JP2000350592A - オリゴヌクレオチド検出プローブ - Google Patents

オリゴヌクレオチド検出プローブ

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 標的核酸配列の多数のコピーを合成する新規
な自動触媒的方法に用いるオリゴヌクレオチド検出プロ
ーブを提供する。 【解決手段】 ＨＢＶ核酸標的配列とハイブリダイズす
ることができるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオ
チド検出プローブを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本出願は１９８９年７月１１日出願の出願
番号第３７９５０１号の継続出願である。
【発明の属する技術分野】本発明は、単独でまたは核酸
のホモジーニアスまたはヘテロジーニアスな混合物の大
きなまたは小さな成分として存在し得る「標的配列」ま
たは特定の核酸配列のコピー数を増加させる方法に関す
るものである。この核酸の混合物は、診断用の検査、環
境検査、学術研究、クローニングのような別の操作のた
めの試薬または材料の調製、またはその他の目的のため
に採取される試料中に見いだされるものであり得る。特
定の核酸配列の選択的増幅は、特異性を維持し、様々な
研究方法の感受性、簡便性、正確さおよび信頼性を増
し、かつ種々の目的のための特定のオリゴヌクレオチド
の十分な供給を可能にしつつ、診断上のおよび環境に関
わる検定の感受性を増すという点で貴重である。本発明
は、その実施の際の簡便性の故に、とりわけ環境および
診断用検査における使用に好適である。
【０００２】
【従来の技術】特定の核酸配列の検出および／または定
量は、微生物の同定および分類、感染症の診断、遺伝的
異常の発見および性格決定、癌に伴う遺伝子の変化の同
定、遺伝的易罹患性の研究、および種々の型の処置に対
する応答の測定のためにますます重要になりつつある技
術である。さらにこのような方法は、食物、環境からの
試料、種、および特定の微生物の存在が監視される必要
のあるその他の型の物質中で微生物を検出および定量す
る際の使用へと用途が広がることがわかった。その他、
犯罪の容疑者の同定、父親捜しの論争の解決、家系図お
よび系統発生樹の作成、および様々な生命形態の分類を
助けるために核酸配列の関連性の測定が用いられる、法
医学、人類学、考古学および生物学における適用性が見
いだされている。特定の核酸配列の検出および定量のた
めの一般的方法は核酸のハイブリダイゼーションであ
る。この方法は、相補的または本質的に相補的な配列を
含む二本の核酸鎖が適当な条件の下で特異的に結合して
二本鎖構造を形成する能力に基づくものである。特定の
核酸配列（「標的配列」として知られる）を検出および
／または定量するために、その標的配列に対し相補的な
配列を含む標識オリゴヌクレオチド（「プローブ」とし
て知られる）を調製する。このプローブを、標的配列の
含有が疑われる試料と混合し、ハイブリッド形成のため
に適当な条件を作りだす。試料中に標的配列が存在すれ
ば、プローブは標的配列とハイブリダイズする。次いで
このプローブ−標的ハイブリッドを様々な手段のうちの
一つを用いて一本鎖プローブから分離する。このハイブ
リッドに付随した標識の量を測定する。
【０００３】核酸ハイブリダイゼーション検定の感度
は、主としてプローブの特異活性、ハイブリダイゼーシ
ョン反応の割合および程度、ハイブリッド形成および非
ハイブリッド形成プローブの分離方法の挙動、および標
識の検出される感度によって制限を受ける。最良の条件
下において上記のような直接ハイブリダイゼーション法
は約１ｘ１０5ないし１ｘ１０6の標的分子を検出するこ
とができる。最も鋭敏な方法は、日常の臨床および環境
検査に必要とされる速さ、簡便性、および経済性という
ような多くの特徴を欠く場合がある。そのうえ、その感
度は多くの望ましい適用に対して十分でないことがあ
る。感染症は、血液または他の試料１０ｍｌにつきわず
か１個の病原性微生物に伴って起こり得る。法医鑑識官
は犯罪現場から微量の組織しか得られないということも
ある。研究者は、生体の遺伝子材料中または一群の細胞
のメッセンジャーＲＮＡ群中に存在する全配列の中にご
く小さな断片として存在する特定の遺伝子配列を検出お
よび／または定量する必要があるかも知れない。この型
の検定の様々な構成因子および操作工程間の相互作用の
結果として、感度および特異性の間には殆ど常に逆の関
係が存在する。即ち、その検定の感度を高めるための工
程（例えばプローブの特異活性を高める）を取り入れた
結果、偽陽性の試験結果の比率がより高くなり得る。感
度および特異性のつながりは、ハイブリダイゼーション
検定の感度を高める上での重大な障壁であった。この問
題に対する一つの解決は、増幅方法を用いて標的配列の
存在量を特異的に増加させることである。試料の残りの
配列にコードされている情報のかなりの部分の増幅を必
要とすることなくただ一個の標的配列部分を増幅するこ
とにより、感度が向上し、一方同時に特異性は低下しな
い。例えば長さ２５塩基の核酸配列は、この配列中の２
５の位置の各々が４種の異なるヌクレオチドのうちの１
個によって占められているため、４25分の１または１０
15分の１の確率で存在する可能性がある。
【０００４】「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣ
Ｒ」と呼ばれる核酸配列の特異的増幅法はミュリス等に
よって記載されている（米国特許第４６８３１９５号、
４６８３２０２号および４８００１５９号ならびに欧州
特許出願第８６３０２２９８．４号、８６３０２２９
９．２号および８７３００２０３．４号ならびにメソッ
ズ・イン・エンザイモロジー第１５５巻、１９８７、３
３５−３５０頁参照）。この方法は、鋳型として相補的
配列の各鎖を用いる、同時に起こるプライマー依存核酸
合成の反復サイクルを使用している。増幅される配列
は、合成を開始させるプライマー分子の位置によって規
定される。プライマーは標的配列またはその相補体の
３'末端部分に対して相補的であり、かつ核酸合成を開
始させるためにはこの部位と結合せねばならない。伸長
産物の合成後、次の合成工程の前にこの鎖を通常熱変性
により分離する。ＰＣＲ法の場合、相補的配列の両方の
鎖が合成される。ＰＣＲにおいてＰＣＲ反応の各サイク
ルの終わりに新たに合成される鎖を分離するのに用いら
れる鎖の分離工程は、しばしば熱変性である。その結
果、熱安定性酵素が必要となるか、または熱変性工程と
ＤＮＡ合成の次のサイクルの開始の間に新たな酵素が添
加されねばならないかのいずれかとなる。幾つかの異な
る且つ極端な反応温度のサイクルを反復する必要がある
ということは、ＰＣＲ法の不利な点である。ＰＣＲを簡
便にするためには高価なプログラム可能な温度サイクル
機器が必要である。
【０００５】ＰＣＲ反応に使用されるプライマーの１個
にプロモーター配列を組み込み、次いで数サイクルのＰ
ＣＲ法により増幅した後、この二本鎖ＤＮＡを一本鎖Ｒ
ＮＡの転写のための鋳型として使用することにより、Ｐ
ＣＲ法がＲＮＡ転写と組み合わせられた（例えばムラカ
ワ等、ＤＮＡ第７巻２８７−２９５頁（１９８８）参
照）。特定の核酸配列を増幅するその他の方法は、プラ
イマーの使用によりプロモーター配列を含む中間体二本
鎖ＤＮＡ分子を供給するための一連のプライマーハイブ
リダイゼーション、伸長および変性工程を含む。この二
本鎖ＤＮＡを標的配列のＲＮＡコピーを多数生成させる
のに使用する。得られたＲＮＡコピーをさらにコピーを
生成させるための標的配列として使用し、多数のサイク
ルを実施することができる（例えばバーグ等、ＷＯ８９
／１０５０およびジンジェラス等、ＷＯ８８／１０３１
５参照）。特定の配列の比較的大量のＤＮＡをインビト
ロで化学的に合成する方法は当業者に良く知られてお
り、この方法によるＤＮＡの生成は今や常套である。し
かしながらこれらの方法は時間がかかり、また長さ約１
００塩基よりずっと大きなオリゴヌクレオチドの合成に
は容易に用いることができない。さらに、合成すべきＤ
ＮＡの全塩基配列がわかっていなければならない。これ
らの方法は、一度にただ１種の配列しか合成できない高
価な機器を必要とする。この機器の操作にはかなりの訓
練と専門知識が必要である。ＲＮＡの化学合成法は開発
がより困難であった。
【０００６】核酸は、微生物の遺伝子材料中に特定の核
酸配列をクローニングまたは挿入し、その結果この微生
物が複製を行なう時に挿入された配列が複製されること
を含む技術によって合成することができる。適当なプロ
モーター配列の下流に隣接してこの配列が挿入されれ
ば、この配列のＲＮＡコピーまたはこの配列によりコー
ドされる蛋白生成物が生成し得る。クローニングは事実
上無制限の量の特定の核酸配列を産み出せるが、含まれ
る操作の数のため、これは診断用、環境、または法医学
用の検査における使用には適していない。クローニング
技術の使用にはかなりの訓練と専門知識を要する。１個
の配列のクローニングには数人月またはそれ以上の労力
が費やされ得る。ＲＮＡ指向ポリメラーゼ、好ましくは
Ｑβレプリカーゼの結合のための認識配列を有する組み
替え一本鎖ＲＮＡ分子を用いて、比較的大量の特定のＲ
ＮＡを作ることができる（例えばクレーマー等の米国特
許第４７８６６００号参照）。特定の配列を異なった分
子のＤＮＡコピー中に挿入し、これを発現ベクターにク
ローニングし、それをＲＮＡに転写し、次いでＱβレプ
リカーゼをもって複製するために、多くの工程が必要で
ある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は標的（ターゲ
ット）核酸配列の多数のコピーを合成する新規な自触
（自動触媒）的（即ち、温度、ｐＨ、またはイオン強度
のような反応条件を修飾する必要なしに、１つのサイク
ルの生成物を次のサイクルに使用して自動的に循環する
ことができる）方法を目的とするものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】本方法は、（ａ）オリゴヌクレオ
チド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る
条件下で、ＲＮＡ標的配列を、標的の３'末端部分に対
してこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列
を有し、且つ所望によりＲＮＡポリメラーゼのためのプ
ロモーターを含むプライミング配列の５'側配列を有す
る、第一プライマーを含む第一のオリゴヌクレオチドで
処理し、（ｂ）ＲＮＡ標的に対し相補的な第一のＤＮＡ
プライマー伸長産物を与える鋳型として該標的を使用す
る伸長反応において第一プライマーを伸長し、（ｃ）Ｒ
ＮＡ標的を選択的に減成（分解）する酵素を用いてＤＮ
Ａ伸長産物をＲＮＡ標的から分離し、（ｄ）ＤＮＡプラ
イマー伸長産物を、プライマーまたはスプライスの鋳型
を含み、そしてオリゴヌクレオチド／標的配列複合体が
作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下でＤＮＡプライマ
ー伸長産物の３'末端部分に対しこれと複合体を作るに
十分相補的な複合体形成配列を有する第二のオリゴヌク
レオチドで処理し（ただし、もし第一のオリゴヌクレオ
チドがプロモーターを持たなければ、第二のオリゴヌク
レオチドがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを
含む複合体形成配列の５'側配列を有するスプライスの
鋳型である）、（ｅ）ＤＮＡ伸長反応において、第二の
オリゴヌクレオチドまたは第一プライマー伸長産物のい
ずれかの３'末端を伸長してＲＮＡポリメラーゼのため
の鋳型を生成し、そして（ｆ）この鋳型を用い、プロモ
ーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼを使用して標
的配列のＲＮＡコピーを多数生成させる、ことを含む。
オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡコピーは、標的配列の
コピーを多数自触的に合成するために使用できる。
【０００９】本発明の一側面において、概括的方法は、
（ａ）オリゴヌクレオチド／標的複合体が作られＤＮＡ
合成が開始し得る条件下で、ＲＮＡ標的配列を、標的の
３'末端部分に対してこれと複合体を作るに十分相補的
な複合体形成配列を有し、且つＲＮＡポリメラーゼのた
めのプロモーターを含む５'から複合体形成配列に至る
配列を有する、第一プライマーを含む第一のオリゴヌク
レオチドで処理し、（ｂ）鋳型として該標的を使用する
伸長反応において第一プライマーを伸長して、ＲＮＡ標
的に対し相補的な第一のＤＮＡプライマー伸長産物を
得、（ｃ）ＲＮＡ標的を選択的に減成（分解）する酵素
を用いて第一のＤＮＡプライマー伸長産物をＲＮＡ標的
から分離し、（ｄ）ＤＮＡプライマー伸長産物を、オリ
ゴヌクレオチド／標的複合体が作られＤＮＡ合成が開始
し得る条件下でＤＮＡプライマー伸長産物の３'末端部
分に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成
配列を有する第二プライマーで処理し、（ｅ）第二のＤ
ＮＡプライマー伸長産物を与えるＤＮＡ伸長反応におい
て第二プライマーの３'末端を伸長し、これによりＲＮ
Ａポリメラーゼのための鋳型を生成し、そして（ｆ）こ
の鋳型を用いて、プロモーター配列を認識するＲＮＡポ
リメラーゼを使用して標的配列のＲＮＡコピーを多数生
成させる、ことを含む。オリゴヌクレオチドおよびＲＮ
Ａコピーは標的配列のコピーを多数自触的に合成するた
めに使用することができる。この側面は、さらに、
（ｇ）工程（ｆ）からのＲＮＡコピーを、オリゴヌクレ
オチド／標的配列複合体が生成しＤＮＡ合成が開始し得
る条件下で、第二プライマーによって処理し、（ｈ）Ｒ
ＮＡコピーを鋳型として用いるＤＮＡ伸長反応において
第二プライマーの３'末端を伸長して第二のＤＮＡプラ
イマー伸長産物を得、（ｉ）ＲＮＡコピーを選択的に減
成する酵素を用いて第二のＤＮＡプライマー伸長産物を
ＲＮＡコピーから分離し、（ｊ）第二のＤＮＡプライマ
ー伸長産物を、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が
生成しＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、第一プライマ
ーによって処理し、（ｋ）ＤＮＡ伸長反応において第二
プライマー伸長産物の３'末端を伸長してＲＮＡポリメ
ラーゼのための鋳型を生成し、そして、（ｌ）工程
（ｋ）の鋳型を用い、プロモーターを認識するＲＮＡポ
リメラーゼを使用して標的配列のコピーを多数生成させ
る、ことを含む。工程（ｌ）、工程（ｇ）ないし（ｋ）
のＲＮＡコピーの使用は自触的に反復されて標的配列の
コピーを多数合成する。工程（ｋ）においてスプライス
の鋳型として挙動する第一プライマーもまた工程（ｋ）
のＤＮＡ伸長反応において伸長され得る。
【００１０】本発明に係る概括的方法のもう１つの側面
は、（ａ）オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作ら
れＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、ＲＮＡ標的配列
を、標的配列の３'末端部分に対してこれと複合体を作
るに十分相補的な複合体形成配列を有する第一プライマ
ーで処理し、（ｂ）鋳型として該標的を使用する伸長反
応においてプライマーの３'末端を伸長して、ＲＮＡ標
的に対し相補的なＤＮＡプライマー伸長産物を得、
（ｃ）ＲＮＡ標的を選択的に減成する酵素を用いてＤＮ
Ａ伸長産物をＲＮＡ標的から分離し、（ｄ）オリゴヌク
レオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し
得る条件下で、ＤＮＡプライマー伸長産物を、プライマ
ー伸長産物の３'末端に対しこれと複合体を作るに十分
相補的な複合体形成配列、およびＲＮＡポリメラーゼの
ためのプロモーターを含む５'から複合体形成配列に至
る配列、を有するスプライスの鋳型を含む第二のオリゴ
ヌクレオチドで処理し、（ｅ）ＤＮＡプライマー伸長産
物の３'末端を伸長してこれにプロモーターに対し相補
的な配列を加え、それによりＲＮＡポリメラーゼのため
の鋳型を生成し、（ｆ）この鋳型を用い、プロモーター
配列を認識するＲＮＡポリメラーゼを使用して標的配列
のＲＮＡコピーを多数生成させ、そして、（ｇ）工程
（ｆ）のＲＮＡコピーを用いて工程（ａ）ないし（ｆ）
を自触的に反復させて標的配列を増幅する、ことからな
る方法を提供する。所望により、工程（ｄ）のスプライ
スの鋳型をプライマーとしても機能させ、これを工程
（ｅ）において第一のプライマー伸長産物を鋳型として
使用して伸長し、第二プライマー伸長産物を得ることも
できる。さらに、本発明の別の側面において、増幅させ
たい配列がＤＮＡとして存在する場合、適当な「予備操
作」を使用するとＲＮＡコピーが生成し、次いでこれを
本発明の「概括的方法」に従って増幅することができ
る。したがって別の側面においては本発明は、増幅すべ
き存在するコピーの数を増加させるばかりでなく、増幅
のためのＤＮＡ配列のＲＮＡコピーを提供し得る、本発
明の増幅方法に関連して使用するための「予備操作」を
目的とするものである。
【００１１】本発明は、試料中の特定の標的核酸配列の
コピー数を増加させる方法を目的とするものである。１
つの側面において本発明は、それ自身追加の生成物の生
成に使用されることができ、その結果、例えば温度循環
のような反応条件の操作を必要とせずに自触的反応を引
き起こす生成物を産生する酵素的ハイブリッド−分離工
程を伴う、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）お
よびＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（転写酵素）の共同
作用を含む。「予備操作」を含む本発明方法の幾つかの
態様においては、「予備操作」の最初の工程を除く全て
の工程を１種類の温度で実施する。本発明方法は、臨床
上の、環境の、法医学用の、および類似の試料における
特定の核酸標的配列を検出および／または定量する検定
の構成因子として、または、様々な使用のための特定の
標的配列のＤＮＡおよび／またはＲＮＡのコピーを多数
生成させるために使用できる。さらにこれらの方法は、
クローニングのためのＤＮＡ標的配列のＤＮＡコピーを
多数生成させるため、またはプローブを産み出すため、
または配列決定のためのＲＮＡおよびＤＮＡコピーを生
成させるためにも使用できる。
【００１２】典型的な検定の一例の場合、増幅すべき試
料を、緩衝液、塩、マグネシウム、ヌクレオチド三燐
酸、プライマーおよび／またはスプライスの鋳型、ジチ
オトレイトール、およびスペルミジンを含有する緩衝液
濃縮物と混合する。次いで所望によりこの反応物を１０
０℃付近で２分間インキュベートして二次構造を変性さ
せる。室温まで冷却した後、もし標的が、確定した３'
末端の無いＤＮＡ標的ならば、逆転写酵素を加え反応混
合物を４２℃で１２分間インキュベートする。反応物
を、今回はプライマー伸長産物をＤＮＡ鋳型から分離す
るために、再度１００℃付近で変性させる。冷却後、逆
転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮアーゼＨを
加え、反応物を３７℃で２ないし４時間インキュベート
する。次いで、生成物を変性させ、プローブ溶液を加
え、６０℃で２０分間インキュベートし、ハイブリダイ
ズしていないプローブを選択的に加水分解する溶液を加
え、反応物を６０℃で６分間インキュベートし、そして
残留する化学ルミネセンスをルミノメーターで測定する
ことにより、この反応物を検定することができる（例え
ばアーノルド等、ＰＣＴ ＵＳ８８／０２７４６号（１
９８８年９月２１日出願、１９８９年３月２９日公告）
参照。この内容は引用して本明細書の一部とし、「ＨＰ
Ａ」と呼称する）。本発明方法の生成物は当業者に知ら
れる他の多くの検定系で使用することができる。もし標
的が確定した３'末端を有する、または標的がＲＮＡで
あるならば、典型的な検定は、標的を前記の緩衝液濃縮
物と混合し、二次構造を変性させることを含む。冷却
後、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮアー
ゼＨを加え、この混合物を３７℃で２ないし４時間イン
キュベートする。次いで反応物を前記のごとく検定し得
る。
【００１３】本発明方法およびこの中で用いられる材料
は、診断操作における使用のための診断キットの一部と
して組み入れることができる。 定義 本明細書中使用される以下の語は、特に別途記載のない
限り以下の意義を有する。 １．鋳型 「鋳型」は、核酸ポリメラーゼにより複製される核酸分
子である。鋳型はそのポリメラーゼにより、一本鎖、二
本鎖または部分的二本鎖であり得る。合成されたコピー
は鋳型に対し、または二本鎖もしくは部分的二本鎖の鋳
型の少なくとも一本の鎖に対し相補的である。ＲＮＡお
よびＤＮＡの両者は常に５'から３'の方向へと合成さ
れ、二本鎖核酸の二本の鎖は常に二本の鎖の５'末端が
その二本鎖の反対の端にあるように並んでいる（そして
その場合必然的に３'末端もまた同様である）。
【００１４】２．プライマー、スプライスの鋳型 「プライマー」は、鋳型と複合体を形成（水素結合また
はハイブリダイゼーションによる）してＤＮＡポリメラ
ーゼによる合成の開始のためのプライマー／鋳型複合体
を与える、鋳型に対し相補的なオリゴヌクレオチドであ
って、これはＤＮＡ合成の過程で、鋳型に対し相補的な
３'末端に連なった共有結合により結合した塩基の添加
により、伸長する。この結果がプライマー伸長産物であ
る。事実上、既知の全てのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写
酵素を含む）はＤＮＡ合成の開始のためにオリゴヌクレ
オチドの一本鎖鋳型への結合（プライミング）を必要と
するが、これに対してＲＮＡの複製および転写（ＤＮＡ
からＲＮＡの複製）は一般にプライマーを必要としな
い。適当な状況下ではプライマーがスプライスの鋳型と
しても働き得る（以下の「スプライスの鋳型」の定義を
参照されたい）。「スプライスの鋳型」は一本鎖の核酸
と複合体を作るオリゴヌクレオチドであって、特定の配
列を付加するために標的核酸の３'末端を伸長する鋳型
として使用される。スプライスの鋳型は標的核酸分子の
３'末端に対し十分相補的であり、この３'末端はスプラ
イスの鋳型と複合体を作らせるために伸長させる。次い
でＤＮＡ−またはＲＮＡ−依存ＤＮＡポリメラーゼを使
用して、スプライスの鋳型の５'から相補領域に至る配
列を鋳型として用いて標的核酸分子を伸長する。伸長し
た分子の伸長産物は、スプライスの鋳型の５'末端の配
列に相補的な特異的配列を３'末端に有する。もしスプ
ライスの鋳型の３'末端がブロックされておらず、且つ
標的核酸に対し相補的であれば、これはプライマーとし
ても働き、鋳型として標的核酸分子を用いてＤＮＡポリ
メラーゼにより伸長される。スプライスの鋳型の３'末
端は、３'末端のジデオキシヌクレオチドの存在または
標的に対し非相補的３'末端配列の存在を含む種々の形
で、または当業者に知られるその他の形でブロックでき
る。プライマーまたはスプライスの鋳型のいずれかが一
本鎖の核酸と複合体を形成し、ＤＮＡポリメラーゼのた
めのプライミング機能を果たすことができる。
【００１５】３．標的核酸、標的配列 「標的核酸」は増幅されるべき「標的配列」を有し、一
本鎖または二本鎖のいずれかであることができ、標的配
列の外に増幅されるべきでない他の配列を含むことがあ
る。「標的配列」という語は増幅されるべき標的核酸の
特定のヌクレオチド配列を意味する。「標的配列」は、
本発明の工程の最中にオリゴヌクレオチド（プライマー
および／またはスプライスの鋳型）が複合体を形成する
複合体形成配列を含む。標的核酸が本来一本鎖である場
合、「標的配列」という語は標的核酸中に存在する「標
的配列」に相補的な配列をも意味することになろう。
「標的核酸」が本来二本鎖である場合、「標的配列」と
いう語は（＋）および（−）鎖の両者を意味する。
【００１６】４．プロモーター／プロモーター配列 「プロモーター配列」は、その核酸に結合し、特定の位
置でＲＮＡの転写を開始させる信号としてＤＮＡ依存Ｒ
ＮＡポリメラーゼ（転写酵素）により認識される特定の
核酸配列である。結合のためには、このような転写酵素
は一般にプロモーター配列およびその相補体を含む部分
において二本鎖であるＤＮＡが必要であり、鋳型部分
（転写されるべき配列）は二本鎖である必要がない。個
々のＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼは、転写を進める効
率の点で著しく異なる様々な異なったプロモーター配列
を認識する。ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始するため
にプロモーター配列に結合するとき、そのプロモーター
配列は転写される配列の一部ではない。したがってこれ
により生成するＲＮＡ転写物は、その配列を含まないで
あろう。
【００１７】５．ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ 「ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡ鋳型から
相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。例として大
腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩおよびバクテリオファ
ージＴ７ ＤＮＡポリメラーゼがある。既知のＤＮＡ依
存ＤＮＡポリメラーゼはすべて合成の開始に相補的プラ
イマーを必要とする。適当な条件下ではＤＮＡ依存ＤＮ
ＡポリメラーゼがＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを
合成できることが知られている。
【００１８】６．ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（転写
酵素） 「ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ」または「転写酵素」
は、プロモーター配列（通常二本鎖）を有する二本鎖ま
たは部分的二本鎖のＤＮＡ分子から多数のＲＮＡコピー
を合成する酵素である。このＲＮＡ分子（「転写物」）
はプロモーターのすぐ下流の特定の位置から始まって
５'→３'の方向へ合成される。転写酵素の例には大腸菌
およびバクテリオファージＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６由
来のＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼがある。
【００１９】７．ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転
写酵素） 「ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ」または「逆転写酵
素」はＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成する酵
素である。知られている全ての逆転写酵素はＤＮＡ鋳型
から相補的ＤＮＡコピーを作り出す能力をも有する。し
たがってこれらはＲＮＡ−およびＤＮＡ−依存性のＤＮ
Ａポリメラーゼである。合成を開始するためにはＲＮＡ
およびＤＮＡ鋳型の両者にプライマーが必要である。
【００２０】８．ＲＮアーゼＨ 「ＲＮアーゼＨ」はＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ部分
を減成させる酵素である。ＲＮアーゼＨはエンドヌクレ
アーゼまたはエキソヌクレアーゼであり得る。殆どの逆
転写酵素は普通それらのポリメラーゼ活性に加えてＲＮ
アーゼＨ活性を有する。しかし、付随するポリメラーゼ
活性のないＲＮアーゼＨの他の供給源も利用できる。減
成の結果ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体からＲＮＡが分離し得
る。これとは別にＲＮアーゼＨはＲＮＡ部分が融解また
は酵素にＲＮＡ部分の巻戻しをさせるように、様々な位
置で単にＲＮＡを切断することもできる。
【００２１】９．プラス／マイナス鎖 核酸合成の議論は、核酸二本鎖の二本の相補的鎖を命名
する語を採用することにより著しく単純化且つ明確化す
る。伝統的に、蛋白または構造的ＲＮＡを生成するため
に使用される配列をコードする鎖は「プラス」鎖、そし
てその相補体は「マイナス」鎖と称した。現在では、多
くの場合両方の鎖が機能的であり、よって一方を「プラ
ス」とし他方を「マイナス」とする命名の割り振りは任
意であることがわかっている。にもかかわらずこの語は
核酸の配列の方向を指定するのに非常に有用であるの
で、本明細書においてこの目的のためにこれを用いる。
【００２２】１０．ハイブリダイズ、ハイブリダイゼー
ション 「ハイブリダイズ」および「ハイブリダイゼーション」
という語は、ワトソン・クリックの塩基対形成により複
合体を形成するに十分相補的なヌクレオチド配列間の複
合体形成を意味する。プライマー（またはスプライスの
鋳型）が標的（鋳型）と「ハイブリダイズ」する時、こ
のような複合体（またはハイブリッド）はＤＮＡポリメ
ラーゼがＤＮＡ合成を開始するのに要するプライミング
機能を果たすのに十分安定である。
【００２３】１１．プライマー配列 本明細書中で言及するプライマーの配列を以下に開示す
る。 ＨＢＶ領域２プライマー (+)： 5'CACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGG3' (-)： 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCGAGATTGAG ATCTTCTGCGAC3' プローブ (+)： 5'GGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCG3' ＨＩＶ領域１プライマー (+)： 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGGGACTTTCC GCTGGGGACTTTCC3' (-)： 5'GTCTAACCAGAGAGACCCAGTACAGGC3' プローブ配列： 5'GCAGCTGCTTATATGCAGGATCTGAGGG3' ＨＩＶ領域２プライマー (+)： 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACAAATGGCA GTATTCATCCACA3' (-)： 5'CCCTTCACCTTTCCAGAG3' プローブ配列： (-)： 5'CTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTACCCC3' ＨＩＶ領域３プライマー (+)： 5'CTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTG3' (-)： 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACTCCCCCGCTT AATACTGACGCT3' プローブ： (+)： 5'GACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGG3' ＨＩＶ領域４プライマー (+)： 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGACCATCAATGAGGAA GCTGCAGAATG3' (-)： 5'CCATCCTATTTGTTCCTGAAGGGTAC3' プローブ： (-)： 5'CTTCCCCTTGGTTCTCTCATCTGGCC3' ＨＩＶ領域５プライマー (+)： 5'GGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAG3' (-)： 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGGGTGGCTCCTT CTGATAATGCTG3' プローブ： 5'GAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTAATACCCATG3' ＢＣＬ−２ 染色体転移主要ブレイクポイントt（１４；１８）プライマー (-)： 5'GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCTGAGGAGACGGTGACC3' (+)： 5'TATGGTGGTTTGACCTTTAG3' プローブ： 5'GGCTTTCTCATGGCTGTCCTTCAG3' 5'GGTCTTCCTGAAATGCAGTGGTCG3' ＣＭＬ 染色体転移t（９；２２）プライマー (-)： 5'GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACTCAGAC CCTGAGGCTCAAAGTC3' (+)： 5'GGAGCTGCAGATGCTGACCAAC3' プローブ： 5'GCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGG3'
【００２４】１２．特異性 核酸配列の特性であって、これは配列および検定条件に
より標的および非標的配列を識別する能力を意味する。
【００２５】本発明によれば、特定の核酸標的配列の検
出および／または定量用の検定における使用のため、ま
たは様々な用途の特定の標的配列のＤＮＡおよび／また
はＲＮＡの多数のコピーを生成するための、特定の核酸
標的配列の増幅のための新規な方法および組成物が提供
される。 Ｉ．概括的方法 好ましい側面において、本発明はＲＮＡ標的配列のＤＮ
ＡおよびＲＮＡコピーを多数合成する自触的増幅方法を
提供する。標的核酸は、増幅されるべき標的配列を含
む。標的配列は、どちらかの端がプライマー、スプライ
スの鋳型、および／または天然の標的核酸の末端によっ
て規定される標的核酸の領域であって、（＋）および
（−）の両鎖を含む。ある側面においてこの方法は、オ
リゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成
が開始し得る条件下で、ＲＮＡ標的配列を含む標的核酸
を、標的配列の３'末端部分に対してこれと複合体を作
るに十分相補的な複合体形成配列を有し、且つ所望によ
りＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む
５'から複合体形成配列に至る配列を有する、第一プラ
イマーを含む第一のオリゴヌクレオチドで処理する事か
らなる。第一のオリゴヌクレオチドプライマーは、５'
からプライミング配列に至る他の配列を有することもあ
る。第一プライマーの３'末端は適当なＤＮＡポリメラ
ーゼにより、ＲＮＡを鋳型として用いる伸長反応におい
て伸長され、ＲＮＡ鋳型に対し相補的な第一のＤＮＡプ
ライマー伸長産物が得られる。この第一プライマー伸長
産物を、ＲＮＡ鋳型を選択的に減成させる酵素を用いて
ＲＮＡ鋳型から分離（少なくとも部分的に）する。好適
な酵素はＲＮＡ−ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖に選択的に働
く酵素であって、ＲＮアーゼＨを含む酵素を包含する。
幾つかの逆転写酵素はＲＮアーゼＨ活性を含むが、大腸
菌ＲＮアーゼＨのような外性のＲＮアーゼＨを添加する
のが好ましい。
【００２６】オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作
られＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、一本鎖の第一プ
ライマー伸長産物を、第一プライマー伸長産物中に含ま
れる標的配列の３'末端部分に対しこれと複合体を作る
に十分相補的な複合体形成配列を有する第二プライマー
またはスプライスの鋳型を含む第二のオリゴヌクレオチ
ドで処理する。第一プライマーがプロモーターを持たな
いときは、第二のオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡポリメ
ラーゼのためのプロモーターを含む５'から複合体形成
領域の配列を有するスプライスの鋳型である。所望によ
りこのスプライスの鋳型はその３'末端においてブロッ
クされ得る。第二のオリゴヌクレオチドおよび／または
プライマー伸長産物の３'末端はＤＮＡ伸長反応におい
て伸長してＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成す
る。作られたＲＮＡコピーまたは転写物は、さらに操作
をすることなく自触的に増幅できる。オリゴヌクレオチ
ドがスプライスの鋳型として機能する場合、そのプライ
マー機能は必要ない。したがって、このスプライスの鋳
型の３'末端はブロックされていてもいなくてもよい。
得られる反応混合物の構成因子（即ち、確定した３'末
端を有する第一プライマー伸長産物を生成させるＲＮＡ
標的、第一プライマー、およびブロックされたまたはブ
ロックされていないスプライスの鋳型）は大量のＲＮＡ
およびＤＮＡを自触的に合成するよう機能する。
【００２７】本発明の一側面において、第一および第二
のオリゴマーは共にプライマーである。第一プライマー
はＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む５'
から複合体形成配列に至る配列を有し、また他の配列を
も含み得る。第二プライマーもまたＲＮＡポリメラーゼ
のためのプロモーターを含み得る５'から複合体形成配
列に至る配列を含み、所望により他の配列を含む。両方
のプライマーがプロモーター配列を有する場合、クロー
ニングのような他の目的のための第二のプロモーターを
導入する意図でない限り、両方の配列が同じＲＮＡポリ
メラーゼにより認識されるのが好ましい。第二プライマ
ーの３'端は、適当なＤＮＡポリメラーゼにより伸長反
応において伸長され、第一プライマー伸長産物に対し相
補的な第二のＤＮＡプライマー伸長産物を生成する。第
一プライマーが標的配列の一方の端を規定し、第二プラ
イマーはここで多端を規定することに留意されたい。第
二の伸長反応の二本鎖生成物は、ＲＮＡポリメラーゼに
よるＲＮＡの生成のための好適な鋳型である。もし第二
プライマーもまたプロモーター配列を有するときは、二
本鎖鋳型の両方の鎖に相補的な転写物が自触反応中に生
成するであろう。この時点でＲＮＡ転写物は標的核酸と
は異なる末端を持ち、しかしながら第一プライマーと第
二プライマーの間の配列は損なわれずに残っている。こ
うして生成したＲＮＡ転写物は、さらに操作を行なうこ
となく上の系を自動的に再循環させることができる。し
たがってこの反応は自触的である。もし第二プライマー
の複合体形成配列が第一プライマー伸長産物の３'末端
と複合体を作るならば、第二プライマーはスプライスの
鋳型として働き、第一プライマー伸長産物は伸長して
５'からプライミング配列に至る第二プライマーの任意
の配列を第一プライマー伸長産物に付加することができ
る。（例えば第５および７図参照）もし第二プライマー
がスプライスの鋳型として働き、且つ５'から複合体形
成配列に至るプロモーター配列を含むならば、プロモー
ター配列を付加する第一プライマー伸長産物の伸長はＲ
ＮＡポリメラーゼのためのさらなる鋳型を産み、これが
転写されていずれかの鎖のＲＮＡコピーを生成すること
ができる。（第５および７図参照）両方のプライマーに
プロモーターが含まれていることにより、合成される標
的配列のコピー数が増加する。
【００２８】本発明の概括的方法のもう一つの側面は、
プライマーを含む第一のオリゴヌクレオチド、およびス
プライスの鋳型を含みそれ自身プライマーとして働くこ
とのできるまたはできない（プライマー伸長反応におい
てそれ自体が伸長しないという点において）第二のオリ
ゴヌクレオチドの使用を含む。この概括的方法の側面
は、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮ
Ａ合成が開始し得る条件下で、ＲＮＡ標的配列を含む標
的核酸を、標的配列の３'末端部分に対してこれと複合
体を形成するに十分相補的な複合体形成配列を有する第
一のオリゴヌクレオチドプライマーで処理することから
なる。この第一プライマーは、プロモーターを含む５'
から複合体形成配列に至る他の配列を有していてもよ
い。第一プライマーの３'端を、適当なＤＮＡポリメラ
ーゼにより、ＲＮＡを鋳型とする伸長反応で伸長して、
このＲＮＡ鋳型に対し相補的な第一プライマー伸長産物
を得る。第一プライマー伸長産物を、ＲＮＡ鋳型を選択
的に減成させる酵素を用いてＲＮＡ鋳型から分離する。
好適な酵素はＲＮＡ−ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖に選択的
に働くものであって、ＲＮアーゼＨ活性を含む酵素を包
含する。幾つかの逆転写酵素はＲＮアーゼＨ活性を含む
が、大腸菌ＲＮアーゼＨのような外性のＲＮアーゼＨを
添加するのが好ましい。オリゴヌクレオチド／標的配列
複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、一本
鎖の第一プライマー伸長産物を、プライマー伸長産物の
３'末端部分に対しこれと複合体を作るに十分相補的な
複合体形成配列、およびＲＮＡポリメラーゼのためのプ
ロモーターを含む５'から複合体形成配列に至る配列、
を有するスプライスの鋳型で処理する。スプライスの鋳
型の３'末端は、ブロックされている（例えばジデオキ
シヌクレオチドの添加により）か、または標的核酸に対
し非相補的である（その結果これはプライマーとして機
能しない）か、または別法によりブロックされていない
か、のいずれかである。第一プライマー伸長産物の３'
末端は適当なＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ伸長反
応において伸長され、第一プライマー伸長産物の３'末
端にプロモーターを含む５'から複合体形成配列に至る
スプライスの鋳型の配列に対し相補的な配列が付加され
る。もし３'末端がブロックされていなければ、スプラ
イスの鋳型が伸長して第一プライマー伸長産物に対して
相補的な第二プライマー伸長産物が得られる。スプライ
スの鋳型を伴う伸長反応の生成物（ブロックされていよ
うとなかろうと）は、プロモーターを認識するＲＮＡポ
リメラーゼを用いるＲＮＡ合成のための鋳型として機能
することができる。上に述べたように、このように生成
したＲＮＡ転写物はさらに操作を行なうことなく自動的
に前記の系を再循環させることができる。即ちこの反応
は自触的である。
【００２９】幾つかの態様においては、増幅すべき標的
配列は、使用するプライマー（またはスプライスの鋳
型）に対して相補的な特定の配列の位置によって両端が
規定される。他の態様においては、標的配列は、使用す
るプライマー分子に対し相補的な特定の配列の位置が一
個、そして特異的制限エンドヌクレアーゼにより、また
は他の適当な手段により切断される、天然３'末端を含
み得る特定の配列の位置により、反対の端が規定され
る。他の態様においては、標的配列は、１またはそれ以
上の特異的制限エンドヌクレアーゼにより切断される特
定の配列の位置により、両端が規定される。本発明の好
ましい態様においては、ＲＮＡ標的配列を決定し、次い
でＲＮアーゼＨの減成がどこで二本鎖からＲＮＡ部分の
切断または除去を起こすのかを決定する。ＡＭＶ逆転写
酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素中に存在するＲＮアーゼ
Ｈ、大腸菌ＲＮアーゼＨまたは他の供給源およびこれら
の組合せによって分析を行ない、標的配列のＲＮアーゼ
減成の効果を決定する。プライマーの組を選択するにあ
たり、プライマーのうち１個を、反応混合物中に存在す
るＲＮアーゼＨにより実質上減成されないＲＮＡの部分
とハイブリダイズするように選択するのが好ましい。も
し実質的な減成が起こると、プライマーの領域における
ＲＮＡ鎖の切断により、ＤＮＡ合成の開始が阻害されプ
ライマーの伸長が妨げられ得る。したがって、ＲＮＡが
ＲＮアーゼＨの作用を受ける場合、プライマー伸長産物
の生成を妨げる実質的減成の無いように配置されたＲＮ
Ａ標的の配列とハイブリダイズするプライマーを選択す
ることが好ましい。
【００３０】プロモーター−プライマーのハイブリダイ
ゼーションの部位は、プロモーター−プライマーがハイ
ブリダイズするＤＮＡ鎖の部分にハイブリダイズしたＲ
ＮＡ鎖部分を除去するに十分なＲＮＡ鎖の減成が起こる
ように選択する。典型的には、ＲＮアーゼＨ減成により
ＲＮＡの一部分のみがＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖から除去さ
れ、このＲＮＡ鎖の実質的部分は二本鎖に残る。ＲＮＡ
合成のためのプロモーター含有二本鎖生成物の形成を第
２２〜２５図に示す。第２２〜２５図に示すように、標
的ＲＮＡ鎖は、反応混合物中に存在するＲＮアーゼＨに
より実質上減成されないＲＮＡ鎖の領域とハイブリダイ
ズするよう選択されたプライマーとハイブリダイズす
る。次いでこのプライマーを伸長してＲＮＡ鎖に対し相
補的なＤＮＡ鎖を生成する。この後、反応混合物中に存
在するＲＮアーゼＨによりＲＮＡ鎖を様々な位置で切断
または減成する。この切断または減成は、この時点でま
たは反応工程中の他の時点で起こり得ることを理解され
たい。次いで重要な切断または減成が起こる領域でこの
ＲＮＡフラグメントをＤＮＡ鎖から分離する。次にこの
プロモーター−プライマーを、ＲＮＡ鎖が実質的に減成
されＤＮＡ鎖から分離されたその３'末端でＤＮＡ鎖に
ハイブリダイズする。次いでこのＤＮＡ鎖を伸長して二
本鎖ＤＮＡプロモーター配列を作り、これによりＲＮＡ
合成用の鋳型を生成する。この鋳型は二本鎖ＤＮＡプロ
モーター配列を含むことがわかる。この鋳型をＲＮＡポ
リメラーゼで処理するとＲＮＡの多重鎖ができる。
【００３１】ＲＮアーゼＨで引き起こされるＲＮＡの減
成の正確な性質はわかっていないが、ＲＮＡ：ＤＮＡハ
イブリッドのＲＮＡ鎖上のＲＮアーゼＨ減成の結果、ハ
イブリッドからＲＮＡの小片が分離する事がわかった。
さらに、ＲＮアーゼＨ減成の後に、小フラグメントの除
去された領域でＤＮＡと結合するであろうプロモーター
−プライマーを選択できるという事もわかった。描かれ
た第１〜１５図および第１６〜２０図にはＲＮアーゼＨ
減成の後に残り得るＲＮＡは示していない。これらの図
は一般にＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖からのＲＮＡの完全な除
去を示しているが、好ましい条件下では第２１図に示す
ように部分的脱離のみが起こることが理解されるべきで
ある。第１図を参照することにより、第１〜１５図のＲ
ＮＡ鎖の実体部分が減成されずに残り、その結果第二プ
ライマーのハイブリダイゼーションまたはプロモーター
配列に対し相補的なＤＮＡ鎖を作るためのハイブリダイ
ズされた第二プライマーの伸長が妨げられると、提唱さ
れる機構は起こらないであろう事が理解できる。しかし
ながら本出願において発見され開示される合成の原理に
基づいて、当業者は本発明の教示に従い、常套的改良を
施してＲＮＡの増幅のための効果的且つ効率的な方法を
提供することができる。本明細書中の記載および第１〜
１５図からわかるように、本発明は選択可能な変法を包
含している。
【００３２】第１図は、標的核酸が３'から標的配列に
至る余分の配列を有する場合の本発明に係る方法を描い
ている。第一のオリゴヌクレオチドは、３'から標的配
列の末端に至る余分の配列を有する標的核酸（ＲＮＡ）
の標的配列の３'末端部分と複合体を作る、５'からその
複合体形成配列に至るプロモーターを有する第一プライ
マーを含む。第二のオリゴヌクレオチドは第二プライマ
ーを含み、これは、第一プライマー伸長産物の３'末端
と位置を同じくして第一プライマー伸長産物の３'末端
部分と複合体を作る。工程（１）において第一プライマ
ーは３'から標的配列に至る余分の配列のためにスプラ
イスの鋳型としては働かない。しかしながら工程（１
０）においては、第二プライマー伸長産物が３'から標
的配列に至る余分の配列を持たないため、第一プライマ
ーはスプライスの鋳型として働くことができる。第２図
は、標的核酸（ＲＮＡ）が５'および３'の両方から標的
配列に至る余分の配列を有する場合の本発明に係る方法
を描いている。第一のオリゴヌクレオチドは第１図に示
す通りである。第二のオリゴヌクレオチドは、３'から
標的配列に至る余分の配列を有する第一プライマー伸長
産物の標的配列の３'末端部分と複合体を作るプライマ
ーを含む。
【００３３】第３図は、確定した５'および３'末端を持
ち、したがって５'または３'のいずれから標的配列に至
る余分の配列も持たない標的核酸（ＲＮＡ）を描いてい
る。第一のオリゴヌクレオチドは第１図および第２図に
示す通りであるが、これは標的核酸の３'末端と複合体
を作るため、工程１においてプライマーおよびスプライ
スの鋳型の両者として働く。第二のオリゴヌクレオチド
は第１図に示す通りである。第４図は、確定した３'端
を持ち、したがって３'から標的配列に至る余分の配列
は持たないが、５'から標的配列に至る余分の配列を有
する標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌ
クレオチドは第３図に示す通りであり、プライマーおよ
びスプライスの鋳型の両者として機能する。第二のオリ
ゴヌクレオチドは第２図に示す通りである。第５図は、
確定した５'端を持つが３'から標的配列に至る余分の配
列を有する標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオ
リゴヌクレオチドは第１図に示す通りである。第二のオ
リゴヌクレオチドは第二プライマーを含み、これは第一
プライマー伸長産物の３'末端と複合体を作るので、ス
プライスの鋳型をも含む。第二のオリゴヌクレオチドは
さらに５'からその複合体形成配列に至るプロモーター
をも有する。
【００３４】第６図は５'および３'の両者から標的配列
に至る余分の配列を有する標的核酸（ＲＮＡ）を描いて
いる。第一のオリゴヌクレオチドは第１図に示す通りで
ある。第二のオリゴヌクレオチドは、第一プライマー伸
長産物が３'から標的配列に至る余分の配列を有するた
め工程（４）でスプライスの鋳型として働けない外は、
第５図に示す通りである。第７図は、確定した５'およ
び３'端の両者を持ち、標的配列以外に配列を持たない
標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレ
オチドは第３図に示す通りであり、第二のオリゴヌクレ
オチドは第５図に示す通りである。この標的は余分の配
列を持たないので、両方のオリゴヌクレオチドがスプラ
イスの鋳型としても働く。第８図は、３'から標的配列
に至る配列の無い確定した３'端を持ち、５'から標的配
列に至る余分の配列を持つ標的核酸（ＲＮＡ）を描いて
いる。第一のオリゴヌクレオチドは第３図および第７図
に示す通りであり、プライマーおよびスプライスの鋳型
の両者として働く。第二のオリゴヌクレオチドは第６図
に示す通りである。第９図は、確定した５'末端を持ち
５'から標的配列に至る余分の配列を持たないが、３'か
ら標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸（ＲＮ
Ａ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドはプロモ
ーターなしのプライマーを含んでいる。第二のオリゴヌ
クレオチドは、５'から複合体形成配列に至るプロモー
ターを有する、ブロックされていないスプライスの鋳型
を含む。
【００３５】第１０図は、確定した５'および３'端の両
者を持ち、標的配列以外に配列を持たない標的核酸（Ｒ
ＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドはプロ
モーターなしのプライマーを含んでいる。第二のオリゴ
ヌクレオチドは第９図に示す通りである。第１１図は、
５'から標的配列に至る余分の配列を持たない確定した
５'末端を持ち、３'から標的配列に至る余分の配列を有
する標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第二のオリゴヌ
クレオチドは５'からその複合体形成配列に至るプロモ
ーターを有するスプライスの鋳型を含むが、これはその
３'末端がブロックされている。第二のオリゴヌクレオ
チドはプライマーとして働くことはできない。第１２図
は、確定した５'および３'端を持ち、標的配列以外に余
分の配列を持たない標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。
第一のオリゴヌクレオチドはプライマーおよびスプライ
スの鋳型の両者として働く。第二のオリゴヌクレオチド
はブロックされたスプライスの鋳型であり、第１１図に
示す通りである。
【００３６】第１３図は、確定した５'末端を持ち、し
たがって５'から標的配列に至る余分の配列を持たない
が、３'から標的配列に至る余分の配列を有する標的核
酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチド
は第９図に示すプライマーである。第二のオリゴヌクレ
オチドは、第１１図および第１２図に示す、プロモータ
ーを有するブロックされたスプライスの鋳型である。第
１４図は、標的配列以外に余分の配列を持たない確定し
た５'および３'配列の両者を持つ標的核酸（ＲＮＡ）を
描いている。第一のオリゴヌクレオチドは、第１０図に
示すように、プロモーターなしのプライマーを含む。第
二のオリゴヌクレオチドは、第１１図、第１２図および
第１３図に示すように、プロモーターを有するブロック
されたスプライスの鋳型を含む。第１５図は、５'から
標的配列に至る余分の配列を持たない確定した５'末端
を持ち、３'から標的配列に至る余分の配列を有する標
的核酸（ＲＮＡ）を描いている。１個のオリゴヌクレオ
チドが第一のおよび第二のオリゴヌクレオチドの両方に
使用される。このオリゴヌクレオチドは、工程（１）に
示すように標的配列の３'末端部分と複合体を作る３'プ
ライマー配列、および、工程（４）に示すようにプライ
マー伸長産物の３'末端と複合体を作るプロモーターを
持つ５'スプライスの鋳型の配列を有する。
【００３７】要約すると本発明方法は、温度、イオン強
度およびｐＨのような反応条件の反復操作をすることな
く標的核酸配列の多数のコピーを自触的に合成するため
の方法を提供するものであって、この方法は、（ａ）反
応混合物中に、ＲＮＡ標的配列を含む標的核酸；２個の
オリゴヌクレオチドプライマー、即ちＲＮＡ標的配列
（例えば（＋）鎖）の３'末端部分に対しこれと複合体
を形成するに十分相補的な複合体形成配列を有する第一
のオリゴヌクレオチド、および相補体（例えば（−）
鎖）の標的配列の３'末端部分に対しこれと複合体を形
成するに十分相補的な複合体形成配列を有する第二のオ
リゴヌクレオチド（ここで、第一のオリゴヌクレオチド
は、所望によりプロモーターを含む５'から複合体形成
配列に至る配列を有する第一プライマーを含み、第二の
オリゴヌクレオチドはプライマーまたはスプライスの鋳
型を有する。但し、もし第一のオリゴヌクレオチドがプ
ロモーターを持たない場合は、第二のオリゴヌクレオチ
ドはＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む
５'からプライミング配列に至る配列を有するスプライ
スの鋳型である。）；ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡ−Ｄ
ＮＡ複合体のＲＮＡ鎖を選択的に減成する酵素活性（例
えばＲＮアーゼＨ）；およびプロモーターを認識するＲ
ＮＡポリメラーゼ、を混合することからなる。反応混合
物の構成因子は順次または一度に合することができる。
反応混合物をオリゴヌクレオチド／標的配列が形成され
る条件下で、そしてＤＮＡプライミングおよび核酸合成
条件（リボヌクレオチド三燐酸およびデオキシリボヌク
レオチド三燐酸を含む）のもとで標的配列の多数のコピ
ーが作られるに十分な一定時間インキュベートする。こ
の反応は、構成因子である酵素のような反応因子の安定
性を維持するのに好適な条件の下で、そして増幅反応過
程の間反応条件の修飾または操作を要することなく、有
利に起こる。したがってこの反応は、実質的に等温の条
件下で起こり得、実質的に一定のイオン強度およびｐＨ
を含む。
【００３８】この反応は、第一のＤＮＡ伸長反応により
生成するＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を分離する変性工程を必
要としない。こうした工程は、反応混合物の温度の実質
的上昇（一般に周囲温度ないし約８０℃から約１０５℃
まで）、そのイオン強度の減少（一般に１０Ｘまたはこ
れ以上）、またはｐＨの変化（通常ｐＨを１０またはこ
れ以上に上げる）によるような反応条件の操作を必要と
する。このような反応条件の操作はしばしば酵素活性に
有害に作用して余分の酵素の添加を要し、また、これを
さらなる核酸合成に好適な条件に戻すためさらに反応混
合物の操作が必要にもなる。好適なＤＮＡポリメラーゼ
は逆転写酵素を包含する。特に好適なＤＮＡポリメラー
ゼはＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素を包含
する。本発明方法に使用されるプライマーおよび／また
はスプライスの鋳型への組み込みに好適なプロモーター
またはプロモーター配列は、その配列を認識し且つこれ
に結合するＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識さ
れ、転写の工程を開始させ、これによりＲＮＡ転写物を
生成させる核酸配列（天然に存在するか、合成により作
られるか、または制限消化の産物のいずれか）である。
この配列は所望によりＲＮＡポリメラーゼのための実際
の認識部位を越えて伸長しているヌクレオチド塩基を含
んでよく、これが安定性または減成工程に対する感受性
の増加または転写効率の向上を与え得る。開始配列を認
識できる既知の且つ利用可能なポリメラーゼのあるプロ
モーター配列は、使用にとりわけ好適である。典型的な
既知の且つ有用なプロモーターは、バクテリオファージ
Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６由来のもののように、ある種の
バクテリオファージポリメラーゼにより認識されるも
の、または大腸菌由来のプロモーターを包含する。
【００３９】本発明方法での使用に好適ないくつかの逆
転写酵素は、例えばＡＭＶ逆転写酵素のようにＲＮアー
ゼＨ活性を有するが、大腸菌ＲＮアーゼＨのような外性
ＲＮアーゼＨを添加するのが好ましい。実施例に示すよ
うに、外性ＲＮアーゼＨの添加が必要でなくとも、ある
条件下ではＡＭＶ逆転写酵素中に存在するＲＮアーゼＨ
活性が、反応混合物中に存在する因子によって阻害され
ることがある。このような状況においては外性ＲＮアー
ゼの添加が望ましい。比較的大量の異種ＤＮＡが反応混
合物中に存在する場合、ＡＭＶ逆転写酵素の本来のＲＮ
アーゼＨ活性は多少阻害され（例えば実施例８参照）、
したがって、生成する標的配列のコピー数はその結果減
少する。標的配列が、存在するＤＮＡのうちわずかな部
分しか含まない場合（例えば試料が有意な量の異種ＤＮ
Ａを含有するとき）、外性ＲＮアーゼＨを添加するのが
特に好ましい。このような好ましいＲＮアーゼＨの１つ
は大腸菌ＲＮアーゼＨである。このような外性ＲＮアー
ゼＨの添加が大量のＤＮＡにより引き起こされる阻害を
克服することが示された（例えば実施例８参照）。
【００４０】これらの方法により生成したＲＮＡ転写物
は、前記の機作により標的配列のさらなるコピーを生成
する鋳型として働くことができる。この系は自触的であ
り、本発明方法による増幅は、温度、ｐＨ、イオン強度
などのような反応条件を繰り返し修飾または変化させる
必要なしに自触的に起こる。この方法は高価な温度循環
装置を要せず、増幅反応工程の最中に酵素または他の試
薬を何回も添加する必要もない。本発明の方法は、臨床
上、環境の、法医学、および類似の試料中の特定の核酸
標的配列を検出および／または定量するため、または種
々の用途のために特定の標的配列のＤＮＡおよび／また
はＲＮＡの多数のコピーを生成させるための検定の一因
子として使用できる。
【００４１】典型的な検定においては、増幅すべき試料
を、緩衝液、塩、マグネシウム、三燐酸、プライマーお
よび／またはスプライスの鋳型、ジチオトレイトール、
およびスペルミジンを含有する緩衝液濃縮物と混合す
る。この反応物を所望により１００℃付近で２分間イン
キュベートして核酸中の二次構造を変性させる。冷却
後、もし標的が確定した３'末端を持たないＤＮＡ標的
ならば、逆転写酵素を加え、反応混合物を約４２℃で１
２分間インキュベートする。今回はＤＮＡ鋳型からプラ
イマー伸長産物を分離するために反応物を１００℃付近
で再度変性させる。冷却後、逆転写酵素、ＲＮＡポリメ
ラーゼ、およびＲＮアーゼＨを加え、反応物を３７℃で
２ないし４時間インキュベートする。次いで生成物を変
性させ、プローブ溶液を加え、６０℃で２０分間インキ
ュベートし、ハイブリダイズしていないプローブの標識
を選択的に加水分解する溶液を加え、反応物を６０℃で
６分間インキュベートし、そしてルミノメーターで残っ
ている化学ルミネセンスの標識を測定することにより、
反応物を検定することができる。上記に引用したＨＰＡ
適用の方法をここに記載してある。溶液内プローブハイ
ブリダイゼーションの代わりに、生成物を測定する幾つ
かの他の方法を用いることができる。標的が確定した
３'末端を持ち、且つ一方のオリゴヌクレオチドが、３'
末端に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形
成配列、および５'から複合体配列に至るプロモーター
配列を有するスプライスの鋳型である場合、または標的
がＲＮＡである場合、典型的な検定は、標的を前記の緩
衝液濃縮物と混合し二次構造を変性させることを含む。
冷却後、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、および所望
ならばＲＮアーゼＨを加え、混合物を３７℃で２ないし
４時間インキュベートする。次いで反応物を前記のよう
に検定することができる。
【００４２】ＩＩ．予備操作 以下の記載は、所望により本発明の好ましい方法と共に
使用できる予備操作の幾つかの態様である。幾つかの標
的核酸は自触的増幅に先立ち修飾を要するため、これら
の操作を用いて修飾を行なう。標的核酸（および標的配
列）が本来ＤＮＡである場合、これらの操作を用いて概
括的方法で使用するための標的配列のＲＮＡコピーを作
ることができる。これらの予備操作は自身反復でき、故
にそれ自身増幅方法として使用できることが理解される
べきである。 予備操作Ｉ この方法は、確定した３'末端を有する１本（一本鎖）
のＤＮＡからなる標的核酸の標的配列のＲＮＡコピーを
与えるものである。予備操作Ｉは２個の核酸構成因子、
即ち標的核酸分子およびオリゴヌクレオチドスプライス
の鋳型を使用する。この操作は確定した３'端を有する
ＤＮＡ標的核酸を要する。もし本来の３'末端が未知ま
たは何らかの理由で不十分な場合は、制限ヌクレアーゼ
の使用、別の配列へのライゲーション、または他の何ら
かの手段によって新たな確定３'末端を作り出すことが
できる。以下の記述において、（第１６図ないし第１８
図参照）標的核酸は自由裁量により「マイナス」の意義
を有するものとする。したがってスプライスの鋳型は標
的に対しこれと複合体を作るに十分相補的であるような
「プラス」の意義を有することになる。このスプライス
の鋳型は標的の３'末端に対しこれと複合体を作るに十
分相補的な複合体形成配列を有する。さらにスプライス
の鋳型は、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配
列を含む５'から複合体形成配列に至る配列を有する。
スプライスの鋳型は所望により、５'からプロモーター
に至る、プロモーターおよび複合体形成配列の間、およ
び／または３'から複合体形成配列に至る、他の配列を
有していてよい。スプライスの鋳型はさらに３'末端で
ブロックされるよう修飾されていてもよく、その結果こ
れは伸長反応において余分のヌクレオチドを添加しても
伸長できず、またスプライスの鋳型として働くのに加え
てプライマーとして働くことができなくなる。
【００４３】予備操作Ｉは２種の酵素活性、即ちＤＮＡ
依存ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存ＲＮＡポリメ
ラーゼを使用する。標的核酸を、オリゴヌクレオチド／
標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下
でスプライスの鋳型で処理する。適当なＤＮＡポリメラ
ーゼを使用するＤＮＡ伸長反応においては、５'から複
合体形成配列に至るスプライスの鋳型の配列に対し相補
的な配列を標的ＤＮＡの３'末端に付加する。スプライ
スの鋳型は、もし３'末端でブロックされていなければ
ＤＮＡポリメラーゼのためのプライマーとしても働き、
伸長してプライマー伸長産物を与える。この伸長反応の
産物、即ち二本鎖または部分的二本鎖のいずれかである
標的／スプライスの鋳型複合体は、プロモーターを認識
するＲＮＡポリメラーゼを用いるＲＮＡ転写物の合成の
ための鋳型として働く。次いでＲＮＡ転写物を、概括的
方法用に使用、または以下のごとくＲＮＡのＤＮＡコピ
ーの生成に使用することができる：標的配列を含むＲＮ
Ａ転写物（「プラス」意義を有する）を、オリゴヌクレ
オチド／標的配列複合体が形成されＤＮＡ合成が開始し
得る条件下で、ＲＮＡ転写物の標的配列の３'端に対し
これと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有
するプライマー（名目上「マイナス」意義を有する）で
処理する。次いでこのプライマーを、標的配列を有する
ＤＮＡプライマー伸長産物を作り出す鋳型としてＲＮＡ
転写物を用いるＤＮＡ伸長反応で伸長させる。ＤＮＡ標
的配列を、ＲＮＡの変性または減成のいずれかによりＲ
ＮＡ転写物から分離し、スプライスの鋳型で始まるサイ
クルを反復させる。所望によりプライマーは５'からプ
ライミング配列に至る余分の配列をも有していてよい。
さらにスプライスの鋳型もまた３'から複合体形成配列
に至る余分の配列を有していてよい。ある態様におい
て、上の方法を、３'からスプライスの鋳型を含む配列
に至るプライマーを含む配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを使用することにより、１個のオリゴヌクレオチドを
用いて実施することができる（例えば第１８図参照）。
予備操作Ｉをさらに第１６図ないし第２０図を参考にし
て説明する。第１６図は、確定した３'末端を持ち、３'
から標的配列に至る余分の配列を持たない標的核酸（Ｄ
ＮＡ）を示している。第一のオリゴヌクレオチドはプラ
イマーおよびスプライスの鋳型の両者を含み、５'から
複合体形成配列に至るプロモーターを有する。
【００４４】第１７図は第１６図に示されるような標的
核酸（ＤＮＡ）を示している。第一のオリゴヌクレオチ
ドは、３'端でブロックされ、したがってプライマーと
して働くことのできないスプライスの鋳型を含んでい
る。第１８図は第１６図および第１７図に示されるよう
な標的ＤＮＡを示している。第１８図は、５'からその
３'端のプライマー配列に至るスプライスの鋳型（プロ
モーターを有する）の配列を有する一個のオリゴヌクレ
オチドの使用を示している。即ちこのオリゴヌクレオチ
ドは、工程（１）および（７）ではブロックされたスプ
ライスの鋳型として、そして工程（４）ではプライマー
（およびスプライスの鋳型）として働く。第１９図は、
確定した５'端、ならびに、前述の複合体形成、プライ
マー伸長および分離工程（工程１および２）を受けて確
定した３'末端を有する相補的ＤＮＡ標的を作り出す、
３'から標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸
（ＤＮＡ）を示している。工程（１）および（７）のオ
リゴヌクレオチドは、最初の標的ＤＮＡの標的配列（こ
こでは名目上（＋））の３'末端部分と複合体を作るプ
ライマーを含む。他のオリゴヌクレオチド（工程（４）
および（１０））は、最初の標的に対する相補体の３'
端と複合体を作る、ブロックされていないスプライスの
鋳型を含む。第２０図は、確定した５'端、ならびに、
前述の複合体形成、伸長および分離工程（工程（１）お
よび（２））を受けて確定した３'末端を有する相補的
ＤＮＡ標的を作り出す、３'から標的配列に至る余分の
配列を有する標的核酸（ＤＮＡ）を示している。工程
（１）および（７）のオリゴヌクレオチドは、最初の標
的ＤＮＡの標的配列（ここでは名目上（＋））の３'末
端部分と複合体を作るプライマーを含む。工程（４）お
よび（１０）のオリゴヌクレオチドは、最初の標的に対
する相補体の標的配列の３'末端部分と複合体を作るブ
ロックされたスプライスの鋳型を含む。
【００４５】スプライスの鋳型は、標的／スプライスの
鋳型複合体が形成されＤＮＡ合成が開始し得るような複
合体形成条件下で、標的核酸の３'末端と複合体を作
る。（工程１）適当なＤＮＡポリメラーゼを用いて標的
核酸の３'末端を伸長し、５'から複合体形成配列に至る
スプライスの鋳型の配列に対し相補的な配列を付加す
る。もしスプライスの鋳型の３'末端がブロックされて
おらず、標的核酸に対し十分相補的であるならば、この
スプライスの鋳型はプライマーとして働き、その結果ス
プライスの鋳型の３'末端もまた伸長され得る。（第１
６図）得られた標的／スプライスの鋳型複合体は部分的
または完全に二本鎖である。（第１６図対第１７および
１８図参照）最小限この二本鎖領域は標的核酸と複合体
を形成したプロモーター配列およびプライミング配列を
含む。工程２の鋳型は適当なＲＮＡポリメラーゼにより
転写される。このＲＮＡポリメラーゼは各鋳型につき約
５−１０００のＲＮＡコピーを生成する。第１６図ない
し１８図において、生成したＲＮＡは名目上「プラス」
意義であり、プロモーターの３'端から標的核酸の５'端
に至る配列を含む。
【００４６】工程３のＲＮＡ産物は概括的方法にしたが
って標的配列を自触的に増幅させるために使用でき、ま
たは、別法として、このＲＮＡ中の標的配列の３'末端
部分に対しこれと複合体を形成するに十分相補的な複合
体形成配列を３'末端に持ち、且つ所望により５'から複
合体形成配列に至る他の配列を含むプライマーと複合体
を形成且つプライミングする条件下で処理することがで
きる。このプライマーを、プライマー伸長反応におい
て、ＲＮＡを鋳型として使用してＲＮＡ依存ＤＮＡポリ
メラーゼにより、伸長する。これにより少なくとも部分
的に二本鎖の生成物が作られ、そしてこれは例えばＲＮ
アーゼＨによる（工程５）ＲＮＡ部分の減成または変性
のような他のなんらかの方法によって、さらなる合成の
ために少なくとも部分的に一本鎖としなければならな
い。工程６で生成したＤＮＡは工程１のための標的分子
として使用でき、前記のごとくスプライスの鋳型で処理
して、より多くのＲＮＡおよびＤＮＡを生産させる。こ
れらの工程を、所望の増幅レベルが生成するまで循環さ
せることができる。スプライスの鋳型およびプライマー
の適当な選択により、この新たな標的分子（工程６）が
最初の分子とは異なる末端を持つことができることにも
留意されたい。さらに、もしＲＮＡ由来のプライマー伸
長産物が５'から複合体形成配列に至るプロモーター配
列を有するならば、「プラス」意義の複合体形成配列を
持ち、所望により５'から複合体形成配列に至る他の配
列をも有する第二プライマーを、伸長したプライマー産
物の複製に使用してＲＮＡポリメラーゼのための二本鎖
鋳型を生成することができる。このように作られた鋳型
はＲＮＡポリメラーゼが「マイナス」意義のＲＮＡを作
ることを可能にし、このＲＮＡを、概括的方法を用いて
増幅、または本明細書中の操作を用いてさらに増幅する
ことができる。
【００４７】予備操作ＩＩ 予備操作ＩＩは、自触的反応種を生み出す方法の点で予
備操作Ｉと異なる。ＤＮＡ標的核酸は確定した３'末端
を持つ必要が無い。ある側面においては、スプライスの
鋳型の代わりに５'から複合体形成配列に至るプロモー
ター配列を含んでいるプライマーを使用して、このプロ
モーター配列をＲＮＡポリメラーゼのための鋳型へと導
入する。このプライマーは、標的配列の３'末端部分に
対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配
列、および、５'から複合体形成配列に至るＲＮＡポリ
メラーゼのためのプロモーターを含む配列を有する。こ
のプライマーをＤＮＡポリメラーゼで伸長させてプライ
マー伸長産物を得る。通常熱変性により鎖を分離した
後、標的分子と同じ意義の第二のオリゴヌクレオチドを
プライマーとして用いて、第一プライマー伸長産物に対
するＤＮＡ相補物を合成する。第二プライマーは、プロ
モーターを含み得る５'から複合体形成領域に至る余分
の配列を持ち得る。第二プライマー中にプロモーター配
列が含まれることにより増幅が促進される。第二プライ
マーはスプライスの鋳型でもあり得る。
【００４８】予備操作ＩＩを第２１図を参考にしてさら
に説明する。第２１図は、５'および３'の両方から標的
配列に至る余分の配列を有する標的ＤＮＡを示してい
る。第一プライマーはその３'末端に複合体形成配列、
そしてプロモーター配列を含む５'から複合体形成配列
に至る配列を持ち、標的と十分複合体を形成してプライ
ミング機能を発揮しＤＮＡ合成を開始させる。適当なＤ
ＮＡポリメラーゼがこのプライマーを伸長してプライマ
ー伸長産物を与える。この鎖を変性または他の手段によ
り分離して、プライマー伸長産物を含む一本鎖のプロモ
ーターを生成する。第一プライマー伸長産物の標的配列
の３'末端部分に対し十分相補的な複合体形成配列をそ
の３'末端に持ち、そして所望により、プロモーター配
列を含み得る５'から複合体形成配列に至る他の配列を
持つ、第二プライマーを使用する。第二プライマーは工
程３からのプライマー伸長産物と十分複合体形成してプ
ライミング機能を発揮しＤＮＡ合成を開始させる。ＤＮ
Ａポリメラーゼは第二プライマーを伸長させて第二プラ
イマー伸長産物を与える。得られた二本鎖ＤＮＡ分子は
この時点でＲＮＡポリメラーゼのための鋳型として働
き、概括的方法のためのＲＮＡ転写物を産むことができ
る。第２１図に示すように、生成されたＲＮＡ分子は名
目上「プラス」意義であり、本発明に係る概括的方法を
用いて増幅することができる。第二プライマーの複合体
形成配列が工程３からの第一プライマー伸長産物の３'
末端に対し相補的であり、第二プライマーが５'から複
合体形成配列に至るプロモーター配列を含んでいる場
合、第二プライマーはスプライスの鋳型として働き、そ
の結果工程３からの第一プライマー伸長産物の３'末端
がさらに伸長してプロモーター配列を付加し、両意義の
ＲＮＡ転写物を生成するＲＮＡポリメラーゼのための鋳
型ができる。このようにして作られたＲＮＡ分子は概括
的方法を用いて増幅することができる。
【００４９】本発明の他の側面においては、第二プライ
マーがスプライスの鋳型として働き、且つ５'から複合
体形成配列に至るプロモーターを有し、その結果第一プ
ライマーはプロモーターを有する必要が無い。この場
合、工程２からの第一プライマー伸長産物はさらに伸長
してプロモーター配列に対する相補体を生成し、こうし
て「マイナス」意義のＲＮＡを生産するための鋳型がＲ
ＮＡポリメラーゼによって作られる。上記の工程を反復
することにより、さらなる標的配列のＲＮＡおよびＤＮ
Ａコピーを生産することができる。
【００５０】
【実施例】前述の方法に対する以下の実施例は本発明方
法の機作および用途を説明するものである。これらは本
発明を限定するものではなく、そのように解してはなら
ない。１またはそれ以上の実施例において用いられる多
くの物質は類似している。実施例の記載を単純にするた
めに幾つかの物質を略記し、ここに説明する。「ｆｒａ
ｇ１」と称する鋳型は、Ｂ型肝炎ゲノム由来のＤＮＡの
一部分と相同性の二本鎖ＤＮＡセグメントである。これ
は制限ヌクレアーゼ消化によりプラスミドから切り取ら
れ、クロマトグラフィー法によって残りの核酸から精製
された。精製に続いてこのフラグメントは制限エンドヌ
クレアーゼで切断し、フェノール抽出を経て精製し、エ
タノール沈澱により所望の標的を得た。「Ｍ１３Ｌ
（−）」と称する鋳型は、全配列のうちの小断片として
マイナス鎖標的配列を含む精製された一本鎖ＤＮＡ標的
である。本明細書に記載される実施例においては幾つか
の異なるプライマーおよびスプライスの鋳型を使用し
た。Ｔ７ｐｒｏ（＋）と称するオリゴヌクレオチドは、
５'末端付近にＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ
ー、そして３'末端付近には、上記２種の鋳型に対する
マイナス鎖標的配列の３'末端に対して相補的な配列を
含む。さらにＴ７ｐｒｏ（＋）はその働きを促進するた
めの他の配列情報をも含んでいる。Ｔ７ｐｒｏ（＋）の
配列は、５’-ＡＡＴＴＴ ＡＡＴＡＣ ＧＡＣＴＣ
ＡＣＴＡＴ ＡＧＧＧＡ ＧＡＧＧＴ ＴＡＴＣＧ Ｃ
ＴＧＧＡ ＴＧＴＧＴ ＣＴＧＣＧ ＧＣＧＴ３'であ
る。Ｔ７ｐｒｏに類似のもう一つのオリゴヌクレオチド
はｄｄＴ７ｐｒｏ（＋）である。これは、３'末端が末
端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて
ジデオキシヌクレオチドで伸長されている点でＴ７ｐｒ
ｏ（＋）と異なる。Ｔ７ｐｒｏ（＋）と異なりｄｄＴ７
ｐｒｏ（＋）は、逆転写酵素によるＤＮＡ合成のための
プライマーとして働くことはできないが、スプライスの
鋳型として働くことができる。
【００５１】ＨＢＶ（−）Ｐｒは、ｆｒａｇ１鋳型のプ
ラス鎖とハイブリダイズしＭ１３Ｌ（−）の内部の配列
と相同的なプライマーである。［ＨＢＶ（−）Ｐｒは
３'からＴ７ｐｒｏ（＋）に対し相同的なプラス鎖配列
に至る配列に対して相補的である。］ＨＢＶ（−）Ｐｒ
に相当する配列は、５'−ＧＡＧＧＡ ＣＡＡＡＣ Ｇ
ＧＧＣＡ ＡＣＡＴＡ ＣＣＴＴＧ−３'である。プロ
モーター領域を含むもう一つのオリゴヌクレオチドはＴ
７ｐｒｏ（−）である。このプロモーター−プライマー
はＴ７ｐｒｏ（＋）と同一の配列を含むが、マイナス標
的に対して相補的な配列がプラス標的に対して相補的な
配列で置き変わっている。Ｔ７ｐｒｏ（−）の３'末端
はｆｒａｇ１のプラス鎖の３'末端に対して相補的であ
る。Ｔ７ｐｒｏ（−）に相当する配列は、５'−ＡＡＴ
ＴＴＡＡＴＡＣ ＧＡＣＴＣ ＡＣＴＡＴ ＡＧＧＧＡ
ＧＡＴＣＣ ＴＧＧＡＡＴＴＡＧＡ ＧＧＡＣＡ Ａ
ＡＣＧＧ ＧＣ−３'である。ｄｄＴ７ｐｒｏ（＋）と
同様に、ｄｄＴ７ｐｒｏ（−）は、末端デオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼを用いて３'末端をジデオ
キシヌクレオチドで伸長することによって作られた３'
がブロックされたオリゴヌクレオチドである。ｄｄＴ７
ｐｒｏ（−）はプライマーとして働くことはできない
が、他の点ではＴ７ｐｒｏ（−）と類似している。
【００５２】これらの実施例で用いられる鋳型は、プラ
イマーに対して相同的または相補的な領域および前記の
スプライスの鋳型の間の実質的な配列を含む。オリゴヌ
クレオチド間の配列が本発明の結果として増幅されるの
であるから、この配列の定量化は増幅を測定する特異的
手段を提供する。この生成物は、オリゴヌクレオチドプ
ライマーとスプライスの鋳型の間にコードされた配列に
特異的なＤＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーショ
ン技術によって検定するのが簡便である。以下に示す実
施例では２個のプローブ、即ちプローブ（＋）およびプ
ローブ（−）を使用する。プローブ（＋）はマイナス意
義の生成物に対して相補的であり、プローブ（−）はプ
ラス意義の生成物に対して相補的である。プローブ
（＋）に相当する配列は５'−ＣＣＴＣＴ ＴＣＡＴＣ
ＣＴＧＣＴ ＧＣＴＡＴ ＧＣＣＴＣ−３'であり、
プローブ（−）に相当する配列は５'−ＧＡＧＣ ＡＴ
ＡＧＣＡＧＣＡＧ ＧＡＴＧＡ ＡＧＡＧＧ−３’であ
る。本明細書中で使用されるプローブは化学ルミネセン
スの標識で標識した。検定において、ハイブリダイズし
たプローブ上の標識はルミノメーターで測定される光を
放出する。
【００５３】以下の実施例において、相対的増幅を以下
のように測定した。増幅反応混合物の試料（通常１０μ
ｌ）を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）で５０μ
ｌに希釈し、９５℃で２分間変性させた。氷上で冷却し
た後、およそ７５ｆｍｏｌのプローブ（＋）またはプロ
ーブ（−）、０．２Ｍ琥珀酸リチウム（ｐＨ５．２）、
２１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、２ｍＭＥＤＴ
Ａ、および２ｍＭＥＧＴＡを含有するプローブ溶液５０
μｌを試料に加え、混合した。次いで反応物を６０℃で
２０分間インキュベートし冷却した。各ハイブリダイゼ
ーション反応物に、飽和ほう酸ナトリウム溶液を塩酸で
ｐＨ８．５に調節し、次いでこのほう酸の最終濃度が
０．８Ｍとなるよう希釈し、トリトンＸ−１００を最終
濃度５％（ｖ／ｖ）まで加えることにより調製した溶液
５００μｌを添加した。次にこの反応物を混合し、６０
℃で６分間インキュベートして、ハイブリダイズしてい
ないプローブの化学ルミネセンス標識を破壊した。この
ハイブリダイズしていないプローブの化学ルミネセンス
標識の破壊方法は非常に特異的であって、ハイブリダイ
ズしていないプローブのうちほんのわずかな部分のみに
化学ルミネセンスが残るだけである。反応物を冷却し、
残留する化学ルミネセンスを、１．５Ｍ水酸化ナトリウ
ム２００μｌ、０．１％（ｖ／ｖ）過酸化水素を加えて
ルミノメーターで定量した。この検定において、ハイブ
リダイズしたプローブはルミノメーターで測定される光
を放出する。ハイブリダイズしていないプローブの化学
ルミネセンス標識を破壊する反応は１００％有効ではな
いため、一般に約３００ないし１３００相対光単位（Ｒ
ＬＵ）の範囲で存在する信号のバックグラウンドがあ
る。同位体で標識したプローブとのハイブリダイゼーシ
ョン、ブロッティング技術および電気泳動を使用する検
定を含む他の多くの検定法もまた利用可能である。
【００５４】以下の実施例において使用される酵素は、
セイカガク・アメリカ、Ｉｎｃ．の鳥の骨髄芽球症ウイ
ルス逆転写酵素、ニュー・イングランド・バイオラブズ
またはエピセンターのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、なら
びにベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズのモロニー・
ネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素および大
腸菌ＲＮアーゼＨである。類似の活性を持つ他の酵素お
よび他の供給源からの酵素もまた使用でき、また、異な
ったプロモーター特異性を有する他のＲＮＡポリメラー
ゼもまた使用に適している。別途記載のない限り以下の
実施例において使用する反応条件は、容量１００μｌ
中、４０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２５ｍＭＮａＣｌ、８ｍ
ＭＭｇＣｌ2、５ｍＭジチオトレイトール、２ｍＭスペ
ルミジン三塩酸塩、１ｍＭｒＡＴＰ、１ｍＭｒＣＴＰ、
１ｍＭｒＧＴＰ、１ｍＭｒＵＴＰ、０．２ｍＭｄＡＴ
Ｐ、０．２ｍＭｄＣＴＰ、０．２ｍＭｄＧＴＰ、０．２
ｍＭｄＴＴＰ、０．１５μＭの各プライマーまたはスプ
ライスの鋳型、および特記した量の鋳型および酵素であ
る。これらの反応条件は必ずしも最適のものではなく、
いくつかの系では記したように変更されている。これら
のおよび他の標的配列のために他の配列が使用されてお
り、使われているオリゴヌクレオチド配列は一例であっ
てこれを限定する意図ではない。
【００５５】実施例１ 予備工程Ｉ 本システムが機能することを説明するために、上記の４
つのプロモーター含有オリゴヌクレオチドを各々別々に
４ｆモルのターゲット（フラッグ１）を含有あるいは非
含有の反応液に加えた。反応液を９５℃で２分間インキ
ュベートしてターゲットを変性させ、ついで冷却して該
オリゴヌクレオチドをターゲットにアニーリングさせ
た。逆転写酵素１３単位とＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ１
００単位を加え、反応液を３７℃で３０分間インキュベ
ートした。反応液の１０分の１をハイブリディゼーショ
ン法で検定した。表１に示した結果（相対光単位（Ｒｅ
ｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ ＵｎｉｔあるいはＲＬＵ
（ｓ）とｆモルで表示している）はブロックしたあるい
はブロックしていないオリゴヌクレオチドがスプライス
鋳型として作用し、生成物を生成することを示してい
る。ターゲット非存在下の反応液で測定した信号はこの
タイプのアッセイに於ける信号の典型的なバックグラウ
ンドを示している。
【００５６】
【表１】
【００５７】実施例２ 予備工程Ｉのサイクリング 増幅システムをｄｄＴ７ｐｒｏ（＋）とＴ７ｐｒｏ
（＋）でサイクルした。この実験で、標準反応液では４
ａモルのフラッグＩ、ＨＢＶ（−）ＰｒおよびｄｄＴ７
ｐｒｏ（＋）あるいはＴ７ｐｒｏ（＋）を混合し９５℃
でインキュベートした。冷却後、逆転写酵素１３単位と
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ１００単位を加え、混合物を３
７℃で３０分間インキュベートした。反応物の１０分の
１を測定のため除き、残りでサイクルを繰り返した。３
回サイクルを繰り返した後、その１０μリットル部をハ
イブリディゼーション法にてプローブ（−）により測定
した。表２に示した結果は生成物がブロックしたスプラ
イス鋳型あるいは非ブロックしたスプライス鋳型いずれ
ともサイクリングすることにより増幅することを示して
いる。
【００５８】
【表２】
【００５９】実施例３ 予備工程Ｉの感度 この実施例では非ブロックスプライス鋳型、Ｔ７ｐｒｏ
（＋）とプライマー、ＨＢＶ（−）Ｐｒを用い増幅法の
感度を調べた。予備工程Ｉの６サイクルを実施例２と同
様にフラッグ１の量を減少しながら行った。増幅後、生
成物を発明の詳細な説明の欄で述べたハイブリディゼー
ション法を用いて測定した。この方法を用いて４×１０
-21モルのフラッグ１が検知され得た（表３参照）。
【００６０】
【表３】 予備工程Ｉの６サイクルを用いた感度 ターゲット（モル） 検体（μｌ） 生成物（ＲＬＵ’ｓ） ４×１０-18 ５ ３２８３９０ ４×１０-19 ２０ １０５３６４ ４×１０-20 ２０ ３１６６ ４×１０-21 ２０ １９２７ ０ ２０ ８０６
【００６１】実施例４ 予備工程Ｉを含む増幅 下記実施例では、増幅されるターゲットはフラッグ１で
あった。反応液の最初のセットでは、ターゲットとスプ
ライス鋳型の種々の組み合わせを９５℃で２分間インキ
ュベートし、ついで冷却し逆転写酵素１３単位とＴ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼ１００単位を加えた。反応混合物を３
７℃で３０分間インキュベートしついで５μｌ部の反応
混合物を両プローブと測定して生成物を定量した。この
測定の後、反応液を５μｌの反応液１および２、および
Ｔ（−）スプライス鋳型を用いて調製した。混合物を９
５℃で２時間インキュベートし、冷却しついで逆転写酵
素１３単位Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ１００単位を加え
た。新しい反応物を混合し３７℃で２時間インキュベー
トした。その１０μｌ部を下記表４に示した時間で氷浴
に除いた。生成物を前記のハイブリディゼーション方法
を用い測定した。データは両スプライス鋳型がいずれも
フラッグ１からＲＮＡを生成せしめたことを示してい
る。データはまたＲＮＡとそのＲＮＡに相補のスプライ
ス鋳型を含有した反応液中でより多くのマイナスおよび
プラスセンス生成物が生成されたことを有意に示してい
る。最後に、反応液１Ｂの反応速度論は生成物の幾何学
的増加を示し、一方反応液２Ｂの速度論はもっと直線で
ある。この違いは１Ｂ反応液での生成物はさらに生成物
を生成する為の基質として作用していることを示し、つ
まりこの反応は自触反応である。
【００６２】
【表４】
【００６３】実施例５ 予備工程Ｉを含む増幅の反応速度論 下記の実施例は本発明方法のこの態様の可能性を示す。
フラッグ１の少量（１０ａモル）をＴ７ｐｒｏ（＋）、
Ｔ７ｐｒｏ（−）およびＨＢＶ（−）Ｐｒの種々の組み
合わせと反応に用いた。反応混合物を９５℃で２分間イ
ンキュベートしてＤＮＡターゲットを変性し、冷却しつ
いで逆転写酵素とＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加えた。混
合後、反応液を３７℃で３０分間インキュベートした。
その１５μｌ部を種々の時間で除き、０℃で測定まで保
存した。反応生成物を定量するためにハイブリディゼー
ションアッセイを用いた。表５に示したデータは本発明
が１つのスプライス鋳型と１つのプライマーを必要とす
ることを示している。しかしながら第２のスプライス，
鋳型は有利である。１つのみのプライマーあるいはスプ
ライス鋳型で得た結果は本アッセイの測定限界以下であ
った。先の実施例のように、反応速度論は幾何学的であ
り自触反応を示唆している。
【００６４】
【表５】 我々の次の研究は先行技術の方法より実質的に優れてい
る、５．０時間以上にわたる生成物合成の継続を示し
た。我々はさらに感度の向上をも示した。
【００６５】実施例６ 予備工程ＩＩを含む増幅 この実施例ではプライマーの種々の組み合わせを用いて
決定した末端のないＤＮＡターゲットの５００ａモルを
増幅する。ターゲットは先に引用したＭ１３Ｌ（−）で
あった。反応物調製にあたって、サンプルを９５℃で２
分間インキュベートし、冷却しついで逆転写素１３単位
を加えた。反応物をついで４２℃で１２分間インキュベ
ートした。次に、反応物を再び９５℃で２分間インキュ
ベートし冷却した。逆転写酵素とＴ７ＲＮＡポリメラー
ゼを加え、３７℃で２分間インキュベートした。反応物
の１０μｌ部をプローブ（＋）およびプローブ（−）と
測定した。表６に示した結果は大量の核酸の合成が２つ
のプライマーを用いた時のみ起こることを示している。
また２つのプロモータープライマーが１つのプロモータ
ープライマーと１つのプライマーに比べて有利なことを
示している。反応液４および５における低レベル合成は
元の鋳型から約１コピーのＤＮＡの合成に符合する。本
システムを初期９５℃変性工程を要し、この工程は二重
鎖ターゲットあるいは一本鎖ターゲットの二重鎖領域を
変性し同時にまた不活性の望まれないヌクレアーゼやプ
ロテアーゼ活性をも変性する。
【００６６】
【表６】予備工程IIシステム 反応 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ M13L(-) − − ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ T7pro(+) ＋ ＋ − ＋ − ＋ ＋ T7pro(-) ＋ − − − ＋ ＋ − HBV(-)Pr − ＋ − − − − ＋フ゜ローフ゛ 相対光単位(RLU's)フ゜ローフ゛ (+) 862 744 762 1089 2577 96221 30501 フ゜ローフ゛ (-) 473 420 483 3038 1080 15171 14863
【００６７】実施例７ ＲＮＡｓｅ Ｈの作用 外因性ＲＮＡｓｅ Ｈの添加が本発明の自触反応システ
ムでの増幅を向上し得ることを示すために、いくつかの
反応物を種々の量のターゲット、Ｍ１３Ｌ（−）および
外因性ＲＮＡｓｅＨを０あるいは２単位用いて調製し
た。用いた外因性ＲＮＡｓｅ ＨはＥ.ｃｏｌｉ.由来で
あった。すべての反応物はＴ７ｐｒｏ（＋）とＴ７ｐｒ
ｏ（−）と調製した。反応物を９５℃変性処理に処し、
冷却し逆転写酵素を加えた。４２℃で１２分間インキュ
ベート後、反応物を再び９５℃で変性した。冷却後、逆
転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよび必要な場合は
（表７参照）ＲＮＡｓｅ Ｈを加え、３７℃で３時間イ
ンキュベートした。その１０μｌ部を各反応混合物から
ハイブリディゼーション法によるアッセイのために１時
間毎に除いた。表７のデータは外因性ＲＮＡｓｅ Ｈが
有意に反応速度を促進し本発明の感度を上昇させること
を示している。６００ＲＬＵ’ｓ以下の信号は典型的な
バックグラウンドレベルとみなした。
【００６８】
【表７】
【００６９】実施例８ 外因性ＤＮＡの作用 外因性ＤＮＡの添加が有意に本自触増幅システムを阻害
し得ることを示した。外因性ＲＮＡｓｅ Ｈの添加の有
利性をさらに示すために、増幅反応液を２μｇの子牛胸
腺ＤＮＡの添加あるいは不添加で調製しこの阻害を示し
た。子牛胸腺ＤＮＡ添加の反応液では、逆転写酵素を２
濃度で用い、さらにＡＭＶ ＲＮＡｓｅＨがこの阻害を
克服するかどうかを調べた。また、Ｅ．ｃｏｌｉ．由来
のＲＮＡｓｅ Ｈを同様の理由によりいくつかの反応液
に加えた。反応液は標準反応液とは各リボヌクレオチド
の濃度が２．５ｍＭまで上昇し、塩化マグネシウムの濃
度が１２．８ｍＭまで上昇している点において異なる。
反応液をターゲットとして１００ａモルのＭ１３Ｌ
（−）を、およびＴ７ｐｒｏ（＋）とＴ７ｐｒｏ（−）
を用いて調製した。９５℃で２分間変性後、反応液を冷
却し逆転写酵素を１３単位あるいは３９単位加え、さら
に反応物を３７℃で１２分間インキュベートした。反応
液を再び９５℃で変性し冷却しついで逆転写酵素１３単
位あるいは３９単位、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ１００単
位あるいは３００単位およびＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ
Ｈを０単位あるいは２単位加えた。３７℃で１時間イ
ンキュベート後、各反応液の１０μｌ部をハイブリディ
ゼーションアッセイを用いて測定した。表８に示した結
果は子牛胸腺ＤＮＡが外因性ＤＮＡの無い反応システム
に比べ反応を９０％阻害し、逆転写酵素の追加（ＲＮＡ
ｓｅ Ｈを伴う）は生成物増幅を有意に影響しないこと
を示した。さらにＴ７ＲＮＡポリメラーゼの追加は生成
物収量に有意な影響を示すが、それは外因性ＲＮＡｓｅ
Ｈの追加による増加にほとんど関係しなかった。阻害
が除去されるだけではなくまた増幅も子牛胸腺ＤＮＡと
Ｅ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの無い反応に関係して５
倍以上も増加した。高濃度のＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ
Ｈとの反応でみられた信号はハイブリディゼーション
アッセイで用いたプローブ量を飽和していた。これらの
サンプルを正確に定量するために、増幅生成物は測定の
前に希釈する必要があった。
【００７０】
【表８】外因性ＤＮＡによる増幅阻害に対するＲＮＡｓｅ Ｈの効果 逆転写酵素 T7 RNA E.coli. ターケ゛ット 外因性 相対 酵素 ホ゜リメラーセ゛ RNAse H DNA DNA 光 (単位) (単位) (単位) (aモル) (μg) 単位 13 100 0 0 0 458 13 100 0 100 0 55305 13 100 0 100 2 3003 39 100 0 100 2 2786 13 300 0 100 2 5734 39 300 0 100 2 6831 13 100 4 100 2 278666 39 100 4 100 2 334649 13 300 4 100 2 359101 39 300 4 100 2 375043
【００７１】実施例９ 総括方法による増幅 このシステムは初期転写と変性を要しない。つまりター
ゲットのＤＮＡ補体が作られ元のターゲットはＲＮＡｓ
ｅ Ｈで除かれる。ＤＮＡは次に第２プライマーあるい
はプロモータープライマーにアニーリングしＤＮＡ合成
を通してＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を作る。ＲＮ
Ａｓｅ Ｈが活性でない場合は、始めに生成したＤＮ
Ａ：ＲＮＡハイブリッドはＲＮＡポリメラーゼのための
鋳型を生成することなく反応を終結させるであろう。本
発明方法を説明する試みの中で、ＲＮＡポリメラーゼプ
ロモーターとターゲット核酸を含有したプラスミドを用
い他の配列の中にターゲット配列を含有した大量の一本
鎖ＲＮＡ転写体を生成した。２つの同様な反応液もまた
調製した。つまりＲＮＡポリメラーゼ不含のプラスミド
含有を１つ、他方はプラスミド不含でＲＮＡポリメラー
ゼ含有の反応液である。これらの反応液の希釈物を生成
物定量のため測定した。３反応液すべての等希釈物を２
つのプロモータープライマー、Ｔ７ｐｒｏ（＋）および
Ｔ７ｐｒｏ（−）含有の増幅反応物を調製するために用
いた。表９の反応液１は６０ａモルのＲＮＡと０．６ａ
モルの原料プラスミドを含有していた。反応液２は０．
６ａモルの原料プラスミドを含有していたがＲＮＡは含
有していなかった。反応液３はターゲットを全く含有し
なかった。各反応液は９５℃で変性せず、かわりに逆転
写酵素とＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加え３７℃で４時間
インキュベートした。ハイブリディゼーション法による
後のアッセイのために１時間毎に反応液の１部を除い
た。表９に示したように、プラスミドとプラスミドから
調製したＲＮＡを含有した反応液は大きなハイブリディ
ゼーション信号を示した。つまりプラスミドのみを含有
した反応液はＴ７ＲＮＡポリメラーゼがプラスミドから
ＲＮＡをつくることができるので重要な生成物を生成
し、これは総括方法により両センスの核酸をさらに生成
すめために利用できた。最後にターゲットを含有しない
対照（反応液３）は何も生成しなかった。
【００７２】
【表９】予備工程IV反応速度論 時間 反応液 １ ２ ３ １ ２ ３ （時間） フ゜ローフ゛(+)のRLU's フ゜ローフ゛(-)のRLU's 2 9695 1890 886 7979 1074 434 3 22266 2819 824 15018 1487 491 4 33863 4571 828 16540 2310 556 反応液１：プラスミド＋ＲＮＡ 反応液２：プラスミド 反応液３：ターゲット無し
【００７３】実施例１０ 総括方法による増幅 下記の実験は他の初期化方法が本発明において第１プラ
イマーの伸展と決定した末端の無いＤＮＡターゲットの
変性工程の必要性を緩和しうることが可能かどうかを決
定するために行った。この実験では既知量のターゲット
を表１０に示したように第１逆転写酵素の存在下あるい
は非存在下で増幅した。一度にすべての酵素を加える増
幅時間は４時間であった。使用したターゲットは正常生
理食塩水に希釈したＭ１３（＋）であった。Ｔ７ｐｒｏ
（＋）とＴ７ｐｒｏ（−）を使用した。２５μｌの各希
釈液に２５μｌの０．１Ｎ ＫＯＨを加えた。サンプル
を９８℃で１０分間インキュベートしついで冷却した。
各サンプルを１００μｌにして、最終濃度を５０ｍＭト
リズマ（Ｔｒｉｚｍａ）塩基、４０ｍＭグルタミン酸、
２５ｍＭ水酸化カリウム、１２．８ｍＭ塩化マグネシウ
ム、５ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭスペルミジン三
塩酸塩、２．５ｍＭ各リボヌクレオチドトリホスフェー
ト、０．２ｍＭ各デオキシリボヌクレオチドトリホスフ
ェート、および０．１５μＭ各プライマーとした。標準
プロトコール管に１３単位の逆転写酵素を入れ４２℃で
１２分間、ついに９５℃で２分間インキュベートし冷却
した。ついですべての試験管に１３単位の逆転写酵素、
１００単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよび０．５単位
のＲＮＡｓｅ Ｈを加えた。反応液を３７℃で４時間イ
ンキュベートしその１０μｌ部をケミルミネッセンスプ
ローブアッセイにて測定した。表１０の結果は短縮プロ
トコールを用いた場合にいくらかの増幅は明らかである
ことを示している。観察された増幅のレベルは有意に標
準プロトコールを用いた場合よりも低度であるが、これ
は同程度に有効になるように開発され得るし、あるいは
有意なレベルのターゲット核酸が存在する場合には有用
になり得る。
【００７４】
【表１０】第１プライマー伸展のない増幅 ターゲット モル プロトコール ＲＬＵ’ｓ Ｍ１３(＋) ３．８Ｅ−１７ 標準 ２２９５４５１ 〃 ３．８Ｅ−１９ 〃 ２３７４４４３ 〃 ３．８Ｅ−２１ 〃 ２３０２２７ 無 ０ 〃 ３０３７ Ｍ１３(＋) ３．８Ｅ−１７ 短縮 ２４７５５７４ 〃 ３．８Ｅ−１９ 〃 ２７２０９ 〃 ３．８Ｅ−２１ 〃 １７１４４ 無 ０ 〃 １６７９ これらのデータのもっとも予想される説明はＴ７ＲＮＡ
ポリメラーゼが完全には特異的ではないということであ
る。ターゲット領域の少数のＲＮＡコピーを生じる低レ
ベルのでたらめなＲＮＡ合成が存在する。これらのコピ
ーは標準方法により増幅される。
【００７５】我々の初期の研究はある種のプライマーセ
ットとターゲットで外因性ＲＮＡｓｅ Ｈなしで優れた
増幅を示した。反応のメカニズムを明らかにする我々の
次の研究で、広範囲のターゲットに本方法を有効的に適
用することが可能になった。我々はここに増幅に外因性
ＲＮＡｓｅ Ｈを用い、また逆転写酵素を伴うＲＮＡｓ
ｅ Ｈ活性に呼応する方法を開示しその権利を主張す
る。我々はＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅは常に増幅を改良
するわけではないので日常的に添加されるべきではない
ことを発見した。我々はＲＮＡｓｅ Ｈのいくつかの形
態はＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡのどこを切断
するかについての特異的な配列であることを確定した。
増幅反応において、我々は完全な長さの生成物ＤＮＡ中
のプロモーター含有プライマーを検出しなかった。２つ
のプロモータープライマーを用いた態様ではプロモータ
ープライマーのうちただひとつのみが完全な長さの生成
物ＤＮＡに測定可能な限りにおいてとり込まれている。
本分野の技術者により自明なすべての他のメカニズムは
両プライマーを含有する完全な長さの生成ＤＮＡを示唆
している。これらの発見はＲＮＡｓｅ Ｈが増幅の間に
合成された主要ＲＮＡ種を十分には分解していないとい
う可能性に因ると思われる。これらの発見に基づいて、
ＲＮＡｓｅ Ｈ配列特異性に関する我々の発見を組み入
れた新しい増幅メカニズムがここに提示される。新規で
有用なプロモータープライマー設計標準を開示する。さ
らには、ターゲット核酸配列の複数コピーを合成する新
規な方法をここに主張し、これは １）選択されたＲＮＡｓｅ Ｈによる分解にさらされた
後にプライマー伸展生成物を形成する能力を残すように
位置しているＲＮＡターゲットの部分と複合化するＲＮ
Ａターゲット配列の部分に相補であるプライマーを選択
し； ２）すべてのメッセンジャーＲＮＡが実質的にＲＮＡｓ
ｅ Ｈの分解を通して二重鎖から除かれる領域において
ＤＮＡと複合化するプライマーの伸展により得られるＤ
ＮＡの部分に相関であるプロモータープライマーを選択
し； ３）ＲＮＡターゲットとプライマー、プロモータープラ
イマー、ＲＮＡｓｅＨ、逆転写酵素をコンバインし、Ｒ
ＮＡの複数コピーとそのＲＮＡに相補のＤＮＡの複数コ
ピーを形成することを特徴とする。ここで開示の新規な
方法はＲＮＡターゲット配列と同じ極性(あるいはセン
ス)のＤＮＡの実質的に等数のコピーを作らない。
【００７６】この工程は新規なターゲットサイトのため
の優れたプロモータープライマーとプライマーの設計を
可能にする方法を提供する。我々はプロモータープライ
マーとプライマーのそのような組み合わせおよびそのた
めの設計標準をここに開示し主張する。ここで開示のメ
カニズムはＲＮＡ鎖の転写のための新規な反応中間体を
包含する。この中間体は二重鎖ＤＮＡプロモーター領域
を含むＲＮＡとＤＮＡの二重鎖複合体である。我々の知
る限りこのようにものはかつて文献に記載された事はな
い。実にどの先行技術システムも、特にグアテリ、Ｊ．
Ｃ．らの８７ＰＮＡＳ １８７４〜１８７８（１９９
０）もまたジンゲラス、Ｔ．Ｒ．らのＰＣＴ出願番号８
８／１０３１５号のいずれもＲＮＡｓｅ Ｈ分解サイト
の位置に基づいてプライマーとプロモータープライマー
配列を適切に選択していない。このように、本方法は新
規でありどの先行開示に対しても自明なものではない。
ＲＮＡｓｅ Ｈ配列特異性の重要さと反応メカニズムの
理解の認識は本ターゲット増幅法を広範囲のターゲット
配列に有効的に適用ための鍵である。さらに、従来同業
者はＲＮＡｓｅ Ｈは十分にまた組織的にＲＮＡ：ＤＮ
Ａ複合体のＲＮＡ鎖を分解しているとしていた。
【００７７】Ｉ：増幅法のメカニズム 増幅効率を両先行方法と調べると使用したプライマーセ
ットでのわずかな変動を伴う増幅効率に大きな変異が明
らかとなった。先行技術が一般に受け入れている反応方
法は我々の見るところでは、なぜ１つのプライマーセッ
トが他よりずっと優れて作用するのか合理的な説明をし
ていない。先行技術方法を用いて増幅法を改良する試み
では満足出来る結果が得られなかった。ＤＮＡ鎖を初期
化する能力での差がプライマーセット効率でみられた差
の原因かどうか知るためにプライミングの有効性を調べ
た。プライミング効率と総体的増幅の間に相関性はみら
れなかった。プライマーセットの自己相補構造と交差相
補構造を形成する能力の分析によりプライマー効率に於
ける差はこれらのファクターに単に原因があるのではな
いと判明した。我々はまたＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ
Ｈの添加が均一に増幅を改良するのではないことを発見
した。ここで提示するたデータが示すように、得られた
結果はターゲットからターゲットで、またプライマーセ
ットからプライマーセットで変化する。添加するＥ．ｃ
ｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの量は非常に重要であり狭い特
定の範囲内に保たなければならない。与えられたターゲ
ットとプライマーセットと共に、Ｅ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡ
ｓｅ Ｈの添加は逆転写酵素がトリ骨髄芽球細胞症ウイ
ルス（ＡＭＶ）由来のものでありモロニーマウス白血病
ウイルス（ＭＭＬＶ）でない場合には有利である。これ
らの結論を示すデータを下記に記す。初期の研究ではＡ
ＭＶ逆転写酵素はウイルス複製の間に形成されたＲＮ
Ａ：ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを消化する時に比較
的大きなフラグメントを残すことが示唆された。これら
のフラグメントはプライマーとして第２ＤＮＡ鎖の合成
を初期化する。我々はＡＭＶとＭＭＬＶ ＲＮＡｓｅ Ｈ
活性の配列特異性の証拠があるという発見をここに報告
するものである。
【００７８】反応メカニズムを明確にするために、個々
のプライマーの末端を32Ｐで標識し、各プライマーのＤ
ＮＡ生成物へのとり込むをポリアクリルアミドゲル電気
泳動により調べた。一般的に受け入れられている先行技
術メカニズムによれば、両プライマーは完全な長さのＤ
ＮＡ生成物にとり込まれていることになる。しかしなが
ら我々の実験では増幅の間に合成された主要ＲＮＡ種に
相補するプライマーのみが完全な長さの生成物にとり込
まれていた。主要ＲＮＡ鎖と同じ極性を持つプライマー
は決して完全な長さのＤＮＡ生成物にとり込まれなかっ
た。事実、それは全く小さいままで残った。これらの結
果は多数の異なるターゲットとプライマーセットで確認
された。プライマーの一つの伸展を検出出来なかったこ
とから、完全な二重鎖ＤＮＡ中間体は増幅の間に蓄積し
ないこと、また自触増幅には要しないことが示唆され
た。これらの観察はＲＮＡｓｅ Ｈの可能な配列特異性
を考慮した本発明の増幅システムのメカニズムを示唆す
る。本メカニズムを大まかに図４に示す。実験により酵
素がＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを特殊な切片
に切断することが判明した。さらに、切断サイトの位置
は特異な領域にあることが判明した。メカニズムを確認
するために、我々のＴ７ｐｒｏ+／Ｔ７ｐｒｏ-ターゲッ
トとプライマーセットの組み合わせから生じたプラス鎖
ＲＮＡを含有したＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを調製し
た。32Ｐ標識ＲＮＡをメッセンジャーＤＮＡにハイブリ
ッドし、ＡＭＶ逆転写酵素（付随するＲＮＡｓｅ Ｈ活
性を含有している）とインキュベートし反応生成物をポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分析した（図２６）。
フラグメントの大きさから数個の小さな切片が生成しこ
れらは１つあるいは両方の末端の近くを切断して生成し
たことが判明した。分子の内部部分は切断されなかっ
た。この実験は酵素が使用した反応条件下で配列あるい
は構造特異性を持つことを示している。結果は図２２〜
２５の反応メカニズムと完全に一致する。
【００７９】切断サイトがどこで起こるかを決定するた
めにさらに実験を行った。複数切断サイトはプロモータ
ー含有プライマーと一致する領域にあり他のプライマー
を結合する領域には無いことが望ましい。ＲＮＡ末端を
個々に標識し消化生成物を分析することにより、使用し
た条件下で切断はＲＮＡの５’末端のみに検出されるこ
とが判明した。これは図４のメカニズムと一致する。Ａ
ＭＶおよびＭＭＬＶ逆転写酵素のＲＮＡｓｅ Ｈ活性が
切断する配列を調べるために配列決定実験を行った。特
異的に各々の酵素で切断されることにより配列は識別さ
れる。予測通り、２つの酵素の配列特異性は異なりこれ
はあるプライマーセットは一つの酵素とまた別のプライ
マーはもう一つの酵素とより機能することを説明すると
思われる。我々の反応条件下でＭＭＬＶ酵素で得た配列
特異性は文献に記載の別の反応条件下でのものと一致し
ない。これは特異性は反応条件により影響され得ること
を示唆している。増幅メカニズムに於けるＲＮＡｓｅ
Ｈの役割の詳細に調べるとｃＤＮＡコピーからの転写を
指示するプロモーターの完全な除去は必要でなく、ある
いは新規の転写活性鋳型の形成に望ましいという我々の
発見に達した。つまりいくつかの適用に於いては、もし
ＲＮＡｓｅ Ｈがプロモータープライマーが第１鎖ｃＤ
ＮＡ生成物にアニーリングする上でさらにサイトに選択
的であれば、またもし他のプライマーが転写物にアニー
リングするのにもっと阻害しなければ、逆転写酵素固有
のＲＮＡｓｅ Ｈ由来の非常に低レベルのＲＮＡｓｅ Ｈ
活性でさえ効果的な増幅に十分であろう。
【００８０】Ｅ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈはレトロウ
イルス酵素よりも伝えられるように特異的でないので、
特にもしこのプライマー、ターゲット、Ｅ．ｃｏｌｉ．
ＲＮＡｓｅ Ｈ、および酵素活性に影響を及ぼす成分の
濃度が慎重に釣り合っていない場合には、非プロモータ
ー含有プライマーが結合している領域に割って入るかも
しれない。我々の見るところ、これらの結果はＥ．ｃｏ
ｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの使用を商業的な分野での適用に
適しなくしている。逆転写酵素ＲＮＡｓｅ Ｈが所望の
領域で切断しない場合や適した条件下で切断しない場合
には、異なる特異性を持つ他のＲＮＡｓｅ Ｈ活性の添
加は有効である。例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素での研究
により、この酵素はＡＭＶ酵素よりもサンプルＤＮＡに
よる阻害に敏感でないことが判明した。多くのシステム
に於いてこれは最良の様式である。新しいプライマーセ
ットが設計され、模型と我々が今までに得たＲＮＡｓｅ
Ｈ配列特異性情報に基づいて開示される。メカニズムや
配列特異性の知識がない以前に設計されたもので得たも
のよりも、有意に優れた合成がこれらのプライマーセッ
トから得られた。ここに記載の本発明は特異的なターゲ
ット領域の為の機能的なプライマーセットの設計を可能
にする。我々が開示する新しいメカニズムはＲＮＡ鎖の
転写の為の新規な反応中間体を包含する。この中間体は
ＲＮＡとＤＮＡの二重鎖複合体であり、これはまた二重
鎖ＤＮＡプロモーター領域を包含する。我々の知識では
この反応は述べた通りどの先行技術とも異なる。反応メ
カニズムを理解することはこれらのターゲット増幅工程
を使用する上で重要である。ＲＮＡｓｅ Ｈ配列特異性
の重要性を認識することは本ターゲット増幅法を広範囲
のターゲット配列に有効的に適用する上での鍵である。
一方、プロモータープライマー設計の実験的研究は困難
で経費がかかり、また成功の頻度も低くて本発明をこの
分野での貴重な進歩とする。
【００８１】Ａ．ＲＮＡｓｅ Ｈ活性濃度の狭範囲 Ｅ．ｃｏｌｉ． ＲＮＡｓｅ Ｈを用いた増幅システム
は、先に述べたように大量の合成が特殊なターゲットと
プライマーセットで得られるために当初は好ましい態様
とみなされていた。またＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈ
はサンプルＤＮＡによる阻害を克服するのを助長する上
で有用であると発見された。しかしながら、反応の分析
によりＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの添加は多くの場
合に増幅に不利益であることが判明した。さらに過剰量
あるいは過小量のＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの存在
は有害なのでその添加量は狭い範囲内だ注意深く調整さ
れなければならない。本方法を実用的に商業上適用する
にあたっては、特に酵素が保存にあたって完全に安定で
ないかも知れないためにこれは重大な障害である。さら
にＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの使用によりこのシス
テムに過大な経費と煩雑さが加わる。経費は多くの商業
的適用にとっては禁制である。Ｅ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓ
ｅ Ｈの使用はアッセイをさらに複雑にし、その代わり
に研究開発経費を上昇せしめこのアッセイを広範囲の商
業的適用にとって繊細すぎるものとしてしまう。このよ
うにアッセイメカニズムに対する我々の説明は技術的に
実行可能（ターゲットサイトへの適用性）でまたより安
価でより丈夫な工程である点において広範囲の使用に適
した方法に帰着した。初期の実験でＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮ
Ａｓｅ Ｈの添加が増幅上昇を起こすことが判明したの
で、血清やヒトＤＮＡを含有したサンプルでの増幅シス
テムの実行に及ぼすＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの効
果をいくつかの実験で調べた。
【００８２】実施例１１ Ｅ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈ濃度の最適化 血清での最適増幅に必要なＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ
Ｈ量を決定するために実験を行った。下記の実験はＴ７
ｐｒｏ+／Ｔ７ｐｒｏ-プライマー対での０、０．２５、
０．５および１単位のＲＮＡｓｅ Ｈ存在下で増幅を比
べた。ＨＢＶ-ヒト血清のレベルまで希釈したＨＢＶ＋
血漿あるいはＨＢＶ-血清を単独で調べた。１０μｌの
血清を当量の０．１Ｎ ＫＯＨに加え蒸発を防ぐために
油層で覆った。サンプルを混合し９５℃で加熱し室温ま
で放冷した。サンプルを９０μｌの反応容積にして最終
濃度を５０ｍＭトリス酢酸ｐＨ７．６、２０．８ｍＭＭ
ｇＣｌ2、５ｍＭジチオスレトール、２ｍＭスペルミジ
ン塩酸塩、０．１５μＭ各プライマー、６．２５ｍＭ
ＧＴＰ、６．２５ｍＭ ＡＴＰ、２．５ｍＭ ＵＴＰ、
２．５ｍＭ ＣＴＰ、０．２ｍＭの各ｄＴＴＰ、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、および１３単位のＡＭＶ逆転
写酵素とした。サンプルを混合し３７℃で１２分間加熱
しついで９５℃まで加熱してさらに室温まで冷却した。
１３単位のＲＴと１００単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
を加え反応混合物を３７℃で３時間インキュベートす
る。２５μｌの各反応混合物を測定した。データより
Ｅ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの濃度はこのシステムの
各反応毎に０．２５単位のＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ
Ｈ付近を中心とした狭い最適範囲にあることが判明し
た。Ｅ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈは使用が困難ではあ
るけれどもいくらかのＲＮＡｓｅＨ活性の添加はこの実
験で有用である。
【００８３】
【表１１】 ターゲット(モル) ＲＮＡse Ｈ（単位） 実測ＲＬＵ ５×１０-20 ０ ５６７８０９ ５×１０-22 １８０４１ ５×１０-23 ２９３８ ０ １６３４ ５×１０-20 ０．２５ １１５３３６６ ５×１０-22 ７３２１０９ ５×１０-23 ５５６６ ０ １４２３ ５×１０-20 ０．５ １００１９０４ ５×１０-22 ２９５９６ ５×１０-23 １７９３ ０ １８９８ ５×１０-20 １．０ ６１０４８５ ５×１０-22 １３０２６ ５×１０-23 ４０６２ ０ １６６２
【００８４】実施例１２ つぎにＨＩＶプライマー対の最適増幅に必要なＥ．ｃｏ
ｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの量を８μｇのヒトＤＮＡを含有
した溶解産物の存在下または非存在下で測定した。２×
１０-18モルのウイルスターゲットが各反応混合物に存
在した。ＤＮＡターゲットは５０ｐモルの各プライマー
と４０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．３、２５ｍＭ ＮａＣ
ｌ、２０．８ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭジチオスレイトー
ル、２ｍＭスペルミジン塩酸塩および表１１に示したヌ
クレオチドトリホスフェートの存在下混合し、９５℃ま
で加熱し室温まで冷却した。１３単位の逆転写酵素を加
え反応混合物を４２℃まで１２分間加熱し、９５℃まで
加熱し再び室温まで冷却した。１３単位のＡＭＶ逆転写
酵素と１００単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加え３７
℃で３．５時間加熱した後測定した。
【表１２】溶解産物 ＲＮＡｓｅ Ｈ ＲＬＵ − ０ 単位 ８,４００ − ０．５ ２３９,０００ − １．０ ４６８,０００ − １．５ ４９８,０００ − ２．０ ４３９,０００ − ３．０ ２０,１００ − ４．０ ５,８０６ ＋ ０ １,６６７ ＋ ０．５ ９２４ ＋ １．０ ６,６３５ ＋ １．５ ５７９ ＋ ２．０ １３,４００ ＋ ３．０ １７,８００ ＋ ４．０ ９,１５２ これらの結果はＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈレベルは
過剰量のＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈが増幅に有害な
ので注意深く調整されなければならないことを示してい
る。さらに最適濃度は非特異ヒトＤＮＡの存在により変
化し、ヒトＤＮＡによる阻害はすべてのＲＮＡｓｅ Ｈ
レベルで重大であった。
【００８５】実施例１３ 大腸菌ＲＮＡseＨの、ＨＩＶ領域２と称する第２領域の
増幅への効果を調べた。以下のデータは大腸菌ＲＮＡse
Ｈが狭い濃度範囲で増幅を促進することを証明してい
る。ＨＩＶ領域２プライマーは表１２に関して述べたよ
うに、種々の濃度の大腸菌ＲＮＡseＨの存在下で増幅さ
れた。各反応混合物１０μlを分析し、必要に応じて希
釈した。生成した標的（ターゲット）を定量するため
に、シグナルを標準曲線と比較した。
【表１３】 ＲＮＡseＨ 標的（pmol) 生成物(pmol) 増幅の観測値 - 0 0 0 - 1.67 × 10-10 2.14 1.3 × 1010 0.2 U 1.67 × 10-10 0.17 1.0 × 109 0.4 U 1.67 × 10-10 0.18 1.1 × 109 1.2 U 1.67 × 10-10 0.012 7.6 × 107 - 1.67 × 10-8 16.0 9.6 × 108 0.2 U 1.67 × 10-8 20.6 1.2 × 109 0.4 U 1.67 × 10-8 0.14 8.5 × 106 1.2 U 1.67 × 10-8 0.15 9.0 × 106
【００８６】これらのデータは、ガテリら（Guatelli，
87 PNAS 1874-1878）の説とは逆に、大腸菌ＲＮＡseＨ
を加えなくとも増幅が達成され得ることを示している。
本発明者らは幾つかの標的領域で大腸菌ＲＮＡseＨとＭ
ＭＬＶ逆転写酵素とを用いて調べた。実施例１２に記載
の条件下、ヒトＤＮＡ８μｇの存在下または非存在下、
３時間の自己触媒工程の反応を行った。ＨＩＶ領域１、
３および４からのプライマーセットを試験した。使用す
るウイルス性鋳型は、ハイブリダイゼーションアッセイ
でＲＬＵが直線領域にあるよう選択した。ＭＭＬＶ逆転
写酵素を、開始時４００Ｕ、増幅期８００Ｕで用いた。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼも含有させ、大腸菌ＲＮＡ
１Ｕを指示の通り加えた。最上欄の＋ＲＮＡseＨ、−Ｒ
ＮＡseＨの項の下の値はアッセイ反応液１０μlに関し
て得たＲＬＵ値である。
【００８７】
【表１４】標的領域 標的(mol) ヒトDNA +RNAseH
-RNAseH HIV領域1 2 × 10-21 - 54,900
137,000 HIV領域1 2 × 10-21 8 μg 15,100
13,800 HIV領域3 2 × 10-20 - 96,100
391,000 HIV領域3 2 × 10-20 8 μg 124,000
246,000 HIV領域4 2 × 10-21 - 20,400
107,000 HIV領域4 2 × 10-21 8 μg 56,000
8,800 ＤＮＡの存在下、大腸菌ＲＮＡseＨは明らかにＨＩＶ領
域４プライマーによる増幅を刺激した。試験した大多数
の場合、ＭＭＬＶ逆転写酵素単独使用の場合の増幅は、
少なくとも、ＭＭＬＶ逆転写酵素と大腸菌ＲＮＡseＨの
併用時と同様に良好であった。ガテリら（Guatelli， 8
7 PNAS 1874-1878）の説とは逆に、効率的な増幅は大腸
菌ＲＮＡseＨを必要としなかった。
【００８８】逆転写酵素の配列特異性 本発明者らは、あるプライマーセットは、ＡＭＶ逆転写
酵素と併用するとその作用が最良となるのに対し、他は
ＭＭＬＶ逆転写酵素との併用、またはいずれか１つの逆
転写酵素に大腸菌ＲＮＡseＨを添加した時その作用が最
良となることをも見いだした。プロモータープライマー
およびプライマーまたは大腸菌ＲＮＡseＨの起源を少し
変化した場合の、増幅効率の変動の観測値は本発明機構
を支持している。これらの発見を支持する詳細なデータ
を以下に記載する。 ＭＭＬＶ逆転写酵素はクローン化されており、３００単
位／μl以上の高濃度でＢＲＬ（Bethesda Research Lab
s)やＵ．Ｓ．Biochemicalsから購入することができる。
注意すべき点は、ＭＭＬＶ逆転写酵素の天然の核酸鋳型
に対するＤＮＡ合成活性は、ＡＭＶ逆転写酵素との比較
で、約１０倍高い単位濃度で得られることである。単位
活性における類似性の欠如は、ホモポリマー鋳型（単位
活性アッセイに使用）を用いた場合と、ヘテロ重合核酸
鋳型を用いた場合に酵素が異なる相対活性を示すことに
よる。本発明における増幅反応において、種々の濃度の
ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて試験した。これらの結果の
例を以下の表に示した。ＡＭＶ逆転写酵素試料の場合、
開始段階で逆転写酵素を１４Ｕ用い、増幅段階で５６Ｕ
用いた。開始段階および増幅段階におけるＭＭＬＶ逆転
写酵素量を測定した。ＨＩＶ領域２プライマー各１５pm
olを用い，ＮaＣlの代わりに２５mＭ ＫＣlを用いる外
は、実施例１２記載のインキュベーション条件を用い
た。Ｔ７ポリメラーゼ４００Ｕを増幅期間中に用いた。
ヒトＤＮＡ８μｇの存在下または非存在下に行った結果
を以下の表に示す。ＡＭＶまたはＭＭＬＶで示した欄
は、それぞれＡＭＶ逆転写酵素またはＭＭＬＶ逆転写酵
素による増幅作用の結果を示す。数字は開始、および自
己触媒期間のそれぞれにおいて用いた値（単位）を示し
ている。表中の値はＲＬＵである。増幅生成物は希釈さ
れておらず、用いた条件下で約２５０，０００ＲＬＵを
与えるに十分な濃度のハイブリダイゼーション標的でシ
グナルが飽和するので、＞２００，０００ＲＬＵの値で
は増幅程度が有意に低く見積もられているかもしれな
い。
【００８９】
【表１５】 ヒト AMV MMLV MMLV MMLV標的（mol） DNA 14/56 400/400 400/600 400/800 0 - 495 470 - 3,800 1.6 × 10-22 - 278,000 77,000 - 5,621 1.6 × 10-20 - 292,000 278,000 - 269,000 0 + 474 547 488 1,352 1.6 × 10-20 + 10,200 62,700 205,000 149,000 ヒトＤＮＡの非存在下におけるＭＭＬＶ逆転写酵素の指
令による増幅の感度はＡＭＶ指令による増幅よりも有意
に低いが、外因性ＤＮＡの存在下ではＭＭＬＶは非常に
有効であった。
【００９０】ＨＩＶ領域２の高レベル増幅を観察した
後、本発明者らはＡＭＶ逆転写酵素を用いてヒトＤＮＡ
の存在下、他の標的領域を試験した結果、これらの領域
の最良の増幅には大腸菌ＲＮＡseＨがなお必要であるこ
とを見いだした。次いで、大腸菌ＲＮＡseＨの非存在
下、ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて各領域の増幅を試験
し、ＡＭＶ逆転写酵素＋大腸菌ＲＮＡseＨを含有する反
応での増幅と比較した。これらの結果の幾つかを以下の
表に示した。実施例１２の記載に従ってＨＩＶ領域３お
よび４プライマーを用いた（５０pmol／反応）。ＡＭＶ
逆転写酵素を用いる反応では開始に際して１４Ｕ用い、
増幅に際して逆転写酵素５６Ｕ＋大腸菌ＲＮＡseＨ１Ｕ
を用いた。ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いる反応では開始に
際して４００Ｕ加え、増幅に際して８００Ｕを加えた。
４時間の増幅インキュベーション期間中、全反応混合物
中にＴ７ポリメラーゼ４００Ｕを存在させた。表中の値
は増幅反応混合物１０μlを用いて行った、ホモジーニ
アスプロテクションアッセイで得たＲＬＵ値である。ア
ッセイ前に反応混合物を希釈した場合もある。
【００９１】
【表１６】 ＨＩＶ領域２で観察されたように、ヒトＤＮＡの非存在
下ではＭＭＬＶによる増幅はＡＭＶ逆転写酵素＋大腸菌
ＲＮＡseＨによる増幅よりも有意に低いが、ＤＮＡの存
在下ではＭＭＬＶによる増幅は少なくともＡＭＶ逆転写
酵素＋ＲＮＡseＨ.４２によって達成される増幅と同じ
く良好であった。
【００９２】実施例１４ ＨＢＶゲノムの第２領域の
ためのプライマー 以下の実験はＨＢＶゲノムの２つの領域に向けたプライ
マーセットを用いて行われた。データはプライマーセッ
トがＡＭＶ ＲＴと同程度には増幅しないことを示して
いる。実験はＨＢＶ陰性血清で希釈した陽性血漿を用
い、実施例１１記載のごとくに行った。増幅反応混合物
１０μlをハイブリダイゼーションアッセイに付した。
【００９３】
【表１７】 これらの結果を標準的なプロトコールを用いる追加実験
で確認した。領域１プライマーはこれらの実験でも高い
ＲＬＵであり一致した結果を示した。
【００９４】対照的に、同じ２つのプライマー対の増幅
にＭＭＬＶ酵素８００Ｕを用いると、 下記表に示すよ
うに反対の効果が認められた。
【表１８】 ＲＬＵ観測値標的（mol） 領域１ 領域２ 9.6 × 10-20 37,278 1,067,951 9.6 × 10-22 1,858 40,826 0 1,010 1,646 この実験では、各反応混合物中に血清５μlが含有され
ていた。このように、各プライマー対の増幅能力は増幅
期間中存在する逆転写酵素の影響を受けた。鋳型配列の
利用可能性等のファクター、プライマーの特異的ハイブ
リダイゼーション能力、およびＲＮＡ合成の効率に対す
る逆転写酵素の影響は有意でない。ＲＮＡseＨの特異性
や活性、およびＤＮＡのポリマー化活性にも影響しない
であろう。
【００９５】下記のデータは、適当な条件下でプロモー
ター−プライマーを組合せて用いると増幅が増大するこ
とを例示している。この実験は、全増幅反応をハイブリ
ダイゼーション法で分析したことを除き、表１１の項で
述べたと同様に行った。
【表１９】標的分子 標的（mol） ＲＬＵ観測値 1200 2 × 10-21 1,094,177 120 2 × 10-22 442,137 12 2 × 10-23 24,053 1.2 2 × 10-24 8,654 0 0 1,828
【００９６】実施例１５ ＡＭＶ逆転写酵素とＭＭＬＶ
逆転写酵素の比較 以下の実験はＭＭＬＶ（３００単位）またはＡＭＶ（３
９単位）を用いてＣＭＬ患者の染色体に発見されたＢＣ
Ｌ−２染色体転座主要ヒト染色体ブレイクポイントｔ
（１４；１８）のためのプライマーの増幅に関する比較
実験である。各酵素について、大腸菌ＲＮＡseＨの作用
を評価した。増幅は２４mＭ ＭgＣl2およびプライマー
各５０pmolを用いる外は実施例１２記載の方法に従って
増幅を行った。溶解液（リゼート）を含有する反応液に
は白血球由来のＤＮＡ４μｇが存在していた。全反応混
合物はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ３００単位とインプット
２本鎖ＤＮＡ標的１０amolを含有していた。
【００９７】
【表２０】 結果はＭＭＬＶおよびＡＭＶ ＲＴが、特に大腸菌ＲＮ
ＡseＨの非存在下では、同程度にこのプライマーセット
を増幅しないことを示すものである。ＡＭＶ逆転写酵素
を含有する反応混合物に大腸菌ＲＮＡseＨを加えると増
幅が顕著に増大する。このことはこれらの反応ではＲＮ
Ａse活性が制限されていることを示唆するものである。
逆に、ＭＭＬＶ ＲＴを含有する反応混合物に大腸菌Ｒ
ＮＡseＨを加えても増幅は促進されなかった。これらの
データによっても、以前に、ＭＭＬＶ ＲＴには、大量
の非特異的ヒトＤＮＡの存在下での有意な増幅を維持す
る能力があるという指摘が確認された。
【００９８】Ｃ．１つのプライマーは完全長さの生成物
には取り込まれない 本発明者らの最も重要な発見の１つは、主ＲＮＡ種と同
じ極性を持つプライマーが検出可能な程度には完全長さ
の生成物に取り込まれないということであった。このこ
とを証明するために、個々のプライマーを32Ｐで末端ラ
ベルし、各プライマーのＤＮＡ生成物への導入をポリア
クリルアミドゲル電気泳動で調べた。本発明者らは、当
初、両プライマーが共に完全長さのＤＮＡ生成物に取り
込まれると予測していた。しかしながら、プロモーター
を含有するプライマーは完全長さのＤＮＡ生成物中に見
い出すことができなかった。実際、それは非常に小さい
ままであった。これらの結果は多くの異なる標的および
プライマーセットによって確認された。本発明者らの方
法を以下に説明する。自己触媒期間に蓄積されたｃＤＮ
Ａの種を同定するためにプライマーの５’末端をＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼで32Ｐラベルし、増幅反応混合
物に打ち込んだ（スパイクした）。以下の実施例は、１
つの極性のプライマーが増幅の間に優先的に蓄積され、
その蓄積される鎖は常に、自己触媒中に合成された優勢
なＲＮＡ種と相補的な鎖であることを示している。図２
６は増幅期間中に32ＰラベルＨＩＶ領域２が取り込まれ
たという結果を示す。このプライマーセットから、
（＋）センスの２１４塩基からなるＲＮＡが得られた。
ＲＮＡに相補的なプライマーは、標的配列の存在下、２
３５および２１４塩基の主バンドに取り込まれた（レー
ン３）。標的非存在下では完全長さの断片は見られなか
った（レーン４）。２１４塩基の断片はＲＮＡと同長の
ｃＤＮＡを表しているが、２３５塩基断片はＲＮＡ＋Ｔ
７プロモーター配列（２１塩基）を表している。逆に、
このプロモータープライマーは標的存在下、または非存
在下における完全長さＤＮＡ生成物には観察されなかっ
た（それぞれレーン１および２）。
【００９９】図２６のレーン５−８は増幅期間中の32Ｐ
ラベルＨＢＶ領域１プライマーの導入結果を示してい
る。これらはＴ７pro+およびＴ７pro-として知られてい
る。このプライマーセットは２極性を有する１３２塩基
ＲＮＡを産生し得るが（＋）鎖ＲＮＡが優勢である。優
勢なＲＮＡに相補的なＴ７pro-は本発明で提供した機構
の通り、１３２塩基および１５３塩基の断片に取り込ま
れた（レーン７、（＋）標的；レーン８、（−）標
的）。１５３塩基断片はＴ７pro+のＲＮＡ＋Ｔ７プロモ
ーター配列（２１塩基）を表している。逆に、32Ｐラベ
ルＴ７pro+プライマーはいずれの長さの断片にも取り込
まれなかった（レーン５、（＋）標的；レーン６、
（−）標的）。ゲル電気泳動で分析した反応混合物をＨ
ＰＡによって分析し、優勢なＲＮＡと同じ極性のｃＤＮ
Ａを別の方法でも検出できるかを調べた。作成された鎖
の相対比率を決定するためにプラスおよびマイナス鎖プ
ローブを用い、各反応混合物の一部をＲＮＡseＡで処理
してＲＮＡとＤＮＡの比率を求めた。結果を以下に示
す。
【０１００】
【表２１】 プローブの極性 プライマーセット ＲＬＵ ＲＬＵ 未処理 ＲＮＡseＡ （−） ＊ＨＩＶ領域２ 679,182 1,037 ＊ＨＩＶ領域２ 453,675 1,464 （＋） ＊ＨＩＶ領域２ 32,922 1,094,249 ＊ＨＩＶ領域２ 39,494 655,595 （−） ＊ＨＢＶ領域１ 567,110 4,854 ＨＢＶ領域１ 671,656 4,210 （＋） ＊ＨＢＶ領域１ 56,550 303,160 ＨＢＶ領域１ 77,983 450,332 ＊＝32Ｐラベル(＋)鎖プライマー、その他、32Ｐラベル(−)鎖。 これらの結果は完全長さの生成物がプロモータープライ
マーで観察されない場合でも増幅が十分に作動していた
ことを示すものである。これらの結果は従来の研究にお
いて観察されたこと、即ち、１個のセンスプローブで観
察されるシグナルの大多数はＲＮＡに由来しているこ
と、そして相補的な鎖シグナルは予測通りＤＮＡに由来
する、ということに関連している。両極性のＲＮＡから
作成されたＨＢＶ領域１プライマーセットについてさ
え、このことは正しい。
【０１０１】Ｄ．酵素がＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの
特異的部位を切断するということを示す機構の確認 上記の実験および観察結果に基づいて、ＲＮＡseＨ中に
あり得る配列特異性を考慮した増幅システムを図２２〜
２５に示した。この機構をサポートする上で重要な要素
はＲＮＡseＨ配列特異性であることから、酵素が実際に
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを特異的な部位で切断する
ということを示す必要がある。しかもこの切断部位は、
良好な増幅のためには、モデルにしたがって、特異領域
内に存在していなければならない。この疑問を解くため
に、既知の標的とプライマーセットの組み合わせで生成
されるＲＮＡ：ＤＮＡハイブリドを調製した。ＲＮＡを
32ＰでラベルしＡＭＶ逆転写酵素（その関連ＲＮＡseＨ
活性を含有する）と一緒にインキュベーションし、反応
生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。
結果は、新規な反応機構と完全に一致していた。即ち、
断片のサイズは、数個の小片が生成しこれらは１方また
は両方の端付近で切断されて生成したものであることを
示していた。分子の内部領域は切断されていなかった。
この実験で、用いた反応条件下で酵素が配列または構造
特異性を有することを確認した。提供した機構において
はプロモーター含有プライマーが結合する領域で複数の
切断が起きることを必要とするので、切断の起きる位置
を決定するためにさらに実験を行った。個別にＲＮＡの
末端ラベルし、消化生成物を分析することで、それらの
切断がＲＮＡの５’末端においてのみ起きることが示さ
れた。これはまた提供した機構と一致することである。
【０１０２】実施例１６ 図２７は特異的ＲＮＡseＨ開裂部位における、ＡＭＶ、
ＭＭＬＶおよび大腸菌切断由来のＲＮＡseＨ活性を示
す。図中の矢印は完全長さＲＮＡの位置を示す。図２７
ａは32Ｐで内部標識したＨＩＶ領域２を１本鎖配列とハ
イブリダイゼーションしＡＭＶ由来ＲＮＡseＨで４５分
間（レーン２）、ＭＭＬＶ由来ＲＮＡseＨで５、１５、
４５または１２０分間（レーン３−６）、または大腸菌
由来ＲＮＡseＨで５分間（レーン７）ニックトランスレ
ーションしたものである。生成した断片のサイズは各酵
素によって異なり、酵素開裂の特異性およびこの鋳型に
ついての特異性が酵素間で異なることを示している。最
も急速な分解は大腸菌ＲＮＡseＨの存在下で観察され、
この酵素の切断が、特異性においてより低いことあるい
は活性がより高いことを示唆している。図２７ｂはＨＢ
Ｖ領域１ＲＮＡを合成標的配列とハイブリダイゼーショ
ンし、ＡＭＶ逆転写酵素由来のＲＮＡseＨで５、３０、
６０または１２０分間（レーン２−５）または大腸菌由
来ＲＮＡseＨで１、３、１５または６０分間（レーン６
−９）、ニックトランスレーションした結果を示す。２
個の酵素により異なるサイズの断片が生成し、開裂の特
異性を示した。ＨＢＶ ＲＮＡの３’末端をラベルし、
ＡＭＶ逆転写酵素でニックトランスレーションすると同
じサイズの断片が観察され、開裂部位がＲＮＡの５’末
端に近いことを示した。これらのデータは特異的な部位
がＡＭＶ由来ＲＮＡseＨ、ＭＭＬＶ由来ＲＮＡseＨおよ
び大腸菌由来ＲＮＡseＨで開裂されること、およびこれ
ら３酵素における部位の幾つかは異なっていることを示
している。増幅される領域内に特異的な部位が存在する
ことはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを開裂さ
せ、能率的な自己触媒作用がもたらされる。切断部位情
報を用いて設計されたプライマーは増幅効率を改善す
る。このことは、あるプライマーセットの増幅程度がＲ
ＮＡseＨの供給源に依存して様々な程度に変化するとい
う本発明者らの観察と一致している。
【０１０３】Ｅ．ＭＭＬＶ ＲＮＡseＨおよびＡＭＶ
ＲＮＡseＨ切断部位の同定実施例１７ ＡＭＶ ＲＮＡseＨによる消化部位を同定するためにＲ
ＮＡを相補的配列とハイブリダイゼーションし、ＡＭＶ
ＲＮＡseＨでニックトランスレーションした。変性
後、配列決定すべき領域の３’末端に相補的なプライマ
ーとハイブリダイゼーションし、サンガーの配列決定法
に従い、ジデオキシヌクレオチドの存在下で伸長した。
ｃＤＮＡ合成の終結、これはＲＮＡ開裂を示すが、はＨ
ＢＶ ＲＮＡの以下の部位で観察された。 5' GGGAGAGGUUAUCGC*UGGA*UGUGUCUGCGGCGUUUUAUCA*UAU UCCUCUUCA*UCCUG・・・3' ＭＭＬＶ ＲＮＡseＨによる消化部位を同定するために
ＲＮＡと相補配列とをハイブリダイゼーションし、ＭＭ
ＬＶ ＲＮＡseＨでニックトランスレーションした。変
性後、配列決定すべき領域の３'末端に相補的なプライ
マーとハイブリダイゼーションし、サンガーの配列決定
法に従い、ジデオキシヌクレオチドの存在下で伸長し
た。ｃＤＮＡ合成の終結はＨＢＶ ＲＮＡの以下の部位
で観察された。 5' GGGAGAGGUUAUCGC*UGGA*UGUGUCUGCGGC*GUUUUAUCA* UAUUCCUCUUCAUCCUGC*UGCUAUGCCUCA*UCUUC・・・-3' 以下の部位は第２のＨＢＶ ＲＮＡ配列と同定された。 5' GGGAGACCCGAGAU*UGA*GAUCUUCUGCGAC GCGGCGAU*UGA*GAUCUGCGUCU*GCGAGGCGAGGGAGU*UCU*UCUU*
CUA GGGGACCUGCCUCGGUCCCGUC*GUCUA・・・3' 以下の部位はＨＩＶ ＲＮＡ配列と同定された。 5' GGGAGACAAA*UGGCAGUA*UUCAUCCAC AAUUUUAAAAGAAAAGGGGGGAUUGGGGGGUA CAGUGCAGGGGAAAGAAUAGUAGACAUAAUAGC*AACAGACA UAC*AAACUAAAGAAUUACAAAAACAAAUUAC*AAAAAUUCAA AAUUUUCGGGUUUAUUACAGGGAC*AGC*AGAAA・・・3' 大多数の開裂部位はＣＡまたはＵＧジヌクレオチドの近
くに存在する。開裂部位の検出に用いた方法では開裂反
応の間に蓄積された部位が同定されたにすぎない。使用
した方法で認識された部位以外の部位でも開裂が起きる
と予測される。
【０１０４】Ｆ．増幅システムのためのプライマー 種々のＲＮＡseＨ酵素が配列特異性を有するという知見
に基づいて本発明者らは様々なプライマー／標的の組み
合わせを試験しそれらの増幅システムにおける動向を適
正化することを試みた。今日までに得られたデータは生
成したＲＮＡ断片の各片のサイズが比較的大きく、断片
はおそらく２本鎖から自然発生的に解離したものではな
いことを示唆している。このことは、ＡＭＶ逆転写酵素
を用いて行ったＡＭＶ ＲＮＡまたはポリオウイルスＲ
ＮＡの複写実験において、最初に合成されたｃＤＮＡ鎖
からのｃＤＮＡの合成におけるプライムに、ＲＮＡseＨ
によって産生されたＲＮＡ断片を酵素が用いることが分
かったことから、予想外なことではない。ＲＮＡseＨ酵
素が配列特異性を有するならば、増幅反応は以下のごと
くに進行するであろう（反応混合物中のＲＮＡ中間体か
ら開始して）。増幅中に生成した主プライマー種に相補
的なプライマーがＲＮＡの３’末端に結合する。反応混
合物中のプライマー濃度は高いので、過剰のプライマー
により生成されたＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖は合成を開始し
得る前にＲＮＡseＨ活性によって開裂されるであろう。
従って、プライマー結合領域は、反応に用いるＲＮＡse
Ｈが認識する配列を多数含有しないことが好ましい。切
断部位が頻繁に存在するので、認識された切断部位を含
まないＲＮＡ相補プライマーを実際に設計し得ない場合
もあるかもしれない。そのような場合、プライマーの
３’末端部位をＲＮＡとのアニーリングのために保持す
るために切断部位はできるだけ５’末端に近くすべきで
ある。プライマーを適当なＤＮＡポリメラーゼで伸長す
ると、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する第２
プライマーの結合部位が現れるはずである。逆転写酵素
によって仲介されるプライマーの結合と合成の開始のた
めには、プライマーがＤＮＡにハイブリダイズする際に
ヌクレーション（nucleation)とジッパーリング(zipper
ing)が可能なようＲＮＡの一部を除去する、あるいは単
にＲＮＡをニックし生成したＲＮＡを排除するだけで十
分である。本発明者らのデータはかなり大きいＲＮＡ片
が生成し、またプロモーター含有プライマーが完全長さ
のＤＮＡに取り込まれないことを示していることから、
以下の事象が起きていると考えられる。
【０１０５】１. プロモーター−プライマー結合を可
能ならしめるに十分なニックがＲＮＡに含まれている。
適当な部位の１つのニックによって、単に、消失させる
に十分な小さいＲＮＡ断片が生成しプライマー結合部位
またはその一部が露出されるのか、または１つのニック
が１またはそれ以上の酵素の巻戻し作用を促しＲＮＡ断
片が追い出されるのかは、現時点では不明である。 ２．逆転写酵素でｃＤＮＡ３’末端が伸長されプロモー
ター領域の２本鎖ＤＮＡが作られる。 ３．このようにして生成した複合体からＲＮＡが合成さ
れる。この複合体はＲＮＡに結合したｃＤＮＡからな
り、２本鎖ＤＮＡプロモーターを含有する。このよう
に、反応物には、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含
有するプライマーの結合部位の内部または近辺のどこか
に、ＲＮＡseＨ活性が認識する配列が存在する必要があ
る。幾つかの適用例では、標的配列それ自身の内部には
ＲＮＡseＨ認識部位のないことも望ましい。標的内の部
位は開裂され２本鎖ｃＤＮＡ領域の合成のためのＲＮＡ
プライマーの生産に用いられるであろう。この酵素作用
の可能性を消滅することが好ましい。
【０１０６】本発明者らが得たモデルおよびＲＮＡseＨ
配列特異性情報に基づいて新規なプライマーセットが企
画された。本発明者らの企画は以下の通りである。Ｔ７プロモーター−プライマー用 １）プライマー領域は１０塩基あたり１またはそれ以上
の切断部位を有する。 ２）プライマー領域はその５’末端の近くに切断部位を
有する。 ３）プライマー領域はその３’末端の近く、および可能
なら３’末端の一部に切断部位を有する。 ４）プライマーの長さは＞１８塩基である。 ５）Ｔmest は約５５−６５℃である。他のプライマー用 １）プライマーはＲＮＡseＨ切断部位を殆ど持たない
か、全く持たない。 ２）プライマー内に存在する切断部位はすべて５’末端
付近に存在する。 ３）プライマーの長さは約１８−２８塩基である。 ４）Ｔmestは５５−６５℃である。明らかに、これらの
基準および機構、ならびに配列特異性に関する知識に従
って設計されたプライマーを用いて、より良好な合成が
達成された。このことは本発明によれば、特異的な標的
領域のための機能的なプライマーセットの製造が可能で
あることを示すものである。これらを以下により詳細に
説明する。
【０１０７】実施例１８ ＲＮＡseＨの特異性に関する発見を効率的なプロモータ
ー−プライマーの組合せを設計するのに利用した。従来
技術の方法はプロモーターを非選択的にプライマーに付
加したものにすぎない。本発明者らは増幅産物の収率を
高めるのに最適なプロモーター−プライマーの組み合わ
せを設計することができた。以下に示す実験はプロモー
ター−プライマー配列を少し変化させることで増幅効率
が大きく変化することを示している。以下の例では同一
領域からのプライマーを、ＲＮＡseＨ開裂部位およびＧ
Ｐ−III増幅効率に関して比較したものである。各試料
について、被検プライマー以外は同一の試薬を用いて２
回、増幅を行った。
【０１０８】１．非プロモータープライマー 最初の例では、ＣＭＬ主要ｔ（１４；１８）ブレイクポ
イント増幅領域のための非プロモータープライマー部位
を１５塩基移動することにより、４塩基認識配列と仮定
して推定のＲＮＡseＨ切断部位内の数を４から１に、３
塩基認識配列と仮定して５から２に減少した。２.５mm
ＡＴＰ、１６.５mm ＭgＣl2、および５０mＭ ＫＣlを
用いるほかは実施例１５と同様に反応させた。このプラ
イマー配列における変化は増幅効率にとって極めて積極
的な影響を及ぼした。第２の例では、４塩基認識部位と
仮定される推定のＲＮＡseＨ部位のみを除去するために
ＨＢＶ領域１の非プロモータープライマー内に意図的に
不適合を配した。３塩基切断部位の場合は、当業者なら
ば、不適合により３’末端に最も近い切断部位が除去さ
れたことが分かるであろう。この変化もまた、増幅効率
に極めて積極的な影響を及ぼした。データは、プライマ
ーの位置を変化する方法または不適合を導入する方法の
２方法のいずれも増幅の促進に利用し得ることを示して
いる。おそらく非プロモータープライマーからのＲＮＡ
seＨ切断部位の除去の方が、より能率的に自己触媒期間
のｃＤＮＡ合成を開始させるであろう。 配列 ＲＬＵ 例１ GGAGCTGCAGATGCTGACCAAC 78,880 GACCAACTCGTGTGTGAAACTCCA 2,552,333 例２ TCCTGGAATTAGAGGACAAACGGGC 57,710 TCCTGGAATTAGAGGATAAACGGGC 518,695
【０１０９】２．プロモーター−プライマー 以下の例は同じ領域を起源とするが推定のＲＮＡseＨ切
断部位の数が異なるプロモータープライマーを示す。最
初の例ではＨＩＶ領域５のための２つのプロモータープ
ライマーが１０塩基移動して４塩基認識部位と仮定して
推定のＲＮＡseＨ切断部位を２から３に変化させるか、
３塩基認識部位と仮定して３から５に変化させた。これ
は増幅効率に正の影響を及ぼした。第２の例では推定の
ＲＮＡseＨ切断部位を含有する配列を主要ブレイクポイ
ントｔ（１４；１８）転座のためのプロモータープライ
マーの上流に挿入し、標的に対する１つの不適合を含有
させてプライマー領域内に切断部位を生成させた。これ
も増幅効率に正の影響を及ぼした。これは増幅効率の上
昇に、プロモータープライマーへのＲＮＡseＨ切断部位
の挿入を利用することができることを示すものである。
おそらく、ＲＮＡseＨ切断部位の挿入がＲＮＡ鎖の移動
を助け、プロモーター領域の複製効率を増大し、その結
果、能率的な自己触媒が達成される。 上記プライマーの配列を以下に示す。 プライマーＡ：AATTTTAATACGACTCACTATAGGGAGAAATCTTGT
GGGGTGGCTCCTTCT-3’ プライマーＢ：AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGGGTGGCT
CCTTCTGATAA TGCTG-3’ プライマーＣ：ATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACGGTGACCGT
GGTCCCTTG-3' プライマーＤ：TAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATCAGTTAC
AATCGC TGGTATCAACGCTGAGCAGACGCTGACCGTGGTCCCTTG-3'
【０１１０】上記の例で、非プロモータープライマーか
らのＲＮＡseＨ切断部位の除去は、切断部位の除去が元
の標的に不適合を導入するとしても、増幅効率を増大し
た。付加的なＲＮＡseＨ切断部位を含有させるためのプ
ロモーター含有プライマーの設計もまた、それが切断部
位の導入が元の標的に不適合を導入するとしても、増幅
を増大した。推定のＲＮＡseＨ切断部位の数、分布、お
よび位置が、一部では、特定のプライマーの有用性を決
定する。意図的な不適合の導入またはプロモーターおよ
びプライマー間への配列の挿入による増幅の増大は増幅
法における自明の改善ではない。本発明の好ましい実施
態様では、ＲＮＡ標的配列を決定し、次いでＲＮＡseＨ
分解が２本鎖からのＲＮＡ切片の切断または除去を起こ
す場所を決定する。ＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆
転写酵素中に存在するＲＮＡseＨ、大腸菌ＲＮＡseＨま
たはこれらの組み合わせによる、標的配列のＲＮＡse分
解の効果を決定するために実験を行うことができる。プ
ライマーを選択するに際し、反応混合物中に存在するＲ
ＮＡseＨによって実質上分解されないＲＮＡセクション
とハイブリダイズするようにプライマーを選択すること
が好ましい。実質的な分解があるとプライマー領域内で
のＲＮＡ鎖の切断によってＤＮＡ合成が停止または阻害
されプライマーの伸長が阻止される。このように、ＲＮ
Ａ標的の配列とハイブリダイズするプライマーであっ
て、ＲＮＡがＲＮＡseＨに供されたとき、プライマー伸
長生成物の形成を阻止する実質的な分解がないような位
置にあるプライマーを選択することが望ましい。プロモ
ーター−プライマーがハイブリダイズするであろうＤＮ
Ａ部分にハイブリダイズしたＲＮＡ鎖部分を除去するに
十分なＲＮＡ鎖の分解が起きるようにプロモーター−プ
ライマーのハイブリダイゼーション部位を選択する。通
常は、ＲＮＡseＨ分解によってＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖の
ＲＮＡの幾つかの部分だけが除去され、ＲＮＡ鎖の実質
的な部分は２本鎖に残存する。２本鎖ＤＮＡプロモータ
ーを含有するＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖１つが得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の概括的方法を表わす。
【図２】 本発明の概括的方法を表す。
【図３】 本発明の概括的方法を表す。
【図４】 本発明の概括的方法を表す。
【図５】 本発明の概括的方法を表す。
【図６】 本発明の概括的方法を表す。
【図７】 本発明の概括的方法を表す。
【図８】 本発明の概括的方法を表す。
【図９】 本発明の概括的方法を表す。
【図１０】 本発明の概括的方法を表す。
【図１１】 本発明の概括的方法を表す。
【図１２】 本発明の概括的方法を表す。
【図１３】 本発明の概括的方法を表す。
【図１４】 本発明の概括的方法を表す。
【図１５】 本発明の概括的方法を表す。
【図１６】 予備操作Ｉと称される本発明の態様を表わ
す。
【図１７】 予備操作Ｉと称される本発明の態様を表わ
す。
【図１８】 予備操作Ｉと称される本発明の態様を表わ
す。
【図１９】 予備操作Ｉと称される本発明の態様を表わ
す。
【図２０】 予備操作Ｉと称される本発明の態様を表わ
す。
【図２１】 予備操作ＩＩと称される本発明の態様を表
わす。
【図２２】 改良増幅法を表わす。
【図２３】 改良増幅法を表わす。
【図２４】 改良増幅法を表わす。
【図２５】 改良増幅法を表わす。
【図２６】 ＡＭＶおよびＭＭＬＶおよび大腸菌由来の
ＲＮアーゼＨが特異的ＲＮＡ開裂サイトを有するという
仮説を確認する実験の結果を示す。
【図２７】 増幅中の32Ｐ−標識プライマーの取り込み
の結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ティモシー・ジェイ・フルツ アメリカ合衆国カリフォルニア92083、ビ スタ、ティークウッド・ウェイ1872番

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 5' GGTCCCCTAG AAGAAGAACT CCCTCG、5'
    CCTCTTCATC CTGCTGCTAT GCCTC、5' GAGCATAGCA GCAGGAT
    GAA GAGG、およびそれらと完全に相補的な配列からなる
    群から選ばれるＨＢＶ核酸標的配列とハイブリダイズす
    ることができる核酸配列を含むオリゴヌクレオチド検出
    プローブであって、該プローブがヒト核酸とハイブリダ
    イズして検出可能なプローブ／非標的二本鎖を形成する
    ことがないハイブリダイゼーション条件下で、ＨＢＶ核
    酸とハイブリダイズして検出可能なプローブ／標的二本
    鎖を形成させる該プローブ。
  2. 【請求項２】 5' GGTCCCCTAG AAGAAGAACT CCCTCGまた
    はその相補物のいずれかの配列を含む請求項１に記載の
    オリゴヌクレオチド検出プローブ。
  3. 【請求項３】 5' CCTCTTCATC CTGCTGCTAT GCCTCまたは
    その相補物のいずれかの配列を含む請求項１に記載のオ
    リゴヌクレオチド検出プローブ。
  4. 【請求項４】 5' GAGCATAGCA GCAGGATGAA GAGGまたは
    その相補物のいずれかの配列を含む請求項１に記載のオ
    リゴヌクレオチド検出プローブ。
  5. 【請求項５】 該配列またはその相補物からなる請求項
    ２〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド検出プロ
    ーブ。
  6. 【請求項６】 該配列からなる請求項５に記載のオリゴ
    ヌクレオチド検出プローブ。
  7. 【請求項７】 検出可能な部分で標識されている請求項
    ２〜６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド検出プロ
    ーブ。
  8. 【請求項８】 検出可能な部分が化学ルミネセンス標識
    である請求項７に記載のオリゴヌクレオチド検出プロー
    ブ。
  9. 【請求項９】 化学ルミネセンス標識がアクリジニウム
    エステルである請求項８に記載のオリゴヌクレオチド検
    出プローブ。
  10. 【請求項１０】 ＨＢＶ核酸が試料中に存在するかどう
    かを検出するためのキットであって、ａ)請求項２〜６
    のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド検出プローブ、
    および ｂ) 5' CACCAAATGC CCCTATCTTA TCAACACTTC CGG、5' AA
    TTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGACCC GAGATTGAGA TCTTCTGC
    GA C、5' AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGAGGT TATCGCTG
    GA TGTGTCTGCG GCGT、5' GAGGACAAAC GGGCAACATA CCTT
    G、5' AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGATCC TGGAATTAGA
    GGACAAACGG GC、5' CCCGAGATTG AGATCTTCTG CGAC、5' G
    GTTATCGCT GGATGTGTCT GCGGCGT、および5' TCCTGGAATT
    AGAGGACAAA CGGGCからなる群から選ばれる配列を含む増
    幅オリゴヌクレオチドを含むキット。
  11. 【請求項１１】 ａ）5'GGTCCCCTAG AAGAAGAACT CCCTCG
    の配列を含む検出プローブ、 ｂ) 5' CACCAAATGC CCCTATCTTA TCAACACTTC CGGの配列
    を含む第一増幅オリゴヌクレオチド、および ｃ) 5' AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGACCC GAGATTGAGA
    TCTTCTGCGA Cの配列を含む第二増幅オリゴヌクレオチド
    を含む請求項１０に記載のキット。
  12. 【請求項１２】 ａ）5' CCTCTTCATC CTGCTGCTAT GCCTC
    および5' GAGCATAGCA GCAGGATGAA GAGGからなる群から
    選ばれる配列を含む１またはそれ以上の検出プローブ、 ｂ)5' AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGAGGT TATCGCTGGA
    TGTGTCTGCG GCGTの配列を含む第一増幅オリゴヌクレオ
    チド、および ｃ) 5' GAGGACAAAC GGGCAACATA CCTTGおよび5' AATTTAA
    TAC GACTCACTAT AGGGAGATCC TGGAATTAGA GGACAAACGG GC
    からなる群から選ばれる配列を含む１またはそれ以上の
    第二増幅オリゴヌクレオチドを含む請求項１０に記載の
    キット。
  13. 【請求項１３】 5' CCTCTTCATC CTGCTGCTAT GCCTCの検
    出プローブを含む請求項１２に記載のキット。
  14. 【請求項１４】 5' GAGCATAGCA GCAGGATGAA GAGGの検
    出プローブを含む請求項１２に記載のキット。
  15. 【請求項１５】 ａ）請求項２〜６のいずれかに記載の
    オリゴヌクレオチド検出プローブを試料に加え、 ｂ)ＨＢＶ核酸が存在する指標として、該オリゴヌクレ
    オチドプローブが試料中に存在する核酸とハイブリダイ
    ズするかどうかを検出する工程を含む試料中にＨＢＶ核
    酸が存在するかどうかを検出するための方法。
  16. 【請求項１６】 5' CACCAAATGC CCCTATCTTA TCAACACTT
    C CGG、5' AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGACCC GAGATTG
    AGA TCTTCTGCGA C、5'AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGAG
    GT TATCGCTGGA TGTGTCTGCG GCGT、5' GAGGACAAAC GGGCA
    ACATA CCTTG、5' AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGATCC T
    GGAATTAGA GGACAAACGG GC、5' CCCGAGATTG AGATCTTCTG
    CGAC、5' GGTTATCGCT GGATGTGTCT GCGGCGT、および5' T
    CCTGGAATT AGAGGACAAA CGGGCからなる群から選ばれる配
    列を含む増幅オリゴヌクレオチドを用いてＨＢＶ核酸を
    増幅させる工程を含む請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 該増幅がＲＮアーゼＨ活性を含む逆転
    写酵素の存在下で行われ、該逆転写酵素が該増幅中に存
    在するＲＮアーゼＨ活性の唯一の供給源である請求項１
    ６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 試料中にＨＢＶ核酸が存在するかどう
    かを検出するための方法であって、ａ）請求項１０〜１
    ４のいずれかに記載のキットのオリゴヌクレオチド検出
    プローブと増幅プローブを用いてＨＢＶ核酸を増幅さ
    せ、ｂ）ＨＢＶ核酸が存在する指標として、該オリゴヌ
    クレオチドプローブが該試料中に存在する核酸とハイブ
    リダイズするかどうかを検出する工程を含む方法。
  19. 【請求項１９】 ＨＢＶ核酸の増幅方法であって、 ａ）増幅オリゴヌクレオチドが、5' CACCAAATGC CCCTAT
    CTTA TCAACACTTC CGG、5' GAGGACAAAC GGGCAACATA CCTT
    G、5' CCCGAGATTG AGATCTTCTG CGAC、5' GGTTATCGCT GG
    ATGTGTCT GCGGCGT、および5' TCCTGGAATT AGAGGACAAA C
    GGGCからなる群から選ばれる配列と相補的なＨＢＶヌク
    レオチド配列と結合するかまたはそれを介して伸長する
    核酸増幅条件下で、該オリゴヌクレオチドを該ＨＢＶ核
    酸に加え、 ｂ) 該ＨＢＶ核酸を増幅する工程を含む方法。
  20. 【請求項２０】 該ヌクレオチド塩基配列が5' CACCAAA
    TGC CCCTATCTTA TCAACACTTC CGGである請求項１９に記
    載の方法。
  21. 【請求項２１】 該ヌクレオチド塩基配列が5' GAGGACA
    AAC GGGCAACATA CCTTGである請求項１９に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 該ヌクレオチド塩基配列が5' CCCGAGA
    TTG AGATCTTCTG CGACである請求項１９に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 該ヌクレオチド塩基配列が5' GGTTATC
    GCT GGATGTGTCT GCGGCGTである請求項１９に記載の方
    法。
  24. 【請求項２４】 該ヌクレオチド塩基配列が5' TCCTGGA
    ATT AGAGGACAAA CGGGCである請求項１９に記載の方法。
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