JP3736617B2 - 細胞型の決定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
開示される出願は、国立保健研究所によって与えられた認可（契約）番号1RO1DC02253号の下での政府の援助を得てなされた。政府はこれらの発明に権利を有する場合がある。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の分野は、細胞型のマーカーを決定することである。
【０００３】
（背景）
細胞の同一性は、ゲノム中の５０，０００から１００，０００遺伝子の中から発現する、遺伝子の特定成分の直接的な徴候である。個々の細胞型は、通常は生物体内で特定の機能を行うために存在しているので、遺伝子発現を通して細胞型を決定する技術は、遺伝子の発現に機能的に定義された細胞型を割り当てることを可能とするばかりでなく、個々の細胞に機能的に関連する特性を与える遺伝子を容易に発見することも可能にする。この遺伝子配列への機能の割り当ては、ゲノム分野の主要な目標である。
【０００４】
従って、識別可能な細胞型を遺伝子発現のパターンに基づいて決定する技術は、細胞の極めて有用で機能的に重要な定義を可能にする。このような技術の手法は、通常は異なる細胞型からの発現された細胞の対をなす比較（ディファレンシャルディスプレー又はサブトラクティブハイブリッド形成）を実施することを含む。このような手法の欠点は、複雑な組織中の多数の細胞型を決定するのに対をなす比較を用いることの非実用性である。さらに、そのような手法は通常、殆どの組織の殆どの細胞型について存在しない状況である、細胞を純粋な集団として単離する能力に依存している。また、事前にそれらが存在することを知ること無しに細胞型を決定することを可能にする技術も必要である。例えば、ヒトの脳において、ニューロンは、形態、位置、結合性、及び少数のマーカー遺伝子の発現といったパラメータによって組織学的に決定されている。しかしながら、我々は、どれほど多くの本質的に異なる細胞型が脳内に存在するのか、これらの細胞型の殆どが如何なる機能で相違するのか、及びこれらの相違が特定の遺伝子の発現においてどのように現れるかを知らない。この重要な問題の解決には、新たな技術の開発が必要である。我々は、そのような技術をここに記載する。
【０００５】
（関連文献）
Sippel (1973) Eur. J. Biochem. 37, 31-40は、大腸菌からのＡＴＰ：ＲＮＡアデニルトランスフェラーゼの特徴付けを開示し、Wittmann等 (1997) Biochim. Biophys. Acta 1350, 293-305は哺乳動物ポリ（Ａ）ポリメラーゼの特徴付けを開示している。Ghthing等 (1980) Nature 287, 301-306は、全インフルエンザウイルスＲＮＡの’３末端のポリアデニル化へのＡＴＰ：ＲＮＡアデニルトランスフェラーゼの使用を開示している。Eberwine等 (1996) 米国特許第5,514,545号は、ＲＮＡ増幅に基づく単一細胞の特徴付け方法を記載している。Eberwine等 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3010-3014は、単一生ニューロンにおける遺伝子発現の分析を記載している。Gubler U 及び Hoffman BJ. (1983) Gene (2-3), 263-9は、ｃＤＮＡライブラリの作成方法を記載しており、より最近の概説は、Gubler (1987) Methods in Enzymology, 152, 325-329及びGulber (1987) Methods in Enzymology, 152, 330-335 を参照のこと。Clontech (Palo Alto, CA)は、逆転写酵素によりキャップされた新生ｃＤＮＡに対する「ＧＧＧ」プライマーを用いる「キャップファインダー」クローニングキットを製造しており、Clontechniques, 11, 2-3 (Oct 1996)、Maleszka等 (1997) Gene 202, 39-43も参照のこと。
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、細胞型を決定するための方法及び組成物を提供する。一般的な方法は、（ａ）細胞の不均一集団の単一細胞のｍＲＮＡを増幅し；（ｂ）包括的発現ライブラリを増幅したｍＲＮＡでプローブして細胞の総発現プロフィールを決定し；そして（ｃ）細胞の総発現プロフィールを１つ又はそれ以上の他の細胞の総発現プロフィールと比較して細胞の独特な発現プロフィールを決定する工程を含み、前記細胞の独特な発現プロフィールが細胞型を決定するマーカーを提供する。特定の実施態様では、工程（ｃ）が、細胞の総発現プロフィールを、（ｉ）細胞の独特な発現プロフィールを決定するために複数の他の細胞の総発現プロフィールと；（ｉｉ）細胞の独特な発現プロフィールを決定するために複数の他の細胞の各単一細胞の総発現プロフィールと；及び／又は（ｉｉｉ）細胞の独特な発現プロフィールを決定するために、複数の他の単一細胞が機能的又は構造的に異なる細胞亜集団から誘導される、複数の他の細胞の各単一細胞の総発現プロフィールと比較することを含む。従って、本発明は、（ａ）生物体の細胞の不均一亜集団を決定し；（ｂ）細胞の亜集団のｍＲＮＡから包括的ライブラリを作成し；（ｃ）集団の単一細胞のｍＲＮＡを増幅し；そして（ｄ）ライブラリを増幅したｍＲＮＡでプローブして細胞の遺伝子発現を決定する工程を含み、細胞の遺伝子発現が細胞型を決定するマーカーを提供する。
【０００７】
細胞の亜集団は、共通の特徴を占める細胞の識別可能な基を含む。例えば、亜集団が組織特異的な細胞、例えば海馬ニューロン、共通マーカーを表現する細胞、例えばＣＤ８＋細胞等を含む。一実施態様では、特にエピトープ又はシグナル生成タンパク質などの共通の選択可能なマーカーを持つ各細胞をコードし提供する遺伝子作成物に突然変異が挿入された場合、マーカーは共通突然変異から誘導される。好ましい実施態様では、挿入された作成物は、各細胞に内部リボソームエントリー配列をさらにコードし提供し、作成物は標的遺伝子の最後のエクソンの停止コドンの下流側だがポリアデニル化シグナルの上流側で標的遺伝子に挿入され、内部リボソームエントリー配列は標的遺伝子の転写物内に第２の読み取り枠を提供する。標的亜集団の選択及び／又は分離は、任意の従来法によって行ってよい。例えば、マーカーが外部から接近可能である場合には、細胞表面関連タンパク質又は他のエピトープ含有分子、免疫吸着技術又は蛍光活性化細胞選別と結合した蛍光免疫標識が便利に適用される。
【０００８】
プローブしたライブラリは、典型的にはｃＤＮＡライブラリであり、好ましくは規格化又は減算される。特別な実施態様では、ライブラリは、固定化された核酸の高密度の規則的配列(array)を含む。
【０００９】
ｍＲＮＡは、単一細胞に適用可能な任意の技術により増幅される。特別な実施態様では、増幅は、５’末端に知られた配列を持つ第１のＲＮＡの３’末端に知られた核酸配列を付加して第２のＲＮＡを形成し、当該第２のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを形成する比例方法である。
【００１０】
最後に、ライブラリを増幅されたｍＲＮＡでプローブして対象とする細胞の遺伝子発現を決定し、独特な遺伝子発現又は遺伝子発現パターンが細胞型を決定するためのマーカーを提供する。
【００１１】
（本発明の好ましい実施態様の詳細な説明）
以下の好ましい実施態様及び実施例は、例示のために提供され、何ら限定するものではない。
【００１２】
我々は、異なる細胞で発現された遺伝子を測定することにより、対象とする不均一集団中で識別可能な細胞型を決定し、究極的には単離するための技術を提供する。まず、一般的には細胞のサブセットとして組織中に存在し、細胞の特定の群の機能に重要な遺伝子の共通発現によって定義される不均一細胞集団が決定される。一実施態様では、これは、
トランスジェニック細胞において緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するこれらの遺伝子の内在性プロモータ、及びフローサイトメトリーで単離された細胞の標的化集団を用いて達成される。場合によっては規格化及び／又は減算されたｃＤＮＡライブラリは、次いで、これらの細胞から作成され配列される。ハイブリッド形成プローブは、細胞の不均一プールからの個々の細胞のｍＲＮＡを増幅することによって作成され、配列したｃＤＮＡクローンの別々にハイブリッド形成する。配列したｃＤＮＡクローンへのハイブリッド形成における相違の分析を通して、細胞の不均一集団内の特定細胞型に制限した同時発現された転写物の群を同定し、これらの細胞型の決定に使用した。
【００１３】
この技術には、未だマーカーが存在しない個々の細胞集団の単離、例えば別々の細胞集団を標的とする薬物の設計等の多くの用途がある。また、新規な細胞型を決定及び単離する能力は、新規な栄養性分子の発見及び特徴付けを促進する。さらに、この技術は、特殊化した機能の遺伝子配列への割り当てを可能にし、例えば、個々の細胞型の操作を許容する抗体及びトランスジェニック動物を作成することを可能にする。
【００１４】
本発明は、細胞不均一性の程度が知られていない、又は形態学的に決定された細胞型が記載されているが分子マーカーを欠いている場合の任意の組織に適用することができる。重要なのは、異なる細胞に対するこれらの新たなマーカーが、用途を広げることができることであり、例えば、このようなマーカーは、マーカー遺伝子にコードされる細胞表面抗原に対する抗体を通して、又は標識細胞がそのような遺伝子を発現するトランスジェニック手法を通して、個々の細胞型を単離することを可能にする。
異なる細胞型を複雑な組織から純粋な形で単離するこの能力は、細胞型特異的な栄養性分子の決定を含む用途を広げることができる。また、細胞の関連する群を含む個々の細胞型を単離することが可能にすることは、試験している治療薬の正確な標的を提供し、標的細胞型に対する望ましい効果を持つ化合物の製造を促進するとともに非標的に対する作用を通した副作用を最小にすることができる。例えば、セロトニン作動性ニューロンのサブセットの異常な機能化は種々の気分障害に関係している。しかしながら、これらの障害の治療に現在用いられている薬物は全てのセロトニン作動性ニューロンに作用し、しばしば望ましくない副作用をもたらしている。本発明は、特定の疾患に含まれるこれらのニューロンの特定のサブセットを決定する手段を提供し、その細胞サブセットに特異的な治療薬の開発のためにより良い標的を与える。
【００１５】
従って、この技術の１つの目的は、不均一な集団中の識別可能な細胞型を、区別を付けて発現される遺伝子の決定を通して線引きし決定することである。一般的な表現では、これらの方法は以下を含む：
（１）細胞の不均一集団の単一細胞のｍＲＮＡを、好ましくは下記の増幅技術を用いて増幅し、
（２）包括的発現ライブラリを増幅したｍＲＮＡでプローブして細胞の総発現プロフィールを決定し；そして
（３）細胞の総発現プロフィールを、１つ又はそれ以上の他の細胞の総発現プロフィールと比較して当該細胞の独特な発現プロフィールを決定し、当該細胞の独特な発現プロフィールがその細胞を特定するマーカを提供する。言い換えれば、例えば、特定の細胞型についての「発現指紋(fingerprint)」を決定する転写された遺伝子セットを決定するための、配列された集団ｃＤＮＡライブラリを増幅したｍＲＮＡ集団でプローブすることによる細胞型の決定である。
【００１６】
単一細胞のｍＲＮＡ集団の増幅。単一細胞のｍＲＮＡ集団を増幅するための好ましい方法は、比較的短い、ｍＲＮＡ分子の３’伸展の対数的ＰＣＲベースの増幅に基づくブラディ及びイスコヴ(Brady and Iscove)の方法(Brady等, 1990, Methods Mol & Cell Biol 2, 17-25)、及び比例ＲＮＡ-ポリメラーゼベースの増幅、例えばエバウィン(Eberwine)プロトコール（Eberwine等 (1992) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 3010-3014）を含む。しかしながら、殆どの増幅について、我々は以下に記載する比例ＲＮＡ-ポリメラーゼベースの増幅法を好んで用いた。比例増幅は、対数増幅より増幅中に導入される偏向が少なく、低い発生量の転写物で現れる区別を付けて発現された遺伝子を見つける確実性を向上させ、元のｍＲＮＡ集団の全手順を用いた増幅が１，０００，０００倍のオーダーとなる。
【００１７】
包括的発現ライブラリの探索。プローブされたライブラリは一般に、生物体又はその細胞亜集団、好ましくはその細胞の機能的又は構造的に識別可能な亜集団、例えば与えられた組織の細胞、１つ又はそれ以上の共通遺伝子を発現する細胞などによって発現された全ての遺伝子を表す。共通遺伝子の発現による亜集団の決定は、相同的組換え及びマーカー遺伝子の使用により促進される。特に、内在性プロモータからの発現を遺伝子産物の内因性レベルを低下させることなく駆動するために、我々は図１に示すカセットを対象とする遺伝子に相同的組換えを用いて挿入した。脳心筋炎ウイルスから誘導された内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）は、単一のｍＲＮＡ分子内の第２の読み取り枠において翻訳を開始する。ＩＲＥＳ-ＧＦＰカセットは、標準的な技術を用いて、対象とする遺伝子の最後のエクソンにおいて停止コドンの下流側であるがポリアデニル化シグナルの上流側に導入した。ＥＳ細胞クローンの作成及びスクリーニング、及びこれらのクローンからのトランスジェニック動物の作成は、標準的な技術を用いて実施した。プロモータ駆動ネオ発現の存在からの混乱を防止するために、ＣｒｅリコンビナーゼをコードするプラスミドでのＥＳ細胞の一過性発現を通して、我々はｌｏｘ-部位区切りネオ発現断片を排除した。ＧＦＰが対象とする遺伝子を発現する細胞に制限されることを確認するために免疫組織化学を用い、ＧＦＰ＋細胞を単離するためにフローサイトメトリー選別を用いた。多くの用途において、我々は、フローサイトメータのレーザの出力と合致する４８８ｎｍに最大励起を持つ修飾ＧＦＰ、ＥＧＦＰを用いた。
【００１８】
包括的発現ライブラリは、好ましくは規格化され高密度配列で表現される。例えば、我々は純粋なＧＦＰ＋細胞からｍＲＮＡを単離し、標準的な手法を用いてプラスミドｃＤＮＡライブラリを作成した。典型的な体細胞におけるｍＲＮＡ種の約１／１０（１５，０００〜２０，０００のうちの１０００〜２０００）が存在するｍＲＮＡの５０〜６５％を構成するので、我々は再会合速度論ベースの方法、例えば、Soares MB (1997) Curr Opin Biotechnol 8(5): 542-546及びその引用文献を用いてｃＤＮＡライブラリを規格化した。常に必要ではないが、我々は、ライブラリの規格化が、識別可能に発現された多数の遺伝子を発見する頻度を増加させ（細胞型及び細胞型特異的遺伝子の両方を決定するための我々の指紋の利用性を向上させ）、必要なスクリーニング量を最小にすることを見出した。この規格化方法は、ｃＤＮＡの規格化にうまく利用され、多数の全てのｃＤＮＡが大きさの順序になるとともに、最も長いｃＤＮＡの表示は保持する。さらに、交差ハイブリッド形成で分枝した配列は一般にこの手法での規格化を免れる。ライブラリをプローブすることにより、細胞によって発現され包括的ライブラリに存在する全ての遺伝子を表現する細胞の総発現プロフィールが提供される。
【００１９】
総発現プロフィールの比較（細胞型の決定及び細胞型特異的遺伝子発現）。我々は、これらの単一細胞から増幅されたｍＲＮＡ集団を配列された包括的発現ライブラリをスクリーニングするプローブに用いた。配列したライブラリは、「ＤＮＡスペクトログラフ」として作用する。全ての配列した核酸は潜在的な標的であるが、個々の細胞で発現されたもののみをハイブリッド形成後に陽性として記録する。ハイブリッド形成メッセージのパターンは、細胞型を決定する「発現指紋」を提供するが、ハイブリッド形成する正確なｃＤＮＡはその細胞型に対するマーカー遺伝子である。ライブラリをハイブリッド形成機能によってスクリーニングできるようにするライブラリの任意の配列が用いられる。典型的には、このような配列はロボッティックピッキング及び微小配列技術、例えばHeller R.,等, (1997) Proc Natl Acad Sci USA, 94, 2150-2155を用いたナイロン又はガラス基体材料上のスポッティングを含む。
【００２０】
捕捉後、個々の単一細胞プローブにより生成されたハイブリッド形成シグナルは、手動又は好ましくは自動化技術、例えば、Wodicka L,等 (1997) Nat Biotechnol 15(13): 1359-1367; Zweiger G, (1997) Curr Opin Biotechnol 8(6): 684-687及びそれらの引用文献を用いて分析される。この比較又は分析工程は、しばしば、細胞の総発現プロフィールの（ｉ）細胞の独特な発現プロフィールを決定するために複数の他の細胞；（ｉｉ）細胞の独特な発現プロフィールを決定するために複数の他の単一細胞；及び／又は（ｉｉｉ）細胞の独特な発現プロフィールを決定するために複数の他の単一細胞の各々の複数の総発現プロフィールの総発現プロフィールと比較することを含み、複数の他の単一細胞は、機能的又は構造的に相違する細胞の亜集団から誘導される。例えば、１つの分析は、個々の遺伝子が個々の細胞でともに発現される頻度の測定からなる。図２は、個々の単一細胞プローブで９回スクリーニングされた１−１００−成分配列についての結果の模式図を示す。ハイブリッド形成パターン（最上パネル）の分析後に、我々は発現された遺伝子の数種の異なるクラスを見出した（最下パネル）。幾つかの遺伝子はノイズの結果としてランダムに発現されるが、遺伝子発現に対する活性依存的効果により幾つかの変化が検出でき、そして幾つかの遺伝子は細胞中に高頻度で発現されるが、我々は幾つかの場合に繰り返しともに発現されるがその他ではされない遺伝子の中心群を決定した。これらの遺伝子の組は、個々の細胞型を決定する。また我々の分析は、幾つかの場合にのみ高度に関連した遺伝子セットと発現される他の遺伝子も生じた。これらの群は、機能的サブタイプを決定し；例えば、これらの遺伝子は、他の同一細胞型に位置的同一性を与えるパターニング遺伝子であり得る。細胞型を決定するｃＤＮＡは部分的に配列分析され、ＧｅｎＢａｎｋ及びＭｏｕｓｅＥＳＴ Ｐｒｏｊｅｃｔデータベースに対してマッチングさせた。新規なｃＤＮＡは、更なる分析のために全て配列分析した。選択したｃＤＮＡから誘導したプローブでのインサイツハイブリッド形成は、生物体の組織内の単一細胞型での関連する遺伝子発現の確認に用いた。
【００２１】
増幅方法。好ましい増幅方法は、一般に、５’末端に知られた配列を持つ第１のＲＮＡの３’末端に知られたヌクレオチド配列を付加して第２のＲＮＡを形成し、当該第２のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを形成する工程を含む。第１のＲＮＡの５’末端における知られた配列は、プライマーに標的を提供するのに十分である他に大きくは出発物質の性質で定義される。例えば、出発物質がｍＲＮＡである場合、５’末端の知られた配列はポリ（Ａ）配列及び／又は（ｂ）ｍＲＮＡの内部ｍＲＮＡ配列を含み得る。あるいは、出発物質が増幅されたＲＮＡ、又はａＲＮＡである場合、知られた配列はポリ（Ｔ）配列又は知られたｍＲＮＡ内部配列の補体を含み得る。知られた５’配列は、有利には、プライマー標的部位、ＲＮＡポリメラーゼ部位などの付加的配列を含んでよい。例えば、ポリ（Ｔ）配列などのプライマー標的部位及びＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の両方が存在すると、下流側増幅又は転写の機会を増加させる。
【００２２】
付加工程は、任意の従来方法によって行ってよい。例えば、ポリアデニルトランスフェラーゼ又はポリ（Ａ）ポリメラーゼは、選択されたヌクレオチドを３’末端に付加するのに用いられる。ポリ（Ａ）ポリメラーゼは、広範な原核生物及び真核生物供給源から誘導され、商業的に入手可能で良く特徴付けされている。他の例では、１又はそれ以上の選択されたオリゴヌクレオチドを付加するのにリガーゼが用いられる。これらの酵素は同様に、種々の供給源から容易かつ広く入手可能であり、良く特徴付けされている。
【００２３】
付加される知られた３’配列は同様に、プライマーに標的を提供するのに十分である他に付加された知られた配列の性質は付加方法によってのみ制限される便宜的事項である。例えば、リガーゼ媒介オリゴヌクレオチド付加を用いると、プライマーの標的として用いられ得る本質的に任意の知られた配列が３’末端に付加される。ポリアデニルトランスフェラーゼ媒介付加では、一般にポリ（Ｎ）配列の付加がより便利であり、ポリ（Ａ）配列を添加するときは最適な効果を示す多くのそのようなトランスフェラーゼである。ポリアデニルトランスフェラーゼ媒介付加については、付加される配列は一般に５から５０ヌクレオチドの範囲、好ましくは６から２５ヌクレオチドの範囲、より好ましくは７から１５ヌクレオチドの範囲である。
【００２４】
逆転写工程は、一般的には３’末端配列にハイブリッド形成するのに十分な相補性を持つプライマーを付加することにより形成された、第２のＲＮＡ種（３’配列を付加した第１の種）の３’末端又はその近傍の非共有結合複製領域で開始される。従って、３’末端はポリ（Ａ）配列を含み、逆転写工程は好ましくはポリ（Ａ）配列にハイブリッド形成したポリ（Ｔ）配列を含む複製領域で開始される。多くの応用では、プライマーは付加的機能配列、例えばＴ７又はＴ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどの１又はそれ以上のＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、１又はそれ以上のプライマー配列などを含む。
【００２５】
好ましい実施態様では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列はＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり、少なくとも野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列のヌクレオチド−１７から＋６を含み、上流フランキング配列、特に上流Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターフランキング配列の好ましくは少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドに結合している。付加的下流フランキング配列、特に下流Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターフランキング配列、例えばヌクレオチド＋７から＋１０も有利に用いられる。例えば、特別な一実施態様では、プロモーターは、クラスＩＩＩＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列のヌクレオチド−５０から＋１０を含む。表Ｉは、例示的プロモーター配列及びそれらの主題の方法における相対的転写効率を与える（列挙したプロモーター配列は、２３ヌクレオチドの天然クラスＩＩＩＴ７プロモーター上流フランキング配列に結合している）。
【００２６】
【００２７】
転写されたｃＤＮＡは、当初は一本鎖であり、第２のＲＮＡから広範な確立された方法によって単離される。例えば、これらの方法は、ＲＮＡをＲＮａｓｅＨなどのヌクレアーゼ、熱又はアルカリなどの変性剤、及び／又は電気泳動による鎖の分離で処理することを含む。第２の鎖ｃＤＮＡ合成は多くの良く確立された技術によって行ってよく、それらは、３’-末端ヘアピンループプライミング又は、例えば、第１のｃＤＮＡ鎖の３’末端に相補的な外来プライマーの付加によって、又はホフマン-ガブラー(Hoffman-Gubler)プロトコールに従って形成された非共有結合複製領域で重合が開始される方法を含む。この後者の実施態様では、ｃＤＮＡ単離及び二本鎖ｃＤＮＡの変換工程は、例えば、１回のインキュベーション工程においてＲＮＡをＲＮａｓｅＨに接触させ、一本鎖ｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼに接触させて同時に実施してもよい。いずれにしても、これらの方法は、非常に小さな、例えば単一細胞の出発物質からｃＤＮＡライブラリを作成するのに用いることができる。
【００２８】
特別な実施態様では、この方法はさらに、一本又は二本鎖ｃＤＮＡを繰り返し転写して複数の第３のＲＮＡを作成する、事実上第１のＲＮＡ種を増幅する工程を含む。好ましい転写条件は、クラスＩＩＩＴ７プロモーター配列（配列番号：１）及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼを以下の反応条件下で用いる：４０ｍＭのトリスｐＨ７．９、６ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのスペルミジン、１０ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＮＴＰ（Pharmacia）、４０単位のＲＮＡｓｉｎ（Promega）、３００−１０００単位のＴ７RNAポリメラーゼ（６．１６Ｐｒｅｐ）。酵素は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ及び５０％のグリセロール中に、２．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度及び３００−３５０単位／μＬの活性で貯蔵する。例示すると、このポリメラーゼの１−３μＬが５０μＬ反応に用いられた。テンプレートの出発濃度は、ピコグラム量（単一細胞レベル）から１μｇ又はそれ以上までの直線状プラスミドＤＮＡで変えられる。最終的なＮａＣｌ濃度は、好ましくは６ｍＭを超えない。
【００２９】
より特別な実施態様では、第１のＲＮＡはＲＮＡ、特にｍＲＮＡの増幅によって作成されたもの自体である。例えば、第１のＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列に結合したポリ（Ｔ）オリゴヌクリオチドをｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部にハイブリッド形成し、ｍＲＮＡを逆転写して一本鎖ｃＤＮＡを作成し、一本鎖ｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換し、そして二本鎖ｃＤＮＡを転写して第１のＲＮＡを作成することによるｍＲＮＡの増幅により作成される。図３は、本発明のこの一連のｍＲＮＡ増幅例の図であり、以下の各工程を明示している。
【００３０】
（ａ）５’-Ｔ７-ＲＮＡポリメラーゼプロモーター-オリゴ(ｄＴ)２４-３’からなるオリゴヌクレオチドプライマーを、成熟ｍＲＮＡの３’末端に存在するポリ（Ａ）トラクトにアニーリングし、逆転写酵素を用いて第１のｃＤＮＡ鎖を合成してＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッドを生成する（ＲＮＡは白抜き枠で、ＤＮＡは黒塗り枠で表す）；、
（ｂ）ハイブリッドをＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼで処理して一本鎖ｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換する；
（ｃ）このｃＤＮＡから大量の増幅されたＲＮＡ（ａＲＮＡ）を合成するのにＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる。Eberwine等, PNAS 89: 3010-3014, 1992 によって利用された変性プロモーター配列に比較したときの改変されたＴ７ポリメラーゼプロモーター配列の我々のプライマーへの取り込みがａＲＮＡの収量を格段に増大させる；
（ｄ）ａＲＮＡにポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてポリ（Ａ）を付随させる。この改変が、次の工程で元のプロトコールに比較して極めて長い第１のｃＤＮＡ鎖を生成する；
（ｅ）ａＲＮＡの変性及び除去の後、Ｔ７-ＲＮＡポリメラーゼプロモーター-オリゴ(ｄＴ)プライマーをこの新たに合成したポリ（Ａ）配列にアニーリングし、第１のｃＤＮＡ鎖を合成するのに逆転写酵素を用いる。第２のｃＤＮＡ鎖及びポリメラーゼプロモーターの相補的鎖を（ｂ）のように合成する；そして、
（ｆ）次いでＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてこのｃＤＮＡテンプレートからａＲＮＡを生成する。
【００３１】
他の実施態様は、或る合成工程の間に付加配列の取り込みを含む。これらの配列は、例えば、増幅したＲＮＡＰＣＲ増幅、第２のｃＤＮＡ鎖全体の合成無しの直接第２ラウンド増幅などを可能にする。この実施態様は図４に図示する。
（ａ）これは、第１のｃＤＮＡ鎖合成のためのプライマーもポリ(T)とＴ７配列との間に異なるＲＮＡポリメラーゼ（ＳＰ６で示す；Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ部位も可能である）に対するプライマー部位を含む以外は図３の工程（ａ）と同じである；
（ｂ）これは、図３の工程の（ｂ）である；
（ｃ）これは、ａＲＮＡがその５’末端にＲＮＡポリメラーゼ部位を有する以外は図３の工程（ｃ）と同じである；
（ｄ）これは、図３の工程（ｄ）と同じである；
（ｅ）これは、第１のｃＤＮＡ鎖合成のプライミングのために用いるオリゴヌクレオチドも、その５’末端にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の間プライミング部位として用いるのに好適な付加配列を有している以外は図３の工程（ｅ）と同じである。また、ＳＰ６又はＴ３ＲＮＡポリメラーゼ部位も第１のｃＤＮＡ鎖にコピーされることに注意されたい。この第１のｃＤＮＡ鎖が、その５’及び３’末端の両方に独特な配列を有するので、それは、全ての配列の全増幅のためのＰＣＲ反応において、ａＲＮＡ合成の他のラウンドを実施するための代替物として直接使用できる。
（ｆ）第１のｃＤＮＡ鎖は、ＳＰ６又は好ましくはＴ３ＲＮＡポリメラーゼ部位の相補的部分を取り込むオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによりａＲＮＡ合成のために直接使用できる。あるいは、第１のｃＤＮＡ鎖は、第２の鎖合成を通して二本鎖ｃＤＮＡに変換でき、次いでａＲＮＡ合成が続く。
【００３２】
この明細書中で引用した全ての出版物及び特許出願は、個々の出版物及び特許出願が特別にかつ独立して参考として取り入れられることが明示されているように、ここに出典明示して取り入れる。上記の発明は、理解を明確にするために、例示及び実施例によって幾分詳細に記述したが、当業者には、本発明の教示に照らして、添付する特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、それらにある種の変更及び修正がなし得ることが容易に明らかになるであろう。
【００３３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）を含むカセットを示す図である。
【図２】 個々の単一細胞プローブでスクリーニングしたｃＤＮＡ配列についての結果を示す図である。
【図３】 好ましいｍＲＮＡ増幅方法を示す図である。
【図４】 好ましいｍＲＮＡ増幅方法の代替的実施態様を示す図である。
開示される出願は、国立保健研究所によって与えられた認可（契約）番号1RO1DC02253号の下での政府の援助を得てなされた。政府はこれらの発明に権利を有する場合がある。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の分野は、細胞型のマーカーを決定することである。
【０００３】
（背景）
細胞の同一性は、ゲノム中の５０，０００から１００，０００遺伝子の中から発現する、遺伝子の特定成分の直接的な徴候である。個々の細胞型は、通常は生物体内で特定の機能を行うために存在しているので、遺伝子発現を通して細胞型を決定する技術は、遺伝子の発現に機能的に定義された細胞型を割り当てることを可能とするばかりでなく、個々の細胞に機能的に関連する特性を与える遺伝子を容易に発見することも可能にする。この遺伝子配列への機能の割り当ては、ゲノム分野の主要な目標である。
【０００４】
従って、識別可能な細胞型を遺伝子発現のパターンに基づいて決定する技術は、細胞の極めて有用で機能的に重要な定義を可能にする。このような技術の手法は、通常は異なる細胞型からの発現された細胞の対をなす比較（ディファレンシャルディスプレー又はサブトラクティブハイブリッド形成）を実施することを含む。このような手法の欠点は、複雑な組織中の多数の細胞型を決定するのに対をなす比較を用いることの非実用性である。さらに、そのような手法は通常、殆どの組織の殆どの細胞型について存在しない状況である、細胞を純粋な集団として単離する能力に依存している。また、事前にそれらが存在することを知ること無しに細胞型を決定することを可能にする技術も必要である。例えば、ヒトの脳において、ニューロンは、形態、位置、結合性、及び少数のマーカー遺伝子の発現といったパラメータによって組織学的に決定されている。しかしながら、我々は、どれほど多くの本質的に異なる細胞型が脳内に存在するのか、これらの細胞型の殆どが如何なる機能で相違するのか、及びこれらの相違が特定の遺伝子の発現においてどのように現れるかを知らない。この重要な問題の解決には、新たな技術の開発が必要である。我々は、そのような技術をここに記載する。
【０００５】
（関連文献）
Sippel (1973) Eur. J. Biochem. 37, 31-40は、大腸菌からのＡＴＰ：ＲＮＡアデニルトランスフェラーゼの特徴付けを開示し、Wittmann等 (1997) Biochim. Biophys. Acta 1350, 293-305は哺乳動物ポリ（Ａ）ポリメラーゼの特徴付けを開示している。Ghthing等 (1980) Nature 287, 301-306は、全インフルエンザウイルスＲＮＡの’３末端のポリアデニル化へのＡＴＰ：ＲＮＡアデニルトランスフェラーゼの使用を開示している。Eberwine等 (1996) 米国特許第5,514,545号は、ＲＮＡ増幅に基づく単一細胞の特徴付け方法を記載している。Eberwine等 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3010-3014は、単一生ニューロンにおける遺伝子発現の分析を記載している。Gubler U 及び Hoffman BJ. (1983) Gene (2-3), 263-9は、ｃＤＮＡライブラリの作成方法を記載しており、より最近の概説は、Gubler (1987) Methods in Enzymology, 152, 325-329及びGulber (1987) Methods in Enzymology, 152, 330-335 を参照のこと。Clontech (Palo Alto, CA)は、逆転写酵素によりキャップされた新生ｃＤＮＡに対する「ＧＧＧ」プライマーを用いる「キャップファインダー」クローニングキットを製造しており、Clontechniques, 11, 2-3 (Oct 1996)、Maleszka等 (1997) Gene 202, 39-43も参照のこと。
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、細胞型を決定するための方法及び組成物を提供する。一般的な方法は、（ａ）細胞の不均一集団の単一細胞のｍＲＮＡを増幅し；（ｂ）包括的発現ライブラリを増幅したｍＲＮＡでプローブして細胞の総発現プロフィールを決定し；そして（ｃ）細胞の総発現プロフィールを１つ又はそれ以上の他の細胞の総発現プロフィールと比較して細胞の独特な発現プロフィールを決定する工程を含み、前記細胞の独特な発現プロフィールが細胞型を決定するマーカーを提供する。特定の実施態様では、工程（ｃ）が、細胞の総発現プロフィールを、（ｉ）細胞の独特な発現プロフィールを決定するために複数の他の細胞の総発現プロフィールと；（ｉｉ）細胞の独特な発現プロフィールを決定するために複数の他の細胞の各単一細胞の総発現プロフィールと；及び／又は（ｉｉｉ）細胞の独特な発現プロフィールを決定するために、複数の他の単一細胞が機能的又は構造的に異なる細胞亜集団から誘導される、複数の他の細胞の各単一細胞の総発現プロフィールと比較することを含む。従って、本発明は、（ａ）生物体の細胞の不均一亜集団を決定し；（ｂ）細胞の亜集団のｍＲＮＡから包括的ライブラリを作成し；（ｃ）集団の単一細胞のｍＲＮＡを増幅し；そして（ｄ）ライブラリを増幅したｍＲＮＡでプローブして細胞の遺伝子発現を決定する工程を含み、細胞の遺伝子発現が細胞型を決定するマーカーを提供する。
【０００７】
細胞の亜集団は、共通の特徴を占める細胞の識別可能な基を含む。例えば、亜集団が組織特異的な細胞、例えば海馬ニューロン、共通マーカーを表現する細胞、例えばＣＤ８＋細胞等を含む。一実施態様では、特にエピトープ又はシグナル生成タンパク質などの共通の選択可能なマーカーを持つ各細胞をコードし提供する遺伝子作成物に突然変異が挿入された場合、マーカーは共通突然変異から誘導される。好ましい実施態様では、挿入された作成物は、各細胞に内部リボソームエントリー配列をさらにコードし提供し、作成物は標的遺伝子の最後のエクソンの停止コドンの下流側だがポリアデニル化シグナルの上流側で標的遺伝子に挿入され、内部リボソームエントリー配列は標的遺伝子の転写物内に第２の読み取り枠を提供する。標的亜集団の選択及び／又は分離は、任意の従来法によって行ってよい。例えば、マーカーが外部から接近可能である場合には、細胞表面関連タンパク質又は他のエピトープ含有分子、免疫吸着技術又は蛍光活性化細胞選別と結合した蛍光免疫標識が便利に適用される。
【０００８】
プローブしたライブラリは、典型的にはｃＤＮＡライブラリであり、好ましくは規格化又は減算される。特別な実施態様では、ライブラリは、固定化された核酸の高密度の規則的配列(array)を含む。
【０００９】
ｍＲＮＡは、単一細胞に適用可能な任意の技術により増幅される。特別な実施態様では、増幅は、５’末端に知られた配列を持つ第１のＲＮＡの３’末端に知られた核酸配列を付加して第２のＲＮＡを形成し、当該第２のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを形成する比例方法である。
【００１０】
最後に、ライブラリを増幅されたｍＲＮＡでプローブして対象とする細胞の遺伝子発現を決定し、独特な遺伝子発現又は遺伝子発現パターンが細胞型を決定するためのマーカーを提供する。
【００１１】
（本発明の好ましい実施態様の詳細な説明）
以下の好ましい実施態様及び実施例は、例示のために提供され、何ら限定するものではない。
【００１２】
我々は、異なる細胞で発現された遺伝子を測定することにより、対象とする不均一集団中で識別可能な細胞型を決定し、究極的には単離するための技術を提供する。まず、一般的には細胞のサブセットとして組織中に存在し、細胞の特定の群の機能に重要な遺伝子の共通発現によって定義される不均一細胞集団が決定される。一実施態様では、これは、
トランスジェニック細胞において緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するこれらの遺伝子の内在性プロモータ、及びフローサイトメトリーで単離された細胞の標的化集団を用いて達成される。場合によっては規格化及び／又は減算されたｃＤＮＡライブラリは、次いで、これらの細胞から作成され配列される。ハイブリッド形成プローブは、細胞の不均一プールからの個々の細胞のｍＲＮＡを増幅することによって作成され、配列したｃＤＮＡクローンの別々にハイブリッド形成する。配列したｃＤＮＡクローンへのハイブリッド形成における相違の分析を通して、細胞の不均一集団内の特定細胞型に制限した同時発現された転写物の群を同定し、これらの細胞型の決定に使用した。
【００１３】
この技術には、未だマーカーが存在しない個々の細胞集団の単離、例えば別々の細胞集団を標的とする薬物の設計等の多くの用途がある。また、新規な細胞型を決定及び単離する能力は、新規な栄養性分子の発見及び特徴付けを促進する。さらに、この技術は、特殊化した機能の遺伝子配列への割り当てを可能にし、例えば、個々の細胞型の操作を許容する抗体及びトランスジェニック動物を作成することを可能にする。
【００１４】
本発明は、細胞不均一性の程度が知られていない、又は形態学的に決定された細胞型が記載されているが分子マーカーを欠いている場合の任意の組織に適用することができる。重要なのは、異なる細胞に対するこれらの新たなマーカーが、用途を広げることができることであり、例えば、このようなマーカーは、マーカー遺伝子にコードされる細胞表面抗原に対する抗体を通して、又は標識細胞がそのような遺伝子を発現するトランスジェニック手法を通して、個々の細胞型を単離することを可能にする。
異なる細胞型を複雑な組織から純粋な形で単離するこの能力は、細胞型特異的な栄養性分子の決定を含む用途を広げることができる。また、細胞の関連する群を含む個々の細胞型を単離することが可能にすることは、試験している治療薬の正確な標的を提供し、標的細胞型に対する望ましい効果を持つ化合物の製造を促進するとともに非標的に対する作用を通した副作用を最小にすることができる。例えば、セロトニン作動性ニューロンのサブセットの異常な機能化は種々の気分障害に関係している。しかしながら、これらの障害の治療に現在用いられている薬物は全てのセロトニン作動性ニューロンに作用し、しばしば望ましくない副作用をもたらしている。本発明は、特定の疾患に含まれるこれらのニューロンの特定のサブセットを決定する手段を提供し、その細胞サブセットに特異的な治療薬の開発のためにより良い標的を与える。
【００１５】
従って、この技術の１つの目的は、不均一な集団中の識別可能な細胞型を、区別を付けて発現される遺伝子の決定を通して線引きし決定することである。一般的な表現では、これらの方法は以下を含む：
（１）細胞の不均一集団の単一細胞のｍＲＮＡを、好ましくは下記の増幅技術を用いて増幅し、
（２）包括的発現ライブラリを増幅したｍＲＮＡでプローブして細胞の総発現プロフィールを決定し；そして
（３）細胞の総発現プロフィールを、１つ又はそれ以上の他の細胞の総発現プロフィールと比較して当該細胞の独特な発現プロフィールを決定し、当該細胞の独特な発現プロフィールがその細胞を特定するマーカを提供する。言い換えれば、例えば、特定の細胞型についての「発現指紋(fingerprint)」を決定する転写された遺伝子セットを決定するための、配列された集団ｃＤＮＡライブラリを増幅したｍＲＮＡ集団でプローブすることによる細胞型の決定である。
【００１６】
単一細胞のｍＲＮＡ集団の増幅。単一細胞のｍＲＮＡ集団を増幅するための好ましい方法は、比較的短い、ｍＲＮＡ分子の３’伸展の対数的ＰＣＲベースの増幅に基づくブラディ及びイスコヴ(Brady and Iscove)の方法(Brady等, 1990, Methods Mol & Cell Biol 2, 17-25)、及び比例ＲＮＡ-ポリメラーゼベースの増幅、例えばエバウィン(Eberwine)プロトコール（Eberwine等 (1992) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 3010-3014）を含む。しかしながら、殆どの増幅について、我々は以下に記載する比例ＲＮＡ-ポリメラーゼベースの増幅法を好んで用いた。比例増幅は、対数増幅より増幅中に導入される偏向が少なく、低い発生量の転写物で現れる区別を付けて発現された遺伝子を見つける確実性を向上させ、元のｍＲＮＡ集団の全手順を用いた増幅が１，０００，０００倍のオーダーとなる。
【００１７】
包括的発現ライブラリの探索。プローブされたライブラリは一般に、生物体又はその細胞亜集団、好ましくはその細胞の機能的又は構造的に識別可能な亜集団、例えば与えられた組織の細胞、１つ又はそれ以上の共通遺伝子を発現する細胞などによって発現された全ての遺伝子を表す。共通遺伝子の発現による亜集団の決定は、相同的組換え及びマーカー遺伝子の使用により促進される。特に、内在性プロモータからの発現を遺伝子産物の内因性レベルを低下させることなく駆動するために、我々は図１に示すカセットを対象とする遺伝子に相同的組換えを用いて挿入した。脳心筋炎ウイルスから誘導された内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）は、単一のｍＲＮＡ分子内の第２の読み取り枠において翻訳を開始する。ＩＲＥＳ-ＧＦＰカセットは、標準的な技術を用いて、対象とする遺伝子の最後のエクソンにおいて停止コドンの下流側であるがポリアデニル化シグナルの上流側に導入した。ＥＳ細胞クローンの作成及びスクリーニング、及びこれらのクローンからのトランスジェニック動物の作成は、標準的な技術を用いて実施した。プロモータ駆動ネオ発現の存在からの混乱を防止するために、ＣｒｅリコンビナーゼをコードするプラスミドでのＥＳ細胞の一過性発現を通して、我々はｌｏｘ-部位区切りネオ発現断片を排除した。ＧＦＰが対象とする遺伝子を発現する細胞に制限されることを確認するために免疫組織化学を用い、ＧＦＰ＋細胞を単離するためにフローサイトメトリー選別を用いた。多くの用途において、我々は、フローサイトメータのレーザの出力と合致する４８８ｎｍに最大励起を持つ修飾ＧＦＰ、ＥＧＦＰを用いた。
【００１８】
包括的発現ライブラリは、好ましくは規格化され高密度配列で表現される。例えば、我々は純粋なＧＦＰ＋細胞からｍＲＮＡを単離し、標準的な手法を用いてプラスミドｃＤＮＡライブラリを作成した。典型的な体細胞におけるｍＲＮＡ種の約１／１０（１５，０００〜２０，０００のうちの１０００〜２０００）が存在するｍＲＮＡの５０〜６５％を構成するので、我々は再会合速度論ベースの方法、例えば、Soares MB (1997) Curr Opin Biotechnol 8(5): 542-546及びその引用文献を用いてｃＤＮＡライブラリを規格化した。常に必要ではないが、我々は、ライブラリの規格化が、識別可能に発現された多数の遺伝子を発見する頻度を増加させ（細胞型及び細胞型特異的遺伝子の両方を決定するための我々の指紋の利用性を向上させ）、必要なスクリーニング量を最小にすることを見出した。この規格化方法は、ｃＤＮＡの規格化にうまく利用され、多数の全てのｃＤＮＡが大きさの順序になるとともに、最も長いｃＤＮＡの表示は保持する。さらに、交差ハイブリッド形成で分枝した配列は一般にこの手法での規格化を免れる。ライブラリをプローブすることにより、細胞によって発現され包括的ライブラリに存在する全ての遺伝子を表現する細胞の総発現プロフィールが提供される。
【００１９】
総発現プロフィールの比較（細胞型の決定及び細胞型特異的遺伝子発現）。我々は、これらの単一細胞から増幅されたｍＲＮＡ集団を配列された包括的発現ライブラリをスクリーニングするプローブに用いた。配列したライブラリは、「ＤＮＡスペクトログラフ」として作用する。全ての配列した核酸は潜在的な標的であるが、個々の細胞で発現されたもののみをハイブリッド形成後に陽性として記録する。ハイブリッド形成メッセージのパターンは、細胞型を決定する「発現指紋」を提供するが、ハイブリッド形成する正確なｃＤＮＡはその細胞型に対するマーカー遺伝子である。ライブラリをハイブリッド形成機能によってスクリーニングできるようにするライブラリの任意の配列が用いられる。典型的には、このような配列はロボッティックピッキング及び微小配列技術、例えばHeller R.,等, (1997) Proc Natl Acad Sci USA, 94, 2150-2155を用いたナイロン又はガラス基体材料上のスポッティングを含む。
【００２０】
捕捉後、個々の単一細胞プローブにより生成されたハイブリッド形成シグナルは、手動又は好ましくは自動化技術、例えば、Wodicka L,等 (1997) Nat Biotechnol 15(13): 1359-1367; Zweiger G, (1997) Curr Opin Biotechnol 8(6): 684-687及びそれらの引用文献を用いて分析される。この比較又は分析工程は、しばしば、細胞の総発現プロフィールの（ｉ）細胞の独特な発現プロフィールを決定するために複数の他の細胞；（ｉｉ）細胞の独特な発現プロフィールを決定するために複数の他の単一細胞；及び／又は（ｉｉｉ）細胞の独特な発現プロフィールを決定するために複数の他の単一細胞の各々の複数の総発現プロフィールの総発現プロフィールと比較することを含み、複数の他の単一細胞は、機能的又は構造的に相違する細胞の亜集団から誘導される。例えば、１つの分析は、個々の遺伝子が個々の細胞でともに発現される頻度の測定からなる。図２は、個々の単一細胞プローブで９回スクリーニングされた１−１００−成分配列についての結果の模式図を示す。ハイブリッド形成パターン（最上パネル）の分析後に、我々は発現された遺伝子の数種の異なるクラスを見出した（最下パネル）。幾つかの遺伝子はノイズの結果としてランダムに発現されるが、遺伝子発現に対する活性依存的効果により幾つかの変化が検出でき、そして幾つかの遺伝子は細胞中に高頻度で発現されるが、我々は幾つかの場合に繰り返しともに発現されるがその他ではされない遺伝子の中心群を決定した。これらの遺伝子の組は、個々の細胞型を決定する。また我々の分析は、幾つかの場合にのみ高度に関連した遺伝子セットと発現される他の遺伝子も生じた。これらの群は、機能的サブタイプを決定し；例えば、これらの遺伝子は、他の同一細胞型に位置的同一性を与えるパターニング遺伝子であり得る。細胞型を決定するｃＤＮＡは部分的に配列分析され、ＧｅｎＢａｎｋ及びＭｏｕｓｅＥＳＴ Ｐｒｏｊｅｃｔデータベースに対してマッチングさせた。新規なｃＤＮＡは、更なる分析のために全て配列分析した。選択したｃＤＮＡから誘導したプローブでのインサイツハイブリッド形成は、生物体の組織内の単一細胞型での関連する遺伝子発現の確認に用いた。
【００２１】
増幅方法。好ましい増幅方法は、一般に、５’末端に知られた配列を持つ第１のＲＮＡの３’末端に知られたヌクレオチド配列を付加して第２のＲＮＡを形成し、当該第２のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを形成する工程を含む。第１のＲＮＡの５’末端における知られた配列は、プライマーに標的を提供するのに十分である他に大きくは出発物質の性質で定義される。例えば、出発物質がｍＲＮＡである場合、５’末端の知られた配列はポリ（Ａ）配列及び／又は（ｂ）ｍＲＮＡの内部ｍＲＮＡ配列を含み得る。あるいは、出発物質が増幅されたＲＮＡ、又はａＲＮＡである場合、知られた配列はポリ（Ｔ）配列又は知られたｍＲＮＡ内部配列の補体を含み得る。知られた５’配列は、有利には、プライマー標的部位、ＲＮＡポリメラーゼ部位などの付加的配列を含んでよい。例えば、ポリ（Ｔ）配列などのプライマー標的部位及びＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の両方が存在すると、下流側増幅又は転写の機会を増加させる。
【００２２】
付加工程は、任意の従来方法によって行ってよい。例えば、ポリアデニルトランスフェラーゼ又はポリ（Ａ）ポリメラーゼは、選択されたヌクレオチドを３’末端に付加するのに用いられる。ポリ（Ａ）ポリメラーゼは、広範な原核生物及び真核生物供給源から誘導され、商業的に入手可能で良く特徴付けされている。他の例では、１又はそれ以上の選択されたオリゴヌクレオチドを付加するのにリガーゼが用いられる。これらの酵素は同様に、種々の供給源から容易かつ広く入手可能であり、良く特徴付けされている。
【００２３】
付加される知られた３’配列は同様に、プライマーに標的を提供するのに十分である他に付加された知られた配列の性質は付加方法によってのみ制限される便宜的事項である。例えば、リガーゼ媒介オリゴヌクレオチド付加を用いると、プライマーの標的として用いられ得る本質的に任意の知られた配列が３’末端に付加される。ポリアデニルトランスフェラーゼ媒介付加では、一般にポリ（Ｎ）配列の付加がより便利であり、ポリ（Ａ）配列を添加するときは最適な効果を示す多くのそのようなトランスフェラーゼである。ポリアデニルトランスフェラーゼ媒介付加については、付加される配列は一般に５から５０ヌクレオチドの範囲、好ましくは６から２５ヌクレオチドの範囲、より好ましくは７から１５ヌクレオチドの範囲である。
【００２４】
逆転写工程は、一般的には３’末端配列にハイブリッド形成するのに十分な相補性を持つプライマーを付加することにより形成された、第２のＲＮＡ種（３’配列を付加した第１の種）の３’末端又はその近傍の非共有結合複製領域で開始される。従って、３’末端はポリ（Ａ）配列を含み、逆転写工程は好ましくはポリ（Ａ）配列にハイブリッド形成したポリ（Ｔ）配列を含む複製領域で開始される。多くの応用では、プライマーは付加的機能配列、例えばＴ７又はＴ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどの１又はそれ以上のＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、１又はそれ以上のプライマー配列などを含む。
【００２５】
好ましい実施態様では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列はＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり、少なくとも野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列のヌクレオチド−１７から＋６を含み、上流フランキング配列、特に上流Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターフランキング配列の好ましくは少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドに結合している。付加的下流フランキング配列、特に下流Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターフランキング配列、例えばヌクレオチド＋７から＋１０も有利に用いられる。例えば、特別な一実施態様では、プロモーターは、クラスＩＩＩＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列のヌクレオチド−５０から＋１０を含む。表Ｉは、例示的プロモーター配列及びそれらの主題の方法における相対的転写効率を与える（列挙したプロモーター配列は、２３ヌクレオチドの天然クラスＩＩＩＴ７プロモーター上流フランキング配列に結合している）。
【００２６】
転写されたｃＤＮＡは、当初は一本鎖であり、第２のＲＮＡから広範な確立された方法によって単離される。例えば、これらの方法は、ＲＮＡをＲＮａｓｅＨなどのヌクレアーゼ、熱又はアルカリなどの変性剤、及び／又は電気泳動による鎖の分離で処理することを含む。第２の鎖ｃＤＮＡ合成は多くの良く確立された技術によって行ってよく、それらは、３’-末端ヘアピンループプライミング又は、例えば、第１のｃＤＮＡ鎖の３’末端に相補的な外来プライマーの付加によって、又はホフマン-ガブラー(Hoffman-Gubler)プロトコールに従って形成された非共有結合複製領域で重合が開始される方法を含む。この後者の実施態様では、ｃＤＮＡ単離及び二本鎖ｃＤＮＡの変換工程は、例えば、１回のインキュベーション工程においてＲＮＡをＲＮａｓｅＨに接触させ、一本鎖ｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼに接触させて同時に実施してもよい。いずれにしても、これらの方法は、非常に小さな、例えば単一細胞の出発物質からｃＤＮＡライブラリを作成するのに用いることができる。
【００２８】
特別な実施態様では、この方法はさらに、一本又は二本鎖ｃＤＮＡを繰り返し転写して複数の第３のＲＮＡを作成する、事実上第１のＲＮＡ種を増幅する工程を含む。好ましい転写条件は、クラスＩＩＩＴ７プロモーター配列（配列番号：１）及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼを以下の反応条件下で用いる：４０ｍＭのトリスｐＨ７．９、６ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのスペルミジン、１０ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＮＴＰ（Pharmacia）、４０単位のＲＮＡｓｉｎ（Promega）、３００−１０００単位のＴ７RNAポリメラーゼ（６．１６Ｐｒｅｐ）。酵素は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ及び５０％のグリセロール中に、２．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度及び３００−３５０単位／μＬの活性で貯蔵する。例示すると、このポリメラーゼの１−３μＬが５０μＬ反応に用いられた。テンプレートの出発濃度は、ピコグラム量（単一細胞レベル）から１μｇ又はそれ以上までの直線状プラスミドＤＮＡで変えられる。最終的なＮａＣｌ濃度は、好ましくは６ｍＭを超えない。
【００２９】
より特別な実施態様では、第１のＲＮＡはＲＮＡ、特にｍＲＮＡの増幅によって作成されたもの自体である。例えば、第１のＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列に結合したポリ（Ｔ）オリゴヌクリオチドをｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部にハイブリッド形成し、ｍＲＮＡを逆転写して一本鎖ｃＤＮＡを作成し、一本鎖ｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換し、そして二本鎖ｃＤＮＡを転写して第１のＲＮＡを作成することによるｍＲＮＡの増幅により作成される。図３は、本発明のこの一連のｍＲＮＡ増幅例の図であり、以下の各工程を明示している。
【００３０】
（ａ）５’-Ｔ７-ＲＮＡポリメラーゼプロモーター-オリゴ(ｄＴ)２４-３’からなるオリゴヌクレオチドプライマーを、成熟ｍＲＮＡの３’末端に存在するポリ（Ａ）トラクトにアニーリングし、逆転写酵素を用いて第１のｃＤＮＡ鎖を合成してＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッドを生成する（ＲＮＡは白抜き枠で、ＤＮＡは黒塗り枠で表す）；、
（ｂ）ハイブリッドをＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼで処理して一本鎖ｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換する；
（ｃ）このｃＤＮＡから大量の増幅されたＲＮＡ（ａＲＮＡ）を合成するのにＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる。Eberwine等, PNAS 89: 3010-3014, 1992 によって利用された変性プロモーター配列に比較したときの改変されたＴ７ポリメラーゼプロモーター配列の我々のプライマーへの取り込みがａＲＮＡの収量を格段に増大させる；
（ｄ）ａＲＮＡにポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてポリ（Ａ）を付随させる。この改変が、次の工程で元のプロトコールに比較して極めて長い第１のｃＤＮＡ鎖を生成する；
（ｅ）ａＲＮＡの変性及び除去の後、Ｔ７-ＲＮＡポリメラーゼプロモーター-オリゴ(ｄＴ)プライマーをこの新たに合成したポリ（Ａ）配列にアニーリングし、第１のｃＤＮＡ鎖を合成するのに逆転写酵素を用いる。第２のｃＤＮＡ鎖及びポリメラーゼプロモーターの相補的鎖を（ｂ）のように合成する；そして、
（ｆ）次いでＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてこのｃＤＮＡテンプレートからａＲＮＡを生成する。
【００３１】
他の実施態様は、或る合成工程の間に付加配列の取り込みを含む。これらの配列は、例えば、増幅したＲＮＡＰＣＲ増幅、第２のｃＤＮＡ鎖全体の合成無しの直接第２ラウンド増幅などを可能にする。この実施態様は図４に図示する。
（ａ）これは、第１のｃＤＮＡ鎖合成のためのプライマーもポリ(T)とＴ７配列との間に異なるＲＮＡポリメラーゼ（ＳＰ６で示す；Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ部位も可能である）に対するプライマー部位を含む以外は図３の工程（ａ）と同じである；
（ｂ）これは、図３の工程の（ｂ）である；
（ｃ）これは、ａＲＮＡがその５’末端にＲＮＡポリメラーゼ部位を有する以外は図３の工程（ｃ）と同じである；
（ｄ）これは、図３の工程（ｄ）と同じである；
（ｅ）これは、第１のｃＤＮＡ鎖合成のプライミングのために用いるオリゴヌクレオチドも、その５’末端にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の間プライミング部位として用いるのに好適な付加配列を有している以外は図３の工程（ｅ）と同じである。また、ＳＰ６又はＴ３ＲＮＡポリメラーゼ部位も第１のｃＤＮＡ鎖にコピーされることに注意されたい。この第１のｃＤＮＡ鎖が、その５’及び３’末端の両方に独特な配列を有するので、それは、全ての配列の全増幅のためのＰＣＲ反応において、ａＲＮＡ合成の他のラウンドを実施するための代替物として直接使用できる。
（ｆ）第１のｃＤＮＡ鎖は、ＳＰ６又は好ましくはＴ３ＲＮＡポリメラーゼ部位の相補的部分を取り込むオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによりａＲＮＡ合成のために直接使用できる。あるいは、第１のｃＤＮＡ鎖は、第２の鎖合成を通して二本鎖ｃＤＮＡに変換でき、次いでａＲＮＡ合成が続く。
【００３２】
この明細書中で引用した全ての出版物及び特許出願は、個々の出版物及び特許出願が特別にかつ独立して参考として取り入れられることが明示されているように、ここに出典明示して取り入れる。上記の発明は、理解を明確にするために、例示及び実施例によって幾分詳細に記述したが、当業者には、本発明の教示に照らして、添付する特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、それらにある種の変更及び修正がなし得ることが容易に明らかになるであろう。
【００３３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）を含むカセットを示す図である。
【図２】 個々の単一細胞プローブでスクリーニングしたｃＤＮＡ配列についての結果を示す図である。
【図３】 好ましいｍＲＮＡ増幅方法を示す図である。
【図４】 好ましいｍＲＮＡ増幅方法の代替的実施態様を示す図である。
Claims (21)
- 細胞の細胞型の決定方法において、
（ａ）細胞の不均一集団の細胞型の特定されていない単一細胞のｍＲＮＡを増幅し、
（ｂ）包括的発現ライブラリを増幅したｍＲＮＡでプローブして細胞の総発現プロフィールを決定し、
（ｃ）細胞の総発現プロフィールを１つ又はそれ以上の他の細胞の総発現プロフィールと比較して細胞の独特な発現プロフィールを決定する工程を含んでなり、
前記細胞の独特な発現プロフィールが細胞型を決定するマーカーを提供する方法。 - 工程（ｃ）が、細胞の総発現プロフィールを複数の他の細胞の総発現プロフィールと比較して細胞の独特な発現プロフィールを決定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
- 工程（ｃ）が、細胞の総発現プロフィールを複数の他の細胞の各単一細胞の総発現プロフィールと比較して細胞の独特な発現プロフィールを決定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
- 工程（ｃ）が、細胞の総発現プロフィールを複数の他の細胞の各単一細胞の総発現プロフィールと比較して細胞の独特な発現プロフィールを決定することを含んでなり、複数の単一の他の細胞が細胞の機能的又は構造的に異なる亜集団から誘導される、請求項１に記載の方法。
- 細胞の亜集団が組織特異的である、請求項４に記載の方法。
- 細胞の亜集団の各細胞が突然変異を含むゲノムを含む、請求項４に記載の方法。
- 細胞の亜集団の各細胞が突然変異を含むゲノムを含み、当該突然変異が各細胞に共通の選択可能又は検出可能なマーカーを提供する、請求項４に記載の方法。
- 細胞の亜集団の各細胞が突然変異を含むゲノムを含み、当該突然変異が各細胞にエピトープ又はシグナル生成タンパク質から選択される共通の選択可能なマーカーをコードし提供する挿入作成物である、請求項４に記載の方法。
- 細胞の亜集団の各細胞が突然変異を含むゲノムを含み、当該突然変異が各細胞に緑色蛍光タンパク質、ガラクトシダーゼ及び外部から接近可能な細胞表面関連タンパク質からなる群から選択されるシグナル生成タンパク質をコードし提供する挿入作成物である、請求項４に記載の方法。
- 細胞の亜集団の各細胞が突然変異を含むゲノムを含み、当該突然変異が各細胞にエピトープ又はシグナル生成タンパク質から選択される共通の選択可能なマーカーをコードし提供する挿入作成物であり、当該挿入作成物が、各細胞に内部リボソームエントリー配列をコードし提供し、作成物が標的遺伝子の最後のエクソンにおける停止コドンの下流側だがポリアデニル化シグナルの上流側の標的遺伝子に挿入され、内部リボソームエントリー配列が標的遺伝子の転写物内に第２の読み取り枠を提供する、請求項４に記載の方法。
- 細胞の亜集団の各細胞が突然変異を含むゲノムを含み、当該突然変異が各細胞にエピトープ又はシグナル生成タンパク質から選択される共通の選択可能なマーカーをコードし提供する挿入作成物であり、当該亜集団がフローサイトメトリーにより単離される、請求項４に記載の方法。
- ライブラリがｃＤＮＡライブラリである、請求項１に記載の方法。
- ライブラリが規格化又はサブトラクト (subtract)される、請求項１に記載の方法。
- ライブラリが固定化された核酸の高密度の規則的配列(array)を含む、請求項１に記載の方法。
- ｍＲＮＡが、５’末端に知られた配列を持つ第１のＲＮＡの３’末端に知られた核酸配列を付加して第２のＲＮＡを形成し、当該第２のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを形成する工程を含む方法により増幅される、請求項１に記載の方法。
- ｍＲＮＡが、５’末端に知られた配列を持つ第１のＲＮＡの３’末端に知られた核酸配列を付加して第２のＲＮＡを形成し、当該第２のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを形成する工程を含む方法により増幅され、ｃＤＮＡが一本鎖であって、ＲＮＡを変性剤に接触させ、一本鎖ｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼ及び一本鎖ｃＤＮＡの３’末端に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー及びＲＮＡポリメラーゼプロモーターと接触させる工程を含み、それによりＤＮＡポリメラーゼが一本鎖ｃＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の非共有結合した二重鎖領域において変換を開始する方法により二本鎖ｃＤＮＡに変換される、請求項１に記載の方法。
- ｍＲＮＡが、５’末端に知られた配列を持つ第１のＲＮＡの３’末端に知られた核酸配列を付加して第２のＲＮＡを形成し、当該第２のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを形成する工程を含む方法により増幅され、ｃＤＮＡが一本鎖であって、ＲＮＡを変性剤に接触させ、一本鎖ｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼ及び一本鎖ｃＤＮＡの３’末端に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー及び約３〜１００ヌクレオチドのフランキング配列の上流側に結合した配列番号：１を含むＲＮＡポリメラーゼプロモーターと接触させる工程を含み、それによりＤＮＡポリメラーゼが一本鎖ｃＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の非共有結合した二重鎖領域において変換を開始する方法により二本鎖ｃＤＮＡに変換される、請求項１に記載の方法。
- ｍＲＮＡが、５’末端に知られた配列を持つ第１のＲＮＡの３’末端に知られた核酸配列を付加して第２のＲＮＡを形成し、当該第２のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを形成する工程を含む方法により増幅され、ｃＤＮＡが一本鎖であって二本鎖に変換され、当該方法が二本鎖ｃＤＮＡを繰り返し転写して複数の第３のＲＮＡを形成する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
- ｍＲＮＡが、５’末端に知られた配列を持つ第１のＲＮＡの３’末端に知られた核酸配列を付加して第２のＲＮＡを形成し、当該第２のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを形成する工程を含む方法により増幅され、第１のＲＮＡがｍＲＮＡの増幅により製造される、請求項１に記載の方法。
- ｍＲＮＡが、５’末端に知られた配列を持つ第１のＲＮＡの３’末端に知られた核酸配列を付加して第２のＲＮＡを形成し、当該第２のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを形成する工程を含む方法により増幅され、第１のＲＮＡが、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列に結合したポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチドをｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部にハイブリッド形成し、当該ｍＲＮＡを逆転写して一本鎖ｃＤＮＡを形成し、一本鎖ｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換し、そして二本鎖ｃＤＮＡを転写して第１のＲＮＡを形成する工程によりｍＲＮＡを増幅することにより製造される、請求項１に記載の方法。
- ｍＲＮＡが、ポリメラーゼ連鎖反応を含む方法により増幅される、請求項１に記載の方法。
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