JP2022002525A - キメラ抗原受容体発現細胞の有効性および増殖を改善するための方法 - Google Patents

キメラ抗原受容体発現細胞の有効性および増殖を改善するための方法 Download PDF

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Abstract

【課題】臨床グレードの製品を生成するために、Ｔ細胞採取の効率を改善し、より多量の免疫エフェクター細胞を増殖させる能力を改善する方法を提供する。【解決手段】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）、それを含む組成物および反応混合物、ならびにそれを使用した治療方法を提供する。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１５年４月１７日に出願された米国第６２／１４９，２４９号の優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０１６年４月１４日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、Ｎ２０６７−７０９４ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズが７２０，０４２バイトである。
本発明は、概して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）、それを含む組成物、ならびにそれを作製および使用する方法に関する。
自家Ｔ細胞、特に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が形質導入されたＴ細胞を用いた養子細胞移入（ＡＣＴ）療法は、いくつかの血液がんの臨床試験において有望であることが示されている。これらの有望な結果にもかかわらず、臨床的に利用可能な製品の収率が不十分であるために（少なくとも部分的に）、登録しようと評価を受ける多くの患者が、最終的に、次に進むことができない。臨床的に利用可能な製品におけるこのような制限は、患者から適切かつ十分なリンパ球を採取することができないこと、採取した細胞の限界、およびエキソビボでの細胞増殖が限定されることを含む、複数の要因の結果として生じ得る。
したがって、臨床グレードの製品を生成するために、Ｔ細胞採取の効率を改善し、より多量の免疫エフェクター細胞を増殖させる能力を改善する必要性が存在する。
本開示は、少なくとも部分的に、細胞療法において使用するための免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の有効性および／または増殖（例えば、エキソビボ増殖）を改善するための方法に関する。一部の実施形態では、出願人らは、対象、例えば、がん患者から、診断後できるだけ早い時点で（例えば、治療法の前、または治療法過程の間の早い時点で）、免疫細胞を取得すること、例えば、採取することの重大な利点を発見した。本明細書に記載される一部の実施形態は、細胞療法、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法における使用に対する免疫細胞の適性を評価および／または最適化するための基準を提供する。理論に束縛されることを望むものではないが、診断後または選択された化学療法での治療後のできるだけ早い時点で採取した免疫細胞は、低分化度の免疫エフェクター細胞集団（例えば、ナイーブＴ細胞および早期メモリーＴ細胞）を含むと考えられる。低分化度の免疫エフェクター細胞集団は、高度に増殖性であり、自己再生性があり、かつ／または生存能力を有し、したがって、より高い増殖能力および／またはより高い抗腫瘍効果を有すると考えられる。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、有利なことに、がんの診断後の早い時点で、例えば、化学療法の前またはある特定の／複数回の化学療法サイクルの前に、対象から細胞を取得することによって、Ｔ細胞の適合性（例えば、細胞療法での使用に対する適性）および有効性を改善する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、Ｔ細胞枯渇薬を含む化学療法サイクルの前に患者から取得された（例えば、２回、３回、４回、もしくは５回の化学療法サイクルの前に取得された）細胞、または後期強化サイクルもしくは地固めサイクルの前に取得された細胞を利用する。他の実施形態では、本方法は、例えば、悪性腫瘍の種類（例えば、白血病に対してリンパ腫）または疾患の重症度（例えば、標準リスク、高リスク、もしくは非常に高リスク）に基づいた患者の選択を含めることによって、免疫細胞の増殖能力および／または抗腫瘍効果を最適化する。さらに他の実施形態では、本方法は、細胞の選択、例えば、Ｔ細胞絶対数が高いかまたは低分化度のＴ細胞の割合が高い細胞集団の選択を含めることによって、免疫細胞の増殖能力および／または抗腫瘍効果を最適化する。したがって、本明細書に開示される方法を使用して、細胞療法のための組成物および方法、ならびに／または免疫エフェクター細胞集団（例えば、ＣＡＲ発現細胞）を作製する方法のうちの１つまたは複数を最適化することができる。
したがって、一態様では、本発明は、細胞療法、例えば、ＣＡＲ療法（例えば、がん療法）における使用に対する免疫細胞（例えば、免疫エフェクター細胞またはその集団）の適性を評価するための方法を特徴とする。本方法は、
（ｉ）対象（例えば、がん患者）から免疫細胞を取得する（例えば、採取する）タイミング、
（ｉｉ）例えば、免疫細胞取得（例えば、採取）に対する治療法、例えば、化学療法のタイミング、
（ｉｉｉ）治療法、例えば、化学療法の種類、
（ｉｖ）原発性悪性腫瘍、
（ｖ）免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）パラメーター、例えば、Ｔ細胞数、Ｔ細胞表現型、もしくはＴ細胞機能のうちの１つもしくは複数
のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上（すべて）、または（ｉ）〜（ｖ）の組合せの値を取得することを含み、
（ｉ）〜（ｖ）のうちのいずれかの値が、細胞療法、例えば、ＣＡＲ療法における使用に対する免疫細胞の適性を示す。一実施形態では、（ｉ）〜（ｖ）のうちのいずれかの値は、免疫細胞の増殖（例えば、エキソビボ増殖）の能力、治療法に対する免疫細胞の有効性、または免疫細胞の収率のうちの１つまたは複数を示す。
別の態様では、本発明は、がんを有する対象を治療するか、またはこの対象に抗腫瘍免疫を提供する方法を特徴とする。本方法は、対象に、治療法、例えば、化学療法と組み合わせて、ＣＡＲ分子を発現する能力のある免疫細胞（例えば、免疫エフェクター細胞またはその集団）（「ＣＡＲ発現細胞」または「ＣＡＲ療法」）を投与することを含む。ある特定の実施形態では、免疫細胞（例えば、免疫エフェクター細胞またはその集団）は、
（ｉ）対象（例えば、がん患者）から免疫細胞を取得する（例えば、採取する）タイミング、
（ｉｉ）例えば、免疫細胞取得（例えば、採取）に対する治療法、例えば、化学療法のタイミング、
（ｉｉｉ）治療法、例えば、化学療法の種類、
（ｉｖ）原発性悪性腫瘍、
（ｖ）免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）パラメーター、例えば、Ｔ細胞数、Ｔ細胞表現型、もしくはＴ細胞機能のうちの１つもしくは複数
のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上（すべて）、または（ｉ）〜（ｖ）の組合せを最適化することによって取得される（例えば、得られるかまたは採取される）。
一実施形態では、免疫細胞は、ＣＡＲ分子の導入前に取得される。一実施形態では、取得した免疫細胞を、ＣＡＲ分子の導入前に増殖させる。他の実施形態では、免疫細胞は、ＣＡＲ分子の導入後に取得される。一実施形態では、取得した免疫細胞を、ＣＡＲ分子の導入後に増殖させる。免疫細胞は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかに従って増殖および／または活性化され得る。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、（ｉ）〜（ｖ）のうちのいずれかが最適化されている場合に、免疫細胞集団の増殖（例えば、エキソビボ増殖）、治療法に対する免疫細胞集団の有効性、または免疫細胞集団の収率のうちの１つまたは複数の増加を示す。
一部の実施形態では、本方法は、取得した免疫細胞（例えば、細胞集団）に、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ（例えば、ＣＴＬ０１９）をコードする核酸を導入することを含む。
さらに別の態様では、本発明は、ＣＡＲ療法（例えば、ＣＡＲ分子を発現する細胞）における使用に好適な免疫細胞集団（例えば、免疫エフェクター細胞集団）を富化するか、またはそれを作製する方法を特徴とする。本方法は、
（ｉ）対象（例えば、がん患者）から免疫細胞を取得する（例えば、採取する）タイミング、
（ｉｉ）例えば、免疫細胞取得（例えば、採取）に対する治療法、例えば、化学療法のタイミング、
（ｉｉｉ）治療法、例えば、化学療法の種類、
（ｉｖ）原発性悪性腫瘍、
（ｖ）免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）パラメーター、例えば、Ｔ細胞数、Ｔ細胞表現型、もしくはＴ細胞機能のうちの１つもしくは複数
のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上（すべて）、または（ｉ）〜（ｖ）の組合せに従って、免疫細胞集団を取得する（例えば、採取する）ことを含む。
一実施形態では、免疫細胞集団は、ＣＡＲ分子の導入前に取得される。一実施形態では、取得した免疫細胞を、ＣＡＲ分子の導入前に増殖させる。他の実施形態では、免疫細胞は、ＣＡＲ分子の導入後に取得される。一実施形態では、取得した免疫細胞を、ＣＡＲ分子の導入後に増殖させる。免疫細胞は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかに従って増殖および／または活性化され得る。
いくつかの実施形態では、免疫細胞集団は、（ｉ）〜（ｖ）のうちのいずれかが最適化されている場合に、免疫細胞集団の増殖（例えば、エキソビボ増殖）、治療法に対する免疫細胞集団の有効性、または免疫細胞集団の収率のうちの１つまたは複数の増加を示す。
一部の実施形態では、本方法は、免疫細胞（例えば、細胞集団）に、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ（例えば、ＣＴＬ０１９）をコードする核酸を導入することをさらに含む。
別の態様では、本発明は、例えば、本明細書に記載される方法により作製された免疫エフェクター細胞集団（例えば、ＣＡＲ分子またはＣＡＲ分子をコードする核酸を含む）を含む免疫細胞調製物または反応混合物を特徴とする。
前述の方法、調製物、および反応混合物のうちのいずれかのさらなる特徴または実施形態には、以下のうちの１つまたは複数が含まれる。
対象
一実施形態では、対象、例えば、免疫細胞が取得される対象および／または治療を受ける対象は、ヒト、例えば、がん患者である。ある特定の実施形態では、対象は、年齢が１８歳またはそれよりも若い［例えば、１８歳、１７歳、１６歳、１５歳、１４歳、１３歳、１２歳、１１歳、１０歳、９歳、８歳、７歳、６歳、５歳、４歳、３歳、２歳、１歳、またはそれよりも若い（例えば、１２ヶ月、６ヶ月、３ヶ月、またはそれ未満）］。一実施形態では、対象は、小児がん患者である。
他の実施形態では、対象は、成人であり、例えば、対象は、年齢が１８歳を超える（例えば、１８歳を超える、１９歳を超える、２０歳を超える、２５歳を超える、３０歳を超える、３５歳を超える、４０歳を超える、４５歳を超える、５０歳を超える、５５歳を超える、６０歳を超える、６５歳を超える、７０歳を超える、７５歳を超える、８０歳を超える、またはそれよりも老齢である）。一実施形態では、対象は、成人がん患者である。
ある特定の実施形態では、対象は、腫瘍関連抗原またはがん関連抗原の発現と関連する疾患、例えば、本明細書に記載される疾患を有する。一実施形態では、対象は、がん、例えば、本明細書に記載されるがんを有する。
一実施形態では、対象は、血液がん、固形腫瘍、またはそれらの転移病変から選択されるがんを有する。例示的ながんとしては、Ｂ細胞性急性リンパ球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞性前骨髄球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞性白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ならびにワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、がんは、ＡＬＬである。別の実施形態では、がんは、ＣＬＬである。
いくつかの実施形態では、対象は、白血病、例えば、ＡＬＬを有する。いくつかの実施形態では、対象は、白血病、例えば、ＡＬＬを有し、かつ小児患者であり、例えば、年齢が１８歳またはそれよりも若い［例えば、１８歳、１７歳、１６歳、１５歳、１４歳、１３歳、１２歳、１１歳、１０歳、９歳、８歳、７歳、６歳、５歳、４歳、３歳、２歳、１歳、またはそれよりも若い（例えば、１２ヶ月、６ヶ月、３ヶ月、またはそれ未満）］。
ある実施形態では、対象は、ＡＬＬを有し、例えば、標準リスク、高リスク、または非常に高リスクのＡＬＬを有するとして分類される。ある実施形態では、対象は、ＡＬＬを有し、例えば、標準リスク、高リスク、または非常に高リスクのＡＬＬを有するとして分類され、かつ小児対象であり、例えば、年齢が１８歳またはそれよりも若い。一実施形態では、対象は、標準リスクのＡＬＬを有するとして分類される。いくつかの実施形態では、対象は、標準リスクのＡＬＬを有するとして分類され、かつ小児対象であり、例えば、年齢が１８歳またはそれよりも若い。別の実施形態では、対象は、高リスクのまたは非常に高リスクのＡＬＬを有するとして分類されない。いくつかの実施形態では、対象は、高リスクまたは非常に高リスクのＡＬＬを有するとして分類されず、かつ小児対象であり、例えば、年齢が１８歳またはそれよりも若い。
いくつかの実施形態では、対象は、リンパ腫を有さず、例えば、対象は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を有さない。いくつかの実施形態では、対象は、小児対象であり、例えば、年齢が１８歳またはそれよりも若く、かつＮＨＬを有さない。
他の実施形態では、対象は、リンパ腫、例えば、ＮＨＬを有する。いくつかの実施形態では、対象は、小児対象であり、例えば、年齢が１８歳またはそれよりも若く、かつＮＨＬを有する。
いくつかの実施形態では、対象は、再発がんを有さない。いくつかの実施形態では、対象は、小児対象であり、例えば、年齢が１８歳またはそれよりも若く、かつ再発がんを有さない。他の実施形態では、対象は、再発がんを有する。いくつかの実施形態では、対象は、小児対象であり、例えば、年齢が１８歳またはそれよりも若く、かつ再発がんを有する。
一実施形態では、免疫細胞（例えば、免疫エフェクター細胞集団）は、血液がん、例えば、白血病、例えば、ＣＬＬ、ＡＬＬ、またはリンパ腫、例えば、ＭＣＬ、ＮＨＬ、もしくはＨＬを有する対象から取得される、例えば、得られる。
採取／化学療法の投与のタイミング
ある特定の実施形態では、早いタイミングの免疫細胞取得、例えば、採取（例えば、診断後の）は、細胞療法、例えば、ＣＡＲ療法における使用に対する免疫細胞の適性の増加を示す。いくつかの実施形態では、早いタイミングの免疫細胞採取は、免疫細胞の増殖（例えば、エキソビボ増殖）、治療法に対する免疫細胞の適性、または免疫細胞の作製収率のうちの１つまたは複数の能力を増加させる。
一実施形態では、治療法、例えば、化学療法を対象に投与する前に免疫細胞を採取することは、結果として、細胞療法、例えば、ＣＡＲ療法における使用に対する免疫細胞の適性の増加をもたらす。他の実施形態では、対象に対する治療法、例えば、化学療法の過程の早い時点で（例えば、対象が、２回、３回、４回、または５回の化学療法サイクルを受ける前に）免疫細胞を採取することは、結果として、細胞療法、例えば、ＣＡＲ療法における使用に対する免疫細胞の適性の増加をもたらす。
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態では、免疫細胞採取は、治療法、例えば、化学療法を対象に施す前に起こる。いくつかの実施形態では、採取は、対象に対する治療法、例えば、化学療法の過程の早い時点で起こる。ある実施形態では、免疫細胞採取は、対象が、２回、３回、４回、または５回の化学療法サイクルを受ける前に起こる。ある実施形態では、免疫細胞採取は、対象が１回の化学療法サイクル受けた後だが、対象が１回を上回る（例えば、１回を上回る、２回を上回る、３回を上回る、４回を上回る、または５回を上回るサイクルの）化学療法サイクルを受ける前に起こる。
ある特定の実施形態では、化学療法または化学療法サイクルは、寛解導入療法、地固め療法、中間維持療法、後期強化療法、または維持療法のサイクルのうちの１つまたは複数を含む。一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、対象が地固めの化学療法サイクルまたは寛解導入の化学療法サイクルを受ける前に、対象から採取される。いくつかの実施形態では、細胞は、対象が、地固めの化学療法サイクルを受ける前に採取される。いくつかの実施形態では、対象は、高リスクまたは非常に高リスクのがん（例えば、ＡＬＬ）を有するとして分類され、細胞は、対象が地固めサイクルを受ける前に採取される。別の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、対象が後期強化サイクルを受ける前に、対象から採取される。いくつかの実施形態では、対象は、標準リスクのがん（例えば、ＡＬＬ）を有するとして分類され、細胞は、対象が後期強化サイクルを受ける前に採取される。いくつかの実施形態では、化学療法サイクルは、表８から選択される。
一部の実施形態では、化学療法は、表８から選択される薬物を含む。いくつかの実施形態では、化学療法は、表８に記載される薬物および投薬レジメンを含む。いくつかの実施形態では、化学療法は、ビンクリスチン、デキサメタゾン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、ダウノルビシン、６−メルカプトプリン、シクロホスファミド、シタラビン、メトトレキサート、ドキソルビシン、６−チオグアニン、および／またはプレドニゾンを含み得る。
一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、対象がシクロホスファミドおよび／またはシタラビンの投与を受ける前に対象から採取される。
免疫エフェクター細胞パラメーター
一部の実施形態では、採取した免疫エフェクター細胞は、例えば、参照値（例えば後の時点またはさらなる回数の化学療法に曝露した後の対象からの試料）と比較して、より多数の低分化度のＴ細胞、例えば、より多数のナイーブＴ細胞、ステムセントラルメモリーＴ細胞、および／またはセントラルメモリーＴ細胞のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、採取した免疫エフェクター細胞は、少なくとも２０％のナイーブＴ細胞、少なくとも２％のステムセントラルメモリーＴ細胞、および／または少なくとも４％のセントラルメモリーＴ細胞を含む。
他の実施形態では、Ｔ細胞絶対数（ＡＴＣ）の増加は、細胞療法、例えば、ＣＡＲ療法における使用に対する免疫細胞の適性の増加を示す。一実施形態では、採取した免疫エフェクター細胞は、１マイクロリットル当たり少なくとも４００個のＴ細胞絶対数、１マイクロリットル当たり少なくとも２００のナイーブＴ細胞絶対数、１マイクロリットル当たり少なくとも２０個のステムセントラルメモリーＴ細胞絶対数、および／または１マイクロリットル当たり少なくとも４０個のセントラルメモリーＴ細胞絶対数を含む。
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、１つまたは複数のマーカー、例えば、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ９５の発現に基づいて選択され、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）集団は、ＣＣＲ７＋およびＣＤ６２Ｌ＋である。
いくつかの実施形態では、ナイーブＴ細胞は、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ９５−の発現パターンに基づいて特定され、ステムセントラルメモリーＴ細胞は、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ９５＋の発現パターンに基づいて特定され、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ９５＋の発現パターンに基づいて特定される。
ＣＡＲ分子
本明細書に記載される方法、調製物、および反応混合物によると、例えば本明細書に記載される方法によって得られた免疫エフェクター細胞は、１つまたは複数のがん関連抗原を標的とするＣＡＲ分子（本明細書において「ＣＡＲ」とも称される）を含有するように操作することができる。一部の実施形態では、がん関連抗原（腫瘍抗原）は、以下のうちの１つまたは複数から選択される：ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ−１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９、および１９Ａ２４とも称される）；Ｃ型レクチン様分子−１（ＣＬＬ−１またはＣＬＥＣＬ１）；ＣＤ３３；上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２−８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２−３）ｂＤＧａｌｐ（１−４）ｂＤＧｌｃｐ（１−１）Ｃｅｒ）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原［（Ｔｎ Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）］；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２（ＩＬ−１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２）；メソテリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ−１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（ＴｅｓｔｉｓｉｎまたはＰＲＳＳ２１）；血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；Ｌｅｗｉｓ（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ−ベータ）；ステージ特異的胎児抗原−４（ＳＳＥＡ−４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体チロシン−タンパク質キナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ（Ｐｒｏｓｔａｓｅ）；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２突然変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；ブレイクポイントクラスター領域（ＢＣＲ）およびエーベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子相同体１（Ａｂｌ）からなる癌遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ−ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルＬｅｗｉｓ接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２−３）ｂＤＧａｌｐ（１−４）ｂＤＧｌｃｐ（１−１）Ｃｅｒ）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７−関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；プロテインＧ結合型受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ−ＢＲ−１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パンネキシン３（ＰＡＮＸ３）；プロテインＧ結合型受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウイルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ−１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ−Ａ１）；ＥＴＳ転座−変異体遺伝子６、１２ｐ染色体に位置（ＥＴＶ６−ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合性細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）；黒色腫がん精巣抗原−１（ＭＡＤ−ＣＴ−１）；黒色腫がん精巣抗原−２（ＭＡＤ−ＣＴ−２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３突然変異体；プロステイン；生存；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１またはガレクチン８）、Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原１（ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１）；ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座ブレイクポイント；黒色腫のアポトーシス阻害因子（ＭＬ−ＩＡＰ）；ＥＲＧ［膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子］；Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；対合ボックスタンパク質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ−ｍｙｃニワトリ骨髄芽球腫ウイルス癌遺伝子神経芽細胞腫由来相同体（ＭＹＣＮ）；Ｒａｓ相同体ファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）；シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（亜鉛フィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳまたはインプリント部位の制御因子の同胞）、Ｔ細胞によって認識される扁平上皮細胞癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；対合ボックスタンパク質Ｐａｘ−５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ−ＴＥＳ１）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ−４）；滑膜肉腫、Ｘブレイクポイント２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物の受容体（ＲＡＧＥ−１）；腎臓偏在１（ＲＵ１）；腎臓偏在２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸内カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０−２突然変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０−２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡのＦｃ断片受容体（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様分子含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；ならびに免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）。
一実施形態では、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ（例えば、ＣＴＬ０１９）によって標的とされるがん関連抗原は、ＣＤ１９である。一実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表４に示されるアミノ酸を含むか、または表４に示されるヌクレオチド配列を有する。
一実施形態では、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲによって標的とされるがん関連抗原は、ＢＣＭＡである。一実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、表１１に示されるアミノ酸を含むか、または表１１に示されるヌクレオチド配列を有する。
ある実施形態では、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲによって標的とされるがん関連抗原は、ＥＧＦＲｖＩＩＩであり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０３２２２７５Ａ１に記載されている。いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０３２２２７５Ａ１に示されているアミノ酸を含むか、またはそこに示されているヌクレオチド配列を有する。
ある実施形態では、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ１２３ ＣＡＲによって標的とされるがん関連抗原は、ＣＤ１２３であり、例えば、ＵＳ２０１４／０３２２２１２Ａ１またはＵＳ２０１６／００６８６０１Ａ１に記載されており、これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１２３ ＣＡＲは、いずれも参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０３２２２１２Ａ１またはＵＳ２０１６／００６８６０１Ａ１に示されているアミノ酸を含むか、またはそこに示されているヌクレオチド配列を有する。
ある実施形態では、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載される抗メソテリンＣＡＲによって標的とされるがん関連抗原は、メソテリンであり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０９０２３０に記載されている。いくつかの実施形態では、抗メソテリンＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０９０２３０に示されているアミノ酸を含むか、またはそこに示されているヌクレオチド配列を有する。
ある実施形態では、ＣＡＲ分子によって標的とされるがん関連抗原は、メソテリン例えば、本明細書に記載される抗ＣＬＬ１ ＣＡＲであり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００５１６５１Ａ１に記載されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＬＬ１ ＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００５１６５１Ａ１に示されているアミノ酸を含むか、またはそこに示されているヌクレオチド配列を有する。
ある実施形態では、ＣＡＲ分子によって標的とされるがん関連抗原は、メソテリン、例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ３３ ＣＡＲであり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００９６８９２Ａ１に記載されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ ＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００９６８９２Ａ１に示されているアミノ酸を含むか、またはそこに示されているヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、ＣＡＲ分子の抗原結合性ドメインは、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＳＤＡＢ）、ＶＨもしくはＶＬドメイン、またはラクダＶＨＨドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲ分子の膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒ α、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、および／またはＮＫＧ２Ｃの膜貫通ドメインから選択される、膜貫通ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲ分子の膜貫通ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾を有するが、２０個を上回る、１０個を上回る、もしくは５個を上回る修飾は有さない、ＣＤ８膜貫通ドメインのアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸配列に９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号６の配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１７の配列またはそれに９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ヒンジ領域によって膜貫通ドメインに接続される。一実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８ヒンジのアミノ酸配列、例えば、配列番号２、またはＩｇＧ４ヒンジのアミノ酸配列、例えば、配列番号３６、または配列番号２もしくは３６に９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。他の実施形態では、ヒンジ領域をコードする核酸配列は、それぞれがＣＤ８ヒンジもしくはＩｇＧ４ヒンジに対応する、配列番号１３もしくは配列番号３７の配列、または配列番号１３もしくは３７に９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
他の実施形態では、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態では、ＣＡＲ分子の一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ３ゼータ一次シグナル伝達ドメインは、配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾を有するが、２０個を上回る、１０個を上回る、もしくは５個を上回る修飾は有さない、アミノ酸配列、または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列に９５〜９９％の同一性を有する配列を含み得る。一部の実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、配列番号９または配列番号１０の配列を含む。他の実施形態では、一次シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号２０もしくは配列番号２１の配列、またはそれに９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲ分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、またはＮＫＧ２Ｄのうちの１つまたは複数から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲ分子の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７もしくは配列番号１６のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾を有するが、２０個を上回る、１０個を上回る、もしくは５個を上回る修飾は有さないアミノ酸配列、または配列番号７もしくは配列番号１６のアミノ酸配列に９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７または配列番号１６の配列を含む。他の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１８もしくは配列番号１５の配列、またはそれに９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
他の実施形態では、ＣＡＲ分子の細胞内ドメインは、配列番号９または配列番号１０の配列および配列番号７または配列番号１６の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列は、同じフレーム内で単一のポリペプチド鎖として発現される。
ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１８もしくは配列番号１５の配列またはそれに９５〜９９％の同一性を有する配列、および配列番号２０もしくは配列番号２１の配列またはそれに９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、リーダー配列をさらに含む。一実施形態では、リーダー配列は、配列番号１の配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲ分子の抗原結合性ドメインは、１０−４Ｍ〜１０−８Ｍの結合親和性ＫＤを有する。
一実施形態では、ＣＡＲ分子の抗原結合性ドメインは、本明細書に記載される抗原結合性ドメイン、例えば、上述の標的に対する本明細書に記載される抗原結合性ドメインである。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９ ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、本明細書、例えば、表１または４に記載される抗原結合性ドメインを含む。
治療の方法／組合せ療法
本明細書に記載される障害（例えば、がん）を治療する方法および本明細書に記載される抗腫瘍免疫を提供する方法によると、一部の実施形態では、本方法は、対象に、ＣＡＲ分子、または本明細書に記載される方法によって作製された免疫エフェクター細胞集団を投与することを含む。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲを発現するように操作される。いくつかの実施形態では、本方法は、治療法、例えば、本明細書に記載される化学療法を、対象に施すことをさらに含む。
腫瘍抗原の発現と関連する疾患、例えば、本明細書に記載される障害を有する対象の治療における使用のための、ＣＡＲ分子（例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ分子）を含む免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞集団）を含む組成物もまた、本明細書に提供される。
一部の実施形態では、化学療法（例えば、化学療法サイクル）およびＣＡＲ療法は、並行して投与される。他の実施形態では、化学療法（例えば、化学療法サイクル）およびＣＡＲ療法は、逐次的に、例えば、次々に投与される。いくつかの実施形態では、化学療法（例えば、化学療法サイクル）およびＣＡＲ療法の投与には、１週間未満（例えば、７日未満、６日未満、５日未満、４日未満、３日未満、２日未満、または１日未満）の重複が存在する。いくつかの実施形態では、化学療法（例えば、化学療法サイクル）およびＣＡＲ療法の投与には、少なくとも１週間（例えば、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、またはそれ以上）の重複が存在する。
一部の実施形態では、ＣＡＲ療法は、化学療法の前、例えば、化学療法サイクルの前に投与される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ療法は、１回目の化学療法サイクル、２回目の化学療法サイクル、３回目の化学療法サイクル、４回目の化学療法サイクル、または５回目の化学療法サイクルの前に投与される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ療法は、寛解導入の化学療法サイクル、地固めの化学療法サイクル、中間維持の化学療法サイクル、後期強化の化学療法サイクル、または維持の化学療法サイクルの前に投与される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ療法は、化学療法、例えば、本明細書に記載される薬物、例えば、表８に記載される薬物を含む化学療法サイクルの前に投与される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ療法の投与は、化学療法の投与の前、例えば、化学療法サイクルの前に開始し、その後、ＣＡＲ療法および化学療法の投与は、ある期間、並行して継続される。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ療法は、化学療法の後、例えば、化学療法サイクルの後に投与される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ療法は、１回目の化学療法サイクル、２回目の化学療法サイクル、３回目の化学療法サイクル、４回目の化学療法サイクル、または５回目の化学療法サイクルの後に投与される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ療法は、寛解誘導の化学療法サイクル、地固めの化学療法サイクル、中間維持の化学療法サイクル、後期強化の化学療法サイクル、または維持の化学療法サイクルの後に投与される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ療法は、化学療法、例えば、本明細書に記載される薬物、例えば、表８に記載される薬物を含む化学療法サイクルの後に投与される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ療法の投与は、化学療法の投与の後、例えば、化学療法サイクルの後に開始し、その後、ＣＡＲ療法および化学療法の投与は、ある期間、並行して継続される。
一実施形態では、がんは、例えば、ＡＬＬまたはＣＬＬなどの血液がんである。一実施形態では、がん、例えば、本明細書に記載される血液がん、例えば、白血病（例えば、ＡＬＬもしくはＣＬＬ）またはリンパ腫（例えば、ＭＣＬ、ＨＬ、もしくはＮＨＬ）。
一実施形態では、腫瘍抗原、例えば、本明細書に記載される腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９と関連する疾患は、増殖性疾患、例えば、がんもしくは悪性腫瘍、または前がん状態、例えば、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、または前白血病から選択されるか、または本明細書に記載される腫瘍抗原の発現と関連する非がん関連適応症である。一実施形態では、疾患は、本明細書に記載されるがん、例えば、本明細書に記載される標的と関連付けられている本明細書に記載されるがんである。一実施形態では、血液がんは、白血病である。一実施形態では、がんは、Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、ＡＬＬを含むがこれらに限定されない１つもしくは複数の急性白血病；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含むがこれらに限定されない１つもしくは複数の慢性白血病；Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞性白血病、小細胞型もしくは大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、ならびに／または「前白血病」［例えば、骨髄血液細胞の無効な産生（もしくは異形成）などによってまとめられる、血液状態の多様な集合］を含むがこれらに限定されないさらなる血液がんまたは血液状態からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される腫瘍抗原の発現と関連する疾患は、本明細書に記載される腫瘍抗原を発現する、異型および／または非古典的ながん、悪性腫瘍、前がん状態、または増殖性疾患、ならびにこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原の発現と関連する疾患は、腫瘍抗原の発現と関連する増殖性疾患、前がん状態、がん、および非がん関連の適応症からなる群から選択される。
別の実施形態では、本明細書に記載される腫瘍抗原と関連する疾患は、固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、がんは、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌腫、肝臓がん、肺の非小細胞癌腫、小腸のがん、食道のがん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頸部のがん、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、小児期の固形腫瘍、膀胱のがん、腎臓または尿管のがん、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮がん、扁平上皮細胞がん、Ｔ細胞性リンパ腫、環境によって誘発されるがん、前記がんの組合せ、ならびに前記がんの転移病変から選択される。
前述の方法または使用のうちのいずれかのある特定の実施形態では、疾患と関連する腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１（ＣＬＥＣＬ１）、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＦＡＰ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３突然変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ突然変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレイクポイント、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、腸内カルボキシルエラスターゼ、ｈｓｐ７０−２突然変異型、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、およびＩＧＬＬ１のうちの１つまたは複数から選択される。
一実施形態では、細胞集団は、集団を投与される対象にとって自家的である。一実施形態では、細胞集団は、集団を投与される対象にとって同種である。一実施形態では、対象は、ヒトである。
一実施形態では、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を形質導入した免疫エフェクター細胞集団を、例えば、本明細書に記載される方法によって増殖させる。一実施形態では、細胞は、８日間またはそれ未満、例えば、７日間、６日間、５日間、４日間、または３日間の期間、増殖させる。一実施形態では、細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ細胞は、５日間培養液中で増殖させ、その結果得られた細胞は、例えば、本明細書に記載されるように、同じ培養条件下において９日間培養液中で増殖させた同じ細胞よりも強力である。
一実施形態では、対象には、対象の体重１ｋｇ当たり１０４〜１０６個の免疫エフェクター細胞が投与される。一実施形態では、対象は、免疫エフェクター細胞集団の初回投与（例えば、対象の体重１ｋｇ当たり１０４〜１０６個の免疫エフェクター細胞、例えば、対象の体重１ｋｇ当たり１０４〜１０５個の免疫エフェクター細胞の初回投与）を受容し、そのうちの複数が、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を含み、さらに、免疫エフェクター細胞集団の１回または複数回の後続の投与（例えば、対象の体重１ｋｇ当たり１０４〜１０６個の免疫エフェクター細胞、例えば、対象の体重１ｋｇ当たり１０４〜１０５個の免疫エフェクター細胞の１回または複数回の後続の投与）を受容し、そのうちの複数が、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を含む。一実施形態では、１回または複数回の後続の投与は、前回の投与後１５日未満、例えば、１４日未満、１３日未満、１２日未満、１１日未満、１０日未満、９日未満、８日未満、７日未満、６日未満、５日未満、４日未満、３日未満、または２日未満、例えば、４日未満、３日未満、２日未満で投与される。一実施形態では、対象は、免疫エフェクター細胞集団の少なくとも３回の投与過程にわたって、合計で対象の体重１ｋｇ当たり約１０６個の免疫エフェクター細胞を受容し、例えば、対象は、初回用量１×１０５個の免疫エフェクター細胞、２回目の３×１０５個の免疫エフェクター細胞の投与、３回目の６×１０５個の免疫エフェクター細胞の投与を受容し、例えば、各投与は、前回の投与後４日未満、３日未満、２日未満で投与される。
ある特定の実施形態では、本方法または使用は、免疫エフェクター細胞の有効性を増加させる薬剤、例えば、本明細書に記載される薬剤と組み合わせて行われる。
方法、調製物、および反応混合物のさらなる実施形態
本明細書に記載される治療方法ならびに／または調製物および反応混合物の作製方法によると、いくつかの実施形態では、本方法は、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、免疫細胞集団から除去し、例えば、それによって、ＣＡＲの発現に好適な制御性Ｔ細胞枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団を得ることをさらに含む。
一実施形態では、制御性Ｔ細胞枯渇細胞の集団は、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含有する。
一実施形態では、免疫細胞集団は、がんを有する対象、例えば、ＣＤ２５発現がん、例えば、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有する対象の細胞を含む。一実施形態では、制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞、および５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の腫瘍細胞を含有する。
一実施形態では、免疫細胞集団は、治療のために細胞が投与される対象にとって自家的である。一実施形態では、免疫エフェクター細胞の集団は、治療のために細胞が投与される対象にとって同種である。
一実施形態では、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片またはＣＤ２５結合性リガンド、例えば、ＩＬ−２を使用して、集団から除去される。一実施形態では、抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片、またはＣＤ２５結合性リガンドは、基質、例えば、ビーズにコンジュゲートされているか、またはそれ以外の場合では基質、例えばビーズにコーティングされている。一実施形態では、抗ＣＤ２５抗体またはその断片は、本明細書に記載される基質にコンジュゲートされている。
一実施形態では、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ（商標）からのＣＤ２５枯渇試薬を使用して集団から除去される。一実施形態では、細胞対ＣＤ２５枯渇試薬の比は、１ｅ７個の細胞に対して２０ｕＬ、または１ｅ７個の細胞に対して１５ｕＬ、または１ｅ７個の細胞に対して１０ｕＬ、または１ｅ７個の細胞に対して５ｕＬ、または１ｅ７個の細胞に対して２．５ｕＬ、または１ｅ７個の細胞に対して１．２５ｕＬである。
一実施形態では、制御性Ｔ細胞枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団は、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲの発現に好適である。一実施形態では、制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団は、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の白血病細胞、例えば、ＣＬＬ細胞、ＡＬＬ細胞、またはリンパ腫細胞、例えば、ＭＣＬ細胞、ＮＨＬ細胞、もしくはＨＬ細胞を含有する。一実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、ＣＬＬを有する対象から得られ、制御性Ｔ細胞枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団は、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の白血病細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含有し、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲの発現に好適である。一実施形態では、制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団は、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞、および１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含有する。一実施形態では、制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団は、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞、および１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含有する。
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、対象の血液、例えば、末梢血から採取される。
一実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、末梢血リンパ球から単離されたＴ細胞である。ある実施形態では、Ｔ細胞集団は、赤血球を溶解させることおよび／または単球を枯渇させることによって得られる。ある実施形態では、Ｔ細胞集団は、例えば、本明細書に記載される方法を使用して、末梢リンパ球から単離される。
一実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、対象由来の血液試料から得ることができ、例えば、アフェレーシスによって得ることができる。一実施形態では、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、適宜、細胞を後続の処理工程のために適切な緩衝液または培地に入れる。一実施形態では、細胞を、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液で洗浄する。ある実施形態では、細胞は、カルシウムおよびマグネシウムといった１つまたは複数の二価カチオンを欠く洗浄溶液中で洗浄する。一実施形態では、細胞は、二価カチオンを実質的に含まない緩衝液中で洗浄する。
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、密度遠心分離を使用して、血液から採取される。
一実施形態では、作製方法は、腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４、またはＣＤ１１ｂを発現する細胞を集団から除去し、それによって、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲの発現に好適な制御性Ｔ細胞枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞、および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を得ることをさらに含む。一実施形態では、腫瘍抗原発現細胞は、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片、および抗腫瘍抗原抗体もしくはその断片は、同じ基質、例えば、ビーズに付着させることができ、これを使用して細胞を除去してもよく、または抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片、または抗腫瘍抗原抗体もしくはその断片は、別個のビーズに付着させることができ、これらの混合物を使用して細胞を除去してもよい。他の実施形態では、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去、および腫瘍抗原発現細胞の除去は、逐次的であり、例えば、いずれかの順序で起こり得る。
一実施形態では、作製方法は、集団から、チェックポイント阻害剤、例えば、本明細書に記載されるチェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞、およびＴＩＭ３＋細胞のうちの１つまたは複数を発現する細胞を除去し、それによって、制御性Ｔ細胞枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞、ならびにチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えば、ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋、および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を得ることをさらに含む。一実施形態では、チェックポイント阻害剤発現細胞は、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片、および抗チェックポイント阻害剤抗体もしくはその断片は、同じビーズに付着させることができ、これを使用して細胞を除去してもよく、または抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片および抗チェックポイント阻害剤抗体もしくはその断片は、別個のビーズに付着させることができ、これらの混合物を使用して細胞を除去してもよい。他の実施形態では、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去、およびチェックポイント阻害剤発現細胞の除去は、逐次的であり、例えば、いずれかの順序で起こり得る。
一実施形態では、除去されるべき細胞集団は、制御性Ｔ細胞でも腫瘍細胞でもなく、除去しなければＣＡＲＴ細胞の増殖および／または機能に負の影響を及ぼす細胞、例えば、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５、または可能性として免疫抑制細胞によって発現される他のマーカーを発現する細胞である。一実施形態では、このような細胞は、制御性Ｔ細胞および／または腫瘍細胞と並行して、または前記枯渇の後に、または別の順序で、除去されることが想定される。
一実施形態では、本方法は、集団から、ＣＤ１４を発現する細胞を除去し、それによって、制御性Ｔ細胞枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞、およびＣＤ１４＋枯渇細胞の集団を得ることをさらに含む。一実施形態では、ＣＤ１４＋細胞は、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片、および抗ＣＤ１４抗体もしくはその断片は、同じビーズに付着させることができ、これを使用して細胞を除去してもよく、または抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片、または抗ＣＤ１４抗体もしくはその断片は、別個のビーズに付着させることができ、これらの混合物を使用して細胞を除去してもよい。他の実施形態では、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去、およびＣＤ１４＋細胞の除去は、逐次的であり、例えば、いずれかの順序で起こり得る。
一実施形態では、提供される免疫エフェクター細胞の集団は、１つまたは複数のマーカー、例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ４５ＲＯの発現に基づいて選択されており、例えば、提供される免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）集団は、ＣＤ３＋および／またはＣＤ２８＋である。
一実施形態では、本方法は、１つまたは複数のマーカー、例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ４５ＲＯの発現が富化された、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団を得ることをさらに含む。ある実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、ＣＤ３＋細胞および／またはＣＤ２８＋細胞が富化されている。例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コンジュゲートビーズとともにインキュベートすることによって単離したＴ細胞が得られる。一実施形態では、本方法は、制御性Ｔ細胞枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団から、１つまたは複数のマーカー、例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ４５ＲＯを発現する細胞を選択することをさらに含む。
一実施形態では、本方法は、制御性Ｔ細胞枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団を、例えば、本明細書に記載される方法によって活性化することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、免疫エフェクター細胞集団由来の細胞に、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを形質導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、例えば、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞集団を、例えば、本明細書に記載される方法によって増殖させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞集団を、サイトカイン、例えば、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７（例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７）の存在下において増殖させる。
一実施形態では、作製方法は、制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞集団由来の細胞に、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを形質導入することをさらに含む。一実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。一実施形態では、制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞集団由来の細胞は、免疫エフェクター細胞集団を、例えば、対象由来の血液試料から得た、例えば、アフェレーシスによって得た後１日以内に、ベクターが一度形質導入されている。
一実施形態では、本方法は、制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞集団から、外来性ＲＮＡを一過的に発現するＲＮＡ操作細胞の集団を生成することをさらに含む。本方法は、インビトロ転写したＲＮＡまたは合成のＲＮＡを、集団由来の細胞に導入することを含み、ここで、ＲＮＡは、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を含む。
一実施形態では、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を形質導入した細胞を、例えば、本明細書に記載される方法によって増殖させる。一実施形態では、細胞は、数時間（例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間）から約１４日間（例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、または１４日間）の期間、培養液中で増殖させる。一実施形態では、細胞は、４〜９日間の期間、増殖させる。一実施形態では、細胞は、８日間またはそれ未満、例えば、７日間、６日間、５日間、４日間、または３日間の期間、増殖させる。一実施形態では、細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ細胞は、５日間培養液中で増殖させ、その結果得られた細胞は、同じ培養条件下において９日間培養液中で増殖させた同じ細胞よりも強力である。効力は、例えば、様々なＴ細胞機能、例えば、増殖、標的細胞殺滅、サイトカイン産生、活性化、遊走、またはこれらの組合せによって、定義することができる。一実施形態では、５日間増殖させた細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ細胞は、抗原刺激時に、同じ培養条件下において９日間培養液中で増殖させた同じ細胞と比較して、細胞倍増の少なくとも１倍、２倍、３倍、または４倍の増加を示す。一実施形態では、細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞を、５日間培養液中で増殖させ、その結果得られた細胞は、同じ培養条件下において９日間培養液で増殖した同じ細胞と比較して、より高い炎症促進性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを呈する。一実施形態では、５日間増殖させた細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下において９日間培養液中で増殖させた同じ細胞と比較して、ｐｇ／ｍｌでの炎症促進性サイトカイン産生、例えば、ＩＮＦ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルの少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれ以上の増加を示す。
一実施形態では、細胞は、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤および細胞の表面上の共刺激性分子を刺激するリガンドの存在下において、細胞を培養することによって増殖させる。一実施形態では、薬剤は、抗ＣＤ３抗体もしくはその断片、および／または抗ＣＤ２８抗体もしくはその断片とコンジュゲートしたビーズである。
一実施形態では、細胞は、血清（例えば、ウシ胎児血清またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ−α、または細胞の成長のための任意の他の添加物を含む、増殖および／または生存のための１つまたは複数の要素を適宜含有し得る、適切な培地（例えば、本明細書に記載される培地）において増殖させる。
一実施形態では、細胞を、１つまたは複数のインターロイキンを含む適切な培地（例えば、本明細書に記載される培地）において増殖させ、これが、例えば、フローサイトメトリーなど、本明細書に記載される方法によって測定した場合に、１４日間の増殖期間にわたって細胞の少なくとも２００倍（例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍）の増加をもたらす。一実施形態では、細胞を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７（例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７）の存在下において増殖させる。
一実施形態では、細胞は、適切な増殖期間の後、凍結保存される。一実施形態では、細胞は、本明細書に記載される方法に従って凍結保存される。一実施形態では、増殖させた細胞は、適切な培地、例えば、例として本明細書に記載されるような、注入可能培地で凍結保存される。
一実施形態では、作製方法は、免疫エフェクター細胞集団を、テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸と接触させることをさらに含む。ある実施形態では、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
一実施形態では、本方法は、増殖の前に、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、集団から除去し、それによって、増殖させるべき制御性Ｔ細胞枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団を得ることをさらに含む。一実施形態では、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞は、本明細書に記載される方法によって除去される。
一実施形態では、本方法は、増殖の前に、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ１４＋細胞を、集団から除去し、それによって、増殖させるべき、ＣＤ１４＋枯渇細胞の集団を得ることをさらに含む。一実施形態では、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ１４＋細胞は、本明細書に記載される方法によって除去される。
一実施形態では、本方法は、免疫エフェクター細胞集団を、テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸と接触させることをさらに含む。ある実施形態では、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、本方法は、免疫エフェクター細胞集団を、ＣＡＲをコードする核酸およびテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸と、ＣＡＲおよびテロメラーゼの発現を可能にする条件下において接触させることを含む。
ある実施形態では、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、ＲＮＡである。別の実施形態では、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、ＤＮＡである。ある実施形態では、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、テロメラーゼサブユニットの発現を作動させることができるプロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、作製方法は、免疫エフェクター細胞集団を、ＣＡＲをコードする核酸およびテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードするＲＮＡと、ＣＡＲおよびテロメラーゼの発現を可能にする条件下において接触させることを含む。
ある実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸およびテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡは、同じ核酸分子の一部である。ある実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸およびテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡは、別個の核酸分子の一部である。
ある実施形態では、本方法は、免疫エフェクター細胞集団を、ＣＡＲをコードする核酸およびテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡと、実質的に同時に接触させることを含む。ある実施形態では、作製方法は、免疫エフェクター細胞集団を、テロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡと接触させる前に、免疫エフェクター細胞集団を、ＣＡＲをコードする核酸と接触させることを含む。ある実施形態では、本方法は、免疫エフェクター細胞集団を、テロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡと接触させた後に、免疫エフェクター細胞集団を、ＣＡＲをコードする核酸と接触させることを含む。
ある実施形態では、テロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡは、ｍＲＮＡである。ある実施形態では、テロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡは、ポリ（Ａ）尾部を含む。ある実施形態では、テロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。
ある実施形態では、本方法は、免疫エフェクター細胞に、テロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡをトランスフェクトすることを含む。ある実施形態では、作製方法は、免疫エフェクター細胞に、テロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡを形質導入することを含む。ある実施形態では、作製方法は、免疫エフェクター細胞に、ＣＡＲおよびテロメラーゼの発現を可能にする条件下で、テロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡを電気穿孔することを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＡＲを発現し、かつ／またはＣＡＲをコードする核酸を含む免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の集団を提供すること、ならびに免疫エフェクター細胞集団を、テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸と、ｈＴＥＲＴの発現を可能にする条件下で接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の集団を提供すること、およびおよび免疫エフェクター細胞集団を、ＣＡＲをコードする核酸と、ＣＡＲの発現を可能にする条件下で接触させることを含む。
免疫エフェクター細胞調製物
一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞調製物（例えば、反応混合物、または免疫エフェクター細胞集団）は、本明細書に記載される方法によって作製される。
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞調製物（例えば、反応混合物）は、
（ｉ）少なくとも２０％のナイーブＴ細胞、少なくとも２％のステムセントラルメモリーＴ細胞、および／もしくは少なくとも４％のセントラルメモリーＴ細胞を含む免疫エフェクター細胞集団、ならびに／または
（ｉｉ）１マイクロリットル当たり少なくとも４００個のＴ細胞絶対数、１マイクロリットル当たり少なくとも２００個のナイーブＴ細胞絶対数、１マイクロリットル当たり少なくとも２０個のステムセントラルメモリーＴ細胞絶対数、および／もしくは１マイクロリットル当たり少なくとも４０個のセントラルメモリーＴ細胞絶対数を含む免疫エフェクター細胞集団
から選択される。
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、１つまたは複数のマーカー、例えば、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ９５の発現に基づいて選択されており、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）集団は、ＣＣＲ７＋およびＣＤ６２Ｌ＋である。
いくつかの実施形態では、ナイーブＴ細胞は、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ９５−の発現パターンに基づいて特定され、ステムセントラルメモリーＴ細胞は、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ９５＋の発現パターンに基づいて特定され、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ９５＋の発現パターンに基づいて特定される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞調製物は、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞調製物は、外来性テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を含む。ある実施形態では、外来性テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞調製物は、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、および外来性テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴを含む。ある実施形態では、細胞は、外来性テロメラーゼサブユニットをコードするＤＮＡを含まない。例えば、細胞は、外来性テロメラーゼサブユニットをコードするｍＲＮＡと接触されていてもよい。
一実施形態では、免疫エフェクター細胞調製物は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含有する、制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団である。一実施形態では、免疫エフェクター細胞調製物は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞、および５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含有する、制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団である。一実施形態では、免疫エフェクター細胞調製物は、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞、および１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含有する。一実施形態では、免疫エフェクター細胞調製物は、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞、および１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含有する。
一実施形態では、免疫エフェクター細胞調製物は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞、および５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のチェックポイント阻害剤発現細胞、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞、またはＴＩＭ３＋細胞を含有する、制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団である。
一実施形態では、免疫エフェクター細胞調製物は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞、および５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ１４＋細胞を含有する、制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞調製物は、自家免疫エフェクター細胞集団を含み、例えば、そのうちの複数には、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターがトランスフェクトまたは形質導入されており、ここで、免疫エフェクター細胞調製物は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞、および５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含有する。一実施形態では、免疫エフェクター細胞調製物は、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞、および１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含有する。一実施形態では、免疫エフェクター細胞調製物は、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞、および１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含有する。
一実施形態では、反応混合物は、集団内の細胞を活性化および／または増殖させる薬剤、例えば、本明細書に記載されるように、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤および／または細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドをさらに含み得る。一実施形態では、薬剤は、抗ＣＤ３抗体もしくはその断片、および／または抗ＣＤ２８抗体もしくはその断片とコンジュゲートしたビーズである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される反応混合物は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含有する制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団を含む。一実施形態では、反応混合物は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞、および５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含有する、制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団を含む。一実施形態では、細胞集団は、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞、および１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含有する。一実施形態では、細胞集団は、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞、および１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含有する。
一実施形態では、反応混合物は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞、および５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のチェックポイント阻害剤発現細胞、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞、またはＴＩＭ３＋細胞を含有する、制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団を含む。反応混合物は、緩衝液または他の試薬、例えば、ＰＢＳ含有溶液をさらに含んでもよい。
一実施形態では、反応混合物は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞、および５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ１４＋細胞を含有する、制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団を含む。反応混合物は、緩衝液または他の試薬、例えば、ＰＢＳ含有溶液をさらに含んでもよい。
一実施形態では、反応混合物は、血清（例えば、ウシ胎児血清またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ−α、または細胞の成長のための任意の他の添加物を含む、増殖および／または生存のための１つまたは複数の要素をさらに含む。一実施形態では、反応混合物は、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７をさらに含む。
一実施形態では、反応混合物中の集団内の複数の細胞は、例えば、本明細書に記載されるように、ＣＡＲコード配列、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲコード配列を含む、核酸分子、例えば、本明細書に記載される核酸分子を含む。
一実施形態では、反応混合物中の集団内の複数の細胞は、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターを含む。一実施形態では、ベクターは、本明細書に記載されるベクター、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択されるベクターである。
一実施形態では、反応混合物は、凍結保護剤または安定剤、例えば、単糖類、オリゴ糖、多糖類、およびポリオール（例えば、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、グルコース、およびデキストラン）、塩、およびクラウンエーテルなどをさらに含む。一実施形態では、凍結保護剤は、デキストランである。
いくつかの実施形態では、反応混合物は、免疫エフェクター細胞集団を含み、ここで、反応混合物中の集団内の複数の細胞は、例えば、本明細書に記載されるように、ＣＡＲコード配列、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲコード配列を含む、核酸分子、例えば、本明細書に記載される核酸分子、ならびにＩＬ−７および／またはＩＬ−１５を含む。
一実施形態では、反応混合物中の集団内の複数の細胞は、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターを含む。一実施形態では、ベクターは、本明細書に記載されるベクター、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択されるベクターである。
別途定義されない限り、本明細書に使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似またはそれと同等の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が、以下に記載されている。本明細書に記載されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。加えて、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。
図１Ａ〜１Ｄは、γｃサイトカインおよびＩＬ−１８のＣＡＲ−Ｔ細胞蓄積に対する効果差を示す。図１Ａは、Ｃ４−２７ｚ ＣＡＲベクターの模式図である。図１Ｂは、様々なサイトカイン曝露に応答したＣＡＲ−Ｔ細胞の全蓄積を示すグラフである。Ｔ細胞を形質導入し、翌日（０日目）から１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で様々な外因性サイトカインに曝露した。ＣＡＲ−Ｔ細胞数は、Ｔ細胞数およびＣＡＲ発現のパーセンテージに基づき計算した。曲線は６名のドナーを代表している。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＮＣ、サイトカインなし。図１Ｃは、様々なサイトカインに応答したＴ細胞の増殖を示すヒストグラムである。レンチウイルス形質導入後７日目に、ＮＣ群のＴ細胞はＣＦＳＥ（２．５μＭ）で標識し、次いで様々なサイトカインに曝露した。７日後、Ｔ細胞はフローサイトメトリーによりＣＦＳＥ希釈について分析した。図１Ｄは、レンチウイルス形質導入１５日後のＴ細胞の生存率を示すグラフである。様々なサイトカイン群由来のＴ細胞はアネキシンＶおよび７−ＡＡＤで染色し、次いで生細胞（アネキシンＶおよび７−ＡＡＤの両方とも陰性）の割合について分析する。ＩＬ−２群（ｎ＝６）と対比した＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 図１Ａ〜１Ｄは、γｃサイトカインおよびＩＬ−１８のＣＡＲ−Ｔ細胞蓄積に対する効果差を示す。図１Ａは、Ｃ４−２７ｚ ＣＡＲベクターの模式図である。図１Ｂは、様々なサイトカイン曝露に応答したＣＡＲ−Ｔ細胞の全蓄積を示すグラフである。Ｔ細胞を形質導入し、翌日（０日目）から１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で様々な外因性サイトカインに曝露した。ＣＡＲ−Ｔ細胞数は、Ｔ細胞数およびＣＡＲ発現のパーセンテージに基づき計算した。曲線は６名のドナーを代表している。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＮＣ、サイトカインなし。図１Ｃは、様々なサイトカインに応答したＴ細胞の増殖を示すヒストグラムである。レンチウイルス形質導入後７日目に、ＮＣ群のＴ細胞はＣＦＳＥ（２．５μＭ）で標識し、次いで様々なサイトカインに曝露した。７日後、Ｔ細胞はフローサイトメトリーによりＣＦＳＥ希釈について分析した。図１Ｄは、レンチウイルス形質導入１５日後のＴ細胞の生存率を示すグラフである。様々なサイトカイン群由来のＴ細胞はアネキシンＶおよび７−ＡＡＤで染色し、次いで生細胞（アネキシンＶおよび７−ＡＡＤの両方とも陰性）の割合について分析する。ＩＬ−２群（ｎ＝６）と対比した＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 図１Ａ〜１Ｄは、γｃサイトカインおよびＩＬ−１８のＣＡＲ−Ｔ細胞蓄積に対する効果差を示す。図１Ａは、Ｃ４−２７ｚ ＣＡＲベクターの模式図である。図１Ｂは、様々なサイトカイン曝露に応答したＣＡＲ−Ｔ細胞の全蓄積を示すグラフである。Ｔ細胞を形質導入し、翌日（０日目）から１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で様々な外因性サイトカインに曝露した。ＣＡＲ−Ｔ細胞数は、Ｔ細胞数およびＣＡＲ発現のパーセンテージに基づき計算した。曲線は６名のドナーを代表している。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＮＣ、サイトカインなし。図１Ｃは、様々なサイトカインに応答したＴ細胞の増殖を示すヒストグラムである。レンチウイルス形質導入後７日目に、ＮＣ群のＴ細胞はＣＦＳＥ（２．５μＭ）で標識し、次いで様々なサイトカインに曝露した。７日後、Ｔ細胞はフローサイトメトリーによりＣＦＳＥ希釈について分析した。図１Ｄは、レンチウイルス形質導入１５日後のＴ細胞の生存率を示すグラフである。様々なサイトカイン群由来のＴ細胞はアネキシンＶおよび７−ＡＡＤで染色し、次いで生細胞（アネキシンＶおよび７−ＡＡＤの両方とも陰性）の割合について分析する。ＩＬ−２群（ｎ＝６）と対比した＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 図１Ａ〜１Ｄは、γｃサイトカインおよびＩＬ−１８のＣＡＲ−Ｔ細胞蓄積に対する効果差を示す。図１Ａは、Ｃ４−２７ｚ ＣＡＲベクターの模式図である。図１Ｂは、様々なサイトカイン曝露に応答したＣＡＲ−Ｔ細胞の全蓄積を示すグラフである。Ｔ細胞を形質導入し、翌日（０日目）から１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で様々な外因性サイトカインに曝露した。ＣＡＲ−Ｔ細胞数は、Ｔ細胞数およびＣＡＲ発現のパーセンテージに基づき計算した。曲線は６名のドナーを代表している。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＮＣ、サイトカインなし。図１Ｃは、様々なサイトカインに応答したＴ細胞の増殖を示すヒストグラムである。レンチウイルス形質導入後７日目に、ＮＣ群のＴ細胞はＣＦＳＥ（２．５μＭ）で標識し、次いで様々なサイトカインに曝露した。７日後、Ｔ細胞はフローサイトメトリーによりＣＦＳＥ希釈について分析した。図１Ｄは、レンチウイルス形質導入１５日後のＴ細胞の生存率を示すグラフである。様々なサイトカイン群由来のＴ細胞はアネキシンＶおよび７−ＡＡＤで染色し、次いで生細胞（アネキシンＶおよび７−ＡＡＤの両方とも陰性）の割合について分析する。ＩＬ−２群（ｎ＝６）と対比した＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 図２Ａ〜２Ｆは、ＣＡＲ−Ｔ細胞のメモリーＴ細胞サブセットを示す。図２Ａは、形質導入前のＴ細胞および形質導入１５日後のＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋亜集団におけるＣＤ９５発現を示す。図２Ｂおよび２Ｃは、レンチウイルス形質導入後のＣＤ４＋（図２Ｂ）およびＣＤ８＋ Ｔ細胞（図２Ｃ）におけるメモリーステムＴ細胞（Ｔｓｃｍ）割合の増加を示すグラフである。Ｔｓｃｍは、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋ＣＣＲ７＋ Ｔ細胞サブセットとして定義する。図２Ｄは、形質導入前のＴ細胞におけるナイーブＴ（Ｔｎ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５−亜集団として定義）の量と、形質導入後のＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴｓｃｍの割合との相関を示すグラフである（ｎ＝６）。左のバーは、形質導入前のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＴｎのパーセンテージを表し、右のバーは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴｓｃｍ のパーセンテージを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。図２Ｅは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の種々のサブセットの自己再生および分化を示すグラフである。ＦＡＣＳ選別ＣＡＲ＋ Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、およびＴｅｍｒａ細胞を培養しＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）に３日間曝露し、次いでＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ発現に基づき表現型を分析する（ｎ＝３）。図２Ｆは、ＩＬ−２に応答したＣＡＲ−Ｔ細胞の様々なサブセットの増殖を示すヒストグラムプロットである。ＦＡＣＳ選別ＣＡＲ＋ Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、およびＴｅｍｒａ細胞をＣＦＳＥ（２．５μＭ）で標識し、次いで培養しＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）に３日間曝露した。３日後、Ｔ細胞をＣＦＳＥ希釈について分析した。 図２Ａ〜２Ｆは、ＣＡＲ−Ｔ細胞のメモリーＴ細胞サブセットを示す。図２Ａは、形質導入前のＴ細胞および形質導入１５日後のＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋亜集団におけるＣＤ９５発現を示す。図２Ｂおよび２Ｃは、レンチウイルス形質導入後のＣＤ４＋（図２Ｂ）およびＣＤ８＋ Ｔ細胞（図２Ｃ）におけるメモリーステムＴ細胞（Ｔｓｃｍ）割合の増加を示すグラフである。Ｔｓｃｍは、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋ＣＣＲ７＋ Ｔ細胞サブセットとして定義する。図２Ｄは、形質導入前のＴ細胞におけるナイーブＴ（Ｔｎ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５−亜集団として定義）の量と、形質導入後のＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴｓｃｍの割合との相関を示すグラフである（ｎ＝６）。左のバーは、形質導入前のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＴｎのパーセンテージを表し、右のバーは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴｓｃｍ のパーセンテージを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。図２Ｅは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の種々のサブセットの自己再生および分化を示すグラフである。ＦＡＣＳ選別ＣＡＲ＋ Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、およびＴｅｍｒａ細胞を培養しＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）に３日間曝露し、次いでＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ発現に基づき表現型を分析する（ｎ＝３）。図２Ｆは、ＩＬ−２に応答したＣＡＲ−Ｔ細胞の様々なサブセットの増殖を示すヒストグラムプロットである。ＦＡＣＳ選別ＣＡＲ＋ Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、およびＴｅｍｒａ細胞をＣＦＳＥ（２．５μＭ）で標識し、次いで培養しＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）に３日間曝露した。３日後、Ｔ細胞をＣＦＳＥ希釈について分析した。 図２Ａ〜２Ｆは、ＣＡＲ−Ｔ細胞のメモリーＴ細胞サブセットを示す。図２Ａは、形質導入前のＴ細胞および形質導入１５日後のＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋亜集団におけるＣＤ９５発現を示す。図２Ｂおよび２Ｃは、レンチウイルス形質導入後のＣＤ４＋（図２Ｂ）およびＣＤ８＋ Ｔ細胞（図２Ｃ）におけるメモリーステムＴ細胞（Ｔｓｃｍ）割合の増加を示すグラフである。Ｔｓｃｍは、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋ＣＣＲ７＋ Ｔ細胞サブセットとして定義する。図２Ｄは、形質導入前のＴ細胞におけるナイーブＴ（Ｔｎ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５−亜集団として定義）の量と、形質導入後のＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴｓｃｍの割合との相関を示すグラフである（ｎ＝６）。左のバーは、形質導入前のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＴｎのパーセンテージを表し、右のバーは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴｓｃｍ のパーセンテージを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。図２Ｅは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の種々のサブセットの自己再生および分化を示すグラフである。ＦＡＣＳ選別ＣＡＲ＋ Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、およびＴｅｍｒａ細胞を培養しＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）に３日間曝露し、次いでＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ発現に基づき表現型を分析する（ｎ＝３）。図２Ｆは、ＩＬ−２に応答したＣＡＲ−Ｔ細胞の様々なサブセットの増殖を示すヒストグラムプロットである。ＦＡＣＳ選別ＣＡＲ＋ Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、およびＴｅｍｒａ細胞をＣＦＳＥ（２．５μＭ）で標識し、次いで培養しＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）に３日間曝露した。３日後、Ｔ細胞をＣＦＳＥ希釈について分析した。 図２Ａ〜２Ｆは、ＣＡＲ−Ｔ細胞のメモリーＴ細胞サブセットを示す。図２Ａは、形質導入前のＴ細胞および形質導入１５日後のＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋亜集団におけるＣＤ９５発現を示す。図２Ｂおよび２Ｃは、レンチウイルス形質導入後のＣＤ４＋（図２Ｂ）およびＣＤ８＋ Ｔ細胞（図２Ｃ）におけるメモリーステムＴ細胞（Ｔｓｃｍ）割合の増加を示すグラフである。Ｔｓｃｍは、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋ＣＣＲ７＋ Ｔ細胞サブセットとして定義する。図２Ｄは、形質導入前のＴ細胞におけるナイーブＴ（Ｔｎ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５−亜集団として定義）の量と、形質導入後のＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴｓｃｍの割合との相関を示すグラフである（ｎ＝６）。左のバーは、形質導入前のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＴｎのパーセンテージを表し、右のバーは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴｓｃｍ のパーセンテージを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。図２Ｅは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の種々のサブセットの自己再生および分化を示すグラフである。ＦＡＣＳ選別ＣＡＲ＋ Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、およびＴｅｍｒａ細胞を培養しＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）に３日間曝露し、次いでＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ発現に基づき表現型を分析する（ｎ＝３）。図２Ｆは、ＩＬ−２に応答したＣＡＲ−Ｔ細胞の様々なサブセットの増殖を示すヒストグラムプロットである。ＦＡＣＳ選別ＣＡＲ＋ Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、およびＴｅｍｒａ細胞をＣＦＳＥ（２．５μＭ）で標識し、次いで培養しＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）に３日間曝露した。３日後、Ｔ細胞をＣＦＳＥ希釈について分析した。 図２Ａ〜２Ｆは、ＣＡＲ−Ｔ細胞のメモリーＴ細胞サブセットを示す。図２Ａは、形質導入前のＴ細胞および形質導入１５日後のＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋亜集団におけるＣＤ９５発現を示す。図２Ｂおよび２Ｃは、レンチウイルス形質導入後のＣＤ４＋（図２Ｂ）およびＣＤ８＋ Ｔ細胞（図２Ｃ）におけるメモリーステムＴ細胞（Ｔｓｃｍ）割合の増加を示すグラフである。Ｔｓｃｍは、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋ＣＣＲ７＋ Ｔ細胞サブセットとして定義する。図２Ｄは、形質導入前のＴ細胞におけるナイーブＴ（Ｔｎ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５−亜集団として定義）の量と、形質導入後のＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴｓｃｍの割合との相関を示すグラフである（ｎ＝６）。左のバーは、形質導入前のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＴｎのパーセンテージを表し、右のバーは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴｓｃｍ のパーセンテージを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。図２Ｅは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の種々のサブセットの自己再生および分化を示すグラフである。ＦＡＣＳ選別ＣＡＲ＋ Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、およびＴｅｍｒａ細胞を培養しＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）に３日間曝露し、次いでＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ発現に基づき表現型を分析する（ｎ＝３）。図２Ｆは、ＩＬ−２に応答したＣＡＲ−Ｔ細胞の様々なサブセットの増殖を示すヒストグラムプロットである。ＦＡＣＳ選別ＣＡＲ＋ Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、およびＴｅｍｒａ細胞をＣＦＳＥ（２．５μＭ）で標識し、次いで培養しＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）に３日間曝露した。３日後、Ｔ細胞をＣＦＳＥ希釈について分析した。 図２Ａ〜２Ｆは、ＣＡＲ−Ｔ細胞のメモリーＴ細胞サブセットを示す。図２Ａは、形質導入前のＴ細胞および形質導入１５日後のＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋亜集団におけるＣＤ９５発現を示す。図２Ｂおよび２Ｃは、レンチウイルス形質導入後のＣＤ４＋（図２Ｂ）およびＣＤ８＋ Ｔ細胞（図２Ｃ）におけるメモリーステムＴ細胞（Ｔｓｃｍ）割合の増加を示すグラフである。Ｔｓｃｍは、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋ＣＣＲ７＋ Ｔ細胞サブセットとして定義する。図２Ｄは、形質導入前のＴ細胞におけるナイーブＴ（Ｔｎ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５−亜集団として定義）の量と、形質導入後のＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴｓｃｍの割合との相関を示すグラフである（ｎ＝６）。左のバーは、形質導入前のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＴｎのパーセンテージを表し、右のバーは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴｓｃｍ のパーセンテージを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。図２Ｅは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の種々のサブセットの自己再生および分化を示すグラフである。ＦＡＣＳ選別ＣＡＲ＋ Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、およびＴｅｍｒａ細胞を培養しＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）に３日間曝露し、次いでＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ発現に基づき表現型を分析する（ｎ＝３）。図２Ｆは、ＩＬ−２に応答したＣＡＲ−Ｔ細胞の様々なサブセットの増殖を示すヒストグラムプロットである。ＦＡＣＳ選別ＣＡＲ＋ Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、およびＴｅｍｒａ細胞をＣＦＳＥ（２．５μＭ）で標識し、次いで培養しＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）に３日間曝露した。３日後、Ｔ細胞をＣＦＳＥ希釈について分析した。 図３Ａ〜３Ｂは、ＣＤ４５ ＲＡ発現とＣＦＳＥ強度との相関を示す。図３Ａは、ＣＤ４５ＲＡ発現がＣＦＳＥ強度と逆相関していることを示す。図３Ｂは、すべてのサイトカイン群（ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１）について、ＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ弱陽性および陰性Ｔ細胞よりはるかに低いＣＦＳＥレベルを示したことを示す。これは、ＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ− Ｔ細胞より強い増殖活性を有したことを示すものである。 図３Ａ〜３Ｂは、ＣＤ４５ ＲＡ発現とＣＦＳＥ強度との相関を示す。図３Ａは、ＣＤ４５ＲＡ発現がＣＦＳＥ強度と逆相関していることを示す。図３Ｂは、すべてのサイトカイン群（ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１）について、ＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ弱陽性および陰性Ｔ細胞よりはるかに低いＣＦＳＥレベルを示したことを示す。これは、ＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ− Ｔ細胞より強い増殖活性を有したことを示すものである。 図４は、種々のサイトカインへの曝露から生じるＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型を示す。図４は、示されたサイトカイン群におけるＣＡＲ−Ｔ細胞表面のＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、およびＩＬ７Ｒα発現のＦＡＣＳによる定量を示す一連のグラフである。ヒストグラムは、６名の独立したドナーからの発現レベルの平均値±ＳＥＭを表す。ＩＬ−２群と対比した＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 図５Ａ〜５Ｄは、種々のサイトカインに曝露したＣＡＲ−Ｔ細胞の機能分析を示す。図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃは、ＩＦＮγ（図５Ａ）、ＴＮＦ−α（図５Ｂ）、およびＩＬ−２（図５Ｃ）の産生に関する、様々なサイトカイン群（ｎ＝６）におけるサイトカイン産生ＣＡＲ−Ｔ細胞のパーセンテージを示す定量的プロットである。レンチウイルス形質導入Ｔ細胞を示されたサイトカインに１４日間曝露し、次いで、フローサイトメトリー分析のために採取する前にＳＫＯＶ３細胞と５時間共培養する。図５Ｄは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗原特異的細胞傷害性活性を示すグラフである。示されたサイトカイン曝露の１４日後、ＣＡＲ−Ｔ細胞を、示されたＥ／Ｔ比でＳＫＯＶ３と１８時間共培養後のルシフェラーゼベースのアッセイを用いて細胞溶解能について評価した。非形質導入Ｔ細胞（ＵＮＴ）は、陰性エフェクター対照としての役割を果たした。示されたデータは、６つの独立した細胞溶解アッセイの平均値±ＳＥＭである。 図５Ａ〜５Ｄは、種々のサイトカインに曝露したＣＡＲ−Ｔ細胞の機能分析を示す。図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃは、ＩＦＮγ（図５Ａ）、ＴＮＦ−α（図５Ｂ）、およびＩＬ−２（図５Ｃ）の産生に関する、様々なサイトカイン群（ｎ＝６）におけるサイトカイン産生ＣＡＲ−Ｔ細胞のパーセンテージを示す定量的プロットである。レンチウイルス形質導入Ｔ細胞を示されたサイトカインに１４日間曝露し、次いで、フローサイトメトリー分析のために採取する前にＳＫＯＶ３細胞と５時間共培養する。図５Ｄは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗原特異的細胞傷害性活性を示すグラフである。示されたサイトカイン曝露の１４日後、ＣＡＲ−Ｔ細胞を、示されたＥ／Ｔ比でＳＫＯＶ３と１８時間共培養後のルシフェラーゼベースのアッセイを用いて細胞溶解能について評価した。非形質導入Ｔ細胞（ＵＮＴ）は、陰性エフェクター対照としての役割を果たした。示されたデータは、６つの独立した細胞溶解アッセイの平均値±ＳＥＭである。 図５Ａ〜５Ｄは、種々のサイトカインに曝露したＣＡＲ−Ｔ細胞の機能分析を示す。図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃは、ＩＦＮγ（図５Ａ）、ＴＮＦ−α（図５Ｂ）、およびＩＬ−２（図５Ｃ）の産生に関する、様々なサイトカイン群（ｎ＝６）におけるサイトカイン産生ＣＡＲ−Ｔ細胞のパーセンテージを示す定量的プロットである。レンチウイルス形質導入Ｔ細胞を示されたサイトカインに１４日間曝露し、次いで、フローサイトメトリー分析のために採取する前にＳＫＯＶ３細胞と５時間共培養する。図５Ｄは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗原特異的細胞傷害性活性を示すグラフである。示されたサイトカイン曝露の１４日後、ＣＡＲ−Ｔ細胞を、示されたＥ／Ｔ比でＳＫＯＶ３と１８時間共培養後のルシフェラーゼベースのアッセイを用いて細胞溶解能について評価した。非形質導入Ｔ細胞（ＵＮＴ）は、陰性エフェクター対照としての役割を果たした。示されたデータは、６つの独立した細胞溶解アッセイの平均値±ＳＥＭである。 図５Ａ〜５Ｄは、種々のサイトカインに曝露したＣＡＲ−Ｔ細胞の機能分析を示す。図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃは、ＩＦＮγ（図５Ａ）、ＴＮＦ−α（図５Ｂ）、およびＩＬ−２（図５Ｃ）の産生に関する、様々なサイトカイン群（ｎ＝６）におけるサイトカイン産生ＣＡＲ−Ｔ細胞のパーセンテージを示す定量的プロットである。レンチウイルス形質導入Ｔ細胞を示されたサイトカインに１４日間曝露し、次いで、フローサイトメトリー分析のために採取する前にＳＫＯＶ３細胞と５時間共培養する。図５Ｄは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗原特異的細胞傷害性活性を示すグラフである。示されたサイトカイン曝露の１４日後、ＣＡＲ−Ｔ細胞を、示されたＥ／Ｔ比でＳＫＯＶ３と１８時間共培養後のルシフェラーゼベースのアッセイを用いて細胞溶解能について評価した。非形質導入Ｔ細胞（ＵＮＴ）は、陰性エフェクター対照としての役割を果たした。示されたデータは、６つの独立した細胞溶解アッセイの平均値±ＳＥＭである。 図６Ａ〜６Ｃは、図５で上記したＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型および機能を示す。図６Ａおよび６Ｂは、ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＴｓｃｍおよびＴｃｍ）が、ＣＤ６２Ｌ− ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＴｅｍおよびＴｅｍｒａ）と比較した場合、低いサイトカイン産生活性（図６Ａおよび６Ｂ）および弱い細胞溶解能（図６Ｃ）を示したことを示す。 図６Ａ〜６Ｃは、図５で上記したＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型および機能を示す。図６Ａおよび６Ｂは、ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＴｓｃｍおよびＴｃｍ）が、ＣＤ６２Ｌ− ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＴｅｍおよびＴｅｍｒａ）と比較した場合、低いサイトカイン産生活性（図６Ａおよび６Ｂ）および弱い細胞溶解能（図６Ｃ）を示したことを示す。 図６Ａ〜６Ｃは、図５で上記したＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型および機能を示す。図６Ａおよび６Ｂは、ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＴｓｃｍおよびＴｃｍ）が、ＣＤ６２Ｌ− ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＴｅｍおよびＴｅｍｒａ）と比較した場合、低いサイトカイン産生活性（図６Ａおよび６Ｂ）および弱い細胞溶解能（図６Ｃ）を示したことを示す。 図７Ａ〜７Ｂは、抗原チャレンジに曝露したＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖および表現型を示す。図７Ａは、抗原チャレンジ時の、示されたサイトカインに以前に曝露したＣＡＲ−Ｔの全蓄積および生存率を示す２つのグラフを表す。示されたサイトカインに曝露したＴ細胞を１５日目に採取し、次いでＳＫＯＶ３と５：１のＥ／Ｔ比で７日間共培養する。ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を計算し、Ｔ細胞の生存率を１７日目に評価する。図７Ｂは、様々なサイトカイン群におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞のメモリーＴサブセットの分布を示す２つのグラフである。Ｎ．Ｓ．、統計的差なし。 図７Ａ〜７Ｂは、抗原チャレンジに曝露したＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖および表現型を示す。図７Ａは、抗原チャレンジ時の、示されたサイトカインに以前に曝露したＣＡＲ−Ｔの全蓄積および生存率を示す２つのグラフを表す。示されたサイトカインに曝露したＴ細胞を１５日目に採取し、次いでＳＫＯＶ３と５：１のＥ／Ｔ比で７日間共培養する。ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を計算し、Ｔ細胞の生存率を１７日目に評価する。図７Ｂは、様々なサイトカイン群におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞のメモリーＴサブセットの分布を示す２つのグラフである。Ｎ．Ｓ．、統計的差なし。 図８Ａ〜８Ｃは、以前にサイトカイン曝露した様々なＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。図８Ａは、様々なサイトカイン曝露Ｃ４−２７ｚ ＣＡＲ−Ｔ細胞、抗ＣＤ１９−２７ｚ ＣＡＲ−Ｔ細胞、および非形質導入Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍増殖曲線を示す。データを平均値±ＳＥＭとして表す。矢印はＴ細胞注入時点を示す。図８Ｂは、ＣＡＲ−Ｔ細胞注入の初回投与１５日後のマウス末梢血中の循環ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞数の定量を示すグラフである。図８Ｃは、マウス血液中の循環ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現の定量を示すグラフである。 図８Ａ〜８Ｃは、以前にサイトカイン曝露した様々なＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。図８Ａは、様々なサイトカイン曝露Ｃ４−２７ｚ ＣＡＲ−Ｔ細胞、抗ＣＤ１９−２７ｚ ＣＡＲ−Ｔ細胞、および非形質導入Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍増殖曲線を示す。データを平均値±ＳＥＭとして表す。矢印はＴ細胞注入時点を示す。図８Ｂは、ＣＡＲ−Ｔ細胞注入の初回投与１５日後のマウス末梢血中の循環ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞数の定量を示すグラフである。図８Ｃは、マウス血液中の循環ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現の定量を示すグラフである。 図８Ａ〜８Ｃは、以前にサイトカイン曝露した様々なＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。図８Ａは、様々なサイトカイン曝露Ｃ４−２７ｚ ＣＡＲ−Ｔ細胞、抗ＣＤ１９−２７ｚ ＣＡＲ−Ｔ細胞、および非形質導入Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍増殖曲線を示す。データを平均値±ＳＥＭとして表す。矢印はＴ細胞注入時点を示す。図８Ｂは、ＣＡＲ−Ｔ細胞注入の初回投与１５日後のマウス末梢血中の循環ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞数の定量を示すグラフである。図８Ｃは、マウス血液中の循環ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現の定量を示すグラフである。 図９は、ＣＤ３およびＣＤ１９集団を示す一連のＦＡＣＳプロット（一番上）、ならびにアフェレーシスからの細胞、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で選択した細胞、ＣＤ２５が枯渇した細胞、およびＣＤ２５富化細胞のＣＤ１４発現を示すヒストグラム（一番下）である。 図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃは、ＣＤ３／ＣＤ２８選択細胞とＣＤ２５枯渇細胞との増殖能の比較を示す。図１０Ａは、示された培養日数の全細胞数を示すグラフである。図１０Ｂは、示された培養日数ごとの定量化した集団倍加を示すグラフである。図１０Ｃは、示された培養日数の生細胞のパーセンテージを示す。 図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃは、ＣＤ３／ＣＤ２８選択細胞とＣＤ２５枯渇細胞との増殖能の比較を示す。図１０Ａは、示された培養日数の全細胞数を示すグラフである。図１０Ｂは、示された培養日数ごとの定量化した集団倍加を示すグラフである。図１０Ｃは、示された培養日数の生細胞のパーセンテージを示す。 図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃは、ＣＤ３／ＣＤ２８選択細胞とＣＤ２５枯渇細胞との増殖能の比較を示す。図１０Ａは、示された培養日数の全細胞数を示すグラフである。図１０Ｂは、示された培養日数ごとの定量化した集団倍加を示すグラフである。図１０Ｃは、示された培養日数の生細胞のパーセンテージを示す。 図１１は、示されたサイトカイン補充（ＩＬ−７、ＩＬ−１５、またはＩＬ−７およびＩＬ−１５）による培養後の、未操作ＰＢＭＣおよびＣＤ２５枯渇ＰＢＭＣ中のＣＤ３およびＣＤ１９の分布を示す一連のＦＡＣｓプロットである。 図１２は、抗ＣＤ３およびＣＤ２８ビーズで刺激し、ならびに未操作（ＵＴＤ）のままにするかまたはＣＤ１９ ＣＡＲ（ＣＤ１９．ＢＢｚ）を形質導入し、ビーズを除去し（ｄｅ−ｂｅａｄｅｄ）、次いで５日目およびＤ９に採取したＰＢＭＣの集団倍加（左手のグラフ）および平均サイズ（ｆＬ）（右手のグラフ）における増殖プロファイルを示すグラフのセットである。 図１３は、抗ＣＤ３およびＣＤ２８ビーズで刺激し、ならびに未操作（ＵＴＤ）のままにするかまたはＣＤ１９ ＣＡＲ（ＣＤ１９．ＢＢｚ）を形質導入し、ビーズを除去し、次いで５日目およびＤ９に採取したＰＢＭＣで処置したＣＤ１９発現Ｋ５６２細胞の溶解パーセントとしての細胞傷害性を表すグラフのセットである。 図１４は、抗ＣＤ３およびＣＤ２８ビーズ（３×２８ビーズ）、野生型Ｋ５６２細胞、ＣＤ１９発現Ｋ５６２細胞、ＡＬＬ細胞（Ｎａｌｍ６）またはＣＬＬ細胞（ＰＩ１４）で刺激したＰＢＭＣの増殖を表すグラフのセットである。ＰＢＭＣは、未操作（ＵＴＤ）のままにするかまたはＣＤ１９ ＣＡＲ（ＣＡＲＴ１９）を形質導入し、ビーズを除去し、次いで５日目およびＤ９に採取していた。 図１５は、例示的な作製スキームの模式図である。 図１６は、例示的な作製スキームの模式図である。 図１７は、ＣＴＬ０１９ ＣＡＲ、ＣＨＰ９５９−１１５、およびＣＨＰ９５９−１２１をトランスフェクトし、０〜９日の期間にわたって増殖させたドナー細胞の２つの異なる作製バッチの細胞増殖のレベルを表すグラフのセットである。 図１８は、ＣＴＬ０１９ ＣＡＲ、すなわちＣＨＰ９５９−１１５かまたはｓｓ１−ｍｅｓｏＣＡＲ、すなわちＣＨＰ９５９−１２１のどちらかをトランスフェクトし、アフェレーシス後、０〜９日の期間にわたって増殖させたドナー細胞の２つの異なる作製バッチの炎症促進性サイトカイン産生、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−４を示すグラフのセットである。 図１９は、抗ＣＡＲ１９イディオタイプ抗体ビーズまたは対照ビーズで刺激し、ＣＴＬ０１９ ＣＡＲをトランスフェクトし、５〜９日間増殖させたドナー細胞における産生レベルＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−２、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−４を表すグラフのセットである。サイトカインなしまたは低サイトカインレベル（＜２００ｐｇ／ｍｌ）は対照ビーズで検出した。 図２０は、未操作（ＵＴＤ）のままにするかまたはＣＤ１９ ＣＡＲ（ＣＡＲＴ１９）を形質導入し、ビーズを除去し、次いで５日目およびＤ９に採取したＰＢＭＣのＮａｌｍ６（ＡＬＬ）細胞のルシフェラーゼアッセイを用いた、総溶解物に基づく細胞殺傷を表すグラフである。様々な比のＰＭＢＣ対Ｎａｌｍ６細胞（エフェクター（Ｅ）：標的（Ｔ））を培養した。示されているように、５日目に採取したＣＡＲＴ１９細胞はより良好な殺傷能力を有する。 図２１は、未操作（ＵＴＤ）のままにするかまたはＣＤ１９ ＣＡＲ（ＣＡＲＴ１９）を形質導入し、ビーズを除去し、次いで５日目およびＤ９に採取したＰＢＭＣの長期インビボ殺傷能力を表すグラフである。ＰＢＭＣは、Ｎａｌｍ６細胞を接種した非肥満糖尿病／重症複合免疫不全症マウスに導入した。 図２２Ａは、ＡＬＬおよびＮＨＬ患者由来の、テスト増殖に合格した末梢血試料のパーセンテージを示す棒グラフである。図２２Ｂは、ＳＲ−ＡＬＬおよびＨＲ／ＶＨＲ ＡＬＬ患者由来の、テスト増殖に合格した末梢血試料のパーセンテージを示す棒グラフである。図２２Ｃは、インビトロ増殖閾値における５倍より多く（合格）または５倍未満に（不合格）増殖したすべての患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対リンパ球数を示す棒グラフである。図２２Ｄは、インビトロ増殖閾値における５倍に合格したかまたは不合格になったすべての患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対Ｔ細胞数を示す棒グラフである。図２２Ｅは、白血病またはリンパ腫を有するすべての患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対リンパ球数（１マイクロリットルあたりの細胞中の）を示す棒グラフである。図２２Ｆは、白血病またはリンパ腫患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対Ｔ細胞数（１マイクロリットルあたりの細胞中の）を示す棒グラフである。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１２に見出すことができる。 図２２Ａは、ＡＬＬおよびＮＨＬ患者由来の、テスト増殖に合格した末梢血試料のパーセンテージを示す棒グラフである。図２２Ｂは、ＳＲ−ＡＬＬおよびＨＲ／ＶＨＲ ＡＬＬ患者由来の、テスト増殖に合格した末梢血試料のパーセンテージを示す棒グラフである。図２２Ｃは、インビトロ増殖閾値における５倍より多く（合格）または５倍未満に（不合格）増殖したすべての患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対リンパ球数を示す棒グラフである。図２２Ｄは、インビトロ増殖閾値における５倍に合格したかまたは不合格になったすべての患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対Ｔ細胞数を示す棒グラフである。図２２Ｅは、白血病またはリンパ腫を有するすべての患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対リンパ球数（１マイクロリットルあたりの細胞中の）を示す棒グラフである。図２２Ｆは、白血病またはリンパ腫患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対Ｔ細胞数（１マイクロリットルあたりの細胞中の）を示す棒グラフである。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１２に見出すことができる。 図２２Ａは、ＡＬＬおよびＮＨＬ患者由来の、テスト増殖に合格した末梢血試料のパーセンテージを示す棒グラフである。図２２Ｂは、ＳＲ−ＡＬＬおよびＨＲ／ＶＨＲ ＡＬＬ患者由来の、テスト増殖に合格した末梢血試料のパーセンテージを示す棒グラフである。図２２Ｃは、インビトロ増殖閾値における５倍より多く（合格）または５倍未満に（不合格）増殖したすべての患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対リンパ球数を示す棒グラフである。図２２Ｄは、インビトロ増殖閾値における５倍に合格したかまたは不合格になったすべての患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対Ｔ細胞数を示す棒グラフである。図２２Ｅは、白血病またはリンパ腫を有するすべての患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対リンパ球数（１マイクロリットルあたりの細胞中の）を示す棒グラフである。図２２Ｆは、白血病またはリンパ腫患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対Ｔ細胞数（１マイクロリットルあたりの細胞中の）を示す棒グラフである。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１２に見出すことができる。 図２２Ａは、ＡＬＬおよびＮＨＬ患者由来の、テスト増殖に合格した末梢血試料のパーセンテージを示す棒グラフである。図２２Ｂは、ＳＲ−ＡＬＬおよびＨＲ／ＶＨＲ ＡＬＬ患者由来の、テスト増殖に合格した末梢血試料のパーセンテージを示す棒グラフである。図２２Ｃは、インビトロ増殖閾値における５倍より多く（合格）または５倍未満に（不合格）増殖したすべての患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対リンパ球数を示す棒グラフである。図２２Ｄは、インビトロ増殖閾値における５倍に合格したかまたは不合格になったすべての患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対Ｔ細胞数を示す棒グラフである。図２２Ｅは、白血病またはリンパ腫を有するすべての患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対リンパ球数（１マイクロリットルあたりの細胞中の）を示す棒グラフである。図２２Ｆは、白血病またはリンパ腫患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対Ｔ細胞数（１マイクロリットルあたりの細胞中の）を示す棒グラフである。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１２に見出すことができる。 図２２Ａは、ＡＬＬおよびＮＨＬ患者由来の、テスト増殖に合格した末梢血試料のパーセンテージを示す棒グラフである。図２２Ｂは、ＳＲ−ＡＬＬおよびＨＲ／ＶＨＲ ＡＬＬ患者由来の、テスト増殖に合格した末梢血試料のパーセンテージを示す棒グラフである。図２２Ｃは、インビトロ増殖閾値における５倍より多く（合格）または５倍未満に（不合格）増殖したすべての患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対リンパ球数を示す棒グラフである。図２２Ｄは、インビトロ増殖閾値における５倍に合格したかまたは不合格になったすべての患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対Ｔ細胞数を示す棒グラフである。図２２Ｅは、白血病またはリンパ腫を有するすべての患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対リンパ球数（１マイクロリットルあたりの細胞中の）を示す棒グラフである。図２２Ｆは、白血病またはリンパ腫患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対Ｔ細胞数（１マイクロリットルあたりの細胞中の）を示す棒グラフである。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１２に見出すことができる。 図２２Ａは、ＡＬＬおよびＮＨＬ患者由来の、テスト増殖に合格した末梢血試料のパーセンテージを示す棒グラフである。図２２Ｂは、ＳＲ−ＡＬＬおよびＨＲ／ＶＨＲ ＡＬＬ患者由来の、テスト増殖に合格した末梢血試料のパーセンテージを示す棒グラフである。図２２Ｃは、インビトロ増殖閾値における５倍より多く（合格）または５倍未満に（不合格）増殖したすべての患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対リンパ球数を示す棒グラフである。図２２Ｄは、インビトロ増殖閾値における５倍に合格したかまたは不合格になったすべての患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対Ｔ細胞数を示す棒グラフである。図２２Ｅは、白血病またはリンパ腫を有するすべての患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対リンパ球数（１マイクロリットルあたりの細胞中の）を示す棒グラフである。図２２Ｆは、白血病またはリンパ腫患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対Ｔ細胞数（１マイクロリットルあたりの細胞中の）を示す棒グラフである。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１２に見出すことができる。 図２３Ａ〜２３Ｏは、化学療法を受けている患者の末梢血から採取したＴ細胞のメモリー表現型を示す棒グラフである。絶対細胞数は、５倍より大きい増殖閾値に合格したおよび不合格になった試料［カラム１、図２３Ａ〜図２３Ｅ］、ＡＬＬまたはＮＨＬ患者［カラム２、図２３Ｆ〜図２３Ｊ］、ならびにＳＲ−およびＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ患者［カラム３、図２３Ｋ〜図２３Ｏ］から示される。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１３に見出すことができ、要約表は表９に見出すことができる。 図２３Ａ〜２３Ｏは、化学療法を受けている患者の末梢血から採取したＴ細胞のメモリー表現型を示す棒グラフである。絶対細胞数は、５倍より大きい増殖閾値に合格したおよび不合格になった試料［カラム１、図２３Ａ〜図２３Ｅ］、ＡＬＬまたはＮＨＬ患者［カラム２、図２３Ｆ〜図２３Ｊ］、ならびにＳＲ−およびＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ患者［カラム３、図２３Ｋ〜図２３Ｏ］から示される。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１３に見出すことができ、要約表は表９に見出すことができる。 図２３Ａ〜２３Ｏは、化学療法を受けている患者の末梢血から採取したＴ細胞のメモリー表現型を示す棒グラフである。絶対細胞数は、５倍より大きい増殖閾値に合格したおよび不合格になった試料［カラム１、図２３Ａ〜図２３Ｅ］、ＡＬＬまたはＮＨＬ患者［カラム２、図２３Ｆ〜図２３Ｊ］、ならびにＳＲ−およびＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ患者［カラム３、図２３Ｋ〜図２３Ｏ］から示される。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１３に見出すことができ、要約表は表９に見出すことができる。 図２３Ａ〜２３Ｏは、化学療法を受けている患者の末梢血から採取したＴ細胞のメモリー表現型を示す棒グラフである。絶対細胞数は、５倍より大きい増殖閾値に合格したおよび不合格になった試料［カラム１、図２３Ａ〜図２３Ｅ］、ＡＬＬまたはＮＨＬ患者［カラム２、図２３Ｆ〜図２３Ｊ］、ならびにＳＲ−およびＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ患者［カラム３、図２３Ｋ〜図２３Ｏ］から示される。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１３に見出すことができ、要約表は表９に見出すことができる。 図２３Ａ〜２３Ｏは、化学療法を受けている患者の末梢血から採取したＴ細胞のメモリー表現型を示す棒グラフである。絶対細胞数は、５倍より大きい増殖閾値に合格したおよび不合格になった試料［カラム１、図２３Ａ〜図２３Ｅ］、ＡＬＬまたはＮＨＬ患者［カラム２、図２３Ｆ〜図２３Ｊ］、ならびにＳＲ−およびＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ患者［カラム３、図２３Ｋ〜図２３Ｏ］から示される。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１３に見出すことができ、要約表は表９に見出すことができる。 図２３Ａ〜２３Ｏは、化学療法を受けている患者の末梢血から採取したＴ細胞のメモリー表現型を示す棒グラフである。絶対細胞数は、５倍より大きい増殖閾値に合格したおよび不合格になった試料［カラム１、図２３Ａ〜図２３Ｅ］、ＡＬＬまたはＮＨＬ患者［カラム２、図２３Ｆ〜図２３Ｊ］、ならびにＳＲ−およびＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ患者［カラム３、図２３Ｋ〜図２３Ｏ］から示される。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１３に見出すことができ、要約表は表９に見出すことができる。 図２３Ａ〜２３Ｏは、化学療法を受けている患者の末梢血から採取したＴ細胞のメモリー表現型を示す棒グラフである。絶対細胞数は、５倍より大きい増殖閾値に合格したおよび不合格になった試料［カラム１、図２３Ａ〜図２３Ｅ］、ＡＬＬまたはＮＨＬ患者［カラム２、図２３Ｆ〜図２３Ｊ］、ならびにＳＲ−およびＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ患者［カラム３、図２３Ｋ〜図２３Ｏ］から示される。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１３に見出すことができ、要約表は表９に見出すことができる。 図２３Ａ〜２３Ｏは、化学療法を受けている患者の末梢血から採取したＴ細胞のメモリー表現型を示す棒グラフである。絶対細胞数は、５倍より大きい増殖閾値に合格したおよび不合格になった試料［カラム１、図２３Ａ〜図２３Ｅ］、ＡＬＬまたはＮＨＬ患者［カラム２、図２３Ｆ〜図２３Ｊ］、ならびにＳＲ−およびＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ患者［カラム３、図２３Ｋ〜図２３Ｏ］から示される。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１３に見出すことができ、要約表は表９に見出すことができる。 図２３Ａ〜２３Ｏは、化学療法を受けている患者の末梢血から採取したＴ細胞のメモリー表現型を示す棒グラフである。絶対細胞数は、５倍より大きい増殖閾値に合格したおよび不合格になった試料［カラム１、図２３Ａ〜図２３Ｅ］、ＡＬＬまたはＮＨＬ患者［カラム２、図２３Ｆ〜図２３Ｊ］、ならびにＳＲ−およびＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ患者［カラム３、図２３Ｋ〜図２３Ｏ］から示される。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１３に見出すことができ、要約表は表９に見出すことができる。 図２３Ａ〜２３Ｏは、化学療法を受けている患者の末梢血から採取したＴ細胞のメモリー表現型を示す棒グラフである。絶対細胞数は、５倍より大きい増殖閾値に合格したおよび不合格になった試料［カラム１、図２３Ａ〜図２３Ｅ］、ＡＬＬまたはＮＨＬ患者［カラム２、図２３Ｆ〜図２３Ｊ］、ならびにＳＲ−およびＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ患者［カラム３、図２３Ｋ〜図２３Ｏ］から示される。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１３に見出すことができ、要約表は表９に見出すことができる。 図２３Ａ〜２３Ｏは、化学療法を受けている患者の末梢血から採取したＴ細胞のメモリー表現型を示す棒グラフである。絶対細胞数は、５倍より大きい増殖閾値に合格したおよび不合格になった試料［カラム１、図２３Ａ〜図２３Ｅ］、ＡＬＬまたはＮＨＬ患者［カラム２、図２３Ｆ〜図２３Ｊ］、ならびにＳＲ−およびＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ患者［カラム３、図２３Ｋ〜図２３Ｏ］から示される。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１３に見出すことができ、要約表は表９に見出すことができる。 図２３Ａ〜２３Ｏは、化学療法を受けている患者の末梢血から採取したＴ細胞のメモリー表現型を示す棒グラフである。絶対細胞数は、５倍より大きい増殖閾値に合格したおよび不合格になった試料［カラム１、図２３Ａ〜図２３Ｅ］、ＡＬＬまたはＮＨＬ患者［カラム２、図２３Ｆ〜図２３Ｊ］、ならびにＳＲ−およびＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ患者［カラム３、図２３Ｋ〜図２３Ｏ］から示される。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１３に見出すことができ、要約表は表９に見出すことができる。 図２３Ａ〜２３Ｏは、化学療法を受けている患者の末梢血から採取したＴ細胞のメモリー表現型を示す棒グラフである。絶対細胞数は、５倍より大きい増殖閾値に合格したおよび不合格になった試料［カラム１、図２３Ａ〜図２３Ｅ］、ＡＬＬまたはＮＨＬ患者［カラム２、図２３Ｆ〜図２３Ｊ］、ならびにＳＲ−およびＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ患者［カラム３、図２３Ｋ〜図２３Ｏ］から示される。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１３に見出すことができ、要約表は表９に見出すことができる。 図２３Ａ〜２３Ｏは、化学療法を受けている患者の末梢血から採取したＴ細胞のメモリー表現型を示す棒グラフである。絶対細胞数は、５倍より大きい増殖閾値に合格したおよび不合格になった試料［カラム１、図２３Ａ〜図２３Ｅ］、ＡＬＬまたはＮＨＬ患者［カラム２、図２３Ｆ〜図２３Ｊ］、ならびにＳＲ−およびＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ患者［カラム３、図２３Ｋ〜図２３Ｏ］から示される。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１３に見出すことができ、要約表は表９に見出すことができる。 図２３Ａ〜２３Ｏは、化学療法を受けている患者の末梢血から採取したＴ細胞のメモリー表現型を示す棒グラフである。絶対細胞数は、５倍より大きい増殖閾値に合格したおよび不合格になった試料［カラム１、図２３Ａ〜図２３Ｅ］、ＡＬＬまたはＮＨＬ患者［カラム２、図２３Ｆ〜図２３Ｊ］、ならびにＳＲ−およびＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ患者［カラム３、図２３Ｋ〜図２３Ｏ］から示される。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１３に見出すことができ、要約表は表９に見出すことができる。 図２４は、ＳＲ−またはＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬを有するすべての患者からの様々な回収時の末梢血由来の絶対Ｔ細胞数（１マイクロリットルあたりの細胞中の）を示す棒グラフである。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。統計分析は表１２に見出すことができる。 図２５Ａおよび２５Ｂは、Ｔ細胞表現型および増殖に対するＩＬ−７およびＩＬ−１５の効果を示す棒グラフである。回収試料を、実施例４に記載したようにＩＬ−７およびＩＬ−１５を含むかまたはＩＬ−７およびＩＬ−１５なしの２つの刺激培養物に分けた。図２５Ａは、サイトカインと培養した後の白血病およびリンパ腫患者における絶対メモリー表現型細胞数の変化パーセントを示す棒グラフである。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。図２５Ｂは、サイトカインと培養またはサイトカインなしで培養した後に評価した、テスト増殖合格試料のパーセントを示す棒グラフである。「全試料」はサイトカインなしで増殖させたすべての試料を表し、このうち幾つかを分割培養プロトコールの前に回収した。統計分析は表１４に見出すことができる。 図２５Ａおよび２５Ｂは、Ｔ細胞表現型および増殖に対するＩＬ−７およびＩＬ−１５の効果を示す棒グラフである。回収試料を、実施例４に記載したようにＩＬ−７およびＩＬ−１５を含むかまたはＩＬ−７およびＩＬ−１５なしの２つの刺激培養物に分けた。図２５Ａは、サイトカインと培養した後の白血病およびリンパ腫患者における絶対メモリー表現型細胞数の変化パーセントを示す棒グラフである。有意差は各カラムの上の「＊」で示され、Ｐ＜０．０５を表す。図２５Ｂは、サイトカインと培養またはサイトカインなしで培養した後に評価した、テスト増殖合格試料のパーセントを示す棒グラフである。「全試料」はサイトカインなしで増殖させたすべての試料を表し、このうち幾つかを分割培養プロトコールの前に回収した。統計分析は表１４に見出すことができる。 図２６は、テスト増殖合格および不合格試料の増殖後表現型を示す円グラフのセットである。表現型はテスト増殖の終了時に評価した。
本発明は、少なくとも部分的に、細胞療法（例えば、例として本明細書に記載されるようなＣＡＲ療法）における使用に対する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の適合性が、対象からの細胞取得に対する化学療法のタイミング、細胞を取得する対象に投与される化学療法の種類、対象（細胞が取得される）の原発性悪性腫瘍、悪性腫瘍の重症度（例えば、標準リスク、高リスク、または非常に高リスクのＡＬＬ）、低分化度のＴ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、ステムセントラルメモリーＴ細胞、またはセントラルメモリーＴ細胞）の割合、末端エフェクターＴ細胞の割合、および対象から取得されるＴ細胞の数（例えば、Ｔ細胞絶対数）を含む、多数の要因と相関関係にあるという発見に基づく。
実施例において詳細に説明されるように、患者の化学療法中の早い時点で（例えば、高い増殖能力を有するＴ細胞を枯渇させる化学療法サイクルの投与の前に）患者から取得した細胞を使用することで、Ｔ細胞増殖の改善（例えば、細胞療法における使用に対する適性を示し得る）が確認された。理論に束縛されることを望むものではないが、患者の化学療法中の早い時点で患者から細胞を取得することにより、例えば、増殖能力があまり劣化していない細胞集団が得られると考えられる。後期強化の化学療法サイクルまたは地固めの化学療法サイクルの前に患者から取得した細胞を使用することで、例えば、Ｔ細胞増殖の改善が確認された。いくつかの実施形態では、疾患の重症度が、細胞の劣化、例えば、細胞増殖能力に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、重症度の低い疾患（例えば、標準リスクのＡＬＬ）を有する患者から取得した細胞は、重症度の高い疾患（例えば、高リスクまたは非常に高リスクのＡＬＬ）を有する患者から取得した細胞よりも良好に増殖した。いくつかの実施形態では、重症度の高い疾患（例えば、高リスクまたは非常に高リスクのＡＬＬ）を有する患者は、重症度の低い疾患（例えば、標準リスクのＡＬＬ）を有する患者と比較して、化学療法中のより早い時点（例えば、２回目のサイクルまたは地固めサイクルの前）での細胞取得を要し得る。いくつかの実施形態では、増殖が可能な細胞は、重症度の低い疾患（例えば、標準リスクのＡＬＬ）を有する患者からは、より重症度の高い疾患を有する患者と比較して、化学療法中の遅い時点で（例えば、４回目のサイクルまたは後期強化サイクルの前に）取得することができる。他の実施形態では、白血病（例えば、ＡＬＬ、例えば、小児ＡＬＬ）を有する患者から取得した細胞は、リンパ腫（例えば、ＮＨＬ、例えば、小児ＮＨＬ）を有する患者から取得した細胞よりも高い増殖能力を有していた。さらに、Ｔ細胞絶対数がより高かった取得細胞集団もまた、Ｔ細胞絶対数が低かったものよりも良好に増殖する傾向にあった。増殖能力および生存能力がより高い傾向にある低分化度の免疫エフェクター細胞（例えば、低分化度のＴ細胞）をより多くの割合で含んでいた取得細胞集団も、同様に、高い増殖能力を呈した。
理論に束縛されることを望むものではないが、一部の化学療法サイクルにおいて使用される薬物、例えば、シクロホスファミドおよびシタラビンは、高度に増殖性のＴ細胞（例えば、低分化度のＴ細胞）を著しく枯渇させ、この作用は、より重症度の高い疾患を有する患者ではより顕著であると考えられている。化学療法薬へのより長期間の曝露またはより高い用量は、これらのＴ細胞集団のさらなる枯渇をもたらし得る。さらに、より多くの低分化度のＴ細胞集団は、より高いＴ細胞の増殖能力、存続性、および抗がんＴ細胞療法としての有効性につながると考えられている。
したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、有利なことに、がんの診断後の早い時点で、例えば、化学療法の前またはある特定の／複数回の化学療法サイクルの前に、対象から細胞を取得することによって、Ｔ細胞の適合性（細胞療法での使用に対する適性）および有効性を改善する。いくつかの実施形態では、本方法は、Ｔ細胞枯渇薬を含む化学療法サイクルの前に患者から取得された細胞、２回、３回、４回、もしくは５回の化学療法サイクルの前に取得された細胞、または後期強化サイクルもしくは地固めサイクルの前に取得された細胞を利用する。他の実施形態では、本方法は、例えば、悪性腫瘍の種類（例えば、白血病に対してリンパ腫）または疾患の重症度（例えば、標準リスク、高リスク、もしくは非常に高リスク）に基づいた患者の選択を含めることによって、免疫細胞の増殖能力および／または抗腫瘍効果を最適化する。さらに他の実施形態では、本方法は、細胞の選択、例えば、Ｔ細胞絶対数が高いかまたは低分化度のＴ細胞の割合が高い細胞集団の選択を含めることによって、免疫細胞の増殖能力および／または抗腫瘍効果を最適化する。さらなる実施形態が、本明細書にさらに詳細に説明される。
定義
別途定義されない限り、本明細書に使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。
「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は、１つまたは１つを上回る（すなわち、少なくとも１つの）その品目の文法上の目的物を指す。例として、「１つの要素」とは、１つまたは１つを上回る要素を意味する。
測定可能な値、例えば、量、時間的な期間などに言及する際の「約」という用語は、示された値からの±２０％、または一部の事例では±１０％、または一部の事例では±５％、または一部の事例では±１％、または一部の事例では±０．１％のばらつきを含むことを意味するが、これは、このようなばらつきが、開示される方法を実行するのに適切なためである。
本明細書に使用される「取得する」または「取得すること」という用語は、物理的実体（例えば、試料、細胞もしくは細胞集団、ポリペプチド、核酸、または配列）、または値、例えば数値を、その物理的実体または値を「直接的に取得すること」または「間接的に取得すること」によって得ることを指す。一実施形態では、取得することは、細胞または細胞集団（例えば、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞または集団）を得ることまたは採取することを指す。「直接的に取得すること」とは、物理的実体または値を得るためのプロセスを行うこと（例えば、合成法または分析法または精製法を行うこと）を意味する。「間接的に取得すること」とは、物理的実体または値を別の集団または供給源（例えば、物理的実体または値を直接的に取得した第三者研究室）から受容することを指す。物理的実体を直接的に取得することは、物理的物質、例えば、出発材料の物理的変化を含むプロセスを行うことを含む。例示的な変化としては、２つ以上の出発材料から物理的実体を作製すること、物質をせん断または断片化すること、物質を分離または精製すること、２つ以上の別個の実体を合わせて混合物にすること、共有結合または非共有結合を破壊または形成することを含む化学反応を行うことが挙げられる。値を直接的に取得することには、試料または別の物質の物理的変化を含むプロセスを行うこと、例えば、物質、例として試料、検体、もしくは試薬の物理的変化を含む分析プロセス（本明細書において「物理的分析」と称されることが多い）を行うこと、分析法、例えば、次の：物質、例えば、検体、またはその断片もしくは他の誘導体を別の物質から分離または精製すること；検体、またはその断片もしくは他の誘導体を、別の物質、例えば、緩衝液、溶媒、または反応物質と合わせること；または検体、またはその断片もしくは他の誘導体の構造を、例えば、検体の第１の原子と第２の原子との間の共有結合または非共有結合を破壊または形成することによって変化させること；または試薬、またはその断片もしくは他の誘導体の構造を、例えば、試薬の第１の原子と第２の原子との間の共有結合または非共有結合を破壊または形成することによって変化させることのうちの１つまたは複数を含む方法を行うことが含まれる。
「生物学的に同等な（ｂｉｏｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」とは、参照化合物（例えば、ＲＡＤ００１）の参照用量または参照量によってもたらされる効果と同等の効果をもたらすために必要な、参照化合物（例えば、ＲＡＤ００１）以外の薬剤の量を指す。ある実施形態では、効果は、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ阻害によって測定される、例えば、インビボもしくはインビトロアッセイで評価される、例えば、本明細書に記載のアッセイ、例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイ、またはウェスタンブロットによるリン酸化Ｓ６レベルの測定によって測定される、ｍＴＯＲ阻害のレベルである。ある実施形態では、効果は、細胞選別によって測定される、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞の比の変化である。ある実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的に同等な量または用量とは、参照化合物の参照用量または参照量と同じレベルのＰ７０ Ｓ６キナーゼ阻害を達成する量または用量である。ある実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的に同等な量または用量とは、参照化合物の参照用量または参照料と同じレベルのＰＤ−１陽性Ｔ細胞／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞の比の変化を達成する量または用量である。
「キメラ抗原受容体」または代替として「ＣＡＲ」という用語は、免疫エフェクター細胞において、標的細胞、典型的にはがん細胞に対する特異性を細胞に提供し、細胞内シグナル生成を提供する、ポリペプチドのセット、最も単純な実施形態では典型的に２つのポリペプチドのセットを指す。一部の実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに以下に定義される刺激分子および／または共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書において、「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される）を含む。一部の態様では、ポリペプチドのセットは、互いに連続しており、例えば、同じポリペプチド鎖にあり、例えば、キメラ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドのセットは、互いに連続しておらず、例えば、異なるポリペプチド鎖にある。一部の実施形態では、ポリペプチドのセットには、二量体化分子が存在する場合に、ポリペプチドを互いに結合させることができる、例えば、抗原結合性ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合させることができる、二量体化スイッチが含まれる。一態様では、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に付随するゼータ鎖である。一態様では、細胞質シグナル伝達ドメインは、以下に定義される少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つまたは複数の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。一態様では、共刺激分子は、本明細書に記載される共刺激分子、例えば、４−１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、および／またはＣＤ２８から選択される。一態様では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに１つまたは複数の共刺激分子に由来する２つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する１つの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに１つまたは複数の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する１つの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）にリーダー配列を含んでもよい。一態様では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメインのＮ末端にリーダー配列をさらに含み、ここで、リーダー配列は、適宜、細胞プロセシングおよび細胞膜へのＣＡＲの局在化の際に抗原結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から切断される。
本明細書に記載されるものなど、特異的腫瘍抗原Ｘを標的とする抗原結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはＴＣＲ）を含むＣＡＲは、ＸＣＡＲとも称される。例えば、ＣＤ１９を標的とする抗原結合性ドメインを含むＣＡＲは、ＣＤ１９ＣＡＲと称される。
「シグナル伝達ドメイン」という用語は、第２のメッセンジャーを生成するか、またはそのようなメッセンジャーに応答することによってエフェクターとして機能することで、所定のシグナル伝達経路を介して細胞活性を制御するように細胞内で情報を伝達することによって作用する、タンパク質の機能的部分を指す。
「抗体」という用語は、本明細書に使用されるとき、抗原に特異的に結合する、免疫グロブリン分子に由来するタンパク質、またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル、多重鎖もしくは一本鎖、またはインタクトな免疫グロブリンであり得、天然源または組換え源に由来し得る。抗体は、免疫グロブリン粒子の四量体であってもよい。
「抗体断片」という用語は、抗原のエピトープと特異的に相互作用する（例えば、結合、立体障害、安定化／脱安定化、空間分布により）能力を保持する、抗体の少なくとも一部分を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合型Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、線形抗体、単一ドメイン抗体、例えばｓｄＡｂ（ＶＬもしくはＶＨのいずれか）、ラクダＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片などの抗体断片から形成された多重特異的抗体、単離ＣＤＲ、または抗体の他のエピトープ結合性断片が挙げられるがこれらに限定されない。抗原結合性断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、およびビス−ｓｃＦｖに組み込むことができる（例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005を参照されたい）。抗原結合性断片はまた、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）など、ポリペプチドに基づいて、スキャフォールドにグラフトされ得る（フィブロネクチンポリペプチドミニボディについて記載している、米国特許第６，７０３，１９９号を参照されたい）。
「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片および重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片を含む融合タンパク質であって、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例として短い可動性ポリペプチドリンカーを介して連続的に連結されており、一本鎖ポリペプチドとして発現され得、ｓｃＦｖは、それが由来するインタクトな抗体の特異性を保持する、融合タンパク質を指す。指定されない限り、本明細書に使用されるとき、ｓｃＦｖは、ＶＬ可変領域およびＶＨ可変領域をいずれの順序で有してもよく、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関して、ｓｃＦｖは、ＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでもよく、またはＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでもよい。
抗体またはその抗体断片を含むＣＡＲの部分は、抗原結合性ドメインが、例えば、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、およびヒト化抗体を含む、連続的ポリペプチド鎖の一部として発現された、様々な形態で存在し得る（Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York、Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883、Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。一実施形態では、ＣＡＲの抗原結合性ドメインは、抗体断片を含む。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体断片を含む。所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（「Ｋａｂａｔ」付番スキーム）、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」付番スキーム）、またはこれらの組合せを含む、多数の周知のスキームのうちのいずれかを使用して決定することができる。
本明細書に使用されるとき、「結合性ドメイン」または「抗体分子」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、タンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖またはその断片を指す。「結合性ドメイン」または「抗体分子」という用語は、抗体および抗体断片を包含する。ある実施形態では、抗体分子は、多重特異的抗体分子であり、例えば、これは、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、複数のうちの第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第１のエピトープに対する結合特異性を有し、複数のうちの第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第２のエピトープに対する結合特異性を有する。ある実施形態では、多重特異的抗体分子は、二重特異的抗体分子である。二重特異的抗体は、２つ以下の抗原に対する特異性を有する。二重特異的抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列および第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列を特徴とする。
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、本明細書に使用されるとき、抗原特異性および結合親和性を付与する、抗体の可変領域内のアミノ酸の配列を指す。例えば、一般に、各重鎖可変領域には、３つのＣＤＲがあり（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、各軽鎖可変領域には３つのＣＤＲがある（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）。所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（「Ｋａｂａｔ」付番スキーム）、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」付番スキーム）、またはこれらの組合せを含む、多数の周知のスキームのうちのいずれかを使用して決定することができる。Ｋａｂａｔ付番スキームでは、一部の実施形態において、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲアミノ酸残基には、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）が付番され、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲアミノ酸残基には、２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）が付番される。Ｃｈｏｔｈｉａ付番スキームでは、一部の実施形態において、ＶＨのＣＤＲアミノ酸には、２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）が付番され、ＶＬのＣＤＲアミノ酸残基には、２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）が付番される。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａを組み合わせた付番スキームでは、一部の実施形態において、ＣＤＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲ、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ、または両方の一部であるアミノ酸残基に対応する。例えば、一部の実施形態では、ＣＤＲは、ＶＨ、例えば、哺乳動物ＶＨ、例えば、ヒトＶＨのアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）に対応し、ＶＬ、例えば、哺乳動物ＶＬ、例えば、ヒトＶＬのアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）に対応する。
抗体またはその抗体断片を含む本発明のＣＡＲの部分は、抗原結合性ドメインが、例えば、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、または二重特異的抗体を含む、連続的ポリペプチド鎖の一部として発現された、様々な形態で存在し得る（Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York、Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883、Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。一態様では、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合性ドメインは、抗体断片を含む。さらなる態様では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体断片を含む。
「抗体重鎖」という用語は、抗体分子の天然の立体配置において、存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの大きい方を指し、これが、通常、抗体が属するクラスを決定する。
「抗体軽鎖」という用語は、抗体分子の天然の立体配置において、存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。カッパ（κ）軽鎖およびラムダ（λ）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
「組換え抗体」という用語は、例えば、バクテリオファージまたは酵母発現系によって発現された抗体など、組換えＤＮＡ技術を使用して生成された抗体を指す。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成された抗体であり、このＤＮＡ分子は抗体タンパク質、または抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、ここで、そのＤＮＡまたはアミノ酸配列が、当該技術分野で利用可能かつ周知の組換えＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られたものである、抗体を意味すると解釈されるべきである。
「抗原」または「Ａｇ」という用語は、免疫応答を誘起する分子を指す。この免疫応答には、抗体産生もしくは特定の免疫学的に適合性の細胞の活性化、またはその両方が含まれ得る。当業者であれば、実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含め、いずれの巨大分子も、抗原として機能し得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者であれば、免疫応答を誘起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、したがって、この用語が本明細書に使用されるとき「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者であれば、抗原が、必ずしも、遺伝子の全長ヌクレオチド配列だけによってコードされるわけではないことを理解するであろう。本発明が、１つを上回る遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むがこれに限定されないこと、およびこれらのヌクレオチド配列が、様々な組合せで配置されて、所望される免疫応答を誘起するポリペプチドをコードすることは、容易に明らかである。さらに、当業者であれば、抗原が、「遺伝子」によってコードされる必要が全くないことを理解するであろう。抗原が、生成、合成されてもよく、または生物学的試料に由来してもよく、またはポリペプチド以外の巨大分子であってもよいことは、容易に明らかである。このような生物学的試料としては、他の生物学的成分を有する組織試料、腫瘍試料、細胞、または流体が挙げられるがこれらに限定されない。
「自家」という用語は、同じ個体に由来する任意の材料を指し、この材料は、後に、この個体に再び導入される。
「同種」という用語は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を指す。２つ以上の個体は、１つまたは複数の遺伝子座にある遺伝子が同一でない場合に、互いに同種であると言われる。一部の態様では、同じ種の個体に由来する同種材料は、遺伝子的には十分に異なっており、抗原的に相互作用し得る。
「異種」という用語は、異なる種の動物に由来する任意の材料を指す。
「がん」という用語は、異常な細胞の制御されない成長によって特徴付けられる疾患を指す。がん細胞は、局所的に拡がり得るか、または血流およびリンパ系を介して身体の他の部分に拡がり得る。様々ながんの例が本明細書に記載されており、これらとしては、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がんなどが挙げられるがこれらに限定されない。「腫瘍」および「がん」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、例えば、いずれの用語も、固形腫瘍および液性腫瘍、例えば、びまん性腫瘍または循環腫瘍を包含する。本明細書に使用されるとき、「がん」または「腫瘍」という用語は、前悪性ならびに悪性のがんおよび腫瘍を含む。
「由来する」という用語は、この本明細書に使用されるとき、第１の分子と第２の分子との間の関係性を示す。この用語は、通常、第１の分子と第２の分子との間の構造上の類似性を指し、第１の分子が第２の分子に由来するプロセスまたは起源に関する制限を示すものでも含むものでもない。例えば、ＣＤ３ゼータ分子に由来する細胞内シグナル伝達ドメインの場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、必要とされる機能、すなわち、適切な条件下でシグナルを生成する能力を有するように、十分なＣＤ３ゼータ構造を保持している。これは、細胞内シグナル伝達ドメインを生成する特定のプロセスへの限定を示すものでも、それを含むものでもなく、例えば、これは、この細胞内シグナル伝達ドメインを提供するために、ＣＤ３ゼータ配列で開始し、不必要な配列を欠失させるか、または突然変異を加えて、細胞内シグナル伝達ドメインを達成しなければならないことを意味するものではない。
本明細書に記載される「腫瘍抗原の発現と関連する疾患」という語句には、本明細書に記載される腫瘍抗原の発現と関連する疾患または本明細書に記載される腫瘍抗原を発現する細胞と関連する状態が含まれるがこれらに限定されず、これには、例えば、がんもしくは悪性腫瘍、または前がん性状態といった増殖性疾患、例えば、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、もしくは前白血病、または本明細書に記載される腫瘍抗原を発現する細胞と関連する非がん関連の適応症が含まれる。一実施形態では、本明細書に記載される腫瘍抗原の発現と関連するがんは、血液がんである。一実施形態では、本明細書に記載される腫瘍抗原の発現と関連するがんは、固形がんである。本明細書に記載される腫瘍抗原の発現と関連するさらなる疾患としては、例えば、本明細書に記載される腫瘍抗原の発現と関連する、異型および／または非古典的ながん、悪性腫瘍、前がん状態、または増殖性疾患が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に記載される腫瘍抗原の発現と関連する非がん関連の適応症としては、例えば、自己免疫疾患（例えば、ループス）、炎症性障害（アレルギーおよび喘息）、ならびに移植が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するか、または任意の時点で発現していた。ある実施形態では、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原タンパク質（例えば、野生型または突然変異型）を産生し、腫瘍抗原タンパク質は、正常なレベルまたは低下したレベルで存在し得る。ある実施形態では、腫瘍抗原発現細胞は、ある時点で検出可能なレベルの腫瘍抗原タンパク質を産生しており、その後は、検出可能な腫瘍抗原タンパク質を実質的に産生していなかった。
本明細書に使用されるとき、「ＣＤ１９」という用語は、分化クラスター１９タンパク質（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １９ ｐｒｏｔｅｉｎ）を指し、これは、白血病前駆細胞で検出可能な抗原決定基である。ヒトおよびマウスのアミノ酸配列および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの公的なデータベースに見出すことができる。例えば、ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ１５３９１として見出すことができ、ヒトＣＤ１９をコードするヌクレオチド配列は、受託番号ＮＭ＿００１１７８０９８で見出すことができる。本明細書に使用されるとき、「ＣＤ１９」には、全長野生型ＣＤ１９の突然変異、例えば、点突然変異、断片、挿入、欠失、およびスプライス変異体を含むタンパク質が含まれる。ＣＤ１９は、例えば、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、および非ホジキンリンパ腫を含む、ほとんどのＢ系統がんで発現される。ＣＤ１９を発現する他の細胞は、以下の「ＣＤ１９の発現と関連する疾患」の定義に提供される。これは、Ｂ細胞前駆細胞の早期マーカーでもある。例えば、Nicholson et al.Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)を参照されたい。一態様では、ＣＡＲＴの抗原結合性部分は、ＣＤ１９タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、それに結合する。一態様では、ＣＤ１９タンパク質は、がん細胞に発現する。
「ＣＤ１９の発現と関連する疾患」という語句には、ＣＤ１９（例えば、野生型もしくは突然変異型ＣＤ１９）の発現と関連する疾患またはＣＤ１９（例えば、野生型もしくは突然変異型ＣＤ１９）を発現するかもしくは任意の時点で発現していた細胞と関連する状態が含まれるがこれらに限定されず、これには、例えば、がんもしくは悪性腫瘍、または前がん状態といった増殖性疾患、例えば骨髄異形成、骨髄異形成症候群、もしくは前白血病、あるいはＣＤ１９を発現する細胞と関連する非がん関連の適応症が含まれる。懸念を回避するために、ＣＤ１９の発現と関連する疾患には、現時点でＣＤ１９を発現していない細胞と関連する状態が含まれ得るが、これは、例えば、ＣＤ１９の発現が、例としてＣＤ１９を標的とする分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲでの治療により下方制御されているが、かつてＣＤ１９を発現していたためである。一態様では、ＣＤ１９の発現と関連するがんは、血液がんである。一態様では、血液がんは、白血病またはリンパ腫である。一態様では、ＣＤ１９の発現と関連するがんには、例として、例えば、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を含むがこれらに限定されない１つまたは複数の急性白血病；例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含むがこれらに限定されない１つまたは複数の慢性白血病が挙げられるがこれらに限定されない、がんおよび悪性腫瘍が含まれる。ＣＤ１９の発現と関連するさらなるがんまたは血液状態には、例えば、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞性白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、ならびに骨髄血液細胞の無効な産生（または異形成）などによってまとめられる、血液状態の多様な集合である「前白血病」が含まれるがこれらに限定されない。ＣＤ１９発現の発現と関連するさらなる疾患としては、例えば、ＣＤ１９の発現と関連する異型および／または非古典的ながん、悪性腫瘍、前がん状態、または増殖性疾患が挙げられるがこれらに限定されない。ＣＤ１９の発現と関連する非がん関連の適応症としては、例えば、自己免疫疾患（例えば、ループス）、炎症性障害（アレルギーおよび喘息）、ならびに移植が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＣＤ１９発現細胞は、ＣＤ１９ ｍＲＮＡを発現するか、または任意の時点で発現していた。ある実施形態では、ＣＤ１９発現細胞は、ＣＤ１９タンパク質（例えば、野生型または突然変異型）を産生し、ＣＤ１９タンパク質は、正常なレベルまたは低下したレベルで存在し得る。ある実施形態では、ＣＤ１９発現細胞は、ある時点で検出可能なレベルのＣＤ１９タンパク質を産生しており、その後は、検出可能なＣＤ１９タンパク質を実質的に産生していなかった。
「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体または抗体断片の結合特徴に実質的に影響を及ぼさないかまたはそれを変化させない、アミノ酸修飾を指す。このような保存的修飾には、アミノ酸置換、付加、および欠失が含まれる。修飾は、部位指向的突然変異生成およびＰＣＲ媒介型突然変異生成など、当該技術分野で既知の標準的な技法によって、本発明の抗体または抗体断片に導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝型側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、ならびに芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、本明細書に記載されるＣＡＲ内の１つまたは複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えられてもよく、変化したＣＡＲは、本明細書に記載される機能性アッセイを使用して試験することができる。
「刺激」という用語は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＡＲ）とその同族リガンド（またはＣＡＲの場合は腫瘍抗原）との結合によって誘発され、それによって、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達または適切なＮＫ受容体もしくはＣＡＲのシグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達などであるがこれらに限定されないシグナル伝達イベントが媒介される、一次応答を指す。刺激は、ある特定の分子の発現の変化を媒介することができる。
「刺激分子」という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞）によって発現される分子を指し、この分子は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部の態様に関して、免疫細胞の活性化を刺激手段で制御する細胞質シグナル伝達配列を提供する。一態様では、シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と、ペプチドが充填されたＭＨＣ分子との結合によって開始される一次シグナルであり、増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答の媒介をもたらす。刺激様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも称される）は、免疫受容体活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして既知のシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明において特に有用なＩＴＡＭを含む細胞質シグナル伝達配列の例としては、ＣＤ３ゼータ、一般的なＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２に由来するものが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の特定のＣＡＲでは、本発明の任意の１つまたは複数のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の特定のＣＡＲでは、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号９として提供される配列であるか、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基である。本発明の特定のＣＡＲでは、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号１０に提供される配列であるか、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基である。
「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」という用語は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）とその表面上で複合体を形成した外来抗原を提示する、補助細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など）などの免疫系細胞を指す。Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこれらの複合体を認識することができる。ＡＰＣは、抗原をプロセシングし、それらをＴ細胞に提示する。
「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、本明細書に使用されるとき、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えば、ＣＡＲＴ細胞における免疫エフェクター機能の例としては、細胞溶解活性、およびサイトカインの分泌を含むヘルパー活性が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、特化した機能を行うよう細胞に指示する、タンパク質の部分である。通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体が用いられ得るが、多くの場合には、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分が使用される範囲では、このような短縮された部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用することができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、したがって、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮された部分を含むことを意味する。
ある実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとしては、一次刺激または抗原依存性刺激を担う分子に由来するものが挙げられる。ある実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインとしては、共刺激シグナル、または抗原非依存性刺激を担う分子に由来するものが挙げられる。例えば、ＣＡＲＴの事例では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体の細胞質配列を含み得、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共受容体または共刺激分子由来の細胞質配列を含み得る。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして既知のシグナル伝達モチーフを含み得る。ＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達配列の例としては、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」）、ＦｃεＲＩ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ３２、ＤＡＰ１０、ならびにＤＡＰ１２が挙げられるがこれらに限定されない。
「ゼータ」または代替として「ゼータ鎖」、「ＣＤ３ゼータ」、もしくは「ＴＣＲゼータ」という用語は、ＧｅｎＢａｎ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１として提供されるタンパク質、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基として特定され、「ゼータ刺激ドメイン」または代替として「ＣＤ３ゼータ刺激ドメイン」もしくは「ＴＣＲゼータ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞活性に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分な、ゼータ鎖の細胞質ドメインに由来するアミノ酸残基として定義される。一態様では、ゼータの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２から１６４、または非ヒト種、例えば、その機能的オルトログであるマウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基を含む。一態様では、「ゼータ刺激ドメイン」または「ＣＤ３ゼータ刺激ドメイン」は、配列番号９として提供される配列である。一態様では、「ゼータ刺激ドメイン」または「ＣＤ３ゼータ刺激ドメイン」は、配列番号１０として提供される配列である。
「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドに特異的に結合し、それによって、増殖などであるがこれに限定されないＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族の結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に寄与する、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子としては、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、リンパ球活性化シグナル伝達分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドが挙げられるがこれらに限定されない。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子またはその機能的断片の、細胞内部分全体または天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体を含み得る。
「４−１ＢＢ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２として提供されるアミノ酸配列、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを指し、「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４〜２５５、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基として定義される。一態様では、「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、配列番号７として提供される配列、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基である。
「免疫エフェクター細胞」は、この用語が本明細書に使用されるとき、免疫応答に関与する、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する、細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞、ならびに骨髄芽球由来の食細胞が挙げられる。
「免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答」は、この用語が本明細書に使用されるとき、標的細胞の免疫攻撃を強化または促進する、機能または応答、例えば、免疫エフェクター細胞の機能または応答を指す。例えば、免疫エフェクター機能または応答は、標的細胞の殺滅または標的細胞の成長もしくは増殖の阻害を促進する、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の特性を指す。Ｔ細胞の場合、一次刺激および共刺激は、免疫エフェクター機能または応答の例である。
「コードする」という用語は、定義されたヌクレオチド配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸配列のいずれかを有し、それによりもたらされる生物学的特性を有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマーまたは巨大分子の合成のための鋳型として機能する、ポリヌクレオチド、例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡにおける特定のヌクレオチド配列の固有の特性を指す。したがって、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳により、細胞または他の生物系においてタンパク質が生じる場合、タンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供されるヌクレオチド配列であるコード鎖、および遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方が、タンパク質またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードすると称され得る。
別途示されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いに縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句には、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、一部の型においてイントロンを含有し得る限り、イントロンも含まれ得る。
「内在性」という用語は、生物、細胞、組織、または系に由来するか、またはその内部で産生される、任意の材料を指す。
「外来性」という用語は、生物、細胞、組織、または系に導入されるか、またはその外部で産生される、任意の材料を指す。
「発現」という用語は、プロモーターによって作動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を指す。
「移入ベクター」という用語は、単離核酸を含み、単離核酸を細胞の内部にデリバリーするために使用することができる物質の組成物を指す。線状ポリヌクレオチド、イオン性化合物または両親媒性化合物と関連するポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むがこれらに限定されない多数のベクターが、当該技術分野で既知である。したがって、「移入ベクター」という用語には、自律複製プラスミドまたはウイルスが含まれる。この用語はまた、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなどといった、核酸の細胞への移入を促進する非プラスミドまたは非ウイルスの化合物をさらに含むとみなされるべきである。ウイルス移入ベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるがこれらに限定されない。
「発現ベクター」という用語は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む、組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によってかまたはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込む、コスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドまたはリポソームに含まれる）、およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含む、すべての当該技術分野で既知のものが含まれる。
「レンチウイルス」という用語は、レトロウイルスファミリーの属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという点で、レトロウイルスの中でも固有であり、これらは、相当な量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡにデリバリーすることができ、そのため、遺伝子デリバリーベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、およびＦＩＶは、すべて、レンチウイルスの例である。
「レンチウイルスベクター」という用語は、特に、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)に提供されるような、自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターを指す。臨床で使用することができるレンチウイルスベクターの他の例としては、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａからのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子デリバリー技術、ＬｅｎｔｉｇｅｎからのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系などが挙げられるがこれらに限定されない。非臨床的種類のレンチウイルスベクターもまた、利用可能であり、当業者に既知である。
「相同」または「同一性」という用語は、２つのポリマー分子間、例えば、２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子といった２つの核酸分子間、または２つのポリペプチド分子間におけるサブユニットの配列同一性を指す。２つの分子の両方においてサブユニットの位置が、同じモノマーサブユニットで占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれのある位置が、アデニンで占められている場合、それらは、その位置において相同または同一である。２つの配列間の相同性は、一致するかまたは相同な位置の数の直接的な関数であり、例えば、２つの配列における位置の半数（例えば、長さが１０サブユニットのポリマーにおいて５つの位置）が相同である場合、これら２つの配列は、５０％相同であり、位置の９０％（例えば、１０個中９個）が一致するかまたは相同である場合、これら２つの配列は、９０％相同である。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくは抗体の他の抗原結合性部分配列）である。ほとんどの部分に関して、ヒト化抗体およびその抗体断片は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望される特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体または抗体断片）である。一部の事例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体／抗体断片は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾により、抗体または抗体断片の性能をさらに精査し、最適化することができる。一般に、ヒト化抗体またはその抗体断片は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的にすべてを含むことになり、ここで、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは大部分が、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体または抗体断片はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含み得る。さらなる詳細については、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986、Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照されたい。
「完全ヒト」とは、全分子が、ヒト起源のものであるか、またはヒト型の抗体または免疫グロブリンと同一なアミノ酸配列からなる、抗体または抗体断片などの免疫グロブリンを指す。
「単離」されたという用語は、天然の状態から変化しているか、取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離」されていないが、同じ核酸またはペプチドがその天然の状態の共存する材料から部分的または完全に分離されている場合は、「単離」されている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または例えば宿主細胞などの非天然の環境において存在し得る。
本発明の文脈において、一般に生じる核酸塩基に関して、次の略語が使用される。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。
「作動可能に連結された」または「転写制御」という用語は、制御配列と異種核酸配列との間の機能的連結であり、後者の発現をもたらすものを指す。例えば、第１の核酸配列が、第２の核酸配列との機能的関係にある場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結されている。例えば、プロモーターが、コード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、互いに連続的であってもよく、例えば、２つのタンパク質のコード領域を結合する必要が有る場合、同じリーディングフレームに存在する。
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語には、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、もしくは胸骨内注射、腫瘍内、または注入技法が含まれる。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、ならびに一本鎖形態または二本鎖形態いずれかのそれらのポリマーを指す。「核酸」という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡを含む。一実施形態では、核酸分子は、合成（例えば、化学的に合成されたもの）または組換えである。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然のヌクレオチドに類似の様式で代謝される、天然のヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途示されない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルトログ、ＳＮＰ、および相補配列、ならびに明確に示されている配列を暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る［Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)、Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)、およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)］。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、互換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならないが、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に関しては制限がない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに結合された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書に使用されるとき、この用語は、当該技術分野では一般的に例えばペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも称される短い鎖、ならびに多数の種類が存在し当該技術分野では一般的にタンパク質と称される長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然のポリペプチド、組換えポリペプチド、またはこれらの組合せが含まれる。
「プロモーター」という用語は、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識される、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するために必要なＤＮＡ配列を指す。
「プロモーター／制御配列」という用語は、プロモーター／制御配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を指す。一部の事例では、この配列は、コアプロモーター配列であり得、他の事例では、この配列はまた、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の制御エレメントも含み得る。プロモーター／制御配列は、例えば、組織特異的様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。
「構成的」プロモーターという用語は、遺伝子産物をコードするかまたはそれを指定するポリヌクレオチドに作動可能に連結されている場合に、細胞のほとんどまたはすべての生理学的条件下で、細胞において遺伝子産物を産生させる、ヌクレオチド配列を指す。
「誘導的」プロモーターという用語は、遺伝子産物をコードするかまたはそれを指定するポリヌクレオチドに作動可能に連結されている場合に、実質的に、プロモーターに対応するインデューサーが細胞に存在しているときにだけ、細胞において遺伝子産物を産生させる、ヌクレオチド配列を指す。
「組織特異的」プロモーターという用語は、遺伝子をコードするかまたは遺伝子によって指定されるポリヌクレオチドに作動可能に連結されている場合に、実質的には細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にだけ、その遺伝子産物が細胞において産生されるようにするヌクレオチド配列を指す。
「がん関連抗原」または「腫瘍抗原」という用語は、正常細胞と比較して、がん細胞の表面上に全体としてまたは断片として（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）のいずれかで優先的に発現し、薬理作用のある物質の標的をがん細胞に優先的に定めるのに有用である、分子（典型的にはタンパク質、炭水化物、または脂質）を互換可能に指す。一部の実施形態では、がん関連抗原は、正常細胞と比較して、がん細胞において過剰発現する、例えば、正常細胞と比較して、１倍過剰発現、２倍過剰発現、３倍過剰発現、またはそれ以上である、細胞表面分子である。一部の実施形態では、がん関連抗原は、がん細胞において不適切に合成される細胞表面分子、例えば、正常細胞において発現する分子と比較して、欠失、付加、または突然変異を含有する分子である。一部の実施形態では、がん関連抗原は、がん細胞の細胞表面上だけに全体としてまたは断片（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）として発現し、正常細胞の表面では合成も発現もされないであろう。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲには、ＭＨＣ提示ペプチドに結合する抗原結合性ドメイン（例えば、抗体または抗体断片）を含むＣＡＲが含まれる。通常、内在性タンパク質に由来するペプチドは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子のポケットを満たし、ＣＤ８＋Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、すべての有核細胞によって構成的に発現される。がんの場合、ウイルス特異的および／または腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体は、免疫療法のための固有なクラスの細胞表面標的を表す。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ２の関連でウイルス抗原または腫瘍抗原に由来するペプチドを標的とするＴＣＲ様抗体が、説明されている［例えば、Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942、Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272、Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165、Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21) :1601-1608、Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176) :176ra33、Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100を参照されたい］。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｓｃＦｖファージ提示ライブラリーなどのライブラリーをスクリーニングすることにより特定することができる。
ｓｃＦｖの文脈で使用される「可動性ポリペプチドリンカー」または「リンカー」という用語は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を一緒に連結させるために単独または組み合わせて使用されるグリシン残基および／またはセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一実施形態では、可動性ポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（配列番号２２）を含み、ここで、ｎは、１に等しいまたは１を上回る正の整数である。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、およびｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９、およびｎ＝１０である。一実施形態では、可動性ポリペプチドリンカーとしては、（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）４（配列番号２７）または（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）３（配列番号２８）が挙げられるがこれらに限定されない。別の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）、または（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）（配列番号２９）の複数回の繰り返しを含む。一実施形態では、リンカーは、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１０４）である。参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／１３８４７５に記載されているリンカーもまた、本発明の範囲内に含まれる）。
本明細書に使用されるとき、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ ７−メチルグアノシンキャップ、またはＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも称される）は、転写開始直後に真核生物メッセンジャーＲＮＡの「前方」または５’末端に付加された、修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、最初に転写されたヌクレオチドに連結された末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識およびＲＮａｓｅからの保護に重要である。キャップ付加は、転写と連動しており、互いに影響し合うように転写と同時に起こる。転写開始直後に、合成されているｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼに付随するキャップ合成複合体によって結合される。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要とされる化学反応を触媒する。合成は、複数工程の生化学反応として進行する。キャッピング部分は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳の効率性などの機能を調節するように修飾され得る。
本明細書に使用されるとき、「インビトロ転写ＲＮＡ」とは、インビトロで合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。一般にインビトロで転写されたＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから生成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡを生成するために使用される鋳型を含む。
本明細書に使用されるとき、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに結合された一連のアデノシンである。一過性発現のためのコンストラクトの好ましい実施形態では、ポリＡは、５０〜５０００（配列番号３０）であり、好ましくは６４を上回り、より好ましくは１００を上回り、最も好ましくは３００または４００であり、ポリ（Ａ）配列は、局在化、安定性、または翻訳の効率性などのｍＲＮＡ機能を調節するように化学的または酵素的に修飾され得る。
本明細書に使用されるとき、「ポリアデニル化」は、ポリアデニリル部分、またはその修飾変異体とメッセンジャーＲＮＡ分子との共有結合を指す。真核生物では、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は、３’末端においてポリアデニル化されている。３’ポリ（Ａ）尾部は、ポリアデニル化ポリメラーゼ酵素の作用を通じて前ｍＲＮＡに付加されたアデニンヌクレオチド（数百であることが多い）の長い配列である。より高等な真核生物では、ポリ（Ａ）尾部は、特異的な配列であるポリアデニル化シグナルを含む転写産物に付加される。ポリ（Ａ）尾部およびそれに結合したタンパク質は、ｍＲＮＡをエクソヌクレアーゼによる分解から保護することに役立つ。ポリアデニル化はまた、転写終結、核からのｍＲＮＡの輸送、および翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡからＲＮＡへの転写直後に核で生じるが、追加として、後で細胞質において生じることもある。転写が終結された後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼに付随するエンドヌクレアーゼ複合体の作用を通じて切断される。切断部位は、通常、切断部位付近の塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在によって特徴付けられる。ｍＲＮＡが切断された後、アデノシン残基が、切断部位の遊離３’末端に付加される。
本明細書に使用されるとき、「一過性」とは、数時間、数日間、または数週間の期間の、非組込み型導入遺伝子の発現を指し、ここで、発現期間は、ゲノムに組み込まれているかまたは宿主細胞の安定なプラスミドレプリコン内に含まれている場合の遺伝子の発現期間よりも短い。
アフェレーシスは、全血を個体から取り出し、選択成分に分離し、残りを循環に戻すプロセスである。一般に、血液成分を分離するためには、遠心分離および非遠心分離の２つの方法がある。白血球アフェレーシスは、患者の白血球の能動的な選択および除去をもたらす。
本明細書に使用されるとき、「治療する」、「治療」、および「治療すること」という用語は、１つまたは複数の治療法（例えば、本発明のＣＡＲなどの１つまたは複数の治療剤）の投与によりもたらされる増殖性障害の進行、重症度、および／もしくは期間の低減もしくは緩和、または増殖性障害の１つもしくは複数の症状（好ましくは、１つまたは複数の認識可能な症状）の緩和を指す。具体的な実施形態では、「治療する」、「治療」、および「治療すること」という用語は、必ずしも患者によって認識可能であるとは限らない、腫瘍の成長などの増殖性障害の少なくとも１つの測定可能な物理的パラメーターの緩和を指す。他の実施形態では、「治療する」、「治療」、および「治療すること」という用語は、例えば認識可能な症状の安定化による物理的なもの、例えば物理的パラメーターの安定化による生理学的なもの、またはその両方のいずれかである、増殖性障害の進行の阻害を指す。他の実施形態では、「治療する」、「治療」、および「治療すること」という用語は、腫瘍サイズまたはがん細胞計数の低減または安定化を指す。治療は、１００％である必要はなく、一部の実施形態では、疾患または障害の少なくとも１つの症状を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の低減または遅延が、これらの用語の範囲内とみなすのに十分である。
本明細書に使用される「不応性」とは、治療に応答しない疾患、例えばがんを指す。いくつかの実施形態では、不応性がんは、治療の前または開始時点で、治療に耐性であり得る。他の実施形態では、不応性がんは、治療中に不応性になる場合がある。
本明細書に使用される「再発」という用語は、初期応答期間（例えば、完全な応答または部分的な応答）後の疾患（例えば、がん）の再出現を指す。初期応答期間は、ある特定の閾値を下回る、例えば、２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％を下回る、がん細胞レベルの低下を伴い得る。再出現は、ある特定の閾値を上回る、例えば、２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％を上回る、がん細胞レベルの上昇を伴い得る。再発は、例えば、Cheson et al, J Clin Oncol 17:1244 (1999)およびCheson et al., "Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma", J Clin Oncol 25:579-586 (2007)（これらのいずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているＣｈｅｓｏｎ基準を使用して、特定することができる。例えば、例として、Ｂ−ＡＬＬの文脈において、完全な応答後、再出現は、例えば、血液、骨髄（５％超）、または任意の骨髄以外の部位における芽球の再出現を伴い得る。完全な応答は、この文脈において、５％未満のＢＭ芽球を伴い得る。より一般的に、ある実施形態では、応答（例えば、完全な応答または部分的な応答）は、検出可能なＭＲＤ（微小残存病変）の不在を伴い得る。ある実施形態では、初期応答期間は、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、もしくは６日間、少なくとも１週間、２週間、３週間、もしくは４週間、少なくとも１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、６ヶ月間、８ヶ月間、１０ヶ月間、もしくは１２ヶ月間、または少なくとも１年間、２年間、３年間、４年間、もしくは５年間持続する。
「シグナル伝達経路」という用語は、細胞の１つの部分から細胞の別の部分へのシグナル伝達において役割を果たす、様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係性を指す。「細胞表面受容体」という語句には、シグナルを受信し、細胞膜を超えてシグナルを伝達することができる、分子および分子の複合体が含まれる。
「対象」という用語は、免疫応答が誘起される生物（例えば、哺乳動物、ヒト）を含むことが意図される。
「実質的に精製された」細胞という用語は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞はまた、通常その細胞が天然の状態で関連している他の細胞型から分離されている細胞を指す。一部の事例では、実質的に精製された細胞の集団は、均質な細胞集団を指す。他の事例では、この用語は、単純に、細胞がその天然の状態で天然に関連している細胞から分離されているものを指す。一部の態様では、細胞は、インビトロで培養されている。他の態様では、細胞は、インビトロで培養されていない。
本発明の文脈において、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性障害抗原」または「過剰増殖性障害と関連する抗原」は、特定の過剰増殖性障害に共通している抗原を指す。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、原発性または転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝臓がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、および腺癌、例えば、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵臓がんなどが挙げられるがこれらに限定されないがんに由来する。
「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外来性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外来性核酸がトランスフェクトされたか、形質転換されたか、または形質導入されたものである。細胞には、初代細胞およびその子孫が含まれる。
「特異的に結合する」という用語は、試料中に存在する同族の結合パートナー（例えば、Ｔ細胞上に存在する刺激分子および／または共刺激分子）タンパク質を認識し、それに結合する、抗体またはリガンドを指すが、この抗体またはリガンドは、実質的に、試料中の他の分子の認識もそれとの結合も行わない。
範囲：本開示全体を通じて、本発明の様々な態様が、範囲形式で提示され得る。範囲形式での記述は、単に便宜上および簡潔さのためのものにすぎず、本発明の範囲に対する確固たる制限とみなされるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記述は、可能性のあるすべての部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものとみなすべきである。例えば、１〜６などの範囲の記述は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などといった部分範囲、ならびに、その範囲内の個々の数値、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６を具体的に開示したものとみなすべきである。別の例として、９５〜９９％の同一性などの範囲には、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するものが含まれ、９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％、および９８〜９９％の同一性などの部分範囲が含まれる。これは、範囲の広さに関しても当てはまる。
治療方法
一態様では、本開示は、本明細書に記載される腫瘍抗原の発現と関連する疾患を治療するための方法を提供する。
一態様では、本開示は、がん（例えば、ＡＬＬおよびＣＬＬなどの血液がん）の治療を、それを必要とする対象に、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を与えることによって行う方法を提供する。一実施形態では、治療されるがんは、Ｂ細胞悪性腫瘍である。一実施形態では、治療されるがんは、ＡＬＬ（急性リンパ芽球性白血病）、ＣＬＬ（慢性リンパ球性白血病）、ＤＬＢＣＬ（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）、ＭＣＬ（マントル細胞リンパ腫、またはＭＭ（多発性骨髄腫）である。
一態様では、本開示は、がん（例えば、ＡＬＬおよびＣＬＬなどの血液がん）の治療を、それを必要とする対象に、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を与えることによって行う方法であって、がん細胞がＣＤ１９を発現する、方法を提供する。一実施形態では、治療されるがんは、Ｂ細胞悪性腫瘍である。一実施形態では、治療されるがんは、ＡＬＬ（急性リンパ芽球性白血病）、ＣＬＬ（慢性リンパ球性白血病）、ＤＬＢＣＬ（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）、ＭＣＬ（マントル細胞リンパ腫）、ホジキンリンパ腫、またはＭＭ（多発性骨髄腫）である。
本開示は、一種の細胞療法であって、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）が、ＣＡＲを発現するように遺伝子修飾されており（例えば、レンチウイルスベクターの形質導入により）、このＣＡＲ発現細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される、細胞療法を含む。注入された細胞は、レシピエントにおいて腫瘍細胞を殺滅させることができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、インビボでの複製が可能であり、これにより、持続的な腫瘍制御につながり得る長期存続性が得られる。レンチウイルスベクターを使用して生成したＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）は、安定なＣＡＲ発現を有するであろう。様々な態様では、患者に投与される免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）またはそれらの子孫は、Ｔ細胞を患者に投与した後、少なくとも４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１４ヶ月間、１５ヶ月間、１６ヶ月間、１７ヶ月間、１８ヶ月間、１９ヶ月間、２０ヶ月間、２１ヶ月間、２２ヶ月間、２３ヶ月間、２年間、３年間、４年間、または５年間、患者に存続する。
本発明はまた、一種の細胞療法であって、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）が、例えば、インビトロ転写されたＲＮＡによって、ＣＡＲを一過的に発現するように修飾されており、このＣＡＲ発現細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される、細胞療法を含む。ＣＡＲ ＲＮＡの形質導入（例えば、トランスフェクションまたは電気穿孔による）によって生成されたＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、形質導入後４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、ＲＮＡ ＣＡＲを一過的に発現する。注入された細胞は、レシピエントにおいて腫瘍細胞を殺滅させることができる。したがって、様々な態様では、患者に投与される免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、Ｔ細胞を患者に投与した後、１ヶ月未満、例えば、３週間未満、２週間未満、１週間未満存在する。
一実施形態では、本開示は、がん（例えば、ＡＬＬおよびＣＬＬなどの血液がん）の治療を、それを必要とする対象に、本明細書に記載される腫瘍抗原（またはがん関連抗原）を特異的に標的とするかまたはそれに結合するＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を与えることによって行う方法を提供する。さらに別の実施形態では、治療の方法は、例えば、本明細書に記載されるナイーブＴ細胞を富化するように、ＣＡＲ発現細胞の作製を変化させることを含む。
一実施形態では、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、がん（例えば、ＡＬＬおよびＣＬＬなどの血液がん）を有する対象を治療するために、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するように操作されており、ここで、がん細胞は、ＣＤ１９を発現する。一実施形態では、治療されるがんは、ＡＬＬまたはＣＬＬである。免疫エフェクター細胞において発現されるＣＤ１９ ＣＡＲ分子は、完全ＣＡＲコンストラクトを生成するように、当該技術分野における任意の抗ＣＤ１９抗原結合性ドメイン（例えば、表１または４に提供されるもの）を、本明細書に記載されるＣＡＲドメインのうちのいずれかと組み合わせて含み得る。例えば、完全ＣＡＲコンストラクトは、表４に列挙されるＣＡＲである。表４は、本明細書に記載される様々なＣＡＲドメイン（例えば、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン）ならびに表１または４に列挙される抗ＣＤ１９抗原結合性ドメインを使用して生成された、例示的な完全ＣＤ１９ ＣＡＲコンストラクトを提供する。アミノ酸配列は（ａａ）と表記され、核酸配列は（ｎｔ）と表記される。
一態様では、本開示は、がん、例えば、ＣＤ１９発現と関連するがんを、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）療法を用いて治療するための方法を提供する。例示的ながんとしては、例えば、例えば、Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、ＡＬＬを含むがこれらに限定されない１つまたは複数の急性白血病、例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含むがこれらに限定されない１つまたは複数の慢性白血病が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書に記載される方法を用いて治療することができるさらなるがんまたは血液状態としては、例えば、Ｂ細胞性前骨髄球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞性白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、ならびに骨髄血液細胞の無効な産生（または異形成）などによってまとめられる、血液状態の多様な集合である「前白血病」が挙げられるがこれらに限定されない。
前述の血液状態は、ＣＤ１９の発現と関連している場合がある。さらに、ＣＤ１９の発現と関連する疾患としては、例えば、ＣＤ１９の発現と関連する、異型および／または非古典的ながん、悪性腫瘍、前がん状態、または増殖性疾患が挙げられるがこれらに限定されない。
一実施形態では、本開示は、ＣＬＬを治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本開示は、ＡＬＬを治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本開示は、Ｂ細胞性ＡＬＬを治療するための方法を提供する。
一態様では、本開示は、がん（例えば、ＡＬＬおよびＣＬＬなどの血液がん）を有する対象を、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）［例えば、例としてＣＴＬ０１９など、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）］を用いて治療する方法を提供する。ある実施形態では、本開示は、対象を、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を別の治療剤、例えば、本明細書に記載される別の治療剤［例えば、別のＣＡＲ、例えば、本明細書に記載される別のＣＡＲ、阻害性ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載される阻害性ＣＡＲ；化学療法；キナーゼ阻害剤（例えば、本明細書に記載されるキナーゼ阻害剤、例えば、ｍＴＯＲ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤）、チェックポイント阻害剤、例えば、本明細書に記載されるチェックポイント阻害剤、治癒療法の標準物など］と組み合わせて用いて治療する方法を提供する。組合せは、例えば、本明細書に記載される任意の薬剤とのものであり得る。
一部の実施形態では、対象におけるがんの治療は、本明細書に記載されるＣＡＲ療法を、１つまたは複数の化学療法サイクルと組み合わせて投与することを含む。いくつかの実施形態では、例示的な化学療法サイクルには、寛解導入、地固め、中間維持、後期強化、および維持が含まれる。
一部の実施形態では、第１の化学療法サイクルは、寛解導入であり、ここでの目標は、可能な限り多数のがん性細胞を消失させることである。いくつかの実施形態では、白血病（例えば、ＡＬＬ）を患う対象において、寛解導入サイクルは、１つまたは複数の薬物、例えば、ビンクリスチン、デキサメタゾン、および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−Ｌ−アスパラギナーゼでの治療を含む。ある実施形態では、白血病（例えば、ＡＬＬ、例えば、標準リスクのＡＬＬ）を患う対象において、寛解導入サイクルは、ビンクリスチン、デキサメタゾン、およびＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼを、例えば、それぞれ、６ｍｇ／ｍ２、６ｍｇ／ｍ２、および２５００Ｕ／ｍ２の用量で用いた治療を含む。ある実施形態では、白血病（例えば、ＡＬＬ、例えば、高リスクのＡＬＬ）を患う対象において、寛解導入サイクルは、ビンクリスチン、デキサメタゾン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、およびダウノルビシンを、例えば、それぞれ、６ｍｇ／ｍ２、６ｍｇ／ｍ２、および２５００Ｕ／ｍ２、ならびに１００ｍｇ／ｍ２の用量で用いた治療を含む。
いくつかの実施形態では、さらなる化学療法サイクルは、地固めであり、ここでの目標は、残存する任意のがん性細胞を破壊することである。一部の実施形態では、地固めサイクルは、寛解導入サイクルの後に寛解が達成された後、対象に与えられる。いくつかの実施形態では、白血病（例えば、ＡＬＬ）を患う対象において、地固めサイクルは、１つまたは複数の薬物、例えば、ビンクリスチン、６−メルカプトプリン、シクロホスファミド、シタラビン、および／またはＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼでの治療を含む。ある実施形態では、白血病（例えば、ＡＬＬ、例えば、標準リスクのＡＬＬ）を患う対象において、地固めサイクルは、ビンクリスチンおよび６−メルカプトプリンを、例えば、それぞれ、１．５ｍｇ／ｍ２、および７５ｍｇ／ｍ２の用量で用いた治療を含む。ある実施形態では、白血病（例えば、ＡＬＬ、例えば、高リスクのＡＬＬ）を患う対象において、地固めサイクルは、ビンクリスチン、６−メルカプトプリン、シクロホスファミド、シタラビン、およびＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼを、例えば、それぞれ、１．５ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、１ｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、および２５００ｍｇ／ｍ２の用量で用いた治療を含む。
いくつかの実施形態では、さらなる化学療法サイクルは、維持サイクルを含み、その場合の目標は、がん再発の長期リスクを低減することであるか、または中間維持サイクルを含み、その場合の目標は、強力な治療からの休止を提供することである。いくつかの実施形態では、中間維持サイクルは、寛解導入の後、および一部の事例では地固めの後に行われる。いくつかの実施形態では、中間維持サイクルは、後期強化サイクルの前に行われる。一部の実施形態では、中間維持サイクルは、後期強化サイクルの後に行われる。いくつかの実施形態では、維持サイクルは、例えば、寛解導入、地固め、中間維持、および／または後期強化の後の、最後の化学療法サイクルである。一部の実施形態では、白血病（例えば、ＡＬＬ、例えば、標準リスクのＡＬＬ）を患う対象において、中間維持サイクルは、ビンクリスチンおよびメトトレキサートを、例えば、それぞれ、７．５ｍｇ／ｍ２、および５００ｍｇ／ｍ２の用量で用いた治療を含む。一部の実施形態では、白血病（例えば、ＡＬＬ、例えば、高リスクのＡＬＬ）を患う対象において、中間維持サイクルは、ビンクリスチン、メトトレキサート、および６−メルカプトプリンを、例えば、それぞれ、７．５ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、および２５ｍｇ／ｍ２の用量で用いた治療を含む。いくつかの実施形態では、白血病（例えば、ＡＬＬ、例えば、標準リスクのＡＬＬ）を患う対象において、維持サイクルは、ビンクリスチン、デキサメタゾン、６−メルカプトプリン、およびメトトレキサートを、例えば、それぞれ、１．５ｍｇ／ｍ２、６ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、および２０ｍｇ／ｍ２の用量で用いた治療を含む。いくつかの実施形態では、白血病（例えば、ＡＬＬ、例えば、高リスクのＡＬＬ）を患う対象において、維持サイクルは、ビンクリスチン、プレドニゾン、６−メルカプトプリン、およびメトトレキサートを、例えば、それぞれ、１．５ｍｇ／ｍ２、４０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、および２０ｍｇ／ｍ２の用量で用いた治療を含む。
いくつかの実施形態では、さらなる化学療法サイクルは、後期強化サイクルを含み、ここでの目標は、残存する任意のがん性細胞を消失させることである。いくつかの実施形態では、後期強化サイクルは、地固めサイクルの後、および例えば中間維持サイクルの後に行われる。いくつかの実施形態では、白血病（例えば、ＡＬＬ、例えば、標準リスクのＡＬＬ）を患う対象において、後期強化サイクルは、ビンクリスチン、デキサメタゾン、ドキソルビシン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、および６−チオグアニンを、例えば、それぞれ、４．５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、２５００Ｕ／ｍ２、１ｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、および６０ｍｇ／ｍ２の用量で用いた治療を含む。いくつかの実施形態では、白血病（例えば、ＡＬＬ、例えば、高リスクのＡＬＬ）を患う対象において、後期強化サイクルは、ビンクリスチン、デキサメタゾン、ドキソルビシン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、および６−チオグアニンを、例えば、それぞれ、７．５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、５０００Ｕ／ｍ２、１ｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、および６０ｍｇ／ｍ２の用量で用いた治療を含む。
一部の実施形態では、対象は、例えば、生存を最大にしながら毒性を最小限に抑えるために、リスク測定値に基づいて様々な強度の化学療法レジメンを用いて治療される。いくつかの実施形態では、例えば、ＡＬＬ（例えば、小児ＡＬＬ）を有する対象は、例として、白血球計数および年齢に基づいて、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）のリスク群分類に基づいて、標準リスクの群または高リスクの群に類別される。例えば、Smith et al. J. Clin. Oncol. 14.1(1996):18-24を参照されたい。例えば、対象は、白血球計数が、１マイクロリットル当たり５０，０００個未満の細胞であり、対象が１歳〜１０歳である場合、標準リスクの群に類別される。例えば、対象は、白血球計数が、１マイクロリットル当たり５０，０００個以上の細胞である、かつ／または対象が１０歳以上である場合、高リスクの群に類別される。いくつかの実施形態では、例えば、ＡＬＬ（例えば、小児ＡＬＬ）を有する対象は、Moeriche et al. Blood 111.9(2008):4477-89およびPui et al. Blood 92.2(1998):411-5に記載されているように、非常に高リスクの群に類別される。例えば、次の特徴のうちの１つまたは複数を有するＡＬＬ対象は、非常に高リスクのＡＬＬとして分類される：幼児である対象；有害な染色体異常（例えば、ｔ（９；２２）、ＭＬＬ遺伝子再編成、および低二倍性（染色体数＜４４）を有する対象；最初の療法に対して遅い初期応答を有する対象；寛解導入サイクルの終わりまたはその後のサイクルで微小残存病変（ＭＲＤ）レベルが高い対象；寛解導入サイクルの後に形態学的に存続する疾患を有する対象。
ある実施形態では、ＣＬＬの標準的なケアとしては、本明細書に記載される例示的な治療法、例えば、表５に記載されるもの、およびそれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。
Figure 2022002525
ある実施形態では、ＣＬＬの標準的なケアとしては、（１）照射療法、（２）化学療法、（３）外科手術（例えば、脾臓の摘出）、（４）標的化療法、（５）幹細胞移植、およびこれらの組合せが挙げられる。ある実施形態では、標準的なケアは、外照射療法を含む。ある実施形態では、標準的なケアは、内照射療法（例えば、例としてがん内またはその付近に直接入れられる、針、ワイヤ、またはカテーテルに封入された放射性物質）を含む。
ある実施形態では、ＡＬＬの標準的なケアとしては、本明細書に記載される例示的な治療法、例えば、表６に記載されるもの、およびそれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。
Figure 2022002525
ある実施形態では、ＡＬＬの標準的なケアとしては、（１）化学療法、（２）照射療法、（３）幹細胞移植、（４）生物療法、（５）標的化療法、およびこれらの組合せが挙げられる。
ある実施形態では、標準的なケアとしては、フルダラビンとシクロホスファミド（ＦＣ）；フルダラビンとリツキシマブ（ＦＲ）；フルダラビン、シクロホスファミド、およびリツキシマブ（ＦＣＲ）；シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン（ＣＨＯＰ）；ならびにこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。使用が考えられる一般的な化学療法剤としては、アナストロゾール［Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標）］、ビカルタミド［Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標）］、硫酸ブレオマイシン［Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標）］、ブスルファン［Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標）］、ブスルファン注射［Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）］、カペシタビン［Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）］、Ｎ４−ペンタオキシカルボニル（ｐｅｎｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン［Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）］、カルムスチン［ＢｉＣＮＵ（登録商標）］、クロラムブシル［Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標）］、シスプラチン［Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）］、クラドリビン［Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標）］、シクロホスファミド［Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（登録商標）］、シタラビン、シトシンアラビノシド［Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標）］、シタラビンリポソーム注射［ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標）］、ダカルバジン［ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標）］、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ）、ダウノルビシン塩酸塩［Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標）］、ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム注射［ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標）］、デキサメタゾン、ドセタキセル［Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）］、ドキソルビシン塩酸塩［Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標）］、エトポシド［Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標）］、リン酸フルダラビン［Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標）］、５−フルオロウラシル［Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標）］、フルタミド［Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標）］、テザシチビン（ｔｅｚａｃｉｔｉｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシ尿素［Ｈｙｄｒｅａ（登録商標）］、イダルビシン［Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）］、イホスファミド［ＩＦＥＸ（登録商標）］、イリノテカン［Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標）］、Ｌ−アスパラギナーゼ［ＥＬＳＰＡＲ（登録商標）］、ロイコボリンカルシウム、メルファラン［Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標）］、６−メルカプトプリン［Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標）］、メトトレキサート［Ｆｏｌｅｘ（登録商標）］、ミトキサントロン［Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標）］、マイロターグ（ｍｙｌｏｔａｒｇ）、パクリタキセル［Ｔａｘｏｌ（登録商標）］、フェニックス（ｐｈｏｅｎｉｘ）（イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、カルムスチンインプラントを有するポリフェプロサン２０［Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標）］、クエン酸タモキシフェン［Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標）］、テニポシド［Ｖｕｍｏｎ（登録商標）］、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン［Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標）］、注射用トポテカン塩酸塩［Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標）］、ビンブラスチン［Ｖｅｌｂａｎ（登録商標）］、ビンクリスチン［Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標）］、ビノレルビン［Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標）］、およびこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。
ある実施形態では、化学療法は、葉酸アンタゴニスト（本明細書において抗葉酸剤とも称される）、ピリミジン類似体、プリン類似体、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤）：メトトレキサート［Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（登録商標）、Ｔｒｅｘａｌｌ（登録商標）］、５−フルオロウラシル［Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標）、Ｆｌｕｏｒｏｐｌｅｘ（登録商標）］、フロクスウリジン［ＦＵＤＦ（登録商標）］、シタラビン［Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標）、Ｔａｒａｂｉｎｅ ＰＦＳ］、６−メルカプトプリン［Ｐｕｒｉ−Ｎｅｔｈｏｌ（登録商標）］］、６−チオグアニン［Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ Ｔａｂｌｏｉｄ（登録商標）］、リン酸フルダラビン［Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標）］、ペントスタチン［Ｎｉｐｅｎｔ（登録商標）］、ペメトレキセド［Ａｌｉｍｔａ（登録商標）］、ラルチトレキシド［Ｔｏｍｕｄｅｘ（登録商標）］、クラドリビン［Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標）］、クロファラビン［Ｃｌｏｆａｒｅｘ（登録商標）、Ｃｌｏｌａｒ（登録商標）］、シタラビンリポソーム（Ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ）［リポソームＡｒａ−Ｃ、ＤｅｐｏＣｙｔ（商標）としても既知］、デシタビン［Ｄａｃｏｇｅｎ（登録商標）］；ヒドロキシ尿素［Ｈｙｄｒｅａ（登録商標）、Ｄｒｏｘｉａ（商標）およびＭｙｌｏｃｅｌ（商標）］；メルカプトプリン［Ｐｕｒｉ−Ｎｅｔｈｏｌ（登録商標）］、プララトレキサート［Ｆｏｌｏｔｙｎ（商標）］；カペシタビン［Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）］、ネララビン［Ａｒｒａｎｏｎ（登録商標）］、アザシチジン［Ｖｉｄａｚａ（登録商標）］、およびゲムシタビン［Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）］を含むがこれらに限定されない、抗体謝剤を含む。好ましい抗代謝剤としては、例えば、５−フルオロウラシル［Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標）、Ｆｌｕｏｒｏｐｌｅｘ（登録商標）］、フロクスウリジン［ＦＵＤＦ（登録商標）］、カペシタビン［Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）］、ペメトレキセド［Ａｌｉｍｔａ（登録商標）］、ラルチトレキシド［Ｔｏｍｕｄｅｘ（登録商標）］、およびゲムシタビン［Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）］、ならびにこれらの組合せが挙げられる。ある実施形態では、プリン類似体は、フルダラビンである。
ある実施形態では、化学療法は、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素およびトリアゼン、ウラシルマスタード［Ａｍｉｎｏｕｒａｃｉｌ Ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ（登録商標）、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｎｏｒｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ（登録商標）］、クロルメチン［Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標）］、シクロホスファミド［Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｃｌａｆｅｎ（登録商標）、Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標）］、イホスファミド［Ｍｉｔｏｘａｎａ（登録商標）］、メルファラン［Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標）］、クロラムブシル［Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標）］、ピポブロマン［Ａｍｅｄｅｌ（登録商標）、Ｖｅｒｃｙｔｅ（登録商標）］、トリエチレンメラミン［Ｈｅｍｅｌ（登録商標）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）、Ｈｅｘａｓｔａｔ（登録商標）］、トリエチレンチオホスホラミン、テモゾロミド［Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）］、チオテパ［Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標）］、ブスルファン［Ｂｕｓｉｌｖｅｘ（登録商標）、Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標）］、カルムスチン［ＢｉＣＮＵ（登録商標）］、ロムスチン［ＣｅｅＮＵ（登録商標）］、ストレプトゾシン［Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標）］、およびダカルバジン［ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標）］、ならびにこれらに組合せを含むがこれらに限定されない、アルキル化剤を含む。さらなる例示的なアルキル化剤としては、限定することなく、オキサリプラチン［Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標）］、テモゾロミド［Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）およびＴｅｍｏｄａｌ（登録商標）］、ダクチノマイシン［アクチノマイシン−Ｄ、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標）としても既知］、メルファラン［Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシン、およびフェニルアラニンマスタード、Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標）としても既知］、アルトレタミン［ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）としても既知］、カルムスチン［ＢｉＣＮＵ（登録商標）］、ベンダムスチン［Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標）］、ブスルファン［Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）およびＭｙｌｅｒａｎ（登録商標）］、カルボプラチン［Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）］、ロムスチン［ＣＣＮＵ、ＣｅｅＮＵ（登録商標）としても既知］、シスプラチン［ＣＤＤＰ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）、およびＰｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）−ＡＱとしても既知）、クロラムブシル［Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標）］、シクロホスファミド［Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）およびＮｅｏｓａｒ（登録商標）］、ダカルバジン［ＤＴＩＣ、ＤＩＣ、およびイミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標）としても既知）、アルトレタミン［ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）としても既知］、イホスファミド［Ｉｆｅｘ（登録商標）］、プレドヌムスチン（Ｐｒｅｄｎｕｍｕｓｔｉｎｅ）、プロカルバジン［Ｍａｔｕｌａｎｅ（登録商標）］、メクロレタミン［ナイトロジェンマスタード、ムスチン、およびメクロレタミン塩酸塩、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標）としても既知］、ストレプトゾシン［Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標）］、チオテパ［チオホスホアミド（Ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｅ）、ＴＥＳＰＡ、およびＴＳＰＡ、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標）としても既知）、シクロホスファミド［Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（登録商標）］、ベンダムスチンＨＣｌ［Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標）］、ならびにこれらの組合せが挙げられる。ある実施形態では、アルキル化剤は、ベンダムスチンである。ある実施形態では、アルキル化剤は、シクロホスファミドである。
ある実施形態では、化学療法剤は、キナーゼ阻害剤、例えば、エルロチニブ塩酸塩［Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）］、リニファニブ［ＡＢＴ ８６９としても既知であり、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから入手可能なＮ−［４−（３−アミノ−１Ｈ−インダゾール−４−イル）フェニル］−Ｎ’−（２−フルオロ−５−メチルフェニル）尿素］、リンゴ酸スニチニブ［Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）］、ボスチニブ［ＳＫＩ−６０６としても既知であり、米国特許第６，７８０，９９６号に記載されている、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−メトキシ−７−［３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロポキシ］キノリン−３−カルボニトリル］、ダサチニブ［Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標）］、パゾパニブ［Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（登録商標）］、ソラフェニブ［Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）］、ザクチマ（ｚａｃｔｉｍａ）（ＺＤ６４７４）、ならびにイマチニブまたはメシル酸イマチニブ［Ｇｉｌｖｅｃ（登録商標）およびＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）］が含まれるがこれらに限定されない、チロシンキナーゼ阻害剤である。一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）、ＧＤＣ−０８３４、ＲＮ−４８６、ＣＧＩ−５６０、ＣＧＩ−１７６４、ＨＭ−７１２２４、ＣＣ−２９２、ＯＮＯ−４０５９、ＣＮＸ−７７４、およびＬＦＭ−Ａ１３から選択される、ＢＴＫ阻害剤である。一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、アロイシンＡ、フラボピリドールまたはＨＭＲ−１２７５、２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−［（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル］−４−クロメノン、クリゾチニブ（ＰＦ−０２３４１０６６、２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−［（２Ｒ，３Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−１−メチル−３−ピロリジニル］−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、塩酸塩（Ｐ２７６−００）、１−メチル−５−［［２−［５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−４−ピリジニル］オキシ］−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン（ＲＡＦ２６５）、インジスラム（Ｅ７０７０）、ロスコビチン（ＣＹＣ２０２）、パルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）、ジナシクリブ（ｄｉｎａｃｉｃｌｉｂ）（ＳＣＨ７２７９６５）、Ｎ−［５−［［（５−ｔｅｒｔ−ブチルオキサゾール−２−イル）メチル］チオ］チアゾール−２−イル］ピペリジン−４−カルボキサミド（ＢＭＳ ３８７０３２）、４−［［９−クロロ−７−（２，６−ジフルオロフェニル）−５Ｈ−ピリミド［５，４−ｄ］［２］ベンザゼピン−２−イル］アミノ］−安息香酸（ＭＬＮ８０５４）、５−［３−（４，６−ジフルオロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イル］−Ｎ−エチル−４−メチル−３−ピリジンメタンアミン（ＡＧ−０２４３２２）、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸Ｎ−（ピペリジン−４−イル）アミド（ＡＴ７５１９）、４−［２−メチル−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］−Ｎ−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−２−ピリミジンアミン（ＡＺＤ５４３８）、およびＸＬ２８１（ＢＭＳ９０８６６２）から選択される、ＣＤＫ４阻害剤である。一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＣＧＰ０５２０８８、４−アミノ−３−（ｐ−フルオロフェニルアミノ）−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（ＣＧＰ５７３８０）、セルコスポラミド、ＥＴＣ−１７８０４４５−２、および４−アミノ−５−（４−フルオロアニリノ）−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンから選択される、ＭＮＫ阻害剤である。
ある実施形態では、標的化療法としては、抗ＣＤ２０抗体またはその機能的断片、例えば、リツキシマブ［Ｒｉｕｘａｎ（登録商標）およびＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）］、トシツモマブ［Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）］、およびオファツムマブ［Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標）］、ならびにこれらの組合せなどが挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、標的化療法としては、抗ＣＤ５２抗体またはその機能的断片、例えば、アレムツズマブ［Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）］が挙げられるこれらに限定されない。
ある実施形態では、生物療法は、免疫療法を含む。例示的なアントラサイクリンとしては、限定することなく、ドキソルビシン［Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）およびＲｕｂｅｘ（登録商標）］、ブレオマイシン［ｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標）］、ダウノルビシン［ダウノルビシン塩酸塩、ダウノマイシン、およびルビドマイシン塩酸塩、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標）］、ダウノルビシンリポソーム［ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標）］、ミトキサントロン［ＤＨＡＤ、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標）］、エピルビシン［Ｅｌｌｅｎｃｅ（商標）］、イダルビシン［Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｉｄａｍｙｃｉｎ ＰＦＳ（登録商標）］、マイトマイシンＣ［Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標）］、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、ラビドマイシン、デスアセチルラビドマイシン、ならびにこれらの組合せが挙げられる。
ある実施形態では、幹細胞移植は、自己（ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）幹細胞移植を含む。ある実施形態では、幹細胞移植は、同種幹細胞移植を含む。ある実施形態では、幹細胞移植は、同種骨髄移植を含む。ある実施形態では、幹細胞移植は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を含む。ある実施形態では、造血幹細胞は、骨髄、末梢血、臍帯血、およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない、様々な組織に由来する。
一態様では、本開示は、ＣＤ１９の発現と関連する疾患を治療するための方法を提供する。一態様では、本発明は、腫瘍の一部がＣＤ１９に関して陰性であり、腫瘍の一部がＣＤ１９に関して陽性である、疾患を治療するための方法を提供する。例えば、提供される方法は、ＣＤ１９の発現増加と関連する疾患の治療を受けた対象を治療するのに有用であり、ここで、ＣＤ１９レベルの上昇に対する治療を受けた対象は、ＣＤ１９レベルの上昇と関連する疾患を呈する。
一態様では、提供される方法は、哺乳動物細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）での発現のためのプロモーターに作動可能に連結されたＣＤ１９ ＣＡＲを含むベクターを含む。一態様では、提供される方法は、ＣＤ１９発現腫瘍を治療するのに使用するためのＣＤ１９ ＣＡＲを発現する組換え細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を含み、ここで、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する組換えＴ細胞は、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞と称される。一態様では、提供される方法に従って投与されるＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、腫瘍細胞を、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞の表面に発現する少なくとも１つのＣＤ１９ ＣＡＲと接触させることができ、その結果、ＣＡＲ発現細胞は、腫瘍細胞を標的とし、腫瘍の成長が阻害される。
一態様では、本開示は、ＣＤ１９を発現する腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、腫瘍細胞を、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）と接触させ、結果として、ＣＡＲ発現細胞が、抗原に応答して活性化され、がん細胞を標的とし、腫瘍の成長が阻害されることを含む方法を特徴とする。
一態様では、本開示は、一種の細胞療法であって、Ｔ細胞が、ＣＡＲを発現するように遺伝子修飾されており、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）が、それを必要とするレシピエントに注入される、細胞療法を含む。注入された細胞は、レシピエントにおいて腫瘍細胞を殺滅させることができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ修飾細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）は、インビボでの複製が可能であり、これにより、持続的な腫瘍制御につながり得る長期存続性が得られる。様々な態様では、患者に投与される細胞またはそれらの子孫は、細胞を患者に投与した後、少なくとも４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１４ヶ月間、１５ヶ月間、１６ヶ月間、１７ヶ月間、１８ヶ月間、１９ヶ月間、２０ヶ月間、２１ヶ月間、２２ヶ月間、２３ヶ月間、２年間、３年間、４年間、または５年間、患者に存続する。
本開示はまた、一種の細胞療法であって、細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）が、例えば、インビトロ転写されたＲＮＡによって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を一過的に発現するように修飾されており、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）が、それを必要とするレシピエントに注入される、細胞療法を含む。注入された細胞は、レシピエントにおいて腫瘍細胞を殺滅させることができる。したがって、様々な態様では、患者に投与される細胞は、細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を患者に投与した後、１ヶ月未満、例えば、３週間未満、２週間未満、１週間未満存在する。
任意の特定の理論に束縛されることを望むものではないが、ＣＡＲ修飾細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）によって誘起される抗腫瘍免疫応答は、能動免疫応答もしくは受動免疫応答であり得るか、または代替として、直接的対間接的免疫応答に起因するものであってもよい。一態様では、ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞は、ＣＤ１９を発現するヒトがん細胞に応答して、特異的炎症促進性サイトカイン分泌および強力な細胞溶解活性を呈し、可溶性ＣＤ１９阻害に抵抗し、バイスタンダー殺滅を媒介し、確立されたヒト腫瘍の縮退を媒介する。例えば、ＣＤ１９発現腫瘍の不均一領域内の、抗原がない腫瘍細胞は、以前に隣接する抗原陽性がん細胞に対して反応したＣＤ１９再指向型Ｔ細胞による間接的な破壊を受けやすい可能性がある。
一態様では、本明細書に記載される完全ヒトＣＡＲ修飾細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、哺乳動物におけるエキソビボ免疫付与および／またはインビボ療法のための一種のワクチンであり得る。一態様では、哺乳動物は、ヒトである。
エキソビボ免疫付与に関して、次のうちの少なくとも１つが、細胞を対象に投与する前に起こる：ｉ）細胞の増殖、ｉｉ）細胞へのＣＡＲをコードする核酸の導入、またはｉｉｉ）細胞の凍結保存。
エキソビボ手順は、当該技術分野で既知であり、以下により詳細に説明されている。簡単に述べると、細胞を、対象（例えば、ヒト）から単離し、本明細書に開示されるＣＡＲを発現するベクターで遺伝子修飾する（すなわち、インビトロで形質導入またはトランスフェクトする）。ＣＡＲ修飾細胞を、哺乳動物レシピエントに投与して、治療的利点を得ることができる。哺乳動物レシピエントはヒトであってもよく、ＣＡＲ修飾細胞は、レシピエントに対して自家であり得る。代替として、細胞は、レシピエントに対して同種、同系、または異種であってもよい。
血液がん
血液がん状態は、血液、骨髄、およびリンパ系に罹患する、白血病および悪性リンパ球増殖性状態などの種類のがんである。
白血病は、急性白血病および慢性白血病として分類することができる。急性白血病は、さらに、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）として分類することができる。慢性白血病には、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）が含まれる。他の関連状態としては、骨髄血液細胞の無効な産生（または異形成）およびＡＭＬへの転換のリスクによってまとめられる、血液状態の多様な集合である、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、以前は「前白血病」として知られていた）が挙げられる。
本開示は、がんを治療するための組成物および方法を提供する。一態様では、がんは、白血病またはリンパ腫を含むがこれらに限定されない血液がんである。一態様では、本発明のＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、例えば、例としてＢ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、ＡＬＬを含むがこれらに限定されない急性白血病、例えば、ＣＭＬ、ＣＬＬを含むがこれに限定されない１つまたは複数の慢性白血病、例えば、Ｂ細胞性前骨髄球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞性白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、ならびに骨髄血液細胞の無効な産生（または異形成）などによってまとめられる、血液状態の多様な集合である「前白血病」を含むがこれらに限定されないさらなる血液がんまたは血液状態といった、がんならびに悪性腫瘍を治療するために使用することができる。
本開示はまた、ＣＤ１９発現細胞集団の増殖を阻害するかまたはそれを減少させるための方法であって、ＣＤ１９発現細胞を含む細胞集団を、ＣＤ１９発現細胞に結合する本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）と接触させることを含む方法を提供する。具体的な態様では、本開示は、ＣＤ１９を発現するがん細胞集団の増殖を阻害するかまたはそれを減少させるための方法であって、ＣＤ１９発現がん細胞集団を、ＣＤ１９発現細胞に結合する本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）と接触させることを含む方法を提供する。一態様では、本開示は、ＣＤ１９を発現するがん細胞集団の増殖を阻害するかまたはそれを減少させるための方法であって、ＣＤ１９発現がん細胞集団を、ＣＤ１９発現細胞に結合する本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）と接触させることを含む方法を提供する。ある特定の態様では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、骨髄性白血病またはＣＤ１９発現細胞と関連する別のがんを有する対象またはその動物モデルにおいて、陰性対照と比較して、細胞および／またはがん細胞の数量、数、量、または割合を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％減少させる。一態様では、対象は、ヒトである。
本開示はまた、ＣＤ１９発現細胞と関連する疾患（例えば、血液がんまたはＣＤ１９を発現する異型のがん）を予防、治療、および／または管理するための方法であって、必要のある対象に、ＣＤ１９発現細胞に結合する本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を投与することを含む方法を提供する。一態様では、対象は、ヒトである。ＣＤ１９発現細胞と関連する障害の非限定的な例としては、自己免疫障害（ループスなど）、炎症性障害（アレルギーおよび喘息など）、ならびにがん（血液がんまたはＣＤ１９を発現する異型のがん）が挙げられる。
本開示はまた、ＣＤ１９発現細胞と関連する疾患を予防、治療、および／または管理するための方法であって、必要のある対象に、ＣＤ１９発現細胞に結合する本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を投与することを含む方法を提供する。一態様では、対象は、ヒトである。
本開示は、ＣＤ１９発現細胞と関連するがん（例えば、ＡＬＬおよびＣＬＬなどの血液がん）の再発を予防するための方法であって、それを必要とする対象に、ＣＤ１９発現細胞に結合する本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を投与することを含む方法を提供する。一態様では、本方法は、それを必要とする対象に、有効量の別の治療薬と組み合わせて、有効量の、ＣＤ１９発現細胞に結合する本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を投与することを含む。
組合せ療法
上述および本明細書に記載される任意のがん療法は、本明細書に記載されるがんの症状を治療および／または低減するために、１つまたは複数の追加の治療薬と組み合わせて投与してもよいことが理解される。医薬組成物は、１つまたは複数の他の追加の治療薬または治療剤と同時に、その前に、またはその後で、投与され得る。ある実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、他の既知の薬剤および治療薬と組み合わせて使用することができる。「組み合わせて」投与されるとは、本明細書に使用されるとき、２つ（またはそれ以上）の異なる治療が、対象の障害に伴う一連の苦痛の間に対象にデリバリーされること、例えば、対象が障害と診断された後かつ障害が治癒もしくは消失される前または治療が他の理由により終了する前に、２種類以上の治療がデリバリーされることを意味する。一部の実施形態では、１つの治療のデリバリーは、２つ目のデリバリーが開始するときに依然として生じており、そのため、投与に関して、重複が存在する。これは、本明細書において、「同時」または「並行デリバリー」と称されることがある。他の実施形態では、一方の治療のデリバリーは、他方の治療のデリバリーが開始する前に終了する。いずれの事例でも一部の実施形態では、治療は、投与を組み合わせたため、より有効である。例えば、第２の治療がより有効であり、例えば、第２の治療を第１の治療なしで投与した場合、または類似の状況が第１の治療で見出される場合に、より少ない第２の治療で同等の効果が見出されるか、または第２の治療が症状を低減させる程度がより大きい。一部の実施形態では、デリバリーは、症状、または障害に関連する他のパラメーターにおける低減が、一方の治療を他方が存在しない状態でデリバリーした場合に観察されるであろうものよりも大きくなるようなものである。２種類の治療の効果は、部分的に相加性、全体的に相加性、または相加性を上回るものであってもよい。デリバリーは、デリバリーされる第１の治療の効果が、第２のものがデリバリーされたときに依然として検出可能となるようなものであり得る。
本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞および少なくとも１つの追加の治療剤は、同じかもしくは別個の組成物において同時に投与されてもよく、または逐次投与されてもよい。逐次投与については、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞がまず投与され得、追加の薬剤が２番目に投与され得るか、または投与の順序は逆であってもよい。
さらなる態様では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、外科手術、化学療法、照射、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、およびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫吸着剤、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、または他の抗体治療薬、細胞毒素、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および放射線照射ペプチドワクチン、例えば、Izumoto et al. 2008 J NEUROSURG 108:963-971.に記載されているものと組み合わせた治療レジメンにおいて使用され得る。
一実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、化学療法剤と組み合わせて使用することができる。例示的な化学療法剤としては、アントラサイクリン［例えば、ドキソルビシン（例えば、リポソームドキソルビシン）］、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、アルキル化剤（例えば、ベンダムスチン、シクロホスファミド、デカルバジン、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミド）、免疫細胞抗体（例えば、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ）、抗代謝剤［例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えば、フルダラビン）を含む］、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘導型ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）アゴニスト、プロテアソーム阻害剤（例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシン、またはボルテゾミブ）、サリドマイドまたはサリドマイド誘導体（例えば、レナリドマイド）などの免疫調節剤、ならびにこれらの組合せが挙げられる。
組合せ療法における使用が考えられる一般的な化学療法剤としては、アナストロゾール［Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標）］、ビカルタミド［Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標）］、硫酸ブレオマイシン［Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標）］、ブスルファン［Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標）］、ブスルファン注射［Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）］、カペシタビン［Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）］、Ｎ４−ペンタオキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン［Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）］、カルムスチン［ＢｉＣＮＵ（登録商標）］、クロラムブシル［Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標）］、シスプラチン［Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）］、クラドリビン［Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標）］、シクロホスファミド［Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（登録商標）］、シタラビン、シトシンアラビノシド［Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標）］、シタラビンリポソーム注射［ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標）］、ダカルバジン［ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標）］、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ）、ダウノルビシン塩酸塩［Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標）］、ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム注射［ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標）］、デキサメタゾン、ドセタキセル［Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）］、ドキソルビシン塩酸塩［Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標）］、エトポシド［Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標）］、リン酸フルダラビン［Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標）］、５−フルオロウラシル［Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標）］、フルタミド［Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標）］、テザシチビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシ尿素［Ｈｙｄｒｅａ（登録商標）］、イダルビシン［Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）］、イホスファミド［ＩＦＥＸ（登録商標）］、イリノテカン［Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標）］、Ｌ−アスパラギナーゼ［ＥＬＳＰＡＲ（登録商標）］、ロイコボリンカルシウム、メルファラン［Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標）］、６−メルカプトプリン［Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標）］、メトトレキサート［Ｆｏｌｅｘ（登録商標）］、ミトキサントロン［Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標）］、マイロターグ、パクリタキセル［Ｔａｘｏｌ（登録商標）］、フェニックス（イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、カルムスチンインプラントを有するポリフェプロサン２０［Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標）］、クエン酸タモキシフェン［Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標）］、テニポシド［Ｖｕｍｏｎ（登録商標）］、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン［Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標）］、注射用トポテカン塩酸塩［Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標）］、ビンブラスチン［Ｖｅｌｂａｎ（登録商標）］、ビンクリスチン［Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標）］、およびビノレルビン［Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標）］が挙げられる。
例示的なアルキル化剤としては、限定することなくナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素およびトリアゼン、ウラシルマスタード［Ａｍｉｎｏｕｒａｃｉｌ Ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ（登録商標）、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｎｏｒｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ（登録商標）］、クロルメチン［Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標）］、シクロホスファミド［Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｃｌａｆｅｎ（登録商標）、Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標）］、イホスファミド［Ｍｉｔｏｘａｎａ（登録商標）］、メルファラン［Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標）］、クロラムブシル［Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標）］、ピポブロマン［Ａｍｅｄｅｌ（登録商標）、Ｖｅｒｃｙｔｅ（登録商標）］、トリエチレンメラミン［Ｈｅｍｅｌ（登録商標）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）、Ｈｅｘａｓｔａｔ（登録商標）］、トリエチレンチオホスホラミン、テモゾロミド［Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）］、チオテパ［Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標）］、ブスルファン［Ｂｕｓｉｌｖｅｘ（登録商標）、Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標）］、カルムスチン［ＢｉＣＮＵ（登録商標）］、ロムスチン［ＣｅｅＮＵ（登録商標）］、ストレプトゾシン［Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標）］、およびダカルバジン［ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標）］、ならびにこれらに組合せが挙げられる。さらなる例示的なアルキル化剤としては、限定することなく、オキサリプラチン［Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標）］、テモゾロミド［Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）およびＴｅｍｏｄａｌ（登録商標）］、ダクチノマイシン［アクチノマイシン−Ｄ、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標）としても既知］、メルファラン［Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシン、およびフェニルアラニンマスタード、Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標）としても既知］、アルトレタミン［ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）としても既知］、カルムスチン［ＢｉＣＮＵ（登録商標）］、ベンダムスチン［Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標）］、ブスルファン［Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）およびＭｙｌｅｒａｎ（登録商標）］、カルボプラチン［Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）］、ロムスチン［ＣＣＮＵ、ＣｅｅＮＵ（登録商標）としても既知］、シスプラチン［ＣＤＤＰ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）、およびＰｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）−ＡＱとしても既知）、クロラムブシル［Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標）］、シクロホスファミド［Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）およびＮｅｏｓａｒ（登録商標）］、ダカルバジン［ＤＴＩＣ、ＤＩＣ、およびイミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標）としても既知）、アルトレタミン［ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）としても既知］、イホスファミド［Ｉｆｅｘ（登録商標）］、プレドヌムスチン（Ｐｒｅｄｎｕｍｕｓｔｉｎｅ）、プロカルバジン［Ｍａｔｕｌａｎｅ（登録商標）］、メクロレタミン［ナイトロジェンマスタード、ムスチン、およびメクロレタミン塩酸塩、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標）としても既知］、ストレプトゾシン［Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標）］、チオテパ［チオホスホアミド（ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｅ）、ＴＥＳＰＡ、およびＴＳＰＡ、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標）としても既知）、シクロホスファミド［Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（登録商標）］、ベンダムスチンＨＣｌ［Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標）］、ならびにこれらの組合せが挙げられる。
例示的なｍＴＯＲ阻害剤としては、限定することなく、ＲＡＤ００１、テムシロリムス、リダフォロリムス［以前はデフェロリムスとして知られていた、（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−４−［（２Ｒ）−２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても既知であり、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０６４３８３号に記載されている］、エベロリムス［Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）またはＲＡＤ００１］、ラパマイシン［ＡＹ２２９８９、Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ（登録商標）］、シマピモド（ｓｉｍａｐｉｍｏｄ）（ＣＡＳ １６４３０１−５１−３）、エムシロリムス、（５−｛２，４−ビス［（３Ｓ）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）、２−アミノ−８−［トランス−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ １０１３１０１−３６−４）、およびＮ２−［１，４−ジオキソ−４−［［４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−（配列番号３５６）、分子内塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ ９３６４８７−６７−１）、ＸＬ７６５、およびこれらの組合せが挙げられる。
例示的な免疫調節剤としては、限定することなく、アフツズマブ［Ｒｏｃｈｅ（登録商標）から入手可能］、ペグフィルグラスチム［Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）］、レナリドマイド［ＣＣ−５０１３、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標）］、サリドマイド［Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標）］、アクチミド（ＣＣ４０４７）、ＩＲＸ−２（インターロイキン１、インターロイキン２、およびインターフェロンγを含むヒトサイトカインの混合物、ＣＡＳ ９５１２０９−７１−５、ＩＲＸ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手可能）、ならびにこれらの組合せが挙げられる。
例示的なアントラサイクリンとしては、限定することなく、ドキソルビシン［Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）およびＲｕｂｅｘ（登録商標）］、ブレオマイシン［ｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標）］、ダウノルビシン［ダウノルビシン塩酸塩、ダウノマイシン、およびルビドマイシン塩酸塩、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標）］、ダウノルビシンリポソーム［ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標）］、ミトキサントロン［ＤＨＡＤ、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標）］、エピルビシン［Ｅｌｌｅｎｃｅ（商標）］、イダルビシン［Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｉｄａｍｙｃｉｎ ＰＦＳ（登録商標）］、マイトマイシンＣ［Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標）］、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、ラビドマイシン、デスアセチルラビドマイシン、ならびにこれらの組合せが挙げられる。
例示的なビンカアルカロイドとしては、限定することなく、酒石酸ビノレルビン［Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標）］、ビンクリスチン［Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標）］、ビンデシン［Ｅｌｄｉｓｉｎｅ（登録商標）］］、ビンブラスチン［硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチン、およびＶＬＢとしても既知、Ａｌｋａｂａｎ−ＡＱ（登録商標）およびＶｅｌｂａｎ（登録商標）］、ビノレルビン［Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標）］、ならびにこれらの組合せが挙げられる。
例示的なプロテオソーム阻害剤としては、限定することなく、ボルテゾミブ［Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）］、カーフィルゾミブ［ＰＸ−１７１−００７、（Ｓ）−４−メチル−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−４−メチル−１−（（Ｒ）−２−メチルオキシラン−２−イル）−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）−２−（（Ｓ）−２−（２−モルホリノアセトアミド）−４−フェニルブタンアミド）−ペンタンアミド］、マリゾミブ（ＮＰＩ−００５２）、クエン酸イキサゾミブ（ＭＬＮ−９７０８）、デランゾミブ（ＣＥＰ−１８７７０）、Ｏ−メチル−Ｎ−［（２−メチル−５−チアゾリル）カルボニル］−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［（２Ｒ）−２−メチル−２−オキシラニル］−２−オキソ−１−（フェニルメチル）エチル］−Ｌ−セリンアミド（ＯＮＸ−０９１２）、およびこれらの組合せが挙げられる。
例示的なＧＩＴＲアゴニストとしては、限定することなく、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体）、例えば、米国特許第６，１１１，０９０号、欧州特許第０９０５０５Ｂ１号、米国特許第８，５８６，０２３号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／００３１１８号および同第２０１１／０９０７５４号に記載されているＧＩＴＲ融合タンパク質、または例えば、米国特許第７，０２５，９６２号、欧州特許第１９４７１８３Ｂ１号、米国特許第７，８１２，１３５号、米国特許第８，３８８，９６７号、米国特許第８，５９１，８８６号、欧州特許第ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０２８６８３号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０３９９５４号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／００７１９０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／１３３８２２号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０５５８０８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／４０１９６号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００１／０３７２０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／２０７５８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０８３２８９号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１１５４５１号、米国特許第７，６１８，６３２号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０５１７２６号に記載されている抗ＧＩＴＲ抗体などが挙げられる。
ある実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）、例えば、ＣＴＬ０１９などは、例えば、ラパマイシンシグナル伝達経路の標的である、ＲＡＤ００１などのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、本明細書に記載されるｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて、対象、例えば、部分的レスポンダーまたは非レスポンダーとして特定された対象に投与される。ある実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、ＣＡＲ発現細胞の前に投与される。例えば、ある実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、細胞のアフェレーシスの前に投与され得る。ある実施形態では、対象は、がん（例えば、ＡＬＬおよびＣＬＬなどの血液がん）を有する。ある実施形態では、対象は、ＡＬＬを有する。ある実施形態では、対象は、ＣＬＬを有する。
ある実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）、例えば、ＣＴＬ０１９などは、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、本明細書に記載されるＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて、対象、例えば、部分的レスポンダーまたは非レスポンダーとして特定された対象に投与される。ある実施形態では、ＧＩＴＲアゴニストは、ＣＡＲ発現細胞の前に投与される。例えば、ある実施形態では、ＧＩＴＲアゴニストは、細胞のアフェレーシスの前に投与され得る。ある実施形態では、対象は、がん（例えば、ＡＬＬおよびＣＬＬなどの血液がん）を有する。ある実施形態では、対象は、ＡＬＬを有する。ある実施形態では、対象は、ＣＬＬを有する。
キナーゼ阻害剤
一実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、キナーゼ阻害剤、例えば、ＣＤＫ４阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、ＭＮＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＩＴＫ阻害剤などと組み合わせた治療レジメンにおいて使用することができる。一実施形態では、対象は、完全レスポンダーであり、この対象に、キナーゼ阻害剤、例えば、本明細書に記載されるキナーゼ阻害剤と組み合わせて、例えば、本明細書に記載される用量または投薬スケジュールで、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞の投与を含む治療レジメンを施す。一実施形態では、対象は、部分的レスポンダーまたは非レスポンダーであり、この対象に、キナーゼ阻害剤、例えば、本明細書に記載されるキナーゼ阻害剤と組み合わせて、例えば、本明細書に記載される用量または投薬スケジュールで、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞の投与を含む治療レジメンを施す。
ある実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、本明細書に記載されるＣＤＫ４阻害剤、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤、例えば、６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−（５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ）−８Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン、塩酸塩（パルボシクリブまたはＰＤ０３３２９９１とも称される）などである。一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、本明細書に記載されるＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブなどである。一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、本明細書に記載されるｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン、ラパマイシン類似体、ＯＳＩ−０２７などである。ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば、本明細書に記載されるｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤であり得る。一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば、本明細書に記載されるＭＮＫ阻害剤、例えば、４−アミノ−５−（４−フルオロアニリノ）−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンなどである。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ、ＭＮＫ１ｂ、ＭＮＫ２ａ、および／またはＭＮＫ２ｂ阻害剤であり得る。
一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、アロイシンＡ、フラボピリドールまたはＨＭＲ−１２７５、２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−［（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル］−４−クロメノン、クリゾチニブ（ＰＦ−０２３４１０６６、２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−［（２Ｒ，３Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−１−メチル−３−ピロリジニル］−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、塩酸塩（Ｐ２７６−００）、１−メチル−５−［［２−［５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−４−ピリジニル］オキシ］−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン（ＲＡＦ２６５）、インジスラム（Ｅ７０７０）、ロスコビチン（ＣＹＣ２０２）、パルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）、ジナシクリブ（ｄｉｎａｃｉｃｌｉｂ）（ＳＣＨ７２７９６５）、Ｎ−［５−［［（５−ｔｅｒｔ−ブチルオキサゾール−２−イル）メチル］チオ］チアゾール−２−イル］ピペリジン−４−カルボキサミド（ＢＭＳ ３８７０３２）、４−［［９−クロロ−７−（２，６−ジフルオロフェニル）−５Ｈ−ピリミド［５，４−ｄ］［２］ベンザゼピン−２−イル］アミノ］−安息香酸（ＭＬＮ８０５４）、５−［３−（４，６−ジフルオロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イル］−Ｎ−エチル−４−メチル−３−ピリジンメタンアミン（ＡＧ−０２４３２２）、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸Ｎ−（ピペリジン−４−イル）アミド（ＡＴ７５１９）、４−［２−メチル−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］−Ｎ−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−２−ピリミジンアミン（ＡＺＤ５４３８）、ならびにＸＬ２８１（ＢＭＳ９０８６６２）から選択される、ＣＤＫ４阻害剤である。
一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、パルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）であり、パルボシクリブは、約５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１０５ｍｇ、１１０ｍｇ、１１５ｍｇ、１２０ｍｇ、１２５ｍｇ、１３０ｍｇ、１３５ｍｇ（例えば、７５ｍｇ、１００ｍｇ、または１２５ｍｇ）の用量で、ある期間の間毎日、例えば、２８日サイクルの１４〜２１日の間毎日、２１日サイクルの７〜１２日の間毎日、投与される。一実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上のサイクルのパルボシクリブが投与される。
一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）、ＧＤＣ−０８３４、ＲＮ−４８６、ＣＧＩ−５６０、ＣＧＩ−１７６４、ＨＭ−７１２２４、ＣＣ−２９２、ＯＮＯ−４０５９、ＣＮＸ−７７４、およびＬＦＭ−Ａ１３から選択される、ＢＴＫ阻害剤である。
一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）であり、イブルチニブは、約２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４２０ｍｇ、４４０ｍｇ、４６０ｍｇ、４８０ｍｇ、５００ｍｇ、５２０ｍｇ、５４０ｍｇ、５６０ｍｇ、５８０ｍｇ、６００ｍｇ（例えば、２５０ｍｇ、４２０ｍｇ、または５６０ｍｇ）の用量で、ある期間の間毎日、例えば、２１日のサイクルの間毎日、または２８日のサイクルの間毎日投与される。一実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上のサイクルのイブルチニブが投与される。
一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても既知の（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−４−［（２Ｒ）−２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、ラパマイシン（ＡＹ２２９８９）、シマピモド、（５−｛２，４−ビス［（３Ｓ）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）、２−ミノ（ｍｍｉｎｏ）−８−［トランス−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２）、Ｎ２−［１，４−ジオキソ−４−［［４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−（配列番号３５６）、分子内塩（ＳＦ１１２６）、ならびにＸＬ７６５から選択されるｍＴＯＲ阻害剤である。
一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンであり、ラパマイシンは、約３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ（例えば、６ｍｇ）の用量で、ある期間の間毎日、例えば、２１日のサイクルの間毎日、または２８日のサイクルの間毎日投与される。一実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上のサイクルのラパマイシンが投与される。一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスであり、エベロリムスは、約２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ（例えば、１０ｍｇ）の用量で、ある期間の間毎日、例えば、２８日のサイクルの間毎日投与される。一実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上のサイクルのエベロリムスが投与される。
一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＣＧＰ０５２０８８、４−アミノ−３−（ｐ−フルオロフェニルアミノ）−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（ＣＧＰ５７３８０）、セルコスポラミド、ＥＴＣ−１７８０４４５−２、および４−アミノ−５−（４−フルオロアニリノ）−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンから選択される、ＭＮＫ阻害剤である。
低用量のｍＴＯＲ阻害剤との組合せ
本明細書に記載される方法は、低い免疫強化用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１などのラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）を含む、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤を使用することができる。低い免疫強化用量のｍＴＯＲ阻害剤（例えば、免疫系を完全に抑制するには不十分であるが、免疫機能を改善するには十分である用量）の投与により、対象における免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＣＡＲ発現細胞の性能を最適化することができる。ｍＴＯＲ阻害を測定するための方法、投薬量、治療レジメン、および好適な医薬組成物は、２０１４年１１月１３日に出願され、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１５／０１４００３６号に記載されている。
ある実施形態では、低い免疫強化用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、以下の：
ｉ）ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞数の減少、
ｉｉ）ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞数の増加、
ｉｉｉ）ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の比の増加、
ｉｖ）ナイーブＴ細胞数の増加、
ｖ）例えば、メモリーＴ細胞、例えば、メモリーＴ細胞前駆体における次のマーカー：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ、ＣＤ１２７ｈｉｇｈ、ＣＤ２７＋、およびＢＣＬ２のうちの１つもしくは複数の発現の増加、
ｖｉ）例えば、メモリーＴ細胞、例えば、メモリーＴ細胞前駆体におけるＫＬＲＧ１の発現の減少、または
ｖｉｉ）メモリーＴ細胞前駆体、例えば、次の特徴：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈの増加、ＣＤ１２７ｈｉｇｈの増加、ＣＤ２７＋の増加、ＫＬＲＧ１の減少、およびＢＣＬ２の増加のうちの任意の１つもしくは複数の組合せを有する細胞数の増加、
のうちの１つまたは複数をもたらし得、前述のものいずれか、例えば、ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）、ｖｉ）、またはｖｉｉ）は、例えば、未治療の対象と比較して、例えば、少なくとも一過的に起こる。
別の実施形態では、低い免疫強化用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、未処置のＣＡＲ発現細胞または未治療の対象と比較して、例えば、培養液または対象において、ＣＡＲ発現細胞の増殖の増加または延長をもたらす。いくつかの実施形態では、増殖の増加には、ＣＡＲ発現細胞数の増加が伴う。別の実施形態では、低い免疫強化用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、未処置のＣＡＲ発現細胞または未治療の対象と比較して、例えば、培養液または対象において、ＣＡＲ発現細胞によるがん細胞殺滅の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、がん細胞殺滅の増加は、腫瘍体積の減少と関連している。
一実施形態では、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞は、低い免疫強化用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１、または触媒性ｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与される。例えば、低い免疫強化用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞の投与の前に開始されてもよく、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞の投与の前に完了してもよく、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞の投与と同時に開始されてもよく、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞の投与と重複してもよく、または本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞の投与の後に継続してもよい。
代替としてまたは追加として、低い免疫強化用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、免疫エフェクター細胞を、本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現するように操作されるように最適化することができる。このような実施形態では、低い免疫強化用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１、または触媒性阻害剤の投与は、本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現するように操作されるべき免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を対象から採取する前に開始または完了する。
別の実施形態では、例えば、対象から採取した後に本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現するように操作されるべき免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、または例えば、対象に投与する前のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞は、低い免疫強化用量のｍＴＯＲ阻害剤の存在下において培養され得る。
ある実施形態では、低い免疫強化用量のｍＴＯＲ阻害剤を対象に投与することは、例えば、１週間に１回、例えば、即時放出剤形で、０．１〜２０ｍｇ、０．５〜１０ｍｇ、２．５〜７．５ｍｇ、３〜６ｍｇ、もしくは約５ｍｇのＲＡＤ００１、またはその生物学的に同等な用量を投与することを含む。ある実施形態では、低い免疫強化用量のｍＴＯＲ阻害剤を対象に投与することは、例えば、１週間に１回、例えば、持続放出剤形で、０．３〜６０ｍｇ、１．５〜３０ｍｇ、７．５〜２２．５ｍｇ、９〜１８ｍｇ、もしくは約１５ｍｇのＲＡＤ００１、またはその生物学的に同等な用量を投与することを含む。
ある実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％だが９０％を超えない、少なくとも１０％だが９０％を超えない、少なくとも１５％だが９０％を超えない、少なくとも２０％だが９０％を超えない、少なくとも３０％だが９０％を超えない、少なくとも４０％だが９０％を超えない、少なくとも５０％だが９０％を超えない、少なくとも６０％だが９０％を超えない、少なくとも７０％だが９０％を超えない、少なくとも５％だが８０％を超えない、少なくとも１０％だが８０％を超えない、少なくとも１５％だが８０％を超えない、少なくとも２０％だが８０％を超えない、少なくとも３０％だが８０％を超えない、少なくとも４０％だが８０％を超えない、少なくとも５０％だが８０％を超えない、少なくとも６０％だが８０％を超えない、少なくとも５％だが７０％を超えない、少なくとも１０％だが７０％を超えない、少なくとも１５％だが７０％を超えない、少なくとも２０％だが７０％を超えない、少なくとも３０％だが７０％を超えない、少なくとも４０％だが７０％を超えない、少なくとも５０％だが７０％を超えない、少なくとも５％だが６０％を超えない、少なくとも１０％だが６０％を超えない、少なくとも１５％だが６０％を超えない、少なくとも２０％だが６０％を超えない、少なくとも３０％だが６０％を超えない、少なくとも４０％だが６０％を超えない、少なくとも５％だが５０％を超えない、少なくとも１０％だが５０％を超えない、少なくとも１５％だが５０％を超えない、少なくとも２０％だが５０％を超えない、少なくとも３０％だが５０％を超えない、少なくとも４０％だが５０％を超えない、少なくとも５％だが４０％を超えない、少なくとも１０％だが４０％を超えない、少なくとも１５％だが４０％を超えない、少なくとも２０％だが４０％を超えない、少なくとも３０％だが４０％を超えない、少なくとも３５％だが４０％を超えない、少なくとも５％だが３０％を超えない、少なくとも１０％だが３０％を超えない、少なくとも１５％だが３０％を超えない、少なくとも２０％だが３０％を超えない、または少なくとも２５％だが３０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関連付けられるか、またはそれを提供する。
ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ阻害の程度として伝えることができるか、またはそれに対応し得、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性の減少レベルによって、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ基質のリン酸化の減少によって、判定することができる。ｍＴＯＲ阻害のレベルは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１５／０１２４００３６号に記載されているように、もしくは参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７２７，９５０号に記載されているように、ＢｏｕｌａｙアッセイによってＰ７０ Ｓ６キナーゼ活性を測定すること、ウェスタンブロットによってリン酸化Ｓ６のレベルを測定すること、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞対ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞の比の変化を評価することなど、様々な方法によって評価することができる。
本明細書に使用されるとき、「ｍＴＯＲ阻害剤」という用語は、細胞においてｍＴＯＲキナーゼを阻害する化合物もしくはリガンド、またはその薬学的に許容される塩を指す。ある実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、アロステリック阻害剤である。アロステリックｍＴＯＲ阻害剤としては、天然の三環式化合物ラパマイシン（シロリムス）、ラパマイシンと構造的および機能的類似性を有する化合物であり、例えば、ラパマイシン誘導体、ラパマイシン類似体（ラパログとも称される）、およびｍＴＯＲ活性を阻害する他のマクロライド化合物を含む、ラパマイシン関連化合物が挙げられる。ある実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、触媒性阻害剤である。
ラパマイシンは、式Ａに示される構造を有するストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）によって産生される、既知のマクロライド系抗生物質である。
Figure 2022002525
例えば、McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688、Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433、米国特許第３，９２９，９９２号を参照されたい。ラパマイシンには様々な付番スキームが提案されている。混乱を避けるために、特定のラパマイシン類似体を本明細書において命名するとき、名称は、式Ａの付番スキームを使用したラパマイシンに関して与えられる。
本発明において有用なラパマイシン類似体は、例えば、ラパマイシンのシクロヘキシル環のヒドロキシル基がＯＲ１で置換されており、式中、Ｒ１がヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキル、またはアミノアルキルである、Ｏ置換類似体、例えば、ＵＳ５，６６５，７７２号よびＷＯ９４／０９０１０に記載されている、エベロリムスとしても既知のＲＡＤ００１であり、これらの内容は参照により組み込まれる。他の好適なラパマイシン類似体としては、２６位または２８位で置換されているものが挙げられる。ラパマイシン類似体は、上述の類似体のエピマー、例えば、特に、参照により内容が組み込まれるＵＳ６，０１５，８１５、ＷＯ９５／１４０２３、およびＷＯ９９／１５５３０に記載されるように、４０位、２８位、または２６位で置換されており、さらに水素化されていてもよい、類似体のエピマー、例えば、参照により内容が組み込まれるＵＳ７，０９１，２１３、ＷＯ９８／０２４４１、およびＷＯ０１／１４３８７に記載されているゾタロリムスまたはラパマイシン類似体としても既知のＡＢＴ５７８、例えば、リダフォロリムスとしても既知のＡＰ２３５７３であってもよい。
本発明において使用するのに好適な、ＵＳ５，６６５，７７２からのラパマイシン類似体の例としては、４０−Ｏ−ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−（４’−ヒドロキシメチル）ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−［４’−（１，２−ジヒドロキシエチル）］ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−アリル−ラパマイシン、４０−Ｏ−［３’−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４（Ｓ）−イル）−プロパ−２’−エン−１’−イル］−ラパマイシン、（２’Ｅ，４’Ｓ）−４０−Ｏ−（４’，５’−ジヒドロキシペンタ−２’−エン−１’−イル）−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エトキシカルボニルメチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−（３−ヒドロキシ）プロピル−ラパマイシン、４０−Ｏ−（６−ヒドロキシ）ヘキシル−ラパマイシン、４０−Ｏ−［２−（２−ヒドロキシ）エトキシ］エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−［（３Ｓ）−２，２−ジメチルジオキソラン−３−イル］メチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−［（２Ｓ）−２，３−ジヒドロキシプロパ−１−イル］−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−アセトキシ）エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ニコチノイルオキシ）エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−［２−（Ｎ−モルホリノ）アセトキシ］エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−Ｎ−イミダゾリルアセトキシ）エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−［２−（Ｎ−メチル−Ｎ’−ピペラジニル）アセトキシ］エチル−ラパマイシン、３９−Ｏ−デスメチル−３９，４０−Ｏ，Ｏ−エチレン−ラパマイシン、（２６Ｒ）−２６−ジヒドロ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−アミノエチル）−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−アセトアミノエチル）−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ニコチンアミドエチル）−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−（Ｎ−メチル−イミダゾ−２’−イルカルベトキサミド）エチル）−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−エトキシカルボニルアミノエチル）−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−トリルスルホンアミドエチル）−ラパマイシン、および４０−Ｏ−［２−（４’，５’−ジカルボエトキシ−１’，２’，３’−トリアゾール−１’−イル）−エチル］−ラパマイシンが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明において有用な他のラパマイシン類似体は、ラパマイシンのシクロヘキシル環のヒドロキシル基および／または２８位のヒドロキシ基が、ヒドロキシエステル基で置き換えられた類似体であり、例えば、ＵＳ ＲＥ４４，７６８に見出されるラパマイシン類似体、例えば、テムシロリムスが既知である。
本発明において有用な他のラパマイシン類似体としては、例えば、参照により内容が組み込まれるＷＯ９５／１６６９１およびＷＯ９６／４１８０７に記載されているように、１６位のメトキシ基が、他の置換基、好ましくは（ヒドロキシ置換されていてもよい）アルキニルオキシ、ベンジル、オルトメトキシベンジル、もしくはシクロベンジルで置き換えられているもの、および／または３９位のメトキシ基が、３９炭素とともに欠失しており、結果としてラパマイシンのシクロヘキシル環が３９位のメトキシ基を欠くシクロペンチル環となっているものが挙げられる。類似体は、ラパマイシンの４０位のヒドロキシがアルキル化される、および／または３２−カルボニルが還元されるようにさらに修飾され得る。
ＷＯ９５／１６６９１からのラパマイシン類似体としては、１６−デメトキシ−１６−（ペンタ−２−イニル）オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−（ブタ−２−イニル）オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−（プロパルギル）オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−（４−ヒドロキシ−ブタ−２−イニル）オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−オルト−メトキシベンジル−ラパマイシン、１６−デメトキシ−４０−Ｏ−（２−メトキシエチル）−１６−ペンタ−２−イニル）オキシ−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ホルミル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ヒドロキシメチル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−カルボキシ−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−（モルホリン−４−イル）カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−［Ｎ−メチル，Ｎ−（２−ピリジン−２−イル−エチル）］カルバモイル−４２−ノル−ラパマイシン、および３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−（ｐ−トルエンスルホニルヒドラゾノメチル）−４２−ノル−ラパマイシンが挙げられるがこれらに限定されない。
ＷＯ９６／４１８０７からのラパマイシン類似体としては、３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペンタ−２−イニル−３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペンタ−２−イニル−３２−デオキソ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ−エチル）−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペンタ−２−イニル−３２−（Ｓ）−ジヒドロ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、３２（Ｓ）−ジヒドロ−４０−Ｏ−（２−メトキシ）エチル−ラパマイシン、および３２（Ｓ）−ジヒドロ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンが挙げられるがこれらに限定されない。
別の好適なラパマイシン類似体は、参照により内容が組み込まれるＵＳ２００５／０１０１６２４に記載されているウミロリムス（ｕｍｉｒｏｌｉｍｕｓ）である。
ＲＡＤ００１は、それ以外にはエベロリムス［Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）］としても既知であり、化学名（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｅ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１２−｛（１Ｒ）−２−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル｝−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−１１，３６−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−２，３，１０，１４，２０−ペンタオンを有する。
アロステリックｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例としては、シロリムス（ラパマイシン、ＡＹ−２２９８９）、４０−［３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロパノエート］−ラパマイシン（テムシロリムスまたはＣＣＩ−７７９とも称される）、およびリダフォロリムス（ＡＰ−２３５７３／ＭＫ−８６６９）が挙げられる。アロステリックｍＴｏｒ阻害剤の他の例としては、ゾタロリムス（ＡＢＴ５７８）およびウミロリムスが挙げられる。
代替としてまたは追加として、触媒性のＡＴＰ−競合ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲキナーゼドメインを直接に標的とし、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両方を標的とすることが見出されている。これらはまた、ラパマイシンのようなアロステリックｍＴＯＲ阻害剤よりも効果的なｍＴＯＲＣ１の阻害剤であるが、これは、それらが、４ＥＢＰ１−Ｔ３７／４６リン酸化およびキャップ依存性翻訳などのラパマイシン耐性ｍＴＯＲＣ１による結果を調節するためである。
触媒性阻害剤としては、次のものが挙げられる：ＢＥＺ２３５もしくは２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］−プロピオニトリル、またはモノトシル酸塩形態、ＢＥＺ２３５の合成は、ＷＯ２００６／１２２８０６に記載されている；ＣＣＧ１６８（これ以外にはＡＺＤ−８０５５としても既知、Chresta, C.M., et al., Cancer Res, 2010, 70(1), 288-298）、これは、化学名｛５−［２，４−ビス−（（Ｓ）−３−メチル−モルホリン−４−イル）−ピリド［２，３ｄ］ピリミジン−７−イル］−２−メトキシ−フェニル｝−メタノールを有する；３−［２，４−ビス［（３Ｓ）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ−メチルベンズアミド（ＷＯ０９１０４０１９）；３−（２−アミノベンゾ［ｄ］オキサゾール−５−イル）−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン（ＷＯ１００５１０４３およびＷＯ２０１３０２３１８４）；Ｎ−（３−（Ｎ−（３−（（３，５−ジメトキシフェニル）アミノ）キノキサリン−２−イル）スルファモイル）フェニル）−３−メトキシ−４−メチルベンズアミド（ＷＯ０７０４４７２９およびＷＯ１２００６５５２）；ＰＫＩ−５８７（Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645）、これは、化学名１−［４−［４−（ジメチルアミノ）ピペリジン−１−カルボニル］フェニル］−３−［４−（４，６−ジモルホリノ−１，３，５−トリアジン−２−イル）フェニル］尿素を有する；ＧＳＫ−２１２６４５８（ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43）、これは、化学名２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−メトキシ−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドを有する；５−（９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル）ピリミジン−２−アミン（ＷＯ１０１１４４８４）；（Ｅ）−Ｎ−（８−（６−アミノ−５−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）−１−（６−（２−シアノプロパン−２−イル）ピリジン−３−イル）−３−メチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２（３Ｈ）−イリデン）シアンアミド（ＷＯ１２００７９２６）。
触媒性ｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例としては、８−（６−メトキシ−ピリジン−３−イル）−３−メチル−１−（４−ピペラジン−１−イル−３−トリフルオロメチル−フェニル）−１，３−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン（ＷＯ２００６／１２２８０６）およびＫｕ−００６３７９４（Garcia-Martinez JM, et al., Biochem J., 2009, 421(1), 29-42。Ｋｕ−００６３７９４は、哺乳動物のラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）の特異的阻害剤である）が挙げられる。ＷＹＥ−３５４は、触媒性ｍＴｏｒ阻害剤の別の例である（Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240）。
本発明による有用なｍＴＯＲ阻害剤には、前述のもののいずれかのプロドラッグ、誘導体、薬学的に許容される塩、またはその類似体も含まれる。
ＲＡＤ００１などのｍＴＯＲ阻害剤は、本明細書に記載される具体的な投薬量に基づいて、当該技術分野で十分に確立された方法に基づくデリバリーのために製剤化されてもよい。具体的には、米国特許第６，００４，９７３号（参照により本明細書に組み込まれる）が、本明細書に記載されるｍＴＯＲ阻害剤とともに使用することができる製剤の例を提供している。
さらなる組合せ療法には、抗アレルゲン剤、抗嘔吐薬、鎮痛薬、補助療法が含まれ得る。
一部の患者は、投与中または投与後に、本明細書に記載される治療薬および／または他の抗がん剤に対してアレルギー反応をきたす場合があり、したがって、アレルギー反応のリスクを最小限に抑えるために、抗アレルギー剤が投与されることがある。好適な抗アレルギー剤としては、コルチコステロイド、例えばデキサメタゾン［例えば、Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標）］、ベクロメタゾン［例えば、Ｂｅｃｌｏｖｅｎｔ（登録商標）］、ヒドロコルチゾン［コルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウムとしても既知であり、商標名Ａｌａ−Ｃｏｒｔ（登録商標）、リン酸ヒドロコルチゾン、Ｓｏｌｕ−Ｃｏｒｔｅｆ（登録商標）、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔ Ａｃｅｔａｔｅ（登録商標）、およびＬａｎａｃｏｒｔ（登録商標）で販売されている］、プレドニゾロン［商標名Ｄｅｌｔａ−Ｃｏｒｔｅｌ（登録商標）、Ｏｒａｐｒｅｄ（登録商標）、Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ（登録商標）、およびＰｒｅｌｏｎｅ（登録商標）で販売されている］、プレドニゾン［商標名Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕｉｄ Ｒｅｄ（登録商標）、Ｍｅｔｉｃｏｒｔｅｎ（登録商標）、およびＯｒａｓｏｎｅ（登録商標）で販売されている］、メチルプレドニゾロン（６−メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウムとしても既知であり、商標名Ｄｕｒａｌｏｎｅ（登録商標）、Ｍｅｄｒａｌｏｎｅ（登録商標）、Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標）、Ｍ−Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ（登録商標）、およびＳｏｌｕ−Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標）で販売されている）、抗ヒスタミン剤、例えば、ジフェンヒドラミン［例えば、Ｂｅｎａｄｒｙｌ（登録商標）］、ヒドロキシジン、およびシプロヘプタジン、ならびに気管支拡張剤、例えば、ベータ−アドレナリン受容体アゴニスト、アルブテロール［例えば、Ｐｒｏｖｅｎｔｉｌ（登録商標）］、およびテルブタリン［Ｂｒｅｔｈｉｎｅ（登録商標）］が挙げられる。
一部の患者は、本明細書に記載される治療薬および／または他の抗がん剤の投与中および投与後に吐き気をきたす場合があり、したがって、吐き気（胃上部）および嘔吐を予防するために抗嘔吐薬が使用される。好適な抗嘔吐薬としては、アプレピタント［Ｅｍｅｎｄ（登録商標）］、オンダンセトロン［Ｚｏｆｒａｎ（登録商標）］、グラニセトロンＨＣｌ［Ｋｙｔｒｉｌ（登録商標）］、ロラゼパム［Ａｔｉｖａｎ（登録商標）、デキサメタゾン［Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標）］、プロクロルペラジン［Ｃｏｍｐａｚｉｎｅ（登録商標）］、カソピタント［Ｒｅｚｏｎｉｃ（登録商標）およびＺｕｎｒｉｓａ（登録商標）］、ならびにこれらの組合せが挙げられる。
治療期間中に経験される疼痛を軽減するための薬物治療が、患者をより快適にするために、処方されることが多い。一般的な処方箋不要の鎮痛剤、例えばＴｙｌｅｎｏｌ（登録商標）が使用されることが多い。しかしながら、オピオイド鎮痛薬、例えば、ヒドロコドン／パラセタモールまたはヒドロコドン／アセトアミノフェン［例えば、Ｖｉｃｏｄｉｎ（登録商標）］、モルヒネ［例えば、Ａｓｔｒａｍｏｒｐｈ（登録商標）またはＡｖｉｎｚａ（登録商標）］、オキシコドン［例えば、ＯｘｙＣｏｎｔｉｎ（登録商標）またはＰｅｒｃｏｃｅｔ（登録商標）］、オキシモルフォン塩酸塩［Ｏｐａｎａ（登録商標）］、およびフェンタニル［例えば、Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ（登録商標）］もまた、中等度または重度の疼痛に有用である。
正常細胞を治療毒性から保護するため、および臓器毒性を制限するための取組みにおいて、細胞保護剤（神経保護剤、フリーラジカルスカベンジャー、心臓保護薬、アントラサイクリン血管外漏出中和剤、および栄養素など）を、補助療法として使用してもよい。好適な細胞保護剤としては、アミホスチン［Ｅｔｈｙｏｌ（登録商標）］、グルタミン、ジメスナ［Ｔａｖｏｃｅｐｔ（登録商標）］、メスナ［Ｍｅｓｎｅｘ（登録商標）］、デクスラゾキサン［Ｚｉｎｅｃａｒｄ（登録商標）またはＴｏｔｅｃｔ（登録商標）］、キサリプロデン［Ｘａｐｒｉｌａ（登録商標）］、およびロイコボリン（ロイコボリンカルシウム、シトロボラム因子、およびフォリン酸としても既知である）が挙げられる。
コード番号、一般名、または商標名によって特定される活性化合物の構造は、標準的な概説書「The Merck Index」の現行版、またはデータベース、例えば、Ｐａｔｅｎｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（例えば、ＩＭＳ Ｗｏｒｌｄ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）から入手することができる。
本発明の化合物と組み合わせて使用することができる上述の化合物は、上で列挙した文書など、当該技術分野において記載されているように調製し、投与することができる。
一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの本発明の化合物（例えば、本発明の化合物）またはその薬学的に許容される塩を、ヒト対象または動物対象に単独または他の抗がん剤とともにのいずれかで投与するのに好適な薬学的に許容される担体とともに含む、医薬組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、がんなどの細胞増殖性疾患を患うヒト対象または動物対象を治療する方法を提供する。本発明は、そのような治療を必要とするヒト対象または動物対象を治療する方法であって、対象に、治療有効量の本発明の化合物（例えば、本発明の化合物）またはその薬学的に許容される塩を、単独または他の抗がん剤と組み合わせてのいずれかで投与することを含む方法を提供する。
具体的には、組成物は、組合せ治療薬として一緒に製剤化されるか、または別個に投与されるかのいずれかであろう。
組合せ療法において、本発明の化合物および他の抗がん剤は、同時に、並行して、または特定の時間制限を伴わずに逐次的にのいずれかで投与され得、このような投与により、患者の体内に治療有効レベルの２つの化合物を提供する。
好ましい実施形態では、本発明の化合物および他の抗がん剤は、注入または経口により、任意の順序で逐次的に投与されることが一般的である。投薬レジメンは、疾患のステージ、患者の身体的適合性、個々の薬物の安全性プロファイル、および個々の薬物の忍容性、ならびに組合せ薬を投与する担当医および医療従事者に周知の他の基準に応じて多様であり得る。本発明の化合物および他の抗がん剤は、治療に使用されている特定のサイクルに応じて、互いに数分、数時間、数日間、または数週間以内、間を空けて投与されてもよい。加えて、このサイクルは、治療サイクル中に一方の薬物を他方の薬物よりも高い頻度で、薬物の投与毎に異なる用量で、投与することを含んでもよい。
本発明の別の態様では、１つまたは複数の本発明の化合物および本明細書に開示される組合せパートナーを含む、キットが提供される。代表的なキットには、（ａ）本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩、（ｂ）少なくとも１つの組合せパートナー、例えば、上述のものが含まれ、その場合、このようなキットは、投与のための指示を含む添付文書または他のラベルを含み得る。
本発明の化合物はまた、既知の治療プロセス、例えば、ホルモンまたは特に放射線照射の投与と組み合わせて有益となるように使用してもよい。本発明の化合物は、特に、放射線療法に対して感受性が乏しい腫瘍の治療のための放射線増感剤として使用することができる。
免疫エフェクター細胞の作製および作製方法
ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲを有するように操作され得る免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）、ならびにこのような細胞を含む反応混合物および組成物を作製する方法が、本明細書に提供される。
一態様では、本開示は、ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を特徴とし、この操作された免疫エフェクター細胞は、抗腫瘍特性を呈する。好ましい抗原は、本明細書に記載されるがん関連抗原（すなわち、腫瘍抗原）である。一態様では、細胞にはＣＡＲが形質転換されており、ＣＡＲが、細胞表面上に発現される。一部の実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）には、ＣＡＲをコードするウイルスベクターが形質導入されている。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一部のこのような実施形態では、細胞は、ＣＡＲを安定に発現し得る。別の実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）には、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡがトランスフェクトされている。一部のこのような実施形態では、細胞は、ＣＡＲを一過的に発現し得る。
さらに、本発明は、ＣＡＲＴ組成物、ならびに他の疾患の中でもとりわけ、本明細書に記載される腫瘍抗原を発現する細胞または組織が関与するがんまたは任意の悪性腫瘍または自己免疫疾患を治療するための医薬品または方法におけるそれらの使用を提供する。
一態様では、本発明のＣＡＲは、本明細書に記載される腫瘍抗原を発現する正常細胞を根絶させるために使用することができ、そのため、細胞移植前の細胞の調整療法としての使用に適用可能である。
免疫エフェクター細胞の供給源
いくつかの実施形態では、増殖および遺伝子修飾もしくは他の修飾の前に、細胞、例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の供給源、例えば、Ｔ細胞集団またはＮＫ細胞集団を、対象から取得する、例えば、得ることができる。「対象」という用語は、免疫応答が誘起される生物（例えば、哺乳動物）を含むことが意図される。対象の例としては、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が挙げられる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、多数の供給源から得ることができる。
一部の実施形態では、細胞集団、例えば、採取した細胞集団は、Ｔ細胞またはＴ細胞集団を、例えば、様々な分化段階で含む。Ｔ細胞の分化段階としては、最も低い分化のものから最も分化したものの順に、ナイーブＴ細胞、ステムセントラルメモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、および末端エフェクターＴ細胞が挙げられる。抗原曝露の後、ナイーブＴ細胞は、増殖し、分化してメモリーＴ細胞、例えば、ステムセントラルメモリーＴ細胞およびセントラルメモリーＴ細胞となり、これが、次いで、分化してエフェクターメモリーＴ細胞となる。適切なＴ細胞受容体、共刺激シグナル、および炎症性シグナルを受容すると、メモリーＴ細胞は、さらに分化して末端エフェクターＴ細胞となる。例えば、Restifo.Blood.124.4(2014):476-77およびJoshi et al.J.Immunol.180.3(2008):1309-15を参照されたい。
ナイーブＴ細胞（ＴＮ）は、次の細胞表面マーカーの発現パターンによって特徴付けられる：ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ９５−。ステムセントラルメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、次の細胞表面マーカーの発現パターンによって特徴付けられる：ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ９５＋。セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、次の細胞表面マーカーの発現パターンによって特徴付けられる：ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ９５＋。エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）は、次の細胞表面マーカーの発現パターンによって特徴付けられる：ＣＣＲ７−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ９５＋。末端エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥｆｆ）は、次の細胞表面マーカーの発現パターンによって特徴付けられる：ＣＣＲ７−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ９５＋。例えば、Gattinoni et al.Nat.Med.17(2011):1290-7およびFlynn et al.Clin.Translat.Immunol.3(2014):e20を参照されたい。
本開示のある特定の態様では、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離など、当業者に既知の任意の多数の技法を使用して、対象から収集された血液単位から得ることができる。１つの好ましい態様では、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的に、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含有する。一態様では、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、適宜、後続の処理工程のために適切な緩衝液または培地に細胞を入れてもよい。一実施形態では、細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。代替的な実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムを含まず、かつマグネシウム不含であり得るか、またはすべてではないものの多くの二価カチオン不含であり得る。
カルシウム非存在下における初期活性化工程は、活性化の拡大をもたらし得る。当業者には容易に理解されるように、洗浄工程は、半自動化「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞処理装置、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を製造業者の説明書に従って使用することによるなど、当業者に既知の方法によって達成され得る。洗浄後、細胞を、例えば、Ｃａ不含、Ｍｇ不含ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、または緩衝液ありもしくはなしの他の生理食塩水など、様々な生体適合性緩衝液中に再懸濁させてもよい。代替として、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地中に直接再懸濁してもよい。
本出願の方法は、５％以下、例えば、２％のヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を用いることができ、既知の培養培地条件および組成、例えば、Smith et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement" Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31に記載されているものを採用し得ることが理解される。
一態様では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解させ、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配遠心分離または向流遠心分離溶出により単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球から単離される。
本明細書に記載される方法は、例えば、例として本明細書に記載される、例えば、ネガティブセレクション技法を使用した制御性Ｔ細胞枯渇集団、ＣＤ２５＋枯渇細胞である免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の特定の部分集団の選択が含まれる。好ましくは、制御性Ｔ細胞枯渇細胞の集団は、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含有する。
一実施形態では、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片、またはＣＤ２５結合性リガンド、例えば、ＩＬ−２を使用して集団から除去される。一実施形態では、抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片、またはＣＤ２５結合性リガンドは、基質、例えば、ビーズにコンジュゲートされているか、またはそれ以外の場合では基質、例えばビーズにコーティングされている。一実施形態では、抗ＣＤ２５抗体またはその断片は、本明細書に記載される基質にコンジュゲートされている。
一実施形態では、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（商標）からのＣＤ２５枯渇試薬を使用して集団から除去される。一実施形態では、細胞対ＣＤ２５枯渇試薬の比は、１ｅ７個の細胞に対して２０ｕＬ、または１ｅ７個の細胞に対して１５ｕＬ、または１ｅ７個の細胞に対して１０ｕＬ、または１ｅ７個の細胞に対して５ｕＬ、または１ｅ７個の細胞に対して２．５ｕＬ、または１ｅ７個の細胞に対して１．２５ｕＬである。一実施形態では、例えば、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇に関しては、５億個を上回る細胞／ｍｌが使用される。さらなる態様では、６億個、７億個、８億個、または９億個の細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。
一実施形態では、枯渇させるべき免疫エフェクター細胞の集団には、約６×１０９個のＣＤ２５＋Ｔ細胞が含まれる。他の態様では、枯渇させるべき免疫エフェクター細胞の集団には、約１×１０９〜１×１０１０個、およびこれらの間の任意の整数値のＣＤ２５＋Ｔ細胞が含まれる。一実施形態では、結果として得られる制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団は、２×１０９個またはそれ未満の制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞（例えば、１×１０９個、５×１０８個、１×１０８個、５×１０７個、１×１０７個、またはそれ未満のＣＤ２５＋細胞）を有する。
一実施形態では、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞は、ＣｌｉｎｉＭＡＣシステムを枯渇用チューブセット、例えば、チューブ１６２−０１などとともに使用して集団から除去される。一実施形態では、ＣｌｉｎｉＭＡＣシステムは、例えば、ＤＥＰＬＥＴＩＯＮ２．１などの枯渇設定で動作する。
特定の理論に束縛されることを望むものではないが、アフェレーシスの前またはＣＡＲ発現細胞産物の作製中に、対象における免疫細胞の負の制御因子のレベルを減少させること（例えば、望ましくない免疫細胞、例えば、ＴＲＥＧ細胞の数を減少させること）により、対象の再発のリスクが著しく低減される。例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させる方法は、当該技術分野で既知である。ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法としては、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体（本明細書に記載される抗ＧＩＴＲ抗体）、ＣＤ２５枯渇、およびこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、作製方法は、ＣＡＲ発現細胞の作製前にＴＲＥＧ細胞の数を減少させること（例えば、枯渇させること）を含む。例えば、作製方法は、例えば、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）産物の作製前に、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させるために、試料、例えば、アフェレーシス試料を、抗ＧＩＴＲ抗体および／または抗ＣＤ２５抗体（またはその断片もしくはＣＤ２５結合性リガンド）と接触させることを含む。
ある実施形態では、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物作製のために細胞を収集する前に、ＴＲＥＧ細胞を減少させる１つまたは複数の治療法により予備治療を受け、それによって、ＣＡＲ発現細胞治療に対する対象の再発のリスクを減少させる。ある実施形態では、ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法としては、対象へのシクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇、またはこれらの組合せのうちの１つまたは複数の投与が挙げられるがこれらに限定されない。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇、またはこれらの組合せのうちの１つまたは複数の投与は、ＣＡＲ発現細胞産物の注入の前、最中、またはその後に起こり得る。
ある実施形態では、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物作製のために細胞を収集する前に、シクロホスファミドによる予備治療を受け、それによって、ＣＡＲ発現細胞治療に対する対象の再発のリスクを減少させる。ある実施形態では、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物作製のために細胞を収集する前に、抗ＧＩＴＲ抗体で予備治療を受け、それによって、ＣＡＲ発現細胞治療に対する対象の再発のリスクを減少させる。
一実施形態では、除去されるべき細胞集団は、制御性Ｔ細胞でも腫瘍細胞でもなく、除去しなければＣＡＲＴ細胞の増殖および／または機能に負の影響を及ぼす細胞、例えば、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５、または可能性として免疫抑制細胞によって発現される他のマーカーを発現する細胞である。一実施形態では、このような細胞は、制御性Ｔ細胞および／または腫瘍細胞と並行して、または前記枯渇の後に、または別の順序で、除去されることが想定される。
ある実施形態では、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）作製プロセスは、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）産物（例えば、ＣＴＬ０１９産物）を作製する前にＴＲＥＧ細胞を枯渇させるように修正される。ある実施形態では、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）産物（例えば、ＣＴＬ０１９産物）の作製前に、ＣＤ２５枯渇を使用して、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させる。
本明細書に記載される方法は、１つを上回る選択工程、例えば、１つを上回る枯渇工程を含み得る。ネガティブセレクションによるＴ細胞の富化は、例えば、ネガティブセレクションを行った細胞に固有な表面マーカーに対する抗体の組合せにより達成することができる。１つの方法は、ネガティブセレクションを行った細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負の磁気免疫付着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、ネガティブセレクションによりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含み得る。
本明細書に記載される方法は、腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４、またはＣＤ１１ｂを発現する細胞を集団から除去し、それによって、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲの発現に好適な制御性Ｔ細胞枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞、および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を得ることをさらに含み得る。一実施形態では、腫瘍抗原発現細胞は、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片、および抗腫瘍抗原抗体もしくはその断片は、同じ基質、例えば、ビーズに付着させることができ、これを使用して細胞を除去してもよく、または抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片、または抗腫瘍抗原抗体もしくはその断片は、別個のビーズに付着させることができ、これらの混合物を使用して細胞を除去してもよい。他の実施形態では、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去、および腫瘍抗原発現細胞の除去は、逐次的であり、例えば、いずれかの順序で起こり得る。
チェックポイント阻害剤、例えば、本明細書に記載されるチェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞、およびＴＩＭ３＋細胞のうちの１つまたは複数を集団から除去し、それによって、例えば、本明細書に記載されるように、制御性Ｔ細胞枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞、およびチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／もしくはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４もしくはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、ならびにＴＧＦＲ（例えば、ＴＧＦＲベータ）の集団を得ることを含む方法もまた提供される。一実施形態では、チェックポイント阻害剤発現細胞は、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片、および抗チェックポイント阻害剤抗体もしくはその断片は、同じビーズに付着させることができ、これを使用して細胞を除去してもよく、または抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片および抗チェックポイント阻害剤抗体もしくはその断片は、別個のビーズに付着させることができ、これらの混合物を使用して細胞を除去してもよい。他の実施形態では、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去、およびチェックポイント阻害剤発現細胞の除去は、逐次的であり、例えば、いずれかの順序で起こり得る。
本明細書に記載される方法は、ポジティブセレクション工程を含み得る。例えば、Ｔ細胞は、所望されるＴ細胞のポジティブセレクションに十分な期間、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）コンジュゲートビーズ、例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔとともにインキュベートすることによって単離することができる。一実施形態では、この期間は、約３０分間である。さらなる実施形態では、この期間は、３０分間〜３６時間またはそれ以上、ならびにこれらの間のすべての整数値の範囲にわたる。さらなる実施形態では、この期間は、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、または６時間である。さらに別の実施形態では、この期間は、１０〜２４時間、例えば、２４時間である。腫瘍組織からまたは免疫無防備状態の個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離するなど、他の細胞種と比較して存在するＴ細胞がわずかである任意の状況では、Ｔ細胞を単離するために、より長いインキュベーション時間を使用してもよい。さらに、より長いインキュベーション時間を使用することで、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率が増加する。したがって、単純にＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させる時間を短縮もしくは延長することにより、および／またはビーズ対Ｔ細胞の比を増加もしくは減少させることにより（本明細書でさらに説明される）、Ｔ細胞の部分集団は、培養開始時もしくはプロセス中の他の時点で、それについてまたはそれに対して優先的に選択される。追加として、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加または減少させることにより、Ｔ細胞の部分集団は、培養開始時または他の所望される時点で、それについてまたはそれに対して優先的に選択され得る。
一実施形態では、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢ、およびパーフォリン、または他の適切な分子、例えば、他のサイトカインのうちの１つまたは複数を発現するＴ細胞集団が、選択され得る。細胞発現に関してスクリーニングするための方法は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／１２６７１２号に記載されている方法によって決定され得る。
所望される細胞集団をポジティブセレクションまたはネガティブセレクションによって単離するために、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変化させることができる。ある特定の態様では、細胞とビーズとの最大限の接触を確実にするために、ビーズおよび細胞を一緒に混合する量を大幅に減少させる（例えば、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。例えば、一態様では、１００億個の細胞／ｍｌ、９０億個／ｍｌ、８０億個／ｍｌ、７０億個／ｍｌ、６０億個／ｍｌ、または５０億個／ｍｌの濃度が使用される。一態様では、１０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる一態様では、７５００万個、８０００万個、８５００万個、９０００万個、９５００万個、または１億個の細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる態様では、１億２５００万個または１億５０００万個の細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。
高い濃度を使用することにより、細胞収率、細胞活性化、および細胞増殖の増加をもたらすことができる。さらに、高い細胞濃度を使用することにより、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞など、または多数の腫瘍細胞が存在する試料（例えば、白血病血、腫瘍組織など）からの、目的の標的抗原を微弱に発現し得る細胞のより効率的な捕捉が可能となる。このような細胞集団は、治療的価値を有する可能性があり、得ることが望ましいであろう。例えば、高い細胞濃度を使用することにより、通常、微弱なＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択が可能となる。
関連する態様では、より低い細胞濃度を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物を大幅に希釈することにより、粒子と細胞との間の相互作用が最小限に抑えられる。これにより、これらの粒子に結合する所望される抗原を多量に発現する細胞が選択される。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より高いレベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度においてＣＤ８＋Ｔ細胞よりも効率的に捕捉される。一態様では、使用される細胞の濃度は、５×１０６／ｍｌである。他の態様では、使用される濃度は、約１×１０５／ｍｌ〜１×１０６／ｍｌ、およびこれらの間の任意の整数値であり得る。
他の態様では、細胞は、２〜１０℃または室温のいずれかで、様々な速度で様々な長さの期間、ローテータでインキュベートしてもよい。
一実施形態では、集団中の複数の免疫エフェクター細胞は、ジアグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）を発現せず、例えば、ＤＧＫ欠損性である。一実施形態では、集団中の複数の免疫エフェクター細胞は、Ｉｋａｒｏｓを発現せず、例えば、Ｉｋａｒｏｓ欠損性である。一実施形態では、集団中の複数の免疫エフェクター細胞は、ＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓを発現せず、例えば、ＤＧＫ欠損性およびＩｋａｒｏｓ欠損性の両方である。
また、刺激のためのＴ細胞を、洗浄工程後に凍結させてもよい。理論に束縛されることを望むものではなく、凍結工程および後続の解凍工程は、細胞集団中の顆粒球およびある程度の単球を除去することによって、より均一な生成物をもたらす。洗浄工程により血漿および血小板を除去した後、細胞を、凍結溶液中に懸濁させてもよい。多くの凍結溶液およびパラメーターが当該技術分野で既知あり、この文脈において有用であるが、１つの方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７．５％ＤＭＳＯ、または３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、または例えばＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する他の好適な細胞凍結培地の使用を伴い、細胞は、次いで、１分間当たり１°の速度で−８０℃に凍結され、液体窒素貯蔵タンクの蒸気相で保管される。他の制御された凍結法が、−２０℃または液体窒素中での制御されない即時凍結と同様に使用され得る。
ある特定の態様では、凍結保存細胞は、本明細書に記載のように解凍し、洗浄して、室温で１時間静置させた後、本発明の方法を使用して活性化させる。
本明細書に記載される増殖細胞が必要となり得る前の時点における、対象からの血液試料またはアフェレーシス産物の収集もまた、本発明の文脈において企図される。そのため、増殖させるための細胞の供給源は、必要な任意の時点で収集することができ、所望される細胞、例えば、Ｔ細胞を、本明細書に記載されるものなどの免疫エフェクター細胞療法により利益が得られるであろう任意の多数の疾患または状態のための免疫エフェクター細胞療法における今後の使用のために単離し、凍結させることができる。一態様では、血液試料またはアフェレーシスは、全般的に健常な対象から取得される。ある特定の態様では、血液試料またはアフェレーシスは、疾患を発症するリスクがあるが、まだ疾患を発症していない、全般的に健常な対象から取得し、今後の使用のために目的の細胞を単離し、凍結させる。ある特定の態様では、Ｔ細胞は、増殖させ、凍結させ、後の時点で使用してもよい。ある特定の態様では、試料は、本明細書に記載される特定の疾患の診断直後であるが、いかなる治療よりも前に、患者から収集される。さらなる態様では、細胞は、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、照射、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、およびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫除去剤、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、ならびに放射線照射などの薬剤での治療を含むがこれらに限定されない、任意の多数の関連する治療モダリティの前に、対象由来の血液試料またはアフェレーシスから単離される。
本発明のさらなる態様では、Ｔ細胞は、対象に機能性Ｔ細胞を残す治療の直後に、患者から得られる。この点に関して、ある特定のがん治療の後、特に、免疫系を損傷する薬物での治療の後は、患者が通常であれば治療から回復している最中であろう治療後間もない時点で、得られるＴ細胞の品質が、エキソビボで増殖する能力の点で最適であり得るか、または改善され得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載される方法を使用したエキソビボ操作後には、これらの細胞は、生着強化およびインビボ増殖に好ましい状態であり得る。したがって、この回復段階中に、Ｔ細胞、樹状細胞、または他の造血系細胞を含む、血液細胞を収集することが、本発明の文脈において企図される。さらに、ある特定の態様では、動員（例えば、ＧＭ−ＣＳＦでの動員）および調整レジメンを使用して、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生成、および／または増殖にとって有利な状態を、特に、治療法の後の所定の時間枠の間に、対象において作り出すことができる。例示的な細胞型としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、および他の免疫系細胞が挙げられる。
一実施形態では、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現する免疫エフェクター細胞は、低い免疫強化用量のｍＴＯＲ阻害剤を受容した対象から得られる。ある実施形態では、ＣＡＲを発現するように操作されるべき免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団は、対象におけるかまたは対象から採取されたＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベル、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が、少なくとも一過的に増加した状態となるように、低い免疫強化用量のｍＴＯＲ阻害剤から十分な時間の後、またはその十分な投薬の後に採取される。
他の実施形態では、ＣＡＲを発現するように操作されているか、またはこれから操作される免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団は、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の数を増加させるか、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比を増加させる量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることによって、エキソビボで処置することができる。
本出願の方法は、５％以下、例えば、２％のヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を用いることができ、既知の培養培地条件および組成、例えば、Smith et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement" Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31に記載されているものを採用し得ることが理解される。
一実施形態では、Ｔ細胞集団は、ジアグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）欠損性である。ＤＧＫ欠損細胞には、ＤＧＫ ＲＮＡもしくはタンパク質を発現しないか、またはＤＧＫ活性が低減もしくは阻害されている、細胞が含まれる。ＤＧＫ欠損細胞は、遺伝学的アプローチによって、例えば、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを投与して、ＤＧＫ発現を低減または防止することによって、生成することができる。代替として、ＤＧＫ欠損細胞は、本明細書に記載されるＤＧＫ阻害剤での処置によって生成することができる。
一実施形態では、Ｔ細胞集団は、Ｉｋａｒｏｓ欠損性である。Ｉｋａｒｏｓ欠損細胞には、Ｉｋａｒｏｓ ＲＮＡもしくはタンパク質を発現しないか、またはＩｋａｒｏｓ活性が低減もしくは阻害されている細胞が含まれ、Ｉｋａｒｏｓ欠損細胞は、遺伝学的アプローチによって、例えば、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを投与して、Ｉｋａｒｏｓ発現を低減または防止することによって、生成することができる。代替として、Ｉｋａｒｏｓ欠損細胞は、Ｉｋａｒｏｓ阻害剤、例えば、レナリドマイドでの処置によって生成することができる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞集団は、ＤＧＫ欠損性かつＩｋａｒｏｓ欠損性であり、例えば、ＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓを発現しないか、またはＤＧＫ活性およびＩｋａｒｏｓ活性が低減もしくは阻害されている。このようなＤＧＫ欠損性かつＩｋａｒｏｓ欠損性の細胞は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかによって生成することができる。
ある実施形態では、ＮＫ細胞が、対象から得られる。別の実施形態では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株、例えば、ＮＫ−９２細胞株（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ）である。
同種ＣＡＲ
本明細書に記載される実施形態では、免疫エフェクター細胞は、同種免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。例えば、細胞は、同種Ｔ細胞、例えば、機能性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ならびに／またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／もしくはＨＬＡクラスＩＩの発現を欠く同種Ｔ細胞であり得る。
機能性ＴＣＲを欠くＴ細胞は、例えば、その表面上にいずれの機能性ＴＣＲも発現しないように操作され得るか、機能性ＴＣＲを含む１つまたは複数のサブユニットを発現しないように操作され得る［例えば、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、ＴＣＲイプシロン、および／またはＴＣＲゼータを発現しない（もしくはそれらの低減された発現を呈する）ように操作され得る］か、その表面上に機能性ＴＣＲをほとんど産生しないように操作され得る。代替として、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットのうちの１つまたは複数の突然変異形態または短縮形態の発現によって、実質的に損傷したＴＣＲを発現し得る。「実質的に損傷したＴＣＲ」という用語は、このＴＣＲが、宿主において有害な免疫反応を誘起しないことを意味する。
本明細書に記載されるＴ細胞は、例えば、その表面上に機能性ＨＬＡを発現しないように操作され得る。例えば、本明細書に記載されるＴ細胞は、ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラス１および／またはＨＬＡクラスＩＩの細胞表面発現が下方制御されるように操作され得る。一部の実施形態では、ＨＬＡの下方制御は、ベータ−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現を低減または消失させることによって、達成され得る。
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、機能性ＴＣＲならびに機能性ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩを欠く場合がある。
機能性ＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を欠く修飾Ｔ細胞は、ＴＣＲまたはＨＬＡの１つまたは複数のサブユニットのノックアウトまたはノックダウンを含む、任意の好適な手段によって得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、クラスター化された規則的に間隔の空いた短い回文配列の繰り返し（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ、ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用した、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡのノックダウンを含み得る。
一部の実施形態では、同種細胞は、例えば、本明細書に記載される任意の方法によって、阻害性分子を発現しないか、または低いレベルで発現する細胞であり得る。例えば、細胞は、例えば、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させることができる、阻害性分子を発現しないか、または低いレベルで発現する細胞であり得る。阻害性分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、およびＴＧＦＲベータが挙げられる。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質レベルでの阻害による阻害性分子の阻害は、ＣＡＲ発現細胞の性能を最適化させ得る。いくつかの実施形態では、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、例えば、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、クラスター化された規則的に間隔の空いた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が使用され得る。
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
一部の実施形態では、ＴＣＲ発現および／またはＨＬＡ発現は、細胞、例えば、Ｔ細胞において、ＴＣＲおよび／もしくはＨＬＡならびに／または本明細書に記載される阻害性分子［例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／もしくはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４もしくはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦＲベータ］をコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡを使用して阻害することができる。
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの発現系、ならびに例示的なｓｈＲＮＡは、例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際出願第ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落６４９および６５０に記載されており、これは、参照によりその全体が組み込まれる。
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するＣＲＩＳＰＲ
本明細書に使用される「ＣＲＩＳＰＲ」または「ＴＣＲおよび／またはＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ」または「ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するＣＲＩＳＰＲ」は、クラスター化された規則的に間隔の空いた短い回文配列の繰り返しのセット、またはこのような繰り返しのセットを含む系を指す。「Ｃａｓ」は、本明細書に使用されるとき、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指す。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系は、細胞、例えば、Ｔ細胞において、ＴＣＲ遺伝子および／もしくはＨＬＡ遺伝子、ならびに／または本明細書に記載される阻害性分子［例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／もしくはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４もしくはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦＲベータ］をサイレンシングまたは突然変異させるために使用することができる、ＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓに由来する系を指す。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびその使用は、例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際出願第ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落６５１〜６５８に記載されており、これは、参照によりその全体が組み込まれる。
ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するＴＡＬＥＮ
「ＴＡＬＥＮ」または「ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ」または「ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するＴＡＬＥＮ」は、細胞、例えば、Ｔ細胞において、ＨＬＡ遺伝子および／もしくはＴＣＲ遺伝子、ならびに／または本明細書に記載される阻害性分子［例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／もしくはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４もしくはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦＲベータ］を編集するために使用することができる人工的ヌクレアーゼである、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを指す。
ＴＡＬＥＮおよびその使用は、例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際出願第ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落６５９〜６６５に記載されており、これは、参照によりその全体が組み込まれる。
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害する亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
「ＺＦＮ」または「亜鉛フィンガーヌクレアーゼ」または「ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＺＦＮ」または「ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するＺＦＮ」は、細胞、例えば、Ｔ細胞において、ＨＬＡ遺伝子および／もしくはＴＣＲ遺伝子、ならびに／または本明細書に記載される阻害性分子［例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／もしくはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４もしくはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦＲベータ］を編集するために使用することができる人工的ヌクレアーゼである、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを指す。
ＺＦＮおよびその使用は、例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際出願第ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落６６６〜６７１に記載されており、これは、参照によりその全体が組み込まれる。
テロメラーゼ発現
テロメアは、体細胞存続において重要な役割を果たし、その長さは、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）によって維持されている。ＣＬＬ細胞ではテロメア長は非常に短く（Roth et al., "Significantly shorter telomeres in T-cells of patients with ZAP-70+/CD38 chronic lymphocytic leukaemia" British Journal of Haematology, 143, 383-386., August 28 2008）、作製されたＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ１９細胞ではさらに短い可能性があり、患者への養子移入後にそれらが増殖する能力は制限されている。テロメラーゼ発現は、ＣＡＲ発現細胞を複製による消耗からレスキューすることができる。
いかなる理論によっても束縛されることを望むものではないが、一部の実施形態では、治療用Ｔ細胞は、Ｔ細胞における短縮されたテロメアに起因して、患者における存続性が短期的であり、このため、テロメラーゼ遺伝子のトランスフェクションにより、Ｔ細胞のテロメアを延長させ、患者におけるＴ細胞の存続性を改善してもよい。Carl June, "Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic", Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)を参照されたい。したがって、ある実施形態では、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、テロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒性サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴを異所的に発現する。一部の態様では、本開示は、ＣＡＲ発現細胞を産生する方法であって、細胞を、テロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒性サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸と接触させることを含む方法を提供する。細胞は、ＣＡＲをコードするコンストラクトと接触させる前、それと同時に、またはその後で、核酸と接触させることができる。
テロメラーゼ発現は、安定的であってもよく（例えば、核酸が、細胞のゲノムに組み込まれる）、または一過性であってもよい（例えば、核酸は組み込まれず、発現は、ある期間、例えば数日間の後に減少する）。安定な発現は、細胞に、テロメラーゼサブユニットをコードするＤＮＡおよび選択性マーカーをトランスフェクトまたは形質導入し、安定な組込み体を選択することによって達成することができる。代替としてまたは組合せとして、安定な発現は、例えば、Ｃｒｅ／ＬｏｘまたはＦＬＰ／ＦＲＴ系を使用した部位特異的組換えによって達成してもよい。
一過性発現は、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡのトランスフェクションまたは形質導入を伴い得る。一部の実施形態では、一過性ｍＲＮＡトランスフェクションにより、ときにはＴＥＲＴでの安定なトランスフェクションに付随する遺伝的不安定性が回避される。外来性テロメラーゼ活性の一過性発現は、例えば、国際出願第ＷＯ２０１４／１３０９０９号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、テロメラーゼサブユニットのｍＲＮＡに基づくトランスフェクションは、Ｍｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓにより市販されているメッセンジャーＲＮＡ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（商標）プラットフォームに従って行われる。例えば、この方法は、米国特許第８７１０２００号、同第８８２２６６３号、同第８６８００６９号、同第８７５４０６２号、同第８６６４１９４号、または同第８６８００６９号に記載されている方法であり得る。
ある実施形態では、ｈＴＥＲＴは、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質ＩＤ ＡＡＣ５１７２４．１のアミノ酸配列を有する（Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795）。
Figure 2022002525
ある実施形態では、ｈＴＥＲＴは、配列番号５の配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６＾、９７％、９８％、または９９％同一な配列を有する。ある実施形態では、ｈＴＥＲＴは、配列番号５の配列を有する。ある実施形態では、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端、または両方に欠失（例えば、５個以下、１０個以下、１５個以下、２０個以下、または３０個以下のアミノ酸の）を含む。ある実施形態では、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端、または両方にトランスジェニックアミノ酸配列（例えば、５個以下、１０個以下、１５個以下、２０個以下、または３０個以下のアミノ酸の）を含む。
ある実施形態では、ｈＴＥＲＴは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０１８１６７の核酸配列によってコードされる（Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795）。
Figure 2022002525
ある実施形態では、ｈＴＥＲＴは、配列番号８の配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６＾、９７％、９８％、または９９％同一な配列を有する核酸によってコードされる。ある実施形態では、ｈＴＥＲＴは、配列番号８の核酸によってコードされる。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）をがんに対する１つまたは複数のＣＡＲを含有するように操作された免疫エフェクター細胞を提供する。これは、がん関連抗原に特異的なＣＡＲ上の抗原結合性ドメインを通じて達成される。本明細書に記載されるＣＡＲによって標的とされ得るがん関連抗原（腫瘍抗原）には、２つのクラスがある：（１）がん細胞の表面上に発現するがん関連抗原、および（２）がん関連抗原自体は細胞内にあるが、そのような抗原の断片（ペプチド）がＭＨＣ（主要組織適合複合体）によってがん細胞の表面上に提示されるもの。
したがって、例えば、本明細書に記載される方法によって得られる免疫エフェクター細胞は、以下のがん関連抗原（腫瘍抗原）のうちの１つを標的とするＣＡＲを含有するように操作することができる：ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ−１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９、および１９Ａ２４とも称される）；Ｃ型レクチン様分子−１（ＣＬＬ−１またはＣＬＥＣＬ１）；ＣＤ３３；上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２−８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２−３）ｂＤＧａｌｐ（１−４）ｂＤＧｌｃｐ（１−１）Ｃｅｒ）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原［（Ｔｎ Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）］；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２（ＩＬ−１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２）；メソテリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ−１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（ＴｅｓｔｉｓｉｎまたはＰＲＳＳ２１）；血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；Ｌｅｗｉｓ（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ−ベータ）；ステージ特異的胎児抗原−４（ＳＳＥＡ−４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体チロシン−タンパク質キナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ（Ｐｒｏｓｔａｓｅ）；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２突然変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；ブレイクポイントクラスター領域（ＢＣＲ）およびエーベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子相同体１（Ａｂｌ）からなる癌遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ−ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルＬｅｗｉｓ接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２−３）ｂＤＧａｌｐ（１−４）ｂＤＧｌｃｐ（１−１）Ｃｅｒ）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７−関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；プロテインＧ結合型受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ−ＢＲ−１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パンネキシン３（ＰＡＮＸ３）；プロテインＧ結合型受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウイルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ−１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ−Ａ１）；ＥＴＳ転座−変異体遺伝子６、１２ｐ染色体に位置（ＥＴＶ６−ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合性細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）；黒色腫がん精巣抗原−１（ＭＡＤ−ＣＴ−１）；黒色腫がん精巣抗原−２（ＭＡＤ−ＣＴ−２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３突然変異体；プロステイン；生存；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１またはガレクチン８）、Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原１（ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１）；ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座ブレイクポイント；黒色腫のアポトーシス阻害因子（ＭＬ−ＩＡＰ）；ＥＲＧ［膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子］；Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；対合ボックスタンパク質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ−ｍｙｃニワトリ骨髄芽球腫ウイルス癌遺伝子神経芽細胞腫由来相同体（ＭＹＣＮ）；Ｒａｓ相同体ファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）；シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（亜鉛フィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳまたはインプリント部位の制御因子の同胞）、Ｔ細胞によって認識される扁平上皮細胞癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；対合ボックスタンパク質Ｐａｘ−５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ−ＴＥＳ１）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ−４）；滑膜肉腫、Ｘブレイクポイント２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物の受容体（ＲＡＧＥ−１）；腎臓偏在１（ＲＵ１）；腎臓偏在２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸内カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０−２突然変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０−２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡのＦｃ断片受容体（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様分子含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；ならびに免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）。
ある実施形態では、多重特異的抗体分子は、二重特異的抗体分子である。二重特異的抗体は、２つ以下の抗原に対する特異性を有する。二重特異的抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列および第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列を特徴とする。ある実施形態では、第１のエピトープおよび第２のエピトープは、同じ抗原上、例えば、同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、第１のエピトープおよび第２のエピトープは、重複する。ある実施形態では、第１のエピトープおよび第２のエピトープは、重複しない。ある実施形態では、第１のエピトープおよび第２のエピトープは、異なる抗原上、例えば、異なるタンパク質（または多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。ある実施形態では、二重特異的抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列、ならびに第２のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。ある実施形態では、二重特異的抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体および第２のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体を含む。ある実施形態では、二重特異的抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体またはその断片および第２のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体またはその断片を含む。ある実施形態では、二重特異的抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖまたはその断片および第２のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖまたはその断片を含む。
ある特定の実施形態では、抗体分子は、多重特異的（例えば、二重特異的または三重特異的）抗体分子である。二重特異的抗体分子またはヘテロ二量体抗体分子を生成するためのプロトコル、および二重特異的抗体分子の様々な構造は、例えば、２０１５年３月１３日に出願されたＷＯ２０１５／１４２６７５の段落４５５〜４５８に記載されており、これは、参照によりその全体が組み込まれる。
一態様では、二重特異的抗体分子は、ＣＤ１９に対する結合特異性を有し、例えば、本明細書に記載されるｓｃＦｖを含むか、または本明細書に記載されるｓｃＦｖに由来する軽鎖ＣＤＲおよび／もしくは重鎖ＣＤＲを含む、第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列、例えばｓｃＦｖ、ならびに異なる抗原上の第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列を特徴とする。
キメラＴＣＲ
一態様では、本発明の抗体および抗体断片（例えば、ＣＤ１９抗体および断片）を、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）鎖、例えば、ＴＣＲアルファ鎖またはＴＣＲベータ鎖の１つまたは複数の定常ドメインにグラフトして、キメラＴＣＲを作り出すことができる。理論に束縛されるものではなく、キメラＴＣＲは、抗原結合の際に、ＴＣＲ複合体を通じてシグナル伝達すると考えられている。例えば、本明細書に開示されるｓｃＦｖを、ＴＣＲ鎖、例えば、ＴＣＲアルファ鎖および／またはＴＣＲベータ鎖の定常ドメイン、例えば、細胞外定常ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインの少なくとも一部分にグラフトすることができる。別の例として、抗体断片、例えば、本明細書に記載されるＶＬドメインを、ＴＣＲアルファ鎖の定常ドメインにグラフトしてもよく、抗体断片、例えば、本明細書に記載されるＶＨドメインを、ＴＣＲベータ鎖の定常ドメインにグラフトしてもよい（または代替として、ＶＬドメインをＴＣＲベータ鎖の定常ドメインにグラフトしてもよく、ＶＨドメインをＴＣＲアルファ鎖にグラフトしてもよい）。別の例として、抗体または抗体断片のＣＤＲを、ＴＣＲアルファ鎖および／またはベータ鎖にグラフトして、キメラＴＣＲを作り出してもよい。例えば、本明細書に開示されるＬＣＤＲを、ＴＣＲアルファ鎖の可変ドメインにグラフトしてもよく、本明細書に開示されるＨＣＤＲを、ＴＣＲベータ鎖の可変ドメインにグラフトしてもよく、またはその逆であってもよい。このようなキメラＴＣＲは、例えば、当該技術分野で既知の方法によって産生することができる［例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 2000;7:1369-1377、Zhang T et al, Cancer Gene Ther 2004;11:487-496、Aggen et al, Gene Ther. 2012 Apr;19(4):365-74］。
非抗体スキャフォールド
いくつかの実施形態では、抗原結合性ドメインは、非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、アンキリン、ドメイン抗体、リポカリン、小モジュラー免疫薬、マキシボディ、プロテインＡ、またはアフィリンを含む。非抗体スキャフォールドは、細胞上の標的抗原に結合する能力を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合性ドメインは、細胞上に発現する天然のタンパク質のポリペプチドまたはその断片である。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、非抗体スキャフォールドを含む。結果として得られるポリペプチドが標的細胞上の標的抗原に特異的に結合する少なくとも１つの結合性領域を含む限り、広範な非抗体スキャフォールドを利用することができる。
非抗体スキャフォールドとしては、フィブロネクチン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、ＭＡ）、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ、チューリッヒ、スイス）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．、ケンブリッジ、マサチューセッツ州およびＡｂｌｙｎｘ ｎｖ、ズウェイナールデ、ベルギー）、リポカリン（Ｐｉｅｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ ＡＧ、フライジング、ドイツ）、低分子モジュラー免疫薬（Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、シアトル、ワシントン州）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．、マウンテンビュー、カリフォルニア州）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＧ、スウェーデン）、およびアフィリン（ガンマ血漿またはユビキチン）（Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ、ハレ（ザーレ）、ドイツ）が挙げられる。
ある実施形態では、抗原結合性ドメインは、標的細胞の表面上のカウンターリガンドに結合する分子の細胞外ドメイン、またはそのカウンターリガンド結合性断片を含む。
免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをコードする配列を含む組換えＤＮＡコンストラクトを含み得、ここで、ＣＡＲは、腫瘍抗原、例えば、本明細書に記載される腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合性ドメイン（例えば、抗体もしくは抗体断片、ＴＣＲもしくはＴＣＲ断片）、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ゼータ鎖を含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインの少なくとも一部分を含むＣＡＲの部分を指す。他の箇所に記載されるように、本明細書に記載される方法は、例えば制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団に由来する細胞に、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸を形質導入することを含み得る。
具体的な態様では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖドメインを含み、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号１に提供されるような適宜リーダー配列が先行し得、続いて、配列番号２または配列番号３６または配列番号２３に提供されるような適宜ヒンジ配列、配列番号６に提供されるような膜貫通領域、配列番号７または配列番号１６を含む細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびに配列番号９または配列番号１０を含むＣＤ３ゼータ配列があり得、例えば、これらのドメインは、連続しており、同じリーディングフレーム内にあり、単一の融合タンパク質を形成している。
一態様では、例示的なＣＡＲコンストラクトは、適宜リーダー配列（例えば、本明細書に記載されるリーダー配列）、細胞外抗原結合性ドメイン（例えば、本明細書に記載される抗原結合性ドメイン）、ヒンジ（例えば、本明細書に記載されるヒンジ領域）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載される膜貫通ドメイン）、および細胞内刺激ドメイン（例えば、本明細書に記載される細胞内刺激ドメイン）を含む。一態様では、例示的なＣＡＲコンストラクトは、適宜リーダー配列（例えば、本明細書に記載されるリーダー配列）、細胞外抗原結合性ドメイン（例えば、本明細書に記載される抗原結合性ドメイン）、ヒンジ（例えば、本明細書に記載されるヒンジ領域）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載される膜貫通ドメイン）、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載される共刺激シグナル伝達ドメイン）、および／または細胞内一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載されるシグナル伝達ドメイン）を含む。
例示的なリーダー配列は、配列番号１として提供される。例示的なヒンジ／スペーサー配列は、配列番号２または配列番号３６または配列番号２３として提供される。例示的な膜貫通ドメイン配列は、配列番号６として提供される。４−１ＢＢタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの例示的な配列は、配列番号７として提供される。ＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインの例示的な配列は、配列番号１６として提供される。例示的なＣＤ３ゼータドメイン配列は、配列番号９または配列番号１０として提供される。
一態様では、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組換え核酸コンストラクトを含み、ここで、核酸分子は、抗原結合性ドメインをコードする核酸配列を含み、この配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続しており、同じリーディングフレーム内にある。ＣＡＲにおいて使用することができる例示的な細胞内シグナル伝達ドメインとしては、例えば、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４−１ＢＢなどの１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。一部の事例では、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの任意の組合せを含み得る。
所望される分子をコードする核酸配列は、当該技術分野で既知の組換え法を使用して、例えば、標準的な技法を使用して、核酸分子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすることによって、それを含むことが既知のベクターから核酸分子を誘導することによって、またはそれを含む細胞および組織から直接的に単離することによって、得ることができる。代替として、目的の核酸は、クローニングではなく合成で産生することができる。
ＣＡＲをコードする核酸は、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターのコンストラクトを使用して、免疫エフェクター細胞に導入することができる。
ＣＡＲをコードする核酸はまた、例えば、細胞に直接トランスフェクトすることができるＲＮＡコンストラクトを使用して、免疫エフェクター細胞に導入することもできる。トランスフェクションにおいて使用するためのｍＲＮＡを生成するための方法は、特別に設計したプライマーを用いた鋳型のインビトロ転写（ＩＶＴ）、続いて、ポリＡ付加により、３’および５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）（例えば、本明細書に記載される３’および／または５’ＵＴＲ）、５’キャップ（例えば、本明細書に記載される５’キャップ）、ならびに／または配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（例えば、本明細書に記載されるＩＲＥＳ）、発現される核酸、ならびに典型的に長さが５０〜２０００塩基であるポリＡ尾部（例えば、本明細書に記載される、例えば、配列番号３５）を含有するコンストラクトを産生することを伴う。このようにして産生されたＲＮＡは、様々な種類の細胞に効率的にトランスフェクトすることが可能である。一実施形態では、鋳型は、ＣＡＲの配列を含む。ある実施形態では、ＲＮＡ ＣＡＲベクターは、電気穿孔によって細胞、例えば、Ｔ細胞に形質導入される。
抗原結合性ドメイン
一態様では、複数の免疫エフェクター細胞、例えば、制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団は、別様に抗原結合性ドメインとも称される標的特異的結合性エレメントを含むＣＡＲをコードする核酸を含む。結合性エレメントの選択は、標的細胞の表面に定められるリガンドの種類および数に依存する。例えば、抗原結合性ドメインは、特定の疾患状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして機能するリガンドを認識するように選択され得る。したがって、本明細書に記載されるＣＡＲにおいて抗原結合性ドメインのリガンドとして機能し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス感染、細菌感染、および寄生虫感染、自己免疫疾患ならびにがん細胞に関連するものが挙げられる。
一態様では、抗原結合性ドメインを含むＣＡＲの部分は、腫瘍抗原、例えば、本明細書に記載される腫瘍抗原を標的とする抗原結合性ドメインを含む。
抗原結合性ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ならびにラクダ由来ナノボディの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および可変ドメイン（ＶＨＨ）などの一本鎖ドメイン抗体を含むがこれらに限定されないその機能的断片、ならびに抗原結合性ドメインとして機能することが当該技術分野で既知の代替的なスキャフォールド、例えば、組換えフィブロネクチンドメイン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはその断片、例えば、一本鎖ＴＣＲなどを含むがこれらに限定されない、抗原に結合する任意のドメインであり得る。一部の事例では、抗原結合性ドメインは、ＣＡＲが最終的に使用されるであろうものと同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトにおける使用では、ＣＡＲの抗原結合性ドメインが、抗体または抗体断片の抗原結合性ドメインのヒトまたはヒト化残基を含むことが有益な場合がある。
ある実施形態では、抗原結合性ドメインは、抗ＣＤ１９抗体またはその断片、例えば、ｓｃＦｖを含む。例えば、抗原結合性ドメインは、表１に列挙される可変重鎖および可変軽鎖を含む。可変重鎖および可変軽鎖を接合するリンカー配列は、例えば、本明細書に記載されるリンカー配列のうちのいずれかであり得るか、または代替として、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１０４）であり得る。
Figure 2022002525
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ヒト化抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖドメインを含有するＣＤ１９ ＣＡＲコンストラクトは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／１５３２７０号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖドメインのマウスおよびヒト化ＣＤＲ配列の配列は、重鎖可変ドメインについては表７に示され、軽鎖可変ドメインについては表８に示されている。「ＩＤ」は、各ＣＤＲのそれぞれの配列番号を表す。
Figure 2022002525
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当該技術分野における任意の既知のＣＤ１９ ＣＡＲ、例えば、任意の既知のＣＤ１９ ＣＡＲのＣＤ１９抗原結合性ドメインも、本開示により使用することができる。例えば、ＬＧ−７４０、米国特許第８，３９９，６４５号；米国特許第７，４４６，１９０号、Xu et al., Leuk Lymphoma. 2013 54(2):255-260(2012)、Cruz et al., Blood 122(17):2965-2973 (2013)、Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011)、Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010)、Kochenderfer et al., Blood 122 (25):4129-39(2013)、および16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (May 15-18, Salt Lake City) 2013, Abst 10に記載されているＣＤ１９ ＣＡＲ。
ある実施形態では、抗原結合性ドメインは、抗ＢＣＭＡ抗体またはその断片、例えば、ｓｃＦｖを含む。例えば、抗原結合性ドメインは、表１１に列挙される可変重鎖および可変軽鎖を含む。可変重鎖および可変軽鎖を接合するリンカー配列は、例えば、本明細書に記載されるリンカー配列のうちのいずれかであり得る。抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖドメインを含有する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲコンストラクトは、本明細書、例えば、表１１に記載されているか、または参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００４６７２４Ａ１に記載されている。
いくつかの実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体またはその断片、例えば、ｓｃＦｖを含む。例えば、抗原結合性ドメインは、ＵＳ２０１４／０３２２２７５Ａ１に記載されている可変重鎖および可変軽鎖を含む。抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖドメインを含有する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲコンストラクトは、本明細書に記載されており、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０３２２２７５Ａ１に記載されている。いくつかの実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＣＤ１２３抗体またはその断片、例えば、ｓｃＦｖを含む。例えば、抗原結合性ドメインは、ＵＳ２０１４／０３２２２１２Ａ１またはＵＳ２０１６／００６８６０１Ａ１に記載されている可変重鎖および可変軽鎖を含む。抗ＣＤ１２３ ｓｃＦｖドメインを含有する抗ＣＤ１２３ ＣＡＲコンストラクトは、本明細書に記載されており、例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０３２２２１２Ａ１またはＵＳ２０１６／００６８６０１Ａ１に記載されている。
いくつかの実施形態では、抗原結合性ドメインは、抗メソテリン抗体またはその断片、例えば、ｓｃＦｖを含む。例えば、抗原結合性ドメインは、ＷＯ２０１５／０９０２３０に記載されている可変重鎖および可変軽鎖を含む。抗メソテリンｓｃＦｖドメインを含有する抗メソテリンＣＡＲコンストラクトは、本明細書に記載されており、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０９０２３０に記載されている。
いくつかの実施形態では、抗原結合性ドメインは、抗ＣＬＬ１抗体またはその断片、例えば、ｓｃＦｖを含む。例えば、抗原結合性ドメインは、ＵＳ２０１６／００５１６５１Ａ１に記載されている可変重鎖および可変軽鎖を含む。抗ＣＬＬ１ ｓｃＦｖドメインを含有する抗ＣＬＬ１ ＣＡＲコンストラクトは、本明細書に記載されており、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００５１６５１Ａ１に記載されている。
いくつかの実施形態では、抗原結合性ドメインは、抗ＣＤ３３抗体またはその断片、例えば、ｓｃＦｖを含む。例えば、抗原結合性ドメインは、ＵＳ２０１６／００９６８９２Ａ１に記載されている可変重鎖および可変軽鎖を含む。抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖドメインを含有する抗ＣＤ３３ ＣＡＲコンストラクトは、本明細書に記載されており、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００９６８９２Ａ１に記載されている。
一実施形態では、抗原結合性ドメインは、上記に列挙した抗体に由来する１つ、２つ、３つ（例えば、３つすべて）の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３を含む、かつ／または上記に列挙した抗体に由来する１つ、２つ、３つ（例えば、３つすべて）の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３を含む。一実施形態では、抗原結合性ドメインは、上記に列挙したかまたは上述の抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。
一態様では、抗腫瘍抗原結合性ドメインは、断片、例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。一態様では、本明細書に記載される抗がん関連抗原結合性ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、または二官能性（例えば、二重特異的）ハイブリッド抗体である［例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)］。一態様では、本発明の抗体およびその断片は、野生型の親和性または強化された親和性を有する本明細書に記載されるがん関連抗原タンパク質に結合する。
一部の事例では、ｓｃＦｖは、当該技術分野で既知の方法に従って調製することができる［例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい］。ＳｃＦｖ分子は、可動性ポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨ領域およびＶＬ領域を一緒に連結させることによって産生することができる。ｓｃＦｖ分子は、最適な長さおよび／またはアミノ酸組成を有するリンカー（例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー）を含む。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折りたたまれ、相互作用するかに大きく影響を及ぼし得る。実際に、短いポリペプチドリンカーを用いた場合（例えば、５〜１０個のアミノ酸）、鎖内折りたたみが防止される。鎖内折りたたみは、２つの可変領域を一緒にして、機能的エピトープ結合性部位を形成するためにも必要である。リンカーの配向およびサイズの例については、例えば、Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開第２００５／０１００５４３号、同第２００５／０１７５６０６号、同第２００７／００１４７９４号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０２０２５８号および同第ＷＯ２００７／０２４７１５号を参照されたく、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
ｓｃＦｖは、ＶＬ領域とＶＨ領域との間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上のアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、任意の天然のアミノ酸を含んでもよい。一部の実施形態では、リンカー配列は、アミノ酸グリシンおよびセリンを含む。別の実施形態では、リンカー配列は、グリシンおよびセリンのセットの繰り返し、例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含み、ここで、ｎは、１に等しいまたは１を上回る正の整数である（配列番号２６）。一実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号２７）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号２８）であり得る。リンカーの長さの変動は、活性を保持することもあれば、活性を強化して、活性研究においてより優れた有効性をもたらすこともある。
別の態様では、抗原結合性ドメインは、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）またはその断片、例えば、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）である。このようなＴＣＲを作製する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000)、Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004)、Aggen et al, Gene Ther. 19(4):365-74 (2012)を参照されたい（参考文献は、その全体が本明細書に組み込まれる）。例えば、リンカー（例えば、可動性ペプチド）によって連結されたＴ細胞クローンから、Ｖα遺伝子およびＶβ遺伝子を含有するｓｃＴＣＲを操作することができる。このアプローチは、がん関連標的自体は細胞内にあるが、その抗原の断片（ペプチド）がＭＨＣによってがん細胞の表面上に提示されるものに対して、非常に有用である。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、様々な実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合した膜貫通ドメインを含むように、ＣＡＲを設計することができる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する１つまたは複数の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通領域が由来するタンパク質の細胞外領域に関連する１つもしくは複数のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、最大１５個のアミノ酸）および／または膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域に関連する１つもしくは複数の追加のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、最大１５個のアミノ酸）を含み得る。一態様では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメインのうちの１つに関連するものである。一部の事例では、膜貫通ドメインは、そのようなドメインと、同じかまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインとの結合を回避するように、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるように、選択され得るか、アミノ酸置換によって修飾され得る。一態様では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ発現細胞の細胞表面上の別のＣＡＲとホモ二量体化することができる。異なる態様では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲＴに存在する天然の結合パートナーの結合性ドメインとの相互作用を最小限に抑えるように修飾または置換され得る。
膜貫通ドメインは、天然の供給源または組換えの供給源のいずれに由来してもよい。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。一態様では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合しているときはいつでも、細胞内ドメインにシグナル伝達を行うことができる。本発明において特に有用な膜貫通ドメインには、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域が少なくとも含まれ得る。一部の実施形態では、膜貫通ドメインには、例えば、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒ α、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃの膜貫通領域が少なくとも含まれ得る。
一部の事例では、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質由来のヒンジを介して、ＣＡＲの細胞外領域、例えば、ＣＡＲの抗原結合性ドメインに、結合することができる。例えば、一実施形態では、ヒンジは、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジ、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、またはＣＤ８ａヒンジであり得る。一実施形態では、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号２のアミノ酸配列を含む（例えば、それからなる）。一態様では、膜貫通ドメインは、配列番号６の膜貫通ドメインを含む（例えば、それからなる）。
一態様では、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、一実施形態では、ヒンジまたはスペーサーは、以下のアミノ酸配列のヒンジを含む：
Figure 2022002525
 一部の実施形態では、ヒンジまたはスペーサーは、以下のヌクレオチド配列によってコードされるヒンジを含む。
Figure 2022002525
一態様では、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＤヒンジを含む。例えば、一実施形態では、ヒンジまたはスペーサーは、以下のアミノ酸配列のヒンジを含む：
Figure 2022002525
 一部の実施形態では、ヒンジまたはスペーサーは、以下のヌクレオチド配列によってコードされるヒンジを含む。
Figure 2022002525
一態様では、膜貫通ドメインは、組換えであってもよく、その場合は、主として、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含む。一態様では、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが、組換え膜貫通ドメインの各末端に確認され得る。
適宜、長さが２〜１０個のアミノ酸である短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質領域との間の連結部を形成し得る。グリシン−セリンのダブレットが、特に好適なリンカーをもたらす。例えば、一態様では、リンカーは、
Figure 2022002525
 のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、
Figure 2022002525
 のヌクレオチド配列によってコードされる。
一態様では、ヒンジまたはスペーサーは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
細胞質ドメイン
ＣＡＲの細胞質ドメインまたは細胞質領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般に、ＣＡＲが導入されている免疫細胞の通常のエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化を担う。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特化した機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。そのため、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特化した機能を行うよう細胞に指示する、タンパク質の部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体が用いられ得るが、多くの場合には、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分が使用される範囲では、このような短縮された部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用することができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、したがって、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮された部分を含むことを意味する。
本明細書に記載されるＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、抗原受容体の係合後にシグナル伝達を開始するように協働して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列、ならびに同じ機能能力を有するこれらの配列の任意の誘導体または変異体および任意の組換え配列が挙げられる。
ＴＣＲ単独により生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であること、ならびに二次シグナルおよび／または共刺激シグナルも必要とされることが、既知である。したがって、Ｔ細胞活性化は、以下の２つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されると言うことができる：ＴＣＲを通じた抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次細胞内シグナル伝達ドメイン）および抗原非依存的様式で、二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供するよう作用するもの（二次細胞質ドメイン、例えば共刺激ドメイン）。
一次シグナル伝達ドメインは、刺激様式または阻害様式のいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する。刺激様式で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして既知のシグナル伝達モチーフを含み得る。
本発明において特に有用なＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄのものが挙げられる。一実施形態では、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータ、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３ゼータ配列の一次シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、天然のＩＴＡＭドメインと比較して変化した（例えば、増加または減少した）活性を有する、修飾型ＩＴＡＭドメイン、例えば、突然変異型ＩＴＡＭドメインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、修飾型ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化および／または短縮型ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン自体を含んでもよく、または本発明のＣＡＲの文脈で有用な任意の他の所望される細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせてもよい。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達ドメインを含む。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含む、ＣＡＲの部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。例えば、ＣＤ２７共刺激は、インビトロにおいてヒトＣＡＲＴ細胞の増殖、エフェクター機能、および生存を強化し、インビボでヒトＴ細胞の存続性および抗腫瘍活性を増強させることが実証されている［Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706］。このような共刺激分子のさらなる例としては、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、およびＰＡＧ／Ｃｂｐが挙げられる。
ＣＡＲの細胞質部分の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムな順序または特定の順序で互いに連結され得る。適宜、例えば、長さが２〜１０個のアミノ酸（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸）である短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーが、細胞内シグナル伝達配列間の連結部を形成してもよい。一実施形態では、グリシン−セリンのダブレットが、好適なリンカーとして使用され得る。一実施形態では、単一のアミノ酸、例えば、アラニン、グリシンが、好適なリンカーとして使用され得る。
一態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある実施形態では、２つ以上、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば、本明細書に記載されるリンカー分子によって分離されている。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、リンカー分子は、グリシン残基である。一部の実施形態では、リンカーは、アラニン残基である。
一態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様では、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号７のシグナル伝達ドメインである。一態様では、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号９のシグナル伝達ドメインである。
一態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様では、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、
Figure 2022002525
 のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、以下の核酸配列によってコードされる。
Figure 2022002525
ＣＡＲと他の分子または作用物質の共発現
第２のＣＡＲの共発現
一態様では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、第２のＣＡＲ、例えば、例として同じ標的（例えば、ＣＤ１９）または異なる標的（例えば、本明細書に記載されるがん関連抗原、例えば、ＣＤ１９以外の標的、または本明細書に記載される別のがん関連抗原）に対する異なる抗原結合性ドメインを含む第２のＣＡＲをさらに含み得る。一実施形態では、第２のＣＡＲは、がん関連抗原と同じがん細胞種を発現する標的に対する抗原結合性ドメインを含む。一実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、第１の抗原を標的とし、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが一次シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを含む、第１のＣＡＲ、ならびに第２の異なる抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが共刺激シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを含む、第２のＣＡＲを含む。理論に束縛されることを望むものではないが、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、またはＯＸ−４０を第１のＣＡＲに配置し、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータを第２のＣＡＲに配置することにより、ＣＡＲ活性を、両方の標的が発現される細胞に限定することができる。一実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書に記載される標的抗原に結合する抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインを含む第１のがん関連抗原ＣＡＲ、ならびに異なる標的抗原（例えば、第１の標的抗原と同じがん細胞種に発現する抗原）を標的とし、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含む、第２のＣＡＲを含む。別の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書に記載される標的抗原に結合する抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ、第１の標的抗原以外の抗原（例えば、第１の標的抗原と同じがん細胞種に発現する抗原）を標的とし、抗原に対する抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激シグナル伝達ドメインを含む、第２のＣＡＲを含む。
一実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書に記載されるＸＣＡＲおよび阻害性ＣＡＲを含む。一実施形態では、阻害性ＣＡＲは、正常細胞、例えば、Ｘも発現する正常細胞には認められるががん細胞には認められない抗原に結合する抗原結合性ドメインを含む。一実施形態では、阻害性ＣＡＲは、阻害性分子の抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／もしくはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４もしくはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、またはＴＧＦＲ（例えば、ＴＧＦＲベータ）の細胞内ドメインであり得る。
一実施形態では、ＣＡＲ発現細胞が２つ以上の異なるＣＡＲを含む場合、異なるＣＡＲの抗原結合性ドメインは、抗原結合性ドメインが、互いに相互作用しないようなものであり得る。例えば、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを発現する細胞は、第１のＣＡＲの抗原結合性ドメインを、例えば、第２のＣＡＲの抗原結合性ドメイン、例えば、ＶＨＨである第２のＣＡＲの抗原結合性ドメインとの会合を形成しない断片、例えば、ｓｃＦｖとして有し得る。
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である分子を含む、単一ドメイン抗原結合性（ＳＤＡＢ）分子を含む。例としては、重鎖可変ドメイン、軽鎖が天然に欠けている結合性分子、従来的な４本鎖抗体に由来する単一ドメイン、操作されたドメイン、および抗体に由来するもの以外の単一ドメインスキャフォールドが挙げられるがこれらに限定されない。ＳＤＡＢ分子は、当該技術分野の任意のもの、または任意の将来的な単一ドメイン分子であってもよい。ＳＤＡＢ分子は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含むがこれらに限定されない任意の種に由来し得る。この用語はまた、ラクダおよびサメ以外の種に由来する天然に存在する単一ドメイン抗体分子も含む。
一態様では、ＳＤＡＢ分子は、例えば、サメの血清で見られる、新規抗原受容体（ＮＡＲ）として既知の免疫グロブリンアイソタイプに由来するもののように、魚類で見られる免疫グロブリンの可変領域に由来し得る。ＮＡＲの可変領域に由来する単一ドメイン分子（「ＩｇＮＡＲ」）を産生する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１およびStreltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909に記載されている。
別の態様によると、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖が欠けている重鎖として知られる天然の単一ドメイン抗原結合性分子である。このような単一ドメイン分子は、明確さの目的で、例えば、ＷＯ９４０４６７８およびHamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448に開示されている、軽鎖が天然に欠けている重鎖分子に由来するこの可変ドメインは、従来的な４本鎖免疫グロブリンのＶＨとは区別して、本明細書ではＶＨＨまたはナノボディとして認識される。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科の種、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、およびグアナコに由来し得る。ラクダ科以外の他の種も、軽鎖を天然に欠いている重鎖分子を産生する可能性があり、このようなＶＨＨは、本発明の範囲内である。
ＳＤＡＢ分子は、組換え、ＣＤＲグラフト、ヒト化、ラクダ化、脱免疫、および／またはインビトロ生成（例えば、ファージディスプレイによる選択）が行われたものであってもよい。
受容体の抗原結合性ドメイン間で相互作用する抗原結合性ドメインを含む複数のキメラ膜埋込み受容体を有する細胞は、例えば、抗原結合性ドメインのうちの１つまたは複数がその同族抗原に結合する能力を阻害するため、望ましくない場合があることもまた発見されている。したがって、本明細書には、そのような相互作用を最小限に抑える抗原結合性ドメインを含む第１および第２の非天然のキメラ膜埋込み受容体を有する細胞が開示される。また、そのような相互作用を最小限に抑える抗原結合性ドメインを含む第１および第２の非天然のキメラ膜埋込み受容体をコードする核酸、ならびにそのような細胞および核酸を作製および使用する方法も、本明細書に開示される。ある実施形態では、第１および第２の非天然のキメラ膜埋込み受容体のうちの一方の抗原結合性ドメインが、ｓｃＦｖを含み、他方が、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ、サメ、もしくはヤツメウナギの単一ＶＨドメイン、またはヒトもしくはマウスの配列に由来する単一ＶＨドメインを含む。
一部の実施形態では、細胞は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含み、ここで、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲのうちの一方の抗原結合性ドメインは、可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインを含まない。一部の実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲののうちの一方の抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖであり、他方は、ｓｃＦｖではない。一部の実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲのうちの一方の抗原結合性ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ、サメ、もしくはヤツメウナギの単一ＶＨドメイン、またはヒトもしくはマウスの配列に由来する単一ＶＨドメインを含む。一部の実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲのうちの一方の抗原結合性ドメインは、ナノボディを含む。一部の実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲのうちの一方の抗原結合性ドメインは、ラクダＶＨＨドメインを含む。
一部の実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲのうちの一方の抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ、サメ、もしくはヤツメウナギの単一ＶＨドメイン、またはヒトもしくはマウスの配列に由来する単一ＶＨドメインを含む。一部の実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲのうちの一方の抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は、ナノボディを含む。一部の実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲのうちの一方の抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は、ラクダＶＨＨドメインを含む。
一部の実施形態では、細胞の表面上に存在する場合、第１のＣＡＲの抗原結合性ドメインとその同族抗原との結合は、第２のＣＡＲの存在によって実質的に低減されることはない。一部の実施形態では、第２のＣＡＲの存在下における第１のＣＡＲの抗原結合性ドメインとその同族抗原との結合は、第２のＣＡＲの非存在下における第１のＣＡＲの抗原結合性ドメインとその同族抗原との結合の８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。
一部の実施形態では、細胞表面上に存在する場合、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲの抗原結合性ドメインの互いとの会合は、両方がｓｃＦｖ抗原結合性ドメインである場合よりも少ない。一部の実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲ抗原結合性ドメインの互いとの会合は、両方がｓｃＦｖ抗原結合性ドメインである場合よりも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％少ない。
ＣＡＲ活性を強化する作用物質の共発現
別の態様では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、さらに、別の作用物質、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を強化する作用物質を発現し得る。
例えば、一実施形態では、この作用物質は、Ｔ細胞の機能を調節または制御、例えば、阻害する分子を阻害する作用物質であり得る。例えば、一実施形態では、作用物質は、阻害性分子を阻害する作用物質であってもよい。阻害性分子、例えば、ＰＤ１は、一部の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始させる能力を減少させ得る。阻害性分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４もしくはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、またはＴＧＦＲベータが挙げられる。
一実施形態では、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、クラスター化された規則的に間隔の空いた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して、ＣＡＲ発現細胞におけるＴ細胞の機能を調節または制御、例えば、阻害する分子の発現を阻害することができる。ある実施形態では、作用物質は、ｓｈＲＮＡ、例えば、本明細書に記載されるｓｈＲＮＡである。ある実施形態では、Ｔ細胞の機能を調節または制御、例えば、阻害する作用物質は、ＣＡＲ発現細胞内で阻害される。例えば、Ｔ細胞の機能を調節または制御、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子は、ＣＡＲの構成要素、例えば、構成要素のすべてをコードする核酸に連結されている。
ある実施形態では、Ｔ細胞の機能を調節または制御、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、Ｔ細胞の機能を調節または制御、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子が発現されるように、例えば、それがＣＡＲ発現細胞内で発現されるように、プロモーター、例えば、Ｈ１由来またはＵ６由来のプロモーターに作動可能に連結されている。例えば、Tiscornia G., "Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA," Chapter 3, in Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (eds. Friedmann and Rossi). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2007、Brummelkamp TR, et al. (2002) Science 296: 550-553、Miyagishi M, et al. (2002) Nat. Biotechnol. 19: 497-500を参照されたい。ある実施形態では、Ｔ細胞の機能を調節または制御、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの構成要素、例えば、構成要素のすべてをコードする核酸分子を含む同じ、ベクター、例えば、レンチウイルスベクターに存在する。このような実施形態では、Ｔ細胞の機能を調節または制御、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ベクター、例えば、レンチウイルスベクターに、ＣＡＲの構成要素、例えば、構成要素のすべてをコードする核酸に対して５’または３’で位置する。Ｔ細胞の機能を調節または制御、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの構成要素、例えば、構成要素のすべてをコードする核酸と同じかまたは異なる方向で転写され得る。ある実施形態では、Ｔ細胞の機能を調節または制御、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの構成要素、例えば、構成要素のすべてをコードする核酸分子を含むベクター以外のベクターに存在する。ある実施形態では、Ｔ細胞の機能を調節または制御、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲ発現細胞内で一過的に発現される。ある実施形態では、Ｔ細胞の機能を調節または制御、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲ発現細胞のゲノムに安定に組み込まれている。ある実施形態では、Ｔ細胞の機能を調節または制御、例えば、阻害する分子は、ＰＤ−１である。
一実施形態では、阻害性分子を阻害する作用物質は、第１のポリペプチド、例えば、阻害性分子が、正のシグナルを細胞に提供する第２のポリペプチド、例えば、本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメインに会合したものを含む。一実施形態では、作用物質は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４もしくはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、またはＴＧＦＲベータなどの阻害性分子、またはこれらのうちのいずれかの断片（例えば、これらのうちのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部分）である、第１のポリペプチド、ならびに本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメインである第２のポリペプチド［例えば、共刺激ドメイン（例えば、例として本明細書に記載される４１ＢＢ、ＣＤ２７、もしくはＣＤ２８）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む］を含む。一実施形態では、作用物質は、ＰＤ１またはその断片（例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部分）である第１のポリペプチド、ならびに本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／または本明細書に記載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）である第２のポリペプチドを含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８ファミリーの受容体の阻害性メンバーの１つであり、これには、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、およびＢＴＬＡも含まれる。ＰＤ−１は、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞、および骨髄系細胞に発現される（Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75）。ＰＤ１の２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ１に結合すると、Ｔ細胞活性化を下方制御することが示されている（Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34、Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8、Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43）。PD-L1は、ヒトのがんに多量に存在する（Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7、Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314、Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094）。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１との局所相互作用を阻害することによって逆転させることができる。
一実施形態では、作用物質は、膜貫通ドメインならびに４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータなどの細胞内シグナル伝達ドメインと融合された阻害性分子、例えば、プログラム死１（ＰＤ１）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む（本明細書においてＰＤ１ ＣＡＲとも称される）。一実施形態では、ＰＤ１ ＣＡＲは、本明細書に記載されるＸＣＡＲと組み合わせて使用した場合、Ｔ細胞の存続性が改善される。一実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１０５において下線で示される、ＰＤ１の細胞外ドメインを含む、ＰＤ１ ＣＡＲである。一実施形態では、ＰＤ１ ＣＡＲは、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。
Figure 2022002525
一実施形態では、ＰＤ１ ＣＡＲは、以下に提供されるアミノ酸配列を含む（配列番号１０６）。
Figure 2022002525
一実施形態では、作用物質は、ＰＤ１ ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＰＤ１ ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、ＰＤ１ ＣＡＲの核酸配列は以下に示されており、ＰＤ１ ＥＣＤは、以下の配列番号１０３において下線で示されている。
Figure 2022002525
一実施形態では、阻害性シグナルの阻害剤は、例えば、阻害性分子に結合する抗体または抗体断片であり得る。例えば、作用物質は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、またはＣＴＬＡ４に結合する抗体または抗体断片［例えば、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０およびＭＤＸ−１０１とも称され、Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）として販売されている；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；トレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒから市販されているＩｇＧ２モノクローナル抗体、以前はチシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６として知られていた）］であり得る。ある実施形態では、作用物質は、ＴＩＭ３に結合する抗体または抗体断片である。ある実施形態では、作用物質は、ＬＡＧ３に結合する抗体または抗体断片である。ある実施形態では、作用物質は、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）に結合する抗体または抗体断片である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の活性を強化する作用物質、例えば、阻害性分子の阻害剤は、同種ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載される同種ＣＡＲ（例えば、本明細書の同種ＣＡＲの節に記載されている）と組み合わせて投与される。
ＰＤ１は、ＣＤ２８ファミリーの受容体の阻害性メンバーの１つであり、これには、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、およびＢＴＬＡも含まれる。ＰＤ１は、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞、および骨髄系細胞に発現される（Agata et al.1996 Int.Immunol 8:765-75）。ＰＤ１の２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ１に結合すると、Ｔ細胞活性化を下方制御することが示されている（Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34、Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8、Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43）。ＰＤ−Ｌ１は、ヒトのがんに多量に存在する（Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7、Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314、Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094）。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１との局所相互作用を阻害することによって逆転させることができる。
ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−Ｌ２の抗体、抗体断片、および他の阻害剤が既知であり、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用することができる。例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８またはＭＤＸ１１０６とも称される、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）は、ＰＤ１を特異的に遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ＰＤ１に特異的に結合するニボルマブ（クローン５Ｃ４）および他のヒトモノクローナル抗体は、ＵＳ８，００８，４４９およびＷＯ２００６／１２１１６８に開示されている。ピディリズマブ（ＣＴ−０１１、Ｃｕｒｅ Ｔｅｃｈ）は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピディリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ１モノクローナル抗体は、ＷＯ２００９／１０１６１１に開示されている。ペンブロリズマブ（以前はランブロリズマブとして知られており、Ｋｅｙｔｒｕｄａ、ＭＫ０３４７５とも称される、Ｍｅｒｃｋ）は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペンブロリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ１抗体は、ＵＳ８，３５４，５０９およびＷＯ２００９／１１４３３５に開示されている。ＭＥＤＩ４７３６（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）は、ＰＤＬ１に結合し、このリガンドとＰＤ１との相互作用を阻害する、ヒトモノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）は、ＰＤ−Ｌ１に結合する、ヒトＦｃ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０ＡおよびＰＤ−Ｌ１に対する他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号および米国公開第２０１２００３９９０６号に開示されている。他の抗ＰＤ−Ｌ１結合物質としては、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、ＷＯ２０１０／０７７６３４において配列番号２０および２１に示されている）ならびにＭＤＸ−１ １０５（ＢＭＳ−９３６５５９とも称され、例えば、ＷＯ２００７／００５８７４に開示されている抗ＰＤ−Ｌ１結合物質である）が挙げられる。ＡＭＰ−２２４（Ｂ７−ＤＣＩｇ、Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ、例えば、ＷＯ２０１０／０２７８２７およびＷＯ２０１１／０６６３４２に開示されている）は、ＰＤ１とＢ７−Ｈ１との間の相互作用を遮断する、ＰＤ−Ｌ２ Ｆｃ融合可溶性受容体である。他の抗ＰＤ１抗体としては、とりわけ、例えば、ＵＳ８，６０９，０８９、ＵＳ２０１００２８３３０、および／またはＵＳ２０１２０１１４６４９に開示されている抗ＰＤ１抗体であるＡＭＰ ５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＰＤ１阻害剤（例えば、ＰＤ１抗体、例えば、本明細書に記載されるＰＤ１抗体）は、ＣＤ１９の発現と関連する疾患を治療するために、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１阻害剤（例えば、ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１抗体）は、ＣＤ１９の発現と関連する疾患を治療するために、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用される。疾患は、例えば、原発性ＤＬＢＣＬまたは続発性ＤＬＢＣＬを含むＤＬＢＣＬなどのリンパ腫であり得る。一部の実施形態では、対象は、がん細胞、例えば、ＤＬＢＣＬ細胞のうちの少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％がＣＤ３＋／ＰＤ１＋であるか、またはそうであるとして特定される。一部の実施形態では、対象は、がん、例えば、がんの微小環境において、ＣＤ１９＋細胞およびＰＤ−Ｌ１＋細胞の集団が実質的に重複しないか、または実質的に重複しないものとして特定される。例えば、一部の実施形態では、がん、例えば、がんの微小環境における細胞のうちの２０％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、ＣＤ１９およびＰＤ−Ｌ１の二重陽性である。
一部の実施形態では、対象は、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＰＤ１阻害剤、およびＰＤ−Ｌ１阻害剤の組合せで治療される。一部の実施形態では、対象は、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＰＤ１阻害剤、およびＣＤ３阻害剤の組合せで治療される。一部の実施形態では、対象は、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＰＤ１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、およびＣＤ３阻害剤の組合せで治療される。
一部の実施形態では、本明細書の方法は、生物学的試料、例えば、ＤＬＢＣＬ細胞を含む試料において、細胞をＣＤ３および／またはＰＤ−１（例えば、ＣＤ３および／またはＰＤ−１の発現）に関してアッセイする工程を含む。一部の実施形態では、本方法は、生物学的試料、例えば、ＤＬＢＣＬ細胞を含む試料において、細胞をＣＤ１９および／またはＰＤ−Ｌ１（例えば、ＣＤ１９および／またはＰＤ−Ｌ１の発現）に関してアッセイする工程を含む。一部の実施形態では、本方法は、例えば、がん細胞を含む試料を提供すること、および例えば免疫組織化学法により、ＣＤ３、ＰＤ−１、ＣＤ１９、またはＰＤ−Ｌ１のうちの１つまたは複数に関して、検出工程を行うことを含む。本方法は、治療、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲを含む治療を推薦または投与する工程をさらに含んでもよい。
一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体またはその断片は、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ＰＤ−１ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題され、参照によりその全体が組み込まれるＵＳ２０１５／０２１０７６９に記載されている抗ＰＤ−１抗体分子である。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０４９−クローン−Ａ、ＢＡＰ０４９−クローン−Ｂ、ＢＡＰ０４９−クローン−Ｃ、ＢＡＰ０４９−クローン−Ｄ、もしくはＢＡＰ０４９−クローン−Ｅのうちのいずれかから選択される抗体に由来する重鎖可変領域および軽鎖可変領域からの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ（もしくは集合的にすべてのＣＤＲ）；またはＵＳ２０１５／０２１０７６９の表１に記載されているか、もしくは表１のヌクレオチドによってコードされるもの、もしくは前述の配列のうちのいずれかに実質的に同一である（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上同一である）配列；または密接に関連するＣＤＲ、例えば、同一であるか、もしくは少なくとも１つのアミノ酸変化を有するが、２つ、３つ、もしくは４つを上回る変化（例えば、置換、欠失、もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有さないＣＤＲを含む。
さらに別の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、本明細書に記載される抗体、例えば、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０４９−クローン−Ａ、ＢＡＰ０４９−クローン−Ｂ、ＢＡＰ０４９−クローン−Ｃ、ＢＡＰ０４９−クローン−Ｄ、もしくはＢＡＰ０４９−クローン−Ｅのうちのいずれかから選択される抗体からの少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの可変領域；またはＵＳ２０１５／０２１０７６９の表１に記載されているか、もしくは表１のヌクレオチド配列によってコードされるもの；または前述の配列のうちのいずれかに実質的に同一である（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上同一である）配列を含む。
ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリン−３）もまた、特に、ＩＦＮ−ｇ−分泌性ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞１およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞１において、Ｔ細胞機能を負に制御し、Ｔ細胞消耗において重要な役割を果たす。ＴＩＭ３とそのリガンド、例えば、ガレクチン−９（Ｇａｌ９）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびＨＭＧＢ１との間の相互作用の阻害により、免疫応答を増加させることができる。抗体、抗体断片、およびＴＩＭ３とそのリガンドとの他の阻害剤は、当該技術分野で入手可能であり、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用することができる。例えば、ＴＩＭ３を標的とする抗体、抗体断片、小分子、またはペプチド阻害剤は、ＴＩＭ３のＩｇＶドメインに結合して、そのリガンドとの相互作用を阻害する。ＴＩＭ３を阻害する抗体およびペプチドは、ＷＯ２０１３／００６４９０およびＵＳ２０１００２４７５２１に開示されている。他の抗ＴＩＭ３抗体としては、ヒト化バージョンのＲＭＴ３−２３（Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551に開示されている）およびクローン８Ｂ．２Ｃ１２（Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541に開示されている）が挙げられる。ＴＩＭ３およびＰＤ−１を阻害する二重特異的抗体は、ＵＳ２０１３０１５６７７４に開示されている。
一実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体またはその断片は、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ＴＩＭ３ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題され、参照によりその全体が組み込まれるＵＳ２０１５／０２１８２７４に記載されている抗ＴＩＭ３抗体分子である。一実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体分子は、ＡＢＴＩＭ３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０４、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０５、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０６、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０７、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０８、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０９、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１０、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１４、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１５、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１６、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１７、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１８、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１９、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２０、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２３のうちのいずれかから選択される抗体に由来する重鎖可変領域および軽鎖可変領域から少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ（もしくは集合的にすべてのＣＤＲ）；またはＵＳ２０１５／０２１８２７４の表１〜４に記載されているもの；または表１〜４のヌクレオチド配列によってコードされるもの；または前述の配列のいずれかに実質的に同一である（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上同一である）配列、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、少なくとも１つのアミノ酸変化を有するが、２つ、３つ、もしくは４つを上回る変化（例えば、置換、欠失、もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有さないＣＤＲを含む。
さらに別の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体分子は、本明細書に記載される抗体、例えば、ＡＢＴＩＭ３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０４、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０５、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０６、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０７、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０８、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０９、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１０、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１４、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１５、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１６、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１７、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１８、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１９、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２０、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２３のうちのいずれかから選択される抗体に由来する少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの可変領域、またはＵＳ２０１５／０２１８２７４の表１〜４に記載されているもの、または表１〜４のヌクレオチド配列によってコードされるもの、または上述の配列のうちのいずれかに実質的に同一である（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上同一である）配列を含む。
他の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の活性を強化する作用物質は、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５阻害剤）である。一実施形態では、ＣＥＡＣＡＭの阻害剤は、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体分子である。抗ＣＥＡＣＡＭ−１抗体の例は、ＷＯ２０１０／１２５５７１、ＷＯ２０１３／０８２３６６、ＷＯ２０１４／０５９２５１、およびＷＯ２０１４／０２２３３２に記載されており、例えば、モノクローナル抗体３４Ｂ１、２６Ｈ７、および５Ｆ４であるか、または例えば、ＵＳ２００４／００４７８５８、ＵＳ７，１３２，２５５、およびＷＯ９９／０５２５５２に記載されているそれらの組換え体である。他の実施形態では、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体は、例えば、Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146)に記載されているようにＣＥＡＣＡＭ−５に結合するか、例えば、ＷＯ２０１３／０５４３３１およびＵＳ２０１４／０２７１６１８に記載されているようにＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５と交差反応する。
理論に束縛されることを望むものではないが、癌胎児性抗原細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）、例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５は、少なくとも部分的に、抗腫瘍免疫応答の阻害を媒介すると考えられている［例えば、Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10、Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71、Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200、Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30、Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10、Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701、Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529を参照されたい］。例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１は、ＴＩＭ−３のヘテロ親和性リガンドとして、またＴＩＭ−３により媒介されるＴ細胞寛容およびＴ細胞消耗において役割を果たすとして記載されている［例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２、Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848を参照されたい］。いくつかの実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＴＩＭ−３の同時遮断が、異種移植片結腸直腸がんモデルにおいて抗腫瘍免疫応答を強化することが示されている［例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２、Huang, et al. (2014)、上記を参照されたい］。他の実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＰＤ−１の同時遮断は、例えば、ＷＯ２０１４／０５９２５１に記載されているように、Ｔ細胞寛容を低減させる。したがって、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤を、本明細書に記載される他の免疫調節剤（例えば、抗ＰＤ−１阻害剤および／または抗ＴＩＭ−３阻害剤）とともに使用して、がん、例えば、黒色腫、肺がん（例えば、ＮＳＣＬＣ）、膀胱がん、結腸がん、卵巣がん、および本明細書に記載される他のがんに対する免疫応答を強化することができる。
ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子−３またはＣＤ２２３）は、活性化Ｔ細胞上およびＢ細胞上に発現する細胞表面分子であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞消耗において役割を果たすことが示されている。抗体、抗体断片、およびＬＡＧ３とそのリガンドとの他の阻害剤は、当該技術分野で入手可能であり、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用することができる。例えば、ＢＭＳ−９８６０１６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂ）は、ＬＡＧ３を標的とするモノクローナル抗体である。ＩＭＰ７０１（Ｉｍｍｕｔｅｐ）は、アンタゴニストＬＡＧ３抗体であり、ＩＭＰ７３１（ＩｍｍｕｔｅｐおよびＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）は、枯渇性ＬＡＧ３抗体である。他のＬＡＧ３阻害剤としては、ＩＭＰ３２１（Ｉｍｍｕｔｅｐ）が挙げられ、これは、ＬＡＧ３およびＩｇの可溶性部分の組換え融合タンパク質であり、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化する。他の抗体は、例えば、ＷＯ２０１０／０１９５７０に開示されている。
一実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体またはその断片は、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ＬＡＧ３ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題され、参照によりその全体が組み込まれるＵＳ２０１５／０２５９４２０に記載されている抗ＬＡＧ３抗体分子である。一実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体分子は、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１８、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１９、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ２０、ｈｕＢＡＰ０５０（Ｓｅｒ）（例えば、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０１−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０２−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０３−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０４−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０５−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０６−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０７−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０８−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０９−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１０−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１１−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１２−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１３−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１４−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１５−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１８−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１９−Ｓｅｒ、またはＢＡＰ０５０−ｈｕｍ２０−Ｓｅｒ）、ＢＡＰ０５０−クローン−Ｆ、ＢＡＰ０５０−クローン−Ｇ、ＢＡＰ０５０−クローン−Ｈ、ＢＡＰ０５０−クローン−Ｉ、またはＢＡＰ０５０−クローン−Ｊのいずれかから選択される抗体に由来する重鎖可変領域および軽鎖可変領域から少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ（または集合的にすべてのＣＤＲ）、またはＵＳ２０１５／０２５９４２０の表１に記載されているもの、または表１のヌクレオチド配列によってコードされるもの、または上述の配列のうちのいずれかに実質的に同一である（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上同一である）配列、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、少なくとも１つのアミノ酸変化を有するが、２つを上回る、３つを上回る、もしくは４つを上回る変化（例えば、置換、欠失、もしくは挿入、例えば、保存的置換）は有さないＣＤＲを含む。
さらに別の実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体分子は、本明細書に記載される抗体、例えば、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１８、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１９、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ２０、ｈｕＢＡＰ０５０（Ｓｅｒ）（例えば、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０１−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０２−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０３−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０４−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０５−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０６−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０７−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０８−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０９−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１０−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１１−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１２−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１３−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１４−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１５−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１８−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１９−Ｓｅｒ、もしくはＢＡＰ０５０−ｈｕｍ２０−Ｓｅｒ）、ＢＡＰ０５０−クローン−Ｆ、ＢＡＰ０５０−クローン−Ｇ、ＢＡＰ０５０−クローン−Ｈ、ＢＡＰ０５０−クローン−Ｉ、またはＢＡＰ０５０−クローン−Ｊのうちのいずれかから選択される抗体から少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの可変領域、またはＵＳ２０１５／０２５９４２０の表１に記載されているもの、または表１のヌクレオチド配列によってコードされるもの、または上述の配列のうちのいずれかに実質的に同一である（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上同一である）配列を含む。
別の例において、一実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の活性を強化する作用物質は、共刺激分子または共刺激分子のリガンドであり得る。共刺激分子の例としては、例えば、本明細書に記載されるように、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、リンパ球活性化シグナル伝達分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドが挙げられる。共刺激分子リガンドの例としては、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、およびＬＩＧＨＴが挙げられる。いくつかの実施形態では、共刺激分子リガンドは、ＣＡＲの共刺激分子ドメインとは異なる共刺激分子のリガンドである。いくつかの実施形態では、共刺激分子リガンドは、ＣＡＲの共刺激分子ドメインと同じ共刺激分子のリガンドである。ある実施形態では、共刺激分子リガンドは、４−１ＢＢＬである。ある実施形態では、共刺激リガンドは、ＣＤ８０またはＣＤ８６である。ある実施形態では、共刺激分子リガンドは、ＣＤ７０である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、１つまたは複数の追加の共刺激分子または共刺激分子リガンドを発現するようにさらに操作され得る。
別の態様では、本開示は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞の集団を特徴とする。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、一実施形態では、ＣＡＲＴ細胞集団には、本明細書に記載されるがん関連抗原に対する抗原結合性ドメインを有するＣＡＲを発現する第１の細胞、および異なる抗原結合性ドメイン、例えば、本明細書に記載される異なるがん関連抗原に対する抗原結合性ドメイン、例えば、第１の細胞が発現するＣＡＲの抗原結合性ドメインによって結合されるがん関連抗原とは異なる本明細書に記載されるがん関連抗原に対する抗原結合性ドメインを有するＣＡＲを発現する第２の細胞が含まれ得る。別の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団には、本明細書に記載されるがん関連抗原に対する抗原結合性ドメインを含むＣＡＲを発現する第１の細胞、および本明細書に記載されるがん関連抗原以外の標的に対する抗原結合性ドメインを含むＣＡＲを発現する第２の細胞が含まれ得る。一実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の集団には、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第１の細胞、および二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第２の細胞が含まれる。
別の態様では、本開示は、集団内の少なくとも１つの細胞が、本明細書に記載されるがん関連抗原に対する抗原結合性ドメインを有するＣＡＲを発現し、第２の細胞は別の作用物質、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を強化する作用物質を発現する、細胞集団を特徴とする。例えば、一実施形態では、作用物質は、阻害性分子を阻害する作用物質であってもよい。阻害性分子、例えば、ＰＤ−１は、一部の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始させる能力を減少させることができる。阻害性分子の例としては、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、およびＴＧＦＲベータが挙げられる。一実施形態では、阻害性分子を阻害する作用物質は、第１のポリペプチド、例えば、阻害性分子が、正のシグナルを細胞に提供する第２のポリペプチド、例えば、本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメインに会合したものを含む。一実施形態では、作用物質は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、およびＴＧＦＲベータなどの阻害性分子、またはこれらのうちのいずれかの断片である第１のポリペプチド、ならびに本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン［例えば、共刺激ドメイン（例えば、例として本明細書に記載される４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＯＸ４０、またはＣＤ２８）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む］である第２のポリペプチドを含む。一実施形態では、作用物質は、ＰＤ−１またはその断片である第１のポリペプチド、および本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／または本明細書に記載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）である第２のポリペプチドを含む。
ＣＡＲをコードする核酸コンストラクト
本発明はまた、例えば、本明細書に記載される方法によって作製された、本明細書に記載される１つまたは複数のＣＡＲコンストラクトをコードする核酸分子を含む免疫エフェクター細胞を提供する。一態様では、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写産物として提供される。一態様では、核酸分子は、ＤＮＡコンストラクトとして提供される。本明細書に記載される核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはこれらの組合せであり得る。他の実施形態では、核酸分子は、前述の核酸分子のうちのいずれかを含むベクターである。
一態様では、本発明のＣＡＲの抗原結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、哺乳動物細胞における発現に関して配列がコドン最適化されている核酸分子によってコードされる。一態様では、本発明のＣＡＲコンストラクト全体は、配列全体が哺乳動物細胞における発現に関してコドン最適化されている核酸分子によってコードされる。コドン最適化は、コーディングＤＮＡにおける同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）の発生頻度に、異なる種では偏りがあることを発見することを指す。このようなコドン縮重は、同一のポリペプチドが様々なヌクレオチド配列によってコードされることを可能にする。様々なコドン最適化方法が、当該技術分野で既知であり、例えば、少なくとも米国特許第５，７８６，４６４号および同第６，１１４，１４８号に開示されている方法が挙げられる。
したがって、一態様では、例えば、本明細書に記載される方法によって作製された免疫エフェクター細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子であって、ＣＡＲは、本明細書に記載される腫瘍抗原に結合する抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載される膜貫通ドメイン）、ならびに刺激ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載される共刺激シグナル伝達ドメイン）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載される一次シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に記載されるゼータ鎖）を含む細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む、核酸分子を含む。
本発明はまた、ＣＡＲをコードする核酸分子、例えば、本明細書に記載される核酸分子が挿入された、ベクターも提供する。レンチウイルスなど、レトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期間の安定した組込みおよび娘細胞における導入遺伝子の繁殖を可能するため、長期遺伝子移入を達成するのに好適なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞の形質導入が可能であるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターよりもさらなる利点を有する。これらは、免疫原性が低いというさらなる利点も有する。レトロウイルスベクターはまた、例えば、ガンマレトロウイルスベクターであってもよい。ガンマレトロウイルスベクターには、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル（Ψ）、プライマー結合性部位（ＰＢＳ）、１つまたは複数の（例えば、２つの）長い末端反復配列（ＬＴＲ）、および目的の導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子が含まれ得る。ガンマレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖなどのウイルス構造遺伝子を欠いている場合がある。例示的なガンマレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）、および骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）、ならびにこれらに由来するベクターが挙げられる。他のガンマレトロウイルスベクターは、例えば、Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713に記載されている。
別の実施形態では、所望されるＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。別の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ、ｃｒｉｓｐｅｒ、ＣＡＳ９、および亜鉛フィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して達成することができる。以下のJune et al. 2009Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716を参照されたく、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
ベクターには、例えば、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結因子［例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子に由来する］、エピソーム複製および原核生物での複製を可能にするエレメント（例えば、ＳＶ４０起源およびＣｏｌＥ１、もしくは当該技術分野で既知のその他のもの）、ならびに／または選択を可能にするエレメント（例えば、アンピシリン耐性遺伝子および／もしくはゼオシンマーカー）が含まれ得る。
概要を述べると、ＣＡＲをコードする天然または合成の核酸の発現は、典型的に、ＣＡＲポリペプチドまたはその部分をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結させ、コンストラクトを発現ベクターに組み込むことによって、達成される。ベクターは、真核生物での複製および組込みに好適であり得る。典型的なクローニングベクターは、所望される核酸配列の発現の制御に有用な、転写終結因子および翻訳終結因子、開始配列、ならびにプロモーターを含む。
核酸は、多数の種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含むがこれらに限定されない、ベクターにクローニングすることができる。特に関心の高いベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターが挙げられる。
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY）、ならびにウイルス学および分子生物学のその他のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製起源、プロモーター配列、便宜的な制限エンドヌクレアーゼ部位、１つまたは複数の選択的マーカーを含む（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、および米国特許第６，３２６，１９３号）。
哺乳動物細胞への遺伝子移入のために、ウイルスに基づく系が多数開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子デリバリー系の簡便なプラットフォームを提供する。当該技術分野で既知の技法を使用して、選択された遺伝子を、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次いで、組換えウイルスを単離し、インビボまたはエキソビボのいずれかで対象の細胞にデリバリーすることができる。多数のレトロウイルス系が、当該技術分野で既知である。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。多数のアデノウイルスベクターが、当該技術分野で既知である。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。
さらなるプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。典型的に、これらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にも同様に機能的エレメントを含むことが示されている。多くの場合、プロモーターエレメント間の間隔には、柔軟性があり、そのため、プロモーター機能は、エレメントが互いに逆位になった場合または移動した場合にも、保持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターの場合、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始める前に、５０ｂｐ間隔に増加し得る。プロモーターによって、個々のエレメントは、転写を活性化するために協働してまたは独立してのいずれかで機能し得るとみられる。例示的なプロモーターとしては、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣ、またはホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。ある実施形態では、プロモーターは、ＰＧＫプロモーター、例えば、本明細書に記載される短縮型ＰＧＫプロモーターである。
哺乳動物Ｔ細胞においてＣＡＲをコードする核酸分子を発現することができるプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然のＥＦ１ａプロモーターは、リボソームへのアミノアシルｔＲＮＡの酵素的デリバリーを担う、伸長因子−１複合体のアルファサブユニットの発現を作動させる。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物発現プラスミドにおいて広範に使用されており、レンチウイルスベクターにクローニングされた核酸分子からのＣＡＲ発現を作動させるのに有効であることが示されている。例えば、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。一態様では、ＥＦ１ａプロモーターは、実施例に提供される配列を含む。
プロモーターの別の例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター配列である。このプロモーター配列は、そこに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を作動させることができる、強力な構成的プロモーター配列である。しかしながら、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、イプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子−１αプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーター等であるがこれらに限定されないヒト遺伝子プロモーターが含まれるがこれらに限定されない、他の構成的プロモーター配列もまた使用可能である。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるものではない。誘導的プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。誘導的プロモーターの使用は、それが作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を、そのような発現が所望されるときには有効にし、発現が所望されないときには発現を無効にすることができる分子スイッチを提供する。誘導的プロモーターの例としては、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
プロモーターの別の例は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、短縮型ＰＧＫプロモーター（例えば、野生型ＰＧＫプロモーター配列と比較して１つまたは複数の、例えば、１、２、５、１０、１００、２００、３００、または４００のヌクレオチド欠失を有するＰＧＫプロモーター）が所望される場合がある。例示的なＰＧＫプロモーターのヌクレオチド配列を、以下に提示する。
野生型ＰＧＫプロモーター：
Figure 2022002525
 例示的な短縮型ＰＧＫプロモーター：
PGK100:
Figure 2022002525
 PGK200:
Figure 2022002525
 PGK300:
Figure 2022002525
 PGK400:
Figure 2022002525
ベクターには、例えば、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結因子［例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子に由来する］、エピソーム複製および原核生物での複製を可能にするエレメント（例えば、ＳＶ４０起源およびＣｏｌＥ１、もしくは当該技術分野で既知のその他のもの）、ならびに／または選択を可能にするエレメント（例えば、アンピシリン耐性遺伝子および／もしくはゼオシンマーカー）が含まれ得る。
ＣＡＲポリペプチドまたはその部分の発現を評価する目的で、ウイルスベクターを通じてトランスフェクトまたは感染させようとする細胞集団からの発現細胞の特定および選択を容易にするために、細胞に導入される発現ベクターはまた、選択的マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれか、または両方を含み得る。他の態様では、選択的マーカーは、別個のＤＮＡ片に保持させ、コトランスフェクション手順において使用してもよい。選択的マーカーおよびレポーター遺伝子のいずれも、宿主細胞における発現を可能にする適切な制御配列が隣接し得る。有用な選択的マーカーとしては、例えば、抗生物質耐性遺伝子、例えば、ｎｅｏなどが挙げられる。
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされている可能性のある細胞を特定するため、および制御配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織には存在しないか、または発現されない遺伝子であり、かつ発現が何らかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって顕在化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の好適な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができる（例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82）。好適な発現系は、周知であり、既知の技法を使用して調製することができるか、市販で入手することができる。一般に、最も高いレベルのレポーター遺伝子発現を示す、最小限の５’隣接領域を有するコンストラクトが、プロモーターとして特定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結させることができ、プロモーターにより作動される転写を調節する能力に関して作用物質を評価するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ、および第２のＣＡＲ、例えば、阻害性ＣＡＲまたはＣＤ１９以外の抗原に特異的に結合するＣＡＲをコードする、２つ以上の核酸配列を含み得る。このような実施形態では、ＣＡＲをコードする２つ以上の核酸配列が、同じフレーム内の単一の核酸分子によって、単一のポリペプチド鎖としてコードされる。この態様では、２つ以上のＣＡＲは、例えば、１つまたは複数のペプチド切断部位によって離間している場合がある。（例えば、自己切断部位または細胞内プロテアーゼの基質）。ペプチド切断部位の例としては、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａ部位が挙げられる。
遺伝子を細胞に導入し、発現させる方法は、当該技術分野で既知である。発現ベクターの関連では、ベクターは、当該技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターを、物理的手段、化学的手段、または生物学的手段によって、宿主細胞に移入することができる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的な方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、電気穿孔などが挙げられる。ベクターおよび／または外来性核酸を含む細胞を産生させる方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY）を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
目的のポリペプチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法は、ＤＮＡベクターおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特に、レトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞に挿入するための最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および同第５，５８５，３６２号を参照されたい。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、コロイド分散系、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質に基づく系が挙げられる。インビトロおよびインビボにおけるデリバリービヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。標的化されたナノ粒子または他の好適なサブミクロンサイズのデリバリー系を用いたポリヌクレオチドのデリバリーなど、他の最先端の標的化された核酸デリバリー方法が利用可能である。
非ウイルス性デリバリー系の場合、例示的なデリバリービヒクルは、リポソームである。核酸を宿主細胞に（インビトロ、エキソビボ、またはインビボで）導入することに関して、脂質製剤の使用が企図される。別の態様では、核酸を脂質と会合させてもよい。脂質と会合させた核酸は、リポソームの水性内部に封入されていてもよく、リポソームの脂質二重層内に点在していてもよく、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方と会合する連結分子によってリポソームに結合していてもよく、リポソームに封じ込められていてもよく、リポソームと複合体を形成していてもよく、脂質を含有する溶液中に分散していてもよく、脂質と混合していてもよく、脂質と合わさっていてもよく、脂質中の懸濁液として含有されていてもよく、ミセルとともに含有されているかもしくはそれ以外には複合体を形成していてもよく、または別様に脂質と会合されていてもよい。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクター会合組成物は、溶液中の任意の特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造で、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在し得る。それらはまた、単純に溶液中に点在していてもよく、サイズまたは形状が均一でない凝集体を形成している可能性がある。脂質は、脂肪性物質のことであり、天然の脂質であっても合成の脂質であってもよい。例えば、脂質には、細胞質において天然に生じる脂肪小滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドを含むクラスの化合物が含まれる。
使用に好適な脂質は、商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手することができ、ジセチルホスフェート（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から入手することができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ．）から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約−２０℃で保管され得る。クロロホルムはメタノールよりも蒸発し易いため、クロロホルムが唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、閉じた脂質二重層または凝集体の生成によって形成される、様々な単層および多層の脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質の二重層膜および内側の水性媒体を伴う小胞構造を有することを特徴とし得る。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質を過剰量の水溶液中に懸濁させると自発的に形成される。脂質成分に自己再配置が起こり、その後、閉じた構造の形成が生じ、脂質二重層間に水および溶解した溶質が封じ込められる（Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10）。しかしながら、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物もまた、包含される。例えば、脂質は、ミセル構造をとってもよく、または単に、脂質分子の不均一な凝集体として存在してもよい。リポフェクタミン核酸複合体もまた、企図される。
本方法が、外来性核酸を宿主細胞に導入するために使用されるか、またはそれ以外には細胞を本発明の阻害剤に曝露するために使用されるかにかかわらず、宿主細胞における組換え核酸配列の存在を確認するために、様々なアッセイが行われ得る。このようなアッセイとしては、例えば、当業者には周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、およびＰＣＲ、「生化学的」アッセイ、例えば、特定のペプチドの存在または不在を、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット法）または本発明の範囲内に含まれる作用物質を特定するための本明細書に記載されるアッセイによって検出することが挙げられる。
キメラ抗原受容体を制御するための戦略
一部の実施形態では、ＣＡＲ療法の安全性および有効性を最適化するには、ＣＡＲ活性を制御することができる制御可能なＣＡＲ（ＲＣＡＲ）が、望ましい。ＣＡＲ活性が制御され得る多数の手段が存在する。例えば、例として、二量体化ドメインに融合されたカスパーゼを使用した誘導的アポトーシス［例えば、Di Stasa et al., N Egnl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683］を、本発明のＣＡＲ療法における安全性スイッチとして使用することができる。一実施形態では、本発明のＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）は、誘導的アポトーシススイッチをさらに含み、ここで、ヒトカスパーゼ（例えば、カスパーゼ９）または修飾バージョンは、条件付き二量体化を可能にするヒトＦＫＢタンパク質の修飾体に融合されている。ラパログ（例えば、ＡＰ １９０３、ＡＰ２０１８７）などの小分子の存在下では、誘導的カスパーゼ（例えば、カスパーゼ９）が活性化され、本発明のＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の急速なアポトーシスおよび死滅をもたらす。カスパーゼに基づく誘導的アポトーシススイッチ（またはそのようなスイッチの１つもしくは複数の態様）の例は、例えば、ＵＳ２００４０４００４７、ＵＳ２０１１０２８６９８０、ＵＳ２０１４０２５５３６０、ＷＯ１９９７０３１８９９、ＷＯ２０１４１５１９６０、ＷＯ２０１４１６４３４８、ＷＯ２０１４１９７６３８、ＷＯ２０１４１９７６３８に記載されており、これらすべて、参照により本明細書に組み込まれる。
別の例では、ＣＡＲ発現細胞はまた、二量体化薬（例えば、リミデュシド（ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ）［ＡＰ１９０３（Ｂｅｌｌｉｃｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）またはＡＰ２０１８７（Ａｒｉａｄ）とも称される］を投与すると、カスパーゼ−９の活性化および細胞のアポトーシスをもたらす、誘導的カスパーゼ−９（ｉＣａｓｐａｓｅ−９）分子も発現し得る。ｉＣａｓｐａｓｅ−９分子は、二量体化の化学的インデューサー（ＣＩＤ）結合性ドメインを含有し、このドメインは、ＣＩＤの存在における二量体化を媒介する。これにより、ＣＡＲ発現細胞の誘導的かつ選択的枯渇がもたらされる。一部の事例では、ｉＣａｓｐａｓｅ−９分子は、ＣＡＲをコードするベクターとは別の核酸分子によってコードされる。一部の事例では、ｉＣａｓｐａｓｅ−９分子は、ＣＡＲをコードするベクターと同じ核酸分子によってコードされる。ｉＣａｓｐａｓｅ−９は、ＣＡＲ発現細胞のあらゆる毒性を回避するための安全性スイッチを提供することができる。例えば、Song et al. Cancer Gene Ther. 2008; 15(10):667-75、Clinical Trial Id. No. NCT02107963、およびDi Stasi et al. N. Engl. J. Med. 2011; 365:1673-83を参照されたい。
本発明のＣＡＲ療法を制御するための代替的な戦略には、例えば、ＣＡＲ発現細胞を枯渇させることによって、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を誘導することによって、ＣＡＲ活性を非活性化するかまたは無効にする、小分子または抗体を利用することが含まれる。例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞はまた、細胞死、例えば、ＡＤＣＣまたは補体誘導性細胞死を誘導することができる分子によって認識される抗原も発現し得る。例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞はまた、抗体または抗体断片によって標的とされ得る受容体も発現し得る。このような受容体の例としては、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン（例えば、インテグリンανβ３、α４、αΙ３／４β３、α４β７、α５β１、ανβ３、αν）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＰＤＧＦ受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ−１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ１、ＴＡＧ−７２、ＩＬ−６受容体、５Ｔ４、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１ １、ＣＤ１ １ ａ／ＬＦＡ−１、ＣＤ１５、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３／ｌｇＥ受容体、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７／ベイシジン、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ７、およびＥＧＦＲ、ならびにこれらの短縮バージョン（例えば、１つまたは複数の細胞外エピトープを保持しているが、細胞質ドメイン内の１つまたは複数の領域を欠くバージョン）が挙げられる。
例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞はまた、シグナル伝達能力を欠くが、ＡＤＣＣを誘導することができる分子、例えば、セツキシマブ［ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）］によって認識されるエピトープは保持している短縮型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）も発現し、その結果、セツキシマブの投与により、ＡＤＣＣが誘導され、続いてＣＡＲ発現細胞の枯渇が誘導される［例えば、ＷＯ２０１１／０５６８９４およびJonnalagadda et al., Gene Ther. 2013; 20(8)853-860を参照されたい］。別の戦略としては、リツキシマブに結合し、例えば、ＡＤＣＣによって、ＣＡＲ発現細胞の選択的枯渇をもたらす、ＣＤ３２抗原およびＣＤ２０抗原の両方に由来する標的エピトープを組み合わせた超小型マーカー／自殺遺伝子を、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞において発現させることを含む［例えば、Philip et al., Blood. 2014; 124(8)1277-1287を参照されたい］。本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞を枯渇させるための他の方法には、例えば、ＡＤＣＣを誘導することによる破壊のための、成熟リンパ球、例えば、ＣＡＲ発現細胞に選択的に結合し、それを標的とするモノクローナル抗ＣＤ５２抗体であるＣＡＭＰＡＴＨの投与が含まれる。他の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲリガンド、例えば、抗イディオタイプ抗体を使用して選択的に標的化することができる。一部の実施形態では、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えば、ＡＤＣＣ活性またはＡＤＣ活性を引き起こし、それによって、ＣＡＲ発現細胞の数を低減させることができる。他の実施形態では、ＣＡＲリガンド、例えば、抗イディオタイプ抗体を、細胞の殺滅を誘導する作用物質、例えば、毒素と連結させ、それによって、ＣＡＲ発現細胞の数を低減させることができる。代替として、ＣＡＲ分子自体が、以下に記載されるように、活性を制御することができるように、例えば、有効にすることおよび無効にすることができるように、構成されてもよい。
他の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞はまた、Ｔ細胞枯渇剤によって認識される標的タンパク質も発現し得る。一実施形態では、標的タンパク質は、ＣＤ２０であり、Ｔ細胞枯渇剤は、抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブである。このような実施形態では、Ｔ細胞枯渇剤は、ＣＡＲ発現細胞を低減または消失させることが望ましくなった後に、例えば、ＣＡＲにより誘導される毒性を軽減するために、投与される。他の実施形態では、Ｔ細胞枯渇剤は、抗ＣＤ５２抗体、例えば、アレムツズマブである。
ある態様では、ＲＣＡＲは、ポリペプチドのセット、最も単純な実施形態では典型的に２つのポリペプチドのセットを含み、ここで、本明細書に記載される標準的なＣＡＲの構成要素、例えば、抗原結合性ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが、別個のポリペプチドまたはメンバーに分配されている。一部の実施形態では、ポリペプチドのセットには、二量体化分子が存在する場合に、ポリペプチドを互いに結合させることができる、例えば、抗原結合性ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合させることができる、二量体化スイッチが含まれる。一実施形態では、本発明のＣＡＲは、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４１２７２６１に記載されているものなどの二量体化スイッチを利用する。このような制御可能なＣＡＲのさらなる説明および例示的な構成は、本明細書、および例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際公開第ＷＯ２０１５／０９０２２９号の段落５２７〜５５１に提供されており、これは、参照によりその全体が組み込まれる。
二量体化スイッチ
二量体化スイッチは、非共有結合性または共有結合性であり得る。非共有結合性二量体化スイッチでは、二量体化分子は、スイッチドメイン間の非共有結合性相互作用を促進する。共有結合性二量体化スイッチでは、二量体化分子は、スイッチドメイン間の共有結合性相互作用を促進する。
ある実施形態では、ＲＣＡＲは、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰまたはＦＫＢＰ／ＦＲＢに基づく二量体化スイッチを含む。ＦＫＢＰ１２（ＦＫＢＰ、またはＦＫ５０６結合性タンパク質）は、天然物の免疫抑制薬であるラパマイシンの初期細胞内標的として機能する、豊富に存在する細胞質タンパク質である。ラパマイシンは、ＦＫＢＰおよび大型のＰＩ３Ｋ相同体ＦＲＡＰ（ＲＡＦＴ、ｍＴＯＲ）に結合する。ＦＲＢは、ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体の結合に十分な、ＦＲＡＰの９３アミノ酸部分である［Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51］。
いくつかの実施形態では、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢに基づくスイッチは、二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体を使用し得る。
ＦＫＢＰのアミノ酸配列は、以下の通りである。
Figure 2022002525
いくつかの実施形態では、ＦＫＢＰスイッチドメインは、ラパマイシンまたはラパログの存在下において、ＦＲＢまたはその断片もしくは類似体に結合する能力を有するＦＫＢＰの断片を含み得、例えば、以下の配列番号１３１の下線部分である。
Figure 2022002525
ＦＲＢのアミノ酸配列は、以下の通りである。
Figure 2022002525
「ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢに基づくスイッチ」とは、この用語が本明細書に使用されるとき、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１の存在下において、ＦＲＢ、またはその断片もしくは類似体に結合する能力を有し、配列番号１３１または１３２のＦＫＢＰ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらの配列とは３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、もしくは１個以下のアミノ酸残基が異なる、ＦＫＢＰ断片またはその類似体を含む、第１のスイッチドメイン、ならびにラパマイシンまたはラパログの存在下において、ＦＲＢまたはその断片もしくは類似体に結合する能力を有し、配列番号１３３のＦＲＢ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはその配列とは３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、もしくは１個以下のアミノ酸残基が異なる、ＦＲＢ断片またはその類似体を含む、第２のスイッチドメインを含む二量体化スイッチを指す。ある実施形態では、本明細書に記載されるＲＣＡＲは、配列番号１３１（または配列番号１３２）に開示されるアミノ酸残基を含む１つのスイッチドメイン、および配列番号１３３に開示されるアミノ酸残基を含む１つのスイッチドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化スイッチは、ＦＲＢに基づくスイッチドメイン、例えば、修飾されたＦＲＢスイッチドメイン、ＦＫＢＰに基づくスイッチドメインと、二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１との間の複合体形成の変化、例えば強化を呈する、修飾されたＦＲＢスイッチドメインを含む。ある実施形態では、修飾されたＦＲＢスイッチドメインは、アミノ酸位Ｌ２０３１、Ｅ２０３２、Ｓ２０３５、Ｒ２０３６、Ｆ２０３９、Ｇ２０４０、Ｔ２０９８、Ｗ２１０１、Ｄ２１０２、Ｙ２１０５、およびＦ２１０８における突然変異から選択される、１つまたは複数の突然変異、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上の突然変異を含み、ここで、野生型アミノ酸が、任意の他の天然のアミノ酸に突然変異している。ある実施形態では、突然変異型ＦＲＢは、Ｅ２０３２に突然変異を含み、ここで、Ｅ２０３２が、フェニルアラニン（Ｅ２０３２Ｆ）、メチオニン（Ｅ２０３２Ｍ）、アルギニン（Ｅ２０３２Ｒ）、バリン（Ｅ２０３２Ｖ）、チロシン（Ｅ２０３２Ｙ）、イソロイシン（Ｅ２０３２Ｉ）、例えば、配列番号１３４、またはロイシン（Ｅ２０３２Ｌ）、例えば、配列番号１３５に突然変異している。ある実施形態では、突然変異型ＦＲＢは、Ｔ２０９８に突然変異を含み、ここで、Ｔ２０９８が、フェニルアラニン（Ｔ２０９８Ｆ）またはロイシン（Ｔ２０９８Ｌ）、例えば、配列番号１３６に突然変異している。ある実施形態では、突然変異型ＦＲＢは、Ｅ２０３２およびＴ２０９８に突然変異を含み、ここで、Ｅ２０３２が、任意のアミノ酸に突然変異しており、Ｔ２０９８が、任意のアミノ酸、例えば、配列番号１３７に突然変異している。ある実施形態では、突然変異型ＦＲＢは、Ｅ２０３２ＩおよびＴ２０９８Ｌ突然変異、例えば、配列番号１３８を含む。ある実施形態では、突然変異型ＦＲＢは、Ｅ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ突然変異、例えば、配列番号１３９を含む。
Figure 2022002525
ナチュラルキラー細胞受容体（ＮＫＲ）ＣＡＲ
ある実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ分子は、ナチュラルキラー細胞受容体（ＮＫＲ）の１つまたは複数の構成要素を含み、それによって、ＮＫＲ−ＣＡＲを形成する。ＮＫＲ構成要素は、以下のナチュラルキラー細胞受容体のいずれかに由来する膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン、または細胞質ドメインであり得る：キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＤＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１、およびＫＩＲ３ＤＰ１；ナチュラル細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６；免疫細胞受容体のリンパ球活性化シグナル伝達分子（ＳＬＡＭ）ファミリー、例えば、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥ、およびＣＤ２Ｆ−１０；Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、例えば、ＣＤ１６およびＣＤ６４；ならびにＬｙ４９受容体、例えば、ＬＹ４９Ａ、ＬＹ４９Ｃ。本明細書に記載されるＮＫＲ−ＣＡＲ分子は、アダプター分子または細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＤＡＰ１２と相互作用し得る。ＮＫＲ構成要素を含むＣＡＲ分子の例示的な構成および配列は、国際公開第ＷＯ２０１４／１４５２５２号に記載されており、この内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
スプリットＣＡＲ
一部の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、スプリットＣＡＲを使用する。スプリットＣＡＲアプローチは、公報ＷＯ２０１４／０５５４４２およびＷＯ２０１４／０５５６５７により詳細に記載されている。簡単に述べると、スプリットＣＡＲ系は、第１の抗原結合性ドメインおよび共刺激ドメイン（例えば、４１ＢＢ）を有する第１のＣＡＲを発現する細胞を含み、この細胞はまた、第２の抗原結合性ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータ）を有する第２のＣＡＲも発現する。細胞が第１の抗原に遭遇すると、共刺激ドメインが活性化され、細胞が増殖する。細胞が第２の抗原に遭遇すると、細胞内シグナル伝達ドメインが活性化、細胞殺滅活性が開始される。したがって、ＣＡＲ発現細胞は、両方の抗原の存在下でのみ完全に活性化される。
免疫エフェクター細胞
本明細書に記載されるＣＡＲ分子または本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸を含有する細胞もまた、本明細書に記載される。本明細書に記載される核酸、例えば、例として本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸がトランスフェクトまたは形質導入されている細胞もまた、本明細書に記載される。一実施形態では、細胞は、本明細書に記載される細胞、例えば、ヒトＴ細胞、例えば、本明細書に記載されるヒトＴ細胞、またはヒトＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載されるヒトＮＫ細胞である。一実施形態では、ヒトＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、細胞での治療を受ける対象にとって自家的である。一部の実施形態では、細胞は、細胞での治療を受ける対象にとって同種である。
一態様では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、第２のＣＡＲ、例えば、例として同じ標的または異なる標的（例えば、本明細書に記載される腫瘍抗原以外の標的または本明細書に記載される別の腫瘍抗原）に対する異なる抗原結合性ドメインを含む第２のＣＡＲをさらに含み得る。一実施形態では、第２のＣＡＲは、腫瘍抗原と同じがん細胞種を発現する標的に対する抗原結合性ドメインを含む。一実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、第１の抗原を標的とし、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが一次シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを含む、第１のＣＡＲ、ならびに第２の異なる抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが共刺激シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを含む、第２のＣＡＲを含む。理論に束縛されることを望むものではないが、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、またはＯＸ−４０を第１のＣＡＲに配置し、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータを第２のＣＡＲに配置することにより、ＣＡＲ活性を、両方の標的が発現される細胞に限定することができる。一実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書に記載される標的抗原に結合する抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインを含む第１の腫瘍抗原ＣＡＲ、ならびに異なる標的抗原（例えば、第１の標的抗原と同じがん細胞種に発現する抗原）を標的とし、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含む、第２のＣＡＲを含む。別の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書に記載される標的抗原に結合する抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ、第１の標的抗原以外の抗原（例えば、第１の標的抗原と同じがん細胞種に発現する抗原）を標的とし、抗原に対する抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激シグナル伝達ドメインを含む、第２のＣＡＲを含む。
別の態様では、本発明は、ＣＡＲ発現細胞集団を提供し、例えば、そのうちの少なくとも１つまたは複数が、本明細書に記載される核酸分子を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。
例えば、一実施形態では、ＣＡＲＴ細胞の集団には、本明細書に記載される腫瘍抗原に対する抗原結合性ドメインを有するＣＡＲを発現する第１の細胞、および異なる抗原結合性ドメイン、例えば、本明細書に記載される異なる腫瘍抗原に対する抗原結合性ドメイン、例えば、第１の細胞が発現するＣＡＲの抗原結合性ドメインによって結合される腫瘍抗原とは異なる本明細書に記載される腫瘍抗原に対する抗原結合性ドメインを有するＣＡＲを発現する第２の細胞が含まれ得る。
別の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団には、本明細書に記載される腫瘍抗原に対する抗原結合性ドメインを含むＣＡＲを発現する第１の細胞、および本明細書に記載される腫瘍抗原以外の標的に対する抗原結合性ドメインを含むＣＡＲを発現する第２の細胞が含まれ得る。一実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の集団には、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第１の細胞、および二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第２の細胞が含まれる。
別の態様では、本発明は、集団内の少なくとも１つの細胞が、本明細書に記載される腫瘍抗原に対する抗原結合性ドメインを有するＣＡＲを発現し、第２の細胞は別の作用物質、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を強化する作用物質を発現する、細胞集団を提供する。一実施形態では、作用物質は、阻害性分子を阻害する作用物質であってもよい。阻害性分子、例えば、ＰＤ−１は、一部の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始させる能力を減少させることができる。阻害性分子の例としては、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦＲ（例えば、ＴＧＦＲベータ）が挙げられる。一実施形態では、阻害性分子を阻害する作用物質は、第１のポリペプチド、例えば、阻害性分子が、正のシグナルを細胞に提供する第２のポリペプチド、例えば、本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメインに会合したものを含む。一実施形態では、作用物質は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、もしくはＴＧＦＲベータなどの阻害性分子、またはこれらのうちのいずれかの断片である、第１のポリペプチド、ならびに本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン［例えば、共刺激ドメイン（例えば、例として本明細書に記載される４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＯＸ４０、またはＣＤ２８）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む］である第２のポリペプチドを含む。一実施形態では、作用物質は、ＰＤ−１またはその断片である第１のポリペプチド、および本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／または本明細書に記載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）である第２のポリペプチドを含む。
ＲＮＡトランスフェクション
インビトロ転写されたＲＮＡ ＣＡＲを産生するための方法が、本明細書に開示される。本明細書に記載される方法は、細胞に直接トランスフェクトすることができるＣＡＲコードＲＮＡコンストラクトを導入することを含む。トランスフェクションにおいて使用するためのｍＲＮＡを生成するための方法は、特別に設計したプライマーを用いた鋳型のインビトロ転写（ＩＶＴ）、続いて、ポリＡ付加により、３’および５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップ、ならびに／または配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現される核酸、ならびに典型的に長さが５０〜２０００塩基であるポリＡ尾部（例えば、例えば、配列番号３５）を含有するコンストラクトを産生することを伴い得る。このようにして産生されたＲＮＡは、様々な種類の細胞に効率的にトランスフェクトすることが可能である。一態様では、鋳型は、ＣＡＲの配列を含む。
免疫エフェクター細胞は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によってコードされたＣＡＲを含み得る。一態様では、本明細書に記載されるＣＡＲをコードするｍＲＮＡは、ＣＡＲ発現細胞の産生のために、例えば本明細書に記載される方法によって作製された免疫エフェクター細胞に導入される。
一実施形態では、インビトロ転写されたＲＮＡ ＣＡＲは、一過性トランスフェクションの形態で細胞に導入することができる。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成された鋳型を使用して、インビトロ転写によって産生される。任意の供給源に由来する目的のＤＮＡを、適切なプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼを使用して、ＰＣＲにより、インビトロｍＲＮＡ合成の鋳型に直接変換することができる。ＤＮＡの供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列、または任意の他の適切なＤＮＡ供給源であり得る。インビトロ転写に所望される鋳型（ｔｅｍｐｌｅ）は、本明細書に記載されるＣＡＲである。例えば、ＲＮＡ ＣＡＲの鋳型には、本明細書に記載される腫瘍関連抗原に対する抗体の一本鎖可変ドメインを含む細胞外領域；ヒンジ領域（例えば、本明細書に記載されるヒンジ領域）、膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８ａの膜貫通ドメインなど、本明細書に記載される膜貫通ドメイン）；ならびに細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、例としてＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域が含まれる。
一実施形態では、ＰＣＲに使用されるＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物のゲノム由来の天然のＤＮＡ配列に由来し得る。一実施形態では、核酸は、５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部または全体を含み得る。核酸は、エクソンおよびイントロンを含み得る。一実施形態では、ＰＣＲに使用されるＤＮＡは、ヒト核酸配列である。別の実施形態では、ＰＣＲに使用されるＤＮＡは、５’および３’ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。ＤＮＡは、代替として、天然の生物において通常は発現されない人工ＤＮＡ配列であってもよい。例示的な人工ＤＮＡ配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するように、一緒にライゲーションされる遺伝子の部分を含むものである。一緒にライゲーションされるＤＮＡの部分は、単一の生物に由来してもよく、または１種を上回る生物に由来してもよい。
ＰＣＲは、トランスフェクションに使用されるｍＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型を生成するために使用される。ＰＣＲを行う方法は、当該技術分野で周知である。ＰＣＲにおいて使用するためのプライマーは、ＰＣＲの鋳型として使用されるＤＮＡの領域に実質的に相補的な領域を有するように設計される。「実質的に相補的な」とは、本明細書に使用されるとき、プライマー配列における塩基の大部分またはすべてが、相補的であるか、または１つもしくは複数の塩基が、非相補的もしくは不一致である、ヌクレオチドの配列を指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに使用されるアニーリング条件下において、意図されるＤＮＡ標的とアニーリングまたはハイブリダイズすることができる。プライマーは、ＤＮＡ鋳型の任意の部分に実質的に相補的になるように設計され得る。例えば、プライマーは、５’および３’ＵＴＲを含む、細胞において通常転写される核酸の部分（オープンリーディングフレーム）を増幅させるように設計され得る。プライマーはまた、目的とされる特定のドメインをコードする核酸の一部分を増幅させるように設計され得る。一実施形態では、プライマーは、５’および３’ＵＴＲのすべてまたは一部を含む、ヒトｃＤＮＡのコーディング領域を増幅させるように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当該技術分野で周知の合成方法によって生成することができる。「順方向プライマー」は、増幅させようとするＤＮＡ配列の上流にある、ＤＮＡ鋳型上のヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「上流」は、コーディング鎖を基準として、増幅させようとするＤＮＡ配列に対する５側の位置を指して本明細書に使用される。「逆方向プライマー」は、増幅させようとするＤＮＡ配列の下流にある、二本鎖ＤＮＡ鋳型に実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「下流」は、コーディング鎖を基準として、増幅させようとするＤＮＡ配列に対する３’側の位置を指して本明細書に使用される。
ＰＣＲに有用な任意のＤＮＡポリメラーゼが、本明細書に開示される方法において使用され得る。試薬およびポリメラーゼは、多数の供給源から市販入手可能である。
安定性および／または翻訳効率を向上させる能力を有する化学構造体もまた、使用され得る。ＲＮＡは、５’および３’ＵＴＲを有することが好ましい。一実施形態では、５’ＵＴＲは、長さが１〜３０００ヌクレオチドである。コーディング領域に付加される５’および３’ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの異なる領域にアニーリングする、ＰＣＲのプライマーを設計することを含むがこれに限定されない様々な方法によって、変化させることができる。このアプローチを使用して、当業者であれば、転写されたＲＮＡのトランスフェクション後の最適な翻訳効率を達成するのに必要とされる５’および３’ＵＴＲの長さを修正することができる。
５’および３’ＵＴＲは、天然の、目的の核酸にとって内在性の５’および３’ＵＴＲであってもよい。代替として、目的の核酸にとって内在性でないＵＴＲ配列を、ＵＴＲ配列を順方向プライマーおよび逆方向プライマーに組み込むことによって、または任意の他の鋳型修飾によって、付加することもできる。目的の核酸にとって内在性でないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を修正するために有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列内のＡＵリッチエレメントは、ｍＲＮＡの安定性を低下させ得ることが知られている。したがって、３’ＵＴＲは、当該技術分野で周知のＵＴＲの特性に基づいて、転写されたＲＮＡの安定性を増加させるように選択または設計され得る。
一実施形態では、５’ＵＴＲは、内在性核酸のＫｏｚａｋ配列を含み得る。代替として、目的の核酸にとって内在性でない５’ＵＴＲが上述のようにＰＣＲによって付加される場合は、５’ＵＴＲ配列を付加することによってコンセンサスＫｏｚａｋ配列を再設計することができる。Ｋｏｚａｋ配列は、一部のＲＮＡ転写産物の翻訳効率を増加させ得るが、すべてのＲＮＡで効率的な翻訳を可能にするために必須というわけではないとみられる。多数のｍＲＮＡに対するＫｏｚａｋ配列の要件は、当該技術分野で既知である。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞において安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであり得る。他の実施形態では、様々なヌクレオチド類似体を、ｍＲＮＡのエクソヌクレアーゼ分解を妨げるために、３’または５’ＵＴＲにおいて使用することができる。
遺伝子クローニングを必要とすることなく、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡ合成を可能にするために、転写のプロモーターを、転写させようとする配列の上流でＤＮＡ鋳型と結合させる必要がある。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列を順方向プライマーの５’末端に付加すると、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写させようとするオープンリーディングフレームの上流でＰＣＲ産物に組み込まれるようになる。１つの好ましい実施形態では、プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載されるＴ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターとしては、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は、当該技術分野で既知である。
好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは５’末端のキャップおよび３’のポリ（Ａ）尾部の両方を有し、これらは、リボソーム結合、翻訳の開始、および細胞におけるｍＲＮＡ安定性を決定する。環状ＤＮＡ鋳型、例えば、プラスミドＤＮＡでは、ＲＮＡポリメラーゼは、真核生物細胞での発現に好適ではない、長いコンカテマー産物を産生する。３’ＵＴＲの末端で線状化されたプラスミドＤＮＡの転写は、正常なサイズのｍＲＮＡをもたらし、これは、転写後にポリアデニル化されるとしても、真核生物トランスフェクションには有効ではない。
線状ＤＮＡ鋳型では、ファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の最後の塩基を越えて転写産物の３’末端を伸長させることができる（Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985)、Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)。
ポリＡ／Ｔ部分をＤＮＡ鋳型に組み込む従来的な方法は、分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡに組み込まれたポリＡ／Ｔ配列は、プラスミド不安定性を引き起こす可能性があり、これが原因で、細菌細胞から得られたプラスミドＤＮＡ鋳型は、欠失および他の異常が多数混入することが多い。これにより、クローニング手順は、手間がかかるだけでなく、時間もかかるが、信頼できないことも多い。このため、クローニングなしで、ポリＡ／Ｔ３’部分を有するＤＮＡ鋳型の構築を可能にする方法が、非常に望ましい。
転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、１００Ｔ尾部（配列番号３１）［サイズは、５０〜５０００Ｔ（配列番号３２）であり得る］などのポリＴ尾部を含む逆方向プライマーを使用したＰＣＲの際に、またはＤＮＡライゲーションもしくはインビトロ組換えを含むがこれらに限定されない任意の他の方法によるＰＣＲの後に、産生され得る。ポリ（Ａ）尾部はまた、ＲＮＡに安定性を提供し、それらの分解を低減させる。一般に、ポリ（Ａ）尾部の長さは、転写されるＲＮＡの安定性と正相関にある。一実施形態では、ポリ（Ａ）尾部は、１００〜５０００のアデノシン（例えば、配列番号３０）である。
ＲＮＡのポリ（Ａ）尾部は、大腸菌ポリＡポリメラーゼ（Ｅ−ＰＡＰ）などのポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用したインビトロ転写後に、さらに伸長させることができる。一実施形態では、ポリ（Ａ）尾部の長さを１００ヌクレオチドから、３００〜４００ヌクレオチド（配列番号３４）に増加させることにより、ＲＮＡの翻訳効率に約２倍の増加がもたらされる。加えて、３’末端に異なる化学基を結合させることにより、ｍＲＮＡ安定性を増加させることができる。このような結合部は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマー、および他の化合物を含み得る。例えば、ＡＴＰ類似体を、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して、ポリ（Ａ）尾部に組み込むことができる。ＡＴＰ類似体は、ＲＮＡの安定性をさらに増加させ得る。
５’キャップもまた、ＲＮＡ分子に安定性をもたらす。好ましい実施形態では、本明細書に開示される方法によって産生されたＲＮＡは、５’キャップを含む。５’キャップは、本明細書に記載される当該技術分野で既知の技法を使用して提供される［Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)、Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001)、Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)］。
本明細書に開示される方法によって産生されたＲＮＡはまた、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列も含み得る。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存性リボソーム結合を開始し、翻訳の開始を促進する、任意のウイルス配列、染色体配列、または人工的に設計された配列であり得る。細胞の透過性および生存を高める因子、例えば、糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤、および界面活性剤が含まれ得る、細胞電気穿孔に好適な任意の溶質もまた、含まれ得る。
ＲＮＡは、多数の異なる方法、例えば、電気穿孔法［Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ−ＩＩ（Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）］、（ＥＣＭ ８３０（ＢＴＸ）（Ｈａｒｖａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）、またはＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ、Ｄｅｎｖｅｒ、Ｃｏｌｏ．）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ、Ｈａｍｂｕｒｇ Ｇｅｒｍａｎｙ）、リポフェクションを使用したカチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション、ポリマー封入、ペプチド媒介性トランスフェクション、または「遺伝子銃」などのバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）粒子デリバリーシステム（例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)を参照されたいを含むがこれらに限定されない、市販入手可能な方法を使用して、標的細胞に導入することができる。
非ウイルス性デリバリー方法
一部の態様では、非ウイルス性の方法を使用して、本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸を、細胞もしくは組織または対象にデリバリーすることができる。
一部の実施形態では、非ウイルス性の方法には、トランスポゾン（転位性因子とも呼ばれる）の使用が含まれる。一部の実施形態では、トランスポゾンは、それ自体をゲノム内のある位置に挿入することができるＤＮＡ片、例えば、自己複製し、そのコピーをゲノムに挿入することができるＤＮＡ片、または長い核酸からスプライシングされ、ゲノム内の別の場所に挿入され得るＤＮＡ片である。例えば、トランスポゾンは、転位のための遺伝子に隣接する逆位反復配列から作製されるＤＮＡ配列を含む。
トランスポゾンを使用した核酸デリバリーの例示的な方法としては、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系（ＳＢＴＳ）およびｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾン系が挙げられる。例えば、Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20、Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971、Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589、Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209、Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166、Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16、Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65、およびDing et al. Cell. 122.3(2005):473-83を参照されたく、これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれる。
ＳＢＴＳには、次の２つの構成要素が含まれる：１）導入遺伝子を含むトランスポゾン、および２）トランスポサーゼ酵素の供給源。トランスポサーゼは、担体プラスミド（または他のドナーＤＮＡ）から標的ＤＮＡ、例えば、宿主細胞の染色体／ゲノムにトランスポゾンを転位させることができる。例えば、トランスポサーゼは、担体プラスミド／ドナーＤＮＡに結合し、プラスミドからトランスポゾン（導入遺伝子を含む）を切り離し、それを宿主細胞のゲノムに挿入する。例えば、Aronovich et al.（上記）を参照されたい。
例示的なトランスポゾンとしては、ｐＴ２系トランスポゾンが挙げられる。例えば、Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47およびSingh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971を参照されたく、これらのすべては参照により本明細書に組み込まれる。例示的なトランスポサーゼとしては、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポサーゼ、例えば、ＳＢ１０トランスポサーゼまたはＳＢ１１トランスポサーゼ（例えば、サイトメガロウイルスプロモーターから発現され得る高活性トランスポサーゼ）が挙げられる。例えば、Aronovich et al.、Kebriaei et al.、およびGrabundzija et al.を参照されたく、これらのすべては参照により本明細書に組み込まれる。
ＳＢＴＳの使用により、導入遺伝子、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸の効率的な組込みおよび発現が可能となる。例えば、ＳＢＴＳなどのトランスポゾン系を使用して、本明細書に記載されるＣＡＲを安定に発現する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を生成する方法が、本明細書に提供される。
本明細書に記載される方法によると、一部の実施形態では、ＳＢＴＳ構成要素を含む１つまたは複数の核酸、例えば、プラスミドが、細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）にデリバリーされる。例えば、核酸は、核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ）デリバリーの標準的な方法、例えば、本明細書に記載される方法、例えば、電気穿孔、トランスフェクション、またはリポフェクションによって、デリバリーされる。一部の実施形態では、核酸は、導入遺伝子、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸を含む、トランスポゾンを含む。一部の実施形態では、核酸は、導入遺伝子（例えば、本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸）を含むトランスポゾンならびにトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む。他の実施形態では、２種類の核酸を有する系、例えば、二重プラスミド系が提供され、例えば、その場合、第１のプラスミドは、導入遺伝子を含むトランスポゾンを含み、第２のプラスミドは、トランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む。例えば、第１の核酸および第２の核酸は、宿主細胞に共にデリバリーされる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲを発現する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、ＳＢＴＳを使用した遺伝子挿入とヌクレアーゼ［例えば、亜鉛ンフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、または操作型メガヌクレアーゼ再操作型ホーミングエンドヌクレアーゼ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ ｒｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｏｍｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）］を使用した遺伝子編集との組合せを使用して、生成される。
一部の実施形態では、非ウイルス性デリバリー方法の使用により、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の再プログラミング、および対象への細胞の直接注入が可能となる。非ウイルス性ベクターの利点としては、患者集団に対処するのに必要な十分な量を産生することが容易かつ比較的低費用であること、保管時の安定性、および免疫原性の欠如が挙げられるがこれらに限定されない。
免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化および増殖
Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載されている方法を使用して、活性化および増殖させることができる。
一般に、免疫エフェクター細胞、例えば、制御性Ｔ細胞枯渇細胞の集団は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤およびＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドが結合した表面との接触によって、増殖させることができる。具体的には、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載されるように、例えば、表面上に固定化された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合性断片、または抗ＣＤ２抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアを伴うタンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によって、刺激され得る。Ｔ細胞の表面上の補助分子の共刺激については、補助分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適した条件下において、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させてもよい。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体が使用され得る。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、当該技術分野で一般に既知の他の方法と同様に使用することができる［Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998、Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999、Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999］。
ある特定の態様では、Ｔ細胞の一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中のものであってもよく、または表面に連結されていてもよい。表面に連結している場合、薬剤は、同じ表面に連結されてもよく（すなわち、「シス」構成）または別個の表面に連結されてもよい（すなわち、「トランス」構成）。代替として、一方の薬剤が表面に連結され、他方の薬剤が溶液中にあってもよい。一態様では、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合しており、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるかまたは表面に連結されている。ある特定の態様では、両方の薬剤が溶液中にあってもよい。一態様では、薬剤は、可溶性形態であってもよく、次いで、Ｆｃ受容体を発現する細胞または薬剤に結合する抗体もしくは他の結合剤などの表面に架橋されてもよい。この点に関しては、例えば、本発明においてＴ細胞の活性化および増殖での使用が企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）について、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号および同第２００６００３４８１０号を参照されたい。
一態様では、２種類の薬剤は、同じビーズに、すなわち「シス」、または別個のビーズに、すなわち「トランス」のいずれかで、ビーズに固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片であり、共刺激シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性断片であり、これらの薬剤はいずれも、同等な分子量で同じビーズに共固定化されている。一態様では、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖およびＴ細胞成長のためにビーズに結合させる各抗体は１：１の比で使用される。本発明のある特定の態様では、ビーズに結合させる抗ＣＤ３抗体：抗ＣＤ２８抗体の比は、１：１の比を使用して観察される増殖と比較してＴ細胞増殖に増加が観察されるようなものが使用される。１つの特定の態様では、１：１の比を使用して観察される増殖と比較して、約１倍〜約３倍の増加が観察される。一態様では、ビーズに結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１〜１：１００の範囲およびこれらの間のすべての整数値に及ぶ。一態様では、抗ＣＤ３抗体よりも多くの抗ＣＤ２８抗体が、粒子に結合する、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比が１未満となる。ある特定の態様では、ビーズに結合する抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体の比は、２：１よりも大きい。１つの特定の態様では、ビーズに結合するＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比１：１００が使用される。一態様では、ビーズに結合するＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比１：７５が使用される。さらなる態様では、ビーズに結合するＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比１：５０が使用される。一態様では、ビーズに結合するＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比１：３０が使用される。１つの好ましい態様では、ビーズに結合するＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比１：１０が使用される。一態様では、ビーズに結合するＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比１：３が使用される。さらなる１つの態様では、ビーズに結合するＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比３：１が使用される。
Ｔ細胞および他の標的細胞を刺激するために、粒子対細胞の比１：５００〜５００：１およびこれらの間の任意の整数値が使用され得る。当業者であれば容易に理解することができるように、粒子対細胞の比は、標的細胞に対する粒子のサイズに依存し得る。例えば、サイズの小さいビーズは、数個の細胞にのみ結合することができるが、大きなビーズは、多数に結合することができる。ある特定の態様では、細胞対粒子の比は、１：１００〜１００：１の範囲およびそれらの間の任意の整数値に及び、さらなる態様では、比は、１：９〜９：１およびそれらの間の任意の整数値を含み、同様にＴ細胞を刺激するために使用することができる。Ｔ細胞刺激をもたらす、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８に連結した粒子対Ｔ細胞の比は、上述のように多様であり得るが、ある特定の好ましい値としては、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、および１５：１が挙げられ、１つの好ましい比は、Ｔ細胞１つ当たりの粒子が少なくとも１：１である。一態様では、粒子対細胞の比１：１またはそれ以下が使用される。１つの特定の態様では、粒子：細胞の好ましい比は、１：５である。さらなる態様では、粒子対細胞の比は、刺激の日に応じて多様であり得る。例えば、一態様では、粒子対細胞の比は、初日では１：１〜１０：１であり、その後最大１０日間、毎日または１日おきに細胞にさらなる粒子が追加され、最終的な比は１：１〜１：１０である（追加日における細胞計数に基づく）。１つの特定の態様では、粒子対細胞の比は、刺激の初日では１：１であり、刺激の３日目および５日目に１：５に調節される。一態様では、粒子は、毎日または１日おきに追加され、最終的な比は、初日で１：１、ならびに刺激の３日目および５日目で１：５である。一態様では、粒子対細胞の比は、刺激の初日では２：１であり、刺激の３日目および５日目に１：１０に調節される。一態様では、粒子は、毎日または１日おきに追加され、最終的な比は、初日で１：１、ならびに刺激の３日目および５日目で１：１０である。当業者であれば、様々な他の比が、本発明における使用に好適であり得ることを理解するであろう。特に、比は、粒子のサイズならびに細胞のサイズおよび種類に応じて多様であろう。一態様では、使用するための最も典型的な比は、初日で１：１、２：１、および３：１付近である。
さらなる態様では、細胞、例えばＴ細胞を、薬剤でコーティングされたビーズと合わせ、次いで、ビーズおよび細胞を分離した後に、細胞を培養する。代替的な態様では、培養の前に、薬剤でコーティングしたビーズおよび細胞を分離させず、一緒に培養する。さらなる態様では、ビーズおよび細胞を、まず、磁力などの力を印加することによって濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションの増加をもたらし、それによって、細胞刺激を誘導する。
例として、細胞表面タンパク質は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合した常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）をＴ細胞に接触させることによって、ライゲーションさせることができる。一態様では、細胞（例えば、１０４〜１０９個のＴ細胞）およびビーズ［例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ常磁性ビーズ、１：１の比］を、緩衝液、例えば、ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオンを含まない）中で合わせる。ここでも、当業者であれば、任意の細胞濃度が使用され得ることを容易に理解することができる。例えば、標的細胞が、試料中にほとんど見られず、試料のわずか０．０１％を構成し得るか、または全試料（すなわち、１００％）が、目的の標的細胞で構成されてもよい。したがって、あらゆる細胞数が、本発明の文脈の範囲内である。ある特定の態様では、細胞と粒子との最大限の接触を確実にするために、粒子および細胞を一緒に混合する量を大幅に減少させる（すなわち、細胞濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。例えば、一態様では、約１００億個の細胞／ｍｌ、９０億個／ｍｌ、８０億個／ｍｌ、７０億個／ｍｌ、６０億個／ｍｌ、５０億個／ｍｌ、または２０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用される。一態様では、１億個の細胞／ｍｌを上回るものが、使用される。さらなる態様では、１０００万個、１５００万個、２０００万個、２５００万個、３０００万個、３５００万個、４０００万個、４５００万個または５０００万個の細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらなる一態様では、７５００万個、８０００万個、８５００万個、９０００万個、９５００万個、または１億個の細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる態様では、１億２５００万個または１億５０００万個の細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。高い濃度を使用することにより、細胞収率、細胞活性化、および細胞増殖の増加をもたらすことができる。さらに、高い細胞濃度を使用することにより、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞など、目的の標的抗原を微弱に発現し得る細胞のより効率的な捕捉が可能となる。このような細胞集団は、ある特定の態様では、治療的価値を有する可能性があり、得ることが望ましいであろう。例えば、高い細胞濃度を使用することにより、通常、微弱なＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択が可能となる。
一実施形態では、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を形質導入した細胞を、例えば、本明細書に記載される方法によって増殖させる。一実施形態では、細胞は、数時間（例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間）から約１４日間（例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、または１４日間）の期間、培養液中で増殖させる。一実施形態では、細胞は、４〜９日間の期間、増殖させる。一実施形態では、細胞は、８日間またはそれ未満、例えば、７日間、６日間、または５日間の期間、増殖させる。一実施形態では、細胞は、５日間培養液中で増殖させ、その結果得られた細胞は、同じ培養条件下において９日間培養液中で増殖させた同じ細胞よりも強力である。効力は、例えば、様々なＴ細胞機能、例えば、増殖、標的細胞殺滅、サイトカイン産生、活性化、遊走、またはこれらの組合せによって、定義することができる。一実施形態では、５日間増殖させた細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ細胞は、抗原刺激時に、同じ培養条件下において９日間培養液中で増殖させた同じ細胞と比較して、細胞倍増の少なくとも１倍、２倍、３倍、または４倍の増加を示す。一実施形態では、細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞を、５日間培養液中で増殖させ、その結果得られた細胞は、同じ培養条件下において９日間培養液で増殖させた同じ細胞と比較して、より高い炎症促進性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを呈する。一実施形態では、５日間増殖させた細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下において９日間培養液中で増殖させた同じ細胞と比較して、ｐｇ／ｍｌでの炎症促進性サイトカイン産生、例えば、ＩＮＦ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルの少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれ以上の増加を示す。
Ｔ細胞の培養時間が６０日またはそれ以上となり得るように、複数回の刺激サイクルも所望され得る。Ｔ細胞培養に適した条件としては、血清（例えば、ウシ胎児血清またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ−α、または当業者に既知の細胞の成長のための任意の他の添加物を含む、増殖および生存に必要な要素を含有し得る、適切な培地［例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ）］が挙げられる。細胞の成長のための他の添加物としては、界面活性剤、プラスマネート、および還元剤、例えば、Ｎ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールが挙げられるがこれらに限定されない。培地としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加された、血清不含であるか、または適切な量の血清（もしくは血漿）もしくは所定のセットのホルモンおよび／またはＴ細胞の成長および増殖に十分な量のサイトカインが補充された、ＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ １５、およびＸ−Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを挙げることができる。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養液にのみ含まれ、対象に注入される細胞培養液には含まれない。標的細胞は、成長を補助するのに必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気に加えて５％ＣＯ２）で維持される。
一実施形態では、細胞を、１つまたは複数のインターロイキンを含む適切な培地（例えば、本明細書に記載される培地）において増殖させ、これが、例えば、フローサイトメトリーなど、本明細書に記載される方法によって測定した場合に、１４日間の培養期間にわたって細胞の少なくとも２００倍（例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍）の増加をもたらす。一実施形態では、細胞を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７（例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７）の存在下において増殖させる。
様々な回数の刺激に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を呈し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスを受けた末梢血単核細胞産物は、細胞傷害性またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）よりも多くのヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３受容体およびＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞のエキソビボ増殖では、約８〜９日目よりも前には主にＴＨ細胞からなるＴ細胞集団が生じるが、約８〜９日目よりも後にはＴ細胞集団は、次第に多くのＴＣ細胞集団を含む。したがって、治療の目的に応じて、ＴＨ細胞を主に含むＴ細胞集団を対象に注入することが有利な場合がある。同様に、抗原特異的なＴＣ細胞サブセットが単離されている場合、このサブセットをさらに増殖させることが有益な場合がある。
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞増殖プロセスの過程において、著しく多様であるが、大部分は再現的に多様である。したがって、このような再現性により、活性化Ｔ細胞産物を特定の目的に合わせることが可能となる。
本明細書に記載されるＣＡＲが構築されると、様々なアッセイを使用して、抗原刺激後にＴ細胞を増殖させる能力、再刺激の非存在下においてＴ細胞増殖を維持する能力、ならびにインビトロおよび動物モデルにおいて適切な抗がん活性などであるがこれらに限定されない分子の活性を評価することができる。本発明のｃａｒの効果を評価するためのアッセイを、以下にさらに詳細に説明する。
初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析を使用して、単量体および二量体の存在を検出することができる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。非常に簡単に述べると、ＣＡＲを発現するＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の１：１混合物）を、１０日間を上回ってインビトロで増殖させた後、溶解させ、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。全長ＴＣＲ−ζ細胞質ドメインおよび内在性ＴＣＲ−ζ鎖を含むＣＡＲは、ＴＣＲ−ζ鎖に対する抗体を使用してウェスタンブロットによって検出される。同じＴ細胞サブセットを、共有結合二量体形成の評価が可能となるように非還元条件下においてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に使用する。
抗原刺激後のＣＡＲ＋Ｔ細胞のインビトロ増殖は、フローサイトメトリーによって測定することができる。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、αＣＤ３／αＣＤ２８ ａＡＰＣと接触させた後、分析しようとするプロモーターの制御下において、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターを形質導入する。例示的なプロモーターとしては、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣ、またはホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。ＧＦＰ蛍光は、フローサイトメトリーによって、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットおよび／またはＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおいて、培養の６日目に評価する。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。代替として、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、０日目に、αＣＤ３／αＣＤ２８でコーティングした磁気ビーズで刺激し、１日目に、２Ａリボソームスキッピング配列を使用して、ｅＧＦＰとともにＣＡＲを発現するバイシストロンのレンチウイルスベクターを使用してＣＡＲの形質導入を行う。培養物を、洗浄後に、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体（Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８）の存在下において、本明細書に記載されるがん関連抗原＋Ｋ５６２細胞（本明細書に記載されるＫ５６２を発現するがん関連抗原）、野生型Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２野生型）、またはｈＣＤ３２および４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞のいずれかで、再刺激する。外来性ＩＬ−２を、１００ＩＵ／ｍｌで１日おきに培養物に添加する。ビーズに基づく計数を使用して、フローサイトメトリーによってＧＦＰ＋Ｔ細胞を数える。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。
再刺激の非存在下におけるＣＡＲ＋Ｔ細胞増殖の持続も測定することができる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。簡単に述べると、０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８でコーティングした磁気ビーズで刺激し、１日目に、示されるＣＡＲを形質導入した後、平均Ｔ細胞量（ｆｌ）を、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ＩＩＩ粒子計数装置を使用して、培養の８日目に測定する。
例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１５年３月１３日に出願された国際出願第ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落６９８に記載されているように、動物モデルを使用して、ＣＡＲ発現細胞活性を測定することもできる。用量依存性のＣＡＲ治療応答は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１５年３月１３日に出願された国際出願第ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落６９９に記載されているように、評価することができる。細胞増殖およびサイトカイン産生の評価は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１５年３月１３日に出願された国際出願第ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落７００に記載されているように、これまでに説明されている。細胞傷害性は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１５年３月１３日に出願された国際出願第ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落７０１に記載されているように、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって、評価することができる。撮像技術を使用して、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１５年３月１３日に出願された国際出願第ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落７０２に記載されているように、腫瘍保持動物モデルにおけるＣＡＲの特異的な輸送および増殖を評価することができる。本明細書の実施例の節に記載されているもの、ならびに当該技術分野で既知のものを含む、他のアッセイを使用して、本明細書に記載されるＣＡＲを評価することもできる。
代替として、または本明細書に開示される方法との組合せで、ＣＡＲ発現細胞の検出および／または定量化［例えば、インビトロもしくはインビボでの（例えば、臨床モニタリング）］、免疫細胞の増殖および／または活性化、ならびに／またはＣＡＲリガンドの使用を伴うＣＡＲ特異的選択のうちの１つまたは複数のための方法および組成物が、開示される。１つの例示的な実施形態では、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ分子に結合する、例えば、ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインに結合する抗体（例えば、抗原結合性ドメインに結合する抗体、例えば、抗イディオタイプ抗体、または細胞外結合性ドメインの定常領域に結合する抗体）である。他の実施形態では、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ抗原分子（例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ抗原分子）である。
一態様では、ＣＡＲ発現細胞を検出および／または定量化するための方法が、開示される。例えば、ＣＡＲリガンドを使用して、インビトロまたはインビボでＣＡＲ発現細胞を検出および／または定量化することができる（例えば、患者におけるＣＡＲ発現細胞の臨床モニタリング、または患者への投薬）。この方法には、
ＣＡＲリガンド（適宜、標識されたＣＡＲリガンド、例えば、タグ、ビーズ、放射標識、または蛍光標識を含むＣＡＲリガンド）を提供すること、
ＣＡＲ発現細胞を取得すること（例えば、ＣＡＲ発現細胞を含有する試料、例えば、作製用試料または臨床試料を取得すること）、
ＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲリガンドと、結合が生じる条件下において接触させ、それによって、存在するＣＡＲ発現細胞のレベル（例えば、量）を検出すること
が含まれる。ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンドとの結合は、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡなどといった標準的な技法を使用して検出することができる。
別の態様では、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）を増殖および／または活性化する方法が、開示される。この方法には、
ＣＡＲ発現細胞（例えば、第１のＣＡＲ発現細胞または一過的に発現するＣＡＲ細胞）を提供すること、
前記ＣＡＲ発現細胞をＣＡＲリガンド、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲリガンド）と、免疫細胞の増大および／または増殖が生じる条件下において接触させ、それによって、活性化および／または増殖させた細胞集団を生成することが含まれる。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲリガンドは、基質上に存在する（例えば、基質、例えば、非天然の基質に固定化されているかまたは結合している）。一部の実施形態では、基質は、非細胞性基質である。非細胞性基質は、例えば、プレート（例えば、マイクロタイタープレート）、膜（例えば、ニトロセルロース膜）、マトリックス、チップ、またはビーズから選択される固体支持体であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲリガンドは、基質内（例えば、基質表面上）に存在する。ＣＡＲリガンドは、基質に固定化、結合、または共有結合もしくは非共有結合で会合（例えば、架橋）され得る。一実施形態では、ＣＡＲリガンドは、ビーズに結合（例えば、共有結合）している。前述の実施形態では、免疫細胞集団は、インビトロまたはエキソビボで増殖させることができる。この方法は、免疫細胞集団を、ＣＡＲ分子のリガンドの存在下において、例えば、本明細書に記載される方法のうちのいずれかを使用して、培養することをさらに含み得る。
他の実施形態では、細胞を増殖および／または活性化する方法は、第２の刺激分子、例えば、ＣＤ２８の付加をさらに含む。例えば、ＣＡＲリガンドおよび第２の刺激分子を、基質、例えば、１つまたは複数のビーズに固定化し、それによって、細胞増殖および／または活性化の増加を提供することができる。
さらに別の態様では、ＣＡＲ発現細胞を選択または富化するための方法が、提供される。この方法には、ＣＡＲ発現細胞を、本明細書に記載されるＣＡＲリガンドと接触させること、およびＣＡＲリガンドの結合に基づいて細胞を選択することが含まれる。
さらに他の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞を枯渇、低減、および／または殺滅させるための方法が、提供される。この方法には、ＣＡＲ発現細胞を、本明細書に記載されるＣＡＲリガンドと接触させること、ならびにＣＡＲリガンドの結合に基づいて細胞を標的化し、それによって、ＣＡＲ発現細胞の数を低減させる、および／またはＣＡＲ発現細胞を殺滅させることが含まれる。一実施形態では、ＣＡＲリガンドは、毒性剤［例えば、毒素または細胞除去薬（ｃｅｌｌ ａｂｌａｔｉｖｅ ｄｒｕｇ）］に連結されている。別の実施形態では、抗イディオタイプ抗体により、エフェクター細胞活性、例えば、ＡＤＣＣ活性またはＡＤＣ活性を引き起こすことができる。
本明細書に開示される方法において使用することができる例示的な抗ＣＡＲ抗体は、例えば、ＷＯ２０１４／１９０２７３およびJena et al., "Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials", PLOS March 2013 8:3 e57838に記載されており、これらの内容は、参照により組み込まれる。
一部の態様および実施形態では、本明細書の組成物および方法は、例えば、参照により内容が全体として本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０１９３００に記載されているように、特定のＴ細胞サブセットに対して最適化される。一部の実施形態では、最適化されたＴ細胞サブセットは、同じコンストラクトを発現する対照Ｔ細胞、例えば、異なる種類のＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋）と比較して、存続性の強化を示す。
一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、本明細書に記載されるＣＡＲを含み、このＣＡＲは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に好適な（例えば、例として存続性の強化をもたらすように最適化された）細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＩＣＯＳドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、本明細書に記載されるＣＡＲを含み、このＣＡＲは、ＣＤ８＋Ｔ細胞に好適な（例えば、例としてその存続性の強化をもたらすように最適化された）細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン、またはＩＣＯＳドメイン以外の別の共刺激ドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、本明細書に記載される抗原結合性ドメインを含み、例えば、ＣＡＲは、抗原結合性ドメインを含む。
ある態様では、対象、例えば、がんを有する対象を治療する方法が、本明細書に記載される。この方法は、前記対象に、有効量の
１）ＣＡＲを含むＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＡＲＣＤ４＋）であって、
抗原結合性ドメイン、例えば、本明細書に記載される抗原結合性ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、第１の共刺激ドメイン、例えば、ＩＣＯＳドメインを含む、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ならびに
２）ＣＡＲを含むＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＡＲＣＤ８＋）であって、
抗原結合性ドメイン、例えば、本明細書に記載される抗原結合性ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、第２の共刺激ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン、またはＩＣＯＳドメイン以外の別の共刺激ドメインを含む、ＣＤ８＋Ｔ細胞を投与することを含み、
ここで、ＣＡＲＣＤ４＋およびＣＡＲＣＤ８＋は、互いに異なる。
適宜、本方法は、さらに、
３）ＣＡＲを含む第２のＣＤ８＋Ｔ細胞（第２のＣＡＲＣＤ８＋）であって、
抗原結合性ドメイン、例えば、本明細書に記載される抗原結合性ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
細胞内シグナル伝達ドメインを含む、第２のＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、ここで、第２のＣＡＲＣＤ８＋は、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＡＲＣＤ８＋には存在していない共刺激シグナル伝達ドメインを含み、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメインを含まなくてもよい。
本明細書に記載される方法のうちのいずれも、本明細書に記載されるＢＴＫ阻害剤の投与をさらに含んでもよい。
バイオポリマーデリバリー方法
一部の実施形態では、本明細書に開示される１つまたは複数のＣＡＲ発現細胞は、バイオポリマースキャフォールド、例えば、バイオポリマーインプラントによって、対象に投与またはデリバリーされ得る。バイオポリマースキャフォールドは、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞のデリバリー、増殖、および／または分散を補助または強化することができる。バイオポリマースキャフォールドは、生体適合性ポリマー（例えば、実質的に炎症応答もしくは免疫応答を誘導することがない）および／または生体分解性ポリマーを含み、これらは、天然または合成であり得る。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の作製方法は、ＣＡＲ発現細胞をバイオポリマー、例えば、この節に記載のバイオポリマーと接触させる工程を含む。
好適なバイオポリマーの例としては、単独または任意の他のポリマー組成物との組合せで、任意の濃度および任意の比率で、寒天、アガロース、アルジネート、アルジネート／リン酸カルシウムセメント（ＣＰＣ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−ＧＡＬ）、（１，２，３，４，６−ペンタアセチルａ−Ｄ−ガラクトース）、セルロース、キチン、キトサン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、ヒアルロン酸コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシ−ヘキサノエート）（ＰＨＢＨＨｘ）、ポリ（ラクチド）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリビニルアルコール）（ＰＶＡ）、シルク、ダイズタンパク質、およびダイズタンパク質分離物が挙げられるが、これらに限定されない。バイオポリマーは、接着促進性分子もしくは遊走促進性分子、例えば、リンパ球のコラーゲン受容体に結合するコラーゲン模倣ペプチド、および／またはデリバリーしようとする細胞のデリバリー、増殖、または機能、例えば、抗がん活性を強化するための刺激分子を用いて増強または修飾することができる。バイオポリマースキャフォールドは、注射可能なもの、例えば、ゲルもしくは半固体、または固体の組成物であり得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、対象へのデリバリーの前にバイオポリマースキャフォールドに播種される。いくつかの実施形態では、バイオポリマースキャフォールドは、例えば、スキャフォールドのバイオポリマーに組み込まれるかまたはコンジュゲートされた、１つもしくは複数の追加の本明細書に記載される治療剤（例えば、別のＣＡＲ発現細胞、抗体、もしくは小分子）またはＣＡＲ発現細胞の活性を強化する薬剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、バイオポリマースキャフォールドは、例えば、腫瘍内に注射されるか、または腫瘍にかもしくは抗腫瘍効果を媒介するのに十分に腫瘍に近接して、外科手術により埋め込まれる。バイオポリマー組成物およびそれらのデリバリー方法のさらなる例は、Stephan et al., Nature Biotechnology, 2015, 33:97-101およびＷＯ２０１４／１１０５９１に記載されている。
作製／生成の方法
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、細胞（例えば、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞）での処置後にＴ細胞枯渇剤を投与し、それによって、ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞）を低減させる（例えば、枯渇させる）ことをさらに含む。このようなＴ細胞枯渇剤は、ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞）を効果的に枯渇させて、毒性を軽減するために使用され得る。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞を、本明細書に記載される方法に従って作製し、例えば、本明細書の方法に従ってアッセイした（例えば、トランスフェクションまたは形質導入の前または後に）。
一部の実施形態では、Ｔ細胞枯渇剤は、細胞、例えば、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞集団の投与の１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、または５週間後に投与される。
一実施形態では、Ｔ細胞枯渇剤は、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体誘導性細胞死を誘導することによって、ＣＡＲ発現細胞を枯渇させる薬剤である。例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞はまた、細胞死、例えば、ＡＤＣＣまたは補体誘導性細胞死を誘導することができる分子によって認識される抗原（例えば、標的抗原）も発現し得る。例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞はまた、抗体または抗体断片によって標的とされ得る標的タンパク質（例えば、受容体）も発現し得る。このような標的タンパク質の例としては、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン（例えば、インテグリンανβ３、α４、αΙ３／４β３、α４β７、α５β１、ανβ３、αν）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＰＤＧＦ受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ−１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ１、ＴＡＧ−７２、ＩＬ−６受容体、５Ｔ４、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＣＤ１５、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３／ｌｇＥ受容体、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７／ベイシジン、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ７、およびＥＧＦＲ、ならびにこれらの短縮バージョン（例えば、１つまたは複数の細胞外エピトープを保持しているが、細胞質ドメイン内の１つまたは複数の領域を欠くバージョン）が挙げられるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲおよび標的タンパク質を共発現し、例えば、標的タンパク質を天然に発現するか、または標的タンパク質を発現するように操作されている。例えば、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団は、ＣＡＲ核酸（例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ核酸）を含む核酸（例えば、ベクター）および標的タンパク質をコードする核酸を含む。
一実施形態では、Ｔ細胞枯渇剤は、ＣＤ５２阻害剤、例えば、抗ＣＤ５２抗体分子、例えば、アレムツズマブである。
他の実施形態では、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書に記載されるＣＡＲ分子（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ）およびＴ細胞枯渇剤によって認識される標的タンパク質を発現する。一実施形態では、標的タンパク質は、ＣＤ２０である。標的タンパク質がＣＤ２０であるいくつかの実施形態では、Ｔ細胞枯渇剤は、抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブである。
前述の方法のうちのいずれかのさらなる実施形態では、本方法は、細胞、例えば、造血幹細胞、または骨髄を、哺乳動物に移植することをさらに含む。別の態様では、本発明は、細胞移植の前に哺乳動物を調整する方法を特徴とする。この方法は、ＣＡＲ核酸またはポリペプチド、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ核酸またはポリペプチドを含む、有効量の細胞を、哺乳動物に投与することを含む。一部の実施形態では、細胞移植は、幹細胞移植、例えば、造血幹細胞移植、または骨髄移植である。他の実施形態では、細胞移植の前に対象を調整することは、対象における標的発現細胞、例えば、ＣＤ１９を発現する正常細胞またはＣＤ１９を発現するがん細胞の数を低減させることを含む。
医薬組成物および治療
本明細書に記載される方法は、ＣＡＲ発現細胞を医薬組成物に製剤化することをさらに含み得る。医薬組成物は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、本明細書に記載される複数のＣＡＲ発現細胞を、１つまたは複数の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含み得る。このような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など、炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン、抗酸化剤、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、ならびに保存剤を含み得る。組成物は、例えば、静脈内投与用に製剤化され得る。
一実施形態では、医薬組成物は、混入物質、例えば、内毒素マイコプラズマ、複製能力のあるレンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ ｇａｇ、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８でコーティングされたビーズの残留物、マウス抗体、貯蔵ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地成分、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌および真菌からなる群から選択されるものを実質的に含まず、例えば、混入物質は検出可能なレベルでは存在しない。一実施形態では、細菌は、アルガリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ナイセリア・メニンギティデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、およびストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ａ群からなる群から選択される少なくとも１つである。
「免疫学的有効量」、「抗がん有効量」、「がん阻害に有効な量」、または「治療量」が示される場合、投与される組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の範囲、および患者（対象）の状態における個々の相違を考慮して、医師によって決定され得る。一般に、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を含む医薬組成物は、１０４〜１０９個の細胞／体重ｋｇの投薬量で投与され得、一部の事例では、１０５〜１０６個の細胞／体重ｋｇで投与され得、これらの範囲内のすべての整数が含まれる。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投薬量で複数回投与してもよい。細胞は、免疫療法において一般に既知の注入技法を使用して投与することができる（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照されたい）。
一部の実施形態では、ＣＡＲ細胞の１回用量は、約１×１０６個、１．１×１０６個、２×１０６個、３．６×１０６個、５×１０６個、１×１０７個、１．８×１０７個、２×１０７個、５×１０７個、１×１０８個、２×１０８個、または５×１０８個の細胞／ｋｇを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ細胞）の１回用量は、少なくとも約１×１０６個、１．１×１０６個、２×１０６個、３．６×１０６個、５×１０６個、１×１０７個、１．８×１０７個、２×１０７個、５×１０７個、１×１０８個、２×１０８個、または５×１０８個の細胞／ｋｇを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ細胞）の１回用量は、最大で約１×１０６個、１．１×１０６個、２×１０６個、３．６×１０６個、５×１０６個、１×１０７個、１．８×１０７個、２×１０７個、５×１０７個、１×１０８個、２×１０８個、または５×１０８個の細胞／ｋｇを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ細胞）の１回用量は、約１．１×１０６〜１．８×１０７個の細胞／ｋｇを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ細胞）の１回用量は、約１×１０７個、２×１０７個、５×１０７個、１×１０８個、２×１０８個、５×１０８個、１×１０９個、２×１０９個、または５×１０９個の細胞を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ細胞）の１回用量は、少なくとも約１×１０７個、２×１０７個、５×１０７個、１×１０８個、２×１０８個、５×１０８個、１×１０９個、２×１０９個、または５×１０９個の細胞を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ細胞）の１回用量は、最大で約１×１０７個、２×１０７個、５×１０７個、１×１０８個、２×１０８個、５×１０８個、１×１０９個、２×１０９個、または５×１０９個の細胞を含む。
患者に投与される治療の投薬量は、治療されている状態および治療のレシピエントの正確な性質に応じて多様であろう。ヒトへの投与のための投薬量の増減は、当該技術分野の慣例に従って行うことができる。例えば、ＣＡＭＰＡＴＨの用量は、一般に、成人患者では１〜約１００ｍｇの範囲内となり、通常は１〜３０日間の期間で毎日投与される。好適な１日用量は、１日当たり１〜１０ｍｇであるが、一部の事例では、１日当たり最大４０ｍｇまでのより多用量が使用され得る（米国特許第６，１２０，７６６号に記載されている）。
ある特定の態様では、活性化された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を対象に投与した後、続いて、血液を再び採取し（またはアフェレーシスを行い）、それ由来の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を活性化させ、これらの活性化させ、増殖させた免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間毎に複数回行われ得る。ある特定の態様では、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採取血から活性化され得る。ある特定の態様では、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採取血から活性化される。
本主題の組成物の投与は、任意の従来的な方式で実行され得る。本明細書に記載される組成物は、経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈注射により（ｉ．ｖ．）、または腹腔内、例えば、皮内もしくは皮下注射により、患者に投与され得る。免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射してもよい。
本明細書の方法により作製された免疫エフェクター細胞は、ＴＲＥＧ細胞集団を減少させる分子と組み合わせて、対象に投与され得る。ＴＲＥＧ細胞の数を減少させる（例えば、枯渇させる）方法は、当該技術分野で既知であり、この方法としては、例えば、ＣＤ２５枯渇、シクロホスファミド投与、およびＧＩＴＲ機能の調節が挙げられる。理論に束縛されることを望むものではないが、アフェレーシスの前または本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞の投与の前に、対象におけるＴＲＥＧ細胞の数を低減させることにより、腫瘍の微小環境における望ましくない免疫細胞（例えば、Ｔｒｅｇ）の数が低減し、対象の再発のリスクが低減すると考えられる。一実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲを発現する細胞は、ＧＩＴＲを標的とする分子および／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子、例えば、制御性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）を枯渇させるＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＧＩＴＲ抗体と組み合わせて、対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲを発現する細胞は、シクロホスファミドと組み合わせて、対象に投与される。一実施形態では、ＧＩＴＲに結合する分子および／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子（例えば、ＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＴｒｅｇ枯渇性ＧＩＴＲ抗体）は、ＣＡＲ発現細胞の投与よりも前に投与される。例えば、一実施形態では、ＧＩＴＲアゴニストは、細胞のアフェレーシスの前に投与され得る。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、ＣＡＲ発現細胞の投与（例えば、注入または再注入）の前または細胞のアフェレーシス（ａｐｈｅｒｓｉｓ）の前に、対象に投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドおよび抗ＧＩＴＲ抗体は、ＣＡＲ発現細胞の投与（例えば、注入または再注入）の前または細胞のアフェレーシスの前に、対象に投与される。一実施形態では、対象は、がん（例えば、固形がんまたは造血がん、例えばＡＬＬもしくはＣＬＬ）を有する。ある実施形態では、対象は、ＣＬＬを有する。いくつかの実施形態では、対象は、ＡＬＬを有する。いくつかの実施形態では、対象は、固形がん、例えば、本明細書に記載される固形がんを有する。例示的なＧＩＴＲアゴニストとしては、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体）、例えば、例として、米国特許第６，１１１，０９０号、欧州特許第０９０５０５Ｂ１号、米国特許第８，５８６，０２３号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／００３１１８号、および同第２０１１／０９０７５４号に記載されているＧＩＴＲ融合タンパク質、または例えば、米国特許第７，０２５，９６２号、欧州特許第１９４７１８３Ｂ１号、米国特許第７，８１２，１３５号、米国特許第８，３８８，９６７号、米国特許第８，５９１，８８６号、欧州特許第ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０２８６８３号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０３９９５４号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／００７１９０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／１３３８２２号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０５５８０８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／４０１９６号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００１／０３７２０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／２０７５８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０８３２８９号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１１５４５１号、米国特許第７，６１８，６３２号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０５１７２６号に記載されている抗ＧＩＴＲ抗体などが挙げられる。
ある実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲを発現する細胞は、Ｔｒｅｇ細胞集団を減少させる分子と組み合わせて、対象に投与される。Ｔｒｅｇ細胞の数を減少させる（例えば、枯渇させる）方法は、当該技術分野で既知であり、この方法としては、例えばＣＤ２５枯渇、シクロホスファミド投与、ＧＩＴＲ機能の調節が挙げられる。理論に束縛されることを望むものではないが、アフェレーシスの前または本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞の投与の前に、Ｔｒｅｇ細胞の数を低減させることにより、腫瘍の微小環境における望ましくない免疫細胞（例えば、Ｔｒｅｇ）の数が低減し、対象の再発のリスクが低減すると考えられる。
一実施形態では、本明細書に記載される治療法、例えば、ＣＡＲ発現細胞は、分子標的化ＧＩＴＲおよび／またはＧＩＴＲ機能の調節、例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を枯渇させるＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＧＩＴＲ抗体と組み合わせて、対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲを発現する細胞は、シクロホスファミドと組み合わせて、対象に投与される。一実施形態では、ＧＩＴＲに結合する分子および／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子（例えば、ＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＴｒｅｇ枯渇性ＧＩＴＲ抗体）は、ＣＡＲ発現細胞よりも前に投与される。例えば、一実施形態では、ＧＩＴＲアゴニストは、細胞のアフェレーシスの前に投与され得る。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、ＣＡＲ発現細胞の投与（例えば、注入または再注入）の前または細胞のアフェレーシスの前に、対象に投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドおよび抗ＧＩＴＲ抗体は、ＣＡＲ発現細胞の投与（例えば、注入または再注入）の前または細胞のアフェレーシスの前に、対象に投与される。一実施形態では、対象は、がん（例えば、固形がんまたは造血がん、例えばＡＬＬもしくはＣＬＬ）を有する。一実施形態では、対象は、ＣＬＬを有する。いくつかの実施形態では、対象は、ＡＬＬを有する。いくつかの実施形態では、対象は、固形がん、例えば、本明細書に記載される固形がんを有する。
一実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、本明細書に記載されるＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて、対象に投与される。一実施形態では、ＧＩＴＲアゴニストは、ＣＡＲ発現細胞の前に投与される。例えば、一実施形態では、ＧＩＴＲアゴニストは、細胞のアフェレーシスの前に投与され得る。一実施形態では、対象は、ＣＬＬを有する。
例示的なＧＩＴＲアゴニストとしては、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体）、例えば、例として、米国特許第６，１１１，０９０号、欧州特許第０９０５０５Ｂ１号、米国特許第８，５８６，０２３号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／００３１１８号、および同第２０１１／０９０７５４号に記載されているＧＩＴＲ融合タンパク質、または例えば、米国特許第７，０２５，９６２号、欧州特許第１９４７１８３Ｂ１号、米国特許第７，８１２，１３５号、米国特許第８，３８８，９６７号、米国特許第８，５９１，８８６号、欧州特許第ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０２８６８３号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０３９９５４号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／００７１９０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／１３３８２２号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０５５８０８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／４０１９６号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００１／０３７２０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／２０７５８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０８３２８９号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１１５４５１号、米国特許第７，６１８，６３２号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０５１７２６号に記載されている抗ＧＩＴＲ抗体などが挙げられる。
一実施形態では、本明細書に記載されるＢＴＫ阻害剤と組み合わせた本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、本明細書に記載されるＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて、対象に投与される。一実施形態では、ＧＩＴＲアゴニストは、ＣＡＲ発現細胞の前に投与される。例えば、一実施形態では、ＧＩＴＲアゴニストは、細胞のアフェレーシスの前に投与され得る。一実施形態では、対象は、ＣＬＬを有する。
例示的なＣＡＲコンストラクト
抗ＣＤ１９結合性ドメインの配列は、上述の表１に提供されている。抗ＢＣＭＡ結合性ドメインの配列は、表１１に提供される。完全ＣＡＲコンストラクトは、表１または表１１に記載される抗原結合性ドメインのいずれかを、以下に提供される１つまたは複数の追加のＣＡＲ構成要素とともに使用して、生成することができる。
・リーダー（アミノ酸配列）（配列番号１）
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 ・リーダー（核酸配列）（配列番号１２）
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 ・ＣＤ８ヒンジ（アミノ酸配列）（配列番号２）
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 ・ＣＤ８ヒンジ（核酸配列）（配列番号１３）
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 ・ＣＤ８膜貫通（アミノ酸配列）（配列番号６）
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 ・膜貫通（核酸配列）（配列番号１７）
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 ・４−１ＢＢ細胞内ドメイン（アミノ酸配列）（配列番号７）
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 ・４−１ＢＢ細胞内ドメイン（核酸配列）（配列番号１８）
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 ・ＩＣＯＳ細胞内ドメイン（アミノ酸配列）（配列番号３６４）
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 ・ＩＣＯＳ細胞内ドメイン（核酸配列）（配列番号３６５）
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 ・ＣＤ３ゼータドメイン（アミノ酸配列）（配列番号９）
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 ・ＣＤ３ゼータ（核酸配列）（配列番号２０）
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 ・ＣＤ３ゼータドメイン（アミノ酸配列、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００７３４．３）（配列番号１０）
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 ・ＣＤ３ゼータ（アミノ酸配列；ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００７３４．３）；（配列番号２１）
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 ＩｇＧ４ヒンジ（アミノ酸配列）（配列番号３６）
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 ＩｇＧ４ヒンジ（ヌクレオチド配列）（配列番号３７）
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 ＥＦ１アルファプロモーター
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 Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（配列番号２５）
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 Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（配列番号３６３）：この配列は、１〜６個の「Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ」繰り返しユニットを含み得る
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 Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（配列番号２７）
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 Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（配列番号２８）
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 Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（配列番号２９）
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 ポリＡ（配列番号３０）
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 ポリＡ（配列番号３１）
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 ポリＡ（配列番号３２）
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 ポリＡ（配列番号３３）
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 ポリＡ（配列番号３４）
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 ポリＡ（配列番号３５）
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 Gly/Ser（配列番号３８）：この配列は、１〜１０個の「Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ」繰り返しユニットを含み得る
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 本明細書に記載される方法において使用することができる例示的なＣＤ１９ ＣＡＲコンストラクトを、表４に示す。
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本明細書に記載される方法において使用することができる例示的な抗ＢＣＭＡ ＣＡＲコンストラクト（例えば、ｓｃＦｖドメインおよびＣＡＲ分子のアミノ酸配列および核酸配列）を、表１１に示す。重鎖ＨＣ ＣＤＲ（ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３）およびＬＣ ＣＤＲ（ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、ＬＣＣＤＲ３）は、下線で示す。各ｓｃＦｖの可変重鎖配列および可変軽鎖配列のアミノ酸配列もまた、提供する。
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本発明は、以下の実験例を参照して詳細にさらに記載される。これらの例は例示のみの目的で提供され、特に指示がない限り、限定することを意図するものではない。故に、本発明は以下の例に限定されると決して解釈されるべきでなく、むしろ、本明細書に提供された教示の結果明らかになる、ありとあらゆる変形形態を包含すると解釈されるべきである。
外因性サイトカインを用いたＣＡＲＴ産生の最適化
サイトカインは、Ｔ細胞増殖、分化、生存および恒常性に関連する重要な機能を有する。臨床用途に最も重要なサイトカインファミリーの１つは共通γ鎖（γｃ）ファミリーサイトカインであり、これにはインターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２１が含まれる（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ３８：１３-２５。ＩＬ−２はがんの免疫療法剤として広く研究されている。ＩＬ−２の補充は、臨床試験において抗ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍能力を増強した（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｌｙｍｐｈｏｍａ， ５４：２５５-６０）。しかし、ＩＬ−２の投与は、副作用および制御性Ｔ細胞の増殖傾向および活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）の影響により制限される（Ｍａｌｅｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ３３：１５３-６５；およびＬｅｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １７：２２１-５３）。ＩＬ−７、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２１はそれぞれ養子免疫療法の有効性を増強することができ、ＩＬ−２と比較して毒性が少ないように思われる（Ａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ， １０８：１１３-２０）。上記のサイトカインの役割に関する広範な前臨床および臨床研究にもかかわらず、ＣＡＲ−Ｔ細胞養子療法における様々な外因性γｃサイトカインの役割に関するマルチパラメーター比較研究は不足している。
γ鎖サイトカインに加えてＩＬ−１８は、免疫応答を制御する別の免疫賦活性サイトカインであり、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの産生を増強し、ＣＴＬの細胞溶解活性を増大させる（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ， １７：３３５３-７）。ＩＬ−１８の投与は、用量が１０００μｇ／ｋｇに達しても安全であり、良好な忍容性を示す（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １２：４２６５-７３）。したがって、ＩＬ−１８は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍をブーストするのに使用される別の候補となり得る。
この例では、種々の外因性サイトカインの投与の効果を、Ｔ細胞および葉酸受容体アルファ（ＦＲα）ＣＡＲＴ細胞の増殖、表現型、インビトロエフェクター機能、およびインビボ抗腫瘍効果について調べた。
以下の材料および方法を、この例に記載した実験で使用した。
ＣＡＲ構築およびレンチウイルス調製
ｐＥＬＮＳ−Ｃ４−２７ｚ ＣＡＲベクターを、以前に記載したように（審査中の原稿）構築した。簡単には、抗ＦＲα Ｃ４／ＡＦＲＡ４ ｓｃＦｖを含有するｐＨＥＮ２プラスミドを、５’−ａｔａｇｇａｔｃｃｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａｇｔｃｔｇｇｇｇｇａｇｇｃ−３’（配列番号３）および５’−ａｔａｇｃｔａｇｃａｃｃｔａｇｇａｃｇｇｔｃａｇｃｔｔｇｇｔｃｃｃ−３’（配列番号４）のプライマーを用いたＣ４断片のＰＣＲ増幅の鋳型として使用した（ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩに下線を引いた）。ＰＣＲ産物および第３世代の自己不活性化レンチウイルス発現ベクターｐＥＬＮＳをＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化した。消化したＰＣＲ産物を次いで、導入遺伝子発現が伸長因子−１α（ＥＦ−１α）プロモーターにより駆動されるＣＤ２７−ＣＤ３ｚ Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含有するｐＥＬＮＳベクターに挿入した。
高力価の複製欠損レンチウイルスを、以前に記載したようにＥｘｐｒｅｓｓ Ｉｎ（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、ヒト胎児腎臓細胞株２９３Ｔ（２９３Ｔ）細胞に４つのプラスミド（ｐＶＳＶ−Ｇ、ｐＲＳＶ．ＲＥＶ、ｐＭＤＬｇ／ｐ．ＲＲＥ、およびｐＥＬＮＳ−Ｃ４−２７ｚ ＣＡＲ）をトランスフェクションして生成した。上清をトランスフェクション後２４時間および４８時間で回収し、超遠心分離により濃縮した。ウイルス力価を、限界希釈法を用いてＳｕｐＴ１細胞へのレンチウイルスの導入効率に基づき判定した。
Ｔ細胞および細胞株
末梢血リンパ球を、ペンシルバニア大学の大学治験審査委員会により承認されたプロトコール下でインフォームドコンセント後に健康なドナーから得た。初代Ｔ細胞は、ネガティブセレクションによる精製後にＨｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅから購入した。Ｔ細胞を完全培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０）で培養し、説明書に従って１：１の比で抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ ｍＡｂ被覆ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で刺激した。活性化２４時間後、細胞にレンチウイルスをＭＯＩ ５で形質導入した。指示されたサイトカインを、１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で翌日から形質導入Ｔ細胞に添加した。サイトカインは３日ごとに交換した。
レンチウイルスパッケージングに使用した２９３Ｔ細胞およびレンチウイルス滴定に使用したＳｕｐＴ１細胞は、ＡＴＣＣから入手した。確立された卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３（ＦＲα＋）およびＣ３０（ＦＲα−）を、サイトカイン分泌アッセイおよび細胞傷害性アッセイの標的細胞として使用した。生物発光アッセイには、ＳＫＯＶ３にホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）を発現するレンチウイルスを形質導入した。
フローサイトメトリー分析および細胞選別
フローサイトメトリーはＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏで行った。抗ヒトＣＤ４５（ＨＩ３０）、ＣＤ３（ＨＩＴ３ａ）、ＣＤ８（ＨＩＴ８ａ）、ＣＤ４５ＲＡ（ＨＩ１００）、ＣＤ６２Ｌ（ＤＲＥＧ−５６）、ＣＣＲ７（Ｇ０４３Ｈ７）、ＩＬ−７Ｒα（Ａ０１９Ｄ５）、ＣＤ２７（Ｍ−Ｔ２７１）、ＣＤ２８（ＣＤ２８．２）、ＣＤ９５（ＤＸ２）、ＴＮＦ−α（ＭＡｂ１１）、ＩＦＮ−γ（４Ｓ．Ｂ３）、ＩＬ−２（ＭＱ１−１７Ｈ１２）、パーフォリン（Ｂ−Ｄ４８）、グランザイム（ｇｒａｎｚｙｍ）−Ｂ（ＧＢ１１）はＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手した。ビオチン−ＳＰコンジュゲートウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）はＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから購入し、ＡＰＣコンジュゲートストレプトアビジンはＢｉｏｌｅｇａｎｄから購入した。抗ヒトＢｃｌ−ｘｌ（７Ｂ２．５）はＳｏｕｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈから購入した。アポトーシスキットおよびＴｒｕＣｏｕｎｔチューブはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した。末梢血Ｔ細胞数に関しては血液を後眼窩出血により得、ヒトＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８ Ｔ細胞の存在について染色した。ヒトＣＤ４５＋ゲーティングサブセット、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋サブセットを、ＴｒｕＣｏｕｎｔチューブにより製造者の説明書に従って定量化した。
養子細胞療法のインビボ試験
メスの非肥満糖尿病／重症複合免疫不全症／γ鎖−／−（ＮＳＧ）マウス、８〜１２週齢は、ペンシルバニア大学Ａｂｒａｍｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒのＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｃｏｒｅから入手した。マウスは０日目に３×１０６ｆＬｕｃ＋ＳＫＯＶ３細胞を側腹部に皮下接種した。処置前に１群あたり４匹または５匹のマウスを無作為に割り付けた。腫瘍が触知可能になった後、ヒト初代Ｔ細胞を以前に記載したように活性化し、形質導入した。Ｔ細胞をＩＬ−２（５ｎｇ／ｍＬ）の存在下で約２週間増殖させた。腫瘍量が約２５０〜３００ｍｍ３となったとき、マウスに５×１０６ＣＡＲ−Ｔ細胞または１００μｌ生理食塩水を静脈内注射し、マウスは次いで５μｇのＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１またはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）の腹腔内注射を７日間、毎日受けた。腫瘍寸法をノギスで測定し、腫瘍体積を以下の式：腫瘍体積＝（長さ×幅２）／２により計算した。レシピエントマウス血液中の導入Ｔ細胞の数および表現型を、後眼窩出血後、フローサイトメトリーにより判定した。腫瘍体積が２０００ｍｍ３を上回ったときマウスを安楽死させ、さらなる分析のために腫瘍を直ちに切除した。
統計分析
統計分析は、Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）およびＩＢＭ ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２０．０ソフトウェアを用いて行った。データは、明らかにされない限り平均±ＳＥＭとして示した。２群の比較には、対応のある試料ｔ検定またはノンパラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎ順位検定を使用し、反復測定ＡＮＯＶＡまたはＦｒｉｅｄｍａｎ検定を使用して３群間以上の差の統計的有意性をテストした。Ｐ値が０．０５未満の場合、知見を統計的に有意と見なした。
結果
１．抗ＦＲα Ｃ４ ＣＡＲの構築および発現
ｐＥＬＮＳ−Ｃ４−２７ｚ ＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通領域と、これに続くＣＤ２７細胞内シグナル伝達モチーフと直列したＣＤ３ζシグナル伝達部分に連結した抗ＦＲα Ｃ４ ｓｃＦｖからなった（図１Ａ）。形質導入後４８時間で検出した場合４３％〜６５％の導入効率で、初代ヒトＴ細胞にＣ４ ＣＡＲレンチウイルスベクターを効率的に形質導入した。ＣＡＲ発現レベルは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞とＣＤ８＋ Ｔ細胞とで同等であった（５２．６±１０．２％対４９．５±１７．１％、Ｐ＝０．７１３）。
２．ＣＡＲ形質導入Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞の増殖に対するサイトカインの影響
様々なγｃサイトカインおよびＩＬ−１８の存在下でのＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖および蓄積を調べた。培養下で種々のサイトカインに曝露した３週間後、ＩＬ２、ＩＬ−７、またはＩＬ−５の存在下で培養したＣＡＲ−Ｔ細胞は１０００〜２０００倍に増殖した。ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、またはＮＣ（対照、サイトカインなし）の存在下で培養したＣＡＲ−Ｔ細胞は、２００倍未満の増殖を示した（図１Ｂ）。
ＣＡＲ−Ｔ細胞のより高い蓄積をもたらす理由を分析し、具体的には、Ｔ細胞の増殖およびアポトーシスを評価した。増殖応答は、７日間培養したＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の細胞分裂をモニターして測定した。図１Ｃに示されているように、ＩＬ−２およびＩＬ−１５と培養したＴ細胞は最も高い増殖能を示し、これにＩＬ−７が続いた。一方、ＩＬ−２１およびＩＬ−１８は、あまり強力でない分裂刺激物質であった。種々のサイトカインで培養したＴ細胞のアポトーシスは、アネキシンＶ染色を用いてテストした。結果は、ＮＣ、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１群と比較した場合、ＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５で培養したＴ細胞はアポトーシスが少ないことを示した（図１Ｄ）。これらの結果は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、またはＩＬ−１５）の存在下で増殖させたＴ細胞の蓄積の増加は、増殖の増加およびアポトーシスの減少（例えば、Ｂｃｌ−ｘｌ抗アポトーシス経路の活性化による）の両方に起因している可能性があることを示している。
３．ＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型に対するサイトカインの影響
次に、外因性サイトカインの存在下で増殖させたＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型を調べた。健康なドナー由来の新鮮なＴ細胞を、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ発現に基づき概ね４つのサブセットに分類した：１）ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋、Ｔｎと呼ぶ）、２）セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋、Ｔｃｍと呼ぶ）、３）エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−、Ｔｅｍと呼ぶ）、および４）ＣＤ４５ＲＡ陽性エフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ−、Ｔｅｍｒａと呼ぶ）。次いでＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、およびＣＤ９５の発現を、サブセットごとにさらに評価した。ＣＤ９５発現は、レンチウイルスを形質導入すると有意にアップレギュレートされた。後者の３つのＴ細胞サブセットはＣＤ９５陽性であったが、Ｔｎのごく一部のみがＣＤ９５を発現した（ＣＤ４＋ Ｔ細胞で３．６±１．４％、およびＣＤ８＋ Ｔ細胞で３．７±１．３％）。この小集団はＣＤ２７、ＣＤ２８、およびＣＣＲ７も共発現しており、メモリーステムＴ細胞（ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ Ｔ ｃｅｌｌ）（Ｔｓｃｍ）と見なされた。しかし、ＣＡＲをレンチウイルス形質導入する前後に抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激した後、ＣＤ９５はこの集団においてほぼ１００％まで大幅にアップレギュレートされた（図２Ａ）。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋ Ｔ細胞のパーセンテージは、新鮮なＴ細胞と比較した場合、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞ならびにＣＡＲ−Ｔ細胞の両方で大幅に増した（図２Ｂおよび２Ｃ）。この集団は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、およびＣＣＲ７を同時に高度に発現し、Ｔｓｃｍと定め得ることを示した。さらに、ＣＤ８＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞はより高いパーセンテージのＴｓｃｍ細胞を有した。これは、最初のＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＴｎのより高い割合と関連している可能性がある（図２Ｄ）。
様々なサイトカインと共培養した１４日後、ＣＡＲ−Ｔ細胞のＴ細胞サブセットの割合を、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ９５の発現を測定して調べた。ＣＤ４＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞のうち、ＩＬ−２群と比べてＩＬ−７群で有意に高いパーセンテージのＴｓｃｍ細胞が存在し、一方、サイトカインなし（ＮＣ）群およびＩＬ−１８群はＴｓｃｍのより低いパーセンテージを示したが、Ｔｃｍのパーセンテージはより高かった。ＩＬ−１５群におけるＴ細胞サブセットの分布はＩＬ−２群と類似していたが、ＩＬ−２１群はＴｃｍのパーセンテージが高く、一方、ＴｓｃｍパーセンテージはＩＬ−２群と同等であった。ＣＤ８＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞は、各サイトカイン投与群の４つのＴ細胞サブセットの分化および分布においてＣＤ４＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞と類似の傾向を示し、ＣＤ８＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞の対応する群のＣＤ４＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞と比べて、Ｔｓｃｍの割合が高かった。
様々なＣＡＲ−Ｔ細胞亜集団の自己再生し他の細胞型に分化する能力をさらに試験した。ＣＡＲ−Ｔ細胞の４つのサブセットをＣＡＲ、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ６２Ｌ発現に基づき選別し、ＩＬ−２を含有する培地で３日間別々に培養した。図２Ｅに示されているように、Ｔｓｃｍサブセットは他の３つのサブセットすべてに分化することができ、ＴｃｍおよびＴｅｍｒａサブセットはＴｅｍに分化することができた。これらの結果は、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔ細胞が、それぞれＣＤ６２Ｌ−およびＣＤ４５ＲＡ− Ｔ細胞に分化することができたことを示している。４つのサブセットの増殖能をＣＦＳＥ希釈により評価し、次いで比較した。結果は、Ｔｓｃｍが他のサブセットより強い増殖能を示すことを示した（図２Ｆ）。さらに、ＣＤ４５ＲＡ発現はＣＦＳＥ強度と逆相関し、ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７発現は増殖と直接相関した。すべてのサイトカイン群において、ＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ弱陽性および陰性Ｔ細胞よりはるかに低いＣＦＳＥ レベルを示した（図３Ａ〜３Ｂ）。これは、ＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ− Ｔ細胞より強い増殖活性を有したことを示している。故に、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で増殖したＴ細胞の蓄積の増加は、ＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔ細胞（増殖能が増加した）の割合の増加と関係している可能性がある（図４）。
ＣＡＲ− Ｔ細胞の表現型に関して、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｔ細胞表面のＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７およびＣＤ２８のより低い発現を示したが、ＣＣＲ７の発現はより高かった。ＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型に対するサイトカインの影響を、以下の表面マーカー：ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＩＬ７Ｒαの発現に基づきさらに評価した。ＩＬ−１８の存在下で増殖したＣＡＲ−Ｔ細胞は、サイトカイン補充なしで増殖したＣＡＲ−Ｔ細胞と極めて類似した発現パターンを示した。ＩＬ−２は、ＮＣ対照と比較した場合、ＣＤ２７、ＣＤ２８ ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７およびＩＬＲ７αの発現を劇的にダウンレギュレートした。他のγｃサイトカインのうち、ＩＬ−２曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞と比べてＩＬ−７曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞はより高いＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、およびＣＤ２８発現を示したが、ＣＣＲ７発現は有意に減少した。ＩＬ−１５群ＣＡＲ−Ｔ細胞はより高いＣＤ２７およびＣＤ２８発現を示し、ＩＬ−２１曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞はより高いＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、およびＣＤ２８発現を示した。これらは、ＩＬ−２曝露が、Ｔ細胞表現型がすべての他の群よりはるかに成熟したＴ細胞のサブセットの増殖を誘導したことを示している（図４）。
４．ＣＡＲ−Ｔ細胞のエフェクター機能に対するサイトカインの影響
ＣＡＲ−Ｔ細胞エフェクター機能に対するサイトカインの影響を調べるために、ＦＲα発現ＳＫＯＶ３細胞で刺激した後のＣＡＲ−Ｔ細胞のサイトカイン産生能を評価した。５時間刺激した後、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−２がＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞質で検出可能であり、ＣＡＲ−Ｔ細胞産生ＴＮＦ−α ４１．５〜５４．０％、ＣＡＲ−Ｔ細胞産生ＩＦＮγ １２．４〜１５．３％、およびＣＡＲ−Ｔ細胞産生ＩＬ−２ ４．３〜６．５％であった（図５Ａ〜５Ｃ）。増殖中のＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５曝露は、ＣＡＲ−Ｔ細胞のＴＮＦ−α産生を促進したが、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２産生ＣＡＲ−Ｔ細胞数はすべてのサイトカイン群で同等であった（図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃ）。次に、応答性ＣＡＲ−Ｔ細胞の分画およびその多機能性を比較した。増殖中のＩＬ−２への曝露と比べると、増殖中のＩＬ−１８、ＩＬ−２１への曝露またはサイトカイン曝露なしは、サイトカイン産生ＣＡＲ−Ｔ細胞の誘導が低く、標的細胞により刺激した場合、複数のサイトカインを産生する能力を有するＣＡＲ−Ｔ細胞が少なかった。これらの結果は、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、およびＮＣ群におけるＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＩＬ−２曝露群におけるＣＡＲ−Ｔ細胞より分化しなかったという表現型と一致している。
次いで、抗原刺激後の細胞溶解分子パーフォリンおよびグランザイム−Ｂの発現に対する増殖中のサイトカイン曝露の影響を判定した。ＴＮＦ−α産生と同様に、ＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５に曝露さたＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＮＣ、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１に曝露されたＣＡＲ−Ｔ細胞と比べてパーフォリン発現の増加を示した。しかし、ＩＬ−２１に曝露されたＣＡＲ−Ｔ細胞はＴＮＦ−αおよびパーフォリンをあまり産生しないが、最も高いレベルのグランザイム−Ｂを産生した。次に最も高いレベルのグランザイム−Ｂ産生は、増殖中にＩＬ−２およびＩＬ−１５に曝露されたＣＡＲ−Ｔ細胞で観察された。ＩＬ−１８群のＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗原刺激後のパーフォリンおよびグランザイム−Ｂ発現ともに最も少ない量を示した。
最後に、曝露中に様々なサイトカインに曝露されたＣＡＲ−Ｔ細胞による腫瘍溶解活性を、ルシフェラーゼアッセイにより定量化した。図５Ｄに示されているように、ＩＬ−２およびＩＬ−１５と共培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＮＣおよびＩＬ−１８と共培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞（いずれもＰ＜０．０５）より効率的にＳＫＯＶ３を溶解した。
ＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型とその機能との関連をさらに確認した。Ｔ細胞１４日を、レンチウイルス形質導入後にＣＡＲおよびＣＤ６２Ｌ発現に基づき選別した。ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＴｓｃｍおよびＴｃｍ）は、ＣＤ６２Ｌ− ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＴｅｍおよびＴｅｍｒａ）と比較した場合、低いサイトカイン産生活性および弱い細胞溶解能を示した（図６Ａ〜６Ｃ）。この観点において、ＩＬ−２およびＩＬ−１５に曝露されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、より多くのサイトカインを産生し、より強い腫瘍溶解活性を示した。これは、これらの群におけるＴｅｍおよびＴｅｍｒａのより高い割合に一部起因している可能性がある。
５．抗原チャレンジ後のＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖および表現型
特異的抗原のチャレンジ下でのＣＡＲ−Ｔ細胞増殖に対するサイトカインの影響を調べるために、ＩＬ−２に２週間曝露されたＣＡＲ−Ｔ細胞を、示されたサイトカインの存在下で７日間ＳＫＯＶ３（ＦＲα＋）またはＣ３０（ＦＲα−）細胞と共培養した。無抗原環境と同様、ＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５に曝露されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、他のサイトカインに曝露されたＣＡＲ−Ｔ細胞より高い倍増殖を示した。増殖中にＩＬ−２１に曝露されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、アポトーシスを起こす可能性が高かった。しかし、示されたサイトカインに２週間曝露されたＣＡＲ−Ｔ細胞を、さらなるサイトカイン補充なしでＳＫＯＶ３またはＣ３０細胞と７日間共培養した場合、ＣＡＲ−Ｔ細胞の蓄積は全群で同等であり、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８に曝露されたＣＡＲ−Ｔ細胞はアポトーシスの量が最も少なかった（図７Ａ）。ＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型も分析した。メモリーＴ細胞の４つのサブセットに関して、結果は無抗原試験とは異なった。Ｔｓｃｍは稀であり、Ｔｅｍはサイトカインなし、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１全群で５０％超を占めた。サイトカインはメモリーＴサブセットの構成に有意な影響を与えず、ＩＬ−７曝露はＴｓｃｍの増加を促さなかった（図７Ｂ）。
６．動物モデルにおける様々なサイトカインの抗腫瘍効果
インビボでのＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性に対する、ＣＡＲ−Ｔ細胞のエクスビボ増殖中の様々なサイトカインの影響を評価するために、ＣＡＲ−Ｔ細胞の存続性および転帰を、卵巣がんのＮＳＧマウス異種移植モデルを用いて調べた。皮下ＳＫＯＶ３腫瘍を有するマウスに、以前に示されたサイトカインにエクスビボで２週間曝露された５×１０６ Ｃ４−２７ｚ ＣＡＲ−Ｔ細胞を２回静脈内注射した。Ｃ４−２７ｚ ＣＡＲ−Ｔ細胞注入を受けたすべてのマウスは、非形質導入Ｔ細胞および抗ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞を注射されたマウスと比較した場合、少ない腫瘍量を示した（図８Ａ）。様々なサイトカイン群のうち、以前にＩＬ−２曝露されたＣＡＲ−Ｔ細胞を受け取ったマウスは、これらのマウスにおける最少量の循環ヒトＴ細胞と一致する最も高い腫瘍量を示した。ＮＣ、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１群における腫瘍は、すべて有意に抑制されるかまたはさらには消失し、腫瘍サイズに関するいかなる統計的有意差もなかった。末梢血中の導入Ｔ細胞の存続性を、養子移入１５日後および３２日後に判定した。ＩＬ−７およびＩＬ−２１処置ＣＡＲ−Ｔ細胞を受け取ったマウスは、＋１５日目で末梢血中に他の群より高量のヒトＴ細胞を有するように思われたが、ＩＬ−２処置ＣＡＲ−Ｔ細胞を受け取ったマウスは、ヒトＴ細胞数が最も少なかった（図８Ｂ〜８Ｃ）。種々のＣＡＲ−Ｔ細胞集団のパーセンテージに関して、ＮＣ、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１曝露群はすべて、ＩＬ−２群と比較した場合ＣＤ４＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞は高かったが、ＣＤ８＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞のパーセンテージは全群で同等であった。Ｔ細胞表現型のうち、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、およびＣＤ２８は、ＩＬ−２１群のＣＤ８＋ Ｔ細胞がＩＬ−２およびＮＣ群のＣＤ８＋ Ｔ細胞（いずれもＰ＜０．０５）より高いＣＤ２８を発現したことを除いて、Ｔ細胞の約５〜１０％でのみ発現し、全群で同等であった。＋３２日目に、すべてのＣＡＲ−Ｔ細胞群の循環ヒトＴ細胞はＩＬ−２群を除いて有意に増殖しており、平均Ｔ細胞アカウント（ａｃｃｏｕｎｔ）１４９０７／μｌ〜１９６５１／μｌ（およびＩＬ−２群ではわずか２４２／μｌ）であった。腫瘍が退縮したにもかかわらず、２匹のマウスが死亡した。
考察
ＩＬ−２は、養子免疫療法のためのリンパ球を生成するのに最も頻繁に使用されるサイトカインである。ＩＬ−２はＴ細胞の生存および増殖を促進し、Ｔ細胞の腫瘍殺傷能力を増強する。しかし、Ｔ細胞の活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）および制御性Ｔ細胞の発生をもたらすことから、ＩＬ−２の作用は限定される（Ｍａｌｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ２０１０， ３３：１５３−６５；およびＬｅｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９９９， １７：２２１−５３）。この例では、ＩＬ−２はＣＡＲ−Ｔ細胞の蓄積および細胞傷害性能を有意に増加させたが、ＩＬ−２曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞は、養子移入後、インビボでの低い抗腫瘍免疫を示した。この知見は、インビトロ腫瘍溶解とインビボ腫瘍根絶との逆相関を示すものである。ＩＬ−２曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、およびＣＤ２８の発現が低い比較的成熟した表現型を示した。これは、インビボでは存続性が低い（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ， ２０１３， ６２：７２７−３６）。最近の研究は、低分化Ｔ細胞の養子移入が、優れた腫瘍退縮と相関することを示しており、これはＩＬ−２曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞は他の群より効果が低いという知見を支持している（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ， ２０１１， １７：１２９０−７；およびＭａｒｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ２０１０， １１５：３５０８−１９）。
ＩＬ−１５は、ＩＬ−２と類似したＣＡＲ−Ｔ細胞増殖および腫瘍溶解機能を刺激する能力を示したが、より低分化の表現型（ＣＤ２７およびＣＤ２８のより高い発現）を誘導した。したがって、ＩＬ−１５はインビボでのＣＡＲ−Ｔ細胞の存続性を支持し、動物モデルにおけるより良好な抗腫瘍免疫を示す。
ＩＬ−２およびＩＬ−１５と比べて、ＩＬ−７はＣＡＲ−Ｔ細胞増殖を促進する類似した能力を示したが、無抗原環境においてより高いレベルのＣＤ６２Ｌ発現を誘導し、ＣＡＲ−Ｔｓｃｍ細胞の最も高い割合を示した。したがって、ＩＬ−２に曝露されたＣＡＲ−Ｔ細胞と比べて、抗原チャレンジなしでのＩＬ−７のエクスビボ曝露は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍効果を増強した。ＩＬ−７曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＩＬ−２より良好なインビボ抗腫瘍効果をもたらさず、抗原チャレンジ下でのＣＡＲ−Ｔ細胞の低増殖により、効果はＩＬ−１５に劣った。
ＩＬ−２１は、例えばＢｃｌ−ｘＬ発現を促進することにより、抗アポトーシス能を増強することができないことから、ＣＡＲ−Ｔ細胞蓄積に対してほとんど効果を発揮しなかった。しかし、ＩＬ−２１は、抗原チャレンジの環境下でさえＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、およびＣＤ２８の高発現の表現型を有する低分化ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を誘導した。したがって、ＩＬ−２１曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞は、動物モデルおよびインビボＩＬ−２１注射において最良の存続性を示し、腫瘍根絶を促進する上でＩＬ−１５を除いて他のサイトカイン群より良好な有効性も示した。これらの結果は、低分化ＣＡＲ−Ｔ細胞は優れた腫瘍退縮と相関するという以前の知見と一致している。
ＩＬ−１８は、ＩＬ−１ファミリーに属する炎症促進性サイトカインであり、単球、ＮＫ細胞、およびＴ細胞、ならびにＩＦＮ−γおよび他のサイトカインの産生をインビボで活性化して、先天性免疫応答および適応免疫応答の両方を制御する（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ， ２０１０， １７：３３５３−７）。本明細書に示された結果は、ＩＬ−１８群の結果のほとんどがＮＣ群と類似しており、同等であったことから、ＩＬ−１８がエクスビボ実験におけるＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖、表現型、および機能にほとんど影響しなかったことを示している。ＩＬ−１８は、対照（ＮＣ）群と比較した場合、抗原チャレンジ下でＴ細胞の増殖をほとんど促進せず、より多くのＴ細胞生存を維持した。インビボ試験は、サイトカイン補充なしのマウスと比較した場合、ＩＬ−１８がＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性に有意な影響を与えないことを示している。
まとめると、これらの実験の知見は、ＣＡＲ−Ｔ細胞増殖のためのエクスビボでのＩＬ−２補充は、広く使用されているにもかかわらず、最適戦略ではないことを示している。ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、またはサイトカイン補充なしに関して、これらは比較的有効なＣＡＲ−Ｔ細胞を誘導し得るが、限られた増殖時間で十分なＣＡＲ−Ｔ細胞が臨床用途に調製され得るように、十分効果的にはＣＡＲ−Ｔ細胞増殖を促進しない。したがって、ＣＡＲ−Ｔ細胞増殖にはＩＬ−１５およびＩＬ−７がより良好な薬剤となり得る。さらに、ＩＬ−７およびＩＬ−１５補充の組合せは、より多くの「若い」ＣＡＲ−Ｔ細胞を産生するのに有益なＴｓｃｍの生成を指示する。インビボサイトカイン注射に関して、すべてのγｃサイトカイン補充は、その多くがＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を促すことから抗腫瘍効果を増強し、ＩＬ−１５は最良の効果を示す。ＩＬ−１５曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞を注射により受け取ったマウスは、一部には腫瘍処置中のＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖能の向上および存続性の向上により有効性が向上した。故に、これらの実験の結果は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５が、ＣＡＲ−Ｔ細胞増殖を促進し、治療的処置に最も有効なＴ細胞表現型を誘導するのに有望であることを示している。
細胞増殖および導入効率に対するＣＤ２５枯渇の効果
ＣＤ２５としても知られるインターロイキン−２α鎖は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）により発現されるが、慢性Ｂ細胞白血病（ＣＬＬ）細胞（ＣＬＬ患者の８５％超の）でも観察されている。Ｔｒｅｇは免疫抑制機能を有し、例えばＴ細胞増殖を阻害することにより免疫療法の有効性を妨害する可能性がある。ＣＬＬ患者由来のＴ細胞のアフェレーシスによる現在の単離または富化は、通常、大幅に増加した割合のＴｒｅｇおよびＣＬＬ細胞を含有する。ＣＤ２５枯渇法による出発材料におけるＴｒｅｇおよびＣＬＬ細胞の枯渇は、エフェクターＴ細胞の純度を大幅に改善し、これによりＣＡＲ１９発現Ｔ細胞、例えばＣＡＲＴ１９細胞の効力を増加させることができる。
ＣＤ２５枯渇の最適化
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＳｙｓｔｅｍにおいてＭｉｌｔｅｎｙｉ製ＣＤ２５ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、患者２名からのアフェレーシスからのＣＤ２５枯渇に対する最適条件を特定するための検証実験を行った。ＣＤ２５枯渇試薬を製造者の推奨量の１００％、７０％、および３０％で使用して、より少ない試薬を用いて同じ枯渇効率を得ることができるかを特定した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ製の２つの異なるチューブセットもテストした。枯渇は製造者の指示書に従って行った。実験からの結果を以下の表に示す。対照には、抗ＣＤ３／ＣＤ２８免疫磁気ビーズを用いた選択を行った。
Figure 2022002525
 予測ＣＤ２５−（ＣＤ２５陰性）Ｔ細胞収量は、それぞれの操作において１００％効率と仮定して計算された算出ＣＤ２５− Ｔ細胞収量を表す。ＣＤ２５− Ｔ細胞の、観察された収量は、それぞれの操作後のＣＤ２５− Ｔ細胞数を表す。表２に示されているように、製造者により推奨されているよりも少ない試薬の使用は、ＣＤ２５枯渇において同じ効率をもたらさなかった。異なるチューブの使用は、Ｔ細胞富化の１ログ増加をもたらした。
図９は、アフェレーシスからの全細胞、対照ＣＤ３／ＣＤ２８選択細胞、ＣＤ２５枯渇細胞、およびＣＤ２５富化細胞と比較した、ＣＤ２５枯渇の効率を示す代表的なフローサイトメトリー分析プロットを示している。ＣＤ３−ＣＤ１９−サブセットのＣＤ１４発現により判定した細胞集団の単球量。これらの結果は効率的なＣＤ２５枯渇を示すものであり、ＣＤ２５枯渇がかなりの単球量（アフェレーシスからの全細胞、対照、およびＣＤ２５富化細胞での２％未満と比べてＣＤ１４発現細胞が６１．１％）ももたらしたことを示している。
Ｔ細胞集団および増殖に対するＣＤ２５枯渇の効果
次に、ＣＤ２５枯渇後のＴ細胞産物の質を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合および増殖能を判定して評価した。
特定のＴ細胞集団の割合を判定するために、上記したように、抗ＣＤ３／ＣＤ２８またはＣＤ２５枯渇による選択９日後に細胞をフローサイトメトリーにより分析した。結果は、ＣＤ３／ＣＤ２８−選択Ｔ細胞は、ＣＤ２５枯渇細胞と比べてＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合が大きかったことを示している（ＣＤ４＋ Ｔ細胞４６．８％と比べて８４．６％）。反対に、ＣＤ２５枯渇細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８−選択細胞と比べてＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合が大きかった（ＣＤ８＋ Ｔ細胞１１．５％と比べて４７．２％）。したがって、ＣＤ２５枯渇は、ＣＤ８＋ Ｔエフェクター細胞の割合がより大きいＴ細胞をもたらす。
増殖能および細胞生存率も対照（ＣＤ３／ＣＤ２８選択細胞）およびＣＤ２５枯渇細胞で評価した。対照およびＣＤ２５枯渇細胞由来の１．６×１０７細胞を播種し、細胞数および生存率を１０〜１３日にわたって判定した。図１０Ａは経時的な全細胞数を示し、図１０Ｂは算出集団倍加（細胞総数から計算）を示す。結果は、ＣＤ２５枯渇細胞が対照細胞と類似した増殖特性を示したことを示している。図１０Ｃは生細胞のパーセンテージを示し、結果は、生存率も対照とＣＤ２５枯渇細胞とで類似していたことを示している。
レンチウイルス導入効率に対するＣＤ２５枯渇の効果
レンチウイルス導入効率に対するＣＤ２５枯渇の効果を、形質導入後のＣＡＲの発現を判定して評価した。患者アフェレーシスは上記したようにＣＤ２５細胞を枯渇させた。ＣＤ２５枯渇の効率を、ＣＤ２５枯渇の前（アフェレーシス試料）および後（ＣＤ２５枯渇分画）のＣＤ２５発現集団を比較するフローサイトメトリー分析プロットで示す。ＣＤ２５枯渇後、ＣＤ２５枯渇分画はＣＤ２５陰性細胞の約５９．２％、およびわずか１０．３％ＣＤ２５陽性細胞を含有した。
ＣＤ２５枯渇分画にＣＡＲ１９をコードするレンチウイルスコンストラクトを形質導入した。培養の１１日後、ＣＡＲ発現をフローサイトメトリーにより評価した。形質導入されなかった細胞および形質導入ＣＤ３選択細胞を対照として使用した。ＣＡＲ１９発現は、ＣＤ３選択細胞と比べてＣＤ２５枯渇細胞で有意に高かった（１２．８％と比べて５１．４％）。この結果は、ＣＤ２５枯渇細胞がレンチウイルス導入効率を改善したことを示している。これは、ＣＡＲＴ療法における治療効果の改善に重要となり得る。
ＣＤ２５枯渇細胞とのサイトカインの使用
この例では、培養下、増殖中のＣＤ２５枯渇とサイトカイン補充との効果を調べた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を患者から単離し、未操作のままにするか、またはＣＤ２５発現細胞を実施例２に記載したように枯渇させた。Ｔ細胞富化は、抗ＣＤ３およびＣＤ２８被覆ビーズを用いた刺激により達成した。Ｔ細胞は、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−７、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５、または１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−７および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５の組合せを補充した培地ですぐに培養した。３日目に、同じサイトカインを追加して培地を交換した。５日目に、１００ＩＵ ＩＬ−２／ｍｌを含有する培地を追加し、細胞を合計１０日間増殖させた。
フローサイトメトリー分析は、ＩＬ７、ＩＬ−１５、またはＩＬ７およびＩＬ１５の存在下で培養後の未操作ＰＢＭＣ（標準的ＣＤ３／ＣＤ２８選択）と比べた、ＣＤ２５枯渇細胞におけるＣＤ３およびＣＤ１９細胞の分布の変化を示す。開始集団（例えば、ＣＤ２５枯渇前およびサイトカイン補充培養の前）におけるＣＤ３、ＣＤ１９、およびＣＤ２５発現細胞の分布を評価した。開始集団は、ＣＤ３−ＣＤ１９＋細胞の割合が高く（約９７．２％）、およびＣＤ２５発現細胞の割合が高かった（約９４．５％ＣＤ２５＋ ＣＤ３−；および約９３．８％ＣＤ２５＋ ＣＤ１９＋）。操作（ＣＤ２５枯渇）およびサイトカインとの培養後、分布は図１１に示されているように変化した。ＣＤ２５枯渇細胞は全体的に、未操作細胞と比べてＣＤ１９発現細胞の大幅な減少を示した。
増殖能も、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８被覆ビーズによる刺激後１０日目に培養下の細胞総数を判定して、同じ細胞試料について評価した。各細胞試料の細胞数を以下に示す。
Figure 2022002525
これらの結果は、ＣＤ２５枯渇Ｔ細胞の培養中のＩＬ−１５の補充が、未操作細胞と比べて増殖の増加をもたらしたことを示している。培養中の培地へのＩＬ−７およびＩＬ−１５の添加は、未操作細胞と比べて、およびサイトカインＩＬ−７またはＩＬ−１５を独立して添加することと比べて増殖の有意な増加をもたらした。故に、組合せＩＬ−７およびＩＬ−１５補充は、最も増加した増殖能を有するＴ細胞をもたらした。
細胞療法に使用するためのＴ細胞の適合性
操作細胞療法の使用は、この５年間で、具体的にはＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を用いたＢ細胞悪性腫瘍を標的とする臨床試験において、大きな成功を示してきた。これらの有望な結果にもかかわらず、登録のための評価を受けている多くの患者が、十分な細胞産物の不足のために最終的に続行できないでいる。この限界は、末梢血から十分なリンパ球を採取できないか、または細胞作製の構成要素であり、インビボ活性予測因子であるエクスビボ細胞増殖の失敗のいずれかの結果として生じる。多くの患者の評価の時点で、患者の３０％超が細胞療法産物を成功裡に臨床的に作製するための細胞材料を持たない。この例は、Ｔ細胞数に影響を与え得る採取および化学療法のタイミングなどの、末梢Ｔ細胞採取に影響を与え得る要因の特定を記載する。ＣＡＲ Ｔ細胞の治験はより大規模になり、数も増えていることから、これらの要因は重大な臨床的関連性がある。特に、ＡＬＬおよびＮＨＬを有する小児患者における化学療法中のＴ細胞増殖能およびメモリー表現型を調べた。
方法
患者選択および臨床プロトコール
血液悪性腫瘍を有する小児患者から採取したＴ細胞の増殖能および表現型を、化学療法の開始前および化学療法の各サイクル後に分析した。患者は、フィラデルフィア（ＰＡ）のフィラデルフィア小児病院血液腫瘍科での診察により特定した。患者をフィラデルフィア小児病院施設内治験審査委員会承認臨床試験ＣＨＰ−１２−００９９１５に登録した。組み入れ基準は、次のように定義した：生後６ヵ月〜２１歳の男性または女性； ＣＤ１９陽性Ｂ細胞悪性腫瘍の診断；以前の遺伝子療法なし（その後に骨髄破壊的幹細胞移植が続いたならば、患者はＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞療法を受けていた可能性がある）；親／保護者のインフォームドコンセント；および適切な場合は子どもの同意。除外基準は、次のように定義した：活動性Ｂ型またはＣ型肝炎感染；ＨＩＶ感染；参加を妨げる管理されていない何らかの医学的状態；および治験責任医師の意見で、試験手順を遵守しない可能性がある親または保護者。
同意および登録はＤａｖｉｄ Ｍ． Ｂａｒｒｅｔｔにより行われ、日常検査に加えて末梢血の４ミリリットル試料を回収し、試験に使用した。これが唯一の治験介入であり、すべての患者は疾患に基づき標準治療療法を継続し、同様の回収は化学療法の各サイクル後に生じた。末梢血試料は、以下の時点：化学療法前、導入後、地固め後、中間維持後、後期強化後、および維持で、ＩＲＢ承認臨床試験プロトコール（ＣＨＰ−１２−００９９１５）を用いて、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）と診断された患者から回収した。再発疾患患者は登録から除外した。患者特性を表７に示す。登録時の患者年齢は生後８ヵ月〜１９歳にわたり、患者は男性５８％および女性４２％であった。疾患群は、国立がん研究所（ＮＣＩ）ＳＲ（ＳＲ−ＡＬＬ、ｎ＝１７）またはＨＲ／ＶＨＲ（ＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ、ｎ＝２１）、およびＮＨＬ（ｎ＝１２）として層別化したＡＬＬを含んだ。リンパ腫サブタイプは、バーキット（ｎ＝６）、びまん性大細胞型Ｂ細胞（ＤＬＢＣＬ、ｎ＝３）、縦隔原発（ｎ＝１）、骨原発性リンパ腫（ｎ＝１）、および濾胞性リンパ腫（ｎ＝１）を含んだ。すべてのＮＨＬサブタイプを分析のためにグループ化した。標準リスク（ｓｔａｎｄａｒｄ ｒｉｓｋ）および高リスクＡＬＬに対する化学療法レジメンを表８に示す。
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エクスビボＴ細胞増殖および培養
リンパ球を、標準プロトコールの通りＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）密度遠心分離培地（ｄｅｎｓｉｔｙ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）を用いて末梢血から採取した。採取したバフィーコートをＴ細胞培養培地に再懸濁し、細胞を適切な大きさの培養容器に５〜１０×１０６細胞／ｍｌの濃度で播種し、３７℃で一晩インキュベートした。この１８〜２４時間のインキュベーション後、これらの培養物からの上清を回収および洗浄し、接着細胞を培養容器に残し、懸濁細胞のみを単離した。この上清の試料をＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８発現について染色して（以下参照）ＡＴＣを計算した。この全培養物を次いで、ＣＤ３およびＣＤ２８アゴニスト抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ＃１１１．３２Ｄ）で被覆した刺激マイクロビーズと１Ｔ細胞あたり３ビーズの比で混ぜ合わせ、本発明者らの臨床検査増殖で使用される同じ刺激および培養条件を用いて、Ｔ細胞増殖のために１０６ Ｔ細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。細胞をカウントし、細胞サイズを１日おきに測定し、ビーズを７日目に除去した。細胞増殖動態および容量が、細胞が活性化から休止したことを示したとき、培養期間は終了した。サイトカイン試験のために、試料を記載したように回収し、ビーズと混ぜ合わせ、次いで２つの培養物に分けた。一方の培養物（サイトカインなし）を上記のように処置し、他方（＋ＩＬ−７およびＩＬ−１５）をＩＬ−７（２５ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃２０７−ＩＬ−０２５および＃２４７−ＩＬ−２０５）で処置した。
細胞のＣＤ３／ＣＤ２８刺激への応答が成功する確率に対する診断および化学療法の影響を評価した。１０日間で５倍超の細胞増殖の基準を培養細胞に適用した。この基準は、ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の臨床試験に登録されるのに必要な最小増殖の閾値に使用されていることから、操作細胞療法治験と臨床的に関係している。統計分析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアで行い、分散分析を使用して群を比較した。
フローサイトメトリー
Ｔ細胞を、Ｔ細胞系を鑑別するための細胞表面マーカーについて染色した。ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ９５は、以下の発現パターン：ナイーブ（ＴＮ）−ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ９５−；ステムセントラルメモリー（ＴＳＣＭ）−ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ９５＋；セントラルメモリー（ＴＣＭ）−ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ９５＋；エフェクターメモリー（ＴＥＭ）−ＣＣＲ７−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ９５＋；ターミナルエフェクター（ＴＥｆｆ）−ＣＣＲ７−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ９５＋を用いて、様々なＴ細胞表現型を鑑別するのに使用することができる。例えば、Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １７（２０１１）：１２９０-７参照。この分析、および上記したＴ細胞バルクの定量の両方に使用した抗体は、ＣＤ８−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランクリンレイクス、ＮＪ；＃３４７３１３）、ＣＤ３−ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５５３４０）、ＣＤ４−ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５５３４９）、ＣＣＲ７−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５６１２７１）、ＣＤ９５−ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５６６４１）、ＣＤ４５ＲＯ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５９８６５）、およびＣＤ６２Ｌ−ＰＥ／Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、ＣＡ；３０４８２２）であった。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ウシ胎仔血清）に再懸濁し、次いで抗体カクテルと４℃で２５分間インキュベートした。試料を次いで２回洗浄し、フローサイトメトリー取得はＢＤ ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃６５３１１８）で行った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ， Ｉｎｃ、アシュランド、ＯＲ）を用いて分析を行った。
統計分析
すべての統計分析は、分散分析検定を用いてＰｒｉｓｍ ４（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ラホーヤ、ＣＡ）を用いて行った。パーセンテージの比較には、フィッシャー直接検定を使用した。有意と報告されるすべての比較は、ｐ値＜０．０５に達したか、または多重比較のためのボンフェローニ補正を行うために計算した（ｏｒ ａｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）。
結果
テスト増殖中のインビトロでの５倍より大きい増殖は、７０％の陽性予測値および９５％の陰性予測値で臨床スケールの増殖の成功を高度に予測する。
疾患群および以前の療法により異なるＴ細胞増殖
末梢血を、診断時および化学療法の毎サイクル後に各登録患者から回収した。これらのサイクル中にＳＲ−およびＨＲ−ＡＬＬ患者に投与した化学療法レジメンを表８に示す。Ｔ細胞をＣＤ３およびＣＤ２８アゴニスト抗体で被覆したビーズを用いて単離および刺激し、細胞増殖を経時的に測定した。テスト増殖中の５倍より大きい増殖の閾値（臨床増殖の成功の高い可能性と関連する）を適用して、増殖に「合格する」試料、および増殖に「不合格になる」試料に分析を層別化した。これらのカテゴリーは、臨床試験への組み入れにそれぞれ適格であったかまたは不適格であった患者試料を表した。
ＡＬＬ ｖ． ＮＨＬ
ＡＬＬ患者のほぼ８０％が診断時にこの閾値を満たし、合格率は療法期間にわたってゆっくり低下し、維持相中に約４０％に達した（図２２Ａ）。明らかに対照的であったのはＮＨＬ患者から回収した細胞であり、不十分な増殖を示し、２５％のみが診断時に合格し、ほとんどの試料（すべての残りの時点の１２．５％）は療法の開始後、何らかの増殖を示さなかった（図２２Ａ）。白血病試料とリンパ腫試料との合格率の差は、すべての時点で有意であった（表１２は統計分析の結果を示している）。
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標準リスクｖ．高／超高リスク
ＮＣＩ ＳＲ群およびＨＲ／ＶＨＲ群へのＡＬＬ試料の層別化は、ＳＲ−ＡＬＬ患者由来のＴ細胞が、療法初期の最初の減少および維持相中の穏やかな減少を伴う堅調な維持された増殖能を示すことを明らかにした（図２２Ｂ）。ＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ試料は療法初期に十分に増殖したが、合格率は地固め相後、急速に低下し（図２２Ｂ）、ＳＲ−ＡＬＬと比較した場合、テスト増殖の合格率の統計的に有意な差をもたらした（表１２）。
Ｔ細胞数
回収時の末梢血由来の絶対リンパ球数（ＡＬＣ）は療法初期に高く、地固め後に減少した（図２２Ｃおよび２２Ｅ）。絶対リンパ球数は、白血病患者とリンパ腫患者とで異ならず、Ｔ細胞機能の予測因子でもなかった。ＡＴＣと増殖能との関係を調べて、この観察された機能差が単にＴ細胞量のばらつきの反映なのかどうかを評価した。５倍インビトロ増殖閾値に合格したかまたは不合格になったすべての患者から回収した時点の末梢血由来の絶対Ｔ細胞数は、療法初期に概ね高かった（図２２Ｄおよび２２Ｆ）。白血病試料のＡＴＣは導入後、維持療法に至るまで減少し（図２２Ｆ）、増殖率と類似した傾向を示した。幾つかの時点のリンパ腫試料は、適度の末梢Ｔ細胞数（３００〜４００細胞／ｍｌ）を有した。しかし、これらのサイクル中でさえ、Ｔ細胞は不十分な増殖を示した。白血病試料が、リンパ腫と比べて療法期間を通じて有意に大きな増殖を示したのに対し（図２２Ａ）、これらの２つの疾患間でそのような統計的有意差はＡＴＣでは観察されなかった。リスク群層別化ＡＬＬ試料の調査は、ＳＲ−ＡＬＬ ＡＴＣが漸進的に減少し、後期強化後に大幅に減少することを示した（図２４）。ＡＴＣのこの漸進的減少は、増殖の漸進的減少と相関した（図２２Ｂ）。ＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ ＡＴＣは、地固め後の増殖の急激な減少と相関する地固め療法後の急激な減少を経験した（図２２Ｂ）。ＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ ＡＴＣは療法の残りに関して低いままであり、増殖能は漸進的減少を示した。これらの知見は、ＡＬＬではＡＴＣが増殖能とある程度関係し得ることを示唆している。しかし、この関連は各サイクル時では直接相関しなかった。ＮＨＬに関して、ＡＴＣは増殖能と関係がないように思われた。
発現の増強と関連する初期系統Ｔ細胞
Ｔ細胞量はＮＨＬでは増殖と関連がなく、ＡＬＬでは一般的な相関のみであったことを考え、これらの試料内に存在するメモリー表現型を、観察された機能差の潜在的寄与因子として評価した。細胞系統は、本明細書に記載した様々な細胞表面マーカーパターンにより定義した。分析は、図２３の各カラムの最上部に表示されている３つの比較群に分けた（合格対不合格、図２３Ａ〜２３Ｅ；白血病対リンパ腫、図２３Ｆ〜２３Ｊ；ＳＲ−ＡＬＬ対ＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ、図２３Ｋ〜２３Ｏ）。
テスト増殖に合格した試料対合格しなかった試料の比較（図２３Ａ〜２３Ｅ）は、増殖の成功が、後期強化後を除くすべての時点でのＴＮ細胞の有意な富化、ならびに診断時点および後期強化後を除くすべての時点でのＴＳＣＭ細胞の富化と関連していることを明らかにした（図２３Ａ〜２３Ｂ）。ＴＳＣＭ数が比較的安定したままであったのに対し、ＴＮ数は合格および不合格試料の両方で療法を通じて漸進的に減少した。合格試料はまた、ＴＣＭについても療法初期（図２３Ｃ）およびＴＥＭ細胞についても単一時点（図２３Ｄ）で富化され、ＴＥｆｆ数は両群で比較的同等であった（図２３Ｅ）。この全体的なパターンは、テスト増殖合格試料は、化学療法のほぼ毎サイクル後に不合格になった試料と比べて、初期系統表現型について有意に富化されたことを示唆した。
図２３Ｆ〜２３Ｊ）は、図２２Ｆに代表されるＡＴＣを構成するＴ細胞表現型を反映している。診断時、後期強化後、および維持中にＡＬＬ試料におけるＴＮ細胞の有意な富化があり、ならびに導入および中間維持後を除いてすべてのサイクル後にＴＳＣＭ細胞の有意な富化があった。リンパ腫試料は対照的に、療法期間を通じてＴＮおよびＴＳＣＭ数が低く、メモリーおよびエフェクター表現型を比較的保存していた（図２３Ｈ〜２３Ｊ）。これは、リンパ腫患者における循環Ｔ細胞集団が大部分は増殖能が限られた分化Ｔ細胞からなり、診断時でさえ初期系統サブタイプはまれであることを示唆するものである。ＡＬＬ試料は、療法期間を通じた増殖の増強と相関する初期系統細胞に富んでいた。
ＡＬＬ患者由来の試料の分析は、ＳＲ−ＡＬＬおよびＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬに分けた。それぞれ図２２Ｂおよび２４に代表される増殖およびＡＴＣデータを今や反映するこれらの表現型試験は、両方の集団においてＴＮ細胞は最初は上昇するが、療法中に急減を示したことを示した。ＳＲ−ＡＬＬに関して、この減少は後期強化後に生じ、ＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬに関して、これは地固め後に生じた（図２３Ｋ）。ＴＮ減少のタイミングのこのばらつきは、地固め後および中間維持後の絶対ＴＮ数における有意差をもたらした。この有意性は、ＳＲ−ＡＬＬ ＴＮ数が後期強化後に減少した時に失われた。ＡＴＣの減少のタイミングは、図２４に示されたＴＮ細胞数の枯渇のタイミングと直接相関した。一方で、ＴＳＣＭ細胞は、ＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ試料では漸進的に減少したが、ＳＲ−ＡＬＬ試料では比較的安定したままであった（図２３Ｌ）。この減少もやはり、後期強化後に失われる、地固めおよび中間維持後の有意差をもたらした。図２２Ｂは、ＴＮおよびＴＳＣＭ細胞数で観察された差と一致する、同様に地固め後に現れた（および維持された）増殖における有意差を示した。これは、これらの初期系統細胞の枯渇が増殖の成功を無効にしたことを示唆するものである。後期系統細胞における傾向の調査は、幾つかの追加の観察を明らかにした。ＴＣＭ数は、ＳＲ−ＡＬＬ試料では比較的安定したままであり、ＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ試料では後期強化後の減少を示したが、この減少は維持されなかった（図２３Ｍ）。ＴＥＭ細胞数は、両方の疾患群で療法期間を通じて低く、ばらつきの程度は高かった（図２３Ｎ）。最後に、ＴＥｆｆ細胞数は、ＳＲ−ＡＬＬ試料では漸進的減少を示したが、ＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ試料では比較的安定したままであった（図２３Ｏ；統計分析の結果については、表１３参照）。全ての３つの比較群からの結果を表９にまとめる。
ＳＲ−およびＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬは両方とも、診断時に同等の初期系統細胞数で始まり、枯渇のパターンは投与した化学療法レジメンの調査に至った。２つの薬剤、シクロホスファミドおよびシタラビンは、ＴＮ細胞の観察された減少時点で各リスク群に投与した。すなわち、ＳＲ−ＡＬＬ患者はこれらを後期強化中に受け取り、ＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ患者はこれらを地固めと共に受け取った。これらの薬剤は、どちらの処置プロトコールについてもどの他の時点でも投与されず、他の薬剤はこの一貫した特異的な枯渇と関連がなかった。
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ＴＳＣＭ細胞の富化は増殖をレスキューした
ＩＬ−７およびＩＬ−１５サイトカインの添加によるＴＳＣＭ集団の富化は、あまり成熟していないＴ細胞表現型を支持すると考えられている。初期系統細胞と増殖との関連を前提として、細胞表現型および増殖能に対するこれらのサイトカインの効果を評価した。試料を回収し、１つはサイトカインを含み、１つはサイトカインを含まない２つの培養物に分けた。この分析は、リスクカテゴリーまたは療法サイクルではなく疾患タイプによってのみ層別化した。参考までに、分析は、分割培養実験の一部ではない、以前に回収したすべての試料を含む（すなわち、図２２Ａ〜２２Ｂ、２２Ｆ、２４、および２３Ａ〜２３Ｏで分析された試料）、各疾患群のすべてのテスト増殖合格試料のパーセンテージを含んだ。
白血病およびリンパ腫の両方の患者から回収した試料は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５と培養した後、ＴＳＣＭ集団の有意な富化を示した（図２５Ａ；統計分析の結果については、表１４参照）。ＴＳＣＭのこの増殖は、白血病試料におけるＴＥｆｆ集団の増加を例外として、ほぼすべての他の細胞タイプを犠牲にして成り立った。ＴＳＣＭ細胞のこの増加は、白血病およびリンパ腫試料の両方における増殖の増強と関連していた（図２５Ｂ）。増殖の増強は、リンパ腫患者由来の試料で最も顕著であり、ＴＳＣＭ細胞が富化された場合の５７．７％の全合格率、およびサイトカインなしで培養した場合の１５．３％の合格率を反映する統計的に有意な改善を示した（Ｐ＝０．００３）。この合格率は、白血病試料により示されたもの（６０．３％）に近かった。
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結論
ＡＬＬの分析は、標準リスク（ＳＲ−ＡＬＬ）および高／超高リスク（ＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ）疾患に層別化した。ＨＲ／ＶＨＲ試料がシクロホスファミドおよびシタラビン投与と関連して急激に減少する、最初の増殖の成功を示したのに対し、ＳＲ−ＡＬＬ試料は、療法後期まで堅調な増殖を維持した。シクロホスファミドおよびシタラビンは、ＨＲ／ＶＨＲ−ＡＬＬ Ｔ細胞増殖の減少に対応して、両方のＡＬＬリスク群でＴＮ細胞を選択的に枯渇させるように思われた。外因性インターロイキン−７（ＩＬ−７）およびＩＬ−１５との増殖中の培養は、ＴＳＣＭ細胞数を有意に増強し、この富化はリンパ腫Ｔ細胞の増殖能を有意に改善した。
標準リスクＡＬＬ患者は、高リスクまたは超高リスクＡＬＬ患者と比べてＴ細胞増殖が改善した。リンパ腫患者は、療法期間を通じてＴ細胞増殖が不十分であった。インビトロで増殖がより良好であった初期系統細胞が富化されたＴ細胞集団を有する患者、およびＡＬＬ患者は、ＮＨＬ患者由来の細胞と比べてより多数のこれらの細胞に、対応する増殖の増強が伴っていた。Ｔ細胞表現型の調査は、リンパ腫患者が極めて低い初期系統細胞数を有するのに対し、ＡＬＬ患者は富化ＴＮおよびＴＳＣＭ細胞サブセット（初期系統細胞）を有することを明らかにした。また、より大きなナイーブおよびステムセントラルメモリー細胞集団は、増殖能の増強と相関していた。ナイーブおよびステムセントラルメモリー細胞は、標準リスクＡＬＬでは後期強化後に枯渇し、高および超高リスクＡＬＬではより初期（地固め後）に枯渇した。不合格試料が、ＴＥＭおよびＴＥｆｆ約５５％、Ｔｅｆｆプールが合格試料の２倍大きい（１９．６％ ｖ． １０．５％）細胞産物を産生したのに対し、増殖合格試料はＴＣＭ約５０％の集団を産生した。図２６参照。Ｔ細胞増殖の終了時に存在するＴＣＭ集団は、主にＴＮおよびＴＳＣＭ細胞に由来した。初期系統細胞は、シクロホスファミドおよびシタラビン化学療法により選択的に枯渇され、インターロイキン−７（ＩＬ−７）およびＩＬ−１５とのその培養は、厳選された初期系統細胞を富化し、Ｔ細胞増殖能をレスキューした。この結果に基づくと、シクロホスファミドおよびシタラビンは、高い増殖能を有するＴ細胞の枯渇に主に関与している可能性があった。初期系統細胞は増殖に対するＴ細胞の適合性を大いに助け、Ｔ細胞回収のタイミングかまたは培養方法のどちらかによるこの集団の富化は、極めて有効な操作細胞療法を受けることができる患者の数を増加させ得る。これらの薬剤を含むサイクル前のＴ細胞の回収は、これらの患者が細胞療法の対象となる可能性を増加させた。本明細書に記載された結果は、エクスビボでの治療細胞の増殖を最適化し、細胞の存続性を増強する（例えば、Ｔ細胞選択および支持により）ための方法を提供する。
対応特許
本明細書に引用されたそれぞれの特許、特許出願、および公報の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、特定の態様を参照して開示されているが、本発明の他の態様および変形形態が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく他の当業者により考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、すべてのそのような態様および同等の変形形態を含むと解釈されることが意図される。

Claims (70)

  1. ＣＡＲ療法において使用するのに好適な免疫エフェクター細胞（例えば、細胞集団）を富化するかまたは作製する方法であって、
    （ｉ）対象（例えば、血液がん患者）からの免疫エフェクター細胞取得のタイミング、
    （ｉｉ）前記免疫エフェクター細胞取得に対する化学療法のタイミング、
    （ｉｉｉ）化学療法の種類、
    （ｉｖ）原発性悪性腫瘍、
    （ｖ）免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）パラメーター、例えば、Ｔ細胞数、Ｔ細胞表現型、もしくはＴ細胞機能のうちの１つもしくは複数
    のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上（すべて）、または（ｉ）〜（ｖ）のうちの２つ、３つ、４つ、もしくは５つの組合せに従って、前記免疫エフェクター細胞を取得し（例えば、得るかまたは採取し）、
    それによって、ＣＡＲ療法において使用するのに好適な前記免疫エフェクター細胞を富化するかまたは作製することを含む方法。
  2. 化学療法と組み合わせて、血液がんを有する対象を治療するか、または前記対象に抗腫瘍免疫を提供するのに使用するための、ＣＡＲ分子を発現する免疫エフェクター細胞（「ＣＡＲ発現細胞」）（例えば、細胞集団）を含む組成物であって、前記免疫エフェクター細胞が、
    （ｉ）対象（例えば、がん患者）から免疫エフェクター細胞を取得するタイミング、
    （ｉｉ）前記免疫エフェクター細胞取得に対する化学療法のタイミング、
    （ｉｉｉ）化学療法の種類、
    （ｉｖ）原発性悪性腫瘍、
    （ｖ）免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）パラメーター、例えば、Ｔ細胞数、Ｔ細胞表現型、もしくはＴ細胞機能のうちの１つもしくは複数
    のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上（すべて）、または（ｉ）〜（ｖ）のうちの２つ、３つ、４つ、もしくは５つの組合せを最適化することによって、前記対象から取得され（例えば、得られるかまたは採取され）、
    （適宜）前記免疫エフェクター細胞は、前記ＣＡＲ分子の導入の前に前記対象から取得される、組成物。
  3. 血液がんを有する対象を治療するか、または前記対象に抗腫瘍免疫を提供する方法であって、前記対象に、化学療法と組み合わせて、ＣＡＲ分子を発現する有効量の免疫エフェクター細胞（例えば、細胞集団）（「ＣＡＲ発現細胞」または「ＣＡＲ療法」）を投与することを含み、前記免疫エフェクター細胞は、
    （ｉ）対象（例えば、がん患者）から免疫エフェクター細胞を取得するタイミング、
    （ｉｉ）前記免疫エフェクター細胞取得に対する化学療法のタイミング、
    （ｉｉｉ）化学療法の種類、
    （ｉｖ）原発性悪性腫瘍、
    （ｖ）免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）パラメーター、例えば、Ｔ細胞数、Ｔ細胞表現型、もしくはＴ細胞機能のうちの１つもしくは複数
    のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上（すべて）、または（ｉ）〜（ｖ）のうちの２つ、３つ、４つ、もしくは５つの組合せを最適化することによって、前記対象から取得され（例えば、得られるかまたは採取され）、
    （適宜）前記免疫エフェクター細胞は、前記ＣＡＲ分子の導入の前に前記対象から取得され、
    それによって、前記血液がんを治療するか、または前記血液がんに対する抗腫瘍免疫を提供する、方法。
  4. 前記免疫エフェクター細胞集団は、（ｉ）〜（ｖ）のうちのいずれかが最適化されている場合に、前記免疫細胞集団のエキソビボ増殖、治療法に対する前記免疫細胞集団の有効性、または前記免疫細胞集団の収率のうちの１つまたは複数の増加を示す、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲ、例えば、本特許請求の範囲に記載されるＣＡＲ分子、例えば、本特許請求の範囲に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ（例えば、ＣＴＬ０１９）をコードする核酸を含む、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記免疫エフェクター細胞集団に、ＣＡＲ、例えば、本特許請求の範囲に記載されるＣＡＲ分子、例えば、本特許請求の範囲に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ（例えば、ＣＴＬ０１９）をコードする核酸を導入することをさらに含む、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記ＣＡＲ分子は、表１または表４による配列を含む、請求項５または６に記載の方法。
  8. 免疫細胞が取得される前記対象および／または治療を受ける前記対象は、ヒトがん患者である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記対象は、年齢が１８歳またはそれよりも若い（例えば、１８歳、１７歳、１６歳、１５歳、１４歳、１３歳、１２歳、１１歳、１０歳、９歳、８歳、７歳、６歳、５歳、４歳、３歳、２歳、１歳、またはそれよりも若い）、請求項８に記載の方法。
  10. 前記対象は、年齢が１８歳を超えている、請求項８に記載の方法。
  11. 前記対象は、腫瘍関連抗原またはがん関連抗原の発現と関連する疾患を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
  12. 前記血液がんは、Ｂ細胞性急性リンパ球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞性前骨髄球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞性白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ならびにワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症のうちの１つまたは複数から選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. 前記血液がんは、白血病、例えば、ＣＬＬ、ＡＬＬ、またはリンパ腫、例えば、ＭＣＬ、ＮＨＬ、もしくはＨＬである、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
  14. 前記対象は、白血病を有し、小児科患者である、例えば、年齢が１８歳またはそれよりも若い、請求項１〜９または１１〜１３のいずれかに記載の方法。
  15. 前記対象は、標準リスク、高リスク、または非常に高リスクのＡＬＬを有するとして分類される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. 前記対象は、リンパ腫を有さない、例えば、前記対象は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を有さない、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
  17. 前記対象は、再発がんを有さない、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
  18. 前記免疫エフェクター細胞集団取得は、前記対象に前記化学療法を施す前に行う、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. 前記免疫エフェクター細胞集団取得は、前記対象が２回、３回、４回、または５回の化学療法サイクルを受ける前に行う、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
  20. 前記免疫エフェクター細胞集団取得は、前記対象が１回の化学療法サイクルを受けた後だが、前記対象が１回を上回る（例えば、１回を上回る、２回を上回る、３回を上回る、４回を上回る、または５回を上回る）化学療法サイクルを受ける前に行う、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
  21. 前記化学療法または化学療法サイクルは、寛解導入療法、地固め療法、中間維持療法、後期強化療法、または維持療法のサイクルのうちの１つまたは複数を含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
  22. 前記免疫エフェクター細胞集団は、前記対象が地固めの化学療法サイクルまたは寛解導入の化学療法サイクルを受ける前に、前記対象から取得される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記免疫エフェクター細胞集団は、前記対象が地固めの化学療法サイクルを受ける前に、前記対象から取得される、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記対象は、高リスクまたは非常に高リスクのがん（例えば、ＡＬＬ）を有するとして分類され、前記細胞は、前記対象が地固めサイクルを受ける前に採取される、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記免疫エフェクター細胞集団は、前記対象が、後期強化サイクルを受ける前に、前記対象から取得される、請求項２１に記載の方法。
  26. 前記対象は、高リスクまたは非常に高リスクのがん（例えば、ＡＬＬ）を有するとして分類され、前記細胞は、前記対象が後期強化サイクルを受ける前に採取される、請求項２１に記載の方法。
  27. １つまたは複数の化学療法サイクルまたは薬物は、表８から選択される、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
  28. 前記化学療法は、表８に記載される薬物および投薬レジメンを含む、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
  29. 前記化学療法は、ビンクリスチン、デキサメタゾン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、ダウノルビシン、６−メルカプトプリン、シクロホスファミド、シタラビン、メトトレキサート、ドキソルビシン、６−チオグアニン、および／またはプレドニゾンのうちの１つまたは複数を含む、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
  30. 前記免疫エフェクター細胞集団は、前記対象がシクロホスファミドおよび／またはシタラビンの投与を受ける前に前記対象から取得される、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
  31. 取得された前記免疫エフェクター細胞集団は、例えば、参照値（例えば、後の時点またはさらなる回数の化学療法に曝露した後の前記対象からの試料）と比較して、より多数の低分化度のＴ細胞、例えば、より多数のナイーブＴ細胞、ステムセントラルメモリーＴ細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）、および／またはセントラルメモリーＴ細胞のうちの１つまたは複数を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
  32. 取得された前記免疫エフェクター細胞集団は、少なくとも２０％のナイーブＴ細胞、少なくとも２％のステムセントラルメモリーＴ細胞、および／または少なくとも４％のセントラルメモリーＴ細胞を含む、請求項２３１に記載の方法。
  33. 取得された前記免疫エフェクター細胞集団は、少なくとも５０％のセントラルメモリーＴ細胞を含む、請求項３１または３２に記載の方法。
  34. 取得された前記免疫エフェクター細胞集団は、合わせて５５％未満のエフェクターメモリーＴ細胞および末端エフェクターＴ細胞を含む、請求項３１または３２に記載の方法。
  35. 取得された前記免疫エフェクター細胞集団は、参照値（例えば、後の時点またはさらなる回数の化学療法に曝露した後の前記対象からの試料）と比較して、Ｔ細胞絶対数（ＡＴＣ）の増加を示す、請求項３１に記載の方法。
  36. 取得された前記免疫エフェクター細胞集団は、１マイクロリットル当たり少なくとも４００個のＴ細胞絶対数、１マイクロリットル当たり少なくとも２００個のナイーブＴ細胞絶対数、１マイクロリットル当たり少なくとも２０個のステムセントラルメモリーＴ細胞絶対数、および／または１マイクロリットル当たり少なくとも４０個のセントラルメモリーＴ細胞絶対数を含む、請求項３１に記載の方法。
  37. 取得された前記免疫エフェクター細胞集団は、１つまたは複数のマーカー、例えば、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ９５の発現に基づいて選択され、例えば、前記免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）集団は、ＣＣＲ７＋およびＣＤ６２Ｌ＋である、請求項１〜３６のいずれかに記載の方法。
  38. 前記ナイーブＴ細胞は、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ９５−の発現パターンに基づいて特定され、前記ステムセントラルメモリーＴ細胞は、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ９５＋の発現パターンに基づいて特定され、前記セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ９５＋の発現パターンに基づいて特定される、請求項３２に記載の方法。
  39. 前記免疫細胞集団は、血液がん、例えば、白血病、例えば、ＣＬＬ、ＡＬＬ、またはリンパ腫、例えば、ＭＣＬ、ＮＨＬ、もしくはＨＬを有する対象から取得される、請求項１〜３８のいずれかに記載の方法。
  40. 制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、取得された前記免疫細胞集団から除去し、それによって、制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞集団を得ることをさらに含む、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法。
  41. 前記制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団は、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含有する、請求項４０に記載の方法。
  42. 取得された前記免疫エフェクター細胞集団は、がんを有する対象、例えば、ＣＤ２５発現がん、例えば、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）などを有する対象の細胞である、請求項１〜４１のいずれかに記載の方法。
  43. 前記制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞、および５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の腫瘍細胞を含有する、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ２５抗体またはその断片を使用して、取得された前記免疫エフェクター細胞集団から除去される、請求項４０に記載の方法。
  45. 前記抗ＣＤ２５抗体またはその断片は、基質、例えば、ビーズにコンジュゲートされている、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団は、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の前記白血病細胞、例えば、ＣＬＬ細胞、ＡＬＬ細胞、またはリンパ腫細胞、例えば、ＭＣＬ細胞、ＨＬ細胞を含有する、請求項４３に記載の方法。
  47. 前記制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団は、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞、および１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含有する、請求項４３に記載の方法。
  48. 前記制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団は、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞、および１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含有する、請求項４３に記載の方法。
  49. 取得された前記免疫エフェクター細胞集団から、腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４、またはＣＤ１１ｂを発現する細胞を除去し、それによって、制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞集団、およびＣＡＲ、例えば、本特許請求の範囲に記載されるＣＡＲの発現に好適な腫瘍抗原枯渇細胞の集団を得ることをさらに含む、請求項１〜４８のいずれかに記載の方法。
  50. 取得された前記免疫エフェクター細胞集団から、チェックポイント阻害剤、例えば、本特許請求の範囲に記載されるチェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞、およびＴＩＭ３＋細胞のうちの１つまたは複数を発現する細胞を除去し、それによって、制御性Ｔ細胞枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞、ならびにチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えば、ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋、および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を得ることをさらに含む、請求項１〜４８のいずれかに記載の方法。
  51. 取得された前記免疫エフェクター細胞集団は、１つまたは複数のマーカー、例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ４５ＲＯの発現に基づいて選択され、例えば、前記得られた免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）集団は、ＣＤ３＋および／またはＣＤ２８＋である、請求項１〜４８のいずれかに記載の方法。
  52. 前記制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞集団を活性化させることをさらに含む、請求項１〜５１のいずれかに記載の方法。
  53. 前記免疫エフェクター細胞集団由来の細胞に、ＣＡＲ、例えば本特許請求の範囲に記載されるＣＡＲ、例えば、本特許請求の範囲に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを形質導入することをさらに含む、請求項１〜５２のいずれかに記載の方法。
  54. 例えば、ＣＡＲ、例えば、本特許請求の範囲に記載されるＣＡＲ、例えば、本特許請求の範囲に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲを発現するように操作された前記免疫エフェクター細胞集団を、例えば、本特許請求の範囲に記載される方法によって増殖させることをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団、例えば、前記ＣＤ２５＋枯渇細胞集団由来の細胞に、ＣＡＲ、例えば、本特許請求の範囲に記載されるＣＡＲ、例えば、本特許請求の範囲に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを形質導入することをさらに含む、請求項１〜５４のいずれかに記載の方法。
  56. 例えば、ＣＡＲ、例えば、本特許請求の範囲に記載されるＣＡＲ、例えば、本特許請求の範囲に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲを発現するように操作された前記制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団を、例えば、本特許請求の範囲に記載される方法によって増殖させることをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記細胞集団を、８日間またはそれ未満、例えば、７日間、６日間、または５日間の期間、増殖させる、請求項５４または５６に記載の方法。
  58. 前記細胞集団を、５日間培養液で増殖させ、その結果得られる細胞は、同じ培養条件下において９日間培養液中で増殖させた同じ細胞よりも強力である、請求項５４または５６に記載の方法。
  59. 前記５日間増殖させた細胞は、抗原刺激時に、同じ培養条件下において９日間培養液中で増殖させた同じ細胞と比較して、細胞倍増の少なくとも１倍、２倍、３倍、または４倍の増加を示す、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記細胞を、５日間培養液で増殖させ、その結果得られる細胞は、同じ培養条件下において９日間培養液で培養した同じ細胞と比較して、より高い炎症促進性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを呈する、請求項５８に記載の方法。
  61. 前記細胞集団は、例えば、本特許請求の範囲に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤および前記細胞の表面上の共刺激性分子を刺激するリガンドの存在下において、前記細胞を培養することによって増殖させる、請求項５４または５６に記載の方法。一実施形態では、前記薬剤は、抗ＣＤ３抗体もしくはその断片、および／または抗ＣＤ２８抗体もしくはその断片とコンジュゲートしたビーズである。
  62. 前記細胞集団を、１つまたは複数のインターロイキンを含む適切な培地（例えば、本特許請求の範囲に記載される培地）において増殖させ、これが、例えば、フローサイトメトリーなど、本特許請求の範囲に記載される方法によって測定した場合に、１４日間の増殖期間にわたって細胞の少なくとも２００倍（例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍）の増加をもたらす、請求項５４〜６１〜５５のいずれかに記載の方法。
  63. 前記細胞集団を、サイトカイン、例えば、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７（例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７）の存在下において増殖させる、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記細胞の前記集団は、前記増殖期間後に凍結保存される、請求項５４〜６３のいずれかに記載の方法。
  65. 前記免疫エフェクター細胞集団を、テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸と接触させることをさらに含む、請求項１〜６４のいずれかに記載の方法。
  66. 例えば、本特許請求の範囲に記載される方法のうちのいずれかにより作製された免疫エフェクター細胞集団（例えば、ＣＡＲ分子またはＣＡＲ分子をコードする核酸を含む）を含む免疫細胞調製物または反応混合物。
  67. （ｉ）少なくとも２０％のナイーブＴ細胞、少なくとも２％のステムセントラルメモリーＴ細胞、および／もしくは少なくとも４％のセントラルメモリーＴ細胞を含む、前記免疫エフェクター細胞集団、ならびに／または
    （ｉｉ）１マイクロリットル当たり少なくとも４００個のＴ細胞絶対数、１マイクロリットル当たり少なくとも２００個のナイーブＴ細胞絶対数、１マイクロリットル当たり少なくとも２０個のステムセントラルメモリーＴ細胞絶対数、および／もしくは１マイクロリットル当たり少なくとも４０個のセントラルメモリーＴ細胞絶対数を含む、前記免疫エフェクター細胞集団
    から選択される、請求項６６に記載の免疫エフェクター細胞調製物（例えば、反応混合物）。
  68. １つまたは複数のマーカー、例えば、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ９５の発現に基づいて選択され、例えば、前記免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）集団は、ＣＣＲ７＋およびＣＤ６２Ｌ＋である、請求項６６に記載の免疫エフェクター細胞調製物（例えば、反応混合物）。
  69. 前記ナイーブＴ細胞は、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ９５−の発現パターンに基づいて特定され、前記ステムセントラルメモリーＴ細胞は、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ９５＋の発現パターンに基づいて特定され、前記セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ９５＋の発現パターンに基づいて特定される、請求項６７に記載の免疫エフェクター細胞調製物（例えば、反応混合物）。
  70. ＣＡＲ、例えば、本特許請求の範囲に記載されるＣＡＲをコードする核酸を含む、請求項６７〜６９のいずれかに記載の免疫エフェクター細胞調製物（例えば、反応混合物）。
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