JP2017538710A - Ｂｃｍａキメラ抗原受容体 - Google Patents

Ｂｃｍａキメラ抗原受容体 Download PDF

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Abstract

本発明は、Ｂ細胞関連状態の養子Ｔ細胞療法のための改善された組成物を提供する。例えば、ヒトＢＣＭＡポリペプチドの１つ以上のエピトープに結合するマウス抗ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、及び一次シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドもまた提供する。【選択図】図１０Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもと、２０１５年８月３日に出願された米国仮出願第６２／２００，５０５号及び２０１４年１２月１２日に出願された米国仮出願第６２／０９１，４１９号の利益を主張し、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書において参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称はＢＬＢＤ＿０４３＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは２７ＫＢであり、２０１５年１２月４日に作成され、本明細書の出願と同時に、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
背景
本発明は、Ｂ細胞関連状態を治療するための、改善された組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、マウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片を含む、改善されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、これらのＣＡＲを発現するように遺伝子改変された免疫エフェクター細胞、及びＢ細胞関連状態を効果的に治療するための、これらの組成物の使用に関する。
いくつかの重要な疾患は、Ｂリンパ球、すなわち、Ｂ細胞に関係する。異常なＢ細胞生理機能はまた、限定されないが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含む自己免疫疾患の発生にもつながる場合がある。Ｂ細胞の悪性転換は、限定されないが、リンパ腫、例えば、多発性骨髄腫及び非ホジキンリンパ腫を含む癌につながる。
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）及び多発性骨髄腫（ＭＭ）を含む、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者の大多数がかなりの癌死亡率に寄与している。様々な治療形態に対するＢ細胞悪性腫瘍の応答は複雑である。化学療法及び放射線療法を含む、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療するための従来の方法は、毒性副作用により有用性が限られている。抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ５２、抗ＣＤ８０、及び抗ＨＬＡ−ＤＲ治療用抗体を用いた免疫療法は、一部、不十分な薬物動態プロファイル、血清プロセアーゼ及び糸球体濾過による抗体の迅速な排除、ならびに腫瘍部位内への限られた透過及び標的抗原の癌細胞上での限られた発現レベルにより、成果が限られている。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変細胞を使用する試みの成果も限られている。加えて、ＣＡＲに使用された所与の抗原結合ドメインの治療有効性は予測不可能であり、抗原結合ドメインが非常に強く結合する場合、ＣＡＲ Ｔ細胞は大量のサイトカイン放出を誘発し、「サイトカインストーム」と見なされる、死に至る可能性がある免疫反応をもたらし、抗原結合ドメインが非常に弱く結合する場合、ＣＡＲ Ｔ細胞は、癌細胞の排除に十分な治療有効性を表さない。
本発明は概して、Ｔ細胞療法をもたらすための改善されたベクター及びその使用方法を提供する。
様々な実施形態では、ヒトＢＣＭＡポリペプチドの１つ以上のエピトープに結合するマウス抗ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。
特定の実施形態では、ヒトＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合断片は、Ｃａｍｅｌ Ｉｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される。
追加の実施形態では、ヒトＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。
いくつかの実施形態では、マウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜３のいずれか１つに記載される、１つ以上のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、マウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４〜６のいずれか１つに記載される、１つ以上のＣＤＲを含む。
ある特定の実施形態では、マウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７に記載される、可変軽鎖配列を含む。
ある特定の実施形態では、可変軽鎖配列は、配列番号１〜３に記載される、ＣＤＲ配列を含む。
他の実施形態では、マウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８に記載される、可変重鎖配列を含む。
追加の実施形態では、可変重鎖配列は、配列番号４〜６に記載される、ＣＤＲ配列を含む。
更なる実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１からなる群から選択される、ポリペプチドからのものである。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１、及びＣＤ１５４からなる群から選択される、ポリペプチドのものからである。
ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αからのものである。
特定の実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される、共刺激分子からのものである。
特定の実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、及びＣＤ１３７からなる群から選択される、共刺激分子からのものである。
追加の実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、及びＣＤ１３７からなる群から選択される、共刺激分子からのものである。
追加の実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８からのものである。
特定の実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３４からのものである。
他の実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７からのものである。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジ領域ポリペプチドを含む。
更なる実施形態では、ヒンジ領域ポリペプチドは、ＣＤ８αのヒンジ領域を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、スペーサー領域を含む。
追加の実施形態では、スペーサー領域ポリペプチドは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、シグナルペプチドを含む。
更なる実施形態では、シグナルペプチドは、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体２（ＧＭ−ＣＳＦＲ２）シグナルポリペプチド、またはＣＤ８αシグナルポリペプチドを含む。
一実施形態では、ＣＡＲは、配列番号９に記載される、アミノ酸配列を含む。
様々な実施形態では、本明細書において想定されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが提供される。
様々な特定の実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが提供され、このポリヌクレオチド配列は配列番号１０に記載されるものである。
様々なある特定の実施形態では、本明細書において想定されるＣＡＲをコードする、または配列番号１０に記載されるポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
ある特定の実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。
追加の実施形態では、ベクターは、エピソームベクターである。
特定の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。
更なる実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターである。
他の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
一実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするベクターは、配列番号３６に記載される、ポリヌクレオチド配列を含む。
追加の実施形態では、レンチウイルスベクターは、本質的に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、ビスナ・マエディ（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選択される。
特定の実施形態では、ベクターは、左（５’）レトロウイルスＬＴＲ、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス輸送要素、本明細書において想定されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたプロモーター、及び右（３’）レトロウイルスＬＴＲを含む。
他の実施形態では、ＣＡＲは、異種ポリアデニル化配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節要素（ＨＰＲＥ）またはウッドチャック転写後調節要素（ＷＰＲＥ）を含む。
ある特定の実施形態では、５’ＬＴＲのプロモーターは、異種プロモーターに置き換えられる。
更なる実施形態では、異種プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターまたはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである。
特定の実施形態では、５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲは、レンチウイルスＬＴＲである。
特定の実施形態では、３’ＬＴＲは、１つ以上の改変を含む。
いくつかの実施形態では、３’ＬＴＲは、１つ以上の欠失を含む。
ある特定の実施形態では、３’ＬＴＲは自己不活性型（ＳＩＮ）ＬＴＲである。
いくつかの実施形態では、ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化またはシグナルウサギβ−グロビンポリアデニル化配列である。
追加の実施形態では、本明細書において想定されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、最適化されたコザック配列を含む。
更なる実施形態では、本明細書において想定されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたプロモーターは、サイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１−α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター（ＰＧＫ）、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＱ−Ｃ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ＭＣ１）、ベータアクチンプロモーター（β−ＡＣＴ）、サルウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される。
様々な実施形態では、本明細書において想定されるベクターを含む免疫エフェクター細胞が提供される。様々な実施形態では、免疫エフェクター細胞は、本明細書において想定されるベクターを形質導入される。
更なる実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、請求項２８〜４６のいずれか１項に記載のベクターを形質導入され、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化及び刺激され、それによりＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の不在下で活性化及び刺激された、形質導入された免疫エフェクター細胞の増殖と比較して、形質導入された免疫エフェクター細胞の増殖を維持する。
特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化及び刺激された免疫エフェクター細胞では、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の不在下で活性化及び刺激された免疫エフェクター細胞と比較して、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択される１つ以上のマーカー、またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のマーカーの全ての発現が増加する。
一実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＺＳＴＫ４７４である。
様々な実施形態では、本明細書において想定される免疫エフェクター細胞及び生理学的に許容される賦形剤を含む組成物が提供される。
様々な実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを免疫エフェクター細胞内に導入することを含む、本明細書において想定されるＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞を生成する方法が提供される。
追加の実施形態では、本方法は、免疫エフェクター細胞を刺激し、細胞を、ＣＤ３に結合する抗体及びＣＤ２８に結合する抗体と接触させることによって、細胞の増殖を誘発し、それにより免疫エフェクター細胞集団を生成することを更に含む。
特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ベクターを導入する前に刺激され、増殖を誘発される。
ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球を含む。
特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞を含む。
特定の実施形態では、細胞は、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化及び刺激され、それによりＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の不在下で活性化及び刺激された免疫エフェクター細胞の増殖と比較して、形質導入された免疫エフェクター細胞の増殖を維持する。
いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化及び刺激された免疫エフェクター細胞では、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の不在下で活性化及び刺激された免疫エフェクター細胞と比較して、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択される１つ以上のマーカー、またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７及びＣＤ３８のマーカーの全ての発現が増加する。
一実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＺＳＴＫ４７４である。
様々な実施形態では、対象に、本明細書において想定されるＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞、及び任意選択で、薬学的に許容される賦形剤を含む、治療有効量の組成物を投与することを含む、Ｂ細胞関連状態の治療を必要とする対象に、それを行う方法が提供される。
他の実施形態では、Ｂ細胞関連状態は、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、不確定な悪性度のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害、免疫調節性障害、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質抗体症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質抗体症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血及び急速進行性糸球体腎炎、重鎖病、原発性もしくは免疫細胞関連アミロイドーシス、または意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症である。
更なる実施形態では、Ｂ細胞関連状態は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。
ある特定の実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、多発性骨髄腫（ＭＭ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。
ある特定の実施形態では、ＭＭは、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、及び髄外性形質細胞腫からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＮＨＬは、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。
特定の実施形態では、Ｂ細胞関連状態は、形質細胞悪性腫瘍である。
更なる実施形態では、Ｂ細胞関連状態は、自己免疫疾患である。
追加の実施形態では、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデスである。
ある特定の実施形態では、Ｂ細胞関連状態は、関節リウマチである。
特定の実施形態では、Ｂ細胞関連状態は、特発性血小板減少性紫斑病、または重症筋無力症、または自己免疫性溶血性貧血である。
マウスＢ細胞成熟抗原（ｍｕＢＣＭＡ）ＣＡＲ構築物の模式図を示す。 細胞がＢＣＭＡを発現するＫ５６２細胞と２４時間共培養された後に、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲＴ細胞、及びＣＡＲ１９Δ Ｔ細胞から放出されたＩＦＮｇの量を示す。 細胞がＢＣＭＡを発現するＫ５６２細胞と比較して、ＢＣＭＡ発現を欠くＫ５６２と２４時間共培養された後に、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲＴ細胞、及びＣＡＲ１９Δ Ｔ細胞から放出されたＩＦＮｇの量を示す。 アッセイの１０日前に刺激された、形質導入されていない対照Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲＴ細胞、及びＣＡＲ１９Δ Ｔ細胞からの成長培地中の炎症性サイトカインの量を示す。 抗原刺激不在下での、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲＴ細胞、及びＣＡＲ１９Δ Ｔ細胞により産生された炎症性サイトカインの量を示す。 抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞製造の終了時の活性化の表現型マーカーの発現を示す。ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ２５発現は、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞、及び抗ＣＡＲ１９Δ Ｔ細胞において測定された。 アポトーシスに必要なステップであり、抗原刺激不在下での抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＡＩＣＤに重要である、活性化されたカスパーゼ−３のレベルを示す。 ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ヒトＡＢ血清（ＨＡＢＳ）、または１００ｎｇ／ｍｌの可溶性ＢＣＭＡを含有する培地中の抗ＢＣＭＡ０２及び抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞における炎症性サイトカイン放出の量を示す。 約１００ｍｍ３の実験用皮下ヒト多発性骨髄腫（ＲＰＭＩ−８２２６）腫瘍を有するＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスにおける腫瘍体積を示す。マウスを、ビヒクル、１０７抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞、１０７抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞、またはボルテゾミブ（ベルケイド）で処置した。 約１００ｍｍ３の実験用皮下ヒト多発性骨髄腫（ＲＰＭＩ−８２２６）腫瘍を有するＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスにおける腫瘍体積を示す。マウスを、ビヒクル、１０７抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞、１０７抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞、またはボルテゾミブ（ベルケイド）で処置した。 リンパ腫及び白血病細胞系のＢＣＭＡ発現レベル（丸）及び各細胞系に対する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の活性（ＩＦＮγ放出、ボックス）を示す。ＢＣＭＡ陰性（ＢＣＭＡ−）腫瘍細胞系：骨髄性白血病（Ｋ５６２）、急性リンパ芽球性白血病（ＮＡＬＭ−６及びＮＡＬＭ−１６）；マントル細胞リンパ腫（ＲＥＣ−１）；またはホジキンリンパ腫；（ＨＤＬＭ−２）は、ＩＦＮγ放出をほとんど、または全く示さなかった。ＢＣＭＡ陽性（ＢＣＭＡ＋）腫瘍細胞系：Ｂ細胞慢性リンパ芽球性白血病（ＭＥＣ−１）、マントル細胞リンパ腫（ＪｅＫｏ−１）、ホジキンリンパ腫（ＲＰＭＩ−６６６６）、バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ細胞及びＲａｍｏｓ細胞）、及び多発性骨髄腫（ＲＰＭＩ−８２２６）は、実質的なＩＦＮγ放出を示した。 ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍誘発後８日目にマウスに投与されるとき、ＮＳＧマウスモデルにおいてバーキットリンパ腫細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）を発現するＢＣＭＡに対するビヒクル、抗ＣＤ１９Δ ＣＡＲ Ｔ細胞、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ活性を示す。 ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍誘発後１８日目にマウスに投与されるとき、ＮＳＧマウスモデルにおいてバーキットリンパ腫細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）を発現するＢＣＭＡに対するビヒクル、抗ＣＤ１９Δ ＣＡＲ Ｔ細胞、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ活性を示す。 図１１は、５０パーセント減少した抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現で達成された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の強力なインビトロ活性を示す。（Ａ）Ｔ細胞集団は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ分子（５〜４０のＭＯＩ）をコードするレンチウイルスの４ｘ１０８〜５ｘ１０７の形質導入単位を形質導入された。得られたＴ細胞集団は、２６±４％抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ陽性Ｔ細胞を含有するように正規化された。（Ｂ）正規化された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のＭＦＩは、フローサイトメトリーによりアッセイされたとき、８８５〜１８７５の範囲であった。（Ｃ）Ｋ５６２細胞及びＫ５６２−ＢＣＭＡ細胞を、比較可能な細胞溶解活性を示した２０：１または１０：１のエフェクター（Ｅ；Ｔ細胞）対標的（Ｔ；Ｋ５６２とＫ５６２ ＢＣＭＡ細胞との１：１混合）比で、正規化された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞と共培養した。 図１１は、５０パーセント減少した抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現で達成された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の強力なインビトロ活性を示す。（Ａ）Ｔ細胞集団は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ分子（５〜４０のＭＯＩ）をコードするレンチウイルスの４ｘ１０８〜５ｘ１０７の形質導入単位を形質導入された。得られたＴ細胞集団は、２６±４％抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ陽性Ｔ細胞を含有するように正規化された。（Ｂ）正規化された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のＭＦＩは、フローサイトメトリーによりアッセイされたとき、８８５〜１８７５の範囲であった。（Ｃ）Ｋ５６２細胞及びＫ５６２−ＢＣＭＡ細胞を、比較可能な細胞溶解活性を示した２０：１または１０：１のエフェクター（Ｅ；Ｔ細胞）対標的（Ｔ；Ｋ５６２とＫ５６２ ＢＣＭＡ細胞との１：１混合）比で、正規化された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞と共培養した。 図１１は、５０パーセント減少した抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現で達成された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の強力なインビトロ活性を示す。（Ａ）Ｔ細胞集団は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ分子（５〜４０のＭＯＩ）をコードするレンチウイルスの４ｘ１０８〜５ｘ１０７の形質導入単位を形質導入された。得られたＴ細胞集団は、２６±４％抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ陽性Ｔ細胞を含有するように正規化された。（Ｂ）正規化された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のＭＦＩは、フローサイトメトリーによりアッセイされたとき、８８５〜１８７５の範囲であった。（Ｃ）Ｋ５６２細胞及びＫ５６２−ＢＣＭＡ細胞を、比較可能な細胞溶解活性を示した２０：１または１０：１のエフェクター（Ｅ；Ｔ細胞）対標的（Ｔ；Ｋ５６２とＫ５６２ ＢＣＭＡ細胞との１：１混合）比で、正規化された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞と共培養した。 図１２は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の製造プロセスの信頼度を示す。（Ａ）１１の個々のドナーのＰＢＭＣから製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞産物は、形質導入されていないドナーＴ細胞の対応培養物と比較して、比較可能な拡張レベルを示す。（Ｂ）１１のドナーから製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞産物は、比較可能なレンチウイルス形質導入効率（ＶＣＮ）を示した。（Ｃ）抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の頻度はフローサイトメトリーにより測定され、ＢＣＭＡ発現は全てのドナーにわたって比較可能であることが分かった。（Ｄ）１１のドナーから製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞産物は、ＢＣＭＡ発現Ｋ５６２細胞に曝露されたとき、治療的に関係のあるＩＦＮγ放出レベルを示した。 図１２は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の製造プロセスの信頼度を示す。（Ａ）１１の個々のドナーのＰＢＭＣから製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞産物は、形質導入されていないドナーＴ細胞の対応培養物と比較して、比較可能な拡張レベルを示す。（Ｂ）１１のドナーから製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞産物は、比較可能なレンチウイルス形質導入効率（ＶＣＮ）を示した。（Ｃ）抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の頻度はフローサイトメトリーにより測定され、ＢＣＭＡ発現は全てのドナーにわたって比較可能であることが分かった。（Ｄ）１１のドナーから製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞産物は、ＢＣＭＡ発現Ｋ５６２細胞に曝露されたとき、治療的に関係のあるＩＦＮγ放出レベルを示した。 図１２は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の製造プロセスの信頼度を示す。（Ａ）１１の個々のドナーのＰＢＭＣから製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞産物は、形質導入されていないドナーＴ細胞の対応培養物と比較して、比較可能な拡張レベルを示す。（Ｂ）１１のドナーから製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞産物は、比較可能なレンチウイルス形質導入効率（ＶＣＮ）を示した。（Ｃ）抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の頻度はフローサイトメトリーにより測定され、ＢＣＭＡ発現は全てのドナーにわたって比較可能であることが分かった。（Ｄ）１１のドナーから製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞産物は、ＢＣＭＡ発現Ｋ５６２細胞に曝露されたとき、治療的に関係のあるＩＦＮγ放出レベルを示した。 図１２は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の製造プロセスの信頼度を示す。（Ａ）１１の個々のドナーのＰＢＭＣから製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞産物は、形質導入されていないドナーＴ細胞の対応培養物と比較して、比較可能な拡張レベルを示す。（Ｂ）１１のドナーから製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞産物は、比較可能なレンチウイルス形質導入効率（ＶＣＮ）を示した。（Ｃ）抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の頻度はフローサイトメトリーにより測定され、ＢＣＭＡ発現は全てのドナーにわたって比較可能であることが分かった。（Ｄ）１１のドナーから製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞産物は、ＢＣＭＡ発現Ｋ５６２細胞に曝露されたとき、治療的に関係のあるＩＦＮγ放出レベルを示した。 ＩＬ−２、またはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４の存在下で１０日間培養されたＣＤ６２Ｌ陽性抗ＢＣＭＡ０２ Ｔ細胞におけるＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８の同時発現のベン図を示す。ＺＳＴＫ４７４処理された抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＩＬ−２単独で培養された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８を同時発現する細胞の割合において増加を示した。 ＩＬ−２単独で処理された培養物と比較して、ＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４（ｎ＝７）で処理された培養物においてＣＤ８発現抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞の割合の増加を示す。ＣＤ８の発現は、蛍光標識された抗ＣＤ８抗体及びフローサイトメトリーを使用して決定された。 ＩＬ−２単独またはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で培養した後の、１４のドナーからの抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞により放出されたＩＦＮ−γの量を示す。培養期間の終了時に、同等数の抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞が培地単独中で２４時間再培養された。２４時間内に放出されたＩＦＮ−γの量はＥＬＩＳＡにより数量化された。ＺＳＴＫ４７４中での培養は、ＩＬ−２単独で培養された抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞強直性サイトカイン放出を大幅に増加しなかった。 高悪性度のＤａｕｄｉ腫瘍モデルにおける、ＩＬ−２もしくはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で処理された抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞、またはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で処理された、切り詰められたシグナル伝達欠損抗ＢＣＭＡ０２ （ｔＢＣＭＡ０２） ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。完全な腫瘍縮小は、ＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で処理された抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与された５０％のマウスにおいて観察された。 多発性骨髄腫の腫瘍（ＲＰＭＩ−８２２６）モデルにおける、ＩＬ−２、またはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で処理された抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。ＩＬ−２、またはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４培養された抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置された動物は、腫瘍の成長を完全に阻止した。
配列識別子の簡単な説明
配列番号１〜３は、本明細書において想定されるＢＣＭＡ ＣＡＲの例示的な軽鎖ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を記載する。
配列番号４〜６は、本明細書において想定されるＢＣＭＡ ＣＡＲの例示的な重鎖ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を記載する。
配列番号７は、本明細書において想定されるＢＣＭＡ ＣＡＲの例示的な軽鎖配列のアミノ酸配列を記載する。
配列番号８は、本明細書において想定されるＢＣＭＡ ＣＡＲの例示的な重鎖配列のアミノ酸配列を記載する。
配列番号９は、本明細書において想定される例示的なＢＣＭＡ ＣＡＲのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１０は、本明細書において想定される例示的なＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号１１は、ヒトＢＣＭＡのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１２〜２２は、様々なリンカーのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２３〜３５は、プロテアーゼ切断部位及び自己切断型ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を記載する。
配列番号３６は、ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするベクターのポリヌクレオチド配列を記載する。
Ａ．概要
本発明は概して、Ｂ細胞関連状態を治療するための、改善された組成物及び方法に関する。本明細書で使用される場合、「Ｂ細胞関連状態」という用語は、不適切なＢ細胞活性及びＢ細胞悪性腫瘍に関係する状態に関する。
特定の実施形態では、本発明は、遺伝子改変免疫エフェクター細胞を使用する、Ｂ細胞関連状態の改善された養子細胞療法に関する。遺伝的アプローチは、免疫認識及び癌細胞の排除を強化するための手段の可能性を提案する。有望な戦略の１つは、癌細胞に細胞傷害性を再指向するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するために免疫エフェクター細胞を遺伝子操作することである。しかしながら、Ｂ細胞障害を治療するための既存の養子細胞免疫療法は、細胞がＢ細胞の全てまたは大部分上に発現された抗原を標的とするため、体液性免疫を損なう深刻なリスクを提示する。したがって、このような療法は臨床的に望ましくなく、よって、当該技術分野において、体液性免疫を温存するＢ細胞関連状態のためのより効率的な療法が必要である。
本明細書に開示される養子細胞療法の改善された組成物及び方法は、Ｂ細胞発現Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ、ＣＤ２６９、または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７；ＴＮＦＲＳＦ１７としても知られる）を標的とすることにより、容易に増幅し、インビボにおいて長期持続性を呈し、かつ体液性免疫の障害を低減することができる遺伝子改変エフェクター細胞を提供する。
ＢＣＭＡは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９２（１）：１２９−１３５，２０００及びＭａｃｋａｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２１：２３１−２６４，２００３を参照されたい。ＢＣＭＡはＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）及び増殖誘発リガンド（ＡＰＲＩＬ）に結合する（例えば、Ｍａｃｋａｙ ｅｔ ａｌ．，２００３ ａｎｄ Ｋａｌｌｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０４：４３−５４，２００５を参照されたい）。非悪性細胞の中でも、ＢＣＭＡは、大半が形質細胞及び成熟Ｂ細胞のサブセットにおいて発現されることが報告されている（例えば、Ｌａａｂｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，７７（１）：３８９７−３９０４，１９９２、Ｌａａｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２（７）：１１４７−１１５４，，１９９４、Ｋａｌｌｅｄ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９（１）：９１−９７，２００４及びＮｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７３（２）：８０７−８１７，２００４を参照されたい。ＢＣＭＡが欠損するマウスは健康であり、正常な数のＢ細胞を有するが、長寿命形質細胞の生存が障害される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，２１（１２）： ４０６７−４０７４，２００１及びＳｃｈｉｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３（５５３７）：２ １１１−２１ １４，２００１を参照されたい）。ＢＣＭＡ ＲＮＡは、普遍的に、多発性骨髄腫細胞及び他のリンパ腫において検出されており、ＢＣＭＡタンパク質は、数人の研究者により、多発性骨髄腫患者からの形質細胞の表面上で検出された（例えば、Ｎｏｖａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０３（２）：６８９−６９４，２００４、Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７３（１９）： ５９０３−５９０９，２００７、Ｂｅｌｌｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０５（１０）：３９４５−３９５０，２００５及びＭｏｒｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７０３（８）：３１４８−３１５７，２００４を参照されたい。
様々な実施形態では、マウス抗ＢＣＭＡ抗体配列を含むＣＡＲは、特定のヒト抗体配列を含むＢＣＭＡ ＣＡＲと比較して非常に有効であり、強固なインビボ増幅を受け、ＢＭＣＡを発現するヒトＢ細胞を認識し、ＢＣＭＡ発現Ｂ細胞に対して細胞障害活性を示し、活性化されたＴ細胞によって放出されたサイトカインが非感染性発熱を促す系において突然の炎症応答を引き起こす、死に至る可能性がある状態である、サイトカインストームを誘発する徴候を示さない。
一実施形態では、マウスＢＣＭＡ抗体または抗原結合断片、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む抗ＣＡＲが提供される。
一実施形態では、本明細書において想定されるＣＡＲを発現するように遺伝子改変される免疫エフェクター細胞が提供される。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、本明細書において、ＣＡＲ Ｔ細胞またはＣＡＲ改変Ｔ細胞と称される。
様々な実施形態では、本明細書において想定される遺伝子改変免疫エフェクター細胞は、Ｂ細胞関連状態、例えば、Ｂ細胞に関連する自己免疫疾患またはＢ細胞悪性腫瘍を有する患者に投与される。
本発明の実施は、反対が具体的に示されない限り、当該技術分野の範囲内である化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技法、遺伝学、免疫学、及び細胞生物学の従来の方法を採用し、それらの多くは図示の目的のため以下に記載される。このような技法は文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ Ｊｕｌｙ ２００８）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙならびにＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどのジャーナルの単行書を参照されたい。
Ｂ．定義
別様に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似する、または等価の任意の方法及び材料が本発明の実施または試験に使用され得るが、組成物、方法、及び材料の好ましい実施形態が本明細書において記載される。本発明の目的のため、次の用語が以下に定義される。
冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、本明細書において、冠詞の文法的目的の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ、または１つ以上）を指すように使用される。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ（ある要素）」は１つの要素または１つ以上の要素を意味する。
代替（例えば、「ｏｒ（または）」）の使用は、代替のうちの１つ、両方、またはその任意の組み合わせのいずれかを意味するように理解されるべきである。
「及び／または」という用語は、代替のうちの１つまたは両方のいずれかを意味するように理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、参照の分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％ほど変動する分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、参照の分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さについて±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。
本明細書全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、記述のステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群を含むことを暗示するが、任意の他のステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群を除外することを暗示しないことを理解する。「からなる」とは、句「からなる」に続くもの全てを含み、それに限定されることを意味する。よって、「からなる」という句は、列記される要素が必要であるか、または必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。「から本質的になる」とは、句の後に列記される任意の要素を含み、列記された要素の開示において指定された活性または作用に干渉しない、または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。よって、「から本質的になる」という句は、列記される要素が必要であるか、または必須であるが、列記された要素の活性または作用に物質的に影響を及ぼす他の要素が存在しないことを示す。
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態、「追加の実施形態」、もしくは「更なる実施形態」、またはこれらの組み合わせに対する言及は、実施形態に関して記載される特定の特徴、構造、または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。よって、本明細書全体を通して様々な箇所での前述の句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態に対して言及されない。更に、特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において、任意の好適な様式で組み合わされてよい。一実施形態の特徴の積極的な記載が特定の実施形態における特徴を除外する根拠とならないことも理解する。
Ｃ．キメラ抗原受容体
様々な実施形態では、免疫エフェクター細胞の細胞傷害性をＢ細胞に再指向する遺伝子操作された受容体が提供される。これらの遺伝子操作された受容体は、本明細書において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と称される。ＣＡＲは、特定の抗ＢＣＭＡ細胞免疫活性を呈するキメラタンパク質を生成するために、所望の抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に対する抗体ベースの特異性をＴ細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせる分子である。本明細書で使用される場合、「キメラ」という用語は、異なる起源からの異なるタンパク質またはＤＮＡの一部で構成されることを説明する。
本明細書において想定されるＣＡＲは、ＢＣＭＡに結合する細胞外ドメイン（結合ドメインまたは抗原特異的結合ドメインとも称される）、貫通膜ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲの抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインの、標的細胞の表面上のＢＣＭＡとの会合は、ＣＡＲのクラスター化をもたらし、ＣＡＲ含有細胞に活性化刺激を送達する。ＣＡＲの主な特性は、免疫エフェクター細胞の特異性を再指向し、それにより、主な組織適合性（ＭＨＣ）依存様式で標的抗原発現細胞の細胞死を媒介することができる分子の増殖、サイトカイン産生、食作用、または産生を引き起こし、モノクローナル抗体、可溶性リガンド、または細胞特異的共受容体の細胞特異的標的能を利用するそれらの能力である。
様々な実施形態では、ＣＡＲは、マウス抗ＢＣＭＡ特異的結合ドメインを含む細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、及び一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、マウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外結合ドメイン、１つ以上のヒンジドメインまたはスペーサードメイン、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む膜貫通ドメイン、及び一次シグナル伝達ドメインを含む。
１．結合ドメイン
特定の実施形態では、本明細書において想定されるＣＡＲは、Ｂ細胞上に発現されたヒトＢＣＭＡポリペプチドに特異的に結合するマウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片を含む、細胞外結合ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」、及び「細胞外抗原特異的結合ドメイン」という用語は、交換可能に使用され、対象の標的抗原、例えば、ＢＣＭＡに特異的に結合する能力を有するＣＡＲを提供する。結合ドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。
本明細書で使用される場合、「特異的結合親和性」、または「特異的に結合する」、または「特異的に結合された」、または「特異的結合」、または「特異的に標的とする」という用語は、バックグラウンド結合よりも大きい結合親和性での、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片（またはそれを含むＣＡＲ）の、ＢＣＭＡへの結合を説明する。結合ドメイン（または結合ドメインもしくは結合ドメインを含有する融合タンパク質を含むＣＡＲ）は、例えば、約１０５ Ｍ−１以上の親和性またはＫａでＢＣＭＡに結合するか、またはそれと会合する（すなわち、１／Ｍの単位での特定の結合相互作用の平衡会合定数）場合、ＢＣＭＡに「特異的に結合する」。ある特定の実施形態では、結合ドメイン（またはその融合タンパク質）は、約１０６ Ｍ−１、１０７ Ｍ−１、１０８ Ｍ−１、１０９ Ｍ−１、１０１０ Ｍ−１、１０１１ Ｍ−１、１０１２ Ｍ−１、または１０１３ Ｍ−１以上のＫａで標的に結合する。「高親和性」結合ドメイン（またはその単鎖融合タンパク質）は、少なくとも１０７ Ｍ−１、少なくとも１０８ Ｍ−１、少なくとも１０９ Ｍ−１、少なくとも１０１０ Ｍ−１、少なくとも１０１１ Ｍ−１、少なくとも１０１２ Ｍ−１、少なくとも１０１３ Ｍ−１以上を有するＫａのこれらの結合ドメインを指す。
あるいは、親和性は、Ｍの単位での特定の結合相互作用（例えば、１０−５ Ｍ〜１０−１３ Ｍ以下）の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義され得る。本開示による結合ドメインポリペプチド及びＣＡＲタンパク質の親和性は、従来の技法を使用して、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、または結合会合、または標識リガンドを使用する変位アッセイ、またはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能である）などの表面プラズモン共鳴装置を使用すること、またはそれぞれ、Ｃｏｒｎｉｎｇ及びＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから入手可能なＥＰＩＣシステムもしくはＥｎＳｐｉｒｅなどの光学バイオセンサー技術により、容易に決定され得る（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０及び米国特許第５，２８３，１７３号、第５，４６８，６１４号またはその等価物も参照されたい）。
一実施形態では、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合より約２倍大きい、バックグラウンド結合より約５倍大きい、バックグラウンド結合より約１０倍大きい、バックグラウンド結合より約２０倍大きい、バックグラウンド結合より約５０倍大きい、バックグラウンド結合より約１００倍大きい、またはバックグラウンド結合より約１０００倍以上大きい。
特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含む。「抗体」は、免疫細胞により認識されるものなど、抗原決定基を含有するペプチド、脂質、多糖、または核酸など、抗原のエピトープを特異的に認識し、それに結合する、少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドである。
「抗原（Ａｇ）」は、動物における抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質を指し、動物に注射または吸収される組成物（癌特異的タンパク質を含むものなど）を含む。抗原は、開示される抗原などの異種抗原により誘発されたものを含む、特定の体液性または細胞性免疫の産物と反応する。特定の実施形態では、標的抗原はＢＣＭＡポリペプチドのエピトープである。
「エピトープ」または「抗原決定基」は、結合剤が結合する抗原の領域を指す。エピトープは、タンパク質の三次折り畳み構造により並置された隣接アミノ酸または非隣接アミノ酸の両方から形成され得る。隣接アミノ酸から形成されたエピトープは典型的には、変性溶媒への曝露により保持されるが、三次折り畳み構造により形成されたエピトープは典型的には、変性溶媒での処理により失われる。エピトープは典型的には、独特な空間的立体構造において、少なくとも３個、より一般的には少なくとも５個、約９個、または約８〜１０個のアミノ酸を含む。
抗体は、Ｃａｍｅｌ Ｉｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２，ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、ならびに抗原結合に関与する完全長抗体の一部など、その抗原結合断片を含む。本用語は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ結合抗体（二重特異性抗体など）、及びそれらの抗原結合断片などの遺伝子操作された形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７も参照されたい。
当業者によって理解されるように、また本明細書の別の箇所に記載されるように、完全抗体は２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む。各重鎖は、可変領域、ならびに第１、第２、及び第３の定常領域からなり、一方各軽鎖は、可変領域及び定常領域からなる。哺乳類の重鎖はα、δ、ε、γ、及びμに分類される。哺乳類の軽鎖はλまたはκに分類される。α、δ、ε、γ、及びμの重鎖を含む免疫グロブリンは、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ａ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに分類される。完全抗体は「Ｙ」字形状を形成する。Ｙのステムは一緒に結合した２本の重鎖の第２及び第３の定常領域（ＩｇＥ及びＩｇＭに関しては、第４定常領域）からなり、ジスルフィド結合（鎖間）はヒンジに形成される。重鎖γ、α、及びδは、３つのタンデム（一列の）Ｉｇドメイン、及び柔軟性を高めるためのヒンジ領域で構成された定常領域を有し、重鎖μ及びεは、４つの免疫グロブリンドメインで構成された定常領域を有する。第２及び第３の定常領域は、それぞれ、「ＣＨ２ドメイン」及び「ＣＨ３ドメイン」と称される。Ｙの各アームは、単一の軽鎖の可変及び定常領域に結合された単一の重鎖の可変領域及び第１定常領域を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は抗原結合に関与する。
軽鎖及び重鎖の可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断される「フレームワーク」領域を含有する。ＣＤＲは、従来の方法、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ（Ｗｕ，ＴＴ ａｎｄ Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１３２（２）：２１１−５０，（１９７０）、Ｂｏｒｄｅｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．，ＰＮＡＳ，８４： ２４４０−２４４３（１９８７）（参照により本明細書に組み込まれるＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１を参照されたい）による配列により、またはＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ（Ｃｈｏｉｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６（４）：９０１−９１７（１９８７）、Ｃｈｏｉｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３（１９８９））による構造などにより定義または特定され得る。
異なる軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域の配列は、ヒトなど、種内で比較的保存される。構成物である軽鎖及び重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、３次元空間においてＣＤＲを位置付け、アライメントするのに役立つ。ＣＤＲは主に、抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と称され、Ｎ末端から開始して順次番付され、典型的には特定のＣＤＲが位置する鎖によっても特定される。よって、抗体の重鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３と称される一方で、抗体の軽鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３と称される。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる組み合わせ部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。抗体間で異なるのはＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の制限された数のアミノ酸位置のみが抗原結合に直接関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置は特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。本明細書において想定されるヒト化ＢＣＭＡ ＣＡＲを構築するのに好適である軽鎖ＣＤＲの例示的な例は、配列番号１〜３に記載されるＣＤＲ配列を含むが、これらに限定されない。本明細書において想定されるヒト化ＢＣＭＡ ＣＡＲを構築するのに好適である重鎖ＣＤＲの例示的な例は、配列番号４〜６に記載されるＣＤＲ配列を含むが、これらに限定されない。
「ＶＨ」または「ＶＨ」に対する言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂまたは本明細書に開示される他の抗体断片のものを含む、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」または「ＶＬ」に対する言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂまたは本明細書に開示される他の抗体断片のものを含む、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一クローンにより、または単一抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子が形質移入された細胞により産生された抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に既知の方法、例えば、骨髄腫細胞の免疫脾臓細胞との融合からのハイブリッド抗体形成細胞を作製することにより産生される。モノクローナル抗体はヒト化モノクローナル抗体を含む。
「キメラ抗体」は、ヒトなどの１つの種からのフレームワーク残基及びマウスなどの別の種からのＣＤＲ（一般的に抗原結合を付与する）を有する。特定の好ましい実施形態では、本明細書において想定されるＣＡＲは、キメラ抗体またはその抗原結合断片である抗原特異的結合ドメインを含む。
「ヒト化」抗体は、ヒトフレームワーク領域及び非ヒト（例えば、マウス、ラット、または合成）免疫グロブリンからの１つ以上のＣＤＲを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。
特定の実施形態では、マウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、Ｃａｍｅｌ Ｉｇ（ラクダ科動物の抗体（ＶＨＨ））、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「Ｃａｍｅｌ Ｉｇ」または「ラクダ科動物のＶＨＨ」は、重鎖抗体の最小の既知の抗原結合単位を指す（Ｋｏｃｈ−Ｎｏｌｔｅ，ｅｔ ａｌ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２１：３４９０−３４９８（２００７））。「重鎖抗体」または「ラクダ科動物の抗体」は、２つのＶＨドメインを含有し、軽鎖を含有しない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：２５−３８（１９９９）、ＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９４／２５５９１、米国特許第６，００５，０７９号）。
「免疫グロブリンの新しい抗原受容体」の「ＩｇＮＡＲ」は、１つの可変の新しい抗原受容体（ＶＮＡＲ）ドメイン及び５つの定常の新しい抗原受容体（ＣＮＡＲ）ドメインのホモ二量体からなるサメ免疫レパートリーからの抗体のクラスを指す。ＩｇＮＡＲは、最小の既知の免疫グロブリンベースの足場タンパク質の一部を表し、非常に安定しており、効率的な結合特性を保有する。固有の安定性は、（ｉ）マウス抗体に見られる従来の抗体のＶＨ及びＶＬドメインと比較して、相当な数の荷電及び親水性表面が曝露された残基を提示する、基礎となるＩｇ足場、ならびに（ｉｉ）ループ間ジスルフィド架橋を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）における安定化構造特徴及びループ内水素結合のパターンの両方に起因し得る。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を産生し、各々、単一抗原結合部位及び残留「Ｆｃ」断片を有し、その名称は容易に結晶化するその能力を反映する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、尚も抗原を架橋結合することができるＦ（ａｂ′）２断片をもたらす。
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含有する最小抗体断片である。一実施形態では、２鎖Ｆｖ種は、密着した非共有会合にある１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が２鎖Ｆｖ種のものに類似する「二量体」構造で会合することができるように、柔軟なペプチドリンカーにより共有結合され得る。各可変ドメインの３つの超可変領域（ＨＶＲ）がＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を画定するように相互作用するのは、この構成である。集合的に、６つのＨＶＲは、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも低い親和性であるが、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。
Ｆａｂ断片は重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含有し、また軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ′断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのいくつかの残基の付加により、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ′−ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ′の名称である。Ｆ（ａｂ′）２抗体断片は、本来、間にヒンジシステインを有する対のＦａｂ′断片として産生された。抗体断片の他の化学カップリングも既知である。
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）により完全に記載される。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
「単一ドメイン抗体」もしくは「ｓｄＡｂ」、または「ナノボディ」は、抗体の重鎖の可変領域（ＶＨドメイン）または抗体の軽鎖の可変領域（ＶＬドメイン）からなる抗体断片を指す（Ｈｏｌｔ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１（１１）：４８４−４９０）。
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に、及びいずれかの配向（例えば、ＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ）で存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含む。ｓｃＦｖの概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｅｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。
好ましい実施形態では、本明細書において想定されるＣＡＲは、マウスｓｃＦｖである抗原特異的結合ドメインを含む。単鎖抗体は、所望の標的に特異的なハイブリドーマのＶ領域遺伝子からクローニングされ得る。このようなハイブリドーマの産生は通例となった。可変領域重鎖（ＶＨ）及び可変領域軽鎖（ＶＬ）をクローニングするために使用され得る技法は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９８９；８６：３８３３−３８３７に記載されている。
特定の実施形態では、ヒトＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウスｓｃＦｖである抗原特異的結合ドメイン。本明細書において想定されるＢＣＭＡ ＣＡＲを構築するのに好適である可変重鎖の例示的な例は、配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含むが、これに限定されない。本明細書において想定されるＢＣＭＡ ＣＡＲを構築するのに好適である可変軽鎖の例示的な例は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むが、これに限定されない。
本明細書に提供されるＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、１、２、３、４、５または６つのＣＤＲも含む。このようなＣＤＲは、軽鎖のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３、ならびに重鎖のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３から選択される非ヒトＣＤＲまたは変更された非ヒトＣＤＲであり得る。ある特定の実施形態では、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、（ａ）軽鎖ＣＤＲＬ１、軽鎖ＣＤＲＬ２、及び軽鎖ＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｂ）重鎖ＣＤＲＨ１、重鎖ＣＤＲＨ２、及び重鎖ＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む。
２．リンカー
ある特定の実施形態では、本明細書において想定されるＣＡＲは、様々なドメイン間に、例えば、分子の適切な間隔及び立体構造のために付加されたリンカー残基を含み得る。特定の実施形態では、リンカーは、可変領域連結配列である。「可変領域連結配列」は、得られるポリペプチドが、同じ軽鎖及び重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対して特異的結合親和性を保持するように、ＶＨ及びＶＬドメインを接続し、２つのサブ結合ドメインの相互作用と適合性のあるスペーサー機能を提供するアミノ酸配列である。本明細書において想定されるＣＡＲは、１、２、３、４、または５つ以上のリンカーを含み得る。特定の実施形態では、リンカーの長さは、約１〜約２５個のアミノ酸、約５〜約２０個のアミノ酸、もしくは約１０〜約２０個のアミノ酸、または任意の介在長さのアミノ酸である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個以上のアミノ酸長である。
リンカーの例示的な例は、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎ（ここで、ｎは少なくとも１、２、３、４、または５の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、及び当該技術分野において既知の他の柔軟なリンカーを含む。グリシン及びグリシン−セリンポリマーは、比較的構造不定であり、したがって、本明細書に記載されるＣＡＲなどの融合タンパク質のドメイン間の中性のテザーとして機能することが可能であり得る。グリシンはアラニンよりも非常に大きいファイ−プサイ空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりも大幅に制限が少ない（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ．１１１７３−１４２（１９９２）を参照されたい）。当業者は、特定の実施形態におけるＣＡＲの設計が、リンカーが所望のＣＡＲ構造を提供するために柔軟なリンカーならびにあまり柔軟ではない構造を付与する１つ以上の一部を含み得るように、全てまたは部分的に柔軟であるリンカーを含み得ることを認識するだろう。
他の例示的なリンカーは、限定されないが、以下のアミノ酸配列を含む：ＧＧＧ、ＤＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＴＧＥＫＰ（配列番号１３）（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ５５２５−５５３０（１９９７）を参照されたい）、ＧＧＲＲ（配列番号１４）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．１９９５、上記）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ここで、＝１、２、３、４、または５（配列番号１５）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９３，１１５６−１１６０（１９９６．）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号１６）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号１７）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号１８）、ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号１９）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号２０）、ＬＲＱＫｄ（ＧＧＧＳ）２ ＥＲＰ（配列番号２１）。代替的に、柔軟なリンカーは、ＤＮＡ結合部位及びペプチド自体の両方をモデル化することができるコンピュータプログラムを使用して（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ ９０：２２５６−２２６０（１９９３），ＰＮＡＳ ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４）、またはファージディスプレイ法により、合理的に設計され得る。一実施形態では、リンカーは、以下のアミノ酸配列を含む：ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号２２）（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１（４）：１６３７−１６４４（２００３））。
３．スペーサードメイン
特定の実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインは、適切な細胞／細胞接触、抗原結合、及び活性化を可能にするためにエフェクター細胞表面から離れて抗原結合ドメインを移動する領域を指す、１つ以上の「スペーサードメイン」が後に続く（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２−４１９）。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ある特定の実施形態では、スペーサードメインは、１つ以上の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２及びＣＨ３を含むがこれらに限定されない、免疫グロブリンの一部である。スペーサードメインは、天然に生じる免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
一実施形態では、スペーサードメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。
４．ヒンジドメイン
ＣＡＲの結合ドメインには一般に、適切な細胞／細胞接触、抗原結合、及び活性化を可能にするためにエフェクター細胞表面から離れて抗原結合ドメインを位置付ける機能を果たす、１つ以上の「ヒンジドメイン」が後に続く。ＣＡＲは一般に、結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）との間に１つ以上のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、天然に生じる免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
「変更されたヒンジ領域」は、（ａ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換または欠失）を有する天然に生じるヒンジ領域、（ｂ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換または欠失）を有する、長さが少なくとも１０個のアミノ酸（例えば、少なくとも１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸）である天然に生じるヒンジ領域の一部、または（ｃ）コアヒンジ領域（長さが、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個、または少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個のアミノ酸であり得る）を含む天然に生じるヒンジ領域の一部を指す。ある特定の実施形態では、天然に生じる免疫グロブリンヒンジ領域における１つ以上のシステイン残基は、１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、１つ以上のセリン残基）によって置換され得る。変更された免疫グロブリンヒンジ領域は、代替的にまたは追加的に、別のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）によって置換された野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基を有する。
本明細書に記載されるＣＡＲにおいて使用するのに好適な他の例示的なヒンジドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、及びＣＤ７などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域を含み、これは、これらの分子からの野生型ヒンジ領域であり得るか、または変更され得る。別の実施形態では、ヒンジドメインはＣＤ８αヒンジ領域を含む。
５．膜貫通（ＴＭ）ドメイン
「膜貫通ドメイン」は、細胞外結合部分及び細胞内シグナル伝達ドメインを融合し、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞の形質膜に固着させるＣＡＲの一部である。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１に由来し得る（すなわち、これらの少なくとも膜貫通領域（複数可）を含む）。特定の実施形態では、ＴＭドメインは合成であり、圧倒的に、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含む。
一実施形態では、本明細書において想定されるＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメインを含む。別の実施形態では、本明細書において想定されるＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメイン、及びＣＡＲのＴＭドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを連結する、好ましくは長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の間のアミノ酸の短いオリゴ−またはポリペプチドリンカーを含む。グリシン−セリンベースのリンカーは特に好適なリンカーを提供する。
６．細胞内シグナル伝達ドメイン
特定の実施形態では、本明細書において想定されるＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖、及び細胞傷害性活性（ＣＡＲ結合標的細胞への細胞傷害性因子の放出または細胞外ＣＡＲドメインに結合する抗原により引き起こされた他の細胞応答を含む）を引き起こすために、ヒトＢＣＭＡポリペプチドに結合する有効なＢＣＭＡ ＣＡＲのメッセージを、免疫エフェクター細胞の内部に伝達する際に関与するＣＡＲの一部を指す。
「エフェクター機能」という用語は、免疫エフェクター細胞の特殊機能を指す。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含む補助もしくは活性であり得る。よって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊機能を行うために細胞を指向するタンパク質の一部を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が採用され得るが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切り詰められた部分が使用される程度において、このような切り詰められた部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、ドメイン全体の代わりに使用され得る。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切り詰められた部分を含むことを意味する。
ＴＣＲのみを通して生成されたシグナルはＴ細胞の完全な活性化に不十分であり、二次または共刺激シグナルが必要とされることも既知である。よって、Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲを通した抗原依存性一次活性化を開始する一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）及び二次または共刺激シグナルを提供するように抗原依存様式で作用する共刺激シグナル伝達ドメインの、２つの別個のクラスの細胞内シグナル伝達ドメインにより媒介されると言うことができる。好ましい実施形態では、本明細書において想定されるＣＡＲは、１つ以上の「共刺激シグナル伝達ドメイン」及び「一次シグナル伝達ドメイン」を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一次シグナル伝達ドメインは、刺激方法または阻害方法のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激様式で作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られる、シグナル伝達モチーフを含有し得る。
本発明において特定の用途のものである一次シグナル伝達ドメインを含有するＩＴＡＭの例示的な例は、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものを含む。特定の好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内一次シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序で、タンデムで、膜貫通ドメインのカルボキシル末端に連結され得る。
本明細書において想定されるＣＡＲは、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性及び増幅を強化するために、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。共刺激分子は、抗原に結合するときにＴリンパ球の効率的な活性化及び機能に必要な二次シグナルを提供する抗原受容体またはＦｃ受容体以外の細胞表面分子である。このような共刺激分子の例示的な例としては、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０が挙げられる。一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、及びＣＤ１３４からなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８及びＣＤ１３７共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
また別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８及びＣＤ１３４共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１３７及びＣＤ１３４共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態では、本明細書において想定されるＣＡＲは、Ｂ細胞上に発現されたヒトＢＣＭＡポリペプチドに特異的に結合するマウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片を含む。
一実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１からなる群から選択される、ポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、ならびにＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される、共刺激分子からの１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからの一次シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、及びＣＤ８αヒンジからなる群から選択されるヒンジドメイン、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１からなる群から選択される、ポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、ならびにＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される、共刺激分子からの１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからの一次シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、及びＣＤ８αヒンジからなる群から選択されるヒンジドメイン、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１からなる群から選択される、ポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、ＣＡＲのＴＭドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結する、好ましくは長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の間のアミノ酸の短いオリゴ−またはポリペプチドリンカー、ならびにＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される、共刺激分子からの１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからの一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３ポリペプチド及びＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメイン、約３〜約１０個のアミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメイン、約３〜約１０個のアミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３４細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメイン、約３〜約１０個のアミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
更に、本明細書において想定されるＣＡＲの設計は、改変されていないＴ細胞または他のＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞と比較して、ＣＡＲを発現するＴ細胞における、増幅、長期持続性、及び許容される細胞傷害性の性質の改善を可能にする。
Ｄ．ポリペプチド
本発明は、一部、ＣＡＲポリペプチド及びその断片、ならびにそれを含む細胞及び組成物、ならびにポリペプチドを発現するベクターを想定する。好ましい実施形態では、配列番号９に記載される、１つ以上のＣＡＲを含むポリペプチドが提供される。
「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、反対が明記されない限り、交換可能に、及び従来の意味、すなわち、アミノ酸の配列として使用される。ポリペプチドは特定の長さに限定されず、例えば、それらは、完全長タンパク質配列または完全長タンパク質の断片を含み得、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに天然に生じる及び天然に生じない両方の、当該技術分野において既知の他の修飾を含み得る。様々な実施形態では、本明細書において想定されるＣＡＲポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（またはリーダー）配列を含み、これはタンパク質の移動を同時翻訳により、または翻訳後に指向する。本明細書に開示されるＣＡＲにおいて有用な好適なシグナル配列の例示的な例は、ＩｇＧ重鎖シグナル配列及びＣＤ８αシグナル配列を含むが、これらに限定されない。ポリペプチドは、様々な周知の組換え及び／または合成技法のいずれかを使用して調製され得る。本明細書において想定されるポリペプチドは、本開示のＣＡＲ、または本明細書に開示されるＣＡＲの１つ以上のアミノ酸からの欠失、それへの付加、及び／もしくはその置換を有する配列を包含する。
本明細書で使用される場合、「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、細胞環境からの、及び細胞の他の構成成分との会合からの（すなわち、インビボ物質と顕著に会合しない）ペプチドまたはポリペプチドのインビトロ単離及び／または精製を指す。同様に、「単離された細胞」は、インビボ組織または臓器から得られた細胞を指し、実質的に細胞外マトリックスを含まない。
ポリペプチドは「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、１つ以上の置換、欠失、付加、及び／または挿入において、天然に生じるポリペプチドとは異なり得る。このようなバリアントは、天然に生じ得るか、または例えば、上記のポリペプチド配列のうちの１つ以上を改変することにより、合成により生成され得る。例えば、特定の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドの結合ドメイン、ヒンジ、ＴＭドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、または一次シグナル伝達ドメインに、１つ以上の置換、欠失、付加、及び／または挿入を導入することにより、ＣＡＲの結合親和性及び／または他の生物学的性質を改善することが望ましい場合がある。好ましくは、本発明のポリペプチドは、それに少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
ポリペプチドは「ポリペプチド断片」を含む。ポリペプチド断片はポリペプチドを指し、これは、天然に生じるもしくは組換え産生ポリペプチドのアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、及び／もしくは内部欠失、または置換を有する、単量体または多量体であり得る。ある特定の実施形態では、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約５００個のアミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。ある特定の実施形態では、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０個のアミノ酸長であることを理解する。特に有用なポリペプチド断片は、抗体の抗原結合ドメインまたは断片を含む機能ドメインを含む。マウス抗ＢＣＭＡ抗体の場合では、有用な断片は、重鎖または軽鎖のＣＤＲ３領域であるＣＤＲ領域、重鎖または軽鎖の可変領域、抗体鎖の一部、または２つのＣＤＲを含む可変領域などを含むが、これらに限定されない。
ポリペプチドはまた、インフレームに融合されるか、またはポリペプチド（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）の合成、精製、もしくは特定を容易にするためのリンカーまたは他の配列に抱合される場合もある。
上記のように、本発明のポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切り詰め、及び挿入を含む、様々な方法で変更され得る。このような操作方法は当該技術分野において一般に既知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡにおける突然変異により調製され得る。突然変異誘発及びヌクレオチド配列の変更方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８−４９２）、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４： ３６７−３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）及びそれらの中で引用される参考文献を参照されたい。対象のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出すことができる。
ある特定の実施形態では、バリアントは、保存置換を含有する。「保存置換」とは、ペプチド化学分野における当業者がポリペプチドの二次構造及び疎水性／親水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）が実質的に変化しないことを予想するように、アミノ酸が類似する性質を有する別のアミノ酸に置換されるものである。改変は本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの構造において行われ、尚も望まし特性を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能分子を得ることができる。ポリペプチドのアミノ酸配列を変更して、本発明のポリペプチドと等価なまたは更には改善されたバリアントを創出することが所望される場合、当業者は、例えば、表１に従ってコードＤＮＡ配列のコドンのうちの１つ以上を変更することができる。
どのアミノ酸残基が生物学的活性を消失することなく置換、挿入、または欠失され得るかを決定するガイダンスは、ＤＮＡＳＴＡＲ（商標）ソフトウェアなどの当該技術分野において周知のコンピュータプログラムを使用して見出すことができる。好ましくは、本明細書に開示されるタンパク質バリアントにおけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、類似して荷電されたまたは未荷電のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖において関連するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を伴う。天然に生じるアミノ酸は一般に、酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び未荷電の極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）アミノ酸の４つのファミリーに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、時折、芳香族アミノ酸として一緒に分類される。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の好適な保存的置換は、本技術分野における当業者に既知であり、一般に、得られる分子の生物学的活性を変更することなく作製され得る。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が実質的に生物学的活性を変更しないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照されたい）。例示的な保存的置換は、米国仮特許出願第６１／２４１，６４７号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
このような変更を行う際、アミノ酸のハイドロパシー・インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｉｎｄｅｘ）が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際のハイドロパシーアミノ酸インデックスの重要性は当該技術分野において一般的に理解されている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２、参照により本明細書に組み込まれる）。各アミノ酸は、その疎水性及び荷電特性に基づいてハイドロパシー・インデックスを割り当てられている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。それらの値は、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／システイン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）及びアルギニン（−４．５）である。
ある特定のアミノ酸が、類似するハイドロパシー・インデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸により置換され、それでも類似する生物学的活性を有するタンパク質をもたらし得る、すなわち、それでも生物学機能的に等価なタンパク質が得られることは当該分野において既知である。このような変更を行う際に、ハイドロパシー・インデックスが±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものが更により特に好ましい。同様なアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的に行うことができることも当該分野において理解されている。
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アルパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は類似する親水性値を有する別のものに置換することができ、それでも生物学的に等価で、特に免疫学的に等価なタンパク質を得られることが理解される。このような変更の際に、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものが更により特に好ましい。
上に要約されるように、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどの相対的類似性に基づいてもよい。
ポリペプチドバリアントは、グリコシル化形態、他の分子との凝集性抱合体、及び無関係な化学部分（例えば、ペグ化分子）との共有結合抱合体を更に含む。共有結合バリアントは、当該技術分野において既知である、アミノ酸鎖に見出される基に、またはＮもしくはＣ末端残基で官能基を連結することにより調製され得る。バリアントは、対立遺伝子バリアント、種バリアント、及び変異タンパク質も含む。タンパク質の機能活性に影響を及ぼさない領域の切り詰めまたは欠失もバリアントである。
一実施形態では、２つ以上のポリペプチドの発現が所望される場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書の別の箇所で論じられるように、及びＩＲＥＳ配列によって分離され得る。別の実施形態では、２つ以上のポリペプチドは、１つ以上の自己切断型ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現され得る。
本発明のポリペプチドは融合ポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、融合ポリペプチド、及び融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＣＡＲが提供される。融合ポリペプチド及び融合タンパク質は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。融合ポリペプチドは典型的には、Ｃ末端がＮ末端に連結されるが、それらは、Ｃ末端がＣ末端に、Ｎ末端がＮ末端に、またはＮ末端がＣ末端にも連結され得る。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序で、または指定された順序であり得る。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質は、融合ポリペプチドの所望の転写活性が保存される限り、保存的に改変されたバリアント、多型性バリアント、対立遺伝子、変異体、サブ配列、及び種間相同体も含み得る。融合ポリペプチドは、化学合成方法もしくは２つの部分間の化学連結により産生され得るか、または他の標準的な技法を使用して一般的に調製され得る。融合ポリペプチドを含む連結されたＤＮＡ配列は、本明細書の別の箇所で論じられるように、好適な転写または翻訳制御要素に動作可能に連結される。
一実施形態では、融合パートナーは、未変性組換えタンパク質よりも高い収率でタンパク質の発現を補助する配列（発現エンハンサー）を含む。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解度を増加させるように、またはタンパク質が所望の細胞内区画を標的とする、もしくは細胞膜を通した融合タンパク質の輸送を容易にすることができるように選択され得る。
融合ポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドドメインの各々の間にポリペプチド切断シグナルを更に含み得る。加えて、ポリペプチド部位は、任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。例示的なポリペプチド切断シグナルは、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、稀な制限酵素認識部位、自己切断型リボザイム認識部位）、及び自己切断型ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位を含む（ｄｅＦｅｌｉｐｅ ａｎｄ Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６−２６を参照されたい）。
好適なプロテアーゼ切断部位及び自己切断型ペプチドは当業者に既知である（例えば、Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９−７２２、Ｓｃｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９−５９４を参照されたい）。例示的なプロテアーゼ切断部位は、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルスＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ−２コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロ球状ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、因子Ｘａ、及びエンテロキナーゼを含むが、これらに限定されない。その高い切断厳密性により、ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）プロテアーゼ切断部位、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号２３）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号２４）、及びＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号２５）（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表す（ＴＥＶによる切断がＱとＧまたはＱとＳとの間で生じる）が一実施形態において好ましい。
特定の実施形態では、自己切断型ペプチドは、ポティウイルス及びカルジオウイルス２Ａペプチド、ＦＭＤＶ（口蹄疫ウイルス）、ウマ鼻炎Ａウイルス、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス、及びブタテシオウイルスから得られたこれらのポリペプチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、自己切断型ポリペプチド部位は、２Ａもしくは２Ａ様部位、配列、またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。
好ましい実施形態では、本明細書において想定されるポリペプチドはＣＡＲポリペプチドを含む。
Ｅ．ポリヌクレオチド
好ましい実施形態では、１つ以上のＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号１０が提供される。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、＋鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、−鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、または組換えＤＮＡを指す。ポリヌクレオチドは、１本鎖及び２本鎖ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、典型的には、バリアントが参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を維持する、本明細書に記載される参照配列のいずれか（例えば、配列表を参照されたい）に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはバリアントを含む。様々な例示的な実施形態では、本発明は、一部、発現ベクター、ウイルスベクター、及び伝達性プラスミドを含むポリヌクレオチド、ならびにそれを含む組成物及び細胞を想定する。
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドの少なくとも約５、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、または２０００個以上の隣接アミノ酸残基、ならびに全ての中間の長さをコードするポリヌクレオチドが本発明によって提供される。本文脈における「中間の長さ」は、６、７、８、９等、１０１、１０２、１０３等、１５１、１５２、１５３等、２０１、２０２、２０３等、引用符で囲まれた値間の任意の長さを意味することは容易に理解される。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」及び「バリアント」などの用語は、下文に定義される厳密な条件下で参照配列とハイブリダイズする参照ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドと実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、１つ以上のヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドと比較して、付加されたかもしくは欠失された、または異なるヌクレオチドに置き換えられたポリヌクレオチドを含む。この点において、突然変異、付加、欠失、及び置換を含むある特定の変更は、参照ポリヌクレオチドに対して行われ得、それにより変更されたポリヌクレオチドは参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することは十分に理解されている。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」または例えば、「に対して５０％同一の配列」を含む記述は、配列が、比較枠にわたってヌクレオチド単位基準でまたはアミノ酸単位基準で同一である程度を指す。よって、「配列同一性の割合」は、比較枠にわたって２つの最適にアライメントされた配列を比較すること、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、及びＭｅｔ）が両方の配列で生じる位置数を決定して対応位置数を得ること、比較枠の総位置数（すなわち、枠のサイズ）で対応位置数を除すること、及びその結果を１００で乗じて配列同一性の割合を得ることにより計算され得る。典型的には、ポリペプチドバリアントが参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を維持する、本明細書に記載される参照配列のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド及びポリペプチドが含まれる。
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語は、「参照配列」、「比較枠」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、及び「実質的な同一性」を含む。「参照配列」は、ヌクレオチド及びアミノ酸残基を含めて、長さが少なくとも１２だが、頻繁に１５〜１８、多くの場合少なくとも２５の単量体単位である。２つのポリヌクレオチドは、各々、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）及び（２）２つのポリヌクレオチド間で多様である配列を含み得るため、２つ（以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は典型的には、「比較枠」にわたって２つのポリヌクレオチドの配列を比較して、配列類似性の局所的な領域を特定及び比較することにより行われる。「比較枠」は、２つの配列が最適にアライメントされた後に、ある配列が同じ数の隣接位置の参照配列と比較される、少なくとも６つの隣接位置、一般的には約５０〜約１００、より一般的には約１００〜約１５０の概念的セグメントを指す。比較枠は、２つの配列の最適なアライメントの参照配列（付加または欠失を含まない）と比較したとき、約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較枠をアライメントするための配列の最適なアライメントは、コンピュータ化されたアルゴリズムの実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）により、または調査及び選択された様々な方法のいずれかによって生成された最良のアライメント（すなわち、比較枠にわたって最高率の相同性をもたらす）により実施され得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９により開示されるプログラムのＢＬＡＳＴファミリーも参照されたい。配列分析の詳細な議論は、Ｕｎｉｔ １９．３ ｏｆ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ，１９９４−１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ１５に見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に生じる状態においてそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、断片に通常隣接する配列から除去されたＤＮＡ断片を指す。「単離されたポリヌクレオチド」は、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えＤＮＡ、または自然界に存在せず、人の手によって作製された他のポリヌクレオチドも指す。
ポリヌクレオチドの配向を説明する用語は、５’（通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）及び３’（通常、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）を含む。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’配向または３’から５’配向で注釈が付けられ得る。ＤＮＡ及びｍＲＮＡに関して、５’から３’鎖は、その配列がプレメッセンジャー（ｐｒｅｍＲＮＡ）の配列と同一であるため［ＤＮＡのチミン（Ｔ）の代わりに、ＲＮＡのウラシル（Ｕ）を除く］、「センス」、「＋」、または「コード」鎖と呼ばれる。ＤＮＡ及びｍＲＮＡに関して、ＲＮＡポリメラーゼにより転写された鎖である相補３’から５’鎖は、「テンプレート」、「アンチセンス」、「−」、または「非コード」鎖と呼ばれる。本明細書で使用される場合、「逆配向」という用語は、３’から５’配向で書かれた５’から３’配列、または５’から３’配向で書かれた３’から５’配列を指す。
「相補的」及び「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関係が表されるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’Ａ Ｇ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ ３’の相補鎖は３’Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ｔ Ａ Ｃ ５’である。後者の配列は、左側に５’端、そして右側に３’端の５’Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ Ｔ ３’の逆相補として書かれることが多い。その逆相補と等しい配列は、パリンドローム配列と言われる。相補性は「部分的」であり、核酸の塩基のうちのいくつかのみが塩基対合規則に従い一致する。または、核酸間で「完全な」もしくは「全」相補性が存在し得る。
更に、遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書に記載されるように、ポリペプチドまたはそのバリアントの断片をコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが当業者によって理解される。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の未変性遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用における相違により変動するポリヌクレオチド、例えば、ヒト及び／または霊長類コドン選択に最適化されるポリヌクレオチドは、本発明により具体的に想定される。更に、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子も使用され得る。対立遺伝子は、１つ以上の突然変異、例えば、ヌクレオチドの欠失、付加、及び／または置換などの結果として変更される内在性遺伝子である。
本明細書で使用される場合、「核酸カセット」という用語は、ＲＮＡ及び後にタンパク質を発現するベクター内の遺伝子配列を指す。核酸カセットは、対象の遺伝子、例えば、ＣＡＲを含有する。核酸カセットは、カセット内の核酸がＲＮＡに転写され、必要な場合、タンパク質またはポリペプチドに翻訳され、形質転換された細胞における活性に必要とされる適切な翻訳後修飾を受け、適切な細胞内区画を標的とすること、または細胞内区画への分泌により、生物学的活性のために適切な区画に転座され得るように、ベクター内に、位置的にかつ順次配向される。好ましくは、カセットは、ベクター内への容易な挿入に適合されたその３’端及び５’端を有し、例えば、それは各端に制限エンドンヌクレアーゼ部位を有する。本発明の好ましい実施形態では、核酸カセットは、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療するために使用されるキメラ抗原受容体の配列を含有する。カセットは除去され、単一単位としてプラスミドまたはウイルスベクター内に挿入される。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの対象のポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「対象のポリヌクレオチド」という用語は、発現されることが所望される発現ベクター内に挿入される、ポリペプチド（すなわち、対象のポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを指す。ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の対象のポリヌクレオチドを含み得る。ある特定の実施形態では、対象のポリヌクレオチドは、疾患または障害の治療または予防に治療効果を提供するポリペプチドをコードする。対象のポリヌクレオチド及びそこからコードされたポリペプチドは、野生型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにその機能バリアント及び断片の両方を含む。特定の実施形態では、機能バリアントは、対応する野生型参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、機能バリアントまたは断片は、対応する野生型ポリペプチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の生物学的活性を有する。
一実施形態では、対象のポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードしないが、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、リボザイム、または他の阻害性ＲＮＡを転写するためのテンプレートとして機能する。様々な他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＡＲをコードする対象のポリヌクレオチド、ならびに限定されないが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びリボザイムを含む、限定されないが、阻害性核酸配列を含む、１つ以上の追加の対象のポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」または「短鎖干渉ＲＮＡ」という用語は、動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、またはエピジェネティックＲＮＡｉのプロセスを媒介する短いポリヌクレオチド配列を指す（Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３、Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９５０−９５１、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，４０２，１２８−１２９、Ｓｈａｒｐ，１９９９，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．，１３，１３９−１４１及びＳｔｒａｕｓｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，８８６）。ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、同じ数のヌクレオシドを有する第１の鎖及び第２の鎖を含むが、第１及び第２の鎖は、第１及び第２の鎖上の２つの末端ヌクレオシドが相補鎖上の残基と対合しないように相殺される。ある特定の実施形態では、対合されない２つのヌクレオシドはチミジン残基である。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡまたはその断片が標的遺伝子の下方調節を媒介することができるように、標的遺伝子に対して十分な相同性の領域を含み、ヌクレオチドに関して十分な長さのものであるべきである。よって、ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である領域を含む。ｓｉＲＮＡと標的との間に完全な相補性が存在する必要はないが、その対応は、ｓｉＲＮＡまたはその切断産物が、標的ＲＮＡのＲＮＡｉ切断などにより配列特異的サイレンシングを指向することができるのに十分でなければならない。標的鎖との相補性または相同性の程度は、アンチセンス鎖において最も重要である。特にアンチセンス鎖における完全な相補性は所望されることが多いが、いくつかの実施形態は、標的ＲＮＡに対して、１つ以上だが、好ましくは１０、８、６、５、４、３、２以下のミスマッチを含む。ミスマッチは、末端領域において最も許容され、存在する場合、好ましくは、末端領域、または例えば、５’及び／もしくは３’末端の６、５、４、または３ヌクレオチド以内の領域にある。センス鎖は、分子の全体的な２本鎖の特徴を維持するために、アンチセンス鎖と十分に相補的である必要があるのみである。
加えて、ｓｉＲＮＡは、改変されるか、またはヌクレオシド類似体を含み得る。ｓｉＲＮＡの単鎖領域は、改変されるか、またはヌクレオシド類似体、例えば、不対の領域もしくはヘアピン構造の領域を含み得、例えば、２つの相補領域を連結する領域は、改変またはヌクレオシド類似体を有し得る。例えば、エキソヌクレアーゼに対してｓｉＲＮＡの１つ以上の３’もしくは５’末端を安定させるため、またはＲＩＳＣ内に侵入するためにアンチセンスｓｉＲＮＡ物質を優先するための改変も有用である。改変は、Ｃ３（またはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサー（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、脱塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、特別なビオチン、またはホスホルアミダイトをもたらし、別のＤＭＴ保護されたヒドロキシル基を有し、ＲＮＡ合成中に多数のカップリングを可能にするフルオロセイン試薬を含み得る。ｓｉＲＮＡの各鎖は、長さが３０、２５、２４、２３、２２、２１、または２０ヌクレオチド以下であり得る。鎖は、好ましくは、長さが少なくとも１９ヌクレオチドである。例えば、各鎖は、長さが２１〜２５ヌクレオチドであり得る。好ましいｓｉＲＮＡは、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド対の二本鎖領域、及び２〜３ヌクレオチドの１つ以上のオーバーハング、好ましくは２〜３ヌクレオチドの１または２つの３’オーバーハングを有する。
本明細書で使用される「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」という用語は、２０〜２２ヌクレオチド、典型的には、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして知られる、約７０ヌクレオチドホールドバックＲＮＡ前駆体構造から切り取られた、小さい非コードＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡと標的との間の相補性の程度により、２つの方法のうちの１つでそれらの標的を負に調節する。第１に、タンパク質コードｍＲＮＡ配列に完全なまたはほぼ完全な相補性で結合するｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘発する。それらのｍＲＮＡ標的の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内の不完全な相補部位に結合することによりそれらの調節作用を及ぼすｍｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路に使用されるものに類似する、またはそれとおそらく同一であるＲＩＳＣ複合体を通して、見かけ上は翻訳のレベルで、翻訳後に標的遺伝子発現を抑制する。翻訳制御と一致して、この仕組みを使用するｍｉＲＮＡは、それらの標的遺伝子のタンパク質レベルを減少させるが、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルは、最小限にしか影響されない。ｍｉＲＮＡは、天然に生じるｍｉＲＮＡ、ならびに任意のｍＲＮＡ配列を特異的に標的とし得る人工的に設計されたｍｉＲＮＡの両方を包含する。例えば、一実施形態では、当業者は、ヒトｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−３０またはｍｉＲ−２１）一次転写物として発現される短いヘアピンＲＮＡ構築物を設計することができる。この設計は、ドローシャプロセシング部位をヘアピン構築物に付加し、ノックダウン効率を大幅に増加させることが示された（Ｐｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ヘアピンステムは、２２−ｎｔのｄｓＲＮＡ（例えば、アンチセンスは所望の標的に完全な相補性を有する）及びヒトｍｉＲからの１５〜１９−ｎｔのループからなる。ヘアピンの片側または両側上へのｍｉＲループ及びｍｉＲ３０フランキング配列の付加は、マイクロＲＮＡなしの従来のｓｈＲＮＡ設計と比較したとき、発現されたヘアピンのドローシャ及びダイサープロセシングにおいて１０倍超の増加をもたらす。ドローシャ及びダイサープロセシングの増加は、発現されたヘアピンのより高いｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ産生及びより大きな力価へと変換される。
本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ」または「短いヘアピンＲＮＡ」という用語は、単一の自己相補的ＲＮＡ鎖によって形成される二本鎖構造を指す。標的遺伝子のコードまたは非コード配列のいずれかの一部と同一のヌクレオチド配列を含有するｓｈＲＮＡ構築物は、阻害に好ましい。標的配列に対して挿入、欠失、及び一点突然変異を有するＲＮＡ配列も阻害に有効であることが見出された。阻害性ＲＮＡと標的遺伝子の一部との間で、９０％超の配列同一性、または更には１００％の配列同一性が好ましい。ある特定の好ましい実施形態では、ｓｈＲＮＡの二本鎖形成部分の長さは、例えば、サイズがダイサー依存切断により産生されたＲＮＡ産物に相当する、長さが少なくとも２０、２１、または２２ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡ構築物は、長さが少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、または４００塩基である。ある特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡ構築物は、長さが４００〜８００塩基である。ｓｈＲＮＡ構築物は、ループ配列及びループサイズの変化に非常に耐性がある。
本明細書で使用される場合、「リボザイム」という用語は、標的ｍＲＮＡの部位特異的切断を可能にする、触媒的に活性なＲＮＡ分子を指す。いくつかのサブタイプ、例えば、ハンマーヘッド型及びヘアピン型リボザイムが説明されてきた。リボザイム触媒活性及び安定性は、非触媒性塩基でデオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドに置換することにより改善され得る。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムが特定のｍＲＮＡを破壊するために使用され得るが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成するフランキング領域により指示された位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが２つの塩基の配列：５′−ＵＧ−３′を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築及び産生は当該技術分野において周知である。
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはリボザイムを含む対象のポリヌクレオチドを送達する好ましい方法は、本明細書の別の箇所に記載されるように、例えば、強い構成的ｐｏｌ ＩＩＩ、例えば、ヒトＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーター、マウスＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒト及びマウスＨ１ ＲＮＡプロモーター、ならびにヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーター、または強い構成的ｐｏｌ ＩＩプロモーターなど、１つ以上の調節配列を含む。
本発明のポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、本明細書の別の箇所で開示されるか、または当該技術分野において既知であるように、プロモーター及び／またはエンハンサー、未翻訳領域（ＵＴＲ）、シグナル配列、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、リボソーム内部侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、及びＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終止シグナル、及びポリヌクレオチドコード自己切断型ポリペプチド、エピトープタグなどの他のＤＮＡ配列と組み合わされ得、それによりそれらの全体的な長さが大幅に変動し得る。したがって、ほぼ全ての長さのポリヌクレオチド断片を採用することができ、合計の長さは、好ましくは、調製の容易さ及び意図される組換えＤＮＡプロトコルの使用により制限されることが想定される。
ポリヌクレオチドは、当該技術分野において既知の及び利用可能な様々な十分に確立された技法のいずれかを使用して調製、操作及び／または発現され得る。所望のポリペプチドを発現するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が適切なベクターに挿入され得る。ベクターの例は、プラスミド、自律複製配列、及び転位要素である。追加の例示的なベクターは、限定されないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１誘導人工染色体（ＰＡＣ）など、バクテリオファージ、例えば、ラムダファージまたはＭ１３ファージ、及び動物ウイルスを含む。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例としては、限定されないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。発現ベクターの例は、哺乳類細胞における発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、哺乳類細胞におけるレンチウイルス媒介遺伝子導入及び発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、及びｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。特定の実施形態では、本明細書に開示されるキメラタンパク質のｈｅコード配列が、哺乳類細胞におけるキメラタンパク質の発現のためのこのような発現ベクターに連結され得る。
一実施形態では、本明細書において想定されるＣＡＲをコードするベクターは、配列番号３６に記載される、ポリヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、ベクターは、エピソームベクター、または染色体外に維持されるベクターである。本明細書で使用される場合、「エピソーム」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡ内に組み込むことなしに、及び宿主細胞の分裂により徐々に失われることなく複製することができるベクターを指し、該ベクターは染色体外またはエピソームで複製することも意味する。ベクターは、リンパ増殖性ヘルペスウイルスもしくはガンマヘルペスウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、または酵母からのＤＮＡ複製の起源もしくは「ｏｒｉ」、具体的にはＥＢＶのｏｒｉＰに対応するリンパ増殖性ヘルペスウイルスもしくはガンマヘルペスウイルスの複製起源をコードする配列を保有するように操作される。特定の態様では、リンパ増殖性ヘルペスウイルスは、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、サルヘルペスウイルス（ＨＳ）、またはマレック病ウイルス（ＭＤＶ）であり得る。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）及びカポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）は、ガンマヘルペスウイルスの例でもある。典型的には、宿主細胞は、複製を活性化するウイルス複製トランス活性化因子タンパク質を含む。
発現ベクターに存在する「制御要素」または「調節配列」は、転写及び翻訳を実行するために宿主細胞タンパク質と相互作用する、複製のベクター起源のそれらの非翻訳領域、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャイン・ダルガノ配列またはコザック配列）イントロン、ポリアデニル化配列、５’及び３’非翻訳領域である。このような要素は、それらの強度及び特異性が異なる。利用されるベクター系及び宿主により、任意の数の好適な転写及び翻訳要素（遍在性プロモーター及び誘導性プロモーターを含む）を使用することができる。
特定の実施形態では、限定されないが、発現ベクター及びウイルスベクターを含む、本発明を実施する際に使用するためのベクターは、プロモーター及び／またはエンハンサーなどの外因性、内因性、または異種制御配列を含む。「内因性」制御配列は、ゲノムにおいて所与の遺伝子と自然に連結するものである。「外因性」制御配列は、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターにより指向されるように、遺伝子操作の手段（すなわち、分子生物学的技法）により遺伝子と並立に配置されるものである。「異種」制御配列は、遺伝子操作された細胞とは異なる種からの外因性配列である。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに動作可能に連結されたポリヌクレオチドを開始及び転写する。特定の実施形態では、哺乳類細胞において動作可能なプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴ豊富領域、及び／またはＮが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域の、転写の開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列を含む。
「エンハンサー」という用語は、強化された転写を提供することができ、ある場合では、別の制御配列に対するそれらの配向に関係なく機能することができる配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーター及び／もしくは他のエンハンサー要素と協同的または追加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター及びエンハンサー両方の機能を提供することができる配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。
「動作可能に連結される」という用語は、記載される構成要素が、それらがそれらの意図される様式で機能することを可能にする関係にある並立を指す。一実施形態では、本用語は、発現制御配列が第２の配列に対応する核酸の転写を指向する、核酸発現制御配列（プロモーター及び／またはエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、対象のポリヌクレオチドとの間の機能的連結を指す。
本明細書で使用される場合、「構成的発現制御配列」という用語は、動作可能に連結された配列の転写を継続的または連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、それぞれ、多種多様な細胞及び組織型における発現を可能にする「遍在性」プロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサー、または限定された様々な細胞及び組織型における発現を可能にする「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系列特異的」、もしくは「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであり得る。
本発明の特定の実施形態において使用するのに好適な例示的な遍在性発現制御配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルス性サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルスからのＨ５、Ｐ７．５及びＰ１１プロモーター、伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期成長応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータメンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ ２６座位（Ｉｒｉｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５，１４７７−１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、ならびに骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：７４８−５５（１９９５））を含むが、これらに限定されない。
一実施形態では、本発明のベクターはＭＮＤプロモーターを含む。
一実施形態では、本発明のベクターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の第１イントロンを含むＥＦ１ａプロモーターを含む。
一実施形態では、本発明のベクターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の第１イントロンを欠くＥＦ１ａプロモーターを含む。
特定の実施形態では、Ｔ細胞特異的プロモーターからのＣＡＲを含むポリヌクレオチドを発現することが望ましい場合がある。
本明細書で使用される場合、「条件付き発現」は、限定されないが、誘導性発現、抑制性発現、特定の生理学的、生物学的、もしくは疾患状態等を有する細胞または組織における発現を含む、任意の種類の条件付き発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織特異的発現を除外することを意図しない。本発明のある特定の実施形態は、対象のポリヌクレオチドの条件付き発現を提供し、例えば、発現は、細胞、組織、生物等を、ポリヌクレオチドを発現させる、または対象のポリヌクレオチドによってコードされたポリヌクレオチドの発現に増加もしくは低減をもたらす治療または条件に曝すことにより制御される。
誘導性プロモーター／系の例示的な例としては、グリココルチコイドもしくはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーターなどのステロイド誘導性プロモーター（対応するホルモンでの処理により誘導可能）、メタロチオニンプロモーター（様々な重金属での処理により誘導可能）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンにより誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン調節可能な系（Ｓｉｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クミン酸誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存調節系等が挙げられるが、これらに限定されない。
条件付き発現は、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによっても達成され得る。本発明のある特定の実施形態によると、ベクターは、部位特異的リコンビナーゼにより媒介される組換えのための、少なくとも１つ（典型的には２つ）の部位（複数可）を含む。本明細書で使用される場合、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、野生型タンパク質であり得る、１つ以上の組換え部位（例えば、２、３、４、５、７、１０、１２、１５、２０、３０、５０等）を伴う組換え反応に関与する、切除もしくは組み込みタンパク質、酵素、補助因子、または関連タンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９−７０７（１９９３）を参照されたい）、またはその変異体、誘導体（例えば組換えタンパク質配列を含有する融合タンパク質またはその断片）、断片、及びバリアントを含む。本発明の特定の実施形態において使用するのに好適なリコンビナーゼの例示的な例としては、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、及びＰａｒＡが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターは、多種多様の部位特異的リコンビナーゼのいずれかのための１つ以上の組換え部位を含み得る。部位特異的リコンビナーゼのための標的部位は、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組み込みに必要とされる任意の部位（複数可）に加えてであることを理解されたい。本明細書で使用される場合、「組換え配列」、「組換え部位」、または「部位特異的組換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識及び結合する特定の核酸配列を指す。
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの１つの組換え部位は、８塩基対コア配列に隣接する２つの１３塩基対逆方向反復を含む（リコンビナーゼ結合部位として機能する）３４塩基対配列であるｌｏｘＰである（例えば、Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：５２１−５２７（１９９４）の図１を参照されたい）。他の例示的なｌｏｘＰ部位は、ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｂｅｔｈｋｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９９７）、ｌｏｘ５１７１（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｌｏｘ２２７２（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、及びｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５）を含むが、これらに限定されない。
ＦＬＰリコンビナーゼに好適な認識部位は、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９６）、Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３（Ｓｃｈｌａｋｅ ａｎｄ Ｂｏｄｅ，１９９４）、Ｆ４，Ｆ５（Ｓｃｈｌａｋｅ ａｎｄ Ｂｏｄｅ，１９９４）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９８８）を含むが、これらに限定されない。
認識配列の他の例は、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えば、ファイ−ｃ３１により認識される、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、及びａｔｔＲ配列である。φＣ３１ ＳＳＲは、異型部位ａｔｔＢ（長さが３４ｂｐ）とａｔｔＰ（長さが３９ｂ）との間の組換えのみを媒介する（Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）。それぞれ、細菌及びファージゲノム上のファージインテグラーゼの結合部位に名前が由来するａｔｔＢ及びａｔｔＰは両方とも、φＣ３１ホモ二量体により結合される可能性がある不完全な逆方向反復を含入する（Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）。産生部位であるａｔｔＬ及びａｔｔＲは、φＣ３１媒介組換えを進めるために（Ｂｅｌｔｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）、効果的に不活性であり、反応を不可逆にする。挿入を触媒するために、ａｔｔＢ保有ＤＮＡが、ａｔｔＰ部位をゲノムａｔｔＢ部位に挿入するよりも容易にゲノムａｔｔＰ部位内に容易に挿入されることが分かった（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｂｅｌｔｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。よって、典型的な戦略は、相同組換えにより、ａｔｔＰ保有「ドッキング部位」を、定義された座位に位置付け、次に、挿入のためにこれをａｔｔＢ保有入来配列と組み合わせる。
本明細書で使用される場合、「リボソーム内部侵入部位」または「ＩＲＥＳ」は、シストロンのＡＴＧなど（タンパク質コード領域）、開始コドンへの直接的なリボソーム内部侵入を促進し、それにより遺伝子のｃａｐ非依存性翻訳をもたらす要素を指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７−８３）及びＪａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｋａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ １（１０）：９８５−１０００を参照されたい。特定の実施形態では、本発明により想定されるベクターは、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の対象のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、複数のポリペプチドの各々の効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、１つ以上のＩＲＥＳ配列または自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって分離され得る。
本明細書で使用される場合、「コザック配列」という用語は、リボソームの小さいサブ単位へのｍＲＮＡの初期結合を大幅に容易にし、翻訳を増加させる、短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスコザック配列は（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧであり、ここでＲは、プリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ，１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３−９２及びＫｏｚａｋ，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５−４８）。特定の実施形態では、本明細書において想定されるベクターは、コンセンサスコザック配列を有し、所望のポリペプチド、例えば、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。
本発明のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを保有する細胞は、直接的な毒性及び／または未制御の増殖のリスクを減少させるための誘導性自殺遺伝子を含む、自殺遺伝子を利用する。特定の態様では、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドを保有する宿主または細胞に対して免疫原性ではない。使用され得る自殺遺伝子のある特定の例は、カスパーゼ−９もしくはカスパーゼ−８、またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ−９は、二量体化の特定の化学誘導物資（ＣＩＤ）を使用して活性化され得る。
ある特定の実施形態では、ベクターは、本発明の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞に、インビボでの負の選択を受けやすくさせる遺伝子セグメントを含む。「負の選択」とは、注入された細胞が、個々のインビボ条件における変化の結果として排除され得ることを意味する。負の選択可能表現型は、投与された薬剤、例えば、化合物に対して感受性を付与する遺伝子の挿入により生じ得る。負の選択可能遺伝子は当該技術分野において既知であり、とりわけ、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｉ ＴＫ）遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１：２２３，１９７７）、細胞ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、及び細菌シトシンデアミナーゼを含む（Ｍｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：３３（１９９２））。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞などの遺伝子改変免疫エフェクター細胞は、インビトロでの負の選択可能表現型の細胞の選択を可能にする正のマーカーを更に含むポリヌクレオチドを含む。正の選択マーカーは、宿主細胞内に導入されたときに、遺伝子を有する細胞の正の選択を可能にする優性の表現型を発現する遺伝子であり得る。この種類の遺伝子は当該技術分野において既知であり、とりわけ、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５からのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、及び多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子を含む。
好ましくは、正の選択マーカー及び負の選択可能要素は、負の選択可能要素の損失が正の選択マーカーの損失も必然的に伴うように連結される。更により好ましくは、正及び負の選択マーカーは、一方の損失が義務的に他方の損失につながるように融合される。上述の所望の正及び負両方の選択特徴を付与するポリペプチドを発現産物としてもたらす融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）である。この遺伝子の発現は、インビトロでの正の選択のためのハイグロマイシンＢ耐性、及びインビボでの負の選択のためのガンシクロビル感受性を付与するポリペプチドをもたらす。例えば、Ｌｕｐｔｏｎ Ｓ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ １ １：３３７４−３３７８，１９９１を参照されたい。加えて、好ましい実施形態では、キメラ受容体をコードする本発明のポリヌクレオチドは、融合遺伝子、特にインビトロでの正の選択のためのハイグロマイシンＢ耐性、及びインビボでの負の選択のためのガンシクロビル感受性を付与するものを含有するレトロウイルスベクター、例えば、上記のＬｕｐｔｏｎ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）に記載されるＨｙＴＫレトロウイルスベクターに存在する。優性の正の選択マーカーと負の選択マーカーとの融合に由来する二機能性選択可能融合遺伝子の使用を説明する、Ｓ．Ｄ．ＬｕｐｔｏｎによるＰＣＴ ＵＳ９１／０８４４２及びＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１の刊行物も参照されたい。
好ましい正の選択マーカーは、ｈｐｈ、ｎｃｏ、及びｇｐｔからなる群から選択された遺伝子に由来し、好ましい負の選択マーカーは、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−Ｉ ＴＫ、ＶＺＶ ＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴ、及びｇｐｔからなる群から選択された遺伝子に由来する。特に好ましいマーカーは、二機能性選択可能融合遺伝子であり、正の選択マーカーは、ｈｐｈ、またはｎｅｏに由来し、負の選択マーカーは、シトシンデアミナーゼもしくはＴＫ遺伝子、または選択マーカーに由来する。誘導性自殺遺伝子。
Ｆ．ウイルスベクター
特定の実施形態では、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）は、ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターで形質導入される。例えば、免疫エフェクター細胞は、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、Ｏｘ４０、またはこれらの任意の組み合わせの細胞内シグナル伝達ドメインを有する、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片を含むＣＡＲをコードするベクターで形質導入される。よって、これらの形質導入された細胞は、ＣＡＲ媒介細胞傷害性応答を引き起こすことができる。
レトロウイルスは遺伝子送達の標準的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ．３５７：４５５−４６０）。特定の実施形態では、レトロウイルスは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用される。本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖状二本鎖ＤＮＡのコピーに逆転写し、後にそのゲノムＤＮＡを宿主ゲノム内に共有結合的に組み込むＲＮＡウイルスを指す。ウイルスが宿主ゲノム内に組み込まれたら、それは「プロウイルス」と称される。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのテンプレートとして機能し、新しいウイルス粒子を産生するために必要な構造タンパク質及び酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を指向する。
特定の実施形態において使用するのに好適な例示的なレトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））、ならびにレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（または族）を指す。例示的なレンチウイルスは、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型及びＨＩＶ２型を含む）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、ＨＩＶベースのベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作動性配列要素）が好ましい。特定の実施形態では、レンチウイルスは、ＣＡＲを含むポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用される。
レトロウイルス、及びより具体的にはレンチウイルスベクターは、本発明の特定の実施形態を実施する際に使用され得る。したがって、本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」または「レトロウイルスベクター」という用語は、それぞれ、「レンチウイルス」及び「レンチウイルスベクター」を含むことを意味する。
「ベクター」という用語は、別の核酸分子を移動または輸送することができる核酸分子を指す。移動された核酸は一般に、ベクター核酸分子に連結、例えば、挿入される。ベクターは細胞に自律複製を指向する配列を含み得るか、または宿主細胞ＤＮＡ内への組み込みを可能にするのに十分な配列を含み得る。有用なベクターは、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、及びウイルスベクターを含む。有用なウイルスベクターは、例えば、複製欠損レトロウイルス及びレンチウイルスを含む。
当業者には明らかであるように、「ウイルスベクター」という用語は、典型的には核酸分子の移動もしくは細胞のゲノム内への組み込みを容易にするウイルス由来核酸要素を含む核酸分子（例えば、伝達性プラスミド）、または核酸移動を媒介するウイルス粒子のいずれかを指すように広く使用される。ウイルス粒子は典型的には、様々なウイルス構成成分、及び時折、核酸（複数可）に加えて、宿主細胞の構成成分も含む。
ウイルスベクターという用語は、核酸を細胞内に移動することができるウイルスもしくはウイルス粒子、または移動された核酸自体のいずれかを指し得る。様々なベクター及び伝達性プラスミドは、主にウイルスに由来する構造的及び／または機能的遺伝要素を含有する。「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する、構造的及び機能的遺伝要素もしくはその一部を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲを含む、構造的及び機能的遺伝要素もしくはその一部を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「ハイブリッドベクター」という用語は、レトロウイルス配列、例えば、レンチウイルス配列及び非レンチウイルスのウイルス配列の両方を含有するベクター、ＬＴＲ、または他の核酸を指す。一実施形態では、ハイブリッドベクターは、逆転写、複製、組み込み、及び／またはパッケージングのためのレトロウイルス配列、例えば、レンチウイルス配列を含むベクターまたは伝達性プラスミドを指す。
特定の実施形態では、「レンチウイルスベクター」、「レンチウイルス発現ベクター」という用語は、レンチウイルス伝達性プラスミド及び／または感染性レンチウイルス粒子を指すように使用され得る。本明細書において、クローニング部位、プロモーター、調節要素、異種核酸等の要素に対して参照される場合、これらの要素の配列がＲＮＡ形態で本発明のレンチウイルス粒子に存在し、ＤＮＡの形態で本発明のＤＮＡプラスミドに存在することを理解されたい。
プロウイルスの各末端での構造は「長い末端反復」または「ＬＴＲ」と呼ばれる。「長い末端反復（ＬＴＲ）」という用語は、それらの天然の配列関係において、直接反復であり、Ｕ３、Ｒ、及びＵ５領域を含有するレトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指す。ＬＴＲは一般に、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、遺伝子転写の促進、開始、及びポリアデニル化）及びウイルス複製の基礎となる機能を提供する。ＬＴＲは、転写制御要素、ポリアデニル化シグナル、ならびにウイルスゲノムの複製及び組み込みに必要な配列を含む、多くの調節シグナルを含有する。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ、及びＵ５と呼ばれる３つの領域に分割される。Ｕ３領域はエンハンサー及びプロモーター要素を含有する。Ｕ５領域は、プライマー結合部位とＲ領域との間の配列であり、ポリアデニル化配列を含有する。Ｒ（反復）領域は、Ｕ３及びＵ５領域に隣接している。ＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ及びＵ５領域で構成され、ウイルスゲノムの５’及び３’端の両方に現れる。５’ＬＴＲに隣接するのは、ゲノム（ｔＲＮＡプライマー結合部位）の逆転写及び粒子（プサイ部位）へのウイルスＲＮＡの効率的なパッケージングに必要な配列である。
本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスＲＮＡをウイルスカプシドまたは粒子内に挿入するために必要なレトロウイルスゲノム内に位置する配列を指し、例えば、Ｃｌｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１−２１０９を参照されたい。いくつかのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのカプシド形成に必要な最小パッケージングシグナル（プサイ［Ψ］配列とも称される）を使用する。よって、本明細書で使用される場合、「パッケージング配列」、「パッケージングシグナル」、「プサイ」、及びシンボル「Ψ」という用語は、ウイルス粒子形成中のレトロウイルスＲＮＡ鎖のカプシド形成に必要な非コード配列に関して使用される。
様々な実施形態では、ベクターは改変された５’ＬＴＲ及び／または改変された３’ＬＴＲを含む。ＬＴＲのうちのいずれかまたは両方は、１つ以上の欠失、挿入、または置換を含むがこれらに限定されない１つ以上の改変を含み得る。３’ＬＴＲの改変は、多くの場合、ウイルスに複製欠損を付与することによって、レンチウイルスまたはレトロウイルス系の安全性を改善するために行われる。本明細書で使用される場合、「複製欠損」という用語は、感染性ビリオンが産生されない（例えば、複製欠損レンチウイルス子孫）ように、完全で有効な複製ができないウイルスを指す。「複製能力」という用語は、ウイルスのウイルス複製が感染性ビリオンを産生することができる（例えば、複製能力があるレンチウイルス子孫）ように、複製が可能である野生型ウイルスまたは突然変異ウイルスを指す。
「自己不活性型」（ＳＩＮ）ベクターは、Ｕ３領域として知られる右側（３’）ＬＴＲエンハンサー−プロモーター領域が１回目以降のウイルス複製を阻止するように改変された（例えば、欠失または置換により）、複製欠損ベクター、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを指す。これは、右側（３’）ＬＴＲ Ｕ３領域がウイルス複製中の左側（５’）ＬＴＲ Ｕ３領域のテンプレートとして使用され、よって、ウイルス転写がＵ３エンハンサー−プロモーターなしに作製することができないためである。本発明の更なる実施形態では、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が、例えば、理想的なポリ（Ａ）配列に置き換えられるように改変される。３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、または３’及び５’ＬＴＲ両方に対する改変などのＬＴＲに対する改変も本発明に含まれることを留意するべきである。
追加の安全強化は、ウイルス粒子の産生中にウイルスゲノムの転写を駆動するために、５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターに置き換えることによりもたらされる。使用され得る異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルス性サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。典型的なプロモーターは、Ｔａｔ依存様式で、高レベルの転写を駆動することができる。この置き換えは、ウイルス産生系に完全なＵ３配列が存在しないため、複製能力のあるウイルスを生成するための組換えの可能性を減少させる。ある特定の実施形態では、異種プロモーターは、ウイルスゲノムが転写される様式の制御に追加の利点を有する。例えば、異種プロモーターは、ウイルスゲノムの全てまたは一部の転写が誘発因子が存在するときにのみ生じるように、誘導性であり得る。誘導因子は、１つ以上の化学化合物、または温度もしくはｐＨなどの宿主細胞が培養される生理学的条件を含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＴＡＲ要素を含む。「ＴＡＲ」という用語は、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）ＬＴＲのＲ領域に位置する「トランス活性化応答」遺伝要素を指す。この要素は、ウイルス複製を強化するために、レンチウイルストランス活性化因子（ｔａｔ）遺伝要素と相互作用する。しかしながら、この要素は、５’ＬＴＲのＵ３領域が異種プロモーターに置き換えられる実施形態では必要ない。
「Ｒ領域」は、キャッピング基の開始（すなわち、転写の開始）で始まり、ポリＡトラクトの開始直前で終わるレトロウイルスＬＴＲ内の領域を指す。Ｒ領域は、Ｕ３及びＵ５領域に隣接しているとも定義される。Ｒ領域は、逆転写中、ゲノムの一端からもう一端への新生ＤＮＡの移動を可能にする際に役割を果たす。
本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰ要素」という用語は、配列がレトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のセントラルポリプリントラクト及び中央終止配列（ｃＰＰＴ及びＣＴＳ）を含む核酸を指す。好適なＦＬＡＰ要素は、米国特許第６，６８２，９０７号及びＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。ＨＩＶ−１逆転写、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）での＋鎖ＤＮＡの中央開始及び中央終止配列（ＣＴＳ）での中央終止は、三本鎖ＤＮＡ構造であるＨＩＶ−１中央ＤＮＡフラップの形成をもたらす。任意の理論により拘束されるものではないが、ＤＮＡフラップは、レンチウイルスゲノム核内移行のシス−活性決定基として機能し得、かつ／またはウイルスの力価を増加させ得る。特定の実施形態では、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクター骨格は、ベクターの対象の異種遺伝子の上流または下流に１つ以上のＦＬＡＰ要素を含む。例えば、特定の実施形態では、伝達性プラスミドはＦＬＡＰ要素を含む。一実施形態では、本発明のベクターはＨＩＶ−１から単離されたＦＬＡＰ要素を含む。
一実施形態では、レトロウイルスまたはレンチウイルス伝達性ベクターは、１つ以上のエクスポート要素を含む。「エクスポート要素」という用語は、細胞の核から細胞質へのＲＮＡ転写の輸送を調節するシス作用転写後調節要素を指す。ＲＮＡエクスポート要素の例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３及びＣｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ ５８：４２３）及びＢ型肝炎ウイルス転写後調節要素（ＨＰＲＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、ＲＮＡエクスポート要素は、遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、１つまたは複数のコピーとして挿入され得る。
特定の実施形態では、ウイルスベクターにおける非相同配列の発現は、転写後調節要素、効率的なポリアデニル化部位、及び任意選択で、転写終止シグナルをベクター内に組み込むことにより増加する。様々な転写後調節要素、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）、Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節要素（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）など（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，９：１７６６）は、タンパク質での異種核酸の発現を増加させることができる。特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後調節要素を含む。
特定の実施形態では、本発明のベクターは、いくつかの場合では、これらの要素が細胞形質転換のリスクを増加させ、かつ／または実質的にもしくは大幅に、ｍＲＮＡ転写の量を増加させないか、もしくはｍＲＮＡ安定性を増加させないため、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後調節要素（ＰＴＥ）を欠くか、または含まない。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、ＰＴＥを欠くか、または含まない。他の実施形態では、本発明のベクターは、追加の安定対策としてＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを欠くか、または含まない。
異種核酸転写の効率的な終止及びポリアデニル化を指向する要素は、異種遺伝子発現を増加させる。転写終止シグナルは一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見られる。特定の実施形態では、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３′を含む。本明細書で使用される場合、「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写の終止及びポリアデニル化の両方を指向するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、コード配列の３′端へのポリＡ尾部の付加により、ｍＲＮＡの安定性を促進し、よって、転写効率の増加に寄与し得る。ポリＡ尾部を欠く転写物は不安定であり、迅速に分解されるため、組換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。本発明のベクターにおいて使用され得るポリＡシグナルの例示的な例としては、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、または当該技術を分野において既知の別の好適な異種もしくは内因性ポリＡ配列が挙げられる。
ある特定の実施形態では、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターは、１つ以上のインスレーター要素を更に含む。インスレーター要素は、レンチウイルス発現配列、例えば、治療用ポリペプチドを、ゲノムＤＮＡに存在するシス作用要素によって媒介され、移動された配列の発現の調節解除をもたらし得る組み込み部位作用（すなわち、位置作用、例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ−Ｂｅｕｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９９：１６４３３及びＺｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１０９：４７１）から保護するのに寄与し得る。いくつかの実施形態では、伝達性ベクターは、１つ以上のインスレーター要素である３′ＬＴＲを含み、宿主ゲノム内へのプロウイルスの組み込み時に、プロウイルスは、３′ＬＴＲを複製するため、５′ＬＴＲまたは３′ＬＴＲの両方に１つ以上のインスレーターを含む。本発明において使用するのに好適なインスレーターは、ニワトリβ−グロビンインスレーターを含むが、これに限定されない（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｃｅｌｌ ７４：５０５、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７．ＰＮＡＳ ９４：５７５、及びＢｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｃｅｌｌ ９８：３８７を参照されたい、参照により本明細書に組み込まれる）。インスレーター要素の例としては、ニワトリＨＳ４などのβ−グロビン遺伝子座からのインスレーターが挙げられるが、これに限定されない。
本発明のある特定の実施形態によると、ウイルスベクター骨格配列の大半または全ては、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１に由来する。しかしながら、レトロウイルス及び／もしくはレンチウイルス配列の多くの異なる供給源が使用されるか、または組み合わされ得、あるレンチウイルス配列における多くの置換及び変更が、伝達性ベクターが本明細書に記載される機能を行う能力を損なうことなく適用され得ることを理解されたい。更に、様々なレンチウイルスベクターが当該技術分野において既知である（Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９６ａ，１９９６ｂ、及び１９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号、及び第５，９９４，１３６号を参照されたい、これらの多くは、本発明のウイルスベクターまたは伝達性プラスミドを産生するように適合され得る）。
様々な実施形態では、本発明のベクターは、ＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたプロモーターを含む。ベクターは、１つ以上のＬＴＲを有し得、いずれかのＬＴＲが、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失などの、１つ以上の改変を含む。ベクターは、形質導入効率（例えば、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、ウイルスパッケージング（例えば、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、ＲＲＥ）、及び／または治療用遺伝子発現（例えば、ポリ（Ａ）配列）を増加させるための他の要素を増加させるために、より多くのアクセサリー要素のうちの１つを更に含み得、任意選択でＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の伝達性ベクターは、左側（５’）レトロウイルスＬＴＲ、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルスエクスポート要素、本明細書において想定されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター、及び右側（３’）レトロウイルスＬＴＲ、ならびに任意選択でＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。
特定の実施形態では、本発明の伝達性ベクターは、左側（５’）レトロウイルスＬＴＲ、レトロウイルスエクスポート要素、本明細書において想定されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター、右側（３’）レトロウイルスＬＴＲ、及びポリ（Ａ）配列、ならびに任意選択でＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。別の実施形態では、本発明は、左側（５’）ＬＴＲ、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、ＲＲＥ、本明細書において想定されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター、右側（３’）ＬＴＲ、及びポリアデニル化配列、ならびに任意選択でＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含むレンチウイルスベクターを提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、左側（５’）ＨＩＶ−１ ＬＴＲ、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、ＲＲＥ、本明細書において想定されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター、右側（３’）自己不活性型（ＳＩＮ）ＨＩＶ−１ＬＴＲ、及びウサギβ−グロビンポリアデニル化配列、ならびに任意選択でＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含むレンチウイルスベクターを提供する。
別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＬＴＲ、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルスエクスポート要素、及び本明細書において想定されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター、ならびに任意選択でＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含むベクターを提供する。
特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＬＴＲ、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、ＲＲＥ、本明細書において想定されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター、及びポリアデニル化配列、ならびに任意選択でＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含むベクターを提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＳＩＮ ＨＩＶ−１ ＬＴＲ、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、ＲＲＥ、本明細書において想定されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター、及びウサギβ−グロビンポリアデニル化配列、ならびに任意選択でＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを提供する。
様々な実施形態では、ベクターは、組み込みウイルスベクターである。
様々な他の実施形態では、ベクターは、エピソームまたは非組み込みウイルスベクターである。
様々な実施形態では、本明細書において想定される想定されるベクターは、非組み込みまたは組み込み欠損レトロウイルスを含む。一実施形態では、「組み込み欠損」レトロウイルスまたはレンチウイルスは、ウイルスゲノムを宿主細胞のゲノム内に組み込む能力を欠くインテグラーゼを有するレトロウイルスまたはレンチウイルスを指す。様々な実施形態では、インテグラーゼタンパク質は、具体的にそのインテグラーゼ活性を低減させるために変異される。組み込み能力のないレンチウイルスベクターは、インテグラーゼタンパク質をコードするｐｏｌ遺伝子を改変し、組み込み欠損インテグラーゼをコードするｐｏｌ遺伝子をもたらすことにより得られる。このような組み込み能力のないウイルスベクターは、特許出願ＷＯ２００６／０１０８３４に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
インテグラーゼ活性を減少させるのに好適なＨＩＶ−１ ｐｏｌ遺伝子における例示的な突然変異は、Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１ Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１ Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３Ａ、及びＫ２６４Ｈを含むが、これらに限定されない。
インテグラーゼ活性を減少させるのに好適なＨＩＶ−１ ｐｏｌ遺伝子における例示的な突然変異は、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ９２Ｋ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｗ２３５Ｆ、及びＷ２３５Ｅを含むが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、インテグラーゼは、アミノ酸Ｄ６４、Ｄ１１６、またはＥ１５２のうちの１つ以上において突然変異を含む。一実施形態では、インテグラーゼは、アミノ酸Ｄ６４、Ｄ１１６、及びＥ１５２において突然変異を含む。特定の実施形態では、欠損ＨＩＶ−１インテグラーゼは、Ｄ６４Ｖ突然変異を含む。
「宿主細胞」は、本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドで、インビボ、エクスビボ、もしくはインビトロで電気穿孔された、形質移入された、感染された、または形質導入された細胞を含む。宿主細胞は、パッケージング細胞、プロデューサー細胞、及びウイルスベクターで感染された細胞を含み得る。特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターで感染された宿主細胞は、治療を必要とする対象に投与される。ある特定の実施形態では、「標的細胞」という用語は、宿主細胞と交換可能に使用され、所望の細胞型の形質移入された、感染された、または形質導入された細胞を指す。好ましい実施形態では、標的細胞はＴ細胞である。
妥当なウイルス力価を達成するためには、大規模なウイルス粒子産生が必要である場合が多い。ウイルス粒子は、伝達性ベクターを、ウイルス構造及び／またはアクセサリー遺伝子、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、もしくはｎｅｆ遺伝子、または他のレトロウイルス遺伝子を含むパッケージング細胞系内に形質移入することにより産生される。
本明細書で使用される場合、「パッケージングベクター」という用語は、パッケージングシグナルを欠き、１、２、３、４つ以上のウイルス構造及び／もしくはアクセサリー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターまたはウイルスベクターを指す。典型的には、パッケージングベクターは、パッケージング細胞に含まれ、形質移入、形質導入、または感染を介して細胞内に導入される。形質移入、形質導入、または感染の方法は、当業者に周知である。本発明のレトロウイルス／レンチウイルス伝達性ベクターは、プロデューサー細胞または細胞系を生成するために、形質移入、形質導入、または感染を介してパッケージング細胞系内に導入され得る。本発明のパッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウム形質移入、リポフェクション、または電気穿孔を含む標準的な方法によりヒト細胞または細胞系内に導入され得る。いくつかの実施形態では、パッケージングベクターは、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン、チミジンキナーゼ、ＤＨＦＲ、Ｇｌｎシンセターゼ、またはＡＤＡなどの優性選択マーカーと一緒に細胞内に導入され、続いて適切な薬物の存在下での選択、及びクローンの単離が行われる。選択マーカー遺伝子は、パッケージングベクターにより、例えば、ＩＲＥＳまたは自己切断型ウイルスペプチドによりコードされた遺伝子に物理的に連結され得る。
ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）は、最終的に細胞系から生成された組換えレトロウイルスによって感染され、形質転換され得る宿主細胞の範囲を決定する。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、及びＥＩＶなどのレンチウイルスの場合、ｅｎｖタンパク質はｇｐ４１及びｇｐ１２０を含む。好ましくは、本発明のパッケージング細胞により発現されたウイルスｅｎｖタンパク質は、前に説明されるように、ウイルスｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子からの別個のベクター上にコードされる。
本発明に採用され得るレトロウイルス由来ｅｎｖ遺伝子の例示的な例としては、ＭＬＶエンベロープ、１０Ａ１エンベロープ、ＢＡＥＶ、ＦｅＬＶ−Ｂ、ＲＤ１１４、ＳＳＡＶ、エボラ、センダイ、ＦＰＶ（家禽ペストウイルス）、及びインフルエンザウイルスエンベロープが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、ＲＮＡウイルス（例えば、ピコルナウイルス科、カルシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、アストロウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科、レトロウイルス科のＲＮＡウイルスファミリー）、ならびにＤＮＡウイルス（ヘパドナウイルス科、サーコウイルス科、パルボウイルス科、パボバウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、及びイリドウイルス科）からのエンベロープをコードする遺伝子が利用され得る。代表的な例としては、ＦｅＬＶ、ＶＥＥ、ＨＦＶＷ、ＷＤＳＶ、ＳＦＶ、狂犬病、ＡＬＶ、ＢＩＶ、ＢＬＶ、ＥＢＶ、ＣＡＥＶ、ＳＮＶ、ＣｈＴＬＶ、ＳＴＬＶ、ＭＰＭＶ、ＳＭＲＶ、ＲＡＶ、ＦｕＳＶ、ＭＨ２、ＡＥＶ、ＡＭＶ、ＣＴ１０、及びＥＩＡＶが挙げられる。
他の実施形態では、本発明のウイルスをシュードタイピングするためのエンベロープタンパク質は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、及びＨ５Ｎ１（トリインフルエンザ）などのインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザＣウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス群のいずれかのウイルス、腸内アデノウイルス、パルボウイルス、デング熱ウイルス、サル痘、モノネガウイルス目のリッサウイルス（狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス、モコラウイルス、ドゥベンヘイジウイルス、ヨーロッパコウモリウイルス１＆２、及びオーストラリアコウモリウイルスなど）、エフェメロウイルス、ベジクロウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型及び２型、水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、ヒトヘルペス６型及び８型、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、マウスガンマヘルペスウイルスなど）、アレナウイルス（アルゼンチン出血熱ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルスなど）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ブニヤウイルス科（クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ハンタウイルス、腎症候群原因ウイルスを伴う出血熱、リフトバレー熱ウイルスなど）、フィロウイルス科（フィロウイルス）（エボラ出血熱及びマールブルグ出血熱を含む）、フラビウイルス科（キャサヌール森林病ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎原因ウイルスなど）、及びパラミクソウイルス科（ヘンドラウイルス及びニパウイルスなど）、大痘瘡及び小痘瘡（天然痘）、アルファウイルス（ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、ウエストナイルウイルス、任意の脳炎原因ウイルスなど）のウイルスのいずれかを含むが、これらに限定されない。
一実施形態では、本発明は、ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質でシュードタイピングされた組換えレトロウイルス、例えば、レンチウイルスを産生するパッケージング細胞を提供する。
本明細書で使用される場合、「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、ウイルスエンベロープタンパク質が好ましい特性を保有する別のウイルスのもので置換されたウイルスを指す。例えば、ＨＩＶは、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によってコードされる）が通常ウイルスをＣＤ４＋提示細胞に標的指向するため、ＨＩＶが広範囲の細胞を感染させることを可能にする、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質でシュードタイピングされ得る。本発明の好ましい実施形態では、レンチウイルスエンベロープタンパク質はＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングされる。一実施形態では、本発明は、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質でシュードタイピングされた組換えレトロウイルス、例えばレンチウイルスを産生するパッケージング細胞を提供する。
本明細書で使用される場合、「パッケージング細胞系」という用語は、パッケージングシグナルを含有しないが、ウイルス粒子の正しいパッケージングに必要であるウイルス構造タンパク質及び複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ）を安定してまたは一過性に発現する細胞系に関して使用される。任意の好適な細胞系が本発明のパッケージング細胞を調製するために採用され得る。一般に、細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態では、パッケージング細胞系を産生するために使用される細胞は、ヒト細胞である。使用され得る好適な細胞系は、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、プサイ−２細胞、ＢＯＳＣ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＢＭＴ１０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ−５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、及び２１１Ａ細胞を含む。好ましい実施形態では、パッケージング細胞は、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、またはＡ５４９細胞である。別の好ましい実施形態では、細胞はＡ５４９細胞である。
本明細書で使用される場合、「プロデューサー細胞系」という用語は、パッケージング細胞系及びパッケージングシグナルを含む伝達性ベクター構築物を含む、組換えレトロウイルス粒子を産生することができる細胞系を指す。感染性ウイルス粒子及びウイルスストック溶液の産生は、従来の技法を使用して行うことができる。ウイルスストック溶液の調製方法は当該技術分野において既知であり、例えば、Ｙ．Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６２８−６３３及びＮ．Ｒ．Ｌａｎｄａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５１１０−５１１３により図示される。感染性ウイルス粒子は、従来の技法を使用して、パッケージング細胞から回収され得る。例えば、感染性粒子は、当該技術分野において既知である、細胞溶解、または細胞培養物の上清の回収により回収され得る。任意選択で、回収されたウイルス粒子は、所望する場合、精製され得る。好適な精製技法は当業者に周知である。
形質移入ではなくウイルス感染の手段によりレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用する遺伝子（複数可）または他のポリヌクレオチド配列の送達は、「形質導入」と称される。一実施形態では、レトロウイルスベクターは、感染及びプロウイルス組み込みを通して細胞内に形質導入される。ある特定の実施形態では、標的細胞、例えば、Ｔ細胞は、ウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用して感染により細胞に送達された遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む場合、「形質導入」される。特定の実施形態では、形質導入された細胞は、その細胞ゲノムに、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターによって送達された１つ以上の遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、１つ以上のポリペプチドを発現する本発明のウイルスベクターで形質導入された宿主細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療及び／または予防するために対象に投与される。本発明のある特定の実施形態により利用され得る、遺伝子療法におけるウイルスベクターの使用に関連する他の方法は、例えば、Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．（１９９７）Ｃｈｅｓｔ １１１（６Ｓｕｐｐ．）：１３８Ｓ−１４２Ｓ、Ｆｅｒｒｙ，Ｎ．ａｎｄ Ｈｅａｒｄ，Ｊ．Ｍ．（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１９７５−８１、Ｓｈｉｒａｔｏｒｙ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｌｉｖｅｒ １９：２６５−７４、Ｏｋａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１１：１７９−８６、Ｔｈｕｌｅ，Ｐ．Ｍ．ａｎｄ Ｌｉｕ，Ｊ．Ｍ．（２０００）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１７４４−５２、Ｙａｎｇ，Ｎ．Ｓ．（１９９２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：３３５−５６、Ａｌｔ，Ｍ．（１９９５）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２３：７４６−５８、Ｂｒｏｄｙ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ．（１９９４）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１６：９０−１０１、Ｓｔｒａｙｅｒ，Ｄ．Ｓ．（１９９９）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ８：２１５９−２１７２、Ｓｍｉｔｈ−Ａｒｉｃａ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｓ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｃａｒｄｉｏｌ．Ｒｅｐ．３：４３−４９、及びＬｅｅ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０８：４８３−８に見出すことができる。
Ｇ．遺伝子改変細胞
本発明は、特定の実施形態では、Ｂ細胞関連状態の治療において使用するための、本明細書において想定されるＣＡＲを発現するように遺伝子改変された細胞を想定する。本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」または「遺伝子改変された」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態の余分な遺伝材料を細胞の総遺伝材料内に付加することを指す。「遺伝子改変細胞」、「改変細胞」、及び「再指向された細胞」という用語は、交換可能に使用される。本明細書で使用される場合、「遺伝子療法」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態の余分な遺伝材料を、遺伝子の発現を回復、修正、もしくは改変する、または治療用ポリペプチド、例えば、ＣＡＲを発現する目的のために、細胞の総遺伝材料内に導入することを指す。
特定の実施形態では、本明細書において想定されるＣＡＲは、それらの特異性を対象の標的抗原、例えば、ＢＣＭＡポリペプチドに再指向するために、免疫エフェクター細胞に導入され、発現される。「免疫エフェクター細胞」は、１つ以上のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞死滅活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣの誘発）を有する免疫系の任意の細胞である。
本発明の免疫エフェクター細胞は、自家／自源性（「自己」）または非自家（「非自己」、例えば、同種、同系、または異種）であり得る。
本明細書で使用される場合、「自家」は、同じ対象からの細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「同種」は、比較する際に細胞と遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「同系」は、比較する際に細胞と遺伝的に同一である異なる対象の細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「異種」は、比較する際に細胞と異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態では、本発明の細胞は同種である。
本明細書において想定されるＣＡＲと共に使用される例示的な免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球を含む。「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、当該技術分野において認識されており、胸腺細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むことが意図される。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞、またはＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。特定の実施形態において使用するのに好適なＴ細胞の他の例示的な集団は、未処理Ｔ細胞及びメモリーＴ細胞を含む。
当業者に理解されるように、本明細書に記載されるＣＡＲと共に、他の細胞も免疫エフェクター細胞として使用され得る。特に、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、及びマクロファージも含む。免疫エフェクター細胞は、エフェクター細胞の前駆体も含み、このような前駆体細胞は誘発されて、インビボまたはインビトロで免疫エフェクター細胞に分化し得る。よって、特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、対象における投与時に成熟エフェクター細胞に分化する、もしくはインビトロで成熟免疫エフェクター細胞に分化するように誘発され得る臍帯血、骨髄、または動員末梢血に由来する細胞のＣＤ３４＋集団内に含有される造血性幹細胞（ＨＳＣ）などの免疫エフェクター細胞の前駆体を含む。
本明細書で使用される場合、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを含有するように遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、「ＢＣＭＡ特異的な再指向された免疫エフェクター細胞」と称される場合がある。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４＋細胞」という用語は、その細胞表面上にＣＤ３４タンパク質を発現する細胞を指す。本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４」は、細胞−細胞接着因子として作用し、リンパ節内へのＴ細胞進入に関与する細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）を指す。ＣＤ３４＋細胞集団は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、及び単球／マクロファージ系統の細胞を含む、患者への投与時に分化し、全ての造血系統に寄与する造血性ステム幹細胞（ＨＳＣ）を含有する。
本発明は、本明細書において想定されるＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を作製するための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、免疫エフェクター細胞が本明細書に記載される１つ以上のＣＡＲを発現するように個体から単離した免疫エフェクター細胞を形質移入または形質導入することを含む。ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、個体から単離され、インビトロで更に操作することなく遺伝子改変される。このような細胞は、次に、個体に直接再投与され得る。更なる実施形態では、免疫エフェクター細胞は、最初に、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変される前に、インビトロで増殖するように活性化及び刺激される。この点に関して、免疫エフェクター細胞は、遺伝子改変される前及び／または遺伝子改変された後に培養され得る（すなわち、本明細書において想定されるＣＡＲを発現するように形質導入または形質移入される）。
特定の実施形態では、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞のインビトロ操作または遺伝子改変の前に、細胞源を対象から得る。特定の実施形態では、ＣＡＲ改変エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞は、末梢血、単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含むが、これらに限定されない、いくつかの供給源から得ることができる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、沈降、例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離など、当業者に既知の任意の数の技法を使用して、対象から回収した血液単位から得ることができる。一実施形態では、個体の循環血液からの細胞はアフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、及び血小板を含む、リンパ球を含有する。一実施形態では、アフェレーシスによって回収された細胞を洗浄して血漿分画を除去し、後続処理のために、細胞を適切な緩衝液または培地に設置する。細胞は、ＰＢＳ、またはカルシウム、マグネシウム、及び全てではなくても大半の二価のカチオンを含まない別の好適な溶液で洗浄され得る。当業者が理解するように、洗浄ステップは、半自動フロースルー遠心分離機などを使用することにより、当業者に既知の方法により達成され得る。例えば、 Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅなどである。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、または緩衝液を含む、もしくは含まない他の生理食塩水溶液に再懸濁され得る。ある特定の実施形態では、アフレーシス試料の望ましくない構成成分を、この細胞を直接再懸濁させた培養培地中で除去することができる。
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を通した遠心分離により、赤血球細胞を溶解し、単球を枯渇させることにより、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離される。マーカー：ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＤ４５ＲＯのうちの１つ以上を発現するＴ細胞の特定のサブ集団は、正または負の選択技法により更に単離され得る。一実施形態では、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＤ４５ＲＯを発現するＴ細胞の特定のサブ集団は、正または負の選択技法により更に単離される。例えば、負の選択によるＴ細胞集団の濃縮は、負に選択された細胞に固有の表面マーカーに指向された抗体の組み合わせにより達成され得る。本明細書で使用するための一方法は、負に選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに指向されたモノクローナル抗体のカクテルを使用する負磁気免疫接着またはフローサイトメトリーを介した細胞選別及び／または選択である。例えば、負の選択によりＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。フローサイトメトリー及び細胞選別も、本発明において使用するための対象の細胞集団を単離するために使用され得る。
ＰＢＭＣは、本明細書において想定される方法を使用して、ＣＡＲを発現するように直接遺伝子改変され得る。ある特定の実施形態では、ＰＢＭＣの単離後、Ｔリンパ球は更に単離され、ある特定の実施形態では、細胞傷害性及びヘルパーＴリンパ球の両方が、遺伝子改変及び／または増幅の前またはその後のいずれかに、未処理、メモリー、及びエフェクターＴ細胞サブ集団に選別され得る。
ＣＤ８＋細胞は、標準的な方法を使用して得ることができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、ＣＤ８＋細胞のこれらの型の各々と会合する細胞表面抗原を特定することによって、未処理、中枢メモリー、及びエフェクター細胞に更に選別される。
ある特定の実施形態では、未処理ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７、及びＣＤ４５ＲＡを含む未処理Ｔ細胞の表現型マーカーの発現を特徴とする。
特定の実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８及び抗ＣＤ６２Ｌ抗体で染色した後に、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋分画に選別される。いくつかの実施形態では、中枢メモリーＴ細胞の表現型マーカーの発現は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、及びＣＤ１２７を含み、グランザイムＢに陰性である。いくつかの実施形態では、中枢メモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態では、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、及びＣＤ１２７に陰性であり、グランザイムＢ及びパーフォリンに陽性である。
ある特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、サブ集団に更に選別される。例えば、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を特定することにより、未処理、中枢メモリー、及びエフェクター細胞に選別され得る。ＣＤ４＋リンパ球は、標準的な方法により得ることができる。いくつかの実施形態では、未処理ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、中枢メモリーＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性であり、ＣＤ４５ＲＯ陰性である。いくつかの実施形態では、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＯ陰性である。
Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、既知の方法を使用して単離した後に遺伝子改変され得るか、または免疫エフェクター細胞は、遺伝子改変される前にインビトロで活性化及び増幅され得る（または前駆体の場合、分化され得る）。特定の実施形態では、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、本明細書において想定されるキメラ抗原受容体で遺伝子改変され（例えば、ＣＡＲをコードする核酸を含むウイルスベクターで形質導入される）、次に、インビトロで活性化及び増幅される。様々な実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、第６，５３４，０５５号、第６，９０５，６８０号、第６，６９２，９６４号、第５，８５８，３５８号、第６，８８７，４６６号、第６，９０５，６８１号、第７，１４４，５７５号、第７，０６７，３１８号、第７，１７２，８６９号、第７，２３２，５６６号、第７，１７５，８４３号、第５，８８３，２２３号、第６，９０５，８７４号、第６，７９７，５１４号、第６，８６７，０４１号、及び米国特許出願公開第２００６／０１２１００５号に記載される方法を使用してＣＡＲを発現するために、遺伝子改変前または遺伝子改変後に活性化及び増幅され得る。
一般に、Ｔ細胞は、それに結合された表面と、ＣＤ３ ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを接触させることにより増幅される。Ｔ細胞集団は、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、または表面上に固定された抗ＣＤ２抗体と接触させることにより、あるいはカルシウムイオノフォアと共にタンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）と接触させることにより刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激も想定される。
特定の実施形態では、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及び／またはＩＬ−１５などの適切なサイトカインを含む培養培地において、一般的にビーズまたは他の表面に結合される抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体などの刺激物質及び共刺激物質と接触させられる。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｉｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、当該技術分野において一般的に知られる他の方法（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５−３９７７，１９９８、Ｈａａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９、Ｇａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．２２７（１−２）：５３−６３，１９９９）と同様に使用され得る。同じビーズに結合された抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体は、「代理」抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能する。他の実施形態では、Ｔ細胞は、ＵＳ６０４０１７７、ＵＳ５８２７６４２、及びＷＯ２０１２１２９５１４に記載されるものなどの方法を使用して、フィーダー細胞及び適切な抗体ならびにサイトカインを用いて活性化及び刺激されて増殖し得る。
他の実施形態では、様々な共刺激分子及びサイトカインの安定した発現及び分泌を指向するために、Ｋ５６２、Ｕ９３７、７２１．２２１、Ｔ２、及びＣ１Ｒ細胞を操作することにより作製された人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）。特定の実施形態では、Ｋ３２またはＵ３２ ａＡＰＣは、ＡＡＰＣ細胞表面上に１つ以上の抗体ベースの刺激分子の表示を指向するために使用される。ａＡＰＣが具体的な成長要件及び明確な機能を有するＴ細胞サブセットの最適な伝播のために調整され得るように、ａＡＰＣ上の遺伝子の様々な組み合わせを発現させることによって、ヒトＴ細胞活性化要件の正確な決定が可能となる。ａＡＰＣは、天然のＡＰＣの使用とは対照的に、外因性サイトカインの付加を必要とすることなく、機能性ヒトＣＤ８ Ｔ細胞のエクスビボ成長及び長期増幅を支持する。Ｔ細胞集団は、限定されないが、ＣＤ１３７Ｌ（４−１ＢＢＬ）、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）、及び／またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６を含む、様々な共刺激分子を発現するａＡＰＣにより増幅され得る。最後に、ａＡＰＣは、遺伝子改変Ｔ細胞を増幅し、ＣＤ８ Ｔ細胞上のＣＤ２８発現を維持するために、効率的なプラットホームを提供する。ＷＯ０３／０５７１７１及びＵＳ２００３／０１４７８６９に提供されるａＡＰＣは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、本発明による核酸構築物で形質導入される。ある特定の実施形態では、形質導入されたＣＤ３４＋細胞は、対象、一般に、細胞が本来単離された対象への投与後、インビボで成熟免疫エフェクター細胞に分化する。別の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、本明細書に記載されるＣＡＲに曝露される前、またはそれで遺伝子改変された後に、前に記載される方法により、サイトカイン：Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬＴ３）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、巨核球成長分化因子（ＴＰＯ）、ＩＬ−３、及びＩＬ−６のうちの１つ以上でインビトロで刺激され得る（Ａｓｈｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｉｍｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００４）。
本発明は、癌の治療のための改変された免疫エフェクター細胞集団を提供し、その改変された免疫エフェクター細胞は、本明細書に開示されるＣＡＲを含む。例えば、改変された免疫エフェクター細胞集団は、本明細書に記載されるＢ細胞悪性腫瘍と診断された患者（自家ドナー）から得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製される。ＰＢＭＣは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋、及びＣＤ８＋であり得るＴリンパ球の不均一な集団を形成する。
ＰＢＭＣは、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞などの他の細胞傷害性リンパ球も含み得る。本明細書において想定されるＣＡＲのコード配列を有する発現ベクターは、ヒトドナーＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞の集団に導入され得る。発現ベクターを有する正常に形質導入されたＴ細胞は、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離するためにフローサイトメトリーを使用して選別され、次に、抗ＣＤ３抗体及び／もしくは抗ＣＤ２８抗体ならびにＩＬ−２、または本明細書の別の箇所に記載される、当該技術分野において既知の任意の他の方法を使用する細胞活性化に加えて、Ｔ細胞を発現するこれらのＣＡＲタンパク質の数を増加させるために、更に伝播され得る。貯蔵用のＣＡＲタンパク質Ｔ細胞を発現するＴ細胞の凍結保存及び／またはヒト対象に使用するための調製のために、標準的な手順が使用される。一実施形態では、Ｔ細胞のインビトロ形質導入、培養、及び／または発現は、仔ウシ胎仔血清及びウシ胎仔血清などの非ヒト動物由来産物の不在下で行われる。ＰＢＭＣの異種集団は遺伝子改変されるため、得られる形質導入された細胞は、本明細書において想定されるＢＣＭＡ標的ＣＡＲを含む改変された細胞の異種集団である。
更なる実施形態では、例えば、１、２、３、４、５つ以上の異なる発現ベクターの混合物は、各ベクターが本明細書に置いて想定される異なるキメラ抗原受容体タンパク質をコードする、免疫エフェクター細胞のドナー集団を遺伝子改変する際に使用され得る。得られる改変された免疫エフェクター細胞は、改変された細胞の混合集団を形成し、ある割合の２つ以上の異なるＣＡＲタンパク質を発現する改変された細胞を有する。
一実施形態では、本発明は、細胞が解凍時に生存可能のままであるように、免疫エフェクター細胞を凍結保存することを含む、ＢＣＭＡタンパク質を標的とする遺伝子改変マウス、ヒト、またはヒト化ＣＡＲタンパク質発現免疫エフェクター細胞を選別する方法を提供する。ＣＡＲタンパク質を発現する免疫エフェクター細胞の分画は、Ｂ細胞関連状態に罹患する患者の後の治療のための、このような細胞の永続的な供給源を提供するために、当該技術分野において既知の方法によって凍結保存され得る。必要な場合、冷凍保存された形質転換された免疫エフェクター細胞は、より多くのこのような細胞を得るために解凍、成長、及び増幅され得る。
本明細書で使用される場合、「凍結保存」は、（典型的には）７７Ｋまたは−１９６℃（液体窒素の沸点）などの氷点下温度に冷却することによる細胞の保存を指す。凍結保護剤は、多くの場合、保存される細胞が低温での凍結または室温への加温により損傷するのを阻止するために、氷点下温度で使用される。凍結保存剤及び最適な冷却速度は細胞傷害から保護することができる。使用され得る凍結保護剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ ａｎｄ Ｂｉｓｈｏｐ，Ｎａｔｕｒｅ，１９５９；１８３：１３９４−１３９５、Ａｓｈｗｏｏｄ−Ｓｍｉｔｈ，Ｎａｔｕｒｅ，１９６１；１９０：１２０４−１２０５）、グリセロール、ポリビニルピロリジン（Ｒｉｎｆｒｅｔ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９６０；８５：５７６）、及びポリエチレングリコール（Ｓｌｏｖｉｔｅｒ ａｎｄ Ｒａｖｄｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９６２；１９６：４８）を含むが、これらに限定されない。好ましい冷却速度は１℃〜３℃／分である。少なくとも２時間後、Ｔ細胞は、−８０℃の温度に達し、長期低温貯蔵槽などの永続的な貯蔵のために、液体窒素（−１９６℃）に直接設置され得る。
Ｈ．細胞の製造方法
本明細書において想定される方法により製造されたＴ細胞は、改善された養子免疫療法組成物を提供する。いずれの特定の理論に拘束されるものではないが、本明細書において想定される方法により製造されたＴ細胞組成物は、生存率の増加、分化が比較的少ない増幅、及びインビボでの持続性を含む、優れた性質を有していると考えられる。一実施形態では、Ｔ細胞を製造する方法は、細胞を、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を調節する１つ以上の薬剤と接触させることを含む。一実施形態では、Ｔ細胞を製造する方法は、細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路を調節する１つ以上の薬剤と接触させることを含む。様々な実施形態では、Ｔ細胞は、任意の供給源から得られ、製造プロセスの活性化及び／または増幅段階中に薬剤と接触させられ得る。得られるＴ細胞組成物は、バイオマーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のうちの１つ以上を増殖及び発現する能力を有する発達的に強力なＴ細胞において濃縮される。一実施形態では、１つ以上のＰＩ３Ｋ阻害剤で処理されたＴ細胞を含む細胞集団は、バイオマーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のうちの１つ以上または全てを同時発現するＣＤ８＋Ｔ細胞集団に関して濃縮される。
一実施形態では、維持されたレベルの増殖及び低減された分化を有する、改変されたＴ細胞が製造される。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、１つ以上の刺激シグナル及びＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の阻害剤である薬剤の存在下で、活性化し、増殖するようにＴ細胞を刺激することにより製造される。
次に、Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するように改変され得る。一実施形態では、Ｔ細胞は、本明細書において想定される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを含むウイルスベクターをＴ細胞に形質導入することにより改変される。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の阻害剤の存在下で、刺激及び活性化する前に改変される。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の阻害剤の存在下で、刺激及び活性化した後に改変される。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の阻害剤の存在下で、刺激及び活性化の１２時間以内、２４時間以内、３６時間以内、または４８時間以内に改変される。
Ｔ細胞が活性化された後、細胞は増殖のために培養される。Ｔ細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上増幅しながら、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日間、少なくとも２週間、少なくとも１、２、３、４、５、または６ヶ月間以上培養され得る。
様々な実施形態では、Ｔ細胞組成物は、ＰＩ３Ｋ経路の１つ以上の阻害剤の存在下で製造される。阻害剤は、経路またはシグナル活性における１つ以上の活性を標的とし得る。いずれの特定の理論に拘束されるものではないが、製造プロセスの刺激、活性化、及び／または増幅段階中に、Ｔ細胞を１つ以上のＰＩ３Ｋ経路の阻害剤で処理またはそれと接触させることにより、優先的に若いＴ細胞を増加させ、それにより、優れた治療用Ｔ細胞組成物を産生することが想定される。
特定の実施形態では、操作されたＴ細胞受容体を発現するＴ細胞の増殖を増加させるための方法が提供される。このような方法は、例えば、対象からＴ細胞源を採取すること、１つ以上のＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で、Ｔ細胞を刺激及び活性化すること、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ、例えば、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲを発現するようにＴ細胞を改変し、培養物中でＴ細胞を増幅することを含み得る。
ある特定の実施形態では、バイオマーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のうちの１つ以上を発現するために濃縮されたＴ細胞集団を産生するための方法。一実施形態では、若いＴ細胞は、バイオマーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のうちの１つ以上または全てを含む。一実施形態では、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３の発現を欠く若いＴ細胞が提供される。本明細書の別の箇所に論じられるように、発現レベル若いＴ細胞バイオマーカーは、より分化したＴ細胞または免疫エフェクター細胞集団におけるこのようなマーカーの発現レベルに対してである。
一実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、本明細書において想定されるＴ細胞製造方法において、Ｔ細胞源として使用される。ＰＢＭＣは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋及びＣＤ８＋であり得るＴリンパ球の異種集団を形成し、単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫＴ細胞などの他の単核細胞を含み得る。本明細書において想定される操作されたＴＣＲまたはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、ヒトドナーＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞の集団に導入され得る。発現ベクターを有する正常に形質導入されたＴ細胞は、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離するためにフローサイトメトリーを使用して選別され、次に、抗ＣＤ３抗体及び／もしくは抗ＣＤ２８抗体ならびにＩＬ−２、ＩＬ−７及び／もしくはＩＬ−１５、または本明細書の別の箇所に記載される、当該技術分野において既知の任意の他の方法を使用する細胞活性化に加えて、改変されたＴ細胞の数を増加させるために、更に伝播され得る。
本明細書において想定される製造方法は、貯蔵及び／またはヒト対象に使用するための調製のために、改変されたＴ細胞の凍結保存を更に含む。Ｔ細胞は、細胞が解凍時に生存可能のままであるように凍結保存される。必要な場合、冷凍保存された形質転換された免疫エフェクター細胞は、より多くのこのような細胞を得るために解凍、成長、及び増幅され得る。本明細書で使用される場合、「凍結保存」は、（典型的には）７７Ｋまたは−１９６℃（液体窒素の沸点）などの氷点下温度に冷却することによる細胞の保存を指す。凍結保護剤は、多くの場合、保存される細胞が低温での凍結または室温への加温により損傷するのを阻止するために、氷点下温度で使用される。凍結保存剤及び最適な冷却速度は細胞傷害から保護することができる。使用され得る凍結保護剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ ａｎｄ Ｂｉｓｈｏｐ，Ｎａｔｕｒｅ，１９５９；１８３：１３９４−１３９５、Ａｓｈｗｏｏｄ−Ｓｍｉｔｈ，Ｎａｔｕｒｅ，１９６１；１９０：１２０４−１２０５）、グリセロール、ポリビニルピロリジン（Ｒｉｎｆｒｅｔ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９６０；８５：５７６）、及びポリエチレングリコール（Ｓｌｏｖｉｔｅｒ ａｎｄ Ｒａｖｄｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９６２；１９６：４８）を含むが、これらに限定されない。好ましい冷却速度は１℃〜３℃／分である。少なくとも２時間後、Ｔ細胞は、−８０℃の温度に達し、長期低温貯蔵槽などの永久貯蔵のために、液体窒素（−１９６℃）に直接設置され得る。
１．Ｔ細胞
本発明は、改善されたＣＡＲ Ｔ細胞組成物の製造を想定する。ＣＡＲ Ｔ細胞産生に使用されるＴ細胞は、自家／自源性（「自己」）または非自家（「非自己」、例えば、同種、同系、または異種）であり得る。好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、哺乳類対象から得られる。より好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、霊長類対象から得られる。最も好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、ヒト対象から得られる。
Ｔ細胞は、末梢血、単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含むが、これらに限定されない、いくつかの供給源から得ることができる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、沈降、例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離など、当業者に既知の任意の数の技法を使用して、対象から回収した血液単位から得ることができる。一実施形態では、個体の循環血液からの細胞はアフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、及び血小板を含む、リンパ球を含有する。一実施形態では、アフェレーシスによって回収された細胞を洗浄して血漿分画を除去し、後続処理のために、細胞を適切な緩衝液または培地に設置する。細胞は、ＰＢＳ、またはカルシウム、マグネシウム、及び全てではなくても大半の二価のカチオンを含まない別の好適な溶液で洗浄され得る。当業者が理解するように、洗浄ステップは、半自動フロースルー遠心分離機などを使用することにより、当業者に既知の方法により達成され得る。例えば、Ｃｏｂｅ２９９１細胞プロセッサ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅなどである。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、または緩衝液を含む、もしくは含まない他の生理食塩水溶液に再懸濁され得る。ある特定の実施形態では、アフレーシス試料の望ましくない構成成分を、この細胞を直接再懸濁させた培養培地中で除去することができる。
特定の実施形態では、Ｔ細胞、例えば、ＰＢＭＣを含む細胞集団は、本明細書において想定される製造方法において使用される。他の実施形態では、Ｔ細胞の単離または精製された集団は、本明細書において想定される製造方法において使用される。細胞は、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を通した遠心分離により、赤血球細胞を溶解し、単球を枯渇させることにより、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離され得る。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣの単離後、細胞傷害性及びヘルパーＴリンパ球の両方が、活性化、増幅、及び／または遺伝子改変の前またはその後のいずれかに、未処理、メモリー、及びエフェクターＴ細胞サブ集団に選別され得る。
マーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２、ＣＤ１２７、及びＨＬＡ−ＤＲのうちの１つ以上を発現するＴ細胞の特定のサブ集団は、正または負の選択技法により更に単離され得る。一実施形態では、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、またはｉｉ）ＣＤ３８もしくはＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上を発現するＴ細胞の特定のサブ集団は、正または負の選択技法により更に単離され得る。様々な実施形態では、製造されたＴ細胞組成物は、マーカー：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３のうちの１つ以上を発現しない、または実質的に発現しない。
一実施形態では、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上の発現は、ＰＩ３Ｋ阻害剤なしで活性化及び増幅されたＴ細胞集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍以上増加する。
一実施形態では、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上の発現は、ＰＩ３Ｋ阻害剤と共に活性化及び増幅されたＴ細胞集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍以上低減される。
一実施形態では、本明細書において想定される製造方法は、未処理または発達的に強力なＴ細胞のうちの１つ以上のマーカーを含むＣＡＲ Ｔ細胞の数を増加させる。いずれの特定の理論に拘束されるものではないが、本発明者は、Ｔ細胞を含む細胞集団を１つ以上のＰＩ３Ｋ阻害剤で処理することにより、既存のＣＡＲ細胞療法と比較して、発達的に強力なＴ細胞の増幅を増加させ、より強固かつ有効な養子ＣＡＲ Ｔ細胞免疫療法が提供されると考える。
本明細書において想定される方法を使用して製造されたＴ細胞において増加された未処理または発達的に強力なＴ細胞のマーカーの例示的な例としては、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、未処理Ｔ細胞は、マーカー：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３のうちの１つ以上を発現しない発現しないか、または実質的に発現しない。
Ｔ細胞に関して、本明細書において想定される様々な増幅方法から得られるＴ細胞集団は、採用される条件により、様々な特異的な表現型性質を有し得る。様々な実施形態では、増幅されたＴ細胞集団は、表現型マーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＣＤ３８及びＨＬＡ−ＤＲのうちの１つ以上を含む。
一実施形態では、このような表現型マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のうちの１つ以上または全ての、強化された発現を含む。特定の実施形態では、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８を含む未処理Ｔ細胞の表現型のマーカーの発現を特徴とするＣＤ８＋Ｔリンパ球か増幅される。
特定の実施形態では、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８を含む中枢メモリーＴ細胞、ならびにグランザイムＢに陰性の表現型マーカーの発現を特徴とするＴ細胞が増幅される。いくつかの実施形態では、中枢メモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
ある特定の実施形態では、ＣＤ６２Ｌを含む未処理ＣＤ４＋細胞、ならびにＣＤ４５ＲＡ及び／またはＣＤ４５ＲＯの発現に陰性の表現型マーカーの発現を特徴とするＣＤ４＋Ｔリンパ球が増幅される。いくつかの実施形態では、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＯ陽性を含む中枢メモリーＣＤ４＋細胞の表現型マーカーの発現を特徴するＣＤ４＋細胞。いくつかの実施形態では、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性及びＣＤ４５ＲＯ陰性である。
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、個体から単離され、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するように遺伝子改変される前に、インビトロで増殖するように活性化及び刺激される。この点に関して、Ｔ細胞は、遺伝子改変される前及び／または遺伝子改変された後に培養され得る（すなわち、本明細書において想定される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するように形質導入または形質移入される）。
２．活性化及び増幅
Ｔ細胞組成物の十分な治療量を達成するために、Ｔ細胞は、多くの場合、１回以上の刺激、活性化、及び／または増幅を受ける。Ｔ細胞は、一般的に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、第６，５３４，０５５号、第６，９０５，６８０号、第６，６９２，９６４号、第５，８５８，３５８号、第６，８８７，４６６号、第６，９０５，６８１号、第７，１４４，５７５号、第７，０６７，３１８号、第７，１７２，８６９号、第７，２３２，５６６号、第７，１７５，８４３号、第５，８８３，２２３号、第６，９０５，８７４号、第６，７９７，５１４号、及び第６，８６７，０４１号（それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される方法を使用して、活性化及び増幅され得る。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するために改変されたＴ細胞は、Ｔ細胞が改変される前及び／または改変された後に、活性化及び増幅され得る。加えて、Ｔ細胞は、活性化及び／または増幅の前、その間、及び／またはその後にＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を調節する１つ以上の薬剤と接触させられ得る。一実施形態では、本明細書において想定される方法により製造されたＴ細胞は、１、２、３、４、５回以上の活性化及び増幅を受け、それらの各々は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を調節する１つ以上の薬剤を含み得る。
一実施形態では、共刺激リガンドは、Ｔ細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合する抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に存在し、それにより、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、所望のＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する。好適な共刺激リガンドは、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ １、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、及びＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドを含むが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、共刺激リガンドは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、１ＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
好適な共刺激リガンドは、可溶形態で提供されるか、または改変されたＴ細胞上に発現された、操作されたＴＣＲもしくはＣＡＲに結合するＡＰＣまたはａＡＰＣ上に発現され得る、標的抗原を更に含む。
様々な実施形態では、本明細書において想定されるＴ細胞を製造するための方法は、Ｔ細胞を含む細胞集団を活性化し、Ｔ細胞集団を増幅することを含む。Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を通して、またはＣＤ２表面タンパク質の刺激を介して一次刺激シグナルを提供することにより、及びアクセサリー分子、例えば、ＣＤ２８を通して二次共刺激シグナルを提供することにより達成され得る。
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、Ｔ細胞を、好適なＣＤ３結合剤、例えば、ＣＤ３リガンドまたは抗ＣＤ３モノクローナル抗体と接触させることにより刺激され得る。ＣＤ３抗体の例示的な例としては、ＯＫＴ３、Ｇ１９−４、ＢＣ３、及び６４．１が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、ＣＤ２結合剤は、一次刺激シグナルをＴ細胞に提供するために使用され得る。ＣＤ２結合剤の例示的な例としては、ＣＤ２リガンド及び抗ＣＤ２抗体、例えば、Ｔ１１．１またはＴ１１．２抗体と組み合わせたＴ１１．３抗体（Ｍｅｕｅｒ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｃｅｌｌ ３６：８９７−９０６）、及び９−１抗体と組み合わせた９．６抗体（ＴＩ １．１と同じエピトープを認識する）（Ｙａｎｇ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０９７−１１００）が挙げられるが、これらに限定されない。上述の抗体のいずれかと同じエピトープに結合する他の抗体も使用することができる。本明細書の別の箇所に開示される標準的な技法により、追加の抗体、または抗体の組み合わせを調製及び特定することができる。
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を通して、またはＣＤ２を介して提供される一次刺激シグナルに加えて、Ｔ細胞応答の誘発は、二次共刺激シグナルを必要とする。特定の実施形態では、ＣＤ２８結合剤は、共刺激シグナルを提供するために使用され得る。ＣＤ２８結合剤の例示的な例としては、天然のＣＤ２８リガンド、例えば、ＣＤ２８の天然リガンド（例えば、Ｂ７−１（ＣＤ８０）及びＢ７−２（ＣＤ８６）などのタンパク質のＢ７ファミリーのメンバー；ＣＤ２８を架橋することができる抗ＣＤ２８モノクローナル抗体またはその断片、例えば、モノクローナル抗体９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８、ＫＯＬＴ−２、１５Ｅ８、２４８．２３．２、及びＥＸ５．３Ｄ１０が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、一次刺激シグナルを提供する分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２を通して刺激を提供する分子、及び共刺激分子は同じ表面に結合される。
ある特定の実施形態では、刺激及び共刺激シグナルを提供する結合剤は細胞の表面上に局在化される。これは、細胞表面上でのその発現に好適な形態で、結合剤をコードする核酸を細胞に形質移入または形質導入することにより、ないしは別の方法で、結合剤を細胞表面に結合することにより達成され得る。
別の実施形態では、一次刺激シグナルを提供する分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２を通して刺激を提供する分子、及び共刺激分子は抗原提示細胞上に表示される。
一実施形態では、一次刺激シグナルを提供する分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２を通して刺激を提供する分子、及び共刺激分子は別個の表面上に提供される。
ある特定の実施形態では、刺激及び共刺激シグナルを提供する結合剤のうちの１つは、可溶性（溶液で提供される）であり、他の薬剤（複数可）は１つ以上の表面上に提供される。
特定の実施形態では、刺激及び共刺激シグナルを提供する結合剤は、両方とも可溶形態で提供される（溶液で提供される）。
様々な実施形態では、本明細書において想定されるＴ細胞を製造するための方法は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体でＴ細胞を活性化することを含む。
本明細書において想定される方法によって製造されたＴ細胞組成物は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を阻害する１つ以上の薬剤の存在下で活性化及び／または増幅されたＴ細胞を含む。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するために改変されたＴ細胞は、Ｔ細胞が改変される前及び／または改変された後に、活性化及び／または増幅され得る。特定の実施形態では、Ｔ細胞集団は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するように活性化、改変され、次に増幅のために培養される。
一実施形態では、本明細書において想定される方法によって製造されたＴ細胞は、高増殖の可能性及び自己再生能力を示すマーカーを発現するが、Ｔ細胞分化の検出ができないマーカーを発現しないか、または実質的に発現しない増加した数のＴ細胞を含む。これらのＴ細胞は、強固な様式で繰り返し活性化及び増幅され、それにより改善された治療用Ｔ細胞組成物を提供し得る。
一実施形態では、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を阻害する１つ以上の薬剤の存在下で活性化及び増幅されたＴ細胞集団は、ＰＩ３Ｋ阻害剤なしで活性化及び増幅されたＴ細胞集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍以上増幅される。
一実施形態では、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を阻害する１つ以上の薬剤の存在下で活性化及び増幅された若いＴ細胞である、マーカーの発現を特徴とするＴ細胞集団は、ＰＩ３Ｋ阻害剤なしで活性化及び拡張されたＴ細胞集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍以上増幅される。
一実施形態では、本明細書において想定される方法によって活性化されたＴ細胞の増幅は、数時間（約３時間）〜約７日〜約２８日間、またはそれらの間の任意の時間単位の整数値の間、Ｔ細胞を含む細胞集団を培養することを更に含む。別の実施形態では、Ｔ細胞組成物は、１４日間培養され得る。特定の実施形態では、Ｔ細胞は約２１日間培養される。別の実施形態では、Ｔ細胞組成物は、約２〜３日間培養され得る。Ｔ細胞の培養時間が６０日以上であり得るように、数サイクルの刺激／活性化／増幅が望ましい場合もある。
特定の実施形態では、Ｔ細胞培養に適切な条件は、適切な培地（例えば、最小必須培地、またはＲＰＭＩ Ｍｅｄｉａ １６４０もしくはＸ−ｖｉｖｏ１５，（Ｌｏｎｚａ））、ならびに血清（例えば、ウシ胎仔またはヒト血清）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５，ＴＧＦβ、及びＴＮＦ−α、または当業者に既知の細胞の成長に好適な任意の他の添加剤を含むが、これらに限定されない、増殖及び生存能に必要な１つ以上の因子を含む。
細胞培養培地の更に例示的な例としては、限定されないが、ＲＰＭＩ １６４０、Ｃｌｉｃｋｓ、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５、及びＸ−Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられ、これにアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加され、無血清、または適切な量の血清（もしくは血漿）もしくは定義されたホルモン一式、ならびに／またはＴ細胞の成長及び増幅に十分な量のサイトカイン（複数可）で補足されるかのいずれかである。
Ｔ細胞増幅のための他の添加剤の例示的な例としては、界面活性剤、ピアスマネート（ｐｉａｓｍａｎａｔｅ）、ｐＨ緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、及び還元剤（Ｎ−アセチル−システイン及び２−メルカプトエタノールなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンは、実験培地にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気＋５％Ｃ０２）下で維持される。
特定の実施形態では、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及び／またはＩＬ−１５などの適切なサイトカインを含む培養培地において、一般的にビーズまたは他の表面に結合される抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体などの刺激物質及び共刺激物質と接触させられる。
他の実施形態では、様々な共刺激分子及びサイトカインの安定した発現及び分泌を指向するために、Ｋ５６２、Ｕ９３７、７２１．２２１、Ｔ２、及びＣ１Ｒを操作することによって作製された人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）。特定の実施形態では、Ｋ３２またはＵ３２ ａＡＰＣは、ＡＡＰＣ細胞表面上に１つ以上の抗体ベースの刺激分子の表示を指向するために使用される。Ｔ細胞集団は、限定されないが、ＣＤ１３７Ｌ（４−１ＢＢＬ）、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）、及び／またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６を含む、様々な共刺激分子を発現するａＡＰＣにより増幅され得る。最後に、ａＡＰＣは、遺伝子改変Ｔ細胞を増幅し、ＣＤ８ Ｔ細胞上のＣＤ２８発現を維持するために、効率的なプラットホームを提供する。ＷＯ０３／０５７１７１及びＵＳ２００３／０１４７８６９に提供されるａＡＰＣは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
３．薬剤
様々な実施形態では、細胞のＰＩ３Ｋ経路を調節する薬剤とＴ細胞を接触させることを含む、未分化または発達的に強力なＴ細胞を増幅するＴ細胞を製造するための方法が提供される。様々な実施形態では、細胞のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を調節する薬剤とＴ細胞を接触させることを含む、未分化または発達的に強力なＴ細胞を増幅するＴ細胞を製造するための方法が提供される。細胞は、活性化及び増幅の前、その間、及び／またはその後に接触させることができる。Ｔ細胞組成物は、それらが分化を実質的に増加させずに複数回増幅を受けることができるように、十分なＴ細胞効力を維持する。
本明細書で使用される場合、「調節する」、「調節因子」もしくは「調節剤」という用語、または比較可能な用語は、細胞シグナル伝達経路における変化を引き起こす薬剤の能力を指す。調節因子は、経路構成成分の量、活性を増加させるもしくは低減するか、または細胞シグナル伝達経路の所望の作用もしくは出力を増加させるまたは低減することができる。一実施形態では、調節因子は阻害剤である。一実施形態では、調節因子は活性化剤である。
「薬剤」は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の調節に使用される、化合物、小分子、例えば、小有機分子、核酸、ポリペプチド、またはそれらの断片、アイソフォーム、バリアント、類似体、もしくは誘導体を指す。
「小分子」は、約５ｋＤ未満、４ｋＤ未満、約３ｋＤ未満、約２ｋＤ未満、約１ｋＤ未満、または約．５ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指す。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド、炭水化物、脂質、それらの構成成分、または他の有機もしくは無機分子を含み得る。真菌、細菌、または藻類抽出物などの化学及び／または生物学的混合物のライブラリーは、当該技術分野において既知であり、本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。分子ライブラリーの合成方法の例は、（Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４ａ、Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４ｂ、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）に見出すことができる。
「類似体」は、化合物、ヌクレオチド、タンパク質、もしくはポリペプチドと類似するまたは同一の活性もしくは機能（複数可）を保有する小有機化合物、ヌクレオチド、タンパク質、またはポリペプチド、あるいは本発明の所望の活性を有するが、好ましい実施形態の配列もしくは構造に類似する、または同一である配列もしくは構造を必ずしも含まない化合物を指す。
「誘導体」は、アミノ酸残基の置換、欠失、もしくは付加の導入により変更された親タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列、あるいはヌクレオチドの置換もしくは欠失、付加もしくは突然変異の導入のいずれかにより改変された核酸またはヌクレオチドを含む、化合物、タンパク質、またはポリペプチドのいずれかを指す。誘導体の核酸、ヌクレオチド、タンパク質、またはポリペプチドは、親ポリペプチドと類似するまたは同一の機能を保有する。
様々な実施形態では、ＰＩ３Ｋ経路を調節する薬剤は、経路の構成成分を活性化する。「活性化剤」または「アゴニスト」は、限定されないが、ＰＩ３Ｋの１つ以上の活性を阻害する分子を含む、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路における分子の１つ以上の活性を促進、増加、または誘発する薬剤を指す。
様々な実施形態では、ＰＩ３Ｋ経路を調節する薬剤は、経路の構成成分を阻害する。「阻害剤」または「アンタゴニスト」は、限定されないが、ＰＩ３Ｋを含む、ＰＩ３Ｋ経路における分子の１つ以上の活性を阻害する、低減する、または減少させる薬剤を指す。一実施形態では、阻害剤は、２重分子阻害剤である。特定の実施形態では、阻害剤は、同じまたは実質的に類似する活性を有する分子のクラスを阻害し得るか（汎阻害剤）、または分子の活性を特異的に阻害し得る（選択的または特異的阻害剤）。阻害は、不可逆的または可逆的でもあり得る。
一実施形態では、阻害剤は、少なくとも１ｎＭ、少なくとも２ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも５０μＭ、または少なくとも１００μＭのＩＣ５０を有する。ＩＣ５０の決定は、当該技術分野において既知の任意の従来の技法を使用して達成され得る。例えば、ＩＣ５０は、研究中の阻害剤の濃度範囲の存在下で、所与の酵素の活性を測定することによって決定され得る。次に、酵素活性の実験的に得られた値を、使用した阻害剤濃度に対してプロットする。５０％酵素活性を示す（任意の阻害剤の不在下の活性と比較して）阻害剤の濃度が「ＩＣ５０」値と解釈される。類似的に、他の阻害濃度が活性の適切な決定を通して定義され得る。
様々な実施形態では、Ｔ細胞は、少なくとも１ｎＭ、少なくとも２ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも１００μＭ、または少なくとも１Ｍの濃度で、ＰＩ３Ｋ経路の１つ以上の調節因子と接触させられるか、または処理されるか、または培養される。
特定の実施形態では、Ｔ細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上増幅しながら、少なくとも１２時間、１８時間、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日間、少なくとも２週間、少なくとも１、２、３、４、５、または６ヶ月以上、ＰＩ３Ｋ経路の１つ以上の調節因子と接触させられるか、または処理されるか、または培養され得る。
ａ．ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路
ラパマイシン経路のホスファチジル−イノシトール−３キナーゼ／Ａｋｔ／哺乳類標的は、細胞増殖、分化、代謝、及び生存を伴う成長因子質シグナル伝達を組み込むための導管として機能する。ＰＩ３Ｋは、高度に保存された細胞内脂質キナーゼのファミリーである。クラスＩＡのＰＩ３Ｋは、直接またはアダプター分子のインスリン受容体基質ファミリーとの相互作用を通してのいずれかで、成長因子受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）により活性化される。この活性は、セリン／スレオニンキナーゼＡｋｔの制御因子であるホスファチジル−イノシトール−３，４，５−トリホスペート（ｔｒｉｓｐｈｏｓｐａｔｅ）（ＰＩＰ３）の産生をもたらす。ｍＴＯＲは、各々、明確な活性を付与する異なる結合パートナーを特徴とする２つの明確な複合体を介して標準ＰＩ３Ｋ経路を通して作用する。ｍＴＯＲＣ１（ＰＲＡＳ４０、猛禽類、及びｍＬＳＴ８／ＧｂＬとの複合体におけるｍＴＯＲ）は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達の下流エフェクターとして作用し、成長因子シグナルを、タンパク質翻訳、細胞成長、増殖、及び生存と関連付ける。ｍＴＯＲＣ２（ｒｉｃｔｏｒ、ｍＳＩＮ１、ｐｒｏｔｏｒ、及びｍＬＳＴ８との複合体におけるｍＴＯＲ）は、Ａｋｔの上流活性化因子として作用する。
ＰＩ３Ｋの成長因子受容体媒介活性化時に、Ａｋｔは、そのプレクストリン相同ドメインのＰＩＰ３との相互作用を通して膜に動員され、よって、その活性化ループを露出し、構成的活性ホスホイノシチド依存タンパク質キナーゼ１（ＰＤＫ１）によりスレオニン３０８（Ｔｈｒ３０８）でリン酸化を可能にする。最大活性化に関して、Ａｋｔは、そのＣ末端疎水性モチーフのセリン４７３（Ｓｅｒ４７３）でも、ｍＴＯＲＣ２によりリン酸化される。ＤＮＡ−ＰＫ及びＨＳＰもＡｋｔ活性の調節に重要であることが示されてきた。Ａｋｔは、ＴＳＣ１と共に、ｍＴＯＲＣ１の正の調節因子であるＲｈｅｂ ＧＴＰａｓｅを阻害することにより、ｍＴＯＲＣ１を負に調節する、ＴＳＣ２の阻害性リン酸化を通してｍＴＯＲＣ１を活性化する。ｍＴＯＲＣ１は、２つの十分に定義された基質であるｐ７０Ｓ６Ｋ（以後、Ｓ６Ｋ１と称される）及び４Ｅ−ＢＰ１を有し、その両方は、タンパク質合成を厳密に調節する。よって、ｍＴＯＲＣ１は、ＰＩ３Ｋの重要な下流エフェクターであり、成長因子シグナル伝達をタンパク質翻訳及び細胞増殖と関連付ける。
ｂ． ＰＩ３Ｋ阻害剤
本明細書で使用される場合、「ＰＩ３Ｋ阻害剤」という用語は、ＰＩ３Ｋの少なくとも１つの活性に結合し、それを阻害する核酸、ペプチド、化合物、または小有機分子を指す。ＰＩ３Ｋタンパク質は、クラス１のＰＩ３Ｋ、クラス２のＰＩ３Ｋ、及びクラス３のＰＩ３Ｋの３つのクラスに分けることができる。クラス１のＰＩ３Ｋは、４つのｐ１１０触媒サブ単位（ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、及びｐ１１０γ）のうちの１つ、ならびに調節サブ単位の２つのファミリーのうちの１つからなるヘテロ二量体として存在する。本発明のＰＩ３Ｋ阻害剤は、好ましくは、クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤を標的とする。一実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤の１つ以上のアイソフォームに選択性を示す（すなわち、ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、及びｐ１１０γ、またはｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、及びｐ１１０γのうちの１つ以上に対する選択性）。別の態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、アイソフォーム選択性を示さず、「汎ＰＩ３Ｋ阻害剤」と考えられる。一実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＡＴＰとＰＩ３Ｋ触媒ドメインへの結合に関して競合する。
ある特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、例えば、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路において、ＰＩ３Ｋならびに追加のタンパク質を標的とし得る。特定の実施形態では、ｍＴＯＲ及びＰＩ３Ｋの両方を標的とするＰＩ３Ｋ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤またはＰＩ３Ｋ阻害剤のいずれかと称され得る。ＰＩ３Ｋのみを標的とするＰＩ３Ｋ阻害剤は、選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤と称され得る。一実施形態では、選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤は、経路におけるｍＴＯＲ及び／または他のタンパク質に対して阻害剤のＩＣ５０より少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍以上低いＰＩ３Ｋに対して５０％阻害濃度を呈する薬剤を指すことが理解され得る。
特定の実施形態では、例示的なＰＩ３Ｋ阻害剤は、約２００ｎＭ以下、好ましくは約１００ｎｍ以下、更により好ましくは約６０ｎＭ以下、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、１μＭ以下のＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）でＰＩ３Ｋを阻害する。一実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、約２ｎＭ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、更により好ましくは約２ｎＭ〜約１５ｎＭのＩＣ５０でＰＩ３Ｋを阻害する。
本明細書において想定されるＴ細胞製造方法に使用するのに好適なＰＩ３Ｋ阻害剤の例示的な例としては、ＢＫＭ１２０（クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ１４７（クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、（汎−ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、及びＰＸ−８６６（クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤、ｐ１１０α、ｐ１１０β、及びｐ１１０γアイソフォーム、Ｏｎｃｏｔｈｙｒｅｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤の他の例示的な例としては、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ−２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ−１０１、ＺＳＴＫ４７４、及びＩＰＩ−１４５が挙げられるが、これらに限定されない。
汎ＰＩ３Ｋ阻害剤の更なる例示的な例としては、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ＧＳＫ１０５９６１５、ＴＧ１００７１３、及びＧＤＣ−０９４１が挙げられるが、これらに限定されない。
ｃ．ＡＫＴ阻害剤
本明細書で使用される場合、「ＡＫＴ阻害剤」という用語は、ＡＫＴの少なくとも１つの活性を阻害する核酸、ペプチド、化合物、または小有機分子を指す。ＡＫＴ阻害剤は、脂質ベースの阻害剤（例えば、ＡＫＴが形質膜に局在化するのを阻止するＡＫＴのプレクストリン相同ドメインを標的とする阻害剤）、ＡＴＰ競合阻害剤、及びアロステリック阻害剤を含む、いくつかのクラスに分けることができる。一実施形態では、ＡＫＴ阻害剤は、ＡＫＴ触媒部位に結合することによって作用する。特定の実施形態では、ＡＫＴ阻害剤は、ｍＴＯＲなどの下流ＡＫＴ標的のリン酸化を阻害することによって作用する。別の実施形態では、ＡＫＴ活性は、例えば、ＡＫＴのＤＮＡ−ＰＫ活性化、ＡＫＴのＰＤＫ−１活性化、及び／またはＡｋｔのｍＴＯＲＣ２活性化を阻害することにより、Ａｋｔを活性化する入力シグナルを阻害することにより阻害される。
ＡＫＴ阻害剤は、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３の３つ全てのＡＫＴアイソフォームを標的とし得るか、または選択的なアイソフォームであり得、ＡＫＴアイソフォームのうちの１つまたは２つのみを標的とする。一実施形態では、ＡＫＴ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路において、ＡＫＴならびに追加のタンパク質を標的とし得る。ＡＫＴのみを標的とするＡＫＴ阻害剤は、選択的ＡＫＴ阻害剤と称され得る。一実施形態では、選択的ＡＫＴ阻害剤は、経路において、他のタンパク質に対して阻害剤のＩＣ５０より少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍以上低いＡＫＴに対して５０％阻害濃度を呈する薬剤を指すことが理解され得る。
特定の実施形態では、例示的なＡＫＴ阻害剤は、約２００ｎＭ以下、好ましくは約１００ｎｍ以下、更により好ましくは約６０ｎＭ以下、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、１μＭ以下のＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）でＡＫＴを阻害する。一実施形態では、ＡＫＴ阻害剤は、約２ｎＭ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、更により好ましくは約２ｎＭ〜約１５ｎＭのＩＣ５０でＡＫＴを阻害する。
アウリスタチンベースの抗体−薬物抱合体と組み合わせて使用するためのＡＫＴ阻害剤の例示的な例としては、例えば、ペリホシン（Ｋｅｒｙｘ）、ＭＫ２２０６（Ｍｅｒｃｋ）、ＶＱＤ−００２（ＶｉｏＱｕｅｓｔ）、ＸＬ４１８（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＧＳＫ６９０６９３、ＧＤＣ−００６８、及びＰＸ３１６（ＰＲＯＬＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられる。
選択的Ａｋｔ１阻害剤の例示的な非限定的な例はＡ−６７４５６３である。
選択的Ａｋｔ２阻害剤の例示的な非限定的な例はＣＣＴ１２８９３０である。
特定の実施形態では、Ａｋｔ阻害剤、ＡｋｔのＤＮＡ−ＰＫ活性化、ＡｋｔのＰＤＫ−１活性化、ＡｋｔのｍＴＯＲＣ２活性化、またはＡｋｔのＨＳＰ活性化である。
ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤の例示的な例としては、ＮＵ７４４１、ＰＩ−１０３、ＮＵ７０２６、ＰＩＫ−７５、及びＰＰ−１２１が挙げられるが、これらに限定されない。
ｄ．ｍＴＯＲ阻害剤
「ｍＴＯＲ阻害剤」または「ｍＴＯＲを阻害する薬剤」という用語は、ｍＴＯＲタンパク質の少なくとも１つの活性、例えば、その基質のうちの少なくとも１つ上のセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性（例えば、ｐ７０Ｓ６キナーゼ１、４Ｅ−ＢＰ１、ＡＫＴ／ＰＫＢ、及びＥＦ２）などを阻害する核酸、ペプチド、化合物、または小有機分子を指す。ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２、またはｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の両方に直接結合し、それらを阻害することができる。
ｍＴＯＲＣ及び／またはｍＴＯＲＣ２活性の阻害は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路のシグナル伝達における減少により決定され得る。このようなシグナル伝達経路の出力の減少を確立するために、多種多様の読出しが利用され得る。いくつかの非限定的な例示的な読出しは、（１）限定されないが、５４７３及びＴ３０８を含む残基でのＡｋｔのリン酸化の低減、（２）例えば、限定されないが、Ｆｏｘ０１／Ｏ３ａ Ｔ２４／３２、ＧＳＫ３ａ／β、Ｓ２１／９、及びＴＳＣ２ Ｔ１４６２を含む、Ａｋｔ基質のリン酸化の減少によって確認されるように、Ａｋｔの活性の低減、（３）限定されないが、リボソームＳ６ Ｓ２４０／２４４、７０Ｓ６Ｋ Ｔ３８９、及び４ＥＢＰ１ Ｔ３７／４６を含む、ｍＴＯＲの下流のシグナル伝達分子のリン酸化の低減、ならびに（４）癌細胞の増殖の阻害を含む。
一実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は活性部位阻害剤である。これらは、ｍＴＯＲのＡＴＰ結合部位（ＡＴＰ活性ポケットとも称される）に結合し、ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の両方の触媒活性を阻害するｍＴＯＲ阻害剤である。本明細書において想定されるＴ細胞製造方法に使用するのに好適な活性部位阻害剤のクラスの１つは、ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲの両方を標的とし、直接阻害する２重特異性阻害剤である。２重特異性阻害剤は、ｍＴＯＲ及びＰＩ３ＫのＡＴＰ結合部位の両方に結合する。このような阻害剤の例示的な例としては、イミダゾキナゾリン、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、ＰＩ−１０３（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ＳＦ１１２６（Ｓｅｍａｆｏｒｅ）、ＢＧＴ２２６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ７６５（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、及びＮＶＰ−ＢＥＺ２３５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において想定される方法に使用するのに好適なｍＴＯＲ活性部位阻害剤の別のクラスは、１つ以上のＩ型ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ、例えば、ＰＩ３キナーゼα、β、γ、またはδに対して、ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２を選択的に阻害する。これらの活性部位阻害剤は、ｍＴＯＲの活性部位に結合するが、ＰＩ３Ｋの活性部位に結合しない。このような阻害剤の例示的な例としては、ピラゾロピリミジン、トリン１（Ｇｕｅｒｔｉｎ ａｎｄ Ｓａｂａｔｉｎｉ）、ＰＰ２４２（２−（４−アミノ−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−５−オール）、ＰＰ３０、Ｋｕ−００６３７９４、ＷＡＹ−６００（Ｗｙｅｔｈ）、ＷＡＹ−６８７（Ｗｙｅｔｈ）、ＷＡＹ−３５４（Ｗｙｅｔｈ）、及びＡＺＤ８０５５（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ，８，６２７−６４４，２００９）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｉ
一実施形態では、選択的ｍＴＯＲ阻害剤は、１、２、３つ以上のＩ型ＰＩ３キナーゼまたはＩ型ＰＩ３キナーゼの全てに対して阻害剤のＩＣ５０より少なくとも１０倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍以上低いｍＴＯＲＣ１及び／またはｍＴＯＲＣ２に対して５０％阻害濃度を呈する薬剤を指す。
本発明において使用するためのｍＴＯＲ阻害剤の別のクラスは、本明細書において、「ラパログ」と称される。本明細書で使用される場合、「ラパログ」という用語は、ｍＴＯＲ ＦＲＢドメイン（ＦＫＢＰラパマイシン結合ドメイン）に特異的に結合し、ラパマイシンに構造的に関係し、ｍＴＯＲ阻害性質を維持する化合物を指す。ラパログという用語は、ラパマイシンを除外する。ラパログは、ラパマイシンのエステル、エーテル、オキシム、ヒドラゾン、及びヒドロキシルアミン、ならびにラパマイシンコア構造上の官能基が、例えば、還元または酸化により改変された化合物を含む。このような化合物の薬学的に許容される塩もラパマイシン誘導体と考えられる。本明細書において想定される方法に使用するのに好適なラパログの例示的な例としては、テムシロリムス（ＣＣ１７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、デフォロリムス（ＡＰ２３５７３）、ＡＺＤ８０５５（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、及びＯＳＩ−０２７（ＯＳＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、薬剤は、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシン（シロリムス）である。
特定の実施形態では、本発明において使用するための例示的なｍＴＯＲ阻害剤は、約２００ｎＭ以下、好ましくは約１００ｎｍ以下、更により好ましくは約６０ｎＭ以下、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、１μＭ以下のＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）で、ｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２、またはｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の両方のいずれかを阻害する。一態様では、本発明において使用するためのｍＴＯＲ阻害剤は、約２ｎＭ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、更により好ましくは約２ｎＭ〜約１５ｎＭのＩＣ５０で、ｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２、またはｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の両方のいずれかを阻害する。
一実施形態では、例示的なｍＴＯＲ阻害剤は、約２００ｎＭ以下、好ましくは約１００ｎｍ以下、更により好ましくは約６０ｎＭ以下、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、１μＭ以下のＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）で、ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲＣ１もしくはｍＴＯＲＣ２、またはｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の両方、ならびにＰＩ３Ｋのいずれかを阻害する。一態様では、本発明において使用するためのｍＴＯＲ阻害剤は、約２ｎＭ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、更により好ましくは約２ｎＭ〜約１５ｎＭのＩＣ５０で、ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲＣ１もしくはｍＴＯＲＣ２、またはｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の両方、ならびにＰＩ３Ｋを阻害する。
本明細書において想定される特定の実施形態において使用するのに好適なｍＴＯＲ阻害剤の更なる例示的な例としては、ＡＺＤ８０５５、ＩＮＫ１２８、ラパマイシン、ＰＦ−０４６９１５０２、及びエベロリムスが挙げられるが、これらに限定されない。
ｍＴＯＲは、ウエスタンブロッティングにおいて蛍光体特異的抗体により測定されるとき、生理学的基質タンパク質ｐ７０ Ｓ６リボソームタンパク質キナーゼＩ（ｐ７０Ｓ６Ｋ１）及びｅＩＦ４Ｅ結合タンパク質１（４ＥＢＰ１）に対して強固かつ特異的な触媒活性を示すことが示された。
一実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＢＩ−Ｄ１８７０、Ｈ８９、ＰＦ−４７０８６７１、ＦＭＫ及びＡＴ７８６７からなる群から選択される、ｓ６キナーゼ阻害剤である。
Ｉ．組成物及び製剤
本明細書において想定される組成物は、本明細書において想定されるように、１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それらを含むベクター、遺伝子改変免疫エフェクター細胞等を含み得る。組成物は、薬学的組成物を含むが、これに限定されない。「薬学的組成物」は、単独で、または１つ以上の他の治療様式と組み合わせてのいずれかで、細胞または動物に投与するための、薬学的に許容される、または生理学的に許容される溶液に製剤化された組成物を指す。所望される場合、本発明の組成物は、他の薬剤、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬物、抗体、または他の様々な薬学的に活性な薬剤などと組み合わせて投与され得ることも理解されたい。本組成物に同様に含まれ得る他の構成成分に実質的に制限はないが、但し、追加の薬剤が、本組成物が意図される療法を送達する能力に悪影響を及ぼさないものとする。
「薬学的に許容される」という句は、本明細書において、健全な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に見合う、過度の傷害性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なく、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに好適であるこれらの化合物、材料、組成物、及び／または投薬形態を指すように採用される。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤」は、限定されないが、ヒトまたは家畜動物における使用に許容されると米国食品医薬品局によって承認された、任意のアジュバント、担体、賦形剤、滑走剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、染料／着色剤、風味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤を含む。例示的な薬学的に許容される担体は、ラクトース、グルコース、及びスクロースなどの糖類；コーンスターチ及びジャガイモデンプンなどのデンプン類；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体；トラガカント；モルト；ゼラチン；タルク；ココアバター、ワックス、動物脂及び植物脂、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；落花生油、綿実油、紅花油、胡麻油、オリーブ油、コーン油、及び大豆油などの油類；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールなどのポリオール類；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱性物質除去水；等張食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液、ならびに薬学的製剤において採用される任意の他の適合性物質を含むが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本発明の組成物は、本明細書において想定される、ある量のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む。本明細書で使用される場合、「量」という用語は、臨床結果を含む、有益なもしくは所望の予防または治療結果を達成するための、遺伝子改変治療用細胞、例えば、Ｔ細胞の「有効な量」または「有効量」を指す。
「予防有効量」は、所望の予防的結果を達成するために有効な遺伝子改変治療用細胞の量を指す。必要ではないが典型的には、予防量は、疾患の初期段階前または初期段階で対象に使用されるため、予防有効量は治療有効量よりも少ない。
遺伝子改変治療用細胞の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重などの要因、ならびに個体における所望の応答を引き起こす幹細胞及び前駆細胞の能力により変動し得る。治療有効量は、治療的に有益な作用がウイルスまたは形質導入された治療用細胞の任意の毒性または有害な作用を上回るものでもある。「治療有効量」という用語は、対象（例えば、患者）を治療するのに有効な量を含む。治療量が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、及び状態における個々の差を考慮して、維持により決定され得る。本明細書に記載されるＴ細胞を含む薬学的組成物は、１０２〜１０１０細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重の投薬量（これらの範囲内の全ての整数値を含む）で投与され得ることが一般的に記述され得る。細胞数は、その中に含まれる細胞の型のように、組成物が意図される最終用途に依存する。本明細書に提供される使用において、細胞は一般に、１リットル以下の容量であり、５００ｍＬ以下、更には２５０ｍＬまたは１００ｍＬ以下であり得る。よって、所望の細胞密度は、典型的には、１０６細胞／ｍｌ超、一般的に１０７細胞／ｍｌ超、一般的に１０８細胞／ｍｌ以上である。臨床的に適切な免疫細胞数は、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、または１０１２細胞と累積的に等しいか、またはそれらを超える複数の注入に分配され得る。本発明のいくつかの態様では、特に、注入された細胞の全てが特定の標的抗原（例えば、κまたはλ軽鎖）に再指向されるため、１０６／キログラム（患者当たり１０６〜１０１１）の範囲の低い細胞数が投与され得る。ＣＡＲ発現細胞組成物は、これらの範囲内の投薬量で複数回投与され得る。細胞は、療法を受ける患者に対して同種、同系、異種、または自家であり得る。所望される場合、治療は、免疫応答の誘発を強化するために、本明細書に記載されるように、マイトジェン（例えば、ＰＨＡ）もしくはリンホカイン、サイトカイン、及び／またはケモカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１８、及びＴＮＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α等）の投与も含む。
一般に、本明細書に記載されるように活性化及び増幅された細胞を含む組成物は、免疫不全の個体に生じる疾患の治療及び予防に利用され得る。特に、本明細書において想定されるＣＡＲ改変Ｔ細胞を含む組成物は、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に使用される。本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞は、単独で、あるいは担体、希釈剤、賦形剤、及び／またはＩＬ−２もしくは他のサイトカインまたは細胞集団などの他の構成成分と組み合わせて薬学的組成物としてのいずれかで投与され得る。特定の実施形態では、本明細書において想定される薬学的組成物は、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、もしくは賦形剤と組み合わせた、ある量の遺伝子改変Ｔ細胞を含む。
Ｔ細胞などのＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞集団を含む本発明の薬学的組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストランなどの炭水化物；タンパク質；グリシンなどのポリペプチドまたはアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；ならびに保存剤を含み得る。本発明の組成物は、好ましくは、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内、または筋肉内投与用に製剤化される。
液体薬学的組成物は、それらが溶液、懸濁液、または他の同様の形態であるかにかかわらず、注射用の水、食塩水溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル溶液、等張塩化ナトリウムなどの減菌希釈液、溶媒もしくは懸濁培地、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒として機能し得る合成モノもしくはジグリセリドなどの固定油；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；アセテート、シトレート、またはホスフェートなどの緩衝液、及び塩化ナトリウムもしくはデキストロースなどの等張性を調整するための薬剤のうちの１つ以上を含み得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチックで作製された多用量バイアルに封入され得る。注射可能な薬学的組成物は、好ましくは減菌である。
特定の実施形態では、本明細書において想定される組成物は、単独で、または１つ以上の治療薬と組み合わせて、有効量のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む。よって、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞組成物は、単独で、または放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学療法などの他の既知の癌治療と組み合わせて投与され得る。本組成物は、抗生物質と組み合わせても投与され得る。このような治療薬は、特定の癌など、本明細書に記載される特定の疾患状態の標準的な治療として、当該技術分野において認められていてよい。想定される例示的な治療薬としては、サイトカイン、成長因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症剤、化学療法剤、放射線療法剤、治療用抗体、または他の活性剤及び補助剤が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む組成物は、任意の数の化学療法剤と共に投与され得る。化学療法剤の例示的な例としては、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、及びウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びトリメチローロメラミンレジューム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ ｒｅｓｕｍｅ）を含むエチレンイミンならびにメチルアメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア；アクラシロマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デホファミン；デメコルシン；ジアジコン；エフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロナート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオミチン（ＤＭＦＯ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）などのレチノイン酸誘導体；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。癌に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用するホルモン拮抗剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も、この定義に含まれる。
様々な他の治療薬が、本明細書に記載される組成物と共に使用され得る。一実施形態では、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む組成物は、抗炎症剤と共に投与される。抗炎症剤または薬物は、ステロイド及びグルココルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含む）、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）（アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬物、シクロホスファミド、及びミコフェノレートを含む）を含むが、これらに限定されない。
他の例示的なＮＳＡＩＤは、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ＶＩＯＸＸ（登録商標）（ロフェコキシブ）及びＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（セレコキシブ）などのＣｏｘ−２、ならびにシアルレートからなる群から選択される。例示的な鎮痛薬は、アセトアミノフェン、オキシコドン、プロポルキシフェン（ｐｒｏｐｏｒｘｙｐｈｅｎｅ）塩酸塩のトラマドールからなる群から選択される。例示的なグルココルチコイドは、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、またはプレドニゾンからなる群から選択される。例示的な生物学的応答修飾物質は、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ５等）に対して指向される分子、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））などのサイトカイン阻害剤、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、及びインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、ケモカイン阻害剤、ならびに接着分子阻害剤を含む。生物学的応答修飾物質は、モノクローナル抗体ならびに分子の組換え形態を含む。例示的なＤＭＡＲＤは、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシリラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、金（経口（オーラノフィン）及び筋肉内）、及びミノサイクリンを含む。
本明細書において想定されるＣＡＲ改変Ｔ細胞と組み合わせるのに好適な治療用抗体の例示的な例としては、バビツキシマブ、ベバシズマブ（アバスチン）、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドゥリゴツマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エロツズマブ（ＨｕＬｕｃ６３）、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、ミラツズマブ、モキセツモマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、シルツキシマブ、テプロツムマブ、及びウブリツキシマブが挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、サイトカインと共に投与される。本明細書で使用される場合、「サイトカイン」とは、細胞間の介在物質として別の細胞に作用する１つの細胞集団によって放出されるタンパク質の一般的な用語を意味する。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝臓成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−アルファ及び−ベータ；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−ベータなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−アルファ、ベータ、及び−ガンマなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；ならびに顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１などのインターロイキン（ＩＬ）、ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で使用される場合、サイトカインという用語は、天然源または組換え細胞培養物からのタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
特定の実施形態では、組成物は、本明細書に開示されるＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で培養され、マーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２、ＣＤ１２７、及びＨＬＡ−ＤＲのうちの１つ以上を発現する本明細書において想定されるＣＡＲ Ｔ細胞を含む。一実施形態では、組成物は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上を発現するＴ細胞の特定のサブ集団を含み、ＣＤ３８もしくはＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８は、正または負の選択技法により更に単離される。様々な実施形態では、組成物は、マーカー：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３のうちの１つ以上を発現しない、または実質的に発現しない。
一実施形態では、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上の発現は、ＰＩ３Ｋ阻害剤なしで活性化及び増幅されたＴ細胞集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍以上増加する。
一実施形態では、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上の発現は、ＰＩ３Ｋ阻害剤と共に活性化及び増幅されたＴ細胞集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍以上低減される。
Ｊ．治療方法
本明細書において想定される遺伝子改変免疫エフェクター細胞は、限定されないが、免疫調節状態及び血液悪性腫瘍を含む、Ｂ細胞関連状態を治療する際に使用するための養子免疫療法の改善された方法を提供する。
特定の実施形態では、一次免疫エフェクター細胞の特異性は、一次免疫エフェクター細胞を、本明細書において想定されるＣＡＲで遺伝子改変することにより、Ｂ細胞に再指向される。様々な実施形態では、ウイルスベクターは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、ＴＭドメインをＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに連結する短いオリゴまたはポリペプチドリンカー、及び１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびに一次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする特定のポリヌクレオチドで免疫エフェクター細胞を遺伝子改変するために使用される。
一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞がＢＣＭＡ発現Ｂ細胞を標的とするＣＡＲを発現するように遺伝子改変される、ある種の細胞療法を含む。別の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞の治療性質及び持続性を増加させるために、ＩＬ−２及びＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で培養される。次に、ＣＡＲ Ｔ細胞は、それを必要とするレシピエントに注入される。注入された細胞は、レシピエントの疾患原因Ｂ細胞を死滅させることができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ Ｔ細胞は、インビボで複製することができ、癌療法の持続につながり得る長期持続性をもたらす。
一実施形態では、本発明のＣＡＲ Ｔ細胞は、強固なインビボＴ細胞増幅を受けることができ、長時間持続することができる。別の実施形態では、本発明のＣＡＲ Ｔ細胞は、任意の更なる腫瘍形成または成長を阻害するために再活性化され得る特異的なメモリーＴ細胞に進化する。
特定の実施形態では、本明細書において想定されるＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞を含む組成物が、異常なＢ細胞活性に関連する状態の治療に使用される。
本明細書において想定されるＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞を使用して治療、予防、または寛解することができる状態の例示的な例としては、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質抗体症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質抗体症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、及び急速進行性糸球体腎炎が挙げられるが、これらに限定されない。
改変された免疫エフェクター細胞は、重鎖病、原発性もしくは免疫細胞関連アミロイドーシス、及び意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）などの形質細胞障害における用途も有し得る。
本明細書で使用される場合、「Ｂ細胞悪性腫瘍」は、以下に論じられるＢ細胞（一種の免疫系細胞）に形成する一種の癌である。
特定の実施形態では、本明細書において想定されるＣＡＲ改変Ｔ細胞を含む組成物は、例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）などのＢ細胞悪性腫瘍を含むが、これに限定されない血液悪性腫瘍の治療に使用される。
多発性骨髄腫は、これらの細胞型の単クローンの腫瘍性形質転換を特徴とする成熟形質細胞形態のＢ細胞悪性腫瘍である。これらの形質細胞がＢＭにおいて増殖し、隣接する骨及び時折血液に浸潤する。多発性骨髄腫のバリアント形態は、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、及び髄外性形質細胞腫を含む（例えば、Ｂｒａｕｎｗａｌｄ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ ２００１）を参照されたい）。
非ホジキンリンパ腫は、多くのリンパ球（白血球）の癌を包含する。非ホジキンリンパ腫は、どの年齢でも生じ得、多くの場合、通常より大きいリンパ節、熱、及び体重損失を特徴とする。多くの異なる種類の非ホジキンリンパ腫が存在する。例えば、非ホジキンリンパ腫は、高悪性度（成長が速い）及び低悪性度（成長が遅い）の種類に分けることができる。非ホジキンリンパ腫は、本明細書において使用されるとき、Ｂ細胞及びＴ細胞に由来し得るが、「非ホジキンリンパ腫」及び「Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫」という用語は交換可能に使用される。Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫を含む。骨髄及び幹細胞移植後に生じるリンパ腫は通常、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫である。
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）は、Ｂリンパ球と呼ばれる未成熟の白血球細胞、またはＢ細胞においてゆっくりとした増加をもたらす低悪性度（成長が遅い）の癌である。癌細胞は、血液及び骨髄を通して広がり、リンパ節または肝臓及び脾臓などの他の臓器にも影響を及ぼし得る。ＣＬＬは最終的に骨髄を機能させなくする。時折、疾患の後期において、疾患は小リンパ球性リンパ腫と呼ばれる。
特定の実施形態では、治療有効量の、本明細書において想定されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞またはそれを含む組成物を、それを必要とする患者に、単独で、または１つ以上の治療薬と組み合わせて投与することを含む方法が提供される。ある特定の実施形態では、本発明の細胞は、異常なＢ細胞活性に関連する状態またはＢ細胞悪性腫瘍を発達させるリスクの患者を治療する祭に使用される。よって、本発明は、異常なＢ細胞活性に関連する状態またはＢ細胞悪性腫瘍を治療または予防することを必要とする対象に、治療有効量の、本明細書において想定されるＣＡＲ改変細胞を投与することを含む、その方法を提供する。
本明細書で使用される場合、「個体」及び「対象」という用語は、多くの場合、交換可能に使用され、遺伝子療法ベクター、細胞ベースの療法、及び本明細書の別の箇所に開示される方法で治療され得る疾患、障害、または状態の症状を呈する任意の動物を指す。好ましい実施形態では、対象は、遺伝子療法ベクター、細胞ベースの療法、及び本明細書の別の箇所に開示される方法で治療され得る造血系の疾患、障害、または状態、例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍の症状を呈する任意の動物を含む。好適な対象（例えば、患者）は、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、農場動物、及び家畜動物、またはペット（ネコまたはイヌ）を含む。非ヒト霊長類、及び好ましくはヒト患者が含まれる。典型的な対象は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する、Ｂ細胞悪性腫瘍と診断された、またはＢ細胞悪性腫瘍のリスクにある、もしくはそれを有しているヒト患者を含む。
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、遺伝子療法ベクター、細胞ベースの療法、及び本明細書の別の箇所に開示される方法で治療され得る特定の疾患、障害、または状態と診断された対象を指す。
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患もしくは病的状態の症状または病態に対する任意の有益または望ましい作用を含み、治療される疾患または状態の１つ以上の測定可能なマーカーにおける最小減少さえも含み得る。治療は、任意選択で、疾患もしくは状態の症状の減少または寛解、あるいは疾患もしくは状態の進行の遅延のいずれかを伴い得る。「治療」は、疾患もしくは状態、またはその関連症状の完全な根絶、あるいは治癒を必ずしも示さない。
本明細書で使用される場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」及び「予防される（ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ）」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」等の類似する用語は、疾患もしくは状態の発生または再発の可能性を予防する、阻害する、または減少させるためのアプローチを指す。疾患もしくは状態の開始または再発を遅延する、あるいは疾患もしくは状態の症状の発生または再発を遅延することも指す。本明細書で使用される場合、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」及び類似する用語も、疾患もしくは状態の開始または再発前の疾患もしくは状態の強度、作用、症状、及び／または負荷を減少させることも含む。
「強化する」もしくは「促進する」、または「増加させる」もしくは「増幅する」は、一般的に、本明細書において想定される組成物、例えば、遺伝子改変Ｔ細胞またはＣＡＲをコードするベクターが、ビヒクルもしくは対照分子／組成物のいずれかによってもたらされた応答と比較して、より大きい生理学的応答（すなわち、下流作用）を産生する、引き起こす、またはもたらす能力を指す。測定可能な生理学的応答は、当該技術分野における理解及び本明細書の説明から明らかである、Ｔ細胞の増幅、活性化、持続の増加、及び／またはとりわけ、癌細胞死滅能の増加を含み得る。「増加」または「強化」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照組成物によって産生された応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍以上（例えば、５００、１０００倍）（その間及び１を超える全ての整数及び小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８等を含む）である増加を含み得る。
「低減する」、または「低下させる」、または「小さくする」、または「減少させる」、または「軽減する」とは、本明細書において想定される組成物が、ビヒクルまたは対照分子／組成物のいずれかによってもたらされた応答と比較して、より小さい生理学的応答（すなわち、下流作用）を産生する、引き起こす、またはもたらす能力を指す。「低減」または「減少」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、対照組成物、または特定の細胞系列における応答によって産生された応答（参照応答）の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍以上（例えば、５００、１０００倍）（その間及び１を超える全ての整数及び小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８等を含む）である減少を含み得る。
「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化しない」、または「実質的に変化しない」、または「実質的に低減しない」とは、一般的に、本明細書において想定される組成物が、ビヒクル、対照分子／組成物のいずれかによってもたらされた応答、または特定の細胞系列における応答と比較したとき、細胞においてより小さい生理学的応答（すなわち、下流作用）を産生する、引き起こす、またはもたらす能力を指す。比較可能な応答は、参照応答と大幅に異ならないか、または測定可能な差がないものである。
一実施形態では、Ｂ細胞関連状態の治療を必要とする対象にそれを行う方法は、本明細書において想定される遺伝子改変免疫エフェクター細胞を含む組成物の有効量、例えば、治療有効量を投与することを含む。投与の量及び頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類及び重症度などの要因によって決定されるが、適切な投薬量が臨床試験によって決定され得る。
一実施形態では、対象に投与される組成物中のＴ細胞の量は、少なくとも０．１ｘ１０５細胞、少なくとも０．５ｘ１０５細胞、少なくとも１ｘ１０５細胞、少なくとも５ｘ１０５細胞、少なくとも１ｘ１０６細胞、少なくとも０．５ｘ１０７細胞、少なくとも１ｘ１０７細胞、少なくとも０．５ｘ１０８細胞、少なくとも１ｘ１０８細胞、少なくとも０．５ｘ１０９細胞、少なくとも１ｘ１０９細胞、少なくとも２ｘ１０９細胞、少なくとも３ｘ１０９細胞、少なくとも４ｘ１０９細胞、少なくとも５ｘ１０９細胞、または少なくとも１ｘ１０１０細胞である。特定の実施形態では、約１ｘ１０７ＣＡＲ Ｔ細胞〜約１ｘ１０９ＣＡＲ Ｔ細胞、約２ｘ１０７ＣＡＲ Ｔ細胞〜約０．９ｘ１０９ＣＡＲ Ｔ細胞、約３ｘ１０７ＣＡＲ Ｔ細胞〜約０．８ｘ１０９ＣＡＲ Ｔ細胞、約４ｘ１０７ＣＡＲ Ｔ細胞〜約０．７ｘ１０９ＣＡＲ Ｔ細胞、約５ｘ１０７ＣＡＲ Ｔ細胞〜約０．６ｘ１０９ＣＡＲ Ｔ細胞、または約５ｘ１０７ＣＡＲ Ｔ細胞〜約０．５ｘ１０９ＣＡＲ Ｔ細胞が対象に投与される。
一実施形態では、対象に投与される組成物中のＴ細胞の量は、少なくとも０．１ｘ１０４細胞／体重のｋｇ、少なくとも０．５ｘ１０４細胞／体重のｋｇ、少なくとも１ｘ１０４細胞／体重のｋｇ、少なくとも５ｘ１０４細胞／体重のｋｇ、少なくとも１ｘ１０５細胞／体重のｋｇ、少なくとも０．５ｘ１０６細胞／体重のｋｇ、少なくとも１ｘ１０６細胞／体重のｋｇ、少なくとも０．５ｘ１０７細胞／体重のｋｇ、少なくとも１ｘ１０７細胞／体重のｋｇ、少なくとも０．５ｘ１０８細胞／体重のｋｇ、少なくとも１ｘ１０８細胞／体重のｋｇ、少なくとも２ｘ１０８細胞／体重のｋｇ、少なくとも３ｘ１０８細胞／体重のｋｇ、少なくとも４ｘ１０８細胞／体重のｋｇ、少なくとも５ｘ１０８細胞／体重のｋｇ、または少なくとも１ｘ１０１０細胞／体重のｋｇである。特定の実施形態では、約１ｘ１０６ＣＡＲ Ｔ細胞／体重のｋｇ〜約１ｘ１０８ＣＡＲ Ｔ細胞／体重のｋｇ、約２ｘ１０６ＣＡＲ Ｔ細胞／体重のｋｇ〜約０．９ｘ１０８ＣＡＲ Ｔ細胞／体重のｋｇ、約３ｘ１０６ＣＡＲ Ｔ細胞／体重のｋｇ〜約０．８ｘ１０８ＣＡＲ Ｔ細胞／体重のｋｇ、約４ｘ１０６ＣＡＲ Ｔ細胞／体重のｋｇ〜約０．７ｘ１０８ＣＡＲ Ｔ細胞／体重のｋｇ、約５ｘ１０６ＣＡＲ Ｔ細胞／体重のｋｇ〜約０．６ｘ１０８ＣＡＲ Ｔ細胞／体重のｋｇ、または約５ｘ１０６ＣＡＲ Ｔ細胞／体重のｋｇ〜約０．５ｘ１０８ＣＡＲ Ｔ細胞／体重のｋｇが対象に投与される。
当業者は、本発明の組成物の複数回投与が所望の療法をもたらすために必要とされ得ることを認識するだろう。例えば、組成物は、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、５年、１０年以上にわたって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上投与され得る。
ある特定の実施形態では、活性化された免疫エフェクター細胞を対象に投与し、続いて、再採血し（またはアフェレーシスを行う）、本発明に従いそれからの免疫エフェクター細胞を活性化し、これらの活性化及び増幅した免疫エフェクター細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間に複数回行われ得る。ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化され得る。ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、１００ｃｃ、１５０ｃｃ、２００ｃｃ、２５０ｃｃ、３００ｃｃ、３５０ｃｃ、または４００ｃｃ以上の採血から活性化される。理論に拘束されるものではないが、この複数回採血／複数回再注入プロトコルを使用することにより、免疫エフェクター細胞のある特定の集団を選び出すのに役立ち得る。
本明細書において想定される組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、留置、または移植を含む、任意の従来の様式で行うことができる。好ましい実施形態では、組成物は、非経口投与される。本明細書で使用される場合、「非経口投与」及び「非経口投与される」という句は、腸内及び局所投与以外、通常、注射による投与モードを指し、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、ならびに胸骨内注射及び注入を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、本明細書において想定される組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位への直接注射により対象に投与される。
一実施形態では、それを必要とする対象は、対象におけるＢ細胞関連状態に対する細胞免疫応答を増加させるために、有効量の組成物を投与される。免疫応答は、感染細胞、調節性Ｔ細胞、及びヘルパーＴ細胞応答を死滅させることができる細胞傷害性Ｔ細胞により媒介される細胞免疫応答を含み得る。Ｂ細胞を活性化することができるヘルパーＴ細胞によって主に媒介され、よって抗体産生につながる体液性免疫応答も誘発され得る。本発明の組成物によって誘発された免疫応答の種類を分析するために、様々な技法が使用され得、これらは、例えば、Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ（２００１）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙによって編集されたＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙに詳しく説明されている。
Ｔ細胞媒介死滅の場合、ＣＡＲ−リガンド結合は、Ｔ細胞へのＣＡＲシグナル伝達を開始し、Ｔ細胞が様々な機構によって標的細胞のアポトーシスを誘発することができるタンパク質の産生または放出を誘発する、様々なＴ細胞シグナル伝達経路の活性化をもたらす。これらのＴ細胞媒介機構は、（限定されないが）Ｔ細胞から標的細胞内への細胞内細胞傷害性顆粒の移動、直接的に標的細胞死滅を誘発することができる（または他のキラーエフェクター細胞の動員を介して間接的に）炎症促進性サイトカインのＴ細胞分泌、及び標的細胞上のそれらの同族細胞死受容体（例えば、Ｆａｓ）に結合した後に標的細胞のアポトーシスを誘発するＴ細胞表面上の細胞死受容体リガンド（例えば、ＦａｓＬ）の上方調節を含む。
一実施形態では、本発明は、ＢＣＭＡ発現Ｂ細胞関連状態と診断された対象から免疫エフェクター細胞を除去し、本明細書において想定されるＣＡＲをコードする核酸を含むベクターで、該免疫エフェクター細胞を遺伝子改変し、それにより改変された免疫エフェクター細胞集団を産生し、改変された免疫エフェクター細胞集団を同じ対象に投与することを含む、Ｂ細胞関連状態と診断された対象を治療する方法を提供する。好ましい実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。
ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＡＲ分子をコードする核酸構築物を発現する免疫エフェクター細胞集団を対象に投与するステップを含む、対象において標的細胞集団に応答する免疫エフェクター細胞媒介免疫調節因子を刺激するための方法も提供する。
本明細書に記載される細胞組成物を投与するための方法は、対象において本発明のＣＡＲを直接発現するか、または対象内への導入時にＣＡＲを発現する成熟免疫エフェクター細胞に分化する免疫エフェクター細胞の遺伝子改変前駆体の再導入時のいずれかであるエクスビボの遺伝子改変免疫エフェクター細胞の再導入をもたらすのに効果的である任意の方法を含む。方法の１つは、本発明による核酸構築物を末梢血Ｔ細胞にエクスビボで形質導入し、形質導入した細胞を対象内に戻すことを含む。
本明細書に引用される全ての刊行物、特許出願、及び登録特許は、各個々の刊行物、特許出願、または登録特許が参照により組み込まれると具体的かつ個々に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
前述の発明は理解の明確化の目的のため、図示及び例によりある程度詳細に記載されてきたが、本発明の教示の観点から、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、ある特定の変更及び修正がそれに対して行われ得ることは、当業者には容易に明らかであろう。以下の実施例は単に図示のために提供され、制限するためではない。当業者は、本質的に類似する結果をもたらすように変更または修正され得る、様々な重要ではないパラメータを容易に認識するだろう。
実施例１
ＢＣＭＡ ＣＡＲの構築
マウス抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ抗体を含有するＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖに動作可能に連結されたＭＮＤプロモーター、ＣＤ８αからのヒンジ及び膜貫通ドメイン、及びＣＤ１３７共刺激ドメイン、続いて３ζ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインを含有するように設計された。例えば、図１を参照されたい。図１に示されるＢＣＭＡ ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞上での表面発現のためのＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＰ）配列を含む。例示的なＢＣＭＡ ＣＡＲのポリヌクレオチド配列は配列番号１０に記載され、ＢＣＭＡ ＣＡＲの例示的なポリペプチド配列は配列番号９に記載され、例示的なＣＡＲ構築物のベクターマップは図１に示される。表３は、ＢＣＭＡ ＣＡＲレンチウイルスベクターの様々なヌクレオチドセグメントの識別情報、Ｇｅｎｂａｎｋ参照、供給源名、及び引用文献を示す。
実施例２
マウスＢＣＭＡ ＣＡＲの評価
はじめに
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で遺伝子操作されたＴ細胞の養子移入は、癌を治療するための有望なアプローチとなった。ＣＡＲは、膜貫通領域を介してＴ細胞シグナル伝達ドメインに融合された抗原反応性単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）で構成された人工分子である。この実施例では、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的なＣＡＲ分子が評価された。ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫、形質細胞腫、及びいくつかのリンパ腫に発現されるが、正常な発現は形質細胞に限られる（Ａｖｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００３、Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲは、マウス抗ＢＣＭＡ抗体（Ｃ１１Ｄ５．３）からの配列を使用して構築された。抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲは改変配列を使用して構築され、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲの「ヒト化」型である。一連のインビトロアッセイにおいて、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞の両方が、腫瘍特異性、抗ＣＡＲ発現を呈し、抗原発現標的に強力な反応性をもたらした。抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ発現腫瘍細胞系に対して比較可能な反応性を有することが示された。抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞の両方はマウス腫瘍モデルにおいて縮小をもたらすことができたが、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗原依存性炎症性サイトカイン分泌を示し、よって、臨床毒性に関連する高サイトカインレベルを生じる可能性を有する。
結果
抗ＢＣＭＡ１０ Ｔ細胞から放出された強直性炎症性サイトカインはアポトーシスに関連した。
ＢＣＭＡタンパク質は、多発性骨髄腫の患者の血清において検出可能であった（Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。多発性骨髄腫患者における平均血清ＢＣＭＡは１０ｎｇ／ｍＬであったが、最大１００ｎｇ／ｍＬのレベルでピークであった。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞候補に対する生理学的に可溶性のＢＣＭＡレベルが評価された。
抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲＴ細胞、及びＣＡＲ１９Δ Ｔ 細胞からのＩＦＮγ放出は、可溶性ＢＣＭＡと共に２４時間培養した後に検査された（図２ａ）。抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞は、最大１ｕｇ／ｍＬまでのＢＣＭＡと共に２４時間培養した後、最小サイトカイン放出で応答した。対照的に、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、培養物に添加された可溶性ＢＣＭＡの濃度に比例したＩＦＮγレベルの増加で応答した。多発性骨髄腫患者において報告された最高レベルの１００ｎｇ／ｍＬのＢＣＭＡで、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞によって分泌された２８．８ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγと比較して、８２．１ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγを分泌した。ＩＦＮγは、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞＋ＢＣＭＡ抗原を欠く対照細胞系を用いたいくつかの共培養実験においても検出された（図２ｂ、Ｋ５６２共培養）。これらのデータは、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞が可溶性ＢＣＭＡによる刺激に対して増加した感受性、及びＴ細胞における抗原依存性サイトカイン応答の可能性を有したことを示唆した。
抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲＴ細胞（培養開始から１０日）、及びＣＡＲ１９Δ Ｔ細胞からの強直性サイトカイン分泌の可能性が検査された。ＣＡＲ Ｔ細胞の製造後、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲＴ細胞、及びＣＡＲ１９Δ Ｔ細胞の培養物からの成長培地は、炎症性サイトカインの存在に関して分析された。抗原刺激の不在にもかかわらず、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞培養物は、ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞培養物中１ｎｇ／ｍＬ未満のＩＦＮγと比較して、１０ｎｇ／ｍＬ超のＩＦＮγを含有した（図３）。抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞培養物は、大幅に（ｐ＜０．００１）多くのＴＮＦαも含有した。抗原刺激なしで抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞によって産生されたサイトカインの量を更に定量化するために、２４時間の培養中に、５ｘ１０４ＣＡＲ Ｔ細胞からのサイトカイン放出を測定した。抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、大幅に高い量の炎症性サイトカインＭＩＰ１α、ＩＦＮγ、ＧＭＣＳＦ、ＭＩＰ１β、ＩＬ−８、及びＴＮＦαを産生した（図４、ｐ＜０．０００１）。ＭＩＰ１α及びＩＦＮγの濃度は、検査した全てのサイトカインの中で最も高かった。抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、４．７ｎｇのＭＩＰ１α／５ｘ１０４細胞／２４時間、３．０ｎｇのＩＦＮγ／５ｘ１０４細胞／２４時間、及び約１ｎｇ／５ｘ１０４細胞／２４時間以下の他のサイトカインを産生した。抗炎症性サイトカインＩＬ−１０、ＩＬ−２、及びＩＬ−４において顕著な差は検出されなかった。
抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞製造の終わりでのＴ細胞活性化の表現型マーカーの発現は、強直性炎症性サイトカインの分泌が抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞の活動亢進状態を示すかどうかを検査するために測定された。ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ２５は、Ｔ細胞活性化１２〜２４時間後に通常ピーク発現を呈し、その後時間と共に減退する表面マーカーである。３つの正常なドナーから調製したＣＡＲ Ｔ細胞は、平均４０±２％の抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞がＨＬＡ−ＤＲを発現したことを示した。これらの細胞におけるＨＬＡ−ＤＲの発現は、形質導入されなかった（４３±２．３％）Ｔ細胞及びＣＡＲ１９Δ（３２±２．２％）対照Ｔ細胞と比較可能であった。対照的に、８８±１．２％の抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞はＨＬＡ−ＤＲを発現した（図５）。別の活性化マーカーＣＤ２５の発現も、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞でより高かった（５３±０．９％対３５±２．４％）。したがって、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、追加抗原の不在下で、活性化されたＴ細胞の表現型特性を呈した。
Ｔ細胞における活動亢進は、多くの場合、アポトーシスによる活性化誘発細胞死（ＡＩＣＤ）に関連する。活性化されたカスパーゼ−３のレベルは、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞の活動亢進が、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、より高いアポトーシスレベルをもたらし得るかどうかを検査するために測定された。１６％の抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、２つのドナーからの４８％の抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞が活性カスパーゼ−３を有した（図６）。よって、追加のＢＣＭＡ抗原の不在下で、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して増加した活性化及び炎症性サイトカイン分泌に関連する、高頻度のアポトーシス細胞を含有する。
抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞が低ＢＣＭＡレベルに選択的に応答するか、またはＴ細胞成長に使用されたヒト血清において無関係の抗原に交差反応性であり得るかどうかについて評価された。Ｔ抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ヒト血清を欠く培地中に２日間維持され、次いで、１００ｎｇ／ｍＬの可溶性ＢＣＭＡの存在下または不在下の、ウシ胎血清（ＦＢＳ）、ヒト血清（ＨＡＢＳ）、またはＨＡＢＳを含有する培地に交換された（図７）。ＩＦＮγ放出はＥＬＩＳＡにより２４時間後にアッセイされた。抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞の両方が可溶性ＢＣＭＡに応答した。しかしながら、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞より１０倍多くＩＦＮγを分泌した。ＢＣＭＡの不在下で、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ｐ＝０．０００２）またはヒトＡＢ血清（ＨＡＢＳ）（ｐ＝０．０００７）の培養に関係なく、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞のみがＩＦＮγを放出した。これらのデータは、炎症性サイトカインの分泌が抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞に内在的であったことを示唆した。
多発性骨髄腫のマウスモデルにおける抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞の劣った抗腫瘍機能
活性化過剰及びアポトーシスの増加は、患者、そして最終的には臨床的有効性において、ＣＡＲ Ｔ細胞持続性に負の影響を及ぼす可能性がある。マウス腫瘍モデルにおいて、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍機能を検査した。約１００ｍｍ３の実験皮下ヒト多発性骨髄腫（ＲＰＭＩ−８２２６）の腫瘍を有するＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスを、１０７抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞、１０７抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞、またはボルテゾミブ（ベルケイド）で処置した。ＲＰＭＩ−８２２６の成長をキャリパーで監視した。２つの独立した実験において（図８ａ及び８ｂ）、ボルテゾミブは、ビヒクル対照動物と比較して、腫瘍成長を制御した。抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞を養子移入された動物は、迅速かつ永続的な腫瘍クリアランスを呈した（挿入グラフは初期の腫瘍縮小を誇張する）。抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞の養子移入は腫瘍縮小ももたらしたが、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、両実験において遅延された。
結論
抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、インビトロアッセイにおいて、比較可能な抗腫瘍機能を呈したが、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、患者の治療における安全性及び有効性に負の影響を及ぼす可能性がある特性を有した。抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、生理学的レベルのＢＣＭＡタンパク質に曝露された後、炎症性サイトカインの分泌で確実に応答した。サイトカインストームまたはサイトカイン放出症候群は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法に関連する既知の臨床毒性である。ＢＣＭＡへのサイトカイン放出に対する懸念は、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞の強直な活性の観察後に深刻化した。抗原刺激の不在下でさえ、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、高レベルの炎症性サイトカインを放出した。持続するサイトカイン分泌は、実質的な臨床毒性をもたらし、また抗腫瘍機能に負の影響を及ぼす可能性を有する。実際、我々は、多発性骨髄腫のマウスモデルにおいて、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞培養物と比較して、抗ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲ Ｔ細胞においてアポトーシス細胞の組成がより高く、抗腫瘍機能が劣っていることを発見した。
参照文献
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実施例３
リンパ腫における最小ＢＣＭＡ発現は抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を活性化する
リンパ腫及び白血病細胞系（Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉ）上のＢＣＭＡ発現レベルは、発現が抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞を活性化するのに十分であるかを決定するために測定された。
リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫細胞上のＢＣＭＡ発現は、フローサイトメトリーを使用して定量化された。このアッセイでは、既知数の結合抗体（抗体結合能、ＡＢＣ）に対してＢＣＭＡ発現の蛍光強度を相関させることにより、細胞上の相対的なＢＣＭＡ発現が評価された。リンパ腫細胞系におけるＢＣＭＡ発現レベルは、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞を活性化することが知られている多発性骨髄腫細胞系（ＲＰＭＩ−８２２６）のＢＣＭＡ発現レベルと比較された。１２５９０±１２７５ ＢＣＭＡ０２分子がＲＰＭＩ−８２２６細胞の表面上で発現された。対照的に、Ｄａｕｄｉ細胞は１１７３±２３４ ＢＣＭＡ０２分子を発現し、ＪｅＫｏ−１細胞（マントル細胞リンパ腫細胞系）は２２２±１３８ ＢＣＭＡ０２分子のみを発現した（図９、丸）。
別の実験組では、リンパ腫及び白血病細胞系に観察された微小レベルのＢＣＭＡに対する抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞の活性が試験された（図９、ボックス）。抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞は、標準的な方法を使用して生成され、活性は、ＢＣＭＡ陽性及びＢＣＭＡ陰性の腫瘍細胞系で共培養した後に、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡにより評価された。抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞の反応性は、共培養後の様々な腫瘍細胞系の表面上のＢＣＭＡ ｍＲＮＡ発現の相対量（閾値より上）及び／またはＢＣＭＡ受容体の密度と相関した（図９）。もしあれば、少量のＩＦＮγがＢＣＭＡ−陰性（ＢＣＭＡ−）腫瘍細胞系、骨髄性白血病（Ｋ５６２）、急性リンパ芽球性白血病（ＮＡＬＭ−６及びＮＡＬＭ−１６）、マントル細胞リンパ腫（ＲＥＣ−１）、またはホジキンリンパ腫（ＨＤＬＭ−２）と共にＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を共培養したときに放出される。対照的に、実質的な量のＩＦＮγがＢＣＭＡ−陽性（ＢＣＭＡ＋）腫瘍細胞系：Ｂ細胞慢性リンパ芽球性白血病（ＭＥＣ−１）、マントル細胞リンパ腫（ＪｅＫｏ−１）、ホジキンリンパ腫（ＲＰＭＩ−６６６６）、バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ細胞及びＲａｍｏｓ細胞）、及び多発性骨髄腫（ＲＰＭＩ−８２２６）と共にＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞を共培養したときに放出された。
バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ細胞）を発現するＢＣＭＡに対する抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞の反応性は、インビボ動物研究に及んだ。Ｄａｕｄｉ細胞はＣＤ１９も発現する。抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ活性は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ活性と比較された。ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスに２ｘ１０６ Ｄａｕｄｉ細胞をＩＶ注射し、ＣＡＲ Ｔ細胞で処置する前に大きな全身性腫瘍負荷を蓄積させた。ＣＡＲ Ｔ細胞を、腫瘍誘発８日後及び１８日後に投与した（それぞれ、図１０Ａ及び１０Ｂ）。ビヒクル及び陰性対照（抗ＣＤ１９Δ ＣＡＲ Ｔ細胞）は、生物発光の対数期増加により示されるように、腫瘍の成長を阻止することができず、体重が損失し、死亡した（図１０Ａ、最も左側の２匹のマウスパネル）。抗ＣＤ１９及び抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞は腫瘍の成長を阻止し、体重を維持し、生存した。抗ＣＤ１９及び抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞は、８日目に投与された場合、等しく効果的であった（図１０Ａ、最も右側の２匹のマウスパネル）。抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞も、腫瘍誘発１８日後に投与された場合、腫瘍負荷の減少に効果的であった。図１０Ｂ、最も右側のパネル。
実施例４
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ 細胞の強力なインビトロ活性
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の強力なインビトロ活性は５０パーセント減少した抗ＢＣＭＡ ＣＡＲＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ発現で達成された。Ｔ細胞集団は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ分子をコードするレンチウイルスの４ｘ１０８〜５ｘ１０７の形質導入単位で形質導入された。得られたＴ細胞集団は、抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞頻度（陽性率としてアッセイされた）の減少及び抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ分子の発現（平均蛍光強度：ＭＦＩとしてアッセイされた）の減少を示した。
抗ＢＣＭＡ０２活性に対するＣＡＲ分子発現の減少の影響を決定した。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ−陽性Ｔ細胞の頻度は、２６±４％のＢＣＭＡ反応性Ｔ細胞を含有するように、形質導入されなかったＴ細胞で正規化された（図１１Ａ）。正規化された抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞のＭＦＩは、８８５〜１８７５の範囲であった（図１１Ｂ）。Ｋ５６２は、ＢＣＭＡ発現を欠くＣＭＬ細胞系である。Ｋ５６２細胞はＢＣＭＡを発現するように操作され、様々なＢＣＭＡ ＣＡＲ発現での抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞の活性を評価するためにインビトロ細胞溶解アッセイに使用された（図１１Ｃ）。Ｋ５６２細胞はｃｅｌｌ ｔｒａｃｅバイオレットで標識されたが、ＢＣＭＡを安定して発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ＢＣＭＡ）はＣＦＳＥで標識された。Ｔ細胞、Ｋ５６２細胞、及びＫ５６２−ＢＣＭＡ細胞を採取し、洗浄し、外因性サイトカインを欠く培地に再懸濁した。細胞を、２０：１または１０：１エフェクター（Ｅ；Ｔ細胞）で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで４時間、標的（Ｔ；Ｋ５６２及びＫ５６２ ＢＣＭＡ細胞の１：１混合）の比率に培養した。次いで、細胞を生存／脂肪で染色し、ＦＡＣＳにより分析した。細胞傷害性は、Ｔ細胞を欠く状態に正規化されたＫ５６２：Ｋ５６２−ＢＣＭＡの比率の差により決定された。
実施例５
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞製造プロセス
独特の抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞産物を各患者の治療用に製造する。抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞産物の製造プロセスの信頼度は、１１の個々の正常なドナーＰＢＭＣから抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞を生成することにより評価された。各ドナーからの抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞の増幅は、平行して行われた対応する形質導入されていない培養と比較可能であった（図１２Ａ）。
培養期間の終わりに（１０日目）、Ｔ細胞形質導入の有効性を、組み込まれたレンチウイルスの数を、ｑＰＣＲ及びレンチウイルス特異的プライマーセット（ベクターコピー数、ＶＣＮ）で定量化することにより評価した。１１のドナーからの抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞培養物は、比較可能なレンチウイルス形質導入効率を示した（図１２Ｂ）。抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の頻度はフローサイトメトリーにより測定され、ＢＣＭＡ発現は全てのドナーにわたって比較可能であることが分かった（図１２Ｃ）。
各抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞産物の活性は、ＢＣＭＡを発現するように操作されたＫ５６２細胞で共培養された後のＩＦＮγ放出により評価された。全ての抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ０２ Ｔ細胞産物は、ＢＣＭＡ発現Ｋ５６２細胞に曝露された場合、治療的に適切なレベルのＩＦＮγ放出を呈した（図１２Ｄ）。
実施例６
ＩＬ−２またはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で処理されたＣＡＲ Ｔ細胞上でのＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８発現
ＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４と共に培養されたＣＡＲ Ｔ細胞は、ＩＬ−２単独で培養されたＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ発現の増加を示す。ＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４と共に培養された抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞上の２９の追加の細胞表面マーカーの発現分析は、多パラメータマスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）を使用して行われ、ＩＬ−２単独で培養されたＣＡＲ Ｔ細胞と比較された。３つの追加のマーカー（ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８）は、ＩＬ−２単独で処理されたＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＩＬ−２＋ＺＳＴＫ４７４処理されたＣＡＲ Ｔ細胞において発現の増加を示した。よって、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８の同時発現は、ＺＳＴＫ４７４培養されたＣＡＲ Ｔ細胞を更に層別化した。ＩＬ−２を含有する培地で培養した後、７．４４％の抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔが、ＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で培養された２４．５％の抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８を同時発現した。図１３のベン図は、ＣＤ６２Ｌ陽性抗ＢＣＭＡ０２ Ｔ細胞におけるＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８の同時発現を図示する。
実施例７
ＺＳＴＫ４７４処理はＣＤ８ Ｔ細胞の頻度を増加させる
ＣＤ８発現は、ＩＬ−２単独またはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で処理された抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞において数量化された。ＣＤ８の発現は、蛍光標識された抗ＣＤ８抗体及びフローサイトメトリーを使用して決定された。ＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４と共に培養された７つの正常なドナーからの抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＩＬ−２単独で培養された抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して大幅に高いＣＤ８発現を有した。図１４。
実施例８
ＺＳＴＫ４７４処理された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞における抗原依存活性の欠如
抗原不在下のＣＡＲ Ｔ細胞の強直な活性は、生物学的活性の減少に関連した。抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞の強直な活性は、ＩＬ−２単独の標準的な培養条件と比較して、ＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４の存在下で培養した後の抗原の不在下でのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）放出を数量化することにより評価された。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞培養物は、大規模な臨床製造プロセスに直接拡張可能なシステムを使用して調製された。簡潔に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＩＬ−２（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）ならびにＣＤ３及びＣＤ２８に特異的な抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を含有する培地中で、静的フラスコ中で培養した。２ｘ１０８形質導入単位の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルスを培養開始１日目に添加した。
抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞を、合計１０日の培養日数の間、ＩＬ−２及び最適用量のＺＳＴＫ４７４を含有する新しい培地を添加することにより、対数期で維持した。製造の終了時に、同等数の抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞を、培地単独中で２４時間再培養した。２４時間内に放出されたＩＦＮ−γの量はＥＬＩＳＡにより数量化された。このアッセイでは、２００ｐｇ／ｍＬを下回るＩＦＮ−γレベルは、強直な活性を表さない。図１５は、１４のドナーからの抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞により放出されたＩＦＮ−γの量が、ＣＡＲ ＴがＺＳＴＫ４７４と共に培養されたか否かにかかわらず、強直な活性の欠如と一致することを示す。
実施例９
ＺＳＴＫ４７４処理された抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞はリンパ腫腫瘍モデルにおいて治療活性を示す
ＩＬ−２またはＩＬ−及びＺＳＴＫ４７４と共に培養された抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を調べるために、Ｄａｕｄｉ腫瘍を使用した。Ｄａｕｄｉ細胞は、低レベルのＢＣＭＡタンパク質を発現し、高悪性度で、治療が困難なリンパ腫腫瘍モデルを提供する。
２ｘ１０６のＤａｕｄｉ腫瘍細胞を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子で標識し、静脈内注射により、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ＩＬ−２受容体ガンマ鎖ノックアウトマウス（ＮＳＧ）に注射した。腫瘍を形成させた後、１ｘ１０７のＣＡＲ Ｔ細胞を腫瘍保有マウスに注射した。マウスに、ｉ）ＩＬ−２もしくはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で１０日間処理した抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞、またはｉｉ）ＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で１０日間処理した切り詰められたシグナル伝達欠損抗ＢＣＭＡ０２（ｔＢＣＭＡ０２）ＣＡＲ Ｔ細胞を注射した。腫瘍の成長は、Ｘｅｎｏｇｅｎ−ＩＶＩＳ撮像システムを使用して、生物発光により監視された。
完全な腫瘍縮小は、ＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で処理された抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与された５０％のマウスにおいて観察された。図１６。
実施例１０
ＺＳＴＫ４７４処理されたＣＡＲ Ｔ細胞はヒト骨髄腫のマウスモデルにおいて治療活性を示す
１００ｍｍ３の皮下多発性骨髄腫腫瘍（ＲＰＭＩ−８２２６）を有する動物に、等価のＣＡＲ Ｔ細胞用量（１ｘ１０６抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ−陽性Ｔ細胞）、または対応Ｔ細胞ドナーからの未改変Ｔ細胞（形質導入されていない）を注入した。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、実施例８に記載されるように、ＩＬ−２またはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で処理した。
ＩＬ−２またはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４培養された抗ＢＣＭＡ０２ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置された動物は、腫瘍の成長を完全に阻止した。図１７。対照的に、形質導入されていない、またはビヒクルで処置された動物は、腫瘍の成長を制御することができなかった。図１７。
概して、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、本明細書及び特許請求の範囲において開示される特定の実施形態に対する主張を制限するように解釈されるべきではないが、このような特許請求の範囲が権利を有する等価物の完全な範囲と共に全ての可能な実施形態を含むように解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、開示により制限されない。

Claims (65)

  1. ヒトＢＣＭＡポリペプチドの１つ以上のエピトープに結合するマウス抗ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、及び一次シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  2. 前記ヒトＢＣＭＡポリペプチドに結合する前記マウス抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合断片が、Ｃａｍｅｌ Ｉｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される、請求項１に記載のＣＡＲ。
  3. 前記ヒトＢＣＭＡポリペプチドに結合する前記マウス抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合断片が、ｓｃＦｖである、請求項２に記載のＣＡＲ。
  4. 前記マウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１〜３のいずれか１つに記載される、１つ以上のＣＤＲを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  5. 前記マウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４〜６のいずれか１つに記載される、１つ以上のＣＤＲを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  6. 前記マウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７に記載される、可変軽鎖配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  7. 前記可変軽鎖配列が、配列番号１〜３に記載される、前記ＣＤＲ配列を含む、請求項６に記載のＣＡＲ。
  8. 前記マウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号８に記載される、可変重鎖配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  9. 前記可変重鎖配列が、配列番号４〜６に記載される、前記ＣＤＲ配列を含む、請求項８に記載のＣＡＲ。
  10. 前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドからのものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  11. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１及びＣＤ１５４からなる群から選択される、ポリペプチドからのものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  12. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８αからのものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  13. 前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ及びＺＡＰ７０からなる群から選択される、共刺激分子からのものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  14. 前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３４及びＣＤ１３７からなる群から選択される、共刺激分子からのものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  15. 前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３４及びＣＤ１３７からなる群から選択される、共刺激分子からのものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  16. 前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８からのものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  17. 前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３４からのものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  18. 前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３７からのものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  19. ヒンジ領域ポリペプチドを更に含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  20. 前記ヒンジ領域ポリペプチドが、ＣＤ８αのヒンジ領域を含む、請求項１９に記載のＣＡＲ。
  21. スペーサー領域を更に含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  22. 前記スペーサー領域ポリペプチドが、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＣＨ２及びＣＨ３領域を含む、請求項２１に記載のＣＡＲ。
  23. シグナルペプチドを更に含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  24. 前記シグナルペプチドが、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体２（ＧＭ−ＣＳＦＲ２）シグナルポリペプチド、またはＣＤ８αシグナルポリペプチドを含む、請求項２３に記載のＣＡＲ。
  25. 配列番号９に記載される、アミノ酸配列を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  26. 請求項１〜２５のいずれか１項に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド。
  27. ポリヌクレオチド配列が、配列番号１０に記載される、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド。
  28. 請求項２６または請求項２７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  29. 前記ベクターが、発現ベクターである、請求項２８に記載のベクター。
  30. 前記ベクターが、エピソームベクターである、請求項２８に記載のベクター。
  31. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項２８に記載のベクター。
  32. 前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項２８に記載のベクター。
  33. 前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項２８に記載のベクター。
  34. 前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、ビスナ・マエディ（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）から本質的になる群から選択される、請求項２８に記載のベクター。
  35. 左（５’）レトロウイルスＬＴＲ、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス輸送要素、請求項２６または請求項２７に記載のポリヌクレオチドに動作可能に連結されたプロモーター、及び右（３’）レトロウイルスＬＴＲを含む、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載のベクター。
  36. 異種ポリアデニル化配列を更に含む、請求項３５に記載のベクター。
  37. Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節要素（ＨＰＲＥ）またはウッドチャック転写後調節要素（ＷＰＲＥ）を更に含む、請求項２８〜３６のいずれか１項に記載のベクター。
  38. 前記５’ＬＴＲの前記プロモーターが、異種プロモーターに置き換えられる、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載のベクター。
  39. 前記異種プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターまたはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである、請求項３８に記載のベクター。
  40. 前記５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲが、レンチウイルスＬＴＲである、請求項３５〜３９のいずれか１項に記載のベクター。
  41. 前記３’ＬＴＲが、１つ以上の改変を含む、請求項３５〜４０のいずれか１項に記載のベクター。
  42. 前記３’ＬＴＲが、１つ以上の欠失を含む、請求項３５〜４１のいずれか１項に記載のベクター。
  43. 前記３’ＬＴＲが、自己不活性型（ＳＩＮ）ＬＴＲである、請求項３５〜４２のいずれか１項に記載のベクター。
  44. 前記ポリアデニル化配列が、ウシ成長ホルモンポリアデニル化またはシグナルウサギβ−グロビンポリアデニル化配列である、請求項３５〜４３のいずれか１項に記載のベクター。
  45. 請求項２６または請求項２７に記載のポリヌクレオチドが、最適化されたコザック配列を含む、請求項２８〜４４のいずれか１項に記載のベクター。
  46. 請求項２６または請求項２７に記載のポリヌクレオチドに動作可能に連結された前記プロモーターが、サイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１−α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター（ＰＧＫ）、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＱ−Ｃ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ＭＣ１）、ベータアクチンプロモーター（β−ＡＣＴ）、サルウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される、請求項３５〜４５のいずれか１項に記載のベクター。
  47. 請求項２８〜４６のいずれか１項に記載のベクターを含む、免疫エフェクター細胞。
  48. 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群から選択される、請求項４７に記載の免疫エフェクター細胞。
  49. 請求項４７または請求項４８に記載の免疫エフェクター細胞及び生理学的に許容される賦形剤を含む、組成物。
  50. 請求項１〜２５のいずれか１項に記載のＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞の生成方法であって、請求項２８〜４６のいずれか１項に記載のベクターを、免疫エフェクター細胞内に導入することを含む、前記方法。
  51. 前記免疫エフェクター細胞を刺激し、前記細胞を、ＣＤ３に結合する抗体及びＣＤ２８に結合する抗体と接触させることによって、前記細胞の増殖を誘発し、それにより免疫エフェクター細胞の集団を生成することを更に含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記免疫エフェクター細胞が、前記ベクターを導入する前に刺激され、増殖を誘発される、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔリンパ球を含む、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記免疫エフェクター細胞が、ＮＫ細胞を含む、請求項５１に記載の方法。
  55. Ｂ細胞関連状態の治療を必要とする対象に、それを行う方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項４９に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
  56. 前記Ｂ細胞関連状態が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、不確定な悪性度のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害、免疫調節性障害、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質抗体症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質抗体症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血及び急速進行性糸球体腎炎、重鎖病、原発性もしくは免疫細胞関連アミロイドーシス、または意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症である、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記Ｂ細胞関連状態が、Ｂ細胞悪性腫瘍である、請求項５５に記載の方法。
  58. 前記Ｂ細胞悪性腫瘍が、多発性骨髄腫（ＭＭ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記ＭＭが、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、及び髄外性形質細胞腫からなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記ＮＨＬが、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
  61. 前記Ｂ細胞関連状態が、形質細胞悪性腫瘍である、請求項５５に記載の方法。
  62. 前記Ｂ細胞関連状態が、自己免疫疾患である、請求項５５に記載の方法。
  63. 前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデスである、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記Ｂ細胞関連状態が、関節リウマチである、請求項５５に記載の方法。
  65. 前記Ｂ細胞関連状態が、特発性血小板減少性紫斑病、または重症筋無力症、または自己免疫性溶血性貧血である、請求項５５に記載の方法。
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