JP2017515507A - 膵内分泌細胞内のｍａｆａ発現を強化するための小分子の使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、多能性幹細胞の、成熟した表現型の膵内分泌細胞への分化を促進する方法、細胞培養物、及び分化培地を提供する。結果として生じる膵内分泌細胞は、単一ホルモンインスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを発現する。１つ又は２つ以上の分化ステージにおいて、培養は、培養容器内の空気−液体界面において行うことができる。

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１４年５月１６日に出願された、米国特許仮出願第６１／９９４，２５９号の利益を主張するものであり、参照によりその全体があらゆる目的で本明細書に組み込まれる。

（発明の分野）
本発明は、多能性幹細胞の分化のための方法、並びにそれから生じる細胞及び集団に関する。とりわけ、本発明は、ＭＡＦＡの増加した発現を呈する膵内分泌細胞、及びそのような細胞の集団を生成するためのある特定の小分子の使用に関する。

Ｉ型真性糖尿病の細胞補充療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、生着に適したインスリン産生細胞、又はベータ（β）細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法として、胚性幹細胞などの多能性幹細胞から機能的β細胞を生成するものがある。

脊椎動物の胚発生では、多能性細胞は、原腸形成として知られるプロセスにおいて３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）から構成される細胞群を生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。このプロセスにおける中間ステージは、胚体内胚葉（definitive endoderm）の形成である。

原腸形成の終了までに、内胚葉は、内胚葉の前部、中間、及び後部の領域を特異的にマークする因子のパネルの発現によって認識することができる前部−後部ドメインに分割される。例えば、ＨＨＥＸ及びＳＯＸ２は内胚葉の前領域を特定し、ＣＤＸ１、２及び４は後老域を特定する。

内胚葉組織の移行は、内胚葉を腸管の領域化に役立つ異なった中胚葉組織に近接させる。これは、線維芽細胞増殖因子（「ＦＧＦ」）、ＷＮＴＳ、形質転換増殖因子（「ＴＧＦ−β」）、レチノイン酸、及び骨形成タンパク質（「ＢＭＰ」）リガンド、並びにそれらのアンタゴニストなどの分泌因子の過多によって達成される。例えば、ＦＧＦ４及びＢＭＰは、推定後腸内胚葉においてＣＤＸ２の発現を促進し、前方の遺伝子ＨＨＥＸ及びＳＯＸ２の発現を抑制する（２０００ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２７：１５６３〜１５６７）。ＷＮＴシグナル伝達はまた、後腸の発達を促進し、前腸の運命を阻害するために、ＦＧＦシグナル伝達と平行して作用することが示されている（２００７ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３４：２２０７〜２２１７）。最後に、間葉によって分泌されるレチノイン酸は、前腸−後腸の境界を調節する（２００２ Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１２：１２１５〜１２２０）。

特異的転写因子の発現レベルは、組織のアイデンティティを指定するために使用できる可能性がある。原腸管への胚体内胚葉の形質転換中に、腸管は、制限された遺伝子発現パターンにより分子レベルで観察することができる広いドメインに領域化される。腸管で領域化された膵臓ドメインは、ＰＤＸ１の非常に高い発現並びにＣＤＸ２及びＳＯＸ２の非常に低い発現を示す。ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１／ＰＴＦ１Ａ、及びＮＫＸ２．２は、膵臓組織で高く発現し、ＣＤＸ２の発現は腸組織で高い。

膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により生じる。背側と腹側の膵臓ドメインは、前腸上皮から生じる。また、前腸は、食道、気管、肺、甲状腺、胃、肝臓、及び胆管系を生じさせる。

膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ１が存在しない場合、膵臓の発達は、腹側芽及び背側芽の形成より先に進行しない。したがって、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程を示している。成熟した膵臓は、膵臓内胚葉の分化から生じる外分泌組織及び内分泌組織の両方を含有する。

Ｄ’Ａｍｏｕｒらは、高濃度のアクチビン及び低血清の存在下でのヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮培地の産生を記述している（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５，２３：１５３４〜１５４１、米国特許第７，７０４，７３８号）。マウスの腎臓被膜下でのこれらの細胞の移植は、内胚葉組織の特徴を有する、より成熟した細胞への分化をもたらした（米国特許第７，７０４，７３８号）。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ−１０及びレチノイン酸の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞に更に分化させることができる（米国特許出願公開第２００５／０２６６５５４号）。免疫不全マウスの脂肪パッド中のこれら膵臓前駆細胞のその後の移植は、３〜４ヶ月の成熟期の後に、機能的膵内分泌細胞の形成をもたらした（米国特許第７，５３４，６０８号及び同第７，９９３，９２０号）。

Ｆｉｓｋらは、ヒト胚性幹細胞からの膵島細胞の産生のためのシステムを報告している（米国特許第７，０３３，８３１号）。この場合、分化経路は３つのステージに分割された。ヒト胚性幹細胞は、最初に、酪酸ナトリウムとアクチビンＡとの組み合わせを用いて内胚葉に分化された（米国特許第７，３２６，５７２号）。次に細胞をノギンなどのＢＭＰアンタゴニストと共に、ＥＧＦ又はβセルリンと組み合わせて培養して、ＰＤＸ１陽性細胞を生成した。最終分化は、ニコチンアミドにより誘発された。

小分子阻害剤もまた、膵内分泌前駆細胞の誘導のために使用されている。例えば、ＴＧＦ−β受容体及びＢＭＰ受容体の小分子阻害剤（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１１，１３８：８６１〜８７１、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２０１１，６０：２３９〜２４７）は、膵内分泌細胞の数を著しく増強するために使用されている。加えて、小分子活性因子もまた、胚体内胚葉細胞又は膵内前駆細胞を生成するために使用されている（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００９，２１：７２７〜７３２、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００９，５：２５８〜２６５）。

ＨＢ９（ＨＩＸＢ９及びＭＮＸ１としても知られる）は、およそ胎生８日目に開始する膵臓発達において早期に発現される塩基性ヘリックスループヘリックス（「ｂＨＬＨ」）転写活性因子タンパク質である。ＨＢ９の発現は一時的であり、膵臓上皮内で約１０．５日目にピークに達し、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１発現細胞内で発現される。約１２．５日目に、ＨＢ９発現は減少し、後のステージにおいて、β細胞のみに制限されるようになる。ＨＢ９のヌル突然変異のためのマウスホモ接合体において、膵臓の背葉は発達に失敗する（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２３：６７〜７０，１９９９、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２３：７１〜７５，１９９９）。ＨＢ９−／β−細胞は、低レベルのグルコース輸送体、ＧＬＵＴ２、及びＮＫＸ６．１を発現する。更に、ＨＢ９−／−膵臓は、インスリン陽性細胞の数の著しい低減を示す一方、他の膵臓ホルモンの発現には著しく影響しない。したがって、ＨＢ９の一時的制御は、正常なβ細胞の発達及び機能に必須である。β細胞内のＨＢ９発現を調節する因子について多くは知られていないが、ゼブラフィッシュにおける近年の研究は、レチノイン酸がＨＢ９の発現を積極的に調節できることを示唆する（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３８，４５９７〜４６０８，２０１１）。

参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／９９８，８８３号において、トリヨードチロニン（「Ｔ３」）は、細胞をβ細胞に向かって分化させる際に、ＨＢ９タンパク質発現の誘導体として作用し得ることが実証された。Ｔ３及びＴ４の一方又は両方を使用して、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、及びＨＢ９に陽性の膵臓内胚葉細胞を生成するための方法もまた、そこに開示されている。追加として、及び参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／９９８，８８４号に開示されるように、空気−液体界面において培養し、Ｔ３及びアクチビン受容体様キナーゼ（「ＡＬＫ」）５阻害剤を使用することによって、膵内分泌マーカーの発現が、著しく増強され得ることが実証された。

多様な転写因子は、膵内分泌細胞の、インスリン分泌β細胞への分化を調節する。これらの因子には、ｖ−ｍａｆ鳥類筋腱膜線維腫発癌遺伝子相同体Ａ（「ＭＡＦＡ」）がある。実際に、ＭＡＦＡは、グルコース促進インスリン分泌の、β細胞内の主要調節因子であり得ると考えられる。

一般に、前駆細胞を機能的β細胞に分化させるプロセスは、様々なステージを経て、ヒト多能性幹細胞などの前駆細胞から膵臓細胞を生成するためのプロトコルを改善することにおいて大幅に進歩した。研究におけるこれらの進歩にも関わらず、前駆細胞を分化させるプロセスにおける各工程は、特有の問題を提示する。このようにして、機能的内分泌細胞、とりわけ機能的β細胞を産生する目的で、更なる分化プロトコル開発の必要性が依然として存在する。とりわけ、膵内分泌細胞内のＭＡＦＡの発現が増強されるプロセスを開発することが望ましい。

図Ａ〜図Ｍは実施例１に従い分化される幹細胞株Ｈ１からの、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＡＢＣＣ８、クロモグラニン−Ａ、Ｇ６ＰＣ２、ＩＡＰＰ、インスリン、グルカゴン、及びＰＴＦ１ａの未分化ＥＳ細胞に対する遺伝子発現の倍数変化のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを描くグラフである。 図Ａ〜図Ｃは実施例１に従い分化され、図２ＡではＫｉ６７（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）、図２ＢではＣＤＸ２（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）、及び図２ＣではＮＫＸ６．１について染色された、ステージ３細胞のＦＡＣＳプロファイルを描く。 図Ａ〜図Ｄは実施例１に従い分化され、図３ＡではＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるクロモグラニン（Ｘ軸）、図３ＢではＫｉ６７（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）、図３Ｃではインスリン（Ｙ軸）と共染色されるＮＫＸ６．１（Ｘ軸）、及び図３ＤではＮｅｕｒｏＤ１について染色された、ステージ４細胞のＦＡＣＳプロファイルである。 図Ａ〜図Ｅは実施例１に従い分化され、図４ＡではＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるクロモグラニン（Ｘ軸）、図４ＢではＫｉ６７（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）、図４Ｃではインスリン（Ｙ軸）と共染色されるＮＫＸ６．１（Ｘ軸）、図４ＤではＮｅｕｒｏＤ１、及びグルカゴン（Ｙ軸）と共染色されるインスリン（Ｘ軸）について染色された、ステージ５細胞のＦＡＣＳプロファイルである。 図Ａ〜図Ｆは実施例１に従い分化され、図５ＡではＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるクロモグラニン（Ｘ軸）、図５ＢではＫｉ６７（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）、図５Ｃではインスリン（Ｙ軸）と共染色されるＮＫＸ６．１（Ｘ軸）、図５ＤではＯｃｔ３／４（Ｙ軸）と共染色されるＰＡＸ６（Ｘ軸）、図５Ｅではグルカゴン（Ｙ軸）と共染色されるインスリン（Ｘ軸）、及び図５ＦではＦＯＸＡ２について染色された、ステージ６細胞のＦＡＣＳプロファイルである。 図Ａ〜図Ｆは実施例１に従い分化され、図６ＡではＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるクロモグラニン（Ｘ軸）、図６ＢではＫｉ６７（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）、及び図６Ｃではインスリン（Ｙ軸）と共染色されるＮＫＸ６．１（Ｘ軸）、図６ＤではＯｃｔ３／４（Ｙ軸）と共染色されるＰＡＸ６（Ｘ軸）、図６Ｅではグルカゴン（Ｙ軸）と共染色されるインスリン（Ｘ軸）、及び図６ＦではＦＯＸＡ２について染色された、ステージ７細胞のＦＡＣＳプロファイルである。 実施例１に従い分化されたステージ３〜ステージ７細胞の複数の膵内胚葉マーカー（ＦＯＸＡ２、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１）、未分化ＥＳ細胞マーカー（Ｏｃｔ３／４）、内分泌マーカー（ＰＡＸ６、ＩＳｌ−１、ＮＫＸ２．２、クロモグラニン）、及びホルモン（インスリン、グルカゴン）の発現率のグラフである。 図Ａ〜図Ｅはステージ６〜７の小分子による処理後の、未分化細胞に対する分化細胞のインスリン及びＭＡＦＡの発現の倍数変化のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを描くグラフである。 未分化細胞に対する実施例４の分化細胞のＡＸＬ及びＧＡＳ６の発現の倍数変化のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを描くグラフである。 実施例６に従うステージ７の小分子による処理後の、未分化細胞に対する分化細胞のＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、Ｇ６ＰＣ２、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、及びインスリンの発現の倍数変化のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータのグラフである。 実施例６に従うステージ７の小分子による処理後の、未分化細胞に対する分化細胞のＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、Ｇ６ＰＣ２、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、及びインスリンの発現の倍数変化のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータのグラフである 実施例６に従うステージ７の小分子による処理後の、未分化細胞に対する分化細胞のＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、Ｇ６ＰＣ２、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、及びインスリンの発現の倍数変化のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータのグラフである 実施例６に従うステージ７の小分子による処理後の、未分化細胞に対する分化細胞のＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、Ｇ６ＰＣ２、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、及びインスリンの発現の倍数変化のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータのグラフである。 実施例６に従うステージ７の小分子による処理後の、未分化細胞に対する分化細胞のＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、Ｇ６ＰＣ２、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、及びインスリンの発現の倍数変化のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータのグラフである。 実施例６に従うステージ７の小分子による処理後の、未分化細胞に対する分化細胞のＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、Ｇ６ＰＣ２、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、及びインスリンの発現の倍数変化のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータのグラフである。 実施例７に従うステージ７の小分子による処理後の、未分化細胞に対する分化細胞のＭＡＦＡ、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びインスリンの発現の倍数変化のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを描くグラフである。 実施例７に従うステージ７の小分子による処理後の、未分化細胞に対する分化細胞のＭＡＦＡ、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びインスリンの発現の倍数変化のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを描くグラフである。 実施例７に従うステージ７の小分子による処理後の、未分化細胞に対する分化細胞のＭＡＦＡ、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びインスリンの発現の倍数変化のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを描くグラフである。 実施例７に従うステージ７の小分子による処理後の、未分化細胞に対する分化細胞のＭＡＦＡ、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びインスリンの発現の倍数変化のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを描くグラフである。

本発明の以降の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良好に理解されるであろう。本発明を例示する目的で、図面の本発明の実施形態を示す。しかしながら、本発明は、示される正確な構成、実施例、及び手段に限定されない。開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、「発明を実施するための形態」を、本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を説明又は例示する小項目に分割する。

本発明は、ある特定の小分子による比較的成熟していない膵内分泌細胞の処理によって、より成熟した表現型の膵内分泌細胞を生成することを目的としている。本発明のある特定の実施形態において、膵内分泌細胞は、タンパク質メチルトランスフェラーゼ阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤、及びｐ９０リボソームＳ６キナーゼ（「ＲＳＫ」）阻害剤のうちの１つ又は２つ以上である小分子の存在下、１つ又は２つ以上のステージで培養される。したがって、本発明は、多能性幹細胞を、成熟した表現型の膵内分泌細胞の特徴を呈する細胞に分化させるための細胞培養物だけでなく、分化を開始させ、分化を促す分化培地、並びにそのような分化、及び分化から生じる分化細胞及び細胞集団を提供する。本発明の方法は、膵内分泌細胞集団の形成をもたらし、細胞の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、及び最も好ましくは少なくとも５０％が、単一ホルモンインスリンを発現し、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡ陽性である。

有利かつ好適に、本発明の細胞培養物及び分化培地は、空気−液体界面での分化と併せて使用されてもよい。培養は、多能性幹細胞から成熟した表現型の膵内分泌細胞への分化経路に関与する全てのステージで空気−液体界面で起こり得るか、又は分化の早期ステージで培地中に浸漬された平板培養上で培養することに続いて、分化の後期ステージのうちの１つ又は２つ以上の間に空気−液体界面で培養することを必要とし得る。より好ましくは、本発明のプロセスは、早期ステージを通じて培地中に浸漬された支持表面上で多能性幹細胞を培養することと、次いで分化の後期ステージに空気−液体界面で培養することとの組み合わせを必要とする。このような実施形態において、細胞は、最初に浸漬培養のための固体表面上に播種され、次いでその固体支持体から除去され、空気−液体界面で培養するために、多孔性支持体上に再度播種され得る。代替的に、細胞は、最初に多孔性支持体上に播種され、次いで分化の早期ステージで培地中に浸漬され、次に分化の後期ステージで空気−液体界面に置かれ得る。

更に別の実施形態において、１つ又は２つ以上のステージでの分化はまた、Ｔ３、Ｔ４、それらの類似体のうちの１つ又は２つ以上の存在下、任意選択であるが好ましくはアクチビン受容体様キナーゼ５（「ＡＬＫ５」）阻害剤を用いて行われる。好ましい実施形態において、膵内胚葉／内分泌前駆細胞の集団は、Ｔ３、Ｔ４、それらの類似体、及び膵内分泌細胞に対するＡＬＫ５阻害剤のうちの１つ又は２つ以上を含有する培地中で培養される。より好ましい実施形態において、結果として生じる膵内分泌細胞は、Ｔ３、Ｔ４、それらの類似体、及びＡＬＫ５阻害剤のうちの１つ又は２つ以上を含有する培地の存在下で更に分化される。

ＡＬＫ５阻害剤及び甲状腺受容体アゴニストのうちの１つ又は２つ以上の組み合わせによる膵内胚葉細胞の処理に続いて、タンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤、及びＲＳＫ阻害剤のうちの１つ又は２つ以上と併せて、結果として生じる膵内分泌細胞を培養することは、単一ホルモンインスリン、ＭＡＦＡ、ＰＤＸ１、及びＮＫＸ６．１を発現する集団内の細胞の数を著しく増強すると共に、細胞内のＭＡＦＡ発現のレベルを増加させることは、本発明の特定の発見である。本発明は、空気−液体界面での分化と併せて使用されるときに特定の有用性を見出す。

定義
幹細胞は、単一細胞レベルでの自己再生能及び分化能の両方によって定義される未分化細胞である。幹細胞は、自己再生前駆細胞、非再生性前駆細胞、及び最終分化細胞を含む子孫細胞を生成することができる。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）から様々細胞系統の機能的細胞へと生体外で分化する能力を特徴とする。幹細胞はまた、移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞に注入後、実質的に（全てではないとしても）ほとんどの組織に寄与する。

幹細胞は、それらの発生上の潜在性によって分類される。多能性幹細胞は、全ての胚細胞型を生じさせることが可能である。

分化は、特殊化されていない（unspecialized）（「拘束されていない（uncommitted）」）又は比較的特殊化されていない細胞が、特殊化された細胞、例えば、神経細胞又は筋細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した細胞は、細胞の系統の範囲内で、より特殊化した（「拘束された」）状態を呈している細胞である。分化プロセスに適用された際の用語「拘束された」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合への分化を続け、かつ通常の環境下で異なる細胞型に分化したり、又は低分化細胞型に戻ったりすることができない地点まで、分化経路において進行した細胞を指す。「脱分化」は、細胞が細胞の系統内で比較的特殊化されて（又は拘束されて）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞の系統は、その細胞の遺伝性、すなわち、その細胞がどの細胞に由来するか、またその細胞がどのような細胞を生じさせ得るかを規定する。細胞の系統は、発達及び分化の遺伝スキームの範囲内で、その細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、拘束されていない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。

本明細書で使用するとき「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。これに関して、差異的発現とは、未分化細胞又は分化の別のステージの細胞と比較して、陽性マーカーについては増殖したレベルを意味し、陰性マーカーについては減少したレベルを意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出限界は、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。

本明細書で使用するとき、細胞は、特異的マーカーが細胞内で十分に検出されたとき、特異的マーカー「について陽性」、「陽性」又は「＋」である。同様に、細胞は、特異的マーカーが細胞内で十分に検出されないとき、特異的マーカー「について陰性」、「陰性」又は「−」である。とりわけ、蛍光活性細胞分類サイトメトリー（「ＦＡＣＳ」）による陽性は通常約２％を超えるが、ＦＡＣＳによる陰性閾値は通常約１％を下回る。ポリメラーゼ連鎖反応サイトメトリー（「ＰＣＲ」）による陽性は、通常約３０サイクル（Ｃｔｓ）以下であるが、ＰＣＲによる陰性は、通常約３１サイクルを超える。

静的生体内細胞培養において、多能性幹細胞の機能的膵内分泌細胞への分化を複製する試みでは、分化プロセスは、多くの連続ステージを通じて進行すると見られる場合が多い。とりわけ、分化プロセスは、一般に複数のステージを通じて進行すると見られている。この段階的分化において、「ステージ１」は、分化プロセスの第１の工程、多能性幹細胞の、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ１細胞」）への分化を指す。「ステージ２」は、第２の工程、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ２細胞」）への分化を指す。「ステージ３」は、第３の工程、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ３細胞」）への分化を指す。「ステージ４」は、第４の工程、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、膵前腸前駆体細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ４細胞」）への分化を指す。「ステージ５」は、第５の工程、膵前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、膵内胚葉細胞及び膵内分泌前駆細胞のうちの一方又は両方に特徴的なマーカーを発現する細胞（集合的に「ステージ５細胞」又は代替的に「膵内胚葉／内分泌前駆体細胞」と称される）への分化を指す。ステージ６は、第６の工程、膵内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、未成熟β細胞である膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ６細胞」）への分化を指す。ステージ６細胞は、単一ホルモンインスリンを発現し、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びクロモグラニン陽性である。本発明の細胞の集団を産生するプロセスにおいて、及びその目的で、第７の工程、「ステージ７」が使用され、未成熟β細胞である膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、成熟化β細胞であり、ステージ６細胞と比較してより成熟した表現型を有する膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化を指す。「ステージ７細胞」とは、単一ホルモンインスリン＋、ＭＡＦＡ＋、ＮＫＸ６．１＋、及びＰＤＸ１＋であるが、未成熟β細胞よりも高いレベルでＭＡＦＡを発現する膵内分泌細胞も意味する。追加として、ステージ７を実行することから生じる細胞集団は、ステージ６の細胞集団と比較してより高い割合のＭＡＦＡ陽性及び単一ホルモンインスリン発現細胞を有する。

特定集団の全ての細胞がこれらのステージを同じ速度で進行するとは限らないことに留意されたい。結論として、生体外細胞培養において、特に後期分化ステージでは、集団に存在する細胞の大半よりも分化経路を進行していなかったり、大半よりも進行しいていたりする細胞の存在を検出することは稀ではない。例えば、ステージ５での細胞の培養中、膵内分泌細胞に特徴的なマーカーの出現を見ることは稀ではない。本発明を例証する目的で、上で特定されたステージと関連した様々な細胞型の特徴が本明細書に記載される。

本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保有している細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわち、ＦＯＸＡ２（肝細胞核因子３−β（「ＨＮＦ３−β」）としても知られる）、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ブラチュウリー（Brachyury）、ケルベロス、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１のうちの少なくとも１つを発現する。胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーは、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７である。したがって、胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７の発現で特徴付けられ得る。加えて、細胞がステージ１に留まることができる時間の長さに応じて、ＨＮＦ４αにおける増加が観察され得る。

「腸管細胞」は、本明細書で使用するとき、胚体内胚葉から誘導され、肺、肝臓、膵臓、胃、及び腸などの全ての内胚葉器官を生じ得る細胞を指す。腸管細胞は、胚体内胚葉細胞によって発現されたものに対するＨＮＦ４αの実質的に増加した発現で特徴付けられ得る。例えば、ＨＮＦ４αのｍＲＮＡ発現の１０倍〜４０倍の増加が、ステージ２中に観察され得る。

「前腸内胚葉細胞」は、本明細書で使用するとき、食道、肺、胃、肝臓、膵臓、膀胱、及び十二指腸の一部分を生じる細胞を指す。前腸内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、及びＨＮＦ４αのうちの少なくとも１つを発現する。前腸内胚葉細胞は、腸管細胞と比較してＰＤＸ１の発現の増加で特徴付けられ得る。例えば、ステージ３培養において、細胞の５０パーセント超が、典型的にＰＤＸ１を発現する。

「膵前腸前駆細胞」は、本明細書で使用するとき、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ６、ＮＧＮ３、ＳＯＸ９、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＩＳＬ１、ガストリン、ＦＯＸＡ２、ＰＴＦ１ａ、ＰＲＯＸ１、及びＨＮＦ４αのうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。膵前腸前駆細胞は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＳＯＸ９のうちの少なくとも１つの発現について陽性であることで特徴付けられ得る。

「膵内胚葉細胞」は、本明細書で使用するとき、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１β、ＰＴＦ１α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ９、ＮＧＮ３、ガストリン、ＨＢ９、又はＰＲＯＸ１のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。膵内胚葉細胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２の実質的発現の欠失で特徴付けられ得る。

「膵内分泌前駆細胞」は、本明細書で使用するとき、膵ホルモン発現細胞になることが可能な膵内胚葉細胞を指す。膵内分泌前駆細胞は、以下のマーカー、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮｅｕｒｏＤ１１、ＩＳＬ１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、又はＡＲＸのうちの少なくとも１つを発現する。膵内分泌前駆細胞は、ＮＫＸ２．２及びＮｅｕｒｏＤ１１の発現で特徴付けられ得る。

「膵内分泌細胞」は、本明細書で使用するとき、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す。これらのホルモンに加え、膵内分泌細胞に特徴的なマーカーは、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、ＨＢ９、及びＰＡＸ６のうちの１つ又は２つ以上を含む。膵内分泌細胞の１つのサブセットは、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン、及び膵臓ポリペプチドではないが、インスリンを発現することが可能な細胞である「未成熟β細胞」である。加えて、未成熟β細胞に特徴的なマーカーは、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．２、ＨＢ９、及びＰＡＸ６のうちの１つ又は２つ以上を含む。膵内分泌細胞の第２のサブセットは、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン、及び膵臓ポリペプチドではないが、インスリンを発現することが可能な細胞である「成熟化β細胞」である。追加として、成熟化β細胞に特徴的なマーカーは、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．２、ＨＢ９、ＰＡＸ６、及びＭＡＦＡのうちの１つ又は２つ以上を含む。膵内分泌細胞の更に別のサブセットは、成熟β細胞に特徴的なマーカーを発現するものであり、比較的成熟していないβ細胞のそれと比較して頑強かつ増加したグルコースチャレンジに反応するインスリン放出に伴うＰＤＸ１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３β、ＨＢ９、ＭＡＦＡ、及びＰＡＸ６の発現で特徴付けられ得る。

「空気−液体界面」又は「ＡＬＩ」は、本明細書で使用するとき、開放培養容器又は培地で部分的に充填された培養容器内に存在する空気−液体界面を指す。本明細書では便宜上「空気」と称されるが、本発明は、周囲環境内で見出されるガス及び組成物の混合物に限定されない。本発明は、具体的に企図され、例えば、特定成分が豊富であるか、又は特定成分が枯渇若しくは排除された混合物を含む、周囲環境とは異なる組成物を有するガス混合物を含む。

本明細書では、「ｄ１」、「１ｄ」、及び「１日目」、「ｄ２」、「２ｄ」、及び「２日目」などが同義的に使用される。これらの数字の組み合わせは、本願の段階的分化プロトコル中の異なるステージにおける培養の特定の日を指す。

「ＬＤＮ−１９３１８９」は、（（６−（４−（２−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン、塩酸塩））、Ｓｈａｎｇｈａｉ ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ，Ｃｏ．，ＬＴＤから入手可能なＢＭＰ受容体阻害剤を指す。

多能性幹細胞の特徴付け、供給源、増殖、及び培養
Ａ．多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、指定されたＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１抗体のうちの１つ又は２つ以上を発現し得る（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５〜１１４７）。多能性幹細胞の生体外分化は、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１発現の喪失をもたらす。未分化の多能性幹細胞は、典型的には、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって記載されるように、商標ＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｒｅｄを付して販売されているアルカリホスファターゼ基質キットで発生させることによって検出され得る、アルカリホスファターゼ活性を有する。未分化の多能性幹細胞はまた、典型的には、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（「ＲＴ−ＰＣＲ」）によって検出されるように、ＯＣＴ４及びＴＥＲＴも発現する。

増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉の３胚葉層の全ての細胞に分化する能力である。幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（「ＳＣＩＤ」）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれらの３胚葉由来の細胞型の根拠について組織学的に調べることによって確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を３つの胚葉層に関連したマーカーの存在に対して評価することにより決定することができる。

増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用して核型を決定し、次いで確立された、対応する霊長類種の核型と比較することができる。細胞は「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体が全て揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。

Ｂ．多能性幹細胞の供給源
本発明の方法では、任意の多能性幹細胞が使用され得る。使用が可能な多能性幹細胞の例示の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（胚盤胞など）、胚性組織又は胎児組織を含む、多能性細胞の樹立株が挙げられる。限定されない例は、ヒト胚性幹細胞（「ｈＥＳＣ」）又はヒト胚生殖細胞の樹立株であり、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）、及びＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ＡＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｏｔｅｂｕｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）などである。

フィーダー細胞の非存在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞もまた好適である。ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＺＦＰ４２など多数の多能性に関係する転写因子の強制発現を使用して、成体体細胞から誘導される誘導性多能性細胞（ＩＰＳ）又は再プログラム化された多能性細胞（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２０１１，１２：１６５〜１８５、また、ＩＰＳ，Ｃｅｌｌ，１２６（４）：６６３〜６７６も参照されたい）を使用することもできる。本発明の方法で使用されるヒト胚性幹細胞もまた、Ｔｈｏｍｓｏｎらによって記載されるように調製され得る（米国特許第５，８４３，７８０号、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５〜１１４７、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９９８，３８：１３３〜１６５、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９５，９２：７８４４〜７８４８）。ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，Ｇｅｏｒｇｉａ．）などの変異体ヒト胚性幹細胞株、又はＴａｋａｈａｓｈｉｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １３１：１〜１２（２００７）に開示されている細胞などのヒト成体細胞に由来する細胞を使用することもできる。ある特定の実施形態において、本発明での使用に好適な多能性幹細胞は、Ｌｉら（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４：１６〜１９，２００９）、Ｍａｈｅｒａｌｉら（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １：５５〜７０，２００７）、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２：２３０〜２４０）、Ｎａｋａｇａｗａら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６：１０１〜１０６，２００８）、Ｔａｋａｈａｓｈｉら（Ｃｅｌｌ １３１：８６１〜８７２，２００７）、及び米国特許出願公開第２０１１／０１０４８０５号に記載の方法に従って誘導することができる。ある特定の実施形態において、本発明での使用に好適な多能性幹細胞は、「ナイーブ」であると見なされ、以下に記載の方法に従って誘導することができる。Ｇａｆｎｉら（Ｎａｔｕｒｅ，５０４：２８２，２０１３）、及びＷａｒｅら（ＰＮＡＳ，１１１：４４８４〜４４８９，２０１４）。これらの参考文献、特許、及び特許出願の全ては、とりわけそれらが多能性細胞の単離、培養、増殖、及び分化に関するため、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。

多能性幹細胞の他の供給源は、誘導された多能性幹細胞を含む（ＩＰＳ，Ｃｅｌｌ，１２６（４）：６６３〜６７６）。好適な細胞の更に他の供給源には、ヒト臍帯組織由来細胞、ヒト羊水由来細胞、ヒト胎盤由来細胞、及びヒト単為生殖生物が挙げられる。一実施形態において、臍帯組織由来細胞は、米国特許第７，５１０，８７３号に記載の方法によって得ることができる。別の実施形態において、胎盤組織由来細胞は、米国特許出願公開第２００５／００５８６３１号に記載の方法を使用して得ることができる。別の実施形態において、羊水由来細胞は、米国特許出願公開第２００７／０１２２９０３号に記載の方法を使用して得ることができる。これらの特許出願の各々の開示は、それが細胞の単離及び特徴付けに関するため、その全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態において、多能性幹細胞は、非胎生起源であり得る。

Ｃ．多能性幹細胞の増殖及び培養
多能性幹細胞は、様々な点で多能性幹細胞を支持するフィーダー細胞の層上で一般的に培養される。代替的に、多能性幹細胞は、基本的にフィーダー細胞が存在しないにも関わらず、ほぼ分化を受けないで多能性幹細胞の増殖を支持する培養液システム中で培養され得る。多能性幹細胞を分化させずに無フィーダー培養液中で増殖させる際には、以前に他の細胞種を予め培養しておいて馴化させた培地を使用することでこの操作が支持される場合が多い。代替的に、多能性幹細胞を無フィーダー培養液中で分化させずに増殖させる際は、化学的合成培地を使用することでこの操作が支持され得る。

多能性細胞は、様々なフィーダー層を用いて、又はマトリックスたんぱく質被覆した容器を用いて、容易に培養で増殖させることができる。代替的に、商標ｍＴＥＳＲ（登録商標）１を付して販売されている培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂ．Ｃ．，Ｃａｎａｄａ）などの合成培地との組み合わせで、化学的合成表面を、細胞の常用増殖のために使用してもよい。多能性細胞は、酵素消化、機械的分離、又はエチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」）などの様々なカルシウムキレート剤を使用して、培養プレートから容易に取り出すことができる。代替的に、多能性細胞は、マトリックスタンパク質又はフィーダー層の非存在下で、懸濁液中で増殖させてもよい。

多能性幹細胞を増殖及び培養する多くの異なる既知の方法が、特許請求される発明で使用されてもよい。例えば、本発明の方法は、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｒｉｃｈａｒｄｓら、及び米国特許出願公開第２００２／００７２１１７号に記載の方法を使用することができる。Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：３９９〜４０４（２０００））及びＴｈｏｍｐｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５〜１１４７（１９９８））は、マウス胚性繊維芽細胞フィーダー細胞層を用いたヒト胚盤胞からの多能性幹細胞株の培養について開示している。Ｒｉｃｈａｒｄｓら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：５４６〜５５６，２００３）は、１１の異なるヒト成体、胎児、及び新生児フィーダー細胞層の一団を、ヒト多能性幹細胞培養を支持する能力について評価し、「成体皮膚線維芽細胞フィーダー上で培養されたヒト胚性幹細胞株が、ヒト胚性幹細胞の形態を保持し、多能性を保持する」ことを示した。米国特許出願公開第２００２／００７２１１７号は、無フィーダー培養において霊長類の多能性幹細胞の増殖を支持する培地を産生する細胞系を開示している。使用される細胞系は、胚性組織から得られるか又は胚性幹細胞から分化させた間葉系かつ線維芽細胞様の細胞系である。米国特許出願公開第２００２／００７２１１７号はまた、霊長類のフィーダー細胞層としての細胞株の使用についても開示している。

多能性幹細胞を増殖及び培養する他の好適な既知の方法は、例えば、Ｗａｎｇら、Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃら、Ｍｉｙａｍｏｏら、及びＡｍｉｔらにおいて開示されている。Ｗａｎｇら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：１２２１〜１２２７，２００５）は、ヒト胚性幹細胞由来のフィーダー細胞層上のヒト多能性幹細胞の長期増殖のための方法を開示している。Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５ ２３：３０６〜３１４，２００５）は、ヒト胚性幹細胞の自然分化から誘導されたフィーダー細胞系を開示している。Ｍｉｙａｍｏｔｏら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：４３３〜４４０，２００４）は、ヒトの胎盤から得られたフィーダー細胞の供給源を開示している。Ａｍｉｔら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ ６８：２１５０〜２１５６，２００３）は、ヒトの包皮由来のフィーダー細胞層を開示している。

多能性幹細胞を増殖及び培養する他の好適な方法は、例えば、Ｉｎｚｕｎｚａら、米国特許第６，６４２，０４８号、国際公開第２００５／０１４７９９号、Ｘｕら、及び米国特許出願公開第２００７／００１００１１号に開示されている。Ｉｎｚｕｎｚａら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：５４４〜５４９，２００５）は、ヒトの出生直後産児の包皮線維芽細胞から得られたフィーダー細胞層を開示している。米国特許第６，６４２，０４８号は、無フィーダー細胞培養中での霊長類の多能性幹細胞の増殖を支持する培地、及びこうした培地の産生に有用な細胞株を開示している。米国特許第６，６４２，０４８号は、胚性組織から得られるか、又は胚性幹細胞から分化した間葉系かつ線維芽細胞様の細胞株、並びにこうした細胞株を誘導し、培地を処理し、こうした培地を用いて幹細胞を増殖させるための方法を報告している。国際公開第２００５／０１４７９９号は、哺乳類細胞の維持、増殖及び分化のための馴化培地を開示している。国際公開第２００５／０１４７９９号は、この開示を介して産生された培養培地が、マウス細胞、とりわけ、ＭＭＨ（Ｍｅｔマウス肝細胞）と呼ばれるそれらの分化及び不死化遺伝子導入幹細胞の細胞分泌活性によって馴化されることを報告している。Ｘｕら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：９７２〜９８０，２００４）は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように遺伝子改変されたヒト胚性幹細胞由来細胞から得られた馴化培地を開示している。米国特許出願公開第２００７／００１００１１号は、多能性幹細胞の維持のための化学的合成培地を開示している。

既知の代替培養系は、胚性幹細胞の増殖を促進することができる増殖因子が補充された無血清培地を用いる。こうした培養系の例には、Ｃｈｅｏｎら、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら、及び米国特許出願公開第２００５／０１４８０７０号が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９，２００５）は、胚性幹細胞の自己再生を誘発することが可能な異なる増殖因子が補充された非馴化血清補充培地中に胚性幹細胞が維持されている、無フィーダー、無血清培養系を開示している。Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：５６８〜５７４，２００６）は、線維芽細胞又は馴化培地の非存在下で、ｂＦＧＦが補充された培地を使用して、ヒト胚幹細胞を長期間培養する方法を開示している。米国特許出願公開第２００５／０１４８０７０号は、血清及び繊維芽細胞フィーダー細胞を含まない合成培地中でのヒト胚幹細胞の培養方法を開示し、同方法は、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、無機物、少なくとも１つのトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、少なくとも１つのインスリン又はインスリン代替物を含有する培地中で幹細胞を培養することを含み、この培地は、本質的に哺乳類胎児血清を含有せず、線維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化できる少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子を含有し、増殖因子は、線維芽細胞フィーダー層のみでなく他の源からも供給され、培地はフィーダー細胞又は馴化培地なしで、未分化状態の幹細胞の増殖を支持した。

多能性幹細胞を培養及び増殖させる更に他の既知の好適な方法は、米国特許出願公開第２００５／０２３３４４６号、米国特許第６，８００，４８０号、米国特許出願公開第２００５／０２４４９６２号、及び国際公開第２００５／０６５３５４号に開示されている。米国特許出願公開第２００５／０２３３４４６号は、未分化の霊長類始原幹細胞を含む、幹細胞を培養する際に有用な合成培地を開示している。溶液において、培地は、培養されている幹細胞と比較して実質的に等張である。所定の培養において、特定の培地は、基本培地、及び実質的に未分化の始原幹細胞の増殖の支持に必要な、ある量のｂＦＧＦ、インスリン、及びアスコルビン酸の各々である。米国特許第６，８００，４８０号は、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を増殖させるための細胞培地であって、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持する上で効果的な低浸透圧、低エンドトキシンの基本培地を含む細胞培地が提供されることを報告している。この第６，８００，４８０号特許の開示は更に、基本培地が、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持する上で効果的な栄養素血清、並びにフィーダー細胞及びフィーダー細胞から誘導される細胞外マトリックス成分から選択される基質と組み合わされることを報告している。この培地は更に、非必須アミノ酸、抗酸化剤、並びにヌクレオシド及びピルビン酸塩から選択される第１の増殖因子を含むことを述べている。米国特許出願公開第２００５／０２４４９６２号は、本開示の一態様が、霊長類胚性幹細胞を培養する方法を提供すること、及び培養中の幹細胞が、線維芽細胞フィーダー層以外の源から供給される線維芽細胞増殖因子の存在下、本質的に哺乳類胎児血清を含まない（好ましくは本質的にいかなる動物血清も含まない）ことを報告している。

国際公開第２００５／０６５３５４号は、本質的に無フィーダーかつ無血清であり、実質的に未分化の哺乳類幹細胞の増殖を支持するのに十分な量の基本培地、ｂＦＧＦ、インスリン、及びアスコルビン酸である、合成、等張培養培地を開示している。更に、国際公開第２００５／０８６８４５号は、幹細胞を、細胞を未分化な状態に維持するのに十分な量の、形質転換増殖因子β（「ＴＧＦ−β」）ファミリータンパク質のメンバー、線維芽細胞増殖因子（「ＦＧＦ」）ファミリータンパク質のメンバー、又はニコチンアミドに、所望の結果を得るのに十分な時間にわたって曝露することを含む、未分化幹細胞を維持するための方法を開示している。

多能性幹細胞は、好適な培養基質上で平板培養することができる。一実施形態において、好適な培養基質は、基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成し得るものなどの細胞外マトリックス成分である。好適な培養基質は、商標ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を付して販売されている再構成された基底膜である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞由来の可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。

当該技術分野において既知の他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物は、代替物として好適である。増殖させる細胞型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパリン硫酸塩などを、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。

多能性幹細胞は、好適な分布で、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下、基質上に平板培養されてもよい。これらの特徴の全ては、播種分布に細心の注意を払うことで利益を得られるものであり、当業者は容易に決定することができる。好適な培養培地は、以下の成分、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにより商標ＧＩＢＣＯ（登録商標）（カタログ番号１１９６５−０９２）を付して販売されているダルベッコ改変イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより商標ＧＩＢＣＯ（登録商標）（カタログ番号１０８２９−０１８）を付して販売されているノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（「ＫＯ ＤＭＥＭ」）、ハムＦ１２／５０％ ＤＭＥＭ基本培地、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより商標ＧＩＢＣＯ（登録商標）（カタログ番号２５０３０−０８１）を付して販売されている２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより商標ＧＩＢＣＯ（登録商標）（カタログ番号１１１４０−０５０）を付して販売されている非必須アミノ酸溶液、β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＬＬＣ Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（カタログ番号Ｍ７５２２）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより商標ＧＩＢＣＯ（登録商標）（カタログ番号１３２５６−０２９）を付して販売されているヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（「ｂＦＧＦ」）から作製され得る。

ヒト胚性幹細胞の大規模増殖及び制御された分化はまた、懸濁バイオリアクターを使用して達成され得る。こうした系は、制御された培養系内で、優れた効能を有する、臨床的に関連する細胞数を生成することができ得る。例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｙ ２０１４，Ｖｏｌ．１７８：５４〜６４、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ａｐｒ ２０１４，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．６：１１３２、及びＴｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ：Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｆｅｂ ２０１３，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２：１６６〜１８０に開示されるように、多能性マウス及びｈＥＳ細胞の増殖を可能にする、確立されたバイオリアクター培養システムを使用することが知られている。

多能性幹細胞の分化
多能性細胞がβ細胞に向かって分化するとき、それらは、様々なステージを通じて分化し、各々が特定のマーカーの存在又は非存在で特徴付けられ得る。これらのステージへの細胞の分化は、培養培地に添加されるある特定の因子の存在及び欠失を含む、特異的培養条件によって達成される。一般に、この分化は、多能性幹細胞の、胚体内胚葉系統及び胚体内胚葉細胞への分化を必要とし得る。次いでこれらの細胞は、腸管細胞へと更に分化され得、次いで順次前腸内胚葉細胞へと分化され得る。前腸内胚葉細胞は、膵前腸前駆細胞へと分化され得、次いで膵内胚葉細胞、膵内分泌前駆細胞、又は両方へと更に分化され得る。これらの細胞は、細胞を産生又は分泌する膵臓ホルモンへと分化され得る。この出願は、好ましくは培地で部分的に充填された培養容器内に存在する空気−液体界面で細胞を培養することによって、特にステージ５〜７のうちの１つ又は２つ以上において空気−液体界面で細胞を培養することによって、多能性幹細胞の膵内分泌細胞への段階的分化を提供する。

甲状腺ホルモントリヨードチロニン（「Ｔ３」）及びチロキシン（「Ｔ４」）、並びにそれらの類似体のうちの１つ又は２つ以上が、単独で又はＡＬＫ５阻害剤との更なる組み合わせで、分化のステージ１〜７のうちの１つ又は２つ以上で、好ましくはステージ５〜７の各々で培養する細胞内で使用され得る。代替的に、ＡＬＫ５阻害剤は、分化の１つ又は２つ以上のステージにおいて、しかし好ましくはステージ５〜７の各々で、単独で使用され得る。より好ましくは、甲状腺ホルモン又はそれらの類似体及びＡＬＫ５阻害剤のうちの１つ又は２つ以上は、１つ又は２つ以上の分化ステージにおいて、及び好ましくはステージ５〜７の各々で使用される。好適な甲状腺ホルモン類似体には、制限なしに、ＧＣ−１（Ｓｏｂｅｒｔｉｒｏｍｅ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａから入手可能）、３，５−ジヨードチロプロピオン酸（「ＤＩＰＴＡ」）、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００８，１１１：２６２〜２６７及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ ２００３，１００：１００６７〜１００７２に論じられているＫＢ−１４１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ ２００７，１０４：１５４９０〜１５４９５に論じられているＭＢ０７３４４、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，Ｍａｙ ２００９，５０：９３８及びＥｎｄｏｃｒ．Ｐｒａｃｔ．２０１２，１８（６）：９５４〜９６４（これらの開示は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に論じられているＴ０６８１が挙げられ得る。有用なＡＬＫ５阻害剤としては、好ましいＡＬＫ５阻害剤でもある、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ＡＬＫ５ｉ（Ａｘｘｏｒａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＳＤ２０８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＧＦ−β阻害剤ＳＢ４３１５４２（Ｘｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＩＴＤ−１（Ｘｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＬＹ２１０９７６１（Ｘｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ａ８３−０１（Ｘｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＬＹ２１５７２９９（Ｘｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｖ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｉ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＶ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩＩ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、及びＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が挙げられる。

加えて、本発明の好ましい実施形態において、これらの方法は、ビタミンＥ、アセチルシステイン、ビタミンＣ、抗酸化剤補助剤（カタログ番号Ａ１３４５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＬＬＣ Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、グルタチオン、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼなどの抗酸化剤、及びそれらの組み合わせの一方又は両方を含む分化培地を用いて、１つ又は２つ以上のステージで細胞を処理すること、しかし好ましくは細胞をステージ７中に処理することを含む。更により好ましい実施形態において、ステージ６を実行する際に、γ分泌酵素阻害剤が使用され、これはγ分泌酵素阻害剤ＸＸ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、γ分泌酵素阻害剤ＸＸＩ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、γ分泌酵素阻害剤ＸＶＩ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｎ−［（３，５−ジフルオロフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル−２−フェニル］グリシン−１，１−ジメチルエチルエステル（「ＤＡＰＴ」）（カタログＮｉ．２６３４，Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）など、及びそれらの組み合わせであり得る。γ分泌酵素阻害剤の有用な量は、約５０ｎＭ〜５０００ｎＭ、好ましくは約５０ｎＭ〜５００ｎＭであり得る。抗酸化剤の量は、約０．１〜１００μＭ、代替的には約０．１〜２０μＭ、及び好ましくは約１〜１０μＭであり得る。代替的に、抗酸化剤の有用な量は、約１００ｎＭ〜５ｍＭ、約１０００ｎＭ〜２ｍＭ、及び好ましくは約０．１〜１ｍＭであり得る。

本発明の最も好ましい実施形態において、特定の小分子は、１つ又は２つ以上の分化のステージにおいて、好ましくはステージ６及び７の一方又は両方で使用される。関心対象の小分子は、オーロラキナーゼ、ｐ９０リボソームＳ６キナーゼ、又はメチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌを阻害することが可能なものであり、好ましくは、培養された細胞の酸化ストレスを低減する抗酸化剤と共に使用される。こうした有用な阻害剤には、オーロラキナーゼ阻害剤ＩＩ（４−（４’−ベンズアミドアニリノ）−６，７−ジメトキシキナゾリン）、ＳＮＳ ３１４メシラート（Ｎ−（３−クロロフェニル）−Ｎ’−［５−［２−（チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−イルアミノ）エチル］−２−チアゾリル］ウレアメタンスルホン酸塩）、ＧＳＫ１０７０９１６（３−（４−（４−（２−（３−（（ジメチルアミノ）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−１−エチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）フェニル）−１，１−ジメチルウレア）、ＴＡＫ−９０１（５−（３−（エチルスルホニル）フェニル）−３，８−ジメチル−Ｎ−（１−メチルピペリジン−４−イル）−９Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］インドール−７−カルボキシアミド）、ＲＳＫ阻害剤ＩＩ（ジヒドロプテリジノン２−（３，５−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−アニリノ）−８−イソペンチル−５，７−ジメチル−７Ｈ−プテリジン−６−オン）、及びＥＰＺ−５６７６（９Ｈ−プリン−６−アミン，９−［５−デオキシ−５−［［シス−３−［２−［６−（１，１−ジメチルエチル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］エチル］シクロブチル］（１−メチルエチル）アミノ］−β−Ｄ−リボフラノシル］−のラセミ混合物）、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。オーロラキナーゼ阻害剤ＩＩ、及びＲＳＫ阻害剤ＩＩ、及びＤＯＴ１Ｌ、とりわけＥＰＺ−５６７６が特に関心対象である。本発明の好ましい実施形態において、小分子は、ステージ６及び７のうちの１つ又は２つ以上の培地中で、より好ましくはステージ７で使用される。有用な小分子の量は、成熟マーカーの最良の発現を示す量、及びどの量が毒性作用をもたらさないかを選択することによって決定され得る。典型的に、有用な量は、約５００ｎＭ〜１０μＭ、代替的には約５００ｎＭ〜５μＭ、及び好ましくは約５００ｎＭ〜２μＭとなる。

多能性細胞の、成熟した表現型を有する膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化
多能性幹細胞の特性は当業者には周知であり、多能性幹細胞の更なる特性が引き続き同定されている。多能性幹細胞のマーカーとして、例えば、以下のもの、すなわち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１のうちの１つ又は２つ以上の発現が挙げられる。これらは、ＲＴ−ＰＣＲによって検出可能であり得る。

例示的な多能性幹細胞として、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２が挙げられる。また、多能性細胞に特徴的な以下のマーカー、すなわち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ９、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１のうちの少なくとも１つを発現する細胞も好適である。

胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーの少なくとも１つを発現している細胞は本発明での使用に好適である。本発明の一態様において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。

膵内胚葉系統に特徴的なこれらのマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞もまた、本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵内胚葉細胞であり、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の発現は、ＣＤＸ２及びＳＯＸ２の発現より実質的に高い。ある特定の実施形態において、ＦＡＣＳにより測定して、細胞の３０％超が、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現し、細胞の３０％未満が、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を発現する。ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の発現が、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２の発現より少なくとも２倍高い細胞が特に有用である。

膵内分泌系統に特徴的なこれらのマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞もまた、本発明における使用に更に適している。本発明の一態様において、膵内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵内分泌細胞である。膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であり得、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン、又は膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を意味する。好ましい実施形態において、膵内分泌細胞は、インスリン産生β細胞である。

本発明のある特定の実施形態において、成熟した表現型の膵内分泌β細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞に到達するために、多能性幹細胞で開始するプロトコルが用いられる。このプロトコルは、以下を含む。
ステージ１：細胞培養株から得られる胚性幹細胞などの多能性幹細胞が、胚体内胚葉細胞の形成を誘導するように適切な因子で処理される。
ステージ２：ステージ１から生じる細胞が、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への形成を誘導するように適切な因子で処理される。
ステージ３：ステージ２細胞から生じる細胞が、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への更なる分化を誘導するように適切な因子で処理される。
ステージ４：ステージ３から生じる細胞が、膵前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への更なる分化を誘導するように適切な因子で処理される。これらの細胞は、後期ステージ４において、空気−液体界面で任意選択で培養される。
ステージ５：ステージ４から生じる細胞が、ある特定の実施形態において、（ｉ）Ｔ３、Ｔ４、若しくはそれらの類似体のうちの１つ又は２つ以上、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を含む適切な因子で処理され、任意選択で好ましくは空気−液体界面で培養されて、膵内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化を誘導する。
ステージ６：ステージ５細胞から生じる細胞が、ある特定の実施形態において、（ｉ）Ｔ３、Ｔ４、若しくはそれらの類似体のうちの１つ又は２つ以上、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、（ｉｉｉ）オーロラキナーゼ阻害剤、ＲＳＫ阻害剤、及びタンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤のうちの１つ又は２つ以上、（ｉｖ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方、（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）、（ｖｉ）（ｉ）及び（ｉｉｉ）、又は（ｖｉｉ）（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む適切な因子で処理され、任意選択で好ましくは空気−液体界面で培養されて、膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化を誘導する。
ステージ７：ステージ６細胞から生じる細胞が、ある特定の実施形態において、（ｉ）Ｔ３、Ｔ４、若しくはそれらの類似体のうちの１つ又は２つ以上、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、（ｉｉｉ）抗酸化剤、（ｉｖ）オーロラキナーゼ阻害剤、ＲＳＫ阻害剤、及びタンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤のうちの１つ又は２つ以上、（ｖ）（ｉ）及び（ｉｉ）、（ｖｉ）（ｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｖｉｉ）（ｉ）及び（ｉｖ）、（ｖｉｉｉ）（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉｘ）（ｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｘ）（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）、（ｘｉ）（ｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）、（ｘｉｉ）（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）、（ｘｉｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｘｉｖ）（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）、又は（ｘｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含む適切な因子で処理され、任意選択で好ましくは空気−液体界面で培養されて、単一ホルモンインスリンを発現し、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡ陽性であり、ステージ６細胞より高いレベルのＭＡＦＡの発現を有する膵内分泌細胞の形成を誘導し、結果として生じる細胞集団は、ステージ６細胞より高い割合のＭＡＦＡ陽性かつ単一ホルモンインスリンを発現する細胞を有する。

ある特定の実施形態において、本発明は、多能性幹細胞（例えば、前ステージ１細胞）をステージ７細胞に分化させることを包含するが、本発明はまた、他のステージの細胞をステージ７に向かって分化させることも包含する。とりわけ、本発明は、ステージ４細胞のステージ７細胞への分化を包含する。更に、プロセスは別個のステージで記載されているが、分化プロセスを通じた細胞の処理並びに進行は、連続的又は継続的であり得る。更に、多能性幹細胞の、ステージ６又はステージ７細胞への分化は、懸濁培養において行うことができる。

分化効率は、被処理細胞集団を、関心対象の分化細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する剤、例えば抗体に曝露することにより決定することができる。培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。これらの方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、インシチュハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．２００１ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）、及びイムノアッセイ、例えば、材料切片の免疫組織化学的分析、ウェスタンブロット、並びに無傷細胞内でアクセス可能なマーカーの場合、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）を参照されたい）が挙げられる。

分化細胞は、更に精製されてもよい。例えば、多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、被処理細胞集団を、精製される分化細胞により特徴的に発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する剤（抗体など）に曝露することにより、分化細胞を精製することができる。

細胞分化に望ましい十分な量のビタミン、無機物、塩、グルコース、アミノ酸、及び担体タンパク質を含有する任意の好適な増殖培地は、様々なステージ１〜７に使用され得る。しかしながら、好ましくは、以下が使用される。ステージ１−ＭＣＤＢ−１３１（（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから入手可能）又はＲＰＭＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能））、ステージ２−ＭＣＤＢ−１３１又はダルベッコ改変イーグル培地Ｆ１２（「ＤＭＥＭ−Ｆ１２」）、ステージ３〜５−ＭＣＤＢ−１３１、ＢＬＡＲ（表１）、又はＤＭＥＭ、及びステージ６及び７−ＢＬＡＲ又はＣＭＲＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。好ましくは、培地のグルコース濃度は、ステージ１〜４については約１０ｍＭで、又はより好ましくはそれより低く保持され、ステージ５〜７については約１０ｍＭより高く保持される。
ステージ１：多能性細胞の、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化。

多能性幹細胞は、当技術分野において既知の任意の方法により、又は本発明で提案される任意の方法により、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化され得る。多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させるために有用であると報告されている方法は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（２００５）、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１，１６５１〜１６６２（２００４）、ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５，２９〜３８（２００７）、Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている。追加の好適な分化方法は、米国特許出願公開第２００７／０２５４３５９号、同第２００９／０１７０１９８号、同第２０１１／００９１９７１号、同第２０１０／００１５７１１号、同第２０１２／０１９０１１１号、同第２０１２／０１９０１１２号、同第２０１２／０１９６３６５号に開示されている。これらの開示は、それらが多能性幹細胞の胚体内胚葉細胞への分化に関するため、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。

一実施形態において、多能性細胞は、好適な増殖培地、好ましくはＭＣＤＢ−１３１又はＲＰＭＩで処理される。培地は、好ましくは増殖分化因子、例えば増殖分化因子８（「ＧＤＦ８」）、及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（「ＧＳＫ３β」）阻害剤、例えば米国特許出願公開第２０１０／００１５７１１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される環式アニリン−ピリジントリアジン化合物が補充され、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化を誘導する。好ましいＧＳＫ３β阻害剤は、１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン（「ＭＣＸ化合物」）である。処理は、多能性幹細胞を、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１５０ｎｇ／ｍＬ、代替的に約７５ｎｇ／ｍＬ〜約１２５ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８が補充された培地と接触させることを必要とし得る。この処理はまた、細胞を、約０．１〜約５μＭ、代替的に約０．５〜約２．５μＭ、好ましくは約１μＭのＭＣＸ化合物と接触させることも必要とし得る。多能性細胞は、約２〜５日間、好ましくは約２〜３日間にわたって培養され、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化を促進することができる。

好ましい実施形態において、細胞は、ＧＤＦ８及びＭＣＸ化合物の存在下で１日培養され、続いてＧＤＦ８及びより低い濃度のＭＣＸ化合物の存在下で１日培養され、続いてＧＤＦ８の存在下、ＭＣＸ化合物の非存在下で１日培養される。とりわけ、細胞は、ＧＤＦ８及び約１μＭ ＭＣＸ化合物の存在下で１日培養され、続いてＧＤＦ８及び約０．１μＭ ＭＣＸ化合物の存在下で１日培養され、続いてＧＤＦ８の存在下、ＭＣＸ化合物の非存在下で１日培養される。代替的に、細胞は、ＧＤＦ８及び約１μＭ ＭＣＸ化合物の存在下で１日培養され、続いてＧＤＦ８及び約０．１μＭ ＭＣＸ化合物の存在下で１日培養される。

代替的に、多能性幹細胞は、血清の非存在下、アクチビンＡを含有する培地中で培養され得、次いで細胞をアクチビンＡ及び血清と培養した後、Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示されるように、細胞を異なる濃度のアクチビンＡ及び血清と培養する。更に別の代替として、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いでＤ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５に開示されるように、細胞をアクチビンＡと培養することによって胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。なおも更に、多能性幹細胞は、アクチビンＡ及びＷＮＴリガンドを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いでＷＮＴリガンドを除去し、Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されるように、細胞をアクチビンＡと培養することによって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。

本発明の一実施形態において、多能性幹細胞は、アクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａで処理され、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成をもたらす。処理は、多能性幹細胞を、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１５０ｎｇ／ｍＬ、代替的に約７５ｎｇ／ｍＬ〜約１２５ｎｇ／ｍＬ、代替的に約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させることを必要とし得る。この処理はまた、細胞を、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬ、代替的に約１５ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬ、代替的に約２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａと接触させることを必要とし得る。多能性細胞は、約３日間培養され、胚体内胚葉細胞に到達し得る。一実施形態において、細胞は、アクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａの存在下で１日培養され、続いてアクチビンＡの存在下で（ＷＮＴ３Ａは存在しない）残りを培養する。

胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより決定することができる。多能性幹細胞は、一般にかかるマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞が胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現し始めた際に検出され得る。
ステージ２：胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化。

胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＭＣＤＢ−１３１又はＤＭＥＭ Ｆ１２などの増殖培地中で、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞へと更に分化され得る。一実施形態において、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成は、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を、線維芽細胞増殖因子（「ＦＧＦ」）を含有する培地、好ましくはＦＧＦ７又はＦＧＦ１０と培養して、細胞を分化させることを含む。例えば、細胞培養物は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約７５ｎｇ／ｍＬ、代替的に約２５ｎｇ／ｍＬ〜約７５ｎｇ／ｍＬ、更に代替的に約３０ｎｇ／ｍＬ〜約６０ｎｇ／ｍＬ、代替的に約５０ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子、好ましくはＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、より好ましくはＦＧＦ７、及び最も好ましくは約２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を含み得る。細胞は、これらの条件下で約２〜３日間、好ましくは約２日間培養され得る。

別の実施形態において、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、線維芽細胞増殖因子、好ましくはＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、及びアスコルビン酸（ビタミンＣ）と培養することを含む。培養培地は、約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭのアスコルビン酸、代替的に約０．２ｍＭ〜約０．４ｍＭのアスコルビン酸、代替的に約０．２５ｍＭのアスコルビン酸を含み得る。細胞培養物はまた、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約３５ｎｇ／ｍＬ、代替的に約１５ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬ、代替的に約２５ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子、好ましくはＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、より好ましくはＦＧＦ７を含み得る。例えば、細胞培養物は、約０．２５ｍＭのアスコルビン酸及び約２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を含み得る。一実施形態において、ステージ１細胞は、ＦＧＦ７及びアスコルビン酸で２日間処理される。
ステージ３：腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化

ステージ２を実行することから生じる腸管細胞は、これらの細胞を、ＭＣＤＢ−１３１、ＤＭＥＭなどの増殖培地、又はＢＬＡＲなどのカスタム培地（表Ｉ）中で培養することによってステージ３細胞、つまり前腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞へと更に分化し得る。培地は、（ｉ）線維芽細胞増殖因子、好ましくはＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、及びより好ましくはＦＧＦ７、（ｉｉ）レチノイン酸（「ＲＡ」）、（ｉｉｉ）１−ピペラジンアミン、Ｎ−［（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチレン］−４−（フェニルメチル）−又は（（Ｅ）−４−ベンキシル−Ｎ−（（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル），エチレン−ピペラジン−１−アミン）である、ソニックヘッジホッグ（「ＳＨＨ」）シグナル伝達経路アンタゴニスト（例えばスムーズンド（Smoothened）アンタゴニスト（「ＳＡＮＴ−１」）、２−メトキシエチル１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−４−（３ヒドロキシフェニル）−７−（２−メトキシフェニル）−２−メチル−５−オキソ−３−キノリンカルボキシレートである、ＨＰＩ−１、及び好ましくはＳＡＮＴ−１、（ｉｖ）タンパク質キナーゼＣ（「ＰＫＣ」）活性因子、例えば（（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエンオイルアミノ）ベンゾラクタム）（「ＴＰＢ」）、ホルボール−１２，１３−ジブチレート（「ＰＤＢｕ」）、ホルボール−１２−ミリステート−１３−酢酸塩（「ＰＭＡ」）又はインドラクタムＶ（「ＩＬＶ」）及び好ましくはＴＰＢ、（ｖ）骨形成タンパク質（「ＢＭＰ」）阻害剤、例えばＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ、又はＣｈｏｒｄｉｎ、及び好ましくはＬＤＮ−１９３１８９、並びに（ｖｉ）アスコルビン酸が補充され得る。代替的に、スムーズンド（「ＳＭＯ」）受容体阻害剤（例えば、ＭＲＴ１０（Ｎ［［［３−ベンゾイルアミノ）フェニル］アミノ］チオキソメチル］−３，４，５−トリメトキシベンズアミド））又はシクロパミンが使用されてもよい。例えば、細胞培養物は、約１００ｎＭ〜約５００ｎＭ、代替的に約１００ｎＭ〜約４００ｎＭ、代替的に約２００ｎＭのＰＫＣ活性因子を含み得る。細胞は、これらの増殖因子、小分子アゴニスト、及びアンタゴニストの存在下で約２〜４日間、好ましくは約２〜３日間、より好ましくは約２日間培養され得る。

代替的に、ステージ２細胞は、ＳＭＯ受容体阻害剤、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸、及びＮｏｇｇｉｎが補充された培養培地中でこれらの細胞を培養することによってステージ３細胞へと分化され得る。細胞は、約２〜４日間、好ましくは約２日間培養され得る。

一実施形態において、培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約３５ｎｇ／ｍＬ、代替的に約１５ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬ、代替的に約２５ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子、好ましくはＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、より好ましくはＦＧＦ７、約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭのアスコルビン酸、代替的に約０．２ｍＭ〜約０．４ｍＭ、代替的に約０．２５ｍＭのアスコルビン酸、約０．１μＭ〜約０．４μＭのＳＡＮＴ−１、約１００〜約３００ｎＭのＴＰＢ、及び約５０ｎＭ〜約２００ｎＭ、及び約１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９が補充される。別の実施形態において、培地は、約２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−７、約１μＭのレチノイン酸、約０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、約２００ｎＭのＴＰＢ、約１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、及び約０．２５ｍＭのアスコルビン酸が補充される。

一実施形態において、培地は、約０．１μＭ〜約０．３μＭのＳＡＮＴ−１、約０．５μＭ〜約３μＭのレチノイン酸、及び約７５ｎｇ／ｍＬ〜約１２５ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎが補充される。
ステージ４〜ステージ７：オーロラキナーゼ阻害剤、ＲＳＫ阻害剤、及びタンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤のうちの１つ又は２つ以上と共に甲状腺ホルモン及びＡＬＫ阻害剤の一方又は両方が補充された培養培地での処理による、好ましくは空気−液体界面で培養することによる、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、成熟した表現型膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化。

一実施形態において、本発明は、膵内分泌細胞への多能性細胞の経路における全てのステージについて、空気−液体界面で培養することを企図しているが、本発明は、好ましくは平板又は浸漬培養におけるステージ１〜ステージ４細胞、並びに空気−液体界面で細胞を培養することによるステージ５、６、及び７細胞の形成を提供する。他の実施形態において、本発明は、ステージ４、５、及び６細胞を空気−液体界面で培養することを含む、多能性細胞の分化の段階的方法に関する。ある特定の実施形態において、ステージ４〜７中に培養される細胞は、空気−液体界面で培養され得る。他の実施形態において、後期ステージ４〜ステージ６細胞、又はステージ５及びステージ６細胞のみが空気−液体界面で培養される。更に別の代替実施形態において、ステージ１〜４は、細胞を浸漬された平板培養において細胞を培養することによって行われ、ステージ５〜７は、浸漬された懸濁培養において培養することによって行われる。

追加として、ステージ５、６、及び７のうちの１つ又は２つ以上、好ましくは全ての間の培養は、Ｔ３、Ｔ４、及びそれらの類似体、ＡＬＫ５阻害剤のうちの１つ若しくは２つ以上、又はＴ３、Ｔ４、及びそれらの類似体のうちの１つ若しくは２つ以上及びＡＬＫ５阻害剤の両方の存在下で行われる。好ましい実施形態において、ステージ５、６、及び７のうちの１つ又は２つ以上、及び好ましくはそれらの全ての間の培養は、好ましくはＴ３及びＡＬＫ５阻害剤の存在下、及びより好ましくはＴ３及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩの存在下で行われる。甲状腺ホルモン又はそれらの類似体の好適な量は、約０〜約１０００ｎＭ、代替的に約１０〜約９００ｎＭ、代替的に約１００〜約８００ｎＭ、代替的に約２００〜約７００ｎＭ、代替的に約３００〜約６００ｎＭ、代替的に約４００〜約５００ｎＭ、代替的に約１〜約５００ｎＭ、代替的に約１〜約１００ｎＭ、代替的に約１００〜約１０００ｎＭ、代替的に約５００〜約１０００ｎＭ、代替的に約１００〜約５００ｎＭ、代替的に約１μＭ、及び好ましくは約０．１〜１μＭである。ＡＬＫ５阻害剤の量は、約２５０ｎＭ〜２μＭ、代替的に約３００〜約２０００ｎＭ、代替的に約４００〜約２０００ｎＭ、代替的に約５００〜約２０００ｎＭ、代替的に約６００〜約２０００ｎＭ、代替的に約７００〜約２０００ｎＭ、代替的に約８００〜約２０００ｎＭ、代替的に約１０００〜約２０００ｎＭ、代替的に約１５００〜約２０００ｎＭ、代替的に約２５０〜約１０００ｎＭ、代替的に約２５０〜約５００ｎＭ、代替的に約３００〜約１０００ｎＭ、代替的に約４００〜約１０００ｎＭ、代替的に約５００〜約１０００ｎＭ、代替的に約６００〜約１０００ｎＭ、代替的に約７００〜約１０００ｎＭ、代替的に約８００〜約１０００ｎＭ、代替的に約５００ｎＭ、代替的に約１０μＭ、及び好ましくは約１０μＭである。

細胞が空気−液体界面（「ＡＬＩ」）で培養されるとき、細胞は、多孔性基質上で培養され得、それにより、細胞は上側で空気と接触し、底側で細胞培養培地と接触する。例えば、十分な体積の培地が、多孔性基質（例えば、フィルター挿入物）を収容する培養容器の底部に添加され得、それにより、培地は基質上に存在する細胞の底面と接触するが、それらを被包又は浸漬しない。好適な多孔性基質は、細胞の増殖及び分化に悪影響を及ぼさない任意の材料で形成され得る。例示的な多孔性基質は、ポリエチレンテレフタレート（「ＰＥＴ」）、ポリエステル、又はポリカーボネートなどのポリマーで作製される。好適な多孔性基質は、コーティングされても、コーティングされなくてもよい。一実施形態において、コーティングは、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）であり得る。本発明の一実施形態において、多孔性基質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングされ得る多孔性フィルター挿入物である。本発明の一実施形態において、多孔性基質は、無コーティングフィルター挿入物である。基質の多孔性は、細胞生存性を維持し、細胞の分化を促進するのに十分であるべきである。好適な基質は、約０．３〜約３．０μｍ、約０．３〜約２．０μｍ、約０．３〜約１．０μｍ、約０．３〜約０．８μｍ、約０．３〜約０．６μｍ、約０．３〜約０．５μｍ、約０．３〜約３．０μｍ、約０．６〜約３．０μｍ、約０．８〜約３．０μｍ、約１．０〜約３．０μｍ、約２．０〜約３．０μｍ、好ましくは約０．４μｍの孔径、及び約５０００万〜約１億２０００万孔／ｃｍ²、約６０００万〜約１億１０００万孔／ｃｍ²、約７０００万〜約１億孔／ｃｍ²、好ましくは約８０００万〜約１億孔／ｃｍ²、約９０００万〜約１億孔／ｃｍ²、及びより好ましくは約１億孔／ｃｍ²の孔密度を有するフィルター挿入物を含む。

培地は、１日おき又は好ましくは毎日、交換又はリフレッシュされ得る。多孔性基質の上部で増殖される細胞は、一般に単一細胞ではないが、むしろそれらは、シートの形態であるか、又は集合細胞集団として存在する。ＡＬＩで培養される細胞は、培地中に浸漬された細胞と比較して、より高い酸素分圧を経験し得る。

本発明は、空気−液体界面でのステージ４〜７、好ましくはステージ５〜７細胞の形成を包含する。細胞は、多能性幹細胞を分化させることによって、又はステージ３、４、５、又は６細胞を分化させることによって形成され得る。ステージ４細胞は、空気−液体界面で全体的に培養され得るか、又は細胞は、ステージ４の早期部分（約１〜２日を意味する）の間に、浸漬された平板培養において培養され得、次いでステージ４の後期部分（約２日目〜３日目を意味する）については空気−液体界面で培養され得る。好ましくは、ステージ４は、ＡＬＩで行われないが、浸漬培養において行われる。

一実施形態において、本発明は、多能性幹細胞から膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を産生するための方法を提供し、多能性幹細胞を培養することと、多能性幹細胞を、前腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることと、前腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、任意選択で空気−液体界面で培養することによって、膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることとを含む。この方法は、（ｉ）Ｔ３、Ｔ４、若しくはそれらの類似体の一方又は両方、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、あるいは（ｉ）及び（ｉｉ）の両方が補充された培地での処理を含み得る。この方法は、前腸内胚葉細胞（ステージ３細胞）に特徴的なマーカーを発現する細胞を、（ｉ）Ｔ３、Ｔ４、若しくはそれらの類似体の一方又は両方、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方が補充された培地での処理、並びに平板培養における培養によって膵前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（ステージ４細胞）へと分化させることを含み得る。この方法はまた、膵前腸前駆細胞（ステージ４細胞）に特徴的なマーカーを発現する細胞を、（ｉ）Ｔ３、Ｔ４、若しくはそれらの類似体の一方又は両方、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方が補充された培地での処理、並びに平板培養における培養、好ましくは空気−液体界面での培養によって膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（ステージ６細胞）へと分化させることを含み得る。この方法は、ステージ６細胞を、（ｉ）Ｔ３、Ｔ４、若しくはそれらの類似体の一方又は両方、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方が、オーロラキナーゼ阻害剤、ＲＳＫ阻害剤、及びタンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤のうちの１つ若しくは２つ以上、並びに任意選択だが好ましくはビタミンＥ、又は好ましくはアセチルシステインなどの抗酸化剤と共に補充された培地での処理によって、膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現し、ステージ６と比較して、より成熟した表現型を有する細胞（ステージ７細胞）へと分化させることを更に含む。有用なアセチルシステインの量は、約０．１〜約２ｍＭである。ビタミンＥの量は、約０．１〜約１０μＭである。更に別の実施形態において、この方法は、（ｉ）Ｔ３、Ｔ４、若しくはそれらの類似体の一方又は両方、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方が、オーロラキナーゼ阻害剤、ＲＳＫ阻害剤、及びタンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤のうちの１つ若しくは２つ以上と共に補充された培地でのステージ５細胞の処理によってステージ６を行うことを更に含む。更に別の実施形態において、ステージ６は、（ｉ）Ｔ３、Ｔ４、若しくはそれらの類似体の一方又は両方、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方が、オーロラキナーゼ阻害剤、ＲＳＫ阻害剤、及びタンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤のうちの１つ若しくは２つ以上と共に補充された培地において、ステージ５細胞の処理によって行われ、続いてステージ７が、（ｉ）Ｔ３、Ｔ４、若しくはそれらの類似体の一方又は両方、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方が、オーロラキナーゼ阻害剤、ＲＳＫ阻害剤、及びタンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤のうちの１つ若しくは２つ以上、並びに任意選択だが好ましくはビタミンＥ、又は好ましくはアセチルシステインなどの抗酸化剤と共に補充された培地での処理によって行われる。

本発明の一実施形態は、成熟化β細胞に特徴的なマーカーを発現する膵内分泌細胞（ステージ７細胞）を形成する方法であり、膵前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（ステージ４細胞）を、好ましくは空気−液体界面で培養することによってステージ７細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることを含む。別の実施形態において、本発明の方法は、ステージ６細胞、又は未成熟β細胞である細胞の形成をもたらす。この方法は、好ましくは少なくともステージ５〜７の間、Ｔ３、Ｔ４、若しくはそれらの類似体、ＡＬＫ５阻害剤、又は両方が補充された培地での処理を含む。

空気−液体界面での細胞の培養は、細胞を、多孔性フィルター挿入物などの多孔性基質上に播種することを含む。ある特定の実施形態において、基質孔径は、約０．３〜約３ミクロンの範囲であり得る。播種は、細胞を単一細胞として単層培養物から、又は細胞の集団を単層培養物から懸濁液へと放出し、続いて単一細胞懸濁液又は懸濁された細胞培養物をＡＬＩで多孔性基質の上に分取することによって達成され得る。細胞は、約１０００細胞／μＬ〜約１００，０００細胞／μＬ、約１０００細胞／μＬ〜約９０，０００細胞／μＬ、約１０００細胞／μＬ〜約８０，０００細胞／μＬ、約１０００細胞／μＬ〜約７０，０００細胞／μＬ、約１０００細胞／μＬ〜約６０，０００細胞／μＬ、約１０００細胞／μＬ〜約５０，０００細胞／μＬ、約１０００細胞／μＬ〜約４０，０００細胞／μＬ、約１０００細胞／μＬ〜約３０，０００細胞／μＬ、約１０００細胞／μＬ〜約２０，０００細胞／μＬ、約１０００細胞／μＬ〜約１０，０００細胞／μＬ、約１０００細胞／μＬ〜約５０００細胞／μＬ、約５０００細胞／μＬ〜約１００，０００細胞／μＬ、約１０，０００細胞／μＬ〜約１００，０００細胞／μＬ、約２０，０００細胞／μＬ〜約１００，０００細胞／μＬ、約３０，０００細胞／μＬ〜約１００，０００細胞／μＬ、約４０，０００細胞／μＬ〜約１００，０００細胞／μＬ、約５０，０００細胞／μＬ〜約１００，０００細胞／μＬ、約６０，０００細胞／μＬ〜約１００，０００細胞／μＬ、約２０，０００細胞／μＬ〜約８０，０００細胞／μＬ、約３０，０００細胞／μＬ〜約７０，０００細胞／μＬ、約４０，０００細胞／μＬ〜約６０，０００細胞／μＬ、及び好ましくは約５０，０００細胞／μＬを有する懸濁液から多孔性基質の上に播種され得る。細胞は、個々の細胞又は細胞の集合体若しくは集団を含有する細胞懸濁液の液滴として播種され得る。結果として生じる細胞体積物は、約５×１０⁶〜約５×１０⁷細胞／ｃｍ²、約６×１０⁶〜約５×１０⁷細胞／ｃｍ²、約７×１０⁶〜約５×１０⁷細胞／ｃｍ²、約８×１０⁶〜約５×１０⁷細胞／ｃｍ²、約９×１０⁶〜約５×１０⁷細胞／ｃｍ²、約１×１０⁷〜約５×１０⁷細胞／ｃｍ²、約２×１０⁷〜約５×１０⁷細胞／ｃｍ²、約３×１０⁷〜約５×１０⁷細胞／ｃｍ²、約４×１０⁷〜約５×１０⁷細胞／ｃｍ²、約５×１０⁶〜約４×１０⁷細胞／ｃｍ²、約５×１０⁶〜約３×１０⁷細胞／ｃｍ²、約５×１０⁶〜約２×１０⁷細胞／ｃｍ²、約５×１０⁶〜約１×１０⁷細胞／ｃｍ²、約５×１０⁶〜約９×１０⁶細胞／ｃｍ²、約５×１０⁶〜約８×１０⁶細胞／ｃｍ²、約５×１０⁶〜約７×１０⁶細胞／ｃｍ²、約５×１０⁶〜約６×１０⁶細胞／ｃｍ²、約７×１０⁶〜約４×１０⁷細胞／ｃｍ²、約８×１０⁶〜約３×１０⁷細胞／ｃｍ²、約９×１０⁶〜約２×１０⁷細胞／ｃｍ²、及び好ましくは約１×１０⁷細胞／ｃｍ²を含有し得る。

別の実施形態において、本発明は、単一ホルモン陽性細胞の数を増強する方法を指す（例えば、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共発現細胞の集団を、好ましくは空気−液体界面で培養及び分化させることによって、ＮＫＸ６．１及びインスリンを共発現する細胞、又はＮＫＸ６．１及びクロモグラニンを共発現する細胞）。別の実施形態において、空気−液体界面で培養された膵内胚葉細胞を、以下、すなわち、ＡＬＫ５阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、γ分泌酵素阻害剤、エフリンリガンド、ＥｐｈＢ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ＥＧＦｒ阻害剤、レチノイン酸、ビタミンＣ、Ｔ３／Ｔ４、グルコース、細胞周期調節因子、ＷＮＴ調節因子、ＳＨＨ阻害剤、オーロラ阻害剤、抗酸化剤、ビタミンＥ、アセチル−システイン、又はそれらの組み合わせから選択される化合物での処理によって膵内分泌細胞へと更に分化させる。

更なる実施形態において、本発明は、多能性細胞を分化させる段階的方法に関し、ステージ４〜ステージ６細胞を、十分な量の（ｉ）Ｔ３、Ｔ４、及びそれらの類似体のうちの１つ又は２つ以上、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を含有する培地中で培養することと、ステージ６細胞を、任意選択で好ましくはオーロラキナーゼ阻害剤、ＲＳＫ阻害剤、及びタンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤のうちの１つ又は２つ以上、並びに抗酸化剤を含有する培地中で更に培養して、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを発現する膵内分泌細胞及び膵内分泌細胞の集団を生成することとを含む。

一部の実施形態において、結果として生じる細胞集団の細胞の少なくとも１０％が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを発現する。他の実施形態において、集団の細胞の少なくとも２０％が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを発現する。他の実施形態において、集団の細胞の少なくとも３０％が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを発現する。更に他の実施形態において、集団の細胞の少なくとも４０％が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを発現する。更に他の実施形態において、集団の細胞の少なくとも５０％が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを発現する。代替実施形態において、細胞の少なくとも６０％が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを発現する。更に他の代替実施形態において、集団の細胞の少なくとも７０％が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを発現する。更に他の実施形態において、集団の細胞の少なくとも８０％が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを発現する。他の実施形態において、集団の細胞の少なくとも９０％が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを発現する。代替実施形態において、集団の細胞の少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを発現する。
ステージ４：前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、膵前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化。

一実施形態において、本発明の方法は、ステージ３細胞を、任意の好適な増殖培地であり得、好ましくはＭＣＤＢ−１３１、ＤＭＥＭ、又はＢＬＡＲなどのカスタム培地（表Ｉ）である分化培地で処理することを含む。培地は、以下、すなわち、（ａ）ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｖ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｉ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩＩ、ＴＧＦ−β阻害剤ＳＢ４３１５４２、ＳＤ−２０８、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＡＬＫ５ｉ及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩからなる群から選択されるＡＬＫ５阻害剤、（ｂ）Ｔ３、Ｔ４、Ｔ３の類似体、Ｔ４の類似体、及びそれらの混合物からなる群から選択される甲状腺ホルモン、（ｃ）ＳＡＮＴ−１又はＨＩＰ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、（ｄ）ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ、又はＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤、（ｅ）ＴＰＢ、ＰＰＢｕ、ＰＭＡ、及びＩＬＶから選択されるＰＫＣ活性因子、（ｆ）ＦＧＦ−７又はＦＧＦ−１０から選択される線維芽細胞増殖因子、（ｇ）レチノイン酸、及び（ｈ）アスコルビン酸のうちの１つ又は２つ以上が補充され得る。例えば、ＭＣＤＢ１３１又は好ましくはＢＬＡＲなどの増殖培地は、ＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト（ＳＡＮＴ−１若しくはＨＰＩ−１など）、ＢＭＰ阻害剤（ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ、若しくはＣｈｏｒｄｉｎ）、アスコルビン酸、及びＰＫＣ活性因子（ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ、若しくはＩＬＶ）が補充され、有用な分化培地を提供することができる。ステージ３細胞を、こうした培地中で約２〜４日間、好ましくは約２〜３日間、より好ましくは約３日間培養することは、通常、ステージ３細胞をステージ４細胞へと分化させるのに十分である。別の実施形態において、培地は、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストが補充され得る。好ましい実施形態において、ステージ３細胞は、約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、約１００ｎＭ ＲＡ、約２ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ７、約１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、及び約０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び約２００ｎＭが補充された培地で３日間処理され得る。

ステージ４において、細胞は、ステージ全体の間、又は好ましくは約２〜３日間の平板培養後のいずれかに、空気−液体界面で培養され得る。具体的に、本発明は、空気−液体界面で多能性幹細胞から誘導された細胞を分化させるための生体外細胞培養を提供し、（ａ）培養容器、（ｂ）容器内の、容器の体積の一部分のみを充填するのに十分な体積の増殖培地、（ｃ）培地に隣接する容器の一部分を充填する容器内の空気、（ｄ）培地と空気との間の界面に位置する多孔性基質、及び（ｅ）培地が細胞の表面の一部分のみに接触するように、基質の表面上に配設された多能性幹細胞から誘導される細胞を含む。代替的に、ステージ４は、平坦培養中で全体的に行われ得る。

更なる実施形態において、ステージ４の完了時の細胞は、Ｒｈｏ関連キナーゼ（「ＲＯＣＫ」）阻害剤、例えば、Ｙ２７６３２（（１Ｒ，４ｒ）−４−（（Ｒ）−１−アミノエチル）−Ｎ−（ピリジン−４−イル）シクロヘキサンカルボキシアミド）、ＧＳＫ２６９９６２（Ｎ−［３−［［２−（４−アミノ−１，２，５−オキサジアゾール−３？−イル）−１−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル］オキシ］フェニル］−４−［２−（４−モルホリニル）エトキシ］ベンズアミド）、Ｈ１１５２（（Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］ホモピペラジン、２ＨＣｌ）、及びＳＲ３６７７（Ｎ−［２−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］−４−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）フェニル−２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−２−カルボキシアミドジヒドロクロリド）で処理され得る。ある特定の実施形態において、約１〜２０μＭ、代替的に約１〜１５μＭ、代替的に約１〜１０μＭ、好ましくは約１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤が使用され得る。

ある特定の実施形態において、平板培養中で１〜２日間培養された細胞を意味する、後期ステージ４細胞のみが、ステージ４の完了のために、続けて空気−液体界面で培養され得る。一実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤で処理された後期ステージ４細胞のみが、空気−液体界面で培養される。他の実施形態において、０．５〜約０．７５×１０⁵細胞／μＬが播種され、空気−液体界面で培養される。代替的に、約２〜６×１０⁶細胞が播種され、空気−液体界面で培養される。ある特定の実施形態において、細胞は、空気−液体界面での培養前に、ＴｒｙｐＬＥ（商標）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、又はＤｉｓｐａｓｅ（商標）などのタンパク質分解及びコラーゲン分解酵素を含有する溶液などの細胞脱離溶液で処理され得る。

代替実施形態において、ステージ３細胞は、ＡＬＫ５阻害剤、Ｎｏｇｇｉｎ、及びＰＫＣ活性因子、例えばＴＰＢが補充された増殖培地を含む分化培地で処理され得る。ある特定の実施形態において、培地は、約０．１μＭ ＡＬＫ５阻害剤、約１００ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎ、及び約５００ｎＭ ＴＰＢが補充され得る。細胞培養は、単層形式であり得る。処理は、合計約３日間にわたって継続し得る。ある特定の実施形態において、細胞は、２日間処理され得、次いで最後の日に、細胞は、タンパク質分解酵素、コラーゲン分解酵素、又は両方、例えばＤｉｓｐａｓｅ（商標）で処理され、約１００ミクロン未満の直径を有する細胞集団に分割され、続いてＡＬＫ５阻害剤及びＬＤＮ−１９３１８９の存在下で培養され得る。ある特定の実施形態において、約１００ミクロン未満の直径を有する細胞集団は、約２００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤及び約１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９が補充された培地中で培養され得る。代替実施形態において、ステージ４細胞を空気−液体界面で培養することは、内分泌関連マーカーと共に、膵内胚葉マーカーを著しく増強することができる。したがって、本発明は、ステージ４細胞を空気−液体界面で培養することによって、膵内胚葉及び内分泌関連マーカーを増強する方法を提供する。
ステージ５：膵前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、膵内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化。

一実施形態において、本発明の方法は、ステージ４細胞を、任意の好適な増殖培地であり得、好ましくはＭＣＤＢ−１３１、ＤＭＥＭである分化培地、又は好ましくはＢＬＡＲなどのカスタム培地（表Ｉ）で処理することを含む。培地は、以下、すなわち、（ａ）ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｖ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｉ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩＩ、ＴＧＦ−β阻害剤ＳＢ４３１５４２、ＳＤ−２０８、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＡＬＫ５ｉ及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩからなる群から選択されるＡＬＫ５阻害剤、（ｂ）Ｔ３、Ｔ４、Ｔ３の類似体、Ｔ４の類似体、及びそれらの混合物からなる群から選択される甲状腺ホルモン、（ｃ）ＳＡＮＴ−１又はＨＩＰ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、（ｄ）ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ、又はＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤、（ｅ）レチノイン酸、（ｆ）アスコルビン酸（ｇ）ヘパリン、及び（ｈ）硫酸亜鉛のうちの１つ又は２つ以上が補充され得、細胞を、好ましくは空気−液体界面で約２〜４日間、好ましくは約３日間培養して、細胞をステージ５細胞へと分化させる。別の実施形態において、増殖培地はまた、ＳＭＯ阻害剤（ＭＲＴ１０又はシクロパミンなど）、及び好ましくはＦＧＦ−７又はＦＧＦ−１０から選択される線維芽細胞増殖因子の一方又は両方が補充される。ステージ４細胞の処理は、約２〜４日間、好ましくは約３日間行われ、細胞をステージ５細胞へと分化させる。

好ましい実施形態において、ステージ４細胞は、約０．１μＭ〜約０．４μＭのＳＡＮＴ−１及び好ましくは約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭ ＲＡ、約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭアスコルビン酸、代替的に約０．２ｍＭ〜約０．４ｍＭ及び好ましくは約０．２５ｍＭアスコルビン酸、約５０ｎＭ〜約２００ｎＭ及び好ましくは約１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、約１μＭのＴ３、並びに約１００００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤、より好ましくはＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充された培地で細胞を処理することによって、ステージ５細胞へと分化される。更に別の実施形態において、細胞はまた、任意選択で好ましくは約１〜１５μＭ、代替的に約１〜１０μＭ ＺｎＳＯ₄、代替的に約５〜１０μＭ、好ましくは約１０μＭ、約１０μＭ硫酸亜鉛、及び約１〜１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約１０μｇ／ｍＬのヘパリンで処理される。ステージ４細胞の処理は、約２〜４日間、好ましくは約３日間行われ、細胞をステージ５細胞へと分化させる。

更に別の実施形態において、本発明の方法は、ステージ４細胞を、ヘパリン、ＳＭＯ阻害剤、又はＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、ＲＡ、ＢＭＰ受容体阻害剤、及びＡＬＫ５阻害剤が補充された培地で処理することと、細胞を空気−液体界面で約３日間培養して、細胞をステージ５細胞へと分化させることとを含む。代替実施形態において、培地は、ＲＡ、ＢＭＰ受容体阻害剤、及びＡＬＫ５阻害剤と共に、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストの両方が補充され得る。したがって、一実施形態において、ステージ４細胞は、ヘパリン、ＺｎＳＯ₄、ＳＭＯ阻害剤又はＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、ＲＡ、ＬＤＮ−１９３１８９、及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充された培地でステージ４細胞を処理することによってステージ５細胞へと分化され得る。代替実施形態において、培地は、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストの両方が補充され得る。一実施形態において、ステージ４細胞は、約１０μｇ／ｍＬのヘパリン、約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭ ＲＡ、約５０ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、約１０ｎＭのＴ３、及び約１０００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤が補充された培地で細胞を処理することによってステージ５細胞へと分化される。好適なＡＬＫ５阻害剤としては、ＳＤ−２０８、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｖ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｉ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩＩ、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ステージ４細胞の処理は、約２〜４日間、好ましくは約３日間行われ、細胞をステージ５細胞へと分化させる。

好ましい実施形態において、ＡＬＫ５阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである。別の好ましい実施形態において、約１００００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩが使用される。代替の好ましい実施形態において、ステージ４細胞は、約１０μｇ／ｍＬのヘパリン、約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭ ＲＡ、約１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、及び約１００００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充された培地で処理される。更に別の代替実施形態において、本発明の方法は、ステージ４細胞を、ＳＭＯ阻害剤、又はＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、ＲＡ、及びＡＬＫ５阻害剤が補充された培地で処理することと、細胞を好ましくは空気−液体界面で約２〜４日間、好ましくは約３日間培養して、細胞をステージ５細胞へと分化させることとを含む。代替実施形態において、培地は、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストの両方が補充され得る。一実施形態において、ステージ４細胞は、約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭ ＲＡ、約５０ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、約１μＭ Ｔ３、及び約１０００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤が補充された培地で細胞を処理することによってステージ５細胞へと分化される。

空気−液体界面で培養するために播種される細胞の量は異なり得る。例えば、細胞を空気−液体界面で培養するために、約０．５〜６×１０⁵細胞／μＬを含有する細胞懸濁液の液滴が多孔性基質（例えば、フィルター）上に播種され得る。懸濁液は、約２×１０⁵細胞／μＬ〜約６×１０⁵細胞／μＬ、約４×１０⁵細胞／μＬ〜約６×１０⁵細胞／μＬ、約５×１０⁵細胞／μＬ〜約６×１０⁵細胞／μＬ、約５×１０⁵細胞／μＬ〜約６×１０⁵細胞／μＬ、約２×１０⁵細胞／μＬ〜約５×１０⁵細胞／μＬ、約２×１０⁵細胞／μＬ〜約４×１０⁵細胞／μＬ、又は約３×１０⁵細胞／μＬを含有し得、空気−液体界面に位置するフィルターなどの多孔性基質の上に播種され得る。一部の実施形態において、約０．５×１０⁵細胞／μＬ〜約０．７５×１０⁵細胞／μＬ、約０．６×１０⁵細胞／μＬ〜約０．７５×１０⁵細胞／μＬ、又は約０．５×１０⁵細胞／μＬ〜約０．６×１０⁵細胞／μＬを含有する細胞懸濁液の液滴は、ＡＬＩで培養されるように多孔性支持体の上に播種される。

別の実施形態において、本発明の方法は、ステージ４細胞を、ＢＭＰ受容体阻害剤（例えば、ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ、又はＣｈｏｒｄｉｎ）及びＡＬＫ５阻害剤が補充された培地で約１日間処理して、ステージ４細胞をステージ５細胞へと分化させることを含む。例えば、培地は、約１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、及び約１００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤及び約１μＭ Ｔ３が補充され得る。細胞は、集団の形態であり得る。ある特定の実施形態において、細胞は、空気−液体界面で培養する前に、タンパク質分解酵素及びコラーゲン分解酵素を含有する溶液などの細胞脱離溶液で処理され得る。

前述の方法に従い、本発明は、膵前腸前駆体に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵内胚葉／膵内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させるための細胞培養を更に提供し、（ａ）培養容器、（ｂ）容器内の、容器の体積の一部分のみを充填するのに十分な体積の増殖培地、（ｃ）培地に隣接する容器の一部分を充填する容器内の空気、（ｄ）培地と空気との間の界面に位置する多孔性基質、及び（ｅ）培地が細胞の表面の一部分のみに接触するように、基質の表面上に配設された多能性幹細胞から誘導される膵前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を含む。
ステージ６：膵内胚葉／膵内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、膵内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化。

一実施形態において、本発明の方法は、ステージ５細胞を、任意の好適な増殖培地、好ましくはＭＣＤＢ−１３１又はＣＭＲＬ、より好ましくはＢＬＡＲなどのカスタム培地（表Ｉ）であり得る分化培地で処理することを含む。培地は、以下、すなわち、（ａ）ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｖ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｉ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩＩ、ＴＧＦ−β阻害剤ＳＢ４３１５４２、ＳＤ−２０８、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＡＬＫ５ｉ及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩからなる群から選択されるＡＬＫ５阻害剤、（ｂ）Ｔ３、Ｔ４、それらの類似体、及びそれらの混合物からなる群から選択される甲状腺ホルモン、（ｃ）好ましくはＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ、又はＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤、（ｄ）γ分泌酵素阻害剤ＸＸ、γ分泌酵素阻害剤ＸＸＩ、γ分泌酵素阻害剤ＸＶＩ、又はＤＡＰＴなどのγ分泌酵素阻害剤、（ｅ）アスコルビン酸、（ｆ）ヘパリン、及び（ｇ）硫酸亜鉛のうちの１つ又は２つ以上が補充され得、好ましくは空気−液体界面で、約２〜４日間、好ましくは約３日間培養して、ステージ５細胞をステージ６細胞へと分化させることができる。任意選択で、培地は、追加としてＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、スムーズンド受容体阻害剤、線維芽細胞増殖因子、及びレチノイン酸のうちの１つ又は２つ以上が補充され得る。

好ましい実施形態において、ステージ５細胞は、約５０ｎＭ ＲＡ、約０．２５ｍＭアスコルビン酸、約１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、約１００００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤及び好ましくはＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、１μＭ Ｔ３、約１００ｎＭのγ分泌酵素阻害剤が補充された培地で約７日間処理することによってステージ６細胞へと分化され得る。代替的に、ステージ５細胞は、約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭ ＲＡ、約０．２５ｍＭアスコルビン酸、約１０００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤、及び１μＭ Ｔ３が補充された培地で約３日間処理することによってステージ６細胞へと分化され得る。細胞は、こうした培地中で、必要に応じて更に２日間以上培養され得る。

代替的に、ステージ５細胞は、ヘパリン、ＳＭＯ阻害剤又はＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、ＢＭＰ阻害剤、Ｔ３、Ｔ４、それらの類似体及びそれらの混合物、並びにＡＬＫ５阻害剤が補充された培地で処理し、好ましくは空気−液体界面で、約１〜７日間、代替的に約６日間、代替的に約７日間培養することによってステージ６細胞へと分化され得る。代替実施形態において、培地は、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストの両方が補充され得る。例えば、細胞は、約１０μｇ／ｍＬのヘパリン、約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、約１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、約１０００ｎＭのＴ３、及び約５００〜約１０，０００ｎＭ、代替的に約５００ｎＭ、代替的に約１０００ｍＭ、及び代替的に約１０，０００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤が補充された培地中で培養され得る。好適なＡＬＫ５阻害剤としては、ＳＤ−２０８、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｖ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｉ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩＩ、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

好ましい実施形態において、ＡＬＫ５阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである。より好ましい実施形態において、約１００００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩが使用される。したがって、一実施形態において、ステージ５細胞は、ヘパリン、ＳＭＯ阻害剤又はＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、ＢＭＰ阻害剤、Ｔ３、Ｔ４、それらの類似体及びそれらの混合物、並びにＡＬＫ５阻害剤が補充された培地で処理し、好ましくは空気−液体界面で、約７日間培養することによってステージ６細胞へと分化され得る。代替実施形態において、培地は、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストの両方が補充され得る。ある特定の実施形態において、細胞は、空気−液体界面で培養する前に、タンパク質分解酵素及びコラーゲン分解酵素を含有する溶液などの細胞脱離溶液で処理され得る。

別の実施形態において、ステージ５細胞は、ヘパリン、ＳＭＯ阻害剤又はＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、ＢＭＰ阻害剤、Ｔ３、及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充された培地で処理し、空気−液体界面で約５日〜約７日間、代替的に約５日間、代替的に約６日間、代替的に約７日間培養することによってステージ６細胞へと分化され得る。これらの実施形態において、培地は、約１０μｇ／ｍＬのヘパリン、約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、約１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、約１０００ｎＭのＴ３、及び約１０，０００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充され得る。ある特定の実施形態において、培地は、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ₄）が更に補充されてもよい。例えば、培地は、約１０ｍＭ ＺｎＳＯ₄が更に補充されてもよい。代替実施形態において、培地は、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストの両方が補充され得る。

本発明の特に好ましい実施形態において、オーロラキナーゼ阻害剤、好ましくはオーロラキナーゼ阻害剤ＩＩ、ＲＳＫ阻害剤、好ましくはＲＳＫ阻害剤ＩＩ、及びタンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤、好ましくはＥＰＺ ５６７６のうちの１つ又は２つ以上が培地に添加される。添加される量は、オーロラキナーゼ及びＲＳＫ阻害剤については約１００〜５０００ｎＭ、代替的に約１０００〜５０００ｎＭ、代替的に約２０００〜５０００ｎＭ、代替的に約３０００〜５０００ｎＭ、好ましくは約１０００〜２０００ｎＭ、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤については約１００〜１０００ｎＭ、より好ましくは約１μＭ〜約１０ｎＭであり得る。

前述の方法に従い、本発明は、膵内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させるための細胞培養を更に提供し、（ａ）培養容器、（ｂ）容器内の、容器の体積の一部分のみを充填するのに十分な体積の増殖培地、（ｃ）培地に隣接する容器の一部分を充填する容器内の空気、（ｄ）培地と空気との間の界面に位置する多孔性基質、及び（ｄ）培地が細胞の表面の一部分のみに接触するように、基質の表面上に配設された多能性幹細胞から誘導される膵内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を含む。

一実施形態において、本発明の実施形態に従い培養されたステージ５細胞が用いられ、ステージ６細胞へと分化されるが、他の実施形態において、他のプロトコルに従い培養されたステージ５細胞が用いられてもよい。

別の実施形態において、本発明の方法は、単一ホルモン陽性であるステージ６細胞の形成をもたらす。したがって、一実施形態において、本発明の方法は、ＮＫＸ６．１、インスリン、クロモグラニン、及びＰＤＸ１を共発現するステージ６細胞をもたらす。別の実施形態において、本発明の方法は、ＮＫＸ６．１及びインスリンを共発現するステージ６細胞をもたらす。本発明のある特定の実施形態において、この方法は、ステージ４〜６、又は後期ステージ４〜６、又はステージ５及び６でＢＬＡＲカスタム培地（表Ｉを参照されたい）を用いる。培地は、毎日又は代替的に１日おきに交換され得るか、又は好ましくは交換される。

別の実施形態において、本発明は、ＮＫＸ６．１及びクロモグラニンを共発現するステージ６細胞を形成する方法に関し、ステージ４、好ましくは後期ステージ４細胞を、空気−液体界面でステージ６細胞へと培養することを含む。更に別の実施形態において、本発明は、ステージ４、好ましくは後期ステージ４細胞を、空気−液体界面でステージ６細胞へと培養することによって、ＮＫＸ６．１ステージ６細胞を発現する単一ホルモンインスリン陽性細胞を形成する方法に関する。
ステージ７：膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、より成熟した表現型を有する膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化。

一実施形態において、本発明の方法は、ステージ６細胞を、任意の好適な増殖培地、好ましくはＭＣＤＢ−１３１若しくはＣＭＲＬ、又はより好ましくはＢＬＡＲなどのカスタム培地（表Ｉ）であり得る、分化培地で処理することを含む。培地は、以下、すなわち、（ａ）ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｖ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｉ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩＩ、ＴＧＦ−β阻害剤ＳＢ４３１５４２、ＳＤ−２０８、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＡＬＫ５ｉ及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩからなる群から選択されるＡＬＫ５阻害剤、（ｂ）Ｔ３、Ｔ４、それらの類似体、及びそれらの混合物からなる群から選択される甲状腺ホルモン、（ｃ）ヘパリン、（ｄ）硫酸亜鉛、（ｅ）ビタミンＥ、ビタミンＣ、アセチルシステイン、抗酸化剤補助剤Ａ１３４５、グルタチオン、ペルオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗酸化剤、並びに（ｆ）好ましくはオーロラキナーゼ阻害剤ＩＩであるオーロラキナーゼ阻害剤、好ましくはＲＳＫ阻害剤ＩＩであるＲＳＫ阻害剤、及び好ましくはＥＰＺ ５６７６であるタンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤のうちの１つ又は２つ以上が補充され、好ましくは空気−液体界面で約７〜２１日間、好ましくは約７〜１０日間、より好ましくは約７日間培養して、ステージ６細胞をステージ７細胞へと分化させる。一実施形態において、増殖培地は、Ｔ３、Ｔ４、それらの類似体及びそれらの混合物、ＡＬＫ５阻害剤、抗酸化剤、並びにオーロラキナーゼ阻害剤、好ましくはオーロラキナーゼ阻害剤ＩＩ、又はＲＳＫ阻害剤、好ましくはＲＳＫ阻害剤ＩＩが補充される。ステージ６細胞は、約１００００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、約１０００ｎＭのＴ３、約１０μＭの６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（「Ｔｒｏｌｏｘ」）、及び約１μＭ〜約１μＭのオーロラキナーゼ阻害剤ＩＩ又はＲＳＫ阻害剤ＩＩが補充された培地で約７日間処理することによってステージ７細胞へと分化され得る。

一実施形態において、ステージ６細胞は、約１００００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤、約１μＭのＴ３、約２μＭの、オーロラキナーゼ阻害剤ＩＩ、ＲＳＫ阻害剤ＩＩ、及びＥＰＺ ５６７６のうちの１つ又は２つ以上、並びに約１ｍＭ Ｎ−アセチルシステインが補充された培地で処理することによってステージ７細胞へと分化され得る。代替的に、約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭ ＲＡ、約０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び約１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９のうちの１つ又は２つ以上が添加されてもよい。

代替的に、ステージ６細胞は、ヘパリン、Ｔ３、Ｔ４、それらの類似体又はそれらの混合物、ＡＬＫ５阻害剤、抗酸化剤、及びオーロラキナーゼ阻害剤、ＲＳＫ阻害剤、ＤＯＴ１Ｌのタンパク質メチルトランスフェラーゼ阻害剤、又はそれらの混合物が補充された培地で処理し、好ましくは空気−液体界面で約７〜２１日間、代替的に約７〜１０日間、好ましくは約７日間培養することによってステージ７細胞へと分化され得る。代替実施形態において、培地は、レチノイン酸、ＳＭＯ阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、ＢＭＰ受容体阻害剤、及びＮ−アセチルシステインのうちの１つ又は２つ以上が補充され得る。

好ましい実施形態において、ＡＬＫ５阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである。より好ましい実施形態において、約１００００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩが使用される。したがって、一実施形態において、ステージ６細胞は、ヘパリン、Ｔ３、Ｔ４、それらの類似体及びそれらの混合物、並びにＡＬＫ５阻害剤、抗酸化剤、及びオーロラキナーゼ阻害剤、ＲＳＫ阻害剤、又はタンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤が補充された培地で処理し、好ましくは空気−液体界面で約７日間培養することによってステージ７細胞へと分化され得る。ある特定の実施形態において、細胞は、空気−液体界面で培養する前に、タンパク質分解酵素及びコラーゲン分解酵素を含有する溶液などの細胞脱離溶液で処理され得る。本発明の特に好ましい実施形態において、オーロラキナーゼ阻害剤、好ましくはオーロラキナーゼ阻害剤ＩＩ、ＲＳＫ阻害剤、好ましくはＲＳＫ阻害剤ＩＩ、及びタンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤、好ましくはＥＰＺ ５６７６のうちの１つ又は２つ以上が培地に添加される。添加される量は、約１００〜５０００ｎＭ、代替的に約１０００〜５０００ｎＭ、代替的に約２０００〜５０００ｎＭ、代替的に約３０００〜５０００ｎＭ、より好ましくは約１０００ｎＭ〜２０００ｎＭオーロラキナーゼ阻害剤、より好ましくは約２０００ｎＭオーロラキナーゼ若しくはＲＳＫ阻害剤、又は約１００〜５００ｎＭ ＤＯＴ１Ｌ阻害剤、より好ましくは約１μＭ〜約１０ｎＭのＤＯＴ１Ｌ阻害剤であり得る。

前述の方法に従い、本発明は、膵内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させるための細胞培養を更に提供し、（ａ）培養容器、（ｂ）容器内の、容器の体積の一部分のみを充填するのに十分な体積の増殖培地、（ｃ）培地に隣接する容器の一部分を充填する容器内の空気、（ｄ）培地と空気との間の界面に位置する多孔性基質、及び（ｄ）培地が細胞の表面の一部分のみに接触するように、基質の表面上に配設された多能性幹細胞から誘導される膵内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を含む。

一実施形態において、本発明の実施形態に従い培養されたステージ６細胞が用いられ、ステージ７細胞へと分化されるが、他の実施形態において、他のプロトコルに従い培養されたステージ６細胞が用いられてもよい。

別の実施形態において、本発明の方法は、単一ホルモン陽性であるステージ７細胞の形成をもたらす。したがって、一実施形態において、本発明の方法は、ＮＫＸ６．１、インスリン、ＰＤＸ１、及びＭＡＦＡを共発現するステージ７細胞をもたらす。別の実施形態において、本発明の方法は、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、インスリン、及びＭＡＦＡを共発現するステージ７細胞をもたらす。更に別の実施形態において、細胞の各々の少なくとも約１０％、代替的に少なくとも約２０％、代替的に少なくとも約３０％、代替的に少なくとも約４０％、代替的に少なくとも約５０％、代替的に少なくとも約６０％、代替的に少なくとも約７０％、代替的に少なくとも約８０％、又は代替的に少なくとも約９０％の細胞集団が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡ結果を発現する細胞の集団が生じる。

本発明のある特定の好ましい実施形態において、この方法は、ステージ４〜７又は後期ステージ４〜７、又はステージ５、６、及び７でＢＬＡＲカスタム培地（表Ｉ）を用いる。培地は、好ましくは毎日、又は代替的に１日おきに交換され得る。

別の実施形態において、本発明は、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、及びインスリンを共発現するステージ７細胞を形成する方法に関し、ステージ４、好ましくは後期ステージ４細胞を、空気−液体界面でステージ７細胞へと培養することを含む。更に別の実施形態において、本発明は、ステージ４、好ましくは後期ステージ４細胞を、空気−液体界面でステージ７細胞へと培養することによって、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、及びＭＡＦＡステージ７細胞を発現する単一ホルモンインスリン陽性細胞を形成する方法に関する。

本明細書に記載する方法に従い生成されたステージ６及び７細胞はまた、膵臓ホルモン及び内分泌マーカーの分泌に対するそれらの作用について化合物をスクリーニングにおける使用のために適切である。とりわけ、ＡＬＩで培養されたステージ４〜ステージ７細胞は、３８４〜６ウェルフォーマットの異なる培養フォーマットで試験され得る。こうしたフォーマットは、膵内胚葉、膵内分泌前駆体、膵内分泌及び膵β細胞マーカーの後次発現に関する、様々な用量及び時間間隔での様々な小分子又は生物学の評価を可能にする。こうした評価は、遺伝子発現をＰＣＲによって、タンパク質発現をＦＡＣＳ若しくは免疫染色によって、又は小分子／生物学の追加により影響される細胞による因子の分泌についてはＥＬＩＳＡによって測定することにより達成され得る。

本発明の方法により取得可能な細胞
本発明は、本発明の方法によって取得可能な細胞、又は細胞の集団を提供する。本発明はまた、好ましくは成熟した表現型の膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞、又は細胞集団を提供する。本発明はまた、好ましくは、ＮＫＸ６．１発現（好ましくは約３０％超）、ＰＤＸ１発現（好ましくは約３０％超）、及びＭＡＦＡ発現（好ましくは約１０％超）で特徴付けられる、成熟した表現型の膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現するインスリン陽性細胞又はインスリン陽性細胞の集団を提供する。

治療のための方法
本発明は、糖尿病の治療方法、とりわけ、糖尿病を罹患しているか、又は発症するリスクを有する患者を治療するための方法を提供する。本発明はまた、治療法で使用するために、本発明の方法によって取得可能な、又は得られる、細胞の集団を提供する。とりわけ、本発明は、糖尿病に罹患しているか、又は糖尿病を発症するリスクを有する人を治療する方法で使用する、本発明の方法によって取得可能な、又は得られる、細胞又は細胞の集団を提供する。糖尿病は、Ｉ型又はＩＩ型であり得る。

一実施形態において、治療法は、本発明の方法によって得られるか、又は取得可能な細胞を患者に埋め込むことを含む。一実施形態において、治療法は、生体外で多能性細胞をステージ１、ステージ２、ステージ３、ステージ４、ステージ５、ステージ６、又はステージ７の細胞に分化させることと、例えば、本明細書に記載するように、分化した細胞を患者内に埋め込むこととを含む。別の実施形態において、この方法は、例えば、本明細書に記載するように、多能性幹細胞を分化させる工程の前に、多能性幹細胞を培養する工程を更に含む。なおも更なる実施形態において、この方法は、埋め込む工程の後に、生体内で細胞を分化させる工程を更に含む。一実施形態において、これらの方法のうちのいずれかにより治療される患者は、哺乳動物であり、好ましくはヒトである。

一実施形態において、細胞は、分散した細胞として埋め込まれてもよく、又は血管系、例えば、肝門脈内に注入され得る集団に形成されてもよい。あるいは、細胞は、生体適合性の分解性ポリマー支持体、多孔性の非分解性デバイス内に提供されてもよく、又は宿主の免疫系から保護されるよう封入されてもよい。一実施形態において、治療法は、埋め込み前に、細胞を三次元の支持体内に取り込むことを更に含む。細胞は、患者に埋め込む前に、生体外でこの支持体上に維持されてもよい。あるいは、細胞を含む支持体は、更に生体外で培養することなく、直接患者に埋め込んでもよい。支持体は、場合により、埋め込まれた細胞の生存及び機能を促進する少なくとも１つの医薬品を組み込んでもよい。細胞は、例えば、肝臓、天然の膵臓、腎被膜下空間、網、腹膜、漿膜下空間、腸、胃、又は皮下ポケットを含む、レシピエントの適切な部位に埋め込まれ得る。

生体内で埋め込まれた細胞の更なる分化、生存、又は活性を向上させるために、増殖因子、抗酸化剤、又は抗炎症剤などの追加の因子を、細胞の投与前に、投与と同時に、又は投与後に投与してもよい。これらの因子は、内在性細胞により分泌され、投与された細胞に原位置で曝露されてもよい。移植された細胞には、当該技術分野で既知の内因性の及び外因性の増殖因子の任意の組み合わせにより、分化を誘導することもできる。

埋め込みに使用する細胞の量は、埋め込み対象の状態及び埋め込み治療に対する応答を含む、多数の要因に基づき、当業者により決定され得る。

本発明は、以下の限定されない例を考察することによって更に明確にすることができるだろう。

（実施例１）
空気−液体界面で培養された膵内胚葉細胞−ステージ５〜ステージ７のＭＡＦＡの発現の漸増
この実施例は、ステージ５〜７中に空気−液体界面（「ＡＬＩ」）で培養され、ステージ５〜ステージ７にＴ３及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩで処理された膵内胚葉細胞内のＭＡＦＡ発現の動態を実証する。経路４２におけるヒト胚幹細胞株Ｈ１の細胞（ＷＡ０１細胞、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を、単一細胞として１×１０⁵細胞／ｃｍ²で、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上に、１：３０希釈液（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，カタログ番号３５４２３０）でコーティングされた皿で、ダルベッコ改変イーグル培地、栄養素混合物Ｆ−１２（「ＤＭＥＭ−Ｆ１２」）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カタログ番号１１３３０−０３２）、１：１００希釈（「１倍濃度」）のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５０−０７９）、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、カタログ番号Ａ４５４４）、１００ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子２（「ＦＧＦ２」）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、カタログ番号２３３−ＦＢ−０２５）、１ｎｇ／ｍＬの形質転換増殖因子β（「ＴＧＦ−β」）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、カタログ番号２４０−Ｂ−００２）、１：１００希釈でのインスリン−トランスフェリン−セレニウム−エタノールアミン（「ＩＴＳ−Ｘ」）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号５１５０００５６）、２％無脂肪酸ウシ血清アルブミン（「ＦＡＦ−ＢＳＡ」）（Ｐｒｏｌｉａｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｏｎｅ，Ｉｄａｈｏ、カタログ番号６８７００）、及び２０ｎｇ／ｍＬのインスリン様増殖因子−１（「ＩＧＦ−１」）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２９１−Ｇ１−２００）の、１０μＭのロック阻害剤Ｙ−２７６３２（カタログ番号Ｙ０５０３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充された培地中に播種した。播種から４８時間後、培養物を不完全ＰＢＳ（マグネシウム又はカルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄し、続いて１倍ＴｒｙｐＬＥ（商標）発現酵素（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１４１９０）で３〜５分間、３７℃で培養した。放出された細胞を、ＤＭＥＭ−Ｆ１２ですすぎ、１０００ｒｐｍで５分間回転させた。結果として生じるペレットを、１０μＭ Ｙ−２７６３２、１：１００希釈（「１倍濃度」）のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１００ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２、１ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ−β、１：１００希釈のＩＴＳ−Ｘ、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ−１が補充されたＤＭＥＭ−Ｆ１２中に再懸濁し、単一細胞懸濁液を、約１．３〜１．５×１０⁵細胞／ｃｍ²で播種した。培養物を培地と共に毎日供給し、以下のプロトコルに従い、播種の４８時間後に分化が開始し、約９０％の開始培養密度をもたらした。使用される分化プロトコルのステージ１〜４の間、培養は、平板接着培養上で、かつ空気−液体界面でステージ５〜７の間維持された。

ステージ１（３日間）：
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）でコーティングされた皿上で平板培養した細胞を、最初に１倍不完全ＤＰＢＳですすぎ、次いで以下のステージ１培地、すなわち、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１．２ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、このステージでは４．５ｍＭ Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）（続くステージを使用して、１０ｍＭ濃度のグルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）を得た）、１００ｎｇ／ｍＬ増殖／分化因子８（「ＧＤＦ８」）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、カタログ番号１２０−００）、及び１μＭの１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン（「ＭＣＸ化合物」）が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０３７２−０１９）中で１日培養した。次いで、細胞を、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬ ＧＤＦ８、及び０．１μＭ ＭＣＸ化合物が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中でもう１日培養した。次いで、細胞を、０．５％の無脂肪酸ＢＳＡ、１．２ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、及び１００ｎｇ／ｍＬ ＧＤＦ８が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中でもう１日培養した。

ステージ２（２日間）：
細胞を最初に１倍不完全ＤＰＢＳですすぎ、次いで２日間、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１．２ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び２５ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号２５１−ＫＧ）が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地で処理した。

ステージ３（２日間）：
細胞を、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ、４．５ｍＭグルコース、１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、２．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１（Ｎ−［（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチレン］−４−（フェニルメチル）−１−ピペラジンアミン）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ４５７２）、１μＭレチノイン酸（「ＲＡ」）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｒ２６２５）、２５ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ ＰＫＣ活性剤（（２Ｓ，５Ｓ−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−トリフルオロメチル）フェニル−２，４，−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタム（「ＴＰＢ」）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、カタログ番号５６５７４０）、及び１００ｎＭの骨形成タンパク質（「ＢＭＰ」）受容体阻害剤ＬＤＮ−１９３１８９（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒｓ Ｃｏ Ｌｔｄ．，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）が補充されたＢＬＡＲカスタム培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより製造、成分は表Ｉに列挙される）で２日間処理した。

ステージ４（３日間）：
細胞を、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ、４．５ｍＭグルコース、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、２．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ ＲＡ、２ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ７、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び２００ｎＭ ＴＰＢが補充されたＢＬＡＲ培地で３日間処理した。ステージ４（３日間）の最後に、平皿上で培養された細胞を、１０μＭのＹ２７６３２で４時間処理し、ＰＢＳですすいで、１倍濃度の酵素ＴｒｙｐＬＥ（商標）発現酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号１２６０４−０１３）で５分間室温で処理した後、酵素を除去し、ＢＬＡＲ培地ですすいで、細胞スクレーパによって細胞をこすり取った。結果として生じる細胞の懸濁液を、０．５〜０．７５×１０⁶細胞（５〜１０μＬ分量）の密度で、６ウェルプレートの０．４ミクロン多孔性細胞培養フィルター挿入物（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５３４９３）上に播種した。１．５ｍＬの培地を、各挿入物の底部に添加し、フィルターの尖端、又は上部、側部には更なる培地を添加しなかった。培地は、ステージ５、６、及び７の期間に毎日交換した。

ステージ５（３日間）：
空気−液体界面で培養された細胞を、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ、最終濃度２０ｍＭのグルコースを達成するためのグルコース、１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１０μｇ／ｍＬのヘパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｈ３１４９）、１０μＭ ＺｎＳＯ₄（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｚ０２５１）、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ ＲＡ、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ６３９７）、１００００ｎＭの２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン（「ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ」）（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、カタログ番号ＡＬＸ−２７０−４４５）の形態の１μＭのＴ３が補充されたＢＬＡＲ培地で３日間処理した。

ステージ６（７日間）：
ステージ５細胞を、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ、最終濃度２０ｍＭのグルコースを達成するためのグルコース、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、１．５ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１０μＭ ＺｎＳＯ₄、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、１μＭ Ｔ３、１００ｎＭ（Ｓ，Ｓ）−２−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）アセチルアミノ］−Ｎ−（５−メチル−６−オキソ−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン−７−イル）プロピオンアミド（「γ分泌酵素阻害剤ＸＸ」）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号＃５６５７８９）、及び１００００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充されたＢＬＡＲ培地で７日間処理した。

ステージ７（７日間）：
ステージ６細胞を、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ、最終濃度２０ｍＭのグルコースを達成するためのグルコース、１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１０μＭ ＺｎＳＯ₄、１μＭ Ｔ３、１００００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、１０μＭビタミンＥ類似体Ｔｒｏｌｏｘ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号６４８４７１）が補充されたＢＬＡＲ培地で７〜１５日間処理した。

図１Ａ〜Ｍは、実施例１に概説するように分化させたヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞における以下の遺伝子のリアルタイムＰＣＲ解析のデータを示す：ＰＤＸ１（図１Ａ）、ＮＫＸ６．１（図１Ｂ）、ＰＡＸ４（図１Ｃ）、ＰＡＸ６（図１Ｄ）、ＮＧＮ３（図１Ｅ）、ＭＡＦＡ（図１Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図１Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図１Ｈ）、Ｇ６ＰＣ２（図１Ｉ）、ＩＡＰＰ（図１Ｊ）、インスリン（図１Ｋ）、グルカゴン（図１Ｌ）、及びＰＴＦ１ａ（図１Ｍ）。図１Ｆに示されるように、ステージ４及び５をステージ６及び７と比較して、ＭＡＦＡに明らかな増加又は上方調節があり、β細胞系統に向かう細胞の成熟の増加を実証する。しかしながら、ステージ６及び７において、ＭＡＦＡのｍＲＮＡ発現は、成人膵島よりも低かった。

様々なステージの追加的な特徴付けのために、細胞をステージ３、４、５、６、及び７で採取し、蛍光活性化フローサイトメトリー（「ＦＡＣＳ」）によって解析した。ＦＡＣＳ染色は、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，６１，２０１６，２０１２に記載されるように、かつ表ＩＩＩに列挙される抗体を使用して行った。簡単に言うと、細胞をＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２６０４）中で３〜５分間３７℃で培養し、単一細胞懸濁液へと放出した後、それらを０．２％ ＢＳＡを含有するＰＢＳの染色緩衝液（ＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５４６５７）で２回洗浄した。細胞（１×１０⁵〜１×１０⁶）を、表面マーキングのために、染色緩衝液中に１：４で希釈された０．５％ヒトγグロブリンの１００μＬ遮断緩衝液に再懸濁した。細胞に、最終希釈１：２０で、直接共役一次抗体を添加し、続いて４℃で３０分間培養した。染色した細胞を、染色緩衝液中で２回洗浄し、続いて２００μＬ染色緩衝液中に再懸濁した後、ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ上のＦＡＣＳ解析の前に、生／死区別のために、１５μＬの７ＡＡＤ中で培養した。細胞内抗体染色は、最初に緑色蛍光生／死細胞染料（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｌ２３１０１）を用いて４℃で２０分間培養し、続いて冷たいＰＢＳで単回洗浄することによって達成した。２５０μＬのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液（ＢＤカタログ番号５５４７２３）中に細胞を固定し、続いて２％正常ヤギ血清を含む１００μＬのＰｅｒｍ洗浄緩衝染色／遮断溶液中に細胞を再懸濁した。細胞を、実験的に事前決定された希釈で一次抗体と４℃で３０分間培養し、続いてＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中で２回洗浄した。次いで細胞を、適切な抗体と４℃で３０分間培養した後、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ上の解析前に２回洗浄した。使用した抗体の濃度を表ＩＩＩに示す。膵臓マーカーのための抗体は、ヒト膵島又は未分化Ｈ１細胞を陽性対照として使用し、特異性について試験した。二次抗体については、以下、すなわち、１：５００の抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１：２００（ｖ）のヤギ抗ウサギＰＥ又は１：８００のロバ抗ヤギＡｌｅｘａ ６４７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、４℃で３０分間培養し、続いてＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中で最終洗浄し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを使用してＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ上で解析し、少なくとも３０，０００事象を獲得した。

図２〜６は、それぞれステージ３、４、５、６、及び７で収集された細胞のＦＡＣＳプロファイルを描く。図４に示されるように、ステージ５において、細胞の約１５％がインスリン及びＮＫＸ６．１を共発現し、ＰＤＸ１陽性細胞の約２１％が、ＰＤＸ１及びＫＩ−６７の共発現によって測定して、活性細胞周期にあった（約２３％、ＫＩ−６７は、活性細胞周期にある細胞を示す）。しかしながら、ステージ６及びステージ７によって（図５及び６）、ＰＤＸ１＋細胞の増殖は著しく低下したが（１〜２％）、インスリンを共発現するＮＫＸ６．１＋細胞の数は著しく増加した（ステージ６で約３９％、及びステージ７で約５０％）。更に、内分泌前駆体マーカーＩＳＬ−１、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＮＫＸ２．２を発現する細胞が著しく上昇した。これらの結果は、ステージ６及び７の培養が、内分泌細胞を早期に成熟させる増殖前駆体から離れて細胞の急速成熟を可能にすることを示している。加えて、インスリン及びＮＸＫ６．１を共発現する細胞の割合の増加（３３％）は、ステージ６からステージ７へと延長することによって観察された（図５を図６と比較して）。図７は、複数の膵内胚葉（ＦＯＸＡ２、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１）、未分化ＥＳ細胞（Ｏｃｔ３／４）、内分泌（Ｐａｘ６、ＩＳｌ−１、ＮＫＸ２．２、クロモグラニン）、及びホルモン（インスリン、グルカゴン）の、ステージ３〜ステージ７の発現率を要約する。

（実施例２）
ＭＡＦＡ及びインスリン発現の一方又は両方を著しく上方調節することができる小分子を特定するためのスクリーニング
この実施例は、膵β細胞に向かう細胞の成熟を著しく増強することができる小分子を特定することを目的とする。経路４２におけるヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＷＡ０１）の細胞を、単一細胞として１×１０⁵細胞／ｃｍ²で、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）コーティングされた皿上で、ＤＭＥＭ−Ｆ１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（１：１００希釈）、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β、ＩＴＳ−Ｘ（１：１００希釈）、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１から構成される、１０μＭのＹ−２７６３２が補充された培地中に播種した。播種から４８時間後、培養物を不完全ＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄し、続いて１倍ＴｒｙｐＬＥ（商標）発現酵素（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１４１９０）で３〜５分間、３７℃で培養した。放出された細胞を、ＤＭＥＭ−Ｆ１２ですすぎ、１０００ｒｐｍで５分間回転させた。結果として生じる細胞ペレットを、１０μＭ Ｙ−２７６３２、１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１００ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２、１ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ−β、１：１００希釈のＩＴＳ−Ｘ、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１が補充されたＤＭＥＭ−Ｆ１２中に再懸濁し、単一細胞懸濁液を、約１．３〜１．５×１０⁵細胞／ｃｍ²で播種した。培養物を培地と共に毎日供給し、以下のプロトコルに従い、播種の４８時間後に分化が開始し、約９０％の開始培養密度をもたらした。別途記載されない限り、実施例で使用した培地、試薬、分子などの供給元は、実施例１に記載のとおりである。

ステージ１（３日間）：
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）でコーティングされた皿上で平板培養した細胞を、最初に１倍不完全ＤＰＢＳですすぎ、次いで以下のステージ１培地、すなわち、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬ ＧＤＦ８、及び１μＭ ＭＣＸ化合物が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中で１日培養した。次いで、細胞を、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、４．５ｍＭのＤ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬ ＧＤＦ８、及び０．１μＭ ＭＣＸ化合物が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中でもう１日培養した。次いで、細胞を、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、及び１００ｎｇ／ｍＬ ＧＤＦ８が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中でもう１日培養した。

ステージ２（２日間）：
細胞を最初に１倍不完全ＤＰＢＳですすぎ、次いで２日間、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び２５ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ７が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地で処理した。

ステージ３（２日間）：
細胞を、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ、４．５ｍＭグルコース、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、０．００２５ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、１μＭ ＲＡ、２５ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ ＴＰＢ、及び１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９が補充されたＢＬＡＲカスタム培地で２日間処理した。

ステージ４（３日間）：
細胞を、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ、４．５ｍＭグルコース、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、０．００２５ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ ＲＡ、２ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ７、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び２００ｎＭ ＴＰＢが補充されたＢＬＡＲ培地で３日間処理した後、ステージ４の最後に、平板皿上で培養された細胞を、１０μＭのＹ−２７６３２で４時間処理し、ＰＢＳですすぎ、１倍濃度のＴｒｙｐＬＥ（商標）で５分間、室温で処理した後、酵素を除去し、ＢＬＡＲ基本培地ですすぎ、細胞スクレーパによって細胞をこすり取った。結果として生じる細胞の懸濁液を、０．５〜０．７５×１０⁶細胞（５〜１０μＬ分量）の密度で、６ウェルプレートの０．４ミクロン多孔性細胞培養フィルター挿入物上に播種した。１．５ｍＬの培地を、各挿入物の底部に添加し、フィルターの尖端側には更なる培地を添加しなかった。培地は、ステージ５、６、及び７の期間に毎日交換した。

ステージ５（３日間）：
空気−液体界面で培養された細胞を、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ、２０ｍＭグルコース、１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、０．００１５ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１０μＭ ＺｎＳＯ₄、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ ＲＡ、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、１μＭのＴ３（３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩として）、及び１００００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充されたＢＬＡＲ培地で３日間処理した。

ステージ６（７日間）：
ステージ５細胞を、空気−液体界面で培養し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ、２０ｍＭ グルコース、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、０．００１５ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１０μＭ ＺｎＳＯ₄、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、１μＭ Ｔ３（３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩として）、１００ｎＭ γ分泌酵素阻害剤ＸＸ、及び１００００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充されたＢＬＡＲ培地で７日間処理した。

ステージ７（７日間）：
ステージ６細胞を、空気−液体界面で培養し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ、２０ｍＭグルコース、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、０．００１５ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１０μＭ ＺｎＳＯ₄、１０００ｎＭ Ｔ３（３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩として）、１００００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、１０μＭ Ｔｒｏｌｏｘが補充されたＢＬＡＲ培地で７日間処理した。

ステージ６又は７において、様々な小分子を添加し、それらの作用をリアルタイムＰＣＲによって評価した。表ＩＩＩは、評価した小分子、及びそれらがいつ添加されたかを列挙している。

小分子での処理後のインスリン及びＭＡＦＡの発現のリアルタイムＰＣＲ解析のデータを描くグラフである図８Ａ〜８Ｅに示されるように、ＥＰＺ−５６７６（タンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤）及びＡＸＬ阻害剤（Ｒ４２８）の添加は、それぞれステージ６及びステージ７での未処理の培養物と比較して、ＭＡＦＡの発現を著しく上方調節した。

（実施例３）（仮説）
懸濁培養中でインスリン、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを共発現する内分泌細胞の生成
ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＷＡ０１）の細胞を、単一細胞として１×１０⁵細胞／ｃｍ²で、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）でコーティングされた皿上で、ＤＭＥＭ−Ｆ１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（１：１００希釈）、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β、ＩＴＳ−Ｘ（１：１００希釈）、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１から構成される、１０μＭのＹ−２７６３２が補充された培地中に播種した。播種から４８時間後、培養物を不完全ＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄し、続いて１倍ＴｒｙｐＬＥ（商標）発現酵素で３〜５分間、３７℃で培養する。放出された細胞を、ＤＭＥＭ−Ｆ１２ですすぎ、１０００ｒｐｍで５分間回転させる。結果として生じる細胞ペレットを、１０μＭ Ｙ−２７６３２、１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１００ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２、１ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ−β、ＩＴＳ−Ｘ（１：１００希釈で）、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１が補充されたＤＭＥＭ−Ｆ１２中に再懸濁し、単一細胞懸濁液を、約１．３〜１．５×１０⁵細胞／ｃｍ²で播種する。培養物を培地と共に毎日供給し、以下のプロトコルに従い、播種の４８時間後に分化が開始し、約９０％の開始培養密度をもたらす。ステージ１〜ステージ４は、平坦接着培養上で維持され、一方ステージ５〜７は、懸濁培養において維持される。

ステージ１（３日間）：
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）でコーティングされた皿上で平板培養した細胞を、最初に１倍不完全ＤＰＢＳですすぎ、次いで以下のステージ１培地、すなわち、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１．２ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬ ＧＤＦ８、及び１μＭ ＭＣＸ化合物が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中で１日培養する。次いで、細胞を、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１．２ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬ ＧＤＦ８、及び０．１μＭのＭＣＸ化合物が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中でもう１日培養する。次いで、細胞を、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１．２ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、及び１００ｎｇ／ｍＬ ＧＤＦ８が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中でもう１日培養する。

ステージ２（２日間）：
細胞を最初に１倍不完全ＤＰＢＳですすぎ、次いで２日間、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１．２ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び２５ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ７が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地で処理する。

ステージ３（２日間）：
細胞を、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ、４．５ｍＭグルコース、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、２．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、１μＭ ＲＡ、２５ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ ＴＰＢ、及び１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、ＴＰＢが補充されたＢＬＡＲカスタム培地で２日間処理する。

ステージ４（３日間）：
細胞を、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ、４．５ｍＭグルコース、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、２．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ ＲＡ、２ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ７、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び２００ｎＭ ＴＰＢが補充されたＢＬＡＲ培地で３日間処理した後、ステージ４の最後に、平板皿上で培養された細胞を、１０μＭのＹ−２７６３２で４時間処理し、ＰＢＳですすぎ、１倍濃度のＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃Ａ１１１０５−０１）で５分間、室温で処理し、酵素を除去して、ＢＬＡＲ基本培地ですすぎ、細胞スクレーパを使用して細胞をこすり取り、細胞集団に分割する（１００ミクロン未満）。細胞集団を、使い捨てポリスチレン１２５ｍＬスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）へと移し、下で指定されるステージ５培地を含む懸濁液中で８０〜１００ｒｐｍで回転させる。

ステージ５（３日間）：
集団として調製されたステージ４細胞を、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ、２０ｍＭグルコース（最終）、１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１０μＭ ＺｎＳＯ₄、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ ＲＡ、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、１μＭのＴ３（３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩として）、及び１００００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充されたＢＬＡＲ培地中の懸濁液中で３日間培養する。

ステージ６（７日間）：
ステージ５細胞を、懸濁液中で培養し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ、２０ｍＭグルコース（最終）、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．２５ｍＭ アスコルビン酸、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１０μＭ ＺｎＳＯ₄、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、１μＭ Ｔ３（３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩として）、１００ｎＭ γ分泌酵素阻害剤ＸＸ、及び１００００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充されたＢＬＡＲ培地で７日間処理する。

ステージ７（１５日間）：
ステージ６細胞を、懸濁液中で培養し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ、２０ｍＭグルコース（最終）、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、０．００１５ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１０μＭ ＺｎＳＯ₄、１ｎＭ Ｔ３（３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩として）、１００００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、１０μＭ Ｔｒｏｌｏｘ、１ｍＭ Ｎ−アセチルシステイン、及び２μＭ ＡＸＬ阻害剤（Ｒ４２８）が補充されたＢＬＡＲ培地で最大１５日間処理する。

ステージ５〜７において、細胞集団の分量を除去し、ＰＣＲ、ＦＡＣＳ、及び免疫組織化学によって、インスリン、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ−１、ＭＡＦＡの共発現について特徴付ける。こうした試験の結果は、同一細胞及び細胞の集団内でインスリン、ＰＤＸＩ、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡの共発現を示すことが予想され、細胞集団の少なくとも約１０％が、こうした発現を示した。

（実施例４）
ＡＸＬ及び共リガンドＧＡＳ６のｍＲＮＡ発現は、ステージ７又はヒト膵島細胞に対して非常に低い
ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＷＡ０１）の細胞を、単一細胞として１×１０⁵細胞／ｃｍ²で、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）でコーティングされた皿上で、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）（「Ｅ８」）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３５６２３１）から構成される培地中に播種した。播種から４８時間後に、培養物を１倍不完全ＰＢＳで洗浄し、続いて１倍ＴｒｙｐＬＥ（商標）発現酵素（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１４１９０）で３〜５分間、３７℃で培養した。放出された細胞を、Ｅ８ですすぎ、１０００ｒｐｍで５分間回転させた。結果として生じる細胞ペレットを、１０μＭ Ｙ−２７６３２が補充されたＥ８中に再懸濁し、単一細胞懸濁液を、１．３〜１．５×１０⁵細胞／ｃｍ²で播種した。培養物をＥ８培地と共に毎日供給し、以下のプロトコルに従い、播種の４８時間後に分化が開始し、約９０％の開始培養密度をもたらした。

ステージ１（３日間）：
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）でコーティングされた皿上で平板培養した細胞を、最初に１倍不完全ＤＰＢＳですすぎ、次いで以下のステージ１培地、すなわち、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１．５ｇ／１０００ｍＬ 重炭酸ナトリウム、１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬ ＧＤＦ８、及び１．５μＭ ＭＣＸ化合物が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中で１日培養した。次いで、細胞を、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース濃度、１００ｎｇ／ｍＬ ＧＤＦ８、及び０．１μＭ ＭＣＸ化合物が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中でもう１日培養した。次いで、細胞を、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、及び１００ｎｇ／ｍＬ ＧＤＦ８が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中でもう１日培養した。

ステージ２（２日間）：
細胞を最初に１倍不完全ＤＰＢＳですすぎ、次いで２日間、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び５０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ７が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地で培養した。

ステージ３（２日間）：
細胞を、１：１００希釈のＩＴＳ−Ｘ、１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、２．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、１μＭ ＲＡ、２５ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、３００ｎＭ ＴＰＢ、及び１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９が補充されたＢＬＡＲカスタム培地中で２日間培養した。

ステージ４（３日間）：
細胞を、１：１００希釈のＩＴＳ−Ｘ、１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、２．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、０．１μＭ ＲＡ、２ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ７、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び２００ｎＭ ＴＰＢが補充されたＢＬＡＲ培地中で３日間培養し、次いでステージ４の最後に、平板皿上で培養された細胞を、１０μＭのＹ−２７６３２で４時間処理し、１倍不完全ＰＢＳですすぎ、１倍ＴｒｙｐＬＥ（商標）で３〜５分間、室温で処理した。酵素を除去し、細胞を放出してＢＬＡＲ培地ですすぎ、使い捨てポリスチレン１２５ｍＬスピナーフラスコへと移し、１０００ｒｐｍで３分間回転させた。結果として生じる細胞ペレットを、単一細胞として、約０．５×１０⁵細胞／ｃｍ²の密度で、フィルター挿入物（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３４２０）上に再懸濁した（合計２５万〜５０万細胞／スポットの場合、スポット当たり５〜１０μＬ）。各スポット領域は、添加された細胞の体積に応じて、直径約１〜２ｍｍと測定された。６ウェル挿入物の場合、１．５ｍＬ／ウェルを各挿入物の底部に添加したが、１０ｃｍフィルター挿入物の場合、８ｍＬを添加した。典型的に、６ウェル挿入物の１ウェル当たり２０〜１５スポットを使用し、１０ｃｍ挿入物の場合、８０〜９０スポットを使用した。

ステージ５（３日間）：
ステージ４細胞を、１：１００希釈のＩＴＳ−Ｘ、２０ｍＭグルコース（最終）、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１０μＭ ＺｎＳＯ₄、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、０．０５μＭ ＲＡ、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、１μＭのＴ３（３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩として）、及び１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充されたＢＬＡＲ培地中で３日間培養した。

ステージ６（７日間）：
ステージ５細胞を、１：１００希釈のＩＴＳ−Ｘ、２０ｍＭグルコース（最終）、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１０μＭ ＺｎＳＯ₄、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、１μＭ Ｔ３（３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩として）、１００ｎＭ γ分泌酵素阻害剤ＸＸ、及び１０μＭ ＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充されたＢＬＡＲ培地中で７日間培養した。

ステージ７（７日間）：
ステージ６細胞を、１：１００希釈のＩＴＳ−Ｘ、２０ｍＭグルコース（最終）、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１０μＭ ＺｎＳＯ₄、１μＭ Ｔ３（３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩として）、１０μＭ ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、１ｍＭ Ｎ−アセチルシステイン、及び２μＭ ＡＸＬ阻害剤（Ｒ４２８）が補充されたＢＬＡＲ培地中で７日間培養した。

ステージ４の３日目、ステージ５の３日目、ステージ６の３日目、及びステージ７の７日目において、ｍＲＮＡを収集し、ＡＸＬ及びＧＡＳ６の発現を、未分化ヒト幹細胞及び屍体ヒト膵島（Ｐｒｏｄｏ Ｌａｂｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と比較して評価した。図９に描かれるように、ＡＸＬの発現は、未分化幹細胞中に高レベルで存在した。しかしながら、幹細胞の、膵内胚葉、膵内分泌、及び未成熟β細胞への分化は、ＡＸＬ発現の急落をもたらした。更に、ステージ４〜７では、ＧＡＳ６発現が低レベルで維持された。ＡＸＬの発現もまた、未分化幹細胞と比較して、ヒト膵島において著しく低かった。これらの結果は、ステージ６及び７細胞が、非常に低いＡＸＬの発現を有することを示す。

（実施例５）
Ｒ４２８は、ＡＸＬ及び多くの追加のキナーゼを阻害する
異なるキナーゼを標的とするためのＡＸＬ阻害剤Ｒ４２８の効率を、キナーゼプロファイリングサービスによって、１００μＭ ＡＴＰ濃度（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して評価した。Ｒ４２８を、１μＭ及び１０μＭで試験した。表ＩＶは、キナーゼを標的とする際の効率に従ってプロファイルされたキナーゼを列挙し、より小さい数字は、特定キナーゼのより頑強な阻害を示す。

キナーゼプロファイリング結果は、Ｒ４２８が、予想どおりＡＸＬを阻害することを示す。しかしながら、追加として、Ｒ４２８は、ＲＳＫ３、Ｒｅｔ、Ｆｌｔ、ＦＧＦｒ１、オーロラＡ、及びオーロラＢキナーゼを１μＭ及び１０μＭで強力に阻害する。これは、ＭＡＦＡの誘導におけるＲ４２８の作用機序が、ＡＸＬ受容体阻害剤によるものではない場合があることを意味する。実際に、本明細書の実施例は、ステージ７におけるＡＸＬのｍＲＮＡ発現が非常に低いことを示し、ＭＡＦＡ発現を誘導することにおけるＲ４２８の作用機序は、ＡＸＬの阻害によるものではないが、むしろＲＳＫ３及びオーロラキナーゼなどの他のキナーゼの阻害によるものであることを強調する。

（実施例６）
オーロラキナーゼ発現の阻害は、Ｒ４２８の非存在下、ステージ７におけるＭＡＦＡ発現を増強した
ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＷＡ０１）の細胞を、単一細胞として１×１０⁵細胞／ｃｍ²で、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）でコーティングされた皿上のＥ８培地中に播種した。約７０〜８０％の培養密度で、培養物を１倍不完全ＤＰＢＳで洗浄し、続いて１倍ＴｒｙｐＬＥ（商標）発現酵素で３〜５分間、３７℃で培養した。放出された細胞を、Ｅ８ですすぎ、１０００ｒｐｍで５分間回転させた。結果として生じる細胞ペレットを、１０μＭ Ｙ−２７６３２が補充されたＥ８中に再懸濁し、単一細胞懸濁液を、約１．３〜１．５×１０⁵細胞／ｃｍ²で播種した。培養物をＥ８培地と共に毎日供給し、以下のプロトコルに従い、播種の４８時間後に分化が開始し、約９０％の開始培養密度をもたらした。

ステージ１（３日間）：
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）でコーティングされた皿上で平板培養した細胞を、最初に１倍不完全ＤＰＢＳですすぎ、次いで以下のステージ１培地、すなわち、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、１０ｍＭ最終グルコース濃度、１００ｎｇ／ｍＬ ＧＤＦ８、及び１．５μＭ ＭＣＸ化合物が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中で１日培養した。次いで、細胞を、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、１０ｍＭの最終グルコース濃度、１００ｎｇ／ｍＬ ＧＤＦ８、及び０．１μＭ ＭＣＸ化合物が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中でもう１日培養した。次いで、細胞を、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、１０ｍＭの最終グルコース濃度、及び１００ｎｇ／ｍＬ ＧＤＦ８が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中でもう１日培養した。

ステージ２（２日間）：
細胞を１倍不完全ＤＰＢＳですすぎ、次いで２日間、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、１０ｍＭ最終グルコース濃度、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び５０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ７が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地で培養した。

ステージ３（２日間）：
細胞を、１：１００希釈のＩＴＳ−Ｘ、１０ｍＭ最終グルコース濃度、２．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、１μＭ ＲＡ、２５ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、３００ｎＭ ＴＰＢ、及び１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９が補充されたＢＬＡＲカスタム培地中で２日間培養した。

ステージ４（３日間）：
細胞を、１：１００希釈のＩＴＳ−Ｘ、１０ｍＭ最終グルコース濃度、２．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、０．１μＭ ＲＡ、２ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ７、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び２００ｎＭ ＴＰＢが補充されたＢＬＡＲ培地中で３日間培養し、次いでステージ４の最後に、平板皿上で培養された細胞を、１０μＭのＹ−２７６３２で４時間処理し、１倍不完全ＰＢＳですすぎ、１倍ＴｒｙｐＬＥ（商標）で３〜５分間、室温で処理した。酵素を除去し、細胞を放出してＢＬＡＲ培地ですすぎ、使い捨てポリスチレン１２５ｍＬスピナーフラスコへと移し、１０００ｒｐｍで３分間回転させた。結果として生じる細胞ペレットを、単一細胞として、約０．５×１０⁵細胞／ｃｍ²の密度で、フィルター挿入物上で再懸濁した（合計２５万〜５０万細胞／スポットに対して１スポット当たり５〜１０μＬ）。各スポット領域は、添加された細胞の体積に応じて、直径約１〜２ｍｍと測定された。６ウェル挿入物の場合、１．５ｍＬ／ウェルを各挿入物の底部に添加したが、１０ｃｍフィルター挿入物の場合、８ｍＬを添加した。典型的に、６ウェル挿入物の１ウェル当たり２０〜１５スポットを使用し、１０ｃｍ挿入物の場合、８０〜９０スポットを使用した。

ステージ５（３日間）：
ステージ４細胞を、１：１００希釈のＩＴＳ−Ｘ、２０ｍＭグルコース（最終）、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１０μＭ ＺｎＳＯ₄、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、０．０５μＭ ＲＡ、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、１μＭのＴ３（３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩として）、及び１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充されたＢＬＡＲ培地中で３日間培養した。

ステージ６（７日間）：
ステージ５細胞を、１：１００希釈のＩＴＳ−Ｘ、２０ｍＭグルコース（最終）、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１０μＭ ＺｎＳＯ₄、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、１μＭ Ｔ３（３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩として）、１００ｎＭ γ分泌酵素阻害剤ＸＸ、及び１０μＭ ＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充されたＢＬＡＲ培地中で７日間培養した。

ステージ７（７日間）：
ステージ６細胞を、７日間、１：１００希釈のＩＴＳ−Ｘ、２０ｍＭグルコース（最終）、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１０μＭ ＺｎＳＯ₄、１ｎＭ Ｔ３（３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩として）、１０μＭ ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、１ｍＭ Ｎ−アセチルシステインが補充されたＢＬＡＲ培地中で培養した。一部の培養物はまた、２μＭ Ｒ４２８、２μＭオーロラキナーゼ阻害剤ＶＩ（４−（４−（Ｎ−ベンゾイルアミノ）アニリノ）−６−メトキシ−７−（３−（１−モルホリノ）プロポキシ）キナゾリン）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号１８９４１）、又は２μＭオーロラキナーゼ阻害剤ＩＩ（４−（４’−ベンズアミドアニリノ）−６，７−ジメトキシキナゾリン）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号１８９４０４）のうちの１つを含んでいた。

ステージ７の７日目に、ｍＲＮＡを収集し、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、インスリン、及びＧ６ＰＣ２の発現を、未分化ヒト幹細胞と比較して評価した。図１０に描かれるように、Ｒ４２８の除去は、ＭＡＦＡ発現の著しい減少をもたらした。成熟β細胞の両方のマーカー、ＵＣＮ３及びＧ６ＰＣ２発現の著しい上昇は、Ｒ４２８で処理されていない培養物について示され、Ｒ４２８は、ＭＡＦＡ発現を増加させるが、化合物が他のβ細胞成熟マーカーを低減することを示唆している。オーロラキナーゼ阻害剤をＲ４２８に置換することは、ＭＡＦＡ発現を回復するが、Ｇ６ＰＣ２レベルを減少させない。したがって、ステージ７でのＲ４２８によるＭＡＦＡ発現の誘導は、ＡＸＬ阻害剤によるものではなく、オーロラキナーゼの阻害によるものである可能性があった。オーロラキナーゼ阻害剤ＩＩの使用は、ＭＡＦＡ発現の増加及びＵＣＮ３及びＧ６ＰＣ２発現の維持をもたらした。

（実施例７）
オーロラキナーゼ又はＲＳＫの阻害は、Ｒ４２８の非存在下、ステージ７におけるＭＡＦＡ発現の発現を増強した
ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＷＡ０１）の細胞を、単一細胞として１×１０⁵細胞／ｃｍ²で、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）でコーティングされた皿上のＥ８培地中に播種した。約７０〜８０％の培養密度で、培養物を１倍不完全ＤＰＢＳで洗浄し、続いて１倍ＴｒｙｐＬＥ（商標）発現酵素で３〜５分間、３７℃で培養した。放出された細胞を、Ｅ８ですすぎ、１０００ｒｐｍで５分間回転させた。結果として生じる細胞ペレットを、１０μＭ Ｙ−２７６３２が補充されたＥ８中に再懸濁し、単一細胞懸濁液を、約１．３〜１．５×１０⁵細胞／ｃｍ²で播種した。培養物をＥ８培地と共に毎日供給し、以下のプロトコルに従い、播種の４８時間後に分化が開始し、約９０％の開始培養密度をもたらした。

ステージ１（３日間）：
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）でコーティングされた皿上で平板培養した細胞を、最初に１倍不完全ＤＰＢＳですすぎ、次いで以下のステージ１培地、すなわち、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、１０ｍＭ最終グルコース濃度、１００ｎｇ／ｍＬ ＧＤＦ８、及び１．５μＭ ＭＣＸ化合物が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中で１日培養した。次いで、細胞を、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、１０ｍＭの最終グルコース濃度、１００ｎｇ／ｍＬ ＧＤＦ８、及び０．１μＭ ＭＣＸ化合物が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中でもう１日培養した。次いで、細胞を、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、１０ｍＭの最終グルコース濃度、及び１００ｎｇ／ｍＬ ＧＤＦ８が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中でもう１日培養した。

ステージ２（２日間）：
細胞を１倍不完全ＤＰＢＳですすぎ、次いで２日間、０．５％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、１０ｍＭ最終グルコース濃度、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び５０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ７が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地で培養した。

ステージ３（２日間）：
細胞を、１：１００希釈のＩＴＳ−Ｘ、１０ｍＭ最終グルコース濃度、２．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、１μＭ ＲＡ、２５ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、３００ｎＭ ＴＰＢ、及び１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９が補充されたＢＬＡＲカスタム培地中で２日間培養した。

ステージ４（３日間）：
細胞を、１：１００希釈のＩＴＳ−Ｘ、１０ｍＭ最終グルコース濃度、２．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、０．１μＭ ＲＡ、２ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ７、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び２００ｎＭ ＴＰＢが補充されたＢＬＡＲ培地中で３日間培養し、次いでステージ４の最後に、平板皿上で培養された細胞を、１０μＭのＹ−２７６３２で４時間処理し、１倍不完全ＰＢＳですすぎ、１倍ＴｒｙｐＬＥ（商標）で３〜５分間、室温で処理した。酵素を除去し、細胞を放出してＢＬＡＲ培地ですすぎ、使い捨てポリスチレン１２５ｍＬスピナーフラスコへと移し、１０００ｒｐｍで３分間回転させた。結果として生じる細胞ペレットを、単一細胞として、約０．５×１０⁵細胞／ｃｍ²の密度で、フィルター挿入物上で再懸濁した（合計２５万〜５０万細胞／スポットに対して１スポット当たり５〜１０μＬ）。各スポット領域は、添加された細胞の体積に応じて、直径約１〜２ｍｍと測定された。６ウェル挿入物の場合、１．５ｍＬ／ウェルを各挿入物の底部に添加したが、１０ｃｍフィルター挿入物の場合、８ｍＬを添加した。典型的に、６ウェル挿入物の１ウェル当たり２０〜１５スポットを使用し、１０ｃｍ挿入物の場合、８０〜９０スポットを使用した。

ステージ５（３日間）：
ステージ４細胞を、１：１００希釈のＩＴＳ−Ｘ、２０ｍＭグルコース（最終）、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１０μＭ ＺｎＳＯ₄、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、０．０５μＭ ＲＡ、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、１μＭのＴ３（３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩として）、及び１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充されたＢＬＡＲ培地中で３日間培養した。

ステージ６（７日間）：
ステージ５細胞を、１：１００希釈のＩＴＳ−Ｘ、２０ｍＭグルコース（最終）、１．５ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１０μＭ ＺｎＳＯ₄、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、１μＭ Ｔ３（３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩として）、１００ｎＭ γ分泌酵素阻害剤ＸＸ、及び１０μＭ ＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充されたＢＬＡＲ培地中で７日間培養した。

ステージ７（７日間）：
ステージ６細胞を、１４日間、１：１００希釈のＩＴＳ−Ｘ、２０ｍＭグルコース（最終）、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、２％ ＦＡＦ−ＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１０Ｍ ＺｎＳＯ₄、１μＭ Ｔ３（３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩として）、１０μＭ ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、１ｍＭ Ｎ−アセチルシステインが補充されたＢＬＡＲ培地中で培養した。一部の培養物はまた、２μＭ Ｒ４２８、２〜５μＭ ＲＳＫ阻害剤ＩＩ（２−（３，５−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−アニリノ）−８−イソペンチル−５，７−ジメチル−７Ｈ−プテリジン−６−オン）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号５５９２８６−５ＭＧ）、２〜５μＭオーロラキナーゼ阻害剤ＩＩ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、又は２〜５μＭ ＲＳＫ阻害剤ＩＩ、及び２〜５μＭオーロラキナーゼＩＩ阻害剤の組み合わせ）のうちの１つを含んでいた。

ステージ７の１４日目に、ｍＲＮＡを収集し、未分化ヒト幹細胞と比較した。図１１に描かれるように、Ｒ４２８の除去は、ＭＡＦＡ発現の著しい減少をもたらした。Ｒ４２８をオーロラキナーゼ阻害剤ＩＩと置換することは、ＭＡＦＡ発現を回復した。同様に、Ｒ４２８をＲＳＫ阻害剤と置換することは、ＭＡＦＡ発現を回復した。Ｒ４２８をオーロラキナーゼ阻害剤ＩＩ及びＲＳＫ阻害剤と置換することは、ＭＡＦＡ発現を更に増強した。このデータは、Ｒ４２８によるＭＡＦＡ発現の誘導が、ＡＸＬ阻害剤によるものではなく、むしろオーロラキナーゼ、ＲＳＫ、又はそれらの組み合わせの阻害によるものである可能性があったことを示す。

Claims (7)

1. 膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現する、分化した多能性幹細胞の集団を含み、前記分化細胞の少なくとも１０％が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを発現する、インビトロ細胞培養物。
2. 多能性細胞から誘導される細胞内でＭＡＦＡ発現を誘導する方法であって、多能性細胞を培養することと、オーロラキナーゼ阻害剤、ＲＳＫ阻害剤、タンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される阻害剤が補充された培地での処理によって、前記多能性細胞を、より成熟した表現型の膵内分泌細胞に分化させることと、を含む、方法。
3. 前記阻害剤が、オーロラキナーゼ阻害剤である、請求項２に記載の方法。
4. オーロラキナーゼ阻害剤が、オーロラキナーゼ阻害剤ＩＩである、請求項３に記載の方法。
5. 前記阻害剤が、ＲＳＫ阻害剤である、請求項２に記載の方法。
6. オーロラキナーゼ阻害剤が、ＲＳＫ阻害剤ＩＩである、請求項３に記載の方法。
7. 前記培地が、抗酸化剤を更に含む、請求項２に記載の方法。

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