JP2016198110A5 - - Google Patents

Description

いくつかの方法において、改変された真核細胞は、対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性である。いくつかの方法において、改変された真核細胞は、対象とするゲノム遺伝子座で半接合性である。任意に、１つの染色体における対象とするゲノム遺伝子座での標的遺伝子改変は、内因性核酸配列の欠失及び第１の核酸の挿入を含む。任意に、標的遺伝子改変は、（１）２つの相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）第１の染色体における対象とするゲノム遺伝子座への第１の核酸の挿入及び第２の染色体における対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む。第１の染色体は、２つの相同染色体のうちの一方であり得、第２の染色体は、もう一方の相同染色体であり得る。

いくつかのそのような方法において、改変非ヒトＥＳ細胞は、対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性である。いくつかのそのような方法において、改変非ヒトＥＳ細胞は、対象とするゲノム遺伝子座で半接合性である。任意に、１つの染色体における対象とするゲノム遺伝子座での標的遺伝子改変は、内因性核酸配列の欠失及び第１の核酸の挿入を含む。任意に、標的遺伝子改変は、（１）２つの相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）第１の染色体における対象とするゲノム遺伝子座への第１の核酸の挿入及び第２の染色体における対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む。第１の染色体は、２つの相同染色体のうちの一方であり得、第２の染色体は、もう一方の相同染色体であり得る。

上記の方法のいくつかにおいて、標的遺伝子改変は、２対立遺伝子の遺伝子改変である。上記の方法のいくつかにおいて、２対立遺伝子の遺伝子改変は、２つの相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び第１の核酸の挿入を含む。上記の方法のいくつかにおいて、改変真核細胞、改変マウス細胞、または改変ヒト細胞は、対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性である。上記の方法のいくつかにおいて、改変真核細胞、改変マウス細胞、または改変ヒト細胞は、対象とするゲノム遺伝子座で半接合性である。上記の方法のいくつかにおいて、１つの染色体における対象とするゲノム遺伝子座での標的遺伝子改変は、内因性核酸配列の欠失及び第１の核酸の挿入を含む。上記の方法のいくつかにおいて、標的遺伝子改変は、（１）第１及び第２の相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）第１の相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座への第１の核酸の挿入及び第２の相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む。

対象とするゲノム遺伝子座で標的遺伝子改変を含むＦ０世代非ヒト動物またはマウスを生み出すための方法であって、（ａ）上記の方法のいずれかを用いて、非ヒトまたはマウスＥＳ細胞を改変することと、（ｂ）対象とするゲノム遺伝子座で標的遺伝子改変を含む改変非ヒトまたはマウスＥＳ細胞を特定することと、（ｃ）改変非ヒトまたはマウスＥＳ細胞を非ヒトまたはマウス宿主胚に導入することと、（ｄ）代理母において非ヒトまたはマウス宿主胚を懐胎することと、を含み、代理母が、対象とするゲノム遺伝子座で標的遺伝子改変を含むＦ０世代非ヒト動物またはマウスを生み出す、方法も提供される。
例えば、本発明は、以下を提供する。
（項目１）
マウス細胞またはヒト細胞における対象とするゲノム遺伝子座でのゲノムを改変するための方法であって、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、前記ゲノムを、Ｃａｓタンパク質、前記対象とするゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含み、
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１０ｋｂであり、前記対象とするゲノム遺伝子座の５’標的配列に相同である５’相同性アーム、及び前記対象とするゲノム遺伝子座の３’標的配列に相同である３’相同性アームが隣接する第１の核酸を含み、
前記ＬＴＶＥＣの存在下で、前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡと接触させた後、前記ゲノムが、前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失及び前記対象とするゲノム遺伝子座の前記第１の核酸の挿入を含む標的遺伝子改変を含むように改変され、
（ｉ）欠失した前記対象とするゲノム遺伝子座の領域が、少なくとも３０ｋｂであり、
かつ／または
（ｉｉ）前記挿入された第１の核酸が少なくとも３０ｋｂである、前記方法。
（項目２）
前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び前記ＬＴＶＥＣが、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入される、項目１に記載の前記方法。
（項目３）
前記対象とするゲノム遺伝子座での前記標的遺伝子改変を含む、前記改変マウス細胞または前記改変ヒト細胞を特定することをさらに含む、項目１または２に記載の前記方法。（項目４）
前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、単一転写産物の形態で一緒に導入される、項目２または３に記載の前記方法。
（項目５）
前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、別々に導入される、項目２または３に記載の前記方法。
（項目６）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質が、タンパク質、前記Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または前記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡの形態で、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入され、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入され、かつ
（ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入される、項目２〜５のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目７）
前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、タンパク質−ＲＮＡ複合体として、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入される、項目６に記載の前記方法。
（項目８）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、かつ
（ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする第４の核酸に作動可能に連結された第３のプロモータを含む第３の発現構築物の形態であり、
前記第１、第２、及び第３のプロモータが、前記マウス細胞または前記ヒト細胞において活性である、項目６に記載の前記方法。
（項目９）
前記第１、第２、及び／または第３の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、項目８に記載の前記方法。
（項目１０）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、かつ
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、単一転写産物において、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、
前記第１及び第２のプロモータが、前記マウス細胞または前記ヒト細胞において活性である、項目６に記載の前記方法。
（項目１１）
前記第１及び前記第２の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、項目１０に記載の前記方法。
（項目１２）
前記標的遺伝子改変が、単一ステップにおける前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、及び前記対象とするゲノム遺伝子座での前記第１の核酸の挿入を同時に含む、項目１〜１１のいずれかに記載の前記方法。
（項目１３）
前記欠失した内因性核酸配列が約３０ｋｂ〜約１１０ｋｂであり、前記挿入された第１の核酸が約４０ｋｂ〜約１４０ｋｂである、項目１２に記載の前記方法。
（項目１４）
前記標的遺伝子改変が、２対立遺伝子の遺伝子改変である、項目１〜１３のいずれかに記載の前記方法。
（項目１５）
前記２対立遺伝子の遺伝子改変が、２つの相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び前記第１の核酸の挿入を含む、項目１４に記載の前記方法。
（項目１６）
前記改変マウス細胞または前記改変ヒト細胞が、前記対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性である、項目１４に記載の前記方法。
（項目１７）
前記改変マウス細胞または前記改変ヒト細胞が、前記対象とするゲノム遺伝子座で半接合性である、項目１４に記載の前記方法。
（項目１８）
１つの染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変が、内因性核酸配列の欠失及び前記第１の核酸の挿入を含む、項目１６に記載の前記方法。
（項目１９）
前記標的遺伝子改変が、（１）第１及び第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）前記第１の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座への前記第１の核酸の挿入、及び前記第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む、項目１６に記載の前記方法。
（項目２０）
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、または少なくとも９０ｋｂである、項目１〜１９のいずれかに記載の前記方法。
（項目２１）
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂである、項目１〜２０のいずれかに記載の前記方法。
（項目２２）
前記第１の核酸が、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、または少なくとも３００ｋｂである、項目１〜２１のいずれかに記載の前記方法。
（項目２３）
前記第１の核酸が、約４０ｋｂ〜約１４０ｋｂである、項目１〜２２のいずれかに記載の前記方法。
（項目２４）
前記マウス細胞または前記ヒト細胞が、初代細胞または不死化細胞である、項目１〜２３のいずれかに記載の前記方法。
（項目２５）
前記マウス細胞または前記ヒト細胞が多能性細胞である、項目１〜２３のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目２６）
前記マウス多能性細胞がマウス胚幹（ＥＳ）細胞である、項目２５に記載の前記方法。
（項目２７）
前記ヒト多能性細胞が、ヒト胚幹（ＥＳ）細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限された（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）ヒト前駆細胞、またはヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、項目２５に記載の前記方法。
（項目２８）
前記ヒトｉＰＳ細胞が、基本培地及び補充物を含む培地において維持され、前記培地が、
（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチド、
（ｂ）グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ３）阻害剤、及び
（ｃ）ＭＥＫ阻害剤を含み、
前記培地が、約１７５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項目２７に記載の前記方法。
（項目２９）
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、項目１〜２８のいずれかに記載の前記方法。
（項目３０）
前記標的配列には、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直ぐ隣接する、項目１〜２９のいずれかに記載の前記方法。
（項目３１）
前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’相同性アームの合計が、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである、項目１〜３０のいずれかに記載の前記方法。
（項目３２）
前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’相同性アームの合計が、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、または約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂである、項目１〜３１のいずれかに記載の前記方法。
（項目３３）
前記標的遺伝子改変が、
（ａ）相同またはオーソロガス核酸配列による内因性核酸配列の置換、
（ｂ）内因性核酸配列の欠失、
（ｃ）内因性核酸配列の欠失であって、
約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、または約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、または約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂの範囲に及ぶ、内因性核酸配列の欠失、
（ｄ）外因性核酸配列の挿入、
（ｅ）約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、または約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲に及ぶ、外因性核酸配列の挿入、
（ｆ）相同またはオーソロガス核酸配列を含む外因性核酸配列の挿入、
（ｇ）ヒト及び非ヒト核酸配列を含むキメラ核酸配列の挿入、
（ｈ）部位特異的リコンビナーゼ標的
配列が隣接する条件付き対立遺伝子の挿入、
（ｉ）前記多能性細胞において活性なプロモータに作動可能に連結された選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子の挿入、あるいは、
（ｊ）それらの組み合わせ、を含む、項目１〜３２のいずれかに記載の前記方法。
（項目３４）
前記５’標的配列及び前記３’標的配列が、少なくとも５ｋｂであるが３Ｍｂ未満だけ離れている、項目１〜３３のいずれかに記載の前記方法。
（項目３５）
前記５’標的配列及び前記３’標的配列が、少なくとも５ｋｂであるが１０ｋｂ未満、少なくとも１０ｋｂであるが２０ｋｂ未満、少なくとも２０ｋｂであるが４０ｋｂ未満、少なくとも４０ｋｂであるが６０ｋｂ未満、少なくとも６０ｋｂであるが８０ｋｂ未満、少なくとも約８０ｋｂであるが１００ｋｂ未満、少なくとも１００ｋｂであるが１５０ｋｂ未満、または少なくとも１５０ｋｂであるが２００ｋｂ未満、少なくとも約２００ｋｂであるが約３００ｋｂ未満、少なくとも約３００ｋｂであるが約４００ｋｂ未満、少なくとも約４００ｋｂであるが約５００ｋｂ未満、少なくとも約５００ｋｂであるが約１Ｍｂ未満、少なくとも約１Ｍｂであるが約１．５Ｍｂ未満、少なくとも約１．５Ｍｂであるが約２Ｍｂ未満、少なくとも約２Ｍｂであるが約２．５Ｍｂ未満、または少なくとも約２．５Ｍｂであるが約３Ｍｂ未満だけ離れている、項目１〜３４のいずれかに記載の前記方法。
（項目３６）
前記５’標的配列及び前記３’標的配列が、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂだけ離れている、項目１〜３５のいずれかに記載の前記方法。
（項目３７）
前記５’標的配列及び前記３’標的配列が、約３０ｋｂ〜約１１０ｋｂだけ離れている、項目１〜３６のいずれかに記載の前記方法。
（項目３８）
前記対象とするゲノム遺伝子座が、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、ＡｐｏＥ遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座及びＲａｇ２遺伝子座の両方、Ａｄａｍｔｓ５遺伝子座、Ｔｒｐａ１遺伝子座、Ｆｏｌｈ１遺伝子座、Ｅｒｂｂ４遺伝子座、Ｌｒｐ５遺伝子座、Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子座、Ｒｏｒ１遺伝子座、またはＤｐｐ４遺伝子座を含む、項目１〜３７のいずれかに記載の前記方法。
（項目３９）
前記対象とするゲノム遺伝子座が、染色体外ＤＮＡを含む、項目１〜３８のいずれかに記載の前記方法。
（項目４０）
対象とするゲノム遺伝子座で標的遺伝子改変を含むＦ０世代マウスを生み出すための方法であって、
（ａ）改変マウスＥＳ細胞を形成するために、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、マウスＥＳ細胞における前記ゲノムを、Ｃａｓタンパク質、前記対象とするゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることであって、
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１０ｋｂであり、前記対象とするゲノム遺伝子座の５’標的配列に相同である５’相同性アーム、及び前記対象とするゲノム遺伝子座の３’標的配列に相同である３’相同性アームが隣接する第１の核酸を含み、
前記ＬＴＶＥＣの存在下で、前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡと接触させた後、前記ゲノムが、前記対象とする遺伝子改変を含むように改変され、前記対象とする遺伝子改変が、前記対象とする遺伝子座の領域の欠失及び前記対象とするゲノム遺伝子座で前記第１の核酸の挿入を含み、
（ｉ）欠失した前記対象とするゲノム遺伝子座の領域が、少なくとも３０ｋｂであり、
かつ／または
（ｉｉ）前記挿入された第１の核酸が少なくとも３０ｋである、接触させることと、
（ｂ）前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変を含む前記改変ＥＳ細胞を特定することと、
（ｃ）前記改変マウスＥＳ細胞をマウス宿主胚に導入することと、
（ｄ）代理母において前記マウス宿主胚を懐胎させることと、を含み、
前記代理母が、前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変を含む前記Ｆ０世代マウスを生み出す、前記方法。
（項目４１）
前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、単一転写産物の形態で一緒に導入される、項目４０に記載の前記方法。
（項目４２）
前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、別々に導入される、項目４０に記載の前記方法。
（項目４３）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質が、タンパク質、前記Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または前記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡの形態で、前記マウスＥＳ細胞に導入され、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で、前記マウスＥＳ細胞に導入され、かつ
（ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で、前記マウスＥＳ細胞に導入される、項目４０〜４２のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目４４）
前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、タンパク質−ＲＮＡ複合体として、前記マウスＥＳ細胞に導入される、項目４３に記載の前記方法。
（項目４５）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、かつ
（ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする第４の核酸に作動可能に連結された第３のプロモータを含む第３の発現構築物の形態であり、
前記第１、第２、及び第３のプロモータが、前記マウスＥＳ細胞において活性である、項目４３に記載の前記方法。
（項目４６）
前記第１、第２、及び第３の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、項目４５に記載の前記方法。
（項目４７）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、かつ
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、単一転写産物において、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、
前記第１及び第２のプロモータが、前記マウスＥＳ細胞において活性である、項目４３に記載の前記方法。
（項目４８）
前記第１及び前記第２の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、項目４７に記載の前記方法。
（項目４９）
前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、及び前記対象とするゲノム遺伝子座での前記第１の核酸の挿入を同時に含む、項目４０〜４８のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目５０）
前記標的遺伝子改変が、２対立遺伝子の遺伝子改変である、項目４０〜４９のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目５１）
前記２対立遺伝子の遺伝子改変が、２つの相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び前記第１の核酸の挿入を含む、項目５０に記載の前記方法。
（項目５２）
前記改変マウスＥＳ細胞が、前記対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性である、項目５０に記載の前記方法。
（項目５３）
前記改変マウスＥＳ細胞が、前記対象とするゲノム遺伝子座で半接合性である、項目５０に記載の前記方法。
（項目５４）
１つの染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での前記標的遺伝子改変が、内因性核酸配列の欠失及び前記第１の核酸の挿入を含む、項目５２に記載の前記方法。
（項目５５）
前記標的遺伝子改変が、（１）第１及び第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）前記第１の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座への前記第１の核酸の挿入及び前記第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む、項目５２に記載の前記方法。
（項目５６）
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、項目４０〜５５のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目５７）
真核細胞における対象とするゲノム遺伝子座でゲノムを改変するための方法であって、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、前記ゲノムを、Ｃａｓタンパク質、前記対象とするゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含み、
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１０ｋｂであり、前記対象とするゲノム遺伝子座の５’標的配列に相同である５’相同性アーム、及び前記対象とするゲノム遺伝子座の３’標的配列に相同である３’相同性アームが隣接する第１の核酸を含み、
前記真核細胞がラット細胞ではなく、
前記ＬＴＶＥＣの存在下で、前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡと接触させた後、前記ゲノムが、前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失及び前記対象とするゲノム遺伝子座の前記第１の核酸の挿入を含む標的遺伝子改変を含むように改変され、
（ｉ）欠失した前記対象とするゲノム遺伝子座の領域が、少なくとも３０ｋｂであり、
かつ／または
（ｉｉ）前記挿入された第１の核酸が少なくとも３０ｋｂである、前記方法。
（項目５８）
前記非ラット真核細胞が、多能性細胞、非多能性細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、または線維芽細胞である、項目５７に記載の前記方法。
（項目５９）
前記非ラット真核細胞が、初代細胞または不死化細胞である、項目５７に記載の前記方法。

皿中で通常分離し、浮遊する小型球形コロニーとして成長するラットＥＳＣを示す。 ラットＥＳＣにより発現される様々な多能性マーカーを示す。ＡはＯｃｔ−４（緑色）を示し、ＢはＳｏｘ−２（赤色）を示し、ＣはＤＡＰＩ（青色）を示し、ＤはｒＥＳＣにより発現される多能性マーカーのオーバーレイを示す。 ラットＥＳＣがアルカリホスファターゼ（多能性マーカー）の光レベルを発現することを示す。 ４２Ｘ，Ｙである細胞系列ＤＡ．２Ｂの核型を示す。ラットＥＳＣが多くの場合、４倍体となるため、核型分析が行われ、そのため、細胞系列は、分裂中期の染色体の広がりを計数することにより事前に選別され、大部分が正常な計数を有する細胞系列が、正式に核型分析された。 ＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳ細胞株の染色体数の分析を示す写真を提供する。 ＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳ細胞株の染色体数の分析を示す写真を提供する。 ＤＡ．２ＢラットＥＳ細胞株の染色体数の分析を示す写真を提供する。 ＤＡ．２ＢラットＥＳ細胞株の染色体数の分析を示す写真を提供する。 ＤＡ．２ＣラットＥＳ細胞株の染色体数の分析を示す写真を提供する。 ＤＡ．２ＣラットＥＳ細胞株の染色体数の分析を示す写真を提供する。 図１のラットＥＳＣの拡大図を示す。 生殖細胞系列を通したラットＥＳＣゲノムの胚盤胞注射及び伝達によるキメラの生成を示す。キメラは、親ＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳＣを用いた胚盤胞注射により生成された。高い割合のキメラが、通常、アルビノ鼻を有する。 図９にアスタリスク（^＊）で標識されたＡＣＩ／ＳＤキメラが雄親となるアルビノ同腹子を有するＦ１アグーチ子を示す。 ラットのＡｐｏＥ遺伝子座の概略図を提供し、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ１及びＺＦＮ２）の切断部位を灰色バーで示す。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、５ｋｂ及び５．４ｋｂ）に対応するゲノム領域を濃灰色ボックスで示す。ＡｐｏＥ遺伝子のエクソン１は、非コードであり、５’相同性アームに最も近い白抜きのボックスとして示される。ＡｐｏＥ遺伝子の３つのイントロンは、線で示される。エクソン２及び３は、コード領域を含み、点状の灰色ボックスとして示される。エクソン４は、点状の灰色影付き及び白抜きのボックスで示されるコード配列及び非コード配列の両方を含む。 同じ間隔を有し、マウスにおけるように、Ｓｅｔｄ５遺伝子とＴｈｕｍｐｄ３遺伝子との間にあるラットのＲｏｓａ２６遺伝子座の標的化を示す。パネルＡは、マウスのＲｏｓａ２６遺伝子座の構造を示す。マウスのＲｏｓａ２６転写物は、２つまたは３つのエクソンから成る。パネルＢは、ラットのＲｏｓａ２６遺伝子座の構造を示し、ラットの遺伝子座は、マウスエクソン１（Ｅｘ１ａ）に対して相同的なエクソンに加えて、第２のエクソン１（Ｅｘ１ｂ）を含むが、第３のエクソンは、ラットにおいては確認されていない。パネルＣは、標的とするラットのＲｏｓａ２６対立遺伝子を示し、５ｋｂの相同性アームはそれぞれ、ＤＡ ｒＥＳＣからのゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲによってクローン化され、標的とする対立遺伝子は、ラットのＲｏｓａ２６イントロンにおいて１１７ｂｐの欠失を置換するスプライシング受容体（ＳＡ）−ｌａｃＺ−ｈＵＢ−ｎｅｏカセットを含む。 Ｘ−ｇａｌで染色された１４週齢の野生型ラットの対照脳を示す。対照脳は、ＬａｃＺに対して低レベルの背景染色を示した（背面図）。 ｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合ラット（１４週齢）の脳におけるＬａｃＺ発現を示す。ｌａｃＺレポーターは、ｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合体の脳全体にわたって遍在的に発現した。 Ｘ−ｇａｌで処理された１４週齢の野生型ラットの対照心臓及び胸腺（挿入図）を示す。対照心臓及び胸腺は、ＬａｃＺに対して低レベルの背景染色を示した。 １４週齢のｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合ラットの対照心臓及び胸腺（挿入図）におけるＬａｃＺ発現を示す。ｌａｃＺレポーターは、ｒＲＯＳＡ２６ヘテロ接合体の心臓及び胸腺全体にわたって遍在的に発現した。 Ｘ−ｇａｌで処理された１４週齢の野生型ラットの対照肺を示す。対照肺は、ＬａｃＺに対して低レベルの背景染色を示した。 １４週齢のｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合体ラットの肺におけるＬａｃＺ発現を示す。ｌａｃＺレポーターは、ｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合体の肺全体にわたって遍在的に発現した。 Ｅ１２．５ラット胚におけるＬａｃＺ発現を示す。低レベルの背景ＬａｃＺ染色を示す野生型対照胚（Ｈ）と比較して、ｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合体胚は、胚全体にわたってＬａｃＺレポーターの遍在的発現を示した。 Ｅ１４．５ラット胚におけるＬａｃＺ発現を示す。低レベルの背景ＬａｃＺ染色を示す野生型対照胚（Ｊ）と比較して、ｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合体ラット胚は、胚全体にわたってＬａｃＺレポーターの遍在的発現を示した。 選択カセット（ｌａｃＺ−ｎｅｏカセット）を含む標的化ベクターの電気穿孔後のラットＥＳ細胞内に生じる相同または非相同的組み換え事象を示す。 ゲノム編集エンドヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮ）が標的ゲノム配列において二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導し、ＥＳ細胞において非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を活性化する機構を示す。 標的化ベクターの相同的組み換えの効率を改善するためにＺＦＮ／ＴＡＬＥＮを利用する遺伝子標的技術を示す。ＤＳＢは、二本鎖切断を表す。 改変ラットのＡｐｏＥ遺伝子座のキメラ生成及び生殖細胞系列の伝達によって生み出されたＡｐｏＥ−ＺＦＮ−ＡＢ５キメラを示す。標的改変は、ジンクフィンガーヌクレアーゼによって支援された。 ＺＦＮ Ｕ及びＺＦＮ Ｄを標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼと組み合わせたＩＬ２ｒ−γ標的化事象の概略図を提供する。ＺＦＮ Ｕ及びＺＦＮ Ｄによって標的とされるラットのＩＬ２ｒ−γ遺伝子座の領域を示す（配列番号９３）。ＺＦＮ切断部位を図に示す。 ＺＦＮ Ｕ及びＺＦＮ Ｄを標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼと組み合わせたまたはｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ３、ｇＲＮＡ４）と組み合わせたＩＬ２ｒ−γ標的化事象の概略図を提供する。ＺＦＮ Ｕ及びＺＦＮ ＤまたはｇＲＮＡ１〜４によって標的とされたラットのＩＬ２ｒ−γ遺伝子座の領域を示し、ＺＦＮ切断部位を示す。 ラットのＡｐｏＥ遺伝子座及び標的化プラスミドの概略図を提供する。上の概略図は、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、５ｋｂ及び５．４ｋｂ、濃い灰色ボックス）に対応するゲノム領域のゲノム構造を示す。ＡｐｏＥ遺伝子のエクソン１は、非コードであり、５’相同性アームに最も近い白抜きのボックスとして示される。ＡｐｏＥ遺伝子の３つのイントロンは、線で示される。エクソン２及び３は、コード領域を含み、点状の灰色ボックスとして示される。エクソン４は、点状の灰色影付き及び白抜きのボックスで示されるコード配列及び非コード配列の両方を含む。下パネルは、標的化プラスミドを示す。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、５ｋｂ及び５．４ｋｂ）は、濃い灰色ボックスで示される。標的化ベクターは、レポーター遺伝子（ｌａｃＺ）、及びｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。自己欠失カセットは、Ｃｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたマウスＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む。 ジンクフィンガーヌクレアーゼと、レポーター遺伝子（ＬａｃＺ）、ならびにＣｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたマウスＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、自己欠失カセットを含む標的化ベクターとを用いた、ラットＥＳ細胞におけるＡｐｏＥ遺伝子座を標的化するための概略図を提供する。図２１Ｂは、ホモ接合性標的ＡｐｏＥ遺伝子座を示す。 ラットのＡｐｏＥ遺伝子座及び大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の概略図を提供する。上パネルは、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４５ｋｂ及び２３ｋｂ、濃い灰色ボックス）に対応するゲノム領域のゲノム構成を示す。ＡｐｏＥのエクソン１は、非コードであり、５’相同性アームに最も近い白抜きのボックスとして示される。ＡｐｏＥ遺伝子の３つのイントロンは、線で示され、エクソン２及び３は、コード領域を含み、点状の灰色ボックスとして示される。エクソン４は、点状の灰色影付き及び白抜きのボックスで示されるコード配列及び非コード配列の両方を含む。下パネルは、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座を改変するためのＬＴＶＥＣを示す。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４５ｋｂ及び２３ｋｂ）は、濃い灰色ボックスで示される。ＬＴＶＥＣは、レポーター遺伝子（ｌａｃＺ）、ならびにＣｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたマウスＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、ｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。 ラットのＡｐｏＥ遺伝子座の概略図を提供し、標的化ベクターと標的同種染色体領域との間の相同的組み換えを増強するために大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と一緒に使用される、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ１及びＺＦＮ２）における切断部位を灰色バーで示す。 ３．２ｋｂの欠失と、レポーター遺伝子（ｅＧＦＰ）ならびに薬物選択カセット（ｈＵｂ−ｎｅｏ）及びマウスＰｒｍ１プロモータに作動可能に連結されたＣｒｅｉ遺伝子を含む自己欠失カセットの挿入とによって破壊されたラットのＩＬ２ｒ−γ遺伝子座を示す。 ３．２ｋｂの欠失と、レポーター遺伝子（ｅＧＦＰ）ならびにマウスＰｒｍ１プロモータに作動可能に連結されたＣｒｅｉ遺伝子及び薬物選択カセット（ｈＵｂ−Ｎｅｏ）を含む自己欠失カセットの挿入とによって破壊されたラットのＩＬ２ｒ−γ遺伝子座の別の図を提供する。 ラットＲａｇ２遺伝子座を改変するためのラットＲａｇ２遺伝子座及び大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の概略図を提供する。上パネルは、ラットＲａｇ２遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４８ｋｂ及び８４ｋｂ、濃い灰色ボックス）に対応する同種ゲノム領域のゲノム構成を示す。Ｒａｇ２は、点状の灰色影付きで示される単一のエクソンを含む。下パネルは、ＬＴＶＥＣである。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４８ｋｂ及び８４ｋｂ）は、濃い灰色ボックスで示される。ＬＴＶＥＣは、レポーター遺伝子（ｌａｃＺ）、ならびにＣｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたラットＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、ｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。 ラットのＲａｇ１／Ｒａｇ２遺伝子座、及びＲａｇ２の標的化（Ｒａｇ２の欠失）またはＲａｇ２／Ｒａｇ１の二重標的化（Ｒａｇ２／Ｒａｇ１の欠失）のいずれかによって欠失したゲノム領域のゲノム構造を提供する。 遺伝子座を改変するために使用される、ラットのＲａｇ２及びＲａｇ１遺伝子座ならびに大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の概略図を提供する。上パネルは、Ｒａｇ１及びＲａｇ２遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４８ｋｂ及び１５ｋｂ、濃い灰色ボックス）に対応する同種ゲノム領域のゲノム構成を示す。Ｒａｇ２及びＲａｇ１はそれぞれ、点状の灰色影付きで示される単一のエクソンを含む。下パネルは、ＬＴＶＥＣである。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４８ｋｂ及び１５ｋｂ）は、濃い灰色ボックスで示される。ＬＴＶＥＣは、レポーター遺伝子（ｌａｃＺ）、ならびにＣｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたラットＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、ｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。 ＩＩ２ｒｇ−／ｙキメララット（パネルＡ〜Ｃ）及び野生型ＤＡラット（パネルＤ〜Ｆ）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＧＦＰ発現ならびにＴ−細胞マーカーＣＤ３（パネルＡ及びＤ）、Ｂ−細胞マーカーＢ２２０（パネルＢ及びＥ）、及びＮＫ細胞マーカーＣＤ１６１ａ（パネルＣ及びＦ）のフローサイトメトリー分析を示す。二重陽性細胞を象限Ｒ８に示す。図２９は、ＩＩ２ｒｇ−／ｙ ＰＢＭＣが成熟リンパ球マーカーを発現しないことを示す。 ＩＩ２ｒｇ−／ｙキメララット（パネルＡ〜Ｃ）及び野生型ＤＡラット（パネルＤ〜Ｆ）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＧＦＰ発現ならびにＴ−細胞マーカーＣＤ３（パネルＡ及びＤ）、Ｂ−細胞マーカーＢ２２０（パネルＢ及びＥ）、及びＮＫ細胞マーカーＣＤ１６１ａ（パネルＣ及びＦ）のフローサイトメトリー分析を示す。二重陽性細胞を象限Ｒ８に示す。図２９は、ＩＩ２ｒｇ−／ｙ ＰＢＭＣが成熟リンパ球マーカーを発現しないことを示す。 ＧＦＰ陽性リンパ球が、３つのＩＩ２ｒｇ−／ｙキメラのうち２つのキメラにおける末梢血中に検出されたことを示す。 ラットＩｌ２ｒｇ遺伝子座の完全ヒト化におけるラットＩｌ２ｒｇ遺伝子座及び標的化プラスミドの概略図を提供する。上パネルは、ラットＩｌ２ｒｇ遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４．３ｋｂ及び４．０ｋｂ、灰色ボックス）に対応する同種ゲノム領域のゲノム構成を示す。下パネルは、標的化プラスミドである。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４．３ｋｂ及び４．０ｋｂ）は、灰色ボックスで示される。標的化プラスミドは、ヒトＩＬ−２ｒｇゲノム領域、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、ｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する欠失カセットを含む。 ラットのＩｌ２ｒｇ遺伝子座の細胞外ドメインヒト化におけるラットＩｌ２ｒｇ遺伝子座及び標的化プラスミドの概略図を提供する。上パネルは、ラットＩｌ２ｒｇ遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４．３ｋｂ及び４．０ｋｂ、灰色ボックス）に対応する同種ゲノム領域のゲノム構成を示す。下パネルは、標的化プラスミドである。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４．３ｋｂ及び４．０ｋｂ）は、灰色ボックスで示される。標的化プラスミドは、ＩＬ−２Ｒｇゲノム領域のヒト細胞外ドメイン、ならびにＣｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたラットＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、ｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。 ヒトＩＬ−２ｒｇタンパク質（配列番号２０、ＮＰ＿０００１９７．１）、ラットＩＬ−２ｒｇタンパク質（配列番号２１、ＮＰ＿５４３１６５．１）、及びラットＩＬ−２ｒｇタンパク質の残りに融合されたＩＬ−２ｒｇのヒト細胞外ドメインを含むキメラＩＬ−２ｒｇタンパク質（配列番号２２）の配列アライメントを提供する。ヒトＩＬ−２ｒｇとラットＩＬ−２ｒｇとの間の結合を垂直線で示す。 マウスＬｒｐ５遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援によるヒト化の概略図を提供し、ＬＴＶＥＣを上パネルに示し、マウスＬｒｐ５遺伝子座を下パネルに示す。ヒト化領域は、細胞外ドメインである。矢印は、各ｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＢ、ｇＢ２、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ２、ｇＥ、ｇＦ）及びＺＦＮ（ａ〜ｄ）における標的部位を示す。 欠失の大きさが増加するＬＴＶＥＣ標的化遺伝子（図３５Ａ）及びヒト遺伝子の挿入の大きさが増加するＬＴＶＥＣ（図３５Ｂ）の標的化効率の割合（％）を示す。ＬＴＶＥＣを、単独で（灰色四角形または三角形）またはＺＦＮと組み合わせて（黒色四角形または三角形）使用した。 欠失の大きさが増加するＬＴＶＥＣ標的化遺伝子（図３５Ａ）及びヒト遺伝子の挿入の大きさが増加するＬＴＶＥＣ（図３５Ｂ）の標的化効率の割合（％）を示す。ＬＴＶＥＣを、単独で（灰色四角形または三角形）またはＺＦＮと組み合わせて（黒色四角形または三角形）使用した。 マウスＴｒｐａ１遺伝子の全コード領域のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援によるヒト化の概略図を提供し、ＬＴＶＥＣを上パネルに示し、マウスＴｒｐａ１遺伝子座を下パネルに示す。矢印は、各ｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＡ２、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ２、ｇＥ、ｇＦ）における標的部位を示す。 マウスＦｏｌｈ１遺伝子の細胞外ドメイン（エクソン２から終止コドン）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援によるヒト化の概略図を提供し、ＬＴＶＥＣを上パネルに示し、マウスＦｏｌｈ１遺伝子座を下パネルに示す。矢印は、各ｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＡ２、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＥ２、ｇＦ）における標的部位を示す。 マウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子のエクソン２から終止コドンまでの領域のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援によるヒト化の概略図を提供し、ＬＴＶＥＣを上パネルに示し、マウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子座を下パネルに示す。矢印は、各ｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＢ、ｇＢ２、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ２、ｇＥ、ｇＦ）における標的部位を示す。 マウスＡｄａｍｔｓ５遺伝子の全コード領域のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援によるヒト化の概略図を提供し、ＬＴＶＥＣを上パネルに示し、マウスＡｄａｍｔｓ５遺伝子座を下パネルに示す。矢印は、各ｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＡ２、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ２、ｇＥ、ｇＦ）における標的部位を示す。 マウスＥｒｂｂ４遺伝子のエクソン４〜１５のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援のヒト化の概略図を提供し、ＬＴＶＥＣを上パネルに示し、マウスＥｒｂｂ４遺伝子座を下パネルに示す。矢印は、各ｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＢ、ｇＢ２、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ２、ｇＥ、ｇＦ）における標的部位を示す。 マウスＲｏｒ１遺伝子のエクソン２〜７のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援によるヒト化の概略図を提供し、ＬＴＶＥＣを上パネルに示し、マウスのＲｏｒ１遺伝子座を下パネルに示す。矢印は、各ｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＦ）における標的部位を示す。 マウスＤｐｐ４遺伝子のエクソン２から終止コドンの領域のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援によるヒト化の概略図を提供し、ＬＴＶＥＣを上パネルに示し、マウスのＤｐｐ４遺伝子座を下パネルに示す。矢印は、各ｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＢ、ｇＢ２、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ２、ｇＥ、ｇＦ）における標的部位を示す。 Ｘ−ｇａｌで染色された１２週齢雌ラットの脳を示す。図４３Ａ〜Ｃは、野生型ラットからの脳を示し、図４３Ｄ〜Ｆは、ＡｐｏＥ^＋／−ラットからの脳を示す。図４３Ａ及びＤは背面図を示し、図４３Ｂ及びＥは腹側図を示し、図４３Ｃ及びＦは拡大図を示す。 Ｘ−ｇａｌで染色された１２週齢雌ラットの脳を示す。図４３Ａ〜Ｃは、野生型ラットからの脳を示し、図４３Ｄ〜Ｆは、ＡｐｏＥ^＋／−ラットからの脳を示す。図４３Ａ及びＤは背面図を示し、図４３Ｂ及びＥは腹側図を示し、図４３Ｃ及びＦは拡大図を示す。 Ｘ−ｇａｌで染色された１２週齢雌ラットの心臓（Ａ及びＣ）ならびに血管の対応する拡大図（Ｂ及びＤ）を示す。図４４Ａ及びＢは、それぞれ、野生型ラットからの心臓及び血管を示し、図４４Ｃ及びＤは、それぞれ、ＡｐｏＥ^＋／−ラットからの心臓及び血管を示す。染色は、心臓の心房及びいくつかの血管（例えば、大静脈）に存在した。 Ｘ−ｇａｌで染色された１２週齢雌ラットの肝臓を示す。図４５Ａ及びＢは、野生型ラットからの肝臓を示し、図４５Ｃ及びＤは、ＡｐｏＥ^＋／−ラットからの肝臓を示す。図４５Ｂ及びＤは、肝臓の拡大図である。 ６週間、９週間、１２週間、及び１５週間でのホモ接合性ＡｐｏＥを標的とするラット、ヘテロ接合ＡｐｏＥを標的とするラット、及び野生型ラットにおけるコレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、及びトリグリセリドレベルの検出（それぞれ、図４６Ａ〜Ｄ）を示す。 ラットのＡｐｏＥ遺伝子座（上パネル）、及びラットのＡｐｏＥ遺伝子座（下パネル）を標的とする大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の概略図を示す。上パネルは、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４５ｋｂ及び２３ｋｂ、濃い灰色ボックス）に対応するゲノム領域のゲノム構成を示す。ＡｐｏＥのエクソン１は、非コードであり、５’相同性アームに最も近い白抜きのボックスとして示される。ＡｐｏＥ遺伝子の３つのイントロンは、線で示され、エクソン２及び３は、コード領域を含み、点状の灰色ボックスとして示される。エクソン４は、点状の灰色影付き及び白抜きのボックスで示されるコード配列及び非コード配列の両方を含む。ＡｐｏＥ ｇＲＮＡ２（配列番号８７）及びｇＲＮＡ３（配列番号８８）における標的部位を示す。下パネルは、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座を改変するためのＬＴＶＥＣを示す。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４５ｋｂ及び２３ｋｂ）は、濃い灰色ボックスで示される。ＬＴＶＥＣは、レポーター遺伝子（ｌａｃＺ）、ならびにＣｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたマウスＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、ｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。 ラットＲａｇ２遺伝子座（上パネル）、及びラットＲａｇ２遺伝子座（下パネル）を標的とする大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の概略図を示す。上パネルは、ラットＲａｇ２遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４８ｋｂ及び８４ｋｂ、濃い灰色ボックス）に対応する同種ゲノム領域のゲノム構成を示す。Ｒａｇ２は、点状の灰色影付きで示される単一のエクソンを含む。Ｒａｇ２ ｇＲＮＡ１（配列番号８９）及びｇＲＮＡ４（配列番号９０）における標的部位を示す。下パネルは、ＬＴＶＥＣである。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４８ｋｂ及び８４ｋｂ）は、濃い灰色ボックスで示される。ＬＴＶＥＣは、レポーター遺伝子（ｌａｃＺ）、ならびにＣｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたラットＰｒｍ１プロモータ及びハイグロマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、ｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。 ラットＩｌ２ｒｇ遺伝子座（上パネル）、及びラットＩｌ２ｒｇ遺伝子座（下パネル）の細胞外ドメインのヒト化のための標的化プラスミドの概略図を示す。上パネルは、ラットＩｌ２ｒｇ遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４．３ｋｂ及び４．０ｋｂ、灰色ボックス）に対応する同種ゲノム領域のゲノム構成を示す。Ｉｌ２ｒｇ ｇＲＮＡ２（配列番号９１）及びｇＲＮＡ４（配列番号９２）における標的部位を示す。下パネルは、標的化プラスミドである。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４．３ｋｂ及び４．０ｋｂ）は、灰色ボックスで示される。標的化プラスミドは、ＩＬ−２Ｒｇゲノム領域のヒト細胞外ドメイン、ならびにＣｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたラットＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、ｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。 Ｉｌ２ｒｇが標的となるラットＥＳ細胞（クローンＩｌ２ｒｇ−ＣＧ１２）における遺伝座を改変するために使用される、ラットＲａｇ２及びＲａｇ１遺伝子座ならびに大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の概略図を示す。上パネルは、Ｒａｇ１及びＲａｇ２遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４８ｋｂ及び１５ｋｂ、灰色ボックス）に対応する同種ゲノム領域のゲノム構成を示す。Ｒａｇ２及びＲａｇ１はそれぞれ、陰影のない矢印で示される単一のエクソンを含む。下パネルは、ＬＴＶＥＣである。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４８ｋｂ及び１５ｋｂ）は、灰色ボックスによって示される。ＬＴＶＥＣは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって分離され、アクチンプロモータに作動連結された、レポーター遺伝子（ｅＧＦＰ）及びピューロマイシン耐性遺伝子を含む。ＬＴＶＥＣは、Ｃｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたラットＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、ｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットをさらに含む。 ヒトｉＰＳ細胞におけるＬＴＶＥＣ及びガイドＲＮＡを用いたマウスＡｄａｍ６ａ遺伝子座及びマウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子座を含む核酸によるヒトＡＤＡＭ６遺伝子座の一部分の置換の概略図を示す。ガイドＲＮＡの標的部位を、矢印によって示す。 ２ｉ培地において８日間培養されたヒトｉＰＳ細胞により示された形態を示す。図５２Ｂは、２ｉ培地において１２日間培養されたヒトｉＰＳ細胞により示された形態を示す。 ｍＴｅＳＲ（商標）−ｈＬＩＦ培地または低オスモル濃度ＶＧ２ｉ培地において６日間培養されたヒトｉＰＳ細胞の形態を示す。図５３Ａ及び５３Ｂは、ｍＴｅＳＲ（商標）−ｈＬＩＦ培地（図３Ａ）またはＶＧ２ｉ培地（図５３Ｂ）において６日間培養されたヒトｉＰＳ細胞の形態を示す。図５３Ｃ及び５３Ｄは、ｍＴｅＳＲ（商標）−ｈＬＩＦ培地（図５３Ｃ）またはＶＧ２ｉ培地（図５３Ｄ）において新生児ヒト包皮線維芽細胞（ＮｕＦＦ）のフィーダー細胞に６日間培養されたヒトｉＰＳ細胞の形態を示す。 アルカリホスファターゼに対して染色されたＶＧ２ｉ培地において培養された再プログラミングされたヒトｉＰＳ細胞を示す。図５４Ｂ及び５４Ｃは、ＮＡＮＯＧの発現に対して免疫染色されたＶＧ２ｉ培地において培養された再プログラミングされたヒトｉＰＳ細胞を示す。 ＶＧ２ｉ培地において培養された再プログラミングされたヒトｉＰＳ細胞の酵素解離及び継代培養を示す。図５５Ａは、ＲＯＣＫ阻害剤の不在下でトリプシンによる酵素解離前にＶＧ２ｉ培地において培養された再プログラミングされたヒトｉＰＳ細胞を示す。図５５Ｂは、継代培養後１日間ＶＧ２ｉ培地において培養されたヒトｉＰＳ細胞を示す。図５５Ｃは、継代培養後４日間ＶＧ２ｉ培地において培養されたヒトｉＰＳ細胞を示す。

一実施形態において、第１の核酸は、Ｃａｓタンパク質においてヌクレアーゼ活性部位の少なくとも１つのアミノ酸残基を破壊する突然変異体を含み、突然変異体Ｃａｓタンパク質は標的ＤＮＡ領域の一方の鎖のみに切断を生じ、突然変異体は、標的ＤＮＡ領域において非相同的組み換えを減少させる。

一実施形態において、標的遺伝子座の標的遺伝子改変は、２対立遺伝子である。「２対立遺伝子」とは、遺伝子の両方の対立遺伝子が標的遺伝子改変を含むことを意味する。標的遺伝子改変は、各対立遺伝子において同じであり得るか、または異なり得る。例えば、２対立遺伝子改変は、対応する相同染色体上の対応する対立遺伝子に行われる同じ改変をもたらし得るか、または対応する相同染色体上の対応する対立遺伝子に行われる異なる改変をもたらし得る。それ故に、２対立遺伝子改変は、例えば、対象とするゲノム遺伝子座で特異的改変に対してホモ接合性（すなわち、両方の対立遺伝子において特異的改変）、対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性（例えば、一方の対立遺伝子において特異的改変であり、もう一方の対立遺伝子の不活性化または破壊）、または対象とするゲノム遺伝子座で半接合性（例えば、一方の対立遺伝子において特異的改変であり、もう一方の対立遺伝子の欠失）をもたらし得る。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ剤とともに標的化ベクター（例えば、ＬＴＶＥＣを含む）の組み合わせた使用により、標的化ベクターのみの使用と比較して、細胞において対象とするゲノム遺伝子座の２対立遺伝子の標的遺伝子改変をもたらす。標的化ベクターがヌクレアーゼ剤と組み合わせて使用されるとき、２対立遺伝子の標的化効率は、標的化ベクターのみが使用されるときと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍またはそれ以上増加する。さらなる実施形態において、２対立遺伝子の標的化効率は、少なくとも０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、もしくは５％、またはそれを超える。

一実施形態において、標的遺伝子座での標的遺伝子改変は、半接合性の遺伝子的に改変された細胞をもたらす。「半接合性」とは、標的遺伝子座の１つのみの対立遺伝子（すなわち、２つの相同染色体のうちの１つの染色体上の対立遺伝子）が存在するか、または１つの対立遺伝子のみが発現可能であり、機能的であることを意味する。他の実施形態において、標的遺伝子改変は、より一般に、複合ヘテロ接合性をもたらす。複合ヘテロ接合性は、標的遺伝子座の両方の対立遺伝子（すなわち、両方の相同染色体上の対立遺伝子）が改変されるが、それらは異なる方法（例えば、一方の対立遺伝子において挿入及びもう一方の対立遺伝子の不活性化または破壊）で改変される状況を含む。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ剤を用いた標的化ベクター（例えば、ＬＴＶＥＣを含む）の組み合わせた使用により、細胞において対象とするゲノム遺伝子座の半接合性の標的遺伝子改変をもたらす。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ剤を用いた標的化ベクター（例えば、ＬＴＶＥＣを含む）の組み合わせた使用により、細胞において対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性を形成する標的遺伝子改変をもたらす。一実施形態において、１つの染色体における対象とするゲノム遺伝子座での標的遺伝子改変は、内因性核酸配列の欠失及び挿入核酸の挿入を含む。他の実施形態において、標的遺伝子改変は、（１）２つの相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）第１の染色体における対象とするゲノム遺伝子座への挿入核酸の挿入及び第２の染色体における対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む。第１の染色体は、２つの相同染色体のうちの第１の相同染色体であり得、第２の染色体は、２つの相同染色体のうちの第２の相同染色体であり得る。他の実施形態において、標的改変は、（１）第１の相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び対象とするゲノム遺伝子座への挿入核酸の挿入、ならびに（２）第２の相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む。内因性核酸配列の破壊は、例えば、ヌクレアーゼ剤により形成される対象とするゲノム遺伝子座で二本鎖切断が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介のＤＮＡ修復によって修復されるとき、これは対象とするゲノム遺伝子座で核酸配列の挿入または欠失を含む突然変異対立遺伝子を作製し、それにより、対象とするゲノム遺伝子座の破壊を生じることをもたらし得る。破壊の例には、対象とするゲノム遺伝子座で調節要素（例えば、プロモータまたはエンハンサー）の変更、ミスセンス突然変異、切断突然変異、ヌル突然変異、または（例えば、フレームシフト突然変異を生じる）少数のヌクレオチドの挿入もしくは欠失が含まれる。破壊の別例は、ナンセンス突然変異である。破壊は、対立遺伝子の不活性化（すなわち、機能の喪失）または喪失をもたらし得る。

ホモ接合性及び半接合性の標的遺伝子改変は、これらの突然変異を含む遺伝子的に改変された細胞が以下に論じられる遺伝子的に改変された動物を生み出すために使用されるとき、意図された標的遺伝子改変に対して非ヘテロ接合性（すなわち、ホモ接合性または半接合性）である遺伝子的に改変された動物を生み出すためのプロセスがより効率であり、繁殖ステップをあまり必要としないのであまり時間がかからないため、有利である。複合ヘテロ接合性または半接合性をもたらす標的遺伝子改変（例えば、一方の対立遺伝子において挿入及びもう一方の対立遺伝子の不活性化、破壊、または喪失）は、同じ理由により有利であり得る。

他の実施形態において、標的ゲノム改変は、対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性である改変された多能性細胞を形成する。他の実施形態において、標的ゲノム改変は、対象とするゲノム遺伝子座で半接合性である改変された多能性細胞を形成する。いくつかの実施形態において、１つの染色体における対象とするゲノム遺伝子座での標的遺伝子改変は、内因性核酸配列の欠失及び外因性核酸の挿入を含む。例えば、標的遺伝子改変は、（１）２つの相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）第１の染色体における対象とするゲノム遺伝子座への外因性核酸の挿入及び第２の染色体における対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含むことができる。第１の染色体は、２つの相同染色体のうちの第１の相同染色体であり得、第２の染色体は、２つの相同染色体のうちの第２の相同染色体であり得る。

４１．該標的遺伝子改変が、（１）２つの相同染色体における該対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）第１の染色体における該対象とするゲノム遺伝子座への該第１の核酸の挿入及び第２の染色体における該対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む、実施形態３９に記載の該方法。

８１．該標的遺伝子改変が、（１）２つの相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）第１の染色体における対象とするゲノム遺伝子座への第１の核酸の挿入及び第２の染色体における対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む、実施形態７９に記載の該方法。

実施例２：ラットにおけるゲノム遺伝子座の不活性化
２．１：エンドヌクレアーゼ剤を用いた内因性ゲノム遺伝子座の不活性化
内因性ラットゲノム遺伝子座で突然変異対立遺伝子を導入するために、本明細書に記載されるラットＥＳ細胞は、ＺＦＮ１及び２（またはＴＡＬＥＮ１及び２）を発現する発現ベクター（またはｍＲＮＡ）で電気穿孔される。これらのタンパク質は、約６ｂｐ〜約４０ｂｐだけ離れている、反対のストランド上でそれらの標的配列と結合する。二本鎖切断が、標的遺伝子座内に形成され、細胞が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による修復を試みている。多くの場合、ＮＨＥＪは、欠失の形成をもたらし、しばしば、（ほとんどの場合、フレームシフト突然変異を生じることによって）遺伝子の機能を破壊する。突然変異対立遺伝子を含む陽性クローンを特定するために、薬物選択が行われないので、電気穿孔した細胞を低密度でプレーティングする。コロニーを選出し、突然変異が生じなかったかどうかを確認するために、標的部位でアッセイした（例えば、上述の対立遺伝子（ＭＯＡ）アッセイの改変を用いて）。次いで、突然変異対立遺伝子を含む選択されたＥＳ細胞を宿主ラット胚、例えば、プレ桑実胚期または胞胚期のラット胚に導入し、代理母の子宮内に移植して、創始ラット（Ｆ０ラット）を作製する。続いて、創始ラットを野生型ラットと繁殖させて、突然変異対立遺伝子に対してヘテロ接合性であるＦ１子孫を作製する。ヘテロ接合性のＦ１ラットの交配により、突然変異対立遺伝子に対してホモ接合性の子孫を生み出すことができる。

３．２．（ａ）（ｉ）：ラットアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子座の標的化
ラットアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子座を標的として、ＡｐｏＥ機能を破壊した。ＡｐｏＥ遺伝子座の標的化は、ＡｐｏＥ遺伝子座に相同である５’及び３’相同性アームが隣接するｌａｃＺ−ｈＵｂ−ｎｅｏカセットを含む標的化ベクターを用いて行われた。図２０は、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座が、１．８ｋｂの欠失と、プロタミンプロモータにより駆動されるＣｒｅｉ遺伝子を含む自己欠失カセットをさらに含む、ｌａｃＺ−ｈＵｂ−ｎｅｏカセットの挿入とによって破壊された遺伝子的に改変されたラットのＡｐｏＥ遺伝子座を示す。電気穿孔法の条件は以下の通りであった：６ｕｇ ＤＮＡ、２．０５×１０^６細胞、４００Ｖ、２００ｕＦ：３４２Ｖ、５９３ｕｓｅｃ；２ｉ＋１０ｕＭ ＲＯＣＫｉ中の１５ｃｍの２倍濃厚なｎｅｏＲ ＭＥＦ上にプレーティング。

３．２．（ｂ）（ｉ）：大きな標的化ベクター（ＬＴＣ）を用いたラットアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子座の標的改変
約４５ｋｂのＡｐｏＥ遺伝子座に対して５’相同性アーム及び約２３ｋｂのＡｐｏＥ遺伝子座に対して３’相同性アームが隣接するｌａｃＺ−マウスＰｒｍ１−Ｃｒｅｉカセットを含む大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を用いて、ＡｐｏＥ遺伝子座の標識化が行われる。図２２は、ＡｐｏＥ遺伝子座が、１．８３ｋｂの欠失と、ｌａｃＺ遺伝子ならびにｍＰｒｍ１−Ｃｒｅｉカセット及びｈＵｂ−ｎｅｏ選択カセットを含む自己欠失カセットの挿入とによって破壊されたラットのＡｐｏＥ遺伝子座を示す。実施例３．２（ａ）（ｉ）において用いられる方法を用いて、このベクターをラットＥＳ細胞に導入することができる。

３．３（ａ）：ラットインターロイキン−２受容体ガンマ（ＩＬ２ｒ−γ）遺伝子座の標的化
ラットインターロイキン−２受容体ガンマ（ＩＬ２ｒ−γまたはＩｌ２ｒｇ）遺伝子座を標的として、ＩＬ２ｒ−γ機能を破壊した。ＩＬ２ｒ−γは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１によるシグナル伝達において重要な役割を果たし、ＩＬ２ｒ−γにおける突然変異は、Ｔ、Ｂ、及びＮＫ細胞の成長において著しい欠陥と関連する。

ＩＬ２ｒ−γ遺伝子座の標的化は、図２４に示されるＩＬ２ｒ−γ遺伝子座に相同である５’及び３’相同性アームが隣接するｅＧＦＰ−ｈＵｂ−ｎｅｏカセットを含む標的化ベクターを用いて行われた。図２５は、ラットのＩＬ２ｒ−γ遺伝子座が３．２ｋｂの欠失により破壊されたラットのＩＬ２ｒ−γ遺伝子座のゲノム構造を示す。標的とするＩＬ２ｒ−γ遺伝子座はまた、ｅＧＦＰ遺伝子、ならびにマウスプロタミン１プロモータに作動可能に連結されたＣｒｅｉ及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたｈＵｂプロモータを含む薬物選択カセットを含む自己欠失カセット、からなった。

３．３（ｂ）：ラットインターロイキン−２受容体ガンマ（ＩＬ２ｒ−γ）遺伝子座の標的改変
ラットインターロイキン−２受容体ガンマ（ＩＬ２ｒ−γ）遺伝子座を標的として、ラットにおけるＩＬ２ｒ−γ機能を破壊した。図２５は、ラットＩｌ２ｒｇ遺伝子座のゲノム構造（図２５の上パネル）及び遺伝子座に導入された標的化ベクター（図２５の下パネル）を示す。ｅＧＦＰは、遺伝子的に改変されたラットの免疫表現型がＦＡＣＳを用いて試験され得るように、レポーターとして選択された。自己欠失カセット（ｈＵｂ−Ｎｅｏ、Ｐｒｍ１−Ｃｒｅ）を用いて、薬物選択カセット及びＦ０ラットの雄胚細胞において特異的なＣｒｅ遺伝子を欠失した。さらに、標的化ベクターは、ラットＩｌ２ｒｇ遺伝子の全コード領域（約３．２ｋｂ）を欠失するように設計された。

例えば、本発明は、好ましい実施形態において、以下の項目を提供する。
（項目１）
マウス細胞またはヒト細胞において対象とするゲノム遺伝子座でゲノムを改変するための方法であって、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、前記ゲノムを、Ｃａｓタンパク質、前記対象とするゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含み、
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１０ｋｂであり、前記対象とするゲノム遺伝子座の５’標的配列に相同である５’相同性アーム、及び前記対象とするゲノム遺伝子座の３’標的配列に相同である３’相同性アームが隣接する第１の核酸を含み、前記第１の核酸が、少なくとも３０ｋｂであり、かつ／または前記５’標的配列及び前記３’標的配列が少なくとも３０ｋｂ離れており、
前記ＬＴＶＥＣの存在下で、前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡと接触させた後、前記ゲノムが、前記対象とするゲノム遺伝子座で前記第１の核酸の挿入を含む標的遺伝子改変を含むように改変される、前記方法。
（項目２）
前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び前記ＬＴＶＥＣが、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入される、項目１に記載の前記方法。
（項目３）
前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変を含む、前記改変マウス細胞または前記改変ヒト細胞を特定することをさらに含む、項目１または２に記載の前記方法。
（項目４）
前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、単一転写産物の形態で一緒に導入される、項目２または３に記載の前記方法。
（項目５）
前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、別々に導入される、項目２または３に記載の前記方法。
（項目６）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質が、タンパク質、前記Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または前記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡの形態で、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入され、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入され、かつ
（ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入される、項目２〜５のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目７）
前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、タンパク質−ＲＮＡ複合体として、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入される、項目６に記載の前記方法。
（項目８）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、かつ
（ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする第４の核酸に作動可能に連結された第３のプロモータを含む第３の発現構築物の形態であり、
前記第１、第２、及び第３のプロモータが、前記マウス細胞または前記ヒト細胞において活性である、項目６に記載の前記方法。
（項目９）
前記第１、第２、及び／または第３の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、項目８に記載の前記方法。
（項目１０）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む、第１の発現構築物の形態であり、かつ
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、単一の転写産物において前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む、第２の発現構築物の形態であり、
前記第１及び第２のプロモータが、前記マウス細胞または前記ヒト細胞において活性である、項目６に記載の前記方法。
（項目１１）
前記第１及び前記第２の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、項目１０に記載の前記方法。
（項目１２）
前記標的遺伝子改変が、単一ステップにおける前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、及び前記対象とするゲノム遺伝子座での前記第１の核酸の挿入を同時に含む、項目１〜１１のいずれかに記載の前記方法。
（項目１３）
前記欠失した内因性核酸配列が約３０ｋｂ〜約１１０ｋｂであり、前記挿入された第１の核酸が約４０ｋｂ〜約１４０ｋｂである、項目１２に記載の前記方法。
（項目１４）
前記標的遺伝子改変が、２対立遺伝子の遺伝子改変である、項目１〜１３のいずれかに記載の前記方法。
（項目１５）
前記２対立遺伝子の遺伝子改変が、２つの相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び前記第１の核酸の挿入を含む、項目１４に記載の前記方法。
（項目１６）
前記改変マウス細胞または前記改変ヒト細胞が、前記対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性である、項目１４に記載の前記方法。
（項目１７）
前記改変マウス細胞または前記改変ヒト細胞が、前記対象とするゲノム遺伝子座で半接合性である、項目１４に記載の前記方法。
（項目１８）
１つの染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での前記標的遺伝子改変が、内因性核酸配列の欠失及び前記第１の核酸の挿入を含む、項目１６に記載の前記方法。
（項目１９）
前記標的遺伝子改変が、（１）第１及び第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）前記第１の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座への前記第１の核酸の挿入、及び前記第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む、項目１６に記載の前記方法。
（項目２０）
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、または少なくとも９０ｋｂである、項目１〜１９のいずれかに記載の前記方法。
（項目２１）
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂである、項目１〜２０のいずれかに記載の前記方法。
（項目２２）
前記第１の核酸が、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、または少なくとも３００ｋｂである、項目１〜２１のいずれかに記載の前記方法。
（項目２３）
前記第１の核酸が、約４０ｋｂ〜約１４０ｋｂである、項目１〜２２のいずれかに記載の前記方法。
（項目２４）
前記マウス細胞または前記ヒト細胞が、初代細胞または不死化細胞である、項目１〜２３のいずれかに記載の前記方法。
（項目２５）
前記マウス細胞または前記ヒト細胞が多能性細胞である、項目１〜２３のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目２６）
前記マウス多能性細胞がマウス胚幹（ＥＳ）細胞である、項目２５に記載の前記方法。
（項目２７）
前記ヒト多能性細胞が、ヒト胚幹（ＥＳ）細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限された（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）ヒト前駆細胞、またはヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、項目２５に記載の前記方法。
（項目２８）
前記ヒトｉＰＳ細胞が、基本培地及び補充物を含む培地において維持され、前記培地が、
（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチド、
（ｂ）グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ３）阻害剤、及び
（ｃ）ＭＥＫ阻害剤を含み、
前記培地が、約１７５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項目２７に記載の前記方法。
（項目２９）
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、項目１〜２８のいずれかに記載の前記方法。（項目３０）
前記標的配列には、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直ぐ隣接する、項目１〜２９のいずれかに記載の前記方法。
（項目３１）
前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’相同性アームの合計が、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである、項目１〜３０のいずれかに記載の前記方法。
（項目３２）
前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’相同性アームの合計が、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、または約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂである、項目１〜３１のいずれかに記載の前記方法。
（項目３３）
前記標的遺伝子改変が、
（ａ）相同もしくはオーソロガス核酸配列による内因性核酸配列の置換、
（ｂ）内因性核酸配列の欠失、
（ｃ）内因性核酸配列の欠失であって、
約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、または約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、または約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂの範囲に及ぶ、内因性核酸配列の欠失、
（ｄ）外因性核酸配列の挿入、
（ｅ）約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、または約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲に及ぶ、外因性核酸配列の挿入、
（ｆ）相同もしくはオーソロガス核酸配列を含む外因性核酸配列の挿入、
（ｇ）ヒト及び非ヒト核酸配列を含むキメラ核酸配列の挿入、
（ｈ）部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接する条件付き対立遺伝子の挿入、
（ｉ）前記多能性細胞において活性なプロモータに作動可能に連結された選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子の挿入、または、
（ｊ）それらの組み合わせ、を含む、項目１〜３２のいずれかに記載の前記方法。
（項目３４）
前記５’標的配列及び前記３’標的配列が、少なくとも５ｋｂであるが３Ｍｂ未満だけ離れている、項目１〜３３のいずれかに記載の前記方法。
（項目３５）
前記５’標的配列及び前記３’標的配列が、少なくとも５ｋｂであるが１０ｋｂ未満、少なくとも１０ｋｂであるが２０ｋｂ未満、少なくとも２０ｋｂであるが４０ｋｂ未満、少なくとも４０ｋｂであるが６０ｋｂ未満、少なくとも６０ｋｂであるが８０ｋｂ未満、少なくとも約８０ｋｂであるが１００ｋｂ未満、少なくとも１００ｋｂであるが１５０ｋｂ未満、または少なくとも１５０ｋｂであるが２００ｋｂ未満、少なくとも約２００ｋｂであるが約３００ｋｂ未満、少なくとも約３００ｋｂであるが約４００ｋｂ未満、少なくとも約４００ｋｂであるが約５００ｋｂ未満、少なくとも約５００ｋｂであるが約１Ｍｂ未満、少なくとも約１Ｍｂであるが約１．５Ｍｂ未満、少なくとも約１．５Ｍｂであるが約２Ｍｂ未満、少なくとも約２Ｍｂであるが約２．５Ｍｂ未満、または少なくとも約２．５Ｍｂであるが約３Ｍｂ未満だけ離れている、項目１〜３４のいずれかに記載の前記方法。
（項目３６）
前記５’標的配列及び前記３’標的配列が、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂだけ離れている、項目１〜３５のいずれかに記載の前記方法。
（項目３７）
前記５’標的配列及び前記３’標的配列が、約３０ｋｂ〜約１１０ｋｂだけ離れている、項目１〜３６のいずれかに記載の前記方法。
（項目３８）
前記対象とするゲノム遺伝子座が、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、ＡｐｏＥ遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座及びＲａｇ２遺伝子座の両方、Ａｄａｍｔｓ５遺伝子座、Ｔｒｐａ１遺伝子座、Ｆｏｌｈ１遺伝子座、Ｅｒｂｂ４遺伝子座、Ｌｒｐ５遺伝子座、Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子座、Ｒｏｒ１遺伝子座、またはＤｐｐ４遺伝子座を含む、項目１〜３７のいずれかに記載の前記方法。
（項目３９）
前記対象とするゲノム遺伝子座が、染色体外ＤＮＡを含む、項目１〜３８のいずれかに記載の前記方法。
（項目４０）
対象とするゲノム遺伝子座で標的遺伝子改変を含むＦ０世代マウスを生み出すための方法であって、
（ａ）改変マウスＥＳ細胞を形成するために、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、マウスＥＳ細胞における前記ゲノムを、Ｃａｓタンパク質、前記対象とするゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることであって、
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１０ｋｂであり、前記対象とするゲノム遺伝子座の５’標的配列に相同である５’相同性アーム、及び前記対象とするゲノム遺伝子座の３’標的配列に相同である３’相同性アームが隣接する第１の核酸を含み、前記第１の核酸が、少なくとも３０ｋｂであり、かつ／または前記５’標的配列及び前記３’標的配列が少なくとも３０ｋｂ離れている、接触させることと、
（ｂ）前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変を含む前記改変マウスＥＳ細胞を特定することと、
（ｃ）前記改変マウスＥＳ細胞をマウス宿主胚に導入することと、
（ｄ）代理母において前記マウス宿主胚を懐胎させることと、を含み、
前記代理母が、前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変を含む前記Ｆ０世代マウスを生み出す、前記方法。
（項目４１）
前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、単一転写産物の形態で一緒に導入される、項目４０に記載の前記方法。
（項目４２）
前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、別々に導入される、項目４０に記載の前記方法。
（項目４３）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質が、タンパク質、前記Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または前記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡの形態で、前記マウスＥＳ細胞に導入され、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で、前記マウスＥＳ細胞に導入され、かつ
（ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で、前記マウスＥＳ細胞に導入される、項目４０〜４２のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目４４）
前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、タンパク質−ＲＮＡ複合体として、前記マウスＥＳ細胞に導入される、項目４３に記載の前記方法。
（項目４５）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、かつ
（ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする第４の核酸に作動可能に連結された第３のプロモータを含む第３の発現構築物の形態であり、
前記第１、第２、及び第３のプロモータが、前記マウスＥＳ細胞において活性である、項目４３に記載の前記方法。
（項目４６）
前記第１、第２、及び第３の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、項目４５に記載の前記方法。
（項目４７）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む、第１の発現構築物の形態であり、かつ
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、単一の転写産物において前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む、第２の発現構築物の形態であり、
前記第１及び第２のプロモータが、前記マウスＥＳ細胞において活性である、項目４３に記載の前記方法。
（項目４８）
前記第１及び前記第２の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、項目４７に記載の前記方法。
（項目４９）
前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、及び前記対象とするゲノム遺伝子座での前記第１の核酸の挿入を同時に含む、項目４０〜４８のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目５０）
前記標的遺伝子改変が、２対立遺伝子の遺伝子改変である、項目４０〜４９のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目５１）
前記２対立遺伝子の遺伝子改変が、２つの相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び前記第１の核酸の挿入を含む、項目５０に記載の前記方法。
（項目５２）
前記改変マウスＥＳ細胞が、前記対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性である、項目５０に記載の前記方法。
（項目５３）
前記改変マウスＥＳ細胞が、前記対象とするゲノム遺伝子座で半接合性である、項目５０に記載の前記方法。
（項目５４）
１つの染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での前記標的遺伝子改変が、内因性核酸配列の欠失及び前記第１の核酸の挿入を含む、項目５２に記載の前記方法。
（項目５５）
前記標的遺伝子改変が、（１）第１及び第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）前記第１の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座への前記第１の核酸の挿入及び前記第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む、項目５２に記載の前記方法。
（項目５６）
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、項目４０〜５５のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目５７）
真核細胞において対象とするゲノム遺伝子座でゲノムを改変するための方法であって、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、前記ゲノムを、Ｃａｓタンパク質、前記対象とするゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含み、
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１０ｋｂであり、前記対象とするゲノム遺伝子座の５’標的配列に相同である５’相同性アーム、及び前記対象とするゲノム遺伝子座の３’標的配列に相同である３’相同性アームが隣接する第１の核酸を含み、前記第１の核酸が、少なくとも３０ｋｂであり、かつ／または前記５’標的配列及び前記３’標的配列が少なくとも３０ｋｂ離れており、
前記真核細胞がラット細胞ではなく、
前記ＬＴＶＥＣの存在下で、前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡと接触させた後、前記ゲノムが、前記対象とするゲノム遺伝子座での前記第１の核酸の挿入を含む標的遺伝子改変を含むように改変される、前記方法。
（項目５８）
前記非ラット真核細胞が、多能性細胞、非多能性細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、または線維芽細胞である、項目５７に記載の前記方法。
（項目５９）
前記非ラット真核細胞が、初代細胞または不死化細胞である、項目５７に記載の前記方法。

Claims (58)

1. 多能性細胞における対象とするゲノム遺伝子座でのゲノムを改変するためのインビトロの方法であって、
   前記多能性細胞に、Ｃａｓ９タンパク質、前記対象とするゲノム遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ標的配列にハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を導入することを含み、
   前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１０ｋｂのサイズであり、かつ
   （ｉ）前記対象とするゲノム遺伝子座の５’標的配列に相同である５’相同性アーム；及び
   （ｉｉ）前記対象とするゲノム遺伝子座の３’標的配列に相同である３’相同性アームが隣接する挿入核酸を含み、
   前記多能性細胞は、非ヒト哺乳動物多能性細胞またはヒト誘導多能性幹細胞であり、
   前記多能性細胞に、前記Ｃａｓ９タンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び前記ＬＴＶＥＣを導入した後、前記多能性細胞のゲノムが、前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の少なくとも３０ｋｂの欠失及び／または前記対象とするゲノム遺伝子座の前記挿入核酸の少なくとも３０ｋｂの挿入を含む標的遺伝子改変を含むように改変され、ここで、前記標的遺伝子改変が前記対象とするゲノム遺伝子座の前記挿入核酸の少なくとも３０ｋｂの挿入を含む場合、前記ＬＴＶＥＣは少なくとも３０ｋｂの大きさである、方法。
2. 前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを含む単一の核酸分子として導入される、請求項１に記載の方法。
3. 前記単一の核酸分子が、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の形態で一緒に融合した前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、別々に導入される、請求項１に記載の方法。
5. （ａ）前記Ｃａｓ９タンパク質が、タンパク質、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡの形態で導入され、
   （ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で導入され、かつ
   （ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で導入される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記Ｃａｓ９タンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、タンパク質−ＲＮＡ複合体として導入される、請求項５に記載の方法。
7. （ａ）前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする第１の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、
   （ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする第２の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、かつ
   （ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第３のプロモータを含む第３の発現構築物の形態であり、
   ここで、前記第１、第２、及び第３のプロモータが、前記多能性細胞において活性であり、
   前記第１、第２及び第３の発現構築物は、単一の核酸分子上にあるか、または複数の核酸分子上にある、請求項５に記載の方法。
8. （ａ）前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする第１の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、かつ
   （ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡをコードする第２の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、
   ここで、前記第１及び第２のプロモータが、前記多能性細胞において活性であり、
   前記第１及び第２の発現構築物は、単一の核酸分子上にあるか、または別々の核酸分子上にある、請求項５に記載の方法。
9. 前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、及び前記対象とするゲノム遺伝子座での前記挿入核酸の挿入を同時に含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記欠失した内因性核酸配列が３０ｋｂ〜１１０ｋｂであり、前記挿入核酸が４０ｋｂ〜１４０ｋｂである、請求項９に記載の方法。
11. 前記標的遺伝子改変が、２対立遺伝子の遺伝子改変である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記２対立遺伝子の遺伝子改変が、２つの相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び前記挿入核酸の挿入を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記改変多能性細胞が、前記対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性であるか、または半接合性である、請求項１１に記載の方法。
14. １つの染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での前記標的遺伝子改変が、内因性核酸配列の欠失及び前記挿入核酸の挿入を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記標的遺伝子改変が、（１）第１及び第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）前記第１の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座への前記挿入核酸の挿入、及び前記第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも４０ｋｂであるか；あるいは
    前記標的遺伝子改変が、目的のゲノム遺伝子座の領域の欠失を含み、ここで、前記欠失が少なくとも３０ｋｂであり、かつ前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１５ｋｂである、
    請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記標的遺伝子改変が、前記挿入核酸の挿入を含み、前記挿入核酸が、少なくとも４０ｋｂであるか；あるいは
    前記標的遺伝子改変が、対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失および前記挿入核酸の挿入を含み、ここで、前記欠失が少なくとも３０ｋｂであり、かつ前記挿入核酸が、少なくとも１０ｋｂである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記挿入核酸が、４０ｋｂ〜１４０ｋｂである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記ＣＲＩＳＰＲ標的配列には、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直ぐ隣接する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’相同性アームの合計が、１０ｋｂ〜１５０ｋｂである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’相同性アームの合計が、３０ｋｂ〜１５０ｋｂである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記ＬＴＶＥＣが、１００ｋｂ〜３００ｋｂの長さである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記標的遺伝子改変が、
    （ａ）相同またはオーソロガス核酸配列による内因性核酸配列の置換、
    （ｂ）内因性核酸配列の欠失、
    （ｃ）内因性核酸配列の欠失であって、
    少なくとも３０ｋｂ〜３Ｍｂの範囲に及ぶ、内因性核酸配列の欠失、
    （ｄ）外因性核酸配列の挿入、
    （ｅ）少なくとも３０ｋｂ〜４００ｋｂの範囲に及ぶ、外因性核酸配列の挿入、
    （ｆ）相同またはオーソロガス核酸配列を含む外因性核酸配列の挿入、
    （ｇ）ヒト及び非ヒト核酸配列を含むキメラ核酸配列の挿入、
    （ｈ）部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接する条件付き対立遺伝子の挿入、
    （ｉ）前記多能性細胞において活性なプロモータに作動可能に連結された選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子の挿入、あるいは、
    （ｊ）それらの組み合わせ、を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失を含み、
    前記欠失が、少なくとも４０ｋｂであるか；あるいは
    前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座における前記挿入核酸の挿入および前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失を含み、前記挿入は少なくとも３０ｋｂであり、かつ前記欠失は、少なくとも１０ｋｂである、
    請求項１〜２３のいずれか1項に記載の方法。
25. 欠失する前記ゲノム遺伝子座の領域が、３０ｋｂ〜１１０ｋｂである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失と、前記挿入核酸の前記対象とするゲノム遺伝子座での挿入とを含み、前記欠失が少なくとも３０ｋｂであり、かつ前記挿入が少なくとも３０ｋｂである、請求項１〜２５のいずれか1項に記載の方法。
27. 前記ＬＴＶＥＣが１００ｋｂ〜３００ｋｂであり、前記５’及び前記３’相同性アームの合計が、３０ｋｂ〜１５０ｋｂであり、前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失と、前記挿入核酸の前記対象とするゲノム遺伝子座での挿入とを含み、前記欠失が３０ｋｂ〜１１０ｋｂであり、前記挿入が４０ｋｂ〜１４０ｋｂである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記対象とするゲノム遺伝子座が、前記多能性細胞に対して内因性である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記対象とするゲノム遺伝子座が、前記多能性細胞の前記ゲノムに組み込まれたＤＮＡの異種または外因性セグメントを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
30. 前記対象とするゲノム遺伝子座が、免疫グロブリン遺伝子座である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記免疫グロブリン遺伝子座が、哺乳動物免疫グロブリン重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする、請求項３０に記載の方法。
32. 前記免疫グロブリン遺伝子座が、哺乳動物免疫グロブリン軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする、請求項３０に記載の方法。
33. 前記免疫グロブリン遺伝子座が、再配列されない哺乳動物λ及び／またはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む、請求項３２に記載の方法。
34. 前記免疫グロブリン遺伝子座が、再配列される哺乳動物λ及び／またはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む、請求項３２に記載の方法。
35. 前記対象とするゲノム遺伝子座が、Ｔ細胞受容体遺伝子座である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
36. 前記Ｔ細胞受容体遺伝子座が、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子座である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記対象とするゲノム遺伝子座が、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、ＡｐｏＥ遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座及びＲａｇ２遺伝子座の両方、Ａｄａｍｔｓ５遺伝子座、Ｔｒｐａ１遺伝子座、Ｆｏｌｈ１遺伝子座、Ｅｒｂｂ４遺伝子座、Ｌｒｐ５遺伝子座、Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子座、Ｒｏｒ１遺伝子座、またはＤｐｐ４遺伝子座を含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
38. 前記挿入核酸が、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするゲノム核酸配列を含む、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
39. 前記挿入核酸が、Ｖ _Ｈ １−２、Ｖ _Ｈ １−３、Ｖ _Ｈ １−８、Ｖ _Ｈ １−１８、Ｖ _Ｈ １−２４、Ｖ _Ｈ １−４５、Ｖ _Ｈ １−４６、Ｖ _Ｈ １−５８、Ｖ _Ｈ １−６９、Ｖ _Ｈ ２−５、Ｖ _Ｈ ２−２６、Ｖ _Ｈ ２−７０、Ｖ _Ｈ ３−７、Ｖ _Ｈ ３−９、Ｖ _Ｈ ３−１１、Ｖ _Ｈ ３−１３、Ｖ _Ｈ ３−１５、Ｖ _Ｈ ３−１６、Ｖ _Ｈ ３−２０、Ｖ _Ｈ ３−２１、Ｖ _Ｈ ３−２３、Ｖ _Ｈ ３−３０、Ｖ _Ｈ ３−３０−３、Ｖ _Ｈ ３−３０−５、Ｖ _Ｈ ３−３３、Ｖ _Ｈ ３−３５、Ｖ _Ｈ ３−３８、Ｖ _Ｈ ３−４３、Ｖ _Ｈ ３−４８、Ｖ _Ｈ ３−４９、Ｖ _Ｈ ３−５３、Ｖ _Ｈ ３−６４、Ｖ _Ｈ ３−６６、Ｖ _Ｈ ３−７２、Ｖ _Ｈ ３−７３、Ｖ _Ｈ ３−７４、Ｖ _Ｈ ４−４、Ｖ _Ｈ ４−２８、Ｖ _Ｈ ４−３０−１、Ｖ _Ｈ ４−３０−２、Ｖ _Ｈ ４−３０−４、Ｖ _Ｈ ４−３１、Ｖ _Ｈ ４−３４、Ｖ _Ｈ ４−３９、Ｖ _Ｈ ４−５９、Ｖ _Ｈ ４−６１、Ｖ _Ｈ ５−５１、Ｖ _Ｈ ６−１、Ｖ _Ｈ ７−４−１、Ｖ _Ｈ ７−８１、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の機能的なヒトＶ _Ｈ 遺伝子セグメントを含む、請求項３８に記載の方法。
40. 前記挿入核酸が、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−１４、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−１２、Ｄ５−５、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ６−２５、Ｄ７−２７、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の機能的なヒトＤ遺伝子セグメントを含む、請求項３８または３９に記載の方法。
41. 前記挿入核酸が、Ｊ _Ｈ １、Ｊ _Ｈ ２、Ｊ _Ｈ ３、Ｊ _Ｈ ４、Ｊ _Ｈ ５、Ｊ _Ｈ ６、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の機能的なＪ _Ｈ 遺伝子セグメントを含む、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
42. 前記挿入核酸が、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするゲノム核酸配列を含む、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
43. 前記挿入核酸が、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９、Ｖκ２−４０、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントを含む、請求項４２に記載の方法。
44. 前記挿入核酸が、Ｖλ３−１、Ｖλ４−３、Ｖλ２−８、Ｖλ３−９、Ｖλ３−１０、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１９、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−２２、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２５、Ｖλ３−２７またはそれらの組み合わせを含む１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、請求項４２または４３に記載の方法。
45. 前記挿入核酸が、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
46. 前記挿入核酸が、ヒトＴ細胞受容体の少なくとも１つの領域をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
47. 前記Ｔ細胞受容体が、Ｔ細胞受容体アルファである、請求項４６に記載の方法。
48. 前記挿入核酸が、少なくとも１つの疾患対立遺伝子を含む、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
49. 前記挿入核酸が、ヒト遺伝子の少なくとも１つのヒト疾患対立遺伝子を含む、請求項４８に記載の方法。
50. 前記多能性細胞が非ヒト哺乳動物多能性細胞であり、前記標的遺伝子改変により、（ａ）相同もしくはオーソロガスなヒト核酸配列の挿入、（ｂ）相同もしくはオーソロガスなヒト核酸配列による内因性核酸配列の置換、または（ｃ）それらの組み合わせを含むヒト化ゲノム遺伝子座がもたらされる、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
51. 前記多能性細胞が非ヒト哺乳動物多能性細胞であり、前記標的遺伝子改変が、相同もしくはオーソロガスなヒト核酸配列による内因性核酸配列の置換を含む、請求項５０に記載の方法。
52. 前記哺乳動物多能性細胞が、ヒト誘導多能性幹細胞である、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
53. 前記ヒト誘導多能性幹細胞が、基本培地及び補充物を含む培地において維持され、前記培地は、
    （ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチド、
    （ｂ）グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ３）阻害剤、及び
    （ｃ）ＭＥＫ阻害剤
    を含み、前記基本培地は、１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項５２に記載の方法。
54. 前記哺乳動物多能性細胞が、齧歯類多能性細胞である、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
55. 前記齧歯類多能性細胞が、ラット胚幹（ＥＳ）細胞またはマウスＥＳ細胞である、請求項５４に記載の方法。
56. 前記齧歯類多能性細胞が、ラットＥＳ細胞である、請求項５５に記載の方法。
57. 前記ラットＥＳ細胞は、分裂期に不活性化したマウス胎児線維芽細胞のフィーダー細胞層上で、表３に示される２ｉ培地により、胚盤胞副産物を培養することによって得ることができ、
    前記ラットＥＳ細胞は、ｃ−Ｍｙｃの発現を欠き、
    前記ラットＥＳ細胞は、培養物中で浮遊する球形コロニーを形成し、
    前記ラットＥＳ細胞は、正常な核型を有し、
    前記標的遺伝子改変は、生殖細胞系列を通して伝達されることが可能である、請求項５６に記載の方法。
58. （ａ）前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変を含む、改変されたラットＥＳ細胞を特定することと、
    （ｂ）前記改変されたラットＥＳ細胞をラット宿主胚に導入することと、
    （ｃ）代理母において前記ラット宿主胚を懐胎させることと
    をさらに含み、前記代理母が、前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変を含むＦ０世代ラットを生み出す、請求項５６または５７に記載の方法。