JP2014147400A - メタクリル酸の産生のための微生物 - Google Patents

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Abstract

【課題】メタクリル酸の産生のための微生物の提供。
【解決手段】本発明は、２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸経路を有する、天然に存在しない微生物体を提供する。微生物体は、２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸経路中の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含有する。本発明は、２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸を生成する方法をさらに提供する。この方法は、十分な量で２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を発現する、２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸を生成する微生物体を培養し、２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間培養することを含むことができる。
【選択図】なし

Description

発明の背景
本願は、２００８年５月１日に出願された米国仮特許出願第６１／０４９，７３０号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
本発明は、一般に生合成プロセスに、より具体的にはメタクリル酸、２−ヒドロキシイソブチレートおよび３−ヒドロキシイソブチレートの生合成能力を有する生物体に関する。
メチルメタクリレートは、式ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯ２ＣＨ３を有する有機化合物である。この無色の液体は、メタクリル酸（ＭＭＡ）のメチルエステルであり、透明なプラスチックであるポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）を生成するためのモノマーである。メチルメタクリレート（ＭＭＡ）は、世界的な需要が１年当たり４５億ポンドを超える重要な中間化学物質であり、その多くはポリアクリレートに変換される。
ほとんどの商業的生産体は、アセトンシアノヒドリン（ＡＣＨ）経路を適用してメタクリル酸（ＭＡＡ）を生成し、アセトンおよびシアン化水素を原料とする。この中間体シアノヒドリンは、硫酸を用いてメタクリルアミドの硫酸エステルに変換され、その加水分解により重硫酸アンモニウムおよびＭＡＡが得られる。一部の生産体は、イソブチレン、または同等のｔｅｒｔ−ブタノールから開始し、それは酸化されてメタクロレインになり、さらに酸化されてメタクリル酸になる。次いでＭＡＡはメタノールでエステル化されてＭＭＡになる。
アセトンシアノヒドリン経路を使用する従来の生成プロセスでは、シアン化水素（ＨＣＮ）およびアセトンがアセトンシアノヒドリンに変換され、次いで酸の補助による加水分解を受け、メタノールでのエステル化によりＭＭＡが得られる。潜在的に致死性のあるＨＣＮの取り扱いが難点であるとともに、副産物の廃棄のコストが高い（ＭＭＡ１トン当たり１．２トンの重硫酸アンモニウムが形成される）ことが、よりクリーンで経済的なプロセスを目的とする非常に多くの研究の契機となった。いくつかの新たなプロセスが過去２０年間に商業化されており、さらに多くのプロセスが商業化に近づいている。イソブチレンを酸化してメタクロレインにし、次いでそれをメタノールと混合し、空気で酸化し、エステル化してＭＭＡにする、Ａｓａｈｉの「Ｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｔｈａ」経路が、経済的なプロセスとして記載されている。
メチルメタクリレートの主な適用例は、ポリメチルメタクリレートアクリルプラスチックの生産である。また、メチルメタクリレートは、ＰＶＣの改質剤として使用されるコポリマーのメチルメタクリレート−ブタジエン−スチレン（ＭＢＳ）の生産にも使用される。メチルメタクリレートポリマーおよびコポリマーは、ラテックス塗料などの水性コーティングに使用される。接着剤においても使用が見出される。現代の適用例には、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）コンピュータおよびＴＶスクリーンにわたって光の広がりを均一に維持するプレートにおける使用がある。メチルメタクリレートは、心臓の冠状動脈などの解剖学的臓器の腐食鋳型にも使用される。
メタクリル酸、または２−メチル−２−プロペン酸は、ローマカミツレの油中に少量で天然に存在する低分子量のカルボン酸である。それは、刺激性の不快なにおいを有する腐食性の液体である。それは、温水に溶解性であり、ほとんどの有機溶媒と混和性がある。
メタクリル酸は、加熱、または触媒作用のある量のＨＣｌなどの強酸での処理後に容易に重合する。得られたポリマーは、セラミックに見えるプラスチックである。メタクリル酸は、上記で論じたメチルメタクリレートなど、まとめてメタクリレートとして公知であるそのエステルの調製において産業上使用される。メタクリレートは、最も顕著にはＬｕｃｉｔｅ（商標）およびＰｌｅｘｉｇｌａｓ（商標）などの商品名を有するポリマーの製造において多数の用途を有する。
ＭＭＡポリマー以外で、この産業の他の主要な製品は、粗製メタクリル酸（粗製ＭＡＡ、図１）であり、ＭＭＡの総生産の約２０パーセントを占める。粗製ＭＡＡは処理されてブチルメタクリレートおよび／または高度に精製された粗製ＭＡＡである「精」ＭＡＡとなる。精ＭＡＡは、様々なポリマーにおけるコモノマーとして直接使用することができ、種々の少量のメタクリレートの作製にも使用される。その一方で、ＭＡＡは、メタノールでのエステル化を介してＭＭＡに変換することもできる。
したがって、商業的な量のメタクリル酸、２−ヒドロキシイソブチレートまたは３−ヒドロキシイソブチレートなどの化合物を有効に生成する代替方法の必要性が存在する。本発明はこの必要性を満たし、関連する利点も提供する。
本発明は、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体を提供する。微生物体は、メタクリル酸経路中の酵素をコードする少なくとも１つの外因性の核酸を含有する。本発明は、メタクリル酸を生成する方法をさらに提供する。この方法は、メタクリル酸を生成する微生物体を培養することを含むことができ、微生物体は、メタクリル酸を生成する条件下および十分な期間、メタクリル酸を生成するのに十分な量で、メタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を発現する。本発明はまた、メタクリル酸前駆体の３−ヒドロキシイソブチレートおよび２−ヒドロキシイソブチレートのための生物体および生成方法についても記載する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、メタクリル酸経路を有する微生物体を含み、前記メタクリル酸経路が、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む微生物体。
（項目２）
前記メタクリル酸経路が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼをさらに含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目３）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目４）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目５）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目６）
前記４つの外因性核酸が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目５に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目７）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする５つの外因性核酸を含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目８）
前記メタクリル酸経路が、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼをさらに含む、項目７に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目９）
前記５つの外因性核酸が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目８に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１０）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目１に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１１）
実質的に嫌気性の培地中にある、項目１に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１２）
クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸リアーゼ、リンゴ酸シンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼから選択される少なくとも１つの酵素の活性を増加させる遺伝子改変をさらに含み、活性の増加が、前記遺伝子改変が存在しない状態と比べた増加である、項目１に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１３）
メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、項目１に記載の天然に存在しない微生物体を培養することを含む方法。
（項目１４）
前記天然に存在しない微生物体が実質的に嫌気性の培地中にある、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
前記４つの外因性核酸が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする５つの外因性核酸を含む、項目１３に記載の方法。
（項目２０）
前記メタクリル酸経路が、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼをさらに含む、項目１９に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２１）
前記５つの外因性核酸が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目１３に記載の方法。
（項目２３）
天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、メタクリル酸経路を有する微生物体を含み、前記メタクリル酸経路が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む微生物体。
（項目２４）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目２３に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２５）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目２３に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２６）
前記３つの外因性核酸が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目２５に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２７）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目２３に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２８）
前記メタクリル酸経路が、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼをさらに含む、項目２７に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２９）
前記４つの外因性核酸が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目２７に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目３０）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目２３に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目３１）
実質的に嫌気性の培地中にある、項目２３に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目３２）
クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸リアーゼ、リンゴ酸シンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼから選択される少なくとも１つの酵素の活性を増加させる遺伝子改変をさらに含み、活性の増加が、前記遺伝子改変が存在しない状態と比べた増加である、項目２３に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目３３）
メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、項目２３に記載の天然に存在しない微生物体を培養することを含む方法。
（項目３４）
前記天然に存在しない微生物体が実質的に嫌気性の培地中にある、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
前記３つの外因性核酸が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３９）
前記メタクリル酸経路が、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼをさらに含む、項目３８に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目４０）
前記４つの外因性核酸が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目３３に記載の方法。
（項目４２）
天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、メタクリル酸経路を有する微生物体を含み、前記メタクリル酸経路が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼを含む微生物体。
（項目４３）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目４２に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目４４）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目４２に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目４５）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目４２に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目４６）
前記４つの外因性核酸が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼをコードする、項目４５に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目４７）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする５つの外因性核酸を含む、項目４２に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目４８）
前記メタクリル酸経路が、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼをさらに含む、項目４７に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目４９）
前記５つの外因性核酸が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼをコードする、項目４８に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目５０）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目４２に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目５１）
実質的に嫌気性の培地中にある、項目４２に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目５２）
クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸リアーゼ、リンゴ酸シンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼから選択される少なくとも１つの酵素の活性を増加させる遺伝子改変をさらに含み、活性の増加が、前記遺伝子改変が存在しない状態と比べた増加である、項目４２に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目５３）
メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、項目４２に記載の天然に存在しない微生物体を培養することを含む方法。
（項目５４）
前記天然に存在しない微生物体が実質的に嫌気性の培地中にある、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目５３に記載の方法。
（項目５７）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目５３に記載の方法。
（項目５８）
前記４つの外因性核酸が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼをコードする、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする５つの外因性核酸を含む、項目５３に記載の方法。
（項目６０）
前記メタクリル酸経路が、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼをさらに含む、項目５９に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目６１）
前記５つの外因性核酸が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼをコードする、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目５３に記載の方法。
（項目６３）
天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、メタクリル酸経路を有する微生物体を含み、前記メタクリル酸経路が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む微生物体。
（項目６４）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目６３に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目６５）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目６３に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目６６）
前記３つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目６３に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目６７）
前記３つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目６３に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目６８）
前記３つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目６３に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目６９）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目６３に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目７０）
実質的に嫌気性の培地中にある、項目６３に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目７１）
クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸リアーゼ、リンゴ酸シンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼから選択される少なくとも１つの酵素の活性を増加させる遺伝子改変をさらに含み、活性の増加が、前記遺伝子改変が存在しない状態と比べた増加である、項目６３に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目７２）
メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、項目６３に記載の天然に存在しない微生物体を培養することを含む方法。
（項目７３）
前記天然に存在しない微生物体が実質的に嫌気性の培地中にある、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目７２に記載の方法。
（項目７５）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目７２に記載の方法。
（項目７６）
前記３つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記３つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目７５に記載の方法。
（項目７８）
前記３つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目７５に記載の方法。
（項目７９）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目７２に記載の方法。
（項目８０）
天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、メタクリル酸経路を有する微生物体を含み、前記メタクリル酸経路が、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸ムターゼ、３−メチルアスパルターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼを含む微生物体。
（項目８１）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目８０に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目８２）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目８０に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目８３）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目８０に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目８４）
前記４つの外因性核酸が、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸ムターゼ、３−メチルアスパルターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼをコードする、項目８３に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目８５）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目８０に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目８６）
実質的に嫌気性の培地中にある、項目８０に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目８７）
メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、項目８０に記載の天然に存在しない微生物体を培養することを含む方法。
（項目８８）
前記天然に存在しない微生物体が実質的に嫌気性の培地中にある、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目８７に記載の方法。
（項目９０）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目８７に記載の方法。
（項目９１）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目８７に記載の方法。
（項目９２）
前記４つの外因性核酸が、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸ムターゼ、３−メチルアスパルターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼをコードする、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目８７に記載の方法。
（項目９４）
天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、メタクリル酸経路を有する微生物体を含み、前記メタクリル酸経路が、アルファ−ケトグルタル酸レダクターゼ、２−ヒドロキシグルタミン酸ムターゼ、３−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼを含む微生物体。
（項目９５）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目９４に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目９６）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目９４に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目９７）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目９４に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目９８）
前記４つの外因性核酸が、アルファ−ケトグルタル酸レダクターゼ、２−ヒドロキシグルタミン酸ムターゼ、３−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼをコードする、項目９７に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目９９）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目９４に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１００）
実質的に嫌気性の培地中にある、項目９４に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１０１）
メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、項目９４に記載の天然に存在しない微生物体を培養することを含む方法。
（項目１０２）
前記天然に存在しない微生物体が実質的に嫌気性の培地中にある、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目１０１に記載の方法。
（項目１０４）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目１０１に記載の方法。
（項目１０５）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目１０１に記載の方法。
（項目１０６）
前記４つの外因性核酸が、アルファ−ケトグルタル酸レダクターゼ、２−ヒドロキシグルタミン酸ムターゼ、３−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼをコードする、項目１０１に記載の方法。
（項目１０７）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目１０１に記載の方法。
（項目１０８）
天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、メタクリル酸経路を有する微生物体を含み、前記メタクリル酸経路が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼを含む微生物体。
（項目１０９）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目１０８に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１１０）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目１０８に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１１１）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目１０８に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１１２）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする５つの外因性核酸を含む、項目１０８に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１１３）
前記５つの外因性核酸が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする、項目１１２に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１１４）
前記５つの外因性核酸が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼをコードする、項目１１２に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１１５）
前記５つの外因性核酸が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼをコードする、項目１１２に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１１６）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目１０８に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１１７）
実質的に嫌気性の培地中にある、項目１０８に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１１８）
メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、項目１０８に記載の天然に存在しない微生物体を培養することを含む方法。
（項目１１９）
前記天然に存在しない微生物体が実質的に嫌気性の培地中にある、項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目１１８に記載の方法。
（項目１２１）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目１１８に記載の方法。
（項目１２２）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目１１８に記載の方法。
（項目１２３）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする５つの外因性核酸を含む、項目１１８に記載の方法。
（項目１２４）
前記５つの外因性核酸が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする、項目１２３に記載の方法。
（項目１２５）
前記５つの外因性核酸が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼをコードする、項目１２３に記載の方法。
（項目１２６）
前記５つの外因性核酸が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼをコードする、項目１２３に記載の方法。
（項目１２７）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目１１８に記載の方法。
（項目１２８）
天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、メタクリル酸経路を有する微生物体を含み、前記メタクリル酸経路が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む微生物体。
（項目１２９）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目１２８に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１３０）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目１２８に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１３１）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目１２８に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１３２）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする５つの外因性核酸を含む、項目１２８に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１３３）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする６つの外因性核酸を含む、項目１２８に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１３４）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする７つの外因性核酸を含む、項目１２８に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１３５）
前記７つの外因性核酸が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目１３４に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１３６）
前記７つの外因性核酸が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目１３４に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１３７）
前記７つの外因性核酸が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目１３４に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１３８）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目１２８に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１３９）
実質的に嫌気性の培地中にある、項目１２８に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１４０）
メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、項目１２８に記載の天然に存在しない微生物体を培養することを含む方法。
（項目１４１）
前記天然に存在しない微生物体が実質的に嫌気性の培地中にある、項目１４０に記載の方法。
（項目１４２）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目１４０に記載の方法。
（項目１４３）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目１４０に記載の方法。
（項目１４４）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目１４０に記載の方法。
（項目１４５）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする５つの外因性核酸を含む、項目１４０に記載の方法。
（項目１４６）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする６つの外因性核酸を含む、項目１４０に記載の方法。
（項目１４７）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする７つの外因性核酸を含む、項目１４０に記載の方法。
（項目１４８）
前記７つの外因性核酸が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目１４７に記載の方法。
（項目１４９）
前記７つの外因性核酸が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目１４７に記載の方法。
（項目１５０）
前記７つの外因性核酸が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする、項目１４７に記載の方法。
（項目１５１）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目１４０に記載の方法。
（項目１５２）
天然に存在しない微生物体であって、３−ヒドロキシイソ酪酸を生成するのに十分な量で発現される３−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、３−ヒドロキシイソ酪酸経路を有する微生物体を含み、前記３−ヒドロキシイソ酪酸経路が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼおよび３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼを含む微生物体。
（項目１５３）
それぞれ３−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目１５２に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１５４）
前記２つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼおよび３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼをコードする、項目１５３に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１５５）
前記２つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼおよび３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼをコードする、項目１５３に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１５６）
前記２つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼおよび３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする、項目１５３に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１５７）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目１５２に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１５８）
実質的に嫌気性の培地中にある、項目１５２に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１５９）
クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸リアーゼ、リンゴ酸シンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼから選択される少なくとも１つの酵素の活性を増加させる遺伝子改変をさらに含み、活性の増加が、前記遺伝子改変が存在しない状態と比べた増加である、項目１５２に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１６０）
３−ヒドロキシイソ酪酸を生成する方法であって、３−ヒドロキシイソ酪酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、項目１５２に記載の天然に存在しない微生物体を培養することを含む方法。
（項目１６１）
前記天然に存在しない微生物体が実質的に嫌気性の培地中にある、項目１６０に記載の方法。
（項目１６２）
前記微生物体が、それぞれ３−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目１６０に記載の方法。
（項目１６３）
前記２つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼおよび３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼをコードする、項目１６２に記載の方法。
（項目１６４）
前記２つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼおよび３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼをコードする、項目１６２に記載の方法。
（項目１６５）
前記２つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼおよび３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする、項目１６２に記載の方法。
（項目１６６）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目１６０に記載の方法。
（項目１６７）
天然に存在しない微生物体であって、２−ヒドロキシイソ酪酸を生成するのに十分な量で発現される２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、２−ヒドロキシイソ酪酸経路を有する微生物体を含み、前記２−ヒドロキシイソ酪酸経路が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼを含む微生物体。
（項目１６８）
それぞれ２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目１６７に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１６９）
それぞれ２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目１６７に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１７０）
それぞれ２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目１６７に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１７１）
前記４つの外因性核酸が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする、項目１７０に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１７２）
前記４つの外因性核酸が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼをコードする、項目１７０に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１７３）
前記４つの外因性核酸が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼをコードする、項目１７０に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１７４）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目１６７に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１７５）
実質的に嫌気性の培地中にある、項目１６７に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１７６）
２−ヒドロキシイソ酪酸を生成する方法であって、２−ヒドロキシイソ酪酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、項目１６７に記載の天然に存在しない微生物体を培養することを含む方法。
（項目１７７）
前記天然に存在しない微生物体が実質的に嫌気性の培地中にある、項目１７６に記載の方法。
（項目１７８）
前記微生物体が、それぞれ２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目１７６に記載の方法。
（項目１７９）
前記微生物体が、それぞれ２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目１７６に記載の方法。
（項目１８０）
前記微生物体が、それぞれ２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目１７６に記載の方法。
（項目１８１）
前記４つの外因性核酸が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする、項目１８０に記載の方法。
（項目１８２）
前記４つの外因性核酸が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼをコードする、項目１８０に記載の方法。
（項目１８３）
前記４つの外因性核酸が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼをコードする、項目１８０に記載の方法。
（項目１８４）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目１７６に記載の方法。
（項目１８５）
天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、メタクリル酸経路を有する微生物体を含み、前記メタクリル酸経路が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼのいずれかを含む微生物体。
（項目１８６）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目１８５に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１８７）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目１８５に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１８８）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目１８５に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１８９）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする５つの外因性核酸を含む、項目１８５に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１９０）
前記５つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼをコードする、項目１８９に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１９１）
前記５つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼをコードする、項目１８９に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１９２）
前記５つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする、項目１８９に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１９３）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目１８５に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１９４）
実質的に嫌気性の培地中にある、項目１８５に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１９５）
クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸リアーゼ、リンゴ酸シンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼから選択される少なくとも１つの酵素の活性を増加させる遺伝子改変をさらに含み、活性の増加が、前記遺伝子改変が存在しない状態と比べた増加である、項目１８５に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目１９６）
メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、項目１８５に記載の天然に存在しない微生物体を培養することを含む方法。
（項目１９７）
前記天然に存在しない微生物体が実質的に嫌気性の培地中にある、項目１９６に記載の方法。
（項目１９８）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目１９６に記載の方法。
（項目１９９）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目１９６に記載の方法。
（項目２００）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目１９６に記載の方法。
（項目２０１）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする５つの外因性核酸を含む、項目１９６に記載の方法。
（項目２０２）
前記５つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼをコードする、項目２０１に記載の方法。
（項目２０３）
前記５つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼをコードする、項目２０１に記載の方法。
（項目２０４）
前記５つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする、項目２０１に記載の方法。
（項目２０５）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目１９６に記載の方法。
（項目２０６）
天然に存在しない微生物体であって、２−ヒドロキシイソ酪酸を生成するのに十分な量で発現される２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、２−ヒドロキシイソ酪酸経路を有する微生物体を含み、前記２−ヒドロキシイソ酪酸経路が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼのいずれかを含む微生物体。
（項目２０７）
それぞれ２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目２０６に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２０８）
それぞれ２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目２０６に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２０９）
それぞれ２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目２０６に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２１０）
前記４つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼをコードする、項目２０９に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２１１）
前記４つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼをコードする、項目２０９に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２１２）
前記４つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする、項目２０９に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２１３）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目２０６に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２１４）
実質的に嫌気性の培地中にある、項目２０６に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２１５）
２−ヒドロキシイソ酪酸を生成する方法であって、２−ヒドロキシイソ酪酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、項目２０６に記載の天然に存在しない微生物体を培養することを含む方法。
（項目２１６）
前記天然に存在しない微生物体が実質的に嫌気性の培地中にある、項目２１５に記載の方法。
（項目２１７）
前記微生物体が、それぞれ２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目２１５に記載の方法。
（項目２１８）
前記微生物体が、それぞれ２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目２１５に記載の方法。
（項目２１９）
前記微生物体が、それぞれ２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする４つの外因性核酸を含む、項目２１５に記載の方法。
（項目２２０）
前記４つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼをコードする、項目２１９に記載の方法。
（項目２２１）
前記４つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼをコードする、項目２１９に記載の方法。
（項目２２２）
前記４つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする、項目２１９に記載の方法。
（項目２２３）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目２１５に記載の方法。
（項目２２４）
天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、メタクリル酸経路を有する微生物体を含み、前記メタクリル酸経路が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼを含む微生物体。
（項目２２５）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目２２４に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２２６）
それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目２２４に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２２７）
前記３つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、メタクリリルＣｏＡシンテターゼ、および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼをコードする、項目２２４に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２２８）
前記３つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、メタクリリルＣｏＡヒドロラーゼ、および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼをコードする、項目２２４に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２２９）
前記３つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、メタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼをコードする、項目２２４に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２３０）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目２２４に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２３１）
実質的に嫌気性の培地中にある、項目２２４に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２３２）
クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸リアーゼ、リンゴ酸シンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼから選択される少なくとも１つの酵素の活性を増加させる遺伝子改変をさらに含み、活性の増加が、前記遺伝子改変が存在しない状態と比べた増加である、項目２２４に記載の天然に存在しない微生物体。
（項目２３３）
メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、項目２２４に記載の天然に存在しない微生物体を培養することを含む方法。
（項目２３４）
前記天然に存在しない微生物体が実質的に嫌気性の培地中にある、項目２３３に記載の方法。
（項目２３５）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、項目２３３に記載の方法。
（項目２３６）
前記微生物体が、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む、項目２３３に記載の方法。
（項目２３７）
前記３つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、メタクリリルＣｏＡシンテターゼ、および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼをコードする、項目２３６に記載の方法。
（項目２３８）
前記３つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、メタクリリルＣｏＡヒドロラーゼ、および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼをコードする、項目２３６に記載の方法。
（項目２３９）
前記３つの外因性核酸が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、メタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼをコードする、項目２３６に記載の方法。
（項目２４０）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目２３３に記載の方法。
（項目２４１）
天然に存在しない微生物体であって、タンパク質または酵素をコードする遺伝子中に生じている１つまたは複数の遺伝子破壊を含み、前記１つまたは複数の遺伝子破壊が前記生物体における３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸の生成の増加を付与する微生物体。
（項目２４２）
３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸の生成が増殖連結型である、項目２４１に記載の天然に存在しない生物体。
（項目２４３）
３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸の生成が増殖連結型でない、項目２４１に記載の天然に存在しない生物体。
（項目２４４）
前記１つまたは複数の遺伝子破壊が表１０または１１に列挙したタンパク質または酵素をコードする、項目２４１に記載の天然に存在しない生物体。
（項目２４５）
前記１つまたは複数の遺伝子破壊が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼおよびアセトアルデヒドＣｏＡデヒドロゲナーゼからなる群から選択されるタンパク質または酵素をコードする、項目２４１に記載の天然に存在しない生物体。
（項目２４６）
アスパルターゼ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰシンターゼ、ホスホエノールピルビン酸：ピルビン酸ホスホトランスフェラーゼ系、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、酢酸キナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＨデヒドロゲナーゼからなる群から選択されるタンパク質または酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子破壊をさらに含む、項目２４５に記載の天然に存在しない生物体。
（項目２４７）
前記１つまたは複数の遺伝子破壊が、前記１つまたは複数の遺伝子の欠失を含む、項目２４１に記載の生物体。
（項目２４８）
前記細胞が実質的に嫌気性の培地中にある、項目２４１に記載の生物体。
（項目２４９）
３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸を生成する方法であって、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、項目２４１に記載の天然に存在しない微生物体を培養することを含む方法。
（項目２５０）
３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸の生成が増殖連結型である、項目２４９に記載の方法。
（項目２５１）
３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸の生成が増殖連結型でない、項目２４９に記載の方法。
（項目２５２）
前記１つまたは複数の遺伝子破壊が表１０または１１に列挙したタンパク質または酵素をコードする、項目２４９に記載の方法。
（項目２５３）
前記１つまたは複数の遺伝子破壊が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼおよびアセトアルデヒドＣｏＡデヒドロゲナーゼからなる群から選択されるタンパク質または酵素をコードする、項目２４９に記載の生物体。
（項目２５４）
アスパルターゼ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰシンターゼ、ホスホエノールピルビン酸：ピルビン酸ホスホトランスフェラーゼ系、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、酢酸キナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＨデヒドロゲナーゼからなる群から選択されるタンパク質または酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子破壊をさらに含む、項目２５３に記載の生物体。
（項目２５５）
前記培養が実質的に嫌気性の培地中で行われる、項目２４９に記載の方法。
（項目２５６）
前記１つまたは複数の遺伝子破壊が、前記１つまたは複数の遺伝子の欠失を含む、項目２４９に記載の方法。
図１は、メタクリル酸（ＭＡＡ）の構造を示す図である。 図２は、３−ヒドロキシイソブチレートを介するスクシニルＣｏＡからＭＭＡへの例示的な代謝経路を示す図である。 図３は、公知の酵素触媒脱水と、３−ヒドロキシイソブチレートの脱水について予測される変換との比較を示す図である。図３Ａは、２−（ヒドロキシメチル）グルタル酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）による２−ヒドロキシメチルグルタレートの転換を示す。図３Ｂは、フマル酸ヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．２）によるマレートからフマレートへの脱水を示す。図３Ｃは、３−ヒドロキシイソブチレートからＭＡＡへの予測される脱水を示す。 図４は、３−アミノ−２−メチルプロピオネートを介するスクシニルＣｏＡからＭＡＡへの例示的な経路を示す図である。「集中反応」（段階２〜３）は、１）メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼおよび２）メチルマロニルＣｏＡレダクターゼによって触媒される。 図５は、フマレートを形成するアスパルテートの公知の酵素触媒脱アミノ化（図５Ａ、ＥＣ４．３．１．１）と、ＭＡＡへの３−アミノ−２−メチルプロピオネートの予測される脱アミノ化（図５Ｂ）との比較を示す図である。 図６は、３−ヒドロキシイソブチレートまたはメタクリリルＣｏＡを介して進行する４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＭＡＡへの例示的な経路を示す図である。段階２は、３つの代替酵素：３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼによって触媒され得る。同様に、段階５は、３つの代替酵素：メタクリリルＣｏＡシンテターゼ、メタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼによって触媒され得る。 図７は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡへの転換を触媒する酵素の候補の比較を示す図である。候補メチルムターゼによってコードされる経路：図７Ａ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＣＭ、ＥＣ５．４．９９．２）；図７Ｂ、イソブチリルＣｏＡムターゼ（ＩＣＭ、ＥＣ５．４．９９．１３）；図７Ｃ、図６の段階１で提唱された予測される変換。 図８は、トレオ−３−メチルアスパルテートを介するアルファ−ケトグルタレートからＭＡＡへの例示的な経路を示す図である。 図９は、公知の酵素触媒脱カルボキシル化と、メサコネートの予測される脱カルボキシル化との比較を示す図である。図９Ａは、アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）によって触媒される、アコニテートからイコニテートへの変換を示す。図９Ｂは、４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７７）による４−オキサロクロトネートから２−オキソペンテノエートへの脱カルボキシル化を示す。図９Ｃは、ＭＡＡを形成する、メサコネートの予測される脱カルボキシル化を示す。 図１０は、２−ヒドロキシグルタレートを介するアルファ−ケトグルタレートからＭＡＡへの例示的な経路を示す図である。 図１１は、３−メチルマレートからメサコネートに転換する酵素の候補を示す図である。図１１Ａは、２−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３４）によって触媒される、２−メチルマレートからメサコネートへの変換を示す。図１１Ｂは、フマル酸ヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．２）によるマレートからフマレートへの脱水を示す。図１１Ｃは、３−メチルマレートからメサコネートへの予測される脱水を示す。 図１２は、アセチルＣｏＡまたは４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＭＡＡまたは２−ヒドロキシイソブチレートへの転換の例示的な代謝経路を示す図である。 図１３は、アセチルＣｏＡからＭＡＡへの例示的な経路を示す図である。 図１４は、アクリリルＣｏＡからＭＡＡへの例示的な経路を示す図である。 図１５は、２−ケトバレレートからＭＡＡへの例示的な経路を示す図である。２−ケトイソバレレートは、バリンまたはピルベートから生成することができる。ピルベートから２−ケトイソバレレートに転換する酵素の例示的なセットは、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼからなる。 図１６は、典型的な非増殖連結型生成株と比較した、ＯｐｔＫｎｏｃｋ設計株の仮想の生成エンベロープを示す図である。対角線の右側の領域は、典型的な生成株に関連し、対角線の左側は、ＯｐｔＫｎｏｃｋ設計株を表す。ＯｐｔＫｎｏｃｋ株の潜在的な進化軌跡は、高生産性の表現型につながるという点で根本的に異なる。影付きの領域内にある白丸は、増殖選択前を表す。影付きの領域の頂点にある丸（ＯｐｔＫｎｏｃｋではＢ、典型的な生成株ではＡ）は、増殖選択後の表現型を表す。 図１７は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ（黒色）と比較した、優先度の最も高いノックアウト株の設計（灰色）の増殖連結型のＭＡＡおよび３−ヒドロキシイソブチレート生成の特徴を示す図である。１０ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／時間のグルコース取り込み速度が想定される。 図１８は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ（黒色）と比較した、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＭＡＡへの経路で優先度の最も高いノックアウト株（灰色）の増殖連結型のＭＡＡ生成の特徴を示す図である。１０ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／時間のグルコース取り込み速度が想定される。
本発明は、メタクリル酸の生合成的生成能力を有する細胞および生物体の設計および生成を対象とする。本明細書に記載の結果は、代謝経路を設計し、組換えにより工学的に操作して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよび他の細胞または生物体でメタクリル酸の生合成を行うことができることを示す。メタクリル酸の生合成的生成は、設計された代謝遺伝型を有する株の構築によって確認することができる。理論的な最大増殖に達する条件下でを含めて、代謝について工学的に操作されたこれらの細胞または生物体を適応進化に曝してメタクリル酸生合成をさらに増強することもできる。
本明細書で開示されるように、再生可能な糖フィードストックからの発酵を介して２−メタクリル酸を生成する生物体および方法が提供される。スクシニルＣｏＡ、アルファ−ケトグルタレート、アセチルＣｏＡ、または他の中心的な代謝前駆体からＭＡＡを生成する高収率の代謝経路が本明細書に記載される。発酵的ＭＡＡ生成を実施する経路、その最大の生成物およびＡＴＰ収率、ならびに候補遺伝子が本明細書で開示される。
３−ヒドロキシイソブチレート中間体を通過する経路を、下流の酵素、すなわちデヒドラターゼを除外した場合に、メタクリレート生成ではなく３−ヒドロキシイソブチレート生成に適用できることが理解される（図２および６を参照）。この場合、天然に存在しない生物体は、メタクリレートの代わりに３−ヒドロキシイソブチレートを生成する。あるいは、天然に存在しない生物体は、３−ヒドロキシイソブチレートおよびメタクリレートの混合物を生成し得る。メタクリレートまたは３−ヒドロキシイソブチレートが生成するかどうかにかかわらず、ＡＴＰおよび生成物の最大モル収率は変化しない。２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ中間体を通過する経路を、下流の酵素、すなわちデヒドラターゼを除外し、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼ、またはヒドロラーゼを適用した場合に、メタクリレート生成ではなく２−ヒドロキシイソブチレート生成に適用できることも理解される（図１２を参照）。この場合、天然に存在しない生物体は、メタクリレートの代わりに２−ヒドロキシイソブチレートを生成する。あるいは、天然に存在しない生物体は、２−ヒドロキシイソブチレートおよびメタクリレートの混合物を生成し得る。メタクリレートまたは２−ヒドロキシイソブチレートが生成するかどうかにかかわらず、ＡＴＰおよび生成物の最大モル収率は変化しない。
所望により、本発明の微生物体によって発現された３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸をメタクリル酸に化学的に転換できることがさらに理解される。例えば米国特許第７，１８６，８５６号に記載のように、例えば３−ヒドロキシイソ酪酸またはβ−ヒドロキシイソ酪酸を脱水してメタクリル酸を形成することができる。米国特許第３，６６６，８０５号および米国特許第５，２２５，５９４号に記載のように、２−ヒドロキシイソ酪酸またはα−ヒドロキシイソ酪酸を脱水してメタクリル酸を形成することもできる。
実施例ＩおよびＩＩＩに記載する、スクシニルＣｏＡから始まる２つの経路、ならびに実施例ＶおよびＸＩＸに記載する、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから始まる２つの経路は、嫌気的条件下での高収率（１．３３ｍｏｌ／ｍｏｌグルコース）、好ましいエネルギー特性、および適切な酵素候補の利用可能性をもたらす。原料としてグルコースから開始するメタクリレートの最大理論収率は、下記に示すように１．３３ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースである：
Ｃ６Ｈ１２Ｏ６→１．３３Ｃ４Ｈ６Ｏ２＋０．６７ＣＯ２＋２Ｈ２Ｏ
実施例ＶＩＩ、ＩＸおよびＸＩに記載する３つのさらなる経路は、好気的条件下で高収率でありエネルギー的に好ましい。これらの経路は、開始材料としてアルファ−ケトグルタレート（実施例ＶＩＩおよびＩＸ）またはアセチルＣｏＡ（実施例ＸＩ）から始まる。
実施例ＸＩＩＩ〜ＸＶに記載する３つのさらなる経路のもたらす収率は低い。代替のアセチルＣｏＡ経路（実施例ＸＩＩＩ）は好気的条件下で高収率であるが冗長であり、最低でも７つの酵素段階が関与する。アクリリルＣｏＡ経路（実施例ＸＩＶ）は、嫌気的条件および好気的条件下で高収率であるが、好ましくないエネルギー特性、毒性のある中間体（アクリリルＣｏＡ）の形成、および発酵副産物の分泌に対する高い感受性という不利な点を有する。２−ケトイソバレレート経路は好気的条件下で高収率であるが、潜在的に毒性のある中間体（ＭＡＡ−ＣｏＡ）を生成する不利な点も有する（実施例ＸＶ）。
本明細書で用いるように、本発明の微生物の生物体または微生物に関して用いられる場合、用語「天然に存在しない」は、その微生物の生物体が、その参照種の野生型株を含むその参照種の天然株で通常見られない、少なくとも１つの遺伝的変化を有することを意味するものとする。遺伝的変化には、例えば、代謝ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を導入する改変、他の核酸の付加、核酸欠失および／または微生物遺伝物質の他の機能的破壊が含まれる。そのような改変には、例えば、参照種の異種の、同種の、または異種および同種のポリペプチドのコード領域およびその機能的断片が含まれる。追加の改変には、例えば、その改変が遺伝子またはオペロンの発現を変化させる非コード調節領域が含まれる。例示的な代謝ポリペプチドには、メタクリル酸生合成経路内の酵素が含まれる。
代謝改変は、その天然の状態から変更された生化学反応を指す。したがって、天然に存在しない微生物は、代謝ポリペプチドまたはその機能的断片をコードする核酸に対する遺伝子改変を有することができる。例示的な代謝改変が、本明細書で開示される。
本明細書で用いるように、微生物の生物体に関して用いられる場合、用語「単離された」は、参照の微生物の生物体が天然で見られるような少なくとも１つの成分を実質的に含まない生物体を意味するものとする。本用語は、その天然環境で見られるような一部または全ての成分が除去されている微生物の生物体を含む。本用語は、その微生物の生物体が天然に存在しない環境で見られるような一部または全ての成分が除去されている微生物の生物体も含む。したがって、単離された微生物の生物体は、それが天然で見られるか、またはそれが天然に存在しない環境で増殖され、保存されるか生存するような他の物質から一部または完全に分離される。単離された微生物の生物体の具体例には、部分的に純粋な微生物、実質的に純粋な微生物、および天然に存在しない培地で培養された微生物が含まれる。
本明細書で用いるように、用語「微生物の」、「微生物の生物体」または「微生物」は、古細菌、細菌または真核生物のドメインに含まれる、微視的細胞として存在する任意の生物体を意味するものとする。したがって、本用語は、顕微鏡的大きさを有する原核生物または真核生物の細胞または生物体を包含するものとし、全ての種類の細菌、古細菌および真正細菌、ならびに酵母および真菌類などの真核生物の微生物を含む。本用語は、生化学物質の生成のために培養することができる、任意の種の細胞培養物も含む。
本明細書で用いるように、化学式ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯ２（図１を参照）を有する「メタクリル酸」（ＩＵＰＡＣ名２−メチル−２−プロペン酸）は、メタクリレートの酸の形態であり、メタクリル酸およびメタクリレートは、その任意の塩の形態を含めて、その中性またはイオン化形態のいずれかの化合物を指すのに全体にわたって交換可能な形で使用できることが理解される。特定の形態がｐＨに依存することが当業者により理解される。
同様に、２−ヒドロキシイソブチレートおよび２−ヒドロキシイソ酪酸が、その任意の塩の形態を含めて、その中性またはイオン化形態のいずれかの化合物を指すのに全体にわたって交換可能な形で使用できることが理解される。さらに、３−ヒドロキシイソブチレートおよび３−ヒドロキシイソ酪酸は、その任意の塩の形態を含めて、その中性またはイオン化形態のいずれかの化合物を指すのに全体にわたって交換可能な形で使用することができる。
本明細書で用いるように、用語「ＣｏＡ」または「補酵素Ａ」は、活性酵素系を形成するためにその存在が多くの酵素（アポ酵素）の活性のために必要とされる、有機コファクターまたは補欠分子族（酵素の非タンパク部分）を意味するものとする。補酵素Ａは、特定の縮合酵素で機能し、アセチルまたは他のアシル基転移、ならびに脂肪酸合成および酸化、ピルベート酸化ならびに他のアセチル化で作用する。
本明細書で用いるように、培養または増殖条件に関して用いられる場合、用語「実質的に嫌気性」は、酸素の量が、液体培地中の溶存酸素の飽和量の約１０％未満であることを意味するものとする。本用語は、約１％未満の酸素の雰囲気で維持される、液体または固体培地の密封チャンバー、も含むものとする。
本明細書で用いる「外因性」は、参照分子または参照活性が宿主の微生物の生物体に導入されることを意味するものとする。分子は、例えば、宿主染色体への組込みなどによる宿主遺伝物質へのコード核酸の導入によって、またはプラスミドなどの非染色体遺伝物質として導入することができる。したがって、コード核酸の発現に関して用いられる本用語は、微生物の生物体への発現可能な形でのコード核酸の導入を指す。生合成活性に関して用いられる場合、本用語は、宿主参照生物体に導入される活性を指す。供給源は、例えば、宿主の微生物の生物体への導入の後に参照活性を発現する、同種または異種のコード核酸であってよい。したがって、用語「内因性」は、宿主に存在する参照分子または活性を指す。同様に、コード核酸の発現に関して用いられる場合、本用語は、微生物の生物体に含まれるコード核酸の発現を指す。用語「異種の」は、参照種以外の供給源に由来する分子または活性を指し、「同種の」は、宿主の微生物の生物体に由来する分子または活性を指す。したがって、本発明のコード核酸の外因性の発現は、異種または同種のコード核酸のいずれかまたは両方を利用することができる。
本発明の天然に存在しない微生物の生物体は安定した遺伝的変化を含むことができ、それは変化を失わずに５世代を超えて培養することができる微生物を指す。一般に、安定した遺伝的変化には、１０世代を超えて存続する改変が含まれ、特に安定した改変は約２５世代を超えて存続し、より詳しくは、安定した遺伝子改変は無期限を含めて５０世代を超える。
当業者は、本明細書で例示される代謝改変を含む遺伝的変化が、Ｅ．ｃｏｌｉなどの適切な宿主生物体およびそれらの対応する代謝反応、または所望の遺伝物質、例えば所望の代謝経路の遺伝子に適する供給源生物体に関して記載されることを理解するであろう。しかし、多種多様な生物体の完全なゲノム配列決定およびゲノミクスの領域における高レベルの技術を考慮して、当業者は、本明細書で提供される教示および指針を事実上他の全ての生物体に適用することが容易にできる。例えば、本明細書で例示したＥ．ｃｏｌｉの代謝改変は、参照種以外の種からの同じであるか類似したコード核酸を組み込むことによって、他の種に容易に適用することができる。そのような遺伝的変化には、例えば、一般には種のホモログの遺伝的変化、より詳細には、オルソログ、パラログまたは非オルソロガスな遺伝子置換が含まれる。
オルソログは、垂直伝達（ｖｅｒｔｉｃａｌ ｄｅｓｃｅｎｔ）が関係し、異なる生物体での実質的に同じか同一の機能の役割を担う１つまたは複数の遺伝子である。例えば、マウスエポキシドヒドロラーゼおよびヒトエポキシドヒドロラーゼは、エポキシドの加水分解の生物学的機能のためのオルソログと考えることができる。遺伝子は、例えば、それらが同種であるか共通祖先からの進化によって関係していることを示すのに十分な量の配列類似性をそれらが共有する場合、垂直伝達が関係している。それらが、一次配列類似性が識別可能でない程度までそれらが共通祖先から進化したことを示すのに十分な量の三次元構造を共有するが必ずしも配列類似性を共有しない場合にも、遺伝子はオルソログと考えることができる。オルソロガスである遺伝子は、約２５％〜１００％アミノ酸配列同一性の配列類似性を有するタンパク質をコードすることができる。それらの三次元構造も類似性を示す場合、２５％未満のアミノ酸類似性を共有するタンパク質をコードする遺伝子も、垂直伝達によって生じたと考えることができる。組織プラスミノーゲン活性化因子およびエラスターゼを含む、酵素のセリンプロテアーゼファミリーのメンバーは、共通祖先から垂直伝達によって生じたと考えられる。
オルソログには、例えば進化を通して構造または全体的活性が異なった、遺伝子またはそれらのコードされた遺伝子生成物が含まれる。例えば、１つの種が２つの機能を示す遺伝子生成物をコードし、そのような機能が第２の種の異なる遺伝子に分離されている場合、３つの遺伝子およびそれらの対応する生成物はオルソログであるとみなされる。生化学生成物の生成については、当業者は、天然に存在しない微生物の構築のために、導入または破壊される代謝活性を抱えているオルソロガス遺伝子が選択されるべきであることを理解するであろう。分離できる活性を示すオルソログの例は、異なる活性が２つ以上の種の間で、または単一の種の中で異なる遺伝子生成物に分離されている場合である。具体例は、セリンプロテアーゼ活性の２つの型であるエラスターゼタンパク質分解およびプラスミノーゲンタンパク質分解の、プラスミノーゲン活性化因子およびエラスターゼのような異なる分子への分離である。第２の例は、マイコプラズマ５’−３’エキソヌクレアーゼおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性の分離である。第１の種からのＤＮＡポリメラーゼは、第２の種からのエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼの一方または両方にオルソログであると、またはその逆とみなすことができる。
対照的に、パラログは、例えば複製とそれに続く進化的分岐によって関係があるホモログであり、類似または共通しているが、同一でない機能を有する。パラログは、例えば、同じ種または異なる種を起源とするかそれに由来することができる。例えば、ミクロソームのエポキシドヒドロラーゼ（エポキシドヒドロラーゼＩ）および可溶性のエポキシドヒドロラーゼ（エポキシドヒドロラーゼＩＩ）は、同じ種で異なる反応を触媒し、異なる機能を有する、共通祖先から共進化した２つの異なる酵素を表すので、パラログと考えることができる。パラログは、かなりの相互配列類似性を有する同じ種からのタンパク質であり、共通祖先からの共進化を通してそれらが相同であるか関係することを示唆している。パラロガスのタンパク質ファミリー群には、ＨｉｐＡホモログ、ルシフェラーゼ遺伝子、ペプチダーゼなどが含まれる。
非オルソロガス遺伝子置換は、異なる種の参照遺伝子機能の代わりになることができる、１つの種からの非オルソロガス遺伝子である。置換には、例えば、異なる種での参照機能と比較して、起源種で実質的に同じかまたは類似した機能を発揮することができるものが含まれる。一般に、非オルソロガス遺伝子置換は、参照機能をコードする公知の遺伝子に構造的に関係することを確認することが可能であるが、より構造的に関係しないが機能的に類似した遺伝子およびそれらの対応する遺伝子生成物も、本明細書で用いられるような用語の意味の範囲内である。例えば、機能的類似性は、置換しようとする機能をコードする遺伝子と比較して、非オルソロガス遺伝子生成物の活性部位または結合性領域において少なくとも多少の構造類似性を要求する。したがって、非オルソロガス遺伝子には、例えばパラログまたは無関係な遺伝子が含まれる。
したがって、メタクリル酸生合成能力を有する本発明の天然に存在しない微生物の生物体を特定し、構築することにおいて、特定の種に本明細書で提供される教示および指針を適用することで、当業者は、代謝改変の特定にはオルソログの特定および組入れまたは不活化を含めることができることを理解する。パラログおよび／または非オルソロガスな遺伝子置換が、類似したか実質的に類似した代謝反応を触媒する酵素をコードする参照微生物に存在する範囲内において、当業者はこれらの進化関係の遺伝子を利用することもできる。
オルソログ、パラログおよび非オルソロガスな遺伝子置換は、当業者に周知である方法によって決定することができる。例えば、２つのポリペプチドのための核酸またはアミノ酸配列の検査は、比較される配列間の配列の同一性および類似性を明らかにする。そのような類似性に基づいて、タンパク質が共通祖先からの進化を通して関係していることを示すのにその類似性が十分に高いかどうか、当業者は決定することができる。当業者に周知であるアルゴリズム、例えばＡｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗなどは、生の配列の類似性または同一性を比較、決定し、さらに、重みまたはスコアを割り当てることができる配列中のギャップの存在または重要性を決定する。そのようなアルゴリズムは当技術分野でも公知であり、ヌクレオチド配列の類似性または同一性を決定することに同様に適用できる。関連性を決定するのに十分な類似性のパラメータは、統計的類似性、またはランダムなポリペプチド中で類似したマッチを見出す可能性、および決定されるマッチの有意性を計算するための周知の方法に基づいて計算される。所望により、２つ以上の配列のコンピュータによる比較を、当業者が視覚的に最適化することもできる。関係する遺伝子生成物またはタンパク質は、高い類似性、例えば２５％〜１００％の配列同一性を有すると予想することができる。無関係であるタンパク質は、十分なサイズのデータベースをスキャンする場合に偶然に起こることが予想されるのと事実上同じである同一性を有することができる（約５％）。５％から２４％の間の配列は、比較する配列が関係していると結論するのに十分な相同性を表すことができるか、表すことができない。これらの配列の関連性を決定するために、データセットのサイズを前提とするそのようなマッチの有意性を決定する追加の統計分析を実施することができる。
例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて２つ以上の配列の関連性を決定するための例示的なパラメータは、下に示すようなものでよい。簡単に述べると、アミノ酸配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．８（１９９９年１月５日）および以下のパラメータを用いて実施することができる：マトリックス：０ ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１１；ギャップ伸長：１；ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０；予想：１０．０；ワードサイズ：３；フィルター：オン。核酸配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）および以下のパラメータを用いて実施することができる：マッチ：１；ミスマッチ：−２；ギャップオープン：５；ギャップ伸長：２；ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０；予想：１０．０；ワードサイズ：１１；フィルター：オフ。当業者は、例えば、比較のストリンジェンシーを増加または低減させ、２つ以上の配列の関連性を決定するために、どのような改変を上記のパラメータに加えることができるかを知るであろう。
本明細書で開示されるように、炭素基質としてグルコース／スクロースを使用して２−メタクリル酸（ＭＡＡ）を合成する高収率の代謝経路について記載する。これらの経路を分析し順位付ける２つの主な基準は、好気的条件下および嫌気的条件下の両方におけるＭＡＡの最大理論収率および関連するエネルギー特性であった。Ｒｅｅｄら（Ｒｅｅｄら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．４巻、Ｒ５４頁（２００３年））に記載のものと類似するＳｉｍＰｈｅｎｙ（商標）において問題の経路をＥ．ｃｏｌｉの化学量論ネットワークに加えることによって生成物およびエネルギー収率を計算した。ＭＡＡは生理的条件下では荷電分子であるため、生成物の搬出は、プロトン共輸送の機構により媒介されることが想定される。この輸送機構は、酸性の発酵条件下では熱力学的に好ましくない状態となるが、中性近くの発酵条件で熱力学的制限に遭遇することは予想されていない。経路中の反応および必要な酵素活性については実施例中で論じる。
本発明は、メタクリル酸を生成することができる天然に存在しない微生物体を提供する。例えば、スクシニルＣｏＡが前駆体であるメタクリル酸経路が提供される（実施例Ｉ〜ＩＶ、図２および４を参照）。一実施形態では、本発明は、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む微生物体を提供する（実施例ＩおよびＩＩならびに図２を参照）。別の実施形態では、本発明は、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む微生物体を提供する（実施例Ｉを参照）。本発明は、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼを含む微生物体をさらに提供する（実施例ＩＩＩおよびＩＶならびに図４を参照）。
前駆体として４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを有するメタクリル酸経路を含有する天然に存在しない微生物体がさらに提供される。１つのそのような実施形態は、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む微生物体である（実施例ＶおよびＶＩならびに図６を参照）。あるいは、この経路は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ；およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼを含み得る。
さらに、本発明は、前駆体として４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを有する３−ヒドロキシイソ酪酸経路を含有する天然に存在しない微生物体を提供する。１つのそのような実施形態は、３−ヒドロキシイソ酪酸経路を有する天然に存在しない微生物体であって、３−ヒドロキシイソ酪酸を生成するのに十分な量で発現される３−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、３−ヒドロキシイソ酪酸経路が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ；および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼを含む微生物体である（実施例Ｖおよび図６を参照）。
本発明は、前駆体としてアルファ−ケトグルタレートを有するメタクリル酸経路を含有する天然に存在しない微生物体をさらに提供する。１つのそのような実施形態は、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸ムターゼ、３−メチルアスパルターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼを含む微生物体である（実施例ＶＩＩおよびＶＩＩＩならびに図８を参照）。さらに別の実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、メタクリル酸経路を有する微生物体を含み、メタクリル酸経路が、アルファ−ケトグルタル酸レダクターゼ、２−ヒドロキシグルタミン酸ムターゼ、３−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼを含む微生物体を提供する（実施例ＩＸおよびＸならびに図１０を参照）。
さらに別の実施形態では、本発明は、前駆体としてアセチルＣｏＡを有するメタクリル酸経路を含有する天然に存在しない微生物体を提供する。例えば、本発明は、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼを含む微生物体を提供する（実施例ＸＩおよびＸＩＩならびに図１２を参照）。別の実施形態では、本発明は、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む微生物体を提供する（実施例ＸＩおよびＸＩＩを参照）。
さらに別の実施形態では、本発明は、前駆体としてアセチルＣｏＡを有する２−ヒドロキシイソ酪酸経路を含有する天然に存在しない微生物体を提供する。例えば、本発明は、２−ヒドロキシイソ酪酸経路を有する天然に存在しない微生物体であって、２−ヒドロキシイソ酪酸を生成するのに十分な量で発現される２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、２−ヒドロキシイソ酪酸経路が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ；アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ；および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼを含む微生物体を提供する（実施例ＸＩおよび図１２を参照）。
さらなる実施形態では、本発明は、前駆体として４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを有するメタクリル酸または２−ヒドロキシイソ酪酸経路を含有する天然に存在しない微生物体を提供する。例えば、本発明は、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ；ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ；２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ；およびメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼを含む微生物体を提供する（実施例ＸＶＩＩＩおよび図１２を参照）。さらに、本発明は、２−ヒドロキシイソ酪酸経路を有する天然に存在しない微生物体であって、２−ヒドロキシイソ酪酸を生成するのに十分な量で発現される２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、２−ヒドロキシイソ酪酸経路が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ；ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ；および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼを含む微生物体を提供する（実施例ＸＶＩＩＩおよび図１２を参照）。
さらに別の実施形態では、本発明は、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、イソブチリルＣｏＡムターゼ、イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼを含む微生物体を提供する（実施例ＸＩＩＩおよび図１３を参照）。
本発明は、前駆体としてピルベートを有するメタクリル酸経路を含有する天然に存在しない微生物体をさらに提供する。例えば、本発明は、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、乳酸デヒドロゲナーゼ、ラクテートＣｏＡトランスフェラーゼ、ラクトイルＣｏＡデヒドラターゼ、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む微生物体を提供する（実施例ＸＩＶおよび図１４を参照）。
前駆体として２−ケトイソバレレートを有するメタクリル酸経路を含有する天然に存在しない微生物体も本発明によって提供される。例えば、本発明は、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、バリンアミノトランスフェラーゼ、２−ケトイソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼを含む微生物体を提供する（実施例ＸＶおよび図１５を参照）。そのようなメタクリル酸経路は、バリンを２−ケトイソバレレートに転換（図１５）するバリンアミノトランスフェラーゼをさらに含有し得る。さらに、そのようなメタクリル酸経路は、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼおよびジヒドロキシ酸デヒドラターゼなど、ピルベートを２−ケトイソバレレートに転換（図１５）する酵素をさらに含有し得る（実施例ＸＶを参照）。
追加の実施形態では、本発明は、２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体であって、基質を生成物に転換するタンパク質または酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む微生物体を提供する。そのような経路は、例えば、スクシニルＣｏＡから３−ヒドロキシイソブチレートへの経路では、スクシニルＣｏＡからメチルマロニルＣｏＡへ、メチルマロニルＣｏＡからメチルマロン酸セミアルデヒドへ、メチルマロン酸セミアルデヒドから３−ヒドロキシイソブチレートへの経路、スクシニルＣｏＡからメタクリル酸への経路ではさらに３−ヒドロキシイソブチレートからメタクリル酸への経路であり得る（図２を参照）。さらに、そのような経路は、例えば、スクシニルＣｏＡからメタクリル酸への代替経路では、スクシニルＣｏＡからメチルマロニルＣｏＡへ、メチルマロニルＣｏＡからメチルマロン酸セミアルデヒドへ、メチルマロン酸セミアルデヒドから３−アミノ−２−メチルプロピオネートへ、３−アミノ−２−メチルプロピオネートからメタクリル酸への経路であり得る（図４を参照）。
別の実施形態では、そのような経路は、例えば、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシイソブチレートへの経路では、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡへ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシイソブチレートへの経路、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからメタクリル酸への経路ではさらに３−ヒドロキシイソブチレートからメタクリル酸への経路であり得る（図６を参照）。さらに、そのような経路は、例えば、アルファ−ケトグルタレートからメタクリル酸への経路では、アルファ−ケトグルタレートからグルタメートへ、グルタメートからトレオ−３−メチルアスパルテートへ、トレオ−３−メチルアスパルテートからメサコネートへ、メサコネートからメタクリル酸への経路であり得る（図８）。また、そのような経路は、例えば、アルファ−ケトグルタレートからメタクリル酸への経路では、アルファ−ケトグルタレートから２−ヒドロキシグルタレートへ、２−ヒドロキシグルタレートから３−メチルマレートへ、３−メチルマレートからメサコネートへ、メサコネートからメタクリル酸への経路であり得る（図１０）。
さらに別の実施形態では、そのような経路は、例えば、アセチルＣｏＡからメタクリル酸への経路では、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへ、アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡから２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡへ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡからメタクリリルＣｏＡへ、メタクリリルＣｏＡからメタクリル酸への経路であり得る（図１２）。また、そのような経路は、例えば、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからメタクリル酸への経路では、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからビニルアセチルＣｏＡへ、ビニルアセチルＣｏＡからクロトニルＣｏＡへ、クロトニルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡから２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡへ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡからメタクリリルＣｏＡへ、メタクリリルＣｏＡからメタクリル酸への経路であり得る（図１２）。
さらに別の実施形態では、そのような経路は、例えば、アセチルＣｏＡから２−ヒドロキシイソ酪酸への経路では、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへ、アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡから２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡへ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡから２−ヒドロキシイソ酪酸への経路であり得る（図１２）。また、そのような経路は、例えば、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから２−ヒドロキシイソ酪酸への経路では、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからビニルアセチルＣｏＡへ、ビニルアセチルＣｏＡからクロトニルＣｏＡへ、クロトニルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡから２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡへ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡから２−ヒドロキシイソ酪酸への経路であり得る（図１２）。
別の実施形態では、そのような経路は、例えば、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへ、アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡへ、クロトニルＣｏＡからブチリルＣｏＡへ、ブチリルＣｏＡからイソブチリルＣｏＡへ、イソブチリルＣｏＡからメタクリリルＣｏＡへ、メタクリリルＣｏＡからメタクリル酸への経路であり得る（図１３）。さらに、そのような経路は、例えば、ピルベートからラクテートへ、ラクテートからラクトイルＣｏＡへ、ラクトイルＣｏＡからアクリリルＣｏＡへ、アクリリルＣｏＡからプロピオニルＣｏＡへ、プロピオニルＣｏＡからメチルマロニルＣｏＡへ、メチルマロニルＣｏＡからメタクリル酸への経路であり得る（図１４）。また、そのような経路は、例えば、ピルベートからメタクリル酸への経路では、ピルベートから２−ケトイソバレレートへ、２−ケトイソバレレートからイソブチリルＣｏＡへ、イソブチリルＣｏＡからメタクリリルＣｏＡへ、メタクリリルＣｏＡからメタクリル酸への経路であり得る（図１５）。あるいは、そのような経路は、例えば、バリンからメタクリル酸への経路では、バリンから２−ケトイソバレレートへ、２−ケトイソバレレートからイソブチリルＣｏＡへ、イソブチリルＣｏＡからメタクリリルＣｏＡへ、メタクリリルＣｏＡからメタクリル酸への経路であり得る（図１５）。したがって、本発明は、図２、４、６、８、１０、および１２〜１５に示すものなどの、２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸経路の基質および生成物を転換する酵素またはタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含有する天然に存在しない微生物体を提供する。
一般に代謝反応、その反応体もしくは生成物に言及しつつ、または特に参照代謝反応、反応体もしくは生成物に関連しまたはそれを触媒する酵素をコードする１つまたは複数の核酸または遺伝子に言及しつつ、本明細書において本発明を説明する。本明細書で明示的に述べられていない限り、当業者は、反応への言及が、反応の反応体および生成物への言及も構成することを理解するであろう。同様に、本明細書で明示的に述べられていない限り、反応体または生成物への言及は反応にも言及し、これらの代謝構成要素のいずれかへの言及は、参照反応、反応体または生成物を触媒する酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子にも言及するものである。同様にして、代謝生化学、酵素学およびゲノミクスの周知の分野を考慮すると、本明細書での遺伝子またはコード核酸への言及は、対応するコードされた酵素およびそれが触媒する反応、ならびにその反応の反応体および生成物への言及も構成する。
本発明の天然に存在しない微生物体は、１つまたは複数のメタクリル酸生合成経路に関与する１つまたは複数の酵素をコードする発現可能な核酸を導入することによって生成することができる。同様に、本発明の天然に存在しない微生物体は、１つまたは複数の３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸経路に関与する１つまたは複数の酵素をコードする発現可能な核酸を導入することによって生成することができる。生合成に選択される宿主微生物体に応じて、特定のメタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸生合成経路の一部または全部の核酸を発現させることができる。例えば、選択された宿主で所望の生合成経路の１つまたは複数の酵素が欠損している場合、欠損している（１つまたは複数の）酵素の発現可能な核酸を宿主に導入し、その後外因性に発現させる。あるいは、選択された宿主で経路の一部の遺伝子の内因性発現を示すが、他は欠損している場合、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸、または２−ヒドロキシイソ酪酸の生合成を達成するには、欠損している（１つまたは複数の）酵素のコード核酸が必要である。したがって、外因性の酵素活性を導入することにより本発明の天然に存在しない微生物体を生成して所望の生合成経路を得ることができ、または１つもしくは複数の内因性酵素と共に、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸もしくは２−ヒドロキシイソ酪酸などの所望の生成物を生成する１つもしくは複数の外因性の酵素活性を導入することにより所望の生合成経路を得ることができる。
選択された宿主微生物体のメタクリル酸生合成経路の構成要素に応じて、本発明の天然に存在しない微生物体は、外因性に発現されるメタクリル酸経路をコードする少なくとも１つの核酸、および１つまたは複数のメタクリル酸生合成経路をコードする最大で全ての核酸を含む。例えば、対応するコード核酸の外因性発現により、経路の酵素が欠損している宿主でメタクリル酸の生合成を確立することができる。メタクリル酸経路の全ての酵素が欠損している宿主では、経路中の全ての酵素の外因性発現を含めることができるが、宿主が経路の少なくとも１つの酵素を含有する場合でも、経路の全ての酵素を発現させることができることが理解される。同様に、選択された宿主微生物体の３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸生合成経路の構成要素に応じて、本発明の天然に存在しない微生物体は、それぞれ、外因性に発現される３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸経路をコードする少なくとも１つの核酸、および１つまたは複数の３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸生合成経路をコードする最大で全ての核酸を含む。
例えば、メタクリル酸を生成する経路中の全ての酵素の外因性発現を含めることができる。例えば、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼなど、メタクリル酸を生成する経路中の全ての酵素を含めることができる。メタクリル酸経路中の酵素の別の例には、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼが含まれる。メタクリル酸経路中の酵素のさらなる例には、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼが含まれる。メタクリル酸経路中の酵素のさらに別の例には、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼが含まれる。また、メタクリル酸経路中の酵素の例には、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸ムターゼ、３−メチルアスパルターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼも含まれる。メタクリル酸経路中の酵素のさらに別の例には、アルファ−ケトグルタル酸レダクターゼ、２−ヒドロキシグルタミン酸ムターゼ、３−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼが含まれる。メタクリル酸経路中の酵素のさらなる例には、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼが含まれる。メタクリル酸経路中の酵素のさらに別の例には、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼが含まれる。本明細書で開示されるこれらおよび任意のメタクリル酸経路を微生物体中で利用して、メタクリル酸を生成する微生物体を得ることができることが理解される。
本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、発現可能な形で導入するコード核酸の数が、少なくとも、選択される宿主微生物体のメタクリル酸経路の欠損に対応することを理解するであろう。したがって、本発明の天然に存在しない微生物体は、本明細書で開示されるメタクリル酸生合成経路を構成する上記の酵素をコードする核酸を、１、２、３、４個など、または最大で全て有することができる。一部の実施形態では、天然に存在しない微生物体は、メタクリル酸生合成を促進もしくは最適化するか、または宿主微生物体に他の有用な機能を付与する他の遺伝子改変を含むこともできる。１つのそのような他の機能は、例えば、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸経路の前駆体の１つまたは複数の合成の増強を含むことができる。例示的なメタクリル酸経路の前駆体には、それらに限定されないが、スクシニルＣｏＡ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ、アルファ−ケトグルタレート、アセチルＣｏＡ、ピルベート、および２−ケトイソバレレートが含まれる。
一般に、宿主微生物体は、天然に生成される分子として、または所望の前駆体のｄｅ ｎｏｖｏ生成をもたらすか、宿主微生物体によって天然に生成される前駆体の生成の増加をもたらす工学的生成物として、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸経路の前駆体を生成するように選択される。例えば、スクシニルＣｏＡ、アルファ−ケトグルタレート、アセチルＣｏＡ、およびピルベートは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主生物体中で、グルコース、脂肪酸およびアミノ酸代謝の間にＴＣＡサイクルの構成成分として天然に生成される。本明細書で開示されるように、宿主生物体は、前駆体の生成を増加させるように工学的に処理することができる。そのような工学的に処理された微生物は以前に記載されている（例えば、米国特許公開第２００７／０１１１２９４号を参照）。さらに、本明細書で開示されるように、所望の前駆体を生成するように工学的に処理された微生物体、例えば４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成するように工学的に処理された微生物は、宿主生物体として用いることができる（例えば、２００８年３月１４日に出願の米国特許出願第１２／０４９，２５６号を参照）。そのような宿主生物体は、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素を発現するようにさらに工学的に処理することができる。
一部の実施形態では、本発明の天然に存在しない微生物体は、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸を合成する酵素能力を含有する宿主から生成される。この具体的な実施形態では、例えばメタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸経路の反応をメタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸生成の方へ誘導するために、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸経路の生成物の合成または蓄積を増加させることが有用なことがある。合成または蓄積の増加は、例えば、上記に記載のメタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素の１つまたは複数をコードする核酸の過剰発現によって達成することができる。メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸経路の１つまたは複数の酵素の過剰発現は、例えば、内因性の１つまたは複数の遺伝子の外因性発現を通して、または異種の１つまたは複数の遺伝子の外因性発現を通して行うことができる。したがって、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸生合成経路の酵素をコードする、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸経路に応じて１、２、３、４、５個などの核酸、すなわち、最大で全てを含む核酸の過剰発現を通して、天然に存在する生物体を容易に、例えばメタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸を生成する、本発明の天然に存在しない微生物体にすることができる。さらに、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸生合成経路中の酵素の活性の増加をもたらす内因性遺伝子の突然変異誘発によって、天然に存在しない生物体を生成することができる。
特に有用な実施形態では、コード核酸の外因性発現が使用される。外因性発現は、発現および／または調節エレメントを宿主および用途向けに調整する能力を付与し、使用者によって制御される所望の発現レベルを達成する。しかし、誘導可能なプロモーターまたは他の調節エレメントに連結する場合、負の調節エフェクターの除去または遺伝子のプロモーターの誘導などによって、内因性発現を他の実施形態で利用することもできる。したがって、天然に存在する誘導可能なプロモーターを有する内因性遺伝子は、適当な誘導剤を提供することによって上方制御することができるか、または、内因性遺伝子の調節領域を誘導可能な調節エレメントを組み込むように工学的に処理し、それによって所望の時間における内因性遺伝子の発現の増加の調節を可能にすることができる。同様に、天然に存在しない微生物体に導入される外因性遺伝子のための調節エレメントとして、誘導可能なプロモーターを含めることができる。
本発明の方法では、１つまたは複数の外因性核酸のいずれかを微生物体に導入して、本発明の天然に存在しない微生物体を生成することができることが理解される。核酸は、例えば、微生物体にメタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸生合成経路を付与するように導入することができる。あるいは、コード核酸を導入して、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸生合成能力を付与するために必要とされる反応のいくつかを触媒する生合成能力を有する、中間の微生物体を生成することができる。例えば、メタクリル酸生合成経路を有する天然に存在しない微生物体は、所望の酵素をコードする少なくとも２つの外因性核酸を含むことができる。１つの例示的な組合せには、メチルマロニルＣｏＡムターゼおよびメチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ；またはメチルマロニルＣｏＡムターゼおよびメチルマロニルＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼなどの組合せが含まれる。別の例示的な経路では、組合せは、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼおよび３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ；３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼおよび３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼおよび３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼなどを含み得る。したがって、生合成経路の２つ以上の酵素の任意の組合せを、本発明の天然に存在しない微生物体に含めることができることが理解される。
同様に、生合成経路の３つ以上の酵素の任意の組合せ、例えば、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、およびメチルマロニルＣｏＡレダクターゼ；メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼなどを、本発明の天然に存在しない微生物体に含めることができることが理解される。別の例では、組合せは、所望の生合成経路の酵素の組合せが対応する所望の生成物の生成をもたらす限り、所望により、アルファ−ケトグルタル酸レダクターゼ、３−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；２−ヒドロキシグルタミン酸ムターゼ、３−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼなどであり得る。同様に、所望の生合成経路の酵素の組合せが対応する所望の生成物の生成をもたらす限り、所望により、本明細書で開示される生合成経路の、所望の経路に応じて４つ、５つ、６つまたはそれ以上の酵素の任意の組合せを、本発明の天然に存在しない微生物体に含めることができる。
本明細書に記載のメタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸の生合成に加えて、本発明の天然に存在しない微生物体および方法を、様々な相互の組合せならびに当技術分野で周知である他の微生物体および方法との組合せで利用して、他の経路による生成物の生合成を達成することもできる。例えば、メタクリル酸生産体の使用以外でメタクリル酸を生成する１つの代替形態は、メタクリル酸経路の中間体をメタクリル酸に転換することができる別の微生物体を追加することによるものである。そのような方法の１つは、例えば、メタクリル酸経路の中間体を生成する微生物体の発酵を含む。次に、メタクリル酸経路の中間体は、メタクリル酸経路の中間体をメタクリル酸に転換する第２の微生物体のための基質として用いることができる。メタクリル酸経路の中間体を、第２の生物体の別の培養物に直接加えることができ、または、メタクリル酸経路中間体の生産体の元の培養物から、例えば細胞分離によってこれらの微生物体を除去することができ、次に、発酵ブロスへの第２の生物体のその後の添加を利用して、中間体の精製ステップなしで最終生成物を生成することができる。
他の実施形態では、本発明の天然に存在しない微生物体および方法を多種多様な下位経路で組み立てて、例えばメタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸の生合成を達成することができる。これらの実施形態では、本発明の所望の生成物の生合成経路を異なる微生物体に分離することができ、異なる微生物体を共培養して最終生成物を生成することができる。そのような生合成スキームでは、１つの微生物体の生成物は、最終生成物が合成されるまで第２の微生物体のための基質である。例えば、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸の生合成は、１つの経路の中間体を別の経路の中間体または生成物に転換する生合成経路を含有する微生物体を構築することによって達成することができる。あるいは、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸は、同じ容器中で２つの生物体を用いる共培養または共発酵を通して微生物体から生合成的に生成することもでき、その場合、第１の微生物体はメタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸経路の中間体を生成し、第２の微生物体は中間体をメタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸に変換する。
本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、本発明の天然に存在しない微生物体および方法について、他の微生物体、下位経路を有する他の天然に存在しない微生物体の共培養、ならびにメタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸を生成することが当技術分野で周知である他の化学的方法および／または生化学的方法の組合せとの、多種多様な組合せおよび置換が存在することを理解するであろう。例えば、３−ヒドロキシイソ酪酸を形成する発酵を、メチルメタクリレートをもたらす精製スキームと組み合わせることができる（ＷＯ２００２／０９０３１２を参照）。
メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする核酸の供給源は、例えば、コードされる遺伝子産物が参照反応を触媒することができる任意の種を含み得る。そのような種には、それらに限定されないが、古細菌および真正細菌を含む細菌、ならびに酵母、植物、昆虫、動物およびヒトを含む哺乳動物を含む真核生物を含む、原核生物および真核生物両方の生物体が含まれる。そのような供給源の例示的な種には、例えば、
Figure 2014147400
 、ならびに本明細書で開示されるか、対応する遺伝子の供給源生物体として利用可能な他の例示的な種が含まれる。しかし、３９５種の微生物ゲノムおよび様々な酵母、真菌、植物および哺乳動物のゲノムを含む、今では５５０を超える種（これらの半分を超えるものがＮＣＢＩなどの公開データベースで利用可能）について完全なゲノム配列が利用可能であるので、例えば、公知の遺伝子のホモログ、オルソログ、パラログおよび非オルソロガス遺伝子の置換物を含む、関係のあるまたは遠戚の種における１つまたは複数の遺伝子に必要なメタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸生合成活性をコードする遺伝子の同定、ならびに生物体の間の遺伝子変化の交換は、当技術分野で日常的であり周知である。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉなどの特定の生物体に関して本明細書で記載されるメタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸の生合成を可能にする代謝変化は、原核生物および真核生物の生物体を同様に含む他の微生物に容易に適用することができる。本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、１つの生物体で例示される代謝変化を他の生物体に同等に適用することができることを知るであろう。
代替のメタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸生合成経路が無関係な種に存在する場合などの一部の例では、例えば、参照反応の代わりに類似するが同一でない代謝反応を触媒する、無関係な種からの１つまたは複数のパラログの外因性発現によって、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸生合成を宿主種に付与することができる。異なる生物体間で代謝ネットワーク間に特定の違いがあるので、当業者は、異なる生物体間で実際の遺伝子の使用が異なる可能性があることを理解するであろう。しかし、本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸を合成する対象種で微生物体を構築するために、本明細書で例示される微生物体に対するコグネイト代謝変化を用いて本発明の教示および方法を全ての微生物体に適用することができることも理解するであろう。
宿主微生物体を、例えば、細菌、酵母、真菌、または発酵プロセスに適用できる様々な他の微生物のいずれかから選択し、天然に存在しない微生物体をそれらで生成することができる。例示的な細菌には、
Figure 2014147400
 から選択される種が含まれる。例示的な酵母または真菌には、
Figure 2014147400
 から選択される種が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉは、遺伝子工学に適した、十分に特徴付けられている微生物体であるので、特に有用な宿主生物体である。他の特に有用な宿主生物体には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母が含まれる。
天然に存在しないメタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸産生宿主を構築しその発現レベルを検査するための方法は、例えば、当技術分野で周知である組換えおよび検出方法によって実施することができる。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１年）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ（１９９９年）の記載に認めることができる。
メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸を生成する経路に関与する外因性核酸配列は、それらに限定されないが、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、化学的変換、形質導入、トランスフェクションおよび超音波形質転換を含む当技術分野で周知の技術を用いて、宿主細胞に安定してまたは一時的に導入することができる。Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の原核細胞での外因性発現では、遺伝子のいくつかの核酸配列または真核生物の核酸のｃＤＮＡは、Ｎ末端ミトコンドリアなどのターゲティングシグナルまたは他のターゲティングシグナルをコードすることができ、それは、所望により、原核生物の宿主細胞への形質転換の前に除去することができる。例えば、ミトコンドリアのリーダー配列を除去すると、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現が増加した（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０巻、４３２９〜４３３８頁（２００５年））。酵母または他の真核細胞での外因性発現では、宿主細胞に適したミトコンドリアのターゲティングまたは分泌シグナルなどの適切なターゲティング配列を加えることによって、遺伝子は、リーダー配列を加えることなしにサイトゾルで発現させることができるか、またはミトコンドリアもしくは他のオルガネラを標的にすることができるか、または分泌を標的にすることができる。したがって、核酸配列にターゲティング配列を除去するか含めるための適当な改変を外因性核酸配列に組み込んで、望ましい特性を付与できることが理解される。さらに、当技術分野で周知の技術を用いて遺伝子にコドン最適化を行って、タンパク質の最適化された発現を達成することができる。
宿主生物体で機能的である発現調節配列に作動可能に連結されている、本明細書で例示される核酸をコードする１つまたは複数のメタクリル酸生合成経路を含むように、１つまたは複数の発現ベクターを構築することができる。本発明の微生物宿主生物体での使用に適用可能な発現ベクターには、例えば、宿主染色体への安定した組込みで作動可能なベクターおよび選択配列またはマーカーを含めて、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび人工染色体が含まれる。さらに、発現ベクターは、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および適当な発現調節配列を含むことができる。例えば、抗生物質もしくは毒素に対する耐性を提供するか、栄養要求性の欠乏を補充するか、または培地中にない重大な栄養素を供給する、選択可能なマーカー遺伝子を含めることもできる。発現調節配列は、当技術分野で周知である、構成的および誘導可能なプロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含めることができる。２つ以上の外因性コード核酸を共発現させる場合、両方の核酸を、例えば、単一の発現ベクターまたは別々の発現ベクターに挿入することができる。単一ベクターの発現では、コード核酸を作動的に１つの共通の発現調節配列に連結することもでき、または異なる発現調節配列に、例えば１つの誘導可能なプロモーターおよび１つの構成的プロモーターに連結することもできる。代謝もしくは合成経路に関与する外因性核酸配列の形質転換は、当技術分野で周知である方法を用いて確認することができる。そのような方法には、例えば、ｍＲＮＡのノーザンブロットもしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などの核酸分析、または遺伝子産物の発現についてのイムノブロッティング、または導入された核酸配列もしくはその対応する遺伝子産物の発現を試験する他の適切な分析法が含まれる。外因性核酸は所望の産物の産生に十分な量で発現されることが当業者によって理解され、また、当技術分野で周知であり本明細書で開示される方法を用いて発現レベルを最適化して十分な発現を得ることができることがさらに理解される。
本発明は、メタクリル酸などの所望の生成物を生成する方法をさらに提供する。一実施形態では、本発明は、メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体を培養することを含み、前記経路が、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む方法を提供する（実施例ＩおよびＩＩならびに図２を参照）。別の実施形態では、本発明は、メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体を培養することを含み、前記経路が、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む方法を提供する（実施例Ｉを参照）。
さらに別の実施形態では、本発明は、メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体を培養することを含み、前記経路が、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼを含む方法を提供する（実施例ＩＩＩおよびＩＶならびに図４を参照）。メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体を培養することを含み、前記経路が、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む方法がさらに提供される（実施例ＶおよびＶＩならびに図６を参照）。
メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体を培養することを含み、前記経路が、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸ムターゼ、３−メチルアスパルターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼを含む方法も提供される（実施例ＶＩＩおよびＶＩＩＩならびに図８を参照）。別の実施形態は、メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体を培養することを含み、前記経路が、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、アルファ−ケトグルタル酸レダクターゼ、２−ヒドロキシグルタミン酸ムターゼ、３−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼを含む方法を提供する（実施例ＩＸおよびＸならびに図１０を参照）。
なおさらなる実施形態では、本発明は、メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体を培養することを含み、前記経路が、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼを含む方法を提供する（実施例ＸＩおよびＸＩＩならびに図１２を参照）。なおさらなる実施形態は、メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体を培養することを含み、前記経路が、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む方法を提供する（実施例ＸＩおよびＸＩＩを参照）。
本発明は、メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体を培養することを含み、前記経路が、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、イソブチリルＣｏＡムターゼ、イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼを含む方法をさらに提供する（実施例ＸＩＩＩおよび図１３を参照）。メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体を培養することを含み、前記経路が、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、乳酸デヒドロゲナーゼ、ラクテートＣｏＡトランスフェラーゼ、ラクトイルＣｏＡデヒドラターゼ、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む方法も提供される（実施例ＸＩＶおよび図１４を参照）。なおさらなる実施形態は、メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体を培養することを含み、前記経路が、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、バリンアミノトランスフェラーゼ、２−ケトイソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼを含む方法を提供する（実施例ＸＶおよび図１５を参照）。そのような経路は、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼおよびジヒドロキシ酸デヒドラターゼをさらに含み得る。
本発明は、３−ヒドロキシイソ酪酸を生成する方法であって、３−ヒドロキシイソ酪酸経路を有する天然に存在しない微生物体を培養することを含み、前記経路が、３−ヒドロキシイソ酪酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、３−ヒドロキシイソ酪酸を生成するのに十分な量で発現される３−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、３−ヒドロキシイソ酪酸経路が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ；および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼを含む方法をさらに提供する（実施例Ｖおよび図６を参照）。２−ヒドロキシイソ酪酸を生成する方法であって、２−ヒドロキシイソ酪酸経路を有する天然に存在しない微生物体を培養することを含み、前記経路が、２−ヒドロキシイソ酪酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、２−ヒドロキシイソ酪酸を生成するのに十分な量で発現される２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、２−ヒドロキシイソ酪酸経路が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ；アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ；および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼを含む方法も提供される（実施例ＸＩおよび図１２を参照）。
別の実施形態では、本発明は、メタクリル酸を生成する方法であって、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体を培養することを含み、前記経路が、メタクリル酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ；ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ；２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ；およびメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼを含む方法を提供する（実施例ＸＶＩＩＩおよび図１２を参照）。２−ヒドロキシイソ酪酸を生成する方法であって、２−ヒドロキシイソ酪酸経路を有する天然に存在しない微生物体を培養することを含み、前記経路が、２−ヒドロキシイソ酪酸を生成する条件下およびそれに十分な期間、２−ヒドロキシイソ酪酸を生成するのに十分な量で発現される２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、２−ヒドロキシイソ酪酸経路が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ；ビニルアセチルＣｏＡ
Δ−イソメラーゼ；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ；および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼを含む方法も提供される（実施例ＸＶＩＩＩおよび図１２を参照）。
周知の方法を用いて、メタクリル酸の生成を試験するのに適した精製および／またはアッセイを実施することができる。試験する各工学的処理株について、３連の培養物などの適切な複製物を増殖させることができる。例えば、工学的処理された産生宿主における生成物および副産物の形成を観察することができる。最終生成物および中間体、ならびに他の有機化合物を、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析）およびＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）などの方法、または当技術分野で周知である日常的な手順を用いる他の適切な分析法によって分析することができる。発酵ブロス中の生成物の放出を、培養上清で試験することもできる。副産物および残留グルコースは、例えば、グルコースおよびアルコールには示差屈折率検出器を、有機酸には紫外線検出器を用いるＨＰＬＣによって（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ９０巻、７７５〜７７９頁（２００５年））、または当技術分野で周知である他の適切なアッセイおよび検出方法によって定量化することができる。外因性ＤＮＡ配列からの個々の酵素活性を、当技術分野で周知である方法を用いて分析することもできる。
メタクリル酸、２−ヒドロキシイソ酪酸または３−ヒドロキシイソ酪酸生成物は、当技術分野で周知である様々な方法を用いて培養物中の他の成分から分離することができる。そのような分離法には、例えば、抽出法、ならびに連続液液抽出、浸透気化法、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーおよび限外濾過を含む方法が含まれる。上記の方法は全て、当技術分野において周知である。
本明細書で記載される天然に存在しない微生物体のいずれかを培養して、本発明の生合成生成物を生成および／または分泌することができる。例えば、メタクリル酸の生合成的生成のために、メタクリル酸生産体を培養することができる。
メタクリル酸、２−ヒドロキシイソ酪酸または３−ヒドロキシイソ酪酸の生成では、炭素源および他の必要不可欠な栄養素を含む培地中で組換え株を培養する。全プロセスのコストを削減するために、発酵槽の嫌気的条件を維持することが非常に望ましい。そのような条件は、例えば、最初に窒素で培地をスパージし、次に隔壁および波形キャップでフラスコを密封することによって得ることができる。嫌気的条件で増殖が観察されない株には、限定的通気のための小さな穴を隔壁に開けることによって、微好気的条件を適用することができる。例示的な嫌気的条件は以前に記載されており、当技術分野において周知である。例示的な好気的条件および嫌気的条件は、例えば、２００７年８月１０日に出願の米国特許出願第１１／８９１，６０２号に記載されている。本明細書で開示されるように、発酵は、回分、流加または連続的な形で実施することができる。
培地を望ましいｐＨに維持することが必要なとき、所望により、塩基、例えばＮａＯＨもしくは他の塩基、または酸の添加によって培地のｐＨを所望のｐＨ、特に中性ｐＨ、例えば約７のｐＨに維持することができる。増殖速度は、分光光度計（６００ｎｍ）を用いて光学密度を測定することによって決定することができ、グルコース取り込み速度は、炭素源枯渇を経時的にモニターすることによって決定できる。
増殖培地は、例えば、天然に存在しない微生物に炭素源を供給することができる任意の炭水化物源であり得る。例えば、そのような供給源には、糖類、例えばグルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、およびデンプンが含まれる。炭水化物の他の供給源には、例えば再生可能なフィードストックおよびバイオマスが含まれる。本発明の方法でフィードストックとして用いることができる例示的なバイオマスの型には、セルロースのバイオマス、ヘミセルロースのバイオマスおよびリグニンフィードストックまたはフィードストックの部分が含まれる。そのようなバイオマスフィードストックは、例えば炭素源として有用な炭水化物基質、例えばグルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトースおよびデンプンを含有する。本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、上記に例示されるもの以外の再生可能なフィードストックおよびバイオマスを、メタクリル酸の生成のための本発明の微生物体を培養するのに用いることもできることを理解するであろう。
上記に例示されるものなどの再生可能なフィードストックに加えて、本発明のメタクリル酸微生物体を、炭素源として合成ガスで増殖するように改変することもできる。この具体的な実施形態では、１つまたは複数のタンパク質または酵素をメタクリル酸産生生物体中で発現させて、合成ガスまたは他のガス状炭素源を利用する代謝経路を提供する。
合成ガス（ｓｙｎｇａｓ）またはプロデューサーガスとしても公知の合成ガス（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇａｓ）は、石炭、ならびに炭素材、例えば農作物および残渣を含むバイオマス材のガス化の主要な生成物である。合成ガスは主としてＨ２およびＣＯの混合物であり、それらに限定されないが、石炭、石油、天然ガス、バイオマスおよび廃棄有機物を含む任意の有機フィードストックのガス化から得ることができる。ガス化は、高い燃料対酸素比の下で一般に実施される。ほとんどＨ２およびＣＯであるが、合成ガスはより少ない量のＣＯ２および他のガスをも含み得る。したがって、合成ガスはＣＯ、さらにＣＯ２などのガス状炭素の費用効果の高い供給源を提供する。
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、ＣＯおよびＨ２からアセチルＣｏＡおよびアセテートなどの他の生成物への転換を触媒する。ＣＯおよび合成ガスを利用することができる生物体は一般に、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路に包含される酵素および変換の同じ基本セットを通して、ＣＯ２およびＣＯ２／Ｈ２混合物を利用する能力も有する。同じ生物体がＣＯを用いることもでき、同じ経路が含まれることが明らかにされるずっと前に、微生物によるＣＯ２からアセテートへのＨ２依存性転換が認識された。必要な還元当量を供給する水素が存在する限り、多くの酢酸生成菌がＣＯ２の存在下で増殖し、アセテートなどの化合物を生成することが示された（例えば、Ｄｒａｋｅ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ、３〜６０頁、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９９４年）参照）。これは、以下の式に要約することができる：
２ＣＯ２＋４Ｈ２＋ｎＡＤＰ＋ｎＰｉ→ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２Ｈ２Ｏ＋ｎＡＴＰ
したがって、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を有する天然に存在しない微生物は、アセチルＣｏＡおよび他の所望の生成物の生成にＣＯ２およびＨ２混合物も利用することができる。
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は当技術分野で周知であり、１２個の反応からなり、それらは２つの分岐：（１）メチル分岐および（２）カルボニル分岐に分けることができる。メチル分岐は合成ガスをメチルテトラヒドロ葉酸（メチルＴＨＦ）に転換し、カルボニル分岐はメチルＴＨＦをアセチルＣｏＡに転換する。メチル分岐における反応は、以下の酵素によって順番に触媒される：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ。カルボニル分岐における反応は、以下の酵素によって順番に触媒される：コバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡシンターゼ、アセチルＣｏＡシンターゼジスルフィドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼ。十分な数のコード核酸を導入してメタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸経路を生成することについて本明細書で提供される教示および指針に従って、当業者は、宿主生物体に存在しないＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ酵素をコードする核酸を少なくとも導入することに関して、同じ工学的設計を実施することもできることを理解するであろう。したがって、改変された生物体が完全なＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含むように、本発明の微生物体へ１つまたは複数のコード核酸を導入すると、合成ガス利用能が付与される。
したがって、本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、炭水化物などの炭素源で増殖させるとき、本発明の生合成された化合物を分泌する、天然に存在しない微生物体を生成することができることを理解するであろう。そのような化合物には、例えば、メタクリル酸およびメタクリル酸経路中の中間代謝産物のいずれかが含まれる。必要なのは、例えば、メタクリル酸生合成経路の一部もしくは全部の組入れを含む、所望の化合物または中間体の生合成を達成するために必要とされる酵素活性の１つまたは複数における工学的導入だけである。したがって、本発明は、炭水化物で増殖させるとメタクリル酸を生成および／または分泌し、炭水化物で増殖させるとメタクリル酸経路で示される中間代謝産物のいずれかを生成および／または分泌する、天然に存在しない微生物体を提供する。生成および／または排出することができる中間代謝産物には、３−ヒドロキシイソ酪酸および２−ヒドロキシイソ酪酸が含まれる。
本発明のメタクリル酸を生成する微生物体は、中間体から合成を開始することができる。例えば、前駆体としてスクシニルＣｏＡから合成を開始することに加えて、（Ｒ）−メチルマロニルＣｏＡ、（Ｓ）−メチルマロニルＣｏＡ、メチルマロン酸セミアルデヒドまたは３−ヒドロキシイソブチレートなどの中間体から合成を開始することができる（実施例Ｉおよび図２を参照）。あるいは、（Ｒ）−メチルマロニルＣｏＡ、（Ｓ）−メチルマロニルＣｏＡ、メチルマロン酸セミアルデヒド、または３−アミノ−２−メチルプロピオネートなどの中間体から合成を開始することができる（実施例ＩＩＩおよび図４を参照）。前駆体として４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを有する経路では、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ、メタクリリルＣｏＡまたは３−ヒドロキシイソブチレートなどの中間体から合成を開始することができる（実施例Ｖおよび図６を参照）。
前駆体としてアルファ−ケトグルタレートを利用するメタクリル酸経路では、例えば、グルタメート、トレオ−３−メチルアスパルテートまたはメサコネートから合成を開始することができる（実施例ＶＩＩおよび図８を参照）。あるいは、２−ヒドロキシグルタレート、３−メチルマレートまたはメサコネートなどの中間体から合成を開始することができる（実施例ＩＸおよび図１０を参照）。前駆体としてアセチルＣｏＡを利用する経路では、例えば、アセトアセチルＣｏＡ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ、またはメタクリリルＣｏＡなどの中間体から合成を開始することができる（実施例ＸＩおよび図１２を参照）。あるいは、アセトアセチルＣｏＡ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ、クロトニルＣｏＡ、ブチリルＣｏＡ、イソブチリルＣｏＡおよびメタクリリルＣｏＡなどの中間体から合成を開始することができる（実施例ＸＩＩＩおよび図１３を参照）。
前駆体としてピルベートを利用するメタクリル酸経路では、ラクテート、ラクトイルＣｏＡ、アクリリルＣｏＡ、プロピオニルＣｏＡ、（Ｓ）−メチルマロニルＣｏＡ、メチルマロン酸セミアルデヒドまたは３−ヒドロキシイソブチレートなどの中間体から合成を開始することができる（実施例ＸＩＶおよび図１４を参照）。前駆体として２−ケトイソバレレートを利用する経路では、イソブチリルＣｏＡまたはメタクリリルＣｏＡなどの中間体から合成を開始することができる（実施例ＸＶおよび図１５を参照）。さらに、ピルベートから２−ケトイソバレレートへの転換における中間体から合成を開始することができる。
前駆体として４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを利用する３−ヒドロキシイソ酪酸経路では、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡなどの中間体から合成を開始することができる（実施例Ｖおよび図６を参照）。前駆体としてアセチルＣｏＡを利用する２−ヒドロキシイソ酪酸経路では、例えば、アセトアセチルＣｏＡ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ、または２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡなどの中間体から合成を開始することができる（実施例ＸＩおよび図１２を参照）。
さらに、本発明の微生物体に対して生成物の収率を増加させるようにさらなる改変が可能であることが理解される。例えば、代謝モデリングを用いて、２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸経路を有する微生物体に対して生成物の収率を増加させるように行うことができる任意のさらなる改変を決定することができる（実施例ＸＸＶを参照）。一実施形態では、改変を用いて、２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸経路の前駆体または中間体の生成を増加させることができる。本明細書で開示されるように、中心的な代謝反応およびその対応する酵素の改変を含む代謝経路の改変を用いて、所望の前駆体、中間体または生成物の収率を増加させることができる。例えば、様々な機構によるいくつかの酵素の発現の増加を利用して、ＭＡＡまたは３−ヒドロキシイソブチレートの収率を増加させることができることが見い出されている。そのような酵素には、それらに限定されないが、１）クエン酸シンターゼおよびアコニターゼ；２）イソクエン酸リアーゼおよびリンゴ酸シンターゼ；３）ピルビン酸デヒドロゲナーゼおよび／またはピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ならびに４）ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼがある（実施例ＸＸＶを参照）。これらの酵素の発現を使用して、サクシニルＣｏＡまたは４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからの経路を使用したＭＡＡまたは３−ヒドロキシイソブチレートの収率を増加させることができる。
したがって、本発明は、２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸経路を含有していることに加えて、２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸生成物の前駆体または中間体の生成を増加させる少なくとも１つのタンパク質または酵素の活性を増加させるようにさらに遺伝子改変されている天然に存在しない微生物体をさらに提供し、ここで活性の増加は、少なくとも１つのタンパク質または酵素の活性を増加させる遺伝子改変が存在しない状態と比べた増加である。例えば、クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸リアーゼ、リンゴ酸シンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼから選択される少なくとも１つの酵素の活性を増加させるように、天然に存在しない微生物体を遺伝子改変することができる（実施例ＸＸＶを参照）。活性の増加は、そのような酵素の活性を増加させるように遺伝子改変されていない微生物体と比べた増加であることが理解される。例えば、酵素の活性を増加させる遺伝子改変を、メタクリル酸経路を有する微生物体に導入する場合、酵素の活性の増加は、メタクリル酸経路を有するが遺伝子改変が存在しない宿主生物体と比べた増加である。そのような遺伝子改変には、それらに限定されないが、染色体組込みにより、またはプラスミドに含有されている、活性を増加させるタンパク質または酵素の同種（天然）または異種配列をコードする外因性核酸を導入することが含まれることが理解される。例えば、タンパク質もしくは酵素の活性を増加させる望ましい特性を有する生物体由来の異種配列を導入することもでき、または増加したコピー数の内因性遺伝子を生物体に導入することもできる。さらに、内因性遺伝子のプロモーターをより活性なプロモーターで置換することもでき、タンパク質または酵素の発現、したがって活性を増加させる突然変異で天然のプロモーターを遺伝子改変することもできる。プロモーターのそのような置換または他の遺伝子改変は、構成的および誘導可能なプロモーターをもたらすことができる。さらに、例えば遺伝子破壊でリプレッサーをノックアウトするか、または発現を減少させるようにそのプロモーターを遺伝子改変することにより、内因性遺伝子のリプレッサーを減少させることができる。したがって、本明細書で開示され、当技術分野で公知であるこれらおよび他の遺伝子改変を使用して、所望のタンパク質または酵素の活性を増加させることができる。
本発明の天然に存在しない微生物体は、本明細書で例示される当技術分野で周知の方法を用いて、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸を生成するのに十分な量でメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの核酸を外因性に発現するように構築される。本発明の微生物体は、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸を生成するのに十分な条件下で培養されることが理解される。本明細書で提供される教示および指針に従って、本発明の天然に存在しない微生物体は、細胞内濃度が約０．１〜２００ｍＭ以上となるメタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸の生合成を達成することができる。一般に、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸の細胞内濃度は、約３〜１５０ｍＭ、詳細には約５〜１２５ｍＭ、より詳細には約８〜１００ｍＭであり、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、８０ｍＭ、またはそれ以上を含む。これらの例示的な範囲のそれぞれの間の細胞内濃度およびそれを上回る細胞内濃度も、本発明の天然に存在しない微生物体から達成することができる。
一部の実施形態では、培養条件は、嫌気的または実質的に嫌気的な増殖または維持条件を含む。例示的な嫌気的条件は以前に記載されており、当技術分野において周知である。発酵プロセスの例示的な嫌気的条件が本明細書に記載され、例えば、２００７年８月１０日に出願の米国特許出願第１１／８９１，６０２号に記載されている。これらの条件のいずれかを、当技術分野で周知である他の嫌気的条件と同様に、天然に存在しない微生物体で使用することができる。そのような嫌気的条件の下で、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸生産体は、５〜１０ｍＭ以上の細胞内濃度、ならびに本明細書で例示される他の全ての濃度で、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸をそれぞれ合成することができる。上記の記載が細胞内濃度に言及するものであるとしても、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸を生成する微生物体は、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸を細胞内で生成し、かつ／または培地中にその生成物を分泌することができることが理解される。
培養条件には、例えば、液体培養法だけでなく発酵および他の大規模培養法を含めることができる。本明細書で記載されるように、本発明の生合成生成物の特に有用な収率は、嫌気的または実質的に嫌気的な培養条件下で得ることができる。
本明細書で記載されるように、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸の生合成を達成するための１つの例示的な増殖条件には、嫌気的培養または発酵条件が含まれる。特定の実施形態では、本発明の天然に存在しない微生物体は、嫌気的または実質的に嫌気的な条件の下で保持し、培養し、または発酵させることができる。簡単に述べると、嫌気的条件とは酸素不足の環境を指す。実質的に嫌気的な条件には、例えば、培地中の溶解酸素濃度が飽和の０〜１０％の間にとどまるような、培養、回分発酵または連続発酵が含まれる。実質的に嫌気的な条件には、１％未満の酸素の雰囲気で維持される密封チャンバー内の液体培地または固体寒天で細胞を増殖または休止させることも含まれる。酸素の割合は、例えば、培養をＮ２／ＣＯ２混合物または他の適切な１つまたは複数の非酸素ガスでスパージすることによって維持することができる。
本明細書で記載される培養条件の規模を拡大し、連続的に増殖させてメタクリル酸を製造することができる。例示的な増殖法には、例えば、流加回分発酵および回分分離；流加回分発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離が含まれる。これらのプロセスは全て、当技術分野において周知である。発酵法は、商業的な量のメタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸の生合成による生成に特に有用である。一般に、また非連続的な培養法と同様に、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸の連続的および／またはほとんど連続的な生成には、指数増殖期の増殖を保持および／またはほとんど保持するのに十分な栄養素および培地で、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸を生成する本発明の天然に存在しない生物体を培養することが含まれよう。そのような条件下での連続培養は、例えば、１日、２、３、４、５、６または７日、またはそれ以上を含むことができる。さらに、連続培養は、１週間、２、３、４または５週間、またはそれ以上で最高数カ月を含むことができる。あるいは、本発明の生物体は、特定の用途に適する場合は数時間培養することができる。連続的および／またはほとんど連続的な培養条件は、これらの例示的な期間の間の全ての期間を含むこともできることを理解すべきである。本発明の微生物体を培養する時間は、所望の目的に十分な量の生成物を生成するのに十分な期間であることがさらに理解される。
発酵法は、当技術分野において周知である。簡単に述べると、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸を生合成により生成するための発酵は、例えば、流加回分発酵および回分分離；流加回分発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離で利用することができる。回分および連続発酵法の例は、当技術分野で周知である。
かなり大量のメタクリル酸の連続的生成に本発明のメタクリル酸生産体を用いる上記の発酵法に加えて、メタクリル酸生産体を、例えば、化学合成法に同時にかけて生成物を他の化合物に変換することもでき、または生成物を発酵培養物から分離し、続いて、所望により、化学変換にかけて生成物を他の化合物に変換することもできる。さらには、かなり大量の３−ヒドロキシイソブチレートまたは２−ヒドロキシイソブチレートの連続的生成に本発明の３−ヒドロキシイソブチレートまたは２−ヒドロキシイソブチレート生産体をそれぞれ用いる上記の発酵法に加えて、３−ヒドロキシイソブチレートまたは２−ヒドロキシイソブチレート生産体を、例えば、化学合成法に同時にかけて生成物を他の化合物に転換することもでき、あるいは生成物を発酵培養物から分離し、続いて、所望により、化学変換にかけて生成物を他の化合物に変換することもできる。
バイオプロセシングについて考慮すべきことの１つは、回分または連続発酵スキームのどちらを用いるかである。生成される生成物の量に影響を及ぼす、この２つのスキーム間にある相違の１つは、指数関数的増殖期に加えて、回分スキームには準備期、遅滞期、および静止期が存在することである。その一方で、連続プロセスは、一定の指数関数的増殖の状態で維持され、適切に稼働すれば、一度に数カ月もの間実行することができる。増殖関連および混合増殖関連型の生成物形成では、準備期、遅滞期、および静止期がないことにより、連続プロセスははるかに高い生産性（すなわち細胞集団の希釈倍率）をもたらす。
生産性に利点があるにもかかわらず、いくつかの理由で連続プロセスより多くの回分プロセスが稼働中である。最初に、非増殖関連型の生成物形成では、連続プロセスは非常に低い希釈率で稼働させなければならないため、回分系の生産性は、連続プロセスの生産性を大きく上回り得る。次に、生成株は一般に、生化学的またはタンパク質生成能力が改善するようにその遺伝物質に対して改変を受けている。この特殊化した株は、その親の相補体より迅速には増殖しない可能性が高く、一方恒成分培養槽（連続形式で稼働する発酵槽）を使用するものなどの連続プロセスでは、最も速く増殖している細胞に大きな選択圧が加わる。所望の過剰生成の表現型につながる、組換えＤＮＡを含有するまたは点突然変異を有する細胞は、生産性の低い元の親株となる逆突然変異を起こしやすい。単一の遺伝子欠失を有する株に、野生型の増殖表現型を回復する傾向がある代償的な突然変異が生じる可能性もある。より速く増殖している細胞は通常、栄養素の制限についてより生産性の高い対応物に打ち勝ち、大幅に生産性が低下する。その一方で、回分プロセスは、各周期の終わりにある細胞を再利用するのではなく、このように生成株がその野生型の表現型に復帰する確率を減らすことにより、利用可能な世代の数を制限する。最後に、連続プロセスは、設備故障や外来生物体の混入などの潜在的な工学的障害により、長期に稼働させることがより困難である。そのような故障の重大性は、回分培養より連続プロセスではるかに考慮すべきである。
特殊な化学物質および／またはタンパク質の少量の生成では、連続プロセスの生産性の増加が、株の安定性および信頼性に関連するリスクより勝ることはめったにない。しかし、大量の、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸などの増殖関連型の生成物の生成では、連続プロセスで生産性が増加すると、回分プロセスに比較して著しい経済的利益が生じ得る。連続バイオプロセスの稼働に関連する工学的障害が常に存在するが、株の安定性の懸念は、負の選択圧を低減または回避し、指数関数的増殖期の間標的生成物の生成に有利となるように代謝経路を変更する代謝工学的戦略により克服することができる。
より良好な生産体を得るために、代謝モデリングを利用して、増殖条件を最適化することができる。モデリングを用いて、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計することができる（例えば、米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号を参照）。モデリング解析は、メタクリル酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または２−ヒドロキシイソ酪酸のより効率の高い生成の方向に代謝を移動させる細胞増殖に対する影響の信頼性のある予測を可能にする。
所望の生成物の生合成を有利にする代謝改変を特定し、設計するための１つのコンピュータ方法は、ＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータフレームワークである（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８４巻、６４７〜６５７頁（２００３年））。ＯｐｔＫｎｏｃｋは、標的生成物を過剰に生産する遺伝的に安定した微生物をもたらす遺伝子欠失戦略を示唆する、代謝モデル化およびシミュレーションプログラムである。具体的には、フレームワークは、所望の生化学物質を細胞増殖の必須の副産物になるように強制する遺伝子操作を示唆するために、微生物の完全な代謝ネットワークおよび／または生化学ネットワークを調べる。戦略的に置かれた遺伝子欠失または他の機能的遺伝子破壊を通して生化学的生成を細胞増殖と連結することによって、バイオリアクター内での長期間の後に設計製作された株に加えられる増殖淘汰圧は、強制的な増殖連結型の生化学的生成の結果として、性能の改善をもたらす。最後に、遺伝子欠失が構築されると、ＯｐｔＫｎｏｃｋによって選択された遺伝子はゲノムから完全に除去されるので、設計された株がそれらの野生型状態に戻る可能性はごくわずかである。したがって、このコンピュータ方法は、所望の生成物の生合成をもたらす代替経路を特定するために用いること、または所望の生成物の生合成のさらなる最適化のために、天然に存在しない微生物の生物体と共に用いることができる。
簡単に述べると、ＯｐｔＫｎｏｃｋは細胞代謝のモデル化のためのコンピュータによる方法およびシステムを指すために本明細書で用いられる用語である。ＯｐｔＫｎｏｃｋプログラムは、特定の制約をフラックスバランス分析（ＦＢＡ）モデルに組み込む、モデルおよび方法のフレームワークに関する。これらの制約には、例えば、定性的動態学情報、定性的調節情報および／またはＤＮＡマイクロアレイ実験データが含まれる。ＯｐｔＫｎｏｃｋは、例えばフラックスバランスモデルを通して誘導されるフラックス境界を締め、その後、遺伝子付加または欠失の存在下で代謝ネットワークの性能限界を調査することによって、様々な代謝問題の解法も計算する。ＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータフレームワークは、代謝ネットワークの性能限界の効果的なクエリーを可能にするモデル式の構築を可能にし、生じる混合整数線形計画法の問題を解決する方法を提供する。ＯｐｔＫｎｏｃｋとして本明細書で言及される代謝モデル化およびシミュレーション法は、例えば、２００２年１月１０日に出願の米国特許公開第２００２／０１６８６５４号、２００２年１月１０日に出願の国際特許ＰＣＴ／ＵＳ０２／００６６０、および２００７年８月１０日に出願の米国公開第２００９／００４７７１９号に記載されている。
生成物の生合成による生成を有利にする代謝変化を特定および設計するための別のコンピュータ方法は、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）と呼ばれる代謝モデリングおよびシミュレーションシステムである。このコンピュータ方法およびシステムは、例えば、２００２年６月１４日に出願の米国特許公開２００３／０２３３２１８および２００３年６月１３日に出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／１８８３８に記載されている。ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）は、コンピュータでネットワークモデルを生成し、生物系の化学反応を通して質量、エネルギーまたは電荷のフラックスをシミュレートして、その系の化学反応のありとあらゆる可能な機能を含む解空間を定義し、それによってその生物系に許容される活性を判定するのに用いることができるコンピュータシステムである。この手法は、含まれる反応の公知の化学量などの制約、ならびに反応を通して最大フラックスに関連する熱力学反応および容量制約によって解空間が定義されるので、制約に基づくモデル化と称される。これらの制約によって定義される空間を調べて、生物系またはその生化学成分の表現型能力および挙動を判定することができる。例えば、Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、Ｊ． Ｔｈｅｏｒ． Ｂｉｏｌ．、２０３巻、２２９〜２４８頁（２０００年）；Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ．、７１巻、２８６〜３０６頁（２０００年）およびＳｃｈｉｌｌｉｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｐｒｏｇ．、１５巻、２８８〜２９５頁（１９９９年）に記載されている凸解析、線形計画法および極端経路の計算などの分析法を用いて、そのような表現型能力を判定することができる。
上記に記載のように、本発明に適用可能なコンピュータプログラムで使用される制約に基づく方法の１つはフラックスバランス分析である。フラックスバランス分析は、定常状態の条件におけるフラックスのバランスに基づいており、例えば、ＶａｒｍａおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ．、１２巻、９９４〜９９８頁（１９９４年）に記載のように実施することができる。フラックスバランスの手法を反応ネットワークに適用して、例えば、ＦｅｌｌおよびＳｍａｌｌ、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３８巻、７８１〜７８６頁（１９８６年）に記載の脂肪細胞の代謝、ＭａｊｅｗｓｋｉおよびＤｏｍａｃｈ、Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ．、３５巻、７３２〜７３８頁（１９９０年）に記載のＡＴＰ最大化の条件下でのＥ．ｃｏｌｉのアセテート分泌、またはＶａｎｒｏｌｌｅｇｈｅｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｐｒｏｇ．、１２巻、４３４〜４４８頁（１９９６年）に記載の酵母によるエタノール分泌がシミュレートされ、その系の特性が予測されている。さらに、ＥｄｗａｒｄｓおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、９７巻、５５２８〜５５３３頁（２０００年）、ＥｄｗａｒｄｓおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ．、２７４巻、１７４１０〜１７４１６頁（１９９９年）ならびにＥｄｗａｒｄｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９巻、１２５〜１３０頁（２００１年）に記載のように、この手法を使用して、様々な単一炭素源でのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖、ならびにＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの代謝を予測またはシミュレートすることができる。
生物系は柔軟であり、多くの異なる方法で同じ結果に到達することができるので、これらのコンピュータ手法は生物的な現実と一貫している。生物系は、全ての生物系が直面しなければならない基本的な制約によって制限されている進化機構を通して設計される。したがって、制約に基づくモデリング戦略は、これらの一般的な現実を包含する。さらに、制約の締め付けを通してさらなる制限をネットワークモデルに連続的に加える能力は、解空間の縮小をもたらし、それによって、生理的性能または表現型を予測できる精度を高める。
本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、代謝モデリングおよびシミュレーションのための様々なコンピュータフレームワークを適用して、宿主微生物体における所望の化合物の生合成を設計および実施することができる。そのような代謝モデル化およびシミュレーション方法には、例えば、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）およびＯｐｔＫｎｏｃｋのような上で例示したコンピュータシステムが含まれる。本発明の説明のために、モデリングおよびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋ計算フレームワークに関して、いくつかの方法を本明細書に記載する。当業者は、ＯｐｔＫｎｏｃｋを用いる代謝変化の特定、設計および実行を、当技術分野で周知であるそのような他の代謝モデリングおよびシミュレーションコンピュータフレームワークおよび方法のいずれかに適用する方法を知るであろう。
細胞または生物体が強制的に増殖と生化学的な生成物の生成を連結する能力は、コンピュータモデルを用いて計算された典型的な代謝ネットワークの生化学的生成の限界との関連で説明することができる。これらの限界は、制限している（１つまたは複数の）基質の（１つまたは複数の）取り込み速度をその実験的に測定された（１つまたは複数の）値に固定し、増殖のそれぞれ達成可能なレベルで生化学的生成の最大速度および最低速度を計算することによって得られる。図１６に示すように、所望の生化学的生成は一般に細胞内資源のバイオマス形成と直接競合する。これらの状況下で、生化学的生成の速度が高まると、必ず増殖速度が最大以下となる。本明細書で開示される、ＯｐｔＫｎｏｃｋなどの代謝モデリングおよびシミュレーションプログラムによって示唆されるノックアウトは、図１６に表すように野生型株から代謝挙動を変化させる許容可能な解の境界を制限するように設計される。所与の株についての現実の解の境界は基質の（１つまたは複数の）取り込み速度が増大または低下するにつれて拡張または収縮するが、各実験点は、その計算された解の境界内にある。これらのようなプロットは、設計された株が、どれくらいの余地が改善に利用可能であるかをも示すその性能限界にどれほど近いかの正確な予測を可能にする。
図１６に示すように、増殖連結型生化学的生成をもたらす遺伝子欠失を特定するＯｐｔＫｎｏｃｋ数学フレームワークを例示する。この手順は、物理化学的制約の支配が連続的に課せられることにより細胞系が提示できる可能な表現型の範囲を狭くする、制約に基づく代謝モデリングを基礎とする（Ｐｒｉｃｅら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２巻、８８６〜９７頁（２００４年））。上記に記載のように、制約に基づくモデルおよびシミュレーションは当技術分野で周知であり、一般に、ネットワーク化学量論にさらした特定の細胞目的の最適化を引き起こして、可能性の高いフラックス分布を示唆する。
簡単に述べると、Ｎ＝｛１，．．．，Ｎ｝の代謝産物のセットおよびＭ＝｛１，．．．，Ｍ｝の代謝反応のセットを含む定常状態の代謝ネットワークについて凝集反応フラックスとして定量化される細胞目的の最大化は、以下のように数学的に表される：
Figure 2014147400
 ここで、Ｓｉｊは、反応ｊにおける代謝産物ｉの化学量論係数であり、ｖｊは反応ｊのフラックスであり、ｖ基質＿取り込みは、制限している（１つまたは複数の）基質の想定または測定された（１つまたは複数の）取り込み速度を表し、ｖａｔｐ＿主は、非増殖関連のＡＴＰ維持の必要量である。ベクトルｖは、内部フラックスも外部フラックスも含む。この研究で、細胞目的は、バイオマス形成に必要な比率での生合成前駆体の排出であることがしばしば想定される、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ， Ｆ．Ｃ．ら、第２版、１９９６年、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．：ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ． ２ｖ．（ｘｘ，２８２２，ｌｘｘｖｉ）。フラックスは一般に、１ｇＤＷ・ｈｒ（乾燥重量グラム掛ける時間）当たりで報告され、その結果バイオマス形成は、生成されたバイオマスのｇ／ｇＤＷ・ｈｒまたは１／ｈｒとして表される。
遺伝子欠失、したがって反応の消失のモデリングは、制約に基づく手法のフレームワークへの２値変数の組込みを最初に使用する、Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ、７４巻、３６４〜３７５頁（２００１年）、Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ、１７巻、７９１〜７９７頁（２００１年）。これらの２値変数
Figure 2014147400
 は、反応ｊが活性である場合に１の値を、活性でない場合に０の値を想定する。以下の制約
Figure 2014147400
 は、変数ｙｊが０に等しい場合のみ反応フラックスｖｊが０に設定されることを確実にする。あるいは、ｙｊが１に等しいとき、ｖｊは下方のｖｊ 最小と上方のｖｊ 最大の境界間の任意の値に自由に想定される。ここで、ｖｊ 最小およびｖｊ 最大は、上記に記載のネットワーク制約にさらしたあらゆる反応フラックスをそれぞれ最小化および最大化することによって同定される、Ｍａｈａｄｅｖａｎら、Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ、５巻、２６４〜７６頁（２００３年）。
最適な遺伝子／反応ノックアウトは、生じたネットワークについての最適増殖の解法が対象とする化学物質を過剰に生成するように活性反応のセット（ｙｊ＝１）を選択する、２層の最適化問題を解決することによって同定される。図式的に、この２層の最適化問題を図２に示す。数学的に、この２層の最適化問題は、以下の２層の混合整数最適化問題として表される：
Figure 2014147400
ここで、ｖ化学物質は所望の標的生成物、例えば２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸、メタクリル酸、または他の生化学的生成物の生成であり、Ｋは許容可能なノックアウトの数である。Ｋを０とおくと、完全なネットワークの最大のバイオマスの解が返され、一方Ｋを１とおくと、生じたネットワークが、その最大のバイオマス収率が得られる最大の過剰生成を含むような、単一の遺伝子／反応ノックアウト（ｙｊ＝０）が同定されることに留意されたい。最終的な制約は、生じたネットワークが最小のバイオマス収率を満たすことを確実にする。Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ、８４巻、６４７〜５７頁（２００３年）はモデル式および解法の手順についてより詳細に説明している。ＩＢＭ ＲＳ６０００〜２７０ワークステーションのモデリング環境で、ＧＡＭＳ、Ｂｒｏｏｋｅら、ＧＡＭＳ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９９８年）を介してアクセスするＣＰＬＥＸ８．０、ＧＡＭＳ： Ｔｈｅ Ｓｏｌｖｅｒ Ｍａｎｕａｌｓ、２００３年、ＧＡＭＳ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎを用いて、分から時間のオーダーで数百の２値変数を含有する問題を解決することができる。ＯｐｔＫｎｏｃｋフレームワークは既に生化学的過剰生成に有望な遺伝子欠失戦略を同定できており、Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ、８４巻、６４７〜５７頁（２００３年）、Ｐｈａｒｋｙａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
Ｂｉｏｅｎｇ、８４巻、８８７〜８９９頁（２００３年）、また代謝および制御モデリングフレームワークにおける将来の改善を自然に包含する体系的なフレームワークを確立する。
上記の方法は、破壊する１セットの代謝反応を提供する。セット内の各反応の除去または代謝改変は、生物体の増殖期の間の必須の生成物として、所望の生成物をもたらすことができる。反応が知られているので、２層の（ｂｉｌｅｖｅｌ）ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題の解決は、反応セット内の各反応を触媒する１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の関連遺伝子も提供する。反応セットおよび各反応に関与する酵素をコードするそれらの対応遺伝子の同定は、一般に自動化されたプロセスであり、その反応と、酵素およびコード遺伝子の間の関係を有する反応データベースとの相関関係を通して達成される。
同定されると、標的細胞または生物体において、所望の生成物の生成を達成するために破壊される反応セットが、セット内の各代謝反応をコードする少なくとも１つの遺伝子の機能的破壊によって実施される。反応セットの機能的破壊を達成する１つの特に有用な手段は、各コード遺伝子の欠失によるものである。しかし、一部の例では、例えば、突然変異、プロモーターもしくは調節因子のためのシス結合部位などの調節領域の欠失を含む他の遺伝子異常、またはいくつかの場所のいずれかにおけるコード配列の切断によって反応を破壊することが有益となることがある。例えば、生成物の連結の速やかな評価が所望され、または遺伝子復帰突然変異が起こる可能性がより低い場合、遺伝子セットの全体未満の欠失をもたらすこれらの後者の異常が有用なことがある。
所望の生成物の増殖連結型の生合成を含む生合成をもたらすことができる破壊すべきさらなる反応セットまたは代謝改変をもたらす上記の２層のＯｐｔＫｎｏｃｋ問題のさらなる生産的解法を特定するために、整数カットと呼ばれる最適化法を実施することができる。この方法は、各反復での整数カットと呼ばれる追加の制約の組込みで、上に例示されるＯｐｔＫｎｏｃｋ問題を反復して解決することによって進行する。整数カット制約は、解決手法が、生成物生合成を増殖に不可避的に連結する任意の前の反復で特定されるものと正確に同じ反応セットを選択することを、効果的に防止する。例えば、前に特定された増殖連結型の代謝改変が破壊のための反応１、２および３を特定する場合、以下の制約は、その後の解法で同じ反応が同時に考慮されることを防止する。整数カット法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． １７巻、７９１〜７９７頁（２００１年）に記載されているのを見ることができる。代謝モデル化およびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータフレームワークと組み合わせたそれらの使用に関して本明細書で記載される全ての方法と同様に、反復性コンピュータ分析でのリダンダンシーを減らす整数カット法は、例えばＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）を含む当技術分野で周知である他のコンピュータフレームワークとともに適用することもできる。
上記の形の制約により、以前に同定されたセットを含む大きな反応セットの同定が除外される。例えば、さらなる反復で上記の整数カット最適化法を使用すると、以前に同定されているため、破壊について反応１、２、および３を特定する四重の反応セットの同定が除外される。生成物の増殖連結型生成をもたらす全ての可能な反応セットの同定を確実にするために、整数カット法の変法が使用された。
簡単に述べると、改変型の整数カット手順は、野生型ネットワークについて最適な増殖で所望の生化学物質の最大の生成を計算する「０」の反復から始まる。この計算は、Ｋを０とおいたＯｐｔＫｎｏｃｋの解に対応する。次に、単一のノックアウトを考慮し、２つのパラメータのセットｏｂｊｓｔｏｒｅｉｔｅｒおよびｙｓｔｏｒｅｉｔｅｒ，ｊを導入して、各反復、ｉｔｅｒで目的の機能（ｖ化学物質）および反応のオンオフの情報（ｙｊ）をそれぞれ蓄える。次いで、各反復でＯｐｔＫｎｏｃｋ式に以下の制約を連続的に加える。
Figure 2014147400
 上記の式において、εおよびＭはそれぞれ小さな数および大きな数である。一般に、εは約０．０１に設定でき、Ｍは約１０００に設定できる。しかし、これらの数より小さな数および／または大きな数を用いることもできる。Ｍは、制約が、以前に同定されたノックアウト戦略のみに結合できることを確実にし、一方εは、以前に同定された戦略にノックアウトを加えると、最適な増殖で生化学的生成が少なくともεだけ増加しなければならないことを確実にする。この手法は、単一欠失戦略で野生型株が改善されない場合にはいつでも二重欠失に移動する。次いで二重欠失戦略で野生型株が改善されない場合には三重欠失を考慮する、などとなる。最終結果は、少なくとも１つのノックアウトによって互いに異なる別々の欠失戦略の、最適な増殖での所望の生化学的生成として表される順位付けリストとなる。破壊した場合に生化学的生成物の増殖連結型生成をもたらすこの最適化手順ならびに多種多様な反応セットの同定について、下記でさらに詳細に例示する。本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、本明細書で例示される方法および代謝の工学的設計が、細胞または微生物の増殖と任意の生化学的生成物との強制的な連結に適用可能であることを理解するであろう。
本明細書で例示される方法は、所望の生成物を生合成的に生成する細胞および生物体の構築を可能にし、それには、特定された遺伝子改変を抱えるように設計製作された細胞または生物体の増殖への、標的生化学生成物の生成の必須の連結が含まれる。したがって、本明細書で記載されるコンピュータ方法は、ＯｐｔＫｎｏｃｋまたはＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）から選択されるコンピュータ方法によって特定される代謝改変の同定および実行を可能にする。代謝改変のセットには、例えば、１つまたは複数の生合成経路の酵素の付加および／または、例えば遺伝子欠失による破壊を含む１つまたは複数の代謝反応の機能的破壊を含めることができる。
上記のように、ＯｐｔＫｎｏｃｋ方法は、長期の増殖選択に曝した場合、突然変異体微生物ネットワークをコンピュータによって予測されるそれらの最大増殖表現型の方へ進化させることができるという前提で開発された。言い換えると、本手法は、選択圧の下で自己最適化する生物体の能力を導入する。ＯｐｔＫｎｏｃｋフレームワークは、ネットワーク化学量論に基づいて生化学的生成と細胞増殖との間の連結を強制する遺伝子欠失組合せの網羅的な列挙を可能にする。最適遺伝子／反応ノックアウトの同定は、生じたネットワークについての最適増殖の解法が対象とする生化学物質を過剰に生産するように活性反応セットを選択する、２層の最適化問題の解決を必要とする（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８４巻、６４７〜６５７頁（２００３年））。
前に例示され、例えば米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号に記載されるように、代謝経路に必要不可欠な遺伝子を同定するために、Ｅ．ｃｏｌｉ代謝のコンピュータ化学量論モデルを使用することができる。本明細書で開示されるように、ＯｐｔＫｎｏｃｋ数学フレームワークを、所望の生成物の増殖連結型生成をもたらす正確な遺伝子欠失に適用することができる。さらに、２層のＯｐｔＫｎｏｃｋ問題の解決は、１セットの欠失だけを提供する。全ての意味がある解決、すなわち増殖連結型生成の形成をもたらすノックアウトの全セットを列挙するために、整数カットと呼ばれる最適化技術を実施することができる。これは、上記のように、各反復での整数カットと呼ばれる追加の制約の組込みでＯｐｔＫｎｏｃｋ問題を反復して解決することを必要とする。
本明細書で開示されるように、ＯｐｔＫｎｏｃｋ戦略を用いて、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸などの所望の生成物の生成と増殖を連結する遺伝子ノックアウトを同定した（実施例ＸＸＩ〜ＸＸＩＩＩを参照）。ＯｐｔＫｎｏｃｋ戦略を用いて同定する一方、本明細書で開示されるように、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（商標）などのシステムを含む任意の適切なモデリングシステムを用いて、遺伝子ノックアウトを同定して所望の生成物の生成を増殖と連結できる株を開発することができることが理解される。本明細書で開示される遺伝子欠失戦略のいずれかを、２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸を生成する経路を有する、本明細書で開示される天然に存在しない微生物体のいずれかと適宜連結して、２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸の生成を増加させることができる。
したがって、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、タンパク質または酵素をコードする遺伝子中に生じている１つまたは複数の遺伝子破壊を含み、１つまたは複数の遺伝子破壊が前記生物体における３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸の生成の増加を付与する微生物体をさらに提供する。本明細書で開示されるように、遺伝子破壊は、増殖連結型である、または増殖連結型でない３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸の生成を付与することができる。例えば、１つまたは複数の遺伝子破壊は、表１０または１１に列挙したタンパク質または酵素をコードし得る（実施例ＸＸＩＩおよびＸＸＩＩＩを参照）。特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子破壊は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼおよびアセトアルデヒドＣｏＡデヒドロゲナーゼからなる群から選択されるタンパク質または酵素をコードし得る。さらなる実施形態では、生物体は、アスパルターゼ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰシンターゼ、ホスホエノールピルビン酸：ピルビン酸ホスホトランスフェラーゼ系、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、酢酸キナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＨデヒドロゲナーゼからなる群から選択されるタンパク質または酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子破壊をさらに含み得る。
したがって、本発明は、アルコールデヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、および乳酸デヒドロゲナーゼ（表６および８、設計１）における機能的破壊を含有する、ＭＡＡまたは３−ＨＩＢの収率が改善された生物体を提供する（実施例ＸＸＩＩおよびＸＸＩＩＩを参照）。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、アスパルターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼまたはＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのいずれか（表６、設計２、７、１０、１３；表８、設計２、８）におけるさらなる機能的破壊を有する生物体がさらに提供される。アスパルターゼ、およびＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰシンターゼまたはピルビン酸ギ酸リアーゼのいずれか（表６、設計３、５；表８、設計３、５）におけるさらなる機能的破壊を有する生物体がさらに提供される。ピルビン酸ギ酸リアーゼ、およびＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼまたはグルタミン酸デヒドロゲナーゼのいずれか（表６、設計４；表８、設計４）におけるさらなる機能的破壊を有する生物体も提供される。ＡＴＰシンターゼ、およびピルビン酸ギ酸リアーゼ、ＰＥＰ：Ｐｙｒ ＰＴＳを介したＤ−グルコース輸送、６−ホスホグルコノラクトナーゼまたはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれか（表６、設計６；表８、設計６、７）におけるさらなる機能的破壊を有する生物体がさらに提供される。グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびピルビン酸ギ酸リアーゼ（表６、設計８）におけるさらなる機能的破壊を有する生物体も提供される。酢酸キナーゼまたはホスホトランスアセチラーゼのいずれか（表６、設計９）におけるさらなる機能的破壊を有する生物体がさらに提供される。ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ、および６−ホスホグルコノラクトナーゼまたはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれか（表６、設計１１；表８、設計９ ｗ／ＴＨＤ２）におけるさらなる機能的破壊を有する生物体がさらに提供される。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、および６−ホスホグルコノラクトナーゼまたはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれか（表８、設計９ ｗ／ＧＬＵＤｙ）におけるさらなる機能的破壊を有する生物体がさらに提供される。ピルビン酸ギ酸リアーゼ（表６、設計１２）におけるさらなる機能的破壊を有する生物体も提供される。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、および酢酸キナーゼまたはホスホトランスアセチラーゼのいずれか（表６、設計１４）におけるさらなる機能的破壊を有する生物体がさらに提供される。
本明細書で開示されるように、１つまたは複数の遺伝子破壊は、１つまたは複数の遺伝子の欠失を含み得る。遺伝子欠失を含む遺伝子破壊のそのような方法は、本明細書で開示されるように、当業者に周知である。所望により、実質的に嫌気性の培地中で細胞を培養することができる。
１つまたは複数の遺伝子破壊を有する、本明細書で開示され上記および実施例ＸＸＩＩおよびＸＸＩＩＩで論じられる生物体を用いて、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸を生成する方法も提供される。したがって、本発明は、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸を生成する方法であって、タンパク質または酵素をコードする遺伝子中に生じている１つまたは複数の遺伝子破壊を含む天然に存在しない微生物体を培養することを含み、遺伝子破壊がタンパク質または酵素の活性を低下させる場合に、１つまたは複数の遺伝子破壊が、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸の生成と生物体の増殖との強制的な連結を付与し、それによって、前記１つまたは複数の遺伝子破壊が、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸の安定した増殖連結型の生成を生物体に付与する方法を提供する。
本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、酵素反応を破壊するには、反応に関与する１つまたは複数の酵素の触媒活性を破壊することが必要であることを理解するであろう。破壊は、例えば、コード遺伝子の欠失、またはコード遺伝子配列の１つもしくは複数における遺伝子変化の組込みを含む様々な手段によって行うことができる。破壊の標的とするコード遺伝子は、触媒活性に関与する酵素をコードする遺伝子の１つでもよく、いくつかでもよく、または全てでもよい。例えば、単一の酵素が標的とする触媒活性に関与する場合、コードされた遺伝子産物の触媒活性を低下させ、または壊す遺伝子変化によって破壊を行うことができる。同様に、単一の酵素がヘテロマーを含む多量体である場合、コードされた遺伝子産物の１つまたは全部のサブユニットの機能を低下させ、または壊す遺伝子変化によって破壊を行うことができる。活性の破壊は、活性な複合体を形成するための１つもしくは複数の結合活性の喪失、多量体の複合体の触媒サブユニットの破壊、または両方によって行うことができる。本発明の代謝反応を破壊するために、多量体タンパク質の結合および活性の他の機能を標的にすることもできる。そのような他の機能は当業者に周知である。さらに、本発明の反応または代謝改変に関与する１つまたは複数の酵素の触媒活性を低下または消失させるために、本発明に従って単一のポリペプチドまたは多量体の複合体の機能の一部または全部を破壊することができる。同様に、標的とする反応が破壊される限り、本発明の反応または代謝改変に関与する酵素の一部または全部を破壊することができる。
本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、共通遺伝子および／または同様のもしくは実質的に同じ活性を示すその遺伝子の１つもしくは複数のオルソログによってコードされる反応を低下させまたは除去することによって、酵素反応を破壊することができることも理解するであろう。共通遺伝子と全てのオルソログをどちらも低下させると、標的とする反応の任意の触媒活性の完全な消失をもたらし得る。しかし、共通遺伝子と１つまたは複数のオルソログのどちらかを破壊すると、増殖と生成物の生合成との連結を促進するのに十分な、標的とする反応の触媒活性の低下をもたらし得る。様々な代謝改変の触媒活性をコードする共通遺伝子ならびにそのオルソログがどちらも本明細書で例示される。当業者は、本発明の方法において、標的とする代謝反応の酵素をコードする遺伝子の一部または全部の破壊を実施し、増殖連結型の生成物の生成を達成するために本発明の天然に存在しない微生物体にそれを組み込むことができることを理解するであろう。
一部の実施形態では、遺伝子破壊は、完全な遺伝子欠失を含み得る。一部の実施形態では、遺伝子を破壊する他の手段には、例えば、オリゴヌクレオチドの削除もしくは付加、または遺伝子を作動不能にする突然変異によりフレームシフトさせることが含まれる。しかし、天然に存在しない生物体にその野生型への復帰からの安定性を付与し得るので、当業者は、遺伝子欠失の利点について認識するであろう。特に、遺伝子破壊は、本明細書で詳述する遺伝子を含む遺伝子セットから選択される。
予測された株の設計では生成物の形成とバイオマス形成が十分に連結されないことが決定した場合に、提唱された各株にさらなる欠失を補充することができる。あるいは、適応進化またはランダム突然変異誘発により、増殖条件下で著しい活性を有することが知られていないいくつかの他の酵素を活性にすることができ、それをノックアウトすることもできる。しかし、本明細書で提供される遺伝子欠失セットのリストは、高収率の増殖連結型３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸生成株を構築するための開始点となる。
当業者は、例えば、非生成的増殖期、その後に非増殖的生成期を提供することにより、非増殖連結型の生成によってＭＡＡ、２−ヒドロキシイソブチレート、または３−ヒドロキシイソブチレートを生成することもできることを認識するであろう。本明細書に記載の結果は、遺伝子欠失または遺伝子の機能的破壊の組合せが、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の生物体のＭＡＡ、２−ヒドロキシイソブチレート、または３−ヒドロキシイソブチレートの生成能力を著しく改善することを示す。Ｅ．ｃｏｌｉ以外の微生物体を産生宿主として選択する場合、生物体が、破壊に選び出した遺伝子産物のサブセットについて天然に活性を欠き、または低い活性を示す場合でも、株設計経路は同等に適用可能である。後者の場合、破壊を導入して、選択した産生宿主に天然に存在する遺伝子産物の酵素活性を消失または減弱させることができる。一部の実施形態では、コンピュータで決定された代謝経路のＭＡＡ、２−ヒドロキシイソブチレート、または３−ヒドロキシイソブチレートの増殖連結型生成は、設計された代謝の遺伝子型を有する株の構築によって確認することができる。代謝について工学的に操作されたこれらの細胞または生物体を適応進化に曝して、増殖連結型の生成物の生成をさらに増大させることもできる。一部の実施形態では、工学的に操作された細胞または生物体は、特定の代謝経路を通してフラックスを増加させる有益な遺伝子のさらなるコピーを組み込むこともできる。あるいは、別の生物体からの外因性遺伝子挿入を用いて、宿主生物体に存在しない機能を導入することができる。
本明細書に記載の設計戦略は、２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸の生成をエネルギー発生および／または酸化還元バランスと連結するので、増殖連結型の生成を増強するのに有用であるだけでなく、非増殖連結型の生成を増強するのにもよく適している。例示的な非増殖連結型の生成方法は、好気的増殖期、その後に嫌気的生成期を実施することを含む。例えば、Ｖｅｍｕｒｉら（Ｊ． Ｉｎｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２８巻（６号）、３２５〜３３２頁（２００２年））は、Ｅ．ｃｏｌｉでスクシネートを生成する二重期のプロセスについて記載している。Ｏｋｉｎｏら、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８１巻（３号）、４５９〜４６４頁（２００８年））は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株のある株における同様の非増殖連結型の生成プロセスについて記載している。
Ｄｕｒｎｅｒら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６６巻（８号）、３４０８〜３４１４頁（２０００年）に記載のように、別のそのような方法では、増殖した細胞培養物に必須栄養素を与えないでおき、それによって増殖を制限するが、生成は妨げられない。Ａｌｔａｍｉｒａｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．、７６巻、３５１〜３６０頁（２００１年）に記載のように、生成から増殖を分離することを目標とするさらに別の戦略では、増殖基質を、よりゆっくりと代謝可能である別の化合物と交換する。Ｂｌｏｍｂａｃｈら、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７９巻、４７１〜４７９頁（２００８年）に記載のように、特定の遺伝子改変によって増殖分離型の生成物形成をもたらすこともできる。
本発明の様々な実施形態の働きに実質的に影響を及ぼさない改変も、本明細書で提供される本発明の定義の範囲内で提供されるものと理解される。したがって、以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、限定するものではない。
（実施例Ｉ）
３−ヒドロキシイソブチレートを介したＭＡＡへのスクシニルＣｏＡの転換の経路
この実施例は、３−ヒドロキシイソブチレートを介したスクシニルＣｏＡからメタクリル酸への例示的なＭＡＡの合成経路を記載する。
ＭＡＡ合成の１つの例示的な経路はスクシニルＣｏＡから進行する（図２参照）。この経路は、スクシニルＣｏＡからＭＡＡを形成するために、少なくとも３つおよび最大５つの酵素ステップを使用する。この経路は酸化還元バランスがとれており、嫌気的条件下において副産物を形成せずに、それが潜在的にグルコース１ｍｏｌ当たり１．３３ｍｏｌの最大ＭＡＡ収率をもたらすことができることを示す。さらに、この経路はエネルギー効率が良く、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）活性が不可逆的であると考える（すなわち、オキサロアセテートへのＰＥＰのＡＴＰ生成カルボキシル化を触媒することができない）場合、ＭＡＡに代謝されるグルコース１モル当たり０．５のＡＴＰ、またはＰＥＰＣＫが可逆的であると考える場合１．７２のＡＴＰを生成することができる。後者のＡＴＰ収率は、グルコースからのラクテートまたはエタノールの形成からのＡＴＰ収率、すなわち代謝されるグルコース当たり２ＡＴＰに匹敵し、メタクリレート発酵は細胞増殖および維持に十分なエネルギーを生成することができることを示す。
この経路中（図２参照）、スクシニルＣｏＡは最初に（Ｒ）−メチルマロニルＣｏＡに転換され、これはエピメラーゼによって（Ｓ）−メチルマロニルＣｏＡに転換される可能性がある。メチルマロニルＣｏＡの（Ｒ）−または（Ｓ）−のいずれかの立体異性体は、（図２中に示すような）一対の酵素、またはアシルＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示す一種の酵素のいずれかによって、次いでそれぞれ（Ｒ）−または（Ｓ）−３−ヒドロキシイソブチレートに還元される。スクシニルＣｏＡから３−ヒドロキシイソブチレートへの経路はＷＯ２００７／１４１２０８中にも記載されている。最終ステップ中、３−ヒドロキシイソブチレートが脱水してＭＡＡが形成される。
この経路の首尾良い工学的操作は、十分な活性および特異性を有する適切な酵素のセットの同定を含む。これは、適切な酵素のセットの同定、生成宿主へのそれらの対応する遺伝子のクローニング、発酵条件の最適化、および発酵後の生成物形成に関するアッセイを伴う。メタクリル酸の生成用の生成宿主を工学的に操作するために、１つまたは複数の外因性ＤＮＡ配列を微生物中で発現させる。さらに、微生物は機能的に欠失した（１つまたは複数の）内因性遺伝子を有することができる。これらの改変は、再生可能なフィードストックを使用したメタクリル酸の生成を可能にする。
所望経路のそれぞれのステップを触媒する酵素をコードすることができる、いくつかの生化学的に特徴付けた候補遺伝子を以下に記載する。経路を工学的に操作するための宿主生物体としてのＥ．ｃｏｌｉの使用を記載するが、本質的に任意の適切な宿主生物体を使用することができる。具体的に挙げるのは、Ｅ．ｃｏｌｉに固有である遺伝子、および適切にクローニングおよび発現したときに適切な形質転換を触媒するために適用することができる他の生物体中の遺伝子である。
図２を参照すると、ステップ１はメチルマロニルＣｏＡムターゼが関与する（ＥＣ５．４．９９．２）。最初のステップでは、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＣＭ）によってスクシニルＣｏＡがメチルマロニルＣｏＡに転換される。Ｅ．ｃｏｌｉ中では、可逆性アデノシルコバラミン依存性ムターゼが３ステップ経路に関与し、プロピオネートへのスクシネートの転換をもたらす（Ｈａｌｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３９巻、４６２２〜４６２９頁（２０００年））。ＹｇｆＧの欠失と共にＭＣＭ遺伝子候補の過剰発現を使用して、プロピオニルＣｏＡへのメチルマロニルＣｏＡの脱カルボキシル化を妨げること、およびＭＡＡ合成に利用可能なメチルマロニルＣｏＡを最大にすることができる。ＭＣＭはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中では遺伝子ｓｃｐＡによってコードされており（ＢｏｂｉｋおよびＲａｓｃｈｅ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、３７５巻、３４４〜３４９頁（２００３年）；Ｈａｌｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３９巻、４６２２〜４６２９頁（２０００年））、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ中ではｍｕｔＡによってコードされている（ＰａｄｏｖａｎｉおよびＢａｎｅｒｊｅｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５巻、９３００〜９３０６頁（２００６年））。いくつかの他の生物体中では、ＭＣＭはαおよびβサブユニットを含有し、２つの遺伝子によってコードされている。２つのサブユニットタンパク質をコードする例示的な遺伝子候補は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｈｅｒｍａｎｉ種のｍｕｔＡおよびｍｕｔＢ（ＫｏｒｏｔｋｏｖａおよびＬｉｄｓｔｒｏｍ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９巻、１３６５２〜１３６５８頁（２００４年））、ならびにＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓのｍｃｍＡおよびｍｃｍＢ（ＫｏｒｏｔｋｏｖａおよびＬｉｄｓｔｒｏｍ、上記、２００４年）である。これらの遺伝子のタンパク質配列は、それらの対応するＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって同定することができる。
Figure 2014147400
 これらの配列を使用して、配列類似性検索（例えば、ＢＬＡＳＴｐ）によりＧｅｎＢａｎｋまたは他のデータベース中のホモログタンパク質を同定することができる。得られたホモログタンパク質およびそれらの対応する遺伝子配列は、生成宿主を作製するためのＥ．ｃｏｌｉまたは他の適切な宿主微生物への形質転換用の追加的な外因性ＤＮＡ配列をもたらす。追加的な遺伝子候補には、Ｅ．ｃｏｌｉのｓｐｃＡ遺伝子産物との高い相同性に基づいて同定した以下のものがある。
Figure 2014147400
 メチルマロニルＣｏＡムターゼ触媒遺伝子と隣接する遺伝子は、最大活性に寄与する証拠が存在する。例えば、Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ由来のｍｅａＢ遺伝子はメチルマロニルＣｏＡムターゼと複合体を形成し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでムターゼ活性を刺激し、かつ不可逆的失活からおそらくそれを保護することが実証されている（ＫｏｒｏｔｋｏｖａおよびＬｉｄｓｔｒｏｍ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９巻、１３６５２〜１３６５８頁（２００４年））。Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓのｍｅａＢ遺伝子産物は、染色体上でｓｃｐＡと隣接するＥ．ｃｏｌｉのａｒｇＫ遺伝子（ＢＬＡＳＴｐ：４５％同一、ｅ値：４ｅ−６７）の生成物と非常に類似している。Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ中のｍｅａＢホモログに関する配列はＧｅｎＢａｎｋに載っていない。しかしながら、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓのＫＰＡ１７１２０２遺伝子産物、ＹＰ＿０５５３１０．１はＭ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓのｍｅａＢタンパク質と５１％同一であり、かつその遺伝子も染色体上でメチルマロニルＣｏＡムターゼ遺伝子と隣接する。
Figure 2014147400
 Ｅ．ｃｏｌｉはアデノシルコバラミン、中間体コビナミドまたはコバラミンと供給される時だけこの反応に必要な補因子を合成することができる（ＬａｗｒｅｎｃｅおよびＲｏｔｈ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７巻、６３７１〜６３８０頁（１９９５年）；ＬａｗｒｅｎｃｅおよびＲｏｔｈ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１４２巻、１１〜２４頁（１９９６年））。あるいは、ｄｅ ｎｏｖｏでコバラミンを合成する能力が、異種遺伝子の発現後にＥ．ｃｏｌｉにおいて付与されている（Ｒａｕｘら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、７５３〜７６７頁（１９９６年））。
図２を参照すると、ステップ２はメチルマロニルＣｏＡエピメラーゼが関与する（ＥＣ５．１．９９．１）。経路中の第２の酵素、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ（ＭＭＣＥ）は、（Ｒ）−メチルマロニルＣｏＡを（Ｓ）−メチルマロニルＣｏＡに転換する。ＭＭＣＥは、奇数炭素の脂肪酸、およびアミノ酸バリン、イソロイシン、およびメチオニンの分解において必要な酵素である。メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ活性はＥ．ｃｏｌｉのゲノム中にコードされるとは考えられないが（Ｂｏｙｎｔｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、３０１５〜３０２４頁（１９９６年））、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ＹｑｊＣ）（ＦｕｌｌｅｒおよびＬｅａｄｌａｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２１３巻、６４３〜６５０頁（１９８３年））、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Ｍｃｅｅ）（ＢｏｂｉｋおよびＲａｓｃｈｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６巻、３７１９４〜３７１９８頁（２００１年））、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ（ＡＦ４５４５１１）（Ｆｕｌｌｅｒ．およびＬｅａｄｌａｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２１３巻、６４３〜６５０頁（１９８３年）；Ｈａｌｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９巻、４６２２〜４６２９頁（２０００年）；ＭｃＣａｒｔｈｙら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、９巻、６３７〜６４６頁、２００１年））およびＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ（ｍｍｃｅ）（Ｋｕｈｎｌら、ＦＥＢＳ Ｊ．、２７２巻、１４６５〜１４７７頁（２００５年））などの他の生物体中には存在する。この酵素ステップは、３−ヒドロキシイソ酪酸へのメチルマロニルＣｏＡの転換に使用される１つまたは複数の酵素の立体特異性に応じて必要とされる、または必要とされない可能性がある（ステップ３〜４、図２中）。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ中のＡＥ０１６８７７などの微生物中の追加的な遺伝子候補は高い配列相同性を有するが、実験によって確認されていない。
Figure 2014147400
 図２を参照すると、ステップ３はメチルマロニルＣｏＡレダクターゼが関与する（ＥＣ１．２．１．−）。図２中に示すように、その対応するアルコール、３−ヒドロキシイソブチレートへのメチルマロニルＣｏＡの還元は、２つの酵素ステップによって進行し得る。最初のステップ、メチルマロン酸セミアルデヒドへのメチルマロニルＣｏＡの転換は、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼによって実施される。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ由来のマロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子によってコードされる酵素（Ａｌｂｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８８巻、２４号、８５５１〜８５５９頁（２００６年））は、その対応するアルデヒドへのメチルマロニルＣｏＡの転換を触媒することが示されている（ＷＯ２００７１４１２０８）。同様の酵素がＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ中に存在する（Ａｌｂｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８８巻、２４号、８５５１〜８５５９頁（２００６年））。いくつかの追加的なＣｏＡデヒドロゲナーゼは、その対応するアルデヒドにアシルＣｏＡを還元することもできる。このような酵素をコードする例示的な遺伝子には、脂肪酸アシルＣｏＡレダクターゼをコードするＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓのａｃｒ１（ＲｅｉｓｅｒおよびＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７９巻、２９６９〜２９７５頁（１９９７年））、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種Ｍ−１脂肪酸アシルＣｏＡレダクターゼ（Ｉｓｈｉｇｅら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６８巻、１１９２〜１１９５頁（２００２年））、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ中のｓｕｃＤ遺伝子によってコードされるＣｏＡ−およびＮＡＤＰ−依存性コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、８７１〜８８０頁（１９９６年）；ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、８７１〜８８０頁（１９９６年））がある。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種中でｂｐｈＧによってコードされるアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをアシル化する酵素も良い候補である。分岐鎖状化合物イソブチルアルデヒドを酸化およびアシル化することが実証されているからである（Ｐｏｗｌｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７５巻、３７７〜３８５頁（１９９３年））。
Figure 2014147400
 図２を参照すると、ステップ４は３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼが関与する（ＥＣ１．１．１．３１）。３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼは、メチルマロン酸セミアルデヒドへの３−ヒドロキシイソブチレートの可逆的酸化を触媒する。この酵素はバリン、ロイシンおよびイソロイシンの分解と関係があり、細菌、真核生物、および哺乳動物中で同定されている。Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来のＰ８４０６７によってコードされる酵素は、構造的に特徴付けられている（Ｌｏｋａｎａｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３５２巻、９０５〜９１７頁（２００５年））。ヒト３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼの可逆性は、同位体標識した基質を使用して実証された（ＭａｎｎｉｎｇおよびＰｏｌｌｉｔｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２３１巻、４８１〜４８４頁（１９８５年））。この酵素をコードする追加的な遺伝子には、Ｈｏｍｏ
ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈａｗｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３２４巻、２１８〜２２８頁（２０００年））およびＯｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６０巻、２０４３〜２０４７頁（１９９６年）；Ｈａｗｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３２４巻、２１８〜２２８頁（２０００年））における３ｈｉｄｈ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにおけるｍｍｓｂ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａにおけるｄｈａｔ（ＡｂｅｒｈａｒｔおよびＨｓｕ．．Ｊ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｐｅｒｋｉｎ１］６巻、１４０４〜１４０６頁（１９７９年）；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６７巻、４３８〜４４１頁（２００３年）；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６０巻、２０４３〜２０４７頁（１９９６年））がある。
Figure 2014147400
 図２を参照すると、代替として、ステップ３および４は、組合せアルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼを含むことができる（ＥＣ１．２．１．−）。デュアルアシルＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する多機能酵素による１ステップ中で、メチルマロニルＣｏＡを３−ヒドロキシイソブチレートに還元することができる。３−ヒドロキシイソブチレートへのメチルマロニルＣｏＡの直接転換に関する証拠は報告されていない。しかしながら、この反応は、アルコールとアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の両方を有するＣｏＡ依存性酵素によって触媒される、アセチルＣｏＡからエタノールおよびブチリルＣｏＡからブタノールなどの一般的な転換と類似する。遺伝子候補には、Ｅ．ｃｏｌｉのａｄｈＥ（Ｋｅｓｓｌｅｒら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２８１巻、５９〜６３頁（１９９１年））、およびそれぞれアセチルＣｏＡおよびブチリルＣｏＡをエタノールおよびブタノールに還元することができる、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのｂｄｈＩおよびｂｄｈＩＩ（Ｗａｌｔｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７４巻、７１４９〜７１５８頁（１９９２年））がある。アセチルＣｏＡをエタノールに還元する以外に、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ中でａｄｈＥによってコードされる酵素は、分岐鎖状化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリルＣｏＡに酸化することが示されている（Ｋａｚａｈａｙａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１８巻、４３〜５５頁（１９７２年）；Ｋｏｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、２７巻、５０５〜５１０頁（２００５年））。メチルマロニルＣｏＡを直接３−ヒドロキシイソブチレートに転換するための追加的候補酵素は、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のマロニルＣｏＡレダクターゼによってコードされる（Ｈｕｇｌｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４巻、９号、２４０４〜２４１０頁（２００２年）。
Figure 2014147400
図２を参照すると、ステップ５は３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼが関与する（ＥＣ４．２．１．−）。最終ステップはメタクリル酸への３−ヒドロキシイソブチレートの脱水が関与する。この特異的な酵素的変換に関する直接の証拠は確認されていない。しかしながら、大部分のデヒドラターゼは水のα，β除去を触媒し、これは電子求引性カルボニル、カルボキシレート、またはＣｏＡ−チオールエステル基によるα−水素の活性化、およびβ−位置からのヒドロキシル基の除去を含む（ＢｕｃｋｅｌおよびＢａｒｋｅｒ、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１７巻、１２４８〜１２６０頁（１９７４年）；Ｍａｒｔｉｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１巻、１５６４５〜１５６４９頁（２００４年））。これはメタクリレート経路中の最終ステップに関して提唱されたまさにその型の変換である。さらに、この提唱された変換は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂａｒｋｅｒｉの２−（ヒドロキシメチル）グルタル酸デヒドラターゼと非常に類似している（図３Ａ）。この酵素はニコチネート異化との関連で研究されており、ｈｍｄによってコードされる（Ａｌｈａｐｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０３巻、１２３４１〜１２３４６頁（２００６年））。高い配列相同性を有する類似の酵素は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ、およびＮａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ中で見られる。これらの酵素は、［４Ｆｅ−４Ｓ］を含有する細菌のセリンデヒドラターゼ、例えばｔｄｃＧ、ｓｄｈＢ、およびｓｄａＡ）によってコードされるＥ．ｃｏｌｉの酵素のα−およびβ−サブユニットとも相同である。
Figure 2014147400
 フマレートへのマレートの脱水を天然に触媒するフマル酸ヒドラターゼ酵素は、追加的な候補セットとなる（図３Ｂ）。分岐鎖状基質に反応するフマル酸ヒドラターゼの能力は記載されていないが、この酵素に関する大量の構造情報が入手可能であり、他の研究者達はこの酵素を首尾良く工学的に操作して、活性、阻害および局在を変えている（Ｗｅａｖｅｒ、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、６１巻、１３９５〜１４０１頁（２００５年））。例示的な酵素候補には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅｓｔｅｖｅｚら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、１１巻、１５５２〜１５５７頁（２００２年）；ＨｏｎｇおよびＬｅｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇ．、９巻、２５２〜２５５頁（２００４年）；ＲｏｓｅおよびＷｅａｖｅｒ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１巻、３３９３〜３３９７頁（２００４年））、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（Ｓｍｉｔｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、３１巻、９６１〜９７５頁（１９９９年））およびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｍｉｚｏｂａｔａら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、３５５巻、４９〜５５頁（１９９８年））由来のｆｕｍＣ、およびＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来のｆｕｍＨ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８９巻、１９２３〜１９３１頁（１９８１年））によってコードされる酵素候補がある。高い配列相同性を有する類似の酵素には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のｆｕｍ１およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のｆｕｍＣがある。
Figure 2014147400
 この実施例は、スクシニルＣｏＡからＭＭＡを生成する生合成経路を記載する。
（実施例ＩＩ）
３−ヒドロキシイソブチレートを介したＭＡＡへのスクシニルＣｏＡの転換のための経路を有するＭＡＡ生成微生物体の調製
この実施例は、３−ヒドロキシイソブチレートを介してスクシニルＣｏＡからＭＡＡを生成することができる微生物体の作製を記載する。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、図２中に示すＭＡＡ経路を工学的に操作するための標的生物体として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉは、ＭＡＡを生成することができる天然に存在しない微生物を作製するのに良い宿主を提供する。Ｅ．ｃｏｌｉは遺伝子操作の影響を受けやすく、嫌気的または微好気的条件下で効率良く、エタノール、酢酸、ギ酸、乳酸、およびコハク酸のような、様々な生成物を生成することができることは公知である。
ＭＡＡを生成するように工学的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ株を作製するために、経路中で利用する酵素をコードする核酸を、周知の分子生物学の技術を使用してＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、１９９９年を参照）。特に、それぞれメチルマロニルＣｏＡムターゼ、その安定剤タンパク質、およびメチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ活性をコードするｓｃｐＡ（ＮＰ＿４１７３９２．１）、ａｒｇＫ（ＡＡＣ７５９５５．１）、およびＡＦ４５４５１１（ＡＡＬ５７８４６．１）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＥ１３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。さらに、それぞれメチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ活性をコードするｍｃｒ（ＮＰ＿３７８１６７）、ｄｈａｔ（Ｑ５９４７７．１）、およびｈｍｄ（ＡＢＣ８８４０７．１）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＡ３３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。２組のプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５に形質転換して、スクシニルＣｏＡから３−ヒドロキシイソブチレートの経路を介したＭＡＡ合成に必要なタンパク質および酵素を発現させる。
得られた遺伝子操作生物体は、当技術分野で周知の手順後、グルコース含有培地において培養する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、２００１年を参照）。Ｅ．ｃｏｌｉの宿主株をｄｅ ｎｏｖｏでコバラミンを合成するように操作しない限り、コバラミンをさらに培地に供給してムターゼ酵素の活性を確実にする（例えば、Ｒａｕｘら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８巻、７５３〜７６７頁（１９９６年）を参照）。ＭＡＡ合成遺伝子の発現は、例えば、ノーザンブロット、ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、イムノブロッティングなどを含めた、ポリペプチド発現または酵素活性を決定するための当技術分野で周知の方法を使用して裏付ける。発現される酵素の酵素活性は、個々の活性に特異的なアッセイを使用して確認する。ＭＡＡを生成する工学的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ株の能力は、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣＭＳ）および／または液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣＭＳ）を使用して確認する。
機能的ＭＡＡ合成経路を有するように操作した微生物株は、経路の有効利用のための最適化によってさらに増強する。簡単に述べると、工学的に操作された株を評価して、いずれの外因性遺伝子が律速レベルで発現されるかどうか決定する。例えば追加的遺伝子コピー数の導入によって、経路中の流れを制限し得る低レベルで発現する任意の酵素に関して発現は増大する。
より良い生産体を作製するために、代謝モデリングを利用して増殖条件を最適化する。モデリングをさらに使用して、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計する（例えば、米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、および米国特許第７，１２７，３７９号を参照）。モデリング解析によって、ＭＡＡのより良好な生成への代謝の移行の、細胞増殖に対する影響の信頼できる予測を与える。１つのモデリング法は、ＭＡＡのより良好な生成を一括してもたらす遺伝子ノックアウトを選択するために適用される２層最適化法ＯｐｔＫｎｏｃｋ（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．８４巻、６４７〜６５７頁（２００３年））である。適応進化を使用して、例えばＭＡＡ生成物のスクシニルＣｏＡ中間体の、より良い生産体を作製することもできる。適応進化を実施して増殖特性と生産特性の両方を改善する（ＦｏｎｇおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６巻、１０５６〜１０５８頁（２００４年）；Ａｌｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３１４巻、１５６５〜１５６８頁（２００６年））。結果に基づいて、後の数ラウンドのモデリング、遺伝子操作および適応進化をＭＡＡ生産体に施して、生産をさらに増大することができる。
ＭＡＡの大規模な生産用に、前述の生物体を当技術分野で公知の培地を使用して発酵槽中で培養して、嫌気的条件下での生物体の増殖を促進する。発酵は回分、流加または連続的な形で実施する。嫌気的条件は最初に窒素で培地をスパージし、次いで培養容器を密閉することによって維持し、例えば、フラスコは隔膜および圧着キャップで密閉することができる。限られた通気で隔膜中に小さな穴を与えることによって、微好気的条件を利用することもできる。培地のｐＨは、Ｈ２ＳＯ４などの酸を加えることによって約７のｐＨに保つ。増殖速度は分光光度計を使用して光学濃度を測定することによって決定し（６００ｎｍ）、グルコースの取り込み速度は経時的な炭素源の枯渇をモニターすることによって決定する。望ましくないアルコール、有機酸、および残留グルコースなどの副産物は、例えば、Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）シリーズのＨＰＬＣカラム（例えば、ＨＰＸ−８７シリーズ）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）を使用して、グルコースおよびアルコールに屈折率検出器、有機酸にＵＶ検出器を使用して、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＭＤ）によって定量化することができる（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７７５〜７７９頁（２００５年））。
この実施例は、３−ヒドロキシイソブチレートを介してスクシニルＣｏＡからＭＡＡを生成することができる微生物体の調製を記載する。
（実施例ＩＩＩ）
３−アミノ−２−メチルプロパノエートを介したＭＡＡへのスクシニルＣｏＡの転換のための経路
この実施例は、３−アミノ−メチルプロパノエートを介したスクシニルＣｏＡからＭＡＡへの例示的なＭＡＡ合成経路を記載する。
ＭＡＡ生合成の別の例示的な経路は、３−アミノ−２−メチルプロパノエートを介してスクシニルＣｏＡから進行する（図４参照）。この経路は嫌気的条件下において高収率であり、最大理論収率はグルコース１ｍｏｌ当たりＭＡＡ１．３３ｍｏｌである。この経路はエネルギー効率も良く、ＰＥＰカルボキシキナーゼが可逆的に作用することができるという想定下で、最大生成物収率でグルコース１ｍｏｌ当たり１．５５ｍｏｌのＡＴＰを生成することができる。
メチルマロン酸セミアルデヒドへのスクシニルＣｏＡの転換を含む、この経路の最初の３ステップは、実施例Ｉ中に記載したスクシニルＣｏＡからＭＡＡへの経路と同一である（図２参照）。この経路はステップ４で分岐し、そこでメチルマロン酸セミアルデヒドはトランスアミナーゼによって３−アミノ−２−メチルプロピオネートに変換される。最終経路のステップは、メタクリル酸への３−アミノ−２−メチルプロピオネートの脱アミノ化を伴う。
最初の３経路ステップを触媒するための酵素および遺伝子候補は、実施例Ｉ中に記載する。ステップ４および５の遺伝子候補は以下で論じる。
図４を参照すると、ステップ４は３−アミノ−２−プロピオン酸メチルトランスアミナーゼに関与する（ＥＣ２．６．１．２２）。３−アミノ−２−プロピオン酸メチルトランスアミナーゼは、メチルマロン酸セミアルデヒドから３−アミノ−２−メチルプロピオネートへの変換を触媒する。Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓおよびＳｕｓ ｓｃｒｏｆａにおいて特徴付けられＡｂａｔによってコードされる酵素は、経路中の対象とする方向にこの変換を触媒することが示されている（Ｋａｋｉｍｏｔｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１５６巻、３７４〜３８０頁（１９６８年）；Ｔａｍａｋｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３２４巻、３７６〜３８９頁（２０００年））。３−アミノ−２−プロピオン酸メチルトランスアミナーゼと高い配列相同性を有する、他の生物における酵素候補には、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ中のＧｔａ−１およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ中のｇａｂＴがある。さらに、遺伝子ｇａｂＴによってコードされるＥ．ｃｏｌｉ中の天然ＧＡＢＡアミノトランスフェラーゼの１つは、広範囲の基質特異性を有することが示されており、基質として３−アミノ−２−メチルプロピオネートを利用することができる（Ｌｉｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４３巻、１０８９６〜１０９０５頁（２００４年）；Ｓｃｈｕｌｚら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５６巻、１〜６頁（１９９０年））。
Figure 2014147400
 図４を参照すると、ステップ５は３−アミノ−２−プロピオン酸メチルアンモニアリアーゼが関与する（ＥＣ４．３．１．−）。この経路の最終ステップ中、３−アミノ−２−メチルプロピオネートはメタクリル酸に脱アミノ化される。この正確な変換を触媒する酵素は実験によって実証されていないが、しかしながら、天然Ｅ．ｃｏｌｉ酵素、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ（ＥＣ４．３．１．１）は、この反応を触媒することができる可能性がある（図５Ａ参照）。Ｅ．ｃｏｌｉ中でａｓｐＡによってコードされるアスパラギン酸アンモニアリアーゼは、アスパルテートを脱アミノ化してフマレートを形成するが、別の基質アスパラギン酸フェニルメチルエステル、アスパラギン、ベンジル−アスパルテートおよびマレートと反応することもできる（Ｍａら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６７２巻、６０〜６５頁（１９９２年））。別の研究では、定方向進化をこの酵素に利用して基質特異性を変えていた（Ａｓａｎｏら、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．２２巻、９５〜１０１頁（２００５年））。他の生物体中のアスパルターゼをコードする遺伝子には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ中のａｎｓＢ（Ｓｊｏｓｔｒｏｍら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１３２４巻、１８２〜１９０頁（１９９７年））、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｔａｋａｇｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、９６巻、５４５〜５５２頁（１９８４年）；Ｔａｋａｇｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１００巻、６９７〜７０５頁（１９８６年））およびＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（Ｔａｋａｇｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６１巻、１〜６頁（１９８５年））中のａｓｐＡがある。
Figure 2014147400
 この実施例は、スクシニルＣｏＡからのＭＡＡ生合成経路を記載する。
（実施例ＩＶ）
３−アミノ−２−メチルプロパノエートを介したＭＡＡへのスクシニルＣｏＡの転換のための経路を有するＭＡＡ生成微生物体の調製
この実施例は、３−アミノ−２−メチルプロパノエートを介してスクシニルＣｏＡからＭＡＡを生成することができる微生物体の作製を記載する。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、図４中に示すＭＡＡ経路を工学的に操作するための標的生物体として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉは、ＭＡＡを生成することができる天然に存在しない微生物を作製するのに良い宿主を提供する。Ｅ．ｃｏｌｉは遺伝子操作の影響を受けやすく、嫌気的または微好気的条件下で効率良く、エタノール、酢酸、ギ酸、乳酸、およびコハク酸のような、様々な生成物を生成することができることは公知である。
ＭＡＡを生成するように操作されたＥ．ｃｏｌｉ株を作製するために、経路中で利用する酵素をコードする核酸を、周知の分子生物学の技術を使用してＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、１９９９年を参照）。特に、それぞれメチルマロニルＣｏＡムターゼ、その安定剤タンパク質、およびメチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ活性をコードするｓｃｐＡ（ＮＰ＿４１７３９２．１）、ａｒｇＫ（ＡＡＣ７５９５５．１）、およびＡＦ４５４５１１（ＡＡＬ５７８４６．１）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＥ１３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。さらに、それぞれメチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−プロピオン酸メチルトランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−プロピオン酸メチルアンモニアリアーゼ活性をコードするｂｐｈＧ（ＢＡＡ０３８９２．１）、ｇａｂＴ（Ｐ２２２５６．１）、およびａｓｐＡ（Ｐ０ＡＣ３８．１）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＡ３３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。２組のプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５に形質転換して、スクシニルＣｏＡから３−アミノ−２−メチルプロパノエートの経路を介したＭＡＡ合成に必要なタンパク質および酵素を発現させる。
得られた遺伝子操作生物体は、当技術分野で周知の手順後、グルコース含有培地において培養する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、２００１年を参照）。Ｅ．ｃｏｌｉの宿主株をｄｅ ｎｏｖｏでコバラミンを合成するように操作しない限り、コバラミンをさらに培地に供給してムターゼ酵素の活性を確実にする（例えば、Ｒａｕｘら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、７５３〜７６７頁（１９９６年）を参照）。ＭＡＡ合成遺伝子の発現は、例えば、ノーザンブロット、ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、イムノブロッティングなどを含めた、ポリペプチド発現または酵素活性を決定するための当技術分野で周知の方法を使用して裏付ける。発現される酵素の酵素活性は、個々の活性に特異的なアッセイを使用して確認する。ＭＡＡを生成する工学的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ株の能力は、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣＭＳ）および／または液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣＭＳ）を使用して確認する。
機能的ＭＡＡ合成経路を有するように操作した微生物株は、経路の有効利用のための最適化によってさらに増強する。簡単に述べると、工学的に操作された株を評価して、いずれの外因性遺伝子が律速レベルで発現されるかどうか決定する。例えば追加的遺伝子コピー数の導入によって、経路中の流れを制限し得る低レベルで発現する任意の酵素に関して発現は増大する。
より良い生産体を作製するために、代謝モデリングを利用して増殖条件を最適化する。モデリングをさらに使用して、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計する（例えば、米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、および米国特許第７，１２７，３７９号を参照）。モデリング解析によって、ＭＡＡのより有効な生成への代謝の移行の、細胞増殖に対する影響の信頼できる予測を与える。１つのモデリング法は、ＭＡＡのより良好な生成を一括してもたらす遺伝子ノックアウトを選択するために適用される２層最適化法ＯｐｔＫｎｏｃｋ（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．８４巻、６４７〜６５７頁（２００３年））である。適応進化を使用して、例えばＭＡＡ生成物のスクシニルＣｏＡ中間体の、より良い生産体を作製することもできる。適応進化を実施して増殖特性と生産特性の両方を改善する（ＦｏｎｇおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６巻、１０５６〜１０５８頁（２００４年）；Ａｌｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３１４巻、１５６５〜１５６８頁（２００６年））。結果に基づいて、後の数ラウンドのモデリング、遺伝子操作および適応進化をＭＡＡ生産体に施して、生産をさらに増大することができる。
ＭＡＡの大規模な生産用に、前述の生物体を当技術分野で公知の培地を使用して発酵槽中で培養して、嫌気的条件下での生物体の増殖を促進する。発酵は回分、流加または連続的な形で実施する。嫌気的条件は最初に窒素で培地をスパージし、次いで培養容器を密閉することによって維持し、例えば、フラスコは隔膜および圧着キャップで密閉することができる。限られた通気で隔膜中に小さな穴を与えることによって、微好気的条件を利用することもできる。培地のｐＨは、Ｈ２ＳＯ４などの酸を加えることによって約７のｐＨに保つ。増殖速度は分光光度計を使用して光学濃度を測定することによって決定し（６００ｎｍ）、グルコースの取り込み速度は経時的な炭素源の枯渇をモニターすることによって決定する。望ましくないアルコール、有機酸、および残留グルコースなどの副産物は、例えば、Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）シリーズのＨＰＬＣカラム（例えば、ＨＰＸ−８７シリーズ）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）を使用して、グルコースおよびアルコールに屈折率検出器、有機酸にＵＶ検出器を使用して、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＭＤ）によって定量化することができる（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７７５〜７７９頁（２００５年））。
この実施例は、３−アミノ−２−メチルプロパノエートを介してスクシニルＣｏＡからＭＡＡを生成することができる微生物体の調製を記載する。
（実施例Ｖ）
３−ヒドロキシイソ酪酸またはＭＡＡへの４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの転換のための経路
この実施例は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからの例示的な３−ヒドロキシイソ酪酸またはＭＡＡ合成経路を記載する。
別の例示的な経路はＭＡＡへの４ＨＢ−ＣｏＡの転換を伴う（図６参照）。最初のステップ中、４ＨＢ−ＣｏＡはメチルムターゼによって３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ（３−Ｈｉｂ−ＣｏＡ）に転換される。次いで３−Ｈｉｂ−ＣｏＡは、ＣｏＡヒドロラーゼ、シンターゼまたはトランスフェラーゼによって３−ヒドロキシイソブチレートに転換され得る。３−ヒドロキシイソブチレートが分泌され、生成物として、またはメタクリル酸の生成における最終ステップとして回収される可能性がある。３−ヒドロキシブチレートを脱水させてメタクリル酸を形成することが可能である。あるいは、３−Ｈｉｂ−ＣｏＡをメタクリリルＣｏＡに脱水させて、次いでヒドロラーゼ、シンターゼ、またはトランスフェラーゼによってＭＡＡに転換することが可能である。トリカルボン酸回路中間体、アルファ−ケトグルタレート、スクシネート、またはスクシニルＣｏＡを４ＨＢ−ＣｏＡに転換するのに必要な酵素は十分文書化されている（２００８年３月１４日出願のＢｕｒｋら、米国出願第１２／０４９，２５６号；Ｌｕｔｋｅ−ＥｖｅｒｓｌｏｈおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１８１巻、６３〜７１頁（１９９９年）；ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１２巻、１２１〜１２７頁（１９９３年）；ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、８７１〜８８０頁（１９９６年）；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２７巻、４３〜６０頁（１９９５年）；ＷｏｌｆｆおよびＫｅｎｅａｌｙ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、６巻、２０６〜２１２頁（１９９５年））。
嫌気的条件下では、経路のステップ２中（表１）でＣｏＡ−トランスフェラーゼまたはシンテターゼを利用して３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを３−ヒドロキシブチレートに転換する場合、最大理論生成物収率はグルコース１ｍｏｌ当たりＭＡＡ１．３３モルである。ヒドロラーゼを利用する場合、ＰＥＰカルボキシキナーゼがオキサロアセテートへのＡＴＰ生成方向に可逆的に作用すると想定しない限り、最大理論収率は１．１３ｍｏｌ／ｍｏｌに低下する。同様に、エネルギー収率は経路のステップ２中で利用する酵素の型に依存する。ＣｏＡ−シンテターゼをステップ２中で利用しＰＥＰカルボキシキナーゼが可逆的であると想定するとき、最高ＡＴＰ収率を得る。好気的条件下での生成物およびエネルギー収率は、３−ヒドロキシブチレートへの３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡの転換中で利用する酵素の型にも依存する。ＡＴＰおよび生成物の最大モル収率は、メタクリレートまたは３−ヒドロキシイソブチレートが生成されるかどうかと無関係に不変であろうことが理解される。さらに、ＡＴＰおよびＭＡＡの最大モル収率は、経路が図６中に示すようにメタクリルＣｏＡを介して進行する場合、不変であろうことが理解される。
Figure 2014147400
 図６を参照すると、ステップ１は４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼが関与する（ＥＣ５．４．９９．−）。３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡへの４ＨＢ−ＣｏＡの転換は未だ実験によって実証されていない。しかしながら、２つのメチルムターゼ、すなわち類似の反応を触媒するイソブチリルＣｏＡムターゼ（ＩＣＭ）およびメチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＣＭ）は、それらの対応する基質の構造類似性を考慮すると優れた候補である（図７）。メチルマロニルＣｏＡムターゼは、スクシニルＣｏＡをメチルマロニルＣｏＡに転換するコバラミン依存性酵素である（図７Ａ）。この酵素および適切な遺伝子候補はスクシニルＣｏＡからＭＡＡの経路中で論じた（実施例Ｉ参照）。
あるいは、ＩＣＭは提唱された変換を触媒することができた。ＩＣＭは、ブチリルＣｏＡの炭素骨格をイソブチリルＣｏＡに可逆的に再編成する、ＭＣＭファミリーにおけるコバラミン依存性メチルムターゼである（図７Ｂ）（Ｒａｔｎａｔｉｌｌｅｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４巻、３１６７９〜３１６８５頁（１９９９年））。Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍにおける新規なＩＣＭの近年の研究は、以前の実験と共に、活性部位近辺の１つのアミノ酸の変化は酵素の基質特異性を変える証拠を与える（Ｒａｔｎａｔｉｌｌｅｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４巻、３１６７９〜３１６８５頁（１９９９年）；Ｒｏｈｗｅｒｄｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７２巻、４１２８〜４１３５頁（２００６年））。これは、天然酵素が３ＨＩＢ−ＣｏＡへの４ＨＢ−ＣｏＡの転換を触媒することができない場合、その酵素は合理的な工学的操作を受けた可能性があることを示す。ホモ二量体酵素をコードする例示的なＩＣＭ遺伝子には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３中のｉｃｍＡ（Ａｌｈａｐｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３巻、１２３４１〜１２３４６頁（２００６年））およびＭｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ
ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ ＰＭ１中のＭｐｅ＿Ｂ０５４１がある（Ｒａｔｎａｔｉｌｌｅｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４巻、３１６７９〜３１６８５頁（１９９９年）；Ｒｏｈｗｅｒｄｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７２巻、４１２８〜４１３５頁（２００６年））。ヘテロ二量体酵素をコードする遺伝子には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ中のｉｃｍおよびｉｃｍＢ（Ｒａｔｎａｔｉｌｌｅｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４巻、３１６７９〜３１６８５頁（１９９９年）；Ｖｒｉｊｂｌｏｅｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８１巻、５６００〜５６０５頁（１９９９年）；Ｚｅｒｂｅ−Ｂｕｒｋｈａｒｄｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３巻、６５０８〜６５１７頁（１９９８年））がある。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＭＡ−４６８０中の遺伝子ｉｃｍＡおよびｉｃｍＢは、公知のＩＣＭと高い配列類似性を示す。
Figure 2014147400
 図６を参照すると、ステップ２は３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．４）、シンテターゼ（ＥＣ６．２．１．−）または３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）が関与する。ステップ５は、メタクリリルＣｏＡヒドロラーゼ、シンテターゼ、またはトランスフェラーゼが関与する。これらの変換は、ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）、およびＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ６．１．２．−）を含めた異なるクラスの酵素によって実施することができる。初期に論じたように、ＣｏＡトランスフェラーゼまたはＣｏＡシンテターゼを利用してこの変換を実施する場合（表１）、経路のエネルギー特性は最も好ましい。
ＣｏＡ−トランスフェラーゼファミリー中、アセテート−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）としても公知である、Ｅ．ｃｏｌｉの酵素アシルＣｏＡ：アセテート−ＣｏＡトランスフェラーゼは、イソブチレート（ＭａｔｔｈｉｅｓおよびＳｃｈｉｎｋ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８巻、１４３５〜１４３９頁（１９９２年））、バレレート（Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３巻、９０２〜９０８頁（１９６８年））およびブタノエート（Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら、上記、１９６８年）を含めた、様々な分岐状および直鎖状アシルＣｏＡ基質由来のアセテートにＣｏＡ成分を移動させることが示されている。この酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ種Ｋ１２中のａｔｏＡ（αサブユニット）およびａｔｏＤ（βサブユニット）（Ｋｏｒｏｌｅｖら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５８巻、２１１６〜２１２１頁（２００２年）；Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら、上記、１９６８年）、ならびにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０３２中のａｃｔＡおよびｃｇ０５９２（Ｄｕｎｃａｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８巻、５１８６〜５１９０頁（２００２年））によってコードされ、図６、ステップ２および５中に示す、望ましい３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ生体内変化を触媒するための理想的な候補となる。配列相同性による候補遺伝子にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＵＴ１８９中のａｔｏＤおよびａｔｏＡがある。類似した酵素はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ中にも存在する。
Figure 2014147400
 別の例示的なトランスフェラーゼの変換は、スクシニルＣｏＡ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ、およびブチリルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ活性をそれぞれ示すことが示されているＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉのｃａｔ１、ｃａｔ２、およびｃａｔ３の遺伝子産物によって触媒される（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、３号、８７１〜８８０頁（１９９６年）；Ｓｅｅｄｏｒｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０５巻、６号、２１２８〜２１３３頁（２００８年））。
Figure 2014147400
 嫌気性細菌Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来のグルタコネートＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１２）酵素は、二酸グルタコニルＣｏＡおよび３−ブテノイルＣｏＡと反応する（ＭａｃｋおよびＢｕｃｋｅｌ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４０５巻、２０９〜２１２頁（１９９７年））。この酵素をコードする遺伝子はｇｃｔＡおよびｇｃｔＢである。この酵素は、グルタリルＣｏＡ、２−ヒドロキシグルタリルＣｏＡ、アジピルＣｏＡおよびアクリリルＣｏＡを含めた他のＣｏＡ誘導体と共に、低減しているが検出可能な活性を有する（Ｂｕｃｋｅｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８巻、３１５〜３２１頁（１９８１年））。この酵素はクローニングされＥ．ｃｏｌｉにおいて発現された（Ｍａｃｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２６巻、４１〜５１頁（１９９４年））。
Figure 2014147400
 別の酵素候補は、ＣｏＡアクセプターとしてスクネシートを利用するスクシニルＣｏＡ：３−ケト酸ＣｏＡトランスフェラーゼを含む。例示的なスクシニルＣｏＡ：３−ケト酸ＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（Ｃｏｒｔｈｅｓｙ−Ｔｈｅｕｌａｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２巻、２５６５９〜２５６６７頁（１９９７年））およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｓｔｏｌｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、５３巻、３９６〜４０３頁（２００７年））中に存在する。
Figure 2014147400
 候補ＡＴＰシンテターゼは、ＡＤＰ形成アセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＤ、ＥＣ６．２．１．１３）、それらの対応する酸へのアシルＣｏＡエステルの転換とＡＴＰの同時合成を連結する酵素である。この酵素が基質としての３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡまたはメタクリリルＣｏＡと反応することは示されていないが、広範囲の基質特異性を有するいくつかの酵素は文献中に記載されている。ＡＦ１２１１によってコードされるＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のＡＣＤＩは、イソブチレート、イソペンタノエート、およびフマレートを含めた、様々な直鎖状および分岐鎖状基質に作用することが示された（ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４巻、６３６〜６４４頁（２００２年））。Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の酵素（スクシニルＣｏＡシンテターゼとして注釈をつける）は基質としてのプリオピオネート、ブチレート、分岐鎖状の酸（イソバレレートおよびイソブチレート）を受け入れ、正方向および逆方向に作用することが示された（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８２巻、２７７〜２８７頁（２００４年））。超好熱性クレン古細菌Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のＰＡＥ３２５０によってコードされるＡＣＤは全ての特徴付けられたＡＣＤの最も広い基質範囲を示し、アセチルＣｏＡ、イソブチリルＣｏＡ（好ましい基質）およびフェニルアセチルＣｏＡと反応した（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、上記、２００４年）。しかしながら、定方向進化または工学的操作を使用してこの酵素を改変し、生理的温度において宿主生物体を働かせることができる。Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉおよびＰ．ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来の酵素はいずれもクローニングされ、機能的に発現され、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて特徴付けされた（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、上記、２００４年；ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４巻、６３６〜６４４頁（２００２年））。
Figure 2014147400
 ＣｏＡヒドロラーゼファミリー中、酵素３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼは３−ＨＩＢＣｏＡに特異的であり、バリン分解中の所望の変換を効率よく触媒することが記載されている（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻、１４２４８〜１４２５３頁（１９９４年））。この酵素をコードする遺伝子には、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻、１４２４８〜１４２５３頁（１９９４年）；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３２４巻、２２９〜２４０頁（２０００年））およびＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、上記、２０００年）のｈｉｂｃｈがある。配列相同性による候補遺伝子にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｈｉｂｃｈおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓのＢＣ＿２２９２がある。
Figure 2014147400
 図６を参照すると、ステップ３は３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）が関与する。これは、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼによるＭＡＡへの３−ヒドロキシイソブチレートの脱水を伴う。この酵素の遺伝子候補はスクシニルＣｏＡからＭＡＡの経路中に記載する（実施例Ｉ参照）。さらに図６を参照すると、ステップ４は３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）が関与する。メタクリリルＣｏＡへの３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡの脱水は、クロトナーゼなどの可逆的３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼ（３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ＥＣ４．２．１．５５とも呼ばれる）またはエノイルＣｏＡヒドラターゼ（３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼ、ＥＣ４．２．１．１７とも呼ばれる）によって実施することができる。これらの酵素は一般に可逆的である（ＭｏｓｋｏｗｉｔｚおよびＭｅｒｒｉｃｋ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、８巻、２７４８〜２７５５頁（１９６９年）；Ｄｕｒｒｅら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、１７巻、２５１〜２６２頁（１９９５年））。クロトナーゼ酵素をコードする例示的な遺伝子は、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｂｏｙｎｔｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８巻、１１号、３０１５〜３０２４頁（１９９６年））、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ（ＨｉｌｌｍｅｒおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２１巻、３号、３５１〜３５４頁（１９７２年））、およびＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ（Ｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１８巻、５８５７号、１７８２〜１７８６頁（２００７年））中で見ることはできるが、後者の遺伝子の配列は公知ではない。脂肪酸βの酸化および／または様々なアミノ酸の代謝と関係があるエノイルＣｏＡヒドラターゼも、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを形成するためのクロトニルＣｏＡの水和を触媒することができる（ＡｇｎｉｈｏｔｒｉおよびＬｉｕ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１１巻、１号、９〜２０頁（２００３年）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１１７巻、１号、９９〜１０８頁（１９７８年）；Ｃｏｎｒａｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１１８巻、１号、１０３〜１１１頁（１９７４年））。Ｐ．ｐｕｔｉｄａのエノイルＣｏＡヒドラターゼ、ｐｈａＡおよびｐｈａＢは、フェニル酢酸の異化中に二重結合のヒドロキシル化を実施すると考えられる（Ｏｌｉｖｅｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻、６４１９〜６４２４頁（１９９８年））。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のｐａａＡおよびｐａａＢは類似した変換を触媒する（Ｏｌｉｖｅｒａら、上記、１９９８年）。最後に、ｍａｏＣ（ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８５巻、５３９１〜５３９７頁（２００３年））、ｐａａＦ（Ｉｓｍａｉｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０巻、３０４７〜３０５４頁（２００３年）；ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１３〜１１６頁：３３５〜３４６頁（２００４年）；ＰａｒｋおよびＹｕｐ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８６巻、６８１〜６８６頁（２００４年））、およびｐａａＧ（Ｉｓｍａｉｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０巻、３０４７〜３０５４頁（２００３年）；ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１３〜１１６頁：３３５〜３４６頁（２００４年）；ＰａｒｋおよびＹｕｐ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８６巻、６８１〜６８６頁（２００４年））を含めた、いくつかのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの遺伝子は、エノイルＣｏＡヒドラターゼの官能性を示すことが示されている。
Figure 2014147400
 この実施例は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸を生成する生合成経路を記載する。
（実施例ＶＩ）
ＭＡＡへの４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの転換のための経路を有するＭＡＡ生成微生物体の調製
この実施例は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＭＡＡを生成することができる微生物体の作製を記載する。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、図６中に示すＭＡＡ経路を工学的に操作するための標的生物体として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉは、ＭＡＡを生成することができる天然に存在しない微生物を作製するのに良い宿主を提供する。Ｅ．ｃｏｌｉは遺伝子操作の影響を受けやすく、嫌気的または微好気的条件下で効率良く、エタノール、酢酸、ギ酸、乳酸、およびコハク酸のような、様々な生成物を生成することができることは公知である。
ＭＡＡを生成するように操作されたＥ．ｃｏｌｉ株を作製するために、経路中で利用する酵素をコードする核酸を、周知の分子生物学の技術を使用してＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、１９９９年を参照）。特に、それぞれコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＣｏＡ依存性）、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、およびホスホトランスブチリラーゼ活性をコードするｓｕｃＤ（ＹＰ＿００１３９６３９４）、４ｈｂｄ（ＹＰ＿００１３９６３９３）、ｂｕｋ１（Ｑ４５８２９）、およびｐｔｂ（ＮＰ＿３４９６７６）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＥ１３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。Ｂｕｒｋら（２００８年３月１４日に出願の米国出願第１２／０４９，２５６号）中に記載されたように、この構築体はスクシニルＣｏＡからの４ＨＢ−ＣｏＡの生成を可能にする。さらに、それぞれ４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ活性をコードするｉｃｍＡ（ＣＡＢ４０９１２．１）、ｈｉｂｃｈ（Ｑ５ＸＩＥ６．２）およびｈｍｄ（ＡＢＣ８８４０７．１）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＡ３３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。２組のプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５に形質転換して、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの経路を介したＭＡＡ合成に必要なタンパク質および酵素を発現させる。
得られた遺伝子操作生物体は、当技術分野で周知の手順後、グルコース含有培地において培養する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、２００１年を参照）。Ｅ．ｃｏｌｉの宿主株をｄｅ ｎｏｖｏでコバラミンを合成するように操作しない限り、コバラミンをさらに培地に供給してムターゼ酵素の活性を確実にする（例えば、Ｒａｕｘら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８巻、７５３〜７６７頁（１９９６年）を参照）。ＭＡＡ合成遺伝子の発現は、例えば、ノーザンブロット、ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、イムノブロッティングなどを含めた、ポリペプチド発現または酵素活性を決定するための当技術分野で周知の方法を使用して裏付ける。発現される酵素の酵素活性は、個々の活性に特異的なアッセイを使用して確認する。ＭＡＡを生成する工学的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ株の能力は、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣＭＳ）および／または液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣＭＳ）を使用して確認する。
機能的ＭＡＡ合成経路を有するように操作した微生物株は、経路の有効利用のための最適化によってさらに増強する。簡単に述べると、工学的に操作された株を評価して、いずれの外因性遺伝子が律速レベルで発現されるかどうか決定する。例えば追加的遺伝子コピー数の導入によって、経路中の流れを制限し得る低レベルで発現する任意の酵素に関して発現は増大する。
より良い生産体を作製するために、代謝モデリングを利用して増殖条件を最適化する。モデリングをさらに使用して、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計する（例えば、米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、および米国特許第７，１２７，３７９号を参照）。モデリング解析によって、ＭＡＡのより良好な生成への代謝の移行の、細胞増殖に対する影響の信頼できる予測を与える。１つのモデリング法は、ＭＡＡのより良好な生成を一括してもたらす遺伝子ノックアウトを選択するために適用される２層最適化法ＯｐｔＫｎｏｃｋ（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．、８４巻、６４７〜６５７頁（２００３年））である。適応進化を使用して、例えばＭＡＡ生成物のスクシニルＣｏＡまたは４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ中間体の、より良い生産体を作製することもできる。適応進化を実施して増殖特性と生産特性の両方を改善する（ＦｏｎｇおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、３６巻、１０５６〜１０５８頁（２００４年）；Ａｌｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１４巻、１５６５〜１５６８頁（２００６年））。結果に基づいて、後の数ラウンドのモデリング、遺伝子操作および適応進化をＭＡＡ生産体に施して、生産をさらに増大することができる。
ＭＡＡの大規模な生産用に、前述の生物体を当技術分野で公知の培地を使用して発酵槽中で培養して、嫌気的条件下での生物体の増殖を促進する。発酵は回分、流加または連続的な形で実施する。嫌気的条件は最初に窒素で培地をスパージし、次いで培養容器を密閉することによって維持し、例えば、フラスコは隔膜および圧着キャップで密閉することができる。限られた通気で隔膜中に小さな穴を与えることによって、微好気的条件を利用することもできる。培地のｐＨは、Ｈ２ＳＯ４などの酸を加えることによって約７のｐＨに保つ。増殖速度は分光光度計を使用して光学濃度を測定することによって決定し（６００ｎｍ）、グルコースの取り込み速度は経時的な炭素源の枯渇をモニターすることによって決定する。望ましくないアルコール、有機酸、および残留グルコースなどの副産物は、例えば、Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）シリーズのＨＰＬＣカラム（例えば、ＨＰＸ−８７シリーズ）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）を使用して、グルコースおよびアルコールに屈折率検出器、有機酸にＵＶ検出器を使用して、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＭＤ）によって定量化することができる（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、７７５〜７７９頁（２００５年））。
この実施例は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＭＡＡを生成することができる微生物体の調製を記載する。
（実施例ＶＩＩ）
トレオ−３−メチルアスパルテートを介したＭＡＡへのアルファ−ケトグルタレートの転換のための経路
この実施例は、アルファ−ケトグルタレートからトレオ−３−メチルアスパルテートへの例示的なＭＡＡの合成経路を記載する。
ＭＡＡの生合成に関する別の例示的な経路は、アルファ−ケトグルタレート、ＴＣＡ回路中で生成されるＥ．ｃｏｌｉにおける代謝産物を介して進行する（図８参照）。この経路は好気的条件下において高収率であり、最大理論収率はグルコース１ｍｏｌ当たりＭＡＡ１．２ｍｏｌである（表２）。この経路は酸化還元バランスがとれておらず、ＭＡＡ合成はギ酸およびエタノールなどの発酵副産物の形成を必要とするので、嫌気的条件下での収率は低い。
Figure 2014147400
 酵素アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼによって触媒されるこの経路の最初のステップは、アミノ基をアスパラギン酸からアルファ−ケトグルタレートに移動させ、グルタミン酸およびオキサロ酢酸を形成する。その後の２ステップは、炭素骨格の再編成およびメサコン酸形成のためのその後の脱アミノ化を含む。これらの転換を触媒する酵素は、アミノ酸の発酵が可能である土壌中のＣｌｏｓｔｒｉｄｉａおよび他の生物体中でのグルタミン酸のエネルギー生成発酵において見られる（ＢｕｃｋｅｌおよびＢａｒｋｅｒ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１１７巻、１２４８〜１２６０頁（１９７４年））。これらの生物体中の経路の方向性は、生合成経路中のＭＡＡ合成に必要な方向と一致する。最終経路のステップは、メタクリル酸を生成するためのメサコン酸の脱カルボキシル化を伴う。
図８を参照すると、ステップ１はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１）が関与する。経路の最初のステップは、アミノ基をアスパラギン酸からアルファ−ケトグルタレートに移動させ、グルタミン酸およびオキサロ酢酸を形成する。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の遺伝子ａｓｐＣ（Ｙａｇｉら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１００巻、８１〜８４頁（１９７９年）；Ｙａｇｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１１３巻、８３〜８９頁（１９８５年））、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＡＴ２（Ｙａｇｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、９２巻、３５〜４３頁（１９８２年））、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＡＳＰ５（ｄｅ ｌａ Ｔｏｒｒｅら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、４６巻、４１４〜４２５頁（２００６年）；ＫｗｏｋおよびＨａｎｓｏｎ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．、５５巻、５９５〜６０４頁（２００４年）；ＷｉｌｋｉｅおよびＷａｒｒｅｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、１２巻、３８１〜３８９巻（１９９８年））は、この転換を触媒する酵素、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする。
Figure 2014147400
 図８を参照すると、ステップ２はグルタミン酸ムターゼ（ＥＣ５．４．９９．１）が関与する。ステップ２中、グルタミン酸の炭素直鎖をトレオ−３−メチルアスパルテートの分岐状構造に再編成する。この変換は、グルタミン酸ムターゼ、２つのサブユニットで構成されるコバラミン依存性酵素によって触媒される。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｈｌｅａｒｉｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ由来の２つのグルタミン酸ムターゼは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ機能的に発現されている（ＨｏｌｌｏｗａｙおよびＭａｒｓｈ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻、２０４２５〜２０４３０頁（１９９４年）；Ｒｅｉｔｚｅｒら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、５４巻、１０３９〜１０４２頁（１９９８年））。この２つのサブユニットタンパク質をコードする遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｈｌｅａｒｉｕｍ由来のｇｌｍＥおよびｇｌｍＳ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ由来のｍａｍＡおよびｇｌｍＥ、ならびにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ由来のｍｕｔＥおよびｍｕｔＳである（Ｓｗｉｔｚｅｒ、Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｍｕｔａｓｅ、２８９〜３０５頁、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２年））。
Figure 2014147400
 図８を参照すると、ステップ３は３−メチルアスパルターゼ（ＥＣ４．３．１．２）が関与する。β−メチルアスパルターゼまたは３−メチルアスパラギン酸アンモニアリアーゼとも呼ばれる３−メチルアスパルターゼは、メサコン酸へのトレオ−３−メチルアスパルテートの脱アミノ化を触媒する。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ由来の３−メチルアスパルターゼが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ機能的に発現され、結晶化されている（Ａｓｕｎｃｉｏｎら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、５７巻、７３１〜７３３頁（２００１年）；Ａｓｕｎｃｉｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７巻、８３０６〜８３１１頁（２００２年）；Ｂｏｔｔｉｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７巻、２９５３〜２９５５頁（１９８８年）；Ｇｏｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１巻、１０７４７〜１０７５６頁（１９９２年））。Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓでは、この酵素はＢＡＡ２８７０９によってコードされる（ＫａｔｏおよびＡｓａｎｏ、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１６８巻、４５７〜４６３頁（１９９７年））。Ｅ．ｃｏｌｉＹＧ１００２由来の３−メチルアスパルターゼも結晶化されているが（ＡｓａｎｏおよびＫａｔｏ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１１８巻、２５５〜２５８頁（１９９４年））、そのタンパク質配列はＧｅｎＢａｎｋなどの公のデータベース中には挙げられていない。配列相同性を使用して、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ中のＣＴＣ＿０２５６３およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７中のＥＣｓ０７６１を含めた追加的候補遺伝子を同定することができる。
Figure 2014147400
 図８を参照すると、ステップ４はメサコン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）が関与する。経路の最終ステップはメタクリル酸へのメサコネートの脱カルボキシル化を伴う。この正確な反応を触媒する酵素は実験によって実証されていない。しかしながら、非常に類似した反応を触媒するいくつかの酵素が存在する（図９）。密接に関連した機能を有する１つの酵素はアコニット酸デカルボキシラーゼである（図９Ａ）。この酵素は、Ｃａｎｄｉｄａおよび糸状真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓの株における、イタコネートの生合成中の最終ステップを触媒する（Ｂｏｎｎａｒｍｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７７巻、３５７３〜３５７８頁（１９９５年）；ＷｉｌｌｋｅおよびＶｏｒｌｏｐ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５６巻、２８９〜２９５頁（２００１年））。イタコネートはバイオテクノロジーの対象とする化合物であるが、アコニット酸デカルボキシラーゼ遺伝子を同定またはクローニングするための努力はこれまでなされていない。
類似した機能を有する第２の酵素は４−オキサロクロトンデカルボキシラーゼである。（図９Ｂ）。この酵素は様々な生物体において一般的であり、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（株６００）由来の酵素をコードする遺伝子はＥ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ発現されている（Ｓｈｉｎｇｌｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７４巻、７１１〜７２４頁（１９９２年））。メサコネート中のメチル基は立体障害を引き起こす可能性があるが、この問題は定方向進化またはタンパク質工学によって克服される可能性がある。４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼは２つのサブユニットから構成される。この酵素をコードする遺伝子には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（株６００）中のｄｍｐＨおよびｄｍｐＥ（Ｓｈｉｎｇｌｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．ｊ、１７４巻、７１１〜７２４頁（１９９２年））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のｘｙｌＩＩおよびｘｙｌＩＩＩ（ＫａｔｏおよびＡｓａｎｏ、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１６８巻、４５７〜４６３頁（１９９７年）；Ｓｔａｎｌｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９巻、７１８〜７２６頁（２０００年））、ならびにＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＪＭＰ１３４由来のＲｅｕｔ＿Ｂ５６９１およびＲｅｕｔ＿Ｂ５６９２がある（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５８巻、７９〜８３頁（１９８４年））。
Figure 2014147400
 この実施例は、アルファ−ケトグルタレートからＭＭＡを生成する生合成経路を記載する。
（実施例ＶＩＩＩ）
トレオ−３−メチルアスパルテートを介したＭＡＡへのアルファ−ケトグルタレートの転換のための経路を有するＭＡＡ生成微生物体の調製
この実施例は、トレオ−３−メチルアスパルテートを介してアルファ−ケトグルタレートからＭＡＡを生成することができる微生物体の作製を記載する。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、図８中に示すＭＡＡ経路を工学的に操作するための標的生物体として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉは、ＭＡＡを生成することができる天然に存在しない微生物を作製するのによい宿主を提供する。Ｅ．ｃｏｌｉは遺伝子操作の影響を受けやすく、嫌気的または微好気的条件下で効率良く、エタノール、酢酸、ギ酸、乳酸、およびコハク酸のような、様々な生成物を生成することができることは公知である。
ＭＡＡを生成するように操作されたＥ．ｃｏｌｉ株を作製するために、経路中で利用する酵素をコードする核酸を、周知の分子生物学の技術を使用してＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、１９９９年を参照）。特に、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびグルタミン酸ムターゼ活性をコードするａｓｐＣ（ＮＰ＿４１５４４８．１）、ｇｌｍＥ（Ｐ８００７７．２）、およびｇｌｍＳ（Ｐ８００７８．２）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＥ１３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。さらに、３−メチルアスパラギン酸およびメサコン酸デカルボキシラーゼ活性をコードするＭＡＬ（ＡＡＢ２４０７０．１）、ｄｍｐＨ（ＣＡＡ４３２２８．１）、およびｄｍｐＥ（ＣＡＡ４３２２５．１）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＡ３３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。２組のプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５に形質転換して、アルファ−ケトグルタレートからトレオ−３−メチルアスパルテートの経路を介したＭＡＡ合成に必要なタンパク質および酵素を発現させる。
得られた遺伝子操作生物体は、当技術分野で周知の手順後、グルコース含有培地において培養する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、２００１年を参照）。Ｅ．ｃｏｌｉの宿主株をｄｅ ｎｏｖｏでコバラミンを合成するように操作しない限り、コバラミンをさらに培地に供給してムターゼ酵素の活性を確実にする（例えば、Ｒａｕｘら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、７５３〜７６７頁（１９９６年）を参照）。ＭＡＡ合成遺伝子の発現は、例えば、ノーザンブロット、ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、イムノブロッティングなどを含めた、ポリペプチド発現または酵素活性を決定するための当技術分野で周知の方法を使用して裏付ける。発現される酵素の酵素活性は、個々の活性に特異的なアッセイを使用して確認する。ＭＡＡを生成する工学的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ株の能力は、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣＭＳ）および／または液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣＭＳ）を使用して確認する。
機能的ＭＡＡ合成経路を有するように操作した微生物株は、経路の有効利用のための最適化によってさらに増強する。簡単に述べると、工学的に操作された株を評価して、いずれの外因性遺伝子が律速レベルで発現されるかどうか決定する。例えば追加的遺伝子コピー数の導入によって、経路中の流れを制限し得る低レベルで発現する任意の酵素に関して発現は増大する。
より良い生産体を作製するために、代謝モデリングを利用して増殖条件を最適化する。モデリングをさらに使用して、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計する（例えば、米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、および米国特許第７，１２７，３７９号を参照）。モデリング解析によって、ＭＡＡのより良好な生成への代謝の移行の、細胞増殖に対する影響の信頼できる予測を与える。１つのモデリング法は、ＭＡＡのより有効な生成を一括してもたらす遺伝子ノックアウトを選択するために適用される２層最適化法ＯｐｔＫｎｏｃｋ（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．、８４巻、６４７〜６５７頁（２００３年））である。適応進化を使用して、例えばＭＡＡ生成物のアルファ−ケトグルタレート中間体の、より良い生産体を作製することもできる。適応進化を実施して増殖特性と生産特性の両方を改善する（ＦｏｎｇおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、３６巻、１０５６〜１０５８頁（２００４年）；Ａｌｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１４巻、１５６５〜１５６８頁（２００６年））。結果に基づいて、後の数ラウンドのモデリング、遺伝子操作および適応進化をＭＡＡ生産体に施して、生産をさらに増大することができる。
ＭＡＡの大規模な生産用に、前述の生物体を当技術分野で公知の培地を使用して発酵槽中で培養して、嫌気的条件下での生物体の増殖を促進する。発酵は回分、流加または連続的な形で実施する。嫌気的条件は最初に窒素で培地をスパージし、次いで培養容器を密閉することによって維持し、例えば、フラスコは隔膜および圧着キャップで密閉することができる。限られた通気で隔膜中に小さな穴を与えることによって、微好気的条件を利用することもできる。培地のｐＨは、Ｈ２ＳＯ４などの酸を加えることによって約７のｐＨに保つ。増殖速度は分光光度計を使用して光学濃度を測定することによって決定し（６００ｎｍ）、グルコースの取り込み速度は経時的な炭素源の枯渇をモニターすることによって決定する。望ましくないアルコール、有機酸、および残留グルコースなどの副産物は、例えば、Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）シリーズのＨＰＬＣカラム（例えば、ＨＰＸ−８７シリーズ）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）を使用して、グルコースおよびアルコールに屈折率検出器、有機酸にＵＶ検出器を使用して、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＭＤ）によって定量化することができる（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、７７５〜７７９頁（２００５年））。
この実施例は、トレオ−３−メチルアスパルテートを介してアルファ−ケトグルタレートからＭＡＡを生成することができる微生物体の調製を記載する。
（実施例ＩＸ）
２−ヒドロキシグルタレートを介したＭＡＡへのアルファ−ケトグルタレートの転換のための経路
この実施例は、２−ヒドロキシグルタレートを介したＭＡＡへのアルファ−ケトグルタレートからの例示的なＭＡＡの合成経路を記載する。
ＭＡＡの生合成に関する別の例示的な経路は実施例ＶＩＩ中に記載した経路と類似したスキームを有するが、ただしそれは、アミン置換中間体（図８参照）ではなく、ヒドロキシル化中間体２−ヒドロキシグルタレートおよび３−メチルマレート（図１０参照）を通過する。実施例ＶＩＩ中に記載した経路と同様に、この経路は好気的条件下において高収率であり、最大理論収率がグルコース１ｍｏｌ当たりＭＡＡ１．２ｍｏｌである（表３）。嫌気的条件下では、この経路は酸化還元バランスがとれておらず、ＭＡＡ合成はエタノール、ホルメートおよびスクシネートなどの発酵副産物の形成を必要とする。
Figure 2014147400
 図１０を参照すると、ステップ１はα−ケトグルタル酸レダクターゼ（ＥＣ１．１．９９．２）が関与する。この経路の最初のステップは、天然酵素α−ケトグルタル酸レダクターゼによる、２−ヒドロキシグルタレートへのアルファ−ケトグルタレートの還元を伴う。この酵素は、ｓｅｒＡ、中心代謝中の３−ホスホグリセリン酸の還元も触媒する多機能酵素によってコードされる（ＺｈａｏおよびＷｉｎｋｌｅｒ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、２３２〜２３９頁（１９９６年））。Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ中の遺伝子Ｌ２ＨＧＤＨ（ＪａｎｓｅｎおよびＷａｎｄｅｒｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１２２５巻、５３〜５６頁（１９９３年））、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｎｕｃｌｅａｔｕｍ中のＦＮ０４８７ ｉｎ Ｌ２ｈｇｄｈ（Ｈａｙａｓｈｉら、Ｊ．Ｎｉｈｏｎ Ｕｎｉｖ．Ｓｃｈ．Ｄｅｎｔ．、２８巻、１２〜２１頁（１９８６年））、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ中の予想Ｌ２ｈｇｄｈ（ＪａｎｓｅｎおよびＷａｎｄｅｒｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１２２５巻、５３〜５６頁（１９９３年））はこの酵素をコードする。高い配列相同性を有する遺伝子候補には、Ｍｕｓ
ｍｕｓｃｕｌｕｓ中のＬ２ｈｇｄｈおよびＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ中のＬ２ＨＧＤＨがある。高濃度で、２−ヒドロキシグルタレートは、競合阻害によりα−ケトグルタル酸レダクターゼ活性をフィードバックすることが示されている（ＺｈａｏおよびＷｉｎｋｌｅｒ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、２３２〜２３９頁（１９９６））。
Figure 2014147400
 図１０を参照すると、ステップ２は２−ヒドロキシグルタミン酸ムターゼ（ＥＣ５．４．９９．−）が関与する。経路の第２ステップ中、炭素骨格はグルタミン酸ムターゼ酵素による再編成を経る。このような酵素により触媒される最も一般的な反応は、図８のステップ２中に示す、トレオ−３−メチルアスパルテートへのグルタミン酸の転換である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｈｌｅａｒｉｕｍ由来のアデノシルコバラミン依存性グルタミン酸ムターゼも、別の基質として２−ヒドロキシグルタレートと反応することが示されているが（Ｒｏｙｍｏｕｌｉｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９巻、１０３４０〜１０３４６頁（２０００年））、天然基質グルタミン酸を用いた速度と比較して、この反応の速度は２−ヒドロキシグルタレートを用いると２桁低い。酵素の定方向進化を使用して、２−ヒドロキシグルタレートに対するグルタミン酸ムターゼの親和性を増大することができる。グルタミン酸ムターゼをコードするタンパク質配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、実施例ＶＩＩ、経路のステップ２中で見られる。
図１０を参照すると、ステップ３は３−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）が関与する。第３ステップ中、３−メチルマレートを脱水してメサコネートを形成する。この正確な変換を触媒する酵素は文献中に記載されていないが、いくつかの酵素は類似の反応を触媒することができる（図１１）。１つのこのような酵素は、２−メチルマレートをメサコネートに転換する、シトラリンゴ酸ヒドロリアーゼとも呼ばれる２−メチルリンゴ酸デヒドラターゼである（図１１Ａ）。２−メチルマレートと３−メチルマレートは密接に関連があり、構造の唯一の違いはヒドロキシル基の位置である。２−メチルリンゴ酸デヒドラターゼの活性は、グルタミン酸分解ＶＩ経路の状況でＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓにおいて検出されたが（ＫａｔｏおよびＡｓａｎｏ、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６８巻、４５７〜４６３頁（１９９７年））、しかしながら、この酵素をコードする遺伝子は今日まで配列決定されていない。
第２の候補酵素は、フマレートへのマレートの脱水を触媒するフマル酸ヒドラターゼである（図１１Ｂ）。実施例Ｉ（ステップ５）中に記載したように、この酵素に関する大量の構造情報が入手可能であり、他の研究ではこの酵素を首尾良く工学的に操作して、活性、阻害および局在を変えている（Ｗｅａｖｅｒ、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ
Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、６１巻、１３９５〜１４０１頁（２００５年））。遺伝子候補は実施例Ｉ、経路のステップ５中に論じる。
図１０を参照すると、ステップ４はメサコン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）が関与する。最終経路のステップは、メタクリル酸へのメサコネートの脱カルボキシル化が関与する。この反応は、実施例ＶＩＩ中に記載した経路の最終ステップと同一である。
この実施例は、アルファ−ケトグルタレートからＭＭＡを生成する生合成経路を記載する。
（実施例Ｘ）
２−ヒドロキシグルタレートを介してアルファ−ケトグルタレートをＭＡＡに転換するための経路を有するＭＡＡ生成微生物体の調製
この実施例は、２−ヒドロキシグルタレートを介してアルファ−ケトグルタレートからＭＡＡを生成することができる微生物体の作製を記載する。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、図１０中に示すＭＡＡ経路を工学的に操作するための標的生物体として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉは、ＭＡＡを生成することができる天然に存在しない微生物を作製するのに良い宿主を提供する。Ｅ．ｃｏｌｉは遺伝子操作の影響を受けやすく、嫌気的または微好気的条件下で効率良く、エタノール、酢酸、ギ酸、乳酸、およびコハク酸のような、様々な生成物を生成することができることは公知である。
ＭＡＡを生成するように操作されたＥ．ｃｏｌｉ株を作製するために、経路中で利用する酵素をコードする核酸を、周知の分子生物学の技術を使用してＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、１９９９年を参照）。特に、α−ケトグルタル酸レダクターゼおよび２−ヒドロキシグルタミン酸ムターゼ活性をコードするｓｅｒＡ（ＣＡＡ０１７６２．１）、ｇｌｍＥ（Ｐ８００７７．２）、およびｇｌｍＳ（Ｐ８００７８．２）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＥ１３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。さらに、３−メチルリンゴ酸デヒドラターゼおよびメサコン酸デカルボキシラーゼ活性をコードするｆｕｍＣ（Ｐ０５０４２．１）、ｄｍｐＨ（ＣＡＡ４３２２８．１）、およびｄｍｐＥ（ＣＡＡ４３２２５．１）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＡ３３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。２組のプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５に形質転換して、アルファ−ケトグルタレートから２−ヒドロキシグルタレートの経路を介したＭＡＡ合成に必要なタンパク質および酵素を発現させる。
得られた遺伝子操作生物体は、当技術分野で周知の手順後、グルコース含有培地において培養する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、２００１年を参照）。Ｅ．ｃｏｌｉの宿主株をｄｅ ｎｏｖｏでコバラミンを合成するように操作しない限り、コバラミンをさらに培地に供給してムターゼ酵素の活性を確実にする（例えば、Ｒａｕｘら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、７５３〜７６７頁（１９９６年）を参照）。ＭＡＡ合成遺伝子の発現は、例えば、ノーザンブロット、ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、イムノブロッティングなどを含めた、ポリペプチド発現または酵素活性を決定するための当技術分野で周知の方法を使用して裏付ける。発現される酵素の酵素活性は、個々の活性に特異的なアッセイを使用して確認する。ＭＡＡを生成する工学的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ株の能力は、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣＭＳ）および／または液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣＭＳ）を使用して確認する。
機能的ＭＡＡ合成経路を有するように操作した微生物株は、経路の有効利用のための最適化によってさらに増強する。簡単に述べると、工学的に操作された株を評価して、いずれの外因性遺伝子が律速レベルで発現されるかどうか決定する。例えば追加的遺伝子コピー数の導入によって、経路中の流れを制限し得る低レベルで発現する任意の酵素に関して発現は増大する。
より良い生産体を作製するために、代謝モデリングを利用して増殖条件を最適化する。モデリングをさらに使用して、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計する（例えば、米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、および米国特許第７，１２７，３７９号を参照）。モデリング解析によって、ＭＡＡのより良好な生成への代謝の移行の、細胞増殖に対する影響の信頼できる予測を与える。１つのモデリング法は、ＭＡＡのより良好な生成を一括してもたらす遺伝子ノックアウトを選択するために適用される２層最適化法ＯｐｔＫｎｏｃｋ（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．、８４巻、６４７〜６５７頁（２００３年））である。適応進化を使用して、例えばＭＡＡ生成物のアルファ−ケトグルタレート中間体の、より良い生産体を作製することもできる。適応進化を実施して増殖特性と生産特性の両方を改善する（ＦｏｎｇおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、３６巻、１０５６〜１０５８頁（２００４年）；Ａｌｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１４巻、１５６５〜１５６８頁（２００６年））。結果に基づいて、後の数ラウンドのモデリング、遺伝子操作および適応進化をＭＡＡ生産体に施して、生産をさらに増大することができる。
ＭＡＡの大規模な生産用に、前述の生物体を当技術分野で公知の培地を使用して発酵槽中で培養して、嫌気的条件下での生物体の増殖を促進する。発酵は回分、流加または連続的な形で実施する。嫌気的条件は最初に窒素で培地をスパージし、次いで培養容器を密閉することによって維持し、例えば、フラスコは隔膜および圧着キャップで密閉することができる。限られた通気で隔膜中に小さな穴を与えることによって、微好気的条件を利用することもできる。培地のｐＨは、Ｈ２ＳＯ４などの酸を加えることによって約７のｐＨに保つ。増殖速度は分光光度計を使用して光学濃度を測定することによって決定し（６００ｎｍ）、グルコースの取り込み速度は経時的な炭素源の枯渇をモニターすることによって決定する。望ましくないアルコール、有機酸、および残留グルコースなどの副産物は、例えば、Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）シリーズのＨＰＬＣカラム（例えば、ＨＰＸ−８７シリーズ）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）を使用して、グルコースおよびアルコールに屈折率検出器、有機酸にＵＶ検出器を使用して、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＭＤ）によって定量化することができる（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７７５〜７７９頁（２００５年））。
この実施例は、２−ヒドロキシグルタレートを介してアルファ−ケトグルタレートからＭＡＡを生成することができる微生物体の調製を記載する。
（実施例ＸＩ）
２−ヒドロキシイソ酪酸またはＭＡＡへのアセチルＣｏＡの転換のための経路
この実施例は、アセチルＣｏＡからの例示的な２−ヒドロキシイソ酪酸またはＭＡＡの合成経路を記載する。
ＭＡＡの生合成は、少なくとも５つの酵素ステップでアセチルＣｏＡから進行し得る（図１２参照）。この経路では、２分子のアセチルＣｏＡが組み合わさってアセトアセチル−ｃｏＡを形成し、次いでこれが３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに還元される。あるいは、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼおよびクロトナーゼによって、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換することができる（Ｍａｒｔｉｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１巻、４４号、１５６４５〜１５６４９頁（２００４年）；ＪｏｎｅｓおよびＷｏｏｄｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、５０巻、４８４〜５２４頁（１９８６年）；Ｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１８巻、５８５７号、１７８２〜１７８６頁（２００７年））。次いでメチルムターゼが３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの炭素骨格を２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡに再編成して、次いでそれを脱水してメタクリリルＣｏＡを形成する。あるいは、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを２−ヒドロキシイソブチレートに転換し、分泌させ、生成物として回収することが可能である。メタクリリルＣｏＡをＭＡＡに転換する最終ステップは、１つの酵素（図１２中に示す）または一連の酵素によって実施することができる。
図１２中に示す経路は、好気的条件下において１．２５ｍｏｌ／グルコース１ｍｏｌの最大理論生成収率を有し、０．４モルの酸素の利用をさらに必要とする（表４）。酸素取り込みの不在下で、最大理論収率は１．０１ｍｏｌ／グルコース１ｍｏｌに低下し、酸化還元バランスを維持するために、エタノールおよびホルメートなどの発酵副産物が必ず形成される。ＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）はＡＴＰ生成方向に作用することができると考えることによって、嫌気的条件下でＭＡＡ収率は１．０９ｍｏｌ／ｍｏｌに増大するが、副産物の形成を妨げるわけではない。経路のステップ５中でＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼを利用する場合、ＭＡＡ形成のエネルギー特性は好ましい。本明細書に記載する経路を介してメタクリル酸ではなく２−ヒドロキシイソ酪酸が生成する場合、生成物およびＡＴＰの同等の最大収率を得る。
Figure 2014147400
 図１２を参照すると、ステップ１はアセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）が関与する。２つのアセチルＣｏＡ単位からのアセトアセチルＣｏＡの形成は、アセチルＣｏＡチオラーゼによって触媒される。この酵素はＥ．ｃｏｌｉに固有であり、遺伝子ａｔｏＢによってコードされ、典型的には脂肪酸酸化中にアセトアセテート分解方向に作用する（ＤｕｎｃｏｍｂｅおよびＦｒｅｒｍａｎ、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７６巻、１５９〜１７０頁（１９７６年）；ＦｒｅｒｍａｎおよびＤｕｎｃｏｍｂｅ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５８０巻、２８９〜２９７（１９７９年））。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来の遺伝子ｔｈｌＡをＥ．ｃｏｌｉのイソプロパノール生成株に工学的に導入し、それがアセトアセテート合成の方向に機能することが示された（Ｈａｎａｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７３巻、７８１４〜７８１８頁（２００７年）；Ｓｔｉｍ−Ｈｅｒｎｄｏｎら、Ｇｅｎｅ、１５４巻、８１〜８５頁（１９９５年））。別の遺伝子候補はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来のｔｈｌである（ＭｅｎｇおよびＬｉ．、Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、２８巻、１２２７〜１２３２頁（２００６年））。
Figure 2014147400
 図１２を参照すると、ステップ２はアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ＃：１．１．１．３５）が関与する。第２ステップは、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼによる３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへのアセトアセチルＣｏＡの還元を伴う。この酵素は数種のＣｌｏｓｔｒｉｄｉａにおいて酪酸へのアセチルＣｏＡの発酵経路に関与し、詳細に研究されている（ＪｏｎｅｓおよびＷｏｏｄｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、５０巻、４８４〜５２４頁（１９８６年））。ｈｂｄによってコードされるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来の酵素が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ機能的に発現されている（Ｙｏｕｎｇｌｅｓｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７１巻、６８００〜６８０７頁（１９８９年））。さらに、ｆａｄＢおよびｆａｄＪによってコードされるＥ．ｃｏｌｉ中の２つの脂肪酸酸化複合体のサブユニットは、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼとして機能する（ＢｉｎｓｔｏｃｋおよびＳｃｈｕｌｚ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、７１ＰｔＣ巻、４０３〜４１１頁（１９８１年））。追加的遺伝子候補には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ中のＨｂｄ１（Ｃ末端ドメイン）およびＨｂｄ２（Ｎ末端ドメイン）（ＨｉｌｌｍｅｒおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、３３３４巻、１２〜２３頁（１９７４年））およびＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ中のＨＳＤ１７Ｂ１０（Ｗａｋｉｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２０７巻、６３１〜６３８頁（１９５４年））がある。
Figure 2014147400
 図１２を参照すると、ステップ３は３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ（ＥＣ５．４．９９．−）が関与する。次のステップは、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼにより、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを再編成して２−ＨＩＢＣｏＡを形成する。この酵素は近年発見された新規のＩＣＭ様メチルムターゼであり、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍにおいて特徴付けられている（Ｒａｔｎａｔｉｌｌｅｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４巻、３１６７９〜３１６８５頁（１９９９年）；Ｒｏｈｗｅｒｄｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２巻、４１２８〜４１３５頁（２００６年））。Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ ＰＭ１中でＭｐｅ＿Ｂ０５４１によってコードされるこの酵素は、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ中のＲｓｐｈ１７０２９＿３６５７およびＸａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ中のＸａｕｔ＿５０２１を含めた他の生物体中のメチルマロニルＣｏＡムターゼの大サブユニットと高い配列相同性を有する。実施例Ｖ（ステップ１）中で論じたように、活性部位近辺の１アミノ酸に対する変更は酵素の基質特異性を変えるので（Ｒａｔｎａｔｉｌｌｅｋｅら、上記、１９９９年；Ｒｏｈｗｅｒｄｅｒら、上記、２００６年）、したがって、この酵素の別の遺伝子候補をこの部位で工学的に操作して、適切な反応性を得ることができる。
Figure 2014147400
 図１２を参照すると、ステップ４は２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼが関与する。２−ヒドロキシアシルＣｏＡの脱水は、ラジカル機構によって働く特定クラスの酸素感受性酵素によって触媒することができる（ＢｕｃｋｅｌおよびＧｏｌｄｉｎｇ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６０巻、２７〜４９頁（２００６年）；Ｂｕｃｋｅｌら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、８巻、４６２〜４６７頁（２００４年）；Ｂｕｃｋｅｌら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、３８６巻、９５１〜９５９頁（２００５年）；Ｋｉｍら、ＦＥＢＳ Ｊ．、２７２巻、５５０〜５６１頁（２００５年）；Ｋｉｍら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、２８巻、４５５〜４６８頁（２００４年）；Ｚｈａｎｇら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４５巻、Ｐｔ９号、２３２３〜２３３４頁（１９９９年））。このような酵素の一例は、ラクトイルＣｏＡの脱水を触媒してアクリルＣｏＡを形成する、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来のラクチルＣｏＡデヒドラターゼである（ＫｕｃｈｔａおよびＡｂｅｌｅｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０巻、１３１８１〜１３１８９頁（１９８５年）；ＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒおよびＢｕｃｋｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０６巻、５４７〜５５２頁（１９９２年））。他の例は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来のｈｇｄＡＢＣによってコードされる２−ヒドロキシグルタリルＣｏＡデヒドラターゼである（ＭｕｅｌｌｅｒおよびＢｕｃｋｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２３０巻、６９８〜７０４頁（１９９５年）；Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６９巻、４４１〜４４８頁（１９８７年））。さらに別の例は、ｈａｄＢＣによって触媒されｈａｄＩによって活性化されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の２−ヒドロキシイソカプロイルＣｏＡデヒドラターゼである（Ｄａｒｌｅｙら、ＦＥＢＳ Ｊ．、２７２巻、５５０〜６１頁（２００５年））。Ａ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの対応する配列は以下のＧｅｎＢａｎｋＩＤを使用して発見することができるが、一方Ｃ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｕｍの配列は公に利用可能なデータベース中に依然挙げられていない。
Figure 2014147400
 図１２を参照すると、ステップ５または６は、それぞれメタクリル酸または２−ヒドロキシイソ酪酸に対する活性を有する、トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）、ヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、またはシンテターゼ（ＥＣ６．２．１．−）が関与する。メタクリリルＣｏＡからＭＡＡへの直接転換、または２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡから２−ヒドロキシイソブチレートへの直接転換は、ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼによって実施することができる。実施例Ｖ中で論じたように、ＣｏＡトランスフェラーゼまたはＣｏＡシンテターゼを利用してこの変換を実施する場合、経路のエネルギー特性は最も好ましい。トランスフェラーゼファミリー中、アセテート−ＣｏＡトランスフェラーゼとしても公知である酵素アシルＣｏＡ：アセテート−ＣｏＡトランスフェラーゼは、分岐状アシルＣｏＡ基質を含めたその広範囲の基質特異性のため、望ましい２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡまたはメタクリルＣｏＡトランスフェラーゼ活性を触媒するのに適した候補である（ＭａｔｔｈｉｅｓおよびＳｃｈｉｎｋ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５８巻、１４３５〜１４３９頁（１９９２年）；Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３３巻、９０２〜９０８頁（１９６８年））。ＡＤＰ形成アセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＤ）は、構造上類似した分岐鎖状化合物に作用するＣｏＡシンテターゼファミリー中の有望な酵素である（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、Ａｒｃｈ．．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１８２巻、２７７〜２８７頁（２００４年）；ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８４巻、６３６〜６４４頁（２００２年））。ＣｏＡ−ヒドロラーゼファミリー中、酵素３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼは、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ、メチルマロニルＣｏＡ、および３−ヒドロキシ−２−メチルブタノイルＣｏＡを含めた、様々な分岐鎖状アシルＣｏＡ基質に作用することが示されている（Ｈａｗｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３２４巻、２１８〜２２８頁（２０００年）；Ｈａｗｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻、２６４３０〜２６４３４頁（１９９６年）；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻、１４２４８〜１４２５３頁（１９９４年））。ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼおよびヒドロラーゼが関与する他の例示的な遺伝子候補は、実施例Ｖ（ステップ２および５）中に論じる。
図１２を参照すると、別のステップ５はＭＡＡへの間接的転換が関与する。ＭＡＡへのＭＡＡ−ＣｏＡの直接転換の代替として、メタクリリルＣｏＡをＭＡＡに転換するための別の戦略は、３−ヒドロキシイソブチレートを介してＭＡＡ−ＣｏＡをＭＡＡに転換する多段階プロセスを伴う。このプロセスによって、ＭＡＡ−ＣｏＡは最初に３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡに転換され、それは後に実施例Ｖ中に記載したようにＭＡＡに転換され得る。
この間接的経路の最初のステップは、エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７および４．２．１．７４）による、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ（３ＨＩＢ−ＣｏＡ）へのＭＡＡ−ＣｏＡの転換を伴う。Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｆａｄＡおよびｆａｄＢの遺伝子産物は、エノイルＣｏＡヒドラターゼ活性を示す脂肪酸酸化に関与する多酵素複合体をコードする（ＮａｋａｈｉｇａｓｈｉおよびＩｎｏｋｕｃｈｉ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８巻、４９３７頁（１９９０年）；Ｙａｎｇ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７３巻、７４０５〜７４０６頁（１９９１年）；Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５巻、１０４２４〜１０４２９頁（１９９０年）；Ｙａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻、６７８８〜６７９５頁（１９９１年））。ｆａｄＲによってコードされる負のレギュレーターのノックアウトを利用して、ｆａｄＢ遺伝子産物を活性化することができる（Ｓａｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．、１０３巻、３８〜４４頁（２００７年））。ｆａｄＩ遺伝子とｆａｄＪ遺伝子は類似した機能をコードし、嫌気的条件下で天然に発現される（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４７巻、７９３〜８０５頁（２００３年））。
Figure 2014147400
 エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする追加的な天然遺伝子候補には、ｍａｏＣ（ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８５巻、５３９１〜５３９７頁（２００３年））、ｐａａＦ（Ｉｓｍａｉｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０巻、３０４７〜３０５４頁（２００３年）；ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１３〜１１６巻、３３５〜３４６頁（２００４年）；ＰａｒｋおよびＹｕｐ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８６巻、６８１〜６８６頁（２００４年））、およびｐａａＧ（Ｉｓｍａｉｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０巻、３０４７〜３０５４頁（２００３年）；ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１３〜１１６頁：３３５〜３４６頁（２００４年）；ＰａｒｋおよびＹｕｐ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８６巻、６８１〜６８６頁（２００４年））がある。非天然の候補には、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ（Ｏｌｉｖｅｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻、６４１９〜６４２４頁（１９９８年））およびＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｄｉ Ｇｅｎｎａｒｏら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１８８巻、１１７〜１２５頁（２００７年））由来のｐａａＡ、ｐａａＢ、およびｐａａＮがある。Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｃｒｔの遺伝子産物は別の候補である（Ａｔｓｕｍｉら、Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．、２００７年９月１４日電子出版；Ｂｏｙｎｔｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、３０１５〜３０２４頁（１９９６年））。
Figure 2014147400
 この実施例は、アセチルＣｏＡから２−ヒドロキシイソブチレートまたはＭＡＡを生成する生合成経路を記載する。
（実施例ＸＩＩ）
ＭＡＡへのアセチルＣｏＡの転換のための経路を有するＭＡＡ生成微生物体の調製
この実施例は、アセチルＣｏＡからＭＡＡを生成することができる微生物体の作製を記載する。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、図１２中に示すＭＡＡ経路を工学的に操作するための標的生物体として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉは、ＭＡＡを生成することができる天然に存在しない微生物を作製するのに良い宿主を提供する。Ｅ．ｃｏｌｉは遺伝子操作の影響を受けやすく、嫌気的または微好気的条件下で効率良く、エタノール、酢酸、ギ酸、乳酸、およびコハク酸のような、様々な生成物を生成することができることは公知である。
ＭＡＡを生成するように操作されたＥ．ｃｏｌｉ株を作製するために、経路中で利用する酵素をコードする核酸を、周知の分子生物学の技術を使用してＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、１９９９年を参照）。特に、それぞれアセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、および３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ活性をコードするａｔｏＢ（Ｐ７６４６１．１）、ｈｂｄ（Ｐ５２０４１．２）、およびＭｐｅ＿Ｂ０５４１（ＹＰ＿００１０２３５４６．１）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＥ１３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。さらに、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼおよびメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼ活性をコードするｈｇｄＡ（Ｐ１１５６９）、ｈｇｄＢ（Ｐ１１５７０）、ｈｇｄＣ（Ｐ１１５６８）、およびｈｉｂｃｈ（Ｑ５ＸＩＥ６．２）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＡ３３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。２組のプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５に形質転換して、アセチルＣｏＡの経路を介したＭＡＡ合成に必要なタンパク質および酵素を発現させる。
得られた遺伝子操作生物体は、当技術分野で周知の手順後、グルコース含有培地において培養する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、２００１年を参照）。Ｅ．ｃｏｌｉの宿主株をｄｅ ｎｏｖｏでコバラミンを合成するように操作しない限り、コバラミンをさらに培地に供給してムターゼ酵素の活性を確実にする（例えば、Ｒａｕｘら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、７５３〜７６７頁（１９９６年）を参照）。ＭＡＡ合成遺伝子の発現は、例えば、ノーザンブロット、ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、イムノブロッティングなどを含めた、ポリペプチド発現または酵素活性を決定するための当技術分野で周知の方法を使用して裏付ける。発現される酵素の酵素活性は、個々の活性に特異的なアッセイを使用して確認する。ＭＡＡを生成する工学的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ株の能力は、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣＭＳ）および／または液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣＭＳ）を使用して確認する。
機能的ＭＡＡ合成経路を有するように操作した微生物株は、経路の有効利用のための最適化によってさらに増強する。簡単に述べると、工学的に操作された株を評価して、いずれの外因性遺伝子が律速レベルで発現されるかどうか決定する。例えば追加的遺伝子コピー数の導入によって、経路中の流れを制限し得る低レベルで発現する任意の酵素に関して発現は増大する。
より良い生産体を作製するために、代謝モデリングを利用して増殖条件を最適化する。モデリングをさらに使用して、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計する（例えば、米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、および米国特許第７，１２７，３７９号を参照）。モデリング解析によって、ＭＡＡのより有効な生成への代謝の移行の、細胞増殖に対する影響の信頼できる予測を与える。１つのモデリング法は、ＭＡＡのより良好な生成を一括してもたらす遺伝子ノックアウトを選択するために適用される２層最適化法ＯｐｔＫｎｏｃｋ（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．、８４巻、６４７〜６５７頁（２００３年））である。適応進化を使用して、例えばＭＡＡ生成物のアセチルＣｏＡ中間体の、より良い生産体を作製することもできる。適応進化を実施して増殖特性と生産特性の両方を改善する（ＦｏｎｇおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、３６巻、１０５６〜１０５８頁（２００４年）；Ａｌｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１４巻、１５６５〜１５６８頁（２００６年））。結果に基づいて、後の数ラウンドのモデリング、遺伝子操作および適応進化をＭＡＡ生産体に施して、生産をさらに増大することができる。
ＭＡＡの大規模な生産用に、前述の生物体を当技術分野で公知の培地を使用して発酵槽中で培養して、嫌気的条件下での生物体の増殖を促進する。発酵は回分、流加または連続的な形で実施する。嫌気的条件は最初に窒素で培地をスパージし、次いで培養容器を密閉することによって維持し、例えば、フラスコは隔膜および圧着キャップで密閉することができる。限られた通気で隔膜中に小さな穴を与えることによって、微好気的条件を利用することもできる。培地のｐＨは、Ｈ２ＳＯ４などの酸を加えることによって約７のｐＨに保つ。増殖速度は分光光度計を使用して光学濃度を測定することによって決定し（６００ｎｍ）、グルコースの取り込み速度は経時的な炭素源の枯渇をモニターすることによって決定する。望ましくないアルコール、有機酸、および残留グルコースなどの副産物は、例えば、Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）シリーズのＨＰＬＣカラム（例えば、ＨＰＸ−８７シリーズ）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）を使用して、グルコースおよびアルコールに屈折率検出器、有機酸にＵＶ検出器を使用して、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＭＤ）によって定量化することができる（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、７７５〜７７９頁（２００５年））。
この実施例は、アセチルＣｏＡからＭＡＡを生成することができる微生物体の調製を記載する。
（実施例ＸＩＩＩ）
クロトノイルＣｏＡを介したＭＡＡへのアセチルＣｏＡの転換のための経路
この実施例は、クロトノイルＣｏＡを介したアセチルＣｏＡからの例示的なＭＡＡの合成経路を記載する。
少なくとも７つの酵素ステップでＭＡＡにアセチルＣｏＡを転換するための別の経路を記載する（図１３参照）。好気的および嫌気的条件下でのこの経路の収率は、実施例ＸＩ中に記載した経路と類似している。
経路の最初の２ステップは、実施例ＸＩ中に記載した経路中のステップ１および２と同一である。第３ステップでは、クロトナーゼ（ＥＣ＃：４．２．１．５５）によって３−ＨＢＣｏＡを脱水してクロトニルＣｏＡを形成する。クロトニルＣｏＡ中の二重結合はブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ＃：１．３．９９．２）によって還元される。これらの酵素の両方が、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼと全く同様に、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ種における酪酸へのアセチルＣｏＡの発酵経路の一部である（ＪｏｎｅｓおよびＷｏｏｄｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、５０巻、４８４〜５２４頁（１９８６年））。後のステップ中、イソブチリルＣｏＡムターゼ（５．４．９９．１２）、イソブチリルＣｏＡにブチリルＣｏＡを可逆的に転換することができる酵素によって、ブチリルＣｏＡをイソブチリルＣｏＡに転換する。この酵素はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓからクローニングおよび配列決定されており、組換え酵素がＥ．ｃｏｌｉにおいて特徴付けられている（Ｒａｔｎａｔｉｌｌｅｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４巻、３１６７９〜３１６８５頁（１９９９年））。経路中の次のステップは、２−メチル−アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ＃：１．３．９９．１２）によるメタクリリルＣｏＡへのイソブチリルＣｏＡの転換を伴う。メタクリリルＣｏＡへのこの変換はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種において観察されており、関連酵素はＥ．ｃｏｌｉにおいて単離および発現されている（Ｙｏｕｎｇｌｅｓｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７１巻、６８００〜６８０７頁（１９８９年））。最終ステップでは、実施例ＸＩ（ステップ５）中に記載したように、１つの酵素または一連の酵素のいずれかによって、メタクリリルＣｏＡをＭＡＡに転換する。
この実施例は、アセチルＣｏＡからＭＡＡを生成する生合成経路を記載する。
（実施例ＸＩＶ）
ＭＡＡへのアクリリルＣｏＡの転換のための経路
この実施例は、アクリリルＣｏＡからの例示的なＭＡＡの合成経路を記載する。
高収率のＭＡＡはアクリリルＣｏＡ経路によって得ることができる（図１４参照）。この経路は、ラクトイルＣｏＡへのラクテートの活性化、次にこの活性化ＣｏＡ分子をＭＡＡに転換するための５、または場合によっては６、それより多くのステップを必要とする。この経路を使用したグルコースからのＭＡＡ収率はグルコース１ｍｏｌ当たり１．２８ｍｏｌであり、酸素の取り込みがこれらの収率を得るのに必要とされる。酸素の不在下では、予想収率は消費するグルコース１ｍｏｌ当たり１．２８ｍｏｌから１．０９ｍｏｌに低下する。好気的経路と嫌気的経路は両方共に最大ＭＡＡ収率でエネルギーが制限され、いかなるＡＴＰも生成しない。
アクリリルＣｏＡ経路を介したＭＡＡの生合成は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２８）、Ｅ．ｃｏｌｉおよび多くの他の生物体に固有の酵素によるラクテートへのピルベートの転換を最初に必要とする。ラクテートをプロピオニルＣｏＡに転換する３つの後のステップは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍおよびＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉなどのいくつかの無関係な細菌中のピルビン酸発酵経路における酵素によって触媒される（ＭｅｔａＣｙｃ）。プロピネートＣｏＡトランスフェラーゼとしても公知されているラクテートＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１）はラクテートをラクトイルＣｏＡに転換し、基質としてプロピオネートとラクテートの両方を使用することができる。この酵素は精製および特徴付けられている（Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６９巻、４４１〜４４８頁（１９８７年））。ラクトイルＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５４）、多数の研究の対象となっている酵素を使用して、ラクトイルＣｏＡをアクリリルＣｏＡに脱水する（ＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒおよびＢｕｃｋｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０６巻、５４７〜５５２頁（１９９２年）；ＫｕｃｈｔａおよびＡｂｅｌｅｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０巻、１３１８１〜１３１８９頁（１９８５年））。その後アクリリルＣｏＡは、アクリロイルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．３．２．２、以前は１．３．９９．３）を使用してプロピオニルＣｏＡに還元する（Ｈｅｔｚｅｌら、Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０巻、９０２〜９１０頁（２００３年）；ＫｕｃｈｔａおよびＡｂｅｌｅｓ、上記、１９８５年）。
図１４を参照すると、ステップ５中、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（６．４．１．３）によってプロピオニルＣｏＡがＳ−メチルマロニルＣｏＡに転換される。プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼはラット肝臓から精製されており（Ｂｒｏｗｎｅｒら、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４巻、１２６８０〜１２６８５頁（１９８９年）；Ｋｒａｕｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８巻、７２４５〜７２４８頁（１９８３年））、ヒト肝臓からも単離され特徴付けられている（Ｋａｌｏｕｓｅｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５巻、６０〜６５頁（１９８０年））。この酵素によるスクシニルＣｏＡへのプロピオニルＣｏＡのカルボキシル化は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプロピネート代謝の機構の１つとして確認されているが（Ｅｖａｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２９１巻、Ｐｔ３号、９２７〜９３２頁（１９９３年））、この経路の遺伝的性質に関してはほとんど公知でない。
この経路の最終ステップは、ＭＡＡへのメチルマロニルＣｏＡの転換を伴う（図１４中の集中反応）。これらの反応を触媒する酵素は実施例Ｉ中に記載する。
この実施例は、ピルベートからＭＡＡを生成する生合成経路を記載する。
（実施例ＸＶ）
ＭＡＡへの２−ケトイソバレレートの転換のための経路
この実施例は、２−ケトイソバレレートからの例示的なＭＡＡの合成経路を記載する。
この経路では、２−ケトイソバレレート、バリン生合成の前駆体を介してＭＭＡの生合成が起こる（図１５参照）。具体的には、３つの酵素、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼの作用後、ピルベートから２−ケトイソバレレートを形成することができる。ＭＡＡへの２−ケトイソバレレートの転換は４つの酵素ステップを必要とし、好気的条件下においてグルコース１ｍｏｌ当たり１ｍｏｌのＭＡＡ収率、および嫌気的条件下ではグルコース１ｍｏｌ当たり０．４ｍｏｌの収率をもたらす（表５）。この経路は酸化還元バランスがとれておらず、エタノールおよびギ酸などの発酵生成物の分泌が嫌気的条件下で起こり得る。酸素不在下でのこの経路中のＭＡＡの比較的低い収率にもかかわらず、エネルギー特性は非常に好ましく、消費するグルコース１モル当たり最大２．２モルのＡＴＰが生成する。
Figure 2014147400
 この経路は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、および数種のＰｓｅｕｏｄｏｍｏｎａｓを含めたいくつかの生物体において記載されるが、Ｅ．ｃｏｌｉ中またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中に存在することは公知でない、バリン分解経路の多数のステップを利用する。バリン分解経路の最初のステップ中、分岐鎖状アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２４）、Ｅ．ｃｏｌｉにも固有である酵素によって、バリンは２−ケトイソバレレートに転換される（ＭａｔｔｈｉｅｓおよびＳｃｈｉｎｋ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５８巻、１４３５〜１４３９頁（１９９２年）；ＲｕｄｍａｎおよびＭｅｉｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００巻、５９１〜６０４頁（１９５３年））。分岐鎖状ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＥＣ１．２．１．２５）によって触媒される、イソブチリルＣｏＡへの２−ケトイソバレレートのその後の転換は、この経路によるＭＡＡ生合成の実行ステップである。次に、イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．３．９９．１２）によって、イソブチリルＣｏＡをメタクリリルＣｏＡに転換する。このステップに関する詳細は実施例ＸＩＩＩ中に記載する。最終ステップ、ＭＡＡへのＭＡＡ−ＣｏＡの転換は実施例Ｉ中に記載する。
この実施例は、２−ケトイソバレレートからＭＭＡを生成する生合成経路を記載する。
（実施例ＸＶＩ）
３−ヒドロキシイソ酪酸への４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの転換のための経路を有する３−ヒドロキシイソ酪酸生成微生物体の調製
この実施例は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシイソ酪酸を生成することができる微生物体の作製を記載する。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、図６中に示す３−ヒドロキシイソ酪酸経路を工学的に操作するための標的生物体として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉは、３−ヒドロキシイソ酪酸を生成することができる天然に存在する微生物を作製するのに良い宿主を提供する。Ｅ．ｃｏｌｉは遺伝子操作の影響を受けやすく、嫌気的または微好気的条件下で効率良く、エタノール、酢酸、ギ酸、乳酸、およびコハク酸のような、様々な生成物を生成することができることは公知である。
３−ヒドロキシイソ酪酸を生成するように操作されたＥ．ｃｏｌｉ株を作製するために、経路中で利用する酵素をコードする核酸を、周知の分子生物学の技術を使用してＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、１９９９年を参照）。特に、それぞれコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＣｏＡ依存性）、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、およびホスホトランスブチリラーゼ活性をコードするｓｕｃＤ（ＹＰ＿００１３９６３９４）、４ｈｂｄ（ＹＰ＿００１３９６３９３）、ｂｕｋ１（Ｑ４５８２９）、およびｐｔｂ（ＮＰ＿３４９６７６）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＥ１３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。Ｂｕｒｋら（米国公開２００９／００７５３５１）中に記載されたように、この構築体はスクシニルＣｏＡからの４ＨＢ−ＣｏＡの生成を可能にする。さらに、それぞれ４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼおよび３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼをコードするｉｃｍＡ（ＣＡＢ４０９１２．１）およびｈｉｂｃｈ（Ｑ５ＸＩＥ６．２）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＡ３３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。２組のプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５に形質転換して、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの経路を介した３−ヒドロキシイソ酪酸の合成に必要なタンパク質および酵素を発現させる。
得られた遺伝子操作生物体は、当技術分野で周知の手順後、グルコース含有培地において培養する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、２００１年を参照）。Ｅ．ｃｏｌｉの宿主株をｄｅ ｎｏｖｏでコバラミンを合成するように操作しない限り、コバラミンをさらに培地に供給してムターゼ酵素の活性を確実にする（例えば、Ｒａｕｘら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８巻、７５３〜７６７頁（１９９６年）を参照）。３−ヒドロキシイソ酪酸合成遺伝子の発現は、例えば、ノーザンブロット、ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、イムノブロッティングなどを含めた、ポリペプチド発現または酵素活性を決定するための当技術分野で周知の方法を使用して裏付ける。発現される酵素の酵素活性は、個々の活性に特異的なアッセイを使用して確認する。３−ヒドロキシイソ酪酸を生成する工学的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ株の能力は、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣＭＳ）および／または液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣＭＳ）を使用して確認する。
機能的３−ヒドロキシイソ酪酸合成経路を有するように操作した微生物株は、経路の有効利用のための最適化によってさらに増強する。簡単に述べると、工学的に操作された株を評価して、いずれの外因性遺伝子が律速レベルで発現されるかどうか決定する。例えば追加的遺伝子コピー数の導入によって、経路中の流れを制限し得る低レベルで発現する任意の酵素に関して発現は増大する。
より良い生産体を作製するために、代謝モデリングを利用して増殖条件を最適化する。モデリングをさらに使用して、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計する（例えば、米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、および米国特許第７，１２７，３７９号を参照）。モデリング解析によって、３−ヒドロキシイソ酪酸のより有効な生成への代謝の移行の、細胞増殖に対する影響の信頼できる予測を与える。１つのモデリング法は、３−ヒドロキシイソ酪酸のより良好な生成を一括してもたらす遺伝子ノックアウトを選択するために適用される２層最適化法ＯｐｔＫｎｏｃｋ（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．、８４巻、６４７〜６５７頁（２００３年））である。適応進化を使用して、例えば３−ヒドロキシイソ酪酸生成物のスクシニルＣｏＡまたは４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ中間体の、より良い生産体を作製することもできる。適応進化を実施して増殖特性と生産特性の両方を改善する（ＦｏｎｇおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、３６巻、１０５６〜１０５８頁（２００４年）；Ａｌｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１４巻、１５６５〜１５６８頁（２００６年））。結果に基づいて、後の数ラウンドのモデリング、遺伝子操作および適応進化を３−ヒドロキシイソ酪酸生産体に施して、生産をさらに増大することができる。
３−ヒドロキシイソ酪酸の大規模な生産用に、前述の生物体を当技術分野で公知の培地を使用して発酵槽中で培養して、嫌気的条件下での生物体の増殖を促進する。発酵は回分、流加または連続的な形で実施する。嫌気的条件は最初に窒素で培地をスパージし、次いで培養容器を密閉することによって維持し、例えば、フラスコは隔膜および圧着キャップで密閉することができる。限られた通気で隔膜中に小さな穴を与えることによって、微好気的条件を利用することもできる。培地のｐＨは、Ｈ２ＳＯ４などの酸を加えることによって約７のｐＨに保つ。増殖速度は分光光度計を使用して光学濃度を測定することによって決定し（６００ｎｍ）、グルコースの取り込み速度は経時的な炭素源の枯渇をモニターすることによって決定する。望ましくないアルコール、有機酸、および残留グルコースなどの副産物は、例えば、Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）シリーズのＨＰＬＣカラム（例えば、ＨＰＸ−８７シリーズ）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）を使用して、グルコースおよびアルコールに屈折率検出器、有機酸にＵＶ検出器を使用して、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＭＤ）によって定量化することができる（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、７７５〜７７９頁（２００５年））。
この実施例は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシイソ酪酸を生成することができる微生物体の調製を記載する。
（実施例ＸＶＩＩ）
２−ヒドロキシイソ酪酸へのアセチルＣｏＡの転換のための経路を有する２−ヒドロキシイソ酪酸生成微生物体の調製
この実施例は、アセチルＣｏＡから２−ヒドロキシイソ酪酸を生成することができる微生物体の作製を記載する。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、図１２中に示す２−ヒドロキシイソ酪酸経路を工学的に操作するための標的生物体として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉは、２−ヒドロキシイソ酪酸を生成することができる天然に存在しない微生物を作製するのに良い宿主を提供する。Ｅ．ｃｏｌｉは遺伝子操作の影響を受けやすく、嫌気的または微好気的条件下で効率良く、エタノール、酢酸、ギ酸、乳酸、およびコハク酸のような、様々な生成物を生成することができることは公知である。
２−ヒドロキシイソ酪酸を生成するように操作されたＥ．ｃｏｌｉ株を作製するために、経路中で利用する酵素をコードする核酸を、周知の分子生物学の技術を使用してＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、１９９９年を参照）。特に、それぞれアセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、および３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ活性をコードするａｔｏＢ（Ｐ７６４６１．１）、ｈｂｄ（Ｐ５２０４１．２）、およびＭｐｅ＿Ｂ０５４１（ＹＰ＿００１０２３５４６．１）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＥ１３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。さらに、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ活性をコードするｈｉｂｃｈ（Ｑ５ＸＩＥ６．２）を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＡ３３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。２組のプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５に形質転換して、アセチルＣｏＡの経路を介した２−ヒドロキシイソ酪酸の合成に必要なタンパク質および酵素を発現させる。
得られた遺伝子操作生物体は、当技術分野で周知の手順後、グルコース含有培地において培養する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、２００１年を参照）。Ｅ．ｃｏｌｉの宿主株をｄｅ ｎｏｖｏでコバラミンを合成するように操作しない限り、コバラミンをさらに培地に供給してムターゼ酵素の活性を確実にする（例えば、Ｒａｕｘら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、７５３〜７６７頁（１９９６年）を参照）。２−ヒドロキシイソ酪酸合成遺伝子の発現は、例えば、ノーザンブロット、ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、イムノブロッティングなどを含めた、ポリペプチド発現または酵素活性を決定するための当技術分野で周知の方法を使用して裏付ける。発現される酵素の酵素活性は、個々の活性に特異的なアッセイを使用して確認する。２−ヒドロキシイソ酪酸を生成する工学的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ株の能力は、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣＭＳ）および／または液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣＭＳ）を使用して確認する。
機能的２−ヒドロキシイソ酪酸合成経路を有するように操作した微生物株は、経路の有効利用のための最適化によってさらに増強する。簡単に述べると、工学的に操作された株を評価して、いずれの外因性遺伝子が律速レベルで発現されるかどうか決定する。例えば追加的遺伝子コピー数の導入によって、経路中の流れを制限し得る低レベルで発現する任意の酵素に関して発現は増大する。
より良い生産体を作製するために、代謝モデリングを利用して増殖条件を最適化する。モデリングをさらに使用して、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計する（例えば、米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、および米国特許第７，１２７，３７９号を参照）。モデリング解析によって、２−ヒドロキシイソ酪酸のより有効な生成への代謝の移行の、細胞増殖に対する影響の信頼できる予測を与える。１つのモデリング法は、２−ヒドロキシイソ酪酸のより良好な生成を一括してもたらす遺伝子ノックアウトを選択するために適用される２層最適化法ＯｐｔＫｎｏｃｋ（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．、８４巻、６４７〜６５７頁（２００３年））である。適応進化を使用して、例えば２−ヒドロキシイソ酪酸生成物のアセチルＣｏＡ中間体の、より良い生産体を作製することもできる。適応進化を実施して増殖特性と生産特性の両方を改善する（ＦｏｎｇおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、３６巻、１０５６〜１０５８頁（２００４年）；Ａｌｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３１４巻、１５６５〜１５６８頁（２００６年））。結果に基づいて、後の数ラウンドのモデリング、遺伝子操作および適応進化を２−ヒドロキシイソ酪酸生産体に施して、生産をさらに増大することができる。
２−ヒドロキシイソ酪酸の大規模な生産用に、前述の生物体を当技術分野で公知の培地を使用して発酵槽中で培養して、嫌気的条件下での生物体の増殖を促進する。発酵は回分、流加または連続的な形で実施する。嫌気的条件は最初に窒素で培地をスパージし、次いで培養容器を密閉することによって維持し、例えば、フラスコは隔膜および圧着キャップで密閉することができる。限られた通気で隔膜中に小さな穴を与えることによって、微好気的条件を利用することもできる。培地のｐＨは、Ｈ２ＳＯ４などの酸を加えることによって約７のｐＨに保つ。増殖速度は分光光度計を使用して光学濃度を測定することによって決定し（６００ｎｍ）、グルコースの取り込み速度は経時的な炭素源の枯渇をモニターすることによって決定する。望ましくないアルコール、有機酸、および残留グルコースなどの副産物は、例えば、Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）シリーズのＨＰＬＣカラム（例えば、ＨＰＸ−８７シリーズ）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）を使用して、グルコースおよびアルコールに屈折率検出器、有機酸にＵＶ検出器を使用して、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＭＤ）によって定量化することができる（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、７７５〜７７９頁（２００５年））。
この実施例は、アセチルＣｏＡから２−ヒドロキシイソ酪酸を生成することができる微生物体の調製を記載する。
（実施例ＸＶＩＩＩ）
２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを介した２−ヒドロキシイソブチレートまたはＭＡＡへの４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの転換のための経路
この実施例は、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを介して進行する４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから始まる、例示的な２−ヒドロキシイソ酪酸またはＭＡＡの合成経路を記載する。図１２中に示す経路は嫌気的条件下でも高収率であり、２−ヒドロキシイソ酪酸またはＭＡＡの最大理論収率はグルコース１モル当たり１．３３モルである。これは、グルコース１ｍｏｌ当たり１モルの生成物の最大理論収率に制限される、実施例ＸＩ中に記載したアセチルＣｏＡから始まる経路とは対照的である。
この経路は最初にビニルアセチルＣｏＡへの４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの脱水を伴い、それは後にクロトノイルＣｏＡに異性体化される。クロトニルＣｏＡを水和して３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを形成し、それは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡに再編成される。２−ヒドロキシイソブチレート経路の最終ステップは、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡからのＣｏＡ官能基の除去が関与する。ＭＡＡ合成中の最終ステップは、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡの脱水、次にメタクリリルＣｏＡからのＣｏＡ官能基の除去が関与する。図１２の最初の３経路のステップ、ステップ７、８、および９の遺伝子候補は以下に記載する。図１２のステップ３、４、５、および６の遺伝子候補は実施例ＸＩ中に論じる。
図１２を参照すると、ステップ８および９は４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ酵素によって実施する。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｕｍとＣ．ｋｌｕｙｖｅｒｉの両方由来の酵素は、クロトニルＣｏＡへの４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの可逆的転換を触媒し、さらに固有のビニルアセチルＣｏＡΔ−イソメラーゼ活性を有する（ＳｃｈｅｒｆおよびＢｕｃｋｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１５巻、４２１〜４２９頁（１９９３年）；Ｓｃｈｅｒｆら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１６１巻、２３９〜２４５頁（１９９４年））。Ｎ末端アミノ酸配列を含めて両方の天然酵素が精製および特徴付けられている（ＳｃｈｅｒｆおよびＢｕｃｋｅｌ、上記、１９９３年；Ｓｃｈｅｒｆら、上記、１９９４年）。Ｃ．ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｕｍおよびＣ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来のａｂｆＤ遺伝子はこれらのＮ末端アミノ酸配列が正確に一致し、したがって４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ／ビニルアセチルＣｏＡΔ−イソメラーゼをコードする。さらに、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のａｂｆＤ ＡＴＣＣ３３２７７は、相同性によって同定することができる別の例示的な４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼである。
Figure 2014147400
 図１２のステップ１０はクロトナーゼ酵素によって実施する。このような酵素はいくつかの生物体、特にＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ種中のｎ−ブタノール形成に必要とされ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ、およびＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ属の好熱好酸性古細菌中の３−ヒドロキシプロピオン酸／４−ヒドロキシ酪酸回路の１ステップをさらに含む。クロトナーゼ酵素をコードする例示的な遺伝子は、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｂｏｙｎｔｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、１１号、３０１５〜３０２４頁（１９９６年））、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ（ＨｉｌｌｍｅｒおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２１巻、３号、３５１〜３５４頁（１９７２年））、およびＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ（Ｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１８巻、５８５７号、１７８２〜１７８６頁（２００７年））中で見ることができるが、後者の遺伝子の配列は公知ではない。脂肪酸β酸化および／または様々なアミノ酸の代謝に関与するエノイルＣｏＡヒドラターゼは、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを形成するためのクロトニルＣｏＡの水和も触媒することができる（ＡｇｎｉｈｏｔｒｉおよびＬｉｕ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．１１巻、１号、９〜２０頁（２００３年）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１１７巻、１号、９９〜１０８頁（１９７８年）；Ｃｏｎｒａｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１１８巻、１号、１０３〜１１頁（１９７４年））。Ｐ．ｐｕｔｉｄａのエノイルＣｏＡヒドラターゼ、ｐｈａＡおよびｐｈａＢは、フェニル酢酸異化中に二重結合のヒドロキシル化を実施すると考えられる（Ｏｌｉｖｅｒａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９５巻、１１号、６４１９〜６４２４頁（１９９８年））。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のｐａａＡおよびｐａａＢは同様の変換を触媒する（Ｏｌｉｖｅｒａら、上記、１９９８年）。最後に、ｍａｏＣ（ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８５巻、１８号、５３９１〜５３９７頁（２００３年））、ｐａａＦ（ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８６巻、６号、６８１〜６８６頁（２００４年ａ））；ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１３〜１１６頁：３３５〜３４６頁（２００４年ｂ））；Ｉｓｍａｉｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０巻、１４号、３０４７〜３０５４頁（２００３年）、およびｐａａＧ（ＰａｒｋおよびＬｅｅ、上記、２００４年；ＰａｒｋおよびＬｅｅ、上記、２００４年ｂ；Ｉｓｍａｉｌら、上記、２００３年）を含めた、いくつかのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの遺伝子はエノイルＣｏＡヒドラターゼの官能性を示すことが示されている。
Figure 2014147400
 この実施例は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからの２−ヒドロキシイソブチレートまたはメタクリル酸の生合成経路を記載する。
（実施例ＸＩＸ）
２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを介したＭＡＡへの４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの転換のための経路を有するＭＡＡ生成微生物体の調製
この実施例は、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを介して４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＭＡＡを生成することができる微生物体の作製を記載する。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから始まる、図１２中に示すＭＡＡ経路を工学的に操作するための標的生物体として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉは、ＭＡＡを生成することができる天然に存在しない微生物を作製するのに良い宿主を提供する。Ｅ．ｃｏｌｉは遺伝子操作の影響を受けやすく、嫌気的または微好気的条件下で効率良く、エタノール、酢酸、ギ酸、乳酸、およびコハク酸のような、様々な生成物を生成することができることは公知である。
ＭＡＡを生成するように操作されたＥ．ｃｏｌｉ株を作製するために、経路中で利用する酵素をコードする核酸を、周知の分子生物学の技術を使用してＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、１９９９年を参照）。最初に、それぞれコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＣｏＡ依存性）、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、およびホスホトランスブチリラーゼ活性をコードするｓｕｃＤ（ＹＰ＿００１３９６３９４）、４ｈｂｄ（ＹＰ＿００１３９６３９３）、ｂｕｋ１（Ｑ４５８２９）、およびｐｔｂ（ＮＰ＿３４９６７６）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＥ１３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。Ｂｕｒｋら（米国公開２００９／００７５３５１）中に記載されたように、この構築体はスクシニルＣｏＡからの４ＨＢ−ＣｏＡの生成を可能にする。それぞれ４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡΔ−イソメラーゼ、およびエノイルＣｏＡヒドラターゼ活性をコードするａｂｆＤ（ＹＰ＿００１３９６３９９．１）およびｃｒｔ１（ＹＰ＿００１３９３８５６）を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＳ２３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。さらに、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼおよびメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼ活性をコードするｈｇｄＡ（Ｐ１１５６９）、ｈｇｄＢ（Ｐ１１５７０）、ｈｇｄＣ（Ｐ１１５６８）、およびｈｉｂｃｈ（Ｑ５ＸＩＥ６．２）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＳ１３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。ｐＺＳ２３は、周知の分子生物学の技術によって、ｐＺＳ１３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）のアンピシリン耐性モジュールとカナマイシン耐性モジュールを交換することによって得る。３組のプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５に形質転換して、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを介した４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからのＭＡＡ合成に必要な、タンパク質および酵素を発現させる。
得られた遺伝子操作生物体は、当技術分野で周知の手順後、グルコース含有培地において培養する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、２００１年を参照）。Ｅ．ｃｏｌｉの宿主株をｄｅ ｎｏｖｏでコバラミンを合成するように操作しない限り、コバラミンをさらに培地に供給してムターゼ酵素の活性を確実にする（例えば、Ｒａｕｘら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８巻、７５３〜７６７頁（１９９６年）を参照）。ＭＡＡ合成遺伝子の発現は、例えば、ノーザンブロット、ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、イムノブロッティングなどを含めた、ポリペプチド発現または酵素活性を決定するための当技術分野で周知の方法を使用して裏付ける。発現される酵素の酵素活性は、個々の活性に特異的なアッセイを使用して確認する。ＭＡＡを生成する工学的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ株の能力は、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣＭＳ）および／または液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣＭＳ）を使用して確認する。
機能的ＭＡＡ合成経路を有するように操作した微生物株は、経路の有効利用のための最適化によってさらに増強する。簡単に述べると、工学的に操作された株を評価して、いずれの外因性遺伝子が律速レベルで発現されるかどうか決定する。例えば追加的遺伝子コピー数の導入によって、経路中の流れを制限し得る低レベルで発現する任意の酵素に関して発現は増大する。
より良い生産体を作製するために、代謝モデリングを利用して増殖条件を最適化する。モデリングをさらに使用して、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計する（例えば、米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、および米国特許第７，１２７，３７９号を参照）。モデリング解析によって、ＭＡＡのより有効な生成への代謝の移行の、細胞増殖に対する影響の信頼できる予測を与える。１つのモデリング法は、ＭＡＡのより良好な生成を一括してもたらす遺伝子ノックアウトを選択するために適用される２層最適化法ＯｐｔＫｎｏｃｋ（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．８４巻、６４７〜６５７頁（２００３年））である。適応進化を使用して、例えばＭＡＡ生成物の４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ中間体のより良い生産体を作製することもできる。適応進化を実施して増殖特性と生産特性の両方を改善する（ＦｏｎｇおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６巻、１０５６〜１０５８頁（２００４年）；Ａｌｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３１４巻、１５６５〜１５６８頁（２００６年））。結果に基づいて、後の数ラウンドのモデリング、遺伝子操作および適応進化をＭＡＡ生産体に施して、生産をさらに増大することができる。
ＭＡＡの大規模な生産用に、前述の生物体を当技術分野で公知の培地を使用して発酵槽中で培養して、嫌気的条件下での生物体の増殖を促進する。発酵は回分、流加または連続的な形で実施する。嫌気的条件は最初に窒素で培地をスパージし、次いで培養容器を密閉することによって維持し、例えば、フラスコは隔膜および圧着キャップで密閉することができる。限られた通気で隔膜中に小さな穴を与えることによって、微好気的条件を利用することもできる。培地のｐＨは、Ｈ２ＳＯ４などの酸を加えることによって約７のｐＨに保つ。増殖速度は分光光度計を使用して光学濃度を測定することによって決定し（６００ｎｍ）、グルコースの取り込み速度は経時的な炭素源の枯渇をモニターすることによって決定する。望ましくないアルコール、有機酸、および残留グルコースなどの副産物は、例えば、Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）シリーズのＨＰＬＣカラム（例えば、ＨＰＸ−８７シリーズ）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）を使用して、グルコースおよびアルコールに屈折率検出器、有機酸にＵＶ検出器を使用して、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＭＤ）によって定量化することができる（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、７７５〜７７９頁（２００５年））。
この実施例は、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを介して４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＭＡＡを生成することができる微生物体の調製を記載する。
（実施例ＸＸ）
２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを介した２−ヒドロキシイソ酪酸への４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの転換のための経路を有する２−ヒドロキシイソ酪酸生成微生物体の調製
この実施例は、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを介して４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから２−ヒドロキシイソ酪酸を生成することができる微生物体の作製を記載する。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから始まる、図１２中に示す２−ヒドロキシイソブチレート経路を工学的に操作するための標的生物体として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉは、２−ヒドロキシイソブチレートを生成することができる天然に存在しない微生物を作製するのに良い宿主を提供する。Ｅ．ｃｏｌｉは遺伝子操作の影響を受けやすく、嫌気的または微好気的条件下で効率良く、エタノール、酢酸、ギ酸、乳酸、およびコハク酸のような、様々な生成物を生成することができることは公知である。
２−ヒドロキシイソブチレートを生成するように操作されたＥ．ｃｏｌｉ株を作製するために、経路中で利用する酵素をコードする核酸を、周知の分子生物学の技術を使用してＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、１９９９年を参照）。最初に、それぞれコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＣｏＡ依存性）、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、およびホスホトランスブチリラーゼ活性をコードするｓｕｃＤ（ＹＰ＿００１３９６３９４）、４ｈｂｄ（ＹＰ＿００１３９６３９３）、ｂｕｋ１（Ｑ４５８２９）、およびｐｔｂ（ＮＰ＿３４９６７６）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＥ１３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。Ｂｕｒｋら（米国公開２００９／００７５３５１）中に記載されたように、この構築体はスクシニルＣｏＡからの４ＨＢ−ＣｏＡの生成を可能にする。それぞれ４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡΔ−イソメラーゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ活性をコードするａｂｆＤ（ＹＰ＿００１３９６３９９．１）、ｃｒｔ１（ＹＰ＿００１３９３８５６）、およびｈｉｂｃｈ（Ｑ５ＸＩＥ６．２）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの下でｐＺＳ２３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、ドイツ）にクローニングする。２組のプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５に形質転換して、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを介した４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからの２−ヒドロキシイソブチレートの合成に必要な、タンパク質および酵素を発現させる。
得られた遺伝子操作生物体は、当技術分野で周知の手順後、グルコース含有培地において培養する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、２００１年を参照）。Ｅ．ｃｏｌｉの宿主株をｄｅ ｎｏｖｏでコバラミンを合成するように操作しない限り、コバラミンをさらに培地に供給してムターゼ酵素の活性を確実にする（例えば、Ｒａｕｘら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８巻、７５３〜７６７頁（１９９６年）を参照）。２−ヒドロキシイソ酪酸合成遺伝子の発現は、例えば、ノーザンブロット、ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、イムノブロッティングなどを含めた、ポリペプチド発現または酵素活性を決定するための当技術分野で周知の方法を使用して裏付ける。発現される酵素の酵素活性は、個々の活性に特異的なアッセイを使用して確認する。２−ヒドロキシイソブチレートを生成する工学的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ株の能力は、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣＭＳ）および／または液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣＭＳ）を使用して確認する。
機能的２−ヒドロキシイソブチレート合成経路を有するように操作した微生物株は、経路の有効利用のための最適化によってさらに増強する。簡単に述べると、工学的に操作された株を評価して、いずれの外因性遺伝子が律速レベルで発現されるかどうか決定する。例えば追加的遺伝子コピー数の導入によって、経路中の流れを制限し得る低レベルで発現する任意の酵素に関して発現は増大する。
より良い生産体を作製するために、代謝モデリングを利用して増殖条件を最適化する。モデリングをさらに使用して、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計する（例えば、米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、および米国特許第７，１２７，３７９号を参照）。モデリング解析によって、２−ヒドロキシイソブチレートのより有効な生成への代謝の移行の、細胞増殖に対する影響の信頼できる予測を与える。１つのモデリング法は、２−ヒドロキシイソブチレートのより良好な生成を一括してもたらす遺伝子ノックアウトを選択するために適用される２層最適化法ＯｐｔＫｎｏｃｋ（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．、８４巻、６４７〜６５７頁（２００３年））である。適応進化を使用して、例えば２−ヒドロキシイソ酪酸生成物の４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ中間体のより良い生産体を作製することもできる。適応進化を実施して増殖特性と生産特性の両方を改善する（ＦｏｎｇおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、３６巻、１０５６〜１０５８頁（２００４年）；Ａｌｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１４巻、１５６５〜１５６８頁（２００６年））。結果に基づいて、後の数ラウンドのモデリング、遺伝子操作および適応進化を２−ヒドロキシイソブチレート生産体に施して、生産をさらに増大することができる。
２−ヒドロキシイソブチレートの大規模な生産用に、前述の生物体を当技術分野で公知の培地を使用して発酵槽中で培養して、嫌気的条件下での生物体の増殖を促進する。発酵は回分、流加または連続的な形で実施する。嫌気的条件は最初に窒素で培地をスパージし、次いで培養容器を密閉することによって維持し、例えば、フラスコは隔膜および圧着キャップで密閉することができる。限られた通気で隔膜中に小さな穴を与えることによって、微好気的条件を利用することもできる。培地のｐＨは、Ｈ２ＳＯ４などの酸を加えることによって約７のｐＨに保つ。増殖速度は分光光度計を使用して光学濃度を測定することによって決定し（６００ｎｍ）、グルコースの取り込み速度は経時的な炭素源の枯渇をモニターすることによって決定する。望ましくないアルコール、有機酸、および残留グルコースなどの副産物は、例えば、Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）シリーズのＨＰＬＣカラム（例えば、ＨＰＸ−８７シリーズ）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）を使用して、グルコースおよびアルコールに屈折率検出器、有機酸にＵＶ検出器を使用して、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＭＤ）によって定量化することができる（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７７５〜７７９頁（２００５年））。
この実施例は、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを介して４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから２−ヒドロキシイソブチレートを生成することができる微生物体の調製を記載する。
（実施例ＸＸＩ）
メタクリル酸または３−ヒドロキシイソ酪酸の生産増大用の遺伝子ノックアウト株の設計
この実施例は、メタクリル酸または３−ヒドロキシイソ酪酸の生産増大用の遺伝子ノックアウトした株の設計を記載する。
ＯｐｔＫｎｏｃｋは、遺伝的に安定した過剰生成微生物を開発する全体的な目的で考案された、２層の計算フレームワークである。具体的には、このフレームワークは微生物の完全なネットワークを調べて、望ましい生化学的物質を細胞増殖の絶対副産物の状態にする遺伝的操作を提唱する。戦略的に配置した遺伝子欠失によって生化学的生成と細胞増殖を連結することによって、バイオリアクター中での長期間後に工学的操作株に課した増殖選択圧は、強制的な増殖連結型の生化学的物質の生成の結果として性能の改善をもたらす。最後に、設計した株がそれらの野生型状態に復帰する、ごくわずかな可能性がある。ＯｐｔＫｎｏｃｋによって選択した遺伝子は、挿入ではなく完全な欠失を使用した適切な遺伝的操作によって、ゲノムから完全に除去しなければならないからである。
増殖連結型の生化学的物質の生成の概念は、コンピュータモデルを用いて計算された典型的な代謝ネットワークの生化学的生成エンベロープとの関連で視覚化することができる。これらの限界は、制限している（１つまたは複数の）基質の（１つまたは複数の）取り込み速度をその実験的に測定された（１つまたは複数の）値に固定し、それぞれの増殖到達可能なレベルで生化学的生成の最大および最低速度を計算することによって得られる。例外は存在するが、典型的には望ましい生化学的物質の生成は、細胞内資源のバイオマス形成と直接競合する（図１６参照）。したがって、生化学的生成の速度が高まると、必ず増殖速度が最大以下となる。野生型株から代謝挙動を変化させる許容可能な解の境界を制限するように、ＯｐｔＫｎｏｃｋによって示唆されるノックアウトが設計される。所与の株についての現実の解の境界は、（１つまたは複数の）基質の取り込み速度が増大または低下するにつれて増大または収縮し得るが、それぞれの実験点はその計算した解の境界内に存在するはずである。これらのようなプロットによって、株が性能限界にどの程度近いか、または言い換えると、改善にどれくらいの余地が利用可能であるかの視覚化が可能である。ＯｐｔＫｎｏｃｋのフレームワークは、生化学的過剰生成に有望な遺伝子欠失戦略の確認を既に可能にしており（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８４巻、６号、６４７〜６５７頁（２００３年）；Ｐｈａｒｋｙａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８４巻、７号、８８７〜８９９頁（２００３年）；Ｐｈａｒｋｙａら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１４巻、１１号、２３６７〜２３７６頁（２００４年））、代謝および制御モデルフレームワークの将来的改善を当然ながら含むシステムフレームワークを確立する。
実施例ＸＸＩＩおよびＸＸＩＩＩ中でより詳細に記載するのは、ＭＡＡまたは３−ヒドロキシイソ酪酸生合成経路の添加によって増殖連結型ＭＡＡまたは３−ヒドロキシイソ酪酸生成を実施する宿主生物体を作製するために存在しないか、減弱しているか、または消失しているべきである酵素活性のセットである。全ての考えられる戦略を列挙するために、各反復時に整数カットと呼ばれる追加の制約の組込みによるＯｐｔＫｎｏｃｋ問題の反復的解決を伴う、整数カットと呼ばれる最適化技術が実施されている。
ＯｐｔＫｎｏｃｋアルゴリズムは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの代謝の化学量論モデルに基づいて、ＭＡＡ、または望む場合は前駆体３−ヒドロキシイソブチレート（３−ＨＩＢ）の過剰生成用の増殖連結型株設計を確認した。想定は（ｉ）１０ｍｍｏｌ／ｇｄｗ／時間のグルコース取り込み速度、（ｉｉ）嫌気的または微好気的条件、および（ｉｉｉ）４ｍｍｏｌ／ｇＤＣＷ／時間の最小非増殖連結型維持要件を含む。増殖基質はグルコースであったと想定したが、これらの戦略はグルコース、スクロース、キシロース、アラビノース、またはグリセロールを含めた任意の基質に適用可能であることが理解されよう。スクシニルＣｏＡ：ＭＡＡ経路（図２）および４−ＨＢ−ＣｏＡ：ＭＡＡ経路（図６）に関する増殖連結型生成設計の完全なセットは、それぞれ表１０および１１中に列挙する。表１０および１１は、スクシニルＣｏＡ（表１０）または４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（表１１）中間体を介したＭＡＡまたは３−ヒドロキシイソ酪酸の生成を高めるために、ＯｐｔＫｎｏｃｋによる除去の標的となる反応の組合せを示す。最大または全ての反応を含めた、反応の少なくとも１つ、または任意の組合せの減弱を利用して、望ましい効果を得ることができる。酵素名、それらの略称、および対応する反応化学量論は表１２中に列挙する。最後に、反応式中の略称に対応する代謝産物の名称は表１３中に列挙する。
これらの設計はＥ．ｃｏｌｉ代謝の代謝モデルを使用して確認し、表１２中に列挙する遺伝子名はＥ．ｃｏｌｉに特異的であるが、代謝工学的戦略およびさらに設計自体の選択法は、任意のＭＡＡまたは３−ヒドロキシイソブチレート生成生物体に適用可能である。したがって、これらの設計は本質的に、増殖連結型生成を可能にするために、その活性が消失しているか、減弱しているか、または最初から微生物に存在しないかのいずれかでなければならない酵素的変換のリストである。
設計の最終選択を優先するための重要な基準は、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／またはメタクリル酸の増殖連結型収率であった。これを調べるために、前に記載したように異なる速度のバイオマス形成での生成物収率を最初に最大化し後に最小化することによって、それぞれの戦略用に生成コーンを構築した。一地点での突然変異体ネットワークの考えられる全ての表現型の右端境界への収束は、最大バイオマス形成速度で独自の最適生成物収率が存在することを示す。他の場合、考えられる表現型の右端境界は垂直線であり、最大バイオマスの地点において、ネットワークは計算範囲で、垂直線の最低地点における最小量を含めた任意の量のＭＡＡを生成することができることを示す。このような設計は優先順位が低かった。それぞれの経路に関する最優先のＯｐｔＫｎｏｃｋ設計の簡単なリストは、それぞれ実施例ＸＸＩＩおよびＸＸＩＩＩ中の表６および８中に示す。
以下の実施例中の株設計は、バイオマス形成と連結してＭＡＡを生成するそれらの能力によって特徴付けるが、これらの株をさらに利用して、ＭＡＡ経路中間体３−ヒドロキシイソブチレートを過剰生成することができることが理解される。両方の経路中、ＭＡＡを形成するための最終酵素ステップは、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼによる３−ヒドロキシイソブチレートの脱水を伴う（図２中のステップ５、図６中のステップ３）。この反応は還元当量、プロトン、またはエネルギーを消費または生成しないので、それが株設計のエネルギー特性を変えることはない。したがって、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ活性を欠く株では、本明細書に記載する全ての設計は３−ＨＩＢの増殖連結型生成を可能にする。
この実施例は、ＭＡＡおよび／または３−ＨＩＢの増殖連結型生成用の株を作製するための遺伝子ノックアウトの設計を記載する。
（実施例ＸＸＩＩ）
スクシニルＣｏＡのノックアウト設計：ＭＡＡ経路
この実施例は、ＭＡＡ経路のためのスクシニルＣｏＡのノックアウト設計を記載する。前に論じたように、同様のノックアウト設計を、スクシニルＣｏＡから３−ヒドロキシイソブチレートの経路にも使用することができることが理解される。
表６は、実施例ＸＸＩ中に記載したのと同様に設計した、スクシニルＣｏＡからＭＡＡの経路に関する増殖連結型設計を示す。表７は、表６中に示す増殖連結型設計のＭＡＡの最大理論収率およびバイオマス形成率を示す。
Figure 2014147400
Figure 2014147400
Figure 2014147400
 ＭＡＡ経路のためのスクシニルＣｏＡに関する全ての最優先の増殖連結型設計（表６および図１７）は設計１を構築し、これは発酵副産物の形成を妨げるために、アセチルアルデヒド−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＥｒ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ＿Ｄ）活性の不在を必要とする。設計２は、Ｌ−アスパルターゼ（ＡＳＰＴ）の官能性をさらに除去した、このベース設計を構築する。この設計は、最大バイオマス収率で５４％の理論最大ＭＡＡ収率（０．３５ｇ／ｇ）に到達することができる（表７）。
Figure 2014147400
 設計３および４はベース設計としての設計２を構築する。設計３は、副産物としてのギ酸の分泌を妨げるために、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬｉ）活性の除去を伴う。この設計は、９４％の理論最大ＭＡＡ収率をもたらす。設計４中のＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ（ＴＨＤ２）および／またはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＵＤｙ）のさらなる欠失は、９５％の理論最大収率を得ながら細胞増殖とＭＡＡ生成を強く連結するのに役立つ。この設計は、バイオマス形成に関して少なくとも０．２４ｇ／ＭＡＡ１ｇの形成をさらに必要とする。
設計５および６もベース設計としての設計２を構築する。設計５中、ＡＴＰシンターゼ（ＡＴＰＳ４ｒ）の除去は、０．１２３ｌ／時間の最大バイオマス形成率で０．４２ｇ／ＭＡＡ１ｇの収率をもたらす。この設計は増殖と生成物形成を強く連結するが、発酵副産物としての酢酸およびギ酸の分泌を必要とする。ホスホエノールピルビン酸：ピルビン酸ＰＴＳ系を介したグルコース輸送の除去は副産物の形成を減らし、０．５４ｇ／ｇ（８４％の最大理論収率）までＭＡＡ生成を増大する。
設計７〜１４は設計１を構築し、その中ではＡＤＨＥｒ、ＭＤＨおよびＬＤＨ＿Ｄ官能性を除去する。設計７中、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＵＤｙ）官能性の除去は、０．１６２ｌ／時間で０．２１ｇ／ＭＡＡ１ｇを生成する突然変異体をもたらす。設計８中のピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬｉ）のさらなる欠失は０．３５ｇ／ＭＡＡ１ｇをもたらす。設計９中のホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡｒ）および／または酢酸キナーゼ（ＡＣＫｒ）のさらなる欠失は酢酸の形成を妨げ、０．６０ｇ／ｇ、９５％の理論最大値まで生成物収率を増大する。トランスヒドロゲナーゼ（ＴＨＤ２）官能性のさらなる除去はこの設計の増殖−カップリングを改善する。
設計１０は、ＭＤＨ、ＬＤＨ、およびＡＤＨＥｒに加えてＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ（ＴＨＤ２）をノックアウトする。この株は０．２０ｌ／時間の最大増殖速度で０．２９ｇ／ｇのＭＡＡ収率を得ると予想する。６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）および／またはグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨｙ）のさらなる欠失は解糖を介した流れを増大するのに役立ち、したがってバイオマス形成と強く連結しながら０．３７ｇ／ｇまで予想ＭＡＡ収率を改善する。ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬｉ）のさらなる欠失はＰＤＨを介した流れを促進し、副産物の形成を減らし、０．５２ｇ／ｇ、８２％の理論最大値まで予想ＭＡＡ収率を増大する。ＡＣＫｒおよびＡＳＰＴのさらなる欠失も、副産物の形成を減らすことによって、この設計の生成物収率を改善する。
設計１３は、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＨ６）をさらにノックアウトして設計１を構築する。これは、最大バイオマス形成率で０．２７ｇ／ｇのＭＡＡ収率を有する株をもたらす。設計１４中のホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡｒ）および／または酢酸キナーゼ（ＡＣＫｒ）のさらなる欠失は、０．５６ｇ／ｇ、８８％の理論最大値まで収率を改善する。この設計は、唯一の発酵副産物としてＭＡＡを生成する利点を有する。
全ての高収率株設計は、以下の反応：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＥｒ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ＿Ｄ）、ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨｙ）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬｉ）、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ（ＴＨＤ２）、ＡＴＰシンテターゼ（ＡＴＰＳ４ｒ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＵＤｙ）、アスパルターゼ（ＡＳＰＴ）、酢酸キナーゼ（ＡＣＫｒ）、ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡｒ）およびＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＨ６）の少なくとも１つの欠失を含む。表６中の株設計にこれらのノックアウトのいずれかを加えることによって、ＭＡＡまたは３−ヒドロキシイソブチレートの収率をさらに改善し得る。
これらの結果は、ＭＡＡまたは３−ＨＩＢの増殖連結型生成を有する株を作製するためのノックアウト設計戦略を記載する。
（実施例ＸＸＩＩＩ）
４−ヒドロキシブチリルＣｏＡのノックアウト設計：ＭＡＡ経路
この実施例は、ＭＡＡ経路のための４−ヒドロキシブチリルＣｏＡのノックアウト設計を記載する。前に論じたように、同様のノックアウト設計を、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシイソブチレートの経路にも使用することができることが理解される。
４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの経路に関して、３−ヒドロキシイソブチレートまたはＭＡＡを生成するためにヒドロラーゼまたはトランスフェラーゼのいずれかを利用する株用のＯｐｔＫｎｏｃｋ設計を作製した（図６、ステップ２）。２つの条件に関して作製した設計は類似していたが、生成物収率および増殖−カップリングはトランスフェラーゼを利用したとき有意に高かった。全ての設計は表１１中に挙げる。表８は、実施例ＸＸＩ中に記載したのと同様に設計した、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＭＡＡの経路に関する増殖連結型設計を示す。表９は、表８中に示す増殖連結型設計のＭＡＡの最大理論収率およびバイオマス形成率を示す。
Figure 2014147400
Figure 2014147400
 最優先の増殖連結型株設計（表８、図１８）は、設計１、除去、低下または減弱アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＥｒ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ＿Ｄ）官能性を有するベース株を構築する。コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ官能性のさらなる除去は、スクシニルＣｏＡを介した流れの有効なチャネリングに利点がある可能性がある。
Figure 2014147400
 設計２〜７は、Ｌ−アスパルターゼ（ＡＳＰＴ）活性がさらに除去、低下または減弱した設計１を構築する。設計２は、０．１３ｌ／時間の最大増殖速度で０．３３ｇ／ｇのＭＡＡ収率をもたらす。この株の主な発酵副産物はアセテートおよびホルメートである。ホルメート生成およびエネルギー発生と関係がある遺伝子のさらなる欠失は、これらの副産物の形成を減らすことができる。設計３はＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ（ＴＨＤ２）および／またはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＵＤｙ）のさらなる欠失で設計２を構築し、０．１２ｌ／時間の最大増殖速度で０．３４ｇ／ｇのＭＡＡ収率をもたらす。この株は副産物の形成を消失しないが、強く増殖に連結し、エネルギー発生に利用されるグルコース１グラム当たり少なくとも０．０７ｇのＭＡＡを生成することが必要とされる。設計４中のピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬｉ）のさらなる欠失はギ酸の分泌をなくし、０．６２ｇ／ｇ（９７％の理論最大値）までＭＡＡ収率を増大させ、さらにエネルギー発生のために少なくとも０．２４ｇ／ｇのＭＡＡの生成を必要とする。
設計５はＡＴＰシンテターゼ（ＡＴＰＳ４ｒ）がさらに欠失した設計４を構築する。この株は０．０７３ｌ／時間の最大増殖速度で０．３１ｇ／ｇのＭＡＡを得る。設計６中の６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）および／またはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨｙ）官能性のさらなる欠失によって、最大バイオマスで生成物収率が増大する（０．０５６ｌ／時間の最大増殖速度で０．５７ｇ／ｇ）。あるいは、ピルビン酸ギ酸リアーゼの欠失も強い増殖連結型の高収率設計をもたらす（設計７）。
設計８はＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼの官能性が除去された設計１ベース株（ＡＤＨＥｒ、ＬＤＨ＿Ｄ、ＭＤＨ）を構築する。この株設計はバイオマス０．１９ｌ／時間で０．２９ｇ／ｇのＭＡＡを得る。設計９中のホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）および／またはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨｙ）のさらなる欠失によって、最大バイオマス０．１１２ｌ／時間で０．５２ｇ／ｇまでＭＡＡ生成が増大する。
全ての高収率株設計は、以下の反応：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＥｒ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ＿Ｄ）、ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨｙ）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬｉ）、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ（ＴＨＤ２）、ＡＴＰシンテターゼ（ＡＴＰＳ４ｒ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＵＤｙ）、およびアスパルターゼ（ＡＳＰＴ）の少なくとも１つの欠失を含む。表８中の株設計にこれらのノックアウトのいずれかを加えることによって、ＭＡＡまたは３−ヒドロキシイソブチレートの収率をさらに改善し得る。
これらの結果は、ＭＡＡまたは３−ＨＩＢの増殖連結型生成を有する株を作製するためのノックアウト設計戦略を記載する。
（実施例ＸＸＩＶ）
工学的操作株の特徴付け
この実施例は、工学的操作株の特徴付けを記載する。
株の構築：３−ヒドロキシイソブチレートおよび／またはＭＡＡ経路を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＭＧ１６５５を、欠失を導入する株として使用する。Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７巻、１２号、６６４０〜６６４５頁、２０００年））のλＲｅｄリコンビナーゼシステムによって相同組換えを使用して、インフレーム欠失を取り込ませることによって株を構築する。この手法は、染色体配列、すなわち除去標的の遺伝子と、それ自体は後に除去される選択可能な抗生物体質耐性遺伝子の交換を含む。ノックアウトはレシピエント株に１つずつ組み込む。抗生物体質耐性マーカーはそれぞれの欠失後に存在せず、それぞれの標的株中に多数の突然変異の蓄積を可能にする。欠失技術は除去標的の遺伝子を完全に除去し、したがって構築した突然変異体が野生型に戻る可能性を実質的に低減する。
振とうフラスコの特徴付け：中間体株を構築し、振とうフラスコ発酵を実施することによって株の性能を定量化する。嫌気的条件は、フラスコをゴム隔膜で密閉し、次いで窒素で培地をスパージすることによって得る。厳密な嫌気的条件下で増殖が観察されない株用に、フラスコをホイルで覆い限られた通気で小さな穴を与えることによって、微好気的条件を適用する。個々の適用例に関して他に望まない限り、グルコースを補充したＭ９最小培地を使用して実験を実施した。前培養物を一晩増殖し、指数関数的増殖中の測定値を得るための新たなバッチ培養用の接種材料として使用する。増殖速度は分光光度計を使用して光学濃度を測定することによって決定し（６００ｎｍ）、グルコースの取り込み速度は経時的な炭素源の枯渇をモニターすることによって決定する。エタノール、ＭＡＡ、３−ヒドロキシイソ酪酸および有機酸を、通常の手順を使用してＧＣ−ＭＳまたはＨＰＬＣによって分析する。それぞれの株に関して三連の培養物を増殖する。
回分発酵槽試験：選択した株の性能は、嫌気的な、ｐＨ調節した回分発酵において試験する。これによって、増殖、グルコースの取り込み、および全生成物の形成速度の信頼できる定量化が可能であり、かつ酸性発酵生成物の蓄積が細胞増殖を制限しないことを確実にする。さらに、それは、３−ヒドロキシイソ酪酸および／またはＭＡＡの容積測定生産性および収率、株の性能を標準化する際の最も重要なパラメーターの２つの正確な決定を可能にする。温度およびｐＨ制御を備えた、６００ｍＬの作業体積を有する１Ｌのバイオリアクター中で発酵を実施する。リアクターは約０．５Ｌ／分でＮ２を用いて連続的にスパージし、溶存酸素（ＤＯ）レベルが検出レベル未満に留まることを確実にする。発酵容器中で達成可能な高い細胞密度に従いグルコース濃度が増大したこと以外、培養培地は前に記載したものと同じである。
ケモスタット試験：ケモスタット実験を実施して、バッチ形式から連続形式への発酵形式の変更が、３−ヒドロキシイソ酪酸および／またはＭＡＡの収率および容積測定生産性にどのように影響を与えるかの直接的指標を得る。回分形式を使用する前に記載したバイオリアクターは、培地の連続供給によってケモスタット形式で作用させ、使用済み培養物は除去する。流入速度を設定して、バッチ中の各株に関して観察した最大増殖速度の８０％の一定希釈率を維持し、流出は維持レベルに調節する。グルコースは培地中の限られた栄養素であり、容器中で望ましい光学濃度を得るように設定する。
適応進化：ノックアウト株は、それらの代謝ネットワークがそれらの失われた機能に適応するまで、準最適増殖速度を最初に示すと予想される。この適応を容易にするため、これらの株を適応進化させる。これらの株に適応進化を施すことによって、細胞増殖速度は一次選択圧状態になり、突然変異細胞はそれらの代謝の流れに強制的に再分配されてそれらの増殖速度は高まる。この代謝の再プログラミングは、様々な基質で適応進化させてコンピュータモデルによって推測的に予想した増殖率に到達させた、いくつかのＥ．ｃｏｌｉ突然変異体に関して近年実証されている（ＦｏｎｇおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、３６巻、１０号、１０５６〜１０５８頁（２００４年））。ＯｐｔＫｎｏｃｋ作製株は、他者より優れた品質を有する一株をおそらくもたらし得るＥ．ｃｏｌｉにおいて以前に確認された進化パターンの違いによって（ＦｏｎｇおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．、３６巻、１０号、１０５６〜１０５８頁（２００４年）；Ｆｏｎｇら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８５巻、２１号、６４００〜６４０８頁（２００３年）；Ｉｂａｒｒａら、Ｎａｔｕｒｅ、４２０巻、６９１２号、１８６〜１８９頁（２００２年））、三連で適応進化させる（平行して実施する）。得られる増殖改善の速度に応じて、進化は２〜６週間の間実施する。一般に、安定した表現型を得た後に進化を停止させる。ＯｐｔＫｎｏｃｋ手法の根底にある増殖連結型の生化学的生産概念は、遺伝的に安定した過剰生産体の生成をもたらす。
上記および前の実施例中に記載したように、メタクリル酸（ＭＡＡ）および３−ヒドロキシイソブチレート（３−ＨＩＢ）生成と細胞増殖を連結するための株の工学的操作戦略は、ＯｐｔＫｎｏｃｋ法を使用して計算した。２つの経路を調べた。第１の経路は中間体としてメチルマロニルＣｏＡを介して進行する。第２の経路は４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを介して進行し、ＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼまたはシンテターゼのいずれかを利用して、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを３−ＨＩＢに転換することができる。あるいは、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを最初にメタクリリルＣｏＡに転換する場合、この経路によってＭＡＡを直接生成することができる。経路の選択、宿主のバックグラウンド、およびそれぞれ個々のステップ用の酵素の選択は、最終生成株の生成物収率および増殖特性に影響を与える。
３−ヒドロキシイソ酪酸が前駆体として生成されると想定して、両経路の最終ステップは、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼによるＭＡＡへの３−ＨＩＢの脱水を伴う。この転換はエネルギーまたは酸化還元当量を必要としないので、ＭＡＡに関して記載する株設計戦略は、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ活性が生成生物体中に存在しない場合、３−ＨＩＢ生成の増殖連結型生成に適用することもできることが理解される。この場合、天然に存在しない生物体はＭＡＡの代わりに３−ＨＩＢを生成し得る。最大理論生成物およびエネルギー収率は、ＭＡＡまたは３−ＨＩＢが生成するかどうかとは無関係に不変である。
全ての最優先の株設計は３つの主要な欠失：ＭＤＨ、ＬＤＨ＿ＤおよびＡＤＨＥｒに基づいて構築する。この分析は、宿主株設計戦略は顕著に類似しており、宿主生物体中の少数の酵素活性の欠失を含むことを明らかにした。ＭＡＡ（または３−ＨＩＢ）の生成に影響を与える主な酵素活性は、アセトアルデヒドＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＥｒ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ＿Ｄ）、ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨｙ）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬｉ）、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ（ＴＨＤ２）、ＡＴＰシンテターゼ（ＡＴＰＳ４ｒ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＵＤｙ）、アスパルターゼ（ＡＳＰＴ）、酢酸キナーゼ（ＡＣＫｒ）、ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡｒ）およびＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＨ６）である。表６および８中の株設計にこれらのノックアウトのいずれか、または本明細書で開示する天然に存在しない微生物体のいずれかを加えることによって、ＭＡＡまたは３−ヒドロキシイソブチレートの収率をさらに改善し得る。
（実施例ＸＸＶ）
スクシニルＣｏＡまたは４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ前駆体経路を介してＭＡＡおよび／または３−ヒドロキシイソブチレートの増大した理論収率をもたらす主要代謝酵素
この実施例は、前駆体としてスクシニルＣｏＡまたは４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを利用してＭＡＡおよび／または３−ヒドロキシイソブチレート経路で工学的に操作された生物体の理論収率を増大するために調節することができる主要代謝反応の酵素を記載する。
この実施例中、本発明者らは、スクシニルＣｏＡからＭＡＡの経路または４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＭＡＡの経路により工学的に操作された微生物において高収率のＭＡＡを与える、いくつかの主要代謝反応の重要性を実証する。ＭＡＡによってまたはＭＡＡ以外で工学的に操作された微生物によって３−ヒドロキシイソ酪酸が生成する場合、この実施例中に記載する分析は同様に当てはまる。具体的には、主要代謝中のそれぞれの反応が個別に除去されると想定して、ＭＡＡ生成経路の片方または両方を補ったＥ．ｃｏｌｉの代謝ネットワークに関するグルコースからのＭＡＡ、または３−ヒドロキシイソ酪酸の収率を最大にした一連の線形計画法（ＬＰ）の問題を解決した。前に論じたように、いずれかの経路を介したグルコースからの最大ＭＡＡ収率は１．３３ｍｏｌ／ｍｏｌである。主要代謝は、解糖、ペントースリン酸経路、トリカルボン酸回路、グリオキシレートシャント、および様々な補充反応中の全ての反応を含む。他に記さない限り、ＰＥＰカルボキシキナーゼは、糖新生、ホスホエノールピルビン酸へのＡＴＰ消費方向においてのみ作用することができたと想定した。例示的な微生物としてＥ．ｃｏｌｉを選択したが、本明細書に示す分析はほぼ任意の原核または真核生物体に適用可能である。さらに、本明細書に記載する結論は例示的な炭水化物フィードストックとは無関係に有効であり、この実施例中で任意に選択するのはグルコースである。
外部電子アクセプター（例えば、酸素、硝酸塩）の存在下でその欠失が最大ＭＡＡ収率に悪影響を与える反応を、３つのネットワーク想定：１）非欠失型野生型ネットワーク（すなわち、全ての反応が存在する）；２）リンゴ酸デヒドロゲナーゼを差し引いた野生型ネットワーク（すなわち、いくつかのＯｐｔＫｎｏｃｋ設計において減弱を標的とする１つの反応）；および３）リンゴ酸デヒドロゲナーゼとピルビン酸ギ酸リアーゼの両方を差し引いたネットワーク（すなわち、いくつかのＯｐｔＫｎｏｃｋ設計において減弱を標的とする２つの反応）で表１４中に示す。外部電子アクセプターが存在しないと想定した同様の結果は表１５中に示す。この分析は、以下でより詳細に論じる３つの重要な観察結果をもたらした。
Figure 2014147400
Figure 2014147400
 観察１．クエン酸シンターゼおよびアコニターゼを介した十分な流れが、全ての場合８０％を超えるＭＡＡの理論収率を得るために必要とされる。好気的条件下では非常に活性があるが、トリカルボン酸回路の酸化部分は、酸素または硝酸塩などの外部電子アクセプターの不在下では非常に活性があるわけではない。例えばＥ．ｃｏｌｉでは、クエン酸シンターゼはＮＡＤＨによって阻害され、その濃度は外部電子アクセプターの不在下で高い。さらに、酸素制限条件下では、トリカルボン酸回路の酵素の発現はａｒｃＡ遺伝子の生成物によって抑制される（Ａｌｅｘｅｅｖａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８５巻、１号、２０４〜２０９頁（２００３年））。酸素制限条件下でＥ．ｃｏｌｉにおいてクエン酸シンターゼおよびアコニターゼ活性を増大するための１つの例示的な方法は、レギュレーターａｒｃＡの欠失および／または天然クエン酸シンターゼとＮＡＤＨ無反応酵素の交換を含む（Ｓｔｏｋｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８巻、３５４３５〜３５４４３頁（２００３年）；ＪｉｎおよびＳｏｎｅｎｓｈｅｉｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、１２号、３６５８〜３６６０頁（１９９６年）。
観察２．グリオキシレートシャント酵素、イソクエン酸リアーゼ、およびリンゴ酸シンターゼは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性が減弱するとき、ＭＡＡの最大理論収率を得るために必要とされる。イソクエン酸リアーゼまたはリンゴ酸シンターゼ活性なしでＭＡＡの最大収率が約２０％低下すると、グリオキシレートシャントに関する要件は酸素制限条件下で悪影響を受ける。Ｅ．ｃｏｌｉにおいてグリオキシレートシャント活性を増大するための１つの例示的な方法は、Ｓａｎｃｈｅｚら、（Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．、７巻、３号、２２９〜２３９頁（２００５年）中に記載されたような転写リプレッサー、ｉｃｌＲの欠失を含む。
観察３．リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびピルビン酸ギ酸リアーゼ欠損バックグラウンドでは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、外部電子アクセプターの存在下で９３％の最大理論ＭＡＡ収率、または外部電子アクセプターの不在下で５８％の最大理論収率に達することが必要とされる。ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、高いＮＡＤＨ／ＮＡＤ、ＡＴＰ／ＡＤＰ、およびアセチルＣｏＡ／ＣｏＡ比によって阻害される。したがってこの酵素は、大部分はｌｐｄＡによってコードされるサブユニットＥ３のＮＡＤＨ感度が原因で、Ｅ．ｃｏｌｉなどの生物体において酸素制限または嫌気的条件下で非常に低い活性を本来示す。酸素制限条件下でＥ．ｃｏｌｉにおいてピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を得るための例示的な方法は、天然プロモーターと嫌気的誘導型プロモーターの交換（Ｚｈｏｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、３０巻、２号、３３５〜３４２頁（２００８年））、ＮＡＤＨ感度を軽減するためのｌｐｄＡへの点突然変異の導入（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９０巻、１１号、３８５１〜３８５８頁（２００８年）、またはリプレッサー、ｐｄｈＲの不活性化（ＱｕａｉｌおよびＧｕｅｓｔ、Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１５巻、３号、５１９〜５２９頁（１９９５年））を含む。正味のピルビン酸デヒドロゲナーゼ様活性は、あるいはピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼから得ることができる。そうするために、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）酵素を使用して、フェレドキシンタンパク質を同時に還元しながらピルビン酸をアセチルＣｏＡに転換する。還元フェレドキシンは、次いでＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／フェレドキシンオキシドレダクターゼによってその電子をＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋に移す。異種および天然ＰＦＯＲ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて水素生成を改善することが近年実証されている（ＡｋｈｔａｒおよびＪｏｎｅｓ、Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．１１巻、１３９〜１４７頁（２００９年）；Ｄｏら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５３巻、２１〜３３頁（２００９年））。
最後に、ＰＥＰカルボキシキナーゼがＡＴＰ形成、オキサロ酢酸へのＣＯ２固定方向において作用することができると想定して、この分析を繰り返した。Ｅ．ｃｏｌｉなどの生物体中では、ホスホエノールピルビン酸からオキサロ酢酸への代謝の流れは、ＰＥＰカルボキシラーゼ、ＡＴＰ当量を生成しない酵素によって実施される。しかしながら、ＣＯ２固定ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性は、適切な条件下で天然ＰＥＰカルボキシキナーゼを過剰発現させること（Ｄｅｏｋら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６巻、９号、１４４８〜１４５２頁（２００６年））、またはより好ましい力学的特性を有するＰＥＰカルボキシキナーゼ酵素をコードする外来遺伝子を発現させることによって、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて高めることができる。観察されるＰＥＰカルボキシキナーゼ活性は、減弱したＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有する宿主生物体中でさらに優勢である可能性がある（Ｋｉｍら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０巻、２号、１２３８〜１２４１頁（２００４年））。ＰＥＰカルボキシキナーゼがオキサロ酢酸への有意で実質的な流れを有し得るという想定によって、イソクエン酸リアーゼおよびリンゴ酸シンターゼ活性に関する絶対条件を除外して、全ての場合においてＭＡＡの最大収率を得る。さらに、ピルビン酸デヒドロゲナーゼに関する要件も、野生型およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼ陰性バックグラウンドで除外する。それにもかかわらず、ＭＡＡ生成用に選択した宿主生物体へのＰＥＰカルボキシキナーゼ活性の工学的操作は、０．４７ｍｏｌ／ｍｏｌから１．７１ｍｏｌ／ｍｏｌにＭＡＡ経路の最大ＡＴＰ収率を改善するその役割のため有用であり得る。
この実施例は、３−ヒドロキシイソブチレートまたはＭＡＡ生成微生物体に導入して生成物収率を増大することができる、追加的改変を記載する。
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 本出願を通じて、様々な刊行物に言及してきた。これらの刊行物の開示は、本出願において本発明が属する現況技術をより完全に記載するために、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。前に示した実施例を参照しながら本発明を記載してきたが、本発明の精神から逸脱せずに、様々な改変を加えることができることは理解されたい。

Claims (1)

  1. 本願明細書に記載された発明。
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