JP2011219488A - 選択可能な特性を有するハイブリッドポリペプチド - Google Patents

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Abstract

【課題】 糖尿病および糖尿病関連状態のような、血糖値、インスリン値、および／またはインスリン分泌によって軽減できる代謝疾患および障害の治療および予防のための剤を提供する。
【解決手段】
少なくとも１つのさらなる生理活性ペプチドホルモンモジュールに共有結合した第１の生理活性ペプチドホルモンモジュールを含むハイブリッドポリペプチドであって、該生理活性ペプチドホルモンモジュールは構成ペプチドホルモンなどから選択され、該構成ペプチドホルモンはアミリンなどから選択され、該生理活性ペプチドホルモンモジュールのうちの少なくとも１つは、構成ペプチドホルモンの少なくとも１つのホルモン活性を呈する。
【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、その全文において、本明細書中に引用によって援用される２００４年２月１１日に出願された米国仮特許出願60/543,407に対して優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、ペプチド化学、特に、選択可能な特性を有するハイブリッドポリペプチドに関する。
発明の背景
インスリン値および血糖値の制御は、多くの代謝性疾患および障害の中核を成す。インスリン分泌は、部分的に、腸内分泌細胞によって生成されるインクレチンと呼ばれる分泌促進ホルモンによって変調される。インクレチンホルモン、グルカゴン-様ペプチド-1 (「GLP-1」)は、多くの研究において、インスリン分泌に対して促進作用を生成すると分かっている腸細胞によって分泌されるペプチドホルモンである。GLP-1は、腸内でプログルカゴンから処理され、栄養素によって誘導されたインスリン放出を促進する(Krcymann B., et al., Lancet, 2:1300-1303 (1987))。GLP-1の種々の切断型は、インスリン分泌 (インスリン分泌促進作用)およびcAMP形成を刺激することが分かっている [例えば、Mojsov, S., Int. J. Pep. Pro. Res., 40:333-343 (1992)参照]。種々のインビトロ実験およびGLP-1、GLP-1(7-36)アミド、およびGLP-1(7-37)酸の外生投与に対する哺乳類、特にヒトインスリン分泌促進応答の間の関係が確立されている(例えば、Nauck, M. A., et al., Diabetologia, 36:741-744 (1993); Gutniak, M., et al., New Eng. J. of Med., 326(20):1316-1322 (1992); Nauck, M. A., et al., J. Clin. Invest., 91:301-307 (1993); and Thorens, B., et al., Diabetes, 42:1219-1225 (1993)参照)。
インスリン感受性を刺激することによって、および生理的濃度にて、グルコース誘発のインスリン放出を促進することによって、GLP-1(7-36)アミドは、インスリン依存性糖尿病において、顕著な抗糖尿病活発性効果を発揮する(Gutniak M., et al., New Eng. J. Med., 326:1316-1322 (1992))。非インスリン依存性糖尿病に投与されると、GLP-1(7-36)アミドは、インスリン放出を促進し、グルカゴン分泌を低下し、胃内容排出を阻害し、グルコース利用を促進する(Nauck, 1993; Gutniak, 1992; Nauck, 1993)。しかしながら、糖尿病の長期治療に対するGLP-1型分子の使用は、そのようなペプチドの血中半減期が非常に短いため、複雑である。
特に、GLP-1は、プログルカゴン、160-アミノ酸プロホルモンから由来した30-アミノ酸ペプチドである。膵臓および腸中の異なるプロホルモン転換酵素の作用は、グルカゴンおよび他の不明瞭なペプチドを生成するが、プログルカゴンの開裂は、GLP-1およびGLP-2ならびに２つの他のペプチドを生成する。GLP-1のアミノ酸配列は、現在まで研究された全哺乳類において100%相同的であり、これは、重大な生理的役割を暗示する。GLP-1 (7-37)酸は、C-末端が切断され、アミド化されて、GLP-1 (7-36) NH2を形成する。遊離酸GLP-1 (7-37) OH、およびアミド、GLP-1 (7-36) NH2の生物学的効果および代謝回転は、区別がつかない。慣例により、アミノ酸の番号付けは、プログルカゴンからの処理されたGLP-1 (1-37) OHに基づく。生物学的に活性なGLP-1は、さらなる処理の結果である: GLP-1 (7-36) NH2。従って、GLP-1 (7-37) OHまたはGLP-1 (7-36)NH2の第１のアミノ酸は、7Hisである。
胃腸管において、GLP-1は、ルーメン内グルコースによる刺激に応答して、腸粘膜、結腸粘膜および直腸粘膜のL-細胞によって生成される。活性GLP-1の血中濃度半減期は５分以内であり、その代謝クリアランス速度は、１２ないし１３分辺りである(Holst, 1994)。GLP-1の代謝に関与する主要プロテアーゼは、ジペプチジルペプチダー ゼ (DPP) IV (CD26)であり、これは、N-末端 His-Ala ジペプチドを開裂し、従って、代謝産物、GLP-1受容体の不活性な、弱いアゴニストまたはアンタゴニストとして様々に記載されたGLP-1 (9-37) OHまたはGLP-1 (9-36) NH2を生成する。GLP-1受容体(GLP-1R)は、463のアミノ酸のG蛋白質結合受容体であり、膵臓ベータ細胞において、肺においておよびそれほどではないにせよ脳、脂肪組織および腎臓において局所化される。GLP-1 (7-37) OHまたはGLP-1 (7-36)NH2によるGLP-1Rの刺激は、アデニル酸シクラーゼ活性、cAMP合成、膜の脱分極、細胞内カルシウムの上昇およびグルコース誘発のインスリン分泌の増加を生じる(Holz et al., 1995)。
GLP-1は、食物摂取量に応答して、腸粘膜から分泌される強力なインスリン分泌促進剤である。GLP-1の重大なインクレチン効果は、GLP-1Rノックアウトマウスがグルコース不耐性であるという事実によって強調される。i.v.注射したGLP-1のインクレチン応答は、糖尿病患者において維持されるが、これらの患者における経口グルコースへのインクレチン応答は損なわれる。注射またはsc注射によるGLP-1投与は、糖尿病患者において空腹時血糖値を調節し、インスリン分泌に対するグルコース閾値を維持する(Gutniak et al., 1992; Nauck et al., 1986; Nauck et al., 1993)。GLP-1は、生理学的様式において、スルホニル尿素薬物と関連した低血糖症を避けつつ、インスリン分泌を増加させることが可能な治療剤として非常に大きな可能性を示している。
グルコース恒常性に対するGLP-1の他の重要な効果は、グルカゴン分泌の抑制および胃運動性の阻害である。グルカゴンの膵臓アルファ細胞分泌に対するGLP-1阻害作用は、糖新生および糖原分解の減少を介した肝臓におけるグルコース生成の減少を招く。このGLP-1の抗グルカゴン効果は、糖尿病患者において保存される。
胃運動性および胃液分泌が阻害される、いわゆるGLP-1の回腸ブレーキ（ileal brake）効果は、迷走神経遠心性受容体を介してまたは腸平滑筋に対する直接的な作用によって達成される。GLP-1による胃酸分泌の減少は、栄養素利用性における遅滞期に寄与し、従って、迅速なインスリン応答への必要性を取り除く。要約すると、GLP-1の胃腸影響は、グルコースおよび脂肪酸吸収の遅延に有意に寄与し、インスリン分泌およびグルコース恒常性を変調する。
また、GLP-1は、GLUT-1輸送体、(インスリン遺伝子プロモーターとのPDX-1の相互作用を介する)インスリン、およびヘキソキナーゼ-1のようなベータ細胞特異的遺伝子を誘導することが分かっている。従って、GLP-1は、齧歯類実験によって示されるように、年齢と通常関連しているグルコース不耐性を、潜在的に逆転することができるであろう。加えて、GLP-1は、ベータ細胞欠乏の状態の間、ベータ細胞機能を修復するのに加えて、ベータ細胞新生に寄与し、ベータ細胞質量を増加し得る。
GLP-1の中心的効果は、視床下部GLP-1Rの作用を介して達成される食物摂取量の減少と連結した満腹の増加を含む。II型糖尿病患者におけるGLP-1の４８時間連続SC注射は、空腹および食物摂取量を減少し、満腹を増加させた。これらの食欲抑制作用は、GLP-1Rノックアウトマウスにおいて存在しなかった。
エキセンディンは、インスリン分泌に関係のあるペプチドのもう１つのファミリーである。エキセンディンは、アリゾナ州に固有のトカゲであるアメリカドクトカゲ（Gila-monster）およびメキシコドクトカゲ（Mexican Beaded Lizard）の唾液中に発見される。エキセンディン-3は、メキシコドクトカゲ（Heloderma horridum）の唾液中に存在し、エキセンディン-4は、アメリカドクトカゲ（Heloderma suspectum）の唾液中に存在する(Eng, J., et al., J. Biol. Chem., 265:20259-62, 1990; Eng., J., et al., J. Biol. Chem., 267:7402-05 (1992))。エキセンディンは、グルカゴン-様ペプチドファミリーのいくつかの員といくつかの配列相同性を有し、最も高い相同性は、GLP-1に対する53%である(Goke, et al., J. Biol. Chem., 268:19650-55 (1993))。
エキセンディン-4は、モルモット膵臓からの分散された腺房細胞にて、および胃からの壁細胞にて、インスリン-分泌TC1細胞上のGLP-1受容体を結合し;また、ペプチドは、単離された胃において、ソマトスタチン放出を促進し、ガストリン放出を阻害する(Goke, et al., J. Biol. Chem., 268:19650-55 (1993); Schepp, et al., Eur. J. Pharmacol., 69:183-91 (1994); Eissele, et al., Life Sci., 55:629-34 (1994))。エキセンディン-3およびエキセンディン-4は、膵腺房細胞上のGLP-1を結合し、膵腺房細胞におけるcAMP生成、および膵腺房細胞からのアミラーゼ遊離を促進することが分かった(Malhotra, R., et al., Relulatory Peptides, 41:149-56 (1992); Raufman, et al., J. Biol. Chem., 267:21432-37 (1992); Singh, et al., Regul. Pept., 53:47-59 (1994))。糖尿病の治療および高血糖の予防のためのエキセンディン-3およびエキセンディン-4のインスリン分泌促進活性の使用が提案されている(Eng, U.S. Pat. No. 5,424,286)。
エキセンディン[9-39]のような切断されたエキセンディンペプチド、カルボキシアミド化された分子、および9-39を通る断片3-39は、GLP-1の強力かつ選択性アンタゴニストであると報告されている(Goke, et al., J. Biol. Chem., 268:19650-55 (1993); Raufman, J. P., et al., J. Biol. Chem., 266:2897-902 (1991); Schepp, W., et al., Eur. J. Pharm., 269:183-91 (1994); Montrose-Rafizadeh, et al., Diabetes, 45(Suppl. 2):152A (1996))。エキセンディン[9-39]は、インビボで、内生GLP-1を遮断し、これは、インスリン分泌を減少させる(Wang, et al., J. Clin. Invest., 95:417-21 (1995); D'Alessio, et al., J. Clin. Invest., 97:133-38 (1996))。明らかにGLP-1のインスリン分泌促進効果に関与する受容体は、ラット膵島細胞からクローン化している(Thorens, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8641-8645 (1992))。エキセンディンおよびエキセンディン[9-39]は、該クローン化されたGLP-1受容体に結合する(ラット膵臓細胞GLP-1受容体: Fehmann HC, et al., Peptides, 15 (3): 453-6 (1994); ヒトGLP-1受容体: Thorens B, et al., Diabetes, 42 (11): 1678-82 (1993))。クローン化されたGLP-1受容体によって形質移入された細胞において、エキセンディン-4はアゴニストである、つまり、それはcAMPを増加させるが、エキセンディン[9-39]はアンタゴニストである、つまり、それはエキセンディン-4およびGLP-1の促進作用を遮断する。Id.
より具体的には、エキセンディン-4は、GLP-1 ペプチド配列に対して53%のアミノ酸配列相同性を有する、アメリカドクトカゲ（Gila Monster (Heloderma horridum)）の唾液中に発見される39のアミノ酸 C-末端アミド化ペプチドである。例えば、Eng, J., et al. 「Isolation and Characterization of エキセンディン-4, and エキセンディン-3 Analogue from Heloderma suspectum Venom」、 J. Bio. Chem., 267:11, p. 7402-7405 (1992), Young, A. A., et al., 「Glucose-Lowering and Insulin-Sensitizing Actions of エキセンディン-4」、 Diabetes, Vol. 48, p. 1026-1034, May, 1999を参照。その活性に関して、エキセンディン-4は、GLP-1受容体に対して非常に特異的なアゴニストであり、GLP-1のように、インスリン分泌を促進することができる。従って、GLP-1のように、エキセンディン-4は、インスリン分泌促進ペプチドと見なされる。
しかしながら、GLP-1とは違って、エキセンディン-4は、インビボでGLP-1配列を急速に分解する該ジペプチジルペプチダーゼIVに対するその耐性のため、ヒトにおいて、比較的半減期が長い。さらに、GLP-1と比較して、エキセンディン-4はインスリン分泌を促すより強力な能力を有し、より低い濃度のエキセンディン-4を使用して、そのような促進活性を得ることができることが示されている。例えば、引用によって本明細書中に援用されるU.S. Pat. No. 5,424,286を参照。従って、エキセンディン-4ペプチドまたはその（例えば、そのような誘導体の、例えば、引用によって本明細書中に援用されるU.S. Pat. No. 6,528,486、およびその対応する国際公報WO 01/04156を参照）誘導体は、インスリンまたはGLP-1のいずれかよりも、インスリンレベルの異常調節を含む状態（例えば、糖尿病のような状態）の治療に対してより大きな可能性のある利用性を有する。
代謝性疾患および障害に関係のあるペプチドホルモンのもう１つのファミリーは、アミリン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、アドレノメデュリン、および(「AFP-6」としても知られる)インテルメジンを含むペプチドホルモンの該アミリンファミリーである。アミリンは、37-アミノ酸蛋白質ホルモンである。それは、単離、精製され、ヒト２型糖尿病の該膵島におけるアミロイド沈着の主要な成分として、化学的に特徴付けられた(Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:8628-8632 (1987))。該アミリン分子は、２つの翻訳後修飾を有する:該C-末端はアミド化され、位置2および7のシステインは交差結合して、N-末端ループを形成する。ヒトアミリン遺伝子のオープンリーディングフレームの配列は、Lysに対するN-末端コドンの前のLys-Arg 二塩基性アミノ酸蛋白分解的切断シグナルの存在、およびCLAIMS-末端位置でのys-Arg 蛋白分解シグナルの前のGly、蛋白質アミド化酵素、PAMによるアミド化に対する典型的な配列を示す(Cooper et al., Biochem. Biophys. Acta, 1014:247-258 (1989))。
アミリンは、胃内容排出を調節し、グルカゴン分泌および食物摂取を抑制し、従って、循環血液中のグルコース出現の割合を制御すると考えられる。それは、循環血液からのグルコース消滅の割合および末梢組織によるその摂取を制御するインスリンの作用を補足すると思われる。これらの作用は、アミリンが、その全てがグルコース出現の割合に影響を及ぼす少なくとも３つの独立したメカニズムによる食後のグルコース制御におけるインスリンの効果を補足することを示す、齧歯類およびヒトにおける実験結果によって支持される。まず、アミリンは食後のグルカゴン分泌を抑制する。健康な成人と比較して、１型糖尿病患者は、循環アミリンを全く有さず、２型糖尿病患者は、減少した食後のアミリン濃度を有する。さらに、循環アミリンを結合したアミリン特異的モノクローナル抗体の注入の結果、再び、対照に対して非常に上昇したグルカゴン濃度が得られた。これらの結果の両方は、食後のグルカゴン分泌の制御における内生アミリンの生理的役割を暗示する。第２に、アミリンは、胃腸運動および胃内容排出を遅らせる。最後に、ラットアミリンの視床下部内注射は、ラットの給餌を減少させ、視床下部の神経伝達物質代謝を改変することが示された。特定の研究において、食物摂取量は、ラットアミリンおよびラットCGRPの視床下部内注射後８時間までの間、有意に減少した。ヒト臨床試験において、アミリンアナログ、プラムリンチド（pramlintide）は、体重または体重の増加を減らすことが示されている。アミリンは、糖尿病および肥満のような代謝状態を治療するのに有益であり得る。また、アミリンを使用して、疼痛、骨障害、胃炎を治療、脂質、特にトリグリセリドを変調、あるいは脂肪の選択的喪失および脂肪のほとんどない組織の貧弱性のような身体組成に影響を及ぼし得る。
ホルモンカルシトニン (CT)は、誘発された高カルシウム血症およびその迅速なカルシウム低下効果に応答したその分泌に由来した。それは、ずっとC細胞と呼ばれている甲状腺中の神経内分泌細胞において生成され、それから分泌される。CT(1-32)の最も研究された作用は、破骨細胞に対するその効果である。CTのインビトロ効果は、ひだ付縁の迅速な喪失およびリソソーム酵素の減少した放出を含む。最終的に、CTによる破骨細胞機能の阻害は、骨吸収の減少を招く。しかしながら、甲状腺摘出術の場合の血清CTの慢性的減少または甲状腺髄様癌で発見される増加した血清CTのいずれも、血清カルシウムまたは骨量の変化と関連しているようには思われない。従って、CT(1-32)の主要な機能は、恐らく、緊急事態に急性高カルシウム血症と戦い、および／または、成長、妊娠、および授乳のような「カルシウムストレス」の期間に骨格を保護することである(Becker, JCEM, 89(4): 1512-1525 (2004) and Sexton, Current Medicinal Chemistry 6: 1067-1093 (1999)において概説された)。これは、カルシトニンおよびCGRP-Iペプチドの両方を除去するカルシトニン遺伝子ノックアウトマウスからの最近のデータと一致し、そのデータは、該マウスが基礎カルシウム関連値の正常レベルを有するが、増加したカルシウム血症の応答を有したことを示した(Kurihara H, et al., Hypertens Res. 2003 Feb; 26 Suppl:S105-8)。
CTは血漿カルシウムレベルに対する効果を有し、破骨細胞機能を阻害し、骨粗鬆症の治療に広く使用される。治療的に、サケCT (sCT)は、骨密度を増加し、最小限の副作用で、骨折の割合を減少すると思われる。また、CTは、骨格の１以上の領域で肥大したまたは変形した骨を生じ得る慢性骨障害である骨のパジェット病のための治療として、過去25年にわたり、首尾良く使用されている。また、この効果に対するメカニズムは明白には理解されていないが、CTは、骨粗鬆症の間に経験される骨痛に対するその鎮痛効果にも広く使用される。
カルシトニン遺伝子関連ペプチド (CGRP)は、その受容体が神経系および心血管系を含む体内に広く分配された神経ペプチドである。このペプチドは、知覚神経伝達を変調すると思われ、現在までに発見された最も強力な内生血管拡張性ペプチドの１つである。CGRPに対して報告された生物学的効果は:炎症における物質Pの変調、神経筋接合部のニコチン性受容体作用、膵酵素分泌の促進、胃酸分泌の減少、末梢血管拡張、心促進、神経調節、カルシウム代謝の制御、骨形成刺激、インスリン分泌、体温の上昇および食物摂取量の減少を含む。(Wimalawansa, Amylin, calcitonin gene-related peptide, calcitonin and ADM: a peptide superfamily. Crit Rev Neurobiol. 1997; 11(2-3):167-239)。CGRPの重要な役割は、α-CGRPの静脈内投与後の平均動脈圧の低下によって実証されるように、その強力な血管拡張作用によって、種々の臓器への血流を制御することである。また、血管拡張作用は、末梢交感神経作用の増加によって引き起こされた末梢血管耐性の上昇および高血圧を示した、ホモ接合性ノックアウトCGRPマウスの最近の分析によって支持される(Kurihara H, et al., Targeted disruption of ADM and αCGRP genes reveals their distinct biological roles. Hypertens Res. 2003 Feb; 26 Suppl:S105-8)。従って、CGRPは、他の作用のなかでも、血管拡張作用、血圧低下作用および心拍数の増加を引き出すと思われる。
鬱血性心不全患者へのCGRPの長期間注入は、副作用なしで、血行力学機能に対する持続性の有益な効果を示しており、これは心不全での使用を示唆する。CGRP使用の他の適応症は、腎不全、急性および慢性冠動脈虚血、心不整脈の治療、レイノー症候群、くも膜下出血、高血圧、および肺高血圧のような他の末梢血管疾患を含む。また、妊娠の子癇前中毒症および早期陣痛は、潜在的に治療可能である(Wimalawansa, 1997)。最近の治療的使用は、偏頭痛に対するCGRPアンタゴニストの使用を含む。
アドレノメデュリン(ADM)は、ペプチドを含有しないよりも、ペプチドを含有するはるかに多くの組織によって、ほとんど偏在的に発現される。ADMの公開された概説(Hinson, J.P. et al., Endocrine Reviews (2000) 21(2): 138-167)は、血管拡張、細胞成長、ホルモン分泌の制御、およびナトリウム利尿を含む生物学的作用の範囲をもって、心血管系、細胞成長、中枢神経系および内分泌系に対するその効果を詳述する。ラット、ネコ、ヒツジ、およびヒトの研究は、ADMの静脈内注射によって、強力かつ持続性低血圧が得られ、それがCGRPのものに相当することを裏付ける。しかしながら、麻酔をかけたラットにおける平均動脈圧に対するADMの血圧低下作用は、CGRP アンタゴニスト CGRP8-37によって阻害されず、これは、この作用が、CGRP受容体を介して媒介されないことを示唆する。麻酔をかけた、意識のあるあるいは高血圧のラットにおけるヒトADMの急性または慢性投与は、心拍数, 心拍出量および1回拍出量の同時上昇と、血圧の低下を伴う全末梢血管抵抗の有意な減少を生じる。
また、ADMは、胚形成および分化における重要なファクターとしておよびラット内皮細胞に対するアポトーシス生存ファクターとして提案されている。これは、ADM遺伝子の喪失に対してホモ接合性のマウスが、胚形成の間、欠陥のある血管形成を示し、従って、妊娠中期で死亡した、最近のマウスADMノックアウト研究によって支持される。ADM+/-ヘテロ接合性マウスは、組織損傷への感受性と共に、高血圧を有したと報告された(Kurihara H, et al., Hypertens Res. 2003 Feb; 26 Suppl:S105-8)。
ADMは、下垂体、副腎、生殖器および膵臓のような内分泌器官に影響を及ぼす。ペプチドは、下垂体からのACTH放出を阻害するのに役割を有すると思われる。副腎においては、それは、ラットおよびヒトの両方における副腎皮質の分泌活性に影響を及ぼすと思われ、それは、無傷のラットにおいて副腎血管床における血管拡張剤として作用して、副腎の血流を増加させる。ADMは、女性の生殖器官を通して存在すると示されており、血漿レベルは正常な妊娠において上昇する。子癇前症のラットモデルの研究は、ADMが高血圧を逆転し、妊娠後期の間、ラットに投与すると、子の死亡率を減少させることが可能であることを示す。それは、子癇前症モデルにおいて、妊娠初期の動物または妊娠していないラットにおいて同様の効果を有さなかったため、これは、ADMが子宮胎盤の心血管系において重要な調節的な役割を演じ得ることを示唆する。膵臓においては、ADMは、経口グルコース誘発へのインスリン応答を弱毒化し遅延させるため、恐らく、阻害的役割を演じて、その結果、グルコース値を最初に上昇させる。また、ADMは腎機能に影響を及ぼし得る。末梢血管から投与されたボーラスは、有意に、平均動脈圧を低下させ、腎血流量、糸球体ろ過および尿流量を上昇させることができる。また、いくつかのケースにおいて、Na+排出の増加が存在する。
また、ADMは、骨に対しておよび肺に対して、他の末梢効果を有する。骨に関して、研究は、心血管系および体液の恒常性を超える役割を支持しており、ADMが、胎仔および成体の齧歯類骨芽細胞に対して作用して、成長因子βを形質転換するような既知の骨芽細胞成長因子のものに相当する細胞成長を増加させることを示している。これは、骨粗鬆症リサーチにおける主要な課題の１つが、骨芽細胞刺激を介して骨量を増加する療法を開発することであるため、臨床的に重要である。肺においては、ADMは、肺の血管拡張を引き起こすだけでなく、ヒスタミンまたはアセチルコリンによって誘発される気管支収縮も阻害する。ラットモデルにおいてエアロゾル化したADMを用いて肺高血圧を治療する最近の研究は、平均動脈圧および全肺血管抵抗が、生理食塩水を与えられたラットよりもADMで治療されたラットにおいて著しく低かったという事実によって確証されるように、この状態の吸入治療が有効であることを示す。この結果は、全身動脈圧または心拍数の改変なしに達成された(Nagaya N et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003;285:H2125-31)。
健康なボランティアにおいて、ADMのi.v.注射は、動脈圧を減少させ、心拍数、心拍出量、cAMPの血漿レベル、プロラクチン、ノルエピネフリンおよびレンニンを刺激すると示されている。これらの患者において、尿量またはナトリウム排出の増加はほとんどまたは全く観察されなかった。心不全または慢性腎不全患者において、i.v. ADMは、正常な対象において見られるものと同様の作用を有し、また、投与された用量によって、利尿およびナトリウム利尿を誘発した(Nicholls, MG et al. Peptides. 2001; 22:1745-1752)。また、実験的ADM治療は、動脈および肺高血圧、敗血症ショックおよび虚血／再灌流損傷において有益であると示されている(Beltowski J., Pol J Pharmacol. 2004;56:5-27)。ADM治療に対する他の適応症は: 末梢血管疾患、くも膜下出血、高血圧、妊娠の子癇前中毒症および早産、および骨粗鬆症を含む。
AFP-6 (つまり、インテルメジン)の発現は、主に、下垂体および胃腸管にある。AFP-6に対する特異的な受容体は報告されていないが、結合研究は、AFP-6が、アミリンファミリーの既知の受容体の全てに結合することを示す。AFP-6は、SK-N-MCおよび内生CGRP受容体を発現するL6細胞においてcAMP生産を増加することを示しており、これらの細胞においてその受容体への結合に対して標識されたCGRPと競合する。公開されたインビボ研究において、AFP-6投与は、恐らく該CRLR/RAMP受容体との相互作用を介して、正常なおよび自然発生高血圧ラットの両方において血圧の低下を招いた。マウスにおけるインビボ投与は、胃内容排出および食物摂取の抑制を招いた。(Roh et al. J Biol Chem. 2004 Feb 20;279(8):7264-74.)
アミリンファミリーペプチドホルモンの生物学的活性は、一般的に、２つの類縁タイプII G蛋白質結合受容体(GPCR)、カルシトニン受容体(CTR)およびカルシトニン受容体様受容体(CRLR)への結合を介して媒介されることが報告されている。クローン化および機能的研究は、CGRP、ADM、およびアミリンが、CTRまたはCRLRおよび受容体活性修飾蛋白質(RAMP)の異なる組合せと相互作用することを示している。多くの細胞は、複数のRAMPを発現する。RAMPおよびCTRまたはCRLRのいずれかの同時発現は、カルシトニン、CGRP、ADM、およびアミリンに対する機能的受容体を生じる必要があると考えられる。該RAMPファミリーは、３つのメンバー(RAMP1、-2、および-3)を含み、これらは、30%未満の配列同一性を共有するが、共通のトポロジー組織を有する。CRLRおよびRAMP1の同時発現は、CGRPに対する受容体の形成を導く。CRLRおよびRAMP2の同時発現は、ADMに対する受容体の形成を招く。CRLRおよびRAMP3の同時発現は、ADMおよびCGRPに対する受容体の形成を招く。hCTR2およびRAMP1の同時発現は、アミリンおよびCGRPに対する受容体の形成に繋がる。hCTR2およびRAMP3の同時発現は、アミリンに対する受容体の形成に繋がる。
代謝性疾患および障害に関係があるとされるさらなるもう１つのペプチドホルモンファミリーは、レプチンファミリーである。循環レプチンの成熟した形態は、通常、血液脳関門(BBB)および血液脳脊髄液関門によって、CNSから排除される146-アミノ酸蛋白質である。例えば、Weigle et al., 1995. J Clin Invest 96 : 2065-2070参照。レプチンは、食物摂取量および体重を制御する負のフィードバックループにおける求心シグナルである。該レプチン受容体は、サイトカイン受容体ファミリーのメンバーである。レプチンの食欲減退効果は、蛋白質-蛋白質相互作用に対するいくつかのモチーフを含む長い細胞質内ドメインをコードするこの受容体のOb-Rbアイソフォームのホモ二量体への結合に依存する。Ob-Rbは、視床下部において高度に発現され、これは、この脳領域が、レプチン作用の重要な部位であることを示唆する。該マウスob遺伝子の突然変異は、雄および雌のホモ接合性 ob/ob 肥満のマウスの両方において：肥満、体脂肪沈着の増加、高血糖、高インスリン血、低体温症、および甲状腺障害および生殖機能を含む病態生理を呈する症候群を生じることが示されている(例えば、Ingalis, et al., 1950. J Hered 41 : 317-318参照）。レプチンまたはレプチン受容体に対する治療的使用は、(i)糖尿病 (例えば、PCT Patent Applications W0 98/55139、W0 98/12224、およびW0 97/02004参照); (ii) 造血 (例えば、PCT Patent Applications W0 97/27286およびW0 98/18486参照); (iii) 不妊症 (例えば、PCT Patent Applications W0 97/15322およびW0 98/36763参照); および (iv) 腫瘍抑制(例えば、PCT Patent Applications W0 98/48831参照)を含み、それらの各々は、その全文において、引用によって本明細書中に援用される。
レプチン受容体 (OB-R) 遺伝子は、クローン化され (GenBank Accession No. AF098792)、db 遺伝子座に位置付けられている(例えば、Tartaglia, et al., 1995. Cell 83: 1263-1271参照)。代替スプライシングから生じるOB-Rのいくつかの転写体も同定されている。OB-Rの欠陥は、ob/ob マウスと表現型が同一である突然変異糖尿病ob/ob マウスにおいて、症候群を生み出す(例えば、Ghilardi, et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6231-6235参照)。しかしながら、ob/obマウスと比較して、C57BLKS/J-m ob/obマウスへの組換えレプチンの投与は、食物摂取量および体重を減少しない (例えば、Roberts and Greengerg, 1996. Nutrition Rev. 54: 41-49参照)。
組換えレプチン、レプチン断片および／またはレプチン受容体変異体の投与からの減量活性を報告することができるほとんどのレプチン関連研究は、該構築体を脳室に直接投与している。例えば、Weigle, et al., 1995. J Clin Invest 96 : 2065-2070; Barash, et al., 1996. Endocrinology 137: 3144-3147参照。
他の研究は、テスト対象への腹腔内(i.p.)投与を介するレプチンペプチドの投与による有意な減量活動を示している。Grasso et al., 1997. Endocrinology 138: 1413-1418参照。さらに、レプチン断片、特に完全長ヒトレプチンから採った残基を含む18 アミノ酸断片は、減量において機能すると報告されているが、それは移植されたカニューレを通したラットの側脳室への直接投与の際だけである。例えば、その全文において引用によって本明細書中に援用されるPCT Patent Applications W0 97/46585参照。
代謝性疾患および障害に関係があるとされるもう１つのペプチドホルモンは、コレシストキニン (CCK)である。CCKは、胆嚢収縮を刺激するという能力によって、腸の抽出物の調製からの1928において同定されたと報告されている。以後、膵臓分泌、胃内容排出の遅延、腸運動の促進およびインスリン分泌の促進を含むCCKの他の生物学的活性が報告されている。Lieverse et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 713: 268-272 (1994)参照。また、CCKの活性は、心臓血管機能、呼吸機能、神経毒性および発作、癌細胞増殖、鎮痛、睡眠、性行動および生殖行動、記憶、不安およびドーパミン媒介行動に対する効果を含むと報告されている。Crawley and Corwin, Peptides 15: 731-755 (1994).CCKの他の報告された効果は、膵臓の成長の促進、胆嚢収縮の促進、胃酸分泌の阻害、膵臓ポリペプチド放出および蠕動の収縮要素を含む。CCKのさらなる報告された効果は、血管拡張を含む。Walsh, 「Gastrointestinal Hormones」、 In Physiology of the Gastrointestinal Tract (3d ed. 1994; Raven Press, New York).
グルカゴン、CCKおよびボンベシンの組合せの注射は、個々の化合物によって観察された阻害を超える、欠乏されていないラットにおける練乳テスト食餌の摂取の阻害を強化した。Hinton et al., Brain Res. Bull. 17:615-619 (1986).また、グルカゴンおよびCCKは、ラットにおける見せかけ飼養を相乗的に阻害すると報告されている。LeSauter and Geary, Am. J. Physiol. 253:R217-225 (1987); Smith and Gibbs, Annals N.Y. Acad. Sci. 713:236-241 (1994).また、エストラジオールおよびCCKは満腹に対して相乗効果を有し得ると示唆されている。Dulawa et al., Peptides 15:913-918 (1994); Smith and Gibbs, supra.また、小腸から生じるシグナルは、その中の栄養素に応答して、CCKと相乗的に相互作用して、食物摂取量を減少し得ることが提案されている。Cox, Behav. Brain Res. 38:35-44 (1990).加えて、CCKは、いくつかの種において満腹を誘導すると報告されている。例えば、給食低下は、ラットにおいては腹腔内に、ブタにおいては動脈内に、ネコおよびブタにおいては静脈内に、サル、ラット、イヌおよびヒツジにおいては脳室に、および肥満および肥満でないヒトにおいては静脈内に注射されたCCKによって引き起こされたと報告されている。Lieverse et al., supra参照。いくつかの研究所からの研究は、報告によると、サルおよびラットの両方における非食物補強剤に応答する食物への応答を比較することによっておよびCCKが食物消化後に通常観察される行動の順序 (つまり、食後の満腹の順序)を導き出すことを示すことによって、食餌における阻害に対する低用量のCCKの行動特異性を確認している。加えて、CCK後の行動と単独またはCCKと組合せた食物消化後の行動の比較は、報告によると、CCKおよび食物消化の間の行動の類似性を明らかにしている。Crawley and Corwin, supra.また、生理学的血漿濃度におけるCCKが食物摂取を阻害し、痩せたおよび肥満のヒトの両方において、満腹感を増加させることが報告されている。Lieverse et al., supra参照。
CCKは、1966において、33-アミノ酸ペプチドとして特徴付けられた。Crawley and Corwin, supra. CCKのアミノ酸配列の種特異的分子変異体が同定されている。該33-アミノ酸配列および切断ペプチド、その8-アミノ酸 C-末端配列 (CCK-8)は、ブタ、ラット、トリ、チンチラ、イヌおよびヒトにおいて同定されたと報告されている。39-アミノ酸配列は、ブタ、イヌおよびモルモットにおいて発見されたと報告された。58-アミノ酸配列は、ネコ、イヌおよびヒトにおいて発見されていると報告された。カエルおよびカメは、CCKおよびガストリンの両方に相同的な47-アミノ酸配列を示すと報告される。非常に新鮮なヒトの腸は、CCK-83と呼ばれる少量のさらにより大きな分子を含有すると報告されている。報告によると、ラットにおいて、主要な中間体形態が同定されており、これはCCK-22と呼ばれる。Walsh, "Gastrointestinal Hormones", In Physiology of the Gastrointestinal Tract (3d ed. 1994; Raven Press, New York).硫酸化されてないCCK-8および(CCK-4 (CCK(30-33)と呼ばれる)テトラペプチドは、ラットの脳において報告されている。(CCK-4 (CCK(29-33)と呼ばれる) C-末端ペンタペプチドは、CCKの構造的相同性、また神経ペプチド、ガストリンとの相同性も保存する。C-末端硫酸化オクタペプチド配列、CCK-8は、種にわたり、比較的保存されると報告される。ラット甲状腺癌、ブタの脳、およびブタの腸からのプレプロコレシストキニンをコードするcDNAのクローン化および配列分析は、報告によると、CCKに対する前駆体をコードする345のヌクレオチドを明らかにしており、これは、115 アミノ酸であり、単離されたと既に報告されたCCK配列の全てを含有する。Crawley and Corwin, supra.
CCKは、中枢神経系を通しておよび上部小腸の内分泌細胞および腸神経において分配されると言われている。CCKアゴニストは、(CCK-33とも呼ばれる)CCKそのもの、CCK-8 (CCK(26-33))、硫酸化されていないCCK-8、ペンタガストリン (CCK-5またはCCK(29-33))、およびテトラペプチド、CCK-4 (CCK(30-33))を含む。膵臓CCK受容体にて、CCK-8は、報告によると、硫酸化されていないCCK-8またはCCK-4より1000-5000大きい有効性との結合を置き換え、CCK-8は、膵アミラーゼ分泌を刺激するのに、硫酸化されていないCCK-8またはCCK-4より約1000倍より強力であると報告されている。Crawley and Corwin, supra.大脳皮質からのホモジネートにおいて、CCK受容体結合は、硫酸化されていないCCK-8によっておよび等モル、硫酸化CCK-8より10倍または100倍大きい濃度にて、CCK-4によって置き換えられると考えられた。Id.
CCKに対する受容体は、報告によると、種々の組織において同定されており、２つの主要なサブタイプ：タイプA受容体およびタイプB受容体が記載されている。タイプA受容体は、膵臓、胆嚢、幽門括約筋および求心性迷走神経線維を含む末梢組織において、および該脳の別々の領域において報告されている。タイプA受容体サブタイプ(CCKA)は、硫酸化オクタペプチドに対して選択性であると報告されている。タイプB受容体サブタイプ(CCKB)は、脳を通しておよび胃の中で同定されており、報告によると、硫酸化または全８つのアミノ酸を必要としない。Reidelberger, J. Nutr. 124 (8 Suppl.) 1327S-1333S (1994); Crawley and Corwin, supra参照。
代謝性疾患および障害に関係があるとされるペプチドホルモンのさらにもう１つのファミリーは、該膵臓ポリペプチドファミリー (「PPF」)である。膵臓ポリペプチド (「PP」)は、インスリン抽出物の汚染物質として発見され、機能的重要性よりもむしろその起源の臓器によって名付けられた(Kimmel et al., Endocrinology 83: 1323-30 (1968))。PPは、異なる構造モチーフを含有する36-アミノ酸ペプチドである。関連ペプチドは、続いて、腸の抽出物において発見され、N-およびC-末端チロシンのため、ペプチドYY (「PYY」)と名付けられた(Tatemoto, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2514-8 (1982))。第３の関連ペプチドは、後に、脳の抽出物において発見され、神経ペプチド Y (「NPY」)と名付けられた (Tatemoto, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5485-9 (1982); Tatemoto et al., Nature 296: 659-60 (1982))。
これらの３つの関連したペプチドは、種々の生物学的効果を与えると報告されている。PPの効果は、膵臓分泌の阻害および胆嚢の弛緩を含む。中枢に投与したPPは、視床下部および脳幹に局所化された受容体によって媒介され得る給食の僅かな増加を生成する(Gehlert, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 218: 7-22 (1998)において概説)。
PYYの放出は、食事後に起こる。PYYの代替の分子形態は、PYY(3-36) である(Eberlein et al., Peptides 10: 797-803 (1989); Grandt et al., Regul. Pept. 51: 151-9 (1994))。この断片は、ヒトおよびイヌの腸抽出物において総PYY様免疫反応の約40%および絶食状態において総血漿PYY免疫反応の約36%ないし食後僅かに50%を超えるまでを構成する。それは、明らかに、PYYのジペプチジルペプチダーゼ-IV (DPP4) 開裂産物である。PYY(3-36)は、報告によると、Y2およびY5受容体の選択性リガンドであり、これはN-末端切形された(つまり、C-末端断片) NPYアナログを好むことにおいて、薬理学的にユニークであるようである。報告によると、PYYの末梢投与は、胃酸分泌、胃運動性、膵臓外分泌(Yoshinaga et al., Am. J. Physiol. 263: G695-701 (1992); Guan et al., Endocrinology 128: 911-6 (1991); Pappas et al., Gastroenterology 91: 1386-9 (1986))、胆嚢収縮および腸運動(Savage et al., Gut 28: 166-70 (1987))を減らす。後脳/脳幹においてまたはその周辺で直接注射後に見受けられる胃内容排出、胃運動性および胃酸分泌に対するPYYの中枢注射の効果(Chen and Rogers, Am. J. Physiol. 269: R787-92 (1995); Chen et al., Regul. Pept. 61: 95-98 (1996); Yang and Tache, Am. J. Physiol. 268: G943-8 (1995); Chen et al., Neurogastroenterol. Motil. 9: 109-16 (1997))は、末梢注射後に観察される効果とは異なり得る。例えば、中枢に投与したPYYは、胃酸分泌が阻害されず促進されたという点において、末梢注射されたPYY(3-36)に対して本明細書中に記載されたものと反対の効果をいくつか有した。胃運動性は、単独で投与された時ではなくTRH促進と併せた時にのみ抑制されたが、全く、PP受容体との推定される相互作用を介して、より高い容量で刺激性であった。PYYは、中枢投与後に食物および水摂取量を促進することが分かっている (Morley et al., Brain Res. 341: 200-3 (1985); Corp et al., Am. J. Physiol. 259: R317-23 (1990))。
代謝疾患および障害は、多くの形態を呈し、それは、肥満、糖尿病、異常脂質血症、インスリン耐性、細胞アポトーシス等を含む。肥満およびその関連した障害は、米国および世界中で、一般的であり、非常に深刻な公衆衛生問題である。上半身肥満は、２型糖尿病に対して既知の最大のリスク要因であり、心疾患に対する大きなリスク要因である。肥満は、高血圧、アテローム性動脈硬化症、鬱血性心不全、脳梗塞、胆嚢疾患、変形性関節症、睡眠時無呼吸、多嚢胞性卵巣症候群、乳癌、前立腺癌、および結腸癌のような繁殖障害、および全身麻酔の合併症の増加した発生率に対する認識されたリスク要因である (例えば、Kopelman, Nature 404: 635-43 (2000)参照)。それは寿命を減らし、上記の共存症、ならびに感染症、静脈瘤、黒色表皮症、湿疹、運動不耐性、インスリン耐性、高血圧高コレステロール血症、胆石症、整形外科的損傷、および血栓塞栓症のような障害の深刻なリスクを抱える(Rissanen et al., Br. Med. J. 301: 835-7 (1990))。また、肥満は、インスリン耐性症候群、あるいは「シンドロームX」と呼ばれる状態の群に対するリスク要因である。肥満および関連疾患の医療費の最近の見積もりは、世界中で１５００億ドルである。肥満の原因は多因子性であると考えられるが、基本的な問題は、肥満の対象において、栄養素利用性およびエネルギーの消費が、過剰な脂肪組織が存在するまで均衡にならないことである。肥満は、現在、治療が困難で、慢性的で、本質的に処置しにくい代謝障害である。肥満の人の減量において有用な治療薬は、彼らの健康に対して、深い有益効果を有し得る。
糖尿病は、インスリンの不十分な生成および利用から生じる高血糖および糖尿によって特徴付けられる炭水化物代謝の障害である。糖尿病は、先進国における人口の大部分の生活の質に大きな影響を与える。インスリンの不十分な生成は、１型糖尿病として特徴付けられ、インスリンの不十分な利用は２型糖尿病である。しかしながら、患者が顕性糖尿病と診断されるかなり前に発病する多くの異なる糖尿病関連疾患が存在することが、現在、広く認識されている。また、糖尿病におけるグルコース代謝の最適下調節からの効果は、広範な関連した脂質および心血管疾患を生起させる。
異常脂質血症、または血漿中のリポ蛋白質の異常なレベルは、糖尿病のなかでも頻繁に起こる。異常脂質血症は、典型的には、血液中の上昇した血漿トリグリセリド、低HDL (高密度リポ蛋白質) コレステロール、正常ないし上昇したレベルのLDL (低密度リポ蛋白質) コレステロールおよび増加したレベルの低密度のLDL (低密度リポ蛋白質)粒子によって特徴付けられる。異常脂質血症は、糖尿病患者において、冠動脈事象および死の発生率の増加に対する主な誘因の１つである。疫学の研究は、糖尿病でない対象と比較した時に、糖尿病患者における冠動脈血栓による死の数倍の増加を示すことによって、これを確認している。いくつかのリポ蛋白質異常は、糖尿病患者において記載されている。
インスリン耐性は、広範囲の濃度にわたりその生物学的活性を発揮するインスリンの能力の減少である。インスリン耐性において、体は、異常に多量のインスリンを分泌して、この欠陥を相殺し、損なわれたグルコース耐性の状態が発達する。問題のあるインスリン活性を相殺することに失敗すると、血漿グルコース濃度は不可避的に上昇して、糖尿病の臨床状態を招く。インスリン耐性および相対的高インスリン血は、肥満、高血圧、アテローム性動脈硬化症および２型糖尿病において一因となる役割を有することが認識されている。肥満、高血圧および狭心症とのインスリン耐性の関連は、共通の病原性リンクとしてインスリン耐性を有する症候群、シンドロームXと記載されている。
アポトーシスは、正常な成長の間生じる外因性および内因性シグナルによって制御される細胞の自壊の活性プロセスである。アポトーシスが、腎臓内分泌ベータ細胞の制御において鍵となる役割を演じることは、文書で十分に立証されている。成熟した哺乳類において、ベータ細胞塊は、動力学変化に付されて、妊娠および肥満のような特定の状態において正常血糖を維持するために、インスリン生成を適合することは一層明らかになっている。ベータ細胞塊の制御は、細胞増殖、成長およびプログラムされた細胞死滅(アポトーシス)の間の微妙なバランスによる。このバランスの妨害は、グルコース恒常性の障害を招き得る。例えば、ベータ細胞複製率が減少する加齢と共に、グルコース不耐性が発達することは特記に値し、ヒト剖検研究は、繰り返し、糖尿病でない対象と比較して、非インスリン依存性糖尿病患者において、ベータ細胞塊の40-60%減少を示した。インスリン耐性は、肥満の一定の不随物であるが、正常血糖は、インスリンに対する増加した需要に見合うことが不可能になる、２型糖尿病が始まる時点まで、代償性高インスリン血によって維持されることで、一般的には意見が一致している。
糖尿病と関連した複数の異常の治療の試みは、異なる患者においてこれらの異常に取り組むために、いくつかの抗糖尿病医薬の投与を促している。抗糖尿病医薬の例は、インスリンおよびインスリンアナログのような蛋白質、およびインスリン増感剤のような小分子、インスリン分泌促進および食欲調節化合物である。
上記の代謝性疾患、状態、および障害に有用なポリペプチドを開発する必要性が存在する。従って、ハイブリッドポリペプチドおよびそれらを生成し使用するための方法を提供することが、本発明の目的である。
本明細書中に記載される全文献は、本明細書中に完全に記載されるかのごとく、本出願に、引用によって援用される。
本発明の概要
本発明は、一般的には、血糖値、インスリンレベル、および／またはインスリン分泌を調節することによって緩和できる、糖尿病および糖尿病関連状態のような代謝性疾患および障害の治療および予防のための剤として有用な新規、選択可能なハイブリッドポリペプチドに関する。そのような状態および障害は、高血圧、異常脂質血症、心疾患、摂食障害、インスリン耐性、肥満、および1型、2型、および妊娠性糖尿病を含むいずれかの種の糖尿病を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明の１つの態様において、少なくとも１つのホルモン活性を呈するハイブリッドポリペプチドが提供される。本発明のハイブリッドポリペプチドは、共有結合した少なくとも２つの生理活性ペプチドホルモンモジュールを含み、ここに、少なくとも１つの生理活性ペプチドホルモンモジュールは、構成ペプチドホルモンの少なくとも１つのホルモン活性を呈する。該生理活性ペプチドホルモンモジュールは、独立して: 構成ペプチドホルモン、構成ペプチドホルモンの少なくとも１つのホルモン活性を呈する構成ペプチドホルモンの断片、構成ペプチドホルモンの少なくとも１つのホルモン活性を呈する構成ペプチドホルモンのアナログおよび誘導体、構成ペプチドホルモンの少なくとも１つのホルモン活性を呈する構成ペプチドホルモンのアナログおよび誘導体の断片、およびペプチドエンハンサーから選択される。
本発明の構成ペプチドホルモンは：アミリン、アドレノメデュリン (ADM)、カルシトニン (CT)、カルシトニン遺伝子関連ペプチド (CGRP)、インテルメジン、コレシストキニン (「CCK」)、レプチン、ペプチドYY (PYY)、グルカゴン様ペプチド-1 (GLP-1)、グルカゴン様ペプチド2 (GLP-2)、オキシントモジュリン (OXM)、およびエキセンディン-4;を含む。
本発明のペプチドエンハンサーは：ハイブリッドポリペプチドに所望の化学安定性、立体配座の安定性、代謝安定性、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、または他の薬物動態特徴を付与する構成ペプチドホルモンの構造モチーフ、およびハイブリッドポリペプチドに所望の化学安定性、立体配座の安定性、代謝安定性、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、または他の薬物動態特徴を付与する構成ペプチドホルモンのアナログまたは誘導体の構造モチーフを含む。
本発明のもう１つの態様において、肥満を治療または予防するための方法が提供され、ここに該方法は、治療上または予防上有効量の本発明のハイブリッドポリペプチドを、その必要のある対象に投与することを特徴とする。好ましい具体例において、該対象は、肥満または太りすぎの対象である。「肥満」は、一般的には、30を超える肥満度指数と定義されるが、この開示の目的のために、体重を減らす必要があるまたはそれを望む30未満の肥満度指数のものを含むいずれの対象も「肥満」の範囲に含まれる。インスリン耐性、グルコース耐性である、あるいはいずれかの形態の糖尿病(例えば、１型、２型または妊娠性糖尿病)を有する対象は、この方法から利点を得ることができる。
本発明のさらにもう１つの態様において、食物摂取量を減らす、栄養素利用性を減らす、減量する、糖尿病または糖尿病関連の状態を治療する、および(LDLコレステロールおよびトリグリセリドレベルを減少させるおよび／またはHDLコレステロールレベルを変化させることを含む)脂質プロファイルを改善する方法が提供され、ここに該方法は、対象に、有効量の本発明のハイブリッドポリペプチドを投与することを特徴とする。好ましい具体例において、該対象に、治療上または予防上有効量の本発明のハイブリッドポリペプチドを投与することを特徴とする本発明の方法を使用して、その必要のある対象において栄養素利用性を減少させることによって軽減することができる状態または障害を治療または予防する。もう１つの具体例において、本発明の方法を使用して、血糖値、インスリンレベル、および／またはインスリン分泌を調節することによって軽減することができる状態または障害を治療または予防する。さらにもう１つの具体例において、本発明の方法を使用して、糖尿病および／または糖尿病関連状態を治療する。そのような状態および障害は、高血圧、異常脂質血症、心疾患、摂食障害、インスリン耐性、肥満、およびI型、II型、および妊娠性糖尿病を含むいずれかの種類の糖尿病、糖尿病合併症 ((例えば、エキセンディン-4の神経栄養作用に基づく)神経障害、(例えば、アミリン活性に基づく)神経障害性の疼痛、網膜症、腎症、(例えば、エキセンディン-4およびGLP-1の島新生作用に基づく)不十分な膵臓ベータ細胞塊の状態を含むが、これらに限定されるものではない。
また、本発明は、ハイブリッドポリペプチドの送達において有用な医薬上許容される希釈剤、保存料、溶解剤、乳化剤、アジュバントおよび/またはキャリアと併せた、治療上または予防上有効量の本発明の少なくとも１つのハイブリッドポリペプチドを含む医薬組成物、またはその医薬上許容される塩に関する。
本発明のこれらのおよび他の態様は、以下の好ましい具体例および詳細な記載をもって、より明白に理解されるであろう。
図１は、DIOマウスアッセイにおける本発明の例示的化合物の効果を示す。 図２は、DIOマウスアッセイにおける本発明の例示的化合物の効果を示す。 図３Ａは、DIOマウスアッセイにおける本発明の例示的化合物の効果を示す。 図３Ｂは、DIOマウスアッセイにおける本発明の例示的化合物の効果を示す。 図４Ａは、親ペプチド化合物と比較した、食物摂取量アッセイにおける本発明の例示的化合物の効果を示す。 図４Ｂは、親ペプチド化合物と比較した、食物摂取量アッセイにおける本発明の例示的化合物の効果を示す。
本発明の詳細な記載
本発明は、一般的には、糖尿病および糖尿病関連状態のような、血糖値、インスリンレベルおよび／またはインスリン分泌を制御することによって軽減することができる代謝性疾患および障害の治療および予防のための剤として有用な、新規の、選択可能なハイブリッドポリペプチドに関する。そのような状態および障害は、高血圧、異常脂質血症、心疾患、摂食障害、インスリン耐性、肥満、および1型、2型、および妊娠性糖尿病を含むいずれかの種類の糖尿病を含むが、これらに限定されるものではない。
１つの態様において、本発明は、例えば、治療的有効性、機能の範囲、作用の持続期間、物理化学的性質、および／または他の薬物速度論的特性といった「生物活性」に基づき選択可能な、生理学的に、代謝的に、および／または薬物動力学的に活性なペプチドモジュールのモジュラーアセンブリを含む。
理論によって制限されるようには意図せずに、本発明は、少なくとも部分的には、「ツールボックス」アプローチに関し、ここに、生理活性ペプチドホルモンモジュールは、二級、三級またはより高い順序の組合せで連結されて、選択可能な特性を有する新規の、有効な治療剤を作り出す。「生理活性ペプチドホルモンモジュール」は、ペプチドホルモン、ホルモン活性を有するペプチド断片、または化学、代謝、および／または他の薬物動力学的安定性を付与するペプチドホルモンの構造モチーフであってもよい。ペプチドホルモンは、当該分野で知られ、本明細書中に記載されるように、天然のペプチドホルモン、ならびにペプチドホルモンアナログおよび誘導体を含み得る。
本発明の１つの態様において、２以上のペプチドホルモンのある種の物理化学的特徴の単一様式への組合せは、機能不全代謝回路のいくつかの地点での介入を容易とできることが判明した。そのようなものとして、本発明の１つの態様において、単一のポリペプチド剤に選択可能な生物活性を統合する合理的に設計されたハイブリッドポリペプチドが提供される。１つの具体例において、本発明の選択可能なハイブリッドポリペプチドは、化学的に安定なリンカーを使用して、生理活性モジュールを共有結合することを含み得る。もう１つの具体例において、本発明の選択可能なハイブリッドポリペプチドは、それら自体が生理活性モジュールであるかその一部を形成し得る開裂可能なリンカーの使用を含み得る。
再び、理論によって制限されることを意図せずに、本発明のハイブリッドポリペプチドの設計は、一般的には：(1)所望の有効性および治療的使用のための生理活性ペプチドホルモンモジュールの同定、選択および対合、および(2)直接的にまたは構成モジュールの生理活性の喪失なしにリンカーを介してのいずれかの、生理活性モジュール (例えば、ホルモン活性を有する天然のペプチドホルモン、ペプチドホルモンアナログまたは誘導体、ホルモン活性を有するペプチドホルモン断片、安定化モチーフ等)の共有結合を含み得る。特定の具体例において、モジュール選択基準は: (a)所望の治療的または予防的指標に対する所望のインビボ有効性; (b)複数の治療的または予防的指標に対する連結されたモジュールの所望の相乗作用または二重作用; および／または(c) 所望の化学安定性、立体配座の安定性、代謝安定性、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、および／または他の薬物動態特徴を含むが、これらに限定されるものではない。
セクションヘッディングは、本明細書において、構成目的のためのみに使用され、決して記載の主題を制限するように解釈されるべきではない。
本発明のハイブリッドポリペプチド
上記で言及したように、本発明は、ある程度、本明細書中に記載の構成ペプチドホルモンから選択可能な少なくとも２つの生理活性ペプチドホルモンモジュールを含むハイブリッドポリペプチドに関する。本発明のハイブリッドポリペプチドは、一般的には、代謝状態および障害の治療および予防において有用であろう。本発明のハイブリッドポリペプチドは、構成ペプチドホルモンの少なくとも１つのホルモン活性を呈するであろうし、好ましくは、第２の構成ペプチドホルモンの少なくとも１つのさらなる生理活性を含んでもよい。
１つの具体例において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、少なくとも２つの生理活性ペプチドホルモンモジュールを含み得、ここに、該少なくとも２つの生理活性ペプチドホルモンモジュールの各々は、構成ペプチドホルモンの少なくとも１つのホルモン活性を呈する。もう１つの具体例において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、少なくとも２つの生理活性ペプチドホルモンモジュールを含み得、ここに、少なくとも１つの該生理活性ペプチドホルモンモジュールは、構成ペプチドホルモンの少なくとも１つのホルモン活性を呈し、少なくとも１つの該生理活性ペプチドホルモンモジュールは、ハイブリッドポリペプチドに、所望の化学安定性、立体配座の安定性、代謝安定性、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、および／または他の薬物動態特徴を与える。
好ましい具体例において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、構成ペプチドホルモンと比較して、代謝状態および障害の治療および／または予防において、相当のまたはより高い有効性を有し得る。もう１つの具体例において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、構成ペプチドホルモンと比較して、糖尿病および／または糖尿病関連障害の治療および／または予防において、相当のまたはより高い有効性を有し得る。別法として、本発明の好ましいハイブリッドポリペプチドは、構成ペプチドホルモンと比較して、改善された製造の容易性、安定性、および／または処方の容易性を呈し得る。
より具体的には、本発明のハイブリッドポリペプチドは、一般的には、少なくとも１つのさらなる生理活性ペプチドホルモンモジュールに共有結合した第１の生理活性ペプチドホルモンモジュールを含むであろう。該生理活性ペプチドホルモンモジュールは、下記にさらに詳細に記載されるように、直接的アミド結合または化学リンカー基を含むが、これらに限定されるものではない当該分野で知られるいずれかの手段で一緒に共有結合され得る。１つの具体例において、化学リンカー基は、ポリペプチド構造を誘発するまたは安定させるペプチドミメティクスを含み得る。
第１の生理活性ペプチドホルモンモジュールは、第１の構成ペプチドホルモンから選択されてもよく、(天然ペプチドホルモンならびにそのアナログおよび誘導体を含む)ペプチドホルモン、(天然ペプチドホルモンの断片ならびにそのアナログおよび誘導体を含む)ホルモン活性を有するペプチド断片、またはハイブリッドポリペプチドに所望の化学安定性、立体配座の安定性、代謝的安定性、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、または他の薬物動態特徴を付与する(天然ペプチドホルモンならびにそのアナログおよび誘導体を含む)ペプチドホルモンの構造モチーフであってもよい。同様に、（複数の）さらなる生理活性ペプチドモジュールは、構成ペプチドホルモンから選択してもよく、(天然ペプチドホルモンならびにそのアナログおよび誘導体を含む)ペプチドホルモン、(天然ペプチドホルモンの断片ならびにそのアナログおよび誘導体を含む)ホルモン活性を有するペプチド断片、またはハイブリッドポリペプチドに所望の化学安定性、立体配座の安定性、代謝的安定性、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、または他の薬物動態特徴を付与する(天然ペプチドホルモンならびにそのアナログおよび誘導体を含む)ペプチドホルモンの構造モチーフであってもよい。第１のペプチドホルモンおよびさらなるペプチドホルモンは、生理活性ペプチドホルモンモジュールの所望の特徴によって、同一のペプチドホルモンであってもよく、ペプチドホルモンの同一のファミリーからであってもよく、あるいは異なるペプチドホルモンであってもよい。
本明細書中で使用されるように、用語「生理活性の」は、(1)少なくとも１つのインビボホルモン経路における生物活性、または(2)そのような生物活性の治療的有効性、機能の範囲、活性の持続期間、物理化学特性、および／または他の薬物動態特性の変調を指す。生物活性は、当該分野で知られ本明細書中に記載されるように、標的ホルモン受容体結合アッセイを通して、あるいは生理学的指標をモニターする代謝研究を通して評価され得る。そのような生物活性の治療的有効性、機能の範囲、活性の持続期間、物理化学特性、および／または他の薬物動態特性の変調は、例えば、化学安定性、立体配座の安定性、代謝安定性、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、および／または他の薬物動態特徴の変化を介して修飾され得る。
１つの具体例において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、構成ペプチドホルモンの生物活性の少なくとも約25%、好ましくは約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、または99%パーセント保持する。好ましいハイブリッドポリペプチドは、当該同一アッセイにおける構成ペプチドホルモンの有効性と等しいまたはそれを超える、当該分野で知られているまたは本明細書中に記載されている代謝関連アッセイのうちの１つの有効性(例えば、受容体結合、食物摂取、胃内容排出、膵液分泌、インスリン分泌、血糖降下、減量等)を有するものである。別法として、本発明の好ましいハイブリッドポリペプチドは、構成ペプチドホルモンと比較して、改善された製造の容易性、安定性、および／または処方の容易性を呈し得る。
もう１つの具体例において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、栄養素利用性の減少、食物摂取量の減少、体重増加の効果、および／または代謝状態および障害の治療および予防に関して、天然構成ペプチドホルモンの生物活性の少なくとも約25%、好ましくは約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、または99%パーセント保持する。さらにもう１つの具体例において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、栄養素利用性の減少、食物摂取量の減少、体重増加の効果、および／または代謝状態および障害の治療および予防に関して、天然ペプチドホルモンの少なくとも約110%、125%、130%、140%、150%、200%、またはそれ以上の生物活性を呈する。もう１つの具体例において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、改善された構成ペプチドホルモン受容体アゴニスト活性を呈する。
構成ペプチドホルモン、アナログおよび誘導体
構成ペプチドホルモンは、一般的には: (a)アミリン、アドレノメデュリン (「ADM」)、カルシトニン (「CT」)、カルシトニン遺伝子関連ペプチド (「CGRP」)、インテルメジン (「AFP-6」としても知られる)および関連ペプチドを含むアミリンファミリー; (b) コレシストキニン (「CCK」); (c) レプチンおよびレプチン様ペプチドを含むレプチンファミリー; (d) 膵臓ポリペプチド (「PP」)およびペプチド YY (「PYY」)を含む膵臓ポリペプチドファミリー; および(e) グルカゴン、グルカゴン様ペプチド-1 (「GLP-1」)、グルカゴン様ペプチド 2 (「GLP-2」)、およびオキシントモジュリン(「OXM」)のようなプログルカゴン遺伝子から由来するペプチドホルモン;およびエキセンディン-3、およびエキセンディン-4のようなエキセンディンを含むインクレチンおよびインクレチンミメティクスを含む代謝性疾患および障害の治療または予防に有用なペプチドホルモンを含む。上記で論議したように、本発明の構成ペプチドホルモンは、また、これらの天然ペプチドホルモンのホルモン活性を保持するアナログおよび誘導体を含む。１つの具体例において、そのようなアナログおよび誘導体は、標的ホルモン受容体のアゴニストである。
「アミリン」によって、その内容が本明細書中に引用によって援用される"Hyperglycemic Compositions"に対して1993年8月10日に発行されたU.S. Pat. No. 5,234,906に記載されるように、アミリンと呼ばれ、膵臓のベータ細胞およびその種の異形から分泌されたヒトペプチドホルモンを意味する。より具体的には、アミリンは、栄養素摂取に応答して、通常、膵臓ベータ細胞によってインスリンと共分泌される37-アミノ酸ポリペプチドホルモンである(例えば、Koda et al., Lancet 339:1179-1180, 1992参照)。この意味において、「アミリン」、「野生型アミリン」、および「天然アミリン」、つまり、非修飾アミリンは、相互間的に使用される。
「アドレノメデュリン」または「ADM」によって、ヒトペプチドホルモンおよびその種の異形が意味される。より具体的には、ADMは、連続した酵素開裂およびアミド化を通して、185アミノ酸プレプロホルモンから生成される。このプロセスは、52アミノ酸生理活性ペプチドの遊離に至る。
「カルシトニン」または「CT」によって、ヒトペプチドホルモンおよびサケカルシトニン (「sCT」)を含むその種の異形が意味される。より具体的には、CTは、より大きいプロホルモンから開裂された32アミノ酸ペプチドである。それは、アミノ末端に、環の形状を推定させる単一のジスルフィド結合を含有する。カルシトニンプレ-mRNAの代替スプライシングは、カルシトニン遺伝子関連ペプチドをコードするmRNAを得ることができる;該ペプチドは、神経系および脈管系において機能するように思われる。カルシトニン受容体はクローン化され、７−膜貫通、G蛋白質結合受容体ファミリーのメンバーであることが示されている。
「カルシトニン遺伝子関連ペプチド」または「CGRP」によって、いずれかの生理学的形態のヒトペプチドホルモンおよびその種の異形が意味される。
「インテルメジン」または「AFP-6」によって、生理学的形態のヒトペプチドホルモンおよびその種の異形が意味される。
「コレシストキニン」または「CCK」によって、ヒトペプチドホルモンおよびその種の異形が意味される。より具体的には、CCKは、ヒトにおいて最初に同定された33-アミノ酸配列であり、ブタ、ラット、トリ、チンチラ、イヌおよびヒトにおいて示されたと報告されている8-アミノ酸インビボC末端断片(「CCK-8」)を含む。従って、用語CCK-33は、一般的には、ヒトCCK(1-33)を指すであろうが、CCK-8 (CCK(26-33))は、特記されない限り、一般的に、硫酸化されたおよび硫酸化されていないC-末端オクタペプチドの両方を指すであろう。さらに、ペンタガストリンまたはCCK-5は、C末端ペプチドCCK(29-33)を指し、CCK-4は、C末端テトラペプチドCCK(30-33)を指すであろう。しかしながら、本明細書中で使用されるように、CCKは、一般的には、特記されない限り、硫酸化および硫酸化されていない形態のCCK-33、CCK-8、CCK-5、およびCCK-4を含むホルモンの全天然に生じる異形を指すであろう。
「レプチン」によって、いずれかの種から天然に生じるレプチン、ならびに生物学的に活性なD-イソ型、または天然に生じるレプチンの断片およびその異形、および前述の組合せが意味される。レプチンは、その全文において本明細書中に引用によって援用されるInternational Patent Publication No. WO 96/05309に記載のように、ob遺伝子のポリペプチド生成物である。レプチンの推定アナログおよび断片は、各々がその全文において本明細書中に引用によって援用されるUS Patent 5,521,283、U. S. Patent 5,532,336、PCT/US96/22308およびPCT/US96/01471に報告される。
「PP」によって、いずれかの生理学的形態のヒト膵臓ペプチドポリペプチドまたはその種の異形が意味される。従って、用語「PP」は、配列番号: 1記載のヒト完全長、36アミノ酸ペプチド、および例えば、ネズミ、ハムスター、トリ、ウシ、ラット、およびイヌPPを含むPPの種の異形の両方を含む。この意味において、「PP」、「野生型PP」、および「天然PP」、つまり、非修飾PPは、相互間的に使用される。
「PYY」によって、いずれかの生理学的形態のヒトペプチドYYポリペプチドまたはその種の異形が意味される。従って、用語「PYY」は、ヒト完全長、36アミノ酸ペプチド、および例えば、ネズミ、ハムスター、トリ、ウシ、ラット、およびイヌPYYを含むPYYの種の異形の両方を含む。この意味において、「PYY」、「野生型PYY」、および「天然PYY」、つまり、非修飾PYYは、相互間的に使用される。本発明の文脈において、本発明のPYYアナログポリペプチドへの言及をもって論議される全修飾は、天然ヒトPYYの36アミノ酸配列に基づく。
「GLP-1」によって、いずれかの生理学的形態のヒトグルカゴン様ペプチド-1またはその種の異形が意味される。用語「GLP-1」は、完全長ヒトGLP-1(1-37)への言及をもって、ヒトGLP-1(1-37)、GLP-1(7-37)、およびGLP-1(7-36)アミド、および例えば、ネズミ、ハムスター、トリ、ウシ、ラット、およびイヌPPを含むGLP-1の種の異形を含む。この意味において、「GLP-1」、「野生型GLP-1」、および「天然GLP-1」、つまり非修飾GLP-1は、相互間的に使用される。
「GLP-2」によって、いずれかの生理学的形態のヒトグルカゴン様ペプチド-2またはその種の異形が意味される。より具体的には、GLP-2は、小腸および大腸の腸の内分泌細胞からGLP-1と一緒に共分泌される33アミノ酸ペプチドである。
「OXM」によって、いずれかの生理学的形態のヒトオキシントモジュリンまたはその種の異形が意味される。より具体的には、OXMは、8アミノ酸カルボキシ末端延長が続くグルカゴンの29アミノ酸配列を含有する37アミノ酸ペプチドである。
「エキセンディン」によって、アリゾナ州に内生のトカゲであるアメリカドクトカゲ（Gila-monster）、およびメキシコドクトカゲ（Mexican Beaded Lizard）、ならびにその種の異形の唾液に見受けられるペプチドホルモンが意味される。より具体的には、エキセンディン-3は、メキシコドクトカゲ（Heloderma horridum）の唾液中に存在し、エキセンディン-4は、アメリカドクトカゲ（Heloderma suspectum）の唾液中に存在する(Eng, J., et al., J. Biol. Chem., 265:20259-62, 1990; Eng., J., et al., J. Biol. Chem., 267:7402-05 (1992))。エキセンディンは、GLP-1に対する最高同一性が53%であるグルカゴン様ペプチドのいくつかのメンバーと何らかの配列同一性を有する(Goke, et al., J. Biol. Chem., 268:19650-55 (1993))。この意味において、「エキセンディン」、「野生型エキセンディン」、および「天然エキセンディン」、つまり、非修飾エキセンディンは、相互間的に使用される。
本明細書中で使用されるように、「アナログ」は、配列が、好ましくはベースのペプチドと少なくとも50または55%アミノ酸配列同一性を有する、より好ましくはベースペプチドと少なくとも70%、80%、90%、または95%アミノ酸配列同一性を有する参照アミノ酸配列の挿入、置換、延長、および／または欠失を含むベース参照ペプチド (例えば、PP、PYY、アミリン、GLP-1、エキセンディン等)のものから由来したペプチドを指す。１つの具体例において、そのようなアナログは、（非天然アミノ酸およびLおよびD形態を含む）保存または非保存的アミノ酸置換を含み得る。
「誘導体」は、天然の参照ペプチドまたはアナログのアミノ酸配列を有するが、加えて、１以上のそのアミノ酸側鎖、α炭素原子、末端アミノ基、または末端カルボン酸基の化学的修飾を有する分子として定義される。化学的修飾は、化学部位を加える、新たな結合を作り出す、および化学部位を除去することを含むが、これらに限定されるものではない。アミノ酸側鎖での修飾は、制限なしに、リジンεアミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン、またはリジンのN-アルキル化、グルタミン酸またはアスパラギン酸カルボン酸基のアルキル化、およびグルタミンまたはアスパラギンのアミド分解を含む。末端アミノの修飾は、制限なしに、デサミノ、N-低級アルキル、N-ジ-低級アルキル、拘束アルキル（例えば、分岐、環化、縮合、アダマンチル）およびN-アシル修飾を含む。末端カルボキシ基の修飾は、制限なしに、アミド、低級アルキルアミド、拘束アルキル（例えば、分岐、環化、縮合、アダマンチル）アルキル、ジアルキルアミド、および低級アルキルエステル修飾を含む。低級アルキルは、C1-C4アルキルである。さらに、１以上の側鎖、または末端基は、普通に技術のあるペプチド化学者に知られる保護基によって保護され得る。アミノ酸のα炭素は、モノ-またはジメチル化されてもよい。
「アゴニスト」によって、受容体結合／競合研究のような当該分野で知られる手段によって評価された時、好ましくは参照ペプチドより良い有効性、または参照ペプチドと比較して５桁の規模（プラスまたはマイナス）内、より好ましくは4、3、2、または1桁の規模の有効性を有する天然のヒト参照ペプチドの生物活性を導く化合物が意味される。１つの具体例において、用語は、例えば、(1)天然のヒト参照ペプチドと同様の食物摂取、胃内容排出、膵臓分泌、または減量アッセイにおいて活性を有する、または(2)参照受容体アッセイまたは標識された参照ペプチドとの競合結合アッセイにおいて特異的に結合する化合物といった、天然のヒト参照ペプチドのものと同様の生物学的効果を引き出す化合物を指す。好ましくは、アゴニストは、1 μMを超える親和性を有する、より好ましくは1-5nMを超える親和性を有するそのようなアッセイにおいて結合するであろう。もう１つの具体例において、用語は、糖尿病または糖尿病関連状態または障害の治療において生物学的効果を導き出す化合物を指す。そのようなアゴニストは、参照ペプチドの活性断片または小化学分子を含むポリペプチドを含んでもよい。
「アミノ酸」および「アミノ酸残基」によって、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、および修飾されたアミノ酸が意味される。異論が唱えられない限り、一般的なまたは名前による特異的なアミノ酸へのいずれの言及も、もしそれらの構造がそのような立体異性体形態を許容するならば、DおよびL立体異性体両方への言及を含む。天然のアミノ酸は、アラニン (Ala)、アルギニン (Arg)、アスパラギン (Asn)、アスパラギン酸 (Asp)、システイン (Cys)、グルタミン (Gln)、グルタミン酸 (Glu)、グリシン (Gly)、ヒスチジン (His)、イソロイシン (Ile)、ロイシン (Leu)、リジン (Lys)、メチオニン (Met)、フェニルアラニン (Phe)、プロリン (Pro)、セリン (Ser)、スレオニン (Thr)、トリプトファン (Trp)、チロシン (Tyr)およびバリン (Val)を含む。非天然アミノ酸は、ホモ-リジン、ホモ-アルギニン、アゼチジンカルボン酸、2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、ベータ-アラニン、アミノプロピオン酸、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、三級-ブチルグリシン、2,4-ジアミノイソ酪酸、デスモシン、2,2'-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリジン、アロ-ヒドロキシリジン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ-イソロイシン、N-メチルアラニン、N-メチルグリシン、N-メチルイソロイシン、N-メチルペンチルグリシン、N-メチルバリン、ナフタラニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸およびチオプロリンを含む。さらなる非天然アミノ酸は、可逆的にまたは不可逆的に化学的に遮断された、あるいは例えば、N-メチル化DおよびLアミノ酸または残基のようなN-末端アミノ基または側鎖上に化学的に修飾された修飾アミノ酸を含み、ここに、該側鎖官能基は、もう一方の官能基に化学的に修飾される。例えば、修飾アミノ酸は、メチオニンスルホキシド; メチオニンスルホン; アスパラギン酸- (ベータ-メチルエステル)、アスパラギン酸の修飾アミノ酸; N-エチルグリシン、グリシンの修飾アミノ酸; またはアラニンカルボキシアミド、アラニンの修飾アミノ酸を含む。組み込むことができるさらなる残基は、Sandberg et al., J. Med. Chem. 41: 2481-91, 1998に記載される。
本明細書中で使用されるように: 「5 Apa」は、5 アミノ-ペンタノイルを意味し、「12 Ado」は12-アミノドデカノイルを意味し、「PEG(8)」は3,6,-ジオキシオクタノイルを意味し、「PEG(13)」は1-アミノ-4,7,10-チオキサ-13-トリデカンアミンスクシンイモイルを意味する。
上記で論議のように、天然構成ペプチドホルモンは、アナログおよび誘導体がそうであるように、当該分野で知られている。参考に、いくつかの天然構成ペプチドホルモンの配列を下記の表1に提供する。
Figure 2011219488
これらのペプチドは、生理学的に発現されると、一般的にはC-末端アミド化されるが、本発明の目的のためにはそうなる必要はない。言い換えれば、これらのペプチド、ならびに本発明のハイブリッドポリペプチドのC-末端は、遊離-OHまたは-NH2基を有し得る。また、これらのペプチドは、他の翻訳後修飾を有し得る。当業者は、本発明のハイブリッドポリペプチドが、N-末端メチオニン残基によっても構築され得ることを理解するであろう。
上記構成ペプチドホルモンのアナログは当該分野で知られるが、一般的には、そのような構成ペプチドホルモンのアミノ酸配列への置換、欠失、および挿入、およびそのいずれかの組合せのような修飾を含む。置換、挿入および欠失は、N-末端またはC-末端であってもよく、あるいは構成ペプチドホルモンの内部であってもよい。好ましい態様において、本発明の構成ペプチドホルモンのアナログは、「非必須」アミノ酸残基の１以上の修飾を含む。本発明の文脈において、「非必須」アミノ酸残基は、得られたアナログの構成ペプチドホルモン受容体アゴニスト活性を消すまたは実質的に減らすことなしに、例えば構成ペプチドホルモン断片といった断片の天然ヒトアミノ酸配列において改変、つまり、欠失または置換され得る残基である。
好ましい置換は、保存されたアミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」は、該アミノ酸残基が、同様の側鎖、または物理化学特徴（例えば、静電、水素結合、等比体積、疎水性特徴）を有するアミノ酸残基によって置換されるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で知られる。これらのファミリーは、塩基性側鎖 (例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖 (例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、荷電されていない極性側鎖 (例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、メチオニン、システイン)、非極性側鎖 (例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン)、β-分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。
また、本発明は、構成ペプチドホルモンの誘導体に関する。そのような誘導体は、ポリエチレングリコール(「PEG」)または種々の長さの脂肪酸鎖 (例えば、ステアリル、パルミトイル、オクタノイル等)のような１以上の水溶性ポリマー分子にコンジュゲートされた、あるいはポリ-his、ポリ-arg、ポリ-lys、およびポリ-alaのようなポリアミノ酸の添加による構成ペプチドホルモンおよびそのアナログを含む。また、構成ペプチドホルモンまたはそのアナログへの修飾は、短いアルキルおよび拘束されたアルキル(例えば、分岐、環化、縮合、アダマンチル）のような小分子置換基、および芳香族を含み得る。水溶性ポリマー分子は、好ましくは、約500ないし約20,000ダルトンの範囲の分子量を有するであろう。
そのようなポリマーコンジュゲーションおよび小分子置換基修飾は、ハイブリッドポリペプチドの配列内で、N-またはC-末端にてまたはアミノ酸残基の側鎖基にて、単独で生じ得る。別法として、ハイブリッドポリペプチドと共に誘導化の複数部位があってもよい。１以上のアミノ酸のリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステインによる置換は、誘導化のためのさらなる部位を提供し得る。例えば、U.S. Patent Nos. 5,824,784および5,824,778参照。好ましくは、ハイブリッドポリペプチドは、１、２、または３つのポリマー分子にコンジュゲートされてもよい。
水溶性ポリマー分子は、好ましくは、アミノ、カルボキシル、またはチオール基に並び、NまたはC-末端によって、またはリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステインの側鎖にて連結されてもよい。別法として、水溶性ポリマー分子は、ジアミンおよびジカルボン酸基と連結されてもよい。好ましい具体例において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、リジンアミノ酸上のイプシロンアミノ基を通して、１、２、または３つのPEG分子にコンジュゲートされる。
また、本発明の誘導体は、１以上のアミノ酸残基への化学的改変を有する構成ペプチドホルモンまたはアナログを含む。そのような化学的改変は、アミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化、および環化を含む。化学的改変は、PPFハイブリッドポリペプチドの配列内で、N-またはC-末端にてまたはアミノ酸残基の側鎖にて、単独で生じ得る。１つの具体例において、これらのペプチドのC-末端は、遊離-OHまたは-NH2基を有し得る。もう１つの具体例において、N-末端は、イソブチルオキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、n-ブチルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、イソカプロイル基 (isocap)、オクタニル基、オクチルグリシン基 (G(Oct))、または8-アミノオクタン酸基によって終わってもよい。好ましい具体例において、環化は、ジスルフィド橋の形成を介してであってもよい。別法として、ハイブリッドポリペプチドに沿った、化学的改変の複数部位があってもよい。
アミリンファミリー
上記で論議のように。本発明において有用な構成ペプチドホルモンは、アミリン、アドレノメデュリン (「ADM」)、カルシトニン (「CT」)、カルシトニン遺伝子関連ペプチド (「CGRP」)、(「AFP-6」としても知られる)インテルメジンおよび関連ペプチドを含むアミリンファミリーペプチドホルモンを含む。天然アミリンファミリーペプチドホルモンは、機能的ペプチドアナログおよび誘導体のように、当該分野で知られる。特定の好ましい天然ペプチド、ペプチドアナログおよび誘導体は本明細書中に記載されるが、当該分野で知られるホルモン活性を呈するいずれの既知のアミリンファミリーペプチドも、本発明と併せて使用されてもよいことが認識されるべきである。
当該分野で知られるいずれかのアミリンアナログまたは誘導体は、本発明と併せて使用されてもよい。１つの具体例において、アミリンアナログおよび誘導体は、天然アミリンの少なくとも１つのホルモン活性を有する。特定の具体例において、アミリンアナログは、天然アミリンが特異的に結合することが可能な受容体のアゴニストである。好ましいアミリンアナログおよび誘導体は、本明細書中に引用によって援用されるUS 2003/0026812 A1に記載のものを含む。
例示的アミリンアナログは以下のものを含む:
Figure 2011219488
当該分野で知られるように、そのようなアミリンアナログは、好ましくは、アミド化されるが、本発明の文脈内では、特記されない限り、所望により酸形態であってもよい。
当該分野で知られるいずれかのADMアナログまたは誘導体を、本発明と併せて使用してもよい。１つの具体例において、該ADMアナログおよび誘導体は、天然のADMの少なくとも１つのホルモン活性を有する。特定の具体例において、該ADMアナログは、天然のADMが特異的に結合することが可能な受容体のアゴニストである。
当該分野で知られるいずれかのCTアナログまたは誘導体は、本発明と併せて使用されてもよい。１つの具体例において、該CTアナログおよび誘導体は、天然CTの少なくとも１つのホルモン活性を有する。特定の具体例において、該CTアナログは、天然CTは特異的に結合することが可能な受容体のアゴニストである。好ましいCTアナログおよび誘導体は、本明細書中に引用によって援用されるU.S. Patent Nos. 4,652,627; 4,606,856; 4,604,238; 4,597,900; 4,537,716; 4,497,731; 4,495,097; 4,444,981; 4,414,149; 4,401,593; および4,397,780に記載されるものを含む。
例示的CTアナログは以下のものを含む:
Figure 2011219488
当該分野で知られるように、そのようなCTアナログは、好ましくはアミド化されるが、本発明の文脈内で、特記されない限り、所望により酸形態であってもよい。
当該分野で知られるいずれかのCGRPアナログまたは誘導体は、本発明と併せて使用されてもよい。１つの具体例において、該CGRPアナログおよび誘導体は、天然CGRPの少なくとも１つのホルモン活性を有する。特定の具体例において、該CGRPアナログは、天然CGRPが特異的に結合することが可能な受容体のアゴニストである。好ましいCGRPアナログおよび誘導体は、本明細書中に引用によって援用されるU.S. Patent Nos. 4,697,002; および4,687,839に記載のものを含む。
例示的CGRPアナログは以下のものを含む:
Figure 2011219488
当該分野で知られるいずれかのAFP-6アナログまたは誘導体は、本発明と併せて使用されてもよい。１つの具体例において、該AFP-6アナログおよび誘導体は、天然AFP-6の少なくとも１つのホルモン活性を有する。特定の具体例において、該AFP-6アナログは、天然AFP-6が特異的に結合することが可能な受容体のアゴニストである。好ましいAFP-6アナログおよび誘導体は、本明細書中に引用によって援用されるWO 2003/022304に記載のものを含む。
例示的AFP-6アナログは以下のものを含む:
Figure 2011219488
当該分野で知られるように、そのようなAFP-6アナログは、好ましくはアミド化されるが、本発明の文脈内では、特記されない限り、所望により酸形態であってもよい。
CCKファミリー
hCCKおよび種の異形、およびその種々のアナログを含むCCKは、当該分野で知られている。一般的には、CCKは、ヒトにおいて最初に同定された33-アミノ酸配列を有し、ブタ、ラット、トリ、チンチラ、イヌおよびヒトにおいて示されていると報告されている8-アミノ酸インビボC-末端断片 (「CCK-8」)を含む。他の種の異形は、ブタ、イヌおよびモルモットにおいて見受けられる39-アミノ酸配列、ネコ、イヌおよびヒトにおいて見受けられる58-アミノ酸、およびCCKおよびガストリンの両方に対して相同的な47-アミノ酸配列を含む。C-末端硫酸化オクタペプチド配列(CCK-8)は、種にわたり、比較的保存され、齧歯類の周辺における生物活性に対する最小配列であり得る。従って、用語CCK-33は、ヒトCCK(1-33)を指すであろうが、CCK-8 (CCK(26-33))は、特記されない限り、一般的には、硫酸化および非硫酸化の両方のC-末端オクタペプチドを指すであろう。さらに、ペンタガストリンまたはCCK-5は、C-末端ペプチドCCK(29-33)を指し、CCK-4は、C-末端テトラペプチドCCK(30-33)を指すであろう。
A型受容体サブタイプ(CCKA)は、硫酸化オクタペプチドに対して選択性であると報告されている。B型受容体サブタイプ(CCKB)は、脳を通しておよび胃において同定されており、報告によると硫酸化または全８つのアミノ酸を必要としない。
CCKアナログに対する種々のインビボおよびインビトロスクリーニング方法は、当該分野で知られる。例は、CCK様活性についてテストされる化合物の迅速な静脈注射後のイヌまたはモルモット胆嚢の収縮を含むインビボアッセイ、およびウサギの胆嚢の条片を用いるインビトロアッセイ測定を含む。Walsh, "Gastrointestinal Hormones", In Physiology of the Gastrointestinal Tract (3d ed. 1994; Raven Press, New York)参照。
CCK活性を有する特定の好ましいCCKおよびCCKアナログは以下のものを含む:
Figure 2011219488
当該分野で知られるように、そのようなCCKペプチドは、好ましくはアミド化されるが、本発明の文脈内では、特記されない限り、所望により酸形態であってもよい。
レプチンファミリー
また、本発明において有用な構成ペプチドホルモンは、レプチンファミリーペプチドホルモンを含む。天然レプチンファミリーペプチドホルモンは、機能的ペプチドアナログおよび誘導体のように、当該分野で知られる。特定の好ましい天然ペプチド、ペプチドアナログおよび誘導体は本明細書中に記載されるが、当該分野で知られるホルモン活性を呈するいずれかの既知のアミリンファミリーペプチドを、本発明と併せて使用し得ることが認識されるべきである。
当該分野で知られるいずれかのレプチンアナログまたは誘導体は、本発明と併せて使用されてもよい。１つの具体例において、レプチンアナログおよび誘導体は、天然レプチンの少なくとも１つのホルモン活性を有する。特定の具体例において、該レプチンアナログは、天然レプチンが特異的に結合することが可能な受容体のアゴニストである。好ましいレプチンアナログおよび誘導体は、その全てが本明細書中に引用によって援用される例えば、WO 2004/039832、WO 98/55139、WO 98/12224、およびWO 97/02004に記載のものを含む。
例示的レプチンアナログは、位置43のアミノ酸がAspまたはGluで置き換えられ; 位置48がAlaで置き換えられ; 位置49がGluで置き換えられるかあるいは存在せず; 位置75はAlaで置き換えられ; 位置89はLeuで置き換えられ; 位置93はAspまたはGluで置き換えられ; 位置98はAlaで置き換えられ; 位置117はSerで置き換えられ、位置139はLeuで置き換えられ、位置167はSerで置き換えられたもの、およびそのいずれかの組合せを含む。
CCK活性を有する特定の好ましいCCKおよびCCKアナログは、以下のものを含む:
Figure 2011219488
PPFファミリー
また、本発明において有用な構成ペプチドホルモンは、PPおよびPYYを含むPPFペプチドホルモンを含む。天然PPFペプチドホルモンは、機能的ペプチドアナログおよび誘導体のように、当該分野で知られる。特定の好ましい天然ペプチド、ペプチドアナログおよび誘導体は本明細書中に記載されるが、当該分野で知られるホルモン活性を呈するいずれかの既知のアミリンファミリーペプチドを本発明と併せて使用し得ることが認識されるべきである。
当該分野で知られるいずれかのPPFアナログまたは誘導体は、本発明と併せて使用されてもよい。１つの具体例において、該PPFアナログおよび誘導体は、天然PPFポリペプチドの少なくとも１つのホルモン活性を有する。特定の具体例において、該PPFアナログは、天然PPFポリペプチドが特異的に結合することが可能な受容体のアゴニストである。好ましいPPFアナログおよび誘導体は、その全文において本明細書中に引用によって援用されるWO 03/026591およびWO 03/057235に記載のものを含む。
１つの具体例において、少なくとも１つのPPFホルモン活性を呈する好ましいPPFアナログおよび誘導体は、一般的には、ポリプロリンモチーフおよびC-末端テイルモチーフを含む少なくとも２つのPYYモチーフを含む。そのようなアナログは、一般的には、本明細書中に引用によって援用される2004年２月11日に出願されたU.S. Provisional Application No. 60/543,406に記載される。他の好ましいPPFアナログは、その内容が本明細書中に引用によって援用される同時出願された代理人整理番号 18528.832の"Pancreatic Polypeptide Family Motifs and Polypeptides Comprising the Same"と題されたPCT/US05/[XXXXX]に開示される。背景として、研究は、Y受容体結合親和性の差は、二級および三級構造差と相関すると示唆している。例えば、Keire et al., Biochemistry 2000, 39, 9935-9942参照。天然ブタPYYは、残基23、24、および25のねじれによって分離された残基17ないし22および25ないし33からの２つのC-末端らせんセグメントを含むと特徴付けられており、ここにターンは残基12-14周辺を中心とし、N-末端は残基30および31近くで折り畳まれる。さらに、完全長ブタPYYは、N-およびC-末端における残基の中の疎水性相互作用によって安定化されるPP折り畳みを含むと特徴付けられている。同文献参照。
「PYYモチーフ」は、一般的には、生物活性には絶対不可欠な構造要素、一級、二級、または三級の天然PPファミリーポリペプチドであり、つまり、生物活性は、モチーフの不在または撹乱において実質的に減少される。好ましいPYYモチーフは、天然PPファミリーポリペプチドのN-末端ポリプロリンタイプIIモチーフ、天然PPファミリーポリペプチドのタイプIIβ-ターンモチーフ、天然PPファミリーポリペプチドのC-末端のα-らせんモチーフ、および天然PPファミリーポリペプチドのC-末端テイルモチーフを含む。より具体的には、N-末端ポリプロリン領域において、天然PPファミリーポリペプチドの残基5および8に対応するアミノ酸は、一般的には、プロリンとして保存される。タイプII β-ターンモチーフは、一般的には、天然PPファミリーポリペプチドの残基12-14に対応するアミノ酸を含むであろう。該α-らせんモチーフは、一般的には、該α-らせんモチーフが、α-らせんターンが溶液中で形成されるように、十分な数のアミノ酸残基を含む限り、C-末端までおよしそれを含むいずれかの点まで、天然PPファミリーポリペプチドの大体残基14に対応するアミノ酸から延長することができる。また、α-らせんターンが溶液中で依然として形成される限り、天然PPファミリー配列に対するアミノ酸置換、挿入および欠失を含むことができる。C-末端テイルモチーフは、一般に、天然PPファミリーポリペプチドのほぼ最後の10残基、より好ましくは天然PPファミリーポリペプチドの最後の7、6、または5残基、より好ましくはアミノ酸残基32ないし35に対応するアミノ酸を含む。
好ましいPYYアナログは、ポリプロリンモチーフおよび／またはC-末端テイルモチーフに対応しないPYY分子の領域において内部欠失、挿入、および置換を有するものを含む。例えば、位置4、6、7、9、または10での内部欠失が予想される。
インクレチンおよびインクレチンミメティクス
また、本発明において有用な構成ペプチドホルモンは、GLP-1ペプチドホルモンを含む。GLP-1(1-37)、GLP-1(7-37)、およびGLP-1(7-36)アミドを含む天然GLP-1ペプチドホルモは、機能的ペプチドアナログおよび誘導体のように、当該分野で知られる。本明細書において使用されるように、GLP-1は、GLP-1ペプチドホルモンの全天然形態を指す。特定の好ましい天然ペプチド、ペプチドアナログおよび誘導体は、本明細書中に記載されるが、当該分野で知られるホルモン活性を呈するいずれかの既知のGLP-1ペプチドを本発明と併せて使用し得ることが認識されるべきである。
当該分野で知られるいずれかのGLP-1ペプチドアナログまたは誘導体は、本発明と併せて使用することができる。１つの具体例において、該GLP-1ペプチドアナログおよび誘導体は、天然GLP-1ペプチドの少なくとも１つのホルモン活性を有する。特定の具体例において、該GLP-1ペプチドアナログは、天然GLP-1ペプチドが特異的に結合することが可能な受容体のアゴニストである。好ましいGLP-1ペプチドアナログおよび誘導体は、本明細書中に引用によって援用される例えば、WO 91/11457に記載のものを含む。
当該分野で知られるGLP-1アナログは以下のものを含む:
Figure 2011219488
当該分野で知られるように、そのようなGLP-1アナログは、好ましくはアミド化されてもよいが、本発明の文脈内では、特記されない限り、所望により、酸形態であってもよい。
他のGLP-1アナログおよび誘導体は、本明細書中に引用によって援用されるU.S. Pat. No. 5,545,618に開示される。GLP-1アナログおよび誘導体の好ましい基は、その全文において本明細書中に引用によって援用されるU.S. Patent No. 6,747,006に開示されるものを含む。引用によって明白に援用されるU.S. Pat. No. 5,188,666に記載の分子の本発明における使用もまた考えられる。本発明における使用のための分子のもう１つの基は、本明細書中に引用によって明白に援用されるU.S. Pat. No. 5,512,549に記載の化合物を含む。本発明における使用のためのGLP-1化合物のもう１つの好ましい基は、本明細書中に引用によって援用されるWO 91/11457に開示される。
また、本発明において有用な構成ペプチドホルモンは、GLP-2ペプチドホルモンを含む。例えば、雄牛GLP-2、ブタGLP-2、デグーGLP-2、ウシGLP-2、モルモットGLP-2、ハムスターGLP-2、ヒトGLP-2、ニジマスGLP-2、およびトリGLP-2を含むラットGLP-2およびその相同物といった天然GLP-2ペプチドホルモンは、機能的ペプチドアナログおよび誘導体のように、当該分野で知られる。特定の好ましい天然ペプチド、ペプチドアナログおよび誘導体は、本明細書中に記載されるが、当該分野で知られるホルモン活性を呈するいずれかの既知のGLP-2ペプチドが本発明と併せて使用されてもよいことは認識されるべきである。
当該分野で知られるいずれかのGLP-2ペプチドアナログまたは誘導体は、本発明と併せて使用され得る。１つの具体例において、該GLP-2ペプチドアナログおよび誘導体は、天然GLP-2ペプチドの少なくとも１つのホルモン活性を有する。特定の具体例において、該GLP-2ペプチドアナログは、天然GLP-2ペプチドが特異的に結合することが可能な受容体のアゴニストである。好ましいGLP-2ペプチドアナログおよび誘導体は、両方とも本明細書中に引用によって援用される例えば、U.S. Ser. No. 08/669,791およびPCT Application PCT/CA97/00252に記載のものを含む。当該分野で知られる特異的なGLP-2アナログは:位置2にて改変されて、GlyをAlaと置換することによってDPP-IV耐性を授与するラットまたはヒトGLP-2を含む。
また、本発明において有用な構成ペプチドホルモンは、オキシントモジュリン(OXM)ペプチドホルモンを含む。天然OXMペプチドホルモンは、機能的ペプチドアナログおよび誘導体のように、当該分野で知られる。特定の好ましい天然ペプチド、ペプチドアナログおよび誘導体は、本明細書中に記載されるが、当該分野で知られるホルモン活性を呈するいずれかの既知のOXMペプチドが、本発明と併せて使用され得ることが認識されるべきである。
当該分野で知られるいずれかのOXMペプチドアナログまたは誘導体は、本発明と併せて使用されてもよい。１つの具体例において、該OXMペプチドアナログおよび誘導体は、天然OXMペプチドの少なくとも１つのホルモン活性を有する。特定の具体例において、該OXMペプチドアナログは、天然OXMペプチドが特異的に結合することが可能な受容体のアゴニストである。
また、本発明において有用な構成ペプチドホルモンは、エキセンディンペプチドホルモンを含む。天然エキセンディンペプチドホルモンは、機能的ペプチドアナログおよび誘導体のように、当該分野で知られる。特定の好ましい天然ペプチド、ペプチドアナログおよび誘導体は本明細書中に記載されうが、当該分野で知られるホルモン活性を呈するいずれかの既知のエキセンディンペプチドが、本発明と併せて使用され得ることが認識されるべきである。
当該分野で知られるいずれかのエキセンディンペプチドアナログまたは誘導体は、本発明と併せて使用されてもよい。１つの具体例において、該エキセンディンペプチドアナログおよび誘導体は、天然エキセンディンペプチドの少なくとも１つのホルモン活性を有する。特定の具体例において、該エキセンディンペプチドアナログは、天然エキセンディンペプチドが特異的に結合することが可能な受容体のアゴニストである。
好ましいエキセンディンアナログは以下のものを含む:
Figure 2011219488
当該分野で知られるように、そのようなエキセンディンアナログはアミド化されてもよいが、本発明の文脈内では、特記されない限り、所望により酸形態であってもよい。
さらなる例示的エキセンディンアナログおよび誘導体は、両方とも本明細書中に引用によって援用される1997年８月8日に出願されたU.S. patent application Ser. No. 60/055,404の利益を主張する"Novel Exendin Agonist Compounds"と題された1998年８月6日に出願されたPCT Application Serial No. PCT/US98/16387に記載される。他のエキセンディンアナログおよび誘導体は、両方とも本明細書中に引用によって援用される1997年１１月14日に出願されたU.S. Provisional Application No. 60/065,442の利益を主張する"Novel Exendin Agonist Compounds"と題された1998年１１月13日に出願されたPCT Application Serial No. PCT/US98/24210に記載される。さらに他のエキセンディンアナログおよび誘導体は、両方とも本明細書中に引用によって援用される1997年１１月14日に出願されたU.S. Provisional Application No. 60/066,029の利益を主張する"Novel Exendin Agonist Compounds"と題された1998年１１月13日に出願されたPCT Application Serial No. PCT/US98/24273に記載される。さらに他のエキセンディンアナログおよび誘導体は、両方とも本明細書中に引用によって援用される1996年８月8日に出願されたU.S. patent application Ser. No. 08/694,954の一部継続である"Methods for Regulating Gastrointestinal Activity"と題された1997年８月8日に出願されたPCT Application Serial No. PCT/US97/14199に記載される。さらに他のエキセンディンアナログおよび誘導体は、両方とも本明細書中に引用によって援用される1997年１月7日に出願されたU.S. Provisional Application No. 60/034,905に対して優先権を主張する"Use of Exendins and Agonists Thereof for the Reduction of Food Intake"と題された1998年１月7日に出願されたPCT Application Serial No. PCT/US98/00449に記載される。さらに他のエキセンディンアナログおよび誘導体は、本明細書中に引用によって援用される"Compositions for the Treatment and Prevention of Neuropathy"と題された2003年１２月19日に出願されたUS 2004/0209803 A1に記載される。
生理活性ペプチドホルモンモジュール
上記で論議のように、本発明のハイブリッドポリペプチドは、一般的には、共有結合した少なくとも２つの生理活性ペプチドホルモンモジュールを含む。生理活性ペプチドホルモンモジュールは:(a)天然構成ペプチドホルモン、(b)ホルモン活性を保持する天然構成ペプチドホルモンのアナログまたは誘導体、(c)ホルモン活性を保持する天然構成ペプチドホルモンの断片、(d)ホルモン活性を保持する天然構成ペプチドホルモンのアナログまたは誘導体の断片、(e)所望の化学安定性、立体配座の安定性、代謝的安定性、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、または他の薬物動態特徴をハイブリッドポリペプチドに与える天然構成ペプチドホルモンの構造モチーフ;または(f)所望の化学安定性、立体配座の安定性、代謝的安定性、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、または他の薬物動態特徴をハイブリッドポリペプチドに与える天然構成ペプチドホルモンのアナログまたは誘導体の構造モチーフであってもよい。該構造モチーフ(e)および(f)は、集合的に、本明細書において、「ペプチドエンハンサー」と呼ばれるであろう。
好ましい生理活性ペプチドホルモンモジュールは: アミリン、ADM、CT、CGRP、インテルメジン、CCK(1-33)、CCK-8、レプチン、PYY(1-36)、PYY(3-36)、GLP-1(1-37)、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)、GLP-2、OXM、エキセンディン-3、およびエキセンディン-4から選択される天然ペプチドホルモンを含む。
他の好ましい生理活性ペプチドホルモンモジュールは: アミリン、ADM、CT、CGRP、インテルメジン、CCK、レプチン、PYY(1-36)、PYY(3-36)、GLP-1(1-37)、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)、GLP-2、OXM、エキセンディン-3、およびエキセンディン-4から選択される構成ペプチドホルモンのアナログおよび誘導体を含み、ここに該アナログまたは誘導体は、構成ペプチドホルモンの少なくとも１つのホルモン活性を呈する。該アナログは、構成ペプチドホルモンのアミノ酸配列の１以上の挿入、欠失、または置換を含んでもよく、該誘導体は、本明細書中により完全に記載され、当該分野で知られるアナログまたは構成ペプチドホルモンのアミノ酸残基の１以上の化学的修飾を含んでもよい。
より具体的には、アナログおよび誘導体は、いずれかの上記および／または当該分野で知られるものから選択されてよい。本発明の生理活性ペプチドホルモンモジュールとして有用な少なくとも１つのホルモン活性を呈する特に好ましいアナログおよび誘導体は以下のものを含む:
Figure 2011219488
当該分野で知られるように、そのようなペプチド化合物はアミド化されてもよいが、本発明の文脈内では、特記されない限り、所望により、酸形態であってもよい。
さらに他の好ましい生理活性ペプチドホルモンモジュールは:アミリン、ADM、CT、CGRP、インテルメジン、CCK、レプチン、PYY(1-36)、PYY(3-36)、GLP-1(1-37)、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)、GLP-2、OXM、エキセンディン-3、およびエキセンディン-4から選択される構成ペプチドホルモンの断片を含み、ここに、該断片は、該構成ペプチドホルモンの少なくとも１つのホルモン活性を呈する。
さらに他の好ましい生理活性ペプチドホルモンモジュールは:アミリン、ADM、CT、CGRP、インテルメジン、CCK、レプチン、PYY(1-36)、PYY(3-36)、GLP-1(1-37)、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)、GLP-2、OXM、エキセンディン-3、およびエキセンディン-4から選択される構成ペプチドホルモンのアナログまたは誘導体の断片を含み、ここに、該断片は、該構成ペプチドホルモンの少なくとも１つのホルモン活性を呈する。再び、該アナログは、該構成ペプチドホルモンの該アミノ酸配列の１以上の挿入、欠失、または置換を含んでもよく、該誘導体は、本明細書中により完全に記載され、当該分野で知られるように、アナログまたは構成ペプチドホルモンのアミノ酸残基の１以上の化学的修飾を含んでもよい。
少なくとも１つのホルモン活性を呈する特定の好ましい断片は以下のものを含む。しかしながら、下記の該好ましい断片を含む、当該分野で知られる断片と上記のアナログおよび誘導体の組合せが考えられることが理解されるべきである。
Figure 2011219488
再び、当該分野で知られるように、そのようなペプチド化合物は、好ましくはアミド化されてもよいが、本発明の文脈内では、特記されない限り、所望により、酸形態であってもよい。さらに、上記の好ましい断片は、本明細書中で論議されるまたは当該分野で知られる該アナログまたは誘導体のいずれかと組み合わせてもよい。例えば、好ましいアナログ断片は、5Ala,14Leu,25Phe-エキセンディン-4(1-28)、14Leu,25Phe-エキセンディン-4(1-27)、5Ala,14Leu,25Phe-エキセンディン-4(1-28)、14Leu,25Phe-エキセンディン-4(1-27)、または該開示された断片、アナログ、および誘導体のいずれかの他の組合せを含んでもよい。
さらに他の好ましい生理活性ペプチドモジュールは、「ペプチドエンハンサー」、つまり、該ハイブリッドポリペプチドに所望の化学安定性、立体配座の安定性、代謝安定性、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、および／または他の薬物動態特徴を与える（そのアナログおよび誘導体を含む）構成ペプチドホルモンの構造モチーフを含む。例示的ペプチドエンハンサーは、以下のものを含む。再び、以下の生理活性ペプチドモジュールと上記アナログおよび誘導体の組合せが考えられることが理解されるべきである。例えば、当該分野で知られおよび／または上記のアミリンファミリーペプチドホルモンアナログおよび誘導体の該最後の６つのアミノ酸残基もまた、好ましい生理活性ペプチドモジュールとして考えられる。
Figure 2011219488
ペプチドモジュール選択考慮、スペーサー、および結合基
本発明の該ハイブリッドポリペプチドは、一般的には、本発明の少なくとも２つの生理活性ペプチドホルモンモジュールを含み、ここに該生理活性ペプチドホルモンモジュールのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのホルモン活性を呈する。該少なくとも１つのホルモン活性を呈する該生理活性ペプチドホルモンモジュールは、ハイブリッドポリペプチドのN-末端、ハイブリッドポリペプチドのC-末端に位置することができ、あるいはハイブリッドポリペプチドが２を超える生理活性ペプチドホルモンモジュールを含む場合は、ハイブリッドポリペプチドの内部に位置することができる。
特定の具体例において、該生理活性ペプチドホルモンモジュールの該C-末端がアミド化されるように、該少なくとも１つのホルモン活性を呈する該生理活性ペプチドホルモンモジュールを配置することが好ましいかもしれない。該生理活性ペプチドホルモンモジュールの該C-末端のアミド化は、該ハイブリッドペプチドの該C-末端に該モジュールを配置することによって、あるいは該ハイブリッドポリペプチドの該N-末端にC-末端ないしN-末端方向にモジュールを構成することによって達成され得る。両方の構成において、該生理活性ペプチドホルモンモジュールの該C-末端は、アミド化に入手可能である。C-末端アミド化が存在し得る特異的な構成ペプチドホルモンは、好ましくは、アミリンファミリーペプチドホルモン、CCK、PYY、hGLP-1(7-36)およびhGLP-2を含む。C-末端アミド化が特に好ましいわけではない（別段の定めをした場合、該モジュールの該C-末端での延長は容易に許容される）特異的な構成ペプチドホルモンは、エキセンディン-4、エキセンディン-4(1-28)、GLP-1(7-37)、カエルGLP-1(7-36)、およびカエルGLP-2を含む。しかしながら、もしこれらの構成ペプチドホルモンが該ハイブリッドポリペプチドの該C-末端に位置するなら、それらは、所望によりアミド化されてもよく、実際、好ましくは所望によりアミド化されてもよい。
生理活性ペプチドホルモンモジュールは、当該分野で知られるいずれかの手段で共有結合されてもよい。安定した結合が使用されてもよく、あるいは開裂可能な結合が使用されてもよい。１つの具体例において、第１のモジュールのカルボキシは、第２のモジュールの該アミノに直接的に結合し得る。もう１つの具体例において、連結基を使用して、モジュールを結合してもよい。さらに、所望により、当該分野で知られるスペーサーまたはターンインデューサーを使用して、該結合を安定化してもよい。一例として、該N-末端に位置した生理活性ペプチドホルモンモジュールの該C-末端のアミド化が望ましくない場合、該モジュールを、第２のモジュールに、直接的に、またはアルキル; PEG; アミノ酸、例えば、Lys、Glu、β-Ala; ポリアミノ酸、例えば、ポリ-his、ポリ-arg、ポリ-lys、ポリ-ala、Gly-Lys-Arg (GKR)等; 二官能性リンカー (例えば、Pierce catalog, Rockford, Il参照); アミノカプロイル (「Aca」)、β-アラニル、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタノイル、または当該分野で知られる他の開裂可能なおよび開裂できないリンカーのような当該分野で知られるいずれかの適切な連結基を用いて、付着させてもよい。
N-末端に位置した生理活性ペプチドホルモンモジュールの該C-末端のアミド化が望ましい場合、該モジュールを、再び、当該分野で知られるいずれかの適切な連結基を用いて、第２のモジュールに付着させてもよい。より具体的には、少なくとも１つのホルモン活性を呈する生理活性ペプチドホルモンモジュールが、C-末端ないしN-末端方向に構成されていて、アミノ間結合が生じた場合、好ましい連結基は、ジカルボン酸、アルキル、PEG、およびLys、Cys、およびGluのようなアミノ酸を含む。
上記で言及したように、該ハイブリッドポリペプチドは、また、好ましくは、スペーサーを含んで、該生理活性ペプチドホルモンモジュールの結合をさらに安定化させてもよい。当該分野で知られるいずれかのスペーサーまたはターンインデューサーを使用してもよい。一例として、好ましいβターンミメティクスは、下記に示す模倣体Aおよび模倣体B、またAla-AibおよびAla-Proジペプチドを含む。
Figure 2011219488
例示的組合せおよび特異的な具体例
本発明の該ハイブリッドポリペプチドを形成するための生理活性ペプチドホルモンモジュールの例示的組合せは:天然ペプチドホルモン、少なくとも１つのホルモン活性を呈するペプチドホルモンのアナログおよび誘導体、少なくとも１つのホルモン活性を呈する天然ペプチドホルモンの断片、少なくとも１つのホルモン活性を呈するペプチドホルモンのアナログおよび誘導体の断片、およびペプチドエンハンサーから選択される２以上の生理活性ペプチドホルモンモジュールの組合せを含み、但し、少なくとも１つのモジュールは少なくとも１つのホルモン活性を呈する。
本発明の該ハイブリッドポリペプチドは、少なくとも２つの生理活性ペプチドホルモンモジュールを含み、ここに、各モジュールは構成ペプチドホルモンからなる。本発明の文脈において、該ハイブリッドポリペプチドの該構成ペプチドホルモンは、同一であっても異なっていてもよく、但し該構成ペプチドホルモンのうちの少なくとも２つは異なっている。好ましい具体例において、該構成ペプチドホルモンの少なくとも２つは、例えば、該アミリンファミリー、CCK、該レプチンファミリー、PPF、該プログルカゴンファミリー、および該エキセンディンファミリーといった異なるペプチドホルモンファミリーからである。
特定の具体例において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、少なくとも１つのホルモン活性を呈する２以上のモジュールを含み得る。例えば、該ハイブリッドポリペプチドは、少なくとも１つのさらなるペプチドホルモンアナログの断片に共有結合した少なくとも１つのホルモン活性を呈する第１のペプチドホルモンまたはアナログの断片を含み得る。（複数の）さらなる断片は、所望により、少なくとも１つのホルモン活性を呈してもよい。該第１のペプチドホルモンは、（複数の）さらなるペプチドホルモンと同一であっても異なっていてもよく、但し、少なくとも１つの該さらなるペプチドホルモンは、該第１のペプチドホルモンと異なり、該第１のホルモン活性は、該所望のさらなるホルモン活性と同一または異なっていてもよい。
他の具体例において、本発明の該ハイブリッドポリペプチドは、１以上のペプチドエンハンサーモジュールと組み合わせて、少なくとも１つのホルモン活性を呈する１以上のモジュールを含み得る。例えば、少なくとも１つのホルモン活性を呈する第１のペプチドホルモンの断片を、ペプチドエンハンサーに共有結合してもよく、あるいは少なくとも１つのホルモン活性を呈する第１のペプチドホルモンの断片を、代わりにペプチドエンハンサーに結合された少なくとも１つのホルモン活性を呈する第２のペプチドホルモンに共有結合してもよい。別法として、ペプチドエンハンサーは、安定化するスペーサーとして、２つのペプチドホルモンモジュールの間に位置していてもよい。再び、該第１のペプチドホルモンは、該第２のペプチドホルモンと同一または異なっていてもよく、該第１のホルモン活性は、該第２のホルモン活性と同一または異なっていてもよい。
もう１つの具体例において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、２、３、４、またはそれ以上の生理活性ペプチドホルモンモジュールを含み得る。例示的組合せは、１、２、または３つのペプチドエンハンサーと組合せたホルモン活性を有するモジュール;１または２つのペプチドエンハンサーと組合せたホルモン活性を有する２つのモジュール;１つのペプチドエンハンサー等と組合せたホルモン活性を有する３つのモジュールを含む。
該構成ペプチドホルモンは、好ましくは、アミリン、アドレノメデュリン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、インテルメジン、コレシストキニン、レプチンペプチドYY、グルカゴン様ペプチド-1、グルカゴン様ペプチド2、オキシントモジュリン、またはエキセンディン-4から選択される。
より具体的には、好ましいモジュール組合せは、該構成ペプチドホルモンとして、エキセンディン、アミリン、およびPYYの組合せを含むものを含む。特定の組合せは、スペーサーまたは結合基あるなしで、エキセンディン-4/PYYおよびPYY/エキセンディン-4の組合せを含む。他の組合せは、スペーサーまたは結合基あるなしで、エキセンディン/アミリンおよびアミリン/エキセンディン組合せを含む。さらに他の組合せは、スペーサーまたは連結基あるなしで、アミリン/PYYおよびPYY/アミリン組合せを含む。
１つの態様において、好ましいモジュールの組合せは、エキセンディン-4を含む第１のモジュール、少なくとも１つのホルモン活性を呈するエキセンディン-4の断片、少なくとも１つのホルモン活性を呈するエキセンディン-4アナログまたは誘導体、または少なくとも１つのさらなる生理活性ペプチドホルモンモジュールと併せて少なくとも１つのホルモン活性を呈するエキセンディン-4アナログの断片を含む第１のモジュールを含むものを含む。１つの具体例において、該第１のモジュールは、１、２、または３つのさらなる生理活性ペプチドホルモンモジュールに結合する。
好ましい具体例において、エキセンディン-4ペプチドを含む第１のモジュールは、少なくとも１つのホルモン活性を呈するアミリンペプチドを含む第２の生理活性ペプチドホルモンモジュールに連結される。もう１つの具体例において、該第２のモジュールは、さらに、少なくとも１つのホルモン活性を呈するカルシトニンペプチドを含む第３の生理活性ペプチドホルモンモジュールに連結される。さらにもう１つの具体例において、該第３のモジュールは、アミリンペプチドから選択されたペプチドエンハンサーを含む第４の生理活性ペプチドホルモンモジュールに連結されてもよい。１つの具体例において、該第１のモジュールは、該ハイブリッドポリペプチドの該C-末端に位置していてもよい。別法として、該第１のモジュールは、該ハイブリッドポリペプチドの該N-末端に位置していてもよい。特定の具体例において、βAlaのようなスペーサーまたはリンカーは、所望により、挿入されて、該モジュールを連結してもよい。
好ましいエキセンディン-4 ペプチドは:エキセンディン-4、エキセンディン-4(1-27)、エキセンディン-4(1-28)、14Leu,25Phe-エキセンディン-4(1-28)、および5Ala,14Leu,25Phe-エキセンディン-4(1-28)を含む。少なくとも１つのホルモン活性を呈する好ましいアミリンペプチドは、アミリン、アミリン(1-17)、アミリン(1-16)、アミリン(1-15)、およびアミリン(1-7)のようなアミリン断片、およびプラムリンタイド（pramlintide）、2Ala-h-アミリン、2,7Ala-h-アミリン、およびその断片のようなアミリンアナログを含む。少なくとも１つのホルモン活性を呈する好ましいカルシトニンペプチドは、sCT、sCT(8-10)、sCT(8-27)のようなsCT断片、および18Arg-sCT、14Gln,18Arg-sCT、14Gln,11,18Arg-sCT、およびその断片のようなカルシトニンアナログを含む。好ましいアミリンペプチドエンハンサーは、アミリン(32-37)、アミリン(33-37)、およびアミリン(34-37)、およびそのアナログを含む。本発明と関連して有用なAmylin/sCT組合せは、引用によって本明細書中に援用される同時出願されたPCT/US05/[XXXXX], Amylin Family Agonist, 代理人整理番号 18528.835に開示のものを含む。
１つの態様において、好ましいモジュールの組合せは、エキセンディン-4、少なくとも１つのホルモン活性を呈するエキセンディン-4の断片、少なくとも１つのホルモン活性を呈するエキセンディン-4アナログまたは誘導体、またはペプチドエンハンサーと組合せた少なくとも１つのホルモン活性を呈するエキセンディン-4 アナログの断片を含む第１のモジュールを含むものを含む。好ましいエキセンディン-4化合物は: エキセンディン-4、エキセンディン-4(1-27)、エキセンディン-4(1-28)、14Leu,25Phe-エキセンディン-4(1-28)、および5Ala,14Leu,25Phe-エキセンディン-4(1-28)を含む。好ましいペプチドエンハンサーは: PYY(25-36)、PYY(30-36)およびPYY(31-36)を含む。１つの具体例において、該第１のモジュールは、該ハイブリッドポリペプチドの該C-末端に位置し、該ペプチドエンハンサーは、該ハイブリッドポリペプチドの該N-末端に位置する。別法として、該第１のモジュールは、該ハイブリッドポリペプチドの該N-末端に位置していてもよく、該ペプチドエンハンサーは、該ハイブリッドポリペプチドの該C-末端に位置していてもよい。特定の具体例において、βAlaのようなスペーサーまたはリンカーは、所望により、該モジュールを結合するように挿入されてもよい。
もう１つの態様において、好ましいモジュール組合せは、エキセンディン-4、少なくとも１つのホルモン活性を呈するエキセンディン-4の断片、少なくとも１つのホルモン活性を呈するエキセンディン-4アナログまたは誘導体、またはCCK、少なくとも１つのホルモン活性を呈するCCKの断片、少なくとも１つのホルモン活性を呈するCCKアナログまたは誘導体、または少なくとも１つのホルモン活性を呈するCCKアナログの断片を含む第２のモジュールと組み合わされた少なくとも１つのホルモン活性を呈するエキセンディン-4アナログの断片を含む第１のモジュールを含むものを含む。再び、好ましいエキセンディン-4は：エキセンディン-4、エキセンディン-4(1-27)、エキセンディン-4(1-28)、14Leu,25Phe-エキセンディン-4(1-28)、5Ala,14Leu,25Phe-エキセンディン-4(1-28)、および14Leu-エキセンディン-4(1-28)を含む。好ましいCCK化合物は:CCK-8、およびCCK-8(Phe(CH2SO3))を含む。１つの具体例において、該第１のモジュールは、該ハイブリッドポリペプチドの該C-末端に位置し、該第２のモジュールは該ハイブリッドポリペプチドの該N-末端に位置する。別法として、該第１のモジュールは、該ハイブリッドポリペプチドの該N-末端に位置していてもよく、該ペプチドエンハンサーは、該ハイブリッドポリペプチドの該C-末端に位置していてもよい。特定の具体例において、βAlaのようなスペーサーまたはリンカーは、所望により、該モジュールに結合するように挿入してもよい。
もう１つの態様において、好ましいモジュールの組合せは、アミリン、少なくとも１つのホルモン活性を呈するアミリンの断片、少なくとも１つのホルモン活性を呈するアミリンアナログまたは誘導体、またはPYY(25-36)または PYY(30-36)のようなペプチドエンハンサーを含む第２のモジュールと組合せた少なくとも１つのホルモン活性を呈するアミリンアナログの断片を含む第１のモジュールを含むものを含む。１つの具体例において、該第１のモジュールは、該ハイブリッドポリペプチドの該C-末端に位置し、該ペプチドエンハンサーは、該ハイブリッドポリペプチドの該N-末端に位置する。別法として、該第１のモジュールは、該ハイブリッドポリペプチドの該N-末端に位置していてもよく、該ペプチドエンハンサーは該ハイブリッドポリペプチドの該C-末端に位置していてもよい。特定の具体例において、βAlaのようなスペーサーまたはリンカーは、所望により、該モジュールを結合するように挿入されてもよい。
他の好ましいモジュールの組合せは、三級組合せとして、エキセンディンおよびCCKまたはアミリン、カルシトニン、およびCCKの組合せを含むものを含む。特定の組合せは、スペーサーまたはリンカーおよび連結基あるなしで、エキセンディン/CCKおよびCCK/エキセンディンを含む。他の組合せは、スペーサーまたは連結基あるなしで、CCK/アミリン/カルシトニンおよびCCK/アミリン/カルシトニン/アミリンを含む。各モジュールは、独立して、ペプチドエンハンサーであってもよく、あるいは、該ハイブリッドポリペプチドの所望の特性によって、ホルモン活性を呈してもよい。
さらに他の好ましいモジュールの組合せは、三級および四級ハイブリッド分子として、エキセンディン、アミリンおよびカルシトニンの組合せを含む組合せを含むものを含む。例示的組合せは、スペーサーまたは連結基あるなしで、エキセンディン/アミリン/カルシトニン; エキセンディン/アミリン/カルシトニン/アミリン; アミリン/カルシトニン/エキセンディン;およびアミリン/カルシトニン/アミリン/エキセンディンの組合せを含む。各モジュールは、独立して、ペプチドエンハンサーであってもよく、あるいは、該ハイブリッドポリペプチドの該所望の特性によって、ホルモン活性を呈し得る。
１つの具体例において、少なくとも１つのホルモン活性を呈する（複数の）生理活性ペプチドホルモンモジュールが、アミリンまたはアナログまたはその断片であり、第２の生理活性ペプチドホルモンモジュールがCCKを含む時、該ハイブリッドポリペプチドは、好ましくは、異なる構成ペプチドホルモンから選択された第３の生理活性ペプチドホルモンモジュールを含むべきである。例示的な第３の生理活性ペプチドホルモンモジュールは、カルシトニン、より好ましくはサケカルシトニン、アナログまたはその断片を含む。
もう１つの具体例において、少なくとも１つのホルモン活性を呈する（複数の）生理活性ペプチドホルモンモジュールが、アミリンまたはアナログまたはその断片であり、第２の生理活性ペプチドホルモンモジュールがCTを含む時、該ハイブリッドポリペプチドは、好ましくは、異なる構成ペプチドホルモンから選択される第３の生理活性ペプチドホルモンモジュールを含むべきである。例示的第３の生理活性ペプチドホルモンモジュールは、エキセンディン-4、アナログまたはその断片を含む。
さらにもう１つの具体例において、少なくとも１つのホルモン活性を呈する（複数の）生理活性ペプチドホルモンモジュールのうちの１つが、GLP-1またはアナログまたはその断片であり、第２の生理活性ペプチドホルモンモジュールが、エキセンディン断片を含むペプチドエンハンサーである時、該ハイブリッドポリペプチドは、好ましくは、第３の生理活性ペプチドホルモンモジュールを含むべきである。例示的な第３の生理活性ペプチドホルモンモジュールは、（アナログ、誘導体およびその断片を含む）PYYおよび（アナログ、誘導体およびその断片を含む）CCKを含む。
該上記の好ましい組合せの各々において、構成ペプチドホルモンへの言及は、アナログ、誘導体、断片、ならびにそれに関連したペプチドエンハンサーへの言及を含む。
好ましい態様において、該ハイブリッドポリペプチドは以下のものを含む:
Figure 2011219488
Figure 2011219488
また、本発明の該ハイブリッドポリペプチドは、そのようなハイブリッドポリペプチドおよびそのいずれかの組合せのような該アミノ酸配列への置換、欠失、および挿入を含むが、これらに限定されるものではないさらなる修飾を含み得る。好ましい態様において、本発明の該ハイブリッドポリペプチドは、「非必須」アミノ酸残基の１以上の修飾を含む。本発明の文脈において、「非必須」アミノ酸残基は、該ハイブリッドポリペプチドの該構成ペプチドホルモン受容体アゴニスト活性を消滅させるまたは実質的に減少させることなしに、該断片、例えば、該構成ペプチドホルモン断片の天然ヒトアミノ酸配列において、改変、つまり、欠失または置換することができる残基である。
好ましい置換は、保存されたアミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」は、該アミノ酸残基が、同様の側鎖、または物理化学特徴（例えば、静電、水素結合、等比体積、疎水性特徴）を有するアミノ酸残基によって置換されるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で知られている。これらのファミリーは、塩基性側鎖 (例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖 (例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、荷電されていない極性側鎖 (例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、メチオニン、システイン)、非極性側鎖 (例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン)、β-分岐側鎖 (例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖 (例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。
また、本発明は、該ハイブリッドポリペプチドの誘導体に関する。そのような誘導体は、ポリエチレングリコール (「PEG」)または種々の長さの脂肪酸鎖(例えば、ステアリル、パルミトイル、オクタノイル等)のような１以上の水溶性ポリマー分子にコンジュゲートした、あるいはpoly-his、poly-arg、poly-lys、およびpoly-alaのようなポリアミノ酸の付加によるハイブリッドポリペプチドを含む。また、該ハイブリッドポリペプチドへの修飾は、短いアルキルおよび拘束されたアルキル(例えば、分岐鎖、環化、縮合、アダマンチル)のような小分子置換基、および芳香族基を含み得る。該水溶性ポリマー分子は、好ましくは、約500ないし約20,000ダルトンの範囲の分子量を有するであろう。
そのようなポリマー結合および小分子置換基修飾は、該ハイブリッドポリペプチドの配列内のN-またはC-末端にてまたはアミノ酸残基の側鎖にて、単独で起こり得る。別法として、ハイブリッドポリペプチドに沿って、誘導化の複数部位が存在していてもよい。１以上のアミノ酸のリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステインによる置換は、誘導化のためのさらなる部位を提供し得る。例えば、U.S. Patent Nos. 5,824,784および 5,824,778参照。好ましくは、該ハイブリッドポリペプチドは、１，２、または３つのポリマー分子にコンジュゲートしてもよい。
該水溶性ポリマー分子は、好ましくは、アミノ、カルボキシル、またはチオール基に並べられ、NまたはC末端によって、またはリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステインの側鎖にて結合されてもよい。別法として、該水溶性ポリマー分子は、ジアミンおよびジカルボン酸と結合してもよい。好ましい具体例において、本発明の該ハイブリッドポリペプチドは、リジンアミノ酸上のイプシロンアミノ基を介して、１、２、または３つのPEG分子にコンジュゲートされる。
また、本発明のハイブリッドポリペプチド誘導体は、１以上のアミノ酸残基への化学的改変によるハイブリッドポリペプチドを含む。そのような化学的改変は、アミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化、および環化を含む。化学的改変は、該PPFハイブリッドポリペプチドの配列内のN-またはC-末端またはアミノ酸残基の側鎖にて、単独に生じ得る。１つの具体例において、これらのペプチドの該C-末端は、遊離-OHまたは-NH2基を有し得る。もう１つの具体例において、該N-末端は、イソブチルオキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、n-ブチルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、イソカプロイル基(isocap)、オクタニル基、オクチルグリシン基(G(Oct))、または8-アミノオクタン酸基によって閉じられていてもよい。好ましい具体例において、環化は、ジスルフィド橋の形成を介してであり得る。別法として、該ハイブリッドポリペプチドに沿って、化学的改変の複数部位が存在していてもよい。
本発明の該ハイブリッドポリペプチドの例は、配列表において提供され、下記の実施例セクションにおいてさらに論議される。
治療におけるハイブリッドポリペプチドの使用または代謝状態または障害の予防
本発明のもう１つの態様において、治療上または予防上有効量のハイブリッドポリペプチドを、その必要のある対象に投与することを特徴とする肥満を治療または予防するための方法が提供される。好ましい具体例において、該対象は肥満または標準体重を超えた対象である。「肥満」は、一般的には、30を超える肥満度指数として定義されるが、本開示の目的のために、肥満度指数が30未満のものを含む、体重を減らす必要のあるまたは減らしたいと思ういずれの対象も、「肥満」の範囲に含まれる。インスリン耐性、耐糖能異常、またはいずれかの形態の糖尿病（例えば、１型、２型または妊娠性糖尿病）患者は、本方法から利益を得ることができる。
本発明の他の態様において、食物摂取量を減少させる、栄養素利用性を減少させる、減量を招く、身体組成に影響を及ぼす、および身体エネルギー内容を改変するまたはエネルギー支出を増加させる、糖尿病を治療する、および（LDLコレステロールおよびトリグリセリドレベルを減少させるおよび／またはHDLコレステロールレベルを変化することを含む）脂質プロファイルを改善する方法が提供され、ここに該方法は、有効量の本発明のハイブリッドポリペプチドを対象に投与することを特徴とする。好ましい具体例において、治療上または予防上有効量の本発明のハイブリッドポリペプチドを該対象に投与することを特徴とする本発明の該方法を使用して、その必要のある対象において、栄養素利用性を減少することによって軽減することができる状態または障害を治療または予防する。そのような状態および障害は、高血圧、異常脂質血症、心疾患、摂食障害、インスリン耐性、肥満、およびいずれかの種類の糖尿病を含むが、これらに限定されるものではない。
理論によって制限されることを意図せずに、食物摂取量の低下、胃内容排出の遅延、栄養素利用性の低下、および減量の原因における本発明の末梢投与されたハイブリッドポリペプチドの効果は、PPファミリーでのものにおける、またはそれと同様な１以上のユニークな受容体クラスとの相互作用によって決定されると考えられる。より具体的には、PYY-優先(またはY7) 受容体と同様な受容体または複数の受容体が関与するようである。
本発明に有用なさらなるアッセイは、身体組成に対するPPF化合物の効果を決定することができるものを含む。例示的アッセイは、代謝性疾患に対する食餌性肥満(DIO)マウスモデルの利用を含むものであり得る。治療期間前に、雄のC57BL/6Jマウスに、生後4週目から6週間、高脂肪食餌を与えることができる (#D12331,脂肪から58%のカロリー; Research Diets, Inc.,)。研究の間、該マウスは、高脂肪食餌を食べ続けることができる。水は、研究を通して、自由に与えることができる。同様の年齢の非肥満マウスの１群に、DIO群と代謝パラメーターを比較する目的のため、低脂肪食餌を与えることができる(#D12329, 脂肪から11%のカロリー)。
DIOマウスに、ビヒクル(水中に50%ジメチルスルホキシド (DMSO))または本発明の化合物を送達するための皮下(SC)肩胛骨内浸透圧ポンプを移植することができる。後者の群のポンプは、例えば、1000 μg/kg/dの本発明の化合物を、7-28日間、いずれかの量送達するように設定することができる。
体重および食物摂取量を、研究期間を通して、定期的な間隔にわたり測定することができる。呼吸商(RQ, CO2生成÷O2消費量として定義される)および代謝率を、全動物間接熱量測定法を用いて決定することができる(Oxymax, Columbus Instruments, Columbus, OH)。該マウスを、イソフルラン過剰摂取によって安楽死させ、体脂肪蓄積（両側性精巣上体脂肪肉趾重量）の指数を測定することができる。さらに、精巣上体重量の決定の前に、各マウスに対する身体組成（脂肪の少ない質量含量、脂肪質量含量）を、製造者の取扱説明書(Lunar Piximus, GE Imaging System)に従い、二重エネルギーX線吸収(DEXA)装置を用いて分析することができる。本発明の方法において、本発明の好ましいPPFポリペプチドは、本明細書中に記載のアッセイのうちの１つ(好ましくは、食物摂取量、胃内容排出、膵臓分泌、減量または身体組成アッセイ)において、当該アッセイにおける構成ペプチドホルモンの有効性より大きい有効性を有するものである。
食物摂取量の減少、減量、または肥満の治療の結果としてのその必要のある対象における高血圧の改善に加えて、本発明の化合物を使用して、低血圧を治療してもよい。
また、本発明の化合物は、膵島または細胞において、グルコース応答性を強化する、誘発する、促進するまたは回復するのに有用であり得る。これらの活性は、上記およびU.S. patent application no. US20040228846に記載のもののような代謝障害と関連した状態を治療または予防するのに有用であり得る。そのような活性を決定するためのアッセイは、当該分野で知られている。例えば、（その全文において引用によって援用される）公開されたU.S. patent application no. US20040228846において、アッセイは、膵島単離および培養ならびに胎仔の膵島成熟を決定するために記載される。特許出願US20040228846の実施例において、膵臓ポリペプチド (PP)、神経ペプチドY (NPY)、神経ペプチド K (NPK)、PYY、分泌、グルカゴン-様ペプチド-1 (GLP-1)およびボンベシンを含む腸-由来ホルモンペプチドは、Sigmaから購入された。コラゲナーゼタイプXIは、Sigmaから入手した。RPMI 1640 培養媒体およびウシ胎仔血清を、Gibcoから入手した。抗インスリン抗体を含有するラジオイムノアッセイキット([125I]-RIAキット)を、Linco, St Louisから購入した。
産後ラット膵島を、P-02歳のラットから入手した。成体のラット膵島を、6-8週齢ラットから入手した。胎仔ラット膵島を、以下のように入手した。妊娠中の雌のラットを、妊娠e21目に屠殺した。胎仔を、子宮から除去した。10-14の膵臓を、各同腹仔から解剖し、Hanks緩衝液中で二度洗浄した。該膵臓をプールし、6 ml 1 mg/mlコラゲナーゼ(Type XI, Sigma)中で懸濁し、常に撹拌しながら、8-10分間、37℃にてインキュベートした。該温浸を、10容量の氷冷のHanks緩衝液を添加し、その後、Hanks緩衝液で三度洗浄することによって停止した。次いで、該膵島を、Ficollグラジエントによって精製し、1 μM IBMXの添加あるなしで、10%ウシ胎仔血清(FBS)/RPMI媒体中で培養した。５日目の終わりに、20膵島を、各管に手で掴んで入れ、静的インスリン放出につきアッセイした。一般的には、膵島を、まず、KRP緩衝液で洗浄し、次いで、常に撹拌しながら、37℃にて、30分間、3 mM (低)グルコースを含有する1 mlのKRP緩衝液でインキュベートする。上澄みを収集した後、次いで、該膵島を、37℃にて、１時間、17 mM (高)グルコースでインキュベートした。低または高グルコース刺激から放出されたインスリンを、該[125I]-RIAキットを用いてラジオイムノアッセイ(RIA)によってアッセイした。E21胎仔膵島を、200 ng/mlのPYY、PP、CCK、NPK、NPY、セクレチン、GLP-1またはボンベシンの存在下で、5日間培養した。
また、例示的インビボアッセイを、標準齧歯類ダイエットPurina 5008を与えられた全てのfa/fa雄において糖尿病を自然発生的に発現するZucker Diabetic Fatty(ZDF)雄のラット、同系交配(>F30世代)ラットモデルを用いて提供する。ZDF fa-fa雄において、高血糖は、生後約７週目に発達し始め、血糖値（食餌済み）は、典型的には、生後10ないし11週目までに、500 mg/DLに達する。インスリンレベル（食餌済み）は、糖尿病の発症の間、高い。しかしながら、生後19週目までに、インスリンは、脂肪の少ない対照同腹仔のうちの一匹のレベルまで落ちる。肥満のラットのトリグリセリドおよびコレステロールレベルは、脂肪の少ないものより通常高い。アッセイにおいて、6 ラット／群である３群の生後７週間のZDFラットに、14日間、ALZAポンプによる注入治療を行った: 1)ビヒクル対照、2)および3)、２つの異なる用量、それぞれ100 pmol/kg/hrおよび500 pmol/kg/hrによるPYY。４つの測定を、注入前および注入後7日目および14日目に採った：1) 血糖値、2) 血漿インスリンレベル、および3)血漿トリグリセリド (TG)レベル、ならびに経口的ブドウ糖負荷(OGTT)試験。従って、これらのアッセイを本発明の化合物と使用して、所望の活性につきテストすることができる。
該ハイブリッドポリペプチドについて考えられる他の使用は、アルツハイマー病を治療、予防、またはその発病を遅延するための中枢系におけるアルミニウム(Al)濃度を減少するための方法(その全文において引用によって援用されるU.S. Pat. 6,734,166参照)を含む。Alに対する効果を決定するためのアッセイは当該分野で知られ、２倍体およびTsマウスを用いるUS Pat 6,734,166で見つけることができる。これらのマウスを、個々に、Nalgene（登録商標）ブランドの代謝またはポリプロピレンケージに収容し、３日間かけて、実験前にケージに調整させた。マウスには、全く食物を与えなかった安楽死前の16時間を除く実験前に、食物(LabDiet（登録商標）NIHラットおよびMoust/Auto 6F5K52, St. Louis, Mo.)および水に自由なアクセスを与えた。マウスに、活性化合物または生理食塩水のいずれかを毎日皮下注射した。マウスを、１つの実験のために13日目の終わりに、およびもう一方の実験のために3日目に屠殺し、試料を収集した。マウス脳試料を、清潔なテフロンライナーにおいて重さを測り、低微量元素硝酸におけるマイクロ波分解による分析のために調製した。次いで、試料を、誘導結合プラズマ質量分析法を用いてAl含有量につき分析した(Nuttall et al., Annals of Clinical and Laboratory Science 25, 3, 264-271 (1995))。分析の間の全組織取り扱いは、HEPA空気ろ過システムを利用する清浄な室内環境下で行って、背景汚染を最小化した。
本発明の化合物は、広範囲の生物学的活性を呈し、いくつかはその分泌抑制および腸運動抑制特性に関連する。該化合物は、上皮細胞による直接的相互作用によってあるいは、恐らく、腸内分泌を刺激するホルモンまたは神経伝達物質の分泌を阻害することによって、消化管分泌物を抑制し得る。分泌抑制特性は、胃液分泌および／または膵液分泌の阻害を含み、胃炎、膵炎、バレット食道、および逆流性食道炎を含む疾患および障害の治療または予防に有用であり得る。
本発明の化合物は、過剰な腸電解質および水分泌ならびに例えば、伝染性下痢症、炎症性下痢症、短腸症候群、または例えば、回腸造瘻術といった外科手術後に典型的に生じる下痢症といった減少した吸収と関連した様々な胃腸障害の治療に有用である(例えば、Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill Inco, New York, 12th Ed.参照)。伝染性下痢症の例は、制限なしに、急性ウイルス性下痢、急性細菌性下痢（例えば、サルモネラ、カンピロバクター、およびロストリジウムまたは原虫感染）、あるいは旅行者下痢（例えば、ノーウォークウイルスまたはロタウイルス）を含む。炎症性下痢症の例は、制限なしに、吸収不良症候群、熱帯性スプルー、慢性膵炎、クローン病、下痢、および過敏性腸症候群を含む。また、本発明のペプチドを使用して、例えば、手術後またはコレラによる胃腸障害を含む緊急または生命にかかわる状況を治療することができる。
また、本発明の化合物は、単に腸損傷 (例えば、下痢)と関連した状態を治療するのではなく、腸損傷を治療または予防するのに有用であり得る。腸へのそのような損傷は、潰瘍性大腸炎、炎症性大腸炎、腸萎縮症、腸粘膜の喪失、および／または腸粘膜機能の喪失(その全文において引用によって援用されるWO 03/105763参照)であり得、あるいはその結果であり得る。そのような活性のためのアッセイは、WO 03/105763に記載のように、250-300グラムの範囲で、12:12明:暗サイクルに収容され、標準齧歯類食餌(Teklad LM 485, Madison, WI)および水に自由なアクセスを与えた生後11週間の雄のHSDラットを含む。該動物を、実験前の24時間絶食させた。慢性結腸炎症の単純かつ繁殖可能なラットモデルが、Morris GP, et al., "Hapten- induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon." Gastroenterology. 1989; 96:795-803によって予め記載されている。それは、比較的長い持続期間の炎症および潰瘍形成を呈して、特異的に制御された様式で、結腸炎症疾患の病態生理学を研究し、ヒトにおける炎症性大腸炎に潜在的に適用可能な新たな治療を評価するための機会を与える。
ラットに3%イソフルランで麻酔をかけ、37℃に設定された調節されたヒーティングパッド上に置いた。胃管栄養針を、結腸7 cmに経直腸的に挿入した。50%エタノール中に溶解したハプテントリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)を、Mazelin, et al., Juton Nerv Syst. 1998;73:38 45に記載のように、0 0.4-0.6 mLの総容量で、30 mg/kgの用量にて、該胃管栄養針を介して、該結腸の管腔に送達した。対照群に、食塩水(NaCl 0.9%)を結腸内投与した。
結腸炎の誘発４日後、結腸を麻酔下のラットから切除し、次いで、斬首によって安楽死させた。切除された結腸および脾臓の重量を測定し、該結腸を総形態的障害のスコアのために写真を撮った。炎症を、充血および腸壁肥厚の領域として定義した。
また、本発明のハイブリッドポリペプチドを使用して、膵臓腫瘍を治療または予防（例えば、膵臓腫瘍の増殖を阻害）し得る。本発明の方法は、腫瘍細胞の増殖を減少することを含む。本発明によって治療され得る良性膵臓腫瘍細胞のタイプは、漿液性嚢胞腺（serous cyst adenomas）、小嚢腫腫瘍、および固体嚢胞腫瘍を含む。また、該方法は、管、腺房、または膵臓の膵島から生じる癌のような悪性膵臓腫瘍細胞の増殖を減少するのにも有効である。U.S. Pat. 5,574,010 (その全文において引用によって援用される)は、増殖抑制作用をテストするための例示的アッセイを提供する。例えば、該‘010特許は、PANC-1および MiaPaCa-2が、American Type Culture Collection, ATCC (Rockville, Md.)のような供給者から商業的に入手可能である２つのヒト膵臓腺癌細胞系であることを提供する。該２つの腫瘍細胞を、NAPCO水ジャケット付き5 % CO2インキュベーターにおいて、摂氏37度にて、10%ウシ胎仔血清、29.2 mg/Lのグルタミン、25 μgゲンタマイシン、5 mlペニシリン、ストレプトマイシン、およびフンギゾン（fungizone）溶液(JRH Biosciences, Lenexa, Kans.)で補充されたRPMI-1640培養培地において成長させた。腫瘍細胞の融合性単層を達成する時、全細胞系統を、一週間に一度ないし二度、0.25 %トリプシン(Clonetics, San Diego, Calif.)で分離した。細胞を、摂氏4度にて、冷凍遠心器において、500 gにて、7分間ペレットし、トリプシンなしの強化されたRPMI 1640培養培地で再懸濁した。生存細胞を、トリパンブルーで、血球計算板スライド上で計数した。
各タイプの10,000、20,000、40,000および80,000細胞を、総容量200 ulの培養培地／ウェルにおいて、96ウェルミクロ培養プレート(Costar, Cambridge, Mass.)に添加した。細胞を、PYYまたはテストペプチドの添加前24時間付着させた。新鮮な培養培地を、ペプチドの添加前に交換した。PYYまたはテスト化合物による膵臓腫瘍細胞のインビトロインキュベーションを、長さ6時間および36時間続けた。PYYを、250 pmol、25 pmol、および2.5 pmol／ウェル(N =14)の用量にて、細胞に添加した。テスト化合物を、400 pmol、40 pmol、および4 pmol／ウェルの用量にて、細胞培養液に添加した。対照ウェルは、2 ulの0.9%生理食塩水を受け取って、付着した腫瘍細胞に対して容量および物理的かく乱を模倣した。各96ウェルプレートは、18の対照ウェルを含有して、実験の間、各プレート内で比較した。96ウェルプレートを、PANC-1およびMiaPaCa-2細胞の両方において、PYYおよびテスト化合物の変動する濃度で、6回繰り返した。
インキュベーション期間の終わりに、臭化3-(4,5-ジメチルチアゾリル-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム, MTr臭化テトラゾリウム (Sigma, St. Louis, Mo.)を、0.5 mg/mlにて、新鮮な培養培地に添加した。培養培地を交換し、腫瘍細胞を、37℃にて、MTT臭化テトラゾリウムによって、4時間インキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、培養培地を吸引した。ホルマゾン結晶沈殿を200 μlのジメチルスルホキシド (Sigma, St. Louis, Mo.)中に溶解した。溶解したホルマゾンの計量を、ELISAリーダー(Molecular Devices, Menlo Park, Calif.)上の500 nm波長にて吸収リーディングを得ることによって実施した。MTTアッセイは、ミトコンドリアのNADH依存性デヒドロゲナーゼ活性を測定し、それは、腫瘍細胞の定量的インビトロ化学療法応答に対する最も高感度かつ信用できる方法の中の１つである(Alley, M. C., et al., Cancer Res., 48:589-601, 1988; Carmichael, J., et al., Cancer Res., 47:936-942, 1987; McHale, A. P., et al., Cancer Lett., 41:315-321, 1988; and Saxton, R. E., et al., J. Clin. Laser Med. and Surg., 10(5):331-336, 1992.)。550 nmでの吸収リーディングの分析を、該同一のテスト状態のウェルをグループ分けし、一方向ANOVAによる対照および種々のペプチド濃度治療の間で生じる差を確証することによって分析した。
また、例示的インビボアッセイを提供する。ヒト膵管腺癌Mia Paca-2を、ペプチドYYおよびテスト化合物によるインビボ成長阻害につき検査した。70,000ないし100,000のヒトMia PaCa-2細胞を、48匹の雄の無胸腺マウスに、同所移植した。一週間後、該動物を、4週間、小型の浸透圧ポンプを介して、200 pmol/kg/hrにて、PYYまたはテスト化合物によって治療した。対合培養液は生理食塩水を受け取った。屠殺時、腫瘍の大きさおよび質量の両方を測定した。対照マウスは、組織学のセクションによって実証されるように、膵臓内で、有意なヒト癌成長を有した。9週目、対照マウスのうちの90%が、実質的な転移性疾患を有した。腫瘍質量は、テスト処理マウスにおいて60.5 %およびPYY処置マウスにおいて27%減少した。
全ての適応症につき、好ましい具体例において、本発明の該ハイブリッドポリペプチドは、単一用量または分割量または制御された連続放出で、１日当たり約0.5 μgないし約5 mgの用量で、あるいは１用量当たり約0.01 μg/kgないし約500 μg/kg、より好ましくは約0.05 μg/kgないし約250 μg/kg、最も好ましくは約50 μg/kg以下で末梢投与する。これらの範囲の用量は、各アナログまたは誘導体の効能によって変動するであろうし、当業者によって決定されてよい。
本発明の方法において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、別々にまたはアミリンまたはアミリンアナログアゴニスト、サケカルシトニン、コレシストキニン(CCK)またはCCKアゴニスト、レプチン(OB蛋白質)またはレプチンアゴニスト、エキセンディンまたはエキセンディンアナログアゴニスト、またはGLP-1またはGLP-1アナログアゴニストを含む他の化合物および組成物を含むがこれらに限定されるものではない栄養素利用性を減少させる長期または短期作用を呈する１以上の他の化合物および組成物と一緒に投与されてよい。適当なアミリンアゴニストは、例えば、(「プラムリンタイド（pramlintide）」としても知られ、U.S. Pat. Nos. 5,686,511 and 5,998,367に記載の) [25,28,29Pro-] ヒトアミリンを含む。使用されるCCKは、好ましくはCCKオクタペプチド (CCK-8)である。レプチンは、例えば、(Pelleymounter et al., Science 269: 540-3 (1995); Halaas et al., Science 269: 543-6 (1995); Campfield et al., Science 269: 546-9 (1995))で論議される。適当なエキセンディンは、エキセンディン-3およびエキセンディン-4を含み、エキセンディンアゴニスト化合物は、例えば、PCT Publications WO 99/07404、WO 99/25727、およびWO 99/25728に記載のものを含む。
ポリペプチド生成および精製
本明細書中に記載の該ハイブリッドポリペプチドは、当該分野で知られる標準組換え技術または化学的ペプチド合成技術を用いて、例えば、自動または半自動ペプチド合成器、または両方を用いて調製し得る。
本発明の該ハイブリッドポリペプチドは、慣用的技術によって、溶液中または固体支持体上で合成することができる。種々の自動合成器は、商業的に入手可能であり、既知のプロトコルによって使用することができる。例えば、Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 105: 6442 (1983); Merrifield, Science 232: 341-7 (1986); and Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds., Academic Press, New York, 1-284 (1979)参照。固相ペプチド合成は、キャッピングを施して、NMP/HOBt (オプション1)システムおよびtBocまたはFmoc化学(Applied Biosystems User's Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer, Version 1.3B July 1, 1988, section 6, pp. 49-70, Applied Biosystems, Inc., Foster City, California参照)を用いて、自動ペプチド合成器(例えば、Model 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, California)で行うことができる。また、ペプチドは、Advanced ChemTech Synthesizer (Model MPS 350, Louisville, Kentucky) を用いて、整理してもよい。ペプチドを、例えば、Waters Delta Prep 3000 システムおよびC4、C8、またはC18調製カラム (10 μ, 2.2x25 cm; Vydac, Hesperia, California)を用いる(予備および分析)RP-HPLCによって精製してもよい。活性ペプチドは容易に合成し、次いで、反応性ペプチドを同定するように設計されたスクリーニングアッセイにおいてスクリーンすることができる。
別法として、本発明の該ハイブリッドポリペプチドは、当該分野でよく知られた組換え技術によって生成してもよい。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor (1989)参照。組換え技術によって生成されたこれらのハイブリッドポリペプチドを、ポリヌクレオチドから発現させてもよい。当業者は、該ハイブリッドポリペプチドのそのような種々の断片をコードするDNAおよびRNAを含むポリヌクレオチドを、コドン使用の縮重を考慮して、野生型cDNAから入手し得、あるいは所望により操作し得ることを理解するであろう。これらのポリヌクレオチド配列は、微生物宿主において、mRNAの転写および翻訳を促進するコドンを組み込み得る。そのような製造する配列は、当該分野でよく知られた方法によって容易に構築し得る。例えば、WO 83/04053参照。また、上記の該ポリヌクレオチドは、所望により、N-末端メチオニル残基をコードし得る。本発明において有用な非ペプチド化合物を、当該分野で知られる方法によって調製してもよい。例えば、リン酸塩含有アミノ酸およびそのようなアミノ酸を含有するペプチドを、当該分野で知られる方法を用いて調製してもよい。例えば、Bartlett and Landen, Bioorg. Chem. 14: 356-77 (1986)参照。
種々の発現ベクター／宿主システムを利用して、ハイブリッドポリペプチドコード配列を含有し発現してもよい。これらは、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターによって形質転換された細菌;酵母発現ベクターによって形質転換された酵母;ウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)によって感染された昆虫細胞系;ウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス, CaMV;タバコモザイクウイルス, TMV)によって形質移入されたあるいは細菌発現ベクター (例えば、TiまたはpBR322プラスミド)によって形質転換された植物細胞系;または動物細胞系のような微生物を含むが、これらに限定されるものではない。組換え蛋白質生成において有用な哺乳類細胞は、VERO細胞、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系統、(COS-7のような)COS細胞、WI 38、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562および293細胞を含むが、これらに限定されるものではない。蛋白質の組換え発現のための例示的プロトコルは、下記に本明細書中に記載される。
それ自体、本発明によって提供されるポリヌクレオチド配列は、新たなおよび有用なウイルス性およびプラスミドDNAベクター、(培養液中で成長した細菌、酵母、および哺乳類細胞を含む)新たなおよび有用な形質転換されたおよび形質移入された原核および真核宿主細胞を生成するのに有用であり、本発明のハイブリッドポリペプチドの発現が可能なそのような宿主細胞の培養された成長に新たなおよび有用な方法である。本明細書中のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、キメラの構成ペプチドホルモンの過少生産が軽減される、あるいはその増大したレベルの必要性が満たされる場合に、遺伝子治療に有用であろう。
また、本発明は、本発明のハイブリッドポリペプチドの組換えDNA生成のためのプロセスを提供する。(a)そのようなDNA分子の発現を促進する条件下でそのようなハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する該宿主細胞を培養し；次いで(b)そのようなハイブリッドポリペプチドを入手することを特徴とするそのようなハイブリッドポリペプチドをコードする核酸を含有する宿主細胞から該ハイブリッドポリペプチドを生成するためのプロセスを提供する。
宿主細胞は、原核または真核であり得、細菌、(チャイニーズハムスター卵巣 (CHO)細胞、サル細胞、ベイビーハムスター腎臓細胞、癌細胞または他の細胞のような)哺乳類細胞、酵母細胞、および昆虫細胞を含む。
また、組換え蛋白質の発現のための哺乳類宿主システムは、当業者によく知られている。宿主細胞株は、発現された蛋白質を処理するまたは蛋白質活性を提供するのに有用であろう特定の翻訳後修飾を生成する特定の能力につき選択してもよい。ポリペプチドのそのような修飾は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化を含むが、これらに限定されるものではない。また、蛋白質の「プレプロ」形態を開裂する翻訳後処理は、正確な挿入、折り畳みおよび／または機能に重要であり得る。CHO、HeLa、MDCK、293、WI38等のような異なる宿主細胞は、そのような翻訳後活性に対して特異的な細胞マシーナリーおよび特性メカニズムを有し、選択されて、正確な修飾および導入された異種蛋白質の処理を確証してもよい。
別法として、酵母系を使用して、本発明の該ハイブリッドポリペプチドを発生させてもよい。該ハイブリッドポリペプチドcDNAのコード領域は、PCRによって増幅される。酵母プレ-プロ-アルファリーダー配列をコードするDNAは、アルファ接合因子遺伝子のヌクレオチド 1-20およびこの遺伝子のヌクレオチド 255-235に相補的なもう１つのプライマーを含有する１つのプライマーを用いて、PCR反応において、酵母ゲノムDNAから増幅する (Kurjan and Herskowitz, Cell, 30: 933-43 (1982))。プロモーターが、成熟したハイブリッドポリペプチドに縮合されたプレ-プロ-アルファファクターよりなる融合蛋白質の発現を導くように、プレ-プロ-アルファリーダーコード配列および該ハイブリッドポリペプチドのコード配列断片は、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH2)プロモーターを含有するプラスミドに連結される。Rose and Broach, Meth. Enz. 185: 234-79, Goeddel ed., Academic Press, Inc., San Diego, California (1990)によって教示されるように、ベクターは、さらに、クローニング部位、酵母「2-ミクロン」複製起源、酵母leu-2d遺伝子、酵母REP1およびREP2遺伝子、E. coliβ-ラクタマーゼ遺伝子、および複製のE. coli起源の下流に、ADH2転写ターミネーターを含む。β-ラクタマーゼおよびleu-2d遺伝子は、それぞれ、細菌および酵母の選択に提供する。また、該leu-2d遺伝子は、酵母におけるプラスミドのコピー数の増加を促進して、より高いレベルの発現を誘発する。該REP1およびREP2遺伝子は、プラスミドコピー数の制御に関与する蛋白質をコードする。
前の段落に記載のDNA構築体を、例えば、酢酸リチウム処理といった既知の方法を用いて、酵母細胞に形質転換する(Steams et al., Meth. Enz. 185: 280-97 (1990))。ADH2プロモーターは、成長培地において、グルコースの消耗の際に誘導される(Price et al., Gene 55: 287 (1987))。プレ−プロ−アルファ配列は、細胞からの融合蛋白質の分泌に影響をおよぼす。付随して、酵母KEX2蛋白質は、成熟したPYYアナログポリペプチドからプレ−プロ配列を開裂する(Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330-4 (1984))。
また、本発明のハイブリッドポリペプチドは、製造者の指示に従って、例えば、Pichia Expression System (Invitrogen, San Diego, California)といった商業的に入手可能な発現システムを用いて酵母中に組換え的に発現し得る。また、このシステムは、プレ-プロ-アルファ配列に基づいて、分泌を指示するが、該インサートの転写は、メタノールによる誘導の際に、アルコールオキシダーゼ(AOX1)プロモーターによって駆動する。該分泌されたハイブリッドポリペプチドを、例えば、細菌および哺乳類細胞上澄みからハイブリッドポリペプチドを精製するのに使用する方法によって、酵母成長媒体から精製する。
別法として、該cDNAコードハイブリッドポリペプチドを、バキュロウイルス発現ベクターpVL1393 (PharMingen, San Diego, California)へとクローン化してもよい。次いで、このハイブリッドポリペプチド含有ベクターを製造者の指示(PharMingen)に従って使用して、sF9蛋白質なし培地においてSpodoptera frugiperda細胞を感染し、組換え蛋白質を生成する。該蛋白質を精製し、へパリン-セファロースカラム(Pharmacia, Piscataway, New Jersey)および引き続いての分子サイジングカラム(Amicon, Beverly, Massachusetts)を用いて培地から濃縮し、PBS中で再懸濁する。SDS-PAGE分析は、単一のバンドを示し、該蛋白質のサイズを確認し、Proton 2090 Peptide SequencerにおけるEdman配列決定は、そのN-末端配列を確認する。
例えば、該ハイブリッドポリペプチドをコードする該DNA配列を、所望のプロモーター、および所望により、リーダー配列を含有するプラスミドへとクローン化してもよい(例えば、Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)参照)。この構築体の配列を、自動配列決定によって確認してもよい。次いで、該プラスミドを、細菌のCaCl2インキュベーションおよび熱ショック処置を用いる標準的手順を使用して、E. coli, 株MC1061に形質転換する(Sambrook et al., supra)。形質転換された細菌を、カルベニシリンで補充したLB媒体において成長させ、発現された蛋白質の生成を、適当な媒体における成長によって誘導する。存在するなら、該リーダー配列は、該ハイブリッドポリペプチドの分泌に影響を及ぼし、分泌の間、開裂されるであろう。該分泌組換え蛋白質を、下記に本明細書中に記載の方法によって、細菌培養培地から精製する。
別法として、本発明の該ハイブリッドポリペプチドを、昆虫系において発現させてもよい。蛋白質発現のための昆虫系は、当業者によく知られる。１つのそのような系統において、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)をベクターとして使用して、Spodoptera frugiperda細胞においてまたはTrichoplusia larvaeにおいて外来遺伝子を発現する。該ハイブリッドポリペプチドコード配列を、ポリヘドリン遺伝子のようなウイルスの非必須領域へとクローン化され、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置く。ハイブリッドポリペプチドの首尾良い挿入は、該ポリヘドリン遺伝子を不活性化し、コート蛋白のコートを欠く組み換えウィルスを生成するであろう。次いで、該組換えウィルスを使用して、該ポリペプチドが発現されるS. frugiperda細胞またはTrichoplusia larvaeを感染する(Smith et al., J. Virol. 46: 584 (1983); Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-7 (1994))。
もう１つの例において、該ハイブリッドポリペプチドをコードする該DNA配列を、PCRによって増幅してもよく、例えば、pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, New Jersey)といった適切なベクターにクローン化してもよい。該pGEXベクターを、該ベクターによってコードされるグルタチオニン-S-トランスフェラーゼ(GST)、およびベクターのクローン化部位に挿入されたDNA断片によってコードされた蛋白質を含む融合蛋白質を生成するように設計する。該PCRに対する該プライマーを、例えば、適切な開裂部位を含むように発生させてもよい。次いで、該組換え融合蛋白質を、該融合蛋白質の該GST部分から開裂してもよい。該pGEX-3X/PYYアナログポリペプチド構築体を、E. coli XL-1 Blue 細胞(Stratagene, La Jolla, California)に形質転換し、個々の形質転換体を単離し、0.4の波長 600 nmの光学密度まで37℃にて(カルベニシリンで補充された)LB培地中で増殖させ、続いて、0.5 mM イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド(Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri)の存在下でさらに4時間インキュベートする。個々の形質転換体からのプラスミドDNAを精製し、自動シークエンサーを用いて部分的に配列決定して、該適切な配向における所望のPPFハイブリッドポリペプチドコード遺伝子インサートの存在を確認する。
細菌において不溶性封入体として生成されると予想される融合蛋白質を、以下のとおり生成してもよい。細胞を遠心分離によって収穫し；0.15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA中で洗浄し；次いで、室温にて15分間、0.1 mg/mLリゾチーム(Sigma Chemical Co.)で処理する。該溶解物を超音波処理によってクリアし、細胞デブリスを、12,000xgにて、10分間、遠心分離によってペレットする。該融合蛋白質含有ペレットを、50 mM Tris, pH 8, および10 mM EDTA中で再懸濁し、6000xgにて、30分間、遠心分離する。該ペレットを、Mg++およびCa++なしの標準リン酸緩衝生理食塩水溶液(PBS)中で再懸濁する。該融合蛋白質を、さらに、変性SDSポリアクリルアミドゲル中で再懸濁されたペレットを分画することによって精製する(Sambrook et al., supra)。該ゲルを、0.4 M KCl中に浸漬して、該蛋白質を視覚化し、これを、SDSを欠くゲル泳動緩衝液中で切除し、電気溶出させる。もし該GST/PYYアナログポリペプチド融合蛋白質が、細菌中で可溶性蛋白質として生成されれば、それをGST精製モジュール(Pharmacia Biotech)を用いて精製してもよい。
該融合蛋白質を消化に付して、該PPFハイブリッドポリペプチドから該GSTを開裂してもよい。消化反応物(0.5 mL PBS中に20-40 μgの融合蛋白質, 20-30ユニットのヒトトロンビン(4000 U/mg (Sigma))を、室温にて、16ないし48時間インキュベートし、変性SDS-PAGEゲル上で荷電して、反応産物を分画する。ゲルを0.4 M KCl中に浸漬して、蛋白質バンドを視覚化する。該ハイブリッドポリペプチドの予測される分子量に対応する蛋白質バンドの同一性を、自動配列決定器を用いて、部分的アミノ酸配列分析によって確認してもよい(Applied Biosystems Model 473A, Foster City, California)。
本発明の該ハイブリッドポリペプチドの組換え発現の特に好ましい方法において、293の細胞を、リン酸カルシウム方法によって、pCMVベクター (5' CMV プロモーター, 3' HGH ポリA配列)および(ネオ耐性遺伝子を含有する)pSV2neoにおいて該ハイブリッドポリペプチドcDNAを含有するプラスミドで同時形質移入してもよい。好ましくは、該ベクターは、形質移入の前に、ScaIによって直線化するべきである。同様に、組み込まれたネオ遺伝子を有する同様のpCMVベクターを用いる代替の構築体を使用することができる。安定した細胞系統を、10ないし14日間、0.5 mg/mL G418 (ネオマイシン様抗生物質)を含有する成長培地における希釈を制限することによって、単一の細胞クローンから選択する。細胞系統を、ELISAまたはウェスタンブロットによるハイブリッドポリペプチド発現につきスクリーニングし、高発現細胞系統を大規模増殖のために拡大培養する。
形質転換された細胞を、長期間、高収率蛋白質生成に使用することが好ましく、そのようなものとして、安定した発現が望ましい。一旦、そのような細胞を、所望の発現カセットに沿って選択可能なマーカーを含有するベクターによって形質転換すると、該細胞は、選択性培地に変えられる前に、豊富化された培地において、1ないし2日間成長させてもよい。該選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を授与するように設計され、その存在は、導入された配列を首尾良く発現する細胞の成長および回収を可能にする。安定して形質転換された細胞の耐性群を、該細胞に適切な組織培養技術を用いて増殖させることができる。
多くの選択システムを使用して、組換え蛋白質生成について形質転換されている細胞を回収してもよい。そのような選択システムは、それぞれ、tk-、hgprt-またはaprt- 細胞におけるHSV チミジンキナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むが、これらに限定されるものではない。また、代謝拮抗剤耐性は、メトトレキサートに対する耐性を授与するdhfr;ミコフェノール酸に対する耐性を授与するgpt;アミノグリコシドに対する耐性を付与するneo;クロルスルフロン（chlorsulfuron）に対する耐性を付与するG418; およびハイグロマイシンに対する耐性を授与するhygroについての選択の基礎として使用できる。有用であり得るさらなる選択可能な遺伝子は、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするtrpB、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするhisDを含む。形質転換体の同定のために視覚的表示を与えるマーカーは、アントシアニン、β-グルクロニダーゼおよびその基質、GUSおよびルシフェラーゼおよびその基質、ルシフェリンを含む。
本発明の該ハイブリッドポリペプチドの多くを、自動ペプチド合成および組換え技術の両方の組合せを用いて生成してもよい。例えば、本発明のハイブリッドポリペプチドは、欠失、置換、およびペグ化による挿入を含む修飾の組合せを含有し得る。そのようなハイブリッドポリペプチドを、段階的に生成してもよい。第１の段階において、欠失、置換、挿入、およびそのいずれかの組合せの修飾を含有する中間体ポリペプチドを、記載のとおり、組換え技術によって生成してもよい。次いで、下記の所望の精製工程後、該中間体ポリペプチドを、(例えば、Nectar Transforming Therapeutics, San Carlos, Californiaからの)適切なペグ化試薬による化学的修飾を介してペグ化して、所望のハイブリッドポリペプチドを得る。当業者は、該上記の手順を一般化して、欠失、置換、挿入、誘導体化から選択された修飾、および当該分野で知られ本発明によって考えられる修飾の他の手段の組合せを含有するハイブリッドポリペプチドに適用し得ることを理解するであろう。
本発明によって生成された該ハイブリッドポリペプチドを精製することが望ましいかもしれない。ペプチド精製技術は、当業者によく知られている。これらの技術は、１つのレベルにて、ポリペプチドおよび非-ポリペプチド画分への細胞環境の粗製画分を含む。他の蛋白質からポリペプチドを分離して、関心のあるポリペプチドを、さらに、クロマトグラフィーおよび電気泳動法技術を用いて精製して、部分的または完全な精製(または均一になるまで精製)を達成してもよい。純ペプチドの精製に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、および等電点電気泳動法である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、逆相HPLCであり、続いて、液体クロマトグラフィー/質量分析 (LC/MS)およびマトリックス援助レーザー脱着イオン化 (MALDI) 質量分析によって精製生成物を特徴付ける。純度のさらなる確認は、アミノ酸分析を決定することによって得られる。
本発明の特定の態様は、精製、および特定の具体例においては、コードされた蛋白質またはペプチドの実質的な精製に関する。本明細書中で使用されるように用語「精製されたペプチド」は、他の要素から単離可能な組成物を指すように意図され、ここに該ペプチドをその天然に入手可能な状態に対していずれかの程度まで精製する。また、従って、精製されたペプチドは、それが天然に生じ得る環境から遊離したペプチドを指す。
一般的には、「精製された」は、分画に付して、種々の他の要素を除去しており、組成物がその発現された生物活性を実質的に保持するペプチド組成物を指すであろう。用語「実質的に精製された」を使用する場合、この命名は、該組成物中の約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%またはそれ以上の該ペプチドを構成するような、該ペプチドが該組成物の主要な要素を形成する組成物を指すであろう。
ペプチド精製における使用に適当な種々の技術は、当業者によく知られるであろう。これらは、例えば、硫酸アンモニウム、PEG、抗体等による沈殿；熱変性、その後に遠心分離；イオン効果、ゲルろ過、逆相、水酸燐灰石および親和クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー工程；等電点電気泳動法；ゲル電気泳動法；およびそのようなおよび他の技術の組合せを含む。一般的に当該分野で知られるように、種々の精製工程を行う順序を変更してもよく、あるいは特定の工程を削除し、それでもなお、実質的に精製された蛋白質またはペプチドの調製に適当な方法を得ることができると考えられる。
該ペプチドが、常に、最も精製された状態で提供される一般要件は存在しない。全く、より実質的に精製されていない生成物が特定の具体例において利用性を有するであろうと考えられる。部分的精製を、組み合わせてより少ない精製工程を用いることによって、あるいは該同一の一般的な精製計画の異なる形態を利用することによって達成し得る。例えば、HPLC装置を利用する実施された陽イオン交換カラムクロマトグラフィーが、一般的に、低圧クロマトグラフィーシステムを利用する同一の技術より、より大きい「倍（-fold）」精製を得るであろうことが理解される。より低い程度の相対的精製を呈する方法は、蛋白質生成物の総回収に、または発現された蛋白質の活性を維持するのに利益を有し得る。
所望により、該プロセスにおいて入手される他の要素から、そのようなハイブリッドポリペプチドを精製し単離してもよい。ポリペプチドを精製するための方法は、U.S. Patent No. 5,849,883で見つけることができる。これらの文献は、本発明の該ハイブリッドポリペプチドを単離し精製するのに有用であり得るG-CSF組成物の単離および精製のための特異的な例示的方法を記載する。これらの特許の開示をもって、当業者が、所与の源からハイブリッドポリペプチドを精製するのに使用し得る数多くの精製技術を知っているであろうことは明白である。
また、アニオン交換および免疫親和性クロマトグラフィーの組合せを使用して、本発明の精製されたハイブリッドポリペプチド組成物を生成し得ることが考えられる。
医薬組成物
また、本発明は、該ハイブリッドポリペプチドの送達に有用な医薬上許容される希釈剤、保存料、溶解剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体と一緒に、治療上または予防上有効量の少なくとも１つの本発明のハイブリッドポリペプチド、またはその医薬上許容される塩を含む医薬組成物に関する。そのような組成物は、種々の緩衝剤内容(例えば、Tris-HCl、酢酸塩、リン酸塩)、pHおよびイオン強度の希釈剤；洗浄剤および溶解剤(例えば、Tween 80、Polysorbate 80)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、保存料(例えば、チメロサール、ベンジルアルコール)、およびかさ高い物質(例えば、ラクトース、マニトール)のような添加剤；およびポリ乳酸、ポリグリコール酸等のような高分子化合物、またはリポソームと関連した粒状製剤への物質の組み込みを含んでもよい。そのような組成物は、本発明のハイブリッドポリペプチドの物理状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響を及ぼすであろう。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 1435-712, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1990)参照。
一般的には、本発明のハイブリッドポリペプチドは、個々の構成ポリペプチドがそれらの薬理学的特性に鑑みて有用であると同じように有用であろう。１つの好ましい使用は、代謝状態および障害の治療または予防のために、そのようなハイブリッドポリペプチドを末梢投与することである。特に、本発明の化合物は、栄養素利用性を減少させる、食物摂取量を減少させる、および減量に影響を与える剤として活性を有する。もう１つの具体例において、好ましい使用は、糖尿病または糖尿病関連状態および障害の治療のために、そのようなハイブリッドポリペプチドを投与することである。
本発明のハイブリッドポリペプチドは、注射、経口投与、経鼻投与、肺投与、局所投与、または当業者が認識するであろうように、他のタイプの投与のための処方を含む、末梢投与用に処方されてもよい。より具体的には、本発明による医薬組成物の投与は、標的組織が該経路を介して入手可能である限り、いずれの共通の経路を介してであってもよい。好ましい具体例において、該医薬組成物は、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄腔内、球後、肺内 (例えば、期間放出)によって; 経口、舌下、経鼻、肛門内、膣内、または経皮送達によって、あるいは特定の部位にて外科的移植によってといったいずれかの慣用的な末梢方法によって、対象に導入され得る。治療は、一定の期間にわたり、単一用量または複数の用量よりなっていてもよい。また、本発明の組成物の制御された連続放出も考えられる。
処方は、液体であってもよく、あるいは再構成のために、凍結乾燥のような固体であってもよい。本発明の水性組成物は、医薬上許容されるキャリアまたは水媒体中に溶解または分散された有効量の該ハイブリッドポリペプチドを含む。用語「医薬上または薬理上許容される」は、動物またはヒトに投与された時、副作用、アレルギー反応、または他の有害反応を生成しない分子的実体および組成物を指す。本明細書中で使用されるように、「医薬上許容される担体」は、いずれかおよび全ての溶媒、分散培地、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。医薬上活性な物質に対するそのような培地および剤の使用は、当該分野でよく知られている。いずれかの慣用的培地または剤が該活性成分と不適合である場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が考えられる。また、補助的な有効成分を、組成物中に組み込むことができる。幾つかのケースにおいて、単一の組成物または一緒に投与するための溶液中に、アミリン、アミリンアゴニストアナログ、CCKまたはCCK アゴニスト、またはレプチンまたはレプチンアゴニスト、またはエキセンディンまたはエキセンディンアゴニストアナログ、またはPYYまたはPYYアナログのような本発明の化合物およびもう一方の食物摂取量減少、血漿グルコース低下または血漿脂質改変剤を提供することが便宜であろう。他のケースにおいては、さらなる剤を該ハイブリッドポリペプチドとは別に投与することがより有益であり得る。
本発明の該ハイブリッドポリペプチを、遊離塩基の溶液、またはヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適当に混合された水中の薬理上許容される塩として、投与のために調製されてもよい。医薬上許容される塩は、（該蛋白質の該遊離アミノ基によって形成された）酸付加塩および例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸によって形成されるものを含む。また、遊離カルボキシル基によって形成された塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基から引き出すことができる。そのような生成物は、当業者によく知られた手順によって容易に調製される。また、分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物中で、および油中で調製することができる。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、保存料を含有して、微生物の成長を防ぐ。
１つの具体例において、本発明の該医薬組成物は、例えば、注射または注入を介する非経口投与に適当であるように処方される。好ましくは、該ハイブリッドポリペプチドは、約3.0ないし約8.0のpHにて、好ましくは約3.5ないし約7.4、3.5ないし6.0、または3.5ないし約5.0のpHにて、水溶性担体、例えば等張緩衝液において懸濁される。有用な緩衝液は、クエン酸ナトリウム-クエン酸およびリン酸ナトリウム-リン酸、および酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液を含む。持続性または「デポー」持続放出製剤の形態を、治療上有効量の調製物が、経皮注射または送達後数時間または数日にわたり、血流に送達されるように、使用してもよい。
注射物質使用に適当な医薬組成物は、無菌注射溶液または分散液の即時調製用の無菌の水溶液または分散液および無菌粉末を含む。全てのケースにおいて、該形態は無菌であるべきであり、容易なシリンジ性が存在する範囲において流体であるべきである。また、本発明の該ハイブリッドポリペプチドは、製造および保存の条件下で安定であるのが望ましく、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。該担体は、例えば、溶媒または水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、適当なその混合物、および野菜油を含有する分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合に必要な粒子サイズの維持によっておよび界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等といった種々の抗細菌および抗真菌剤によって成し遂げることができる。多くのケースにおいて、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる剤の組成物（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によって成し遂げることができる。
無菌の注射剤は、必要に応じて、上記で列挙した種々の他の成分を有する適切な溶媒において必要な量の活性化合物を組み込み、続いて滅菌ろ過することによって調製されてもよい。一般的には、分散液は、上記に列挙したものからの塩基性分散媒および必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに、種々の滅菌された有効成分を組み込むことによって調製される。注射剤の調製用の無菌粉末の場合において、調製の好ましい方法は、活性成分の粉末プラスその予め滅菌ろ過された溶液からのいずれかのさらなる所望の成分を得る真空乾燥および凍結乾燥技術である。
一般的には、治療上または予防上有効量の本発明のハイブリッドポリペプチは、受取人の年齢、体重、および疾患の状態または重症度または代謝状態または障害によって決定されるであろう。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences 697-773参照。また、Wang and Hanson, Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers, Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42:2S (1988)参照。典型的には、約0.001μg/kg 体重/日ないし約1000μg/kg 体重/日の間の用量を使用してもよいが、当業者が認識するであろうように、それ以上またはそれ以下を使用してもよい。用量は、１日に１またはそれ以上の回数であってもよく、あるいはより少なくてもよく、本明細書中に記載の他の組成物と併用してもよい。本発明は、本明細書中に列挙される用量に制限されないことが記されるべきである。
適切な用量は、適切な用量応答データと併せた代謝条件または障害のレベルを決定するための確立されたアッセイの使用を介して確かめてもよい。最終用量計画は、例えば、薬物の特異的な活性といった薬物の活性、損傷の重症度および患者の応答性、患者の年齢、状態、体重、性別および食事、いずれかの感染症の重症度、投与の時間および他の臨床因子を修飾する因子を考慮しつつ、主治医によって決定されるであろう。研究が実施されると、適切な用量レベルおよび特異的な疾患および状態に対する治療の持続期間に関するさらなる情報が分かってくるであろう。
有効な用量は、典型的には、単一用量または分割用量で投与される、50 kgの患者に対して、約1ないし30 μgないし約5 mg/日、好ましくは約10ないし30 μgないし約2 mg/日およびより好ましくは約5ないし100 μgないし約1 mg/日、最も好ましくは約5 μgないし約500 μg/日の範囲であろう。好ましくは、用量は、約0.01ないし約100 μg/kg/用量の間である。投与される正確な用量は、当業者によって決定されてもよく、特定の化合物の強度、ならびに個人の年齢、体重および状態によって決まる。投与は、栄養素利用性、食糧摂取量、体重の抑制、血糖または血漿中脂質低下が望ましい時はいつでも、例えば、肥満、糖尿病、またはインスリン抵抗性症候群の最初の徴候が出た時またはその診断の直後、開始するべきである。投与は、例えば、注射、好ましくは、皮下または筋肉内、経口、経鼻、経皮等のいずれかの経路によるものでよい。例えば、経口投与といった特定の経路のための用量を増加して、例えば、生物学的利用能を約5ないし100倍減少させてもよい。
１つの具体例において、医薬処方が非経口で投与される場合、該組成物は、1 μg/kgないし100 mg/kg 体重/日の範囲の該ハイブリッドポリペプチドの用量、好ましくは0.1μg/kgないし約50 mg/kg体重/日の範囲の用量にて、送達されるように処方される。非経口投与は、最初のボーラスによって実施され、その後、持続注入して、製剤の治療的循環レベルを維持してもよい。優良な医療行為および個々の患者の臨床状態によって決定されるように、当業者は容易に有効量および投与計画を最適化するであろう。
用量の頻度は、該剤の薬物動態パラメーターおよび投与経路によって決まるであろう。最適な医薬処方は、投与経路および所望の用量によって、当業者によって決められるであろう。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra, pages 1435-1712参照。そのような処方は、物理的状態、安定性、投与された剤のインビボ放出の速度およびインビボ排除の速度に影響を及ぼし得る。投与経路によって、適当な用量は、体重、体の表面領域または臓器の大きさに従い計算してもよい。適切な治療用量を決定するのに必要な計算のさらなる改良は、特に、本明細書中に開示した用量情報およびアッセイ、ならびに動物またはヒト臨床試験において観察された薬物動態データに鑑みて、過度の実験なしに、当業者によってルーチン的になされるであろう。
本発明の医薬組成物および治療方法が、ヒト医学および獣医学の分野で有用であり得ることが理解されるであろう。従って、治療される対象は、哺乳類、好ましくはヒトまたは他の動物であってもよい。獣医学的目的に対して、対象は、例えば、ウシ、ヒツジ、ウマおよびヤギを含む家畜、イヌおよびネコのようなペット、外来および／または動物園の動物、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびハムスターを含む研究室の動物；および鶏、七面鳥、アヒルおよびカモのような家禽を含む。
加えて、本発明は、本発明のハイブリッドポリペプチド、医薬適用のために本発明の該ハイブリッドポリペプチドを調製するのに適当な成分、および該ハイブリッドポリペプチドおよび医薬適用のための成分を使用するための指示を含むキットを考える。
本発明を理解するのを助けるために、以下の実施例を含む。本発明に関する実験は、もちろん、本発明を特異的に制限すると解釈されるべきではなく、当業者の範囲内であるであろう今知られているまたは後に開発される本発明のそのような変動は、本明細書中に記載され、本明細書において以下に主張されるように、本発明の範囲内であると考えられる。
実施例
本発明は、本発明をより完全に説明するために提供されるが、その範囲を制限する解釈されるべきではない以下の非限定的実施例への言及をもって、より詳細に記載される。実施例は、本発明のハイブリッドポリペプチドの調製、および本発明のこれらのハイブリッドポリペプチドをインビトロおよび／またはインビボでテストすることを説明する。当業者は、これらの実施例に記載される技術が、発明者らによって記載された本発明の実施において上手く機能する技術を示し、そのようなものとして、その実施に好ましいモードを構成することを理解するであろう。しかしながら、本開示に鑑みて、多くの変更を、開示された特異的な方法においてなし、それでもなお同様のまたは似たような結果を、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに得ることができることを、当業者は理解するはずであることが、理解されるべきである。
実施例1.ハイブリッドポリペプチドの調製
本発明のペプチドを、0.050-0.100 mmolでの0.43-0.49 mmol/gの負荷または前負荷されたWang Resin (Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂) 0.63 mmol/g (Novabiochem)を有するRinkアミド樹脂(Novabiochem)を用いてSymphony ペプチド合成器(Protein Technologies, Inc.)上に並べてもよい。Fmocアミノ酸 (5.0 eq, 0.250-.500 mmol)残基を、1-メチル-2-ピロリジノン中に、0.10 Mの濃度にて溶解する。全ての他の試薬(HBTU, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン)を、0.55 Mジメチルホルムアミド溶液として調製する。次いで、Fmoc保護アミノ酸を、HBTU (2.0 eq, 0.100-0.200 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(1.8 eq, 0.090-0.18 mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン (2.4 eq, 0.120-0.240 mmol)を用いて、2時間、樹脂結合アミノ酸に結合する。該最後のアミノ酸結合の後、該ペプチドを、1時間、ジメチルホルムアミド中の20% (v/v)ピペリジンを用いて脱保護する。一旦、ペプチド配列が完了すると、該Symphonyペプチド合成器をプログラムして、該樹脂を開裂する。樹脂からのペプチドのトリフルオロ酢酸(TFA)開裂を、1時間、93% TFA、3% フェノール、3% 水および1% トリイソプロピルシランを用いて実施する。該開裂されたペプチドを、tert-ブチルメチルエーテルを用いて沈殿させ、遠心分離によってペレットし、凍結乾燥する。該ペレットを、水(10-15 mL)中で再度溶解し、ろ過し、C18カラムおよび0.1% TFAを含有するアセトニトリル/水グラジエントを用いる逆相HPLCを介して精製する。
脂肪酸(例えば、オクタン酸およびステアリン酸）による本発明のペプチドをN-キャッピングするための一般的な手順は以下のとおりである: リンクアミド樹脂(0.1 mmol)上のペプチドをNMP (5 mL)中で懸濁する。別のバイアルにおいて、HBTU (0.3 mmol)、 HOBt (0.3 mmol)をDMF (5 mL)中に溶解し、その後、DIEA (0.6 mmol)を添加する。この溶液を樹脂に添加し、この懸濁液を2時間撹拌する。該溶媒をろ過し、NMP (5 mLx4)および CH2Cl2 (20 mL)で徹底的に洗浄し、1時間、TFA開裂に付す。所望のペプチドの収量は、開裂および精製後、約40 mgである。
PEG修飾を、商業的に入手可能な活性化されたPEGエステルを用いて、リジンの遊離イプシロン-アミノ基または精製されたペプチドの末端アミノ基上の溶液において実施してもよい。該得られたペグ化された誘導体を、逆相HPLCによって、均一になるまで精製し、該純度を、LC/MSおよび MALDI-MSによって確認する。
本発明の特定の例示的ハイブリッドポリペプチドを、下記の表1-1に示す。グリコシル化、PEG修飾等のような化学的修飾；置換、挿入および欠失等のようなアミノ酸修飾のような例示された化合物への種々の修飾が予想される。さらに、C-末端がアミド化されたと示されるが、本発明の該ハイブリッドポリペプチドは、別法として、遊離酸形態であってもよいと理解される。
Figure 2011219488
Figure 2011219488
実施例2. 結合アッセイ
本発明の該ハイブリッドポリペプチドを、当業者に一般的に知られる結合アッセイ手順を用いる種々の受容体結合アッセイにおいてテストしてもよい。そのようなアッセイは、下記のものを含む。
アミリン結合アッセイ:本発明のいくつかの例示的化合物のアミリン受容体への結合の評価を、ラット脳から調製された側坐核膜において以下のように実施してもよい。雄のSprague-Dawley（登録商標）ラット(200-250)グラムを、斬首によって屠殺する。脳を除去し、冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に入れる。腹側表面から、視床下部まで頭側に切断し、外側を嗅索によって囲み、これらの管から45°内側に延長する。側坐核および周りの領域を含有するこの前脳基底部の重さを測り、氷冷20 mM HEPES 緩衝液 (20 mM HEPES酸、23℃にてNaOHでpHを7.4に調整)中で均一化する。膜を、48,000xgにて、15分間、遠心分離によって、新鮮な緩衝液中で、３回洗浄する。最終膜ペレットを、0.2 mMフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)を含有する20 mM HEPES緩衝液中で再懸濁する。
125I-アミリン結合を測定するために(Beaumont K et al. Can J Physiol Pharmacol. 1995 Jul; 73(7):1025-9参照)、組織の4 mgの元来の湿重量からの膜を、0.5 mg/ml バシトラシン、0.5 mg/mlウシ血清アルブミン、および0.2 mM PMSFを含有する20 mM HEPES緩衝液において、12-16 pMにて、125I-アミリンによってインキュベートする。溶液を、2℃にて、60分間インキュベートする。インキュベーションを、放射性標識ペプチドの非特異的結合を減らすために、0.3% ポリエチレンイミン中に4時間、予め浸漬されたGF/B ガラス繊維フィルター (Whatman Inc., Clifton, N.J.)を通したろ過によって終了する。ろ過の直前に5 mlの冷PBSで、およびろ過の直後に15 mlの冷PBSで、フィルターを洗浄する。フィルターを除去し、放射能を、77%の計数効率にて、ガンマ計数器で評価する。競合曲線を、10-12ないし10-6 Mの標識されていないテスト化合物の存在下で、結合を測定することによって生成し、4-パラメーターロジスティック方程式を用いて非線形回帰によって分析する(Inplot program; GraphPAD Software, San Diego)。
CGRP受容体結合アッセイ:本発明の化合物のCGRP受容体への結合の評価は、CGRP受容体を発現すると知られるSK-N-MC細胞から調製された膜を用いる以外は、本質的にはアミリンに対して記載したとおりである(Muff, R. et.al., Ann NY Acad. Sci. 1992: 657, 106-16)。結合アッセイを、13,500 cpm 125I-hCGRP /ウェルまたは21.7 pM/ウェル(Amersham)を用いる以外は、アミリンについて記載のとおり行う。
アドレノメデュリン結合アッセイ: アドレノメデュリン受容体への結合を、25-30,000細胞／ウェルの最適条件を用いる環化AMPに対するPerkin Elmer AlphaScreenTMアッセイを用いる該アドレノメデュリン受容体 (Kato J et.al., Eur J Pharmacol. 1995, 289:383-5)を含有するHUVECを用いて調べてもよい。cAMPレベルの評価は、CHO細胞と比較して、HUVECに対して大きくない。そのようなものとして、所望により、該アドレノメデュリン受容体を発現しないため、CHO細胞を陰性対照として選択してもよい。
カルシトニン受容体結合アッセイ: カルシトニン受容体への結合を、当該分野で知られるように、カルシトニン受容体を発現するCHO細胞またはT47D細胞を用いて調べてもよい(Muff R. et.al, Ann N Y Acad Sci. 1992, 657:106-16 and Kuestner R.E. et. al. Mol Pharmacol. 1994, 46:246-55)。
レプチン結合アッセイ:２つのインビトロバイオアッセイをルーチン的に使用して、レプチン結合および受容体活性化を評価する(例えば、White, et al., 1997. Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94: 10657-10662参照)。アルカリホスファターゼ(「AP」)-レプチン(「OB」)融合蛋白質(「AP-OB」)を使用して、長い(シグナリング)形態の該マウスOB受容体(「OB-RL」)によって形質移入されたCOS-7細胞による組換えマウスレプチン(陽性対照)またはペプチドの不在または存在下でのレプチン結合の阻害を測定してもよい。シグナル伝達アッセイを、AP輸送体およびOB-RL構築体によって同時形質移入されたGT1-7細胞において行ってもよい。マウスレプチンまたはペプチドによる刺激に応答して分泌された有りカリンホスファターゼ(「SEAP」)活性を、化学発光によって測定してもよい。
Y1受容体結合アッセイ:膜を、神経ペプチドY1受容体を内生に発現するSK-N-MC細胞の融合性培養液から調製する。膜を、96ウェルポリスチレンプレートにおいて、常温で60分間、60 pM [125I]-ヒトペプチドYY (2200 Ci/mmol, PerkinElmer Life Sciences)で、および非標識PPFポリペプチドでインキュベートする。次いで、ウェル内容物を、Perkin Elmerプレートハーベスターを用いて、96ウェルガラス繊維プレートへと採る。乾燥させたガラス繊維プレートを、シンチラントと組合せ、Perkin Elmerシンチレーションカウンタ上でカウントする。
Y2受容体結合アッセイ: 膜を、神経ペプチドY2受容体を内生に発現するSK-N-BE細胞の融合性培養液から調製する。膜を、96ウェルポリスチレンプレートにおいて、常温で60分間、30 pM [125I]-ヒトペプチドYY (2200 Ci/mmol, PerkinElmer Life Sciences)で、および非標識PPFポリペプチドでインキュベートする。次いで、ウェル内容物を、Perkin Elmerプレートハーベスターを用いて、96ウェルガラス繊維プレートへと採る。乾燥させたガラス繊維プレートを、シンチラントと組合せ、Perkin Elmerシンチレーションカウンタ上でカウントする。
Y4受容体結合アッセイ: CHO-K1細胞を、神経ペプチドY4遺伝子をコードするcDNAによって一時的に形質移入し、次いで、４８時間後、膜を、融合性細胞培養液から調製する。膜を、96ウェルポリスチレンプレートにおいて、常温にて、60分間、18 pM [125I]-ヒト膵臓ポリペプチド (2200 Ci/mmol, PerkinElmer Life Sciences)で、および非標識PPFポリペプチドでインキュベートする。次いで、ウェル内容物を、Perkin Elmerプレートハーベスターを用いて、96ウェルガラス繊維プレートへと採る。乾燥させたガラス繊維プレートを、シンチラントと組合せ、Perkin Elmerシンチレーションカウンタ上でカウントする。
Y5受容体結合アッセイ: CHO-K1細胞を、神経ペプチドY5遺伝子をコードするcDNAによって一時的に形質移入し、次いで、４８時間後、膜を融合性細胞培養液から調製する。膜を、96ウェルポリスチレンプレートにおいて、常温にて、60分間、44 pM [125I]- ヒトペプチドYY (2200 Ci/mmol, PerkinElmer Life Sciences)で、および非標識PPFポリペプチドでインキュベートする。次いで、ウェル内容物を、Perkin Elmerプレートハーベスターを用いて、96ウェルガラス繊維プレートへと採る。乾燥させたガラス繊維プレートを、シンチラントと組合せ、Perkin Elmerシンチレーションカウンタ上でカウントする。
GLP-1受容体結合アッセイ: GLP-1受容体結合活性および親和性を、該受容体源がRINm5F細胞膜であり、該リガンドが[125I]GLP-1である結合置換アッセイを使用して測定し得る。均一化したRINm5F細胞膜を、40,000 cpm [125I]GLP-1トレーサーによって、20 mM HEPES緩衝液中でインキュベートし、常に混合しながら、23℃にて、2時間、テスト化合物の濃度を変動させる。反応混合物を、0.3% PEI溶液で予め浸漬したガラス繊維パッドを通してろ過し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水で濯ぐ。結合カウントを、シンチレーションカウンタを用いて決定する。結合親和性を、GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)を用いて計算する。
実施例3：マウス食餌摂取量アッセイ
本発明の該ハイブリッドポリペプチドを、マウス食餌摂取量アッセイにおける食欲抑制についておよび食餌性肥満(DIO)マウスにおける体重増加に対する効果についてテストしてもよい。スクリーンに対する実験プロトコルを下記する。
雌のNIH/Swissマウス(生後8-24週間)を、0600にて光をつける12:12時間明：暗サイクルで収容する。特記されない限り、水および標準のペレット化したマウス飼料食餌は、無制限に入手可能である。実験の１日前、約1500時間から動物を絶食させる。実験の朝、動物を実験群に分ける。典型的な研究において、n=4ケージは3マウス/ケージである。
時間=0分時に、全動物に、約10 nmol/kgないし75 nmol/kgの範囲の量で、ビヒクルまたは化合物を腹腔内注射し、直ぐに、予め重さを測った量(10-15g)の標準飼料を与える。食物を除去し、30、60、および120分時に重さを測って、消費された食物の量を決定する(Morley, Flood et al., Am. J. Physiol. 267: R178-R184, 1994)。食物摂取量を、例えば、30、60、120、180および／または240分時点の後に残った食物の重量を、時間=0で最初に提供された食物の重量から引くことによって計算する。有意な治療効果を、ANOVA (p<0.05)によって同定した。有意な差が存在するところでは、テスト平均を、ダネット検定を用いて、対照平均と比較する(Prism v. 2.01, GraphPad Software Inc., San Diego, California)。
実施例4：肥育したC57B1/6 (食餌性肥満、またはDIO)マウスにおける体重増加
雄のC57BL/6マウス（研究の開始時に生後4週間）に、高脂肪(HF,脂肪として58%の食餌性kcal）または低脂肪(LF, 脂肪として11%の食餌性kcal）飼料を与える。飼料を始めて4週間後、各マウスに、２週間継続して所定の用量のハイブリッドポリペプチドを皮下投与する浸透圧ポンプ(Alzet # 2002)を移植する。体重および食餌摂取量を毎週測定する (Surwit et al., Metabolism−Clinical and Experimental, 44: 645-51, 1995)。テスト化合物の効果を、少なくとも14匹のマウス／治療群(p<0.05 ANOVA,ダネット検定 , Prism v. 2.01, GraphPad Software Inc., San Diego, California)の%体重変化（つまり、開始時の体重からの%変化）の平均+/-標準偏差として表現する。
エキセンディン/PYYハイブリッド:
本発明の例示的ハイブリッドポリペプチドを、C-末端が切断されたエキセンディン (例えば、エキセンディン-4(1-28)または5Ala,14Leu,25Phe-エキセンディン-4(1-28))および18-36ないし31-36領域におよぶN-末端が切断されたPYYを用いて合成した。そのようなものとして、該例示的ハイブリッドポリペプチドは、一般的には、２つのモジュールを含み、ここに該第１のモジュールはエキセンディン-4アナログの断片であり、該第２のモジュールはPYY切断から選択されたペプチドエンハンサーである。また、比較のために、β-アラニンジペプチドスペーサーを、いくつかの変形において、該ペプチド形成ブロックの間に組み込んだ（表4-1参照）。
Figure 2011219488
表4-1に示されるように、本発明の特定の例示的化合物は、食物摂取量アッセイにおいて、有効性を示した。また、特定のペプチドを、DIOアッセイにおいて、75 nmol/kgでテストし、PYYよりより有効であると証明した（図1）。
エキセンディン/アミリンハイブリッド:
本発明のさらなる例示的ハイブリッドポリペプチドを、C-末端が切断されたエキセンディン (1-27)、C-末端が切断されたアミリンペプチド (例えば、アミリン(1-7)、2,7Ala-アミリン(1-7)、およびアミリン(33-27))、および任意のsCT断片(例えば、sCT(8-10)および14Gln,11,18Arg-sCT(8-27))から調製した。両方のハイブリッドポリペプチドは、食欲抑制において非常に活性であった（表4-2参照）が、活性の発現は、該親分子の活性プロファイルと異なった（データ示されず）。
Figure 2011219488
また、両方の化合物は、該DIOアッセイにおいてスクリーンすると、優れた有効性を示した（図2）。
エキセンディン/CCK-8ハイブリッド:
本発明のさらにさらなる例示的ハイブリッドポリペプチドを、直接的にまたはリンカーを介してのいずれかで、CCK-8の該N末端に結合した完全長またはC-末端が切断されたエキセンディン-4から調製して、該CCK-8のN-末端アミドを保存した（表4-3)。さらに、特定のハイブリッドを、天然に生じるTyr(SO3)を組み込んで調製したが、該より安定したPhe(CH2SO3)基を組み込むもう一方のハイブリッドを調製した。全調製されたハイブリッドポリペプチドは、食物摂取量を阻害するのに活性であった(表4-3)。
Figure 2011219488
例示的エキセンディン/CCK-8 ハイブリッドポリペプチドを、25 nmol/kgにて、DIOアッセイにおいてテストした(図3Aおよび 3B)。データは、全化合物における初期の減量、続くリバウンド効果を示す。興味深いことに、該リバウンド効果は、より加水分解に安定Phe(CH2SO3)残基を組み込むハイブリッド、ならびにエキセンディンおよびCCK残基の間にリンカー 8-アミノ-3,6-ジオキサオクタノイルを組み込むハイブリッドにおいて減少するようである。
アミリン/PYYハイブリッド:
各ペプチドの切断セグメントを含有するアミリン/PYYハイブリッドポリペプチドを合成した。食物摂取量アッセイにおけるインビボ活性を、表4-4に示す。
Figure 2011219488
本発明の例示的ハイブリッドポリペプチドが、それらの親構成ペプチドホルモンより強力であるかを確証するために、例示的化合物を、より活性な親分子の最小有効量にて、該食物摂取量アッセイにおいてテストした。結果を、図4Aおよび4Bに下記し、これは、プールされた親ペプチド(化合物1、11、および12は構成ペプチドホルモン、アナログまたはその断片である)の効果を比較する。該データは、いくつかのペプチドが、少なくとも、該プールされた親ペプチドと等効力であることを示す。該インビボ研究と平行して、インビトロ受容体結合および機能アッセイ（シクラーゼ活性）を、全化合物に対して行っている（データ示されず）。
本発明を、好ましい実施例および具体例の観点から記載しているが、変更および修飾が当業者に起こるであろうことが理解される。従って、添付の請求の範囲は、主張されるように本発明の範囲内に入る全てのそのような同等の変更を含むことが意図される。

Claims (19)

  1. 少なくとも１つのさらなる生理活性ペプチドホルモンモジュールに共有結合した第１の生理活性ペプチドホルモンモジュールを含むハイブリッドポリペプチドであって；
    ここに：
    該生理活性ペプチドホルモンモジュールは、独立して：構成ペプチドホルモン、構成ペプチドホルモンの少なくとも１つのホルモン活性を呈する構成ペプチドホルモンの断片、構成ペプチドホルモンの少なくとも１つのホルモン活性を呈する構成ペプチドホルモンのアナログおよび誘導体、および構成ペプチドホルモンの少なくとも１つのホルモン活性を呈する構成ペプチドホルモンのアナログおよび誘導体の断片よりなる群から選択され;
    該構成ペプチドホルモンは、独立して:アミリン、およびエキセンディン-4よりなる群の少なくとも２つから選択され；および
    該生理活性ペプチドホルモンモジュールのうちの少なくとも１つは、構成ペプチドホルモンの少なくとも１つのホルモン活性を呈することを特徴とする、少なくとも１つのホルモン活性を呈する該ハイブリッドポリペプチド。
  2. 該アミリンアナログが: アミリン(32-37)、アミリン(33-37)、アミリン(34-37)、アミリン(35-37)、アミリン(36-37)、アミリン(37)、ADM(47-52)、ADM(48-52)、ADM(49-52)、ADM(50-52)、ADM(51-52)、ADM(52)、CT(27-32)、CT(27-32)、CT(28-32)、CT(29-32)、CT(30-32)、CT(31-32)、およびCT(32)よりなる群から選択される請求項１記載のハイブリッドポリペプチド。
  3. 該第１の生理活性ペプチドホルモンモジュールまたは該少なくとも１つのさらなる生理活性ペプチドホルモンモジュールのうちの少なくとも１つが、構成ペプチドホルモンまたは該構成ペプチドホルモンの少なくとも１つのホルモン活性を呈する構成ペプチドホルモンの断片である請求項１記載のハイブリッドポリペプチド。
  4. 該第１の生理活性ペプチドホルモンモジュールまたは該少なくとも１つのさらなる生理活性ペプチドホルモンモジュールのうちの少なくとも１つが、少なくとも１つのホルモン活性を呈する構成ペプチドホルモンのアナログまたは誘導体または該構成ペプチドホルモンの少なくとも１つのホルモン活性を呈する構成ペプチドホルモンのアナログまたは誘導体の断片である請求項１記載のハイブリッドポリペプチド。
  5. 該第１の生理活性ペプチドホルモンモジュールまたは該少なくとも１つのさらなる生理活性ペプチドホルモンモジュールのうちの少なくとも１つが、ペプチドエンハンサーである請求項１記載のハイブリッドポリペプチド。
  6. 該構成ペプチドホルモンが、独立して:アミリンアナログ、およびエキセンディン-4よりなる群から選択される請求項１記載のハイブリッドポリペプチド。
  7. 少なくとも１つのホルモン活性を呈する該少なくとも１つの生理活性ペプチドホルモンモジュールが、該ハイブリッドポリペプチドのN-末端部に位置する請求項１記載のハイブリッドポリペプチド。
  8. 該ハイブリッドポリペプチドの該N-末端部に位置する、少なくとも１つのホルモン活性を呈する該少なくとも１つの生理活性ペプチドホルモンモジュールが、該C-末端からN-末端向きに構成される請求項７記載のハイブリッドポリペプチド。
  9. 該ハイブリッドポリペプチドのN-末端がアミド化される請求項８記載のハイブリッドポリペプチド。
  10. 少なくとも１つのホルモン活性を呈する該少なくとも１つの生理活性ペプチドホルモンモジュールが、該ハイブリッドポリペプチドの該C-末端部に位置する請求項１記載のハイブリッドポリペプチド。
  11. 該ハイブリッドポリペプチドの該C-末端がアミド化される請求項１０記載のハイブリッドポリペプチド。
  12. １つの生理活性ペプチドホルモンモジュールの該C-末端が、もう１つの生理活性ペプチドホルモンモジュールのN-末端に直接的に結合して、該共有結合を形成する請求項１記載のハイブリッドポリペプチド。
  13. 該生理活性ペプチドホルモンモジュールが:アルキル;ジカルボン酸PEG;アミノ酸;ポリアミノ酸;二官能性リンカー;アミノカプロイル(Aca)、β-アラニル、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタノイル、およびGly-Lys-Arg (GKR)よりなる群から独立して選択される１以上の連結基を用いて共有結合される請求項１記載のハイブリッドポリペプチド。
  14. 該第１の生理活性ペプチドホルモンモジュールが：エキセンディン-4、少なくとも１つのホルモン活性を呈するエキセンディン-4の断片、少なくとも１つのホルモン活性を呈するエキセンディン-4アナログまたは誘導体、および少なくとも１つのホルモン活性を呈するエキセンディン-4アナログの断片よりなる群から選択され；次いで
    該少なくとも１つのさらなる生理活性ペプチドホルモンモジュールが、独立して:アミリン、少なくとも１つのホルモン活性を呈するアミリンの断片、少なくとも１つのホルモン活性を呈するアミリンアナログまたは誘導体、または少なくとも１つのホルモン活性を呈するアミリンアナログの断片よりなる群から選択される請求項１記載の該ハイブリッドポリペプチド。
  15. 該第１の生理活性ペプチドホルモンモジュールが：エキセンディン-4、エキセンディン-4(1-27)、エキセンディン-4(1-28)、14Leu,25Phe-エキセンディン-4(1-28); 5Ala,14Leu,25Phe-エキセンディン-4(1-28)および14Leu-エキセンディン-4(1-28)よりなる群から選択され；および該少なくとも１つのさらなる生理活性ペプチドホルモンモジュールが、独立して：25,28,29Pro-h-アミリンよりなる群から選択される請求項１４記載の該ハイブリッドポリペプチド。
  16. 該ハイブリッドポリペプチドが、少なくとも３つの生理活性ペプチドホルモンモジュールを含む請求項１４記載のハイブリッドポリペプチド。
  17. 該ハイブリッドポリペプチドが、少なくとも４つの生理活性ペプチドホルモンモジュールを含む請求項１４記載のハイブリッドポリペプチド。
  18. 該第１の生理活性ペプチドホルモンモジュールが、該ハイブリッドポリペプチドの該C-末端に位置し、該少なくとも１つのさらなる生理活性ペプチドホルモンモジュールが、該ハイブリッドポリペプチドの該N-末端に位置する請求項１４記載のハイブリッドポリペプチド。
  19. 該第１の生理活性ペプチドホルモンモジュールが、該ハイブリッドポリペプチドの該N-末端に位置し、該少なくとも１つのさらなる生理活性ペプチドホルモンモジュールが、該ハイブリッドポリペプチドの該C-末端に位置する請求項１４記載のハイブリッドポリペプチド。
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