KR20130010086A - 선택가능한 특성을 갖는 하이브리드 폴리펩티드 - Google Patents

선택가능한 특성을 갖는 하이브리드 폴리펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 혈장 글루코스 수준, 인슐린 수준 및(또는) 인슐린 분비의 제어에 의해 경감될 수 있는 대사 질병 및 질환, 예를 들어, 당뇨병 및 당뇨병-관련 증상의 치료제 및 예방제로서 유용한 신규한 선택가능한 하이브리드 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 증상 및 질환으로는 고혈압, 이상지혈증, 심혈관 질병, 식이 장애, 인슐린 저항, 비만, 및 1형, 2형 및 임신 당뇨병을 포함하는 임의의 종류의 당뇨병이 있으나, 이로 제한되지 않는다.

Description

선택가능한 특성을 갖는 하이브리드 폴리펩티드 {HYBRID POLYPEPTIDES WITH SELECTABLE PROPERTIES}
[관련 출원]
본원은 그 전문을 본원에 참고로 포함하는 2004년 2월 11일 출원된 미국 가출원 60/543,407을 기초로 한 우선권을 주장한다.
본 발명은 펩티드 화학물질, 보다 특히 선택가능한 특성을 갖는 하이브리드 폴리펩티드에 관한 것이다.
많은 대사 질병 및 질환에 인슐린 수준 및 혈액 글루코스 수준의 조절이 중요하다. 인슐린 분비는 장내분비 세포에 의해 생산되는 인크레틴 (incretin)으로 명명된 분비촉진 호르몬에 의해 부분적으로 조절된다. 인크레틴 호르몬인 글루카곤 유사 펩티드-1 ("GLP-1")은 많은 연구에서 인슐린 분비를 향상시키는 효과를 갖는 것으로 밝혀진 장관 세포에서 분비되는 펩티드 호르몬이다. GLP-1은 창자에서 프로글루카곤으로부터 가공되고 영양분-유도 인슐린 방출을 향상시킨다 (Krcymann B., et al., Lancet, 2: 1300-1303 (1987)). 말단 절단된 다양한 형태의 GLP-1은 인슐린 분비 (인슐린자극성 작용) 및 cAMP 형성을 자극하는 것으로 알려져 있다 [예를 들어, Mojsov, S., Int. J. Pep. Pro. Res., 40: 333-343 (1992) 참조]. 다양한 시험관내 실험실 실험과 GLP-1, GLP-1(7-36) 아미드 및 GLP-1(7-37) 산의 외인성 투여에 대한 포유동물, 특히 인간의 인슐린자극성 반응 사이의 관계가 확립되어 있다 (예를 들어, Nauck, M. A., et al., Diabetologia, 36: 741-744 (1993); Gutniak, M., et al., New Eng. J. of Med., 326(20): 1316-1322 (1992); Nauck, M. A., et al., J. Clin. Invest., 91: 301-307 (1993); 및 Thorens, B., et al., Diabetes, 42: 1219-1225 (1993) 참조).
GLP-1(7-36) 아미드는 인슐린 감수성을 자극하고 생리학적 농도에서 글루코스-유도된 인슐린 방출을 향상시킴으로써 인슐린 의존성 당뇨병에서 현저한 항당뇨유발 효과를 발휘한다 (Gutniak M., et al., New Eng. J. Med., 326: 1316-1322 (1992)). 인슐린 비의존성 당뇨병에 투여될 때, GLP-1(7-36) 아미드는 인슐린 방출을 자극하고, 글루카곤 분비를 저하시키고, 위 배출을 억제하고, 글루코스 활용을 향상시킨다 (Nauck, 1993; Gutniak, 1992; Nauck, 1993). 그러나, 당뇨병의 장기 치료를 위해 GLP-1 타입 분자를 사용하는 것은 상기 펩티드의 혈청 반감기가 매우 짧기 때문에 복잡하였다.
보다 특히, GLP-1은 160-아미노산 프로호르몬인 프로글루카곤으로부터 유도된 30-아미노산 펩티드이다. 췌장 및 장관에서 상이한 프로호르몬 전환효소 (convertase)의 작용은 글루카곤 및 다른 불명료한 펩티드를 생산시키는 반면, 프로글루카곤의 절단은 GLP-1 및 GLP-2와 2개의 다른 펩티드를 생산시킨다. GLP-1의 아미노산 서열은 지금까지 연구된 모든 포유동물에서 100％ 상동성이고, 이는 중대한 생리학적 역할을 암시한다. GLP-1(7-37) 산은 C-말단에서 절단되고 아미드화되어 GLP-1(7-36) NH2를 형성한다. 유리 산 GLP-1(7-37) OH 및 아미드 GLP-1(7-36) NH2의 생물학적 효과 및 대사 턴오버 (turnover)는 구별할 수 없다. 통상적으로, 아미노산의 번호매김은 프로글루카곤으로부터 가공된 GLP-1(1-37) OH를 기초로 한다. 생물학적 활성을 갖는 GLP-1 (GLP-1(7-36) NH2)는 추가 가공의 결과이다. 따라서, GLP-1(7-37) OH 또는 GLP-1(7-36) NH2의 제1 아미노산은 7His이다.
위장관에서, GLP-1은 관내 (intraluminal) 글루코스의 자극에 반응하여 장관, 결장 및 직장 점막의 L-세포에 의해 생산된다. 활성 GLP-1의 혈장 반감기는 < 5분이고, 그의 대사 소실률은 약 12-13분이다 (Holst, 1994). GLP-1의 대사에 관여된 주요 프로테아제는 디펩티딜 펩티다제 (DPP) IV (CD26)이고, 이는 N-말단 His-Ala 디펩티드를 절단하여, 대사체인 GLP-1(9-37) OH 또는 GLP-1(9-36) NH2를 생성하고, 이는 GLP-1 수용체의 불활성의 약한 효능제 또는 길항제로서 다양하게 설명된다. GLP-1 수용체 (GLP-1R)은 463 아미노산의 G 단백질 커플링된 수용체이고, 췌장 베타 세포에, 폐에 및 보다 적은 정도로 뇌, 지방 조직 및 신장에 위치한다. GLP-1(7-37) OH 또는 GLP-1(7-36) NH2에 의한 GLP-1R의 자극은 아데닐레이트 시클라제 활성화, cAMP 합성, 막 탈분극, 세포내 칼슘의 상승 및 글루코스-유도된 인슐린 분비의 증가를 일으킨다 (Holz et al., 1995).
GLP-1은 음식 섭취에 반응하여 장관 점막으로부터 분비되는 강력한 인슐린 분비촉진제이다. GLP-1의 충분한 인크레틴 효과는 GLP-1R 녹아웃 (knockout) 마우스가 당 불내성 (glucose intolerance)인 사실에 의해 이해된다. 정맥내(i.v.) 주입된 GLP-1의 인크레틴 반응은 당뇨 환자에서 보존되지만, 이들 환자에서 경구 글루코스에 대한 인크레틴 반응은 손상된다. 주입 또는 피하(sc) 주사에 의한 GLP-1 투여는 당뇨 환자에서 공복시 글루코스 수준을 제어하고, 인슐린 분비에 대한 글루코스 역치를 유지시킨다 (Gutniak et al., 1992; Nauck et al., 1986; Nauck et al., 1993). GLP-1은 술포닐우레아 약물과 연관된 저혈당을 피하면서 생리학적인 방식으로 인슐린 분비를 증대시킬 수 있는 치료제로서 큰 가능성을 보였다.
글루코스 항상성에 대한 GLP-1의 다른 중요한 효과는 글루카곤 분비의 억제 및 위 운동의 저해이다. 글루카곤의 췌장 알파 세포 분비에 대한 GLP-1의 억제 작용은 글루코스 신합성 및 글리코겐 분해의 감소를 통해 간 글루코스 생산을 감소시킨다. GLP-1의 상기 항글루카곤 효과는 당뇨 환자에서 보존된다.
위 운동 및 위 분비가 억제되는 GLP-1의 소위 회장 제동 (brake) 효과는 미주신경 원심성 수용체를 통해 또는 장관 평활근에 대한 직접 작용에 의해 이루어진다. GLP-1에 의한 위산 분비의 감소는 영양분 이용률에서 지연상 (lag phase)에 기여하여, 신속한 인슐린 반응에 대한 필요성을 제거한다. 요약하면, GLP-1의 위장관 효과는 지연된 글루코스 및 지방산 흡수에 상당히 기여하고 인슐린 분비 및 글루코스 항상성을 조절한다.
GLP-1은 또한 베타 세포 특이적 유전자, 예를 들어, GLUT-1 트랜스포터, 인슐린 (PDX-1과 인슐린 유전자 프로모터와의 상호작용을 통해) 및 헥소키나제-1을 유도하는 것으로 나타났다. 따라서, GLP-1은 설치류 실험에 의해 증명된 바와 같이 정상적으로 노화와 연관된 당 불내성을 잠재적으로 역전시킬 수 있다. 또한, GLP-1은 베타 세포 부족 상태 동안 베타 세포 기능을 복구하는 것 외에 베타 세포 신생에 기여하고 베타 세포 질량을 증가시킬 수 있다.
GLP-1의 중추적인 효과는 시상하부 GLP-1R의 작용을 통해 발휘된, 음식 섭취의 감소와 연결된 포만감 증가를 포함한다. II형 당뇨 환자에서 GLP-1의 48시간 연속 피하 주입은 시장기와 음식 섭취를 감소시키고 포만감을 증가시켰다. 이들 식욕감퇴 효과는 GLP-1R 녹아웃 마우스에서는 보이지 않았다.
엑센딘은 인슐린 분비에 관련된 펩티드의 또다른 패밀리이다. 엑센딘은 아메리카독도마뱀 (Gila-monster, 미국 아리조나에 서식하는 도마뱀) 및 멕시코 구슬 도마뱀 (Mexican Beaded Lizard)의 타액에서 발견된다. 엑센딘-3은 헬로더마 호리둠 (Heloderma horridum)의 타액에 존재하고, 엑센딘-4는 헬로더마 서스펙툼 (Heloderma suspectum)의 타액에 존재한다 (Eng, J., et al., J Biol. Chem., 265: 20259-62, 1990; Eng., J., et al., J. Biol. Chem., 267: 7402-05 (1992)). 엑센딘은 글루카곤 유사 펩티드 패밀리의 몇몇 구성원에 일부 서열 유사성을 갖고, GLP-1에 대해 최고 53％의 상동성을 갖는다 (Goke, et al., J. Biol. Chem., 268: 19650-55 (1993)).
엑센딘-4는 인슐린-분비 TC1 세포상, 기니아 피그 췌장의 분산된 선포 세포 및 위의 벽 세포에서 GLP-1 수용체에 결합하고; 펩티드는 또한 소마토스타틴 방출을 자극하고 단리된 위에서 가스트린 방출을 억제한다 (Goke, et al., J. Biol. Chem., 268: 19650-55 (1993); Schepp, et al., Eur.J. Pharmacol., 69: 183-91 (1994); Eissele, et al., Life Sci., 55: 629-34 (1994)). 엑센딘-3 및 엑센딘-4는 췌장 선포 세포 상의 GLP-1 수용체에 결합하여 췌장 선포 세포에서 cAMP 생산 및 췌장 선포 세포로부터 아밀라제 방출을 자극하는 것으로 밝혀졌다 (Malhotra, R., et al., Relulatory Peptides, 41: 149-56 (1992); Raufman, et al., J. Biol. Chem., 267: 21432-37 (1992); Singh, et al., Regul. Pept., 53: 47-59 (1994)). 당뇨병의 치료 및 고혈당증의 예방을 위해 엑센딘-3 및 엑센딘-4의 인슐린자극 활성을 이용하는 것이 제안되었다 (Eng, 미국 특허 5,424,286).
말단 절단된 엑센딘 펩티드, 예를 들어, 엑센딘[9-39], 카르복시아미드화된 분자, 및 단편 3-39 내지 9-39는 GLP-1의 강력하고 선택적인 길항제인 것으로 보고되었다 (Goke, et al., J. Biol. Chem., 268: 19650-55 (1993); Raufman, J. P., et al., J. Biol. Chem., 266: 2897-902 (1991); Schepp, W., et al., Eur. J. Pharm., 269: 183-91 (1994); Montrose-Rafizadeh, et al., Diabetes, 45 (Suppl. 2): 152A (1996)). 엑센딘[9-39]는 내인성 GLP-1을 생체내에서 차단하여, 인슐린 분비를 감소시킨다 (Wang, et al., J. Clin. Invest., 95: 417-21 (1995); D'Alessio, et al., J. Clin. Invest., 97: 133-38 (1996)). GLP-1의 인슐린자극 효과에 대한 기능을 분명하게 수행하는 래트 췌장 섬(islet) 세포로부터 클로닝되었다 (Thorens, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8641-8645 (1992)). 엑센딘 및 엑센딘[9-39]는 클로닝된 GLP-1 수용체에 결합한다 (래트 췌장 세포 GLP-1 수용체: Fehmann HC, et al., Peptides, 15(3): 453-6 (1994); 인간 GLP-1 수용체: Thorens B, et al., Diabetes, 42(11): 1678-82 (1993)). 클로닝된 GLP-1 수용체로 형질감염된 세포에서, 엑센딘-4는 작용제이고, 즉, cAMP를 증가시키는 반면, 엑센딘[9-39]는 길항제이고, 즉, 엑센딘-4 및 GLP-1의 자극 작용을 차단한다. (상기 문헌).
보다 특히, 엑센딘-4는 아메리카독도마뱀 (헬로더마 호리둠)의 타액에서 발견된 39개 아미노산의 C-말단 아미드화된 펩티드이고, GLP-1 펩티드 서열에 53％ 아미노산 서열 상동성을 갖는다 (예를 들어, 문헌 [Eng, J., et al. "Isolation and Characterization of Exendin-4, and Exendin-3 Analogue from Heloderma suspectum Venom, "J. Bio. Chem., 267: 11, p. 7402-7405 (1992), Young, A. A., et al., "Glucose-Lowering and Insulin-Sensitizing Actions of Exendin-4," Diabetes, Vol. 48, p. 1026-1034, May, 1999] 참조). 그의 활성 면에서, 엑센딘-4는 GLP-1 수용체에 대한 고도 특이적 작용제이고, GLP-1처럼 인슐린 분비를 자극할 수 있다. 따라서, GLP-1처럼, 엑센딘-4는 인슐린자극성 펩티드로서 여겨진다.
그러나, GLP-1와 달리, 엑센딘-4는 GLP-1 서열을 생체내에서 신속하게 분해하는 디펩티딜 펩티다제 IV에 대한 저항성 때문에 인간에서 비교적 긴 반감기를 갖는다. 또한, GLP-1에 비해, 엑센딘-4는 인슐린 분비를 자극하는 보다 큰 능력을 갖고, 상기 자극 활성을 얻기 위해 보다 저농도의 엑센딘-4가 사용될 수 있는 것으로 나타났다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,424,286 참조). 따라서, 엑센딘-4 펩티드 또는 그의 유도체 (상기 유도체의 예에 대해서는 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 6,528,486, 및 그의 대응 국제 특허 출원 WO 01/04156를 참조한다)는 인슐린 또는 GLP-1보다 인슐린 수준의 조절곤란을 포함하는 증상 (예를 들어, 당뇨병과 같은 증상)의 치료를 위한 더 큰 잠재적인 효용성을 갖는다.
대사 질병 및 질환에 관련된 또다른 패밀리의 펩티드 호르몬은 아밀린, 칼시토닌, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드, 아드레노메듈린 및 인터메딘 ("AFP-6"으로도 알려짐)을 포함하는 아밀린 패밀리의 펩티드 호르몬이다. 아밀린은 37-아미노산 단백질 호르몬이다. 이는 인간 2형 당뇨병의 췌장의 섬에서 아밀로이드 침착물의 주성분으로서 단리되고, 정제되고 화학적으로 특성화되었다 (Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84: 8628-8632 (1987)). 아밀린 분자는 2개의 번역후 변형을 갖고: C-말단은 아미드화되고, 위치 2 및 7에서 시스테인은 가교결합되어 N-말단 루프를 형성한다. 인간 아밀린 유전자의 오픈 리딩 프레임의 서열은 Lys의 N-말단 코돈 전의 Lys-Arg 2염기성 아미노산 단백질 분해 절단 시그날, 및 CLAIMS-말단 위치 (단백질 아미드화 효소 PAM에 의한 아미드화를 위한 대표적인 서열)에서 Lys-Arg 단백질 분해 시그날 전의 Gly의 존재를 보여준다 (Cooper et al., Biochem. Biophys. Acta, 1014: 247-258 (1989)).
아밀린은 위 배출을 조절하고, 글루카곤 분비 및 음식 섭취를 억제하여, 순환혈 내 글루코스 출현 속도를 조절하는 것으로 생각된다. 이는 순환혈로부터 글루코스 소멸 속도 및 말초 조직에 의한 그의 흡수(uptake)를 조절하는 인슐린의 작용을 보충하는 것으로 보인다. 이들 작용은 아밀린이 모두 글루코스 출현 속도에 영향을 미치는 3가지 이상의 독립적인 메카니즘에 의해 식후 글루코스 제어에서 인슐린의 효과를 보충하는 것을 나타내는, 설치류 및 인간에서의 실험에 의한 발견에 의해 지지된다. 첫째로, 아밀린은 식후 글루카곤 분비를 억제한다. 건강한 성인에 비해, 1형 당뇨병의 환자는 순환 아밀린을 갖지 않고 2형 당뇨병의 환자는 식후 아밀린 농도가 감소되었다. 또한, 순환 아밀린에 결합하는 아밀린 특이적 모노클로날 항체를 주입하면 다시 대조군에 비해 글루카곤 농도를 크게 상승시켰다. 이들 두 가지 결과는 모두 식후 글루카곤 분비의 조절에서 내인성 아밀린의 생리학적 역할을 제시한다. 두번째로, 아밀린은 위장관 운동 및 위 배출을 느리게 한다. 마지막으로, 래트 아밀린의 시상하부내 주사는 래트에서 먹이 섭취를 감소시키고 시상하부에서 신경전달물질 대사를 변경시키는 것으로 나타났다. 특정 연구에서, 먹이 섭취는 래트 아밀린 및 래트 CGRP의 시상하부내 주사 후 8시간까지 유의하게 감소되었다. 인간 시험에서, 아밀린 유사체 프람린타이드 (pramlintide)는 체중 또는 체중 증가를 감소시키는 것으로 나타났다. 아밀린은 대사 질병, 예를 들어, 당뇨병 및 비만을 치료하는데 유익할 수 있다. 아밀린은 통증, 뼈 질환, 위염을 치료하기 위해, 지질, 특히 트리글리세리드를 변형시키기 위해, 또는 지방의 차별적인 손실 및 마른 조직의 이용 감소와 같은 신체 조성에 영향을 미치기 위해 또한 사용될 수 있다.
호르몬 칼시토닌 (CT)은 유도된 고칼슘혈증에 반응하는 그의 분비 및 그의 신속한 저칼슘 효과를 기초로 하여 명명되었다. 이는 그 후 C 세포로 명명된 갑상선 내의 신경내분비 세포에서 생산되고 분비된다. CT(1-32)의 가장 잘 연구된 작용은 파골세포에 대한 그의 효과이다. CT의 시험관내 효과는 파형 (ruffled) 경계의 신속한 손실 및 리소좀 효소의 감소된 방출을 포함한다. 궁극적으로, CT에 의한 파골세포 기능의 억제는 뼈 흡수를 감소시킨다. 그러나, 갑상선절제술의 경우 혈청 CT의 만성적 감소나 수질성 갑상선암에서 발견된 증가된 혈청 CT는 모두 혈청 칼슘 또는 뼈 질량의 변화와 관련된 것으로 보이지 않는다. 따라서, CT(1-32)의 주기능은 응급 상황에서 급성 고칼슘혈증과 싸우고(싸우거나) "칼슘 스트레스" 기간, 예를 들어, 성장, 임신 및 수유 동안 골격을 보호하는 것으로 보인다 (Reviewed in Becker, JCEM, 89 (4): 1512-1525 (2004) and Sexton, Current Medicinal Chemistry 6: 1067-1093 (1999)). 마우스가 정상 수준의 기초 칼슘-관련값을 갖지만, 증가된 칼슘혈 반응을 갖는 것을 밝힌, 칼시토닌 및 CGRP-I 펩티드를 모두 제거한 칼시토닌 녹아웃 마우스로부터 최근의 데이타가 이와 일치한다 (Kurihara H, et al., Hypertens Res. 2003 Feb; 26 Suppl: S105-8).
CT는 혈장 칼슘 수준에 대한 효과를 갖고, 파골세포 기능을 억제하고, 골다공증의 치료에 널리 사용된다. 치료적으로, 연어 CT (sCT)는 골 밀도를 증가시키고 최소의 부작용으로 골절률을 감소시키는 것으로 보인다. CT는 또한 지난 25년에 걸쳐, 골격의 하나 이상의 구역에서 커지거나 변형된 뼈를 생성시킬 수 있는 만성 골격 질환인 뼈의 파제트 (Paget) 병에 대한 치료제로서 성공적으로 사용되었다. CT는 또한 골다공증 동안 경험하는 뼈 통증에 대한 그의 진통 효과를 위해 널리 사용되지만, 상기 효과에 대한 메카니즘은 명백하게 이해되지 않는다.
칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP)는 그의 수용체가 신경계 및 심혈관계를 포함하여 체내에 널리 분포되어 있는 신경펩티드이다. 상기 펩티드는 지각 신경전달을 조정하는 것으로 보이고, 지금까지 발견된 가장 강력한 내인성 혈관확장성 펩티드 중 하나이다. CGRP에 대해 기록된 생물학적 효과는 염증에서 물질 P의 조정, 신경근 접합부에서 니코틴 수용체 활성, 췌장 효소 분비의 자극, 위산 분비의 감소, 말초 혈관확장, 심장 가속, 신경조절, 칼슘 대사의 조절, 골원성 자극, 인슐린 분비, 체온 증가 및 음식 섭취 감소를 포함한다 (Wimalawansa, Amylin, calcitonin gene-related peptide, calcitonin and ADM: a peptide superfamily. Crit Rev Neurobiol. 1997; 11(2-3): 167-239). CGRP의 중요한 역할은 α-CGRP의 정맥내 투여 후 평균 동맥압의 감소로 증명되는 바와 같이 그의 강력한 혈관확장 작용에 의해 다양한 기관으로 혈류를 제어하는 것이다. 혈관확장 작용은 또한 증가된 말초 교감신경 활성에 의해 유발된 상승된 말초 혈관 저항 및 높은 혈압을 보인 동종접합 녹아웃 CGRP 마우스에 대한 최근의 분석에 의해 지지된다 (Kurihara H, et al., Targeted disruption of ADM and αCGRP genes reveals their distinct biological roles. Hypertens Res. 2003 Feb; 26 Suppl: S105-8). 따라서, CGRP는 다른 작용 중에서 혈관확장 효과, 혈압 강하 효과 및 심박수의 증가를 일으키는 것으로 보인다.
울혈성 심부전증의 환자에게 CGRP를 장기 주입하면 부작용 없이 혈류역학적 기능에 지속적인 유익한 효과를 나타냈고, 이는 심부전증에서 용도를 제안한다. CGRP 용도의 다른 예로는 신부전, 급성 및 만성 관상동맥 허혈, 심장 부정맥의 치료, 다른 말초혈관 질병, 예를 들어, 레이노 (Raynaud) 현상, 거미막하 출혈, 고혈압 및 폐 고혈압이 있다. 임신 및 조기 분만의 자간전 중독증이 또한 잠재적으로 치료가능하다 (Wimalawansa, 1997). 최근 치료 용도는 편두통의 치료를 위한 CGRP 길항제의 사용을 포함한다.
아드레노메듈린 (ADM)은 펩티드를 함유하지 않는 것보다 펩티드를 함유하는 보다 많은 조직에서 거의 어느 곳에서나 발현된다. ADM의 발간된 문헌 (Hinson, J. P. et al., Endocrine Reviews (2000) 21(2): 138-167)에서는 혈관확장, 세포 성장, 호르몬 분비의 조절, 및 나트륨뇨배설항진을 포함하는 생물학적 작용의 범위를 갖는 심혈관계, 세포 성장, 중추 신경계 및 내분비계에 대한 그의 효과를 상세히 기술하고 있다. 래트, 고양이, 양 및 인간에 대한 연구는, ADM의 정맥내 주입이 강력하고 지속적인 혈압 강하를 일으키고 CGRP의 효과에 상당하다는 것을 확인하였다. 그러나, 마취된 래트에서 평균 동맥압에 대한 ADM의 혈압 강하 효과는 CGRP 길항제 CGRP8 -37 에 의해 저해되지 않고, 이는 상기 효과가 CGRP 수용체를 통해 매개되는 것이 아님을 제시한다. 마취되거나, 의식있거나 고혈압인 래트에서 인간 ADM의 긴급 또는 만성 투여는 혈압 강하가 동반되는 총 말초 저항의 유의한 감소를 일으키고, 심박수, 심박출량 및 일회 박출량이 동반 상승한다.
ADM은 또한 배아형성 및 분화에서 중요한 인자로서 및 래트 내피세포에 대한 세포자멸 생존 인자로서 제안되었다. 이는 ADM 유전자의 손실에 대한 동종접합성인 마우스가 배아형성 동안 불완전한 혈관 형성을 나타내어 임신 중기에 죽었다는, 최근의 마우스 ADM 녹아웃 연구에 의해 지지된다. ADM +/- 이종접합 마우스는 조직 손상에 대한 감수성과 함께 높은 혈압을 가진 것으로 보고되었다 (Kurihara H, et al., Hypertens Res. 2003 Feb; 26 Suppl:S105-8).
ADM은 뇌하수체, 부신, 생식 기관 및 췌장과 같은 내분비 기관에 영향을 미친다. 상기 펩티드는 뇌하수체로부터 ACTH 방출을 억제하는 역할을 하는 것으로 보인다. 부신에서, 상기 펩티드는 래트 및 인간 모두에서 부신 피질의 분비 활성에 영향을 미치는 것으로 보이고, 무손상 래트에서 부신 혈관상에서 혈관확장제로서 작용하여 부신 혈류를 증가시킨다. ADM은 여성 생식로 전체에 존재하는 것으로 보이고 정상 임신에서 혈장 수준이 상승한다. 자간전증의 래트 모델에서의 연구는 ADM이 고혈압을 역전시키고 임신 후기 동안 래트에 투여될 때 태자 (pup) 사망률을 감소시킬 수 있음을 보여준다. 임신 초기의 동물에서 또는 자간전증 모델에서는 비임신 래트에 유사한 효과를 갖지 않기 때문에, 이는 ADM이 자궁태반 심혈관계에서 중요한 조절 역할을 할 수 있음을 제안한다. 췌장에서, ADM은 경구 글루코스 시도에 대한 인슐린 반응을 약화시키고 지연시켜, 글루코스 수준을 초기에 상승시키므로 아마도 억제 역할을 한다. ADM은 또한 신장 기능에 영향을 미칠 수 있다. 말초 투여된 볼루스 (bolus)는 평균 동맥압을 유의하게 저하시키고 신장 혈류, 사구체 여과율 및 뇨 유동을 상승시킬 수 있다. 일부 경우에, Na+ 배설이 또한 증가된다.
ADM은 또한 뼈 및 폐에서 다른 말초 효과를 갖는다. 뼈에 대해, 연구는 심혈관계 및 유체 항상성을 넘어서는 역할을 지지하였고, ADM이 태아 및 성체 설치류 골모세포에 작용하여 세포 성장을 공지의 골모세포 성장인자, 예를 들어, 형질전환 성장인자-β에 상당하게 증가시키는 것을 증명한다. 골다공증 연구에서 주요 과제 중 하나가 골모세포 자극을 통해 뼈 질량을 증가시키는 요법을 개발하는 것이므로, 이는 임상적으로 중요하다. 폐에서, ADM은 폐 혈관확장을 일으킬 뿐만 아니라 히스타민 또는 아세틸콜린에 의해 유도된 기관지수축을 또한 억제한다. 래트 모델에서 폐 고혈압을 치료하기 위해 에어로졸화된 ADM을 사용하는 최근의 연구는, 평균 폐 동맥압 및 총 폐 저항이 염수를 투여한 래트보다 ADM을 사용하여 치료한 래트에서 현저하게 더 낮다는 사실에 의해 증명되는 바와 같이 상기 질병의 흡입 치료가 효과적임을 보여준다. 이 결과는 전신 동맥압 또는 심박수의 변동 없이 달성되었다 (Nagaya N et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003; 285: H2125-31).
건강한 지원자에서, ADM의 정맥내 주입은 동맥압을 감소시키고 심박수, 심박출량, 및 cAMP, 프로락틴, 노르에피네프린 및 레닌의 혈장 수준을 자극하는 것으로 나타났다. 이들 환자에서, 뇨 부피 또는 나트륨 배설의 증가는 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다. 심부전증 또는 만성 신부전증의 환자에서, 정맥내 ADM은 정상 대상에서 보이는 것과 유사한 효과를 가졌고, 또한 투여된 용량에 따라 이뇨 및 나트륨뇨배설항진을 유도하였다 (Nicholls, MG et al. Peptides. 2001; 22: 1745-1752). 실험적 ADM 치료는 또한 동맥 및 폐 고혈압, 패혈성 쇼크 및 허혈/재관류 손상에 유익한 것으로 나타났다 (Beltowski J., Pol J Pharmacol. 2004; 56: 5-27). ADM 치료에 대한 다른 예로는 말초혈관 질병, 거미막하 출혈, 고혈압, 임신 및 조기 분만의 자간전 중독증, 및 골다공증이 있다.
AFP-6 (즉, 인터메딘)의 발현은 주로 뇌하수체 및 위장관에 존재한다. AFP-6에 대한 특이적 수용체는 보고되지 않았지만; 결합 연구는 AFP-6가 아밀린 패밀리의 공지된 수용체에 모두 결합하는 것을 나타낸다. AFP-6은 내인성 CGRP 수용체를 발현하는 L6 세포 및 SK-N-MC에서 cAMP 생산을 증가시키고, 이들 세포에서 그의 수용체에 대한 결합을 위해 표지된 CGRP와 경쟁하는 것으로 나타났다. 공개된 생체내 연구에서, AFP-6 투여는 아마도 CRLR/RAMP 수용체와의 상호작용을 통해 정상 및 자발적 고혈압 래트 모두에서 혈압 감소를 일으켰다. 마우스에서 생체내 투여는 위 배출 및 음식 섭취의 억제를 일으켰다 (Roh et al. J Biol Chem. 2004 Feb 20; 279(8): 7264-74).
아밀린 패밀리 펩티드 호르몬의 생물학적 작용은 일반적으로 2개의 밀접하게 관련된 타입 II G 단백질-커플링된 수용체 (GPCR), 칼시토닌 수용체 (CTR) 및 칼시토닌 수용체 유사 수용체 (CRLR)에 대한 결합을 통해 매개되는 것으로 보고되었다. 클로닝 및 기능 연구는 CGRP, ADM 및 아밀린이 CTR 또는 CRLR 및 수용체 활성 변형 단백질 (RAMP)의 상이한 조합물과 상호작용함을 보여주었다. 많은 세포가 다수의 RAMP를 발현한다. RAMP와 CTR 또는 CRLR의 동시발현은 칼시토닌, CGRP, ADM 및 아밀린에 대한 기능성 수용체를 생성시키기 위해 필요한 것으로 생각된다. RAMP 패밀리는 30％ 미만의 서열 동일성을 갖지만 공통적인 국소 기관을 갖는 3개의 멤버 (RAMP1, -2 및 -3)를 포함한다. CRLR과 RAMP1의 동시발현은 CGRP에 대한 수용체를 형성시킨다. CRLR과 RAMP2의 동시발현은 ADM에 대한 수용체를 형성시킨다. CRLR과 RAMP3의 동시발현은 ADM 및 CGRP에 대한 수용체를 형성시킨다. hCTR2와 RAMP1의 동시발현은 아밀린 및 CGRP에 대한 수용체를 형성시킨다. hCTR2와 RAMP3의 동시발현은 아밀린에 대한 수용체를 형성시킨다.
대사 질병 및 질환에 관련되는 또다른 펩티드 호르몬 패밀리는 렙틴 패밀리이다. 순환 렙틴의 성숙 형태는 혈액-뇌 장벽 (BBB) 및 혈액-CSF 장벽에 의해 CNS로부터 정상적으로 차단되는 146-아미노산 단백질이다 (예를 들어, Weigle et al., 1995. J Clin Invest 96: 2065-2070 참조). 렙틴은 음식 섭취 및 체중을 조절하는 음성 피드백 루프에서 원심성 시그날이다. 렙틴 수용체는 시토킨 수용체 패밀리의 멤버이다. 렙틴의 식욕억제 효과는 단백질-단백질 상호작용을 위한 복수개의 모티프를 포함하는 긴 세포질내 도메인을 코딩하는 상기 수용체의 Ob-Rb 이소형의 호모다이머에 대한 결합에 의존한다. Ob-Rb는 시상하부에서 높은 수준으로 발현되고, 이것은 상기 뇌 영역이 중요한 렙틴 작용 부위임을 시사한다. 마우스 ob 유전자의 돌연변이는 비만, 체지방 침적 증가, 고혈당증, 고인슐린혈증, 저체온증, 및 수컷 및 암컷 동종접합 ob/ob 비만 마우스에서 갑상선 및 생식 기능의 손상을 포함하는 병리생리학을 보이는 증후군을 야기하는 것으로 입증되었다 (예를 들어, Ingalis, et al., 1950. J Hered 41: 317-318 참조). 렙틴 또는 렙틴 수용체의 치료 용도는 (i) 당뇨병 (예를 들어, PCT 출원 공개 WO 98/55139, WO 98/12224 및 WO 97/02004); (ii) 조혈 (예를 들어, PCT 출원 공개 WO 97/27286 및 WO 98/18486); (iii) 불임 (예를 들어, PCT 출원 공개 WO 97/15322 및 WO 98/36763); 및 (iv) 종양 억제 (예를 들어, PCT 출원 공개 WO 98/48831)를 포함한다 (상기 문헌은 그 전부가 본원에 참고로 포함됨).
렙틴 수용체 (OB-R) 유전자가 클로닝되었고 (GenBank 기탁 번호 AF098792), db 로커스에 맵핑되었다 (예를 들어, Tartaglia, et al., 1995. Cell 83: 1263-1271). 선택적 스플라이싱에 따른 OB-R의 복수개의 전사체가 확인되었다. OB-R의 결함은 표현형이 ob/ob 마우스에 동일한 돌연변이체 당뇨병 ob/ob 마우스에서 증후군을 생성시킨다 (예를 들어, Ghilardi, et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6231-6235). 그러나, ob/ob 마우스와 달리, 재조합 렙틴을 C57BLKS/J-m ob/ob 마우스에 투여하면 음식 섭취 및 체중 감소를 야기하지 않는다 (예를 들어, Roberts and Greengerg, 1996. Nutrition Rev. 54: 41-49 참조).
재조합 렙틴, 렙틴 단편 및(또는) 렙틴 수용체 변이체의 투여로부터 체중 감소 활성을 보고할 수 있는 대부분의 렙틴 관련 연구에서는 상기 구성물을 뇌실 내로 직접 투여하였다 (예를 들어, Weigle, et al., 1995. J Clin Invest 96: 2065-2070; Barash, et al., 1996. Endocrinology 137: 3144-3147 참조).
다른 연구에서는 시험 대상에 복강내 (i.p.) 투여를 통한 렙틴 펩티드로 인하여 유의한 체중 감소 활성을 보였다 (Grasso et al., 1997. Endocrinology 138: 1413-1418 참조). 또한, 렙틴 단편, 및 특히 전체 길이 인간 렙틴으로부터 취한 18개 아미노산의 단편을 포함하는 잔기는 래트의 측뇌실 이식된 캐눌러 (cannula)를 통한 직접 투여시에만 체중 감소에서 기능하는 것으로 보고되었다 (예를 들어, 그 전문을 본원에 참고로 포함하는 PCT 특허 출원 WO 97/46585 참조).
대사 질병 및 질환에 관여된 또다른 펩티드 호르몬은 콜레시스토키닌 (CCK)이다. CCK는 1928년에 담낭 수축을 자극하는 그의 능력에 의해 장관 추출물의 제제로부터 확인된 것으로 보고되었다. 그 후 췌장 분비의 자극, 지연된 위 배출, 장관 운동의 자극 및 인슐린 분비의 자극을 포함하는 CCK의 다른 생물학적 작용이 보고되었다 (Lieverse et al.,Ann. N. Y. Acad. Sci. 713: 268-272 (1994) 참조). CCK의 작용은 또한 심혈관 기능, 호흡 기능, 신경독성 및 발작, 암 세포 증식, 통각상실증, 수면, 성 및 생식 행동, 기억, 불안 및 도파민 매개 행동에 대한 효과를 포함하는 것으로 보고되었다 (Crawley and Corwin, Peptides 15: 731-755 (1994)). CCK의 다른 보고된 효과는 췌장 성장의 자극, 담낭 수축의 자극, 위산 분비의 억제, 췌장 폴리펩티드 이완, 및 연동운동의 수축 성분를 포함한다. CCK의 추가의 보고된 효과는 혈관확장을 포함한다 (Walsh, "Gastrointestinal Hormones," In Physiology of the Gastrointestinal Tract 3d ed. 1994; Raven Press, New York).
글루카곤, CCK 및 봄베신의 조합물을 주사하면 개별 화합물을 사용할 때 관찰된 억제에 비해 비박탈 래트에서 가당연유 시험식의 섭취 억제를 증가시키는 것으로 보고되었다 (Hinton et al., Brain Res. Bull. 17: 615-619 (1986)). 또한, 글루카곤 및 CCK가 래트에서 헛급식을 상승적으로 억제하는 것으로 보고되었다 (LeSauter and Geary, Am. J. Physio. 253: R217-225 (1987); Smith and Gibbs, Annals N.Y. Acad. Sci. 713: 236-241 (1994)). 또한, 에스트라디올 및 CCK가 포만감에 대한 상승 효과를 가질 수 있다고 제시되었다 (Dulawa et al., Peptides 15: 913-918 (1994); Smith and Gibbs, 상기 문헌). 또한, 그 내부의 영양분에 반응하여 소장에서 발생하는 시그날이 CCK와 상승적으로 상호작용하여 음식 섭취를 감소시킬 수 있음이 제안되었다 (Cox, Behav. Brain Res. 38:35-44 (1990)). 부가적으로, CCK는 여러 종에서 포만감을 유도하는 것으로 보고되었다. 예를 들어, 래트에서 복강내, 돼지에서 동맥내, 고양이 및 돼지에서 정맥내, 원숭이, 래트, 개 및 양에서 뇌실내, 및 비만 및 비비만 인간에서 정맥내 주사된 CCK에 의해 섭식 억제가 유발되었다고 보고되었다 (Lieverse et al., 상기 문헌). 여러 연구소에서 보고된 연구는 원숭이 및 래트 모두에서 음식에 대한 반응을 비음식 강화물에 대한 반응과 비교함으로써 및 CCK가 음식 섭취 후 정상적으로 관찰된 거동의 순서 (즉, 식후 포만 순서)를 유도함을 보여줌으로써, 급식 억제에 대한 저용량의 CCK의 행동적 특이성을 확인한 것으로 보고하였다. 부가적으로, CCK 후의 행동을 음식 섭취 자체 또는 CCK와 조합한 후의 행동과 비교하면 CCK와 음식 섭취 사이의 행동 유사성을 밝힌 것으로 보고되었다 (Crawley and Corwin, 상기 문헌). CCK가 생리학적인 혈장 농도에서 마른 인간 및 비만 인간 모두에서 음식 섭취를 억제하고 포만감을 증가시키는 것이 또한 보고되었다 (Lieverse et al., 상기 문헌).
CCK는 1966년에 33-아미노산 펩티드로서 특성화되었다 (Crawley and Corwin, 상기 문헌). CCK의 아미노산 서열의 종-특이적 분자 변이체가 확인되었다. 33-아미노산 서열 및 말단 절단된 펩티드, 그의 8-아미노산 C-말단 서열 (CCK-8)은 돼지, 래트, 닭, 친칠라, 개 및 인간에서 확인된 것으로 보고되었다. 39-아미노산 서열은 돼지, 개 및 기니아 피그에서 발견된 것으로 보고되었다. 58-아미노산 서열은 고양이, 개 및 인간에서 발견된 것으로 보고되었다. 개구리 및 거북이는 CCK 및 가스트린에 상동성인 47-아미노산 서열을 보이는 것으로 보고되었다. 매우 신선한 인간 창자는 소량의 CCK-83으로 명명된 훨씬 더 큰 분자를 함유하는 것으로 보고되었다. 래트에서, 주요 중간체 형태가 확인된 것으로 보고되었고 CCK-22로 명명되었다 (Walsh, "Gastrointestinal Hormones," In Physiology of the Gastrointestinal Tract (3d ed. 1994; Raven Press, New York). 비-황산화 CCK-8 및 테트라펩티드 (CCK-4 (CCK(30-33)로 명명됨)가 래트 뇌에서 보고되었다. C-말단 펜타펩티드 (CCK-4 (CCK(29-33)로 명명됨)는 CCK의 구조적 상동성, 및 또한 신경펩티드, 가스트린과의 상동성을 보존한다. C-말단 황산화 옥타펩티드 서열인 CCK-8은 전체 종에서 비교적 보존되는 것으로 보고되었다. 래트 갑상선 암종, 돼지 뇌, 및 돼지 창자로부터 프리프로콜레시스토키닌을 코딩하는 cDNA의 클로닝 및 서열 분석은 단리된 것으로 앞서 보고된 모든 CCK 서열을 함유하는 115개 아미노산의 CCK 전구체를 코딩하는 345 뉴클레오티드를 밝힌 것으로 보고하였다 (Crawley and Corwin, 상기 문헌).
CCK는 중추신경계 전체에 및 내분비 세포 및 상부 소장의 내장 신경에 분포되는 것으로 말해진다. CCK 작용제는 CCK 자체 (또한 CCK-33으로도 불림), CCK-8 (CCK(26-33)), 비-황산화 CCK-8, 펜타가스트린 (CCK-5 또는 CCK(29-33)), 및 테트라펩티드, CCK-4 (CCK(30-33))을 포함한다. 췌장 CCK 수용체에서, CCK-8은 비황산화 CCK-8 또는 CCK-4보다 1000-5000배 더 큰 효력으로 결합을 대체하는 것으로 보고되었고, CCK-8은 췌장 아밀라제 분비를 자극하는데 있어서 비황산화 CCK-8 또는 CCK-4보다 약 1000배 더 강력한 것으로 보고되었다 (Crawley and Corwin, 상기 문헌). 대뇌 피질로부터의 균질액에서, CCK 수용체 결합은 황산화 CCK-8과 등몰, 10배 또는 100배 더 큰 농도에서 비황산화 CCK-8에 의해 및 CCK-4에 의해 대체된다고 하였다 (상기 문헌).
CCK에 대한 수용체는 다양한 조직에서 확인된다고 보고되었고, 2가지 주요 서브타입이 설명되었다: 타입 A 수용체 및 타입 B 수용체. 타입 A 수용체는 췌장, 담낭, 유문 괄약근 및 원심성 미주신경 섬유을 포함하는 말초 조직에서, 및 뇌의 개별 영역에서 보고되었다. 타입 A 수용체 서브타입 (CCKA)은 황산화 옥타펩티드에 대해 선택적인 것으로 보고되었다. 타입 B 수용체 서브 타입 (CCKB)는 뇌 전체 및 위에서 확인되었고, 황산화 또는 8개의 모든 아미노산을 필요로 하지 않는 것으로 보고되었다 (Reidelberger, J. Nutr. 124 (8 Suppl.) 1327S-1333S (1994); Crawley and Corwin, 상기 문헌).
대사 질병 및 질환에 관여되는 또다른 패밀리의 펩티드 호르몬은 췌장 폴리펩티드 패밀리 ("PPF")이다. 췌장 폴리펩티드 ("PP")는 인슐린 추출물의 오염물질로서 발견되었고 기능적 중요성보다 기원 기관의 명칭을 땄다 (Kimmel et al., Endocrinology 83: 1323-30(1968)). PP는 특유한 구조적 모티프를 함유하는 36-아미노산 펩티드이다. 관련 펩티드가 창자 추출물에서 후속적으로 발견되었고 N- 및 C-말단 티로신 때문에 펩티드 YY ("PYY")로 명명되었다 (Tatemoto, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2514-8 (1982)). 제3의 관련 펩티드는 그후 뇌 추출물에서 발견되었고 신경펩티드 Y ("NPY")로 명명되었다 (Tatemoto, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5485-9 (1982); Tatemoto et al., Nature 296: 659-60 (1982)).
이들 3개의 관련 펩티드는 다양한 생물학적 효과를 발휘하는 것으로 보고되었다. PP의 효과는 췌장 분비의 억제 및 담낭의 이완을 포함한다. 중추 투여된 PP는 시상하부 및 뇌간에 위치하는 수용체에 의해 매개될 수 있는 섭식에서 중간 정도의 증가를 일으킨다 (Gehlert, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 218: 7-22 (1998)).
PYY의 방출은 식사 후 일어난다. PYY의 별도의 분자형은 PYY(3-36)이다 (Eberlein et al., Peptides 10: 797-803 (1989); Grandt et al., Regul. Pept. 51: 151-9 (1994)). 상기 단편은 인간 및 개 장관 추출물에서 총 PYY-유사 면역반응성의 약 40％ 및 공복 상태에서 총 혈장 PYY 면역반응성의 약 36％ 내지 식사 후 50％ 이상을 구성한다. 이는 명백하게 PYY의 디펩티딜 펩티다제-IV (DPP4) 절단 생성물이다. PYY(3-36)은 N-말단에서 말단 절단된 (즉, 그의 C-말단 단편) NPY 유사체를 취하는데 약물학적으로 특유한 것으로 나타나는 Y2 및 Y5 수용체에서 선택적인 리간드인 것으로 보고되었다. PYY의 말초 투여는 위산 분비, 위 운동, 외분비 췌장 분비 (Yoshinaga et al., Am. J. Physio. 263: G695-701 (1992); Guan et al., Endocrinology 128: 911-6 (1991); Pappas et al., Gastroenterology 91: 1386-9 (1986)), 담낭 수축 및 장관 운동 (Savage et al., Gut 28: 166-70 (1987))을 감소시키는 것으로 보고되었다. 후뇌/뇌간 (Chen and Rogers, Am. J. Physiol. 269: R787-92 (1995); Chen et al., Regul. Pept. 61:95-98 (1996); Yang and Tache, Am. J. Physiol. 268: G943-8 (1995); Chen et al., Neurogastroenterol. Motil. 9: 109-16 (1997))에 또는 그 주변에 직접 주사 후 관찰되는 바와 같은 위 배출, 위 운동 및 위산 분비에 대한 PYY의 중추 주사의 효과는 말초 주사 후 관찰된 효과와 상이할 수 있다. 예를 들어, 중추 투여된 PYY는 위산 분비가 억제되지 않고 자극된 점에서 말초 주사된 PYY(3-36)에 대해 본원에 기술한 것에 반대되는 몇몇 효과를 가졌다. 위 운동은 TRH 자극과 함께인 경우에만 억제되었고 단독으로 투여될 때는 그렇지 않았고, PP 수용체와 추정된 상호작용을 통해 보다 고용량에서 실제로 자극성이었다. PYY는 중추 투여 후 음식 및 물 섭취를 자극하는 것으로 나타났다 (Morley et al., Brain Res. 341: 200-3(1985); Corpet al., Am. J. Physiol. 259: R317-23 (1990)).
대사 질병 및 질환은 비만, 당뇨병, 이상지혈증, 인슐린 저항, 세포의 세포자멸 등을 포함하는 많은 형태를 취한다. 비만 및 그의 관련 질환은 미국 및 전세계에서 일반적이고 매우 심각한 공중 보건 문제이다. 상체 비만은 2형 당뇨병에 대해 공지된 최대 위험 인자이고, 심혈관 질병에 대한 강한 위험 인자이다. 비만은 고혈압, 아테롬성 경화증, 울혈성 심부전, 뇌졸중, 담낭 질병, 골관절염, 수면 무호흡, 생식 질환, 예를 들어, 다낭성 난소증후군, 유방, 전립선 및 결장의 암, 및 일반적 무감각증의 합병증의 발병 증가에 대한 인정되는 위험 인자이다 (예를 들어, Kopelman, Nature 404: 635-43 (2000) 참조). 이는 수명을 감소시키고 상기한 것과 또한 감염, 정맥류, 흑색가시세포증, 습진, 운동 불내성, 인슐린 저항, 고혈압 고콜레스테롤혈증, 담석증, 정형외과적 손상, 및 혈전색전성 질병과 같은 질환의 동반이환율의 심각한 위험을 갖는다 (Rissanen et al., Br. Med. J. 301: 835-7 (1990)). 비만은 또한 인슐린 저항 증후군, 또는 "증후군 X"로 불리는 병의 집단에 대한 위험 인자이다. 비만 및 관련 질환의 의료 비용에 대한 최근의 추정치는 세계적으로 1500억불이다. 비만의 발병기전은 다인성인 것으로 생각되지만, 기본 문제는 비만 환자에서 영양분 이용률 및 에너지 소모가 균형을 이루지 않아 과도한 지방 조직이 존재하게 되는 것이다. 비만은 현재 치료가 불량하고, 만성적이며, 특히 난치성인 대사 질환이다. 비만인의 체중 감소에 유용한 치료 약물은 그들의 건강에 충분한 유익한 효과를 가질 수 있다.
당뇨병은 인슐린의 불충분한 생산 또는 이용으로 인한 고혈당 및 당뇨를 특징으로 하는 탄수화물 대사의 장애이다. 당뇨병은 선진국에서 인구 집단의 큰 부분의 삶의 질에 심각하게 영향을 미친다. 인슐린의 불충분한 생산은 1형 당뇨병의 특징이고, 인슐린의 불충분한 이용은 2형 당뇨병의 특징이다. 그러나, 명백한 당뇨병으로 진단되기 오래전에 발병하는 많은 다른 당뇨병 관련 질병이 존재하는 것이 현재 널리 인정되고 있다. 또한, 당뇨병에서 글루코스 대사의 적절하지 않은 제어로 인한 영향은 넓은 스펙트럼의 관련 지질 및 심혈관 질환을 일으킨다.
이상지혈증, 또는 혈장 내 비정상 수준의 지단백질은 당뇨병에서 빈번하게 발생한다. 이상지혈증은 전형적으로 혈액 중 상승된 혈장 트리글리세리드, 저 HDL (고밀도 지단백질) 콜레스테롤, 정상 내지 상승된 수준의 LDL (저밀도 지단백질) 콜레스테롤, 및 증가된 수준의 작은 치밀한 LDL (저밀도 지단백질) 입자를 특징으로 한다. 이상지혈증은 당뇨병 환자에 관상동맥 사건 및 사망의 발생을 증가시키는 주요 원인 중 하나이다. 역학 연구는 비당뇨병 대상과 비교할 때 당뇨병 환자에 관상동맥 사망을 수배 증가시킴을 보임으로써 이를 확인하였다. 몇몇 지단백질 이상은 당뇨병 환자들 사이에서 설명된 바 있다.
인슐린 저항은 넓은 범위의 농도에 걸쳐 그의 생물학적 작용을 발휘하는 인슐린의 능력이 감소된 것이다. 인슐린 저항에서, 신체는 상기 결함을 보충하기 위해 비정상적으로 다량의 인슐린을 분비하고 손상된 내당성 상태가 발현된다. 결함이 있는 인슐린 작용에 대해 보충하지 못하면, 혈장 글루코스 농도가 필연적으로 상승하여, 당뇨병의 임상 상태를 일으킨다. 인슐린 저항 및 관련 고인슐린혈증이 비만, 고혈압, 아테롬성 경화증 및 2형 당뇨병에서 작용하는 것으로 인정되고 있다. 인슐린 저항과 비만, 고혈압 및 협심증의 연관은 일반적인 발병 고리로서 인슐린 저항을 갖는 증후군인 증후군 X로서 설명되었다.
세포자멸은 정상적인 발생 동안 발생하는 외인성 및 내재성 시그날에 의해 조절되는 세포 자가파괴의 능동적인 과정이다. 세포자멸은 췌장 내분비 베타 세포의 조절에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 잘 연구되어 있다. 성인 포유동물에서 베타 세포 집단은 특정 조건, 예를 들어, 임신 및 비만시에 정상혈당을 유지하도록 인슐린을 생산하기 위해 크게 변화된다는 것을 보여주는 증거가 증가하고 있다. 베타 세포 집단의 조절은 세포 증식, 성장 및 프로그램된 세포 사멸 (세포자멸) 사이의 미세한 균형에 의존한다. 상기 균형의 교란은 글루코스 항상성을 손상시킬 수 있다. 예를 들어, 당 불내성은 베타 세포 복제 속도가 감소될 때 노화와 함께 발병하는 것이 주목할 만하고, 인간 부검 연구는 비당뇨병 대상에 비해 인슐린 비의존성 당뇨병의 환자에서 베타 세포 질량의 40-60％ 감소를 보인다고 반복적으로 보고하였다. 인슐린 저항은 비만에 불가피하게 수반되지만, 2형 당뇨병이 개시되는 지점인 베타 세포가 인슐린에 대한 증가된 수요를 만족할 수 없게 될 때까지 보충적 고인슐린혈증에 의해 정상혈당은 유지된다고 일반적으로 동의되고 있다.
당뇨병과 관련된 다수의 이상을 치료하려는 시도는 상이한 환자에서 이들 이상을 다루기 위해 수종의 항-당뇨병 의약을 투여하였다. 항-당뇨병 의약의 예는 단백질, 예를 들어, 인슐린 및 인슐린 유사체, 및 소분자, 예를 들어, 인슐린 민감제, 인슐린 분비촉진제 및 식욕 조절 화합물이다.
상기한 대사 질병, 병 및 질환에 유용한 폴리펩티드를 개발하는 것이 여전히 필요하다. 따라서, 본 발명의 목적은 하이브리드 폴리펩티드 및 이들의 제조 및 사용 방법을 제공하는 것이다.
본원에 언급된 모든 문헌은 본원에서 충분히 제시된 것처럼 본원에 참고로 포함된다.
<발명의 개요>
본 발명은 일반적으로 혈장 글루코스 수준, 인슐린 수준 및(또는) 인슐린 분비의 제어에 의해 완화될 수 있는 대사 질병 및 질환, 예를 들어, 당뇨병 및 당뇨병 관련 증상의 치료 및 예방을 위한 물질로서 유용한 신규한 선택가능한 하이브리드 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 증상 및 질환으로는 고혈압, 이상지혈증, 심혈관 질병, 식이 장애, 인슐린 저항, 비만, 및 1형, 2형 및 임신 당뇨병을 포함하는 임의의 종류의 당뇨병이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 한 측면에서, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 하이브리드 폴리펩티드가 제공된다. 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 함께 공유 연결된 2개 이상의 생활성 펩티드 호르몬 모듈을 포함하고, 하나 이상의 생활성 펩티드 호르몬 모듈은 성분 펩티드 호르몬의 호르몬 활성을 한가지 이상 보인다. 생활성 펩티드 호르몬 모듈은 성분 펩티드 호르몬, 성분 펩티드 호르몬의 호르몬 활성을 한가지 이상 나타내는 성분 펩티드 호르몬의 단편, 성분 펩티드 호르몬의 호르몬 활성을 한가지 이상 나타내는 유사체 및 유도체, 성분 펩티드 호르몬의 호르몬 활성을 한가지 이상 나타내는 성분 펩티드 호르몬의 유사체 및 유도체의 단편, 및 펩티드 인핸서로부터 독립적으로 선택된다.
본 발명의 성분 펩티드 호르몬은 아밀린, 아드레노메듈린 (ADM), 칼시토닌 (CT), 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP), 인터메딘, 콜레시스토키닌 ("CCK"), 렙틴, 펩티드 YY (PYY), 글루카곤 유사 펩티드-1 (GLP-1), 글루카곤 유사 펩티드 2 (GLP-2), 옥신토모듈린 (OXM) 및 엑센딘-4를 포함하고, 본 발명의 펩티드 인핸서는 목적하는 화학적 안정성, 형상 안정성, 대사 안정성, 수용체 상호작용, 프로테아제 억제, 또는 다른 약동학적 특성을 하이브리드 폴리펩티드에 부여하는 성분 펩티드 호르몬의 구조적 모티프, 및 목적하는 화학적 안정성, 형상 안정성, 대사 안정성, 수용체 상호작용, 프로테아제 억제 또는 다른 약동학적 특성을 하이브리드 폴리펩티드에 부여하는 성분 펩티드 호르몬의 유사체 또는 유도체의 구조적 모티프를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에서, 그를 필요로 하는 대상에게 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드의 치료 또는 예방 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 비만의 치료 또는 예방 방법이 제공된다. 바람직한 실시태양에서, 투여 대상은 비만 또는 과체중 대상이다. "비만"은 일반적으로 본원의 목적상 30 이상의 체질량 지수로 정의되지만, 체중을 저하시킬 필요가 있거나 이를 원하는, 체질량 지수가 30 미만인 대상을 포함하는 임의의 대상도 "비만"의 범위에 포함된다. 인슐린 저항, 당 불내성이거나 임의의 형태의 당뇨병 (예를 들어, 1형, 2형 또는 임신 당뇨병)을 갖는 대상이 본 발명의 방법으로부터 도움을 받을 수 있다.
본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 음식 섭취의 감소, 영양분 이용률의 감소, 체중 감소, 당뇨병 또는 당뇨병 관련 병의 치료, 및 지질 프로파일의 개선 (LDL 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준의 감소 및(또는) HDL 콜레스테롤 수준의 변경 포함)을 위한 방법이 제공된다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드의 치료 또는 예방 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상에서 영양분 이용률을 감소시킴으로써 완화될 수 있는 병 또는 질환의 치료 또는 예방에 사용된다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 방법은 혈장 글루코스 수준, 인슐린 수준 및(또는) 인슐린 분비의 조절에 의해 완화될 수 있는 병 또는 질환의 치료 또는 예방에 사용된다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 방법은 당뇨병 및(또는) 당뇨병 관련 병의 치료에 사용된다. 상기 병 및 질환은 고혈압, 이상지혈증, 심혈관 질병, 식이 장애, 인슐린 저항, 비만, 및 1형, 2형 및 임신 당뇨병을 포함하여 임의의 종류의 당뇨병, 당뇨병 합병증, 신경병증 (예를 들어, 엑센딘-4의 향신경 작용을 기초로 한), 신경병 통증 (예를 들어, 아밀린 작용을 기초로 한), 망막병증, 신장병증, 불충분한 췌장 베타 세포 집단의 병 (예를 들어, 엑센딘-4 및 GLP-1의 섬 신생 작용에 기초로 한)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 치료 또는 예방 유효량의 적어도 하나의 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드 또는 그의 제약학상 허용되는 염을 제약학상 허용되는 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 보조제 및(또는) 하이브리드 폴리펩티드의 전달에 유용한 담체와 함께 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 이들 및 다른 측면은 하기 바람직한 실시태양 및 상세한 설명을 참고로 하여 보다 분명하게 이해될 것이다.
<발명의 상세한 설명>
본 발명은 일반적으로 혈장 글루코스 수준, 인슐린 수준 및(또는) 인슐린 분비의 제어에 의해 완화될 수 있는 대사 질병 및 질환, 예를 들어, 당뇨병 및 당뇨병 관련 증상의 치료 및 예방을 위한 물질로서 유용한 신규한 선택가능한 하이브리드 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 증상 및 질환으로는 고혈압, 이상지혈증, 심혈관 질병, 식이 장애, 인슐린 저항, 비만, 및 1형, 2형 및 임신 당뇨병을 포함하는 임의의 종류의 당뇨병이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
한 측면에서, 본 발명은 "생활성", 예를 들어, 치료 효능, 기능 범위, 작용 기간, 물리화학적 특성 및(또는) 다른 약동학적 특성을 기초로 하여 선택할 수 있는 생리학적으로, 대사적으로 및(또는) 약동학적으로 활성인 펩티드 모듈의 모듈 어셈블리를 수반한다.
이론에 매이기를 의도하지 않지만, 적어도 부분적으로 본 발명은 선택가능한 특성을 갖는 신규한 효능있는 치료제를 생성시키기 위해서, 생활성 펩티드 호르몬 모듈이 2차, 3차 또는 그 이상의 차수 조합으로 연결되는 "도구 상자" 방법에 관한 것이다. "생활성 펩티드 호르몬 모듈"은 펩티드 호르몬, 호르몬 활성을 갖는 펩티드 단편 또는 화학적, 대사적 및(또는) 다른 약동학적 안정성을 부여하는 펩티드 호르몬의 구조적 모티프일 수 있다. 펩티드 호르몬은 천연 펩티드 호르몬, 및 당업계에 공지되고 본원에서 설명되는 바와 같은 펩티드 호르몬 유사체 및 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 2 이상의 펩티드 호르몬의 특정 물리화학적 특성을 단일 양식으로 조합하면 기능장애성 대사 회로의 여러 지점에서의 개입을 용이하게 할 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 한 측면에서 선택가능한 생활성을 단일 폴리펩티드 물질 내로 통합시키는, 합리적으로 디자인된 하이브리드 폴리펩티드가 제공된다. 한 실시태양에서, 본 발명의 선택가능한 하이브리드 폴리펩티드는 생활성 모듈을 공유 부착시키기 위해 화학적으로 안정한 링커의 사용을 수반할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 선택가능한 하이브리드 폴리펩티드는 그 자체가 생활성 모듈의 일부이거나 일부를 형성할 수 있는 절단가능한 링커의 사용을 수반할 수 있다.
이론에 매이기를 의도하지 않지만, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드의 디자인은 일반적으로 (1) 목적하는 효능 및 치료 용도를 위한 생활성 펩티드 호르몬 모듈의 확인, 선택 및 페어링, 및 (2) 성분 모듈의 생활성을 상실하지 않으면서 직접 또는 링커를 통한 생활성 모듈 (예를 들어, 천연 펩티드 호르몬, 호르몬 활성을 갖는 펩티드 호르몬 유사체 또는 유도체, 호르몬 활성을 갖는 펩티드 호르몬 단편 및 안정화 모티프 등)의 공유 연결을 수반할 수 있다. 특정 실시태양에서, 모듈 선택 기준으로는 (a) 목적하는 치료 또는 예방 징후를 위해 요구되는 생체내 효능, (b) 다중 치료 또는 예방 징후를 위한 연결된 모듈의 임의의 시너지 효과 또는 이중 작용 및(또는) (c) 목적하는 화학적 안정성, 형상 안정성, 대사 안정성, 수용체 상호작용, 프로테아제 억제 및(또는) 다른 약동학적 특성이 있고, 이로 제한되지 않는다.
섹션의 표제는 단지 분류를 위해 본원에서 사용되는 것으로서, 본원에서 설명되는 주제를 어떠한 방식으로도 제한하지 않음을 이해하여야 한다.
본 발명의 하이브리드 폴리펩티드
상기한 바와 같이, 본 발명은 부분적으로 본원에서 설명되는 성분 펩티드 호르몬으로부터 선택가능한 2개 이상의 생활성 펩티드 호르몬 모듈을 포함하는 하이브리드 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 일반적으로 대사 질환 및 병의 치료 및 예방에 유용할 것이다. 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 성분 펩티드 호르몬의 호르몬 활성을 한가지 이상 보일 것이고, 바람직하게는 제2 성분 펩티드 호르몬의 생활성을 추가로 한가지 이상 포함할 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 2개 이상의 생활성 펩티드 호르몬 모듈을 포함할 수 있고, 여기서 상기 각각의 2개 이상의 생활성 펩티드 호르몬 모듈은 성분 펩티드 호르몬의 호르몬 활성을 한가지 이상 보인다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 2개 이상의 생활성 펩티드 호르몬 모듈을 포함할 수 있고, 여기서 하나 이상의 상기 생활성 펩티드 호르몬 모듈은 성분 펩티드 호르몬의 호르몬 활성을 한가지 이상 보이고, 하나 이상의 상기 생활성 펩티드 호르몬 모듈은 목적하는 화학적 안정성, 형상 안정성, 대사 안정성, 수용체 상호작용, 프로테아제 억제 및(또는) 다른 약동학적 특성을 하이브리드 폴리펩티드에 부여한다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 성분 펩티드 호르몬에 비해 대사 질환 및 병의 치료 및(또는) 예방에 대한 동등하거나 더 높은 효과를 가질 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 성분 펩티드 호르몬에 비해 당뇨병 및(또는) 당뇨병 관련 질환의 치료 및(또는) 예방에 대한 동등하거나 더 높은 효과를 가질 수 있다. 별법으로, 바람직한 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 성분 펩티드 호르몬에 비해 개선된 제조 용이성, 안정성 및(또는) 제제화 용이성을 보일 수 있다.
보다 특히, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 일반적으로 하나 이상의 추가의 생활성 펩티드 호르몬 모듈에 공유 연결된 제1 생활성 펩티드 호르몬 모듈을 포함할 것이다. 생활성 펩티드 호르몬 모듈은 아래에서 상세히 설명하는 직접 아미드 결합 또는 화학적 링커기를 포함하여 이로 제한되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 방식으로 함께 공유 연결될 수 있다. 한 실시태양에서, 화학적 링커기는 폴리펩티드 형상을 유도하거나 안정화시키는 펩티드 모방체를 포함할 수 있다.
제1 생활성 펩티드 호르몬 모듈은 제1 성분 펩티드 호르몬으로부터 선택할 수 있고, 목적하는 화학적 안정성, 형상 안정성, 대사 안정성, 수용체 상호작용, 프로테아제 억제 및(또는) 다른 약동학적 특성을 하이브리드 폴리펩티드에 부여하는 펩티드 호르몬 (천연 펩티드 호르몬 및 그의 유사체 및 유도체 포함), 호르몬 활성을 갖는 펩티드 단편 (천연 펩티드 호르몬의 단편 및 그의 유사체 및 유도체 포함) 또는 펩티드 호르몬의 구조적 모티프 (천연 펩티드 호르몬 및 그의 유사체 및 유도체 포함)일 수 있다. 유사하게, 추가의 생활성 펩티드 모듈(들)은 성분 펩티드 호르몬으로부터 선택될 수 있고, 목적하는 화학적 안정성, 형상 안정성, 대사 안정성, 수용체 상호작용, 프로테아제 억제 및(또는) 다른 약동학적 특성을 하이브리드 폴리펩티드에 부여하는 펩티드 호르몬 (천연 펩티드 호르몬 및 그의 유사체 및 유도체 포함), 호르몬 활성을 갖는 펩티드 단편 (천연 펩티드 호르몬의 단편 및 그의 유사체 및 유도체 포함) 또는 호르몬 펩티드의 구조적 모티프 (천연 펩티드 호르몬 및 그의 유사체 및 유도체 포함)일 수 있다. 제1 펩티드 호르몬 및 추가의 펩티드 호르몬은 생활성 펩티드 호르몬 모듈의 목적하는 특징에 따라 동일한 펩티드 호르몬일 수 있거나, 펩티드 호르몬의 동일한 패밀리일 수 있거나, 상이한 펩티드 호르몬일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "생활성"은 (1) 적어도 하나의 생체내 호르몬 경로에서의 생물학적 활성, 또는 (2) 상기 생물학적 활성의 치료 효능, 기능 범위, 작용 기간, 물리화학적 특성 및(또는) 다른 약동학적 특성의 조절을 의미한다. 생물학적 활성은 표적 호르몬 수용체 결합 분석 또는 당업계에 공지되고 본원에서 설명되는 생리학적인 징후를 모니터하는 대사 연구를 통해 평가될 수 있다. 상기 생물학적 활성의 치료 효능, 기능 범위, 작용 기간, 물리화학적 특성 및(또는) 다른 약동학적 특성의 조절은 예를 들어, 화학적 안정성, 형상 안정성, 대사 안정성, 수용체 상호작용, 프로테아제 억제 및(또는) 다른 약동학적 특성의 변경을 통해 변형될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 성분 펩티드 호르몬의 생물학적 활성의 약 25％ 이상, 바람직하게는 약 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％를 보유한다. 바람직한 하이브리드 폴리펩티드는 당업계에 공지되거나 본원에서 설명되는 대사 관련 분석 (예를 들어, 수용체 결합, 음식 섭취, 위 배출, 췌장 분비, 인슐린 분비, 혈중 글루코스 저하, 체중 감소 등) 중의 하나에서 동일한 분석에서의 성분 펩티드 호르몬의 효과와 동일하거나 더 큰 효과를 갖는 것이다. 별법으로, 바람직한 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 성분 펩티드 호르몬에 비해 개선된 제조 용이성, 안정성 및(또는) 제제화 용이성을 보일 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 영양분 이용률의 감소, 음식 섭취의 감소, 체중 증가의 효과 및(또는) 대사 질환 및 증상의 치료 및 예방의 측면에서 천연 성분 펩티드 호르몬의 생물학적 활성의 약 25％ 이상, 바람직하게는 약 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％를 보유한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 영양분 이용률의 감소, 음식 섭취의 감소, 체중 증가의 효과 및(또는) 대사 질환 및 병의 치료 및 예방의 측면에서 천연 펩티드 호르몬의 생물학적 활성의 약 110％, 125％, 130％, 140％, 150％, 200％ 또는 그 이상을 보인다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 개선된 성분 펩티드 호르몬 수용체 작용제 활성을 보인다.
성분 펩티드 호르몬, 유사체 및 유도체
성분 펩티드 호르몬은 일반적으로 (a) 아밀린 패밀리, 예를 들어, 아밀린, 아드레노메듈린 ("ADM"), 칼시토닌 ("CT"), 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 ("CGRP"), 인터메딘 ("AFP-6"으로도 알려짐) 및 관련 펩티드; (b) 콜레시스토키닌 ("CCK"); (c) 렙틴 패밀리, 예를 들어, 렙틴 및 렙틴 유사 펩티드; (d) 췌장 폴리펩티드 패밀리, 예를 들어, 췌장 폴리펩티드 ("PP") 및 펩티드 YY ("PYY"); 및 (e) 인크레틴 및 인크레틴 모방체, 예를 들어, 프로글루카곤 유전자로부터 유래한 펩티드 호르몬, 예를 들어, 글루카곤, 글루카곤 유사 펩티드-1 ("GLP-1"), 글루카곤 유사 펩티드 2 ("GLP-2") 및 옥신토모듈린 ("OXM"); 및 엑센딘, 예를 들어, 엑센딘-3 및 엑센딘-4를 포함하는, 대사 질병 및 질환의 치료 또는 예방에 유용한 펩티드 호르몬을 포함한다. 상기 논의한 바와 같이, 본 발명의 성분 펩티드 호르몬은 상기 천연 펩티드 호르몬의 호르몬 활성을 갖는 유사체 및 유도체도 포함한다. 한 실시태양에서, 상기 유사체 및 유도체는 표적 호르몬 수용체의 작용제이다.
"아밀린"은 1993년 8월 10일 등록된 미국 특허 5,234,906 ("Hyperglycemic Compositions", 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이 아밀린으로 언급되는, 췌장의 베타 세포로부터 분비되는 인간 펩티드 호르몬 및 그의 종 변이체를 의미한다. 보다 특히, 아밀린은 영양 흡수에 반응하여 췌장 베타 세포에 의해 인슐린과 함께 정상적으로 동시 분비되는 37개 아미노산의 폴리펩티드 호르몬이다 (예를 들어, Koda et al., Lancet 339:1179-1180, 1992 참조). 상기 의미에서, "아밀린", "야생형 아밀린" 및 "천연 아밀린", 즉 비변형 아밀린은 상호교환하여 사용될 수 있다.
"아드레노메듈린" 또는 "ADM"은 인간 펩티드 호르몬 및 그의 종 변이체를 의미한다. 보다 특히, ADM는 연속적인 효소에 의한 절단 및 아미드화를 통해 185개 아미노산의 프리프로호르몬으로부터 생성된다. 이 과정은 최종적으로 52개 아미노산의 생활성 펩티드를 생성시킨다.
"칼시토닌" 또는 "CT"는 연어 칼시토닌 ("sCT")을 포함하는 인간 펩티드 호르몬 및 그의 종 변이체를 의미한다. 보다 특히, CT는 더 큰 프로호르몬으로부터 절단된 32개 아미노산의 펩티드이다. 이것은 아미노 말단이 고리의 형태를 취하도록 하는 1개의 디술피드 결합을 포함한다. 칼시토닌 pre-mRNA의 선택적 스플라이싱은 칼시토닌 유전자 관련 펩티드를 코딩하는 mRNA를 생성시킬 수 있고; 이 펩티드는 신경 및 혈관계에서 기능하는 것으로 보인다. 칼시토닌 수용체는 클로닝되어 세븐-트랜스멤브레인, G 단백질-커플링된 수용체 패밀리의 멤버로 밝혀졌다.
"칼시토닌 유전자 관련 펩티드" 또는 "CGRP"는 임의의 생리학적인 형태의 인간 펩티드 호르몬 및 그의 종 변이체를 의미한다.
"인터메딘" 또는 "AFP-6"은 임의의 생리학적인 형태의 인간 펩티드 호르몬 및 그의 종 변이체를 의미한다.
"콜레시스토키닌" 또는 "CCK"는 인간 펩티드 호르몬 및 그의 종 변이체를 의미한다. 보다 특히, CCK는 인간에서 처음 확인된 33-아미노산 서열이고, 돼지, 래트, 닭, 친칠라, 개 및 인간에서 나타난 것으로 보고된 8-아미노산 생체내 C-말단 단편 ("CCK-8")을 포함한다. 따라서, 용어 CCK-33은 일반적으로 인간 CCK(1-33)을 나타내는 것인 반면, CCK-8 (CCK(26-33))은 달리 특정되지 않으면 황산화된 것과 비황산화된 것 모두에서 총칭하여 C-말단 옥타펩티드를 의미한다. 또한, 펜타가스트린 또는 CCK-5는 C-말단 펩티드 CCK(29-33)를 나타내고, CCK-4는 C-말단 테트라펩티드 CCK(30-33)을 나타낼 것이다. 그러나, 본원에서 사용되는 CCK는 일반적으로 달리 특정되지 않으면 황산화 및 비황산화 형태에서 CCK-33, CCK-8, CCK-5 및 CCK-4를 포함하여 호르몬의 모든 천연 변이체를 의미한다.
"렙틴"은 임의의 종의 천연 렙틴, 및 생물학적으로 활성의 D-이소형, 또는 천연 렙틴 및 그의 변이체의 단편, 및 이들의 조합물을 의미한다. 렙틴은 그 전부가 본원에 참고로 포함된 국제 출원 공개 WO 96/05309에 기재된 ob 유전자의 폴리펩티드 생성물이다. 렙틴의 추정 유사체 및 단편은 각각 그 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,521,283, 미국 특허 5,532,336, PCT/US96/22308 및 PCT/US96/01471에 보고되었다.
"PP"는 임의의 생리학적인 형태의 인간 췌장 펩티드 폴리펩티드 또는 그의 종 변이체를 의미한다. 따라서, 용어 "PP"는 서열 1에 제시된 전체 길이의 인간 36 아미노산 펩티드 및 PP의 종 변이체, 예를 들어, 쥐, 햄스터, 닭, 소, 래트 및 개 PP를 모두 포함한다. 상기 의미에서, "PP", "야생형 PP" 및 "천연 PP", 즉 비변형 PP는 상호교환하여 사용될 수 있다.
"PYY"는 임의의 생리학적인 형태의 인간 펩티드 YY 폴리펩티드 또는 그의 종 변이체를 의미한다. 따라서, 용어 "PYY"는 전체 길이의 인간 36 아미노산 펩티드, 및 PYY의 종 변이체, 예를 들어, 쥐, 햄스터, 닭, 소, 래트 및 개 PYY를 포함한다. 상기 의미에서, "PYY" 및 "야생형 PYY" 및 "천연 PYY", 즉 비변형 PYY는 상호교환가능하게 사용된다. 본 발명의 문맥에서, 본 발명의 PYY 유사체 폴리펩티드에 대해 논의된 모든 변형은 천연 인간 PYY의 36 아미노산 서열을 기초로 한 것이다.
"GLP-1"은 임의의 생리학적인 형태의 인간 글루카곤 유사 펩티드-1 또는 그의 종 변이체를 의미한다. 용어 "GLP-1"은 인간 GLP-1(1-37), 전체 길이의 인간 GLP-1(1-37)과 관련하여 GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36) 아미드, 및 GLP-1의 종 변이체, 예를 들어, 쥐, 햄스터, 닭, 소, 래트 및 개 GLP-1을 포함한다. 이러한 의미에서, "GLP-1", "야생형 GLP-1" 및 "천연 GLP-1", 즉 비변형 GLP-1은 상호교환가능하게 사용된다.
"GLP-2"는 임의의 생리학적인 형태의 인간 글루카곤 유사 펩티드-2 또는 그의 종 변이체를 의미한다. 보다 특히, GLP-2는 소장 및 대장에서 장관 내분비 세포로부터 GLP-1과 함께 동시 분비되는 33개 아미노산의 펩티드이다.
"OXM"은 임의의 생리학적인 형태의 인간 옥신토모듈린 또는 그의 종 변이체를 의미한다. 보다 특히, OXM은 글루카곤의 29 아미노산 서열, 이어서 8개 아미노산의 카르복시 말단 연장을 포함하는 37개 아미노산 펩티드이다.
"엑센딘"은 아메리카독도마뱀 (미국 아리조나에 서식하는 도마뱀) 및 멕시코 구슬 도마뱀의 타액에서 발견된 펩티드 호르몬과 그의 종 변이체를 의미한다. 보다 특히, 엑센딘-3은 헬로더마 호리둠의 타액에 존재하고, 엑센딘-4는 헬로더마 서스펙툼의 타액에 존재한다 (Eng, J., et al., J. Biol. Chem., 265: 20259-62, 1990; Eng., J., et al., J. Biol. Chem., 267: 7402-05 (1992)). 엑센딘은 글루카곤 유사 펩티드 패밀리의 몇몇 구성원에 대한 일부 서열 유사성을 갖고, 최고 동일성인 53％는 GLP-1에 대해서이다 (Goke, et al., J. Biol. Chem., 268: 19650-55 (1993)). 상기 의미에서, "엑센딘", "야생형 엑센딘" 및 "천연 엑센딘", 즉 비변형 엑센딘은 상호교환가능하게 사용된다.
본원에서 사용되는 "유사체"는 바람직하게는 염기 대조 펩티드와 50 또는 55％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 대조 아미노산 서열의 삽입, 치환, 연장 및(또는) 결실을 포함하는, 그의 서열이 염기 대조 펩티드 (예를 들어, PP, PYY, 아밀린, GLP-1, 엑센딘 등)의 서열로부터 유래한 펩티드를 의미한다. 한 실시태양에서, 상기 유사체는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환 (비천연 아미노산 및 L 및 D 형태 포함)을 포함할 수 있다.
"유도체"는 천연 대조 펩티드 또는 유사체의 아미노산 서열을 갖지만, 부가적으로 그의 아미노산 측쇄기, α-탄소 원자, 말단 아미노기 또는 말단 카르복실산기의 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 분자로서 정의된다. 화학적 변형은 화학적 잔기의 부가, 새로운 결합의 생성 및 화학적 잔기의 제거를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 아미노산 측쇄기에서의 변형은 리신 ε-아미노기의 아실화, 아르기닌, 히스티딘 또는 리신의 N-알킬화, 글루탐산 또는 아스파르트산 카르복실산기의 알킬화 및 글루타민 또는 아스파라긴의 탈아미드화를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 아미노의 변형은 데스아미노, N-저급 알킬, N-디-저급 알킬, 구속 알킬 (예를 들어, 분지쇄, 시클릭, 융합, 아다만틸) 및 N-아실 변형을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 말단 카르복시기의 변형은 아미드, 저급 알킬 아미드, 구속 알킬 (예를 들어, 분지쇄, 시클릭, 융합, 아다만틸), 디알킬 아미드 및 저급 알킬 에스테르 변형을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 저급 알킬은 C1-C4 알킬이다. 또한, 하나 이상의 측쇄기 또는 말단기는 펩티드 화학의 통상의 숙련인에게 공지된 보호기로 보호될 수 있다. 아미노산의 α-탄소는 모노- 또는 디메틸화될 수 있다.
"작용제"는 천연 인간 대조 펩티드의 생물학적 활성을 생성시키는, 바람직하게는 인간 대조 펩티드보다 우수한 효과를 갖거나 또는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 수용체 결합/경쟁 연구에 의해 평가될 때 대조 펩티드에 비해 5차수 규모 (플러스 또는 마이너스), 보다 바람직하게는 4, 3, 2 또는 1차수 규모 내의 효과를 갖는 화합물을 의미한다. 한 실시태양에서, 상기 용어는 천연 인간 대조 펩티드와 유사한 생물학적 효과를 생성시키는 화합물, 예를 들어, (1) 음식 섭취, 위 배출, 췌장 분비 또는 체중 감소 분석에서 천연 인간 대조 펩티드와 유사한 활성을 갖거나 또는 (2) 대조 수용체 분석 또는 표지된 대조 펩티드를 사용하는 경쟁적 결합 분석에서 특이적으로 결합하는 화합물을 의미한다. 바람직하게는, 작용제는 상기 분석에서 1 μM 초과, 보다 바람직하게는 1-5 nM 초과의 친화도로 결합할 것이다. 다른 실시태양에서, 상기 용어는 당뇨병 또는 당뇨병 관련 질환 또는 병의 치료시에 생물학적 효과를 생성시키는 화합물을 의미한다. 상기 작용제는 대조 펩티드의 활성 단편 또는 작은 화학 분자를 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
"아미노산" 및 "아미노산 잔기"는 천연 아미노산, 비천연 아미노산 및 변형 아미노산을 의미한다. 달리 언급되지 않으면, 일반적으로 또는 명칭에 의해 구체적으로 언급되는 아미노산에 대한 임의의 언급은 그의 구조가 상기 입체이성체 형태를 허용할 경우 D 및 L 입체이성체 모두에 대한 언급을 포함한다. 천연 아미노산은 알라닌 (Ala), 아르기닌 (Arg), 아스파라긴 (Asn), 아스파르트산 (Asp), 시스테인 (Cys), 글루타민 (Gln), 글루탐산 (Glu), 글리신 (Gly), 히스티딘 (His), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 리신 (Lys), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 트립토판 (Trp), 티로신 (Tyr) 및 발린 (Val)을 포함한다. 비천연 아미노산은 호모-리신, 호모-아르기닌, 아제티딘카르복실산, 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, 베타-알라닌, 아미노프로피온산, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프론산, 2-아미노헵타노산, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노피멜린산, 3급-부틸글리신, 2,4-디아미노이소부티르산, 데스모신, 2,2'-디아미노피멜린산, 2,3-디아미노프로피온산, N-에틸글리신, N-에틸아스파라긴, 호모프롤린, 히드록시리신, 알로-히드록시리신, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸알라닌, N-메틸글리신, N-메틸이소류신, N-메틸펜틸글리신, N-메틸발린, 나프탈라닌, 노르발린, 노르류신, 오르니틴, 펜틸글리신, 피페콜린산 및 티오프롤린을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 추가의 비천연 아미노산은 가역적으로 또는 비가역적으로 화학적으로 차단되거나, 예를 들어, 측쇄 관능기가 또다른 관능기로 화학적으로 변형되는 N-메틸화 D 및 L 아미노산 또는 잔기에서와 같이 그들의 N-말단 아미노기 또는 그들의 측쇄기 상에서 화학적으로 변형된 변형 아미노산 잔기를 포함한다. 예를 들어, 변형 아미노산은 메티오닌 술폭시드; 메티오닌 술폰; 아스파르트산-(베타-메틸 에스테르), 아스파르트산의 변형 아미노산; N-에틸글리신, 글리신의 변형 아미노산; 또는 알라닌 카르복스아미드, 알라닌의 변형 아미노산을 포함한다. 포함될 수 있는 추가의 잔기는 문헌 [Sandberg et al., J. Med. Chem. 41: 2481-91, 1998]에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 "5 Apa"는 5 아미노-펜타노일을 의미하고, "12 Ado"는 12-아미노 도데카노일을 의미하고, "PEG(8)"은 3,6-디옥시옥타노일을 의미하고, "PEG(13)"은 1-아미노-4,7,10-티옥사-13-트리데칸아민 숙신이모일을 의미한다.
상기 논의한 바와 같이, 천연 성분 펩티드 호르몬 및 그의 유사체 및 유도체는 당업계에 공지되어 있다. 참고로, 복수개의 천연 성분 펩티드 호르몬의 서열을 하기 표 1에 제공한다.
Figure pat00001
이들 펩티드는 일반적으로 생리학적으로 발현될 때 C-말단에서 아미드화되지만, 본 발명의 목적을 위해 그러할 필요는 없다. 즉, 이들 펩티드의 C-말단, 및 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 유리 -OH 또는 -NH2 기를 가질 수 있다. 이들 펩티드는 또한 다른 번역후 변형을 가질 수 있다. 당업계의 숙련인은 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드가 또한 N-말단 메티오닌 잔기로 구성될 수 있음을 이해할 것이다.
상기 성분 펩티드 호르몬의 유사체는 당업계에 공지되어 있지만, 일반적으로 상기 성분 펩티드 호르몬의 아미노산 서열에 대한 변형, 예를 들어, 치환, 결실 및 삽입, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 치환, 삽입 및 결실은 N-말단 또는 C-말단 종결부에서 발생할 수 있거나, 성분 펩티드 호르몬의 내부에서 발생할 수 있다. 바람직한 측면에서, 본 발명의 성분 펩티드 호르몬의 유사체는 "비필수" 아미노산 잔기의 하나 이상의 변형을 포함한다. 본 발명의 문맥에서, "비필수" 아미노산 잔기는 생성되는 유사체의 성분 펩티드 호르몬 수용체 작용제 활성을 파괴하거나 실질적으로 감소시키지 않으면서 단편, 예를 들어, 성분 펩티드 호르몬 단편의 천연 인간 아미노산 서열에서 변형, 즉 결실 또는 치환될 수 있는 잔기이다.
바람직한 치환은 보존적 아미노산 치환을 포함한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄, 또는 물리화학적 특성 (예를 들어, 정전, 수소 결합, 등입체성 (isosteric), 소수성 특징)을 갖는 아미노산 잔기로 교체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 공지되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 메티오닌, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판), β-분지된 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다.
본 발명은 또한 성분 펩티드 호르몬의 유도체에 관한 것이다. 상기 유도체는 하나 이상의 수용성 중합체 분자, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG") 또는 다양한 길이의 지방산 사슬 (예를 들어, 스테아릴, 팔미토일, 옥타노일 등)에 컨쥬게이팅되거나 폴리아미노산, 예를 들어, 폴리-his, 폴리-arg, 폴리-lys 및 폴리-ala이 부가된 성분 펩티드 호르몬 및 이들의 유사체를 포함한다. 성분 펩티드 호르몬 또는 그의 유사체의 변형은 또한 작은 분자 치환체, 예를 들어, 단쇄 알킬 및 구속 알킬 (예를 들어, 분지쇄, 시클릭, 융합, 아다만틸) 및 방향족기를 포함할 수 있다. 수용성 중합체 분자의 분자량은 바람직하게는 약 500 내지 약 20,000 달톤일 것이다.
상기 중합체-컨쥬게이션 및 작은 분자 치환체 변형은 하이브리드 폴리펩티드의 서열 내의 아미노산 잔기의 N- 또는 C-말단에서 또는 측쇄에서 1회 발생할 수 있다. 별법으로, 하이브리드 폴리펩티드를 따라 유도체화의 다중 부위가 존재할 수 있다. 리신, 아스파르트산, 글루탐산 또는 시스테인을 사용한 하나 이상의 아미노산의 치환은 유도체화를 위한 추가의 부위를 제공할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,824,784 및 5,824,778 참조). 바람직하게는, 하이브리드 폴리펩티드는 1, 2 또는 3개의 중합체 분자에 컨쥬게이팅될 수 있다.
수용성 중합체 분자는 바람직하게는 아미노, 카르복실 또는 티올기에 연결될 수 있고, 리신, 아스파르트산, 글루탐산 또는 시스테인의 N 또는 C 말단에 또는 측쇄에 연결될 수 있다. 별법으로, 수용성 중합체 분자는 디아민 및 디카르복실기와 연결될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 리신 아미노산 상의 엡실론 아미노기를 통해 1, 2 또는 3개의 PEG 분자에 컨쥬게이팅된다.
또한, 본 발명의 유도체는 하나 이상의 아미노산 잔기에 대한 화학적 변형을 갖는 성분 펩티드 호르몬 또는 유사체를 포함한다. 상기 화학적 변형은 아미드화, 글리코실화, 아실화, 황산화, 인산화, 아세틸화 및 고리화를 포함한다. 화학적 변형은 PPF 하이브리드 폴리펩티드의 서열 내의 아미노산 잔기의 N- 또는 C-말단에서 또는 측쇄에서 1회 발생할 수 있다. 한 실시태양에서, 상기 펩티드의 C-말단은 유리 -OH 또는 -NH2 기를 가질 수 있다. 다른 실시태양에서, N-말단 종결부는 이소부틸옥시카르보닐기, 이소프로필옥시카르보닐기, n-부틸옥시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, 이소카프로일기 (isocap), 옥타닐기, 옥틸 글리신기 (G(Oct)) 또는 8-아미노옥탄산기로 캐핑 (capping)될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 고리화는 디술피드 다리의 형성을 통해 수행될 수 있다. 별법으로, 하이브리드 폴리펩티드를 따라 화학적 변형의 다중 부위가 존재할 수 있다.
아밀린 패밀리
상기 논의한 바와 같이, 본 발명에 유용한 성분 펩티드 호르몬은 아밀린, 아드레노메듈린 ("ADM"), 칼시토닌 ("CT"), 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 ("CGRP"), 인터메딘 ("AFP-6"으로도 알려짐) 및 관련 펩티드를 포함하여 아밀린 패밀리 펩티드 호르몬을 포함한다. 천연 아밀린 패밀리 펩티드 호르몬은 기능성 펩티드 유사체 및 유도체처럼 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 특정 천연 펩티드, 펩티드 유사체 및 유도체가 본원에서 설명된다. 그러나, 당업계에 공지된 호르몬 활성을 나타내는 임의의 공지된 아밀린 패밀리 펩티드가 본 발명과 관련하여 사용될 수 있음을 이해하여야 한다.
당업계에 공지된 임의의 아밀린 유사체 또는 유도체를 본 발명과 관련하여 사용할 수 있다. 한 실시태양에서, 아밀린 유사체 및 유도체는 천연 아밀린의 호르몬 활성을 한가지 이상 갖는다. 특정 실시태양에서, 아밀린 유사체는 천연 아밀린이 특이적으로 결합할 수 있는 수용체의 작용제이다. 바람직한 아밀린 유사체 및 유도체는 본원에 참고로 포함된 US2003/0026812 A1에 기재된 것을 포함한다.
예시적인 아밀린 유사체는 다음을 포함한다.
Figure pat00002
당업계에 공지된 바와 같이, 상기 아밀린 유사체는 바람직하게는 아미드화되지만, 달리 특정되지 않으면 본 발명의 문맥에서 임의로 산 형태일 수 있다.
당업계에 공지된 임의의 ADM 유사체 또는 유도체를 본 발명과 관련하여 사용할 수 있다. 한 실시태양에서, ADM 유사체 및 유도체는 천연 ADM의 호르몬 활성을 한가지 이상 갖는다. 특정 실시태양에서, ADM 유사체는 특이적으로 결합할 수 있는 천연 ADM의 수용체의 작용제이다.
당업계에 공지된 임의의 CT 유사체 또는 유도체를 본 발명과 관련하여 사용할 수 있다. 한 실시태양에서, CT 유사체 및 유도체는 천연 CT의 호르몬 활성을 한가지 이상 갖는다. 특정 실시태양에서, CT 유사체는 천연 CT가 특이적으로 결합할 수 있는 수용체의 작용제이다. 바람직한 CT 유사체 및 유도체는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 4,652,627; 4,606,856; 4,604,238; 4,597,900; 4,537,716; 4,497,731; 4,495,097; 4,444,981; 4,414,149; 4,401,593; 및 4,397,780에 기재된 것을 포함한다.
예시적인 CT 유사체는 다음을 포함한다:
Figure pat00003
당업계에 공지된 바와 같이, 상기 CT 유사체는 바람직하게는 아미드화되지만, 달리 특정되지 않으면 본 발명의 문맥 내에서 임의로 산 형태일 수 있다.
당업계에 공지된 임의의 CGRP 유사체 또는 유도체를 본 발명과 관련하여 사용할 수 있다. 한 실시태양에서, CGRP 유사체 및 유도체는 천연 CGRP의 호르몬 활성을 한가지 이상 갖는다. 특정 실시태양에서, CGRP 유사체는 천연 CGRP가 특이적으로 결합할 수 있는 수용체의 작용제이다. 바람직한 CGRP 유사체 및 유도체는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 4,697,002 및 4,687,839에 기재된 것을 포함한다.
예시적인 CGRP 유사체는 다음을 포함한다:
Figure pat00004
당업계에 공지된 임의의 AFP-6 유사체 또는 유도체를 본 발명과 관련하여 사용할 수 있다. 한 실시태양에서, AFP-6 유사체 및 유도체는 천연 AFP-6의 호르몬 활성을 한가지 이상 갖는다. 특정 실시태양에서, AFP-6 유사체는 천연 AFP-6이 특이적으로 결합할 수 있는 수용체의 작용제이다. 바람직한 AFP-6 유사체 및 유도체는 본원에 참고로 포함된 WO 2003/022304에 기재된 것을 포함한다.
예시적인 AFP-6 유사체는 다음을 포함한다:
Figure pat00005
당업계에 공지된 바와 같이, 상기 AFP-6 유사체는 바람직하게는 아미드화되지만, 달리 특정되지 않으면 본 발명의 문맥에서 임의로 산 형태일 수 있다.
CCK 패밀리
hCCK 및 종 변이체를 포함하는 CCK 및 그의 다양한 유사체는 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, CCK는 인간에서 처음으로 확인된 33개의 아미노산 서열을 갖고, 돼지, 래트, 닭, 친칠라, 개 및 인간에 존재하는 것으로 보고된 8개 아미노산의 생체내 C-말단 단편 ("CCK-8")을 포함한다. 다른 종 변이체는 돼지, 개 및 기니아 피그에서 발견된 39개 아미노산의 서열, 고양이, 개 및 인간에서 발견된 58개 아미노산 및 CCK 및 가스트린 모두에 상동성인 47개 아미노산의 서열을 포함한다. C-말단 황산화 옥타펩티드 서열 (CCK-8)은 종에 걸쳐 비교적 보존되고, 소수의 설치류에서 생물학적 활성을 위한 최소 서열일 수 있다. 따라서, 용어 CCK-33은 일반적으로 인간 CCK(1-33)을 의미하지만, CCK-8 (CCK(26-33))은 달리 특정되지 않으면 황산화 및 비황산화 모두에서 총칭하여 C-말단 옥타펩티드를 의미할 것이다. 또한, 펜타가스트린 또는 CCK-5는 C-말단 펩티드 CCK(29-33)을 의미하고, CCK-4는 C-말단 테트라펩티드 CCK(30-33)을 의미할 것이다.
타입 A 수용체 서브타입 (CCKA)은 황산화 옥타펩티드에 선택적인 것으로 보고되었다. 타입 B 수용체 서브타입 (CCKB)는 뇌 전체 및 위에서 확인되었고, 황산화 또는 8개의 모든 아미노산을 요구하지 않는 것으로 보고되었다.
CCK 유사체에 대한 다양한 생체내 및 시험관내 스크리닝 방법이 당업계에 공지되어 있다. 그 예는 CCK-유사 활성에 대해 시험되는 화합물의 신속한 정맥내 주사 후에 개 또는 기니아 피그 담낭의 수축을 수반하는 생체내 분석 및 토끼 담낭의 스트립을 사용하여 측정하는 시험관내 분석을 포함한다 (Walsh, "Gastrointestinal Hormones", In Physiology of the Gastrointestinal Tract (3d ed. 1994; Raven Press, New York) 참조).
바람직한 특정 CCK 및 CCK 활성을 갖는 CCK 유사체는 다음을 포함한다:
Figure pat00006
당업계에 공지된 바와 같이, 상기 CCK 펩티드는 바람직하게는 아미드화되지만, 달리 특정되지 않으면 본 발명의 문맥에서 임의로 산 형태일 수 있다.
렙틴 패밀리
본 발명에 유용한 성분 펩티드 호르몬은 또한 렙틴 패밀리 펩티드 호르몬을 포함한다. 천연 렙틴 패밀리 펩티드 호르몬은 기능성 펩티드 유사체 및 유도체처럼 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 특정 천연 펩티드, 펩티드 유사체 및 유도체가 본원에서 설명되지만, 당업계에 공지된 호르몬 활성을 나타내는 임의의 공지의 아밀린 패밀리 펩티드가 본 발명과 관련하여 사용될 수 있음을 이해하여야 한다.
당업계에 공지된 임의의 렙틴 유사체 또는 유도체가 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, 렙틴 유사체 및 유도체는 천연 렙틴의 호르몬 활성을 한가지 이상 갖는다. 특정 실시태양에서, 렙틴 유사체는 천연 렙틴이 특이적으로 결합할 수 있는 수용체의 작용제이다. 바람직한 렙틴 유사체 및 유도체는 예를 들어, 그 모두가 본원에 참고로 포함된 WO 2004/039832, WO 98/55139, WO 98/12224 및 WO 97/02004에 기재된 것을 포함한다.
예시적인 렙틴 유사체는 위치 43의 아미노산이 Asp 또는 Glu로 치환된 것, 위치 48의 아미노산이 치환된 Ala인 것, 위치 49의 아미노산이 Glu으로 치환되거나 존재하지 않는 것, 위치 75의 아미노산이 Ala으로 치환된 것, 위치 89의 아미노산이 Leu으로 치환된 것, 위치 93의 아미노산이 Asp 또는 Glu으로 치환된 것, 위치 98의 아미노산이 Ala으로 치환된 것, 위치 117의 아미노산이 Ser으로 치환된 것, 위치 139의 아미노산이 Leu으로 치환된 것, 위치 167의 아미노산이 Ser으로 치환된 것, 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
바람직한 특정 CCK 및 CCK 활성을 갖는 CCK 유사체는 다음을 포함한다:
Figure pat00007
PPF 패밀리
본 발명에 유용한 성분 펩티드 호르몬은 PP 및 PYY를 포함하여 PPF 펩티드 호르몬을 포함한다. 천연 PPF 펩티드 호르몬은 기능성 펩티드 유사체 및 유도체처럼 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 특정 천연 펩티드, 펩티드 유사체 및 유도체가 본원에서 설명되지만, 당업계에 공지된 호르몬 활성을 나타내는 임의의 공지의 아밀린 패밀리 펩티드가 본 발명과 관련하여 사용될 수 있음을 이해하여야 한다.
당업계에 공지된 임의의 PPF 유사체 또는 유도체가 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, PPF 유사체 및 유도체는 천연 PPF 폴리펩티드의 호르몬 활성을 한가지 이상 갖는다. 특정 실시태양에서, PPF 유사체는 천연 PPF 폴리펩티드가 특이적으로 결합할 수 있는 수용체의 작용제이다. 바람직한 PPF 유사체 및 유도체는 전문이 본원에 참고로 포함된 WO 03/026591 및 WO 03/057235에 기재된 것을 포함한다.
한 실시태양에서, 한가지 이상의 PPF 호르몬 활성을 나타내는 바람직한 PPF 유사체 및 유도체는 일반적으로 폴리프롤린 모티프 및 C-말단 테일 모티프를 포함하는 2개 이상의 PYY 모티프를 포함한다. 상기 유사체는 일반적으로 본원에 참고로 포함된 미국 가출원 60/543,406 (2004년 2월 11일 출원)에 기재되어 있다. 다른 바람직한 PPF 유사체는 본원과 동시 출원된, 그 내용이 본원에 참고로 포함된 PCT/US05/[XXXXX] (명칭: "Pancreatic Polypeptide Family Motifs and Polypeptides Comprising the Same", 대리인 문서 번호 18528.832)에 개시되어 있다. 그 배경으로서, Y 수용체 결합 친화도의 차이가 2차 및 3차 구조적 차이와 상호 관련된다고 연구에 의해 제시되었다 (예를 들어, Keire et al., Biochemistry 2000, 39, 9935-9942 참조). 천연 돼지 PYY는 잔기 23, 24 및 25에서 비틀림에 의해 분리된 잔기 17 내지 22 및 25 내지 33의 2개의 C-말단 나선 세그먼트, 잔기 12-14를 중심으로 하는 턴 (turn), 및 잔기 30 및 31에서 폴딩된 N-말단을 포함하는 것을 특징으로 하였다. 또한, 전체 길이 돼지 PYY는 N- 및 C-말단 내의 잔기 중에서 소수성 상호작용에 의해 안정화된 PP 폴드를 포함하는 것을 특징으로 하였다 (상기 문헌).
"PYY 모티프"는 일반적으로 생물학적 활성에 중요한 천연 PP 패밀리 폴리펩티드의 1차, 2차 또는 3차의 구조적 성분이다. 즉, 생물학적 활성은 모티프의 부재 또는 방해시에 실질적으로 감소한다. 바람직한 PYY 모티프는 천연 PP 패밀리 폴리펩티드의 N-말단 폴리프롤린 타입 II 모티프, 천연 PP 패밀리 폴리펩티드의 타입 II β-턴 모티프, 천연 PP 패밀리 폴리펩티드의 C-말단 종결부에서의 α-나선 모티프, 및 천연 PP 패밀리 폴리펩티드의 C-말단 테일 모티프를 포함한다. 보다 특히, N-말단 폴리프롤린 구역에서, 천연 PP 패밀리 폴리펩티드의 잔기 5 및 8에 대응하는 아미노산은 일반적으로 프롤린으로서 보존된다. 타입 II β-턴 모티프는 일반적으로 천연 PP 패밀리 폴리펩티드의 잔기 12-14에 대응하는 아미노산을 포함할 것이다. α-나선 모티프가 α-나선 턴이 용액 중에서 형성되도록 충분한 수의 아미노산 잔기를 포함하는 한, α-나선 모티프는 일반적으로 천연 PP 패밀리 폴리펩티드의 약 잔기 14에 대응하는 아미노산으로부터 C-말단 종결부까지 및 상기 종결부를 포함하는 임의의 지점까지 연장될 수 있다. α-나선 모티프는 또한 α-나선 턴이 계속 용액 중에서 형성되는 한 천연 PP 패밀리 서열에 대한 아미노산 치환, 삽입 및 결실을 포함할 수 있다. C-말단 테일 모티프는 일반적으로 천연 PP 패밀리 폴리펩티드의 마지막 약 10개의 잔기, 보다 바람직하게는 마지막 7, 6 또는 5개의 잔기, 보다 더 바람직하게는 아미노산 잔기 32-35에 대응하는 아미노산을 포함한다.
바람직한 PYY 유사체는 폴리프롤린 모티프 및(또는) C-말단 테일 모티프에 대응하지 않는 PYY 분자의 영역에서 내부 결실, 삽입 및 치환을 갖는 것을 포함한다. 예를 들어, 위치 4, 6, 7, 9 또는 10에서의 내부 결실이 고려된다.
인크레틴 및 인크레틴 모방체
본 발명에 유용한 성분 펩티드 호르몬은 또한 GLP-1 펩티드 호르몬을 포함한다. GLP-1(1-37), GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36) 아미드를 포함하여 천연 GLP-1 펩티드 호르몬은 기능성 펩티드 유사체 및 유도체처럼 당업계에 공지되어 있다. 본원에서 사용되는 GLP-1은 GLP-1 펩티드 호르몬의 모든 천연 형태를 의미한다. 바람직한 특정 천연 펩티드, 펩티드 유사체 및 유도체가 본원에서 설명되지만, 당업계에 공지된 호르몬 활성을 나타내는 임의의 공지된 GLP-1 펩티드가 본 발명과 관련하여 사용될 수 있음을 이해하여야 한다.
당업계에 공지된 임의의 GLP-1 펩티드 유사체 또는 유도체가 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, GLP-1 펩티드 유사체 및 유도체는 천연 GLP-1 펩티드의 호르몬 활성을 한가지 이상 갖는다. 특정 실시태양에서, GLP-1 펩티드 유사체는 천연 GLP-1 펩티드가 특이적으로 결합할 수 있는 수용체의 작용제이다. 바람직한 GLP-1 펩티드 유사체 및 유도체는 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 WO 91/11457에 기재된 것을 포함한다.
당업계에 공지된 GLP-1 유사체는 다음을 포함한다:
Figure pat00008
당업계에 공지된 바와 같이, 상기 GLP-1 유사체는 바람직하게는 아미드화되지만, 달리 특정되지 않으면 본 발명의 문맥에서 임의로 산 형태일 수 있다.
다른 GLP-1 유사체 및 유도체는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,545,618에 개시되어 있다. GLP-1 유사체 및 유도체의 바람직한 군은 그 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 6,747,006에 기재된 것을 포함한다. 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,188,666에 기재된 분자의 본 발명에서의 용도도 포함된다. 본 발명에 사용하기 위한 분자의 다른 군은 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,512,549에 기재된 화합물을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 GLP-1 화합물의 다른 바람직한 군은 본원에 참고로 포함된 WO 91/11457에 개시되어 있다.
본 발명에 유용한 성분 펩티드 호르몬은 GLP-2 펩티드 호르몬을 포함한다. 천연 GLP-2 펩티드 호르몬, 예를 들어, 래트 GLP-2 및 그의 상동체, 예를 들어, ox GLP-2, 돼지 GLP-2, degu GLP-2, 소 GLP-2, 기니아 피그 GLP-2, 햄스터 GLP-2, 인간 GLP-2, 무지개 송어 GLP-2 및 닭 GLP-2가 기능성 펩티드 유사체 및 유도체처럼 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 특정 천연 펩티드, 펩티드 유사체 및 유도체가 본원에서 설명되지만, 당업계에 공지된 호르몬 활성을 나타내는 임의의 공지된 GLP-2 펩티드가 본 발명과 관련하여 사용될 수 있음을 인식해야 한다.
당업계에 공지된 임의의 GLP-2 펩티드 유사체 또는 유도체가 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, GLP-2 펩티드 유사체 및 유도체는 천연 GLP-2 펩티드의 호르몬 활성을 한가지 이상 갖는다. 특정 실시태양에서, GLP-2 펩티드 유사체는 천연 GLP-2 펩티드가 특이적으로 결합할 수 있는 수용체의 작용제이다. 바람직한 GLP-2 펩티드 유사체 및 유도체는 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 08/669,791 및 PCT 출원 PCT/CA97/00252에 기재된 것을 포함한다. 당업계에 공지된 특정 GLP-2 유사체는 Ala을 Gly으로 치환함으로써 DPP-IV 저항성을 부여하기 위해 위치 2에서 변형된 래트 또는 인간 GLP-2를 포함한다.
또한, 본 발명에 유용한 성분 펩티드 호르몬은 옥신토모듈린 (OXM) 펩티드 호르몬을 포함한다. 천연 OXM 펩티드 호르몬은 펩티드 유사체 및 유도체처럼 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 특정 천연 펩티드, 펩티드 유사체 및 유도체가 본원에서 설명되지만, 당업계에 공지된 호르몬 활성을 나타내는 임의의 공지된 OXM 펩티드가 본 발명과 관련하여 사용될 수 있음을 인식하여야 한다.
당업계에 공지된 임의의 OXM 펩티드 유사체 또는 유도체가 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, OXM 펩티드 유사체 및 유도체는 천연 OXM 펩티드의 호르몬 활성을 한가지 이상 갖는다. 특정 실시태양에서, OXM 펩티드 유사체는 천연 OXM 펩티드가 특이적으로 결합할 수 있는 수용체의 작용제이다.
또한, 본 발명에 유용한 성분 펩티드 호르몬은 엑센딘 펩티드 호르몬을 포함한다. 천연 엑센딘 펩티드 호르몬은 기능성 펩티드 유사체 및 유도체처럼 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 특정 천연 펩티드, 펩티드 유사체 및 유도체가 본원에서 설명되지만, 당업계에 공지된 호르몬 활성을 나타내는 임의의 공지된 엑센딘 펩티드가 본 발명과 관련하여 사용될 수 있음을 인식하여야 한다.
당업계에 공지된 임의의 엑센딘 펩티드 유사체 또는 유도체가 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, 엑센딘 펩티드 유사체 및 유도체는 천연 엑센딘 펩티드의 호르몬 활성을 한가지 이상 갖는다. 특정 실시태양에서, 엑센딘 펩티드 유사체는 천연 엑센딘 펩티드가 특이적으로 결합할 수 있는 수용체의 작용제이다.
바람직한 엑센딘 유사체는 다음을 포함한다:
Figure pat00009
당업계에 공지된 바와 같이, 상기 엑센딘 유사체는 바람직하게는 아미드화되지만, 달리 특정되지 않으면 본 발명의 문맥에서 임의로 산 형태일 수 있다.
추가의 엑센딘 유사체 및 유도체의 예는 1997년 8월 8일 출원된 미국 특허 출원 60/055,404를 기초로 한 우선권을 주장하면서 1998년 8월 6일 출원된 PCT 출원 PCT/US98/16387 (명칭: "Novel Exendin Agonist Compounds") (두 출원 모두 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 다른 엑센딘 유사체 및 유도체는 1997년 11월 14일 출원된 미국 가출원 60/065,442을 기초로 한 우선권을 주장하면서 1998년 11월 13일 출원된 PCT 출원 PCT/US98/24210 (명칭: "Novel Exendin Agonist Compounds") (두 출원 모두 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 또다른 엑센딘 유사체 및 유도체는 1997년 11월 14일 출원된 미국 가출원 60/066,029을 기초로 한 우선권을 주장하면서 1998년 11월 13일 출원된 PCT 출원 PCT/US98/24273 (명칭: "Novel Exendin Agonist Compounds") (두 출원 모두 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 또다른 엑센딘 유사체 및 유도체는 미국 특허 출원 08/694,954 (1996년 8월 8일 출원)의 일부 계속 출원으로서 1997년 8월 8일 출원된 PCT 출원 PCT/US97/14199 (명칭 "Methods for Regulating Gastrointestinal Activity") (두 출원 모두 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 또다른 엑센딘 유사체 및 유도체는 1997년 1월 7일 출원된 미국 가출원 60/034,905을 기초로 한 우선권을 주장하면서 1998년 1월 7일 출원된 PCT 출원 PCT/US98/00449 (명칭 "Use of Exendins and Agonists Thereof for the Reduction of Food Intake") (두 출원 모두 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 또다른 엑센딘 유사체 및 유도체는 본원에 참고로 포함된, 2003년 12월 19일 출원된 미국 특허 출원 공개 US 2004/0209803 A1 (명칭: "Compositions for the Treatment and Prevention of Neuropathy")에 기재되어 있다.
생활성 펩티드 호르몬 모듈
상기 논의한 바와 같이, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 일반적으로 함께 공유 연결된 2개 이상의 생활성 펩티드 호르몬 모듈을 포함한다. 생활성 펩티드 호르몬 모듈은 (a) 천연 성분 펩티드 호르몬, (b) 호르몬 활성을 보유하는 천연 성분 펩티드 호르몬의 유사체 또는 유도체, (c) 호르몬 활성을 보유하는 천연 성분 펩티드 호르몬의 단편, (d) 호르몬 활성을 보유하는 천연 성분 펩티드 호르몬의 유사체 또는 유도체의 단편, (e) 목적하는 화학적 안정성, 형상 안정성, 대사 안정성, 수용체 상호작용, 프로테아제 억제 및(또는) 다른 약동학적 특성을 하이브리드 폴리펩티드에 부여하는 천연 성분 펩티드 호르몬의 구조적 모티프; 또는 (f) 목적하는 화학적 안정성, 형상 안정성, 대사 안정성, 수용체 상호작용, 프로테아제 억제 및(또는) 다른 약동학적 특성을 하이브리드 폴리펩티드에 부여하는 천연 성분 펩티드 호르몬의 유사체 또는 유도체의 구조적 모티프일 수 있다. (e) 및 (f)의 구조적 모티프는 "펩티드 인핸서"로서 본원에서 총칭하여 언급될 것이다.
바람직한 생활성 펩티드 호르몬 모듈은 아밀린, ADM, CT, CGRP, 인터메딘, CCK(1-33), CCK-8, 렙틴, PYY(1-36), PYY(3-36), GLP-1(1-37), GLP-1(7-37), GLP-1(7-36), GLP-2, OXM, 엑센딘-3 및 엑센딘-4로부터 선택되는 천연 펩티드 호르몬을 포함한다.
다른 바람직한 생활성 펩티드 호르몬 모듈은 아밀린, ADM, CT, CGRP, 인터메딘, CCK, 렙틴, PYY(1-36), PYY(3-36), GLP-1(1-37), GLP-1(7-37), GLP-1(7-36), GLP-2, OXM, 엑센딘-3 및 엑센딘-4로부터 선택되는 성분 펩티드 호르몬의 유사체 또는 유도체를 포함하고, 여기서 유사체 또는 유도체는 성분 펩티드 호르몬의 호르몬 활성을 한가지 이상 보인다. 유사체는 성분 펩티드 호르몬의 아미노산 서열의 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있고, 유도체는 본원에서 충분히 설명하고 당업계에 공지된 바와 같이 유사체 또는 성분 펩티드 호르몬의 아미노산 잔기의 하나 이상의 화학적 변형을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 유사체 및 유도체는 상기 설명한 및(또는) 당업계에 공지된 임의의 것으로부터 선택할 수 있다. 본 발명의 생활성 펩티드 호르몬 모듈로서 유용한 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 특히 바람직한 유사체 및 유도체는 다음을 포함한다.
Figure pat00010
당업계에 공지된 바와 같이, 상기 펩티드 화합물은 바람직하게는 아미드화되지만, 달리 특정되지 않으면 본 발명의 문맥에서 임의로 산 형태일 수 있다.
또다른 바람직한 생활성 펩티드 호르몬 모듈은 아밀린, ADM, CT, CGRP, 인터메딘, CCK, 렙틴, PYY(1-36), PYY(3-36), GLP-1(1-37), GLP-1(7-37), GLP-1(7-36), GLP-2, OXM, 엑센딘-3 및 엑센딘-4로부터 선택되는 성분 펩티드 호르몬의 단편을 포함하고, 상기 단편은 성분 펩티드 호르몬의 호르몬 활성을 한가지 이상 보인다.
또다른 바람직한 생활성 펩티드 호르몬 모듈은 아밀린, ADM, CT, CGRP, 인터메딘, CCK, 렙틴, PYY(1-36), PYY(3-36), GLP-1(1-37), GLP-1(7-37), GLP-1(7-36), GLP-2, OXM, 엑센딘-3 및 엑센딘-4로부터 선택되는 성분 펩티드 호르몬의 유사체 또는 유도체의 단편을 포함하고, 상기 단편은 성분 펩티드 호르몬의 호르몬 활성을 한가지 이상 보인다. 다시, 유사체는 성분 펩티드 호르몬의 아미노산 서열의 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있고, 유도체는 본원에서 충분히 설명하고 당업계에 공지된 바와 같이 유사체 또는 성분 펩티드 호르몬의 아미노산 잔기의 하나 이상의 화학적 변형을 포함할 수 있다.
한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 바람직한 특정 단편은 하기 설명하는 단편을 포함한다. 그러나, 아래에서 설명하는 바람직한 단편을 포함하여 당업계에 공지된 단편과 상기 설명한 유사체 및 유도체의 조합체도 고려됨을 이해하여야 한다.
Figure pat00011
다시, 당업계에 공지된 바와 같이, 상기 펩티드 화합물은 바람직하게는 아미드화되지만, 달리 특정되지 않으면 본 발명의 문맥에서 임의로 산 형태일 수 있다. 또한, 상기 바람직한 단편은 본원에서 논의되거나 당업계에 공지된 임의의 유사체 또는 유도체와 조합될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 유사체 단편은 5Ala,14Leu,25Phe-엑센딘-4(1-28), 14Leu,25Phe-엑센딘-4(1-27), 5Ala,14Leu,25Phe-엑센딘-4(1-28), 14Leu,25Phe-엑센딘-4(1-27) 또는 개시된 단편, 유사체 및 유도체의 임의의 다른 조합물을 포함할 수 있다.
또다른 바람직한 생활성 펩티드 모듈은 목적하는 화학적 안정성, 형상 안정성, 대사 안정성, 수용체 상호작용, 프로테아제 억제 및(또는) 다른 약동학적 특성을 하이브리드 폴리펩티드에 부여하는 "펩티드 인핸서", 즉 성분 펩티드 호르몬의 구조적 모티프 (그의 유사체 및 유도체 포함)를 포함한다. 예시적인 펩티드 인핸서는 다음을 포함한다. 다시, 상기한 유사체 및 유도체와 다음 생활성 펩티드 모듈의 조합물도 고려됨을 이해하여야 한다. 예를 들어, 당업계에 공지된 및(또는) 상기 설명한 아밀린 패밀리 펩티드 호르몬 유사체 및 유도체의 마지막 6개의 아미노산 잔기도 바람직한 생활성 펩티드 모듈로서 고려된다.
Figure pat00012
펩티드 모듈 선택 고려 사항, 스페이서 및 연결기
본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 일반적으로 하나 이상의 생활성 펩티드 호르몬 모듈이 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 2개 이상의 생활성 펩티드 호르몬 모듈을 포함한다. 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 생활성 펩티드 호르몬 모듈은 하이브리드 폴리펩티드의 N-말단 종결부, 하이브리드 폴리펩티드의 C-말단 종결부에 위치할 수 있거나, 하이브리드 폴리펩티드가 3개 이상의 생활성 펩티드 호르몬 모듈을 포함하는 경우에는 하이브리드 폴리펩티드의 내부 부분에 위치할 수 있다.
*특정 실시태양에서, 생활성 펩티드 호르몬 모듈의 C-말단 종결부가 아미드화되도록 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 생활성 펩티드 호르몬 모듈을 위치시키는 것이 바람직하다. 생활성 펩티드 호르몬 모듈의 C-말단 종결부의 아미드화는 모듈을 하이브리드 폴리펩티드의 C-말단 종결부에 위치시키거나 모듈을 하이브리드 폴리펩티드의 N-말단 종결부에 C-말단에서 N-말단 방향으로 배열함으로써 달성할 수 있다. 두 배열에서, 생활성 펩티드 호르몬 모듈의 C-말단 종결부가 아미드화에 이용될 수 있다. C-말단 아미드화가 바람직한 특정 성분 펩티드 호르몬은 아밀린 패밀리 펩티드 호르몬, CCK, PYY, hGLP-1(7-36) 및 hGLP-2를 포함할 수 있다. C-말단 아미드화가 반드시 바람직하지는 않은 (달리 말하면 모듈의 C-말단 종결부에서의 연장이 쉽게 허용되는) 특정 성분 펩티드 호르몬은 엑센딘-4, 엑센딘-4(1-28), GLP-1(7-37), 개구리 GLP-1(7-36), 및 개구리 GLP-2를 포함한다. 그러나, 상기 성분 펩티드 호르몬이 하이브리드 폴리펩티드의 C-말단 종결부에 위치할 경우, 이들은 여전히 임의로 아미드화될 수 있고, 사실상 바람직하게는 임의로 아미드화될 수 있다.
생활성 펩티드 호르몬 모듈은 당업계에 공지된 임의의 방식으로 공유 연결될 수 있다. 안정한 연결을 사용할 수 있거나, 절단가능한 연결을 사용할 수 있다. 한 실시태양에서, 제1 모듈의 카르복시는 제2 모듈의 아미노에 직접 연결될 수 있다. 다른 실시태양에서, 연결기는 모듈을 부착시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 요구될 경우, 당업계에 공지된 스페이서 또는 턴 인듀서 (turn inducer)는 연결을 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, N-말단에 위치하는 생활성 펩티드 호르몬 모듈의 C-말단 종결부의 아미드화가 요구되지 않을 경우, 모듈은 제2 모듈에 직접 또는 당업계에 공지된 임의의 적절한 연결기, 예를 들어, 알킬; PEG; 아미노산, 예를 들어, Lys, Glu, β-Ala; 폴리아미노산, 예를 들어, 폴리-his, 폴리-arg, 폴리-lys, 폴리-ala, Gly-Lys-Arg (GKR) 등; 2관능성 링커 (예를 들어, 피어스 카탈로그 (Pierce catalog, 미국 일리노이주 록포드), 참조); 아미노카프로일("Aca"), β-알라닐, 8-아미노-3,6-디옥사옥타노일, 또는 당업계에 공지된 다른 절단가능한 및 비절단가능한 링커를 사용하여 부착될 수 있다.
N-말단에 위치하는 생활성 펩티드 호르몬 모듈의 C-말단 종결부의 아미드화가 요구될 경우, 모듈은 다시 당업계에 공지된 임의의 적절한 연결기를 사용하여 제2 모듈에 부착될 수 있다. 보다 구체적으로, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 생활성 펩티드 호르몬 모듈이 C-말단에서 N-말단 방향으로 배열되어 아미노 대 아미노 연결을 생성시킬 경우, 바람직한 연결기는 디카르복실산, 알킬, PEG 및 아미노산, 예를 들어, Lys, Cys 및 Glu를 포함한다.
상기한 바와 같이, 하이브리드 폴리펩티드는 또한 바람직하게는 생활성 펩티드 호르몬 모듈의 연결을 더욱 안정화시키기 위해서 스페이서를 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 스페이서 또는 턴 인듀서를 사용할 수 있다. 예를 들어, β-턴 모방체는 하기 구조의 모방체 A 및 모방체 B, 및 Ala-Aib 및 Ala-Pro 디펩티드를 포함한다.
Figure pat00013
예시적인 조합물 및 특정 실시태양
본 발명의 하이브리드 폴리펩티드를 형성하기 위한 생활성 펩티드 호르몬 모듈의 예시적인 조합물은 천연 펩티드 호르몬, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 펩티드 호르몬의 유사체 및 유도체, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 천연 펩티드 호르몬의 단편, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 펩티드 호르몬의 유사체 및 유도체의 단편, 및 펩티드 인핸서로부터 선택되는, 하나 이상의 모듈이 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 2 이상의 생활성 펩티드 호르몬 모듈의 조합물을 포함한다.
본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 각 모듈이 성분 펩티드 호르몬으로부터 선택되는 2개 이상의 생활성 펩티드 호르몬 모듈을 포함할 것이다. 본 발명의 문맥에서, 하이브리드 폴리펩티드의 성분 펩티드 호르몬은 동일하거나 상이할 수 있되, 2개 이상의 성분 펩티드 호르몬은 상이하다. 바람직한 실시태양에서, 2개 이상의 성분 펩티드 호르몬은 상이한 펩티드 호르몬 패밀리, 예를 들어, 아밀린 패밀리, CCK, 렙틴 패밀리, PPF, 프로글루카곤 패밀리 및 엑센딘 패밀리로부터 유래한 것이다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 2 이상의 모듈을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하이브리드 폴리펩티드는 하나 이상의 추가의 펩티드 호르몬 유사체의 단편에 공유 연결된 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 제1 펩티드 호르몬 또는 유사체의 단편을 포함할 수 있다. 추가의 단편(들)은 임의로 한가지 이상의 호르몬 활성을 보일 수 있다. 제1 펩티드 호르몬은 추가의 펩티드 호르몬(들)과 동일하거나 상이할 수 있되, 하나 이상의 추가의 펩티드 호르몬은 제1 펩티드 호르몬과 상이하고, 제1 호르몬 활성은 임의의 추가의 호르몬 활성과 동일하거나 상이할 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 하나 이상의 펩티드 인핸서 모듈과 조합하여 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 하나 이상의 모듈을 포함할 수 있다. 예를 들어, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 제1 펩티드 호르몬의 단편은 펩티드 인핸서에 공유 연결될 수 있거나, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 제1 펩티드 호르몬의 단편은 펩티드 인핸서에 다시 연결된 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 제2 펩티드 호르몬에 공유 연결될 수 있다. 별법으로, 펩티드 인핸서는 안정화 스페이서로서 2개의 펩티드 호르몬 모듈 사이에 위치할 수 있다. 다시, 제1 펩티드 호르몬은 제2 펩티드 호르몬과 동일하거나 상이할 수 있고, 제1 호르몬 활성은 제2 호르몬 활성과 동일하거나 상이할 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 2, 3, 4 또는 그 이상의 생활성 펩티드 호르몬 모듈을 포함할 수 있다. 예시적인 조합물은 1, 2 또는 3개의 펩티드 인핸서와 함께 호르몬 활성을 갖는 1개의 모듈, 1 또는 2개의 펩티드 인핸서와 함께 호르몬 활성을 갖는 2개의 모듈, 1개의 펩티드 인핸서와 함께 호르몬 활성을 갖는 3개의 모듈 등을 포함한다.
성분 펩티드 호르몬은 바람직하게는 아밀린, 아드레노메듈린, 칼시토닌, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드, 인터메딘, 콜레시스토키닌, 렙틴 펩티드 YY, 글루카곤 유사 펩티드-1, 글루카곤 유사 펩티드 2, 옥신토모듈린 또는 엑센딘-4로부터 선택된다.
보다 특히, 바람직한 모듈 조합물은 성분 펩티드 호르몬으로서 엑센딘, 아밀린 및 PYY의 조합물을 포함하는 것을 포함한다. 특정 조합물은 스페이서 또는 연결기가 존재하거나 존재하지 않는 엑센딘-4/PYY 및 PYY/엑센딘-4 조합물을 포함한다. 다른 조합물은 스페이서 또는 연결기가 존재하거나 존재하지 않는 엑센딘/아밀린 및 아밀린/엑센딘 조합물을 포함한다. 또다른 조합물은 스페이서 또는 연결기가 존재하거나 존재하지 않는 아밀린/PYY 및 PYY/아밀린 조합물을 포함한다.
한 측면에서, 바람직한 모듈 조합물은 엑센딘-4, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 엑센딘-4의 단편, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 엑센딘-4 유사체 또는 유도체, 또는 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 엑센딘-4 유사체의 단편을 포함하는 제1 모듈을 하나 이상의 추가의 생활성 펩티드 호르몬 모듈과 함께 포함하는 것을 포함한다. 한 실시태양에서, 제1 모듈은 1, 2 또는 3개의 추가의 생활성 펩티드 호르몬 모듈에 연결된다.
바람직한 실시태양에서, 엑센딘-4 펩티드를 포함하는 제1 모듈은 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 아밀린 펩티드를 포함하는 제2 생활성 펩티드 호르몬 모듈에 연결된다. 다른 실시태양에서, 제2 모듈은 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 칼시토닌 펩티드를 포함하는 제3 생활성 펩티드 호르몬 모듈에 추가로 연결된다. 또다른 실시태양에서, 제3 모듈은 아밀린 펩티드로부터 선택되는 펩티드 인핸서를 포함하는 제4 생활성 펩티드 호르몬 모듈에 추가로 연결될 수 있다. 한 실시태양에서, 제1 모듈은 하이브리드 폴리펩티드의 C-말단 종결부에 위치할 수 있다. 별법으로, 제1 모듈은 하이브리드 폴리펩티드의 N-말단 종결부에 위치할 수 있다. 특정 실시태양에서, 스페이서 또는 링커, 예를 들어, βAla이 필요할 경우 모듈을 부착시키기 위해 삽입될 수 있다.
바람직한 엑센딘-4 펩티드는 엑센딘-4, 엑센딘-4(1-27), 엑센딘-4(1-28), 14Leu,25Phe-엑센딘-4(1-28) 및 5Ala,14Leu,25Phe-엑센딘-4(1-28)을 포함한다. 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 바람직한 아밀린 펩티드는 아밀린, 아밀린 단편 예를 들어, 아밀린(1-17), 아밀린(1-16), 아밀린(1-15) 및 아밀린(1-7), 및 아밀린 유사체, 예를 들어, 프람린타이드, 2Ala-h-아밀린, 2,7Ala-h-아밀린, 및 이들의 단편을 포함한다. 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 바람직한 칼시토닌 펩티드는 sCT, sCT 단편, 예를 들어, sCT(8-10), sCT(8-27), 및 칼시토닌 유사체, 예를 들어, 18Arg-sCT, 14Gln,18Arg-sCT, 14Gln,11,18Arg-sCT, 및 이들의 단편을 포함한다. 바람직한 아밀린 펩티드 인핸서는 아밀린(32-37), 아밀린(33-37) 및 아밀린(34-37), 및 이들의 유사체를 포함한다. 본 발명과 관련하여 유용한 아밀린/sCT 조합물은 본원에 참고로 포함된, 본원과 동시에 출원된 PCT/US05/[XXXXX] (명칭: Amylin Family Agonist, 대리인 문서 번호 18528.835)에 개시된 것을 포함한다.
한 측면에서, 바람직한 모듈 조합물은 엑센딘-4, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 엑센딘-4의 단편, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 엑센딘-4 유사체 또는 유도체, 또는 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 엑센딘-4 유사체의 단편을 포함하는 제1 모듈을 펩티드 인핸서와 함께 포함하는 것을 포함한다. 바람직한 엑센딘-4 화합물은 엑센딘-4, 엑센딘-4(1-27), 엑센딘-4(1-28), 14Leu,25Phe-엑센딘-4(1-28) 및 5Ala,14Leu,25Phe-엑센딘-4(1-28)을 포함한다. 바람직한 펩티드 인핸서는 PYY(25-36), PYY(30-36) 및 PYY(31-36)을 포함한다. 한 실시태양에서, 제1 모듈은 하이브리드 폴리펩티드의 C-말단 종결부에 위치하고, 펩티드 인핸서는 하이브리드 폴리펩티드의 N-말단 종결부에 위치한다. 별법으로, 제1 모듈은 하이브리드 폴리펩티드의 N-말단 종결부에 위치할 수 있고, 펩티드 인핸서는 하이브리드 폴리펩티드의 C-말단 종결부에 위치할 수 있다. 특정 실시태양에서, 스페이서 또는 링커, 예를 들어, βAla이 필요할 경우 모듈을 부착시키기 위해 삽입될 수 있다.
다른 측면에서, 바람직한 모듈 조합물은 엑센딘-4, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 엑센딘-4의 단편, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 엑센딘-4 유사체 또는 유도체, 또는 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 엑센딘-4 유사체의 단편을 포함하는 제1 모듈을, CCK, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 CCK의 단편, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 CCK 유사체 또는 유도체, 또는 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 CCK 유사체의 단편을 포함하는 제2 모듈과 함께 포함하는 것을 포함한다. 다시, 바람직한 엑센딘-4 화합물은 엑센딘-4, 엑센딘-4(1-27), 엑센딘-4(1-28), 14Leu,25Phe-엑센딘-4(1-28), 5Ala,14Leu,25Phe-엑센딘-4(1-28) 및 14Leu-엑센딘-4(1-28)을 포함한다. 바람직한 CCK 화합물은 CCK-8 및 CCK-8(Phe(CH2SO3))을 포함한다. 한 실시태양에서, 제1 모듈은 하이브리드 폴리펩티드의 C-말단 종결부에 위치하고, 제2 모듈은 하이브리드 폴리펩티드의 N-말단 종결부에 위치한다. 별법으로, 제1 모듈은 하이브리드 폴리펩티드의 N-말단 종결부에 위치할 수 있고, 펩티드 인핸서는 하이브리드 폴리펩티드의 C-말단 종결부에 위치할 수 있다. 특정 실시태양에서, 스페이서 또는 링커, 예를 들어, βAla이 필요할 경우 모듈을 부착시키기 위해 삽입될 수 있다.
다른 측면에서, 바람직한 모듈 조합물은 아밀린, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 아밀린의 단편, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 아밀린 유사체 또는 유도체 또는 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 아밀린 유사체의 단편을 포함하는 제1 모듈을, 펩티드 인핸서, 예를 들어, PYY(25-36) 또는 PYY(30-36)을 포함하는 제2 모듈과 함께 포함하는 것을 포함한다. 한 실시태양에서, 제1 모듈은 하이브리드 폴리펩티드의 C-말단 종결부에 위치하고, 펩티드 인핸서는 하이브리드 폴리펩티드의 N-말단 종결부에 위치한다. 별법으로, 제1 모듈은 하이브리드 폴리펩티드의 N-말단 종결부에 위치할 수 있고, 펩티드 인핸서는 하이브리드 폴리펩티드의 C-말단 종결부에 위치할 수 있다. 특정 실시태양에서, 스페이서 또는 링커, 예를 들어, βAla이 필요할 경우 모듈을 부착시키기 위해 삽입될 수 있다.
다른 바람직한 모듈 조합물은 엑센딘 및 CCK 또는 3차 조합물로서 아밀린, 칼시토닌 및 CCK의 조합물을 포함하는 것을 포함한다. 특정 조합물은 스페이서 또는 링커 및 연결기가 존재하거나 존재하지 않는 엑센딘/CCK 및 CCK/엑센딘을 포함한다. 다른 조합물은 스페이서 또는 연결기가 존재하거나 존재하지 않는 CCK/아밀린/칼시토닌 및 CCK/아밀린/칼시토닌/아밀린을 포함한다. 각각의 모듈은 하이브리드 폴리펩티드의 목적하는 특성에 따라 독립적으로 펩티드 인핸서일 수 있거나 호르몬 활성을 보일 수 있다.
또다른 바람직한 모듈 조합물은 3차 및 4차 하이브리드 분자로서 엑센딘, 아밀린 및 칼시토닌의 조합물을 포함하는 것을 포함한다. 예시적인 조합물은 스페이서 또는 연결기가 존재하거나 존재하지 않는 엑센딘/아밀린/칼시토닌; 엑센딘/아밀린/칼시토닌/아밀린; 아밀린/칼시토닌/엑센딘; 및 아밀린/칼시토닌/아밀린/엑센딘 조합물을 포함한다. 각각의 모듈은 하이브리드 폴리펩티드의 목적하는 특성에 따라 독립적으로 펩티드 인핸서일 수 있거나 호르몬 활성을 보일 수 있다.
한 실시태양에서, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 생활성 펩티드 호르몬 모듈(들)의 하나가 아밀린 또는 그의 유사체 또는 단편이고, 제2 생활성 펩티드 호르몬 모듈이 CCK를 포함할 경우, 하이브리드 폴리펩티드는 바람직하게는 상이한 성분 펩티드 호르몬으로부터 선택되는 제3 생활성 펩티드 호르몬 모듈을 포함하여야 한다. 예시적인 제3 생활성 펩티드 호르몬 모듈은 칼시토닌, 보다 바람직하게는 연어 칼시토닌, 그의 유사체 또는 단편을 포함한다.
다른 실시태양에서, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 생활성 펩티드 호르몬 모듈(들)의 하나가 아밀린 또는 그의 유사체 또는 단편이고, 제2 생활성 펩티드 호르몬 모듈이 CT를 포함할 경우, 하이브리드 폴리펩티드는 바람직하게는 상이한 성분 펩티드 호르몬으로부터 선택되는 제3 생활성 펩티드 호르몬 모듈을 포함하여야 한다. 예시적인 제3 생활성 펩티드 호르몬 모듈은 엑센딘-4, 그의 유사체 또는 단편을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 생활성 펩티드 호르몬 모듈(들)의 하나가 GLP-1 또는 그의 유사체 또는 단편이고, 제2 생활성 펩티드 호르몬 모듈이 엑센딘 단편을 포함하는 펩티드 인핸서일 경우, 하이브리드 폴리펩티드는 바람직하게는 제3 생활성 펩티드 호르몬 모듈을 포함하여야 한다. 예시적인 제3 생활성 펩티드 호르몬 모듈은 PYY (그의 유사체, 유도체 및 단편 포함) 및 CCK (그의 유사체, 유도체 및 단편 포함)를 포함한다.
상기한 각각의 바람직한 조합물 내에, 성분 펩티드 호르몬에 대한 언급은 그에 관련된 유사체, 유도체, 단편, 및 펩티드 인핸서에 대한 언급을 포함함을 이해하여야 한다.
바람직한 측면에서, 하이브리드 폴리펩티드는 다음을 포함한다.
Figure pat00014
Figure pat00015
Figure pat00016
본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 또한 상기 하이브리드 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대한 변형, 예를 들어, 치환, 결실 및 삽입, 및 이들의 임의의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 측면에서, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 "비필수" 아미노산 잔기의 하나 이상의 변형을 포함한다. 본 발명의 문맥에서, "비필수" 아미노산 잔기는 하이브리드 폴리펩티드의 성분 펩티드 호르몬 수용체 작용제 활성을 파괴하거나 실질적으로 감소시키지 않으면서 단편, 예를 들어, 성분 펩티드 호르몬 단편의 천연 인간 아미노산 서열에서 변형, 즉 결실 또는 치환될 수 있는 잔기이다.
바람직한 치환은 보존적 아미노산 치환을 포함한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄, 또는 물리화학적 특성 (예를 들어, 정전, 수소 결합, 등입체성, 소수성 특징)을 갖는 아미노산 잔기로 교체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 공지되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 메티오닌, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판), β-분지된 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다.
본 발명은 또한 성분 펩티드 호르몬의 유도체에 관한 것이다. 상기 유도체는 하나 이상의 수용성 중합체 분자, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG") 또는 다양한 길이의 지방산 사슬 (예를 들어, 스테아릴, 팔미토일, 옥타노일 등)에 컨쥬게이팅되거나 폴리아미노산, 예를 들어, 폴리-his, 폴리-arg, 폴리-lys 및 폴리-ala이 부가된 하이브리드 폴리펩티드를 포함한다. 하이브리드 폴리펩티드의 변형은 또한 작은 분자 치환체, 예를 들어, 단쇄 알킬 및 구속 알킬 (예를 들어, 분지쇄, 시클릭, 융합, 아다만틸) 및 방향족기를 포함할 수 있다. 수용성 중합체 분자의 분자량은 바람직하게는 약 500 내지 약 20,000 달톤일 것이다.
상기 중합체-컨쥬게이션 및 작은 분자 치환체 변형은 하이브리드 폴리펩티드의 서열 내의 아미노산 잔기의 N- 또는 C-말단에서 또는 측쇄에서 1회 발생할 수 있다. 별법으로, 하이브리드 폴리펩티드를 따라 유도체화의 다중 부위가 존재할 수 있다. 리신, 아스파르트산, 글루탐산 또는 시스테인을 사용한 하나 이상의 아미노산의 치환은 유도체화를 위한 추가의 부위를 제공할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,824,784 및 5,824,778 참조). 바람직하게는, 하이브리드 폴리펩티드는 1, 2 또는 3개의 중합체 분자에 컨쥬게이팅될 수 있다.
수용성 중합체 분자는 바람직하게는 아미노, 카르복실 또는 티올기에 연결될 수 있고, 리신, 아스파르트산, 글루탐산 또는 시스테인의 N 또는 C 말단에 또는 측쇄에 연결될 수 있다. 별법으로, 수용성 중합체 분자는 디아민 및 디카르복실기와 연결될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 리신 아미노산 상의 엡실론 아미노기를 통해 1, 2 또는 3개의 PEG 분자에 컨쥬게이팅된다.
또한, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드 유도체는 하나 이상의 아미노산 잔기에 대한 화학적 변형을 갖는 하이브리드 폴리펩티드를 포함한다. 상기 화학적 변형은 아미드화, 글리코실화, 아실화, 황산화, 인산화, 아세틸화 및 고리화를 포함한다. 화학적 변형은 PPF 하이브리드 폴리펩티드의 서열 내의 아미노산 잔기의 N- 또는 C-말단에서 또는 측쇄에서 1회 발생할 수 있다. 한 실시태양에서, 상기 펩티드의 C-말단은 유리 -OH 또는 -NH2 기를 가질 수 있다. 다른 실시태양에서, N-말단 종결부는 이소부틸옥시카르보닐기, 이소프로필옥시카르보닐기, n-부틸옥시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, 이소카프로일기, 옥타닐기, 옥틸 글리신기 (G(Oct)) 또는 8-아미노옥탄산기로 캐핑될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 고리화는 디술피드 다리의 형성을 통해 수행될 수 있다. 별법으로, 하이브리드 폴리펩티드를 따라 화학적 변형의 다중 부위가 존재할 수 있다.
본 발명의 하이브리드 폴리펩티드의 예는 서열 목록에 제시되고 하기 실시예에서 추가로 논의된다.
대사 질환 또는 병의 치료 또는 예방에서 하이브리드 폴리펩티드의 용도
본 발명의 다른 측면에서, 그를 필요로 하는 대상에게 하이브리드 폴리펩티드의 치료 또는 예방 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 비만의 치료 또는 예방 방법이 제공된다. 바람직한 실시태양에서, 투여 대상은 비만 또는 과체중 대상이다. "비만"은 일반적으로 본원의 목적상 30 이상의 체질량 지수로 정의되지만, 체중을 저하시킬 필요가 있거나 이를 원하는, 체질량 지수가 30 미만인 대상을 포함하는 임의의 대상이 "비만"의 범위에 포함된다. 인슐린 저항, 당 불내성이거나 임의의 형태의 당뇨병 (예를 들어, 1형, 2형 또는 임신 당뇨병)을 갖는 대상이 본 발명의 방법으로부터 도움을 받을 수 있다.
본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 음식 섭취의 감소, 영양분 이용률의 감소, 체중 감소, 신체 조성에 대한 영향 및 신체 에너지 함량의 변경 또는 에너지 소모의 증가, 당뇨병의 치료, 및 지질 프로파일의 개선 (LDL 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준의 감소 및(또는) HDL 콜레스테롤 수준의 변경 포함)을 위한 방법이 제공된다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드의 치료 또는 예방 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상에서 영양분 이용률을 감소시킴으로써 완화될 수 있는 병 또는 질환의 치료 또는 예방에 사용된다. 상기 병 및 질환은 고혈압, 이상지혈증, 심혈관 질병, 식이 장애, 인슐린 저항, 비만, 및 임의의 종류의 당뇨병을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
이론에 매이기를 의도하지 않지만, 말초 투여된 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드의 음식 섭취 감소, 위 배출 지연, 영양분 이용률 감소 및 체중 감소 유도 효과는 PP 패밀리 또는 이와 유사한 하나 이상의 특유한 수용체 클래스와의 상호작용에 의해 결정되는 것으로 생각된다. 보다 특히, PYY-선호 (또는 Y7) 수용체에 유사한 수용체 또는 수용체들이 관련되는 것으로 보인다.
본 발명에 유용한 부가적인 분석은 신체 조성에 대한 PPF 화합물의 효과를 결정할 수 있는 것을 포함한다. 예시적인 분석은 대사 질병을 위한 식이 유도 비만 (DIO) 마우스 모델의 유용성을 수반하는 것일 수 있다. 치료 기간 전에, 수컷 C57BL/6J 마우스에게 4주령에서 시작하여 6주 동안 고지방 사료 (#D12331, 지방으로부터 칼로리의 58％; 리서치 다이어트, 인크. (Research Diets, Inc.))를 공급할 수 있다. 연구 동안, 마우스는 고지방 먹이를 계속 섭취할 수 있다. 물은 연구 기간 내내 임의로 제공할 수 있다. DIO 그룹과 대사 파라미터를 비교하기 위해 유사한 주령의 비비만 마우스의 군에는 저지방 사료 (#D12329, 지방으로부터 칼로리의 11％)를 공급할 수 있다.
DIO 마우스에 비히클 (물 중 50％ 디메틸술폭시드 (DMSO)) 또는 본 발명의 화합물을 전달하도록 피하 (SC) 견갑내 삼투 펌프를 이식할 수 있다. 후자의 군의 펌프는 임의의 양, 예를 들어, 1000 ㎍/kg/d의 본 발명의 화합물을 7-28일 동안 전달하도록 세팅될 수 있다.
체중 및 음식 섭취는 연구 기간 내내 규칙적인 간격에 걸쳐 측정할 수 있다. 호흡 지수 (RQ, CO2 생산÷ O2 소비로서 정의됨) 및 대사율은 동물 전체의 간접 열량측정법 (옥시맥스 콜럼버스 인스트루먼츠 (Oxymax Columbus Instruments), 미국 오하이오주 콜럼버스)을 사용하여 측정할 수 있다. 마우스를 이소플루란 과다투여로 안락사시키고, 비만 지수 (양쪽 부고환 지방체 중량)를 측정할 수 있다. 또한, 부고환 중량의 측정 전에, 각 마우스에 대한 신체 조성 (제지방량, 체지방량)을 제조자 (루나 픽시무스, 지이 이미징 시스템 (Lunar Piximus, GE Imaging System))의 지시에 따라 이중 에너지 X선 흡수계측기 (Dual Energy X-ray Absorptiometry, DEXA)를 사용하여 분석할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 본 발명의 바람직한 PPF 폴리펩티드는 본원에 기재된 분석 (바람직하게는 음식 섭취, 위 배출, 췌장 분비, 체중 감소 또는 신체 조성 분석) 중의 하나에서, 동일한 분석에서의 성분 펩티드 호르몬 보다 효과가 더 크다.
그를 필요로 하는 대상에서 음식 섭취 감소, 체중 감소, 또는 비만 치료의 결과로서 고혈압의 개선 이외에, 본 발명의 화합물은 저혈압 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 췌장섬 또는 세포에서 글루코스 반응성의 강화, 유도, 증강 또는 회복에 유용할 수 있다. 상기 작용은 대사 질환, 예를 들어, 상기 및 미국 특허 출원 US20040228846에 설명된 것과 관련된 병의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 상기 활성을 측정하는 분석은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 공개된 미국 특허 출원 US20040228846 (그 전부가 참고로 포함됨)에서,섬 분리 및 배양 및 태아 섬 성숙의 결정에 대한 분석이 기재되어 있다. 특허 출원 US20040228846의 실시예에서, 췌장 폴리펩티드 (PP), 신경펩티드 Y (NPY), 신경펩티드 K (NPK), PYY, 세크레틴, 글루카곤 유사 펩티드-1 (GLP-1) 및 봄베신을 포함하여 장-유래 호르몬 펩티드는 시그마 (Sigma)로부터 구입하였다. 콜라게나제 타입 XI는 시그마로부터 입수하였다. RPMI 1640 배양 배지 및 소 태아 혈청은 깁코 (Gibco)로부터 입수하였다. 항-인슐린 항체를 함유하는 방사성 면역 분석 키트 ([125I]-RIA 키트)는 링코 (Linco, 세인트 루이스)로부터 구입하였다.
산후 래트 섬을 P-02 연령 래트로부터 얻었다. 성체 래트 섬은 6-8주령 래트로부터 얻었다. 태아 래트 섬은 다음과 같이 얻었다. 임신한 암컷 래트를 임신의 21일차에 희생시켰다. 태아를 자궁으로부터 제거하였다. 각각의 태아로부터 10-14 췌장을 절개하여 Hanks 버퍼에서 2회 세척하였다. 췌장을 모아서 6 ml의 1 mg/ml 콜라게나제 (타입 XI, 시그마)에 현탁시키고, 일정하게 진탕하면서 37℃에서 8-10분 동안 인큐베이팅하였다. 10 부피의 빙냉 Hanks 버퍼를 첨가하여 소화를 중지시킨 후 Hanks 버퍼로 3회 세척하였다. 이어서, 섬을 Ficoll 구배에 의해 정제하고, 1μM IBMX를 첨가하거나 첨가하지 않은 10％ 소 태아 혈청 (FBS)/RPMI 배지에서 배양하였다. 5일의 마지막에, 20개의 섬을 손으로 각 튜브에 넣고, 정지상 인슐린 방출에 대해 분석하였다. 일반적으로, 섬을 먼저 KRP 버퍼로 세척한 후, 일정하게 진탕하면서 3 mM (낮은) 글루코스를 함유하는 1 ml의 KRP 버퍼로 30분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 상등액을 수거한 후, 섬을 17 mM (높은) 글루코스로 1시간 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 높은 또는 낮은 글루코스 자극으로부터 방출된 인슐린을 [125I]-RIA 키트를 사용하여 방사성 면역 분석 (RIA)으로 분석하였다. E21 태아 섬을 200 ng/ml PYY, PP, CCK, NPK, NPY, 세크레틴, GLP-1 또는 봄베신의 존재 하에 5일 동안 배양하였다.
또한, 표준 설치류 먹이 Purina 5008를 공급한 모든 fa/fa 수컷에서 당뇨병을 자연발생적으로 발생시키는 동종교배 (> F30 세대) 래트 모델인 Zucker 당뇨병 비만 (ZDF) 수컷 래트를 사용하여 예시적인 생체내 분석을 제공한다. ZDF fa-fa 수컷에서, 고혈당증이 약 7주령에서 발생하기 시작하고, 글루코스 수준 (fed)은 10 내지 11주령까지 전형적으로 500 mg/DL에 도달하였다. 인슐린 수준 (fed)은 당뇨병 발생 동안 높았다. 그러나, 19주령까지 인슐린은 거의 마른 대조군 수컷 새끼의 수준까지 저하되었다. 비만 래트의 트리글리세리드 및 콜레스테롤 수준은 정상적으로 마른 래트보다 더 높다. 분석에서, 3군 (군당 래트 6마리)의 7주령 래트에게 ALZA 펌프를 사용하여 14일 동안 각각 1) 비히클 대조물, 2) 및 3) 2개의 상이한 투여량 100 pmol/kg/hr 및 500 pmol/kg/hr의 PYY을 주입 처리하였다. 주입전 및 주입 7일 및 14일 후에 4개의 측정치, 즉 1) 혈장 글루코스 수준, 2) 혈장 인슐린 수준 및 3) 혈장 트리글리세리드 (TG) 수준, 및 경구 글루코스 허용성 (OGTT) 시험치를 얻었다. 따라서, 이들 분석을 목적하는 활성에 대해 시험하기 위한 본 발명의 화합물과 함께 사용할 수 있다.
하이브리드 폴리펩티드에 대해 고려되는 다른 용도는 알츠하이머병의 치료, 예방 또는 개시 지연을 위해 중추신경계의 알루미늄 (Al) 농도를 감소시키는 방법을 포함한다 (그 전부가 참고로 포함된 미국 특허 6,734,166 참조). Al에 대한 효과를 결정하기 위한 분석은 당업계에 공지되어 있고, 이배체 및 Ts 마우스를 사용한 미국 특허 6,734,166에서 발견할 수 있다. 상기 마우스는 Nalgene(등록상표) 브랜드 대사 또는 폴리프로필렌 우리에 각각 넣고, 실험 전에 우리에 적응시키기 위해 3일 동안 방치하였다. 마우스는 실험 동안 먹이 (LabDiet(등록상표) NIH Rat and Moust/Auto 6F5K52, 미국 미주리주 세인트루이스) 및 물을 자유롭게 섭취할 수 있었고, 단 안락사시키기 전 16시간 동안에는 먹이를 주지 않았다. 마우스에게 매일 활성 화합물 또는 염수를 피하 주사하였다. 한 실험에서 13일 종료시, 다른 실험에서는 3일 종료시에 마우스를 희생시키고, 샘플을 수집하였다. 마우스 뇌 샘플을 깨끗한 테플론 라이너 (liner)로 칭량하고, 분석을 위해 낮은 미량성분 등급 질산 중에서 마이크로파 소화에 의해 준비하였다. 이어서, 유도 커플링 플라즈마 질량 분석기 (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry)를 사용하여 샘플을 Al 함량에 대해 분석하였다 (Nuttall et al., Annals of Clinical and Laboratory Science 25,3, 264-271 (1995)). 분석 동안 모든 조직은 배경 오염을 최소화하기 위해 HEPA 공기 여과 시스템을 사용하여 클린룸 환경에서 취급하였다.
본 발명의 화합물은 일부가 항-분비 및 항-이동 특성에 관련된 것을 포함하여 넓은 범위의 생물학적 활성을 보인다. 화합물은 상피세포와의 직접적인 상호작용에 의해 또는 아마도 장관 분비를 자극하는 호르몬 또는 신경전달물질의 분비를 억제하여 위장관 분비를 억제할 수 있다. 항-분비 특성은 위 및(또는) 췌장 분비의 억제를 포함하고, 위염, 췌장염, 바레트 식도, 및 위식도 역류병을 포함하는 질병 및 질환의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다.
본 발명의 화합물은 과량의 장관 전해질 및 물 분비 및 흡수 감소에 관련된 임의의 수의 위장관 질환 (예를 들어, Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill Inco, New York, 12th Ed. 참조), 예를 들어, 감염성 설사, 염증성 설사, 짧은 창자 증후군, 또는 외과 수술 후에 일반적으로 발생하는 설사, 예를 들어, 회장조루술의 치료에 유용하다. 감염성 설사의 예는 비제한적으로 급성 바이러스성 설사, 급성 세균성 설사 (예를 들어, 살모넬라, 캄필로박터 (campylobacter), 및 클로스트리듐 (clostridium) 또는 원충 감염에 의한), 또는 여행자 설사 (예를 들어, 노르워크 (Norwalk) 바이러스 또는 로타바이러스 (rotavirus))를 포함한다. 염증성 설사의 예는 흡수불량 증후군, 열대 스프루, 만성 췌장염, 크론병, 설사, 및 과민성 대장 증후군을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 펩티드를 예를 들어, 수술 후 또는 콜레라에 의한 위장관 질환에 수반되는 위급 또는 치명적 상황의 치료에 사용될 수 있음이 밝혀졌다.
또한, 본 발명의 화합물은 단순히 장관 손상에 관련된 증상 (예를 들어, 설사) 치료가 아니라 장관 손상의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 상기 장 손상은 궤양 대장염, 염증성 장 질환, 장 위축, 장점막 상실 및(또는) 장점막 기능의 상실일 수 있거나 그 결과일 수 있다 (그 전부가 본원에 참고로 포함된 WO 03/105763 참고). WO 03/105763에 기재된 바와 같은 상기 활성에 대한 분석은 12:12 명:암 사이클에 적용되고 표준 설치류 먹이 (Teklad LM 485, 미국 위스콘신주 메디슨) 및 물을 마음대로 섭취한 250-300 g의 11주령의 수컷 HSD 래트를 포함한다. 래트를 실험 24시간 전에 단식시켰다. 만성 결장염의 간단하고 재현가능한 래트 모델은 문헌 [Morris GP, et al., "Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon." Gastroenterology. 1989; 96:795-803]에 기재된 바 있다. 이 모델은 염증 및 궤양 형성의 비교적 긴 지속 기간을 보이고, 결장 염증성 질병의 병리생리학을 특이적으로 조절된 방식으로 연구하고 인간에서 염증성 장 질환에 잠재적으로 적용가능한 새로운 치료법을 평가하기 위한 수단을 제공한다.
3％ 이소플루오란으로 래트를 마취하고, 37℃로 설정된 제어된 가열 패드에 놓았다. 위관 바늘을 직장을 통해 결장 내로 7 cm 삽입하였다. 문헌 [Mazelin, et al., Juton Nerv Syst. 1998; 73: 38 45]에 기재된 바와 같이, 50％ 에탄올 (v/v)에 용해된 합텐 트리니트로벤젠술폰산 (TNBS)을 위관 바늘을 통해 30 mg/kg의 투여량으로 0.4-0.6 mL의 총 부피로 결장의 내강 내로 전달하였다. 대조군에 염수 용액 (NaCl 0.9％)을 결장내 투여하였다.
대장염을 유발한 지 4일 후에, 결장을 마취된 래트로부터 잘라낸 후, 단두에 의해 안락사시켰다. 절제된 결장 및 비장의 중량을 측정하고, 전체 형태학적 손상을 스코어링하기 위해 결장의 사진을 찍었다. 염증은 충혈 및 장관 비후 영역으로 규정되었다.
본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 또한 췌장 종양을 치료하거나 예방하기 위해 (예를 들어, 췌장 종양의 증식을 억제하기 위해) 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 종양 세포의 증식을 감소시키는 것을 포함한다. 본 발명에 따라 치료할 수 있는 양성 췌장 종양 세포의 종류는 장액성 낭선종, 미세낭 종양 및 고형 낭성 종양을 포함한다. 본 발명의 방법은 또한 췌장의 관, 선방 또는 섬으로부터 발생하는 악성 췌장 종양 세포, 예를 들어, 암종의 증식 저하에도 효과적이다. 미국 특허 5,574,010 (그 전부가 참고로 포함됨)은 항증식성 시험을 위한 예시적인 분석을 제공한다. 예를 들어, '010 특허는 PANC-1 및 MiaPaCa-2가 상업적인 시판처, 예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC, 미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 입수가능한 2개의 인간 췌장 선암종 암세포주임을 제시한다. 2개의 종양 세포는 NAPCO 물 재킷 (jacketed) 5％ C02 인큐베이터 중에서 10％ 소 태아 혈청, 29.2 mg/L의 글루타민, 25 ㎍ 겐타마이신, 5 ml 페니실린, 스트렙토마이신, 및 펀지존 (fungizone) 용액 (제이알에이치 바이오사이언시스 (JRH Biosciences), 미국 캔자스주 레넥사)으로 보충된 RPMI-1640 배양 배지에서 37℃에서 성장시켰다. 모든 세포주를 종양 세포의 융합 단층이 얻어질 때 매주 1 내지 2회 0.25％ 트립신 (클로네틱스 (Clonetics), 미국 캘리포니아주 샌 디에고)으로 탈착시켰다. 세포를 4℃에서 냉장 원심분리기에서 7분 동안 500 g에서 펠렛화시키고, 트립신 부재 강화 RPMI 1640 배양 배지에 재현탁시켰다. 트리판 블루를 사용하여 생존 세포를 혈구계 슬라이드로 계수하였다.
각 종류의 10,000, 20,000, 40,000 및 80,000개 세포를 웰당 총 부피 200 ㎕의 배양 배지의 96웰 미세배양 플레이트 (코스타 (Costar), 미국 매사추세츠주 캠브리지)에 첨가하였다. 세포를 PYY 또는 시험 펩티드의 첨가 전에 24시간 동안 부착시켰다. 펩티드 첨가 전에 신선한 배양 배지로 교체하였다. PYY 또는 시험 화합물과 함께 췌장 종양 세포의 시험관내 인큐베이팅을 6시간 및 36시간 동안 계속하였다. PYY를 웰당 250 pmol, 25 pmol 및 2.5 pmol의 투여량으로 세포에 첨가하였다 (N =14). 시험 화합물은 웰당 400 pmol, 40 pmol 및 4 pmol의 투여량으로 세포 배양액에 첨가하였다. 대조군 웰에는 부착된 종양 세포에 대한 부피 및 물리적 교란을 모방하기 위해 2 ㎕의 0.9％ 염수를 첨가하였다. 각각의 96웰 플레이트는 실험 동안 각 플레이트 내에서 비교를 허용하도록 18개의 대조 웰을 포함하였다. PANC-1 및 MiaPaCa-2 세포 모두에서 PYY 및 시험 화합물의 농도를 변화시키면서 96웰 플레이트를 6회 반복하였다.
인큐베이션 기간 종료시에, 3-(4,5-디메틸티아졸릴-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드, MTr 테트라졸륨 브로마이드 (미국 미저리주 세인트루이스 소재의 시그마)를 신선한 배양 배지에 0.5 mg/ml로 첨가하였다. 배양 배지를 교환하고, 종양 세포를 4시간 동안 MTT 테트라졸륨 브로마이드와 함게 37℃에서 인큐베이팅하였다. 인큐베이션의 끝에, 배양 배지를 흡인하였다. 포르마존 결정 침전물을 200 ㎕의 디메틸 술폭시드 (시그마)에 용해시켰다. 가용화된 포르마존의 정량화는 ELISA 판독기 (몰레큘라 디바이시즈 (Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 멘로 파크) 상에서 500 nm 파장에서 흡수 판독치를 얻어 수행하였다. MTT 분석은 미토콘드리아 NADH 의존성 데히드로게나제 활성을 측정하고, 종양 세포의 정량적 시험관내 화학치료 반응에 대한 가장 민감하고 신뢰성있는 방법 중 하나이다 (Alley, M. C., et al., Cancer Res., 48: 589-601, 1988; Carmichael, J., et al., Cancer Res., 47: 936-942, 1987; McHale, A. P., et al., Cancer Lett., 41: 315-321, 1988; 및 Saxton, R. E., et al., J. Clin. Laser Med. and Surg, 10(5): 331-336, 1992). 550 nm에서 흡수 판독치의 분석은 동일한 시험 조건의 웰을 그룹핑하고 1방향 ANOVA에 의해 대조군과 다양한 펩티드 농도 처리 사이에 발생하는 차이를 입증함으로써 분석하였다.
예시적인 생체내 분석을 또한 제공한다. 인간 췌장관 선암종 Mia Paca-2를 펩티드 YY 및 시험 화합물에 의한 생체내 성장 억제에 대해 검토하였다. 7만 내지 100,000개의 인간 Mia PaCa-2 세포를 48 마리의 흉선없는 수컷 마우스 내로 동소 이식하였다. 1주 후, 동물을 PYY 또는 시험 화합물로 200 pmol/kg/hr로 미니-삼투 펌프를 통해 4주 동안 치료하였다. 짝을 이루는 배양물에는 염수를 투여하였다. 마우스를 희생 시켜 종양 크기 및 질량을 측정하였다. 대조 마우스는 조직 절편에서 입증되는 바와 같이 췌장 내에 유의한 인간 암 성장을 가졌다. 9주에, 90％의 대조 마우스는 실질적인 전이 질병을 가졌다. 종양 질량은 시험 화합물 처리된 마우스에서 60.5％, PYY 처리된 마우스에서 27％ 감소하였다.
모든 징후에 대해, 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 단일 또는 분할 투여 또는 조절된 연속 방출시에 약 0.5 ㎍ 내지 약 5 mg/일의 투여량으로, 투여당 약 0.01 ㎍/kg 내지 약 500 ㎍/kg, 보다 바람직하게는 약 0.05 ㎍/kg 내지 약 250 ㎍/kg, 가장 바람직하게는 약 50 ㎍/kg 미만으로 말초 투여된다. 상기 범위의 투여량은 물론 각각의 유사체 또는 유도체의 효과에 따라 상이할 것이고, 당업계의 숙련인에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 영양분 이용률을 감소시키기 위해 장기 또는 단기 작용을 나타내는, 아밀린 또는 아밀린 유사체 작용제, 연어 칼시토닌, 콜레시스토키닌 (CCK) 또는 CCK 작용제, 렙틴 (OB 단백질) 또는 렙틴 작용제, 엑센딘 또는 엑센딘 유사체 작용제, 또는 GLP-1 또는 GLP-1 유사체 작용제를 포함하는 다른 화합물 및 조성물을 포함하지만 이로 제한되지 않는 하나 이상의 다른 화합물 및 조성물과 함께 또는 개별적으로 투여될 수 있다. 적합한 아밀린 작용제는 예를 들어, [25,28,29Pro-] 인간 아밀린 (또한 "프람린타이드"로서 알려지고, 미국 특허 5,686,511 및 5,998,367에 설명됨)을 포함한다. 사용된 CCK는 바람직하게는 CCK 옥타펩티드 (CCK-8)이다. 렙틴은 예를 들어, 문헌 [Pelleymounter et al., Science 269: 540-3 (1995); Halaas et al., Science 269: 543-6 (1995); Campfield et al., Science 269: 546-9 (1995))에서 논의된다. 적합한 엑센딘은 엑센딘-3 및 엑센딘-4를 포함하고, 엑센딘 작용제 화합물은 예를 들어, PCT 공개 WO 99/07404, WO 99/25727 및 WO 99/25728에 기재된 것을 포함한다.
폴리펩티드 생산 및 정제
본원에 기재된 하이브리드 폴리펩티드는 표준 재조합 기술 또는 예를 들어, 자동화 또는 반자동화 펩티드 합성기 또는 둘 모두를 사용하는 당업계에 공지된 화학적 펩티드 합성 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 통상적인 기술에 따라 용액에서 또는 고체 지지체 상에서 합성할 수 있다. 다양한 자동화 합성기가 상업적으로 입수가능하고 공지의 프로토콜에 따라 사용될 수 있다 (예를 들어, Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 105: 6442 (1983); Merrifield, Science 232: 341-7 (1986); 및 Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds., Academic Press, New York, 1-284 (1979) 참조). 고체상 펩티드 합성은 캡핑 (capping)을 갖는 NMP/HOBt (옵션 1) 시스템 및 tBoc 또는 Fmoc 화학 (Applied Biosystems User's Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer, Version 1.3B July 1, 1988, section 6, pp. 49-70, 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems Inc., 미국 캘리포니아주 포스터 시티) 참조)를 사용하여 자동화 펩티드 합성기 (예를 들어, Model 430A, 어플라이드 바이오시스템즈 인크.)로 수행할 수 있다. 펩티드는 또한 Advanced Chem Tech Synthesizer (Model MPS 350, 미국 켄터키주 루이즈빌)를 사용하여 조립할 수 있다. 펩티드는 예를 들어, Waters Delta Prep 3000 시스템 및 C4, C8 또는 C18 예비적 컬럼 (10 μ, 2.2x25 cm; 비닥 (Vydac), 미국 캘리포니아주 헤스페리아)을 사용하여 RP-HPLC (예비적 및 분석적)에 의해 정제할 수 있다. 활성 펩티드는 쉽게 합성된 후 반응성 펩티드를 확인하기 위해 고안된 스크리닝 분석으로 스크리닝될 수 있다.
본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 별법으로 당업계에 공지된 재조합 기술에 의해 생산할 수 있다 (예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor (1989) 참조). 상기 재조합 기술에 의해 생산된 하이브리드 폴리펩티드는 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있다. 당업계의 숙련인은 상기 하이브리드 폴리펩티드의 다양한 단편을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 코돈 사용의 다의성 (degeneracy)을 고려하여 야생형 cDNA로부터 얻거나, 목적하는 바와 같이 공학처리될 수 있음을 이해할 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 미생물 숙주에서 mRNA의 전사 및 번역을 용이하게 하는 코돈을 포함할 수 있다. 상기 제조 서열은 당업계에 공지된 방법에 따라 용이하게 제조할 수 있다 (예를 들어, WO 83/04053 참조). 상기 폴리뉴클레오티드는 또한 임의로 N-말단 메티오닐 잔기를 코딩할 수 있다. 본 발명에 유용한 비-펩티드 화합물은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 인산염 함유 아미노산 및 상기 아미노산을 함유하는 펩티드는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다 (예를 들어, Bartlett and Landen, Bioorg Chem. 14: 356-77 (1986) 참조).
하이브리드 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하고 발현시키기 위해 다양한 발현 벡터/숙주 시스템을 사용할 수 있다. 이들은 미생물, 예를 들어, 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 형질감염되거나 세균 발현 벡터 (예를 들어, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 재조합 단백질 생산에 유용한 포유동물 세포는 VERO 세포, HeLa 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주, COS 세포 (예를 들어, COS-7), WI 38, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 및 293 세포를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 단백질의 재조합 발현을 위한 예시적인 프로토콜을 아래에서 설명한다.
이와 같이, 본 발명에 의해 제공되는 폴리뉴클레오티드 서열은 신규하고 유용한 바이러스 및 플라스미드 DNA 벡터, 신규하고 유용한 형질전환 및 형질감염된 원핵 및 진핵 숙주 세포 (배양시에 성장한 세균, 효모 및 포유동물 세포 포함), 및 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드를 발현할 수 있는 상기 숙주 세포의 배양 성장을 위한 신규하고 유용한 방법의 제공에 유용하다. 본원에서 하이브리드 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 키메라의 성분 펩티드 호르몬(들)의 과소생성이 완화되거나, 그의 수준 증가에 대한 필요성이 충족되는 유전자 요법에 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드의 재조합 DNA 생산 방법을 제공한다. (a) 상기 DNA 분자의 발현을 용이하게 하는 조건 하에서 상기 하이브리드 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, (b) 상기 하이브리드 폴리펩티드를 얻는 단계를 포함하는, 상기 하이브리드 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포로부터 하이브리드 폴리펩티드를 생산하는 방법이 제공된다.
숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있고, 세균, 포유동물 세포 (예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 원숭이 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, 암세포 또는 다른 세포), 효모 세포 및 곤충 세포를 포함한다.
또한, 재조합 단백질의 발현을 위한 포유동물 숙주 시스템도 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다. 숙주 세포 균주는 발현된 단백질을 프로세싱하거나 단백질 활성 제공에 유용한 특정 번역후 변형을 생성하는 특정 능력에 대해 선택할 수 있다. 폴리펩티드의 상기 변형은 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 단백질의 "프리프로" 형태를 절단하는 번역후 프로세싱은 또한 정확한 삽입, 폴딩 및(또는) 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포, 예를 들어, CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38 등은 상기 번역후 활성을 위한 특정 세포 기구 및 특징적인 메카니즘을 갖고, 도입된 외래 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하도록 선택할 수 있다.
별법으로, 효모 시스템이 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 하이브리드 폴리펩티드 cDNA의 코딩 영역은 PCR에 의해 증폭된다. 효모 프리-프로-알파 리더 (leader) 서열을 코딩하는 DNA는 알파 메이팅 팩터 유전자의 뉴클레오티드 1-20을 포함하는 프라이머 및 이 유전자의 뉴클레오티드 255-235에 상보성인 다른 프라이머를 사용하는 PCR 반응에서 효모 게놈 DNA로부터 증폭된다 (Kurjan and Herskowitz, Cell, 30: 933-43(1982)). 프리-프로-알파 리더 코딩 서열 및 하이브리드 폴리펩티드 코딩 서열 단편은 성숙 하이브리드 폴리펩티드에 융합된 프리-프로-알파 인자로 구성된 융합 단백질의 발현을 프로모터가 지시하도록 효모 알콜 데히드로게나제 (ADH2) 프로모터를 함유하는 플라스미드 내에 라이게이션된다. 문헌 [Rose and Broach, Meth. Enz. 185: 234-79, Goeddeled., Academic Press, Inc., San Diego, California (1990)]에 제시된 바와 같이, 벡터는 클로닝 부위의 하류의 ADH2 전사 터미네이터, 효모 "2-미크론" 복제 기점, 효모 leu-2d 유전자, 효모 REP1 및 REP2 유전자, 이. 콜라이 (E. coli) β-락타마제 유전자 및 이. 콜라이 복제 기점을 추가로 포함한다. β-락타마제 및 leu-2d 유전자는 각각 세균 및 효모에 대한 선택을 제공한다. 또한, leu-2d 유전자는 보다 높은 수준의 발현을 유도하기 위해 효모 내의 플라스미드의 카피수 증가를 촉진시킨다. REP1 및 REP2 유전자는 플라스미드 카피수 조절에 관련되는 단백질을 코딩한다.
위 문단에서 설명한 DNA 구성체는 공지의 방법, 예를 들어, 아세트산리튬 처리를 사용하여 효모 세포 내로 형질전환된다 (Steams et al., Meth. Enz. 185: 280-97 (1990)). ADH2 프로모터는 성장 배지에 글루코스가 고갈되면 유도된다 (Price et al., Gene 55: 287 (1987)). 프리-프로-알파 서열은 세포로부터 융합 단백질의 분비를 야기한다. 동시에, 효모 KEX2 단백질은 성숙 PYY 유사체 폴리펩티드로부터 프리-프로 서열을 절단한다 (Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330-4 (1984)).
본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 또한 효모에서 상업적으로 입수가능한 발현 시스템, 예를 들어, 피치아 (Pichia) 발현 시스템 (인비트로겐 (Invitrogen), 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 재조합적으로 발현될 수 있다. 상기 시스템은 또한 분비를 지시하기 위해 프리-프로-알파 서열에 의존하지만, 삽입체의 전사는 메탄올에 의한 유도시 알콜 옥시다제 (AOX1) 프로모터에 의해 유도된다. 분비된 하이브리드 폴리펩티드는 효모 성장 배지로부터, 예를 들어, 세균 및 포유동물 세포 상등액으로부터 하이브리드 폴리펩티드를 정제하기 위해 사용된 방법에 의해 정제된다.
별법으로, 하이브리드 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA는 바큘로바이러스 발현 벡터 pVL1393 (파밍겐 (PharMingen), 미국 캘리포니아주 샌디에고) 내로 클로닝될 수 있다. 이어서 하이브리드 폴리펩티드-함유 벡터는 sF9 단백질이 없는 배지 내에서 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포를 감염시키고 재조합 단백질을 생산하도록 제조자의 지시 (파밍겐)에 따라 사용된다. 단백질을 정제하고 헤파린-세파로즈 (Sepharose) 컬럼 (파마시아 (Pharmacia), 미국 뉴저지주 피스카타웨이) 및 순차적 분자 사이징 (sizing) 컬럼 (아미콘 (Amicon), 미국 매사추세츠주 비벌리)를 사용하여 배지로부터 농축시키고, PBS에 재현탁시킨다. SDS-PAGE 분석은 단일 밴드를 보여주고 단백질의 크기를 확인하고, Proton 2090 펩티드 서열분석기 (Peptide Sequencer) 상의 에드만 (Edman) 서열분석을 통해 그의 N-말단 서열을 확인한다.
예를 들어, 하이브리드 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 목적하는 프로모터 및 임의로 리더 서열을 함유하는 플라스미드 내로 클로닝될 수 있다 (예를 들어, Better et al., Science 240: 1041-3 (1988) 참조). 상기 구성체의 서열은 자동화 서열분석에 의해 확인할 수 있다. 이어서 플라스미드를 이. 콜라이 균주 MC1061 내로 세균의 CaCl2 인큐베이션 및 열 쇼크 처리를 사용하는 표준 절차를 이용하여 형질전환시킨다 (Sambrook et al., 상기 문헌). 형질전환된 세균을 카르베니실린으로 보충한 LB 배지에서 성장시키고, 발현된 단백질의 생산은 적합한 배지 내의 성장에 의해 유도한다. 존재하는 경우, 리더 서열은 하이브리드 폴리펩티드의 분비에 영향을 미치고 분비하는 동안 절단될 것이다. 분비된 재조합 단백질은 세균 배양 배지로부터 본원에서 하기 기재된 방법에 의해 정제된다.
별법으로, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 곤충 시스템에서 발현될 수 있다. 단백질 발현을 위한 곤충 시스템은 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 그러한 한 시스템에서, 오토그래파 캘리포르니카 (Autographa californica) 핵 다각체병 바이러스 (AcNPV)가 스포돕테라 프루기페르다 세포에서 또는 트리코플러시아 라르배 (Trichoplusia larvae)에서 외래 유전자를 발현하기 위해 벡터로서 사용된다. 하이브리드 폴리펩티드 코딩 서열을 바이러스의 비필수 구역, 예를 들어, 폴리헤드린 (polyhedrin) 유전자 내로 클로닝하고, 폴리헤드린 프로모터의 제어 하에 놓는다. 하이브리드 폴리펩티드의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자를 불활성화시키고 코트 단백질 코트가 결핍된 재조합 바이러스를 생성시킬 것이다. 이어서 재조합 바이러스를 사용하여 에스. 프루기페르다 세포 또는 트리코플러시아 라르배를 감염시키고, 여기에서 하이브리드 폴리펩티드가 발현된다 (Smith et al., J. Virol. 46: 584 (1983); Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-7 (1994)).
다른 예에서, 하이브리드 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 PCR로 증폭시켜 적절한 벡터, 예를 들어, pGEX-3X (파마시아) 내로 클로닝할 수 있다. pGEX 벡터는 벡터에 의해 코딩된 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) 및 벡터의 클로닝 부위 내로 삽입된 DNA 단편에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 융합 단백질을 생산하도록 설계된다. PCR을 위한 프라이머는 예를 들어, 적절한 절단 부위를 포함하도록 생성될 수 있다. 이어서 재조합 융합 단백질은 융합 단백질의 GST 부분으로부터 절단될 수 있다. pGEX-3X/PYY 유사체 폴리펩티드 구성체를 이. 콜라이 XL-1 Blue 세포 (스트라타젠 (Stratagene), 미국 캘리포니아 라 졸라) 내로 형질전환시키고, 개별 형질전환체를 단리하고 37℃에서 LB 배지 (카르베니실린으로 보충한) 내에서 0.4의 파장 600 nm에서의 광학 밀도로 성장시킨 후, 0.5 mM 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드 (시그마 케미칼 컴퍼니)의 존재 하에 4시간 동안 추가로 인큐베이팅시킨다. 개별 형질전환체의 플라스미드 DNA를 정제하고, 자동화 서열분석기를 사용하여 부분적으로 서열분석하여 목적하는 PPF 하이브리드 폴리펩티드-코딩 유전자 삽입이 적절한 배향으로 존재하는지를 확인한다.
세균 내에 불용성 봉입체로서 생산되는 것으로 예상되는 융합 단백질은 아래와 같이 정제할 수 있다. 세포를 원심분리에 의해 회수하고; 0.15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA로 세척하고; 0.1 mg/mL 리소자임 (시그마 케미칼 컴퍼니)으로 15분 동안 실온에서 처리한다. 용해물을 초음파분해에 의해 깨끗이 하고, 세포 파편을 10분 동안 12,000xg에서 원심분리에 의해 펠렛화한다. 융합 단백질-함유 펠렛을 50 mM Tris, pH 8 및 10 mM EDTA에 재현탁시키고, 50％ 글리세롤 상에 적층하고, 30분 동안 6000xg에서 원심분리한다. 펠렛을 Mg++ 및 Ca++가 없는 표준 인산염 완충 염수 용액 (PBS)에 재현탁시킨다. 재현탁된 펠렛을 변성 SDS 폴리아크릴아미드겔에 분획화함으로써 융합 단백질을 추가로 정제한다 (Sambrook et al., 상기 문헌). 겔을 0.4 M KCl에 담거 단백질을 가시화하고, 이를 절개하고 SDS가 없는 겔-진행 (running) 버퍼에서 전해용출한다. GST/PYY 유사체 폴리펩티드 융합 단백질이 세균 내에서 가용성 단백질로서 생산되는 경우, GST 정제 모듈 (파마시아 바이오테크 (Pharmacia Biotech))을 사용하여 정제할 수 있다.
융합 단백질은 PPF 하이브리드 폴리펩티드로부터 GST를 절단하기 위해 소화시킬 수 있다. 소화 반응 (20-40 ㎍ 융합 단백질, 20-30 유닛 인간 트롬빈 (0.5 mL PBS 중 4000 U/mg (시그마))을 16-48시간 실온에서 인큐베이팅하고 반응 생성물을 분획화시키기 위해 변성 SDS-PAGE 겔 상에 로딩시킨다. 겔을 0.4 M KCl에 담거 단백질 밴드를 가시화시킨다. 하이브리드 폴리펩티드의 예상 분자량에 대응하는 단백질 밴드의 서열은 자동화 서열분석기 (어플라이드 바이오시스템즈 모델 473A)를 사용하는 부분 아미노산 서열 분석에 의해 확인할 수 있다.
본 발명의 하이브리드 폴리펩티드의 재조합 발현의 특히 바람직한 방법에서, 293개의 세포를 칼슘 인산염 방법에 의해 pCMV 벡터 (5' CMV 프로모터, 3' HGH 폴리 A 서열) 내에 하이브리드 폴리펩티드 cDNA를 함유하는 플라스미드 및 pSV2neo (neo 내성 유전자를 함유하는)로 동시형질감염시킬 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 형질감염에 앞서 ScaI로 선형화시켜야 한다. 유사하게, neo 유전자가 포함된 유사한 pCMV 벡터를 사용하는 별도의 구성체를 사용할 수 있다. 10-14일 동안 0.5 mg/mL G418 (네오마이신 유사 항생제)를 함유하는 성장 배지 내의 희석을 제한함으로써 단일 세포 클론으로부터 안정한 세포주를 선택한다. 세포주는 ELISA 또는 웨스턴 (Western) 블롯에 의해 하이브리드 폴리펩티드 발현에 대해 스크리닝하고, 고발현 세포주를 대규모 성장을 위해 팽창시킨다.
형질전환된 세포는 장기간 고수율 단백질 생산을 위해 사용하는 것이 바람직하고, 따라서 안정한 발현이 바람직하다. 일단 상기 세포가 목적하는 발현 카세트와 함께 선택가능 마커를 함유하는 벡터로 형질전환되면, 선택 배지로 교체하기 전에 세포를 영양강화 배지 내에서 1-2일 동안 성장시킬 수 있다. 선택가능 마커는 선택을 위해 내성을 부여하도록 설계되고, 그의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장 및 회수를 허용한다. 안정하게 형질전환된 세포의 내성 응집체를 세포에 적절한 조직 배양 기술을 사용하여 증식시킬 수 있다.
재조합 단백질 생산을 위해 형질전환된 세포를 회수하기 위해 많은 선택 시스템을 사용할 수 있다. 상기 선택 시스템은 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포 내에서 HSV 티미딘 키나제, 히포잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 및 아데닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 또한, 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr; 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt; 아미노글리코시드 G418에 대한 내성을 부여하고, 또한 클로르술푸론에 대한 내성을 부여하는 neo; 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro에 대해 선택의 기초로서 항-대사제 내성을 이용할 수 있다. 유용할 수 있는 추가의 선택가능한 유전자는 세포가 트립토판 대신 인돌을 이용하게 하는 trpB, 또는 세포가 히스티딘 대신 히스티놀을 이용하게 하는 hisD를 포함한다. 형질전환체의 확인을 위한 시각적 표시를 제공하는 마커는 안토시아닌, β-글루쿠로니다제 및 그의 기질 GUS, 및 루시퍼라제 및 그의 기질 루시페린을 포함한다.
본 발명의 많은 하이브리드 폴리펩티드는 자동화 펩티드 합성 및 재조합 기술의 조합을 이용하여 생산할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 결실, 치환 및 삽입을 포함하는 변형과 PEG화 반응의 조합을 함유할 수 있다. 상기 하이브리드 폴리펩티드 단계별로 생산할 수 있다. 제1 단계에서, 결실, 치환, 삽입, 및 이들의 임의의 조합의 변형을 함유하는 중간체 폴리펩티드를 설명된 재조합 기술에 의해 생산할 수 있다. 이어서 하기하는 선택적인 정제 단계 후, 중간체 폴리펩티드를 적절한 PEG화 시약 (예를 들어, 넥타르 트랜스포밍 테라퓨틱스 (Nectar Transforming Therapeutics), 미국 캘리포니아주 산 카를로스)로부터)을 사용하는 화학적 변형을 통해 PEG화시켜 목적하는 하이브리드 폴리펩티드를 수득한다. 당업계의 숙련인은 상기한 과정이 결실, 치환, 삽입, 유도체화, 및 당업계에 잘 알려지고 본 발명에서 고려되는 다른 변형 수단으로부터 선택되는 변형의 조합을 함유하는 하이브리드 폴리펩티드에 적용하기 위해 일반화될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명에 의해 생성된 하이브리드 폴리펩티드를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 펩티드 정제 기술은 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 이들 기술은 한 수준에서, 세포 환경의 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 분획으로의 조질 분획화를 포함한다. 폴리펩티드를 다른 단백질로 분리시키면, 관심있는 폴리펩티드를 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 이용하여 추가로 정제하여 부분 또는 완전 정제 (또는 균질상태 (homogeneity)로 정제)를 달성할 수 있다. 순수한 펩티드의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 이온-교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 및 등전 집속 (focusing)이다. 특히 효율적인 펩티드의 정제 방법은 역상 HPLC에 이어, 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법 (LC/MS) 및 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) 질량 분광분석법에 의한 정제된 생성물의 특성화이다. 순도의 추가 확인은 아미노산 분석 결정에 의해 얻어진다.
본 발명의 특정 측면은 코딩된 단백질 또는 펩티드의 정제, 및 특정 실시태양에서 실질적인 정제에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "정제된 펩티드"는 다른 성분으로부터 단리가능한 조성물을 나타내도록 의도되고, 여기서 펩티드는 그의 자연에서 입수가능한 상태에 비해 임의의 정도로 정제된다. 따라서, 정제된 펩티드는 또한 자연에서 발생할 수 있는 환경으로부터 유리된 펩티드를 의미한다.
일반적으로, "정제된"은 다양한 다른 성분을 제거하도록 분획화되고, 조성물이 실질적으로 그의 발현된 생물학적 활성을 보유하는 펩티드 조성물을 의미할 것이다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이는 펩티드가 조성물의 주성분을 형성하는, 예를 들어, 조성물에서 약 50％, 약 60％, 약 70％, 약 80％, 약 90％, 약 95％ 이상의 펩티드를 구성하는 조성물을 의미할 것이다.
펩티드 정제에 사용하기에 적합한 다양한 기술은 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있을 것이다. 이들 기술은 예를 들어, 황산암모늄, PEG, 항체 등을 사용하는 침전; 열 변성에 이은 원심분리; 크로마토그래피 단계, 예를 들어, 이온 교환, 겔 여과, 역상, 히드록실아파티트 및 친화도 크로마토그래피; 등전 집속; 겔 전기영동; 상기 및 다른 기술의 조합을 포함한다. 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서는 변화될 수 있거나 특정 단계가 생략될 수 있고, 여전히 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩티드의 제조에 적합한 방법이 생길 것으로 생각된다.
펩티드가 항상 그의 가장 정제된 상태로 제공되는 일반적인 요건이 존재하지 않는다. 실제로는, 실질적으로 덜 정제된 생성물이 특정 실시태양에서 유용할 것으로 고려된다. 부분 정제는 보다 적은 정제 단계를 조합하여 사용함으로써, 또는 상이한 형태의 동일한 일반적인 정제 방식을 사용함으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, HPLC 장치를 이용하여 수행된 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피는 일반적으로 저압 크로마토그래피 시스템을 이용하는 동일한 기술보다 더 큰 "-배수" 정제를 생성하는 것으로 이해된다. 보다 낮은 정도의 상대적인 정제를 나타내는 방법은 단백질 생성물의 전체 회수에 또는 발현된 단백질의 활성을 유지하는데 유리할 수 있다.
임의로 상기 하이브리드 폴리펩티드를 공정으로부터 수득된 다른 성분으로부터 정제하고 단리할 수 있다. 폴리펩티드의 정제 방법은 미국 특허 5,849,883에서 찾을 수 있다. 상기 문헌은 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드를 단리하고 정제하는데 유용할 수 있는 G-CSF 조성물의 단리 및 정제를 위한 구체적인 예시적인 방법을 설명한다. 상기 특허의 개시내용이 주어지면, 당업계의 숙련인은 주어진 원료로부터 하이브리드 폴리펩티드를 정제하기 위해 사용할 수 있는 수많은 정제 기술을 잘 알 것임이 명백하다.
또한 음이온 교환 및 면역친화도 크로마토그래피의 조합이 본 발명의 정제된 하이브리드 폴리펩티드 조성물을 생산하기 위해 사용될 수 있음이 고려된다.
제약 조성물
본 발명은 또한 치료 또는 예방 유효량의 본 발명의 하나 이상의 하이브리드 폴리펩티드, 또는 그의 제약학상 허용되는 염을 하이브리드 폴리펩티드의 전달에 유용한 제약학상 허용되는 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 보조제 및(또는) 담체와 함께 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 다양한 버퍼 함량 (예를 들어, Tris-HCl, 아세테이트, 인산염), pH 및 이온 강도의 희석제; 첨가제, 예를 들어, 세제 및 가용화제 (예를 들어, Tween 80, Polysorbate 80), 항산화제 (예를 들어, 아스코르브산, 나트륨 메타비술파이트), 보존제 (예를 들어, 티메르솔, 벤질 알콜), 및 부피증가 물질 (예를 들어, 락토스, 만니톨)을 포함하고; 물질은 중합성 화합물, 예를 들어, 폴리락트산, 폴리글리콜산 등의 미립자 제제 내로 도입되거나 리포좀과 함께 포함될 수 있다. 상기 조성물은 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드의 물리적인 상태, 안정성, 생체내 방출 속도, 및 생체내 소실률에 영향을 미칠 것이다 (예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences 1435-712, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1990) 참조).
일반적으로, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 개별 성분 폴리펩티드가 그들의 약물학적 특성 면에서 유용한 것과 동일한 방식으로 유용할 것이다. 하나의 바람직한 용도는 대사 질병 및 질환의 치료 또는 예방을 위해 상기 하이브리드 폴리펩티드를 말초 투여하는 것이다. 특히, 본 발명의 화합물은 영양분 이용률을 감소시키고, 음식 섭취를 감소시키고, 체중 감소를 일으키기 위한 약제로서 활성을 갖는다. 다른 실시태양에서, 바람직한 용도는 당뇨병 또는 당뇨병 관련 질병 및 질환의 치료를 위해 상기 하이브리드 폴리펩티드를 투여하는 것이다.
본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 주사, 경구 투여, 경비 투여, 폐 투여, 국소 투여, 또는 당업계의 숙련인이 인지하는 다른 종류의 투여를 위한 제형을 포함하여, 말초 투여를 위해 제형화할 수 있다. 보다 특히, 본 발명에 따른 제약 조성물의 투여는 표적 조직이 그 경로로 이용가능한 한 임의의 일반적인 경로를 통해 이루어질 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 제약 조성물은 치료대상에게 임의의 통상적인 말초 방법에 의해, 예를 들어, 정맥내, 피부내, 근육내, 유방내, 복강내, 척수강내, 구후 (retrobulbar), 폐내 (예를 들어, 텀 (term) 방출)에 의해; 경구, 설하, 비강, 항문, 질 또는 경피 전달에 의해, 또는 특정 부위에서 외과적 이식에 의해 도입될 수 있다. 치료는 장기간에 걸쳐 단일 용량 또는 복수의 용량으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 조성물의 제어된 지속 방출이 또한 고려된다.
제제는 액체일 수 있거나 고체일 수 있고, 예를 들어, 재구성을 위해 동결건조될 수 있다. 본 발명의 수성 조성물은 제약학상 허용되는 담체 또는 수성 매질에 용해되거나 분산된 유효량의 하이브리드 폴리펩티드를 포함한다. 어구 "제약학상 또는 약물학적으로 허용되는"은 동물 또는 인간에게 투여될 때 유해하거나, 알레르기 또는 다른 부적당한 반응을 일으키지 않는 분자 및 조성물을 의미한다. 본원에서 사용되는 "제약학상 허용되는 담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 제약학상 활성 물질을 위한 상기 매질 및 약제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 약제가 활성 성분과 불혼화성인 것을 제외하고는, 치료 조성물에서 그의 사용이 고려된다. 보충적 활성 성분을 또한 조성물 내에 포함시킬 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드 및 다른 음식 섭취 감소제, 당뇨병 치료제, 혈장 글루코스 저하제 또는 혈장 지질 변경제, 예를 들어, 아밀린, 아밀린 작용제 유사체, CCK 또는 CCK 작용제, 또는 렙틴 또는 렙틴 작용제, 또는 엑센딘 또는 엑센딘 작용제 유사체를 함께 투여하기 위한 단일 조성물 또는 용액으로 제공하는 것이 편리할 것이다. 다른 경우에, 추가의 약제를 상기 하이브리드 폴리펩티드와 별개로 투여하는 것이 보다 유리할 수 있다.
본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 계면활성제, 예를 들어, 히드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 물 중 유리 염기 또는 약물학적으로 허용되는 염의 용액으로서 투여를 위해 준비할 수 있다. 제약학상 허용되는 염은 무기산, 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예를 들어, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등을 사용하여 형성된 산 부가염 (단백질의 유리 아미노기와 함께 형성된)을 포함한다. 유리 카르복실기와 함께 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물, 및 유기 염기, 예를 들어, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등로부터 유도될 수 있다. 상기 생성물은 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 과정에 의해 쉽게 제조된다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 그의 혼합물 중에 및 오일 중에 제조될 수 있다. 보통의 저장 및 사용 조건 하에, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다.
한 실시태양에서, 본 발명의 제약 조성물은 예를 들어, 주사 또는 주입을 통한 비경구 투여에 적합하도록 제형화된다. 바람직하게는, 하이브리드 폴리펩티드는 수성 담체 내에, 예를 들어, pH 약 3.0 내지 약 8.0, 바람직하게는 pH 약 3.5 내지 약 7.4, 3.5 내지 6.0 또는 3.5 내지 약 5.0의 등장성 버퍼 용액에 현탁된다. 유용한 버퍼는 시트르산나트륨-시트르산 및 인산나트륨-인산, 및 아세트산나트륨/아세트산 버퍼를 포함한다. 저장형 또는 "데포 (depot)" 서방 제제 형태가 치료 유효량의 제제를 경피 주사 또는 전달 후 수시간 또는 수일에 걸쳐 혈류 내로 전달하도록 사용될 수 있다.
주사 용도에 적합한 제약 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균되어야 하고 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유동성이어야 한다. 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 제조 및 저장 조건 하에 안정하고, 미생물, 예를 들어, 세균 및 진균의 오염 작용에 대해 보호되어야 하는 것이 바람직하다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 그의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅, 예를 들어, 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 목적하는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 달성할 수 있다. 많은 경우에, 등장제 (예를 들어, 당 또는 염화나트륨)을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 약제 (예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴)를 조성물 내에 사용함으로써 달성할 수 있다.
멸균 주사가능 용액은 목적하는 양의 활성 화합물을 적절한 용매에, 필요한 경우 상기 열거한 다양한 다른 성분과 함께 포함시킨 후, 멸균 여과하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 염기성 분산 매질 및 상기 열거한 것 중의 목적하는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 포함시켜 제조한다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 그의 사전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가의 요구되는 성분의 분말을 수득하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.
일반적으로, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드의 치료 또는 예방 유효량은 투여자의 연령, 체중, 및 상태 또는 질병, 병 또는 질환의 심도에 의해 결정될 것이다 (예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences 697-773 및 Wang and Hanson, Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers, Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42:2S (1988) 참조). 전형적으로, 약 0.001 ㎍/kg 체중/일 내지 약 1000 ㎍/kg 체중/일의 투여량이 사용될 수 있지만, 숙련된 당업자가 인지할 바와 같이 더 많거나 더 적은 양이 사용될 수 있다. 투여는 매일 1회 이상이거나 덜 빈번할 수 있고, 본원에 기재된 바와 같이 다른 조성물과 함께 투여할 수 있다. 본 발명은 본원에 기술된 투여량에 제한되지 않음을 이해해야 한다.
적절한 투여량은 관련 용량-반응 데이타와 함께 대사 질환 또는 병의 수준을 결정하기 위한 확립된 분석의 사용을 통해 확정할 수 있다. 최종 투여 계획은 약물의 작용을 변형시키는 인자, 예를 들어, 약물의 구체적인 활성, 손상의 심도 및 환자의 반응도, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이, 임의의 감염의 심도, 투여 시간 및 다른 임상적 요인을 고려하여 담당의사가 결정할 것이다. 연구가 수행되는 동안, 구체적인 질병 및 병에 대한 적절한 투여량 수준 및 치료 지속 기간에 관하여 추가의 정보가 알려질 것이다.
유효 용량은 50 kg 환자에 대해 단일 또는 분할 용량으로 투여되는, 전형적으로 약 1 내지 30 ㎍ 내지 약 5 mg/일, 바람직하게는 약 10 내지 30 ㎍ 내지 약 2 mg/일, 보다 바람직하게는 약 5 내지 100 ㎍ 내지 약 1 mg/일, 가장 바람직하게는 약 5 ㎍ 내지 약 500 ㎍/일일 것이다. 바람직하게는, 투여량은 약 0.01 내지 약 100 ㎍/kg/용량이다. 투여될 정확한 용량은 당업계의 숙련인이 결정할 수 있고 구체적인 화합물의 효과, 및 개인의 연령, 체중 및 상태에 따른다. 투여는 예를 들어, 영양분 이용률, 음식 섭취, 체중, 혈액 글루코스 또는 혈장 지질 조절의 억제가 요구될 때마다, 예를 들어, 증상의 제1 징후에서 또는 비만, 당뇨병, 또는 인슐린 저항 증후군의 진단 직후 시작해야 한다. 투여는 임의의 경로, 예를 들어, 주사, 바람직하게는 피하 또는 근육내, 경구, 비강, 경피 등에 의해 이루어질 수 있다. 특정 경로, 예를 들어, 경구 투여에 대한 투여량은 감소된 생체이용률을 고려하여 예를 들어, 약 5-100배로 증가될 수 있다.
한 실시태양에서, 제약 제형을 비경구 투여할 경우, 조성물은 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 체중/일의 하이브리드 폴리펩티드의 용량, 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg 체중/일의 용량을 전달하도록 제형화된다. 비경구 투여는 약품의 치료적 순환 수준을 유지하기 위해 초기 볼루스 (bolus)에 이은 연속 주입으로 수행될 수 있다. 당업계의 통상의 기술자는 우수 의료 실무 및 개별 환자의 임상상태에 의해 결정되는 바와 같이 효과적인 투여량 및 투여 계획을 쉽게 최적화할 것이다.
투약의 빈도는 약제의 약동학적 파라미터 및 투여 경로에 따를 것이다. 최적 제약 제형은 당업계의 숙련인이 투여 경로 및 목적하는 투여량에 따라 결정할 것이다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 문헌, pages 1435-1712] 참조). 상기 제형은 투여된 약제의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 소실률에 영향을 미칠 수 있다. 투여 경로에 따라, 적합한 용량은 체중, 체표면적 또는 장기 크기에 따라 계산할 수 있다. 적절한 치료 용량을 결정하기 위해 필요한 계산의 추가의 상세화는 특히 본원에 개시된 투여량 정보 및 분석, 및 동물 또는 인간 임상 시험에서 관찰된 약동학적 데이타의 측면에서 과도한 실험 없이 당업계의 통상의 기술자가 일상적으로 수행할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 및 치료 방법은 인간 의약 및 수의과 의약의 영역에서 유용할 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 치료하고자 하는 대상은 포유동물, 바람직하게는 인간 또는 다른 동물일 수 있다. 수의과적 목적에서, 치료 대상은 예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 및 염소를 포함한 가축, 애완동물, 개 및 토끼, 외래 및(또는) 동물원 동물, 실험실 동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그 및 햄스터; 및 가금류, 예를 들어, 닭, 칠면조, 오리 및 거위를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드, 제약 용도를 위해 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드를 제조하기 위해 적합한 성분, 및 제약 용도를 위해 상기 하이브리드 폴리펩티드 및 성분을 사용하기 위한 지시서를 포함하는 키트를 고려한다.
본 발명의 이해를 돕기 위해, 하기 실시예가 포함된다. 본 발명에 관한 실험은 물론 본 발명을 구체적으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안되고, 당업계의 숙련인의 범위 내에 있는 현재 알려지거나 나중에 개발될 본 발명의 변형은 본원에 기술되고 이후 특허 청구되는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
본 발명은 대사 질병, 병 및 질환에 유용한 하이브리드 폴리펩티드 및 이들의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
도 1은 DIO 마우스 분석에서 본 발명의 예시적인 화합물의 효과를 보여준다.
도 2는 DIO 마우스 분석에서 본 발명의 예시적인 화합물의 효과를 보여준다.
도 3a-3b는 DIO 마우스 분석에서 본 발명의 예시적인 화합물의 효과를 보여준다.
도 4a-4b는 모 (parent) 펩티드 화합물에 비교하여 음식 섭취 분석에서 본 발명의 예시적인 화합물의 효과를 보여준다.
실시예
본 발명은 본 발명을 보다 충분히 예시하기 위해 제공되지만, 그의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안되는 하기 비제한적인 실시예를 참조하여 보다 상세히 설명된다. 실시예는 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드의 제조, 및 본 발명의 이들 하이브리드 폴리펩티드의 시험관내 및(또는) 생체내 시험을 설명한다. 당업계의 숙련인은 이들 실시예에 설명된 기술이 본 발명의 실행시에 잘 기능하는, 본 발명자들에 의해 설명된 기술을 제시하고, 따라서 본 발명의 실행을 위해 바람직한 방식을 구성함을 이해할 것이다. 그러나, 당업계의 숙련인은 본 발명의 취지와 범위로부터 벗어나지 않으면서 본 명세서에서 개시된 구체적인 방법에서 많은 변화가 이루어질 수 있고 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 것임을 이해할 것임을 이해해야 한다.
실시예 1. 하이브리드 폴리펩티드 제조
본 발명의 펩티드는 0.050-0.100 mmol에서 0.43-0.49 mmol/g의 로딩을 갖는 Rink 아미드 수지 (노바바이오켐 (Novabiochem)) 또는 예비로딩된 Wang 수지 (Fmoc-Tyr(tBu)-Wang 수지) 0.63 mmol/g (노바바이오켐)을 사용하여 Symphony 펩티드 합성기 (프로테인 테크놀로지스, 인크. (Protein Technologies, Inc.)) 상에서 조립되었다. Fmoc 아미노산 (5.0 eq, 0.250-0.500 mmol) 잔기를 1-메틸-2-피롤리디논 내에 0.10 M의 농도로 용해시켰다. 다른 모든 시약 (HBTU, 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 및 N,N-디이소프로필에틸아민)은 0.55 M 디메틸포름아미드 용액으로서 제조하였다. 이어서 Fmoc 보호된 아미노산을 HBTU (2.0 eq, 0.100-0.200 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (1.8 eq, 0.090-0.18 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (2.4 eq, 0.120-0.240 mmol)을 사용하여 2시간 동안 수지 결합된 아미노산에 커플링시켰다. 마지막 아미노산 커플링 후, 펩티드를 20％ (v/v)의 디메틸포름아미드 중 피페리딘을 사용하여 1시간 동안 탈보호시켰다. 일단 펩티드 서열이 완성되면, Symphony 펩티드 합성기를 수지를 절단하도록 프로그램시켰다. 수지로부터 펩티드의 트리플루오로아세트산 (TFA) 절단은 93％ TFA, 3％ 페놀, 3％ 물 및 1％ 트리이소프로필실란을 사용하여 1시간 동안 수행하였다. 절단된 펩티드는 t-부틸 메틸 에테르를 사용하여 침전시키고, 원심분리에 의해 펠렛화하고 동결건조시켰다. 펠렛을 물 (10-15 mL)에 재용해시키고, 여과하고, C18 컬럼 및 0.1％ TFA를 함유하는 아세토니트릴/물 구배를 사용하여 역상 HPLC를 통해 정제하였다.
지방산 (예를 들어, 옥탄산 및 스테아르산)을 사용하여 본 발명의 펩티드를 N-캡핑하기 위한 일반적인 절차는 다음과 같다: rink 아미드 수지 (0.1 mmol) 상의 펩티드를 NMP (5 mL)에 현탁시켰다. 별도의 바이알에서, HBTU (0.3 mmol), HOBt (0.3 mmol)을 DMF (5 mL)에 용해시킨 후 DIEA (0.6 mmol)를 첨가하였다. 상기 용액을 수지에 첨가하고, 이 현탁액을 2시간 동안 진탕하였다. 용매를 여과하고 NMP (5 mLx4) 및 CH2Cl2 (20 mL)으로 완전히 세척하고, 건조시키고 1시간 동안 TFA 절단시켰다. 목적하는 펩티드의 수득량은 절단 및 정제 후 약 40 mg이었다.
PEG 변형은 상업적으로 입수가능한 활성화된 PEG 에스테르를 사용하여 리신의 유리 엡실론-아미노기 또는 정제된 펩티드의 말단 아미노기에 대해 용액 중에서 수행할 수 있다. 생성되는 PEG화된 유도체는 역상 HPLC에 의해 균질상태로 정제하고, 순도는 LC/MS 및 MALDI-MS에 의해 확인하였다.
본 발명의 특정한 예시적인 하이브리드 폴리펩티드를 하기 표 1-1에 나타낸다. 구체화된 화합물에 대한 다양한 변형, 예를 들어, 화학적 변형, 예를 들어, 글리코실화, PEG 변형 등; 아미노산 변형, 예를 들어, 치환, 삽입 및 결실 등이 계획되었다. 또한, C-말단에서 아미드화된 것으로서 나타냈지만, 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 별법으로 유리 산 형태로 존재할 수 있음이 이해된다.
[표 1-1]
Figure pat00017
Figure pat00018
Figure pat00019
Figure pat00020
실시예 2. 결합 분석
본 발명의 하이브리드 폴리펩티드를 당업계의 숙련인에게 일반적으로 공지된 결합 분석 방법을 이용하여 다양한 수용체 결합 분석으로 시험할 수 있다. 그러한 분석은 하기하는 것을 포함한다.
아밀린 결합 분석: 아밀린 수용체에 대한 본 발명의 몇몇 예시적인 화합물의 결합의 평가는 래트 뇌로부터 제조된 중격의지핵 멤브레인에서 다음과 같이 수행할 수 있다. 수컷 Sprague-Dawley(등록상표) 래트 (200-250 g)을 단두시켜 희생시켰다. 뇌를 제거하여 냉 인산염 완충 염수 (PBS)에 넣었다. 복부면으로부터, 후각로에 의해 측면으로 접하고 이들 후각로로부터 중간으로 45°각으로 연장하는 시상하부로 입쪽으로 절개를 만들었다. 중격의지핵 및 둘러싸는 구역을 함유하는 상기 기초 전뇌 조직을 칭량하고 빙냉 20 mM HEPES 버퍼 (20 mM HEPES 산, 23℃에서 NaOH를 사용하여 pH 7.4로 조정함) 내에 균질화시켰다. 멤브레인을 15분 동안 48,000 x g에서 원심분리하여 신선한 버퍼로 3회 세척하였다. 최종 멤브레인 펠렛을 0.2 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF)를 함유하는 20 mM HEPES 버퍼에 재현탁시켰다.
125I-아밀린 결합을 측정하기 위해서 (Beaumont K et al. Can J Physiol Pharmacol. 1995 Jul; 73(7): 1025-9 참조), 4 mg의 원래 습윤 중량의 조직으로부터의 멤브레인을 0.5 mg/ml 바시트라신, 0.5 mg/ml 소 혈청 알부민 및 0.2 mM PMSF를 함유하는 20 mM HEPES 버퍼 중에서 12-16 pM의 125I-아밀린과 함께 인큐베이팅하였다. 용액을 60분 동안 2℃에서 인큐베이팅하였다. 인큐베이션은 방사성 표지된 펩티드의 비특이적 결합을 감소시키기 위해 4시간 동안 0.3％ 폴리에틸렌이민에 미리 적신 GF/B 유리 섬유 필터 (와트만 인크. (Whatman Inc.), 미국 뉴저지주 클리프톤)을 통해 여과하여 종결하였다. 필터를 여과 직전 5 ml 냉 PBS로, 여과 직후 15 ml 냉 PBS로 세척하였다. 필터를 제거하고, 방사성을 감마-카운터에서 77％의 계측 효율로 평가하였다. 경쟁 곡선은 10-12 내지 10-6 M 비표지된 시험 화합물의 존재 하에 결합을 측정함으로써 생성하고, 4-파라미터 로지스틱 (logistic) 등식을 사용하여 비선형 회귀법에 의해 분석하였다 (Inplot 프로그램; 그래프패드 소프트웨어 (GraphPAD Software), 미국 캘리포니아주 샌디에고)).
CGRP 수용체 결합 분석: CGRP 수용체에 대한 본 발명의 화합물의 결합의 평가는 CGRP 수용체를 발현하는 것으로 알려진 SK-N-MC 세포로부터 제조된 멤브레인을 사용하는 것을 제외하고는 본질적으로 아밀린에 대해 설명한 바와 같다 (Muff, R. et. al., Ann NY Acad. Sci. 1992: 657, 106-16). 결합 분석은 13,500 cpm 125I-hCGRP/웰 또는 21.7 pM/웰 (아머샴 (Amersham))을 사용하는 것을 제외하고는 아밀린에 대해 설명한 바와 같이 수행하였다.
아드레노메듈린 결합 분석: 아드레노메듈린 수용체에 대한 결합은 웰 당 최적 25-30,000 세포를 사용하는 시클릭 AMP에 대한 퍼킨 엘머 (Perkin Elmer) AlphaScreen™ 분석을 사용하여 아드레노메듈린 수용체를 함유하는 HUVEC를 사용하여 조사할 수 있다 (Kato J et. al., Eur J Pharmacol. 1995, 289: 383-5). cAMP 수준의 상승은 CHO 세포에 비해 HUVEC에 대해서는 크지 않다. 따라서, CHO 세포는 아드레노메듈린 수용체를 발현하지 않으므로 필요한 경우 음성 대조군으로서 선택될 수 있다.
칼시토닌 수용체 결합 분석: 칼시토닌 수용체에 대한 결합은 당업계에 공지된 바와 같이 또한 칼시토닌 수용체를 발현하는 CHO 세포 또는 T47D 세포를 사용하여 조사할 수 있다 (Muff R. et. al, Ann NY Acad Sci. 1992, 657: 106-16 및 Kuestner R. E. et. al. Mol Pharmacol. 1994, 46: 246-55).
렙틴 결합 분석: 렙틴 결합 및 수용체 활성화를 평가하기 위해 2가지 시험관내 생물학적 분석을 통상적인 방식으로 사용하였다 (예를 들어, White, et al., 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94: 10657-10662 참조). 알칼린 포스파타제 ("AP")-렙틴 ("OB") 융합 단백질 ("AP-OB")을 긴 (신호전달) 형태의 마우스 OB 수용체 ("OB-RL")로 형질감염된 COS-7 세포에 의한, 재조합 마우스 렙틴 (양성 대조군) 또는 펩티드의 부재 또는 존재 하에 렙틴 결합의 억제를 측정하기 위해 사용할 수 있다. 시그날 전달 분석은 AP 리포터 및 OB-RL 구성체로 동시형질감염된 GT1-7 세포에서 수행할 수 있다. 마우스 렙틴 또는 펩티드를 사용하는 자극에 반응하는 분비된 알칼린 포스파타제 ("SEAP") 활성은 화학발광에 의해 측정할 수 있다.
Y1 수용체 결합 분석: 신경펩티드 Y1 수용체를 내재적으로 발현하는 SK-N-MC 세포의 융합 배양물로부터 멤브레인을 제조하였다. 멤브레인을 60 pM [125I]-인간 펩티드 YY (2200 Ci/mmol, 퍼킨엘머 라이프 사이언스 (PerkinElmer Life Sciences)) 및 비표지된 PPF 폴리펩티드와 함께 60분 동안 주변 온도에서 96웰 폴리스티렌 플레이트에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 웰 내용물을 퍼킨 엘머 플레이트 회수기 (harvestor)를 사용하여 96웰 유리 섬유 플레이트 상으로 회수하였다. 건조된 유리 섬유 플레이트를 섬광제 (scintillant)와 혼합하고 퍼킨 엘머 섬광 계수기 상에서 계수하였다.
Y2 수용체 결합 분석: 신경펩티드 Y2 수용체를 내재적으로 발현하는 SK-N-BE 세포의 융합 배양물로부터 멤브레인을 제조하였다. 멤브레인을 30 pM [125I]-인간 펩티드 YY (2200 Ci/mmol, 퍼킨엘머 라이프 사이언스) 및 비표지된 PPF 폴리펩티드와 함께 60분 동안 주변 온도에서 96웰 폴리스티렌 플레이트에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 웰 내용물을 퍼킨 엘머 플레이트 회수기를 사용하여 96웰 유리 섬유 플레이트 상으로 회수하였다. 건조된 유리 섬유 플레이트를 섬광제와 혼합하고 퍼킨 엘머 섬광 계수기 상에서 계수하였다.
Y4 수용체 결합 분석: CHO-K1 세포를 신경펩티드 Y4 유전자를 코딩하는 cDNA로 일시적으로 형질감염시킨 다음, 48시간 후 융합 세포 배양물로부터 멤브레인을 제조하였다. 멤브레인을 18 pM [125I]-인간 췌장 폴리펩티드 (2200 Ci/mmol, 퍼킨엘머 라이프 사이언스) 및 비표지된 PPF 폴리펩티드와 함께 60분 동안 주변 온도에서 96웰 폴리스티렌 플레이트에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 웰 내용물을 퍼킨 엘머 플레이트 회수기를 사용하여 96웰 유리 섬유 플레이트 상으로 회수하였다. 건조된 유리 섬유 플레이트를 섬광제와 혼합하고 퍼킨 엘머 섬광 계수기 상에서 계수하였다.
Y5 수용체 결합 분석: CHO-K1 세포를 신경펩티드 Y5 유전자를 코딩하는 cDNA로 일시적으로 형질감염시킨 다음, 48시간 후 융합 세포 배양물로부터 멤브레인을 제조하였다. 멤브레인을 44 pM [125I]-인간 펩티드 YY (2200 Ci/mmol, 퍼킨엘머 라이프 사이언스) 및 비표지된 PPF 폴리펩티드와 함께 60분 동안 주변 온도에서 96웰 폴리스티렌 플레이트에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 웰 내용물을 퍼킨 엘머 플레이트 회수기를 사용하여 96웰 유리 섬유 플레이트 상으로 회수하였다. 건조된 유리 섬유 플레이트를 섬광제와 혼합하고 퍼킨 엘머 섬광 계수기 상에서 계수하였다.
GLP -1 수용체 결합 분석: GLP-1 수용체 결합 활성 및 친화도는 수용체 공급원이 RINm5F 세포 멤브레인이고, 리간드는 [125I]GLP-1인 결합 교체 분석을 사용하여 측정할 수 있다. 균질화된 RINm5F 세포 멤브레인을 20 mM HEPES 버퍼 내에서 40,000 cpm [125I]GLP-1 트레이서 (tracer)와 함께 시험 화합물의 농도를 변화시키면서 2시간 동안 23℃에서 계속 혼합하면서 인큐베이팅하였다. 반응 혼합물을 0.3％ PEI 용액으로 미리 적신 유리 필터 패드를 통해 여과하고 빙냉 인산염 완충 염수로 세정하였다. 결합된 계수는 섬광 계수기를 사용하여 결정하였다. 결합 친화도는 GraphPad Prism 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어, 인크.)를 사용하여 계산하였다.
실시예 3: 마우스 음식 섭취 분석
본 발명의 하이브리드 폴리펩티드는 마우스 음식 섭취 분석에서 식욕 억제 및 식이 유도 비만 (DIO) 마우스에서 체중 증가에 대한 그의 효과에 대해 시험할 수 있다. 스크리닝을 위한 실험 프로토콜을 아래에서 설명한다.
암컷 NIH/Swiss 마우스 (8-24주령)를 0600에서 빛을 사용하여 12:12시간 명:암 사이클로 집단으로 수용하였다. 물 및 표준 펠렛형 마우스 먹이는 설명되는 것을 제외하고는 마음대로 공급할 수 있었다. 마우스를 약 1500시간에서 시작하여 실험 1일 전에 단식시켰다. 실험 당일 아침에 마우스를 실험군으로 분할하였다. 전형적인 연구에서, n=4 우리 (3 마우스/우리)이었다.
0분에, 모든 동물에게 비히클 또는 화합물을 약 10 nmol/kg 내지 75 nmol/kg의 양으로 복강내 주사하고, 즉시 사전 칭량된 양 (10-15 g)의 표준 먹이를 공급하였다. 먹이를 제거하고, 소비된 먹이의 양을 측정하기 위해 30, 60 및 120분에서 칭량하였다 (Morley, Flood et al., Am. J. Physio. 267: R178-R184, 1994). 음식 섭취는 초기 0분에 제공된 먹이의 중량으로부터 예를 들어, 30, 60, 120, 180 및(또는) 240분 시점 후에 남은 먹이의 중량을 차감하여 계산한다. 유의한 처리 효과는 ANOVA (p<0.05)에 의해 확인하였다. 유의한 차이가 존재할 경우, 시험 평균을 던넷 (Dunnet) 시험 (Prism v. 2.01, 그래프패드 소프트웨어 인크.)을 사용하여 대조군 평균과 비교하였다.
실시예 4: 비만 C57B1 /6 (식이 유도 비만, 또는 DIO ) 마우스에서의 체중 증가
수컷 C57BL/6 마우스 (연구 개시시에 4주령)에 고지방 (HF, 음식 kcal의 58％가 지방) 또는 저지방 (LF, 음식 kcal의 11％가 지방) 먹이를 공급하였다. 4주 후에, 2주 동안 연속적으로 하이브리드 폴리펩티드의 소정 투여량을 피하 전달하는 삼투 펌프 (Alzet # 2002)를 각각의 마우스에게 삽입하였다. 체중 및 먹이 섭취를 매주 측정하였다 (Surwit et al., Metabolism-Clinical and Experimental, 44:645-51, 1995). 시험 화합물의 효과를 처리군당 14마리 이상의 마우스의 체중 변화 (％) (즉, 출발 중량으로부터의 변화 (％))의 평균 +/- 표준편차로 표현하였다 (p<0.05 ANOVA, 던넷 시험, Prism v. 2.01, 그래프패드 소프트웨어 인크.).
엑센딘 / PYY 하이브리드 :
예시적인 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드를 C-말단에서 말단 절단된 엑센딘 (예를 들어, 엑센딘-4(1-28) 또는 5Ala,14Leu,25Phe-엑센딘-4(1-28)) 및 18-36 내지 31-36 영역에 걸친 N-말단에서 말단 절단된 PYY을 사용하여 합성하였다. 따라서, 예시적인 하이브리드 폴리펩티드는 일반적으로 두개의 모듈을 포함하고, 제1 모듈은 엑센딘-4 유사체의 단편이고, 제2 모듈은 PYY 말단 절단체로부터 선택된 펩티드 인핸서이다. 비교를 위해, 또한 β-알라닌 디펩티드 스페이서를 복수개의 변이체에서 펩티드 빌딩 블록들 사이에 포함시켰다 (표 4-1 참조).
[표 4-1]
Figure pat00021
표 4-1에 나타낸 바와 같이, 예시적인 본 발명의 특정 예시적인 화합물은 음식 섭취 분석에서 효능을 보였다. 특정 펩티드는 또한 75 nmol/kg로 DIO 분석에서 시험되었고, PYY보다 더 효과적인 것으로 증명되었다 (도 1).
엑센딘 / 아밀린 하이브리드:
본 발명의 추가의 예시적인 하이브리드 폴리펩티드를 C-말단에서 말단 절단된 엑센딘 (1-27), C-말단에서 말단 절단된 아밀린 펩티드 (예를 들어, 아밀린(1-7), 2,7Ala-아밀린(1-7) 및 아밀린(33-27)), 및 선택적인 sCT 단편 (예를 들어, sCT(8-10) 및 14Gln,11,18Arg-sCT(8-27))로부터 제조하였다. 두 하이브리드 폴리펩티드는 모두 식욕 억제에서 매우 활성이었지만 (표 4-2 참조), 작용의 발현은 모 분자의 활성 프로파일과 상이하였다 (데이타를 나타내지 않는다).
[표 4-2]
Figure pat00022
또한 두 화합물은 모두 DIO 분석으로 스크리닝할 때 우수한 효능을 보였다 (도 2).
엑센딘 / CCK -8 하이브리드 :
또다른 예시적인 본 발명의 하이브리드 폴리펩티드를, 전체 길이 또는 직접 또는 링커를 통해 CCK-8의 N-말단 아미드를 유지하는 CCK-8의 N-말단에 부착된, C-말단에서 말단 절단된 엑센딘-4로부터 제조하였다 (표 4-3). 또한, 천연 Tyr(S03)를 포함하는 특정 하이브리드를 제조하고, 보다 안정한 Phe(CH2S03)기를 포함하는 다른 하이브리드를 제조하였다. 제조된 모든 하이브리드 폴리펩티드는 음식 섭취 억제에 대해 활성을 보였다 (표 4-3).
[표 4-3]
Figure pat00023
예시적인 엑센딘/CCK-8 하이브리드 폴리펩티드를 25 nmol/kg에서 DIO 분석으로 시험하였다 (도 3a 및 3b). 데이타는 초기 체중 감소를 보인 후, 모든 화합물에서 되돌림 효과를 보였다. 흥미롭게도, 되돌림 효과는 가수분해에 보다 안정한 Phe(CH2SO3) 잔기를 포함하는 하이브리드 및 엑센딘과 CCK 잔기 사이에 링커 8-아미노-3,6-디옥사옥타노일을 포함하는 하이브리드에서 감소하는 것으로 나타났다.
아밀린 / PYY 하이브리드 :
각 펩티드의 말단 절단된 세그먼트를 포함하는 아밀린/PYY 하이브리드 폴리펩티드를 합성하였다. 음식 섭취 분석에서 생체내 활성은 표 4-4에 나타내었다.
[표 4-4]
Figure pat00024
본 발명의 예시적인 하이브리드 폴리펩티드가 그의 모 성분 펩티드 호르몬보다 효능이 있는지를 확인하기 위해서, 예시적인 화합물을 보다 활성이 큰 모 분자의 최소 효능 투여량으로 음식 섭취 분석에서 시험하였다. 그 결과를 도 4a 및 4b에 도시하였고, 이는 또한 함께 모은 모 펩티드의 효과도 ㄴ비교하고 있다 (화합물 1, 11 및 12는 성분 펩티드 호르몬, 유사체 또는 그의 단편이다). 데이타는 복수개의 펩티드가 적어도 모아진 모 펩티드와 동등한 효능을 가짐을 나타낸다. 생체내 연구와 동시에, 시험관내 수용체 결합 및 기능 분석 (시클라제 활성)을 모든 화합물에 대해 수행하였다 (데이타를 나타내지 않는다).
본 발명을 바람직한 예 및 실시태양의 측면에서 설명하였지만, 당업계의 숙련인이 본 발명을 변형 및 변경시킬 것임이 이해된다. 따라서, 첨부되는 청구의 범위는 본 발명의 범위 내에 포함되는 상기 모든 균등한 변형을 포함하는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> AMYLIN PHARMACEUTICALS, INC. <120> HYBRID POLYPEPTIDES WITH SELECTABLE PROPERTIES <130> 18528-001 <140> PCT/US05/004178 <141> 2005-02-11 <150> 60/543,407 <151> 2004-02-11 <160> 203 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard and human construct <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu 35 40 45 Val Thr Arg Gln Arg Tyr 50 <210> 2 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard and human construct <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg 35 40 45 Gln Arg Tyr 50 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construct <220> <221> MOD_RES <222> (40)..(41) <223> Beta-alanine <400> 5 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val 35 40 45 Thr Arg Gln Arg Tyr 50 <210> 6 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard and human construct <220> <221> MOD_RES <222> (40)..(41) <223> Beta-alanine <400> 6 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa Xaa Val Thr Arg Gln Arg Tyr 35 40 45 <210> 7 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard and human construct <400> 7 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn 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Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Xaa Xaa Ala Ser 20 25 30 Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr 35 40 45 <210> 11 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard and human construct <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(30) <223> Beta-alanine <400> 11 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Xaa Xaa Arg His 20 25 30 Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr 35 40 <210> 12 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard and human construct <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(30) <223> Beta-alanine <400> 12 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Xaa Xaa Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 13 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard and human construct <400> 13 His Gly Glu Gly Ala Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Asn Arg Tyr Tyr 20 25 30 Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr 35 40 45 <210> 14 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard and human construct <400> 14 His Gly Glu Gly Ala Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Ala Ser Leu Arg 20 25 30 His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr 35 40 <210> 15 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard and human construct <400> 15 His Gly Glu Gly Ala Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Arg His Tyr Leu 20 25 30 Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr 35 40 <210> 16 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard and human construct <400> 16 His Gly Glu Gly Ala Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 17 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard and human construct <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(30) <223> Beta-alanine <400> 17 His Gly Glu Gly Ala Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Xaa Xaa Ala Ser 20 25 30 Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr 35 40 45 <210> 18 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard and human construct <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(30) <223> Beta-alanine <400> 18 His Gly Glu Gly Ala Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Xaa Xaa Arg His 20 25 30 Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr 35 40 <210> 19 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard and human construct <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(30) <223> Beta-alanine <400> 19 His Gly Glu Gly Ala Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Xaa Xaa Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 20 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard and human construct <220> <221> MOD_RES <222> (41) <223> Tyr(SO3) <400> 20 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp Phe 35 40 45 <210> 21 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard and human construct <220> <221> MOD_RES <222> (30) <223> Tyr(SO3) <400> 21 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Asp Tyr Met Gly 20 25 30 Trp Met Asp Phe 35 <210> 22 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard and human construct <220> <221> MOD_RES <222> (30) <223> Phe(CH2SO3) <400> 22 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Asp Phe Met Gly 20 25 30 Trp Met Asp Phe 35 <210> 23 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard and human construct <220> <221> MOD_RES <222> (29) <223> 8-amino-3,6-dioxactoanoyl <220> <221> MOD_RES <222> (31) <223> Tyr(SO3) <400> 23 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Xaa Asp Tyr Met 20 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lizard, human and salmon construct <400> 26 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Lys Ala Asn Thr Ala 20 25 30 Thr Ala Val Leu Gly 35 <210> 27 <211> 66 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard, human and salmon construct <220> <221> MOD_RES <222> (29) <223> 12-Ado <400> 27 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Xaa Lys Cys Asn 20 25 30 Thr Ala Thr Cys Val Leu Gly Arg Leu Ser Glu Glu Leu His Arg Leu 35 40 45 Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Arg Gly Ser Asn 50 55 60 Thr Tyr 65 <210> 28 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard, human and salmon construct <220> <221> MOD_RES <222> (29) <223> 12-Ado <400> 28 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Xaa Cys Asn Thr 20 25 30 Ala Thr Cys Val Leu Gly Arg Leu His Arg Leu Gln Thr Tyr Pro Arg 35 40 45 Thr Asn Thr Gly Ser Asn Thr Tyr 50 55 <210> 29 <211> 66 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard, human and salmon construct <220> <221> MOD_RES <222> (29) <223> 3,6-dioxactoanoyl <400> 29 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Xaa Lys Cys Asn 20 25 30 Thr Ala Thr Cys Val Leu Gly Arg Leu Ser Glu Glu Leu His Arg Leu 35 40 45 Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Arg Gly Ser Asn 50 55 60 Thr Tyr 65 <210> 30 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric lizard, human and salmon construct <220> <221> MOD_RES <222> (29) <223> 3,6-dioxactoanoyl <400> 30 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe 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<223> Lys(formyl) <220> <221> MOD_RES <222> (13) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14) <223> Lys(formyl) <400> 39 Ser Thr Ala Val Leu Xaa Lys Leu Ser Gln Glu Leu Xaa Lys Leu Gln 1 5 10 15 Thr Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 40 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> Isocaproyl-Ser <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> Lys(formyl) <220> <221> MOD_RES <222> (13) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14) <223> Lys(formyl) <400> 40 Ser Thr Ala Val Leu Xaa Lys Leu Ser Gln Glu Leu Xaa Lys Leu Glu 1 5 10 15 Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 41 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> Succinoyl-Cys <400> 41 Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp Phe Cys Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly 1 5 10 15 Glu Asp 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135 140 Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln 145 150 155 160 Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 165 <210> 165 <211> 167 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 165 Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 1 5 10 15 Phe Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys 20 25 30 Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asp Asp Ile Ser His Thr 35 40 45 Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro 50 55 60 Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Gln Thr Leu Ala 65 70 75 80 Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln 85 90 95 Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala 100 105 110 Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu 115 120 125 Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val 130 135 140 Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln 145 150 155 160 Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 165 <210> 166 <211> 167 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 166 Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 1 5 10 15 Phe Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys 20 25 30 Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 35 40 45 Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro 50 55 60 Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala 65 70 75 80 Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Leu Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln 85 90 95 Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala 100 105 110 Phe Ser Lys Ser Ser His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu 115 120 125 Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val 130 135 140 Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln 145 150 155 160 Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 165 <210> 167 <211> 167 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 167 Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 1 5 10 15 Phe Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys 20 25 30 Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 35 40 45 Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro 50 55 60 Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala 65 70 75 80 Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Glu Val Ile Gln 85 90 95 Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala 100 105 110 Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu 115 120 125 Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val 130 135 140 Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln 145 150 155 160 Leu Asp Leu Ser Pro Gly Ser 165 <210> 168 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 168 His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 169 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 169 His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 170 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 170 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Thr Ser Lys Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 171 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 171 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 172 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 172 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 173 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 173 His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 174 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 174 His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 175 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> acetyl-Lys <400> 175 His Ala Lys Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 176 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 176 His Ala Thr Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 177 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 177 His Ala Thr Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 178 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 178 His Ala Asn Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 179 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 179 His Ala Asn Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 180 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 180 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 181 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 181 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Thr Ser Lys Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 182 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 182 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 183 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 183 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Arg Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 184 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 184 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 185 <211> 39 <212> PRT <213> Heloderma suspectum <400> 185 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 186 <211> 39 <212> PRT <213> Heloderma suspectum <400> 186 His Gly Glu Gly Ala Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 187 <211> 39 <212> PRT <213> Heloderma suspectum <400> 187 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Ala Ile Glu Phe Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 188 <211> 37 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 188 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Thr Gln Gln Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Asp Trp Leu Ile Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Lys Glu Ile Ile Ser 35 <210> 189 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 189 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Pro Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 190 <211> 28 <212> PRT <213> Heloderma suspectum <400> 190 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn 20 25 <210> 191 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 191 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 192 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 192 Tyr Pro Leu Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu 1 5 10 15 Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 193 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 193 Tyr Pro Val Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu 1 5 10 15 Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 194 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 194 Tyr Pro Ile Arg Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu 1 5 10 15 Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 195 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 195 Tyr Pro Ile Gln Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu 1 5 10 15 Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 196 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 196 Tyr Pro Ile Asn Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu 1 5 10 15 Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 197 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 197 Tyr Pro Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu 1 5 10 15 Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Lys His Tyr Leu Asn Leu Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 198 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 198 Tyr Pro Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu 1 5 10 15 Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr 20 25 30 Arg Pro Arg Tyr 35 <210> 199 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 199 Tyr Pro Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu 1 5 10 15 Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr 20 25 30 Arg His Arg Tyr 35 <210> 200 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 200 Tyr Pro Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Glu 1 5 10 15 Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 201 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 201 Tyr Pro Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu 1 5 10 15 Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Leu Thr 20 25 30 Arg Pro Arg Tyr 35 <210> 202 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 202 Tyr Pro Ile Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 203 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric human and salmon construct <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> Phe(CH2SO3) <400> 203 Asp Phe Met Gly Trp Met Asp Phe Gly Lys Arg Lys Cys Asn Thr Ala 1 5 10 15 Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Glu Leu Val Arg Leu Gln Thr 20 25 30 Tyr Pro Arg Thr Asn Val Gly Ser Asn Thr Tyr 35 40

Claims (17)

  1. 하나 이상의 추가의 생활성 펩티드 호르몬 모듈에 공유 연결된 제1 생활성 펩티드 호르몬 모듈을 포함하는, 두가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 하이브리드 폴리펩티드로서;
    각각의 생활성 펩티드 호르몬 모듈은 성분 펩티드 호르몬, 성분 펩티드 호르몬의 호르몬 활성을 한가지 이상 나타내는 성분 펩티드 호르몬의 단편, 성분 펩티드 호르몬의 호르몬 활성을 한가지 이상 나타내는 성분 펩티드 호르몬의 유사체 및 유도체, 성분 펩티드 호르몬의 호르몬 활성을 한가지 이상 나타내는 성분 펩티드 호르몬의 유사체 및 유도체의 단편, 및 펩티드 인핸서로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택되고;
    상기 제1 생활성 펩티드 호르몬 모듈의 성분 펩티드 호르몬은 엑센딘-4이고, 하나 이상의 추가의 생활성 펩티드 호르몬 모듈의 성분 펩티드 호르몬은 아밀린이며;
    상기 펩티드 인핸서는 임의적으로 존재하고, 목적하는 화학적 안정성, 형상 안정성, 대사 안정성, 수용체 상호작용, 프로테아제 억제 또는 다른 약동학적 특성을 하이브리드 폴리펩티드에 부여하는 성분 펩티드 호르몬의 구조적 모티프, 및 목적하는 화학적 안정성, 형상 안정성, 대사 안정성, 수용체 상호작용, 프로테아제 억제 또는 다른 약동학적 특성을 하이브리드 폴리펩티드에 부여하는 성분 펩티드 호르몬의 유사체 또는 유도체의 구조적 모티프로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택되고;
    각각의 생활성 펩티드 호르몬 모듈은 그의 성분 펩티드 호르몬의 호르몬 활성을 한가지 이상 나타내는 것인 하이브리드 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드 인핸서가 아밀린(32-37), 아밀린(33-37), 아밀린(34-37), 아밀린(35-37), 아밀린(36-37), 아밀린(37), ADM(47-52), ADM(48-52), ADM(49-52), ADM(50-52), ADM(51-52), ADM(52), CT(27-32), CT(28-32), CT(29-32), CT(30-32), CT(31-32), CT(32), CGRP(32-37), CGRP(33-37), CGRP(34-37), CGRP(35-37), CGRP(36-37), CGRP(37), 인터메딘 (42-47), 인터메딘 (43-47), 인터메딘 (44-47), 인터메딘 (45-47), 인터메딘 (46-47), 인터메딘 (47), PYY(25-36), PYY(26-36), PYY(27-36), PYY(28-36), PYY(29-36), PYY(30-36), PYY(31-36), PYY(32-36), PYY(25-35), PYY(26-35), PYY(27-35), PYY(28-35), PYY(29-35), PYY(30-35), PYY(31-35), PYY(32-35), 개구리 GLP-1(29-37), 개구리 GLP-1(30-37), 개구리 GLP-2(24-31), 엑센딘-4(31-39), 엑센딘-4(32-39), 엑센딘-4(33-39), 엑센딘-4(34-39), 엑센딘-4(35-39), 엑센딘-4(36-39), 엑센딘-4(37-39), 엑센딘-4(38-39), 엑센딘-4(39) 및 이들의 유사체로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택되는 것인 하이브리드 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 하나 이상의 제1 생활성 펩티드 호르몬 모듈 또는 하나 이상의 추가의 생활성 펩티드 호르몬 모듈이 성분 펩티드 호르몬, 또는 성분 펩티드 호르몬의 호르몬 활성을 한가지 이상 나타내는 성분 펩티드 호르몬의 단편이거나;
    하나 이상의 제1 생활성 펩티드 호르몬 모듈 또는 하나 이상의 추가의 생활성 펩티드 호르몬 모듈이 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 성분 펩티드 호르몬의 유사체 또는 유도체, 또는 성분 펩티드 호르몬의 호르몬 활성을 한가지 이상 나타내는 성분 펩티드 호르몬의 유사체 또는 유도체의 단편이거나;
    하나 이상의 제1 생활성 펩티드 호르몬 모듈 또는 하나 이상의 추가의 생활성 펩티드 호르몬 모듈이 펩티드 인핸서인 하이브리드 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 제1 생활성 펩티드 호르몬 모듈의 성분 펩티드 호르몬이 엑센딘-4이고, 하나 이상의 추가의 생활성 펩티드 호르몬 모듈의 성분 펩티드 호르몬이 아밀린이고, 펩티드 인핸서가 존재하지 않는 것인 하이브리드 폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 제1 생활성 펩티드 호르몬 모듈이 하이브리드 폴리펩티드의 N-말단 부분에 위치하고; 특히, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 하나 이상의 추가의 생활성 펩티드 호르몬 모듈이 하이브리드 폴리펩티드의 C-말단 부분에 위치하고; 더욱 특히, 하이브리드 폴리펩티드의 C-말단 종결부가 아미드화된 것인 하이브리드 폴리펩티드.
  6. 제1항에 있어서, 제1 생활성 펩티드 호르몬 모듈의 C-말단 종결부가 하나 이상의 추가의 생활성 펩티드 호르몬 모듈의 N-말단 종결부에 직접 부착되어 공유 부착을 형성하는 것인 하이브리드 폴리펩티드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 생활성 펩티드 호르몬 모듈이 알킬; 디카르복실산 PEG; 아미노산; 폴리아미노산; 2관능성 링커; 아미노카프로일 (Aca), β-알라닐, 8-아미노-3,6-디옥사옥타노일, 및 Gly-Lys-Arg (GKR)로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 연결기를 사용하여 공유 부착된 것인 하이브리드 폴리펩티드.
  8. 제1항에 있어서, 제1 생활성 펩티드 호르몬 모듈이 엑센딘-4, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 엑센딘-4의 단편, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 엑센딘-4 유사체 또는 유도체, 및 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 엑센딘-4 유사체의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택되고;
    하나 이상의 추가의 생활성 펩티드 호르몬 모듈이 아밀린, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 아밀린의 단편, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 아밀린 유사체 또는 유도체, 또는 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 아밀린 유사체의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택되고;
    임의적으로, 하나 이상의 추가의 생활성 펩티드 호르몬으로서, CCK, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 CCK의 단편, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 CCK 유사체 또는 유도체, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 CCK 유사체의 단편, CT, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 CT의 단편, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 CT 유사체 또는 유도체, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 CT 유사체의 단편, 및 임의적으로 펩티드 인핸서를 추가로 포함하는 것인 하이브리드 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 생활성 펩티드 호르몬 모듈이 엑센딘-4, 엑센딘-4(1-27), 엑센딘-4(1-28), 14Leu,25Phe-엑센딘-4(1-28); 5Ala,14Leu,25Phe-엑센딘-4(1-28) 및 14Leu-엑센딘-4(1-28)로 이루어진 군 중에서 선택되고;
    하나 이상의 추가의 생활성 펩티드 호르몬 모듈이 25,28,29Pro-h-아밀린, 아밀린(1-7), 2,7Ala-아밀린(1-7), sCT(8-10), sCT(8-27), 14Gln,11,18Arg-sCT(8-27), 아밀린(33-37), h 아밀린(1-7)-14Gln11 ,18Arg sCT(8-27)-h 아밀린(33-37), 아밀린, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 아밀린의 단편, 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 아밀린 유사체 또는 유도체, 및 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내는 아밀린 유사체의 단편으로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택되는 것인 하이브리드 폴리펩티드.
  10. 제1항에 있어서, 두가지의 생활성 펩티드 호르몬 모듈 모두가 그의 모(parent) 성분 펩티드 호르몬의 한가지 이상의 호르몬 활성을 나타내고, 이들이 펩티드 링커로 연결된 것인 하이브리드 폴리펩티드.
  11. 제1항에 있어서, 성분 펩티드 호르몬 모듈 중 어느 하나가 그의 염기 펩티드와 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 하이브리드 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제8항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항의 하이브리드 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 당뇨병, 과체중 및/또는 비만 치료를 위한 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 당뇨병이 II형 당뇨병인 것인 약학적 조성물.
  15. 제9항의 하이브리드 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 당뇨병, 과체중 및/또는 비만 치료를 위한 약학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 당뇨병이 II형 당뇨병인 것인 약학적 조성물.
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