JP2004515049A - 走査型電子顕微鏡を用いた非真空環境内のサンプルの検査のための装置および方法 - Google Patents

Abstract

走査型電子顕微鏡と共に使用するのに適したチャンバ（３４）。チャンバは、膜（３６）で密封された少なくとも１つのアパーチャを含む。膜（３６）は真空に耐えるように適合され、電子に対する透過性をもち、チャンバ（３４）の内部は、前記真空から隔離されている。チャンバは、生きた細胞を内含する湿潤サンプル（３２）を電子顕微鏡の下で検分できるようにするために有用である。

Description

【０００１】
発明の分野
本発明は、走査型電子顕微鏡を用いた非真空環境内のサンプルの検査のための装置および方法、そして更に特定的には（ただし限定的ではなく）、湿潤環境内での物体の検査のためのこのような器具および方法の使用に関する。
発明の背景
光学顕微鏡は、光の波長のために百、通常は数百ナノメートルの範囲内の解像度に制限されている。走査型電子顕微鏡はこの制限をもたず、数ナノメートルの範囲内の著しく高い解像度に到達することができる。
【０００２】
ＳＥＭの欠点の１つは、サンプルを真空下に維持しなければならず、このため、ｉｎ ｖｉｖｏプロセスの研究又は湿潤材料の研究が不可能である、という点にある。その上、有機材料から成る電気絶縁性サンプルには、電荷の蓄積を回避するためのコーティングが必要となる。
【０００３】
１９６０年という早い時期に、Ｔｈｏｒｎｌｅｙの論文（ケンブリッジ大学、１９６０年）が、水蒸気雰囲気内に電子顕微鏡検査用に意図されたサンプルを維持する試みの失敗を開示した。電子ビームの真空からチャンバを密封するためには、膜が用いられ、チャンバ自体は、水蒸気供給源からの入口を有している。
【０００４】
生きた試料用に電子顕微鏡を使用する試みは、１９７０年代にまでさかのぼる。ＳｗｉｆｔおよびＢｒｏｗｎの論文（Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｅ：Ｓｃｉ． Ｉｎｓｔｒｕｍ． ３，９１４，１９７０）が、例えば水中で大気圧での試料を検査するための透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の使用について開示した。サンプルを取付けるためには、コロジオン−炭素フィルムで密封されたアパーチャをもつセルが用いられる。電子ビームがアパーチャを通過してサンプルを打撃し、サンプルにより停止させられなかった電子はシンチレータまで進行を続け、そこで光子が生成される。大気圧で、０．１μｍの解像度が要求されていたにも関わらず、結果は「かなりノイズが多い」ことがわかった。
【０００５】
米国特許第４，０７１，７６６号は、非真空環境内の材料を見るために電子顕微鏡を用いる試みについて記述しており、「永久にくり返し発生する問題」として生きた物体の検査に言及している。米国特許第４，７２０，６３３号は、非真空環境内の材料を見るために電子顕微鏡検査法を用いるさらなる試みについて記述している。これらの特許の両方において、電子ビームは器具を通って湿潤な試料まで走行する。しかしながら、これらの試みはいずれも、湿潤物体をうまく検分することに成功していない。これらの文書の両方の内容が本書に参考として内含されている。
【０００６】
上述の問題を解決しようとしている市販製品が、電子ビームの経路に沿って真空勾配を維持するＰｈｉｌｉｐｓ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｏｐｔｉｃｓ社（オランダ、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ）から市販されている環境走査型電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）である。しかしながら、ＥＳＥＭは、水蒸気平衡の臨界点でサンプルについて作業を行なうことを必要とし、又、４℃前後までサンプルを冷却することをも必要としている。５トールまでの圧力での試料の検査が可能であると言われている。しかしながら、これまでのところ、湿潤でかつ／又は生きた物体を１０ｎｍ以下の解像度で検分できるという証拠は全く無い。この製品およびその作動方法についてのさらなる情報は、本書にその内容が参考として内含されている米国特許第５，２５０，８０８号、５，３６２，９６４号および５，４１２，２１１号の中に見い出すことができる。
【０００７】
有機物質の高解像度検査を達成する一般的方法は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）である。ＴＥＭは、５０ｎｍの範囲内の標準的厚みをもつ特別に調製された試料を必要とする。サンプル中を通過する平行ビームを作り出すために、非常に高い電圧が印加される。本書にその内容が参考として内含されている米国特許第５，４０６，０８７号は、ＴＥＭで使用するための試料保持装置を開示している。電子ビームを透過させることのできる２枚のフィルムの間に試料が密封される。装置の内部は、水分が満たされ、ＴＥＭの真空環境内に設置され得る。非常に高いエネルギーのビームが、試料および周囲流体を通って走行し、低い信号雑音比と同時にサンプルに対する著しい損傷も導く。
【０００８】
ＥＭにより利用可能となった情報は通常、その他の技術によっては利用できない（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ（２００１）細胞生物学における傾向、１１；４；１５３−１５４で再考されている）。ＥＭが一般に充分活用されていない理由は、労働集約的で時間がかかるのみならず結果の生物学的妥当性に関する懸念も発生させるサンプル調製の複雑さにある。水性環境内でＥＭを実施することができれば、これらの問題の多いサンプル調製段階は不要となるだろう。
【０００９】
従って、現在のところ、長い間感じられてきたニーズにも関わらず、高分子および分子レベルの細部を示す解像度での湿潤サンプルの研究を可能にする顕微鏡は全く存在しない。かかる能力は、細胞生物学および重合体科学ならびに石油、食品およびマイクロエレクトロニクスなどの産業といった多様な分野で必要とされている。特に、細胞生物学の分野においては、かかる顕微鏡は、分子レベルのプロセスの測定を導くと同時に医薬品の発見および診断用測定における新しい分野全体を開く細胞の分析を可能にすることだろう。例えば、かかる顕微鏡は、薬物と生きた細胞の間の相互作用の詳細な研究および直接的観察を可能にすることだろう。
発明の概要
本発明の目的は、湿潤サンプルの電子顕微鏡検査を可能にすることになる、走査型電子顕微鏡と共に使用するように適合されたチャンバを提供する。
【００１０】
本発明の第１の態様に従うと、走査型電子顕微鏡と共に使用するのに適したチャンバにおいて、膜で密封された少なくとも１つのアパーチャを含み、前記膜が真空に耐えるように適合されており、かつ電子に対する透過性を有し、内部が前記真空から隔離されているチャンバが提供されている。
【００１１】
好ましくはチャンバは、水又は制限的な意味なく細胞培地を含めたあらゆる水性媒質を実質的に大気圧に保つように適合されている。
【００１２】
好ましくは、膜で密封されたアパーチャは、０．１〜４ｍｍの範囲内の直径を有している。
【００１３】
好ましくは、膜は、実質的に２００〜５０００Åの範囲内、より好ましくは５００〜２０００Åの、そして最も好ましくは、５００〜１５００Åの厚みを有している。
【００１４】
本発明の主要な要素を構成する膜に必要とされる特性としては、エネルギー電子がそれを貫通してチャンバ内に備えられたサンプルと相互作用するのに充分なほど薄い一方で、ＥＭの真空と前記膜により密封されたチャンバ内に収納された環境の間のおよそ１気圧の圧力差に耐えるという能力が含まれる。これらの属性をもつあらゆる材料が、本発明の原理に従った使用に適したものでありうる。現在好まれている態様に従うと、膜材料は、ポリイミド、ポリアミド、ポリアミド−イミド、ポリエチレン、ポリピロールおよび付加的な導電性重合体、パルロジオン、コロジオン、カプトン、フォームバー、ビニレック、ブトバー、ピロフォーム、二酸化ケイ素、一酸化ケイ素および炭素から成るグループの中から選択される。
【００１５】
好ましくは、サンプルは膜の近くに置かれる。代替的には、サンプルは前記膜と接触した状態で取付けられ、こうして、電子ビームがサンプルに到達するのに（真空ではなく）物質の中を最小距離だけ通過する必要しかなくなるという利点が得られる。膜は、好ましくは、膜と真空の間に設置された支持用格子によって支持されている。
【００１６】
一般に、チャンバは、サンプルを流体内か又は実質的に大気圧に、又はその両方の条件に封じ込めながら、真空内に位置づけされる。前記チャンバの壁の少なくとも一部分は、１気圧力の圧力勾配に対する耐性をもち、２ｋｅＶを超えるエネルギーをもつ電子に対する透過性を有している。
【００１７】
本発明の第２の態様に従うと、電子ビーム用の真空通路および物体と結びつけて設置された真空耐性バリヤを含んで成り、前記真空耐性バリヤが、真空から物体を隔離するように設置されている、走査型電子ビームを用いたチャンバ内の物体の高解像度検査のための器具が提供されている。物体の上には、螢光および電子発光マーカーが備わっていてよく、かくして電子ビームは光電子放射を励起することができる。マーカーは、問題の特定の分子と会合させられていてよく、この方法は、個々の分子についての情報を含む光ベースの画像を可能にする。かかる態様は好ましくは又、光検知ユニットを含み、チャンバは、光導体の一部分として構築されていてよい。光検知ユニットは、光電子増倍管を含んでいてよい。
【００１８】
光検知ユニットは、個々の光子を検知するように適合されていてよく、かくして前記器具は、単一の分子の刺激の結果として得られる光放出を検知するように適合されている。
【００１９】
バリヤ又は膜は、より好ましい態様においては、ポリイミド、ポリアミド、ポリアミド−イミド、カプトン、フォームバーおよびブトバーのうちのいずれかであってよい。
【００２０】
バリヤ又は膜は、前記膜と前記真空の間に設置された補強用格子で補強されていてよく、又、実質的に２００〜５０００Åの範囲内、より好ましくは５００〜２０００Åの範囲内、最も好ましくは５００〜１５００Åの範囲内にある厚みを有する。
【００２１】
好ましくは、バリヤ又は膜は、実質的に０．１〜４ｍｍの範囲内の直径をもつアパーチャを横断して設置されている。特に好ましい態様においては、この直径は実質的に１ｍｍである。
【００２２】
バリヤ又は膜は好ましくは、エネルギー電子すなわち、２ｋｅＶを超えるエネルギーをもつ電子に対する透過性を有する。
【００２３】
１つの態様に従うと、バリヤは、高い２次電子収量、標準的にはフッ化リチウムをもつ材料の層でコーティングされている。
【００２４】
１つの態様においては、ラジカルスカベンジャ分子が前記物体と結びつけて位置設定されている。
【００２５】
１つの態様においては、該物体又はサンプルは、前記真空耐性バリヤに隣接して又はそれと接触した状態で設置されている。
【００２６】
本発明の第３の態様に従うと、１気圧の圧力勾配に対する耐性をもつ直径１ｍｍの露呈部域を有しかつ高エネルギー電子に対する透過性をもつ膜の、実質的に１００ｎｍより優れた解像度で走査型電子ビームの下で湿潤サンプルを検分できるようにするためのチャンバを構築することを目的とした使用、が提供されている。
【００２７】
本発明の第４の態様に従うと、バリヤを用いて真空チャンバからそのチャンバを分離することにより１つのチャンバ内の湿潤物体を隔離する段階、前記真空チャンバから前記バリヤを通して前記サンプルを打撃するべく電子ビームを提供する段階および、前記チャンバから出現する２次電子および後方散乱電子のうちの少なくとも１つを観察する段階を含む、ナノメートル範囲の解像度で湿潤物体を観察する方法が提供されている。
【００２８】
好ましくは、バリヤは、実質的に１気圧の圧力に耐え、２ｋｅＶを超えるエネルギーをもつ電子に対する透過性をもつように選択されている膜を含む。
【００２９】
好ましくは、湿潤物体は、医薬組成物を含む。
【００３０】
好ましくは、湿潤物体は更に、医薬組成物と相互作用する生きた細胞を含む。
【００３１】
好ましくは、チャンバは、流体入口を含み、医薬組成物は、観察中動的に入口を通して、濃度およびタイプを含むグループのうちの１つに関して変更される。
【００３２】
本発明をより良く理解し、本発明をいかに有効に実施できるかを示すために、ここで純粋に一例として、添付図面を参照する。
発明の詳細な説明
本発明は、湿潤なサンプルの研究に適合されている走査型電子顕微鏡の新技術を提供する。湿潤な環境は、エネルギー電子が研究対象のサンプルの中を通過しこれと相互作用するのに充分薄い膜によって封じ込められた小型チャンバの中に提供される。
【００３３】
ここでは、膜を通した走査型電子顕微鏡内のサンプルの画像形成における信号形成の技術および機構の両方を開示する。更に我々は、この方法における主要な要素である膜の機械的および空間的セットアップおよびその必要とされる特性をも開示する。
【００３４】
我々は、材料および厚みの選択に対する指針を与える膜の特徴づけのため単純な測定について開示している。更に、さまざまな異なるサンプルの画像を形成する上での該技術の能力についても開示している。アクセス可能なコントラストおよび解像度、これらを得るのに必要な電流も評価されている。我々は、１０ｎｍ前後の解像度で水中の全粒子を観察することが可能であるが、一方それより低いコントラストの材料は、１００ｎｍ前後という著しく低い解像度を提供しうるということを示している。この新しい技術は、材料調査および細胞生物学といったようなさまざまな分野において数多くの応用に適合させることが可能である。
【００３５】
本発明は、膜様仕切りの導入により真空から流体サンプルを隔離することに基づいている。重合体技術における最近の開発は、片側では大気圧、もう１方の側では高真空に耐えるほど充分強靱でありながらエネルギー電子に対しては事実上透過性をもつ薄い膜の生産を可能にしている。画像形成対象体積は、膜のすぐ近く、標準的には流体内へ数μｍの範囲内にある。これは、生体粘着細胞といった膜表面又はその近くにある物体の検査のために理想的である。開示されている技術は、更に、既存の全ての走査型電子顕微鏡に容易に適合でき、室温および大気圧での測定を可能にする。
【００３６】
Ａ．実験用セットアップ
我々は、高真空モードでＪＥＯＬ６４００ＳＥＭおよびフィリップス（Ｐｈｉｌｉｐｓ）ＥＳＥＭの両方で作業するよう本発明の装置および方法をうまく応用したが、我々が提示する装置はあらゆるＳＥＭで使用することができる。本発明の現在好まれているいくつかの態様について、添付図面および図との関係において以下で完全に詳細を記述することにする。
【００３７】
サンプルは、標準的ＳＥＭサンプルマウントインサートのラインに沿って設計されたチャンバの内側に保持される。主として強調されるのは、外部圧力差に対するサンプルの密封であり、これは一連のＯリングを用いて行なわれる。膜が所定の位置にある状態で我々がサンプルを閉じる時点で人がチャンバ内部の流体を試しに圧縮したとすると著しい変形がひき起こされることになるため、サンプルの閉鎖は膜にとっての一つの危険性を提示する。これを回避するために、インサートの軸を通して小さい放出用溝路が開放状態に保たれ、流体のわずかな放出により内側の圧力を平衡化している。この溝路に対する開口部は、所定の位置にネジ込まれているもう１つのＯリングで、その後密封される。
【００３８】
膜は、いくつかの重要な特性を有していなくてはならない。まず最初にそれは可能なかぎり電子に対する透過性をもっている必要がある。これには、低い平均原子数（低いＺ）および低い密度が関与する。従って、重合体フィルムが最も適した選択肢である。
【００３９】
膜には非常にすぐれた機械的特性も必要とされる。電子が問題のゾーンに達する前の電子の散乱を可能なかぎり小さく保ちながら、膜は、観察に必要とされるだけの大きさの表面について１気圧の圧力差に耐えなくてはならない。それは又、サンプルの調製の際の多大な取扱い量を可能にするのに充分な可とう性も有していなくてはならず、かくして炭素フィルムは非常に脆いためその可能性が排除されることになる。サンプル内部のおよびサンプルホルダーを構成する材料に対する多孔性は、チャンバの適切な密封を確保するため、できるかぎり低減されなくてはならない。
【００４０】
理想的には、膜の電気伝導率は、入射電子ビームを摂動させ画像を不鮮明にさせる可能性のある膜の外部表面の局所的帯電を防ぐのに充分高くなくてはならない。実際には、我々は、膜の外側で薄い炭素フィルムを蒸発させ、かくして帯電効果を削除している。
【００４１】
最後に、観察される物体に対する膜の親和性が重要な要因となりうる。標準的には、電子顕微鏡においては、電子は上部領域から底面まで進み、そのため我々が観察したい物体は膜の下に位置設定されることになる。開発された方法においては、物体が膜にきわめて近いところにある場合そして最もよいのはそれらが膜に付着されている場合に最高の結果が得られる。
【００４２】
膜を構築するためには、さまざまな材料がテストされてきており、全ては炭素化合物に基づくものである。ＴＥＭにおいて支持用フィルムを構築するのに一般に用いられているフォームバー（Ｆｏｒｍｖａｒ）およびブトバー〔ＤａｖｉｓｏｎおよびＣｏｌｑｕｈｏｕｎ、Ｊ． Ｅｌｅｃ． Ｍｉｃｒｏｓｃ． Ｔｅｃｈ．２，３５，１９８５；ＨａｎｄｌｅｙおよびＯｌｓｅｎ、Ｕｌｔｒａ−ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ４，４７９，１９７９〕，およびポリイミドがテストされてきた。これまでにテストされてきたこれらの材料のうち、ポリイミドのみが、全ての機械的および密封必要条件を満たした。現在好まれている１つの態様に従うと、Ｍｏｘｔｅｘ、Ｉｎｃにより供給されている厚さ１４５０’のポリイミド膜が使用される。ポリイミド膜は水に対する測定可能な多孔性を全く示さない；サンプルは、ＳＥＭへの挿入に先立ち数時間約１０^−７バールの真空下に置かれても、検出可能な損失を示さない。サンプルは、１ｍｍ^２以上のウインドウ内で大気圧により生成される力に耐えることができる。膜に対するこの力そしてその結果としての破断のリスクを最小限におさえるため、表面は通常、膜の外側に付着されたＴＥＭＮｉ格子の使用により削減された（１２５〜３３０μｍのメッシュが用いられた）。電気伝導度については、外部表面上の５０’の炭素被着で充分であるということがわかった。親和性特性が必要な場合、それは、内部表面処理によって達成される。
【００４３】
Ｂ．コントラスト形成メカニズム
検出器上の信号の形成に対する貢献としては、２つの異なるものが存在する。第１のものは、均等な雑音の供給源であり、一方第２のものには信号が含まれる。
１．ビームが膜を打撃すると、後方散乱電子（ＢＳＥ）および２次電子（ＳＥ）が膜自身によって生成される。最初の数ナノメートル（２次電子の平均自由経路）内で生成されたＳＥのみが膜から逃れることができる〔ゴールドスタイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）ら、走査型電子顕微鏡検査法およびＸ線微量分析ｐ１１３，Ｐｌｅｎｕｍ ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９２〕。それらの平均自由経路は、導体（薄い炭素層）中１ｎｍ前後であり、（ポリイミドおよびそれを超える流体のように）絶縁体の中で最高１０ｎｍである。ＳＥは膜内および炭素コーティング遮へい物内の両方で作り出される。
【００４４】
従って、ＢＳＥおよびＳＥの両方で構成された、膜に起因する信号に対する第１の貢献が得られる。この貢献は、我々が使用する膜の組成および厚みの両方が至る所で同じであることから均質である。以下では、（膜を表わす）下付き文字「ｍ」がこの貢献を意味するものとする。
２．膜を横断するときに後方散乱されないビームからの電子の部分は、サンプル上にぶつかる。ここでも又、２次電子および後方散乱電子が生成される。
【００４５】
ここで生成されたＳＥは、逃がれる機会がなく、膜（絶縁体）又は薄い炭素コーティング遮へい物（導体）により停止させられた状態となる。これとは対照的に、サンプル内に作り出されたＢＳＥは、膜を通って戻るように退出する可能性がある。それらは、膜を通過するにつれて、２次電子を生成する可能性があり、これらの電子はその平均自由経路より低い表面からの距離のところで作り出された場合、検出器に逃れることができる。
【００４６】
かくして、ＥＭおよびＢＳＥ検出器の両方に到達する、問題のゾーン内の後方散乱事象に起因する信号に対するこの第２の貢献が得られる。以下では、（サンプルを表わす）下付き文字「ｓ」がこの貢献を意味することになる。
【００４７】
第２の貢献（ｓ）は明らかに、問題の貢献である。これは、我々が求めている情報を担持しているが、一方第１のものは膜のみ（ｍ）に関係している。２つの隣接点間のコントラストは、それらの間のサンプル信号の差が膜信号内の変動よりも高い場合に観察可能となる。
【００４８】
かくして、画像を形成する我々の能力は、大きい信号対雑音比を得る可能性によって決定される。これは、それ自体、サンプル内部にある材料の後方散乱係数（「材料コントラスト」）の差によって決定され、膜にも左右される。
【００４９】
後方散乱係数がわかっている２つの異なる材料を仮定して、特定の膜について、１つの画像を形成するために満たす必要のある条件を決定したいと思う。
【００５０】
収集された合計信号Ｓは、２次電子と後方散乱電子の両方で構成されている：
【００５１】
【数１】

【００５２】
ηおよびδは、それぞれ、ビーム電流に対するＢＳＥおよびＳＥの比を表わす。係数εは、検出される２種類の電子についての収集効率を表わす。
【００５３】
後方散乱係数ηはそれ自体、２つの貢献すなわち膜（ｍ）内部からのＢＳＥおよびサンプル（ｓ）内部からのＢＳＥから成る。η＝ηｍｔηｓ。
【００５４】
同様にして、ＳＥ散乱係数δは２つの貢献を有する、δ＝δｍ＋ηｓΔｍ。
【００５５】
その差は、δｍが膜内に入るビームの電子により生成される２次電子を表わす一方、Δｍは、サンプル内部の関連する後方散乱事象の後に退出中の電子により膜内で生成される２次電子を表わす、という点にある。
【００５６】
かくして、膜を通って戻るエネルギービーム電子の流束は１からηｓだけ削減されることから、後方散乱係数ηｓはΔｍだけ増す。
【００５７】
δｍおよびΔｍが両方共、膜の表面に近いところからの２次電子の放出を説明しているという点に留意されたい。δｍについて、２次電子を生成する高エネルギー電子は、大部分が、入射ビーム電子であり、膜内部で後方散乱した電子からの貢献は小さい。Δｍについては、２次電子を生成する電子はサンプル内部で後方散乱事象を経験している。この理由から、Δｍは低速材料依存性を含む可能性がある。膜の下にある材料に応じて、この領域内のＢＳＥのエネルギースペクトルは異なるものであり得、ＢＳＥの異なるエネルギーが異なるＳＥ放出を生成し得る。
【００５８】
我々が使用している後方散乱および２次係数および文献内で通常記述されている係数の定義がわずかに異なっているという点に留意されたい。後者は、半無限の媒質について定義されており、材料（金、炭素、ナイロンなど）に特徴的なものである。ここで、係数は、その特定の厚みをもつ１つの膜およびその炭素遮へい物の電荷放出を記述している。これらの係数は、ポリイミド材料の半無限のサンプルの電荷放出を記述するものではない。同じ要領で、サンプル係数は、膜で覆われたサンプルの内部の材料から来る信号を記述している。以下における我々の目標の１つは、測定上の係数を材料（例えば水、金など）の特徴である古典的な理論上の係数と実験的関連づけすることにある。
【００５９】
信号ＳＡおよびＳＢを与える２つの隣接する点を考慮してみよう。それらの間の材料コントラストは次のように定義づけされる。
【００６０】
【数２】

【００６１】
（Ｓ_Ａ＞Ｓ_Ｂと仮定する）。
【００６２】
信号Ｓを修正する方法としては基本的に２つのものが存在する。１つは、それに定数を乗じること（増幅）である。もう１つは、信号に対し正又は負の定数を加えること（これは「ブラックレベル」である）。信号に対する膜の貢献は、至る所で同じである。その厚みおよびその組成は、きわめて明確である。従って、組成コントラストもトポグラフィックコントラストも、膜のために、点ＡおよびＢの間に現われない。
【００６３】
かくして、貢献ｍは、ブラックレベルを適切に選択することによって除去され得る定数である。それでも、ｎを膜から散乱した電子の数としておよそｐｎの雑音が測定に干渉しうるものの、それについては以下で立ち戻ることとして、当面それを無視する、ということに留意されたい。この選択より、点ＡとＢの間のコントラストは大幅に単純化される：
【００６４】
【数３】

【００６５】
材料コントラストは、点ＡとＢで膜の下にある材料内に発生した後方散乱事象の数の差にのみ関係づけられる。
【００６６】
貢献ｍに立ち戻ると、それは、それがおおよそサンプル内部の事象により生成された信号の振幅をもつものである場合、画像を完全に破壊しうる雑音を生成する。このような理由から、我々は、膜特性を研究し、膜のみに関係づけられかつブラックレベルの適切な選択によりコントラストの式（等式３）内では削除された信号の部分を定量化しなくてはならない。
【００６７】
Ｃ．膜を通しての電子の通過
ここで、信号に対する膜の貢献を実験的に定量化することにする。これは、エネルギーの一関数としてその表面から放出されたＢＳＥおよびＳＥを単位として行なわれる。我々が用いる方法は、異なる状況でサンプルを横断する合計電流を測定し、次に減産を行ってＢＳＥおよびＳＥ内への損失を得ることにある。我々は、サンプルにおいてＳＥＭが提供する全電流を推定するべく妨害の無い電流を測定し、次にこの電流に対する膜の効果を測定する。最後に我々は、ここでは金および水である与えられた材料まで膜を通って進む電流を測定する。
【００６８】
この目的のために、我々は４つの異なるサンプルおよび、異なるサンプルが顕微鏡内部に同時に挿入され得るようにする１つのアセンブリを使用した（我々がもっていた４つのサンプルのうち、３つは一緒に挿入でき、従って我々は重複する三ツ揃いおよび同一の条件で実験をくり返した）。異なるエネルギーについて、ビームを連続して各サンプル上に位置づけし、大地とサンプルの間の電流を測定した。
【００６９】
サンプル１は、単に、ビームの全ての電荷を収集することによりビーム電流Ｉ（ビーム）を測定するために使用されたファラデーカップである〔ゴールドスタインら、走査型電子顕微鏡検査法とＸ線微量分析、ｐ６５，Ｐｌｅｎｕｍ ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９２〕。それは、中央に直径が１０ｍのアパーチャをもつＮｉプレートで閉じられたキャビティ（直径２ｍｍ，深さ３ｍｍ）をその上面に伴う、大地に接続された大量の炭素で構成されている。ビームは、アパーチャを通って入り、炭素キャビティの底面を打撃し、かくして、主要ビームおよび実際には全ての散乱した電子が収集されることになる。
【００７０】
サンプル２は、アパーチャが膜で覆われているという点を除いて、同一の設計である。我々はこれを測定Ｉ（膜）と呼ぶ。
【００７１】
サンプル３は、大地に接続され膜で覆われた純金サンプルから成る。金はまず最初に、膜との「直接的」接触が達成された大きい部域が得られるようその表面が充分平滑となるように、融解させられた。最後にサンプル４は、水が入り膜で密封された我々の実験用チャンバである。サンプル３およびサンプル４は、Ｉ（材料）＋Ｉ（膜）について２つの値を定義する。
【００７２】
サンプル１および２について測定した電流の差（サンプル１のものにより正規化されている）は、膜との相互作用によって放出された電子の百分率を与える。これは、膜の２次および後方散乱係数の貢献を測定する：
【００７３】
【数４】

【００７４】
Ｓ３又は４について測定した電流からのビーム電流（サンプル１）の差は、外側に到達するサンプルから放出された電子の百分率を与える。これらには、膜および材料（それぞれ金又は水のいずれか）の両方と相互作用した電子が含まれている：
【００７５】
【数５】

【００７６】
下付き文字Ｓは、ここでは金又は水である材料を意味する。
【００７７】
５ｋｅＶ未満のエネルギーについては、金および水曲線は、膜曲線上に重なることがわかる。これはすなわち、ビームが、サンプルに到達すると同時にＢＳＥを検出器に送り戻すのに充分なほどのエネルギーは有していないことを意味する。
【００７８】
５ｋｅＶを上回るエネルギーについては、３本の曲線は、その勾配が異なっている。検出された信号の成長しつつある部分は、考慮対象の材料との相互作用に起因する。エネルギーが増大するにつれて、この差は増大する。信号の材料成分は支配的なものとなる。
【００７９】
水サンプルおよび１０ｋｅＶの電子エネルギーについては、ビーム−膜相互作用は、電荷放出の５０％に貢献する。その貢献は１５ｋｅＶで３５％まで減少する。
【００８０】
金の場合、原子番号が高いために、割合は劇的に小さくなる。１０ｋｅＶで、放出された電荷のわずか４％が膜の特徴である。１５ｋｅＶでは、膜の貢献は２％まで下がる。
【００８１】
この段階で、我々は合計電子放出から膜成分を差し引き信号に対する材料貢献を得ることができる。これには、問題の材料とそれらの相互作用により散乱させられる電子のみが内含される。
【００８２】
低エネルギーでは、ビームの電子はサンプルに到達せず、曲線はゼロになるはずである。非常に高いエネルギーでは、曲線は、膜が事実上透過性となることから、材料の後方散乱係数の挙動に追従するはずである。これが実際２本の曲線について我々が観察することである。水曲線の減少勾配は、ＨｕｎｇｅｒおよびＫｕｃｈｌｅｒの微分演算〔Ｐｈｙｓ、Ｓｔａｔｕｓ． Ｓｏｌｉｄｉ Ａ． ５６，Ｋ４５，１９７９；ゴールドスタイン前掲書ｐ９５も参照のこと〕から計算されるような、後方散乱係数の理論上の挙動に追従する。全曲線の増加勾配も同じく、（同じ式から導出されるような）計算上の後方散乱係数の推移に直接追従する。
【００８３】
それぞれの材料の後方散乱係数によりこれらの曲線を正規化することによって（その該当するエネルギー依存性を伴って）低い材料依存性のみが残っている曲線が得られる。
【００８４】
水についての結果は、ＨｕｎｇｅｒおよびＫｕｃｈｌｅｒにより予測された理論的曲線よりも約２５％低い後方散乱係数を表わしている。この差の原因が何であるかは定かでないが、我々のサンプルは完全に封じ込められ、汚染の機会は最少限しかないことから、我々は、我々が実験的に決定した値がこの数量について現時点で利用可能な最も偽りのない結果であると考えている。
【００８５】
我々はこれを直接測定したわけではないが、膜より下の材料の特性は明らかに、放出されているＢＳＥのエネルギースペクトルにも影響を及ぼす。エネルギーは、Ｅ_０を入射電子のエネルギーとして、０〜Ｅ_０の範囲内にある。軽い材料（例えば炭素）は、Ｅ_０／２の値をほぼ中心とする分布をもち対称である〔Ｈｅｒｍａｎｎにより編集された第４回国際Ｘ線光学および微量分析会議議事録（Ｐａｒｉｓ、１９６６）中、Ｂｉｓｈｏｐ；ゴールドスタイン前掲書ｐ１００も参照のこと〕。重い材料（例えば金）は、非対称性の強いＢＳＥのエネルギー分析をもち、ピークはＥ_０により近くなっている。この差は、２つの効果を誘発する。まず第１に、膜を横断して戻ることのできるＢＳＥと生成された合計ＢＳＥの比は、軽い材料の場合よりも重い材料の場合に高くなる。膜は、実際には低エネルギーＢＳＥをろ過により除去するように作用しており、かくして軽い要素と重い要素の間のコントラストを人工的に増強している。第２に、ＢＳＥのエネルギースペクトルの差は、低いエネルギーのＢＳＥが退出する途中でＳＥを生成する確率がより高いことから、ＳＥ放出Δｍにも影響を及ぼす可能性がある。
【００８６】
水と金の原子番号の間の電子番号のその他の材料については、対応する曲線は、示された２つの端部の間にあることになる。これまでの結果からの我々の結論は以下のようにまとめられる。
ａ）　４〜５ｋｅＶ以下のエネルギーについては、サンプルからいかなる信号も検出できない。この閾値は、より薄い膜を使用することによって減少させることができる。
ｂ）　エネルギー中間領域は、次のような複数の理由で興味深いものである：まず第１に、低エネルギーのＢＳＥに対する膜ろ過効果は、重量材料と軽量材料の間のコントラストを増強する。第２に、この領域におけるＳＥの放出は重要であり、ＳＥ検出器で容易に画像形成することが可能である。全曲線上のピークは、１より高い値に達し、ＳＥの高い放出を実証している。
ｃ）　高いエネルギーについては、放出された電荷は、理論的に予測されたＢＳＥ係数に近づいている。その理由は、より高い電子エネルギー（ビームの電子および後方散乱電子の両方について）では、ＢＳＥが膜を横断する確率が更に高く、退出中のＳＥに対する確率はより低いものである、ということにある。２次放出はΔｍの減少に関係しており、従って、実験的に観察された通り、ＢＳＥ検出器を通して画像形成することが更に容易になる。
【００８７】
ＢＳＥに対する膜ろ過効果は、高エネルギーで無視できるものとなる。コントラストの式（等式３）の中で、後方散乱係数を、考慮対象の材料（水、金、炭素など）の後方散乱係数で差し換えることができる。水平域に達するエネルギーは、それ以上になるとこの近似が有効となる最小のエネルギーを示している。本書で例示されている膜については、この値は１５ｋｅＶ前後である。
Ｄ．一定の与えられた材料コントラストの観察のため最小プローブ電流を演繹する。
【００８８】
２つの点の間に小さな組成差（平均原子番号の差）が存在する場合直ちに、それを観察することは理論的に可能である。問題は、その観察を行なうために、これらの点にどれだけの電子がぶつかる必要があるかである。
【００８９】
このような推定は、複数の理由から有用である。まず第１に、選択された電流は、解像度に影響を及ぼす。高い電流は、ビームの集束度を低くする。これは、顕微鏡の電子源がタングステンフィラメントである場合に、問題がより大きく、電界放出顕微鏡の場合についてはさほど注意が必要な問題ではない。第２に、電子源は制限された数の電荷しか生成できず、第３に、高い放射線線量が試料に損傷を与える可能性がある。
【００９０】
我々は、一般に、大部分の場合低コントラストのサンプルであることが判明するエマルジョン、生体試料，重合体溶液などといったような試料含有液体に関心を寄せている。
【００９１】
充分な可視性についての幾分か恣意的ではあるものの有用な基準は、「ローズ基準」〔ゴールドスタイン前掲書中、ｐ２１５〕。これには、２点ＡおよびＢ間の差を観察するためには、これらの点の間の信号振幅差は雑音レベルの５倍より高くなくてはならないと記述されている：
（Ｓ_Ａ−Ｓ_Ｂ）＞５Ｎ
異なる走査においてビームが点Ａにあるときに検出器に入る電子の数を測定することで、その標準偏差が〜η^１／２によって求められ平均値ｎに中心をおく分布が得られる。かくして信号はηに比例し、雑音はη^１／２に比例する。信号対雑音比はＳ／Ｎ〜η^１／２であり、観察できる材料コントラストの最小レベルはＣ_ｍｉｎ＝５／η^１／２である。
【００９２】
かくして、特定の材料コントラストＣを観察するために収集すべき電子の平均数は、一般的な形でη＞（５／Ｃ）^２により求められる。（検出器における）対応する電流はＩｓ＞（ｑ／ｔ）（５／Ｃ）^２であり，ここでｑは、電子の電荷であり、ｔはビームが各点に存在する時間である。ｔは同様に、ｔ＝Ｔ／ｎ_ｐとして表現することもでき、この場合式中の
Ｔは走査時間、ｎｐはフレームあたりの画素数である。高品質の画像については、標準的にｎｐ＝１０^６画素が存在する。ピコアンペア単位でＩｓを、又秒単位でＴを測定すると、一定の与えられた材料コントラストＣを得るために検出器において必要とされる電流が、
Ｉ_ｓ＝４／ＴＣ^２　　　（４）
であることが見い出される。
【００９３】
最後に、信号電流Ｉｓおよびビーム電流Ｉ_ＢはＩ_Ｓ＝ηｓ（ε_ＢＳ＋ε_ＳＥΔｍ）Ｉ_Ｂを通して関係づけされる。Ｅｖｅｒｈａｒｔ−Ｔｈｏｍｌｅｙ検出器のようなＳＥ検出器は、ＢＳＥの除去率が優れ、非常に効率が良い〔ゴールドスタイン前掲書〕。ＢＳＥ検出器はＳＥを収集せず、通常小さなシグニチュアを有することから、中程度の収集効率しかもたない。実験により、我々は、１０ｋｅＶ前後のエネルギーで、ＢＳＥおよびＳＥの両方のモードでの画像が同じコントラストで現われ、一方、より高いエネルギーでは、ＢＳＥの方がすぐれているということを発見した。２５％での収集効率の適正な推定値を取り上げると、コントラストＣを得るのに必要とされるビーム電流が〔１９〕（同じく〔ゴールドスタイン　ｐ２１７〕中）であることがわかる。
【００９４】
Ｉ_Ｂ＝１６／ｎηＴＣ^２　　　（５）
高いエネルギーでは、コントラストＣは単純に等式３により膜の下の材料の後方散乱係数に関係づけされる。表１は、細胞、油／水エマルジョンおよび水中金粒子といったような生体試料の観察のために必要とされる最小電流の計算の結果を示している。
【００９５】
４つの元素Ｃ、Ｈ、ＮおよびＯは、細胞といったような生体試料の重量のほぼ９９％を作り上げている。細胞は、７０％の水と２９％の有機化合物で構成されている。これらの化合物中の原子の約５０％がＨ原子であり、２４％がＣ，２４％がＯそして１％がＮ原子である〔２０〕。これらの値がわかっていることから、標準的有機分子の平均原子番号は６．７２である。水の原子番号は７．２２であり、生きた細胞については、それは７．０７である。２０ｋｅＶでの対応する後方散乱係数を計算すると、水については０．０７５、細胞については０．０７３となる。かくして、水性媒質により取り囲まれた細胞は、低いコントラストＣ＝２：５％を提示し、更に後方散乱係数は低い。この計算は、ナノアンペアの範囲内の最小電流が１００ｓという標準走査のために必要とされるということを示している。
【００９６】
【表１】

【００９７】
表Ｉ．水を含む異なるサンプルの観察に必要とされる最小電流の評価。Ｉは等式５から求められる。ηの値は、指示された平均原子番号値Ｚを用いて、エネルギーＥ＝２０ｋｅＶでＨｕｎｇｅｒおよびＫｕｃｈｌｅｒの式から計算される。走査時間Ｔ＝１００ｓは、精細な低速走査に典型的なものである。
【００９８】
油／水エマルジョンは、より容易に観察可能であり得、１０倍高いコントラストＣ＝２６：７％を呈する。最小電流は、その場合、数十ピコアンペアまで降下する。水中に浸漬された金粒子については、コントラストは非常に高い（Ｃ＝９０％）。それを画像形成するには、数分の１ピコアンペアしか必要ではない（表Ｉ）。
【００９９】
細胞といったような生体サンプルは、適正な蓄積時間内で画像形成するために高い電流を必要とする。有利には、細胞を飾るためにコロイド金粒子といったような重量マーカーでの標識づけを使用することができる。油／水のエマルジョンは、標準的な電流および蓄積時間条件下で直接観察することができる。
【０１００】
低エネルギー（１０ｋｅＶ以下）では、膜の影響が重要となる。その結果として、低コントラストサンプルは、画像形成されるのにより一層多くの電流を必要とする。
【０１０１】
Ｅ．当該技術の解像度の評価
あらゆる電子顕微鏡測定においてそうであるように、解像度の問題は究極的に、高い電子含有量をもつ散乱原子の存在に要約される。強く散乱する原子の不在下では、ビームはサンプル中の深いところまで到達し、それにつれて拡幅し、戻されるのに充分な相互作用を受けないうちに、解像度を喪失する。高い電子密度をもつ材料で、ビームは戻され吸収される前に短かい距離しか走行せず、かくして散乱する体積は小さく解像度は高くなる。
【０１０２】
解像度に対する膜の効果を見るためには、直径ｄｅｆｆにより特徴づけられる有効信号生成体積を評価する必要がある〔ゴールドスタイン、前掲書中、ｐ１６２〕：
【０１０３】
【数６】

【０１０４】
なお、式中、ｄ_Ｂは、膜に入るビームの直径を表わす。ビームが膜を横断するにつれて、幾分かの散乱が発生し、これは低エネルギーにおいては特に重要で、高いエネルギーでは無視できる傾向をもつ。ｄ_ｍは、膜との相互作用の結果としてのビームの拡幅を表わす。ゼロの初期幅ｄ_Ｂ＝０をもつビームは、直径ｄｍをもつ膜から出現することになる。
【０１０５】
距離ｄ_ＢＳＥは、ＢＳＥとして戻る前にサンプル中で電子により覆われている体積の平均直径である。ｄ_ＢＳＥは、文献〔ゴールドスタイン前掲書中、ｐ１０５〕内に見い出すことができ、Ｋａｎａｙａ−Ｏｋａｙａｍａ（ＫＯ）範囲に関係する。ＫＯ範囲により全ての特徴的長さを再度スケーリングすると、材料依存性の大部分が除去され、小さい原子番号Ｚの依存性のみが残される。金のサンプルの場合、ＢＳＥの９０％が直径ｄ_ＢＳＥ＝０．３Ｒ_ＫＯの体積に由来している。炭素については、同じ関係から、ｄ_ＢＳＥ＝０．６Ｒ_ＫＯが得られる。
【０１０６】
ＫＯ範囲は、材料内部の電子の相互作用の体積の標準的サイズを与える。これは、その周囲が相互作用体積の制限的包絡線を包含するビーム衝撃点を表面上の中心とする円の半径と等価である：
【０１０７】
【数７】

【０１０８】
Ｒ_ＫＯはμｍ単位で表現され、Ｅ_０はｋｅＶ単位の入射ビームエネルギーであり、Ａはｇ／モル単位の原子量であり、βはｇ／ｃｍ^３単位の密度、Ｚは原子番号である。
【０１０９】
３つの異なる層（炭素膜−材料）という一般的ケースでは、理論上の解像度を計算することは、重要である。しかしながら、非常に低いか又は非常に高い原子番号をもつ材料という２つの制限的ケースでは、かかる推定が可能である。
Ａ．低エネルギーでの低コントラストサンプルの解像度
水、油又は膜を構成する材料といったような軽量材料は、原子番号に関し充分近いものであり、そのため単純な推定というのは、それらを同じものとみなすことである。このとき、解像度の推定は、単純に次のようなものである：
【０１１０】
【数８】

【０１１１】
なお式中、ｄ_ＢＳＥは、平均軽量材料の中で計算される。この評価は、ｄ_ＢＳＥが膜の厚みよりも大きいかぎり意味がある。
【０１１２】
ビームｄ_Ｂの直径は、顕微鏡内で用いられる電子源によって左右される。電界放出源は、最良の条件（低電流、高エネルギー）下で１ｎｍのサイズのビームを生成し、一方、最も困難な条件下では、サイズは１０ｎｍ前後である。タングステンフィラメント顕微鏡については、ビームの直径は１０〜１００ｎｍまで変動しうる。
【０１１３】
かくして、軽量サンプルの場合に得られた解像度は、およそ２００ｎｍである。１０ｋｅＶ，低電流および電界放出源では、推定から、ｄｅｆｆ＝１７０ｎｍが得られ、一方２０ｋｅＶでは、最高ｄｅｆｆ＝５００ｎｍとなる。
【０１１４】
実験により、我々は、膜厚みよりも優れた解像度を得るのが困難である、ということを発見した。エネルギーを低下させた時点で、膜の下でサンプル採取された体積が低減することから、解像度は改善する。しかし、実際には、エネルギーが低減されるにつれて、コントラストは、トレードオフとして減少する。サンプルから後方散乱される電子は更に少なくなり、サンプル信号対膜信号の比は減少する。かくして、解像度の真の限界は、検出可能な最小コントラストにより与えられる。膜の厚みを低減させることができる場合には、サンプルを画像形成するための最小のエネルギーは減少し、解像度は著しく改善することになる。
【０１１５】
この解像度の推定値は、この段階でなぜ水中油型エマルジョンといったような低コントラストのサンプルについて、我々の技術が光学顕微鏡に関し著しく改善を示さないのかを表わしている。これは、より薄い膜といったような技術的進歩により改善可能である。しかしながら、水中金粒子、更に一般的には重量材料で作られ軽量材料中に浸漬された小さな物体を考慮したとき、状況は完全に変わる。
【０１１６】
Ｂ．高エネルギーでの高コントラストサンプルの解像度
水の内部での金粒子のケースは非常に興味深いものである。高エネルギーで実験的に得た解像度は数１０ナノメートルの範囲内にある。エネルギーが高くなればなるほど、得られる解像度は良くなる。実際の直径４０ｎｍのビーズは、３０ｋｅＶで５０ｎｍ前後の直径であるように見え、これは（ｄＢＳＥにより与えられる）ＢＳＥの相互作用体積よりも１ケタ以上小さいものである。このことは、解像度が相互作用範囲と関係づけされないということを実証している。この場合、解像度は、粒子の深さに到達したときのビーズの直径にリンクされる。
【０１１７】
高エネルギーでは、ビームは、それを妨害するビーズが全くない場合、水の内側で拡散することができ、ＢＳＥによりサンプル採取される体積は深くかつ幅広である（１〜数ミクロン）。ＢＳＥが生成する信号は、非常に幅の広い体積全体にわたる蓄積の結果であり、このような理由から、ビームが走査されるとき著しく変動しない。その上、高い倍率では、画像サイズ自体が、おおよそＢＳＥでサンプル採取された体積のサイズである場合、この深いＢＳＥ信号は、ブラックレベルの適切な選択によって除去することのできる定数である。一方、電子ビームが重量材料ビーズを横断する場合、ビームの有意な部分が妨害され得、直ちに、はるかに多くのＢＳＥが放出される（高い後方散乱係数）。かくして、得られる解像度は、ビーズの深さにおける電子ビームの空間的拡がりによって左右される。
【０１１８】
膜のすぐ下にあるビーズは、最高の解像度で画像形成される。サンプルの内部深くに粒子があればあるほど、それを画像形成できる解像度は低くなる。
【０１１９】
ビームの拡張は、モンテカルロシミュレーションに充分適合された問題である。我々は、かかる計算を行なうために、Ｄ．Ｃ．　Ｊａｙが考案したコードを使用した〔電子顕微鏡検査および微量分析のためのモンテカルロモデリング（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｌｏｎｄｏｎ １９９５）〕。シミュレーションのための入力値は、ポリイミド化学量論構造式Ｃ_２２Ｏ_５Ｈ_１０Ｎ_２，平均原子番号６：４および平均原子量９．８ｇ／モルである。材料の密度は１．４ｇ／ｃｃである。
【０１２０】
２０ｋｅＶでは、解像度の限界は、膜より下６０ｎｍと推定される。３０ｋｅＶでは、計算されたビーム直径は３５ｎｍであり、これはビーズが膜と接触している場合に実験的に得られる解像度と相容性ある値である。
【０１２１】
計算は、２倍の薄さの膜を使用した場合、高エネルギーで１０ｎｍの解像度での画像形成が可能であることを示している。
【０１２２】
サンプルの内部深くにあるビーズについては、間にある水に起因するビームの拡張を考慮に入れなくてはならない。解像度の近似は、モンテカルロシミュレーションから計算されたｄ_ｅｆｆ＝Ｖ（ｄ^２（ビーム）＋ｄ^２（膜）＋ｄ^２（水）・ｄ（水）から得られる。
【０１２３】
膜を使用した状態で、かつ３０ｋｅＶで、膜より下１００ｎｍにある金粒子は、４５ｎｍの解像度で画像形成可能である。２００ｎｍの深さのビーズは、同じエネルギーで８０ｎｍの解像度で画像形成できる。
【０１２４】
Ｆ．サンプル採取深度
完全さを期して、サンプル内部でどれほど深く重量粒子を検出できるかを評価することが有利である。
【０１２５】
軽量材料中では、脱出するＢＳＥのほぼ５０％が、表面に戻る前に０．２Ｒ_ＫＯに等しい深さに到達する（ゴールドスタイン前掲書ｐ１０５）。数値的係数０．２は炭素についてのものであるが、係数は原子番号と共に非常にゆっくりと推移することから、水および膜を構成する材料についても非常に類似しているはずである。
【０１２６】
その値を我々の推定上のサンプル採取深度として考慮すると、６ｋｅＶで、サンプル採取深度は１５０ｎｍ前後である。この値は、我々の厚み１４５ｎｍの膜ではこのエネルギー未満では画像形成がほとんど不可能であったという我々の観察と相容性あるものである。
【０１２７】
水中では、サンプル採取深度は１０ｋｅＶで約０．４μｍであり、２０ｋｅＶで１．２μｍ，３５ｋｅＶでは３．１μｍであり、これは、多くの走査型電子顕微鏡上で利用可能な最大エネルギーである。これらの値は、水の内部で全粒子を検出できる深度範囲の推定値を与えている。
【０１２８】
Ｇ．チャンバ内部の圧力の推定
以下に記すのは、湿潤チャンバ内部の圧力の単純な計算である。この計算は、大部分が、きわめてわずかの空気しか（例えば小さな気泡）内部にない状態でチャンバに水が充填されたと仮定されているセットアップを基準としている。
【０１２９】
計算を単純化するために、以下の仮定が考慮される。
１．大気圧でほとんど水が充填されている閉鎖されたチャンバで開始する。内部には、実際小さな体積の空気Ｖａ（大気圧で測定）が入っており、この体積はチャンバを真空内に置いた後の体積膨張Ｖに比べて小さいものである。
２．膜は、バネ定数ｋをもつバネにより保持されたピストンとしてモデリングされる。このモデリングは、膜上の力と膜の変位Ｘの間の線形関係しか仮定していないことから、恐らくは適切なものである。この有効な定数は、実験により容易に推定される。膜（ピストン）の表面積はＳで記されている。
３．水は、圧縮不能であると仮定される。チャンバがひとたび真空下に置かれたならば、ピストンは、平衡に達するまでシフトする。膨張した体積Ｖｅは、平衡条件により決定され、空気および水蒸気により充填される。水蒸気圧Ｐ_Ｈ２Ｏは温度のみによって決定され、体積とは無関係である（Ｋｉｔｔｌｅｙの熱物理学を参照のこと）。空気および水蒸気は両方共理想気体であるものと仮定されている。
【０１３０】
水蒸気分子の数は、以下の式から得られる；
【０１３１】
【数９】

【０１３２】
なお式中Ｔは温度である。
【０１３３】
真空内に挿入した後のチャンバ内の合計圧力は以下の通りである：
【０１３４】
【数１０】

【０１３５】
なお式中、
【０１３６】
【数１１】

【０１３７】
は、空気（窒素）分子の数である。（１）および（２）において、我々は、Ｖｅ＞Ｖａという仮定１を用いた。
【０１３８】
圧力についてのもう１つの等式は、平衡条件によって与えられる：
【０１３９】
【数１２】

【０１４０】
Ｖｅ＝ＸＳを用いて、体積Ｖｅについての等式が得られる。
【０１４１】
【数１３】

【０１４２】
（４）を（１）および（２）に代入すると、幾分かの操作の後、初期パラメータによって左右されるＰ_ｔｏｔについての等式が得られる：
【０１４３】
【数１４】

【０１４４】
この等式は、（最後の項で除することによって）次の式に変換できる：
【０１４５】
【数１５】

【０１４６】
又は
【０１４７】
【数１６】

【０１４８】
等式（７）は、Ｐ_ｔｏｔの推定のために有用である。右側の最初の項は約０．０２５である。第２項についての比率がこの値よりもはるかに小さい場合には、気泡を無視することができ、チャンバ内の圧力は水蒸気圧である。それが大きい場合には、この比率は大気圧からの合計圧力の分数を与える。この等式は、Ｖｅ＞Ｖａを条件として導出されたものであることに留意されたい。Ｖａ＞Ｖｅである場合には、圧力は大気圧に近いものにとどまり、水蒸気圧は不適切である。
好ましい態様の説明
ここで、先行技術のＳＥＭ１０のサンプル部域の縦断面を示す一般化されたダイヤグラムである図１を参照する。一次電子ビーム１２は、真空経路を通って走行し、サンプル１４に達する。それはサンプル１４を打撃して後方散乱した電子６の流れを形成し、これらの電子は後方散乱した電子の検出器１８を打撃する。後方散乱した電子に加えて、サンプルにより放出された２次電子２０が２次電子検出器２２に向かって加速される。
【０１４９】
雰囲気を通しての電子の平均自由経路は非常に小さく、かくして、エミッタからサンプルを介し検出器に至るまでの電子経路全体は真空中にあり、湿潤サンプル又はｉｎ　ｖｉｖｏプロセスを研究することは不可能になっている。
【０１５０】
ここで、本発明の第１の態様に従った走査型電子顕微鏡の縦断面を示す一般化されたダイヤグラムである図２を参照する。前述の図の中に示されたものと同じである部分には同じ参照番号が付され、当該態様の理解に必要な場合を除き、再度説明はしない。
【０１５１】
図２では、１次電子ビーム１２が、真空チャンバ３０を通って、チャンバ３４内に置かれたサンプル３２に向かって走行する。チャンバ３４内に密封されているのは、湿潤で生きた組織の保持に適した雰囲気であり、この雰囲気中でｉｎ　ｖｉｖｏプロセスを行なうことができる。最も適した環境には水性媒質が含まれる。
【０１５２】
真空チャンバからチャンバを密封するために、標準的には膜であるバリヤ３６が、リング３８により画定されたアパーチャを横断して伸張させられる。リング３８は、以下の図３に関連して更に詳細に示されるように気密な形で膜３６を端部で保持するように設計されている。サンプル３２は、好ましくは、膜３６まで近接して設置され、電子ビームがサンプルに到達するのにチャンバ内部の雰囲気を通って走行しなくてすむようになっている。好ましい一態様においては、サンプル３２は、膜と実際に物理的に接触した状態にあり、生きた組織の場合には、膜上で成長させられてもよいし、又は、以下で例示するように既知の方法を用いて膜に取付けられていてもよい。
【０１５３】
好ましくは、チャンバ３４は、以下で図３に関連して詳述されるように、逃し出口４０を含んでいる。チャンバは更に、試料のための適切な条件を維持する流体用の入口４１および出口４２を含む。例えば、研究対象の試料の化学環境を変えるべく入口４１および出口４２を利用することも可能である。この特長は、薬物の研究において特に有用であり、この場合、与えられた薬物の濃度が変わるにつれての細胞の動的反応を見守ることができる。
【０１５４】
膜３６は、ホイル又はフィルムであってよく、好ましくは、同時に電子ビームに対する透過性をもちながら最高１気圧の圧力勾配に耐えることができなくてはならない。１つの実施例においては、圧力勾配に耐えることができかつ３ｋｅＶ以上の領域内のエネルギーをもつ電子ビームに対する透過性を有することから、実質的に厚み１５００Åのポリイミド層が使用される。より薄い膜は、２ｋｅＶに対する透過性をもつ。より一般的には、厚みは、必要な圧力勾配に耐えかつ同時に利用可能なビームエネルギーで電子に対する透過性を有するように、２００〜５０００Åの範囲内にあってよい。好ましい材料は、例えば分子構造式Ｃ_１２Ｈ_１２Ｎ_２Ｏのポリイミド、ポリアミド、ポリアミド−イミド、ポリエチレン、ポリピロールおよび付加的な導電性重合体、パルロジオン、コロジオン、二酸化ケイ素、一酸化ケイ素、炭素およびカプトン（商標），フォームバー（商標），ビニレック（商標），ピロフォーム（商標）およびブトバー（商標）を含む商標付き材料である。上述のようなポリイミドで構成された膜は、一次ビームおよび結果として得られた後方散乱電子１６の通過を可能にする。
【０１５５】
２次電子（ＳＥ）は一般に、上述のものよりも低いエネルギーを有し、通常水中で吸収される傾向をもつ。かくして、サンプルから放出されるＳＥは通常検出されない。しかしながら、好ましい態様においては、ＳＥ信号は、高い２次電子収量をもつ材料の単数又は複数の層３７で膜をコーティングすることによって増強される。標準的材料としては、フッ化リチウムがある。
【０１５６】
ここで認識できるように、ＳＥは、ＳＥ検出器２２により検出され、かくして全体的信号を増強するのに役立つ。
【０１５７】
好ましい態様においては、アパーチャ内の膜３６の露出された部域の直径は、実質的に１〜３ｍｍである。膜は標準的に、格子上に支持され、格子内部の各開口の最大直径は実質的に０．１ｍｍである。格子は、圧力勾配に耐える膜の能力を増強させる。格子は、図３に概略的に示されている。
【０１５８】
膜は好ましくは、チャンバ３４内部の通常の大気条件の維持を可能にし、かくして、生きた細胞、オルガネラ又はその一部分およびタンパク質を内含する一範囲のサンプルの検査を可能にする。膜は更に、表面活性剤、コロイド、油粒子、エマルジョンおよび重合体又はミセル性溶液の検査を可能にする。製薬業界では、チャンバは、例えば、膨潤、溶解および崩壊といったような薬物の動的特性更には或る種の薬物に対する細胞の耐性を検査するために使用可能である。繊維業界では、チャンバは、羊毛、木綿および合成繊維の加湿および乾燥を調査するために使用することができる。本発明を応用できるその他の分子としては、石油、食品、地質学、マイクロエレクトロニクス、ペーパーコーティングおよび材料科学があると考えられる。
【０１５９】
チャンバ３４自体には、望みに応じて気体又は液体を充填することができ、電子ビームのナノメートル範囲の解像度に起因して、分子レベルでサンプルを監視することが可能である。膜に起因する解像度の損失は、その中で発生する散乱事象がきわめて少ないことから、無視できるものである。チャンバに気体が充填される場合、好ましくは、バネ４３および付加的な膜４４を含む圧縮除去装置をチャンバ内に具備して、膜が破裂するのを防ぐことができる。
【０１６０】
本発明の態様に従うと、チャンバ３４を、図３に関して以下で論述するように、標準的ＳＥＭ内に内蔵することができる。チャンバ３４は、標準的試料ホルダー又は試料マウントと相容性がある。試料ホルダーは、試料チャンバ内すなわち試料ホルダーの設置のための顕微鏡のエンクロージャ内に容易に内臓できるような形で、標準的な市販の試料ホルダーの寸法に従って設計されている。
【０１６１】
以上では、大気圧を含むものとしてチャンバが記述されてきたが、このことは全てのサンプルについて必要ではなく、場合によっては、より低い圧力も適切であることが判明することもあり、従って、膜３６を横断する圧力勾配は削減される。
【０１６２】
生きた細胞又はｉｎ ｖｉｖｏプロセスを観察するのに電子ビームを使用するにあたっての問題点は、電子ビーム自体がサンプルに損傷を与えるという点にある。例えば、ＤＮＡに対するピーク損傷は、４ｋｅＶで発生する。３ｋｅＶ／１５００Åのポリイミド膜の選択は、安全なことに、ピーク損傷レベルより低いものである。
【０１６３】
損傷レベルは更に、個々のサンプルに対する損傷を最小限におさえるエネルギーレベルを見い出すことで最適化することができる。
【０１６４】
ここで、図２のチャンバのさらなる１態様のわずかに分解された簡略化した断面図でありさらなる詳細を示す図３を参照する。好ましくは従来のサンプルホルダーにはめ込まれるサイズのチャンバ５０は、サンプル保持アセンブリ５１を含んで成り、このアセンブリはそれ自体、開放した表面５５をもつサンプル領域５４を封じ込める本体部材５２を含む。図３の例においては、本体部材５２は、標準的ＳＥＭ試料マウントである。サンプル領域は、サンプル領域５４の露出側全体にわたりはめ合わされる上述のタイプの膜５６によって封じ込められている。格子５９が、膜より上に位置づけられ、そこからスペーサ５７により分離されている。閉鎖用部材５８が、膜５６をその縁部のまわりでグリップするような形で本体部材５２全体にはめ合わさっている。閉鎖用部材は、本体部材５２内のネジ穴６０と連続している封じ込め部材５８内の対応する穴の中にはまり込むネジ６３を介して本体に取付けられている。サンプル領域５４の密封を提供するため、サンプル領域５４のまわりで本体部材５２の中にＯリングシール６６がはめ込まれている。
【０１６５】
サンプル６４は、膜５６と近接した状態で示されている。好ましくはサンプルは、電子ビームが任意の多大な量の雰囲気内を走行する必要がないように、膜と実際に接触しているか又はそれからナノメートル以内のところにあるべきである。
【０１６６】
サンプル領域が、ネジ６２の締付けによって密封されている場合には、サンプル領域内に圧力の上昇が存在する可能性がある。かくして、余剰の流体を逃がすことができるようにする圧力除去装置が具備される。このアセンブリ６８は、流路７２を封じ込めるステム７０を含む。流路７２は、ステム７０の遠方端部にあるさらなる開口部１４とサンプル領域５４を連結している。ステム７０のまわりには、第２のＯリングシール７８に対し内向きにプレスするべく下部部分７９とはめ合わさる上部部分７７を含む滑動する円筒形閉鎖部材７６がある。閉鎖部材７６は好ましくは、サンプル領域自体が密封された後で初めて開口部を密封するために使用され、かくしてサンプル保持アセンブリ５１の余剰の流体のための経路を可能にしている。
【０１６７】
インサート７３は、サンプルホルダー（図示せず）内への挿入を可能にする。
【０１６８】
ここで、光学手段による付加的なサンプル採取のために適合された図２および３のチャンバの１態様である図４を参照する。図４では、チャンバ８０が光導体８２の一部として作られている。閉鎖用部材８６により保持された膜８４がチャンバ８０を真空に対し密封する。反射性コーティング９０が好ましくは、光導体８２の片端を被覆し、もう一方の端部は、矢印９２の方向に光電子増倍管（図示せず）まで導いている。サンプル９４には、電子ビームにより励起される電子発光（螢光）マーカーでマーキングが施されている。光は、光電子増倍管（図示せず）により増幅されるべく、矢印９２の方向に偏向させられる。かくして、単光子で検出することが可能であり、好ましくは、ＳＥＭのナノ規模の解像度における光学的検出のための手段が具備されている。
【０１６９】
ここで、図３に示された態様を用いた湿潤試料の検査を示す電子顕微鏡写真である図５を参照する。サンプルは、本書にその内容が参考として内含されているＭａｔｔｈｅｗｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ　議事録、ＥＭＡＧ９９，ｐ９５，Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ、１９９９）により記述されている、ＥＳＥＭコントラストを実証するために前述の実験において用いられているような水中油形エマルジョンである。電子顕微鏡写真は、低解像度をもつＪＥＯＬ８４００ＳＥＭで撮影され、目盛マーカーが示されている。本発明に従って膜を用いて得られる解像度は、膜無しの従来の要領でＳＥＭを用いて達成される解像度レベルとほとんど同じである。優れたコントラストが得られ、全体的結果は、湿潤試料の検査にとって充分なものである。
【０１７０】
明確さを期して個々の複数の態様の状況下で記述されている本発明のさまざまな特長を単一の態様の中に組合せた形で提供することも可能である、ということがわかる。換言すると、簡潔さを期して単一の態様の状況下で記されている本発明のさまざまな特長を、個別に、又は任意の適切なサブコンビネーションの形で提供することも又可能である。
発明の好ましい方法の詳細な説明
理想的には、生存可能な未定着細胞を含めた（ただしこれに制限されるわけではない）湿潤サンプルの画像を形成するための技術は、以下の能力を提供すべきである：
１．画像形成特性
−　少なくとも１００ｎｍ、好ましくは１〜２０ナノメートルの範囲の解像度。
−　高い信号対雑音および信号対バックグラウンド比。
２．細胞の生理学的環境：
−　湿潤未定着細胞の湿潤環境内で作業できる能力
−　最小限の放射線損傷（画像形成に対する最小限の妨害、結果の生物学的妥当性に対する最小限の効果）
３．処理能力：
−　最少限のサンプル調製段階
−　自動化戦略
本発明は、以上で概略的に記した仕様に合致するように我々が修正している走査型電子顕微鏡に基づくものである。
【０１７１】
最少限のサンプル調製の段階
従来のＳＥＭ手順では、帯電を防ぐべくサンプルのコーティングが必要とされている。ここでは、細胞をとり囲む電解質水溶液（媒質）は、帯電を防ぐのに充分なものである。かくして、サンプル調製は、コーティングを必要とせず、生きた細胞での作業を可能にしている。サンプル調製に定着、脱水又はコーティングが不要であることから、従来のＳＥＭに比べてサンプル調製手順は徹底的に短縮され単純化され、結果の質は著しく高まる。ここで示すのは、制限的な意味のない例としてのサンプル調製手順である。この例は、膜タンパク質の細胞外部分のような細胞外細胞成分を標識づけするために適している。細胞内細胞成分の標識づけを含めたその他の標識づけ技術は、以下の例の節で記述されている。細胞の標識づけは、普通の免疫標識付け手順によって行なわれる。
【０１７２】
我々の結果は、この湿潤ＳＥＭ技術が、定着された細胞および生きた細胞の両方に、そして粘着細胞、および非粘着細胞の両方のために適しているということを実証している。その上、これらの結果は、単一の分子検出を得るのに標識づけが必要とされる一方で細胞を標識付け無しで画像形成することもできるということを実証している。
【０１７３】
自動化戦略
本発明は同様に、実験室用ＳＥＭの低い処理能力をも解決している。本発明は、生体サンプルのために、ウェーハ検査用に半導体業界向けに開発されたＳＥＭ自動化を利用している。ウェーハ検査用に開発されたＳＥＭ自動化を生物学において利用するというこの考えは、「生体分子の同定および定量化方法およびそのための器具」という題の同時係属ＰＣＴ出願（ＰＣＴ／ＩＬ０１／００７６４）の中で詳細に記述されている。そこでは、サンプルは乾燥しており、ウェーハ検査走査型電子顕微鏡（ＷＩＳＥＭ）又はＷＩＳＥＭ様の顕微鏡の直接的使用を可能にしている。この考え方は、ＷＩＳＥＭを含めた従来の電子顕微鏡の真空必要条件との相容性をもつようにサンプルを調製するためには、自動化の実行可能性を妨げる徹底的かつ複雑な段階が課せられることから、天然の水性環境内で得られた生体サンプルには適用できなかった。本発明は、これらの問題のサンプル調製段階を必要とすることなく、水性サンプルの画像形成を可能にし、かくして、ウェーハ検査用に半導体業界向けに開発されたＳＥＭ自動化を生物学で利用することを可能にしている。この利用により、該方法を実施するのに必要とされる計装コストが大幅に削減されることになる。
【０１７４】
自動化戦略は、ＷＥＴＳＥＭ技術での生きた細胞の自動化された画像形成において使用すべき手順を記述する一組の指針である。本発明の好ましい態様においては、自動化手順には、湿潤ＳＥＭ画像形成のために調製された１つのサンプルを各々が収納している多数の隔離されたチャンバを収納する「セルチップ」が内含される。かかる小分割（隔離されたチャンバ）は各々、上で細胞サンプル（同一の又は異なるものであってよい）が成長させられる仕切り膜を収納している。
【０１７５】
サンプルの調製においては、標準の自動化された流体制御を使用することができる。
【０１７６】
画像形成のためのセルチップの準備がひとたび完了した時点で、これをＳＥＭ内に一体化された標準光学顕微鏡検査又は光ファイバなどのような特殊なセットアップを用いて自動化された光学画像形成（又は代替的には低倍率ＳＥＭ走査）へともっていくことができる。この走査は、各チャンバ内の細胞の全体像、それらの位置および実験のための他のあらゆる関連情報を提供することになる。この走査における細胞に関する情報は、特定的に開発されたアルゴリズムを用いて自動的に検出されることになる。
【０１７７】
仕切り膜は、機械的安定性のため、金属格子上に取付けられる。この格子は、各々全ての画像の座標のための便利できわめて安定した基準を提供する。
【０１７８】
光学的走査がＳＥＭの外側で実施される場合、セルチップは、ＳＥＭａｒｔ画像形成のためＳＥＭチャンバに移送される。光学顕微鏡およびＳＥＭの座標間の整合を行なうため、アラインメントアルゴリズムが使用されることになる。
【０１７９】
これら２つの座標系がひとたび整合されると、ＳＥＭは光学走査（又は低倍率ＳＥＭ走査）から自動的に選択された問題の特定的領域（ＲＯＩ）の画像を形成する。かかるＲＯＩには、重要な生物活性が発生する細胞内の特定の領域、又は、その細胞内の特定の亜局在化に関係する領域、又は、細胞内のその他の領域の統計的表示を提供する領域が含まれる可能性がある。金コロイドは、各々のこのような領域の中で画像を形成すべきである。
【０１８０】
かかるＲＯＩは、異なるサイズを有する可能性があり、従ってＳＥＭの異なる倍率を必要とする。画像形成された視野と観察できる標識づけのサイズの間にはトレードオフが存在するという点を留意されたい。従って、異なる視野で画像形成するためには、異なるサイズの標識付けが必要となる。特定的には、単細胞全体の画像のためには、大きな視野が必要とされる。かかる大きな視野は、低い倍率および走査の解像度に応じて大きな金コロイドのみを観察する能力を意味している。代替的には、より高い倍率で撮られた数多くの小視野画像を組合わせて、細胞全体の高解像度ピクチャを提供することもできる。
【０１８１】
ＳＥＭ画像は自動的に撮られる。これには、ＳＥＭ載物台の自動化された位置づけ、自動焦点および非点収差補正、自動化された輝度およびコントラストが含まれる。
【０１８２】
ＳＥＭにより撮られた画像は、画像分析アルゴリズムを用いて自動的に分析可能である。これには、観察された金コロイドの位置およびサイズの識別、計数および比較が含まれる。
【０１８３】
その他の信号も同様に、ＳＥＭ撮像において測定可能である。これらには、（以下で例示されているような）陰極発光マーカーからの信号又は、サンプルの分析化学分析を提供できるサンプルからのＸ線放出が含まれる。
【０１８４】
１つのセルチップをＳＥＭで走査する一方でもう１つのセルチップを光学的に走査することができる。
【０１８５】
ＳＥＭ内での非常に高い解像度の光学画像形成
非常に興味深い１つのオプションは、サンプル中の光放出を励起するべく狭い電子ビームを使用することにある。かかる光放出は、陰極発光（ＣＬ）と呼ばれ、過去においては、脱水されたサンプルに対して研究されてきた（Ｈｏｕｇｈ ＰＶＣ，ＳＥＭＩ　２５７，１９７７で再考されている）。これは、光学顕微鏡検査での理論的限界よりもはるかに優れた解像度での光放出の検出を可能にすることになる。この解決法は、ＳＥＭ画像形成の高い解像度として良く知られている螢光標識付けを組合せている。このオプションは、ＳＥＭ内で湿潤および生きたサンプルが画像形成される場合に非常に有利である。この画像形成システムにおいては、電子ビームは、それ自体可視光を放出するＣＬ（螢光）標識づけ分子を励起する２次電子（ＳＥ）を生成する。この放出された光は、次の通常の電子検出とは別の収集経路内で収集される。２次電子による励起は、広帯域ＵＶ放射線と等価であることが示される可能性がある（Ｈｏｕｇｈ ＰＶＣ、ＳＥＭＩ，２５７　１９７７参照）。この方法には数多くの利点がある：すなわち
１．螢光および金標識づけの組合せは、生物学的利点を数多く有している。
２．標識づけされた分子の高解像度画像形成を得ることにより、新しい重要な生物学的情報を提供することが可能である。
３．単光子検出は管理が容易で、放出された光子のかなり大きな割合が確実に回収される。
４．ＤＮＡコードされた螢光タンパク質が利用できることで、電子顕微鏡検査のための新しい標識づけの機会が開かれる。
５．この技術では、量子ドットおよび螢光ビーズといったような独特のプローブをマーカーとして使用することができ、その他の技術においては達成できない汎用性および利点が提供される。
【０１８６】
湿潤ＣＬ器具の態様は、既存のＣＬ検出器に基づいていてもよいし、新規の収集幾何形状および構成の開発がこれに関与していてもよい。既存の検出器は、例えば、上部半平面（サンプルより上）から光を収集するものである。この鏡構成では、楕円形の鏡がサンプルより上に設置され、電子ビームの通過を可能にするためその中に小さい穴が備わっている。光は、鏡により収集され、光子検出器がその向こうにある顕微鏡の中のウィンドウに向かって導かれる。このような収集構成は、例えばＧａｔａｎ（前Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）から市販されている。以下では、光子がサンプルの下で収集され光導体により顕微鏡の外側の検出器まで導かれる。下半分平面内での収集のための２つの構成例について説明する。
【０１８７】
器具は以下のように作られる：すなわち、（ステンレス鋼で作られた）サンプルチャンバは、膜がレンズの焦平面に位置づけされるような形で、上部部分では仕切り膜により、又下部部分では小さなレンズにより閉鎖されている。かくして、膜の近くで放出されたレンズにより収集された光は、レンズから離れるときに視準された状態で出てくる。サンプルチャンバは、載物台の内側に置かれ、ここでプリズムが９０度で（すなわち水平に）レンズから出てくる光を再度方向づけする。
【０１８８】
載物台は同様に、光ファイバの入口で光を再度集束するのに用いられるレンズを収納している。光ファイバは、載物台から顕微鏡の外側にある検出器まで至る。使用される検出器は、単光子モジュール検出システムである。検出された各光子について、出力信号はＴＴＬ信号である（０〜５Ｖの方形信号）。
【０１８９】
検出器の出力端はコンピュータカードに接続され、このコンピュータカードが受信したＴＴＬ信号（光子）の数を計数する。コンピュータカードは同様に、顕微鏡からいくつかの信号、すなわち画像獲得開始、新フレームの開始、新しいラインの開始、といったような信号を受信する。特別に設計された適切なソフトウェアを用いて、画像は、収集されたデータから実時間で再構築される。
【０１９０】
図６は、異なる構成要素部品Ａ−Ｅが合わせて組立てられた状態のサンプルチャンバを示している。個々の部品については図７Ａ−Ｅに詳しく描かれている。
【０１９１】
螢光実験用セットアップを組立てる
図７（Ａ−Ｅ）は、螢光実験のために用いられるアセンブリの第１の態様を示している。
【０１９２】
側面に直径数ミリメートルの穴（図示せず）を含む部品Ａがテーブル上に上下逆さまにして置かれている。部品Ｂは、部品ＡとＢのネジ穴を整列させるべく注意しながら内側に置かれる。２つのＯリングが部品Ｂ内に挿入される。膜は、所定の場所に置かれている。膜は、厚み０．１ｍｍのプラスチック製支持体上にとりつけられる。プラスチック製支持体の直径は、使用されるＯリングの２つの直径の間で選択されなくてはならない。直径３ｍｍの穴は、プラスチック製支持体の中央に予め予備成形されており、これは、膜の無い領域である。ＴＥＭ格子は膜の片面（外側面）の中央に貼りつけられている。次に、部品Ｃが挿入される。水平導管が、部品Ａの側面穴と整列させられていることが重要である。６本のネジが挿入される。膜、部品Ａ，ＢおよびＣは、合わせてネジ留めされる。このときサンプルは、いつでも水又はその他のあらゆる水性媒質が満たされてよい状態となる。液体媒質は、部品Ｃの中央にある自由空間の内部に、（それがなおも上下逆さまである状態で）入れられる。部品ＡおよびＣの側面上に設けられた穴を通して、細いピン（直径０．１ｍｍ）が挿入される。ピンは、その端部が湿潤チャンバに到達するまで、内側に深く挿入される。ピンのもう１方の端部は、外側に進む。最後のＯリングは部品Ｃ内でその場所に置かれる（この段階で、ピンがそこのちょうど下にあることから、Ｏリングは完全に所定の場所に設置され得ない。これは正常であり、後続する段階にとって有用なことである）。（中央に光を視準させるためのレンズ（図示せず）を収納している）部品Ｄが、アセンブリの中に置かれる。レンズの内側は、チャンバを満たす媒質によって湿っている。最終的に部品Ｅが挿入される。部品Ｅをアセンブリ内部で回すと、部品Ｄ（レンズ付き）は漸進的にＯリング（部品Ｃの）上にプレスされる。Ｏリングはピンのために完全に所定の場所にないことから、それはなおチャンバを外部から隔離しない。部品Ｅをネジ込むと、湿潤チャンバの体積は減少し、かくして余剰の媒質は、ピンに近いところでＯリングの下を流出することができる。通常は、部品Ｃ内の流路から、幾分かの液滴が流出する。Ｏリングが充分にプレスされレンズが正しく設置された時点で、ピンはゆっくりと引き抜かれる。組立てのこの段階で、部品Ｂ内のＯリングは、自由に全ての空間を占有することができる。Ｏリングは、チャンバを密封するその自然の位置に入る。かくして、チャンバは、最終的にその段階で完全に密封される。このアセンブリ（部品Ａ〜Ｅ）はこのときその正常位置（上面が上）に回転され、専用に設計された顕微鏡の載物台の内側に挿入される。
【０１９３】
図８は、アセンブリと共に使用するのに適した顕微鏡の載物台を示している。載物台（２）の上面キャビティは、サンプルチャンバが挿入されるリセスである。そのすぐ下にはプリズムがある。プリズム（１）は、穴の方向に光を再度導くために使用される。この穴の中で、レンズ（図示せず）が、光ファイバの入口で光を集束する。
【０１９４】
光の収集効率をより良くするために、生体サンプルと光導体の間の直接的カップリングが樹立される代替的なセットアップが設計された。この代替的セットアップは、図９に示されている。それは、光が直接サンプル領域から上述の単光子検出器セットアップまで進む、真空気密チャンバを収納している。この図面では、ハウジング（Ｉ）が、ネジ（６，７）を用いて支持体（２）およびカバー（３）に取付けられ、内部には、Ｏリング（８）で密封された光導体（５）に更に連結された膜（９）を伴うキャビティディスク（４）が位置づけされている。
【０１９５】
標識づけ技術
本発明は、１つの細胞の細胞内又は細胞外部分のいずれかにおいて細胞成分を画像形成するのに適している。
【０１９６】
細胞の細胞内部分を標識づけするのに異なるアプローチを考慮することができる。
【０１９７】
細胞を定着後に使用できる場合、一般的方法には、細胞膜の易透化又はその抽出が関与する。
【０１９８】
生きた細胞に適した１つの代替的方法は、飲作用反応を通してマーカーを挿入することである。細胞をその後定着させるか生きている間に観察することができる。飲作用反応は、適切な条件下で行なわれた場合、細胞の生存可能性を保存する。それは、分子（当該技術分野における既知の応用の大部分において螢光マーカー）又は（本出願にとって特に適しているような）ナノ規模の粒子を挿入することを可能にする。一部の研究者は、細胞内部にミクロン規模でビーズを導入する上での成功も報告している。
【０１９９】
易透化および抽出の手順は、定着された細胞に適している。作業者が細胞膜を完全に除去したいのかそれとも幾分かの間隙を作り出したいだけなのかに応じて、いくつかの手順を採用することができる。
【０２００】
抽出および定着は、細胞の外部膜がまず最初に完全に除去されることを意味する。そのとき、すぐ後で、細胞は定着される。この種の手順は、細胞質、核又は細胞骨格の中の構造を視覚化するために優れている。
【０２０１】
定着および易透化は、細胞がまず最初に定着され更に細胞膜が易透化されることを意味する。
【０２０２】
飲作用反応は、生きた細胞のために適している。例えば、市販のＩｎｆｌｕｘ（細胞内部に粒子を導入するためのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ　Ｉ−１４４０２）といったような作用物質を使用することができる。Ｉｎｆｌｕｘ細胞投入技術は、飲小胞の浸透圧溶解に基づいている。簡単に言うと、投入すべき化合物を、高張媒質と高濃度で混合し、飲小胞を介して細胞内に材料を運び込むことを可能にする。次に、細胞は低張媒質に移送され、その結果、細胞内の飲小胞から捕獲された材料が放出され、細胞質ゾルを化合物で満たすことになる。
【０２０３】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅにより与えられたプロトコルに従って、我々は、細胞内部に、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ、１００ナノメートルサイズの金粒子、ミクロン規模の螢光ビーズおよび量子ドットを導入した。細胞を定着し、観察に先立ち金又は銀を増強させることができる。この方法を用いる場合、或る程度の百分率で細胞が死滅する。実施された実験の大部分において、１０〜２０％未満の細胞が失なわれた。
【０２０４】
生きた細胞の細胞表面を、細胞に対する損傷が低い状態で、金粒子で標識づけすることができる。本発明と合わせて使用するために開発されたプロトコル例では、当該技術分野において既知であるように、ストレプトアビジン−ビチオン標識づけ方法が利用される。考え方は、細胞表面上の一定の百分率のタンパク質に付着することになるビチオンと共に細胞をインキュベートするというものである。このとき、細胞は、ビチオンに付着することになる金粒子にリンクされたストレプトアビジンとインキュベートされる。インキュベーションのためのビオチンの用量は、膜タンパク質上の過度に多くのビチオンがその活性を混乱させ細胞死を誘発し得ることから、入念に制御されなくてはならない。異なる研究から、ビチオンを細胞トラッキングの応用分野のために使用することができる、ということが示された。複数の研究が、赤血球を扱った（例えばＨｏｆｆｍａｎｎ−Ｆｅｚｅｒら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、７４，２３１−２３８，１９９７；Ａｕｌｔ、Ｋ．Ａ． ａｎｄ Ｃ． Ｋｎｏｗｌｅｓ、 Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２３，９９６−１００１，１９９５，およびその中の参考文献）。ビチオンは、その生物学にほとんど又は全く変化をもたらすことなく、数多くの細胞を標識づけし、必要とあらばそれらの検出および回収の両方を可能にする。
【０２０５】
マイクロカラム。処理能力を増大させることになるさらなる開発が、マイクロカラムでの並行検査である。そのサイズのため、マイクロカラムは、並行して作動することができ、走査時間およびＳＥＭをベースとするシステムのかさ高さを著しく削減する。マイクロカラムのさらなる詳細は、その内容が、あたかも本書で完全に開示されているかのように参考として本書に内含されている、ＦｅｉｎｅｒｍａｎおよびＣｒｅｗｅ「小型電子光学」、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｐｈｙｓｉｃｓ、第１０２巻、１８７（１９９８）ならびに米国特許第５，１２２，６６３号の中で提供されている。マイクロカラムベースの電子顕微鏡を生物学的応用分野で利用するという考え方は、「生体分子の同定および定量化方法およびそのための器具」という題の同時係属ＰＣＴ出願の中で詳細に記述されている（ＰＣＴ／ＩＬ０１／００７６４）。
【０２０６】
本発明の原理についての以下の例は、単に、制限的な意味のないものとしてみなされるよう意図された、単に例示を目的として提供されるものである。
例
仕切り膜上で細胞を成長させる
以下に記すのは、非制限的な例として提供される、膜上で細胞を成長させるための手順例である。ポリイミド仕切り膜をまず最初に、１５分間フィブロネクチン（０．１ｍｇ／ｍｌ）でコーティングする。ＰＢＳおよび培地で洗浄した後、チャンバ１個あたり１２〜１５μｌ中８００〜１５００個の細胞という濃度で、通常のやり方で細胞を平板固定する。２４時間後に、細胞はいつでも操作／標識づけできる状態となる。大部分の細胞型は、付加的な基質様のフィブロネクチンの支持無しで、ただし大規模な洗浄手順中により洗い出される確率が更に高くなるような条件下で、仕切り膜自体の上で成長することができる。細胞の生存可能性は、これらの手順のいずれによっても影響されない。
【０２０７】
本発明は、粘着および非粘着細胞の両方と相容性がある（以下で例示される通り）。非粘着細胞（例えばリンパ球）を画像形成する目的で、まず最初に細胞を懸濁状態で標識づけし、その後、１〜３時間０．４％のポリリシンで前処理された仕切り膜上に、３０分間粘着させる。
放射線損傷を最小限におさえる
現在、我々は、短時間規模（秒）でのみ、混乱を受けていないプロセスの画像動力学を例示している。注意する必要のある一種の放射線損傷は、水分子を打撃する電子ビームにより形成された遊離ラジカルによって生成される損傷である。
【０２０８】
かかる損傷に対する考えられる１つの戦略は、放射線によって生成される遊離ラジカルを吸収し、かくして細胞に対する放射線の損傷を最小限におさえると思われる添加剤を細胞の媒質に内含させることである。細胞にとって非毒性であるかぎり、ラジカルスカベンジングに適した既知のあらゆる化合物を使用することが可能である。かかる添加物の１つの候補例は、遊離ラジカル吸収物質として同定されてきたスクロースである。従来の電子ビーム技術が湿潤環境内で機能しないことから、この解決法は、本発明の場合にのみ可能である。
【０２０９】
免疫標識づけによる細胞の標識づけ
細胞の標識づけは、普通の免疫標識づけ手順によって行なわれる。細胞を洗浄し、任意には７分間２％のパラホルムアルデヒドによって定着させた。適切な血清での遮断の後、細胞を１時間特異的モノ又はポリクロナール抗体と共にインキュベートした。洗浄後、第１の特異的抗体を認識する第２の抗体と共にサンプルをインキュベートする。この第２の抗体は、５，１０，２０又は４０ｎｍの金クラスタにリンクされる。このとき、各コロイドについて入念に較正した条件を用いて、銀増強により、金標識づけを更に増幅させることができる。
【０２１０】
仕切り膜下の定着させられた湿潤細胞
定着させたＡ４３１細胞およびＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞上で標識づけされた成長因子レセプタ
２％のパラホルムアルデヒドで細胞を定着させ、抗ＦＧＦレセプタモノクローナル抗体（Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞上）又は抗−ＥＧＦモノクローナル抗体（Ａ４３１細胞）とそれに続く直径２０ｎｍの金コロイドにリンクされた抗マウスＩｇＧで標識づけした。細胞を定着させ、標識づけ粒子のサイズを増大させるために銀増強を用いた。画像形成のためにＸＬ３０ＥＳＥＭを用い、細胞を後方散乱電子（ＢＳＥ）モードで検査した。ＦＧＦレセプタ金標識づけは、図１０Ａに示されている両方の細胞上で明るいスポットとして見ることができる。ＥＧＦレセプタは、図１０Ｂ−ＤのＡ４３１細胞上で目に見える。核部域のまわりの標識づけの不鮮明さは、金粒子間のトポグラフィ差の結果である。仕切り膜に近い金標識づけは、明確でピントが合っているが、核を超えたおよび核のまわりのより遠位の標識づけは不鮮明である。核の領域内の標識の不鮮明さは、この領域内の標識が仕切り膜から更に離れているという事実の証拠である。この不鮮明さは実際、仕切り膜の平面からの標識の距離の決定用の手段を提供し、かくして三次元情報を提供する。仕切り膜と標識の間の付加的な媒質の効果を逆重畳する能力をもつ画像分析アルゴリズムを用いること、この距離のかなり精確な推定が提供できる。
【０２１１】
細胞（膜下層に付着された側とは反対にある）の遠位側で標識のより高い解像度を達成するために、もう１つのチャンバ設計を適用することができる。このような設計においては、細胞は、薄い液体層のみがそれらをカバーしている状態で、平らな基盤上で成長させられる。その後、細胞をカバーするこの基盤の上面に仕切り膜が設置される。このようにして、細胞の上面側が画像形成され、細胞はなお湿潤環境内にある。
【０２１２】
膜の下の生きた標識付けされていない粘着細胞
生きたＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞
その通常の培地内でフィブロネクチン上に平板固定した。２４時間後に、ＢＳＥモードで細胞を検査した。生きたＣ２Ｃ１２細胞（図１１Ａ−Ｄ）およびＣＨＯ細胞（図１２）は、細胞およびその核ならびにいくつかの核下オルガネラの輪郭を明確に示している。
【０２１３】
ジャーカットヒトリンパ球上でアルファ標識づけされたＩＬ−２レセプタ
抗ヒトＩＬ−２レセプタモノクローナル抗体およびそれに続く直径２０ｎｍの金コロイドにリンクされた抗マウスＩｇＧで、細胞を標識づけした。３０分間、ポリリシンで予備コーティングされた仕切り膜上に細胞を粘着させ、その後ＢＳＥモードで検査した。図１３は、定着させたＣ２Ｃ１２のＦＧＦレセプタ標識づけ（図１０Ａ）およびＡ４３１細胞のＥＧＦレセプタ標識づけ（図１０Ｂ−Ｄ）において以前に見られた通りの金粒子の間のトポグラフィ差の結果としてもたらされるピントの合ったおよびピント外れの金標識づけを示している。
【０２１４】
この陰極発光（ＣＬ）セットアップで撮影された画像
信号がかなり微弱でも（おそらくは、集光効率が低いことに起因して）、細胞は明確に観察される。細胞は、ＣＬマーカー無しでも観察される（すなわち、細胞の幾分かの部分は内部発光をもつ）。ＣＬマーカーを用い、収集効率が改善された場合、はるかに高い解像度が予想される。
【０２１５】
定着された細胞ＮＩＨ３Ｔ３の陰極発光画像。
細胞内にはいかなる発光マーカーも挿入されなかった。従って、放出された光は、図１４Ａ−Ｃに示されているように、細胞の「自然の」陰極発光の結果である。細胞の幅は約２０ミクロンである。
【０２１６】
ＮＴＨ３Ｔ３細胞上でのビオチンベースの標識づけ
材料：
スルフォ−ＮＨＳ−ＬＣビオチン（ＳｉｇｍａＢ１０２２）（ＤＭＳＯ中に１０ｍｇ／ｍｇ溶解させ４℃に保つ）。
【０２１７】
直径１０ｍｍから４０ｎｍの金粒子にリンクされたストレプトアビジン
３７℃で予め温められたリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（その細胞系統のための培養温度で予め温められた）細胞系統用培地。
【０２１８】
予め温められた血清を含まない培地。
【０２１９】
調製すべき溶液：
溶液Ａ：　予め温めたＰＢＳ中の０．５ｍｇ／ｍｌのスルフォ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン。水中で分解が発生することから使用直前に溶液を作らなくてはならない。
【０２２０】
溶液Ｂ：　ＰＢＳ中に溶解させたストレプトアビジン金（１／１０〜１／１００）＋血清を含まない培地（１対５の体積比）。
【０２２１】
溶液Ｃ：　完全培地−ＰＢＳ溶液（１対５の体積比）。
【０２２２】
手順：
１．細胞のトリプシン処理
２．４分間１２５０回転／分での遠心分離
３．上清を除去し、１０ｍｌの新鮮培地内で再懸濁させる。
４．１．５ｍｌ入りのエッペンドルフ管２本に分けて３ｍｌを取る。
５．３分間１６００回転／分で遠心分離する。
６．上清を可能なかぎり多く除去する。
７．管の中に１．５ｍｌとなるよう３７度のＰＢＳを穏やかに添加する（洗浄）。細胞を再懸濁させる。
８．３分間再び遠心分離する。
９．ＰＢＳを除去し、ビオチン（溶液Ａ）を添加する。細胞を再度懸濁させ、充分にただし穏やかに混合する。
１０．２０分間３７度でインキュベートする（３分毎に撹拌する）。
１１．遠心分離する。
１２．上清を除去し、１．５ｍｌの新鮮培地中で再懸濁させる。
１３．ペトリ皿又は膜に移し、数時間〜一晩インキュベートさせる。
１４．ＰＢＳで１〜２回洗浄する。
１５．１時間溶液Ｂを用いてインキュベートし、可能ならば時々混ぜる。
１６．ＰＢＳで１〜２回洗う。
１７．ＰＢＳを除去し溶液Ｃと交換する。
１８．電子顕微鏡内での観察にとりかかる。
【０２２３】
生きたＮＩＨＴ３細胞。細胞表面タンパク質をビオチニル化し、図１５に示されているように４０ｎｍの金粒子に付着させたストレプトアビジンにリンクさせた。
【０２２４】
当業者であれば、本発明が以上で特定的に示し記述したものに制限されるものではないということがわかるだろう。むしろ、本発明の範囲は、上述のさまざまな特長のコンビネーションおよびサブコンビネーションの両方ならびに、以上の説明を読んだ時点で当業者が思いつき先行技術には無いその変形形態および修正を内含するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、先行技術の走査型電子顕微鏡のサンプル部域の縦断面を示す一般化されたダイヤグラムである。
【図２】
図２は、本発明の１態様に従ったチャンバを内蔵する走査型電子顕微鏡の縦断面である。
【図３】
図３は、本発明の１態様に従ったチャンバの一般化された断面図である。
【図４】
図４は、光導体内に埋込まれた本発明のもう１つの態様に従ったチャンバの一般化された断面図である。
【図５】
図５は、図３の態様を用いて撮られた電子顕微鏡写真である。
【図６】
図６は、螢光用の組立てられたサンプルチャンバユニットのダイヤグラムである。
【図７】
図７Ａ−Ｅは、図６のチャンバの構成要素Ａ−Ｅのダイヤグラムである。
【図７Ａ】
図７Ａは、図６のチャンバの構成要素Ａのダイヤグラムである。
【図７Ｂ】
図７Ｂは、図６のチャンバの構成要素Ｂのダイヤグラムである。
【図７Ｃ】
図７Ｃは、図６のチャンバの構成要素Ｃのダイヤグラムである。
【図７Ｄ】
図７Ｄは、図６のチャンバの構成要素Ｄのダイヤグラムである。
【図７Ｅ】
図７Ｅは、図６のチャンバの構成要素Ｅのダイヤグラムである。
【図８Ａ】
図８Ａは、チャンバと共に使用するための顕微鏡載物台アダプタのダイヤグラムである。
【図８Ｂ】
図８Ｂは、チャンバと共に使用するための顕微鏡載物台アダプタのダイヤグラムである。
【図９】
図９は、（電子）発光用の１変形態様のダイヤグラムである。
【図１０Ａ】
図１０Ａは、仕切り膜の下の定着された湿潤細胞の画像を示す。
【図１０Ｂ】
図１０Ｂは、仕切り膜の下の定着された湿潤細胞の画像を示す。
【図１０Ｃ】
図１０Ｃは、仕切り膜の下の定着された湿潤細胞の画像を示す。
【図１０Ｄ】
図１０Ｄは、仕切り膜の下の定着された湿潤細胞の画像を示す。
【図１０Ｅ】
図１０Ｅは、仕切り膜の下の定着された湿潤細胞の画像を示す。
【図１１Ａ】
図１１Ａは、膜の下の生きた標識付けの無い粘着細胞の画像である。
【図１１Ｂ】
図１１Ｂは、膜の下の生きた標識付けの無い粘着細胞の画像である。
【図１１Ｃ】
図１１Ｃは、膜の下の生きた標識付けの無い粘着細胞の画像である。
【図１１Ｄ】
図１１Ｄは、膜の下の生きた標識付けの無い粘着細胞の画像である。
【図１２】
図１２は、膜の下のまだ標識付けされていないインタクトのＣＨＯ細胞の画像である。
【図１３】
図１３は、膜の下の生きた非粘着細胞の画像である。
【図１４Ａ】
図１４Ａは、定着されたＮＩＨ３Ｔ３細胞の陰極発光画像である。
【図１４Ｂ】
図１４Ｂは、定着されたＮＩＨ３Ｔ３細胞の陰極発光画像である。
【図１４Ｃ】
図１４Ｃは、定着されたＮＩＨ３Ｔ３細胞の陰極発光画像である。
【図１５】
図１５は、インタクトのＮＩＨ３Ｔ３細胞の画像である。

Claims (40)

1. 走査型電子顕微鏡と共に使用するのに適したチャンバにおいて、膜で密封された少なくとも１つのアパーチャを含み、前記膜が真空に耐えるように適合されており、かつ電子に対する透過性を有し、内部が前記真空から隔離されているチャンバ。
2. 水を実質的に大気圧に保つように適合されている請求項１に記載のチャンバ。
3. 前記膜で密封された前記アパーチャが、０．１〜４ｍｍの範囲内の直径を有する、請求項１に記載のチャンバ。
4. 前記膜が、実質的に２００〜５０００Åの範囲内の厚みを有する、請求項１に記載のチャンバ。
5. 前記膜が、ポリイミド、ポリアミド、ポリアミド−イミド、ポリエチレン、ポリピロールおよび付加的な導電性重合体、パルロジオン、コロジオン、カプトン（Ｋａｐｔｏｎ）、フォームバー（Ｆｏｒｍ Ｖａｒ）、ビニレック（Ｖｉｎｙｌｅｃ）、ブトバー（ＢｕｔＶａｒ）、ピロフォーム（Ｐｉｏｌｏｆｏｒｍ）、二酸化ケイ素、一酸化ケイ素および炭素から成るグループの中から選択された材料を含む、請求項１に記載のチャンバ。
6. 膜がポリイミドである、請求項５に記載のチャンバ。
7. 膜の近くに取付けられたサンプルを含む、請求項１に記載のチャンバ。
8. 前記膜と接触して取付けられたサンプルを含む、請求項１に記載のチャンバ。
9. 前記膜が真空の間に設置された支持用格子によって支持されている、請求項１に記載のチャンバ。
10. 流体内にサンプルを封じ込めながら、真空内に設置可能である、請求項１に記載のチャンバ。
11. サンプルを実質的に大気圧で封じ込めながら真空内に設置可能である、請求項１に記載のチャンバ。
12. 前記チャンバの壁の少なくとも一部分が、１気圧の圧力勾配に対する耐性をもち、２ｋｅＶを超えるエネルギーをもつ電子に対する透過性をもつ、走査型電子顕微鏡と共に使用するためのチャンバ。
13. 電子ビーム用の真空通路および物体と結びつけて設置された真空耐性バリヤを含んで成り、前記真空耐性バリヤが、真空から物体を隔離するように設置されている、走査型電子ビームを用いたチャンバ内の物体の高解像度検査のための器具。
14. 物体が螢光および電子発光マーカーを含むグループのうちの１つを含み、かくして電子ビームは光電子放射を励起することができる、請求項１３に記載の器具。
15. 光検知ユニットを更に含む、請求項１３に記載の器具。
16. 前記チャンバが、光導体の一部分を含む、請求項１３に記載の器具。
17. 前記光検知ユニットが光電子増倍管を含む、請求項１５に記載の器具。
18. 前記光検知ユニットが個々の光子を検知するように適合されており、かくして単一の分子の刺激の結果として得られる光放出を検知するように適合されている請求項１５に記載の器具。
19. バリヤには、高い二次電子収量をもつ材料の少なくとも１つの層がコーティングされている請求項１３に記載の器具。
20. バリヤが、最高１気圧の圧力勾配に耐えるように適合されている、請求項１３に記載の器具。
21. 前記バリヤが膜である、請求項１３に記載の器具。
22. 前記膜がポリイミド、ポリアミド、ポリアミド−イミド、ポリエチレン、ポリピロールおよび付加的な導電性重合体、パルロジオン、コロジオン、カプトン、フォームバー、ビニレック、ブトバー、ピロフォーム、二酸化ケイ素、一酸化ケイ素および炭素から成るグループの中から選択された材料を含む、請求項２１に記載の器具。
23. 膜がポリイミドである、請求項２２に記載の器具。
24. 前記膜が、前記膜と前記真空の間に設置された補強用格子で補強されている、請求項２１に記載の器具。
25. 前記膜が、実質的に２００〜５０００Åの範囲内にある厚みを有する、請求項２１に記載の器具。
26. 前記厚みが５００〜１５００Åの範囲内にある、請求項２５に記載の器具。
27. 前記バリヤが、実質的に０．１〜４ｍｍの範囲内の直径をもつアパーチャを横断して設置されている、請求項１３に記載の器具。
28. 前記直径が実質的に１ｍｍである、請求項２７に記載の器具。
29. 前記バリヤが、エネルギー電子に対する透過性を有する、請求項１３に記載の器具。
30. 前記バリヤが、２ｋｅＶを超えるエネルギーをもつ電子に対する透過性を有する、請求項１３に記載の器具。
31. 前記バリヤが、３ｋｅＶを超えるエネルギーをもつ電子に対する透過性を有する、請求項１３に記載の器具。
32. 前記バリヤには、高い２次電子収量をもつ材料の層がコーティングされている、請求項１３に記載の器具。
33. 高い２次電子収量をもつ前記材料がフッ化リチウムである、請求項３２に記載の器具。
34. スカベンジャ分子が、前記物体と結びつけて位置設定されている、請求項１３に記載の器具。
35. 物体が前記真空耐性バリヤと接触した状態で設置される、請求項１３に記載の器具。
36. バリヤを用いて真空チャンバからそのチャンバを分離することにより１つのチャンバ内の湿潤物体を隔離する段階、前記真空チャンバから前記バリヤを通して前記サンプルを打撃するべく電子ビームを提供する段階および、前記チャンバから出現する２次電子および後方散乱電子のうちの少なくとも１つを観察する段階を含む、ナノメートル範囲の解像度で湿潤物体を観察する方法。
37. 前記バリヤが、実質的に１気圧の圧力に耐え、２ｋｅＶを超えるエネルギーをもつ電子に対する透過性をもつように選択されている膜を含む、請求項３６に記載の方法。
38. 湿潤物体が医薬組成物を含む、請求項３６に記載の方法。
39. 湿潤物体が更に、医薬組成物と相互作用する生きた細胞を含む、請求項３８に記載の方法。
40. 前記チャンバが流体入口を含み、医薬組成物が、観察中動的に入口を通して、濃度およびタイプを含むグループのうちの１つに関して変更される、請求項３８に記載の方法。

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