WO2014167787A1 - 走査電子顕微鏡用試料ホルダ、走査電子顕微鏡像の観察システム、および走査電子顕微鏡像の観察方法 - Google Patents

走査電子顕微鏡用試料ホルダ、走査電子顕微鏡像の観察システム、および走査電子顕微鏡像の観察方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an observation technique using a scanning electron microscope. More specifically, the present invention relates to a scanning electron microscope observation technique that can observe a biological sample as it is.
  • Scanning electron microscopes are widely used as tools for observing biological samples and organic materials with high resolution.
  • a biological sample or an organic material is observed with a scanning electron microscope, in order to reduce electron beam damage of the observation target sample and obtain a high contrast image, the sample is fixed on the surface after being fixed with formaldehyde or the like.
  • Treatments such as coating with gold, platinum, carbon, etc., or dyeing with heavy metals have been essential.
  • Patent Document 1 discloses a method for observing biological samples with high contrast without coating or staining.
  • Patent Document 1 discloses a method for observing biological samples with high contrast without coating or staining.
  • a sample is attached to the lower surface of a thin sample support film such as a carbon film, and an electron beam with an acceleration voltage lower than that of the upper part of the sample support film is irradiated.
  • the irradiated electron beam spreads while diffusing inside the sample support film, reaches near the lower surface of the film, and secondary electrons are emitted from the lower surface of the sample support film.
  • the secondary electrons are absorbed by the sample directly under the sample support film, and thereby an extremely high contrast image can be obtained.
  • a method for further improving the resolution and contrast has been developed by further developing such an observation technique, forming a conductive film under the insulating thin film layer, and utilizing the charging effect by electron beam incidence (Patent Literature). 2 and Non-Patent Document 2).
  • JP 2010-097844 A Patent No. 5115997
  • Non-Patent Document 3 Currently, dedicated holders (see Non-Patent Document 3) for observing biological samples in aqueous solutions and electron microscope systems capable of observing biological samples under atmospheric pressure have been developed. Even with these techniques, damage to biological samples by electron beams is serious, and because the interaction between electron beams and biological samples is extremely weak, observe biological samples in aqueous solutions with high contrast while they are alive. It is extremely difficult.
  • the image observed under the above-mentioned “indirect secondary electron contrast condition” has the problem that the resolution is relatively low, while having the advantage of extremely high contrast. Furthermore, normally, it is difficult for low-energy secondary electrons to pass through an aqueous solution having a thickness (depth) of several ⁇ m or more, and thus it is difficult to observe a biological sample in the aqueous solution.
  • the present invention has been made in view of such a problem, and the object of the present invention is to increase a biological sample in a living state using a scanning electron microscope without performing a staining process or an immobilization process.
  • An object of the present invention is to provide a scanning electron microscope observation technique that enables observation with high resolution and high contrast.
  • a sample holder for a scanning electron microscope has a first insulating thin film whose one main surface is a holding surface of an observation sample and the other main surface of the first insulating thin film.
  • the first insulating thin film formed on the one main surface side of the first insulating thin film due to the electron beam incident from the conductive thin film side.
  • a terminal portion for detecting a signal based on the potential of the main surface is provided.
  • a second insulating thin film is provided between one main surface of the first insulating thin film and the terminal portion, and the one main surface of the second insulating thin film and the first insulating film are provided.
  • the one main surface of the conductive thin film is disposed so as to have a gap of a predetermined distance, and the terminal portion detects the potential of the other main surface of the second insulating thin film as a signal.
  • the thickness of the first insulating thin film is 200 nm or less.
  • the first insulating thin film is made of a silicon nitride film, a carbon film, or a polyimide film.
  • the thickness of the conductive thin film is 100 nm or less.
  • the conductive thin film is a metal thin film mainly composed of a metal having a specific gravity of 10 g / cm 3 or more.
  • the metal thin film contains tantalum, tungsten, rhenium, molybdenum, osmium, gold, or platinum as a main component.
  • an interval between the one main surface of the first insulating thin film and the one main surface of the second insulating thin film can be set to 40 ⁇ m or less.
  • the sample holder for a scanning electron microscope includes an outer frame portion that seals the inside, and the outer frame portion is provided with an internal pressure adjusting mechanism.
  • the sample holder for a scanning electron microscope perfuses an aqueous solution into a gap having a predetermined interval between one main surface of the second insulating thin film and one main surface of the first insulating thin film.
  • a flow path is provided for this purpose.
  • the scanning electron microscope image observation system includes a scanning electron microscope, the above-mentioned scanning electron microscope sample holder set in the scanning electron microscope, and the first insulating property detected by the terminal portion. And an arithmetic unit that processes a signal based on a potential of one main surface of the thin film or a potential signal of the other main surface of the second insulating thin film as an output signal.
  • the arithmetic unit processes the output signal, extracts a signal component having an intensity change frequency from the output signal, and forms an image based on the extracted signal component having the intensity change frequency.
  • extraction of the signal component of the intensity change frequency is performed by any one of a bandpass filter method, a lock-in amplifier method, an autocorrelation analysis method, and a Fourier transform analysis method.
  • a plurality of the terminal portions are provided at different positions, and the arithmetic unit forms an image for each signal component of the intensity change frequency extracted from each of the plurality of terminal portions, and the incident position of the electron beam and the terminal.
  • the inclination angle of the image is obtained from the relationship with the position where the part is provided, the image is corrected based on the inclination angle, and the three-dimensional structure information of the observation sample is analyzed based on the corrected images.
  • the scanning electron microscope image observation method uses the above-described scanning electron microscope image observation system, and performs observation in a state where the conductive thin film is at a ground potential or a predetermined potential of the scanning electron microscope.
  • the scanning electron microscope image observation method uses the above-mentioned scanning electron microscope image observation system, and the acceleration voltage of the incident electron beam is substantially equal to the incident insulating film. Set the voltage so that it does not pass through.
  • the scanning electron microscope image observation method uses the above-mentioned scanning electron microscope image observation system, and performs observation while setting the acceleration voltage of the incident electron beam to 10 kV or less.
  • the scanning electron microscope image observation method uses the above-described scanning electron microscope image observation system, turns on and off the incident electron beam at a frequency of 1 kHz or more, and sets the extracted intensity change frequency. Set to 1 kHz or higher and observe.
  • the observation sample is supported together with the aqueous solution on one main surface of the first insulating thin film using the above-described scanning electron microscope image observation system. Observe the state.
  • the present invention it is possible to observe a biological sample in an aqueous solution with an extremely high contrast simply and without performing a staining treatment or an immobilization treatment.
  • the sample is not damaged by the electron beam, it is possible to know the original form and structure of organic materials that are susceptible to damage, including biological samples such as cells, bacteria, viruses, and protein complexes. It becomes.
  • FIG. 4A is a diagram for conceptually explaining a mechanism in which a signal is detected at a terminal portion when an electron beam whose intensity changes in a rectangular wave shape is incident on the sample holder according to the present invention.
  • FIG. 4A is a diagram for conceptually explaining a mechanism in which a signal is detected at a terminal portion when an electron beam whose intensity changes in a rectangular wave shape is incident on the sample holder according to the present invention.
  • FIG. 4B shows a state where the electron beam is blocked by the diaphragm and is not incident (OFF state). It is a figure for demonstrating notionally the mechanism in which a signal is detected by a terminal part when an electron beam is irradiated to the biological sample which is an observation sample. It is an observation image obtained by accommodating and observing bacteria dissolved in an aqueous solution in a sample holder for a scanning electron microscope according to the present invention.
  • FIG. 7A is an observation image obtained by accommodating and observing yeast dissolved in an aqueous solution in the sample holder for a scanning electron microscope according to the present invention, and FIG. 7A shows the ON / OFF frequency of the incident electron beam.
  • FIGS. 10A to 10C are a perspective view, a top view, and a cross-sectional view, respectively.
  • FIG. 1 is a block diagram for explaining a configuration example of a scanning electron microscope image observation system according to the present invention.
  • the system includes a scanning electron microscope 100, a scanning electron microscope sample holder 200 set in the scanning electron microscope 100, a function generator 300, a lock-in amplifier 400, data A recorder 500 and a PC 600 as an arithmetic device are provided.
  • the scanning electron microscope 100 is provided with a beam blanking device 103 for controlling the irradiation intensity of the electron beam 102 emitted from the electron gun 101 to the observation sample.
  • the beam blanking device 103 is for obtaining a change in the intensity of the incident electron beam on the observation sample, and an ON / OFF signal having a frequency of, for example, 1 kHz or more from the function generator 300 provided outside the mirror body has a rectangular wave shape. Input as a control signal. Also.
  • the function generator 300 outputs a reference signal (reference signal) to the lock-in amplifier 400.
  • the electron beam 102 emitted from the electron gun 101 travels straight, and all of the electron beam 102 passes through the diaphragm 104 and is stored in the sample holder 200. (Not shown).
  • the control signal is a positive potential
  • an electric field is generated in the beam blanking device 103
  • the electron beam is bent by the Coulomb force, shielded by the diaphragm 104, and the electron beam incident on the observation sample is turned OFF.
  • the control signal is zero potential
  • the electron beam passes through the diaphragm 104 and is irradiated onto the observation sample.
  • the frequency of the control signal at this time is preferably 1 kHz or more, and is generally set in the range of 20 to 100 kHz here.
  • the intensity of the electron beam applied to the observation sample (not shown) accommodated in the sample holder 200 by the control signal input from the function generator 300 changes at the same frequency as the control signal.
  • a signal based on a potential generated due to the incidence of the electron beam is generated in the sample holder 200 for the reason described later.
  • This signal is detected by the terminal unit 210 provided at the lower part of the sample holder 200, amplified by the amplifier 105, and output to the lock-in amplifier 400 as a measurement signal. That is, the lock-in amplifier 400 receives the reference signal from the function generator 300 and the measurement signal from the amplifier 105.
  • the lock-in amplifier 400 extracts only the frequency component of the reference signal of the function generator 300 from the measurement signal using the reference signal, and transmits this to the data recorder 500 as an output signal.
  • the PC 600 as an arithmetic unit processes the above-described output signal, extracts a signal component of the intensity change frequency from the output signal, and based on the extracted signal component of the intensity change frequency, an image according to the scanning signal of the electron beam.
  • the extraction of the signal component of the intensity change frequency described above can be performed by a technique such as a bandpass filter method, a lock-in amplifier method, an autocorrelation analysis method, a Fourier transform analysis method, or the like.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view for explaining a configuration example of a sample holder for a scanning electron microscope according to the present invention.
  • the sample holder 200 includes a first insulating thin film 203 whose one main surface is a holding surface of the observation sample 10, and a conductive thin film 201 laminated on the other main surface of the first insulating thin film 203. ing.
  • This laminate has a pressure resistance enough to withstand observation in a vacuum. That is, the atmospheric pressure state can be maintained in the holder even in the electron microscope.
  • the one main surface side of the first insulating thin film 203 is based on the potential of the one main surface of the first insulating thin film 203 generated due to the electron beam 102 incident from the conductive thin film 201 side.
  • a terminal portion 210 for detecting a signal is provided.
  • a second insulating thin film 204 is provided between one main surface of the first insulating thin film 203 and the terminal portion 210, and the second insulating thin film 204
  • the main surface and one main surface of the first insulating thin film 203 are arranged so as to have a gap of a predetermined interval. Therefore, in the case of this configuration, the terminal unit 210 detects the potential of the other main surface of the second insulating thin film 204 as a signal.
  • the terminal portion 210 is provided in a state of being electrically insulated from the first insulating thin film 203 and the second insulating thin film 204 as the sample support film and separated from them.
  • the second insulating thin film 204 is not essential. For example, if the observation sample can be dissolved in an extremely thin water layer, the observation sample is held by the surface tension. Even without the insulating thin film 204, a signal based on the potential of one main surface of the first insulating thin film 203 can be detected by the terminal portion 210.
  • the observation sample 10 may be a biological sample in the aqueous solution 20 and is enclosed between the first insulating thin film 203 and the second insulating thin film 204, and the inside is surrounded by the conductive packing 206 and the O-ring 207. It is housed in a sealed conductive outer frame portion 208. That is, it is possible to observe the biological sample together with the aqueous solution.
  • the outer frame portion 208 may be provided with a mechanism for adjusting the internal pressure.
  • Reference numeral 209 denotes an insulating member for insulating the terminal portion 210 from the outer frame portion 208, and reference numerals 202 and 205 denote frame portions provided for the purpose of maintaining strength.
  • Reference numeral 30 denotes a diffusion region of the incident electron beam 201.
  • the packing 206 and the outer frame portion 208 are both conductive, and the conductive thin film 201 is set to the ground potential of the scanning electron microscope 100, and observation is performed in this state. Note that the observation may be performed with the conductive thin film 201 at a predetermined potential instead of the ground potential.
  • the acceleration voltage of the electron beam 102 emitted from the electron gun 101 is preferably set to a voltage at which the incident electron beam hardly transmits the first insulating thin film 203. Specifically, it is preferable to set the acceleration voltage such that the incident electron beam is substantially scattered or absorbed inside the conductive thin film 201. With such a voltage setting, primary electrons are hardly transmitted to the first insulating thin film 203 side, and electron beam damage to the observation sample 10 can be completely prevented.
  • the acceleration voltage of the incident electron beam is set to 10 kV or less, the above condition is realized.
  • the thickness of the first insulating thin film 203 be 200 nm or less.
  • Examples of the material of the first insulating thin film 203 include a silicon nitride film, a carbon film, and a polyimide film.
  • the thickness of the conductive thin film 201 be 100 nm or less.
  • the conductive thin film 201 is preferably a metal thin film whose main component is a metal having a specific gravity of 10 g / cm 3 or more. This is to efficiently suppress the shielding property of the electron beam and the internal diffusion of incident electrons.
  • a metal thin film include those containing tantalum, tungsten, rhenium, molybdenum, osmium, gold, or platinum as a main component.
  • FIG. 3 shows scattering when an electron beam having an acceleration voltage of 3 kV is made incident on a nickel / tungsten laminated film in which nickel of 5 nm thickness and tungsten of 20 nm thickness are laminated on a silicon nitride thin film having a thickness of 50 nm. It is the result of having calculated the state by Monte Carlo simulation.
  • interval can be set to 40 micrometers or less.
  • the observation sample 10 is accommodated in such a sample holder 200, the electron beam 102 is incident while being turned ON / OFF at a frequency of 1 kHz or more, and the intensity change frequency extracted by the lock-in amplifier 400 is the frequency of the electron beam 102. Set to (1 kHz or higher) and observe.
  • FIG. 4 is a diagram for conceptually explaining a mechanism in which a signal is detected by the terminal portion 210 when the electron beam 102 whose intensity changes in a rectangular wave shape is incident on the sample holder 200 according to the present invention.
  • 4 (a) shows a state where an electron beam is incident (ON state)
  • FIG. 4 (b) shows a state where the electron beam is blocked by a diaphragm and is not incident (OFF state).
  • aqueous solution 20 in which the observation sample 10 is dissolved is sandwiched between the first insulating thin film 203 provided under the conductive thin film 201. Since the water molecules themselves in the aqueous solution 20 are polarized, when the electron beam incident site is negatively charged, the electric dipoles of the water molecules are arranged along the potential gradient. Due to this electric dipole arrangement, electric charges are also generated on the surface of the second insulating thin film 204 below the aqueous solution 20. This electric charge is detected by the terminal portion 210 as a potential signal generated on the main surface of the second insulating thin film 204 and becomes a measurement signal.
  • a signal having the same frequency component can be extracted from the terminal unit 210.
  • FIG. 5 is a diagram for conceptually explaining a mechanism in which a signal is detected by the terminal portion 210 when the biological sample that is the observation sample 10 is irradiated with the electron beam 102.
  • the dielectric constant of water molecules is as large as about 80, if a potential change occurs on one main surface of the first insulating thin film 203, it can be used as a signal having a strong propagation force in the aqueous solution 20.
  • the dielectric constant of the biological sample 10 is generally low, for example, the dielectric constant of protein is 2 to 3, the propagation force of the potential change signal in the biological sample is weak. Therefore, high contrast can be obtained by such a large difference in dielectric constant (difference in propagation force).
  • the resolution of an image obtained by observation substantially depends on the irradiation diameter of the electron beam. For this reason, if the irradiation diameter of the electron beam is narrowed down to about 1 nm, it is possible to achieve substantially the same resolution (1 nm). As a result, biological samples made of bacteria, viruses, proteins, or protein complexes can be observed in a living state with high resolution and high contrast.
  • FIG. 6 is an observation image obtained by accommodating and observing the bacteria 10 dissolved in the aqueous solution 20 in the scanning electron microscope sample holder 200 according to the present invention.
  • the acceleration voltage of the electron beam during observation is 3 kV, and the ON / OFF frequency of the incident electron beam is 30 kHz.
  • the first insulating thin film 203 as the sample support film is a silicon nitride film having a thickness of 50 nm, and as shown in FIG. 3, nickel having a thickness of 5 nm and tungsten having a thickness of 20 nm are formed on the upper part.
  • a thin conductive film 201 is formed.
  • the aqueous solution sample was sandwiched between the first insulating thin film 203 and the second insulating thin film 204 having a thickness of 50 nm, and a terminal portion 210 was provided with a gap below the second insulating thin film 204. .
  • FIG. 7 is an observation image obtained by accommodating and observing the yeast 10 dissolved in the aqueous solution 20 in the scanning electron microscope sample holder 200 according to the present invention
  • FIG. FIG. 7B shows an observation image when the ON / OFF frequency of the line is 30 kHz
  • FIG. 7B is an observation image when the ON / OFF frequency of the incident electron beam is 80 kHz. Note that the acceleration voltage of the electron beam during observation is 3 kV.
  • FIG. 8 shows a scanning electron microscope image observation system configuration example in which a plurality of terminal portions 210a to 210c are provided at different positions.
  • a plurality of amplifiers 105a to 105c and lock-in amplifiers 400a to 400c are also provided.
  • the arithmetic unit forms an image for each signal component of the intensity change frequency extracted from each terminal portion, and obtains the inclination angle of the image from the relationship between the incident position of the electron beam and the position where the terminal portion is provided.
  • the image (tilt image) is corrected based on the tilt angle, and the three-dimensional structure information of the observation sample is analyzed based on the corrected plurality of images.
  • an inclined image from the terminal portion 105a provided on the left side an inclined image from the terminal portion 105c provided on the right side, and a center at a position where the observation sample is observed from the front.
  • An inclined image from the terminal portion 105b can be obtained by a single observation.
  • These three images are constructed as a three-dimensional image using a three-dimensional reconstruction algorithm according to the inclination angle of each image.
  • FIG. 9 is a view for explaining an example of the structure of the sample holder 200 in which the outer frame portion 208 is provided with a mechanism for adjusting the internal pressure.
  • FIG. 9A is a view under atmospheric pressure.
  • FIG. 9B illustrates a state in a vacuum (inside the microscope).
  • the pressure reducing film 211 is used as a pressure adjusting mechanism, which is provided on the lower surface side of the outer frame portion 208.
  • the decompression film 211 of the sample holder 200 swells outward in the microscope body, and the pressure in the holder decreases.
  • the conductive thin film 201 side also curves outward, but the degree of curvature is relaxed by the effect of the decompression film 211.
  • the region below the second insulating thin film 204 is sealed with an O-ring 207 and maintains atmospheric pressure. Therefore, the second insulating thin film 204 is curved upward rather than downward, and a gap between one main surface of the first insulating thin film 203 and one main surface of the second insulating thin film 204 is widened. Thus, the holding of the observation sample 10 is not hindered.
  • a flow path for irrigating the aqueous solution is formed in a gap at a predetermined interval between one main surface of the first insulating thin film 203 and one main surface of the second insulating thin film 204.
  • a plurality of types of solutions may be enclosed in the sample holder 200, and observation may be performed while switching the solutions.
  • FIGS. 10A to 10C are a perspective view, a top view, and a cross-sectional view, respectively, showing an example of a partial configuration of the sample holder 200.
  • the outer frame portion 208 of the sample holder 200 has an upper portion 208a and a lower portion 208b.
  • injection holes 213 corresponding to the three flow paths 212 are formed, and the solution introduced into these flow paths 212 is subjected to the action of surface tension to cause the second insulating thin film 204 to be formed.
  • the first main surface of the first insulating thin film 203 is introduced into a gap at a predetermined interval.
  • a damper 214 as a pressure application unit for extruding the solution from the injection hole 213 is provided on the side of the sample holder 200, and a pressure application valve 215 is provided at the tip of the damper 214. Yes.
  • the present invention it is possible to observe a biological sample in an aqueous solution with an extremely high contrast simply and without performing a staining treatment or an immobilization treatment.
  • the sample is not damaged by the electron beam, it is possible to know the original form and structure of organic materials that are susceptible to damage, including biological samples such as cells, bacteria, viruses, and protein complexes. It becomes.

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  • Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)

Abstract

　導電性薄膜（２０１）の下に設けられた第１の絶縁性薄膜（２０３）側には、観察試料（１０）が溶解等された水溶液（２０）が挟み込まれている。電子線入射部位がマイナスに帯電すると、水分子の電気双極子が電位勾配に添って配列し、第２の絶縁性薄膜（２０４）の面にも電荷が生じる。この電荷は端子部（２１０）により検出されて測定信号となる。電子線（１０２）が遮蔽された状態では、上述のマイナス電位は消失する。これにより第１の絶縁性薄膜（２０３）表面の電荷も消失し、端子部（２１０）から出力される測定信号も０となる。このような電子線のＯＮ／ＯＦＦを１ｋＨｚ以上の周波数で繰り返すことにより、端子部（２１０）からこれと同様の周波数成分の信号を抽出することができる。

Description

走査電子顕微鏡用試料ホルダ、走査電子顕微鏡像の観察システム、および走査電子顕微鏡像の観察方法
　本発明は走査電子顕微鏡による観察技術に関する。より詳細には、生物試料を生きたままの状態で観察することも可能な走査電子顕微鏡観察技術に関する。
　走査電子顕微鏡は、生物試料や有機材料を高分解能で観測する際のツールとして広く用いられている。従来、走査電子顕微鏡で生物試料や有機材料を観察する場合には、観察対象試料の電子線ダメージを低下させ、コントラストの高い画像を得るために、試料をホルムアルデヒド等で固定化した後に、表面に金やプラチナ、カーボン等をコーティングしたり、あるいは、重金属による染色を施す等の処理が必須とされていた。
　しかし、近年、生物試料をコーティングや染色なしに高コントラストで観察できる方法が開発された（特許文献１および非特許文献１を参照）。
　この新規な方法では、カーボン膜などの薄い試料支持膜の下部表面に試料を付着させ、この試料支持膜の上部より低い加速電圧の電子線を照射する。照射された電子線は試料支持膜の内部で拡散しながら広がり、膜の下面付近に到達し、試料支持膜の下部表面より２次電子が放出される。この２次電子は、試料支持膜直下の試料に吸収され、これにより極めて高いコントラスの画像を得ることができる。
　この方法では、上述の２次電子のエネルギが１０ｅＶ程度となるように条件設定される。かかる極めて弱い２次電子であれば、観察対象試料に対する電子線ダメージは顕著に低くなるため、生物試料のような損傷を受けやすい試料であっても、試料本来の形状や構造を高いコントラストの画像で観察乃至解析することが可能となる。こうした観察条件は、「間接２次電子コントラスト条件」と呼ばれる。
　このような観察手法をさらに進展させ、絶縁薄膜層の下部に導電性膜を形成し、電子線入射による帯電効果を利用して、分解能やコントラストをさらに向上させる方法も開発されている（特許文献２および非特許文献２を参照）。
特開２０１０－０９７８４４号公報 特許第５１１５９９７号明細書
　現在では、水溶液中の生物試料の観察を可能とするための専用ホルダ（非特許文献３を参照）や、大気圧下での生物試料観察が可能な電子顕微鏡システムも開発されてきているが、これらの手法でも電子線による生物試料へのダメージは深刻であり、しかも、電子線と生物試料との相互作用が極めて弱いため、水溶液中の生物試料を生きた状態のままで高いコントラストで観察することは極めて困難である。
　このような事情から、生物試料を鮮明に観察するためには、様々な染色処理や固定化処理を施し、電子線のダメージを低減させるとともに、観察画像のコントラストを向上させる必要がある（非特許文献３）。
　しかし、このような処理を施すと、観察対象である生物試料は死滅してしまい、生きている状態での観察はできなくなる。しかも、染色処理等に伴う様々なアーティファクが生じ、観察で得られた画像の信頼性も損なわれる。加えて、こうした染色処理等は熟練の技術を必要とするだけでなく、染色剤としては主に酢酸ウラン等の有害物質が用いられるため、環境保護という観点からも好ましくない。
　上述の「間接２次電子コントラスト条件」で観察された画像は、コントラストが極めて高いという利点の反面、分解能が比較的低いという問題がある。さらに、通常、低エネルギの２次電子では、数μｍ以上の厚さ（深さ）の水溶液を透過させることが困難なため、この水溶液中にある生物試料を観察することは難しい。
　このように、従来の観察技術では、水溶液中の生物試料を生きたままの状態で観察し、本来の形態や構造を正しく反映した高い分解能の画像を得ることが極めて困難である。
　本発明はこのような問題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、染色処理や固定化処理を施すことなく、走査電子顕微鏡を用いて生物試料を生きたままの状態で高分解能・高コントラストで観察することを可能とする走査電子顕微鏡観察技術を提供することにある。
　かかる課題を解決するために、本発明に係る走査電子顕微鏡用試料ホルダは、一方主面が観察試料の保持面である第１の絶縁性薄膜と該第１の絶縁性薄膜の他方主面に積層された導電性薄膜とを備え、前記第１の絶縁性薄膜の一方主面側には、前記導電性薄膜側から入射された電子線に起因して生じた前記第１の絶縁性薄膜の一方主面の電位に基づく信号を検出する端子部が設けられている。
　例えば、前記第１の絶縁性薄膜の一方主面と前記端子部との間に第２の絶縁性薄膜が設けられており、該第２の絶縁性薄膜の一方主面と前記第１の絶縁性薄膜の一方主面とが所定の間隔の隙間を有するように配置されており、前記端子部は、前記第２の絶縁性薄膜の他方主面の電位を信号として検出する。
　好ましくは、前記第１の絶縁性薄膜の厚さが２００ｎｍ以下である。
　例えば、前記第１の絶縁性薄膜は、窒化シリコン膜、カーボン膜、若しくは、ポリイミド膜からなる。
　好ましくは、前記導電性薄膜の厚さが１００ｎｍ以下である。
　また、好ましくは、前記導電性薄膜は、比重が１０ｇ／ｃｍ３以上の金属を主成分とする金属薄膜である。
　例えば、前記金属薄膜は、タンタル、タングステン、レニウム、モリブデン、オスミウム、金、プラチナのうちの何れかを主成分とする。
　好ましくは、前記第１の絶縁性薄膜の一方主面と前記第２の絶縁性薄膜の一方主面との間の間隔を４０μｍ以下に設定し得る。
　また、好ましくは、前記走査電子顕微鏡用試料ホルダは、内部を密閉する外枠部を備え、該外枠部には内部圧力の調整機構が設けられている。
　さらに、好ましくは、前記走査電子顕微鏡用試料ホルダは、前記第２の絶縁性薄膜の一方主面と前記第１の絶縁性薄膜の一方主面との間の所定間隔の隙間に、水溶液を潅流させるための流路が設けられている。
　本発明に係る走査電子顕微鏡像の観察システムは、走査電子顕微鏡と、該走査電子顕微鏡内にセットされる上述の走査電子顕微鏡用試料ホルダと、前記端子部により検出された前記第１の絶縁性薄膜の一方主面の電位に基づく信号若しくは前記第２の絶縁性薄膜の他方主面の電位信号を出力信号として処理する演算装置とを備えている。
　好ましくは、前記演算装置は、前記出力信号を処理して、該出力信号から強度変化周波数の信号成分を抽出し、該抽出された強度変化周波数の信号成分に基づいて画像を形成する。
　例えば、前記強度変化周波数の信号成分の抽出は、バンドパスフィルタ法、ロックインアンプ法、自己相関解析法、フーリエ変換解析法の何れかの方法で行われる。
　好ましくは、前記端子部を複数個異なる位置に設け、前記演算装置は、前記複数の端子部のそれぞれから抽出される強度変化周波数の信号成分ごとに画像を形成し、電子線の入射位置と端子部が設けられている位置との関係から前記画像の傾斜角度を求め、該傾斜角度にもとづいて前記画像に補正を行い、補正後の複数の画像に基づいて観察試料の３次元構造情報を解析する。
　本発明に係る走査電子顕微鏡像の観察方法は、上述の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記導電性薄膜を前記走査電子顕微鏡のグランド電位若しくは所定の電位とした状態で観察を行う。
　また、本発明に係る走査電子顕微鏡像の観察方法は、上述の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記入射電子線の加速電圧を、該入射電子線が前記第１の絶縁性薄膜をほぼ透過しない電圧に設定して観察を行う。
　また、本発明に係る走査電子顕微鏡像の観察方法は、上述の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記入射電子線の加速電圧を１０ｋＶ以下に設定して観察を行う。
　また、本発明に係る走査電子顕微鏡像の観察方法は、上述の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記入射電子線を１ｋＨｚ以上の周波数でオン／オフし、前記抽出される強度変化周波数を１ｋＨｚ以上に設定して観察を行う。
　さらに、本発明に係る走査電子顕微鏡像の観察方法は、上述の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記第１の絶縁性薄膜の一方主面に、水溶液と一緒に観察試料を支持させた状態で観察を行う。
　本発明により、水溶液中の生物試料を、簡便に、しかも、染色処理や固定化処理を施すことなく、極めて高いコントラストで観察することが可能となる。加えて、電子線による試料へのダメージも生じないため、細胞やバクテリア、ウイルス、タンパク質複合体等の生物試料をはじめ、ダメージを受けやすい有機材料についても、本来の形態や構造を知ることが可能となる。
本発明に係る走査電子顕微鏡像の観察システムの構成例を説明するためのブロック図である。 本発明に係る走査電子顕微鏡用試料ホルダの構成例を説明するための断面概略図である。 厚みが５０ｎｍの窒化シリコン薄膜の上部に、厚さ５ｎｍのニッケルと厚さ２０ｎｍのタングステンを積層させ、ニッケル／タングステンの積層膜に電子線を入射させた際の散乱状態を、モンテカルロシミュレーションにより計算した結果である。 本発明に係る試料ホルダに、矩形波状に強度変化する電子線が入射した際に、端子部で信号が検出されるメカニズムを概念的に説明するための図で、図４（ａ）は電子線が入射する状態（ＯＮ状態）、図４（ｂ）は電子線が絞りで遮られて入射しない状態（ＯＦＦ状態）を示している。 電子線が観察試料である生物試料に照射された場合の、端子部で信号が検出されるメカニズムを概念的に説明するための図である。 本発明に係る走査電子顕微鏡用試料ホルダ内に、水溶液中に溶解させたバクテリアを収容して観察して得られた観察画像である。 本発明に係る走査電子顕微鏡用試料ホルダ内に、水溶液中に溶解させた酵母を収容して観察して得られた観察画像であり、図７（ａ）は入射電子線のＯＮ／ＯＦＦ周波数が３０ｋＨｚの場合の観察画像、図７（ｂ）は入射電子線のＯＮ／ＯＦＦ周波数が８０ｋＨｚの場合の観察画像である。 端子部を複数個異なる位置に設けた態様の走査電子顕微鏡像の観察システム構成例である。 外枠部に内部の圧力を調整するための機構を設けた態様の試料ホルダの構造を説明するための図である。 第２の絶縁性薄膜の一方主面と第１の絶縁性薄膜の一方主面との間の所定間隔の隙間に、水溶液を潅流させるための流路が設けられている試料ホルダの構成例で、図１０（ａ）～（ｃ）はそれぞれ、斜視図、上面図、断面図である。
　以下に、図面を参照して、本発明を実施するための形態について説明する。
　図１は、本発明に係る走査電子顕微鏡像の観察システムの構成例を説明するためのブロック図である。
　この図に示した例では、当該システムは、走査電子顕微鏡１００と、この走査電子顕微鏡１００の内部にセットされる走査電子顕微鏡用試料ホルダ２００と、ファンクションジェネレータ３００と、ロックインアンプ４００と、データレコーダ５００と、演算装置としてのＰＣ６００を備えている。
　走査電子顕微鏡１００には、電子銃１０１から射出された電子線１０２の観察試料への照射強度を制御するためのビームブランキング装置１０３が設けられている。ビームブランキング装置１０３は、観察試料への入射電子線の強度変化を得るためのもので、鏡体外に設けられたファンクションジェネレータ３００から、例えば、１ｋＨｚ以上の周波数のＯＮ／ＯＦＦ信号が矩形波状の制御信号として入力される。また。ファンクションジェネレータ３００は、ロックインアンプ４００に対し、リファレンス信号（参照信号）を出力する。
　ファンクションジェネレータ３００からＯＦＦの制御信号が入力されると、電子銃１０１から射出された電子線１０２は直進し、その全てが絞り１０４を透過して、試料ホルダ２００内に収容されている観察試料（不図示）に照射される。
　一方、ファンクションジェネレータ３００からＯＮの制御信号が入力されると、ビームブランキング装置１０３の近傍に電界が生じ、電子銃１０１から射出された電子線１０２はその軌道が曲げられ、その全て（若しくは一部）が絞り１０４により遮られる。
　その結果、制御信号がプラス電位の時は、ビームブランキング装置１０３に電界が生じ、電子線がクーロン力により曲げられて絞り１０４により遮蔽されて観察試料に入射する電子線はＯＦＦとなる一方、制御信号がゼロ電位の時は、電子線は絞り１０４を通過して観察試料に照射される。
　こうした制御信号によるＯＮ／ＯＦＦを繰り返すことで、観察試料へ照射される電子線の強度が変化する。このときの制御信号の周波数は１ｋＨｚ以上であることが好適であり、ここでは一般には、２０～１００ｋＨｚの範囲で設定する。
　つまり、ファンクションジェネレータ３００から入力される制御信号により、試料ホルダ２００内に収容されている観察試料（不図示）に照射される電子線強度は、制御信号と同じ周波数で変化することとなる。
　試料ホルダ２００内に収容されている観察試料に電子線が照射されると、後述する理由により、試料ホルダ２００内で、電子線の入射に起因して生じる電位に基づく信号が生成する。この信号は、試料ホルダ２００の下部に設けられた端子部２１０によって検出され、アンプ１０５で増幅されて測定信号としてロックインアンプ４００へと出力される。つまり、ロックインアンプ４００には、ファンクションジェネレータ３００からのリファレンス信号とアンプ１０５からの測定信号が入力される。
　ロックインアンプ４００は、リファレンス信号を用いて、測定信号の中から、ファンクションジェネレータ３００のリファレンス信号の周波数成分のみを抽出し、これを出力信号としてデータレコーダ５００に送信する。
　演算装置としてのＰＣ６００は、上述の出力信号を処理して、この出力信号から強度変化周波数の信号成分を抽出し、抽出された強度変化周波数の信号成分に基づいて、電子線の走査信号に従い画像を形成する。ここで、上述の強度変化周波数の信号成分の抽出は、例えば、バンドパスフィルタ法、ロックインアンプ法、自己相関解析法、フーリエ変換解析法などの手法により行うことができる。
　図２は、本発明に係る走査電子顕微鏡用試料ホルダの構成例を説明するための断面概略図である。
　この試料ホルダ２００は、一方主面が観察試料１０の保持面である第１の絶縁性薄膜２０３と、この第１の絶縁性薄膜２０３の他方主面に積層された導電性薄膜２０１とを備えている。この積層体は、真空中の観察に耐えられる程度の耐圧性を備えている。つまり、電子顕微鏡体内でも、ホルダ内は大気圧状態を保持することができる。そして、第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面側には、導電性薄膜２０１側から入射された電子線１０２に起因して生じた第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面の電位に基づく信号を検出する端子部２１０が設けられている。
　この図に示した構成例では、第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面と端子部２１０との間に、第２の絶縁性薄膜２０４が設けられており、第２の絶縁性薄膜２０４の一方主面と第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面とが所定の間隔の隙間を有するように配置されている。従って、この構成の場合は、端子部２１０は、第２の絶縁性薄膜２０４の他方主面の電位を信号として検出することになる。この端子部２１０は、試料支持膜としての第１の絶縁性薄膜２０３および第２の絶縁性薄膜２０４からは電気的に絶縁した状態で、これらと離間させて設けられている。
　なお、第２の絶縁性薄膜２０４は必須のものではなく、例えば、観察試料を極薄の水の層中に溶解等させることができれば、その表面張力により観察試料は保持されるから、第２の絶縁性薄膜２０４が無くとも、第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面の電位に基づく信号を端子部２１０で検出することが可能である。
　観察試料１０は、水溶液２０の中にある生物試料であってよく、第１の絶縁性薄膜２０３と第２の絶縁性薄膜２０４の間に封入され、導電性パッキン２０６やＯリング２０７で内部がシールされた導電性の外枠部２０８に収容されている。つまり、水溶液と一緒に生物試料を支持させた状態での観察が可能である。
　なお、後述するように、外枠部２０８には、内部の圧力を調整するための機構を設けるようにしてもよい。また、符号２０９で示したものは端子部２１０を外枠部２０８から絶縁するための絶縁部材であり、符号２０２および２０５で示したものは強度維持等の目的で設けられているフレーム部であり、符号３０は入射した電子線２０１の拡散領域である。
　図２に示した例では、パッキン２０６と外枠部２０８は何れも導電性であり、導電性薄膜２０１は走査電子顕微鏡１００のグランド電位とされ、この状態で観察が行われる。なお、導電性薄膜２０１の電位は、グランド電位ではなく所定の電位とした状態で観察を行うようにしてもよい。
　電子銃１０１から射出される電子線１０２の加速電圧は、入射電子線が第１の絶縁性薄膜２０３をほぼ透過しない電圧に設定することが好ましい。具体的には、入射電子線が導電性薄膜２０１の内部で、ほぼ散乱乃至吸収されてしまうような加速電圧とすることが好ましい。このような電圧設定により、第１の絶縁性薄膜２０３側に１次電子がほぼ透過せず、観察試料１０への電子線ダメージを完全に防ぐことができる。
　一般に、入射電子線の加速電圧を１０ｋＶ以下に設定すれば、上記条件が実現される。
　第１の絶縁性薄膜２０３が厚すぎると、端子部２１０で検知される信号の強度が低下する。このため、第１の絶縁性薄膜２０３の厚さは、２００ｎｍ以下とすることが好ましい。
　第１の絶縁性薄膜２０３の材質としては、窒化シリコン膜、カーボン膜、ポリイミド膜を例示することができる。
　導電性薄膜２０１が厚すぎても、端子部２１０で検知される信号の強度が低下する。このため、導電性薄膜２０１の厚さは、１００ｎｍ以下とすることが好ましい。
　導電性薄膜２０１は、比重が１０ｇ／ｃｍ３以上の金属を主成分とする金属薄膜であることが好ましい。これは、電子線の遮蔽性と入射電子の内部拡散を効率的に抑えるためである。このような金属薄膜としては、タンタル、タングステン、レニウム、モリブデン、オスミウム、金、プラチナのうちの何れかを主成分とするものを例示することができる。
　図３は、厚みが５０ｎｍの窒化シリコン薄膜の上部に、厚さ５ｎｍのニッケルと厚さ２０ｎｍのタングステンを積層させ、ニッケル／タングステンの積層膜に加速電圧３ｋＶの電子線を入射させた際の散乱状態を、モンテカルロシミュレーションにより計算した結果である。
　入射電子の殆どは、比重が１９．３ｇ／ｃｍ３のタングステン膜内で散乱乃至吸収されている。極一部の電子は窒化シリコン薄膜へと散乱するが、この電子の全ては窒化シリコン薄膜内で吸収されている。つまり、１次電子が第１の絶縁性薄膜である窒化シリコン薄膜を透過することは殆どない。
　第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面と第２の絶縁性薄膜２０４の一方主面との間の間隔が厚すぎる場合にも、端子部２１０で検知される信号の強度が低下する。このため、当該間隔は、４０μｍ以下に設定し得ることが好ましい。
　このような試料ホルダ２００内に観察試料１０を収容し、電子線１０２を１ｋＨｚ以上の周波数でＯＮ／ＯＦＦさせながら入射し、ロックインアンプ４００により抽出される強度変化周波数を電子線１０２の上記周波数（１ｋＨｚ以上）に設定して観察を行う。
　図４は、本発明に係る試料ホルダ２００に、矩形波状に強度変化する電子線１０２が入射した際に、端子部２１０で信号が検出されるメカニズムを概念的に説明するための図で、図４（ａ）は電子線が入射する状態（ＯＮ状態）、図４（ｂ）は電子線が絞りで遮られて入射しない状態（ＯＦＦ状態）を示している。
　図４（ａ）に示した様に、電子線１０２が入射する状態（ＯＮ状態）では、ほぼ全ての入射電子は導電性薄膜２０１で散乱乃至吸収される。これにより、電子線の入射部位に電子が蓄積され、当該部位がマイナス電位となる。
　導電性薄膜２０１の下に設けられた第１の絶縁性薄膜２０３側には、観察試料１０が溶解等された水溶液２０が挟み込まれている。この水溶液２０の水分子そのものは分極しているため、電子線入射部位がマイナスに帯電すると、水分子の電気双極子が電位勾配に添って配列する。この電気双極子配列により、水溶液２０の下側にある第２の絶縁性薄膜２０４の面にも電荷が生じる。この電荷は第２の絶縁性薄膜２０４の主面に生じた電位信号として、端子部２１０により検出されて測定信号となる。
　一方、図４（ｂ）に示した様に、電子線１０２が遮蔽された状態（ＯＦＦ状態）では、導電性薄膜２０１内の入射電子はＧＮＤへと直ちに流れ込み、上述のマイナス電位は消失する。これにより水溶液２０中の電気双極子の配列はバラバラに崩れ、第１の絶縁性薄膜２０３表面の電荷も消失し、端子部２１０から出力される測定信号も０となる。
　このような電子線のＯＮ／ＯＦＦを１ｋＨｚ以上の周波数で繰り返すことにより、端子部２１０からこれと同様の周波数成分の信号を抽出することができる。
　図５は、電子線１０２が観察試料１０である生物試料に照射された場合の、端子部２１０で信号が検出されるメカニズムを概念的に説明するための図である。
　ＯＮ／ＯＦＦを１ｋＨｚ以上の周波数で電子線１０２が照射されると、生物試料の誘電率は水に比べて極めて低いため、電気双極子の配列は弱くなり、測定信号の強度も低下する。
　水分子の誘電率は約８０と大きいため、第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面に電位変化が生じると、これを水溶液２０中での伝播力が強い信号として利用できる。一方、生物試料１０の誘電率は一般に低く、例えばタンパク質の誘電率は２～３であるため、当生物試料中での電位変化信号の伝播力は弱い。従って、このような大きな誘電率の差（伝播力の差）によって、高いコントラストを得ることができる。
　その結果、生物試料１０中と水溶液２０中とで、誘電率の差に起因する電位変化信号の伝播力に差が生じ、これを第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面側に設けた端子部２１０で検出することで、生物試料を染色すること無く、高いコントラストで観察することが可能となる。しかも、生物試料１０には、電子線が直接照射されることがないため、観察試料１０が電子線照射によりダメージを受けることがない。
　なお、観察により得られる画像の分解能は、略、電子線の照射径に依存する。このため、電子線の照射径を１ｎｍ程度にまで絞り込めば、これと略同等の分解能（１ｎｍ）を達成することも可能である。その結果、バクテリア、ウイルス、タンパク質、或いは、タンパク質複合体からなる生物試料も、生きた状態での高分解能・高コントラストでの観察が可能となる。
　以下に、観察試料であるバクテリアおよび酵母を水溶液に溶解させ、試料ホルダ２００内に封入して走査電子顕微鏡観察を行った例について説明する。
　図６は、本発明に係る走査電子顕微鏡用試料ホルダ２００内に、水溶液２０中に溶解させたバクテリア１０を収容して観察して得られた観察画像である。観察時の電子線の加速電圧は３ｋＶ、入射電子線のＯＮ／ＯＦＦ周波数は３０ｋＨｚである。
　ここで、サンプル支持膜である第１の絶縁性薄膜２０３は、厚みが５０ｎｍの窒化シリコン膜であり、その上部には、図３に示したように、厚み５ｎｍのニッケルと厚み２０ｎｍのタングステンが薄膜形成された導電性薄膜２０１が積層されている。
　水溶液試料は、第１の絶縁性薄膜２０３と５０ｎｍの厚みの第２の絶縁性薄膜２０４との間で挟み込み、第２の絶縁性薄膜２０４の下方に、空隙を設けて端子部２１０を設置した。
　この観察画像からは、細長い５ｎｍ程のバクテリアと球状のバクテリアが明瞭に確認できる。この観察に際しては、染色処理や固定処理は全く施していないが、極めて高いコントラストの画像が得られている。
　図７は、本発明に係る走査電子顕微鏡用試料ホルダ２００内に、水溶液２０中に溶解させた酵母１０を収容して観察して得られた観察画像であり、図７（ａ）は入射電子線のＯＮ／ＯＦＦ周波数が３０ｋＨｚの場合の観察画像、図７（ｂ）は入射電子線のＯＮ／ＯＦＦ周波数が８０ｋＨｚの場合の観察画像である。なお、観察時の電子線の加速電圧は３ｋＶである。
　入射電子線のＯＮ／ＯＦＦ周波数が３０ｋＨｚの場合でも、サイズが１０μｍ前後の酵母が、極めて高いコントラストで観察できているが、入射電子線のＯＮ／ＯＦＦ周波数を８０ｋＨｚとした場合には、観察画像は更にクリアとなっている。
　図８は、端子部２１０ａ～ｃを複数個異なる位置に設けた態様の走査電子顕微鏡像の観察システム構成例である。端子部２１０ａ～ｃを複数個設けたことに対応して、アンプ１０５ａ～ｃおよびロックインアンプ４００ａ～ｃも複数個設けられている。
　演算装置は、各端子部のそれぞれから抽出される強度変化周波数の信号成分ごとに画像を形成し、電子線の入射位置と端子部が設けられている位置との関係から画像の傾斜角度を求め、この傾斜角度にもとづいて画像（傾斜画像）に補正を行い、補正後の複数の画像に基づいて観察試料の３次元構造情報を解析する。
　例えば、端子部を３つ設けた場合には、左側に設けた端子部１０５ａからの傾斜画像と右側に設けた端子部１０５ｃからの傾斜画像、および、観察試料を正面から観察する位置にある中央の端子部１０５ｂからの傾斜画像を、一回の観察で得ることができる。これら３つの画像は、各画像の傾斜角度に従い、３次元再構成アルゴリズムを用いて３次元画像として構築される。
　図９は、外枠部２０８に、内部の圧力を調整するための機構を設けた態様の試料ホルダ２００の構造例を説明するための図で、図９（ａ）は大気圧下での様子、図９（ｂ）は真空中（顕微鏡体内）での様子を図示してある。この図に示した例では、減圧膜２１１を圧力調整機構とし、これを外枠部２０８の下面側に設けている。
　試料ホルダ２００の減圧膜２１１は、顕微鏡体内で外側に膨らみ、ホルダ内の圧力が減少する。導電性薄膜２０１側も外側に湾曲するが、減圧膜２１１の効果により、湾曲度は緩和される。
　なお、第２の絶縁性薄膜２０４の下方の領域はＯリング２０７により密閉されており、大気圧を保持している。そのため、第２の絶縁性薄膜２０４は、下方ではなく上方へと湾曲し、第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面と第２の絶縁性薄膜２０４の一方主面との間の隙間が広がって観察試料１０の保持に支障が生じることがない。
　このような試料ホルダ２００において、第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面と第２の絶縁性薄膜２０４の一方主面との間の所定間隔の隙間に、水溶液を潅流させるための流路を設け、試料ホルダ２００内に複数種の溶液を封入し、溶液の切り替えを行いながら観察するようにしてもよい。
　図１０は、第２の絶縁性薄膜２０４の一方主面と第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面との間の所定間隔の隙間に、水溶液を潅流させるための流路が設けられている試料ホルダ２００の一部構成の例で、図１０（ａ）～（ｃ）はそれぞれ、斜視図、上面図、断面図である。
　この図に示した例では、水溶液を潅流させるための流路が３つ設けられている。試料ホルダ２００の外枠部２０８は上部２０８ａと下部２０８ｂを有している。この上部２０８ａには、３つの流路２１２に対応付けられた注入孔２１３が形成されており、これらの流路２１２に導入された溶液は、表面張力の作用により、第２の絶縁性薄膜２０４の一方主面と第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面との間の所定間隔の隙間にまで導入される。
　また、この試料ホルダ２００の側部には、注入孔２１３から溶液を押し出すための圧力印加部としてのダンパ２１４が設けられており、これらのダンパ２１４の先端には圧力印加弁２１５が設けられている。
　このような複数の流路２１２を設けることとすると、予め細胞やバクテリアといった観察試料１０を収容した試料ホルダ２００内に、新たに試薬等を送り込み、これによる反応を詳細に観察する等の実験等も容易となる。なお、図中に符号２１６で示したものは、排出液タンクである。このような溶液の送り込みは、圧力印加部によらず、電気泳動的に行うこととしてもよい。
産業上の利用の可能性
　以上説明したように、本発明により、水溶液中の生物試料を、簡便に、しかも、染色処理や固定化処理を施すことなく、極めて高いコントラストで観察することが可能となる。加えて、電子線による試料へのダメージも生じないため、細胞やバクテリア、ウイルス、タンパク質複合体等の生物試料をはじめ、ダメージを受けやすい有機材料についても、本来の形態や構造を知ることが可能となる。
 
　１０　観察試料
　２０　水溶液
　３０　拡散領域
　１００　走査電子顕微鏡
　２００　試料ホルダ
　３００　ファンクションジェネレータ
　４００　ロックインアンプ
　５００　データレコーダ
　６００　ＰＣ
　１０１　電子銃
　１０２　電子線
　１０３　ビームブランキング装置
　１０４　絞り
　１０５　アンプ
　２０１　導電性薄膜
　２０２、２０５　フレーム部
　２０３　第１の絶縁性薄膜
　２０４　第２の絶縁性薄膜
　２０６　導電性パッキン
　２０７　Ｏリング
　２０８　外枠部
　２０９　絶縁部材
　２１０　端子部
　２１１　減圧膜
　２１２　流路
　２１３　注入孔
　２１４　ダンパ
　２１５　圧力印加弁
　２１６　排出液タンク
 

Claims (19)

  1. 　一方主面が観察試料の保持面である第１の絶縁性薄膜と該第１の絶縁性薄膜の他方主面に積層された導電性薄膜とを備え、
    　前記第１の絶縁性薄膜の一方主面側には、前記導電性薄膜側から入射された電子線に起因して生じた前記第１の絶縁性薄膜の一方主面の電位に基づく信号を検出する端子部が設けられている、走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
  2. 　前記第１の絶縁性薄膜の一方主面と前記端子部との間に第２の絶縁性薄膜が設けられており、
    　該第２の絶縁性薄膜の一方主面と前記第１の絶縁性薄膜の一方主面とが所定の間隔の隙間を有するように配置されており、
    　前記端子部は、前記第２の絶縁性薄膜の他方主面の電位を信号として検出する、請求項１に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
  3. 　前記第１の絶縁性薄膜の厚さが２００ｎｍ以下である、請求項１又は２に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
  4. 　前記第１の絶縁性薄膜は、窒化シリコン膜、カーボン膜、若しくは、ポリイミド膜からなる、請求項１又は２に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
  5. 　前記導電性薄膜の厚さが１００ｎｍ以下である、請求項１又は２に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
  6. 　前記導電性薄膜は、比重が１０ｇ／ｃｍ３以上の金属を主成分とする金属薄膜である、請求項１又は２に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
  7. 　前記金属薄膜は、タンタル、タングステン、レニウム、モリブデン、オスミウム、金、プラチナのうちの何れかを主成分とする、請求項６に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
  8. 　前記第１の絶縁性薄膜の一方主面と前記第２の絶縁性薄膜の一方主面との間の間隔を４０μｍ以下に設定し得る、請求項１又は２に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
  9. 　前記走査電子顕微鏡用試料ホルダは、内部を密閉する外枠部を備え、該外枠部には内部圧力の調整機構が設けられている、請求項１又は２に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
  10. 　前記走査電子顕微鏡用試料ホルダは、前記第２の絶縁性薄膜の一方主面と前記第１の絶縁性薄膜の一方主面との間の所定間隔の隙間に、水溶液を潅流させるための流路が設けられている、請求項２に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
  11. 　走査電子顕微鏡と、該走査電子顕微鏡内にセットされる請求項１又は２に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダと、前記端子部により検出された前記第１の絶縁性薄膜の一方主面の電位に基づく信号若しくは前記第２の絶縁性薄膜の他方主面の電位信号を出力信号として処理する演算装置とを備えている、走査電子顕微鏡像の観察システム。
  12. 　前記演算装置は、前記出力信号を処理して、該出力信号から強度変化周波数の信号成分を抽出し、該抽出された強度変化周波数の信号成分に基づいて画像を形成する、請求項１１に記載の走査電子顕微鏡像の観察システム。
  13. 　前記強度変化周波数の信号成分の抽出は、バンドパスフィルタ法、ロックインアンプ法、自己相関解析法、フーリエ変換解析法の何れかの方法で行われる、請求項１１又は１２に記載の走査電子顕微鏡像の観察システム。
  14. 　前記端子部を複数個異なる位置に設け、前記演算装置は、前記複数の端子部のそれぞれから抽出される強度変化周波数の信号成分ごとに画像を形成し、電子線の入射位置と端子部が設けられている位置との関係から前記画像の傾斜角度を求め、該傾斜角度にもとづいて前記画像に補正を行い、補正後の複数の画像に基づいて観察試料の３次元構造情報を解析する、請求項１１又は１２に記載の走査電子顕微鏡像の観察システム。
  15. 　請求項１１又は１２に記載の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記導電性薄膜を前記走査電子顕微鏡のグランド電位若しくは所定の電位とした状態で観察を行う、走査電子顕微鏡像の観察方法。
  16. 　請求項１１又は１２に記載の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記入射電子線の加速電圧を、該入射電子線が前記第１の絶縁性薄膜をほぼ透過しない電圧に設定して観察を行う、走査電子顕微鏡像の観察方法。
  17. 　請求項１１又は１２に記載の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記入射電子線の加速電圧を１０ｋＶ以下に設定して観察を行う、走査電子顕微鏡像の観察方法。
  18. 　請求項１１又は１２に記載の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記入射電子線を１ｋＨｚ以上の周波数でオン／オフし、前記抽出される強度変化周波数を１ｋＨｚ以上に設定して観察を行う、走査電子顕微鏡像の観察方法。
  19. 　請求項１１又は１２に記載の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記第１の絶縁性薄膜の一方主面に、水溶液と一緒に観察試料を支持させた状態で観察を行う、走査電子顕微鏡像の観察方法。
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