JP2002534113A5

JP2002534113A5 -

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Publication number: JP2002534113A5
Application number: JP2000593725A
Authority: JP
Filing date: 2000-01-17
Publication date: 2010-12-09
Anticipated expiration: 2020-01-17

Description

【特許請求の範囲】
【請求項１】ビフィドバクテリウム・ロングム・インファンティスUCC35624（ＮＣＩＭＢ４１００３）の菌株。
【請求項２】生存可能な細胞の形態をしている、請求項１に記載の菌株。
【請求項３】生存不可能な細胞の形態をしている、請求項１に記載の菌株。
【請求項４】請求項１〜３のいずれか１項に記載のビフィドバクテリウム菌株と、他の産物及び／又は担体とを含む配合物。
【請求項５】前記他の産物が他のプロバイオティック物質からなる、請求項４に記載の配合物。
【請求項６】前記他の産物がプレバイオティック物質からなる、請求項４又は５に記載の配合物。
【請求項７】前記担体が摂取可能な担体からなる、請求項４〜６に記載の配合物。
【請求項８】前記摂取可能な担体が製薬上許容される担体である、請求項７に記載の配合物。
【請求項９】前記担体がカプセル剤、錠剤または粉末剤である、請求項８に記載の配合物。
【請求項１０】前記摂取可能な担体が食製品である、請求項７に記載の配合物。
【請求項１１】前記食製品が酸性化ミルク、ヨーグルト、フローズンヨーグルト、粉ミルク、濃縮ミルク、チーズスプレッド、ドレッシングまたは飲料である、請求項１０に記載の配合物。
【請求項１２】前記他の産物がタンパク質および／またはペプチドからなる、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項１３】前記タンパク質および／またはペプチドが、グルタミン／グルタミン酸、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラルおよび／または微量元素を豊富に含む、請求項１２に記載の配合物。
【請求項１４】前記菌株が送達システム１ｇあたり１０⁶cfuより多く存在する、請求項４〜１３のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項１５】前記他の産物がアジュバントからなる、請求項４〜１４のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項１６】前記他の産物が細菌成分からなる、請求項４〜１５のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項１７】前記他の産物が薬物からなる、請求項４〜１６のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項１８】前記他の産物が生体化合物からなる、請求項４〜１７のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項１９】経口免疫のための、請求項４〜１８のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項２０】食品中で使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項２１】医薬として使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項２２】望ましくない炎症活性の予防および／または治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項２３】望ましくない胃腸の炎症活性の予防および／または治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項２４】炎症性腸管疾患の予防および／または治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項２５】クローン病の予防および／または治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項２６】潰瘍性大腸炎の予防および／または治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項２７】過敏性腸管症候群の予防および／または治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項２８】回腸嚢炎の予防および／または治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項２９】感染後大腸炎の予防および／または治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項３０】胃腸の癌の予防および／または治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項３１】全身性疾患の予防および／または治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項３２】慢性関節リウマチの予防および／または治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項３３】望ましくない炎症活性による自己免疫疾患の予防および／または治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項３４】望ましくない炎症活性による癌の予防および／または治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項３５】癌の予防において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項３６】望ましくない炎症活性による下痢性疾患の予防および／または治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項３７】クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)関連の下痢の予防および／または治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項３８】ロタウイルス関連の下痢の予防および／または治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項３９】感染後の下痢の予防および／または治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。

技術分野
本発明は、食品および医療分野で多様な用途を有するプロバイオティック（probiotic）ビフィドバクテリウム菌株に関する。さらに具体的には、本発明は、炎症性疾患において認められる症状を有益に改変し、これによって軽減することのできるビフィドバクテリウムのプロバイオティック株に関する。

プロバイオティックスとは、腸内の微生物平衡を改善することにより、宿主に有益に作用する生きた微生物食品サプリメントとして、あるいは、さらに広義には、所定数を摂取すると、固有の基本栄養を超えて、健康に効果を及ぼす生きた微生物として、定義されている。様々な微生物、特に、乳酸桿菌およびレンサ球菌から成るカクテルが、伝統的に、健康促進のための発酵乳製品に使用されてきた。

近年では、機能食品（ターゲッティング式に、身体の機能に作用することにより、生理学および栄養に好適な影響をもたらす食品）、特に、プロバイオティック（Acidophilus-Bifidus）ヨーグルトの製造および市販が、十分に確立された日本のニッチマーケット分野から、普及し、欧州連合へと拡大している。ヒト由来の多数のプロバイオティック細菌（例えば、好酸性乳酸桿菌（L. acidophilus） LA-1）が市場で開発されているが、多くの消費者、消費者団体および科学組織のメンバーは、そのような製品や、発表されたプロバイオティックの効能について懐疑的である。このため、乳製食品業界は、その新しいプロバイオティック食製品の有効性を科学的に確認する必要に迫られている。

有効なプロバイオティック微生物の選択に際して提示される基準を要約すると、次の通りである：ヒト由来のもの、非病原性挙動、技術的処理工程に対する耐性（すなわち、送達用ビヒクルにおける生存能力および活性）、胃酸および胆汁毒性に対する耐性、消化管上皮組織に対する付着性、GITをコロニー化する能力、抗菌物質の産生、免疫応答の調節能力、ならびに、代謝活性に影響する能力（例えば、コレステロール同化、ラクターゼ活性、ビタミン生成）（Huis in't Veld J, Shortt C. Selection criteria for probiotic micro-organisms. In: Leeds, A.R.、Rowland, I.R.編、Gut Fora and Health - Past, Present and Future、ロンドン：The Royal Society of Medicine Press Ltd., 1996: 19-16）。

ビフィドバクテリウムは、十分な数が摂取されると、基本栄養を超えて、健康に影響を及ぼす生きた微生物であることから、プロバイオティックスであると考えられる。プロバイオティック効果を発揮するためには、多数の摂取ビフィドバクテリウムが消化管の作用部位に到達しなければならない。腸内容物１グラム当たり約106〜107の生存能力を有するビフィドバクテリウムという最少レベルが示唆されている（Bouhnik, Y.、Lait 1993: 73: 241-247）。文献には、成人および乳児に対して実施したin vivo試験で、いくつかのビフィドバクテリウム株は、胃腸管を通過しても生存する能力があることを明らかにした報告がある。様々なビフィドバクテリウム株の酸および胆汁酸塩に耐える能力に有意な相違が認められており、従って、生存能力が、有望なプロバイオティック菌株の選択に重要な基準となることがわかる。

栄養および治療、ならびに、一般的健康に特に有益な効果をもたらすプロバイオティック菌株の研究が現在進行中である。

発明の開示
本発明は、切除および洗浄されたヒトの胃腸管から単離したビフィドバクテリウムの菌株であって、ヒトにおいて経口消費させた後、有意に免疫的な菌株を提供する。

本発明はまた、切除および洗浄されたヒト胃腸管から単離したビフィドバクテリウム・ロングム・インファティスの菌株であって、ヒトにおいて経口消費させた後、有意に免疫調節性の菌株を提供する。

上記配合物は、別のプロバイオティック物質を含んでもよい。これに代わり、あるいは、追加して、上記配合物は、プレバイオティック（prebiotic）物質を含む。

好ましくは、ラクトバチルス・サリバリウスは、切除および洗浄したヒト胃腸管から単離され、ヒトにおける経口消費の後、有意に免疫調節性を有する。好ましくは、ラクトバチルス・サリバリウス菌株は、切除および洗浄したヒト胃腸管から単離されたものであり、非常に多様なグラム陽性およびグラム陰性微生物を抑制する。

上記摂取可能な担体は、酸性化ミルク、ヨーグルト、フローズンヨーグルト、粉ミルク、チーズスプレッド(cheese spread)、ドレッシングまたは飲料等の食製品でよい。

発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、炎症性疾患に認められる症状を有益に改変し、その結果、軽減する能力のあるプロバイオティック細菌の菌株を単離した。これらの菌株および調製した配合物は、炎症性疾患の作用に対抗するため、様々な食品および薬剤に使用することができる。

プロバイオティック細菌株を用いてin vivoおよびin vitro試験を実施した。ビフィドバクテリウム・ロングム・インファンティス UCC 35624を含むヨーグルトを食したヒトは、IL-8の全身レベルの顕著な低下を示すことがわかった。従って、この菌株は、特に、非ステロイド性抗炎症薬剤（NSAID）またはInfliximab等の最近の抗炎症治療薬と組み合わせて用いた場合、様々な炎症性疾患の治療に適用できると考えられる。

抗炎症効果を発揮するために無傷の細菌が必要か否か、あるいは、本発明の個々の活性成分を単独で使用することが可能か否かについては、まだわかっていない。特定菌株の前炎症成分（proinflammatory components）が確認されている。グラム陰性細菌の前炎症作用は、リポ多糖（LPS）によって媒介されている。LPSは単独で、部分的に、単球のCD14受容体にLPSが結合することにより、前炎症ネットワークを誘発する。プロバイオティック細菌の成分は、全細胞の作用により、抗炎症活性を有すると想定されている。これら成分を単離すれば、製剤学的レベルの操作ができると予想される。

【００６４】
【実施例】
実施例１
プロバイオティック細菌の単離
表１に示すように、プロバイオティック細菌株を選別するため、再建手術の際に得られたヒトGITの大小腸の垂(appendices)および切片をスクリーニングした。

実施例４
抗菌作用
ビフィドバクテリウム種は、侵入病原体による長期定着（colonisation）を排除することによって他の細菌に妨害作用を及ぼす。それらの拮抗的活性は、発酵を介した酢酸及び乳酸の産生によるものである（Scardovi, V.（1986）「Bergeyの全身性細菌学マニュアル（Bergey's Manual of systemic bacteriology）」中の「ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）」、第2巻、Sheath, P.H.、Main, N.S.、Sharpe, M.及びHoldt, J.G.編集、Williams and Wilkins Publishers、Baltimore、M.D.、p1418）。酸以外の抗菌性化合物の産生に関しては、ほんの2〜3の報告しか存在しない（Anand, S.K.ら、Cult. Dairy Prods. 1985；J. 2、21-23）。バクテリオシン及び他の化合物は、ある生態学的地位にある細菌の生存に影響を与え、その細菌に発酵生態系を有効に支配させる。このような性質は、プロバイオティック株にとって望ましい特性である。

マウスの糞から培養可能な固有細菌の数に対する、投与されたプロバイオティックス（probiotics）の影響の評価
UCC 118及びUCC 35624を単独又は互いに組み合わせて投与することによって及ぼされる、CB-17 SCIDマウス腸のミクロフローラへの影響を調べた。各マウスから毎週糞サンプルを集め、計量し、10 mlのPBSに再懸濁させた。次いで、このサンプルをPBSで連続的に希釈し、2つずつ適切な培地上に適切な希釈で注入プレーティングするか又は塗布プレーティングした。下記の細菌グループを数えた：乳酸桿菌（lactobacilli）；ビフィドバクテリウム（bifidobacteria）；腸球菌（enterococci）；バクテロイド（bacteroides）及び大腸菌（coliforms）。用いた選択培地は、de Mann Rogosa & Sharpe（MRS）寒天；0.2％塩化リチウム（BDH）、0.3%プロピオン酸ナトリウム（Fluke chemie）、0.5％塩酸システイン（Sigma）、及び5％ヒツジ血液によって補完されたMRS寒天；Slanetz及びBartley寒天；嫌気性サプリメントSR 108及び5％ウマ血液によって補完されたWilkins及びChalgren寒天；並びにバイオレット・レッド・バイル・アガー（Violet Red Bile Agar）（特に断らない限り全てOxoid社製）。VRBA及び、Slanetz及びBartleyプレートを、それぞれ24時間及び45時間好気的にインキュベートした。他の全てのプレートを37℃で48時間嫌気的にインキュベートした。

実施例8
ビフィドバクテリウム・ロングム・インファンティスのin vivo抗炎症活性
発酵乳（ヨーグルト）製品中のビフィドバクテリウム・ロングム・インファンティス（1×109細胞／日）を、18人の健康なヒトに3週間消費させた。このプロバイオティック株の消費前後のサイトカイン分析のために血清を集めた。微生物学的分析のための糞便サンプルを得た。

末梢血液サイトカイン濃度のかなりの変化が、この給餌研究で観察された。血清可溶性インターロイキン-6レセプター（sIL-6R、p＝0.007）、インターフェロン−γ（IFNγ、p＝0.041）およびIL-8（p＝0.004）の濃度は、このプロバイオティック株の消費後に顕著に減少した（図11）。血清TNFαおよびインターロイキン-1レセプターアンタゴニスト（IL-1RA）濃度の変化は観察されなかった（図12）。この給餌研究の間、糞便のグラム当たり約1×105個のコロニー形成単位でビフィドバクテリウム・ロングム・インファンティスが検出された。

GI環境の複合的相互作用を反映する標的in vitro選択基準（targeted in vitro selection criteria）は、その環境に再度導入されたときに有効に機能しうるプロバイオティック株の同定を可能にする。上記に概略が説明された選択基準を用いて、プロバイオティック細菌ビフィドバクテリウム・ロングム・インファンティスは、in vitroでの極めて明らかな免疫調節的特性を有する。SCIDマウスおよびヒトボランティアによる消費後、全身性免疫パラメーターの顕著な変化が注目された。すなわち、免疫仲介疾患の治療における生物療法剤としてのビフィドバクテリウム・ロングム・インファンティスの使用が保証される。

炎症
炎症は、持続的な身体的損傷、感染を有する部位、または進行中の免疫応答が存在する場所での体液、血漿タンパク質および白血球細胞の局所的蓄積を表すために用いられる語句である。炎症性応答の抑制は、多数のレベルで働く（総説としては、Henderson B.、およびWilson M. 1998、「健康および疾患における細菌−サイトカイン相互作用」（Bacteria-Cytokine interactions in health and disease）、Portland Press、79-130を参照）。制御因子としては、サイトカイン類、ホルモン類（例えば、ヒドロコルチゾン）、プロスタグランジン類、反応性中間体類およびロイコトリエン類が挙げられる。サイトカイン類は、発達、組織修復および血液新生も調節しながら、免疫学的応答および炎症応答の生成および制御に関与する低分子量生理活性タンパク質である。それらは、白血球自身の間およびまた他の細胞タイプとのコミュニケーション手段を提供する。殆どのサイトカイン類は、多面発現性であり、複合的な生物学的にオーバーラップした活性を発現する。サイトカインカスケードおよびネットワークは、特定の細胞タイプへの特定のサイトカインの作用よりもむしろ炎症性応答を制御する（Arai KI,ら、Annu Rev Biochem 1990;59:783-836）。炎症性応答の衰退は、より低い濃度の適切な活性化シグナルおよび炎症性応答を停止に導く他の炎症性メディエイターを生じさせる。TNFαは、炎症状態を引き起こすサイトカイン類のカスケードおよび生物学的効果を開始させる、中枢的前炎症性サイトカインである。従って、TNFαを阻害する試薬（例えば、インフリキシマブ）は、現在、炎症性疾患の治療に用いられている。

下痢性疾患
腸上皮のバリア機能は、神経（アセチルコリン）および免疫（ヒスタミン）仲介分泌の間に低下しうる。ある細菌性毒素も、Ca2+およびPKC依存性分泌を誘導でき、それによって、上皮バリアを妨害する（Ganguly NKおよびKaur T.、Indian J Med Res 1996;104:28-37、Groot JA.、Vet Q 1998;20(S3):45-9）。幾つかの研究によって、プロバイオティック細菌を用いた下痢の予防および治療が調べられた。期待された研究は、早産児、新生児、子供の下痢に対する予防的および治療的使用（Isolauri E,ら、Dig Dis Sci 1994 Dec; 39(12):2595-600）、ならびに抗生物質関連下痢（antibiotic related diarrhoea）の治療（Siitonen S,ら、Ann Med 1990 Feb; 22(1):57-9）、および旅行者の下痢（traveller's diarrhoea）の治療（Oksanen PJ,ら、Ann Med 1990 Feb; 22(1):53-6）についての乳酸菌投与の有効性を立証した。

自己免疫疾患
免疫系は、B細胞およびT細胞によって発現される特異性の広いレパートリーを有する。これらの特異性の幾つかは、自己成分に向けられるであろう。自己認識は、クローン除去および自己反応性リンパ球の不活性化によって通常は抑制されている。しかしながら、血清中に見られる多くのタンパク質への抗体による自己免疫の一定した背景が存在する。自己−非自己認識系の崩壊が自己免疫を引き起こす。自己免疫疾患が起きると、その結果として生じる免疫応答が、攻撃すべき抗原を有する組織を損傷する。免疫複合体沈着、II型過敏症および細胞仲介反応は、免疫組織学的損傷が起きることによる、最も重要なメカニズムである。自己免疫疾患の例としては、以下に限定されないが、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症および悪性貧血が挙げられる。ビフィドバクテリウム・ロングム・インファンティスおよびラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウスは、免疫調節性の細菌である。従って、自己免疫疾患を患う患者によって、これらの細菌の単独成分または組み合わせのいずれかを消費することは、器官損傷を制限し、身体の正常な恒常性の回復を助けることができる。

プレバイオティック
プロバイオティック生物の導入は、適当な担体中の微生物を摂取することによって達成される。大腸でのこれらのプロバイオティック株の増殖を促進するであろう培地を提供することが有利であろう。1種以上のオリゴ糖類、多糖類または他のプレバイオティックの添加は、胃腸管中での乳酸菌の増殖を増強する（Gibson, GR. Br. J. Nutr. 1998; 80(4):S209-12）。プレバイオティックとは、陽性値を有すると考えられる固有細菌（例えば、ビフィドバクテリウム、ラクトバチルス）によって結腸内で特異的に発酵された任意の非生存食物成分をいう。プレバイオティックのタイプとしては、フルクトース、キシロース、大豆、ガラクトース、グルコースおよびマンノースを含有するものを挙げることができる。プロバイオティック株と1種以上のプレバイオティック化合物との組み合わせ投与によって、投与されたプロバイオティック菌のin vivoでの増殖が増強され、目立った健康上の利点をもたらすことができ、これをシンビオティック（synbiotic）と呼ぶ。

他の有効成分
ビフィドバクテリウムは、予防的にまたは、それ自身のもしくは他のプロバイオティック物質および／または上記のプレバイオティック物質による治療方法として投与できることが理解されるであろう。さらに、細菌を、他の活性物質（例えば、炎症または他の障害、特に胃腸管の障害の治療に用いられるもの）を用いた予防的または治療的投薬計画の一部として用いることができる。このような組み合わせは、単一の配合物で、または同時または異なる時間に投与され、同一または異なる経路で投与される別々の配合物として投与できる。