JP2002531137A - 第ｖｉｉｉ因子のための発現系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有するタンパク質のタンパク質を含まない製造方法を記述する。一般に、該方法は、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子の高生産性を伴う安定なヒト細胞クローンの派生、および（２）血漿由来タンパク質を含まない培地中で成長させるような細胞の適応を包含する。より具体的には、該方法は、選択可能なマーカーおよび第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有するタンパク質をコードする配列を含んで成る図のようなベクターでヒト細胞をトランスフェクションすること、選択剤で細胞を選択すること、および第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有する高レベルのタンパク質を発現するクローンを単離することを包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 関連出願：ＭＳＢ−７２４１（米国第０９／２０９，９２０号）、「哺乳動物
遺伝子発現のためのヒトハイブリッド宿主細胞（Ｈｕｍａｎ Ｈｙｂｒｉｄ Ｈ
ｏｓｔ Ｃｅｌｌ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ）」と呼称されるチョウ（Ｃｈｏ）への出願、およびＭＳＢ−７２５４（米
国第０９／２０９，９１５号）、「エプスタイン−バーウイルスの末端反復配列
を有するベクター（Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐ
ｅａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）」
と呼称されるチョウ（Ｃｈｏ）およびチャン（Ｃｈａｎ）への出願は関連する主
題を含有する。双方の出願は１９９８年１２月１０日に出願された。

【０００２】 （発明の背景） 分野：本発明は第ＶＩＩＩ因子およびその誘導体の改良された製造方法に関す
る。該方法は、全般的に、ベクター構築、トランスフェクション、およびタンパ
ク質を含まない条件下で高められた生産性をもつ細胞系の選択に関する。とりわ
け、本発明は、工業的スケールでの第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性をもつタンパ
ク質の製造方法に関する。

【０００３】 背景：ヒト第ＶＩＩＩ因子は補助因子として第Ｘ因子および第ＩＸａ因子の活
性化に関与する微量の血漿糖タンパク質である。第ＶＩＩＩ因子の遺伝的欠乏は
第Ｘ因子に関連する出血性障害、血友病Ａをもたらす。血友病Ａは精製された第
ＶＩＩＩ因子で成功裏に治療することができる。血友病Ａの置換療法は、血漿由
来の第ＶＩＩＩ因子の使用から、哺乳動物細胞中で第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡを
クローン化しかつ発現することにより得られる組換え第ＶＩＩＩ因子の使用まで
進化した。（ウッド（Ｗｏｏｄ）ら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３３０
）。

【０００４】 第ＶＩＩＩ因子はＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２のドメイン構造を有し、
そして２３５１アミノ酸の一本鎖ポリペプチドとして合成され、小胞体の管腔へ
の移動に際してこれから１９アミノ酸のシグナルペプチドが切断される。第ＶＩ
ＩＩ因子ははなはだしくグリコシル化されるという事実のため、第ＶＩＩＩ因子
の高レベル発現（＞０．２ｐｇ／ｃ／ｄ）は達成するのが困難であった（リンド
（Ｌｉｎｄ）ら、１９９５、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２：１９−２７
；カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら、１９８９、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
９：１２３３−１２４２）。哺乳動物細胞中での第ＶＩＩＩ因子の発現は、類似
のベクターおよびアプローチを使用して他の遺伝子で観察されるものより典型的
に２〜３桁より低い。第ＶＩＩＩ因子のための産生細胞系の生産力は０．５〜１
μＵ／ｃ／ｄ（０．１〜０．２ｐｇ／ｃ／ｄ）の範囲にあった。

【０００５】 第ＶＩＩＩ因子のＢドメインは凝血促進活性に重要でないことが立証されてい
る。第ＶＩＩＩ因子の短縮変異体を使用する、哺乳動物細胞中での第ＶＩＩＩ因
子の改良された発現が多様なグループにより報告されている（リンド（Ｌｉｎｄ
）ら、１９９５、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２３２：１９−２７；田島（Ｔ
ａｊｉｍａ）ら、１９９０、Ｐｒｏｃ ６^th Ｉｎｔ Ｓｙｍｐ Ｈ．Ｔ．ｐ．
５１−６３；アルムシュテット（Ａｌｍｓｔｅｄｔ）への米国特許第５，６６１
，００８号、１９９７）。しかしながら、第ＶＩＩＩ因子の変異体の発現レベル
は、安定な細胞クローンからは１ｐｇ／ｃ／ｄを下廻ったままであった。

【０００６】 （発明の要約） われわれは、今や、（ｉ）第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有するタンパク質
の極めて高い生産性を伴う細胞系を生じさせる方法、および（ｉｉ）第ＶＩＩＩ
因子の凝血促進活性を有するタンパク質の血漿タンパク質を使用しない製造方法
を発見した。

【０００７】 第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有するタンパク質の工業的スケールでの製造
方法。新たに創製された細胞宿主を使用し、２〜４ｐｇ／細胞／日（１０〜２０
μＵ／ｃ／ｄ）の範囲の比生産性(specific productivity)をもつ細胞クローン
を生じさせた。血清を含まない条件下で１個のクローンは２〜４ｐｇ／ｃ／ｄの
１日の生産力を継続した。この高レベルの生産力をもつクローンは、１５リット
ルの灌流醗酵槽中で１日あたり３〜４百万単位を生産することが可能である。１
単位の第ＶＩＩＩ因子の活性は、定義として、血漿１ミリリットル中に存在する
活性である。１ｐｇの第ＶＩＩＩ因子は一般に約５μＵの第ＶＩＩＩ因子の活性
に同等である。

【０００８】 本明細書で使用されるところの第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有するタンパ
ク質は、インビトロもしくはインビボのモデル系において第Ｘ因子の活性化を引
き起こすタンパク質である。制限するものでない例として、この定義は、完全長
の組換えヒト第ＶＩＩＩ因子およびＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（その配列を
図１に記述する）を包含する。

【０００９】 第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有するタンパク質の高レベルの発現は、血漿
由来タンパク質を含まない培地中で成長される場合に最低約２μＵ／ｃ／ｄ、も
しくはより好ましくは最低約４μＵ／ｃ／ｄ、もしくは最も好ましくは最低約５
μＵ／ｃ／ｄの第ＶＩＩＩ因子の活性、または、血漿由来タンパク質を補充され
た培地中で成長される場合に最低約４μＵ／ｃ／ｄ、もしくはより好ましくは最
低約８μＵ／ｃ／ｄ、もしくは最も好ましくは最低約１０μＵ／ｃ／ｄの第ＶＩ
ＩＩ因子の活性を意味する。発現されるタンパク質がＢＤＤ−ＦＶＩＩＩである
場合、本明細書に記述される方法により、約１５μＵ／ｃ／ｄまで、より好まし
くは約２０μＵ／ｃ／ｄまでの比生産性を有する細胞系を得ることができる。

【００１０】 細胞系の起源を記述するために本明細書で使用されるところの「に由来」は、
限定されるものでないが正常の有糸分裂の細胞分裂、およびトランスフェクショ
ン、細胞融合のような方法、または細胞を変えるもしくは新たな特性をもつ細胞
を生じさせるのに使用される他の遺伝子工学技術を挙げることができることを意
図している。

【００１１】 （特定の態様） FＶＩＩＩアッセイ メトトレキセート（ＭＴＸ）耐性の細胞集団中での組換え遺伝子発現から得ら
れた第ＶＩＩＩ因子誘導体の活性を発色性アッセイにより測定した。製造元の説
明書に従い、コアテスト［Ｃｏａｔｅｓｔ］（商標）第ＶＩＩＩ因子：Ｃ／４キ
ット（クロモゲニックス（Ｃｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）、スウェーデン・モルンダル
）を使用して活性を定量した。ＭＥＧＡ １（生物学研究・審査局（Ｏｆｆｉｃ
ｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗ）、
メリーランド州ベセスダ）として知られる米国の標準的抗血友病因子（第ＶＩＩ
Ｉ因子）をこのアッセイで測定の標準として使用した。バロウクライフ（Ｂａｒ
ｒｏｗｃｌｉｆｆｅ）、１９９３、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍ ７０：８７６を参
照されたい。 Ｂドメイン欠失FＶＩＩＩのための発現ベクターの構築 Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）FＶＩＩＩの配列を図１に示す。１４アミノ酸より
なるリンカーにより９０ｋＤおよび８０ｋＤの鎖を連結した。１９９６年４月１
６日に出願された、チャン（Ｃｈａｎ，Ｓ．−Ｙ．）、「混合組成のリポソーム
様物質の存在下での組換え第ＶＩＩＩ因子の製造（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｅｓ
ｅｎｃｅ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｌｉｋｅ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｏｆ
Ｍｉｘｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」、米国特許出願第０８／６３４，００
１号を参照されたい。標準的組換えＤＮＡ技術を使用してＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの
発現ベクターを作成した。該発現ベクター（ｐＣＩＳ２５ＤＴＲ）の構造を図３
に示す。該ベクターは、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの転写ユニットおよび選択可能なマ
ーカー、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）を包含する。加えて、組込み効率を
増大させるために、高められた薬剤選択比を示すエプスタイン−バーウイルスか
らの末端反復配列（図２）をベクターに挿入した。該ベクターは、本質的に、図
１に示される配列に対応する転写ユニットを包含するよう工作されているベクタ
ー（寄託されたＡＴＣＣ ９８８７９）の構築物である。末端反復配列について
のさらなる情報は、本出願と同一日に出願されたＭＳＢ−７２５４、「エプスタ
イン−バーウイルスの末端反復配列は薬剤選択比を高める（Ｔｅｒｍｉｎａｌ
ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕ
ｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｄｒｕｇ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）」と呼称
されるチョウ（Ｃｈｏ）とチャン（Ｃｈａｎ）への関連特許出願（引用により本
明細書に組み込まれる）に見出すことができる。

【００１２】 第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有するタンパク質を発現する細胞を得るため
に、類似のベクターが当業者により構築かつ使用されることができる。例えば、
凝血促進活性を保持する第ＶＩＩＩ因子の既知の変異体をコードするコーディン
グ配列をＢＤＤ−ＦＶＩＩＩのコーディング配列の代わりに用いることができる
。また、ｄｈｆｒの代わりに、グルタミン合成酵素（ｇｓ）もしくは多剤耐性遺
伝子（ｍｄｒ）のような他の選択可能なマーカーを使用することができる。選択
剤の選択は当該技術分野で既知であるとおり相応して行わなくてはならない。す
なわち、ｄｈｆｒについては好ましい選択剤はメトトレキセートであり、ｇｓに
ついては好ましい選択剤はメチオニンスルホキシミンであり、そしてｍｄｒにつ
いては好ましい選択剤はコルヒチンである。

【００１３】 （作業実施例） ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩを発現する細胞系の派生：トランスフェクション、薬剤選択
および遺伝子増幅 ２ｍｍキュベット（ＢＴＸ部品番号６２０）を使用する、３００ボルトおよび
３００マイクロファラドに設定された電気穿孔法（ＢＴＸ電気細胞操作装置（Ｅ
ｌｅｃｔｒｏ ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ）６００）により、３０マイ
クログラムのｐＣＩＳ２５ＤＴＲのＤＮＡをＨＫＢ１１（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲ
Ｌ １２５６８――２９３Ｓ細胞およびヒトバーキットリンパ腫細胞のハイブリ
ッド、本出願と同一日に出願されかつＭＳＢ−７２４１と呼称されるチョウ（Ｃ
ｈｏ）らへの米国特許出願（引用により本明細書に組み込まれる）を参照された
い）細胞に導入した。ＨＫＢ１１細胞を用いる作業と平行するよう行われた比較
実験では、ライフ テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に
より提供されるプロトコルに従って、陽イオン性脂質試薬ＤＭＲＩＥ−Ｃ（ライ
フ テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州
ゲイタースバーグ）を使用して、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）および
２９３Ｓ（ヒト胚腎）細胞をトランスフェクションした。ヒポキサンチンおよび
チミジンを欠くＭＴＸ選択培地（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ユタ州ロー
ガンからの５％透析ウシ胎児血清を含むヒポキサンチンおよびチミジンを含まな
いＤＭＥ／Ｆ１２培地）中、９６穴プレートあたり細胞１×１０⁶個で、増大す
るメトトレキセート（ＭＴＸ）濃度（１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭおよ
び８００ｎＭ）を用い、トランスフェクションされた細胞の増幅を行った。ＭＴ
Ｘ耐性の細胞を成長について評価し、そしてトランスフェクション後約２〜３週
間にコアテスト［Ｃｏａｔｅｓｔ］（商標）第ＶＩＩＩ因子キットを使用してＢ
ＤＤ−ＦＶＩＩＩの分泌をスクリーニングした。細胞の培養は加湿された５％Ｃ
Ｏ₂インキュベーター中３７℃で行った。 限界希釈クローニング 血清を含まない条件下での９６穴プレート中の高生産集団の限界希釈クローニ
ング（ＬＤＣ）により単一細胞クローン（ＳＣＣ）を生じさせた。細胞は、１０
μｇ／ｍｌのヒュームリン［Ｈｕｍｕｌｉｎ］（商標）組換えインスリン（リリ
ー（Ｌｉｌｌｙ）、インディアナ州インディアナポリス）、１０×必須アミノ酸
（ライフ テクノロジー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、メリーランド州
ゲイタースバーグ）、およびプラスマネート［Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ］（商標）
ヒト血漿タンパク質画分（バイエル（Ｂａｙｅｒ）、ノースカロライナ州クレイ
トン）を補充されたＤＭＥ／Ｆ１２培地中、ウェルあたり細胞１〜１０個で植え
付けた。プラスマネート［Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ］（商標）ヒト血漿タンパク質
（ＨＰＰ）画分はヒトアルブミン（８８％）および多様なグロブリン（１２％）
を含有する。コアテスト［Ｃｏａｔｅｓｔ］（商標）第ＶＩＩＩ因子キットを使
用して、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの生産性についてクローンをスクリーニングした。
最高の産生クローンを振とうフラスコ中での安定性の評価に選択した。ＨＫＢ細
胞については、５％透析ＦＢＳを補充された選択培地を使用して第１回のＬＤＣ
を実施した。第２回のＬＤＣは、プラスマネート［Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ］（商
標）ＨＰＰ画分を補充された血清を含まない培地中で適応された第一のＳＣＣを
使用して、血清を含まないがしかしプラスマネート［Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ］（
商標）ＨＰＰ画分を含有する培地中で行った。 ＨＫＢクローン２０Ｂ８の派生 図４（ａ）に要約されるとおり、最初の集団１Ｃ１０は、５％ＦＢＳを含む選
択培地中での４００ｎＭのＭＴＸでの増幅後にｐＣＩＳ２５ＤＴＲでトランスフ
ェクションされたＨＫＢ細胞由来であった。５％ＦＢＳを補充された選択培地を
使用してＬＤＣにより１Ｃ１０から生じられた最初の単一細胞クローン（ＳＣＣ
）の１種、１０Ａ８を、プラスマネート［Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ］（商標）ＨＰ
Ｐ画分を補充された血清を含まない培地中で適応させた。予期しないことに、１
０Ａ８はこの段階で極めて増大されたレベルのｒＦＶＩＩＩ産生を示した（図４
ｂ）。従って、プラスマネート［Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ］（商標）ＨＰＰ画分で
補充された培地を使用して第二のＬＤＣを行った。第二のＬＤＣ由来のＳＣＣ（
例えば２０Ｂ８）の生産性は、プラスマネート［Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ］（商標
）ＨＰＰ画分で適応された１０Ａ８と同様であった。２０Ｂ８は、血清を含有す
る培地中での第一のＬＤＣから生じられた元の１０Ａ８よりも高レベルのＢＤＤ
−ＦＶＩＩＩを示した。最後に、２０Ｂ８を、血漿タンパク質を含まない（ＰＰ
Ｆ）培地中での成長に適応させた。２０Ｂ８のサンプルをアメリカン タイプ
カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ヴァージニア州マナサス）に寄託した（ＡＴＣＣ寄託番
号ＣＲＬ−１２５８２）。

【００１４】 表１に示されるとおり、ＨＫＢクローンはＢＤＤ−ＦＶＩＩＩについて優れた
生産性を表す。トランスフェクションされたＣＨＯおよび２９３Ｓ細胞由来のク
ローンと比較された場合に、ＨＫＢ細胞で生産性の１０〜２０倍の増大が観察さ
れた。懸濁培養で成長される場合に細胞の大型の凝集物を形成しないＨＫＢ細胞
は、第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有するタンパク質の発現に好ましい細胞で
ある。

【００１５】 表１．ヒトおよびげっ歯類細胞系におけるＦＶＩＩＩおよびＢＤＤ−ＦＶＩＩ
Ｉの発現 比生産性（μＵ／ｃ／ｄ）* ＦＶＩＩＩ誘導体 ＢＨＫ ２９３ｓ ＣＨＯ ＨＫＢ 完全長ＦＶＩＩＩ ０．４５ １．２ ０．５ １．０ ＢＤＤ−ＦＶＩＩ ＮＤ ２．５ １．０ ２０ *５個の高産生クローンの平均（血清を含まない培地中） ＮＤ＝行われていない クローンの血漿タンパク質を含まない適応 血清を含まない懸濁培養物として成長するよう適応されたＨＫＢクローンを、
血漿タンパク質補充物からさらに引き離した。引き離し(weaning)は、血漿由来
タンパク質を含まない培地を使用して細胞約０．５×１０⁶個／ｍｌの細胞密度
で、滅菌のポリカーボネート振とうフラスコ（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、
ニューヨーク州コーニング）中で行った。血漿タンパク質を含まない（ＰＰＦ）
培地は、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８（０．１％）、ＣｕＳＯ₄（
５０ｎＭ）およびＦｅＳＯ₄／ＥＤＴＡ（５０μＭ）を補充されたＤＭＥ／Ｆ１
２培地であった。完全な培地交換を４８時間ごとに行い、そして振とうフラスコ
に細胞０．５×１０⁶個／ｍｌで再植え付けした。 クローン２０Ｂ８の醗酵 クローン２０Ｂ８の生産性を１５リットル灌流醗酵槽中で評価した。醗酵槽に
細胞約３×１０⁶個／ｍｌの密度でクローン２０Ｂ８細胞を植え付けた。先行す
る段落で記述されたとおり、１日あたり４体積の速度で血清を含まない生産培地
で醗酵槽を還流した。評価期間（４５日）を通じて細胞２×１０⁷個／ｍｌの最
終細胞密度を継続した。図５に示されるとおり、醗酵の最初の４週間の間、クロ
ーン２０Ｂ８はプラスマネート［Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ］（商標）ＨＰＰ画分を
補充された血清を含まない生産培地で灌流し、そして高生産性を継続することが
可能であった。第２８日から醗酵運転の終了まで、同一の血清を含まないしかし
プラスマネート［Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ］（商標）ＨＰＰ画分を含まない生産培
地で細胞を灌流した。図５に示されるとおり、細胞は、血漿由来タンパク質を含
まない環境中で高レベルのＦＶＩＩＩを産生し続けた。「血漿由来タンパク質を
含まない」は、本質的に、血漿から単離されたタンパク質が培地に添加されてい
なかったことを意味する。 考察 ＨＫＢ細胞の派生は、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩのみならずしかし他の治療的タンパ
ク質も同様に製造するためのタンパク質を含まない生産系を提供する。ＨＫＢ細
胞から産生されるタンパク質は、インビボでのある種の糖タンパク質の半減期を
向上させるかも知れないヒトのグリコシル化パターンを有する。これらの細胞は
また、遺伝子治療の目的上設計されたアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス
株の製造にも有用であるはずである。

【００１６】 上の実施例は本発明を具体的に説明することを意図しており、そして当業者に
変形物が思い浮かぶであろうと考えられる。従って、本発明の範囲は下の請求の
範囲によってのみ制限されるべきであることを意図している。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 発明にかかる、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号１）。

【図２】 発明にかかる、エプスタイン−バーウイルスから単離された末端反復（ＴＲ）配
列の配列（配列番号２）。

【図３】 発明にかかる、ｐＣＩＳ２５ＤＴＲのプラスミド地図。

【図４（ａ）】 発明にかかる、クローン２０Ｂ８の派生。

【図４（ｂ）】 発明にかかる、多様な培地中での数種のクローンの生産性の比較。各クローンの
２ヶ月安定性試験からの３個のデータ点を提示する。

【図５】 発明にかかる、クローン２０Ｂ８の体積測定の生産性。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＺＮＡＢ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ケルゼイ，ウイリアム アメリカ合衆国カリフオルニア州94112ア ラメダ・ベイパークテラス101 (72)発明者 イー，ヘレナ アメリカ合衆国カリフオルニア州94112サ ンフランシスコ・ビエンナストリート154 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 DA03 GA11 GA18 4B064 AG01 CA10 CA20 CD07 CD12 CD22 DA01 4B065 AA93X AB06 AC14 BB31 BD32 BD34 CA24 CA44 4C084 AA06 BA44 DC15 ZA53

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）専らヒト起源の細胞を得ること、 ｂ）ベクターを細胞に入れるのに十分な条件下で段階ａ）の細胞をベクターと接
   触させること（ここで、該ベクターは選択可能なマーカーおよびプロモーターに
   操作可能に連結された第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有するタンパク質をコー
   ドする配列を含んで成る）、 ｃ）選択剤で段階ｂ）からの細胞を選択すること、ならびに ｄ）段階ｃ）から得られた細胞から第ＶＩＩＩ因子の活性を有する高レベルのタ
   ンパク質を発現する個々のクローンを単離すること の連続的段階を含んで成る、第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有するタンパク質
   を発現する細胞の生産方法。
2. 【請求項２】 ｅ）血漿由来タンパク質を含まない培地中で成長するように
   段階ｄ）のクローンを適応させる段階をさらに含んで成る、請求項１記載の方法
   。
3. 【請求項３】 段階ａ）の細胞がヒトリンパ腫細胞および２９３Ｓ細胞のハ
   イブリッドである、請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 段階ａ）の細胞が２Ｂ８細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２５６
   ９）および２９３Ｓ細胞のハイブリッドである、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 段階ａ）の細胞がＨＫＢ１１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２
   ５６８）である、請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 段階ｃ）およびｄ）を１回以上実施する、請求項１記載の方
   法。
7. 【請求項７】 段階ｂ）の配列が図１に示される配列（配列番号１）をコー
   ドする、請求項１記載の方法。
8. 【請求項８】 段階ｂ）の配列がヒト第ＶＩＩＩ因子をコードする、請求項
   １記載の方法。
9. 【請求項９】 段階ｂ）の選択可能なマーカーがｄｈｆｒであり、また、段
   階ｃ）の選択剤がメトトレキセートである、請求項１記載の方法。
10. 【請求項１０】 段階ｂ）の選択可能なマーカーがｇｓであり、また、段階
    ｃ）の選択剤がメチオニンスルホキシミンである、請求項１記載の方法。
11. 【請求項１１】 段階ｂ）の選択可能なマーカーがｍｄｒであり、また、段
    階ｃ）の選択剤がコルヒチンである、請求項１記載の方法。
12. 【請求項１２】 請求項１記載の方法により製造された細胞を成長培地中で
    成長させること、およびその後培地から第ＶＩＩＩ因子の活性を有するタンパク
    質を単離することを含んで成る、第ＶＩＩＩ因子の活性を有するタンパク質の製
    造方法。
13. 【請求項１３】 タンパク質がヒト第ＶＩＩＩ因子である、請求項１１記載
    の方法。
14. 【請求項１４】 タンパク質が図１に示されるアミノ酸配列（配列番号１）
    を有する、請求項１１記載の方法。
15. 【請求項１５】 第ＶＩＩＩ因子の活性を有する高レベルのタンパク質を発
    現する、ヒトリンパ腫細胞および２９３Ｓ細胞由来のヒト細胞系。
16. 【請求項１６】 ヒト細胞系がＨＫＢ１１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２５
    ６８）由来である、請求項１４記載のヒト細胞系。
17. 【請求項１７】 血漿由来タンパク質を含まない培地中で成長される場合に
    第ＶＩＩＩ因子の活性を有する高レベルのタンパク質を発現する、ヒトリンパ腫
    細胞および２９３Ｓ細胞由来のヒト細胞系。
18. 【請求項１８】 細胞系がＨＫＢ１１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２５６８
    ）由来である、請求項１６記載の細胞系。
19. 【請求項１９】 ２０Ｂ８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２５８２）と呼称される
    細胞系。