ES2315026T3 - Sistema de expresion para el factor viii. - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de producir y aislar una proteína que tiene actividad de factor VIII que comprende células que crecen designadas por la American Type Culture Collection como CRL-12568 que incluye una secuencia codificante para la proteína unida operativamente a un promotor, estando el cultivo bajo condiciones suficientes para expresar la proteína y aislar la proteína.

Description

Sistema de expresión para el factor VIII.
Solicitudes relacionadas
La solicitud de Cho designada MSB-7241 (documento de los EE.UU. con n.º de serie 09/209.920), "Human Hybrid Host Cell for Mammalian Gene Expression," y la solicitud de Cho y Chan designada MSB-7254 (documento de los EE.UU. con n.º de serie n.º 09/209.915), "Vectors Having Terminal Repeat Sequence of Epstein-Barr Virus," contienen un objeto relacionado. Ambas solicitudes se presentaron el 10 de diciembre de 1998.
Antecedentes de la invención Campo
La presente invención se refiere a un procedimiento de producción mejorada para el factor VI y sus derivados. El procedimiento se refiere generalmente a construcción de vector, transfección, y selección de líneas celulares con productividad mejorada bajo condiciones libres de proteínas. En particular, esta invención se refiere a procedimientos para preparar una proteína con actividad procoagulante de factor VIII en una escala industrial.
Antecedentes
El factor VIII humano es una glicoproteína plasmática traza implicada como un cofactor en la activación de factor X y factor IXa. La deficiencia heredada de factor VIII da como resultado el trastorno de sangrado ligado al cromosoma X hemofilia A que se puede tratar exitosamente con factor VIII purificado. La terapia de reemplazo de hemofilia A ha evolucionado a partir del uso de factor VIII derivado de plasma al uso de factor VIII recombinante obtenido clonando y expresando el cDNA de factor VIII en células de mamífero. (Wood y col., 1984, Nature 312: 330).
El factor VIII tiene una organización de dominios de A1-A2-B-A3-C1-C2 y se sintetiza como un polipéptido de cadena simple de 2351 aminoácidos, de los que se escinde un péptido señal de 19 aminoácidos tras traslocación dentro del lumen del retículo endoplásmico. Debido al hecho de que el factor VIII se glicosila mucho, la expresión de alto nivel (>0,2 pg/c/d) del factor VIII ha sido difícil de lograr (Lind y col., 1995, Eur J Biochem. 232: 19-27; Kaufman y col., 1989, Mol Cell Biol. 9: 1233-1242). La expresión de factor VIII en células de mamífero es típicamente 2-3 órdenes de magnitud más baja que aquella observada con otros genes usando vectores y aproximaciones similares. La productividad de líneas celulares de producción para factor VIII ha estado en el intervalo de 0,6-1 PU/c/d (0,1-
0,2 pg/c/d).
Se ha demostrado que el dominio B del factor VIII es prescindible para actividad procoagulante. Usando variantes truncadas de factor VIII, se ha comunicado expresión mejorada de factor VIII en células de mamífero por diversos grupos (Lind y col., 1995, Eur J Biochem 232: 19-27; Tajima y col., 1990, Proc 6th int Symp H.T. p. 51-63; Patente de los Estados Unidos 5.661.008 de Almstedt, 1997). Sin embargo, el nivel de expresión de las variantes del factor VIII permaneció por debajo de 1 pg/c/d a partir de un clon celular estable.
El documento de los EE.UU. PS 5.612.213 describe un procedimiento de seleccionar una línea celular que tiene alta productividad de proteínas heterólogas. Pero esta cita es muda con respecto a la línea celular particular y al procedimiento reivindicado con la presente invención.
Sumario de la invención
Los inventores han descubierto ahora (i) un procedimiento que da líneas celulares con productividad extremadamente alta de proteínas que tienen actividad procoagulante de factor VIII, y (ii) un proceso de producción libre de proteínas para proteínas que tienen actividad procoagulante de factor VIII.
Un procedimiento para la producción de proteínas que tienen actividad procoagulante de factor VIII a escala industrial. Usando un huésped celular creado recientemente, se obtuvieron los clones celulares con productividades específicas en el intervalo de 2-4 pg/célula/día (10-20 \muU/c/d). Bajo condiciones libres de suero, un clon ha mantenido una productividad diaria de 2-4 pg/c/d. Los clones con este nivel alto de productividad son capaces de producir 3-4 millones de unidades por día en un fermentador de perfusión de 15 litros. Una unidad de actividad de factor VIII es por definición la actividad presente en un mililitro de plasma. Un pg de factor VIII es generalmente equivalente a aproximadamente 5 \muU de actividad de FVIII.
Como se usa en el presente documento, una proteína que tiene actividad procoagulante de factor VIII es una proteína que causa la activación de Factor X en un sistema modelo in vitro o in vivo. Como ejemplos no limitantes, esta definición incluye factor VIII humano recombinante de longitud total y el factor VIII con el dominio B eliminado cuya secuencia se describe en la figura 1.
Un nivel alto de expresión de una proteína que tiene actividad procoagulante de factor VIII significa al menos aproximadamente 2 \muU/c/d, o más preferiblemente al menos aproximadamente 4 \muU/c/d, o lo más preferiblemente al menos aproximadamente 5 \muU/c/d, de actividad de factor VIII si creció en medio libre de proteínas derivado de plasma, o al menos aproximadamente 4 \muU/c/d, o más preferiblemente al menos aproximadamente 8 \muU/c/d, o lo más preferiblemente al menos aproximadamente 10 \muU/c/d, de actividad de factor VIII si creció en medio suplementado con proteína derivada de plasma. Cuando la proteína expresada es BDD-FVIII, las líneas celulares que tienen productividades específicas hasta aproximadamente 15 PU/c/d, más preferiblemente hasta aproximadamente 20 PU/c/d se pueden obtener mediante el procedimiento descrito en el presente documento.
Como se usa en el presente documento para describir el origen de las líneas celulares, "derivado de" se desea para incluir, pero no se limita a, división celular mitótica normal y procedimientos tales como transfecciones, fusiones celulares, u otras técnicas de ingeniería genética usadas para cambiar células o producir células con nuevas propiedades.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Secuencia de Aminoácidos de BDD-FVIII (SEQ ID Nº.: 1).
Figura 2. Secuencia de repeticiones terminales (TR) aislada de virus Epstein-Barr (SEQ ID Nº.: 2).
Figura 3. Mapa plasmídico de pCIS25DTR.
Figura 4(a). Derivación de clon 20B8.
Figura 4(b). Comparación de productividades de varios clones en diversos medios. Se presentan tres puntos de datos a partir de una prueba de estabilidad de dos meses de cada clon.
Figura 5. Productividad volumétrica de clon 20B8.
Realizaciones específicas Ensayo FVIII
La actividad de derivados del factor VIII obtenidos a partir de expresión de genes recombinantes en poblaciones de células resistentes a metotrexato (MTX) se midió mediante un ensayo cromogénico. La actividad se cuantificó usando kit de factor VIII:C/4 de Coatest® (Cromogenix, Molndal, Suecia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un factor antihemofílico estándar (factor VIII) de los EE.UU. conocido como MEGA 1 (Office of Biologics Research and Review, Bethesda, MD) se usó como el estándar de medida en este ensayo. Véase Barrowcliffe, 1993, Thromb Haem 70: 876.
Construcción de vectores de expresión para FVIII con el dominio B eliminado
La secuencia del FVIII con el dominio B eliminado (BDD) se muestra en la Figura 1. Las cadenas 90 kD y 80 kD estuvieron unidas mediante un engarce constituido por 14 aminoácidos. Véase Chan, S.-Y., "Production of Recombinant Factor VIII in the Presence of Liposome-like Substances of Mixed Composition", Solicitud de Patente de los EE.UU. Nº.: 08/634,001, presentada el 16 de abril de 1996. El vector de expresión para BDD-FVIII se fabricó usando técnicas de DNA recombinante estándar. La estructura del vector de expresión (pCIS25DTR) se muestra en la Figura 3. El vector incluye una unidad transcripcional para BDD-FVIII y un marcador seleccionable, dihidrofolato reductasa (dhfr). Además una secuencia de repetición terminal de virus Epstein-Barr, que muestra razón de selección de fármacos mejorada, (Figura 2) se insertó dentro del vector para incrementar la eficiencia de integración. El vector es esencialmente una construcción de un vector (depositado ATCC 98879) que se ha manipulado para incluir una unidad transcripcional correspondiente a la secuencia mostrada en la Figura 1. Se puede encontrar información adicional sobre la secuencia de repetición terminal en la solicitud de patente relacionada, cedida a Cho y Chan designada MSB-7254, "Terminal repeat sequence of Epstein-Barr virus enhances drug selection ratio", presentada en el mismo día que la solicitud actual.
Se pueden construir y usar vectores similares por aquellos que tienen habilidad en la técnica para obtener células que expresan proteínas que tienen actividad progoagulante de factor VIII. Por ejemplo, secuencias codificantes que codifican variantes conocidas de factor VIII que retienen actividad procoagulante se pueden sustituir por la secuencia codificante de BDD-FVIII. Además, en vez de dhfr, se pueden usar otros marcadores seleccionables, tales como glutamina sintetasa (gs) o gen de resistencia a multifármaco (mdr). La elección de un agente de selección se debe hacer por consiguiente, como se conoce en la técnica, es decir para dhfr, el agente de selección preferido es metotrexato, para gs el agente de selección preferido es metionina sulfoximina, y para mdr el agente de selección preferido es colchicina.
Ejemplos de trabajo Derivación de líneas celulares que expresan BDD-FVIII: transfección, selección de fármacos y amplificación de genes
Se transfirieron treinta microgramos de DNA de pCIS25DTR en células HKB11 (depósito de ATCC nº.: CRL 12568 - un híbrido de células 293S y células de linfoma de Burkitt humanas, véase Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Cho y col. presentada en el mismo día que la solicitud actual y designada MSB-7241, incorporada en el presente documento por referencia) mediante aparato de electroporación a 300 voltios y 300 microfaradios (BTX Electro cell Manipulator 600) usando una cubeta de 2 mm (parte de BTX nº.: 620). En experimentos comparativos hechos para trabajo paralelo con las células HKB11, se transfectaron células CHO (ovario de hámster chino) y células 293S (riñón embrionario humano) usando un reactivo lipídico catiónico DMRIE-C (Life Technologies, Gaithersburg, MD) de acuerdo con un protocolo proporcionado por Life Technologies. Se hizo la amplificación de células transfectadas con concentraciones de metotrexato (MTX) crecientes (100 nM, 200 nM, 400 nM, y 800 nM) a células 1 x 10^{6} por placa de 96 pocillos en un medio de selección de MTX que carece de hipoxantina y timidina (medios DME/F12 sin hipoxantina y timidina más suero bovino fetal dializado al 5% a partir de Hyclone, Logan, UT). Las células resistentes a MTX se evaluaron para crecimiento, y se rastreó secreción del BDD-FVIII usando un kit de factor VIII de Coatest® aproximadamente 2-3 semanas después de la transfección. El cultivo de células se hizo a 37ºC en un incubador de CO_{2} al 5% humidificado.
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Clonación de Dilución Limitante
Los clones de células individuales (SCC) se derivaron mediante clonación de dilución limitante (LDC) de poblaciones de producción alta en placas de 96 pocillos bajo condiciones libres de suero. Las células se sembraron a 1-10 células por pocillo en medios de DME/F12 suplementados con insulina recombinante Humulin® (Lilly, Indianapolis, IN) a 10 \mug/ml, aminoácidos esenciales 10X (Life Technology, Gaithersburg, MD), y fracción de proteína de plasma humana Plasmanate® (Bayer, Clayton, NC). La fracción de proteína de plasma humana (HPP) Plasmanate® contiene albúmina humana (88%) y diversas globulinas (12%). Los clones se examinaron para productividad de BDD-FVIII usando los kits de factor VIII de Coatest®. Los clones de producción más alta se seleccionaron para evaluación de estabilidad en matraces en agitación. Para células HKB, la LDC de primera ronda se llevó a cabo usando medio de selección suplementado con FBS dializado al 5%. La LDC de segunda ronda se hizo en medio libre de suero pero que contiene fracción de HPP Plasmanate® usando los primeros SCC adaptados en medio libre de suero suplementado con fracción de HPP Plasmanate®.
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Derivación de clon de HKB 20B8
Como se resume en la Figura 4(a), la población inicial 1C10 se derivó de las células HBK transfectadas con pCIS25DTR después de amplificación con MTX 400 nM en el medio de selección con FBS al 5%. Uno de los primeros clones de célula individual (SCC), 10A8, derivado de 1C10 mediante una LDC usando un medio de selección suplementado con FBS al 5% se adaptó en medio libre de suero suplementado con fracción de HPP Plasmanate®. Inesperadamente, 10A8 mostró niveles extremadamente incrementados de producción de rFVIII en esta fase (Figura 4b). Por lo tanto, los inventores hicieron una segunda LDC usando el medio suplementado con fracción de HPP Plasmanate®. La productividad de SCC (por ejemplo 20B8) derivada de la segunda LDC era similar con la 10A8 adaptada a fracción HPP de Plasmanate®. 20B8 mostró niveles más altos de BDD-FVIII que 10A8 original derivados de la LDC primera en medio que contiene suero. Finalmente, 20B8 se adaptó a cultivo en medio libre de proteínas plasmático (PPF). Se depositaron muestras de 20B8 en la American Type Culture Collection (Manassas, VA) (número de depósito en ATCC CRL-12582).
Como se muestra en la Tabla 1, los clones de HKB muestran productividad superior para BDD-FVIII. Se observó un incremento de 10-20 veces en productividad en células HKB cuando se compararon con clones derivados de células transfectadas CHO y células transfectadas 293S cells. Las células HKB, que no forman agregados grandes de células cuando crecen en cultivo de suspensión, son células preferidas para la expresión de proteínas que tienen actividad procoagulante de factor VIII.
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TABLA 1 Expresión de FVIII y BDD-FVIII en líneas celulares humanas y de roedor
1
Libre Adaptación de Proteína Plasmática de clones
Los clones de HKB que se han adaptado para crecer en forma de cultivos de suspensión libres de suero se retiraron adicionalmente de suplementos proteicos de plasma. La retirada se hizo en matraces de agitación de policarbonato estériles (Corning, Corning, NY) a una densidad celular de aproximadamente 0,5 x 10^{6} células/ml usando medio libre de proteínas derivado de plasma. El medio libre de proteínas plasmático (PPF) se suplementó con medio DME/F12 con F68 plurónico F68 (0,1%), CuSO4 (50 nM), y FeSO_{4}/EDTA (50 PM). El intercambio de medio completo se hizo cada 48 horas y los matraces en agitación se volvieron a sembrar a 0,5 x 10^{6} células/ml.
Fermentación de clon 20B8
La productividad de clon 20B8 se evaluó en un fermentador de perfusión de 15 litros. El fermentador se sembró con células de clon 20B8 a una densidad de aproximadamente 3 x 10^{6} células/ml. El fermentador se perfundió a una velocidad de 4 volúmenes por día con el medio de producción libre de suero como se describe en el párrafo precedente. Se mantuvo una densidad celular final de 2 x 10^{7} células/ml a lo largo del periodo de evaluación (45 días). Como se muestra en la Figura 5, durante las primeras cuatro semanas de fermentación, el clon 20B8 se perfundió con el medio de producción libre de suero suplementado con fracción de HPP Plasmanate® y fue capaz de mantener productividad alta. A partir del día 28 hasta el final del proceso de fermentación, las células se perfundieron con el mismo medio de producción libre de suero pero sin fracción de HPP Plasmanate®. Como se muestra en la Figura 5, las células siguieron produciendo niveles altos de FVIII en un ambiente libre de proteínas derivado de plasma. "Libre de proteínas derivado de plasma" significa que esencialmente no se ha añadido ninguna proteína aislada de plasma al medio.
Discusión
La derivación de células HKB proporciona un sistema de producción libre de proteínas para producir no sólo BDD-FVIII sino otras proteínas terapéuticas también. Las proteínas producidas a partir de células HKB tienen patrones de glicosilacion humanos que pueden incrementar la semivida de ciertas glicoproteínas in vivo. Estas células deberían ser útiles también para la producción de adenovirus y cepas de virus adeno-asociadas que se han diseñado para propósitos de terapia génica.
Los ejemplos anteriores se desean para ilustrar la invención y se piensa que se les ocurriran variaciones a aquellos expertos en la técnica. De acuerdo con ello, se desea que el alcance de la invención esté limitado sólo por las reivindicaciones adjuntas.
<110> Cho, Myung-Sam
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Chan, Sham-Yuen 
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Kelsey, William 
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Yee, Helena 
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<120> Sistema de Expresión par el Factor VIII
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<130> MSB-7255
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<140>
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<141>
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<160> 2
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 1438
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: derivada de secuencia de factor VIII humano
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<400> 1
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2
3
4
5 
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<210> 2
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<211> 402
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: derivada de secuencia de virus Epstein-Barr
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<400> 2
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6

Claims (8)

1. Un procedimiento de producir y aislar una proteína que tiene actividad de factor VIII que comprende células que crecen designadas por la American Type Culture Collection como CRL-12568 que incluye una secuencia codificante para la proteína unida operativamente a un promotor, estando el cultivo bajo condiciones suficientes para expresar la proteína y aislar la proteína.
2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la proteína tiene la secuencia de aminoácidos designada como SEQ ID Nº.: 1.
3. El procedimiento de la reivindicación 2 en el que la proteína se expresa a un nivel de al menos 2 \muU/c/d cuando las células se cultivan en un medio libre de proteínas derivado de plasma.
4. El procedimiento de la reivindicación 3 en el que la proteína se expresa a un nivel de al menos 4 \muU/c/d.
5. El procedimiento de la reivindicación 4 en el que la proteína se expresa a un nivel de al menos 5 \muU/c/d.
6. Una línea celular humana derivada de células designadas por la American Type Culture Collection como CRL-12568 incluyendo una secuencia codificante para una proteína que tiene actividad de factor VIII unida operativamente a un promotor.
7. La línea celular humana de la reivindicación 6 que expresa factor VIII con el dominio B eliminado.
8. Una línea celular designada por la American Type Culture Collection como CRL-12582.
ES99966068T 1998-12-10 1999-12-08 Sistema de expresion para el factor viii. Expired - Lifetime ES2315026T3 (es)

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