UA77383C2 - Спосіб одержання та виділення білка, що має активність фактора viii та лінії клітин людини, що експресують білок, що має активність фактора viii - Google Patents

Abstract

Даний винахід описує спосіб одержання білка з прокоагулянтною активністю фактора VIII на основі вільного від білків середовища. Спосіб передбачає розмноження стабільних людських клітинних клонів з високою продуктивністю фактора VIII з делетованим В-доменом, та (2) адаптацію клітин до росту на середовищі, вільному від білків плазми. Зокрема, спосіб включає трансфекцію людських клітин вектором, таким як зображено на фігурі, який містить селективний маркер та послідовність, що кодує білок з прокоагулянтною активністю фактора VIII, відбір клітин за допомогою селекційного агента та ізоляцію клонів, що експресують високі рівні білка з прокоагулянтною активністю фактора VIII.

Description

Галузь: Даний винахід відноситься до покра- присутня в одному міллілітрі плазми. Один пг фак- щеного методу одержання фактора МІ та його тора МІ, взагалі, є еквівалентним приблизно 5 похідних. Взагалі, метод відноситься до конструк- мікроодиницям активності ЕМІПЇ. ції вектора, трансфекції та селекції клітинних ліній Як використовується у контексті даної заявки, з покращеною продуктивністю в умовах відсутності білок, що має прокоагулянтну активність фактора білка. Зокрема, цей винахід пов'язаний зі спосо- МІ, є білком, який зумовлює активацію фактора Х бом одержання білка з прокоагулянтною активніс- у модельних системах іп міїго або іп мімо. Як прик- тю фактора МІ! у промислових масштабах. лади, що не обмежують даний винахід, це визна-

Передумови: Людський фактор МІ! представ- чення включає повну довжину рекомбінантного ляє собою глікопротеїн, що міститься у слідовій людського фактора МІ! та фактор МІ з делетова- кількості в плазмі крові, та втягнений як кофактор у ним доменом В, послідовність якого наведена на процес активації фактора Х та фактора ІХа. Успа- Фігурі 1. дкована недостатність фактора МІ! приводить до Високий рівень експресії білка, що має прокоа-

Х-зв'язаного розладу кровотечі гемофілії А, яка гулянтну активність фактора МІ, означає принай- може успішно лікуватись за допомогою очищеного мні близько 2мікроодиниць/кл/день, або бажано фактора МІ. Замісна терапія гемофілії А розвива- принаймні близько 4мікроодиниць/кл/день, або лася від використання фактора МІ, що одержаний найбільш бажано принаймні близько з плазми крові, до використання рекомбінантного 5мікроодиниць/кл/день активності фактора МІ! при фактора МІЇ, одержаного шляхом клонування та вирощуванні на середовищі, що походить від пла- експресії кКДНК фактора МІ у клітинах ссавців зми крові, та не містить білків, або принаймні бли-

ГУМоса еї аї., 1984, Маштге 312:330). зько 4 мікроодиниць/кл/день, або бажано принай-

Фактор МІ має наступну організації доменів: мні близько 8мікроодиниць/кп/д, або найбільш

А1-А2-8-АЗ-С1-С2, та синтезується як єдиний лан- бажано принаймні близько 1Омікроодиниць/к/д цюг поліпептиду, що складається з 2351 амінокис- активності фактора МІЇ при вирощуванні на сере- лоти, з яких 19 амінокислот сигнального пептиду довищі, забезпеченому білками, що походять з вирізуються під час перенесення у структури ен- плазми крові. Якщо білок, що експресується, є доплазматичного ретикулума. Завдяки тому фак- ВОО-РМІЇ, клітинні лінії що мають специфічну ту, що фактор МІЇЇ є сильно глікозильованим, скла- продуктивність більшу від приблизно дно досягти його експресії на високому рівні 15мікроодиниць/кл/день, бажано більшу від приб- (20 2пг/клітина/день) (Сіпа еї аї.,, 1995, Єиг 3. лизно 20мікроодиниць/кл/день, одержують мето-

Віоспет. 232: 19-27; Каштанп еї аї., 1989, Мої.СеїЇ дом, що описаний у даній заявці.

Віої. 9: 1233-1242). Рівень експресії фактора МІ! у Як використовується у контексті даної заявки клітинах ссавців є типово на 2-3 порядки нижчим, для опису походження клітинних ліній, термін «по- ніж той, який спостерігають з іншими генами, при ходять від» включає, але не обмежений, нормаль- використанні тих. самих векторів та підходів. Про- ний мітотичний поділ клітин та такі процеси як дуктивність утворення фактора МІ клітинними трансфекція, злиття клітин, або інші способи гене- лініями знаходиться на рівні 0,5- тичної інженерії, що використовуються для зміни 1Тмікроодиниць/кл/день (0,1-0,2пг/кл/день). клітин або одержання клітин з новими властивос-

Було продемонстровано, що В-домен фактора тями.

МІ є несуттєвим для прокоагулянтної активності. Фігура 1. Амінокислотна послідовність ВОЮ-

Використовуючи вкорочені варіанти фактора МІ, ЕМІ!І (ЗЕО ІЮ МО:1). рядом груп вчених була описана покращена екс- Фігура 2. Послідовність термінальної ділянки, пресії фактора МІ! у клітинах ссавців |(Сіпа еї аї., що повторюється, ізольованої з вірусу Епштейна- 1995, Єиг. У. Віоспет 232:19-27; Та)іта еї а!., 1990, Барр (ЗЕО ІЮ МО:2).

Ргос б? Іпї бБутр. Н.Т. р.51-63; Патент США Фігура 3. Карта плазміди рСІЗ25Отк.

Ме5,661,008, АІтвіейії, 19971. Проте рівень експре- Фігура 4(а). Походження клону 2088. сії варіантів фактора МИ залишився нижчим Фігура 4(Б). Порівняння продуктивностей декі- 1пг/кл/день у стабільному клітинному клоні. лькох клонів у різних середовищах. Три точки да-

Нами було відкрито (ії) спосіб одержання клі- них представлені двохмісячним тестом на стабіль- тинних ліній з дуже високою продуктивністю білків, ність для кожного клону. що мають прокоагулянтну активність фактора МІ, Фігура 5. Об'ємна продуктивність клону 2088. та (ії) спосіб одержання білків, що мають прокоа- Специфічні втілення гулянтну активність фактора МІ, в умовах відсут- Аналіз ЕМІЇЇ ності білків плазми. Активність фактора МІ, одержаного шляхом

Спосіб одержання білків, що мають прокоагу- експресії рекомбінантного гена у популяції метот- лянтну активність Фактора МІ! у промислових ма- рексат (МТХ)-стійких клітин, вимірювали за допо- сштабах. Використовуючи створену клітину-хазяїн, могою хроматографічного аналізу. Активність кіль- були одержані клітинні клони зі специфічною про- кісно оцінювали при використанні Соаїеві Ф дуктивністю, що коливається у межах 2- фактор МИ:С/4 набору (Сготодепіх, Моіпааї, 4пг/кл/день (10-20мікроодиниць/кл/день). В умовах Змедеп) згідно з інструкціями виробника. Станда- відсутності сироватки один клон підтримував до- ртний американський антигемофілічний фактор бову продуктивність на рівні 2-4пг/кл/день. Клони з (фактор МІ), що відомий як МЕСА 1 (ОПісе ої таким високим рівнем продуктивності здатні виро- Віоіодієх Незеагсі апа Кеміему, Веїпезаа, МО), ви- бляти 3-4 мільйони одиниць на день у перфузій- користовували як стандарт для вимірювання у ному ферментаторі місткістю 15 літрів. Одна оди- цьому аналізі. (Див. Ваггомсійе, 1993, Тпготб. ниця активності фактора МІ за визначенням Наєт 70: 876).

Конструкція експресійних векторів для ЕМІЇ, ни трансфікували, використовуючи катіонний ліпі- що має делетований В-домен дний реагент ОМКІЕ-С (Пе /Тесппоіодієв,

Послідовність ЕМІЇЇ, що має делетований В- Сайпегзригу, МО), згідно з прописом іе домен (ВОО), представлена на Фігурі 1. Ланцюги ТесппоІодіе5. Ампліфікацію трансфікованих клітин масою 9ОкДа та 8ЗОкДа з'єднували за допомогою виконували з концентраціями метотрексату (МТУ), лінкера, що складається з 14 амінокислот. (Див. що збільшуються (100нМ, 200нМ, 40О0нМ та

Спап, 5.-У., «Одержання рекомбінантного фактора 8ООНМ), при 1х105 клітин на 96 комірковий планшет

МІ! у присутності ліпосомо-подібних речовин змі- у МТХ-селективному середовищі, в якому відсутній шаних композицій», патентна заявка США гіпоксантин та тімідин (ОМЕ/Е12 середовище без мМе08/634,001, подана 16 квітня 1996 року). Експре- гіпоксантину та тімідину плюс 595 діалізована фе- сійний вектор для ВОО-ЕМІИ готували при викорис- тальна сироватка великої рогатої худоби з танні стандартних методів рекомбінантної ДНК. Нусіопе, Годап, ОТ). Визначали ріст МТХ-стійких

Структура експресійного вектора (рсіІЗ25ОтЕ) клітин, а скрінінг на секрецію ВОО-РМІЇЇ виконува- представлена на Фігурі 3. Вектор включає транск- ли, використовуючи Соаїезію фактор МІ! набір рипційну одиницю для ВОО-ЕМІЇ та селективний через приблизно 2-3 тижні після трансфекції. Ку- маркер, дигідрофолат редуктазу (ап). Крім того, льтивування клітин виконували при 37"С в інкуба- для збільшення інтеграційної ефективності у век- торі, зволоженому 595 СО». тор вбудовували повторювану термінальну послі- Клонування обмежуючим розведенням довність з вірусу Епштейна Барр, яка демонструє Одиничні клітинні клони (ЗСС) розмножували поліпшене відношення селекції ліків (Фігура 2). шляхом клонування обмежуючим розведенням

Вектор представляє собою суттєво конструкцію (ОС) високопродуктивних популяцій у 96 комірко- вектора (депозитний номер АТСС 98879), який вих планшетах в умовах відсутності сироватки. було створено для включення транскрипційної Клітини висівали у кількості 1-10 клітин на пробірку одиниці, що відповідає послідовності, представле- у ОМЕ/Е12 середовище, забезпечене НитпшііпФ ної на Фігурі 1. Додаткову інформацію стосовно рекомбінантним інсуліном (СПШу, Іпаіапороїїв5, ІМ) повторюваної термінальної послідовності можна при 1Омкг/мл, 10 х основними амінокислотами (Гіїте знайти у пов'язаній з даною патентній заявці, що ТесппоІоду, Сайпег5ригд, МО), та РіазтапаїеФ введена в опис як посилання, та відноситься до людською білковою фракцією плазми (Вауе", заявки Спо та Спап, позначеної як М5В-7254, СіІауюп, МС). Ріазтапаїеф білкова фракція плазми «Термінальна повторювана послідовність вірусу (НРР) (Вауег, СіІауюп, МС) містить альбумін (8895)

Епштейна-Барр, що покращує відношення селекції та різні глобуліни (1295). Клони відбирали на про- ліків», яка подана у той самий день, що і дана зая- дуктивність ВОО-ЕМІЇ, використовуючи набори вка. Соаїеві Ф фактор МІ. Клони з найвищою продук-

Подібні вектори можуть бути сконструйовані та тивністю відбирали на стабільність у качалочних використані спеціалістами у даній галузі для оде- пробірках. Для НКВ клітин перший круг ГО5 про- ржання клітин, що експресують білки, які мають водили, використовуючи селективне середовище, прокоагулянтну активність фактора МІ. Напри- збагачене 595 діалізованим ЕВ5. Другий круг ГО5 клад, кодуючі послідовності, що кодують відомі проводили у вільному від сироватки Ріазтапасетю варіанти фактора МІ, та зберігають його прокоа- НРР середовищі, що містить фракцію при викори- гулянтну активність, можуть бути заміщені на ко- станні першого ЗСС, адаптованого до вільного від дуючу послідовність ВОО-ЕМІІ. Також, замість аптт, сироватки середовища, та забезпеченого можуть використовуватись інші селективні марке- Ріазтапагеюй НРР фракцією ри, такі як глутамін синтетаза (д5) або ген надання Походження НКВ клону 2088 стійкості до різних ліків (таг). Вибір селективного Як підсумовано на фігурі 4(а), початкова попу- агента повинен бути зроблений відповідним чи- ляція 1С 10 походила від НКВ клітин, трансфікова- ном, як це відомо у даній галузі техніки, тобто для них рСІЗ25ОТЕ після ампліфікації 400НМ МІХ у апт бажаним селективним агентом є метотрексат, селективному середовищі з 595 ЕВ5. Один з пер- для 95 бажаним селективним агентом є метіонін ших одиничних клітинних клонів (5СС), 10А8, що сульфоксимін, а для таг бажаним селективним походить від 1С10 при використанні ГО5, на селе- агентом є колхіцин. ктивному середовищі, збагаченому 595 ЕВ5, адап-

Робочі приклади тували у вільному від сироватки середовищі, зба-

Походження клітинних ліній, що експресують гаченому РіазтапаїеФ НРР фракцією.

ВОО-РМІ; селекція на ліки на генна ампліфікація Несподівано, 1010А8 показав дуже високі рівні

Тридцять мікрограмів рСІЗ25ОТ ДНК пере- продуктивності ГЕМІІ! на цій стадії (Фігура 45). Та- носили у НКВ11 І(АТОС депозитний номер СЕ. ким же чином ми проводили друге ГОС, викорис- 12568, депонована 16 вересня 1998 року, - гібрид товуючи середовище, збагачене РіазтапаїеФ НРР 2935 клітин та людських клітин лімфоми Беркіта, фракцією. Продуктивність 5СС (наприклад, 2088), див. патентну заявку США, що подана Спо у той що походять від другого ГОС, була подібною з самий день, що і дана, та позначену як М5В-7241, Ріазтапаєт |НРР фракція-адаптованою 10А8. введена як посилання) клітини шляхом електропо- 2088 показала вищі рівні вОО-РМІ, ніж оригіналь- рації при 300 Вольтах та 300 мікро Фарадах (ВТХ ний 10А8, що походить від першого І 05, у вільно-

ЕІесіго сеї! Мапіршайюг 600), при використанні кю- му від сироватки середовищі. У кінці 2088 адапту- вети на 2мм (ВТХ частина йб620). У порівняльних вали до росту у вільному від білків плазми експериментах проводили паралельну роботу з середовищі (РРЕ). Зразки 2088 депонували в

НКВІ1 клітинами, СНО (яєчник китайського хом'я- Американській Типовій колекції культур (Мапаззав, чка) та 2935 (людська ембріональна нирка). Кліти- МА) (АТСС депозитний номер СВІ -12582, депоно-

вана б жовтня 1998 року)). вність. З 28 дня до кінця перебігу ферментації,

Як показано у Таблиці, НКВ клони демонстру- клітини піддавали перфузії тим самим вільним від ють переважаючу продуктивність для ВОО-ЕМПІ. сироватки продукційним середовищем, але без 10-20 кратне збільшення продуктивності спостері- РіазтапагеФ НРР фракції. Як показано на Фігурі 5, гали у клітинах НКВ при порівнянні з клонами, що клітини продовжували виробляти високі рівні ЕМП походять від трансфікованих СНО та 2935 клітин. у середовищі, вільному від білків плазми. «Вільне

НКВ клітини, які не формують великих агрегатів від білків плазми» означає, що суттєво ніяких біл- при рості у суспензійній культурі, є бажаними клі- ків, ізольованих з плазми, не додавали до середо- тинами для експериментів по експресії білків, що вища. мають прокоагулянтну активність фактора МІП. Обговорення

Походження НКВ клітин забезпечує продукцій-

Таблиця ну систему, вільну від білків, для утворення не тільки ВОО-РМІЇЙЇ, але і інших терапевтичних білків

Експресія ЕМ та ВОО-ЕМІПУу людських також. Білки, одержані за допомогою НКВ клітин, клітинних лініях та клітинних лініях гризунів мають людську модель глікозилування, яка може збільшити напівперіод життя певних глікопротеїнів

Специфічна продуктивність (мікрооди- іп мімо. Ці клітини можуть також бути корисними ниць/кл/день)" для продукції аденовірусу та аденовірус- асоційованих штамів, що призначені для цілей генної терапії.

Наведені вище приклади призначені для ілюс- трації винаходу, який також охоплює можливі варі- анти, що зустрічаються, та є очевидними для спе- я береднє значення 5 високопродуктивних ціалістів у даній галузі. Згідно з цим, зрозуміло, що клонів (у вільному від сироватки середовищі) галузь винаходу обмежена тільки пунктами фор-

НП-не проводили мули, що представлена нижче. й й . . МЕЖ пОеСлІЛОВНОСТЕЙ // Адаптація клонів до середовища, вільного від ло» Чо. М'юттчсь спеоок поестідовностЕй білків плазми Чак, Шам ся

НКВ клони, що були адаптовані до росту як ві- рови льні від сироватки суспензійні культури, були далі «у Пкопрасідння свєтима для фактори УТ відлучені від забезпечення білками плазми. Відлу- тю» мат чення проводили у стерильних полікарбонатних це качалочних пробірках (Согпіпд, Согпіпд, МУ) при как щільності клітин близько 0,5х109 клітин/мл, вико- ше ще ристовуючи середовище, вільне від білків плазми. «рі» : й т. ік ве

Середовищем, вільним від білків плазми (РРЕ), ЗБЕ ення пеліловвість було ОМЕ/Е12 середовище, забезпечене плюроні- ве ком Еб8 (0,196), Си5оХ (БонмМ) та БГебОЛЕДТА ЧЕКУ» Оне ятутної песлуюУЮюиТ: ШУХОХНТЬ БД БОсЛіжовяютях михеького (50мкМ). Повну заміну середовища проводи кожні рр 48 годин о /та пробірки пересівали при Мід ЕМ су Акт Тут ЗУЖ ко Іу зх жх ХХ Джо 52 Тор хр Тух 0,5х10бклітин/мл. ї з 15 15

Ферментація клону 2088 Ме фік Звх дхр ко біу Бій фею Тге Уяй Ав хіх Аге УКк со Бо

Продуктивність клону 2088 оцінювали у 15- й Й й з літровому перфузійному ферментаторі. Фермен- РТ У туди т тв вхо рр Аа ХХ Зх аа Укі Тую ШУ» ух татор засівали клоном клітин 2088 при щільність Звж вх Брж ВІ ЗХ Йбе Тих Уаї Ябе пшту Рут Ля Кіх Хі хух Жхо близько Зх10єклітин/мл. Ферментатор піддавали ва в бо перфузії при нормі 4 об'єми на день з середови- МД М т мех уд ех іще СУ Рсе Жвж Кі бік дія іо Уві щем, вільним від сироватки, так, як описано у по- тут Ахв Тих Уаі Чаї ХУ ТТ Тцоїую ев Моб АХа Зех йбо Вех ХМ передніх розділах. Заключну концентрацію клітин з за ко 2х10'"клітин/мл підтримували протягом періоду сег ех Ще Ма ЯК ЛУ Узі вне Тут тр Бух Хіж Зех іх ву ха оцінки (45 днів). Як показано на Фігурі 5, протягом поши Й й ш . Бім тТух ху кар шуй ХОх Биг бум ААУ сіб цуя ЗМ Дав Ахо бух Чай перших 4 тижнів ферментації, клон 2088 піддава- їв зга 125 ли перфузії з вільним від сироватки продукційним те вка БУ 2У Вях Біо ТЕ Тух УЖ Ткр Фе Уеї до Крх 5» Ме середовищем, що збагачене на Ріазтапаїєт НРР й те по : ; БА Уги нях КІЗ Бех дек Рус вс Суз без» їх бус их тус їха Зо фракцію, та здатне підтримувати високу продукти- 145 52 152 Кб

Міх Мхії Ахр іо Ха! мух Рхр їжа Ах» 5ех Зі МУ 316 біт лік ши Тагобеу Ніе тТух йке Таж 235 Бій Маї піч Ах засо Тс йхи Тух ЖіХ 355 зле її за5 234 зу

Тїжмк Укі бус та Бі: Ф3у бку 500 Ді» ох Сім Му» Уве дію Тих їжи Ми Зктр о Зех Зжу Бус Кіх хі Бех зх Ах» Асу дія бій Зах пір пах 185 545 135 Зх чгУ 830

Щі мух їмо їїю бич фен Же Ді Ма1 б» йхм іє Щіу їх Щех Тер за бо бій Бпз пуа Дух МІ Уа3 бе» йію 435 ОБ» ТЕХ Ляр 03у кг 135 225 зу 83 342 842

Хі Жех 505 Же Мух Дом Зюу інсо Ме дію Люр лхФ ою дів кла Жох Газ вл оЗій Всх зко Ттх зує бу із без дво діє Ніж Бей Зх Бех

КЕ зії лай еза 35 ав: зі» ху Ах Хтр бхо бух Мох Піх ХБт Узі дело БУ ЖЖт Чай йо» ЖІ їез піу бе Тух 3і« дозу Дів б)и Чиї ші дер Авя Таж Меш Чаї ТВ 255 234 З3х 340 як5 зт 575 832 а«т їех тк Му ех Хі» Б1у Суб Ніб буд мух Зх кі Хух фтор Мія Мко дув Аля 515 Дія Зау ху Бла туї йхг Ре тус Зюх Зжх їж Ї1о т» 23 755 285 з ах

Мі іє бАу Меу пу Хвх Твх йки З)и кі іх Зжх Д38 Ріо їв» щу» лат ту 5ІЗ бій Ахр діх Зуб Ха іх Аїз 635 рто Алз Буз зп Рко лей хе до 936 ву ЗУ

СІ Міо ТВУ Сх фе Ук) Ауб ек Міх су щі» Ада Зах їни щі Щ5е Укі Шух ко Кох біо Тох Муз ТЬх Тух Бе Тер Ку Ха) бій Віз Щі5 2 Б ха3 5 ЗІ з25 йвх буо Тік ВХ Уа во ТВх Мк Ма пс фею їх Мах ро бйео йщід Мет ліз хо Тах Му Хор Січ Фби зв пуз Бу Зі» бл хів Тух вла ха 53 зай зза з3У ка сів бе хи фо УМж сух Кіх Їїє« й«гоЗег іх щіх Міо Ахр обі Моє Бжу Ахр Хаї Хор ко Біх хе Алр Узі Міз Беу діу бом хе бАу бли за 315 ще 3хо па 52 к5 З-й

ЯКО мія Тут Мі ух хі Же: кі Пус хо їх пам йхо дію Зо Ко Тез пво хЩз СУх Яїо ТВу З5ю» Ту йо бл йхо Ві Бля ау ка ЗА з2ї хай 235 вх о 87 мех мус Аою Мох біз фіз Айфе Бім Хор Тух Зжр Ямв Мяр ден Хих АЗК чаї ЖВХ Узі Зі ба Фа» Зіз ем Ки фФее тих Хо Мув Аве Зам Твх за? з45 а зе 223 зах ех бін Меї Мем Ук) УЖі Ах Фйк Лор Жар хв Ахя Зех рко Кеу Кіе цех Зах Тур Ту Же Трх 3 Ала мех бі йха б» Су дл ія Бл 355 зо з» 285 дес» х095

Жлю бій фХе Мху бек уЖі Аіа їх Ктє Міх Бу дух Тв Ткр Маї Щіх стх Ах 1іо бік Же бін Ах Рг» ах БРоЄ Із біз дхо Тук Ат Ре яма 375 з8а а УЗ 152

Тух ЇТіє« Ат» хіх іо пін біо дор Тер Кор тух Або ?сю бе» Меї Тех Міх міх Хіє йо» ЗАМ Жук тік Мет Жер Твх ою рез Біу йжо мах Меї

З3Е з5а зак з 3525 1235 1035 3542 діх Хка Вор ков Мхо Зюх Туг бух Жех щі» Тух йо До» До» ЩіЖ ре іх Зах йхр жі» Мха Х1ю Кху Жур Тух фе» без Бех Мих Міу бег йхо 355 ів 415 1545 із 325 сів ле 11 Б3у Ахо бух Тух фут Хух Ме3 йху буе Моб ля Тух ВХ Фі: хи Хіс Яхх Мих фі» Ж)іу Ре Бсу іу Віз Уаі Бе ЗВх Уза дз ях? 45 45 зав 5-8 ї1979 жор сіс Же Ба»х бує Тйх Аху дім Аж їзю Фіз ів бі Хох Щу Це бух фух йо іх ТУук бух Мжу діа йез Тух дей дез бух бто Зі УЗ) «55 45 445 555 1935 нах

Зам 5АЖ Кт без ям Тух ЗУ; щі» УЗА жу жхи ТВг їз Зо їі» Та тТве ІЧ Таг Мі ЗМ МОХ без фуо Бех мух ля Фу ті Тур Ах ув ах» ів зо ВЕН іх 11952 їмо цу кхн біо Жіх Вес жде Бус Тук Аха 212 їту Бу Ні Біу зів дім бух би Хіт ЗІ їх Міх їм Міх Ліх Ф1у мех Шу Тл Бу» Та «85 75 я?» яз зів хм з 1325 - 3 5 ДК. ж 5 їх ун зр. РО В т 7

Тих Азр М АКа тва ки Ту Бех Ах ще іо то БЕЗ діу їні кує ісз чаї Тух Жюх док Буг Сух 51п ТИХ то феш 03у Миб Ма ех ЩУу - а ріж КУН 1135

Ягх ки БуЗ - Тр Рго. 156 їех їх у сін їі УБе їже тус бух Ві Хіо МреФф Кар офве бі бік ЇВс Аза Зех Фіу 51» Тул б)у бів Тур мав 13445 МЕ

Тксротвс уггі Жвх хі біх дор бій Ріо Тах Му З то Мгу ку й й хротве її 5 жі бік Ко у о Так Мо Зех т Ттго мех суг Кіш ртго Мух йем Віа Аге їз Мі Жук ех З1уУ дак тів дви лЛіх Тхр 2358 1155 1165 м отвх аг ік тТух бех ве А Кви с ях Зав мох І

Бе дай хз Хук Тух бе і тва ЧЬА Кв МЕ кяФ еф вар уех Ада Зех Тих Гую біо Вжса 9» йис Тср Хі цуг Уа) Ах фен б Азія Ехо що й зі з во «. п ї У з їх тем її о АК их ам х о з.

МЕ Оу іссо Тхе БУ т їко цех Хі« Сує Ії пув бі люк хві ре Мех її» ді із б51у дів Буб ТЕ ФІН Обі? Аіз лху 01» Мух Рує Зеох то т М т 1155 зї8а 1185 Хо к : вія їх е я за зле й тв окхФ у хяв бла Хбе Бех Бех Ахи дуб Кс ля Ма ТАЖ де их ЗЕг їж Тух ТАН Вех БІО Роз їіє Т1є Мек Тук Вес рич Айр Чіу хуй тм ці ідо» . ів 1215 ої 4 Ххх деу Вик оттр Тух З хі Ха жія ; Ії ; бе»х мої Же ов охо Мих вгц Вк зве Тух їжа Твж бі ма Зв ох цех Тв бій ЇВ ТУК Ак йіу Ах вх Тух З1Ж Хв їжи Меб унії Тис 7 н 1225 1225 3235 -- ї и ді я х щі т Я ч жхе вне ува то дя хо ків ре Ух віп бжо ві дер ято Зх Же ток БАу Ази Зх) лжр зок ис б)у Хіз Муз Віх йх» їЇМа Рі Ахи ха їй 1235 1242 ї24а іп ліз ех йха їїх Мех Міо ех Хіє ЯЗ» сі» Тук меї Вих ех Й бів Аіж ех Ах іх Ме КІ ть ЗУ тує Ахт Бе Усе їз д3ю Ліз мку Тух Ііе Лоу їн Щіа хо Ту Вій Туг Зех ШХая .- ї25й зах 1254

Бас ЗіМм рлч Жех Узі Суз Бен іо бік У«ї Аї» Туг Хур Ту Га бах

Р ни се " 535 й ук я 52 Ак ех Твх їво хка Беж бо Ме Мк бі бує Мир обо лях бок сСуг і268 1579 1275 1259

Зеу Щі 5ІУ Ві 6315 ТйхУ Авт БП З» Зех хі бю Ера бе: зу Туї й й

РУТ 8 ЗЕ Бит Ме рез ем БІ» Мех ФМ Звл фу Дах 2315 Зех юр Аза Фів іо й ви ї255 1:35

ТВ; ке бух Міо ур мех З3А ТУЮ й о Тах без ТВ бач ба вх. В . вх ке дух р Ух мех ЧК ТУк чех Хар твх їз с їй Тв ді ос йве Тук бле ТВл Лав Мах ЮВке лах тс Тклк о й«с тха Бех ізо 13655 35133

Ус Зкг о бІУ Ми Тх ЧоХ Мне Меж ЗегоМет пін Ах го оду йхо Тв пат ин вв вв У ій їух Аїх пд їжо Ніх і» 019 Фіу Луд бхк Аза Ліз Тур Аг ба бІп

Й ху ізля 1325

Ті їск су Сух тя хо 5ех Те Зеу Алп ли сіу мес ТВ дів ї525 у се вва дат ча нео У Маї Дал лес Еко уз Чіз Тхр їх біп кі Азр Бон СІ їх Те Мет - із59 - 1325 хзій те їохм ут МУЗА бив Увт СКх їув Ах ої 5іу Ахн о Хує бух 910 ву бою Бу МЕС хр ту ТЕ ФУ хв тує Тух ЩЕ ув мах Тк Е1у 34 Тйх ТБг бій ХУ Ма) рух бех ди Мби цу дет ї345 і380 1355 ізо

Ар бхі: Тух піо Бар о Їзк бос Ліх Тук бею їлч Хет ух Зх Ах діх

Зх 235 735 Мет ух Уаї пух бко Би їсм І1о Зех Беу Зег бів Бхр йі9 Щіз бів ї3455 1379 1їхт8 тТ3е віх йко дев йо ЕКе Хех іо Жов Вхх Буо Узі рим мо Асу Жіу Й за я то Ткр ХвЕж ім ВЕ Кб БАй Асл біу пуб уеї пух хі Рож біо щіх дн 1580 1185 зо йіп лху 5) К5е тах Яг Тс тах во бай Зжу зр іх бім ойіо їзя Й 255 ке 755 бі» Ахри За: Жке Мох то Ухі Чаї Ахо бек оїе Мер Ко Во ме їси - 1135 1450 1405

Ззр Туг Ар хр ТЕ Щі» ймс Укі сіб Моб бух фу 514 Жжи КМе дор й

Кер 75 тай Тит дка Тух їох Аке Х3е Віз Рке бій бек Ттф Узі Ніз шій Ї3в6 а

М 1515 1429

Ії Тух Ахт Зі Лор сів ха Зі Бех хо Ах Бех ме іп ДУБ ух я й й зах 796 тах за їж ху мех жіз Ужі їжи біу бує сію хія сіх зхо ех Тух умах 3450 Й 1з3к

«2122 ДНК «213» Штучна послідовність «30» І «223» Опис штучної послідовності: походить свідо послідовності віруса : Етщиетейна Барр ко 2 .

Чеасаасоуач сусуасуаад дуссесеуоя содассесуд савасасвяас ссододетес 50 чазуєцассо ауосзеусяс доссеазузу сссобачасу асасадусва сестуасава 150 часссссесау даавдасссс соуачадсає соовчссьо тсодсочуєсе акочачачау ВО сдадесвЕЧе спсасаєтос будазаваці удасчудудеч бодсессксес сесосоуосс 540 сссадсссес ссусададзад садсусвасо зсододсовосИ досозачечє сододессяс 00 дпдскссодчо дчссдсудос зосозасодис достудсакс ссоузудассу обуодоуцие Зб, часу зсусоуосЯс адссаєусоє чассусазсо зу 42 1 АЖВЖЖХОАУ БОБЯБУМОБО ПаБЬВУОАВЕ СиЯСеКаКРЕ КТЄЧУХККТ 5) ЧБЕТЧНЬКК ІАКРВРРИМИ СІСРУХОВЮУ УСУУТІТОКУ МАБЕВИВМНА 103 УСУБТЖКАВЕ САКУВОСТВО МЕКУООКУКК оЗ5НТУУНОМ ІКЕНСЕМАВИ 154 РЬСІТЕЧУТО НУБІЮССИО БІЗОАСОЧЕВ БОЗЮОАКЕКМО ТІНККІВСЕА 361 чЕОБСКожиХ ТКАНІ ОААЕКИДЯРК МИТО ТУМА БИБССТОСНХ 251 КЕТХИНеХСН СТТРЕУВОХЄ ХЕСНТРІХУВИ НАОДяСВІВР СЕБЕ зві МпабОКБЬКС нуЗаВОНІЄМ ЕЛУТКТрОСЬ БЕРОЕЖНККМ БАБІСВООХ 381 ТЮЕЕМИУУВХ ПОРЯБРЯЄТО ХВОУАЖКНИК ТКТВУХААИК БОМКАРІЬ 401 АРПДЕЯУКОО ЖТОХМСРОВІЄ ВКУККУВЕМА ТТОЕТЕКТВЕ ВІОНЕЕСТЬЯ 45) РІБХБНУСЗКЕ ШОІХУКМОДО ВРЕМІХВНОЮ ТОТВАБЕВВА БЕКОУЧКНЬКО 553 ЗРІБРИБІКК УВИХУТУЮТ: ЕТКОЮКВСЬТ РЖУЗЗКУММЮ РохаБсЬІКе

ЗБЕ ВБІСЯКЕОУВ ОдоНОтиВОК ВМУТБЕЗУКО БМВЗЖУЦТЮИ ЗОБЕБЕНРАВ

Жоі1 КОР тО БИТВКУКСТ ТЕО МВЕУВУККХ: ЗІБВИТОКОО кі ЧЕЕЗОТТККИа КМУУЕОЮТЬТІ КРЕУВСЕТЧУМ БИЕМЕС ЖІ. ЗНО МИ

ТлОх ОМТВЬСКУВУ СОКМТОрІХИ ОЗУБОХИДУЄ ЗЕКММАТЕеА ЗЕВОМеРЛЖ 75: ВБОНХІТВХХ СОЄБОБЕТИХ СОТІЗУЄМКК КОРОТТПБОЕ МОЗРЕЕТОКК досл лтоцА СОХОМОВнИ ЗОЛССКАВОЄ ОТБВМОСОСИЯ САЕАССТЯАМІ (БО)

ОЇ ТЕКУРІВАУЄ РОКОТННЯЗІ КИУБАМеМІЙ С5ЧРОКККУ КОВБЕТВЯВЕТ МИ Й й Й Й 851 ОРСуНОВІМИЕ ЯКО ОРІХВ ДЕУКОМІМУТ КАМОДОВеТВ КУБЕБІВЖКИ пОММОСТСІ ООН АСС ВООСАВОсат СоССкаВовО сум Исюта 1390) 80Х ПОВОБАБРИХ МЕМКОМЕТЕХ ТЕУКОСННМА РТКОБКОСКА ЯАХРЕОЧХ дсалА СОСХЦАСЯХА ЗСССОССКО САДАШАИО СОН АР 150 1 КПЧИЗЕЬІЄР БРУСВІМТІМ ВАИСВОУТ) БЕКСЕЕТУМВ ЕТКБИХЕТЕЯ САОАНИЮВА СОБЮЖАСАНА ЗЮСОСОСЬЯ САВАНАСОЮС СОМНИЮСЕт (5

Ії1501 МЕРМСВАРСМ ХОМЕОРТІКО ЗуВЕНАЇМСЇ ЗМОТОеСрУМ ДОРОБІВИУЮ дООсОБОИХ ТТ СОООТИ АТОМІ СОБСХСАТЮЄ СОСОСАЕТОВ ІОВ їп53 оВМеЗВЕМНІіН ЗХНЕБОНУЮКТ УВАЖЕЕКУКМА БУБОТРОЧУЕ ТЕНи еВКАЄ ле смог -ге ХІЮ СеТАпоИИ І 3101 ХЯВУБССІСЕ НІНАСНеТЬК ІУТККОТе ХсМЛеСНУЮю РОХАСОЦУЄ 00ССоАКАСТ ООМСОЄЄОІ ЗОФСКУССС ООПЕЮЮЮ СТАДО (ДВ 3151 ВВ КАИОИ У5ОЗХМАЙСТ КБРЕСИХКУЮ ПОАРМІТНОЇ КТОБАВОКУВ гсзсвакоМ: СУХО оо свос Зою собозтТоюИк ІБН тва ЗЕКтЗоНИІМ ТБМООККНОЄ УВБМОТОТКИ ТРРОМУВЕКЕ ІКМНІУНЬСЇ зуостосово вастосФВс ОетлТоюс БСХООСетТт СооОЮАХИ (850: 1205 ЖЕЖЕНЕАТЕХ КЯКАНІНОС ВОМАЖВРОУМ ВРКЕНЬСУБЕК ОКТМКУТСУТ позу тТо ШООоОТ ВОМ оОсес АЗОСАТОСОХ пасоотовуо МУ 3335 ТОКІО ТЕ МУТКИКОІВК ООН ТИК КОМУ КО СОТИХ ма авт 3423 МЗЕЮРРБОТЕ ТОНІНРОВИУ КОТАЮВМЕТІ ЯСИВОСЬХ 7 шо

Фіг Фіг. 2

НКВИ З рСІб250ТА я, й І " смерч сом МтТю. ; ЦІ Перше 05 10АВ(ЕВ5) я я Ї БЕ адапта тк рСІЗ25оте Ї ція 10545 ре 1048 (Ріазплаюаіс) ; воб-ун й Ї дорувв у. 2088 (Ріаєтапаєс) 5, ВЕ й це ; й І РРЕ здантація сон «фенів ! 2088 (РРЕ) ;

Фіг. З Фіг. 4А я В рт от ттоототтеетте етос етос внчнт

Е

Е і ві А і. Е ПИ а ЕЗ

Га 2; но г-Я ; з и-- 533... в ши г щ- шо . г і с- -- - 5 1 « 5 Лк Ти ши ша , н- в ша М ВЕ ше ;

ТОБ Т0БЩЕВЕ) ПОДВ(РТаютьтво) ОБО яєтне зер о во; 70 дк зе ча 5 5 Клон

Фіг АВ Фіг. 5

Комп'ютерна верстка 0. Гапоненко Підписне Тираж 26 прим.

Міністерство освіти і науки України

Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна

ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601