JP4240818B2 - 第viii因子のための発現系 - Google Patents
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Description
関連出願:MSB−7241(米国第09/209,920号)、「哺乳動物遺伝子発現のためのヒトハイブリッド宿主細胞(Human Hybrid Host Cell for Mammalian Gene Expression)」と呼称されるチョウ(Cho)への出願、およびMSB−7254(米国第09/209,915号)、「エプスタイン−バーウイルスの末端反復配列を有するベクター(Vectors Having Terminal Repeat Sequence of Epstein−Barr Virus)」と呼称されるチョウ(Cho)およびチャン(Chan)への出願は関連する主題を含有する。双方の出願は1998年12月10日に出願された。
【0002】
(発明の背景)
分野:本発明は第VIII因子およびその誘導体の改良された製造方法に関する。該方法は、全般的に、ベクター構築、トランスフェクション、およびタンパク質を含まない条件下で高められた生産性をもつ細胞系の選択に関する。とりわけ、本発明は、工業的スケールでの第VIII因子の凝血促進活性をもつタンパク質の製造方法に関する。
【0003】
背景:ヒト第VIII因子は補助因子として第X因子および第IXa因子の活性化に関与する微量の血漿糖タンパク質である。第VIII因子の遺伝的欠乏は第X因子に関連する出血性障害、血友病Aをもたらす。血友病Aは精製された第VIII因子で成功裏に治療することができる。血友病Aの置換療法は、血漿由来の第VIII因子の使用から、哺乳動物細胞中で第VIII因子のcDNAをクローン化しかつ発現することにより得られる組換え第VIII因子の使用まで進化した。(ウッド(Wood)ら、1984、Nature 312:330)。
【0004】
第VIII因子はA1−A2−B−A3−C1−C2のドメイン構造を有し、そして2351アミノ酸の一本鎖ポリペプチドとして合成され、小胞体の管腔への移動に際してこれから19アミノ酸のシグナルペプチドが切断される。第VIII因子ははなはだしくグリコシル化されるという事実のため、第VIII因子の高レベル発現(>0.2pg/c/d)は達成するのが困難であった(リンド(Lind)ら、1995、Eur J Biochem.232:19−27;カウフマン(Kaufman)ら、1989、Mol Cell Biol.9:1233−1242)。哺乳動物細胞中での第VIII因子の発現は、類似のベクターおよびアプローチを使用して他の遺伝子で観察されるものより典型的に2〜3桁より低い。第VIII因子のための産生細胞系の生産力は0.5〜1μU/c/d(0.1〜0.2pg/c/d)の範囲にあった。
【0005】
第VIII因子のBドメインは凝血促進活性に重要でないことが立証されている。第VIII因子の短縮変異体を使用する、哺乳動物細胞中での第VIII因子の改良された発現が多様なグループにより報告されている(リンド(Lind)ら、1995、Eur J Biochem 232:19−27;田島(Tajima)ら、1990、Proc 6th Int Symp H.T.p.51−63;アルムシュテット(Almstedt)への米国特許第5,661,008号、1997)。しかしながら、第VIII因子の変異体の発現レベルは、安定な細胞クローンからは1pg/c/dを下廻ったままであった。
【0006】
(発明の要約)
われわれは、今や、(i)第VIII因子の凝血促進活性を有するタンパク質の極めて高い生産性を伴う細胞系を生じさせる方法、および(ii)第VIII因子の凝血促進活性を有するタンパク質の血漿タンパク質を使用しない製造方法を発見した。
【0007】
第VIII因子の凝血促進活性を有するタンパク質の工業的スケールでの製造方法。新たに創製された細胞宿主を使用し、2〜4pg/細胞/日(10〜20μU/c/d)の範囲の比生産性(specific productivity)をもつ細胞クローンを生じさせた。血清を含まない条件下で1個のクローンは2〜4pg/c/dの1日の生産力を継続した。この高レベルの生産力をもつクローンは、15リットルの灌流醗酵槽中で1日あたり3〜4百万単位を生産することが可能である。1単位の第VIII因子の活性は、定義として、血漿1ミリリットル中に存在する活性である。1pgの第VIII因子は一般に約5μUの第VIII因子の活性に同等である。
【0008】
本明細書で使用されるところの第VIII因子の凝血促進活性を有するタンパク質は、インビトロもしくはインビボのモデル系において第X因子の活性化を引き起こすタンパク質である。制限するものでない例として、この定義は、完全長の組換えヒト第VIII因子およびBドメイン欠失第VIII因子(その配列を図1に記述する)を包含する。
【0009】
第VIII因子の凝血促進活性を有するタンパク質の高レベルの発現は、血漿由来タンパク質を含まない培地中で成長される場合に最低約2μU/c/d、もしくはより好ましくは最低約4μU/c/d、もしくは最も好ましくは最低約5μU/c/dの第VIII因子の活性、または、血漿由来タンパク質を補充された培地中で成長される場合に最低約4μU/c/d、もしくはより好ましくは最低約8μU/c/d、もしくは最も好ましくは最低約10μU/c/dの第VIII因子の活性を意味する。発現されるタンパク質がBDD−FVIIIである場合、本明細書に記述される方法により、約15μU/c/dまで、より好ましくは約20μU/c/dまでの比生産性を有する細胞系を得ることができる。
【0010】
細胞系の起源を記述するために本明細書で使用されるところの「に由来」は、限定されるものでないが正常の有糸分裂の細胞分裂、およびトランスフェクション、細胞融合のような方法、または細胞を変えるもしくは新たな特性をもつ細胞を生じさせるのに使用される他の遺伝子工学技術を挙げることができることを意図している。
【0011】
(特定の態様)
FVIIIアッセイ
メトトレキセート(MTX)耐性の細胞集団中での組換え遺伝子発現から得られた第VIII因子誘導体の活性を発色性アッセイにより測定した。製造元の説明書に従い、コアテスト[Coatest](商標)第VIII因子:C/4キット(クロモゲニックス(Cromogenix)、スウェーデン・モルンダル)を使用して活性を定量した。MEGA 1(生物学研究・審査局(Office of Biologics Research and Review)、メリーランド州ベセスダ)として知られる米国の標準的抗血友病因子(第VIII因子)をこのアッセイで測定の標準として使用した。バロウクライフ(Barrowcliffe)、1993、Thromb Haem 70:876を参照されたい。
Bドメイン欠失FVIIIのための発現ベクターの構築
Bドメイン欠失(BDD)FVIIIの配列を図1に示す。14アミノ酸よりなるリンカーにより90kDおよび80kDの鎖を連結した。1996年4月16日に出願された、チャン(Chan,S.−Y.)、「混合組成のリポソーム様物質の存在下での組換え第VIII因子の製造(Production of Recombinant Factor VIII in the Presence of Liposome−like Substances of Mixed Composition)」、米国特許出願第08/634,001号を参照されたい。標準的組換えDNA技術を使用してBDD−FVIIIの発現ベクターを作成した。該発現ベクター(pCIS25DTR)の構造を図3に示す。該ベクターは、BDD−FVIIIの転写ユニットおよび選択可能なマーカー、ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)を包含する。加えて、組込み効率を増大させるために、高められた薬剤選択比を示すエプスタイン−バーウイルスからの末端反復配列(図2)をベクターに挿入した。該ベクターは、本質的に、図1に示される配列に対応する転写ユニットを包含するよう工作されているベクター(寄託されたATCC 98879)の構築物である。末端反復配列についてのさらなる情報は、本出願と同一日に出願されたMSB−7254、「エプスタイン−バーウイルスの末端反復配列は薬剤選択比を高める(Terminal repeat sequence of Epstein−Barr virus enhances drug selection ratio)」と呼称されるチョウ(Cho)とチャン(Chan)への関連特許出願(引用により本明細書に組み込まれる)に見出すことができる。
【0012】
第VIII因子の凝血促進活性を有するタンパク質を発現する細胞を得るために、類似のベクターが当業者により構築かつ使用されることができる。例えば、凝血促進活性を保持する第VIII因子の既知の変異体をコードするコーディング配列をBDD−FVIIIのコーディング配列の代わりに用いることができる。また、dhfrの代わりに、グルタミン合成酵素(gs)もしくは多剤耐性遺伝子(mdr)のような他の選択可能なマーカーを使用することができる。選択剤の選択は当該技術分野で既知であるとおり相応して行わなくてはならない。すなわち、dhfrについては好ましい選択剤はメトトレキセートであり、gsについては好ましい選択剤はメチオニンスルホキシミンであり、そしてmdrについては好ましい選択剤はコルヒチンである。
【0013】
(作業実施例)
BDD−FVIIIを発現する細胞系の派生:トランスフェクション、薬剤選択および遺伝子増幅
2mmキュベット(BTX部品番号620)を使用する、300ボルトおよび300マイクロファラドに設定された電気穿孔法(BTX電気細胞操作装置(Electro cell Manipulator)600)により、30マイクログラムのpCIS25DTRのDNAをHKB11(ATCC寄託番号CRL 12568――293S細胞およびヒトバーキットリンパ腫細胞のハイブリッド、本出願と同一日に出願されかつMSB−7241と呼称されるチョウ(Cho)らへの米国特許出願(引用により本明細書に組み込まれる)を参照されたい)細胞に導入した。HKB11細胞を用いる作業と平行するよう行われた比較実験では、ライフ テクノロジーズ(Life Technologies)により提供されるプロトコルに従って、陽イオン性脂質試薬DMRIE−C(ライフ テクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ゲイタースバーグ)を使用して、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)および293S(ヒト胚腎)細胞をトランスフェクションした。ヒポキサンチンおよびチミジンを欠くMTX選択培地(ハイクローン(Hyclone)、ユタ州ローガンからの5%透析ウシ胎児血清を含むヒポキサンチンおよびチミジンを含まないDME/F12培地)中、96穴プレートあたり細胞1×106個で、増大するメトトレキセート(MTX)濃度(100nM、200nM、400nMおよび800nM)を用い、トランスフェクションされた細胞の増幅を行った。MTX耐性の細胞を成長について評価し、そしてトランスフェクション後約2〜3週間にコアテスト[Coatest](商標)第VIII因子キットを使用してBDD−FVIIIの分泌をスクリーニングした。細胞の培養は加湿された5%CO2インキュベーター中37℃で行った。
限界希釈クローニング
血清を含まない条件下での96穴プレート中の高生産集団の限界希釈クローニング(LDC)により単一細胞クローン(SCC)を生じさせた。細胞は、10μg/mlのヒュームリン[Humulin](商標)組換えインスリン(リリー(Lilly)、インディアナ州インディアナポリス)、10×必須アミノ酸(ライフ テクノロジー(Life Technology)、メリーランド州ゲイタースバーグ)、およびプラスマネート[Plasmanate](商標)ヒト血漿タンパク質画分(バイエル(Bayer)、ノースカロライナ州クレイトン)を補充されたDME/F12培地中、ウェルあたり細胞1〜10個で植え付けた。プラスマネート[Plasmanate](商標)ヒト血漿タンパク質(HPP)画分はヒトアルブミン(88%)および多様なグロブリン(12%)を含有する。コアテスト[Coatest](商標)第VIII因子キットを使用して、BDD−FVIIIの生産性についてクローンをスクリーニングした。最高の産生クローンを振とうフラスコ中での安定性の評価に選択した。HKB細胞については、5%透析FBSを補充された選択培地を使用して第1回のLDCを実施した。第2回のLDCは、プラスマネート[Plasmanate](商標)HPP画分を補充された血清を含まない培地中で適応された第一のSCCを使用して、血清を含まないがしかしプラスマネート[Plasmanate](商標)HPP画分を含有する培地中で行った。
HKBクローン20B8の派生
図4(a)に要約されるとおり、最初の集団1C10は、5%FBSを含む選択培地中での400nMのMTXでの増幅後にpCIS25DTRでトランスフェクションされたHKB細胞由来であった。5%FBSを補充された選択培地を使用してLDCにより1C10から生じられた最初の単一細胞クローン(SCC)の1種、10A8を、プラスマネート[Plasmanate](商標)HPP画分を補充された血清を含まない培地中で適応させた。予期しないことに、10A8はこの段階で極めて増大されたレベルのrFVIII産生を示した(図4b)。従って、プラスマネート[Plasmanate](商標)HPP画分で補充された培地を使用して第二のLDCを行った。第二のLDC由来のSCC(例えば20B8)の生産性は、プラスマネート[Plasmanate](商標)HPP画分で適応された10A8と同様であった。20B8は、血清を含有する培地中での第一のLDCから生じられた元の10A8よりも高レベルのBDD−FVIIIを示した。最後に、20B8を、血漿タンパク質を含まない(PPF)培地中での成長に適応させた。20B8のサンプルをアメリカン タイプ カルチャー コレクション(American Type Culture Collection)(ヴァージニア州マナサス)に寄託した(ATCC寄託番号CRL−12582)。
【0014】
表1に示されるとおり、HKBクローンはBDD−FVIIIについて優れた生産性を表す。トランスフェクションされたCHOおよび293S細胞由来のクローンと比較された場合に、HKB細胞で生産性の10〜20倍の増大が観察された。懸濁培養で成長される場合に細胞の大型の凝集物を形成しないHKB細胞は、第VIII因子の凝血促進活性を有するタンパク質の発現に好ましい細胞である。
【0015】
表1.ヒトおよびげっ歯類細胞系におけるFVIIIおよびBDD−FVIIIの発現
比生産性(μU/c/d)*
FVIII誘導体 BHK 293s CHO HKB
完全長FVIII 0.45 1.2 0.5 1.0
BDD−FVII ND 2.5 1.0 20
*5個の高産生クローンの平均(血清を含まない培地中)
ND=行われていない
クローンの血漿タンパク質を含まない適応
血清を含まない懸濁培養物として成長するよう適応されたHKBクローンを、血漿タンパク質補充物からさらに引き離した。引き離し(weaning)は、血漿由来タンパク質を含まない培地を使用して細胞約0.5×106個/mlの細胞密度で、滅菌のポリカーボネート振とうフラスコ(コーニング(Corning)、ニューヨーク州コーニング)中で行った。血漿タンパク質を含まない(PPF)培地は、プルロニック(pluronic)F68(0.1%)、CuSO4(50nM)およびFeSO4/EDTA(50μM)を補充されたDME/F12培地であった。完全な培地交換を48時間ごとに行い、そして振とうフラスコに細胞0.5×106個/mlで再植え付けした。
クローン20B8の醗酵
クローン20B8の生産性を15リットル灌流醗酵槽中で評価した。醗酵槽に細胞約3×106個/mlの密度でクローン20B8細胞を植え付けた。先行する段落で記述されたとおり、1日あたり4体積の速度で血清を含まない生産培地で醗酵槽を還流した。評価期間(45日)を通じて細胞2×107個/mlの最終細胞密度を継続した。図5に示されるとおり、醗酵の最初の4週間の間、クローン20B8はプラスマネート[Plasmanate](商標)HPP画分を補充された血清を含まない生産培地で灌流し、そして高生産性を継続することが可能であった。第28日から醗酵運転の終了まで、同一の血清を含まないしかしプラスマネート[Plasmanate](商標)HPP画分を含まない生産培地で細胞を灌流した。図5に示されるとおり、細胞は、血漿由来タンパク質を含まない環境中で高レベルのFVIIIを産生し続けた。「血漿由来タンパク質を含まない」は、本質的に、血漿から単離されたタンパク質が培地に添加されていなかったことを意味する。
考察
HKB細胞の派生は、BDD−FVIIIのみならずしかし他の治療的タンパク質も同様に製造するためのタンパク質を含まない生産系を提供する。HKB細胞から産生されるタンパク質は、インビボでのある種の糖タンパク質の半減期を向上させるかも知れないヒトのグリコシル化パターンを有する。これらの細胞はまた、遺伝子治療の目的上設計されたアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス株の製造にも有用であるはずである。
【0016】
上の実施例は本発明を具体的に説明することを意図しており、そして当業者に変形物が思い浮かぶであろうと考えられる。従って、本発明の範囲は下の請求の範囲によってのみ制限されるべきであることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【図1】発明にかかる、BDD−FVIIIのアミノ酸配列(配列番号1)。
【図2】発明にかかる、エプスタイン−バーウイルスから単離された末端反復(TR)配列の配列(配列番号2)。
【図3】発明にかかる、pCIS25DTRのプラスミド地図。
【図4(a)】発明にかかる、クローン20B8の派生。
【図4(b)】発明にかかる、多様な培地中での数種のクローンの生産性の比較。各クローンの2ヶ月安定性試験からの3個のデータ点を提示する。
【図5】発明にかかる、クローン20B8の体積測定の生産性。
【配列表】
Claims (6)
- CRL-12568としてアメリカン タイプ カルチャー コレクション( American Type Culture Collection )に寄託されている細胞をプロモーターに作動可能に連結された第VIII因子の活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチドでトランスフェクションした細胞を、該タンパク質を発現するのに十分な条件下で成長させ、次いで該タンパク質を単離することを特徴とする、第VIII因子の活性を有するタンパク質の単離および生産方法。
- タンパク質が配列番号1に表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 細胞を血漿由来のタンパク質を含まない培地で成長させた場合に、該タンパク質が少なくとも2μU/c/dのレベルで発現されることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- タンパク質が少なくとも4μU/c/dのレベルで発現されることを特徴とする請求項3記載の方法。
- タンパク質が少なくとも5μU/c/dのレベルで発現されることを特徴とする請求項4記載の方法。
- CRL-12582としてアメリカン タイプ カルチャー コレクション( American Type Culture Collection )に寄託されている細胞。
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