JP2002500861A - 組換え部位を有する核酸を使用する組換えクローニング - Google Patents

組換え部位を有する核酸を使用する組換えクローニング

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Abstract

(57)【要約】 操作した組換え部位および組換えタンパク質を使用してＤＮＡ分子のセグメントを移動または交換し、所望の特徴および／またはＤＮＡセグメントを有するキメラのＤＮＡ分子を提供するためのインビトロおよびインビボでの、核酸、ベクター、および方法の使用による組換えクローニングを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、組換えＤＮＡ技術に関する。操作された組換え部位を有するＤＮＡ
およびベクターが、組換えタンパク質を用いるＤＮＡセグメントの効率的かつ特
異的な組換えを可能にする組換えクローニング方法における使用のために提供さ
れる。このＤＮＡ、ベクターおよび方法は、インビトロまたはインビボにおける
、ＤＮＡのサブクローニングのような種々のＤＮＡ交換のために有用である。
【０００２】 （関連技術） 部位特異的リコンビナーゼ。部位特異的リコンビナーゼは、多くの生物（例え
ば、ウイルスおよび細菌）において存在するタンパク質であり、そしてエンドヌ
クレアーゼ特性およびリガーゼ特性の両方を有すると特徴付けられている。これ
らのリコンビナーゼは（いくつかの場合においては関連するタンパク質とともに
）、ＤＮＡ中の塩基の特異的配列を認識し、そしてそれらのセグメントに隣接す
るＤＮＡセグメントを交換する。リコンビナーゼおよび会合タンパク質は、総称
して「組換えタンパク質」と称する（例えば、Ｌａｎｄｙ， Ａ．， Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９−７
０７ （１９９３）を参照のこと）。
【０００３】 種々の生物由来の多数の組換え系が記載されている。例えば、Ｈｏｅｓｓら、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４（６）：２２８７ （１
９８６）； Ａｂｒｅｍｓｋｉら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１（１
）：３９１ （１９８６）； Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
． １７４（２３）：７４９５ （１９９２）； Ｑｉａｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ
． Ｃｈｅｍ． ２６７（１１）：７７９４ （１９９２）； Ａｒａｋｉら、
Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２５（１）：２５ （１９９２）； Ｍａｅｓ
ｅｒおよびＫａｈｎｍａｎｎ Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２３０：
１７０−１７６（１９９１）；Ｅｓｐｏｓｉｔｏら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．２５（１８）：３６０５（１９９７）を参照のこと。
【０００４】 これらの多くは、リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する（Ａｒ
ｇｏｓら、ＥＭＢＯ Ｊ． ５：４３３−４４０ （１９８６））。おそらく、
これらの中で最も十分に研究されたのは、バクテリオファージλ由来のインテグ
ラーゼ／ａｔｔ系（Ｌａｎｄｙ． Ａ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ
ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． ３：６９９−７０７ （１９
９３））、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰ系（Ｈｏｅｓｓおよ
びＡｂｒｅｍｓｋｉ （１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４巻、ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＬｉｌｌ
ｅｙ編、Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌ
ａｇ； ９０−１０９頁）、ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ ２μ環状プラスミド由来のＦＬＰ／ＦＲＴ系（Ｂｒｏａｃｈら、Ｃ
ｅｌｌ ２９：２２７−２３４ （１９８２））である。
【０００５】 これらの組換え系は特定の生物について特徴付けられたが、関連技術は、イン
ビボにおける組換えについて、組換え部位により隣接される組換えＤＮＡを用い
て教示されたのみである。
【０００６】 Ｂａｃｋｍａｎ（米国特許第４，６７３，６４０号）は、野生型組換え部位ａ
ｔｔＢおよびａｔｔＰを用いる酵素学的部位特異的組換えによりＤＮＡセグメン
トを生成するタンパク質を組み換えるためのλリコンビナーゼのインビボにおけ
る使用を開示する。
【０００７】 ＨａｓａｎおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ（Ｇｅｎｅ ５６：１４５−１５１ （
１９８７））は、プロモーターに隣接する野生型ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位と
の間の分子内組換えのためのインビボにおけるλＩｎｔリコンビナーゼの使用を
開示する。これらの部位の方向は互いに逆であるので、これは目的の遺伝子に対
して不可逆的なプロモーター領域のフリッピング（ｆｌｉｐｐｉｎｇ）を引き起
こす。
【０００８】 Ｐａｌａｚｚｏｌｏら、Ｇｅｎｅ ８８：２５−３６ （１９９０）は、クロ
ーン化されるＤＮＡ配列の外側および野生型ｌｏｘＰ部位間に配置された制限部
位を含有するバクテリオファージλアームを有するファージλベクターを開示す
る。これらのファージベクターを用いる、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するＥ．
ｃｏｌｉ細胞の感染は、ｌｏｘＰ部位間での組換えおよびプラスミドレプリコ
ン（クローン化ｃＤＮＡを含む）のインビボ切り出しを生じる。
【０００９】 Ｐｏｓｆａｉら（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：２３９２−２３
９８ （１９９４））は、ゲノムＤＮＡ中へ、２つの野生型ＦＲＴ認識配列によ
り隣接される選択マーカーを有する部分的発現ベクターを挿入するための方法を
開示する。細胞中に存在するＦＬＰ部位特異的リコンビナーゼが、ベクターをゲ
ノム中に所定の部位において組み込むために使用される。レプリコンが機能的で
ある条件下において、このクローン化ゲノムＤＮＡは増幅され得る。
【００１０】 Ｂｅｂｅｅら（米国特許第５，４３４，０６６号）は、２つのｌｏｘＰ部位を
含むＤＮＡのためのＣｒｅのような部位特異的リコンビナーゼの使用が部位間の
インビボ組換えのために使用されることを開示する。
【００１１】 Ｂｏｙｄ（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：８１７−８２１（１９
９３））は、Ｅ． ｃｏｌｉ宿主細胞中に存在するＣｒｅ部位特異的リコンビナ
ーゼにより作用される野生型ｌｏｘＰ部位を含有する脱リン酸化されたベクター
の分子間連結を促進する条件を用いて平滑末端ＤＮＡのクローニングを容易にす
る方法を開示する。
【００１２】 Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（ＰＣＴ第９３／１９１７２号およびＮｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１（９）：２２６５ （１９９３））は、特定の抗
体のＬ鎖およびＨ鎖がｌｏｘＰおよびｌｏｘＰ ５１１部位の間で異なるファー
ジベクター中にクローン化され、そしてそれを使用して新たなＥ． ｃｏｌｉ細
胞を形質転換するインビボ方法を開示する。Ｃｒｅ（宿主細胞において２つの親
分子（１つはプラスミド、１つはファージ）に作用する）は４つの産物を平衡し
て生成した：２つの異なる共挿入（ｌｏｘＰ部位またはｌｏｘＰ ５１１部位の
いずれかにおける組換えにより生成される）、および２つの娘分子（その１つが
所望された産物であった）。
【００１３】 他の関連技術とは対照的に、ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｂｅ（Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ３３：１２７４６−１２７５１ （１９９４））は、各々が野生型
およびスペーサー変異されたＦＲＴ組換え部位により隣接される、規定された染
色体位置において発現カセットを交換するためのインビボ方法を開示する。二重
相互交叉（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）が部位
特異的組換えのためにこのＦＬＰ／ＦＲＴ系を用いることにより、培養哺乳動物
細胞において媒介された。
【００１４】 トランスポゼース。酵素のファミリーであるトランスポゼースもまた、レプリ
コン間で遺伝子情報を移動するために使用されている。トランスポゾンは構造的
に可変性であるが（単純（ｓｉｍｐｌｅ）または複合（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）と記
載される）、代表的には逆方向に組織されるＤＮＡ配列により隣接されるリコン
ビナーゼ遺伝子をコードする。トランスポゾンの組み込みは、ランダムであり得
るかまたは高度に特異的であり得る。Ｔｎ７（これは高度に部位特異的である）
のような代表物が、レプリコン間のＤＮＡセグメントのインビボにおける移動に
適用された（Ｌｕｃｋｌｏｗら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７：４５６６−４５７
９ （１９９３））。
【００１５】 ＤｅｖｉｎｅおよびＢｏｅｋｅ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：
３７６５−３７７２ （１９９４）は、ＤＮＡセグメントのインビトロにおける
レシピエントＤＮＡ分子中への挿入のための人工トランスポゾンの構築を開示す
る。この系は、酵母ＴＹ１ウイルス様粒子のインテグラーゼを利用する。目的の
ＤＮＡセグメントは、標準的な方法を用いて、トランスポゾン様エレメントＴＹ
１の末端間にクローン化される。ＴＹ１インテグラーゼの存在下において、生じ
るエレメントは第２の標的ＤＮＡ分子中へランダムに組み込まれる。
【００１６】 ＤＮＡクローニング。ＤＮＡセグメントのクローニングは、現在、多数の研究
所における日常的な慣例として、そして多数の遺伝子解析における事前に必要な
工程として生じている。しかし、これらのクローニングの目的は多様であり、２
つの一般的な目的は以下にように考えられ得る：（１）大きなＤＮＡまたはＲＮ
Ａセグメント（染色体、ＹＡＣ、ＰＣＲフラグメント、ｍＲＮＡなど）からのＤ
ＮＡの最初のクローニング（ｐＵＣ、ｐＧｅｍ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔのよう
な比較的少ない公知のベクターにおいて実施される）、および（２）これらのＤ
ＮＡセグメントの特殊化されたベクター中への機能的分析のためのサブクローニ
ング。多量の時間および努力が、ＤＮＡセグメントの最初のクローニングベクタ
ーからより特殊化されたベクターへの移動においての両方で費やされている。こ
の移動はサブクローニングと呼ばれる。
【００１７】 クローニングのための基本的な方法は長年公知であり、そしてその間にほとん
ど変化していない。代表的なクローニングプロトコルは以下のとおりである： （１） 目的のＤＮＡを１つまたは２つの制限酵素で消化し； （２） 既知の場合目的のＤＮＡセグメントをゲル精製し； （３） 適切な制限酵素での切断、アルカリホスファターゼでの処理、ゲル精
製など（適切なように）によりベクターを調製し； （４） 未切断および自己連結されたベクターのバックグラウンドを除去する
ための適切なコントロールを用いて、ＤＮＡセグメントをベクターに連結し； （５） 生じるベクターをＥ． ｃｏｌｉ宿主細胞中に導入し； （６） 選択されたコロニーをひろい、そして小培養物を一晩増殖させ； （７） ＤＮＡミニプレップを作製し；そして （８） アガロースゲル上で（しばしば診断的制限酵素消化の後）またはＰＣ
Ｒにより、単離されたプラスミドを分析する。
【００１８】 ＤＮＡセグメントをサブクローニングするために使用される特殊化されたベク
ターは、機能的に多様である。これらは、以下を包含するがこれらに限定されな
い：種々の生物において遺伝子を発現させるためのベクター；遺伝子発現を調節
するためのベクター；タンパク質精製を補助するため、または細胞におけるタン
パク質の追跡を可能にするためのタグを提供するためのベクター；クローン化さ
れたＤＮＡセグメントを改変（例えば、欠失の生成）するためのベクター；プロ
ーブの合成（例えば、リボプローブ）のためのベクター；ＤＮＡ配列決定のため
のテンプレートの調製のためのベクター；タンパク質コード領域の同定のための
ベクター；種々のタンパク質コード領域の融合のためのベクター；多量の目的の
ＤＮＡを提供するためのベクターなど。特定の研究が、目的のＤＮＡセグメント
をいくつかの異なる特殊化されたベクター中へサブクローニングする工程を包含
することは一般的である。
【００１９】 当該分野において公知であるように、単純なサブクローニングは１日で実施さ
れ得る（例えば、ＤＮＡセグメントが大きくなく、そして制限部位がサブクロー
ニングベクターの制限部位と適合性である）。しかし、他の多くのサブクローニ
ング（特に、未知の配列、長いフラグメント、毒性遺伝子、制限部位の不適切な
配置、高いバックグラウンド、不純な酵素などを含むサブクローニング）は、数
週間かかり得る。従って、ＤＮＡフラグメントのサブクローニングは、しばしば
、可能な限り少ない回数で実施されるべき面倒な仕事であるとみなされる。ＤＮ
Ａセグメントのクローニングを容易にするいくつかの方法が、例えば以下の参考
文献におけるように記載されている。
【００２０】 Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ １６：１９１ （１９８１）は、酵
母ＤＮＡのフラグメントのサブクローニングのためのベクターのファミリーを開
示する。このベクターは、カナマイシン耐性をコードする。より長い酵母ＤＮＡ
セグメントのクローンが部分的に消化され得、そしてサブクローニングベクター
中に連結され得る。もとのクローニングベクターがアンピシリンに対する耐性を
有する場合には、形質転換の前に精製は必要ではない。なぜなら、選択はカナマ
イシンについてであるからである。
【００２１】 Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ， Ｔ．ら、Ｇｅｎｅ ４１：１２５ （１
９８６）は、ストレプトマイシン感受性遺伝子内のユニークなクローニング部位
を有するサブクローニングベクターを開示し；ストレプトマイシン耐性宿主にお
いて、優性感受性遺伝子における挿入または欠失を有するプラスミドのみが、ス
トレプトマイシン選択を生き残る。
【００２２】 従って、制限酵素およびリガーゼを用いる伝統的なサブクローニング方法は、
時間がかかり、そして比較的信頼できない。かなりの労働が費やされ、そして２
日目以降に所望のサブクローンが候補プラスミドの中で見出され得なければ、次
いで、全体のプロセスが意図される別の条件で繰り返されなければならない。部
位特異的リコンビナーゼがＤＮＡをインビボにおいて組換えるために使用された
が、インビトロにおけるこのような酵素の成功する使用は、いくつかの問題を抱
えると予想された。例えば、部位特異性および効率は、インビトロにおいて異な
ると予想され；トポロジー的に連結された産物が予想され；そしてＤＮＡ基質お
よび組換えタンパク質のトポロジーがインビトロにおいて顕著に異なると予想さ
れた（例えば、Ａｄａｍｓら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２６：６６１−
７３ （１９９２）を参照のこと）。インビボにおいて長時間続き得る反応は、
インビトロにおいて酵素が不活性になる前に有意により短い時間で生じると予想
された。複数のＤＮＡ組換え産物が、使用される生物学的宿主において予想され
、サブクローニングの不満足な信頼性、不満足な特異性または不満足な効率を生
じた。従ってインビトロ組換え反応は、所望のレベルの産物を生じるに十分に効
率的であるとは予想されなかった。
【００２３】 従って、制限酵素およびリガーゼの公知の使用を超えて利点を提供する別のサ
ブクローニング系を提供することが、長い間必要と感じられていた。
【００２４】 （発明の要旨） 本発明は、インビトロまたはインビボにおいて、組換えタンパク質および少な
くとも１つの組換え部位を用いる、増幅されたキメラ核酸分子または増幅された
組換え核酸分子を得るための、核酸、ベクターおよび方法を提供する。これらの
方法は、標準のクローニングまたはサブクローニング技術より、高度に特異的で
あり、迅速でありかつ労働集約的でない。本発明の改善された特異性、スピード
および収率は、任意の関連する目的のために有用なＤＮＡもしくはＲＮＡのクロ
ーニングまたはサブクローニング、調節または交換を容易にする。
【００２５】 本発明は、所望の性質および／またはＤＮＡセグメントを有する、キメラＤＮ
Ａ分子を提供するための、少なくとも１つの組換え部位および少なくとも１つの
組換えタンパク質を用い、核酸セグメント（好ましくは、ＤＮＡセグメントまた
はフラグメント）を移動または交換するための、核酸、ベクターおよび方法に関
連する。従って、本発明の使用は、種々のベクター内に、このような核酸分子を
クローニングまたはサブクローニングすることを可能にする。一般に、１つ以上
の親核酸分子（好ましくは、ＤＮＡ分子）が組換えられて、１つ以上の娘分子を
与え、その少なくとも１つが所望の産物分子であり、好ましくは、それが所望の
核酸セグメントを含むベクターである。従って、本発明は、交換をもたらすため
の、および／または１つ以上の所望の産物を選択するための、核酸分子、ベクタ
ーおよび方法に関する。
【００２６】 本発明の１つの実施態様は、キメラＤＮＡの作製方法に関し、この方法は以下
の工程を包含する： （ａ） インビトロまたはインビボにおいて、 （ｉ） 第１の組換え部位および第２の組換え部位により隣接される所望の
核酸セグメントを含む、１つ以上の挿入ドナーＤＮＡ分子であって、ここで第１
および第２の組換え部位は、実質的に互いに組換えない； （ｉｉ） 第３の組換え部位および第４の組換え部位を含む、１つ以上のベ
クタードナー分子であって、ここで、第３および第４の組換え部位は、実質的に
互いに組換えない；および （ｉｉｉ） 第１および第３の組換え部位および／または第２および第４の
組換え部位を組換え得る、１つ以上の部位特異的組換えタンパク質； を組み合わせ； それにより、組換えを生じさせ得、その結果少なくとも１つのコインテグレー
ト核酸分子、上記所望のセグメントを含む少なくとも１つの所望の産物核酸分子
、および必要に応じて副産物核酸分子を生成する工程；次いで、必要に応じて、 （ｂ） 産物または副産物ＤＮＡ分子について選択する工程。
【００２７】 別の実施態様において、本発明は、キメラ分子の生成の方法に関し、以下の工
程を包含する （ａ） インビトロまたはインビボにおいて、 （ｉ） ２つ以上の組換え部位に隣接する所望の核酸セグメントを含む、１
つ以上の挿入ドナー分子であって、ここで、この組換え部位は、実質的に互いに
組換えない； （ｉｉ） ２つ以上の組換え部位を含む、１つ以上のベクタードナー分子で
あって、ここで、この組換え部位は、実質的に互いに組換えない；および （ｉｉｉ） １つ以上の部位特異的組換えタンパク質； を組み合わせる工程、 （ｂ） １つ以上の上記ベクタードナー分子内に１つ以上の上記所望のセグメ
ントを移すために十分な条件下で上記組み合わせ物をインキュベートする工程で
あって、これにより１つ以上の産物分子を生成する工程。生じた産物分子を、コ
インテグレート分子、副産物分子、および未反応のベクタードナー分子または挿
入ドナー分子のような別の分子から離れて、必要に応じて選択し得るか、または
必要に応じて単離し得る。本発明の好ましい局面において、挿入ドナー分子を、
１つ以上の異なったベクタードナー分子と結合し、これにより異なった産物分子
の生成を可能にし、ここで目的の核酸を、単段階で任意の数の異なったベクター
内に移す。
【００２８】 本発明に従って、上記方法は逆転されて、元々の挿入ドナー分子を提供し得、
次いで、この挿入ドナー分子を１つ以上の異なったベクタードナー分子と組み合
わせて使用して、新規の産物分子または副産物分子を生成し得る。あるいは、本
発明の方法により生成された産物分子は、１つ以上の異なったベクタードナー分
子と直接組み合わせて使用され得る挿入ドナー分子として作用し得、これによっ
て、新規の産物分子または副産物分子を生成し得る。従って、目的の核酸分子を
、任意の数の所望のベクターに移し得、または移動し得、これによって、目的の
分子をサブクローニングするための効果的な手段を提供する。
【００２９】 従って、本発明は、第２の産物分子を生成するための第２のベクタードナー分
子と産物分子を組み合わせすることに関する。次に、第２の産物ＤＮＡ分子を、
第３の産物分子を生成するために第３のベクタードナー分子と組み合わせて利用
し得る。本発明のこのプロセスを、任意の数の異なったベクター内に目的の挿入
物を移すまたは移動するために任意の回数を繰り返し得る。本発明のこの局面に
おいて、２つ以上の異なったベクタードナー分子の組合わせを、単段階で異なっ
た産物分子を生成するための産物分子と組み合わせ得る。ここで、所望の核酸セ
グメント（産物ＤＮＡ分子由来）を、任意の数の異なったベクターに移す。
【００３０】 特に、本発明は、１つ以上の所望の核酸分子をクローニングまたはサブクロー
ニングするための方法に関し、以下の工程を包含する： （ａ）インビトロまたはインビボにおいて、 （ｉ）少なくとも２つの組換え部位に隣接した１つ以上の所望の核酸セグメ
ントを含む、１つ以上の挿入ドナー分子であって、ここで、この組換え部位は、
実質的に互いに組換えない； （ｉｉ）少なくとも２つの組換え部位を含む、１つ以上のベクタードナー分
子であって、ここで、この組換え部位は、実質的に互いに組換えない；および （ｉｉｉ）１つ以上の上記部位特異的組換えタンパク質； を組み合わせる工程、 （ｂ） １つ以上のこのベクタードナー分子内に１つ以上のこの所望のセグメ
ントを移し得るために十分な条件下で上記の組み合わせ物をインキュベートする
工程であって、これによって、１つ以上の産物分子を生成する工程； （ｃ） 上記の産物分子を必要に応じて選択または単離する工程； （ｄ） インビトロまたはインビボにおいて （ｉ）２つ以上の組換え部位に隣接した所望の核酸セグメントを含む、１つ
以上の産物分子であって、ここで、この組換え部位は、実質的に互いに組換えな
い； （ｉｉ）２つ以上の組換え部位を含む、１つ以上の異なったベクタードナー
分子であって、ここで、この組換え部位は、実質的に互いに組換えない；および （ｉｉｉ）１つ以上の部位特異的組換えタンパク質； を組み合わせる工程；および （ｅ）１つ以上の異なったベクタードナー分子内に１つ以上の所望のセグメン
トを移すために十分な条件下で該組み合わせ物をインキュベートする工程であっ
て、これにより、１つ以上の異なった産物分子を生成する、工程。
【００３１】 本発明に従って、ベクタードナー分子は、種々の系または宿主細胞において機
能し得るベクターを含み得る。本発明に使用するための好ましいベクターは、原
核細胞ベクター、真核細胞ベクター、または種々の原核生物系および／または真
核生物系の間で往復し得るベクター（例えば、シャトルベクター）を含む。本発
明に使用するための好ましい原核生物ベクターは、Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ属、Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｋｌｅ
ｂｓｉｅｌｌａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、および
Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属の細菌を含むグラム陰性細菌および／またはグラム陽
性細菌において、ならびに好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ種において増殖および／ま
たは複製し得るベクターを含むが、これに限定されない。本発明に使用するため
の真核生物ベクターは、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、（特にヒト細胞）
、真菌細胞、昆虫細胞、魚細胞などにおいて増殖および／または複製するベクタ
ーを含む。目的の特定のベクターは、クローニングベクター、配列決定ベクター
、発現ベクター、融合ベクター、ツーハイブリッドベクター、遺伝子治療ベクタ
ー、および逆方向ツーハイブリッドベクターを含むが、これに限定されない。こ
のようなベクターは、特定のベクターに依存して原核生物系および／または真核
生物系において使用され得る。
【００３２】 本発明に従って使用した挿入ドナー分子は、好ましくは、ドナー分子の挿入物
（例えば、目的の核酸セグメント）を、本発明に従って１つ以上のベクタードナ
ー分子内に移する、または移動することを可能にするための２つ以上の組換え部
位を含む。本発明の挿入ドナー分子を、目的の分子を付加した２つ以上の組換え
部位により、任意の多数の技術によって調製し得る。本発明の挿入ドナー分子を
調製するために組換え部位を含むためのこのような技術は、核酸分子の変異誘発
（例えば、ランダムまたは部位特異的変異誘発）、組換え技術（例えば、アダプ
ターの連結または核酸分子の組換え部位を含む直鎖分子への連結）、増幅（例え
ば、組換え部位またはその部分を含むプライマーを使用する）遺伝子転移（例え
ば、組換え部位を含むトランスポゾンを使用する）、組換え（例えば、組換え部
位を含む１つ以上の相同な配列を使用する）、核酸合成（例えば、組換え部位を
含む分子の化学的合成または種々のポリメラーゼもしくは逆転写酵素を使用する
酵素学的合成）などを含む。本発明に従って、１つ以上の組換え部位が付加され
る核酸分子は、任意の供給源から由来する任意の核酸分子であり得、そして非天
然に存在する核酸を含み得る（例えば、ＲＮＡ’ｓ、米国特許第５，５３９，０
８２および５，４８２，８３６を参照のこと）。特に好ましい核酸分子は、ＤＮ
Ａ分子（一本鎖または二本鎖）である。さらに、挿入ドナー分子を生成するため
の目的の核酸分子は、直鎖または環状であり得、そしてさらに、目的の特定の配
列（例えば、遺伝子）を含み得るか、または分子の集団（例えば、ゲノムライブ
ラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから作製された分子）であり得る。
【００３３】 従って、本発明は、挿入ドナー分子およびこのような方法で作製された挿入ド
ナー分子を作製するための多数の方法に関する。本発明の１つの局面において、
１つ以上の組換え部位またはその部分を含むプライマーを、本発明の挿入ドナー
分子を調製するための核酸合成または核酸増幅に使用する。従って、本発明は、
核酸分子を合成するための方法に関連し、以下の工程を包含する： （ａ） ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドおよび１つ以上の組換え部位
またはその部分を含む１つ以上のプライマーと、１つ以上の核酸テンプレートと
を混合する工程；および （ｂ） このテンプレートの全部または一部分に相補的な１つ以上の核酸分子
および１つ以上の組換え部位を含む１つ以上の核酸分子を合成するために十分な
条件下でこの混合物をインキュベートする工程。本発明に従って、テンプレート
を含む組換え部位の全部または一部分に相補的な核酸分子を合成するために適切
な条件下で、テンプレートとして、１つ以上の該組換え部位を含む合成された核
酸分子を使用し得、それによって、１つ以上の組換え部位を含む二本鎖分子を形
成する工程。好ましくは、１つ以上の組換え部位を含む、１つ以上のプライマー
の存在下で、このような第２合成段階を行なう。なお別の局面において、１つ以
上の組換え部位を含み得るプライマーを用い、合成された二本鎖分子を増幅し得
る。
【００３４】 本発明の別の局面において、任意の数の核酸増幅技術により、核酸分子に１つ
以上の組換え部位を付加し得る。特に、このような方法は、以下の工程を包含す
る： （ａ） ポリメラーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドの存在下で、前記
第１の核酸分子の一部分に相補的な第１のプライマー分子と、第１の核酸分子を
接触する工程、および第２の核酸分子の一部分に相補的な第２プライマー分子と
、第２の核酸分子を接触させる工程； （ｂ） 第１核酸分子の全部または一部分に相補的な第３の核酸分子を形成す
るために十分な条件下で該分子をインキュベートする工程、および第２の核酸分
子の全部または一部分に相補的な第４の核酸分子を形成するために十分な条件下
で該分子をインキュベートする工程； （ｃ） 第１および第３、ならびに第２および第４の核酸分子を変性させる工
程；および （ｄ） 段階（ａ）から（ｃ）を１回以上繰り返す工程であって、ここで、該
第１および／または該第２プライマー分子は、１つ以上の組換え部位またはその
部分を含む。
【００３５】 本発明のなお別の局面において、核酸分子に１つ以上の組換え部位を付加する
ための方法は、以下の工程を包含し得る： （ａ） １つ以上の組換え部位またはその部分を含む１つ以上のアダプターま
たは核酸分子と、１つ以上の核酸分子を接触させる工程；および （ｂ） この核酸分子に１つ以上の組換え部位を付加するために十分な条件下
でこの混合物をインキュベートする工程。好ましくは、直鎖分子を、本発明に従
って、このようなアダプターまたは分子に付加するために使用し、そしてこのよ
うなアダプターまたは分子を、好ましくは、このような直鎖分子の１つ以上の末
端に付加する。機械的に（例えば、超音波処理または剪断）または酵素的に（例
えば、制限エンドヌクレアーゼのようなヌクレアーゼ）を含む任意の技術により
、直鎖分子を調製し得る。従って、本発明の方法は、１つ以上のヌクレアーゼ（
好ましくは、任意の制限エンドヌクレアーゼ）で核酸分子を消化する工程、およ
び目的の分子にアダプターまたは分子を含む１つ以上の組換え部位を連結する工
程をさらに包含し得る。平滑末端または突出末端分子を用い、連結を成し遂げ得
る。あるいは、本発明に従って、組換え部位を導入するために、トポイソメラー
ゼを使用し得る。トポイソメラーゼを、核酸分子を開裂し、そして再結合し、そ
のために、ヌクレアーゼおよびリガーゼの代わりに使用し得る。
【００３６】 別の局面において、デノボ合成により核酸分子に、１つ以上の組換え部位を付
加し得る。従って、本発明は、合成プロセスの間、ヌクレオチドの適切な配列を
付加することにより組換え部位を付加することにおいて、１つ以上の核酸分子を
化学的に合成することを含むこのような方法に関する。
【００３７】 本発明の別の実施態様において、１つ以上の組換え部位を、以下の工程を包含
する方法により目的の核酸分子に付加し得る： （ａ） １つ以上の組換え部位またはその部分を含む１つ以上の組み込み配列
と、１つ以上の核酸分子を接触させる工程；および （ｂ）核酸分子内に組み込み配列を含む組換え部位を取り込むために十分な条
件下で混合物をインキュベートする工程。本発明のこの局面に従って、組み込み
配列は、組換えによって、または組み込みにより目的の核酸分子の一部分になる
任意の核酸分子を含み得る。本発明のこの局面に従って、インビボまたはインビ
トロの組換え（相同組換えまたは非正統的な組換え）によって、またはトランス
ポゾン、配列挿入、組み込みウイルス、ホーミングイントロン、または他の組み
込みエレメントを用いることにより、インビボまたはインビトロの導入により、
組み込み配列を導入し得る。
【００３８】 他の局面において、本発明は、本発明の方法を実行するためのキットに関し、
そしてより詳細には、クローニングまたはサブクローニングキットおよび本発明
の挿入ドナー分子を作製するためのキットに関する。このようなキットは、任意
の数の容器をその中に受け入れ、そして保持するために区切られた担体または容
器を含み得る。このような容器は、本発明の方法およびこのような成分の組み合
わせを実行するための、任意の数の成分を含み得る。特に、本発明のキットは、
１つ以上の組換えタンパク質またはリコンビナーゼ、１つ以上のベクタードナー
分子、１つ以上の挿入ドナー分子および１つ以上の宿主細胞（例えば、コンピテ
ントセル）からなる群より選択された１つ以上の成分（またはその組み合わせ）
を含み得る。
【００３９】 本発明の挿入ドナー分子を作製するためのキットは、任意または多数の成分を
含み得、そしてこのようなキットの組成は、含まれる特定の方法に非常に依存し
て変化し得る。増幅により挿入ドナー分子を合成するためのキットは、ポリメラ
ーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチド（好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ、
そして最も好ましくは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、１つ以上のヌクレオチ
ド、および１つ以上の組換え部位を含む１つ以上プライマーからなる群より選択
された１つ以上の成分（またはその組み合わせ）を含み得る。組換え部位を目的
の核酸分子に挿入または付加するためのキットは、１つ以上のヌクレアーゼ（好
ましくは、制限エンドヌクレアーゼ）、１つ以上のリガーゼ、１つ以上のトポイ
ソメラーゼ、１つ以上のポリメラーゼ、および１つ以上の組換え部位を含む１つ
以上の核酸分子またはアダプターを含み得る。組換え部位を１つ以上の目的の核
酸分子内に組み込むためのキットは、１つ以上の組換え部位を含む１つ以上の組
み込み配列からなる群より選択された１つ以上の成分（またはその組み合わせ）
を含み得る。このような組み込み配列は、１つ以上のトランスポゾン、組み込み
ウイルス、相同組換え配列、１つ以上の宿主細胞などを含み得る。
【００４０】 本発明はまた、本発明の方法を実行するための組成物、または本発明の方法を
実行することにより生成される組成物に関する。特に、このような組成物は、１
つ以上の挿入ドナー分子、１つ以上のベクタードナー分子、および１つ以上の組
換えタンパク質（または、その組み合わせ）を含み得る。さらなる局面において
、本発明の組成物は、１つ以上のコインテグレート分子、１つ以上の産物分子、
および１つ以上の副産物分子（またはその組み合わせ）を含み得る。
【００４１】 挿入ドナー分子を調製することに関連した組成物は、所望の挿入ドナー分子を
調製することに利用される特定の方法に非常に依存して変化し得る。増幅により
このような分子を調製するための組成物は、ポリメラーゼ活性を有する１つ以上
のポリペプチド、１つ以上の組換え部位を含む１つ以上のプライマー、１つ以上
のヌクレオチド、および増幅するための１つ以上の核酸分子（またはその組み合
わせ）を含み得る。所望の核酸分子に組換え部位を挿入することまたは付加する
ことに関連した組成物は、１つ以上の組換え部位を含む１つ以上の核酸分子また
はアダプター、１つ以上のリガーゼ、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ、１つ
以上のトポイソメラーゼ、およびこのような組換え部位を含むために所望される
１つ以上の核酸分子（またはその組み合わせ）を含み得る。所望の核酸分子に組
換え部位を組み込むことに関連した組成物は、１つ以上の組換え部位を含む１つ
以上の組み込み配列、および組換え部位を含むために所望される１つ以上の核酸
分子を含み得る。
【００４２】 本発明の特に好ましい局面において、ライブラリー（例えば、ランダム配列ま
たは縮重オリゴヌクレオチドのようなデノボ合成により生成されるゲノムＤＮＡ
またはｃＤＮＡの集団、あるいは核酸分子の集団）を、本発明に従って利用する
。核酸分子のこのような集団に組換え部位を挿入、または付加することにより、
挿入ドナー分子の集団を生成する。本発明の組換え方法により、異なったベクタ
ー（またはベクターの組み合わせ）内に、従って、ライブラリーまたはライブラ
リー由来の特定の配列もしくはクローンを評価および分析するための異なった宿
主系（原核生物および真核生物）内に、ライブラリーを容易に移動し得る。ある
いは、所望の分子を含むベクターを、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の生成の
ためのインビトロ発現系のようなインビトロ系において使用し得る。特に好まし
い局面において、１つ以上の組換え部位を、以下の工程を包含する方法によりラ
イブラリーの核酸分子に付加する： （ａ） 直鎖核酸分子の集団と１つ以上の組換え部位を含む１つ以上のアダプ
ターとを混合する工程、 （ｂ） 直鎖分子の１つ以上の末端に１つ以上のアダプターを付加するために
十分な条件下で混合物をインキュベートする工程。好ましい局面において、核酸
分子の集団は、二本鎖ＤＮＡ分子（好ましくは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）
である。本発明において使用するための直鎖フラグメントの集団を、ゲノムまた
はｃＤＮＡを（機械的手段にまたは酵素学的手段により）開裂することにより調
製し得る。好ましい局面において、直鎖分子の１つ以上の末端にアダプターを付
加する。
【００４３】 本発明の別の特に好ましい局面において、本発明の挿入ドナーＤＮＡ分子の集
団を調製するために、ｃＤＮＡライブラリーを使用する。特に、本発明のこの局
面は、以下の工程を包含する方法に関する： （ａ） ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはポリＡ＋ＲＮＡテンプレートの集団と逆転
写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチド、および１つ以上の組換え部位を含
む１つ以上のプライマーを接触する工程、 （ｂ） テンプレートに相補的なＤＮＡ分子の第１の集団を合成するために十
分な条件下で混合物をインキュベートする工程であって、ここでＤＮＡ分子は、
１つ以上の組換え部位を含む。本発明のこの局面は、ＤＮＡ分子の第１の集団の
全部または一部に相補的なＤＮＡ分子の第２の集団を生成するために十分な条件
下で、合成されたＤＮＡをインキュベートする工程をさらに含み得、これによっ
て１つ以上の組換え部位を含む二本鎖ＤＮＡ分子の集団を形成する。
【００４４】 特に好ましい局面において、本発明の挿入ドナー分子は、少なくとも２つの組
換え部位を含み、ここで挿入ドナー分子は、直鎖であり、このような２つ以上の
組換え部位を、好ましくは、分子の両末端に、またはその近くに配置する。本発
明に従って、さらなる組換え部位（２つ以上）の使用を、このような組換え部位
の形態および配置に依存する、挿入ドナー分子内に異なった挿入物のサブクロー
ニングを容易にするために使用し得る。
【００４５】 別の実施態様は、本発明の方法において有用なＤＮＡおよびベクターを含む。
特に、１つの実施態様において、ベクタードナー分子を提供し、ここで、ベクタ
ードナー内のＤＮＡセグメントを、（ｉ） 環状ベクタードナーにおいて、少な
くとも２つの組換え部位で、または（ｉｉ） 直鎖状ベクタードナーにおいて、
少なくとも１つの組換え部位で、のいずれかにより分離し、ここで、組換え部位
は、好ましくは、組換えの特異性または効率を増強するように操作される。１つ
のベクタードナーの実施態様は、第１のＤＮＡセグメントおよび第２のＤＮＡセ
グメントを含み、第１または第２のセグメントは選択マーカーを含む。第２のベ
クタードナーの実施態様は、第１のＤＮＡセグメントおよび第２のＤＮＡセグメ
ントを含み、第１または第２のＤＮＡセグメントは、毒性遺伝子を含む。第３の
ベクタードナーの実施態様は、第１のＤＮＡセグメントおよび第２のＤＮＡセグ
メントを含み、第１または第２のＤＮＡセグメントは、少なくとも１つの選択マ
ーカーの不活性フラグメントを含み、ここで選択マーカーの不活性フラグメント
は、第１または第２の組換え部位を少なくとも１つの選択マーカーの別の不活性
フラグメントで横切って組み換えられる場合に機能的な選択マーカーを再構成し
得る。
【００４６】 本発明の別の好ましい実施態様は、当該分野において公知であることに照らし
て、本発明の以下の図面および記載に照らして、そして特許請求の範囲に照らし
て当業者に明白である。
【００４７】 （発明の詳細な説明） 可逆的なおよび／または繰り返しの可能なクローニングまたはサブクローニン
グ反応が組換えタンパク質および組換え部位を使用してキメラ核酸を形成するた
めの核酸を操作するために使用され得ることが、本発明において予期せずに発見
される。従って、本発明による組換えクローニングは、インビトロおよびインビ
ボにおける核酸分子のセグメントを移動または交換するための少なくとも１つの
選択された組換え部位を有する組換え核酸分子と共に組換えタンパク質を使用す
る。
【００４８】 これらの方法は、所望の特性（単数または複数）および／または核酸セグメン
ト（単数または複数）を有するキメラＤＮＡまたはＲＮＡ分子を生成するために
組換え反応を使用する。本発明の方法は目的の核酸分子が任意の数のベクター系
に移動または移入され得る手段を提供する。本発明に従って、種々のベクター系
へのこのような移入は、別々に、連続的にまたは集団で（例えば、１工程におい
て任意の数の異なったベクター中で）達成され得る。本発明の改良された特異性
、速度および／または収量は、任意の関連した目的のために有用なＤＮＡまたは
ＲＮＡのクローニング、サブクローニング、調節または交換を容易にする。この
ような目的としては、ＤＮＡまたはＲＮＡのセグメントのインビトロ組換え、お
よび転写されたか、複製されたか、単離されたかもしくはゲノムのＤＮＡまたは
ＲＮＡのインビトロまたはインビボにおける挿入あるいは改変が挙げられる。
【００４９】 （定義） 以下の記載において、組換えＤＮＡ技術において使用される多数の用語が広く
利用される。明細書および請求の範囲（このような用語に与えられるべき範囲を
含む）の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【００５０】 副産物：これは、クローン化またはサブクローン化されることが所望されるセ
グメントを欠く、娘分子（組換えクローニングプロセスの間、第２の組換え事象
の後に産生される新たなクローン）である。
【００５１】 コインテグレート：これは、親（出発）分子の両方を含む、本発明の少なくと
も１つの組換え中間体核酸分子である。これは通常環状である。いくつかの実施
態様においては、これは直鎖状であり得る。
【００５２】 宿主：これは、組換えクローニング産物のレシピエントであり得る、任意の原
核生物または真核生物である。本明細書において用いられる用語「宿主」は、遺
伝子操作され得る原核生物または真核生物を包含する。このような宿主の例につ
いては、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ （１９８２）を参照のこと。
【００５３】 挿入物（単数または複数）：これは、本発明の方法により操作され得る所望の
核酸セグメントまたは核酸セグメントの集団（図１のセグメントＡ）を含む。従
って、用語「挿入物（単数または複数）」は、特定の核酸（好ましくはＤＮＡ）
セグメントまたはセグメントの集団を含むことを意味する。このような挿入物（
単数および複数）は１以上の遺伝子を含み得る。
【００５４】 挿入ドナー：これは、挿入物を有する、本発明の２つの親核酸分子（例えば、
ＲＮＡまたはＤＮＡ）のうちの１つである。この挿入ドナー分子は、両方の末端
において組換え部位に隣接される挿入物を含む。この挿入ドナーは直鎖状または
環状であり得る。本発明の１つの実施態様において、この挿入ドナーは環状ＤＮ
Ａ分子であり、そして組換えシグナルの外側のクローニングベクター配列をさら
に含む（図１を参照のこと）。挿入物の集団または核酸セグメントの集団が挿入
ドナーを作製するために使用される場合、挿入ドナーの集団が生じ、そして本発
明に従って使用され得る。
【００５５】 産物：これは、組換えクローニングプロセスの間、第２の組換え事象の後に産
生される、ＡおよびＤ配列を含む１つの所望の娘分子である（図１を参照のこと
）。この産物は、クローン化またはサブクローン化されるべきであった核酸を含
む。本発明に従って、挿入ドナーの集団が使用される場合、生じた産物分子の集
団は、挿入ドナーの挿入物の集団のすべてまたは一部を含み、そして好ましくは
、挿入ドナーの最初の分子の代表的集団を含む。
【００５６】 プロモーター：これは、開始コドンの近位に位置する、遺伝子の５’領域とし
て一般に記載されるＤＮＡ配列である。隣接するＤＮＡセグメントの転写はプロ
モーター領域で開始される。抑制性プロモーターの転写速度は、抑制物質に応答
して減少する。誘導性プロモーターの転写速度は、誘導物質に応答して増加する
。構成性プロモーターの転写速度は、一般的な代謝条件の影響下で変化し得るが
、特異的に調節されない。
【００５７】 認識配列：認識配列は、タンパク質、化学物質、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子（例
えば、制限エンドヌクレアーゼ、修飾メチラーゼ、またはリコンビナーゼ）が認
識し、そして結合する、特定の配列である。本発明において、認識配列は通常、
組換え部位のことをいう。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための認識配列は、
８塩基対のコア配列に隣接する２つの１３塩基対の逆方向反復（リコンビナーゼ
結合部位として作用する）からなる３４塩基対の配列である、ｌｏｘＰである。
Ｓａｕｅｒ， Ｂ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ ５：５２１−５２７ （１９９４）の図１を参照のこと。認識
配列の他の例としては、リコンビナーゼ酵素であるλインテグラーゼにより認識
される、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列である。ａｔｔＢ
は、２つの９塩基対のコア型Ｉｎｔ結合部位および７塩基対の重複領域を含む約
２５塩基対の配列である。ａｔｔＰは、コア型Ｉｎｔ結合部位およびアーム型Ｉ
ｎｔ結合部位、ならびに補助タンパク質組込み宿主因子（ＩＨＦ）、ＦＩＳ、お
よびエグジショナーゼ（ｅｘｃｉｓｉｏｎａｓｅ）（Ｘｉｓ）のための部位を含
む約２４０塩基対の配列である。Ｌａｎｄｙ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏ
ｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９−７０７ （１９９３）を
参照のこと。このような部位はまた、本発明に従って操作され、本発明の方法に
おける産物の産生を増強し得る。このように操作された部位が組換え反応を不可
逆的にするためにＰ１またはＨ１ドメインを欠く場合（例えば、ａｔｔＲまたは
ａｔｔＰ）、このような部位は、これらの部位のドメインが何らかの方法で修飾
されることを示すためにａｔｔＲ’またはａｔｔＰ’と命名され得る。
【００５８】 リコンビナーゼ：これは、特異的な組換え部位におけるＤＮＡセグメントの交
換を触媒する酵素である。
【００５９】 組換えクローニング：これは、本明細書において記載される方法であって、こ
れにより核酸分子のセグメントまたはこのような分子の集団が、インビトロまた
はインビボにおいて、交換、挿入、取り替え（ｒｅｐｌａｃｅ）、置換（ｓｕｂ
ｓｔｉｔｕｔｅ）または改変される。
【００６０】 組換えタンパク質：これは、１つ以上の組換え部位を含む組換え反応に関与す
る、切り出しタンパク質または組み込みタンパク質、酵素、コファクターまたは
会合タンパク質を包含する。Ｌａｎｄｙ （１９９４）（下記）を参照のこと。
【００６１】 抑制カセット：これは、サブクローニングベクター中に存在する選択マーカー
のリプレッサーを含む核酸セグメントである。
【００６２】 選択マーカー：これは、特定の条件下でしばしば、それを含有する分子または
細胞について、あるいはそれを含有する分子または細胞に対して選択することを
可能にする、ＤＮＡセグメントである。これらのマーカーは、ＲＮＡ、ペプチド
、またはタンパク質の産生のような（これらに限定されない）活性をコードし得
るか、あるいは、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機および有機化合物または
組成物などのための結合部位を提供し得る。選択マーカーの例としては以下が挙
げられるがそれらに限定されない：（１）そうでなければ毒性ある化合物（例え
ば、抗生物質）に対する耐性を提供する産物をコードするＤＮＡセグメント；（
２）レシピエント細胞において別に欠如している産物をコードするＤＮＡセグメ
ント（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求マーカー）；（３）遺伝子産物の活性
を抑制する産物をコードするＤＮＡセグメント；（４）容易に同定され得る産物
をコードするＤＮＡセグメント（例えば、βガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパ
ク質（ＧＦＰ）、および細胞表面タンパク質のような表現型マーカー）；（５）
そうでなければ細胞の生存および／または機能に有害である産物に結合するＤＮ
Ａセグメント；（６）そうでなければ上記番号（１）〜（５）に記載のＤＮＡセ
グメントのいずれかの活性を阻害するＤＮＡセグメント（例えば、アンチセンス
オリゴヌクレオチド）；（７）基質を修飾する産物に結合するＤＮＡセグメント
（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）；（８）所望の分子（例えば、特定のタン
パク質結合部位）を単離または同定するために使用され得るＤＮＡセグメント；
（９）そうでなければ非機能性であり得る特異的ヌクレオチド配列をコードする
ＤＮＡセグメント（例えば、分子の亜集団のＰＣＲ増幅のための）；（１０）存
在しない場合、直接的または間接的に、特定の化合物に対する耐性または感受性
を与えるＤＮＡセグメント；および／または（１１）レピシエント細胞において
毒性である産物をコードするＤＮＡセグメント。
【００６３】 選択スキーム：これは、挿入ドナー、ベクタードナー、任意の中間体、（例え
ば、コインテグレート）および／または副産物を含む混合物からの、所望の産物
（単数または複数）の、選択、富化、または同定を可能にする任意の方法である
。１つの好ましい実施態様の選択スキームは、組換えクローニングの間に連結さ
れているまたは連結されていないのいずれかである、少なくとも２つの成分を有
する。一方の成分は選択マーカーである。他方の成分は、選択マーカーのインビ
トロまたはインビボにおける発現、あるいは選択マーカーを有するプラスミドを
有する細胞の生存を制御する。一般的に、この制御エレメントは、選択マーカー
のリプレッサーまたはインデューサーであるが、選択マーカーの発現を制御する
ための他の手段が使用され得る。リプレッサーが使用されるかアクチベーターが
使用されるかは、当業者に容易に明らかなように、マーカーがポジティブ選択用
であるかネガティブ選択用であるか、および種々のＤＮＡセグメントの正確な配
列に依存する。好ましい必要条件は、選択スキームが１つ以上の所望の産物のみ
の選択または富化を生じることである。本明細書において定義されるように、Ｄ
ＮＡ分子について選択は、（ａ）所望のＤＮＡ分子の存在について選択または富
化する工程、および（ｂ）所望のＤＮＡ分子でないＤＮＡ分子の存在に対して選
択または富化する工程を包含する。
【００６４】 １つの実施態様において、この選択スキーム（これは、逆に実施され得る）は
、３つの形態のうちの１つをとり、これは図１に関して議論される。第１（選択
マーカーおよびそのリプレッサーについて本明細書において例示される）は、セ
グメントＤを有し、そしてセグメントＣを欠く分子について選択する。第２は、
セグメントＣを有する分子に対しておよびセグメントＤを有する分子について選
択する。第２の形態の可能な実施態様は、その中にインビトロ反応産物が導入さ
れるべき細胞に対して毒性な遺伝子を保持するＤＮＡセグメントを有する。毒性
遺伝子は、毒性遺伝子産物（毒性タンパク質またはＲＮＡ）として発現されるＤ
ＮＡであり得るか、またはそれ自体でおよびそれだけで毒性であり得る（後者の
場合において、毒性遺伝子はその古典的な定義の「遺伝性の特性（ｈｅｒｉｔａ
ｂｌｅ ｔｒａｉｔ）」を有すると理解される）。
【００６５】 このような毒性遺伝子産物の例は当該分野において周知であり、そして、制限
エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤｐｎＩ）、アポトーシス関連遺伝子（例えば、
ＡＳＫ１またはｂｃｌ−２／ｃｅｄ−９ファミリーのメンバー）、レトロウイル
ス遺伝子（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の毒性遺伝子産物を含む）、ディフ
ェンシン（例えば、ＮＰ−１、逆方向反復または対の回文構造のＤＮＡ配列、バ
クテリオファージ溶解遺伝子（例えば、φＸ１７４またはバクテリオファージ
Ｔ４由来の遺伝子）；抗生物質感受性遺伝子（例えば、ｒｐｓＬ）、抗菌剤感受
性遺伝子（例えば、ｐｈｅＳ、プラスミド殺傷遺伝子、バクテリアに対して毒性
の遺伝子産物を産生する真核生物転写ベクター遺伝子（例えば、ＧＡＴＡ−１）
および抑制機能の非存在下で宿主を傷害する遺伝子（例えば、ｋｉｃＢまたはｃ
ｃｄＢ）を含むがそれらに限定されない。あるいは、毒性遺伝子はインビトロに
おいて選択され得る（例えば、制限部位）。
【００６６】 誘導プロモーターに対して作動可能に連結した制限エンドヌクレアーゼについ
てコードする多くの遺伝子が知られ、そして本発明において使用され得る。例え
ば、米国特許第４，９６０，７０７号（ＤｐｎＩおよびＤｐｎＩＩ）；同第５，
００，３３３号、５，０８２，７８４号、および同第５，１９２，６７５号（Ｋ
ｐｎＩ）；同第５，１４７，８００号（ＮｇｏＡＩＩＩおよびＮｇｏＡＩ）；５
，１７９，０１５号（ＦｓｐＩおよびＨａｅＩＩＩ）；同第５，２００，３３３
号（ＨａｅＩＩおよびＴａｑＩ）；同第５，２４８，６０５号（ＨｐａＩＩ）；
同第５，３１２，７４６号（ＣｌａＩ）；同第５，２３１，０２１号および同第
５，３０４，４８０号（ＸｈｏＩおよびＸｈｏＩＩ）；同第５，３３４，５２６
号（ＡｌｕＩ）；同第５，４７０，７４０号（ＮｓｉＩ）；同第５，５３４，４
２８号（ＳｓｔＩ／ＳａｃＩ）；同第５，２０２，２４８号（ＮｃｏＩ）；同第
５，１３９，９４２号（ＮｄｅＩ）；および同第５，０９８，８３９号（Ｐａｃ
Ｉ）を参照のこと。Ｗｉｌｓｏｎ、Ｇ．Ｇ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．
１９：２５３９−２５６６（１９９１）；およびＬｕｎｎｅｎ、Ｋ．Ｄら、Ｇｅ
ｎｅ ７４：２５−３２（１９９８）もまた参照のこと。
【００６７】 第２の形態において、セグメントＤは選択マーカーを有する。この毒性遺伝子
は、ベクタードナー、コインテグレート、および副産物分子を有する形質転換体
を除去するが、選択マーカーは、産物を含有する細胞について、および挿入ドナ
ーのみを有する細胞に対して選択するために使用され得る。
【００６８】 第３の形態は、同一の分子上にシスでセグメントＡおよびセグメントＤの両方
を有する細胞については選択するが、異なる分子上にトランスで両方のセグメン
トを有する細胞については選択しない。これは、２つの不活性なフラグメント（
各々１つがセグメントＡおよびＤ上にある）に分割される選択マーカーにより具
体化され得る。
【００６９】 このフラグメントは、セグメントが組換え事象により一緒にもたらされる場合
、それらが機能性の選択マーカーを再構成するように、組換え部位に関して配列
される。例えば、この組換え事象はプロモーターを構造遺伝子と連結し得、構造
遺伝子の２つのフラグメントを連結し得、または生存のために必要なヘテロダイ
マー遺伝子産物をコードする遺伝子を連結し得、またはレプリコンの部分を連結
し得る。
【００７０】 部位特異的リコンビナーゼ：これは、代表的には少なくとも以下の４つの活性
（またはその組合わせ）を有するリコンビナーゼの型である：（１）１または２
つの特異的核酸配列の認識；（２）前記配列（単数または複数）の切断；（３）
鎖交換に関与するトポイソメラーゼ活性；および（４）核酸の切断された鎖の再
封鎖（ｒｅｓｅａｌ）をするリガーゼ活性。Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：５２１−５２７
（１９９４）を参照のこと。保存的部位特異的組換えは、両方のパートナーに
ついての高度の特異性により、相同組換えおよび転位から区別される。鎖交換機
構は、ＤＮＡ合成の非存在下における特異的ＤＮＡ配列の切断および再結合を含
む（Ｌａｎｄｙ，Ａ．（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５８：
９１３−９４９）。
【００７１】 サブクローニングベクター：これは、好ましくは、適切なレプリコンを含む環
状または直鎖状核酸分子を含むクローニングベクターである。本発明において、
サブクローニングベクター（図１におけるセグメントＤ）はまた、最終産物中に
組み込まれて、クローン化されたＤＮＡ挿入物（図１におけるセグメントＡ）に
対して作用するか、またはそれとともに作用することが所望される、機能性およ
び／または調節エレメントを含み得る。このサブクローニングベクターはまた、
選択マーカー（好ましくはＤＮＡ）を含み得る。
【００７２】 ベクター：これは、挿入物に、有用な生物学的または生化学的性質を提供する
核酸分子（好ましくは、ＤＮＡ）である。例としては、インビトロまたは宿主細
胞において複製し得るかまたは複製され得る、あるいは所望の核酸セグメントを
宿主細胞内の所望の位置に運搬し得る、プラスミド、ファージ、自己複製配列（
ＡＲＳ）、動原体および他の配列が挙げられる。ベクターは、そこにおいて配列
が、ベクターの本質的な生物学的機能を損失することなく決定可能な様式で切断
され得、そしてその中に核酸フラグメントが、その複製およびクローニングを生
じさせるためにスプライスされ得る、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部
位を有し得る。ベクターは、プライマー部位（例えば、ＰＣＲのための）、転写
および／または翻訳開始および／または調節部位、組換えシグナル、レプリコン
、選択マーカーなどをさらに提供し得る。明らかに、相同組換え、転移または制
限酵素の使用を必要としない所望の核酸フラグメントの挿入方法（例えば（これ
らに限定されない）、ＰＣＲフラグメントのＵＤＧクローニング（米国特許第５
，３３４，５７５号、その全体が本明細書中に参考として援用される）、Ｔ：Ａ
クローニングなど）はまた、本発明に従って使用されるべきクローニングベクタ
ー中へフラグメントをクローン化するために適用され得る。クローニングベクタ
ーは、クローニングベクターで形質転換された細胞の同定における使用のために
適切な１つ以上の選択マーカーをさらに含み得る。
【００７３】 ベクタードナー：これは、所望の産物の部分になるべきＤＮＡベクターを含む
ＤＮＡセグメントを有する、本発明の２つの親核酸分子（例えば、ＲＮＡまたは
ＤＮＡ）の１つである。このベクタードナーは、組換え部位により隣接される、
サブクローニングベクターＤ（または、挿入ドナーが既にクローニングベクター
を含まない場合、これはクローニングベクターと呼ばれ得る）および組換え部位
によって隣接したセグメントＣを含む（図１を参照のこと）。セグメントＣおよ
び／またはＤは、選択スキームについて上記で述べたように、所望の産物娘分子
についての選択に貢献するエレメントを含み得る。組換えシグナルは、同一であ
るかまたは異なり得、そして同一のまたは異なるリコンビナーゼにより作用され
得る。さらに、ベクタードナーは直鎖状または環状であり得る。
【００７４】 プライマー：これは、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）の増幅または重合中に
ヌクレオチドモノマーの共有結合によって伸長される１本鎖または２本鎖オリゴ
ヌクレオチドのことをいう。好ましい局面において、このプライマーは、１以上
の組換え部位またはこのような組換え部位の部分を含む。組換え部位の部分は少
なくとも２塩基、少なくとも５塩基、少なくとも１０塩基または少なくとも２０
塩基の目的の組換え部位を含む。組換え部位の部分が使用される場合、組換え部
位のミッシング部分は、新しく合成された核酸分子によって提供され得る。この
ような組換え部位はプライマー内および／またはプライマーの１つもしくは両終
端に配置され得る。好ましくは、さらなる配列は、組換えを増強または改良し、
および／または組換え中の組換え部位を安定化するために組換え部位（単数また
は複数）に隣接したプライマーに添加される。このような安定化配列は任意の長
さの任意の配列（好ましくはＧ／Ｃに富む配列）であり得る。好ましくは、この
ような配列は、サイズで１〜約１０００塩基、１〜約５００塩基、および１〜約
１００塩基、１〜約６０塩基、１〜約２５塩基、１〜約１０塩基、２〜約１０塩
基および好ましくは約４塩基の範囲である。好ましくは、このような配列は、１
塩基長より大きく、そして好ましくは２塩基長より大きい。
【００７５】 テンプレート：これは、増幅され、合成され、または配列決定される２本鎖ま
たは１本鎖核酸分子のことをいう。２本鎖分子の場合、第１鎖および第２鎖を形
成するためのその鎖の変性は、好ましくはこれらの分子が増幅され、合成されま
たは配列決定される前に行われ、あるいは２本鎖分子は直接テンプレートとして
使用され得る。１本鎖テンプレートに関して、テンプレートの部分に対して相補
的なプライマーは、適切な条件下でハイブリダイズされ、次いで、ポリメラーゼ
活性を有する１以上のポリペプチド（例えば、ＤＮＡポリメラーゼおよび／また
は逆転写酵素）が前記テンプレートのすべてまたは部分に相補的な核酸分子を合
成し得る。あるいは、２本鎖テンプレートに関して、１以上のプロモーターが、
このテンプレートのすべてまたは部分に対して相補的な核酸分子を作製するため
に１以上のポリメラーゼと組み合わせて使用され得る。本発明に従って新しく合
成された分子は、長さにおいて元のテンプレートと同じかまたは短くあり得る。
さらに、元のテンプレート集団の代表的な核酸分子の集団を作製するために核酸
テンプレートの集団は、合成または増幅中に使用され得る。
【００７６】 アダプター：これは、１以上の組換え部位（またはこのような組換え部位の部
分）を含むオリゴヌクレオチドもしくは核酸フラグメントまたはセグメント（好
ましくはＤＮＡ）であり、この組み換え部位は、本発明に従って環状または直鎖
状挿入ドナー分子、ならびに本明細書中に記載の他の核酸分子に加えられ得る。
組換え部位の部分を使用する場合、ミッシング部分は、挿入ドナー分子によって
提供され得る。このようなアダプターは、環状または直鎖状分子内の任意の位置
に加えられ得るが、このアダプターは、好ましくは直鎖状分子の１端もしくは両
端に、あるいはその近傍に加えられる。好ましくは、アダプターは、特に目的の
核酸分子の両側に（隣接する）位置するように配置される。本発明に従って、ア
ダプターは、標準の組換え技術（例えば、制限消化および連結（ｌｉｇａｔｉｏ
ｎ））によって目的の核酸分子に加えられ得る。例えば、アダプターは、適切な
制限酵素を使用した最初に消化した分子によって環状分子に加えられ得、切断部
位にアダプターを加え、そして切断部位にアダプター（単数または複数）を含む
環状分子を再構成する。あるいは、アダプターは、直鎖状分子の１以上のおよび
好ましくは両末端に直接連結され得、それによって１つまたは両末端にアダプタ
ーを有する直鎖状分子を生ずる。本発明の１つの局面において、アダプターは、
直鎖状分子の集団（例えば、切断または消化されたｃＤＮＡライブラリーまたは
ゲノムＤＮＡ）に加えられ、前記集団のすべてまたは実質的な部分の１つおよび
好ましくは両末端でアダプターを含む直鎖状分子の集団を形成し得る。
【００７７】 ライブラリー：これは、核酸分子のコレクションのことをいう（環状または直
鎖状）。１つの好ましい実施態様において、ライブラリーは、生物（「ゲノム」
ライブラリー）のＤＮＡ含有量のすべてまたは重要な部分の代表、あるいは細胞
、組織、器官または生物における発現された遺伝子（ｃＤＮＡライブラリー）の
すべてまたは重要な部分の代表的な核酸分子の１つのセットである。ライブラリ
ーはまた、デノボ合成、１以上の配列の変異誘発などによって作製されるランダ
ムな配列を含み得る。このようなライブラリーは、１以上のベクター中に含まれ
てもよいし、含まれなくてもよい。
【００７８】 増幅：これは、ポリメラーゼを使用して、ヌクレオチド配列のコピー数を増加
するためのインビトロでの任意の方法をいう。核酸の増幅は、ＤＮＡおよび／も
しくはＲＮＡ分子あるいはプライマーにヌクレオチドの組み込みを生じ、これに
よってテンプレートに対して相補的な新しい分子を形成する。形成された核酸分
子およびそのテンプレートは、さらなる核酸分子を合成するためのテンプレート
として使用され得る。本明細書に使用されるように、１回の増幅反応は、多くの
ラウンドの増幅からなり得る。ＤＮＡ増幅反応は、例えばポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）を含む。１回のＰＣＲ反応は、５〜１００「サイクル」のＤＮＡ分子
の変性および合成からなり得る。
【００７９】 オリゴヌクレオチド：これは、共有結合的に連結したヌクレオチド配列を含む
合成または天然の分子のことをいい、これは、１つのヌクレオチドのデオキシリ
ボースまたはリボースの３’位と隣接するヌクレオチドのデオキシリボースまた
はリボースの５’位の間のホスホジエステル結合によって結合される。
【００８０】 ヌクレオチド：これは、塩基−糖−リン酸の組み合わせのことをいう。ヌクレ
オチドは、核酸配列（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の単量体単位である。用語、ヌクレ
オチドは、リボヌクレオシド三リン酸であるＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＧ、ＧＴＰお
よびデオキシヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、
ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）またはその誘導体を含む。このような誘導体に
は、例えば、[αＳ]ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄＡＴ
Ｐを含む。本明細書中に使用されるように、用語、ヌクレオチドはまた、ジデオ
キシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびこれらの誘導体をいう。例
示されたジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の実例には、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣ
ＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰが含まれるがこれらに限定さ
れない。本発明に従って、「ヌクレオチド」は非標識であり得、または周知の技
術によって直接標識され得る。検出可能な標識は、例えば放射性同位元素、蛍光
標識、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識を含む。
【００８１】 ハイブリダイゼーション：用語「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリ
ダイズしている」は、２本鎖分子を生じるための２つの相補的１本鎖核酸分子（
ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の塩基の対合をいう。本明細書中で使用されるよ
うに、２つの核酸分子はハイブリダイズされ得るが、塩基の対合は完全に相補的
ではない。従って、ミスマッチした塩基は、当該分野で周知の適切な条件が使用
された場合、２つの核酸分子のハイブリダイゼーションを妨げない。
【００８２】 組換えＤＮＡ技術ならびに分子生物学および細胞生物学の分野で使用される他
の用語は、本明細書中で使用されるように、当業者によって一般に、理解される
。
【００８３】 （組換えスキーム） 本発明のインビトロまたはインビボの方法についての１つの一般的なスキーム
は図１に示され、ここで挿入ドナーおよびベクタードナーは、環状ＤＮＡまたは
直鎖状ＤＮＡのいずれかであり得るが、環状として示される。ベクターＤは、最
初のクローニングベクターＢと交換される。この挿入ドナーはベクターを含む必
要がない。本発明の方法は、挿入物Ａが任意の数のベクターに移入されることを
可能にする。本発明に従って、この挿入は特定のベクターに移入され得、または
１つの工程で多数のベクターに移入され得る。さらに、この挿入物は、異なった
ベクタードナーと組み合わせて挿入ドナーとして例えば、産物ＤＮＡ分子を使用
して、連続的に任意の数のベクターに移入され得る。目的の核酸分子は、新しい
ベクターに移入され得、それによって新しい産物ＤＮＡ分子を産生する。次いで
、この新しい産物ＤＮＡ分子は、出発材料として使用され、新しいベクターに目
的の核酸分子を移入し得る。このような連続的な移入は、任意の数の異なったベ
クターにおいて多くの回数、達成され得る。従って、本発明は、核酸分子をクロ
ーニングまたはサブクローニングすること可能にし、そしてその容易性および単
純性のため、これらの方法は、特に、高生産性（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈ−ｐ
ｕｔ）適用に適合する。本発明に従って、エレメントＡおよびＤを含み、そして
１以上のコインテグレート（単数および複数）を含む、他の分子に対する娘分子
について選択することが所望され得る。この四角および円は、異なったセットの
組換え部位（例えば、ｌｏｘ部位またはａｔｔ部位）である。セグメントＡまた
はＤは、少なくとも１つの選択マーカー、発現シグナル、複製起点、または検出
、選択、発現、マッピング、もしくは配列決定したＤＮＡに関する特定の機能を
含み得、ここでＤは、この実施例で使用される。このスキームはまた、本明細書
中で記載されるように本発明に従って、逆にされ得る。次いで、生じた逆反応の
産物（例えば、挿入ドナー）は、１つまたは多くのベクターを組み合わせて使用
され、この挿入物が任意の数のベクターに含まれる新しい産物分子を調製し得る
。
【００８４】 エレメントＡまたはＤの部分であり得る所望のＤＮＡセグメントの例は、ＰＣ
Ｒ産物、大きなＤＮＡセグメント、ゲノムクローンまたはフラグメント、ｃＤＮ
Ａクローンまたはフラグメント、機能性エレメントなど、および有用な核酸また
はタンパク質をコードする遺伝子または部分的遺伝子を含むが、それらに限定さ
れない。さらに、本発明の組換えクローニングは、タンパク質発現（ネイティブ
もしくは融合タンパク質）および／または遺伝子治療のための、エクソビボおよ
びインビボ遺伝子移入ビヒクルを作製するために使用され得る。
【００８５】 図１において、そのスキームは以下のようにＡおよびベクターＤを含む所望の
産物を提供する。挿入ドナー（ＡおよびＢを含む）は、組換えタンパク質により
、ベクタードナー（ＣおよびＤを含む）と四角の組換え部位においてまず組換え
て、Ａ−Ｄ−Ｃ−Ｂの各々を有するコインテグレートを形成する。次に、丸の組
換え部位において組換えが生じて、産物ＤＮＡ（ＡおよびＤ）ならびに副産物Ｄ
ＮＡ（ＣおよびＢ）を形成する。しかし、所望であれば、２つ以上の異なるコイ
ンテグレートが形成されて、２つ以上の産物を生成し得る。
【００８６】 本発明のインビトロまたはインビボ組換えクローニング方法の１つの実施態様
において、少なくとも１つの所望の産物ＤＮＡを選択するための方法が提供され
る。これは、図２に示されるプラスミドｐＥＺＣ７２６のマップの考慮により理
解され得る。２つの例示的な組換え部位は、ａｔｔＰおよびｌｏｘＰである。こ
れらの部位により規定される１つのセグメント上に、そのプロモーターがトラン
スポゾンＴｎ１０由来のｔｅｔＯＰオペレーター／プロモーターにより置換され
ているカナマイシン耐性遺伝子が存在する。ｔｅｔリプレッサータンパク質の非
存在下において、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡポリメラーゼは、ｔｅｔＯＰからカナマ
イシン耐性遺伝子を転写する。ｔｅｔリプレッサーが存在する場合、それはｔｅ
ｔＯＰに結合し、そしてカナマイシン耐性遺伝子の転写をブロックする。ｐＥＺ
Ｃ７２６の他のセグメントは、構成性プロモーターにより発現されるｔｅｔリプ
レッサー遺伝子を有する。従って、ｐＥＺＣ７２６により形質転換される細胞は
、ｔｅｔＲと同じセグメント上のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ遺伝子のためにクロラムフェニコールに耐性であるが、カナマイシンに感受
性である。組換え反応は、ｔｅｔＲ遺伝子の調節されたカナマイシン耐性遺伝子
からの分離を生じる。この分離は、所望の組換え産物を受ける細胞においてカナ
マイシン耐性を生じる。
【００８７】 ２つの異なる組のプラスミドを、インビトロ方法を実証するために構築した。
Ｃｒｅリコンビナーゼのみのでの使用のための１つの組（クローニングベクター
６０２およびサブクローニングベクター６２９（図３））は、ｌｏｘＰおよびｌ
ｏｘＰ ５１１部位を含有した。Ｃｒｅおよびインテグラーゼでの使用のための
第２の組（クローニングベクター７０５およびサブクローニングベクター７２６
（図２））は、ｌｏｘＰおよびａｔｔ部位を含有した。所望の娘プラスミドの産
生の効率は、Ｃｒｅ単独を使用するよりも、両方の酵素を使用すると、約６０倍
高かった。Ｃｒｅ単独反応由来の２４コロニー中１９が、所望の産物を含んだが
、インテグラーゼ＋Ｃｒｅ反応由来の３８コロニー中３８が、所望の産物プラス
ミドを含んだ。
【００８８】 種々の他の選択スキームは、組換えクローニングが実施される特定の目的に適
合し得る場合、当該分野において公知であるそれらが、使用され得る。個々の嗜
好および要求に依存して、多数の異なる型の選択スキームが本発明の組換えクロ
ーニングまたはサブクローニング方法において使用され得る。当業者は、多数の
ＤＮＡセグメントまたはそれらを作製するための方法、および当該分野において
慣例的に使用される異なる選択方法の有効性を利用し得る。このようなＤＮＡセ
グメントは、活性（例えば、ＲＮＡ、ペプチド、もしくはタンパク質の産生、し
かしこれらに限定されない）をコードするＤＮＡセグメント、またはこのような
ＲＮＡ、ペプチド、もしくはタンパク質のための結合部位を提供するＤＮＡセグ
メントを含むが、これらに限定されない。選択スキームの考案において使用され
るＤＮＡ分子の例は、「選択スキーム」の定義のもとに、上記に示される。
【００８９】 さらなる例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない： （ｉ）ＰＣＲのための新たなプライマー部位の生成（例えば、以前は並置され
ていなかった２つのＤＮＡ配列の並置）； （ｉｉ）制限エンドヌクレアーゼまたは他のＤＮＡ修飾酵素、化学物質、リボ
ザイムなどにより作用されるＤＮＡ配列の含有； （ｉｉｉ）ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、化学物質などにより認識
されるＤＮＡ配列の含有（例えば、集団についての選択または集団からの排除の
ためのアフィニティータグとしての使用のための）（Ｄａｖｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：７０２−７０６（１９９６）；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９
：８０２７−８０３４（１９９５））あるいはインビトロ転写に関するプロモー
ターを並置するために； （ｉｖ）ランダマイズされ、そしてｃＤＮＡ由来のＲＮＡライブラリーを用い
ることによる、エプスタインバーウイルス発現ＲＮＡに会合するリボソームＬ２
２タンパク質についてのＲＮＡリガンドのインビトロ選択； （ｖｉ）その活性が特異的方向および並置を必要とする機能性エレメント（例
えば、（ａ）トランスでは弱く反応するが、シスに配置されると、適切なタンパ
ク質の存在下において、分子の特定の集団を破壊する組換え（例えば、インビト
ロＲＮＡ合成を可能にするプロモーター配列の再構成）を生じる組換え部位）の
配置。このＲＮＡは直接使用され得るか、または逆転写されて所望のＤＮＡ構築
物を入手し得る； （ｖｉｉ）分子（単数または複数）のサイズ（例えば、画分）または他の物理
的性質による所望の産物の選択；および （ｖｉｉｉ）その同定を可能にする特異的修飾（例えば、メチル化）のために
必要とされるＤＮＡ配列の含有。
【００９０】 本発明の方法における産物および副産物の形成後、特定の組換えクローニング
手順において必要に応じて考案された特定の選択スキームに依存して、選択工程
はインビトロまたはインビボのいずれかにおいて実施され得る。
【００９１】 例えば、選択のインビトロ方法が、挿入物ドナーおよびベクタードナーＤＮＡ
分子について案出され得る。このようなスキームは、組換え事象の後に、希な切
断部位が副産物中に至るように、出発環状ベクターにおいて希な制限部位を操作
することを含み得る。従って、希な制限部位を結合し、そしてそれを切断する制
限酵素がインビトロにおいて反応混合物に添加されると、希な切断部位を有する
ＤＮＡ分子（すなわち、出発ＤＮＡ分子、同時組込み、および副産物）の全ては
切断され、そして意図される宿主細胞において複製不能にされる。例えば、セグ
メントＢおよびＣにおける切断部位（図１を参照のこと）は、産物以外のすべて
の分子に対して選択するために使用され得る。あるいは、セグメントＤについて
（例えば、Ｂ上に見出されない薬物耐性遺伝子により）選択し得る場合、Ｃにお
ける切断部位のみが必要とされる。
【００９２】 同様に、直鎖状ＤＮＡ分子を扱う場合、インビトロ選択方法が案出され得る。
ＰＣＲプライマー配列に相補的なＤＮＡ配列が、産物分子にのみ、組換えクロー
ニング方法により、移入されるように操作され得る。反応が完了した後、適切な
プライマーが反応溶液に添加され、そしてサンプルがＰＣＲに供される。従って
、産物分子の全てまたは一部が増幅される。
【００９３】 他のインビボ選択スキームが、種々の宿主細胞、特にＥ．ｃｏｌｉ株を用いて
使用され得る。１つのスキームは、サブクローニングプラスミドの一方のセグメ
ント上にリプレッサー遺伝子を、そして同じプラスミドの他方のセグメント上に
そのリプレッサーにより制御される薬物マーカーを置くことである。別のスキー
ムは、サブクローニングプラスミドのセグメントＣ上にキラー遺伝子を置くこと
である（図１）。もちろん、このようなプラスミドを増殖させるための方法が存
在しなくてはならない。すなわち、それにおいてキラー遺伝子が死滅させない状
況が存在しなければならない。Ｅ．ｃｏｌｉの特定の株を必要とする公知の多数
の遺伝子が存在する。１つのこのようなスキームは、制限酵素ＤｐｎＩ（これは
、その認識配列ＧＡＴＣがメチル化されない限り切断しない）を使用することで
ある。多数の普及した一般的なＥ．ｃｏｌｉ株はＧＡＴＣ配列をメチル化するが
、その中でクローン化されたＤｐｎＩが害なしに発現され得る変異体が存在する
。その他の制限酵素遺伝子もまた、選択のための毒性遺伝子として用いられ得る
。このような場合、対応するメチラーゼ遺伝子をコードするゲノム（ｇｅｍ）を
含む宿主が、本発明における使用のための保護された宿主を提供する。同様に、
ｃｃｄＢタンパク質は、ＤＮＡジャイレースの潜在的な毒物であり、切断可能な
複合体中のジャイレース分子を効率的にトラップし、ＤＮＡ鎖切断および細胞死
を引き起こす。ＤＮＡジャイレースのｇｙｒＡサブユニット中の変異、特に、ｇ
ｙｒＡ４６２変異は、ｃｃｄＢに対する耐性を付与する（Ｂｅｒｎａｒｄおよび
Ｃｏｕｔｕｒｉｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２６（１９９２）７３５−７４５
）。ｇｙｒＡ４６２変異を含むＥ．ｃｏｌｉ株ＤＢ２が構築されている。ｃｃｄ
Ｂ遺伝子を発現するプラスミドを含むＤＢ２細胞は、ｃｃｄＢにより殺されない
。この株は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能であり、そして
１９９７年１０月１４日に、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、１８１５、Ｎｏｒｔｈ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、ＩＬ ６１６０４ ＵＳＡ
のコレクションに、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１８５２として寄託されている。
【００９４】 もちろん、類似の選択スキームが他の宿主生物のために案出され得る。例えば
、Ｔｎ１０のｔｅｔリプレッサー／オペレーターが真核生物において遺伝子発現
を制御するように適合させられた（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．，およびＢｕｊａｒｄ，
Ｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５
５１（１９９２））。従って、本明細書において例証されるｔｅｔリプレッサー
による薬物耐性の同じ制御または本明細書に記載の他の選択スキームが、真核生
物細胞において産物を選択するために適用され得る。
【００９５】 （組換えタンパク質） 本発明において、ＤＮＡセグメントの交換は、組換えタンパク質（リコンビナ
ーゼならびに会合するコファクターおよびタンパク質を含む）の使用によって達
成される。種々の組換えタンパク質が当該分野において記載されている。このよ
うなリコンビナーゼの例には以下が含まれる： Ｃｒｅ: バクテリオファージＰ１由来のタンパク質（Ａｂｒｅｍｓｋｉおよ びＨｏｅｓｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（３）：１５０９−１５１４（
１９８４））は、ｌｏｘＰ（交叉の遺伝子座）部位と呼ばれる３４ｂｐ ＤＮＡ
配列間の交換を触媒する（すなわち、組換えを引き起こす）（Ｈｏｅｓｓら、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（５）：２２８７（１９８６）を参照のこと
)。Ｃｒｅは市販されている（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログＮｏ．６９２４７−１ ）。Ｃｒｅによって媒介される組換えは、自由に可逆的である。熱力学的考察か
らは、Ｃｒｅ媒介性組込み（１つの分子を形成する２つの分子間の組換え）が、
Ｃｒｅ媒介性切り出し(２つの娘分子を形成する同一分子中の２つのｌｏｘＰ部 位間の組換え）より、はるかに効率的でないことは驚くべきことではない。Ｃｒ
ｅは、当該分野において周知のように、補因子としてマグネシウムまたはスペル
ミジンのいずれかを含む単純な緩衝液中で働く。ＤＮＡ基質は、直鎖状または超
らせん状のいずれかであり得る。多くの変異体ｌｏｘＰ部位が記載されている（
Ｈｏｅｓｓら、前掲）。これらの１つｌｏｘＰ ５１１は、別のｌｏｘＰ ５１
１部位と組換えるが、ｌｏｘＰ部位とは組み換えない。
【００９６】 インテグラーゼ：λゲノムのＥ．ｃｏｌｉ染色体への組込みを媒介する、バク
テリオファージλ由来のタンパク質。バクテリオファージλＩｎｔ組換えタンパ
ク質は、溶原状態の形成または誘導の一部として、その基質ａｔｔ部位間の組換
えを促進する。組換え反応の可逆性は、組込み組換えおよび切り出し組換えのた
めの２つの独立した経路から生じる。各経路は特有であるが重複する、ａｔｔ部
位ＤＮＡを含む１５のタンパク質結合部位のセットを使用する。４つのタンパク
質（Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、ＩＨＦおよびＦＩＳ）が関与する協同的および競合的相互
作用が組換えの方向を決定する。
【００９７】 組込み組換えには、ＩｎｔおよびＩＨＦタンパク質、ならびに部位ａｔｔＰ（
２４０ｂｐ）およびａｔｔＢ（２５ｂｐ）が関与する。組換えは、２つの新たな
部位：ａｔｔＬおよびａｔｔＲの形成を生じる。切り出し組換えは、ａｔｔＰお
よびａｔｔＢを生成するために、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、およびＸｉｓ、ならびに部位
ａｔｔＬおよびａｔｔＲを必要とする。特定の条件下で、ＦＩＳは、切り出し組
換えを刺激する。これらの正常な反応に加えて、ａｔｔＰおよびａｔｔＢは、同
一分子上に配置される場合、切り出し組換えを促進して２つの切り出し産物（ａ
ｔｔＬを有するものおよびａｔｔＲを有するもの）を生成し得ることを理解すべ
きである。同様に、ａｔｔＬを含む分子とａｔｔＲを含む分子との間での分子間
組換えは、Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉｓの存在下で、組込み組換えならびにａｔ
ｔＰおよびａｔｔＢの生成を生じ得る。従って、ＤＮＡセグメントを、操作した
ａｔｔ部位の適切な組合せと隣接させることによって、適切な組換えタンパク質
の存在下で、切り出し組換えまたは組込み組換えを、互いの逆反応として導き得
る。
【００９８】 ａｔｔ部位のそれぞれは、１５ｂｐのコア配列を含む。機能的重要性の個々の
配列エレメントは、この共通コアの境界の範囲内に、外側に、およびその境界を
横切って存在する（Ｌａｎｄｙ，Ａ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８
：９１３（１９８９））。種々のａｔｔ部位間の効率的な組換えは、中心共通領
域の配列が組換えパートナー間で同一であることを必要とする。しかし、現在は
、正確な配列は改変可能であることが見出されている。その結果、コア内に変化
を有する、ａｔｔ部位の誘導体が、少なくとも天然のコア配列と同程度に効率的
に組換えることが、現在は見出されている。
【００９９】 インテグラーゼはバクテリオファージλ上のａｔｔＰ部位（約２４０ｂｐ）を
Ｅ．ｃｏｌｉゲノム上のａｔｔＢ部位（約２５ｂｐ）と組換えて（Ｗｅｉｓｂｅ
ｒｇ，Ｒ．Ａ．およびＬａｎｄｙ，Ａ．Ｌａｍｂｄａ ＩＩ、ｐ．２１１（１９
８３）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ａ
ｔｔＬ（約１００ｂｐ）およびａｔｔＲ（約１６０ｂｐ）部位によって隣接され
た、組み込まれたλゲノムを生成するように作用する。Ｘｉｓの非存在下（下記
参照のこと）で、この反応は本質的に不可逆的である。インテグラーゼおよびＩ
ＨＦによって媒介される組込み反応は、インビトロで、スペルミジンを含む単純
な緩衝液を用いて働く。インテグラーゼは、Ｎａｓｈ，Ｈ．Ａ．、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １００：２１０−２１６（１９８３）によっ
て記載されるように入手され得る。ＩＨＦは、Ｆｉｌｕｔｏｗｉｃｚ，Ｍ．ら、
Ｇｅｎｅ １４７：１４９−１５０（１９９４）によって記載されるように入手
され得る。
【０１００】 種々の生物由来の多くの組換え系もまた、本明細書中に提供される教示および
ガイダンスに基づいて、使用され得る。例えば、Ｈｏｅｓｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４（６）：２２８７（１９８６）；Ａｂｒ
ｅｍｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（１）：３９１（１９８６）；
Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４（２３）：７４９５（１９
９２）；Ｑｉａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１１）：７７９４（１
９９２）；Ａｒａｋｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２５（１）：２５（１９９
２）を参照のこと。これらの多くは、リコンビナーゼのインテグラーゼファミリ
ーに属する（Ａｒｇｏｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：４３３−４４０（１９８６））
。おそらく、これらのうち、バクテリオファージλ由来のインテグラーゼ／ａｔ
ｔ系（Ｌａｎｄｙ，Ａ．（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：６９９−７０７）、バクテリオ
ファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰ系（ＨｏｅｓｓおよびＡｂｒｅｍｓｋｉ（
１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ、第４巻、ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＬｉｌｌｅｙ編、Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈ
ｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；９０−１０９頁）、お
よびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ２μ環状プラスミド由
来のＦＬＰ／ＦＲＴ系（Ｂｒｏａｃｈら、Ｃｅｌｌ ２９：２２７−２３４ （
１９８２））が、最も良く研究されている。
【０１０１】 部位特異的リコンビナーゼの第２のファミリーのメンバーであるリゾルベース
ファミリー（例えば、γδ、Ｔｎ３リゾルベース、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、およびＣｉ
ｎ）もまた公知である。リコンビナーゼのこの高度に関連するファミリーのメン
バーは、代表的には、分子内反応（例えば、反転および切り出し）に制約され、
そして宿主がコードする因子を必要とし得る。宿主因子の要求性のいくつか（Ｍ
ａｅｓｅｒおよびＫａｈｎｍａｎｎ（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．
２３０：１７０−１７６）および分子内組換えの制約のいくつかを軽減する変異
体が単離されている。
【０１０２】 λＩｎｔに類似の他の部位特異的リコンビナーゼおよびＰ１ Ｃｒｅに類似の
他の部位特異的リコンビナーゼは、ＩｎｔおよびＣｒｅを置換し得る。このよう
なリコンビナーゼは公知である。多くの場合、このような他のリコンビナーゼの
精製は、当該分野において記載されている。それらが公知でない場合、細胞抽出
物が使用され得るか、またはＣｒｅおよびＩｎｔについて記載された手順を使用
して、酵素が部分的に精製され得る。
【０１０３】 ＣｒｅおよびＩｎｔが例として詳細に記載されているが、多くの関連するリコ
ンビナーゼ系が存在し、そして記載された発明に対するそれらの適用もまた、本
発明に従って提供される。部位特異的リコンビナーゼのインテグラーゼファミリ
ーは、例えば、バクテリオファージλ、φ８０、Ｐ２２、Ｐ２、１８６、Ｐ４お
よびＰ１によりコードされる部位特異的組換えタンパク質のような、本発明のた
めの別の組換えタンパク質および組換え部位を提供するために使用され得る。こ
の群のタンパク質は、配列の予想し得ないほど大きな多様性を示す。この多様性
にも関わらす、すべてのリコンビナーゼは、そのＣ末端側の半分において整列さ
れ得る。
【０１０４】 Ｃ末端付近の４０残基領域は、すべてのタンパク質において、特によく保存さ
れており、そして酵母２μプラスミドＦｌｐタンパク質のＣ末端付近の領域と相
同である。３つの位置がこのファミリー内で完全に保存されている：ヒスチジン
、アルギニンおよびチロシンが、よく保存されたＣ末端領域内のそれぞれのアラ
インメント位置３９６、３９９および４３３に見出される。これらの残基は、こ
のファミリーのリコンビナーゼの活性部位に寄与し、そしてチロシン-４３３が 鎖切断および再結合の間にＤＮＡと一時的に共有結合を形成することを示唆する
。例えば、Ａｒｇｏｓ，Ｐ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ． ５：４３３−４０ （１９８
６）を参照のこと。
【０１０５】 接合性トランスポゾン（例えば、Ｔｎ９１６）（ＳｃｏｔｔおよびＣｈｕｒｃ
ｈｗａｒｄ．１９９５．Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４９：３６７；
ＴａｙｌｏｒおよびＣｈｕｒｃｈｗａｒｄ、１９９７．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
１７９：１８３７）のようないくつかのトランスポゾンのリコンビナーゼは、
リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属し、そしていくつかの場合には
、特異的組込み部位に対する強い選択性を示す（Ｉｋｅら、１９９２．Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ １７４：１８０１；Ｔｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔら、１９９３．Ｍｏ
ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８：１７９）。
【０１０６】 あるいは、ＩＳ２３１および他のＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ
ｉｓの転移エレメントが、組換えタンパク質および組換え部位として使用され得
る。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓは、その毒性が、農業的な
有害生物ならびにヒトおよび動物の疾患のベクターに対して活性である、胞子嚢
中のデルタエンドトキシン結晶の存在に起因する、昆虫病原性（ｅｎｔｏｍｏｐ
ａｔｈｏｇｅｎｉｃ）細菌である。これらの毒素タンパク質をコードする遺伝子
のほとんどは、プラスミドに保有され、そして一般に、挿入配列（ＩＳ２３１、
ＩＳ２３２、ＩＳ２４０、ＩＳＢＴ１およびＩＳＢＴ２）ならびにトランスポゾ
ン（Ｔｎ４４３０およびＴｎ５４０１）と構造的に関連している。これらの可動
エレメントのいくつかは活性であり、そして結晶遺伝子の可動性に関与し、その
ことによって細菌毒性の変動に寄与することが示されている。
【０１０７】 イソＩＳ２３１エレメントの構造分析により、それらがＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のＩＳ１１５１に関連し、そしてＥｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＩＳ４およびＩＳ１８６に遠縁に関連することが示
される。他のＩＳ４ファミリーのメンバーと同様に、それらは、他のＩＳファミ
リーおよびレトロウイルスに見出される、保存されたトランスポゼース−インテ
グラーゼモチーフを含む。さらに、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＩＳ２
３１Ａから収集した機能的データは、特異的な標的に対して優先性を有する、非
複製様式の転位を示す。同様な結果はまた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓおよびＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓにおいても得られた。例えば、Ｍａｈ
ｉｌｌｏｎ，Ｊ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃａ ９３：１３−２６（１９９４）；Ｃａ
ｍｐｂｅｌｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７４９５−７４９９（１９９２）を参
照のこと。
【０１０８】 リコンビナーゼの非関連ファミリーである、トランスポザーゼもまた、レプリ
コン間の遺伝情報を移入するために用いられている。トランスポゾンは構造的に
変動可能であり、単一物または複合物として記載されるが、代表的には、逆向き
に組織化されたＤＮＡ配列が隣接するリコンビナーゼ遺伝子をコードする。トラ
ンスポゾンの組込みは、ランダムまたは高度に特異的であり得る。高度に部位特
異的である、Ｔｎ７のような代表例は、レプリコン間のＤＮＡセグメントの効率
的な移動に適用された（Ｌｕｃｋｌｏｗら、１９９３．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６７：
４５６６−４５７９）。
【０１０９】 関連するエレメントであるインテグロンはまた、１つのレプリコンから他への
薬物耐性カセットの移動を転座可能に促進する。しばしば、これらのエレメント
は、欠損性トランスポゾン誘導体である。トランスポゾンＴｎ２１は、Ｉｎ２と
呼ばれるクラスＩインテグロンを含む。Ｉｎ２からのインテグラーゼ（ＩｎｔＩ
Ｉ）は、このクラスのすべてのインテグロンに共通であって、２つの５９ｂｐエ
レメント間、または５９ｂｐエレメントとａｔｔＩ部位との間の組換えを仲介し
、これは、レシピエントのインテグロン中への挿入をもたらし得る。このインテ
グラーゼもまた、切除的組換えを触媒する（Ｈａｌｌ、１９９７．Ｃｉｂａ Ｆ
ｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ ２０７：１９２；Ｆｒａｎｃｉａら、１９９７．Ｊ Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ １７９：４４１９）。
【０１１０】 グループＩＩイントロンは、触媒的ＲＮＡおよびタンパク質をコードする移動
性遺伝子エレメントである。このタンパク質成分は、逆転写酵素、マチュラーゼ
、およびエンドヌクレアーゼ活性を持ち、その一方このＲＮＡは、エンドヌクレ
アーゼ活性を持ち、そしてイントロンが組込まれる標的部位の配列を決定する。
このＲＮＡ配列の部分を改変することにより、このエレメントが組込まれる組込
み部位を規定し得る。外来ＤＮＡ配列を、イントロンの両末端間に取込み得、特
異的部位を標的にすることを可能にする。このプロセスは、レトロホーミングと
呼ばれ、ＤＮＡ：ＲＮＡ中間体を経由して生じ、これは、ｃＤＮＡ中、そして最
終的には、二本鎖ＤＮＡ中にコピーされる（Ｍａｔｓｕｕｒａら、Ｇｅｎｅｓ
ａｎｄ Ｄｅｖ １９９７；Ｇｕｏら、ＥＭＢＯ Ｊ，１９９７）。多くのイン
ロトンにコードされるホーミングエンドヌクレアーゼが同定されている（Ｂｅｌ
ｆｏｒｔおよびＲｏｂｅｒｔｓ、１９９７．ＮＡＲ ２５：３３７９）。このよ
うな系は、記載されたサブクローニング方法への適用に容易に採用され得る。
【０１１１】 組換え反応を駆動するために添加されるリコンビナーゼの量は、公知のアッセ
イを用いることによって決定され得る。詳細には、力価アッセイを使用して、精
製されたリコンビナーゼ酵素の適切な量または抽出物の適切な量を決定する。
【０１１２】 （操作された組換え部位） 上記リコンビナーゼおよび対応するリコンビナーゼ部位は、本発明に従う組換
えクローニングにおける使用に適切である。しかし、野生型組換え部位は、本発
明の方法において適用されるような、組換え反応の効率もしくは特異性または産
生分子の機能を低下させる配列を含む。例えば、ａｔｔＢ、ａｔｔＲ、ａｔｔＰ
、ａｔｔＬおよびｌｏｘＰ組換え部位における複数の終止コドンが、両方の鎖上
の複数のリーディングフレーム中に生じる。従って、翻訳の効率は、例えば、コ
ード配列が組換え部位を横切らなければならない（１つのリーディングフレーム
のみがｌｏｘＰおよびａｔｔＢ部位の各鎖上で利用可能である）場合、低下する
か、または（ａｔｔＰ、ａｔｔＲもしくはａｔｔＬにおいて）不可能である。
【０１１３】 従って、本発明はまた、これらの問題を克服する操作された組換え部位を提供
する。例えば、ａｔｔ部位は、組換え反応の特異性または効率および産物ＤＮＡ
の性質を増強するために（例えば、ａｔｔ１、ａｔｔ２、およびａｔｔ３部位）
、逆反応を減少させるために（例えば、ａｔｔＲからのＰ１およびＨ１の除去）
、１または複数の変異を有するように操作され得る。これらの変異体の試験は、
どの変異体が、本発明に従う組換えサブクローニングに適切であるに十分な組換
え活性を生じるかを決定する。
【０１１４】 従って、変異は、部位特異的組換えを増強するために組換え部位に導入され得
る。このような変異には、翻訳終止コドンを有さない組換え部位（これは、融合
タンパク質がコードされることを可能にする）；同一のタンパク質によって認識
されるが塩基配列が異なる組換え部位（その結果、これらは、それらの相同なパ
ートナーと大きくまたは排他的に反応して、複数の意図されるべき反応を可能に
する）および組換え部位のヘアピン形成を防ぐ変異体が含まれるが、これらに限
定されない。どの特定の反応が起こるかは、どの特定のパートナーが反応混合物
中に存在するかによって特定され得る。例えば、三部分タンパク質融合体は、組
換え部位ａｔｔＲ１およびａｔｔＬ１；ならびにａｔｔＢ３；ａｔｔＲ１；ａｔ
ｔＰ３および１０ｘＰ；ならびに／またはａｔｔＲ３および１０ｘＰ；ならびに
／またはａｔｔＲ３およびａｔｔＬ２を含む親プラスミドを用いて達成され得る
。
【０１１５】 特定の変異を核酸配列に導入するための周知の手順が存在する。これらの多く
はＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ
， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９−１９９６））に記載されている。変異は、
オリゴヌクレオチド中に設計され得、これは、既存のクローニングされた配列を
改変するために、または増幅反応において使用され得る。所望の変異体ＤＮＡま
たはＲＮＡを単離するために適切な選択方法が利用可能である場合、ランダム変
異誘発もまた用いられ得る。所望の変異の存在は、核酸を周知の方法によって配
列決定することにより確認され得る。
【０１１６】 以下の限定されない方法が、所定の組換え部位のコア領域を改変または変異し
て、本発明で使用され得る変異した部位を提供するために、使用され得る： １．部位特異的（例えば、ａｔｔＢを得るためのａｔｔＬおよびａｔｔ
Ｒ）組換え機構または他の（例えば、相同）組換え機構による２つの親ＤＮＡ配
列の組換えによる。この親ＤＮＡセグメントは、最終的な変異コア配列を生じる
１つ以上の塩基変化を含む； ２．所望のコア配列の直接的な変異または変異誘発（部位特異的、ＰＣ
Ｒ、ランダム、自発的など）による； ３．組み換えられて所望のコア配列を生じる親ＤＮＡ配列の変異誘発（
部位特異的、ＰＣＲ、ランダム、自発的など）による； ４．所望のコア配列をコードするＲＮＡの逆転写による；および ５．所望の塩基変化を有する配列のデノボ合成（化学合成）。
【０１１７】 変異体組換え部位の機能性は、所望の特定の特性に依存する方法で示され得る
。例えば、組換え部位における翻訳終止コドンの欠如は、適切な融合タンパク質
を発現させることによって示され得る。相同なパートナー間の組換えの特異性は
、適切な分子をインビトロ反応に導入し、本明細書中に記載したように、または
当該分野において公知のように、そして組換え産物について、アッセイすること
によって、示され得る。組換え部位における他の所望の変異は、制限部位、翻訳
または転写開始シグナル、タンパク質結合部位、および核酸塩基配列の他の公知
の機能が存在することまたは存在しないことを包含し得る。組換え部位における
特定の機能的特性に関する遺伝子選択スキームは、公知の方法の工程に従って使
用され得る。例えば、（相互作用しない一対の部位から）相互作用するパートナ
ーを提供するための部位の改変は、毒性物質をコードするＤＮＡ配列のこれら部
位間の組換えを介しての欠失を要求することよって達成され得る。同様に、翻訳
終止配列を除去する部位についての選択、タンパク質結合部位の存在または非存
在などは、当業者によって容易に案出され得る。
【０１１８】 従って、本発明は、選択マーカーおよび／または所望のＤＮＡセグメントに隣
接する少なくとも２つの操作された組換え部位を有する少なくとも１つのＤＮＡ
セグメントを含む核酸分子を提供する。ここで、上記組換え部位のうち少なくと
も１つは、同時組込みＤＮＡまたは産物ＤＮＡの形成においてインビトロで組換
えを増強する、少なくとも１つの操作された変異を有するコア領域を含む。
【０１１９】 好適な実施では、組換え部位は配列が異なり、そして互いに相互作用しないが
、同じ配列を含む部位を操作して、互いとの組換えを阻害し得ることが認識され
る。このような概念も考慮され、そして本明細書中に援用される。例えば、タン
パク質結合部位を、部位の一つに隣接して操作し得る。このような部位を認識す
るタンパク質の存在下で、リコンビナーゼは、この部位にアクセスし得ず、そし
てそれ故、他の部位が優先的に用いられる。融合体では、この部位は、もはや反
応し得ない。なぜなら、それは、例えば、ａｔｔＢからａｔｔＬに変化している
からである。この融合体の分解において、タンパク質は不活性化され得（例えば
、抗体、熱または緩衝液の交換）、そして第２の部位が組換えを行い得る。
【０１２０】 核酸分子は、上記組換えの少なくとも１つの増強を付与する、少なくとも１つ
の変異を有し得る。この増強は、実質的に（ｉ）組込みを優先すること；（ｉｉ
）組換えを優先すること；（ｉｉ）宿主因子の要求性を軽減すること；（ｉｉｉ
）上記コインテグレートＤＮＡまたは産物ＤＮＡ形成の効率を増加させること；
および（ｉｖ）上記コインテグレートＤＮＡまたは産物ＤＮＡ形成の特異性を増
加させることからなる群より選択される。
【０１２１】 核酸分子は、好ましくは、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬまたはａｔｔＲ（例
えば、ａｔｔＲ’またはａｔｔＰ’）に由来する少なくとも１つの組換え部位を
含む。より好ましくは、ａｔｔ部位は、本明細書に記載のように、ａｔｔ１、ａ
ｔｔ２、またはａｔｔ３から選択される。
【０１２２】 好ましい実施態様において、コア領域は、以下からなる群より選択されるＤＮ
Ａ配列： （ａ）ＲＫＹＣＷＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＳＴＳＧＢ（ｍ−ａｔｔ）（
配列番号１）； （ｂ）ＡＧＣＣＷＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＣＴＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＢ）
（配列番号２）； （ｃ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＫＴＲＴＡＣＮＡＡＣＴＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＲ）
（配列番号３）； （ｄ）ＡＧＣＣＷＧＣＴＴＴＣＫＴＲＴＡＣＮＡＡＧＴＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＬ）
（配列番号４）； （ｅ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＧＴＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＰ１
）（配列番号５）； （ｆ）ＲＢＹＣＷＧＣＴＴＴＹＴＴＲＴＡＣＷＡＡＳＴＫＧＤ（ｎ−ａｔｔ）（
配列番号３９）； （ｇ）ＡＳＣＣＷＧＣＴＴＴＹＴＴＲＴＡＣＷＡＡＳＴＫＧＷ（ｎ−ａｔｔＢ）
（配列番号４０）； （ｈ）ＡＳＣＣＷＧＣＴＴＴＹＴＴＲＴＡＣＷＡＡＧＴＴＧＧ（ｎ−ａｔｔＬ）
（配列番号４１）； （ｉ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＹＴＴＲＴＡＣＷＡＡＳＴＫＧＷ（ｎ−ａｔｔＲ）
（配列番号４２）； （ｊ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＹＴＴＲＴＡＣＷＡＡＧＴＴＧＧ（ｎ−ａｔｔＰ）
（配列番号４３）； あるいは対応するまたは相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡ配列を含む。ここで、米
国特許法施行規則§１．８２２（本明細書中に参考としてその全体を援用する）
に示されているように、Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＴ／Ｕ；Ｙ＝ＣまたはＴ
／Ｕ；Ｗ＝ＡまたはＴ／Ｕ；Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ／Ｕ；Ｓ＝Ｃまた
はＧ；そしてＢ＝ＣまたはＧまたはＴ／Ｕであり、コア領域は、１以上のリーデ
ィングフレームにおいて終止コドンを含まない。
【０１２３】 コア領域はまた、好ましくは、以下からなる群より選択されるＤＮＡ配列： （ａ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴ（ａｔｔＢ１）（
配列番号６）； （ｂ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴ（ａｔｔＢ２）（
配列番号７）； （ｃ）ＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴ（ａｔｔＢ３）（
配列番号８）； （ｄ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴ（ａｔｔＲ１）（
配列番号９）； （ｅ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴ（ａｔｔＲ２）（
配列番号１０）； （ｆ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴ（ａｒｒＲ３）（
配列番号１１）； （ｇ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧ（ａｔｔＬ１）（
配列番号１２）； （ｈ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧ（ａｔｔＬ２）（
配列番号１３）； （ｉ）ＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧ（ａｔｔＬ３）（
配列番号１４）； （ｊ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧ（ａｔｔＰ１）（
配列番号１５）； （ｋ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧ（ａｔｔＰ２、Ｐ
３）（配列番号１６）；または、対応するかもしくは相補的なＤＮＡまたはＲＮ
Ａ配列を含む。
【０１２４】 従って、本発明はまた、核酸分子を作製するための方法を提供する。この方法
は、上記配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０〜９９％の相同性
（あるいはその中の任意の範囲または値）を有する少なくとも１つのＤＮＡ配列
を含む少なくとも１つの操作された組換え部位、または任意の適切な組換え部位
を有する核酸分子、あるいは、当該分野において公知のように、ストリンジェン
トな条件下で、その核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を提供する工程を包
含する。
【０１２５】 明らかなことではあるが、このような周知のインビトロおよびインビボ選択方
法の種々のタイプおよび変更が存在する。これらの各々については、簡略にする
ために、本明細書に記載されない。しかし、このような変形および変更は、本発
明の異なる実施態様であると意図されており、そしてそのようにみなされる。
【０１２６】 インビトロ組換え反応である好ましい実施態様の結果として、非生物学的分子
（例えば、ＰＣＲ産物）が、本発明の組換えクローニング方法により操作され得
ることに注目することが重要である。１つの例において、直鎖状分子を環状ベク
ターにクローニングすることが可能である。
【０１２７】 本発明には多くの適用がある。これらの使用には、ベクターを変化させること
、プロモーターを遺伝子の隣に並べること（ａｐｐｏｓｉｎｇ）、融合タンパク
質に対する遺伝子を構築すること、コピー数を変化させること、レプリコンを変
化させること、ファージにクローニングすること、ならびに例えば、ＰＣＲ産物
（一方の端にａｔｔＢ部位、そして他方の端にｌｏｘＰ部位を有する）、ゲノム
ＤＮＡおよびｃＤＮＡをクローニングすることが含まれるが、これらに限定され
ない。
【０１２８】 （ベクタードナー） 本発明に従って、任意のベクターを用いて本発明のベクタードナーを構築する
ために使用し得る。特に、当該分野で公知のベクターおよび市販されているベク
ター（およびそれらの改変体または誘導体）を本発明に従って操作し、本発明の
方法における使用のための一つ以上の組換え部位を含め得る。このようなベクタ
ーは、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、ＩｎＶｉ
ｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｏｖａｇｅｎ、ＮＥＢ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＥｐｉＣｅｎ
ｔｅｒ、ＯｒｉＧｅｎｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、およびＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓから得られ得る。次いでこのようなベクターは、例えば、目的の核酸分子をク
ローニングまたはサブクローニングするために用いられ得る。特定の目的のベク
ターの一般的なクラスは、原核生物および／または真核生物クローニングベクタ
ー、発現ベクター、融合ベクター、ツーハイブリッドまたは逆ツーハイブリッド
ベクター、異なる宿主における使用のためのシャトルベクター、変異誘発ベクタ
ー、転写ベクター、大挿入片などを受け入れるためのベクターなどを含む。
【０１２９】 目的の他のベクターは、ウイルス起源ベクター（Ｍ１３ベクター、バクテリオ
ファージλベクター、アデノウイルスベクター、およびレトロウイルスベクター
）、高、低および調節可能コピー数ベクター、単一宿主中における組み合わせ使
用のための適合レプリコンを有するベクター類（ｐＡＣＹＣ１８４およびｐＢＲ
３２２）および真核生物エピソーム性複製ベクター（ｐＣＤＭ８）を含む。
【０１３０】 目的の特定のベクターは、ｐｃＤＮＡＩＩ、ｐＳＬ３０１、ｐＳＥ２８０、ｐ
ＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＴｒｃＨｉｓＡ、Ｂ、およびＣ、ｐＲＳＥＴＡ、
Ｂ、およびＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ｐＧＥＭＥＸ−１、および
ｐＧＥＭＥＸ−２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）、ｐＥＴベクター類（Ｎｏｖａ
ｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸベクター類
、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、およびｐＭＣ１８７１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，
Ｉｎｃ．）、ｐＫＫ２３３−２およびｐＫＫ３８８−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉ
ｎｃ．）、およびｐＰｒｏＥｘ−ＨＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｉｎｃ．）のような原核生物発現ベクターおよびそれらの改変体および誘導体を
含む。ベクタードナーはまた、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ、ｐＦ
ａｓｔＢａｃＤＵＡＬ、ｐＳＦＶ、およびｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＰＵＲ、ｐＭＡＭ
、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＤＲ２、ｐＣＭＶＥＢＮＡ
、およびｐＹＡＣｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳ
Ｇ、ｐＣＨ１１０、およびｐＫＫ２３２−８（Ｐｈａｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）、
ｐ３’ＳＳ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、
およびｐＯＧ４４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）およびｐＹＥＳ２、ｐＡ
Ｃ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、およびＣ、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｓ
ｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、
ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、およびｐＥＢＶＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎ
ｃ．）のような真核発現ベクターおよびそれらの改変体または誘導体から作成さ
れ得る。
【０１３１】 特定の目的のその他のベクターは、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅＳｃ
ｒｉｐｔ、ｐＳＰＯＲＴ、コスミド、ファージミド、ＹＡＣ類（酵母人工染色体
）、ＢＡＣ類（細菌人工染色体）、Ｐ１（Ｅ．ｃｏｌｉファージ）、ｐＱＥ７０
、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（ｑｕａｇａｎ）、ｐＢＳベクター、ＰｈａｇｅＳｃｒ
ｉｐｔベクター、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、
ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡ３（ＩｎＶ
ｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＸ、ｐＴｒｓｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＥＴ−５、
ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＰＱＲＴ１、ｐＳＰＯＲＴ２、ｐＣＭＶＳＰＯＲ
Ｔ２．０およびｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｉｎｃ．）およびそれらの改変体または誘導体を含む。
【０１３２】 目的のさらなるベクターは、ｐＴｒｘＦｕｓ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ、ｐＬＥＸ、
ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＴｒｃＨｉｓ２、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１（−）／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ、ｐＳｅ
ｃＴａｇ、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＡＯ８１５、
ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺα、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．
５、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＭｅｌＢａｃ、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ｐＳｉｎ
Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ（ＳＰ１）、ｐＶｇＲＸＲ、ｐｃＤＮＡ２．１、ｐ
ＹＥＳ２、ｐＺＥｒＯ１．１、ｐＺＥｒＯ−２．１、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＳ
Ｅ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐ
ＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ、ｐＳｅ、ＳＶ２、ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐＲＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ｐＲＥＰ８、ｐＲＥＰ９、ｐＲＥＰ１０、ｐＣＥ
Ｐ４、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＣＲ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＣＲ３．１−Ｕｎｉ、
およびｐＣＲＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）；λＥｘＣｅｌｌ、λｇｔ１
１、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ−１λＴ、ｐＧＥＸ−２Ｔ，
ｐＧＥＸ−２ＴＫ、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２、ｐＧＥＸ−４Ｔ
−３、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−５Ｘ−２、ｐＧＥＸ−
５Ｘ−３、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＭＣ１８７１、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶ
Ｌ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、ｐＫＫ２３２−８、ｐＳＬ１１８０、ｐＮＥＯ、
およびｐＵＣ４Ｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから）；ｐＳＣＲＥＥＮ−１ｂ（＋）、
ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、ｐＣＩＴＥ−４ａｂｃ（＋）、ｐ
ＯＣＵＳ−２、ｐＴＡｇ、ｐＥＴ−３２ＬＩＣ、ｐＥＴ−３０ＬＩＣ、ｐＢＡＣ
−２ｃｐＬＩＣ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２ｃｐＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２ＬＩＣ、
ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、λＳＣＲＥＥＮ−１、λＢｌｕｅＳＴＡＲ、ｐＥＴ−３ａ
ｂｃｄ、ｐＥＴ−７ａｂｃ、ｐＥＴ９ａｂｃｄ、ｐＥＴ１１ａｂｃｄ、ｐＥＴ１
２ａｂｃ、ｐＥＴ−１４ｂ、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−１６ｂ、ｐＥＴ−１７−
ｂ−ｐＥＴ−１７ｘｂ、ｐＥＴ−１９ｂ、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１
ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ
−２４ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ
−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−２９ａｂｃ（＋）、ｐＥ
Ｔ−３０ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ａｂｃ（＋）、ｐ
ＥＴ−３３ｂ（＋）、ｐＢＡＣ−１、ｐＢＡＣｇｕｓ−１、ｐＢＡＣ４ｘ−１、
ｐＢＡＣｇｕｓ４ｘ−１、ｐＢＡＣ−３ｃｐ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２ｃｐ、ｐＢＡ
Ｃｓｕｒｆ−１、ｐｌｇ、Ｓｉｇｎａｌ ｐｌｇ、ｐＹＸ、Ｓｅｌｅｃｔａ Ｖ
ｅｃｔａ−Ｎｅｏ、Ｓｅｌｅｃｔａ Ｖｅｃｔａ−Ｈｙｇ、およびＳｅｌｅｃｔ
ａ Ｖｅｃｔａ−Ｇｐｔ（Ｎｏｖａｇｅｎから）；ｐＬｅｘＡ、ｐＢ４２ＡＤ、
ｐＧＢＴ９、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤ ＧＬ、ｐ
ＧＡＤ ＧＨ、ｐＧＡＤ１０、ｐＧｉｌｄａ、ｐＥＺＭ３、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧ
ＦＰ−１、ｐＥＧＦＰ−Ｎ、ｐＥＧＰＦ−Ｃ、ｐＥＢＦＰ、ｐＧＦＰｕｖ、ｐＧ
ＦＰ、ｐ６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ、ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏ
ｎｔｒａｌ、ｐＳＥＡＰ２−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐＳＥＡＰ２−Ｅｎｈａｎｃｅ
ｒ、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ、ｐβｇａｌ−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐβｇａｌ−Ｐｒ
ｏｍｏｔｅｒ、ｐβｇａｌ−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐＣＭＶβ、ｐＴｅｔ−Ｏｆｆ
、ｐＴｅｔ−Ｏｎ、ｐＴＫ−Ｈｙｇ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏ
ｎ、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＩＲＥＳ１ｈｙｇ、ｐＬＸＳＮ、ｐＬＮＣＸ、ｐＬ
ＡＰＳＮ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＣＡＴ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＬＵＣ
、ｐＰＵＲ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＹＥＸ４Ｔ−１／２／３、ｐＹＥＸ−Ｓ１、ｐ
ＢａｃＰＡＫ−Ｈｉｓ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＡｃＵＷ３１、ＢａｃＰＡＫ
６、ｐＴｒｉｐｌＥｘ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、ｐＷＥ１５、およびλＴｒｉ
ｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから）；λＺＡＰＩＩ、ｐＢＫ−ＣＭＫ、ｐＢＫ−
ＲＳＶ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋／−、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ
ＳＫ＋／−、ｐＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＢＤ−ＧＡＬ４Ｃａｍ、ｐＳｕｒｆｓｃｒｉ
ｐｔ、λＦＩＸＩＩ、λＤＡＳＨ、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４、ＳｕｐｅｒＣ
ｏｓ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｇｔ Ａｍｐ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ、ｐＣＲ
−Ｓｃｒｉｐｔ Ｄｉｒｅｃｔ、ｐＢＳ＋／−、ｐＢＣ ＫＳ＋／−、ｐＢＣ
ＳＫ＋／−、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＣＡＬ−ｎ、ｐ
ＣＡＬ−ｃ、ｐＣＡＬ−ｋｃ、ｐＥＴ−３ａｂｃｄ、ｐＥＴ−１１ａｂｃｄ、ｐ
ＳＰＵＴＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＣＭＶＬａｃＩ、ｐＯＰＲＳＶＩ／ＭＣＳ、ｐＯ
ＰＩ３ＣＡＴ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣｌｎｅｏ
、ｐＭＣｌｎｅｏ ＰｏｌｙＡ、ｐＯＧ４４、ｐＯＧ４５、ｐＦＲＴβＧＡＬ、
ｐＮＥＯβＧＡＬ、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６
、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４１５、およびｐＲＳ４１６（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅから）を含む。
【０１３３】 特定の目的のツーハイブリッドおよび逆ツーハイブリッドベクターは、ｐＰＣ
８６、ｐＤＢＬｅｕ、ｐＤＢＴｒｐ、ｐＰＣ９７、ｐ２．５、ｐＧＡＤ１−３、
ｐＧＡＤ１０、ｐＡＣｔ、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤＧＬ、ｐＧＡＤＧＨ、ｐＡＳ２
−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＧＢＴ８、ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＬｅ
ｘＡ、ｐＢＤ−ＧＡＬ４、ｐＨＩＳｉ、ｐＨＩＳｉ−１、ｐｌａｃＺｉ、ｐＢ４
２ＡＤ、ｐＤＧ２０２、ｐＪＫ２０２、ｐＪＧ４−５、ｐＮＬｅｘＡ、ｐＹＥＳ
Ｔｒｐおよびそれらの改変体および誘導体を含む。
【０１３４】 （ポリメラーゼ） 逆転写酵素活性を有する好ましいポリペプチド（すなわち、ＲＮＡテンプレー
トからのＤＮＡ分子の合成を触媒し得るポリペプチド）としては、モロニーマウ
ス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆
転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、ラウス随伴ウイルス
（ＲＡＶ）逆転写酵素、骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）逆転写酵素、ヒト免
疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、レトロウイルス逆転写酵素、レトロト
ランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎ウイルス逆転写酵素、カリフラワーモザイク
ウイルス逆転写酵素、および細菌逆転写酵素が挙げられるが、これらに限定され
ない。逆転写酵素活性を有するこれらのポリペプチドが特に好ましく、これはま
た、ＲＮＡａｓｅ Ｈ活性（すなわち、「ＲＮＡｓｅ Ｈ」ポリペプチド）が実
質的に低減されている。「ＲＮＡａｓｅ Ｈ活性が実質的に低減されて」いるポ
リペプチドによって、このポリペプチドが、野生型のＲＮＡａｓｅ Ｈ活性また
は野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のようなＲＮａｓｅ Ｈ+酵素の、約２０％未満 、より好ましくは約１５％、約１０％、または約５％未満、最も好ましくは約２
％未満であることが意味される。このＲＮａｓｅ Ｈ活性は、種々のアッセイ（
例えば、米国特許第５，２４４，７９７号、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）およびＧｅｒａｒｄ，
Ｇ．Ｆ．ら、ＦＯＣＵＳ １４（５）：９１（１９９２）に記載されるようなア
ッセイ、これらの全ての開示は、本明細書中に参考として援用される）によって
決定され得る。本発明における使用のために適切なＲＮＡａｓｅ Ｈ-ポリペプ チドとしては、Ｍ−ＭＬＶ Ｈ-逆転写酵素、ＲＳＶＨ-逆転写酵素、ＡＭＶ Ｈ - 逆転写酵素、ＲＡＶ Ｈ-逆転写酵素、ＭＡＶ Ｈ-逆転写酵素、ＨＩＶ Ｈ-逆
転写酵素およびＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴTMＩ逆転写酵素、およびＳＵＰＥＲＳＣ
ＲＩＰＴTMＩＩ逆転写酵素が挙げられるがこれらに限定されず、これらは、例え
ば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍ
ａｒｙｌａｎｄ）から市販されている。
【０１３５】 本発明の方法における使用のために適切な核酸ポリメラーゼ活性を有する他の
ポリペプチドとしては、好熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラー
ゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、クレノウフラグメント、Ｔ７ポリメラーゼ、
およびＴ５ポリメラーゼ、ならびに熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）が挙げられ、
これらの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃ
ｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔ
ａｎａ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍ
ａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌ
ｉｓ（ＴｌｉまたはＶｅｎｔ（登録商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（ＰｆｕまたはＤＥＥＰＶＥＮＴ（登録商標））Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｏｓｉｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリ
メラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）
ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（
Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌ
ｕｍ（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／
Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）ＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ（ＤＹＮＡＺＹＭＥ（登録
商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍ
ｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれら
の変異体、改変体、および誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１３６】 本明細書中に記載される方法および適用に対する他の適切な改変および適合が
容易に明らかであり、そして発明の範囲またはそれらの任意の実施態様から逸脱
することなくなされ得ることは、関連分野の当業者に理解される。ここで、本発
明を詳細に記載しているが、同じことが以下の実施例を参照してより明らかに理
解される。これは、説明の目的のみが本明細書に挙げられ、本発明を限定するこ
とを意図しない。
【０１３７】 （実施例） 本発明の組換えクローニング法は、クローニングベクターの変化のような、あ
るものを使用者にとって有用にさせるための核酸セグメントの交換を達成する。
これらのセグメントは、互いに関して適切な方向にある組換えシグナルによって
両側で隣接されなければならない。以下の実施例において、２つの親の核酸分子
（例えば、プラスミド）を、挿入ドナーおよびベクタードナーと呼ぶ。挿入ドナ
ーは、ベクタードナーによって寄与された新しいベクターに結合されるようにな
るセグメントを含む。両方の開始分子を含む組換え中間体は、コインテグレート
と呼ばれる。第２の組換え事象は、２つの娘分子を産生し、これらは産物（所望
の新しいクローン）および副産物と呼ばれる。
【０１３８】 （緩衝液） 本発明の反応において、種々の公知の緩衝液を使用し得る。制限酵素について
は、製造者によって推奨される緩衝液の使用が望ましい。代替緩衝液が、文献か
ら容易に見出され得るか、または当業者によって案出され得る。
【０１３９】 （実施例１〜３） λインテグラーゼのための１つの例示的な緩衝液には、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５〜７．８）、７０ｍＭ ＫＣｌ、５
ｍＭスペルミジン、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．２５ｍｇ／ｍｌ ウシ血
清アルブミン、ならびに必要に応じて１０％グリセロールが含まれる。
【０１４０】 Ｐ１ Ｃｒｅリコンビナーゼのための１つの好ましい緩衝液には、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、３３ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ スペルミジ
ン、および０．５ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンが含まれる。
【０１４１】 λ ＩｎｔおよびＰ１ Ｃｒｅに類似する他の部位特異的リコンビナーゼのた
めの緩衝液は、当該分野で公知であるか、または特に上記の緩衝液に照らして、
当業者によって経験的に決定され得るかのいずれかである。
【０１４２】 （実施例１：ＣｒｅならびにＣｒｅおよびＩｎｔを用いる組換えクローニン
グ） ２対のプラスミドを、２つの異なる方法においてインビトロ組換えクローニン
グ法を行うために構築した。一方の対であるｐＥＺＣ７０５およびｐＥＺＣ７２
６（図２Ａ）を、Ｃｒｅおよびλインテグラーゼとともに用いられる、ｌｏｘＰ
およびａｔｔ部位を用いて構築した。他方の対であるｐＥＺＣ６０２およびｐＥ
ＺＣ６２９（図３Ａ）は、ＣｒｅのためのｌｏｘＰ（野生型）部位、１塩基（全
３４中）がｌｏｘＰと異なる第２の変異体ｌｏｘ部位（ｌｏｘＰ ５１１）を含
んだ。本発明の組換えクローニングに対する最小の要求は、各プラスミドにおけ
る２つの組換え部位（一般に、ＸおよびＹ、ならびにＸ’およびＹ’）である。
いずれかまたは両方の型の部位が組換えて、コインテグレート（例えば、Ｘおよ
びＸ’）を形成し得る場合、およびいずれかまたは両方が組換えて、コインテグ
レート（例えば、ＹおよびＹ’）から産物または副産物プラスミドを切り出し得
る場合、組換えクローニングが起こる。同一のプラスミド上の組換え部位は、組
換えないことが重要である。本発明の組換えクローニングは、Ｃｒｅのみを用い
て行われ得ることが見出された。
【０１４３】 （Ｃｒｅのみ） ２つのプラスミドを、この概念を示すために構築した（図３Ａを参照のこと）
。ｐＥＺＣ６２９が、ベクタードナープラスミドであった。これは、構成性薬剤
マーカー（クロラムフェニコール耐性）、複製起点、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰ
５１１部位、条件的薬剤マーカー（トランスポゾンＴｎ１０のテトラサイクリン
耐性オペロンのオペレーター／プロモーターによってその発現が制御されるカナ
マイシン耐性）、およびｔｅｔリプレッサータンパク質に対する構成性に発現さ
れる遺伝子ｔｅｔＲを含んでいた。ｐＥＺＣ６２９を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞は、
３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに対して耐性であるが、１００μｇ／ｍ
ｌのカナマイシンに対して感受性であった。ｐＥＺＣ６０２が、挿入ドナープラ
スミドであり、これは、異なる薬剤マーカー（アンピシリン耐性）、複製起点、
ならびにマルチクローニング部位に隣接しているｌｏｘＰおよびｌｏｘＰ ５１
１部位を含んだ。
【０１４４】 本実験は、以下の２つのパートから構成された： パートＩ：各々約７５ｎｇのｐＥＺＣ６０２およびｐＥＺＣ６２９を全容積３
０μｌのＣｒｅ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３３ｍＭ
ＮａＣｌ、５ｍＭ スペルミジン−ＨＣｌ、５００μｇ／ｍｌ ウシ血清アル
ブミン）中で混合した。２つの１０μｌアリコートを、新しいチューブに移した
。１つのチューブに、０．５μｌのＣｒｅタンパク質（約４単位／μｌ；Ａｂｒ
ｅｍｓｋｉおよびＨｏｅｓｓ，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１５０９（
１９８４）に従って、部分精製した）を入れた。両方のチューブを、３７℃で３
０分間インキュベートし、次いで、７０℃で１０分間インキュベートした。各反
応物のアリコートを希釈し、そしてＤＨ５αに形質転換した。発現後、アリコー
トを、３０μｇ／ｍｌ クロラムフェニコール；１００μｇ／ｍｌ アンピシリ
ン＋２００μｇ／ｍｌ メチシリン；または１００μｇ／ｍｌ カナマイシン上
にプレートした。
【０１４５】 結果：表１を参照のこと。Ｃｒｅを含まない反応物は、１．１１×１０6個の アンピシリン耐性コロニー（挿入ドナープラスミドｐＥＺＣ６０２由来）；７．
８×１０5個のクロラムフェニコール耐性コロニー（ベクタードナープラスミド ｐＥＺＣ６２９由来）；および１４０個のカナマイシン耐性コロニー（バックグ
ラウンド）を生じた。Ｃｒｅを添加した反応物は、７．５×１０5個のアンピリ ン耐性コロニー（挿入ドナープラスミドｐＥＺＣ６０２由来）；６．１×１０5 個のクロラムフェニコール耐性コロニー（ベクタードナープラスミドｐＥＺＣ６
２９由来）；および７６０個のカナマイシン耐性コロニー（バックグラウンドコ
ロニーおよび組換えクローニング産物プラスミド由来のコロニーの混合物）を生
じた。分析：Ｃｒｅの存在において、カナマイシンプレート上のコロニーの数が
ずっと多かったので、それらの多数またはほとんどが所望の産物プラスミドを含
むと予測された。
【０１４６】
【表１】 パートＩＩ：「＋Ｃｒｅ」カナマイシンプレート由来の２４コロニーをひろい
、そして１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含む培地中に接種した。ミニプレップ
を行い、そしてミニプレップＤＮＡ（非切断あるいはＳｍａＩまたはＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断）を電気泳動した。結果：２４個のミニプレップ中１９個は、産物プ
ラスミドについて予測されるサイズの超らせん状のプラスミドを示した。１９個
の全ては、予測されるＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを示した
。分析：Ｃｒｅのみのスキームを示した。詳細には、約７０％（２４個中１９個
）の産物コロニーを生じることが決定された。効率は、約０．１％（６．１×１
０5個のクロラムフェニコール耐性コロニーから７６０個のカナマイシン耐性ク ローンが得られた）であった。
【０１４７】 （Ｃｒｅ＋インテグラーゼ） 本方法を示すために使用されるプラスミドは、ベクタードナープラスミドであ
るｐＥＺＣ７２６がｌｏｘＰ ５１１の代わりにａｔｔＰ部位を含んでいたこと
、および挿入ドナープラスミドであるｐＥＺＣ７０５がｌｏｘＰ ５１１の代わ
りにａｔｔＢ部位を含んだことを除き上記で使用されたプラスミドに正確に類似
する（図２Ａ）。
【０１４８】 この実験は、以下の３つのパートから構成された： パートＩ：約５００ｎｇのｐＥＺＣ７０５（挿入ドナープラスミド）を、アン
ピシリン耐性遺伝子内でプラスミドを直鎖化するＳｃａＩを用いて切断した。（
λインテグラーゼ反応は、歴史的に直鎖状態のａｔｔＢプラスミドを用いて行わ
れている（Ｈ．Ｎａｓｈ，私信）ので、これを行った）。しかし、インテグラー
ゼ反応は、超らせん状の両方のプラスミドを用いて良好に進行することが後に見
出された。次いで、直鎖状プラスミドをエタノール沈殿し、そして２０μｌのλ
インテグラーゼ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（約ｐＨ７．８）、７０ｍ
Ｍ ＫＣｌ、５ｍＭ スペルミジン−ＨＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、２５０μ
ｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン）中で溶解した。また、約５００ｎｇのベクター
ドナープラスミドｐＥＺＣ７２６をエタノール沈殿し、そして２０μｌのλイン
テグラーゼ緩衝液中で溶解した。使用の直前に、λインテグラーゼ（２μｌ、３
９３μｇ／ｍｌ）を融解し、そして１８μｌの冷λインテグラーゼ緩衝液を添加
することにより希釈した。１μｌのＩＨＦ（組み込み宿主因子、２．４ｍｇ／ｍ
ｌ、アクセサリータンパク質）を、１５０μｌの冷λインテグラーゼ緩衝液中で
希釈した。各ＤＮＡのアリコート（２μｌ）を、全量１０μｌで、λインテグラ
ーゼ緩衝液（各々１μｌのλインテグラーゼおよびＩＨＦを含むまたは含まない
）と混合した。混合物を、２５℃で４５分間インキュベートし、次いで、７０℃
で１０分間インキュベートした。各反応物の半分をアガロースゲルに供した。結
果：インテグラーゼおよびＩＨＦの存在下で、全ＤＮＡの約５％が、直鎖状のコ
インテグレート形態に転換された。分析：インテグラーゼおよびＩＨＦの活性を
確認した。
【０１４９】 パートＩＩ：３μlの各反応物（すなわち、インテグラーゼおよびＩＨＦを含 むまたは含まない）を、２７μｌのＣｒｅ緩衝液（上記）中で希釈し、次いで、
各反応物を２つの１０μｌアリコートに分割した（全部で４つ）。これらの反応
物の２つに、０．５μｌのＣｒｅタンパク質（上記）を添加し、そして全ての反
応物を３７℃で３０分間、次いで７０℃で１０分間インキュベートした。各反応
物に、ＴＥ緩衝液（９０μｌ；ＴＥ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．
５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、そして各１μｌを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５
αに形質転換した。形質転換混合物を、１００μｇ／ｍｌ アンピシリン＋２０
０μｇ／ｍｌ メチシリン；３０μｇ／ｍｌ クロラムフェニコール；または１
００μｇ／ｍｌ カナマイシン上にプレートした。結果：表２を参照のこと。
【０１５０】
【表２】 分析：Ｃｒｅタンパク質は、形質転換を減少させた。この効果について調節し
た場合、カナマイシン耐性コロニー数は、Ｃｒｅおよびインテグラーゼの両方を
用いた場合、コントロール反応物と比較して、１００倍より多く増加した。これ
は、９９％より高い特異性を示唆する。
【０１５１】 パートＩＩＩ：３８個のコロニーを、インテグラーゼ＋Ｃｒｅプレートからひ
ろい、ミニプレップＤＮＡを作製し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで切断して診断マッ
ピング情報を得た。結果：３８個全てが正確に予測されたフラグメントサイズを
有した。分析：Ｃｒｅ＋λインテグラーゼ法は、Ｃｒｅのみよりずっと高い特異
性を有することが観察された。結論：Ｃｒｅ＋λインテグラーゼ法を示した。効
率および特異性は、Ｃｒｅのみよりもずっと高かった。
【０１５２】 （実施例２：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の真
核生物細胞における発現のためのベクターへのサブクローニングのためのインビ
トロ組換えクローニングの使用（図４Ａ）） ｌｏｘＰ部位が遺伝子の５’末端に位置するようにｌｏｘＰ部位とａｔｔＢ部
位の間でクローニングされ、Ｅ．ｃｏｌｉのクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子を含む、挿入ドナープラスミドであるｐＥＺＣ８４３を構
築した（図４Ｂ）。ｌｏｘＰ部位に隣接するサイトメガロウイルス真核生物プロ
モーターを含む、ベクタードナープラスミドであるｐＥＺＣ１００３を構築した
（図４Ｃ）。１μｌアリコートの各超らせん状のプラスミド（約５０ｎｇの粗製
ミニプレップＤＮＡ）を、等量のλインテグラーゼ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、７０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ スペルミジン、０．５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．２５ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン）およびＣｒｅリコン
ビナーゼ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３３ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、５ｍＭ スペルミジン、０．５ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン）、２単
位のＣｒｅリコンビナーゼ、１６ｎｇの組み込み宿主因子、および３２ｎｇ λ
インテグラーゼを含む１０μｌの反応物中で合わせた。３０℃で３０分間インキ
ュベートした後、７５℃で１０分間インキュベートし、１μｌをコンピテントＥ
．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に
形質転換した。形質転換体のアリコートを、２００μｇ／ｍｌ カナマイシンを
含む寒天プレート上に広げ、そして３７℃で一晩インキュベートした。それ以外
の同一のコントロール反応は、ベクタードナープラスミドのみを含んだ。コント
ロール反応形質転換の１０％を受けたプレートから、１つのコロニーを得た；組
換えクローニング反応の１０％を受けたプレートからは１４４のコロニーを得た
。これらの数は、９９％より多い組換えクローニングコロニーが、所望の産物プ
ラスミドを含んだことを示唆した。６個の組換えクローニングコロニーから作製
したミニプレップＤＮＡから、予測されたサイズのプラスミド（５０２６塩基対
）であるＣＭＶＰｒｏｄを得た。ＮｃｏＩを用いた制限消化から、６個全てのプ
ラスミドについてＣＭＶプロモーターの下流にクローニングしたクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼと予測されるフラグメントを得た。
【０１５３】 （実施例３：終止コドンを有さないａｔｔＢ部位によって隣接されるサブク
ローニングされたＤＮＡセグメント） パートＩ：背景 上記の実施例は、転写が組換え部位を横切る転写融合に適する。しかし、ａｔ
ｔＲ部位およびｌｏｘＰ部位の両方は、両方の鎖に複数の終止コドンを含み、従
って、コード配列が組換え部位を横断しなければならない（１つのリーディング
フレームのみがｌｏｘＰ部位の各鎖上で利用可能である）場合、転写融合は困難
であり得るか、または不可能であり得る（ａｔｔＲまたはａｔｔＬにおいて）。
【０１５４】 サブクローニングのための主要な理由は、タンパク質ドメインを融合すること
である。例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ドメインの目
的のタンパク質への融合は、融合タンパク質がグルタチオンアガロース（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．，１９９５カタログ）に対するアフィニティークロマト
グラフィーによって精製されることを可能にする。目的のタンパク質が連続的な
ヒスチジンの連続（例えば、Ｈｉｓ６）に融合される場合、融合タンパク質は、
金属イオンを含むキレート樹脂（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に対するアフィニテ
ィークロマトグラフィーによって精製され得る。活性、溶解性、安定性などにつ
いてアミノ末端融合体とカルボキシ末端融合体とを比較することがしばしば望ま
れる。
【０１５５】 バクテリオファージλ組み込み系のａｔｔＢ部位を、ｌｏｘＰ部位に対する代
替物として試験した。なぜなら、それらは小さく（２５ｂｐ）、そしていくらか
の配列可撓性を有するからである（Ｎａｓｈ，Ｈ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４０４９−４０５３（１９８７））。全て
の終止コードを取り除く複数の変異により、組換えサブクローニングのための有
用な組換え部位を得ることは以前には示唆されていなかった。
【０１５６】 λバクテリオファージにおける部位特異的組換えのための標準的な表記（Ｗｅ
ｉｓｂｅｒ，Ｌａｍｂｄａ ＩＩＩ，Ｈｅｎｄｒｉｘら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞における組換え反
応に関与するヌクレオチド領域を以下に示す：
【０１５７】
【化１】 ここで：Ｏは、ファージおよびＥ．ｃｏｌｉゲノムの両方に見出される１５ｂｐ
コアＤＮＡ配列を示す；ＢおよびＢ’は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノム中のコアに隣接す
る約５塩基を示す；およびＰ１、Ｈ１、Ｐ２、Ｘ、Ｈ２、Ｃ、Ｃ’、Ｈ’、Ｐ’
１、Ｐ’２、およびＰ’３は、バクテリオファージλゲノム中のタンパク質結合
ドメインをコードする公知のＤＮＡ配列を示す。
【０１５８】 反応は、タンパク質Ｘｉｓ（エキシジョナーゼ）の存在下で可逆的であり；ａ
ｔｔＬとａｔｔＲとの間の組換えは、その組み込まれた状態からλゲノムを正確
に切り出し、ａｔｔＰ、およびａｔｔＢを含む直鎖状Ｅ．ｃｏｌｉゲノムを含む
環状λゲノムを再生する。
【０１５９】 パートＩＩ：変異体ａｔｔ部位を含むプラスミドの構築および試験 変異体ａｔｔＬ部位および変異体ａｔｔＲ部位を構築した。重要なことに、Ｌ
ａｎｄｙら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：９１３（１９８９））は
、ａｔｔＰのＰ１およびＨ１ドメインの欠失が、切り出し反応を容易にし、そし
て組み込み反応を除去し、その結果切り出し反応を不可逆的にさせることを観察
した。従って、変異がａｔｔＲに導入されて、Ｐ１およびＨ１ドメインもまた欠
失されたので、本実施例におけるａｔｔＲ’部位は、Ｐ１領域およびＨ１領域を
欠き、そして取り除かれたＮｄｅＩ部位を有し（塩基２７６３０をＣからＧに改
変した）、そしてバクテリオファージλ座標２７６１９〜２７７３８（ＧｅｎＢ
ａｎｋ ｒｅｌｅａｓｅ ９２．０，ｂｇ：ＬＡＭＣＧ、「バクテリオファージ
λの完全な配列」）に対応する配列を含む。
【０１６０】 野生型ａｔｔＬおよびａｔｔＲ部位の組換えによって産生されるａｔｔＢの配
列は以下のとおりである：
【０１６１】
【化２】 終止コドンを斜体にし、そして下線を引いた。ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、およびａｔ
ｔＰの配列はａｔｔＢ配列に由来し得、そしてバクテリオファージλの境界は、
ａｔｔＬおよびａｔｔＲ内（座標２７６１９〜２７８１８）に含まれたことに留
意のこと。
【０１６２】 変異体ａｔｔＲ１’部位（ａｔｔＲ’）およびａｔｔＬ１部位を組み換えた場
合、配列ａｔｔＢ１が産生された（変異を太字の、大きな文字で表す）：
【０１６３】
【化３】 ４つの終止コドンが消失していることに留意のこと。
【０１６４】 ａｔｔＲ１（ａｔｔＲ’）配列およびａｔｔＬ１配列（太字）にさらなる変異
を導入した場合、ａｔｔＲ２（ａｔｔＲ’）部位およびａｔｔＬ２部位を得た。
ａｔｔＲ２およびａｔｔＬ２の組換えは、ａｔｔＢ２部位を産生した：
【０１６５】
【化４】 上記のａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ’部位の組換え活性を以下のようにアッセ
イした。プラスミドｐＥＺＣ７０５のａｔｔＢ部位（図２Ｂ）を、ａｔｔＬｗｔ
、ａｔｔＬ１、またはａｔｔＬ２と置換した。プラスミドｐＥＺＣ７２６のａｔ
ｔＰ部位（図２Ｃ）を、ａｔｔＲｗｔ、ａｔｔＲ１（Ｐ１およびＨ１領域を欠く
ａｔｔＲ’）、またはａｔｔＲ２（Ｐ１およびＨ１領域を欠くａｔｔＲ’）と置
換した。従って、得られたプラスミドは、Ｃｒｅによって媒介されて、それらの
ｌｏｘＰ部位を介して組換え得、そしてＩｎｔ、Ｘｉｓ、およびＩＨＦによって
媒介されて、それらのａｔｔＲ’部位およびａｔｔＬ部位を介して組換え得る。
プラスミドの対を、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、およびＩＨＦと混合しそして反応
させ、Ｅ．ｃｏｌｉコンピテント細胞に形質転換し、そしてカナマイシンを含有
する寒天上にプレートした。結果を表３に示す：
【０１６６】
【表３】 上記のデータは、野生型ａｔｔ部位およびａｔｔ１部位は低い程度に組換えた
が、ａｔｔ１部位およびａｔｔ２部位は互いに検出可能には組換えないことを示
す。
【０１６７】 パートＩＩＩ：目的のＤＮＡセグメントに隣接する両方のａｔｔＢ部位のコア
領域が終止コドンを含まない場合の、組換えが示された。関与するプラスミドの
物理的な状態が、組換え効率に影響することが見出された。
【０１６８】 適切なａｔｔ部位を、ｐＥＺＣ７０５およびｐＥＺＣ７２６中に移動し、プラ
スミドｐＥＺＣ１４０５（図５Ｇ）（ａｔｔＲ’１およびａｔｔＲ’２）ならび
にｐＥＺＣ１５０２（図５Ｈ）（ａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２）を作製した。本
実験における所望のＤＮＡセグメントは、ｐＥＺＣ１５０２の２つのａｔｔＬ部
位の間にクローニングされたクロラムフェニコール耐性遺伝子のコピーであった
。プラスミドの対を、Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、およびＩＨＦ（ｌｏｘＰ部位が存在しな
かったのでＣｒｅはなし）を用いてインビトロで組換えた。１００ｎｇの各プラ
スミドを、１０μｌの、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（約ｐＨ７．８）、１６．
５ｍＭ ＮａＣｌ、３５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ スペルミジン、０．２５ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．３７５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、３％グリセロールの反応物（これは
、８．１ｎｇのＩＨＦ、４３ｎｇのＩｎｔ、４．３ｎｇのＸｉｓ、および２単位
のＣｒｅを含む）中でインキュベートした。反応物を、２５℃で４５分間、６５
℃で１０分間でインキュベートし、そして１μｌのアリコートを、ＤＨ５α細胞
に形質転換し、そしてカナマイシンプレートに広げた。表４に示すように、親プ
ラスミドの両方が環状である場合、または一方のプラスミドが環状でありかつ他
方が直鎖状の場合に、所望のカナマイシン耐性コロニーの収率を決定した：
【０１６９】
【表４】 分析：変異体ａｔｔＲ部位および変異体ａｔｔＬ部位を用いる組換えクローニ
ングを確認した。所望のＤＮＡセグメントは、いずれの鎖においても終止コドン
を全く含まないａｔｔＢ部位の間にサブクローニングされる。両方の関与する分
子が超らせん状であり、そしてタンパク質が制限されている場合、切り出し反応
がより効率的であった初期の観察のために、（一方の親が直鎖状の場合の）産物
ＤＮＡの増大した収率は、予測外であった（Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙら、Ｃｅｌｌ
５０：７７９−７８８（１９８７））。
【０１７０】 （実施例４：逆方向反復を有さない組換えクローニングの実証） パートＩ：原理 上記実施例３は、適切な組換え部位の逆方向反復を含むプラスミド（例えば、
プラスミドｐＥＺＣ１５０２中のａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２）（図５Ｈ）が、
組換えて、これも逆方向で終止コドンを有さないａｔｔＢ部位によって隣接され
る所望のＤＮＡセグメントが得られ得ることを示した。逆方向反復のインビボお
よびインビトロでの影響が危惧された。例えば、逆方向でａｔｔＢ部位によって
隣接される所望のＤＮＡセグメントの転写は、ヘアピン構造を形成し得る一本鎖
ＲＮＡ分子を生じ、その結果、翻訳を阻害し得る。
【０１７１】 類似の組換え部位の逆方向を、部位を直列反復配置のａｔｔ部位に配置するこ
とにより回避し得る。親プラスミドの各々が野生型ａｔｔＬ部位および野生型ａ
ｔｔＲ部位を直列反復で有する場合、Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、およびＩＨＦタンパク質
は、分子内反応においてそれらの部位によって隣接されるＤＮＡセグメントを単
に取り除く。しかし、上記の実施例３に記載の変異体部位は、分子内組換えを所
望のように進行させながら、分子内反応を阻害することが可能であり得ることを
示唆した。
【０１７２】 パートＩＩ：組換えクローニングのための逆方向反復を有さないプラスミドの
構造 プラスミドｐＥＺＣ１４０５（図５Ｇ）中のａｔｔＲ２配列を、反対方向での
ａｔｔＬ２と置換し、ｐＥＺＣ１６０３（図６Ａ）を作製した。ｐＥＺＣ１５０
２（図５Ｈ）のａｔｔＬ２配列を、反対方向でのａｔｔＲ２と置換し、ｐＥＺＣ
１７０６（図６Ｂ）を作製した。これらのプラスミドの各々は、ａｔｔ１コアと
ａｔｔ２コアの間の分子内反応を非常に非効率的にするコア領域中の変異を含ん
だ（実施例３、上記を参照のこと）。
【０１７３】 プラスミドｐＥＺＣ１４０５、ｐＥＺＣ１５０２、ｐＥＺＣ１６０３およびｐ
ＥＺＣ１７０６を、Ｑｉａｇｅｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）で精製した
。プラスミドｐＥＺＣ１４０５およびｐＥＺＣ１６０３のアリコートを、Ｘｂａ
Ｉを用いて直鎖化した。プラスミドｐＥＺＣ１５０２およびｐＥＺＣ１７０６の
アリコートを、ＡｌｗＮＩを用いて直鎖化した。１００ｎｇのプラスミドを、Ｉ
ｎｔ（４３．５ｎｇ）、Ｘｉｓ（４．３ｎｇ）、およびＩＨＦ（８．１ｎｇ）を
含む最終容量１０μｌの緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（約ｐＨ７．８）
、１６．５ｍＭ ＮａＣｌ、３５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ スペルミジン、０．２
５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３７５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、３％グリセロール）中で混
合した。反応物を２５℃で４５分間、６５℃で１０分間インキュベートし、そし
て１μｌをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。発現後、アリコートを、２
００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する寒天プレート上に広げ、そして３７℃
でインキュベートした。
【０１７４】 コロニー数／１μｌの組換え反応物として表した結果を表５に示す：
【０１７５】
【表５】 分析：全ての構造において（すなわち、環状または直鎖状）、ｐＥＺＣ１４０
５×ｐＥＺＣ１５０２対（逆方向反復配置でのａｔｔ部位を有する）は、ｐＥＺ
Ｃ１６０３×ｐＥＺＣ１７０６対（ヘアピン形成を回避するために変異されたａ
ｔｔ部位を有する）よりもより効率的であった。ｐＥＺＣ１６０３×ｐＥＺＣ１
７０６対は、ｐＥＺＣ１４０５×ｐＥＺＣ１５０２対より高いバックグラウンド
およびより低い効率を与えた。あまり効率的ではないが、ｐＥＺＣ１６０３×ｐ
ＥＺＣ１７０６反応由来の８０％以上のコロニーが、所望のプラスミド産物を含
むと予測された。１つのパートナーを直鎖状にすることが、全ての場合において
反応を刺激した。
【０１７６】 （パートＩＩＩ：産物プラスミド構造の確認） 直鎖状ｐＥＺＣ１４０５（図５Ｇ）×環状ｐＥＺＣ１５０２（図５Ｈ）、環状
ｐＥＺＣ１４０５×直鎖状ｐＥＺＣ１５０２、直鎖状ｐＥＺＣ１６０３（図６Ａ
）×環状ｐＥＺＣ１７０６（図６Ｂ）、および環状ｐＥＺＣ１６０３×直鎖状ｐ
ＥＺＣ１７０６反応物由来の各々６個のコロニーを富化培地に接種し、そしてミ
ニプレップＤＮＡを調製した。ＳｓｐＩでの診断的切断により、２４個すべての
コロニーについて予想された制限フラグメントを得た。
【０１７７】 分析：同一の分子上の変異体ａｔｔＬ部位および変異体ａｔｔＲ部位を有する
プラスミド間の組換え反応により、高い程度の特異性を有する、所望のプラスミ
ド産物を得た。
【０１７８】 （実施例５：毒性遺伝子を用いる組換えクローニング） （パートＩ：背景） 制限酵素ＤｐｎＩは、配列ＧＡＴＣを認識し、そしてＡがｄａｍメチラーゼに
よってメチル化された場合のみ、この配列を切断する。大部分の一般的に使用さ
れるＥ．ｃｏｌｉ株は、ｄａｍ+である。細胞の染色体が多数の断片に切断され るので、Ｅ．ｃｏｌｉのｄａｍ+株におけるＤｐｎＩの発現は致死性である。し かし、ｄａｍ-細胞において、ＤｐｎＩの発現は無害である。なぜなら染色体は 、ＤｐｎＩ切断に対して免疫性であるからである。
【０１７９】 ベクタードナーが、組換え部位によって分離される２つのセグメントＣおよび
Ｄを含む一般的な組換えクローニングスキームにおいて、所望の産物の選択は、
セグメントＤの存在およびセグメントＣの非存在についての選択に依存する。元
の実施例において、セグメントＤは、セグメントＣ上に見出されるリプレッサー
遺伝子によってネガティブに制御される薬剤耐性遺伝子（Ｋｍ）を含んだ。Ｃが
存在する場合、Ｄを含む細胞は、耐性遺伝子がオフになっていたのでカナマイシ
ンに対して耐性ではなかった。
【０１８０】 ＤｐｎＩ遺伝子は、上記実施態様のリプレッサー遺伝子を置換し得る毒性遺伝
子の例である。セグメントＣがＤｐｎＩ遺伝子産物を発現するする場合、ｄａｍ + 宿主へのプラスミドＣＤの形質転換は細胞を死滅させる。セグメントＤを、例 えば組換えクローニングによって新しいプラスミドに移入する場合、毒性遺伝子
がもはや存在しないので、次いで薬剤マーカーについての選択は成功する。
【０１８１】 （パートＩＩ：毒性遺伝子としてＤｐｎ Ｉを用いるベクタードナーの構築） ＤｐｎＩエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を、プライマー５’ＣＣＡ
ＣＣＡ ＣＡＡ ＡＣＧ ＣＧＴ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＡＴ ＴＡＣ ＡＣＴ
ＴＴＡ ＡＴＴ ＴＡＧ３’（配列番号１７）および５’ＣＣＡ ＣＣＡ ＣＡ
Ａ ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＣＡ ＴＧＣ ＣＧＡ ＣＡＧ ＣＣＴ ＴＣＣ ＡＡ
Ａ ＴＧＴ３’（配列番号１８）ならびに鋳型としてＤｐｎ Ｉ遺伝子を含むプ
ラスミド（Ｓａｎｆｏｒｄ Ａ．Ｌａｃｋｓ， Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｐｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋから入手し
たプラスミド由来であり；またＡＴＣＣ ６７４９４としてアメリカンタイプカ
ルチャーコレクションから入手可能である）を用いるＰＣＲによって増幅した。
【０１８２】 さらなる変異を、所望の塩基変化を含むプライマーを用いる既存のａｔｔＬド
メインおよびａｔｔＲ’ドメインを増幅することによって、それぞれ、ａｔｔＬ
およびａｔｔＲ’のＢ領域およびＢ’領域に導入した。変異体ａｔｔＬ３（オリ
ゴＸｉｓ１１５を用いて作製された）およびａｔｔＲ’３（オリゴＸｉｓ１１２
を用いて作製されたａＴＴＲ’）の組換えにより、以下の配列（太字がａｔｔＢ
１と異なる）を有するａｔｔＢ３を得た： Ｂ Ｏ Ｂ’ ＡＣＣＣＡ ＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡ ＧＴＧＧＴ（配列番号８） ＴＧＧＧＴ ＣＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＴＴ ＣＡＣＣＡ（配列番号４７） 既存の遺伝子ドナープラスミドのａｔｔＬ２の代わりにａｔｔＬ３配列をクロー
ン化し、プラスミドｐＥＺＣ２９０１を得た（図７Ａ）。既存のベクタードナー
プラスミドのａｔｔＲ’２の代わりにａｔｔＲ’３配列をクローン化し、プラス
ミドｐＥＺＣ２９１３を得た（図７Ｂ）。ＤｐｎＩ遺伝子をプラスミドｐＥＺＣ
２９１３にクローン化して、ｔｅｔリプレッサー遺伝子を置換した。得られたベ
クタードナープラスミドをｐＥＺＣ３１０１と名付けた（図７Ｃ）。ｐＥＺＣ３
１０１をｄａｍ-ＳＣＳ１１０株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した場合 、数百のコロニーを得た。同じプラスミドをｄａｍ+ＤＨ５α株に形質導入した 場合、たとえＤＨ５α細胞がＳＣＳ１１０細胞より約２０倍コンピテントであっ
ても、ほんの１コロニーを生じただけであった。ＤｐｎＩ遺伝子を含まない関連
するプラスミドを同じの２つの細胞株に形質転換した場合、ＤＨ５α細胞から４
４８のコロニーが得られたが、ＳＣＳ１１０細胞からは２８個のコロニーが生じ
た。これは、ＤｐｎＩ遺伝子がプラスミドｐＥＺＣ３１０１（図７Ｃ）上で発現
され、そしてｄａｍ+ＤＨ５α細胞を死滅させるが、ｄａｍ-ＳＣＳ１１０細胞を
死滅させないという証拠である。
【０１８３】 （パートＩＩＩ：ＤｐｎＩ選択を用いる組換えクローニングの実証） プラスミド対を使用し、毒性遺伝子ＤｐｎＩに依存する産物についての選択を
用いる組換えクローニングを示した。プラスミドｐＥＺＣ３１０１（図７Ｃ）を
、ＭｌｕＩを用いて直鎖状にし、そして環状プラスミドｐＥＺＣ２９０１（図７
Ａ）と反応させた。リプレッサー遺伝子による薬剤耐性の制御に基づく選択を用
いるプラスミドの第２の対を、コントロールとして使用した：プラスミドｐＥＺ
Ｃ１８０２（図７Ｄ）を、ＸｂａＩを用いて直鎖状にし、そして環状プラスミド
ｐＥＺＣ１５０２（図５Ｈ）と反応させた。緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ ｐＨ 約７．８、１６．５ｍＭ ＮａＣｌ、３５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ス
ペルミジン、０．３７５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、２．５
％ グリセロール）ならびにタンパク質Ｘｉｓ（２．９ｎｇ）、Ｉｎｔ（２９ｎ
ｇ）、およびＩＨＦ（５．４ｎｇ）を含む８マイクロリットルの反応物を、２５
℃で４５分間、次いで７５℃で１０分間インキュベートし、そして１μｌのアリ
コートを、表６に示すようにＤＨ５α（すなわち、ｄａｍ+）コンピテント細胞 に形質転換した。
【０１８４】
【表６】 ミニプレップＤＮＡを、反応＃２由来の４つのコロニーから調製し、そして制
限酵素Ｓｓｐ Ｉを用いて切断した。全てから予想されるフラグメントを得た。
【０１８５】 分析：毒性遺伝子を用いる選択を用いるサブクローニングを示した。予想され
る構造のプラスミドを産生した。
【０１８６】 （実施例６：融合タンパク質作製のための、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを
用いる遺伝子のクローニングおよび組換えクローニングを用いる遺伝子のサブク
ローニング） （パートＩ：既存の発現ベクターの組換えクローニングのためのベクタードナ
ーへの変換） 既存のベクターの機能的ベクタードナーへの変換に有用なカセットを、以下の
ように作製した。プラスミドｐＥＺＣ３１０１（図７Ｃ）を、ＡｐａＩおよびＫ
ｐｎＩを用いて消化し、末端を平滑にするためにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼおよ
びｄＮＴＰで処理し、所望でないＤＮＡフラグメントを小さくするためにＳｍａ
Ｉ、ＨｐａＩ、およびＡｌｗＮＩを用いてさらに消化し、そしてａｔｔＲ’Ｉ−
ＣｍR−ＤｐｎＩ−ａｔｔＲ’−３ドメインを含む２．６ｋｂカセットをゲル精 製した。精製されたカセットの濃度を、約７５ｎｇＤＮＡ／μｌであると評価し
た。
【０１８７】 プラスミドｐＧＥＸ−２ＴＫ（図８Ａ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は、タンパク
質グルタチオンＳトランスフェラーゼと、そのマルチクローニング部位にインフ
レームで挿入され得る任意の第２のコード配列との間の融合を可能にする。ｐＧ
ＥＸ−２ＴＫ ＤＮＡを、ＳｍａＩを用いて消化し、そしてアルカリホスファタ
ーゼで処理した。約７５ｎｇの上記の精製ＤＮＡカセットを、約１００ｎｇのｐ
ＧＥＸ−２ＴＫベクターと５μｌ連結物中で２．５時間連結し、次いで、１μｌ
をコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＢＲＬ３０５６細胞（ＤＨ１０Ｂのｄａｍ-誘導 体；市販のｄａｍ-株は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，由 来のＤＭ１およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ由来のＳＣＳ１１０を含む）に形質転換
した。形質転換混合物のアリコートを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（耐性遺
伝子は、ｐＧＥＸ−２ＴＫ上に存在する）および３０μｇ／ｍｌクロラムフェニ
コール（耐性遺伝子は、ＤＮＡカセット上に存在する）を含有するＬＢ寒天上に
プレートした。コロニーをひろい、そしてミニプレップＤＮＡを作製した。ｐＧ
ＥＸ−２ＴＫ中のカセットの方向を、ＥｃｏＲ Ｉを用いる診断的切断によって
決定した。所望の方向を有するプラスミドを、ｐＥＺＣ３５０１（図８Ｂ）と名
付けた。
【０１８８】 （パートＩＩ：３つのリーディングフレームでのレポーター遺伝子の組換えク
ローニング遺伝子ドナープラスミドへのクローニング） ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）クローニングは、クローニングベク
ターへＰＣＲ増幅産物をクローニングするための方法である（米国特許第５，３
３４，５１５号、本明細書中でその全体が参考として援用される）。簡単に述べ
れば、所望のＤＮＡセグメントのＰＣＲ増幅を、それらの５’末端にチミジン塩
基の代わりにウラシル塩基を含むプライマーを用いて実施する。このようなＰＣ
Ｒ産物を酵素ＵＤＧと共にインキュベートする場合、ウラシル塩基は特異的に取
り除かれる。これらの塩基の欠損は、ＰＣＲ産物ＤＮＡの末端における塩基対合
を弱め、そして適切な温度（例えば、３７℃）でインキュベートした場合、この
ような産物の末端は、主として一本鎖化される。ＰＣＲ産物の３’末端に相補的
である突出した３’テールを含む直鎖状クローニングベクターの存在下でこのよ
うなインキュベーションを行った場合、塩基対合は、効率的にクローニングベク
ターにＰＣＲ産物をアニーリングする。アニーリングされた産物を、形質転換に
よってＥ．ｃｏｌｉ細胞に導入した場合、インビボプロセスは、効率的にそれを
組換えプラスミドに変換する。
【０１８９】 ３つ全てのリーディングフレームでの任意のＰＣＲ産物のクローニングを可能
にするＵＤＧクローニングベクターをｐＥＺＣ３２０１（図８Ｋ）から以下のよ
うに調製した。８つのオリゴヌクレオチドが、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ，Ｉｎｃ．から得られた（全て５’→３’で記載される：ｒｆ１ 上部（Ｇ
ＧＣＣ ＧＡＴ ＴＡＣ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＣＡ ＡＣＧ ＡＣＣ ＧＡＡ
ＡＡＣ ＣＴＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＡＧ ＧＧＴ）（配列番号１９）、ｒｆ１
下部（ＣＡＧ ＧＴＴ ＴＴＣ ＧＧＴ ＣＧＴ ＴＧＧ ＧＡＴ ＡＴＣ
ＧＴＡ ＡＴＣ）（配列番号２０）、ｒｆ２ 上部（ＧＧＣＣＡ ＧＡＴ ＴＡ
Ｃ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＣＡ ＡＣＧ ＡＣＣ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＴＧ ＴＡ
Ｔ ＴＴＴ ＣＡＧ ＧＧＴ）（配列番号２１）、ｒｆ２ 下部（ＣＡＧ ＧＴ
Ｔ ＴＴＣ ＧＧＴ ＣＧＴ ＴＧＧ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＴＡ ＡＴＣＴ）（
配列番号２２）、ｒｆ３ 上部（ＧＧＣＣＡＡ ＧＡＴ ＴＡＣ ＧＡＴ ＡＴ
Ｃ ＣＣＡ ＡＣＧ ＡＣＣ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＴＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＡ
Ｇ ＧＧＴ）（配列番号２３）、ｒｆ３ 下部（ＣＡＧ ＧＴＴ ＴＴＣ ＧＧ
Ｔ ＣＧＴ ＴＧＧ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＴＡ ＡＴＣ ＴＴ）（配列番号２４
）、カルボキシ上部（ＡＣＣ ＧＴＴ ＴＡＣ ＧＴＧ ＧＡＣ）（配列番号２
５）、およびカルボキシ下部（ＴＣＧＡ ＧＴＣ ＣＡＣ ＧＴＡ ＡＡＣ Ｇ
ＧＴ ＴＣＣ ＣＡＣ ＴＴＡ ＴＴＡ）（配列番号２６））。ｒｆ１、２およ
び３上部鎖ならびにカルボキシ下部鎖を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い
てその５’末端上でリン酸化し、次いで各対の相補的な鎖をハイブリダイズした
。プラスミドｐＥＺＣ３２０１（図８Ｋ）をＮｏｔ ＩおよびＳａｌ Ｉを用い
て切断し、そして切断プラスミドのアリコートをカルボキシ−オリゴ二重鎖（Ｓ
ａｌ Ｉ末端）およびｒｆ１、ｒｆ２、またはｒｆ３二重鎖のいずれか（Ｎｏｔ
Ｉ末端）と混合した（２５０ｐｍｏｌカルボキシオリゴ二重鎖と１０μｇ（約
５ｐｍｏｌ）切断プラスミドとを混合し、３つの２０μｌ容積に分割し、ｒｆ１
、ｒｆ２、またはｒｆ３二重鎖の５μｌ（２５０ｐｍｏｌ）および２μｌ＝２単
位Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを各反応物に添加した）。室温での９０分の連結後、各
反応物を調製用アガロースゲルに供し、そして２．１ｋｂのベクターバンドを溶
出し、そして５０μｌのＴＥに溶解した。
【０１９０】 （パートＩＩＩ：ＣＡＴおよびｐｈｏＡ遺伝子のＰＣＲ） プラスミドｐＡＣＹＣ１８４由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉ由来のアルカリホスファターゼ遺
伝子であるｐｈｏＡを増幅するために、プライマーをＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から得た。プライマーは、ウラシル塩基を含む１２塩基５
’伸長を有し、その結果ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）でのＰＣＲ産
物の処理は、ＤＮＡの各末端での塩基対合を弱め、そして３’鎖が上記のｒｆ１
、ｒｆ２、およびｒｆ３ベクターの突出する３’末端とのアニーリングを可能に
する。プライマーの配列（全て５’→３’で記載）は以下のとおりであった：Ｃ
ＡＴ左、ＵＡＵ ＵＵＵ ＣＡＧ ＧＧＵ ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＡＡ ＡＡＡ
ＡＴＣ ＡＣＴ ＧＧＡ ＴＡＴ ＡＣＣ（配列番号２７）；ＣＡＴ右、ＵＣＣ
ＣＡＣ ＵＵＡ ＵＵＡ ＣＧＣ ＣＣＣ ＧＣＣ ＣＴＧ ＣＣＡ ＣＴＣ
ＡＴＣ（配列番号２８）；ｐｈｏＡ左、ＵＡＵ ＵＵＵ ＣＡＧ ＧＧＵ Ａ
ＴＧ ＣＣＴ ＧＴＴ ＣＴＧ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＧＧ（配列番号２９）；お
よびｐｈｏＡ右、ＵＣＣ ＣＡＣ ＵＵＡ ＵＵＡ ＴＴＴ ＣＡＧ ＣＣＣ
ＣＡＧ ＧＧＣ ＧＧＣ ＴＴＴ Ｃ（配列番号３０）。次いで、プライマーを
公知の方法工程（例えば、米国特許第５，３３４，５１５号（これは本明細書中
にその全体が参考として援用される）を参照のこと）を用いるＰＣＲ反応のため
に使用し、そしてこれらのプライマーを用いて得られたポリメラーゼ連鎖反応増
幅産物は、開始ＡＴＧを有するがいかなる転写シグナルも有さないＣＡＴまたは
ｐｈｏＡ遺伝子を含んだ。さらに、アミノ末端上のウラシル含有配列は、ＴＥＶ
プロテアーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の切断部位を
コードし、そしてカルボキシ末端上のウラシル含有配列は、連続的なＴＡＡナン
センスコドンをコードした。
【０１９１】 非精製ＰＣＲ産物（約３０ｎｇ）を、１×ＲＥａｃｔ４緩衝液（ＬＴＩ）およ
び１単位のＵＤＧ（ＬＴＩ）を含む１０μｌの反応物中で、ゲル精製された、直
鎖状ｒｆ１、ｒｆ２、またはｒｆ３クローニングベクター（約５０ｎｇ）と混合
した。３７℃での３０分後、各反応の１μｌアリコートを、コンピテントＥ．ｃ
ｏｌｉ ＤＨ５α細胞（ＬＴＩ）に形質転換し、そして５０μｇ／ｍｌのカナマ
イシンを含有する寒天上にプレートした。コロニーをひろい、そしてミニプレッ
プＤＮＡの分析は、ＣＡＴ遺伝子が、リーディングフレーム１（ｐＥＺＣ３６０
１）（図８Ｃ）、リーディングフレーム２（ｐＥＺＣ３６０９）（図８Ｄ）、お
よびリーディングフレーム３（ｐＥＺＣ３６１７）（図８Ｅ）でクローン化され
、そしてｐｈｏＡ遺伝子が、リーディングフレーム１（ｐＥＺＣ３６０６）（図
８Ｆ）、リーディングフレーム２（ｐＥＺＣ３６１３）（図８Ｇ）、およびリー
ディングフレーム３（ｐＥＺＣ３６２１）（図８Ｈ）でクローン化されたことを
示した。
【０１９２】 （パートＩＶ：ＣＡＴまたはｐｈｏＡのＵＤＧクローニングベクターからＧＳ
Ｔ融合ベクターへのサブクローニング） ３つ全てのリーディングフレームでのＧＳＴとＣＡＴまたはｐｈｏＡのいずれ
かとの間の融合物をコードするプラスミドを、以下の組換えクローニングによっ
て構築した。ＧＳＴベクタードナーｐＥＺＣ３５０１（図８Ｂ）（上記のＰｈａ
ｒｍａｃｉａプラスミドｐＧＥＸ−２ＴＫ由来）のミニプレップＤＮＡを、Ｃｌ
ａ Ｉを用いて直鎖状にした。約５ｎｇのベクタードナーを、緩衝液および組換
えタンパク質Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、およびＩＨＦ（実施例５）を含む８μｌの反応物
中、ＣＡＴまたはｐｈｏＡを含む各約１０ｎｇの適切な環状遺伝子ドナーベクタ
ーと混合した。インキュベーション後、１μｌの各反応物を、Ｅ． ｃｏｌｉＤ
Ｈ５α株に形質転換し、そして表７に示すようにアンピシリン上にプレートした
。
【０１９３】
【表７】 （パートＶ：融合タンパク質の発現） 各形質転換由来の２つのコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有
する１７×１００ｍｍのプラスチックチューブ（Ｆａｌｃｏｎ ２０５９，Ｂｅ
ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中の２ｍｌのリッチ培地（ＣｉｒｃｌｅＧｒｏ
ｗ， Ｂｉｏ１０１ Ｉｎｃ．）中にひろい、そして３７℃で約４時間強く振盪
し、その時培養物は視覚的に濁っていた。１ｍｌの各培養物を、ＧＳＴの発現を
誘導するために１０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＩＰＴＧを含む新しいチューブに移
した。さらなる２時間のインキュベーション後、全ての培養物は、ほぼ同じ濁度
を有した；１つの培養物のＡ６００は、１．５であった。０．３５ｍｌの各培養
物由来の細胞を回収し、そしてサンプル緩衝液（ＳＤＳおよびβ−メルカプトエ
タノールを含む）で処理し、そして細胞の約０．１５のＡ６００単位に等価なア
リコートを、Ｎｏｖｅｘ ４〜２０％勾配ポリアクリルアミドゲルに供した。電
気泳動後、ゲルをクーマシーブルーを用いて染色した。
【０１９４】 結果：単一のタンパク質のバンドの増大した発現は、１２の培養物の全てで見
出された。これらのタンパク質の観察されたサイズは、３つのリーディングフレ
ームでＣＡＴ（図８Ｉ）またはｐｈｏＡ（図８Ｊ）に（終止コドンを含まないａ
ｔｔＢ組換え部位を介して）融合されたＧＳＴの予想したサイズと良く相関した
：ＣＡＴ ｒｆ１＝２６９アミノ酸；ＣＡＴ ｒｆ２＝３０３アミノ酸；ＣＡＴ
ｒｆ３＝４７８アミノ酸；ｐｈｏＡ ｒｆ１＝２８２アミノ酸；ｐｈｏＡ ｒ
ｆ２＝２８０アミノ酸；およびｐｈｏＡ ｒｆ３＝７０５アミノ酸。
【０１９５】 分析：ＣＡＴおよびｐｈｏＡ遺伝子の両方を、３つ全てのリーディングフレー
ムでＧＳＴ融合ベクターにサブクローン化し、そして６つの融合タンパク質の発
現を示した。
【０１９６】 （実施例７：逆組換えおよび組換えによるサブクローニング） ２つのプラスミドを、本発明に従う逆組換えを実証するために構築した。ａｔ
ｔＢ組換え部位を含み、そしてａｔｔＢ親プラスミド（このベクターは、産物Ｄ
ＮＡに相当し得る）と称するベクターｐＥＺＣ５６０１（図１０Ａ）は、上記の
ように、さらにアンピシリン耐性遺伝子、複製起点、ａｔｔＢ２部位、テトラサ
イクリン耐性遺伝子、およびａｔｔＢ０部位を含んだ。ａｔｔＰ組換え部位を含
み、ａｔｔＰ親プラスミド（このベクターは、副産物ＤＮＡに相当し得るか、ま
たは異なるベクタードナーＤＮＡに相当し得る）と称するプラスミドｐＥＺＣ６
７０１（図１０Ｂ）もまた、カナマイシン耐性遺伝子、複製起点、ａｔｔＰ２部
位、毒性タンパク質ｃｃｄＢをコードする遺伝子、およびａｔｔＰ０部位を含ん
だ。１０×インテグラーゼ緩衝液には、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ
７．５、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ ８．０、０．７Ｍ 塩化カリウ
ム、５０ｍＭ 塩酸スペルミジン、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および２．５ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡが含まれた。ａｔｔＰ０およびａｔｔＰ２がＰ１ドメインおよびＨ１ド
メインを含んでいたことに注目のこと。インテグラーゼ（４３５ｎｇ／μｌを１
．５μｌ）およびＩＨＦ（１×インテグラーゼ緩衝液中１６ｎｇ／μｌを１．５
μｌ）を１３．５μｌの１×Ｉｎｔ緩衝液と混合してリコンビナーゼ混合液を作
製した。
【０１９７】 ２つの８μｌ反応液を集めた。反応Ａには、３００ｎｇのｐＥＺＣ６７０１プ
ラスミドおよび１×インテグラーゼ緩衝液中の２μｌのリコンビナーゼ混合液が
含まれた。反応Ｂには、３００ｎｇのｐＥＺＣ５６０１、３００ｎｇのｐＥＺＣ
６７０１、および１×インテグラーゼ緩衝液中の２μｌのリコンビナーゼ混合液
が含まれた。両方の反応を、２５℃で４５分間、次いで７０℃で５分間インキュ
ベートし、次いで冷却した。ＴＥ緩衝液（７９２μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を各々の反応に添加し、そして１μｌ
のこの希釈反応液をＤＨ５α ＵｌｔｒａＭａｘコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ
）に形質転換した。非選択培地中での１時間の発現の後、各々の形質転換体の１
０分の１（１００μｌ）を、１００μｇ／ｍｌ カナマイシンを含む寒天プレー
ト上に広げた。
【０１９８】 ３７℃における一晩のインキュベーション後、反応Ａからのプレートは１つの
コロニーを含んだが、一方反応Ｂからのプレートは３９２コロニーを含んだ。１
２のコロニーを反応Ｂプレートからひろい上げて、富化液体培地に移し、そして
一晩増殖させた。これらの培養物から調製したミニプレップＤＮＡを、アガロー
スゲル上で切断せずに泳動し、そして１２のコロニーすべてが約３．８ｋｂのプ
ラスミドを含んだ。ミニプレップＤＮＡのうちの６個を制限酵素ＣｌａＩで切断
し、そしてこれもまたＣｌａＩで切断したｐＥＺＣ６７０１（カナマイシン耐性
の親のプラスミド）とともに泳動した。プラスミドｐＥＺＣ６７０１を１回Ｃｌ
ａＩで切断して、約３．８ｋｂのフラグメントを得た。６個のミニプレップＤＮ
Ａを２回ＣｌａＩで切断して、約９００塩基対および約２９００塩基対のフラグ
メントを得た。
【０１９９】 分析：ｐＥＺＣ６７０１上のａｔｔＰ部位とｐＥＺＣ５６０１上のａｔｔＢ部
位との間の組換えは、アンピシリン耐性遺伝子およびｃｃｄＢ遺伝子を含む、２
つの娘のプラスミド、ａｔｔＬ産物プラスミドの産生を生じる（図１０Ｃ）（こ
れは、ベクタードナーＤＮＡまたは新しい副産物ＤＮＡに一致し得る）。そして
カナマイシンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含むａｔｔＲ産物プラスミド
の産生を生じる（図１０Ｄ）（これは、挿入ドナーＤＮＡまたは新しい産物ＤＮ
Ａに一致し得る）。ａｔｔＬ産物プラスミド、ａｔｔＰ親プラスミドｐＥＺＣ６
７０１、または組換え中間体を受容するコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞を、毒
性のｃｃｄＢ遺伝子産物によって殺傷した。ａｔｔＢ親プラスミドｐＥＺＣ５６
０１を受容するコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞を、カナマイシン選択によって
殺傷した。カナマイシンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含む、所望のａｔ
ｔＲ産物プラスミドを受容するコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞のみが、コロニ
ーを形成するために生存した。選択ストラテジーの成功は、片方の親のプラスミ
ドのみを含む反応に比較して、両方の親のプラスミドを含む反応からの多数のコ
ロニーによって、示される。その反応機構は、その所望の産物プラスミドが２つ
のＣｌａＩ制限部位を含み、１つはｐＥＺＣ６７０１ ａｔｔＰ親プラスミド由
来のカナマイシン耐性遺伝子中にあり、そしてもう一方はｐＥＺＣ５６０１ ａ
ｔｔＢ親プラスミド由来のテトラサイクリン耐性遺伝子中にあることを予測した
。２つの部位の存在、およびＣｌａＩ消化から生じるフラグメントのサイズによ
って反応機構を確認した。
【０２００】 従って、本発明は図１に示される組換え反応の逆転に関し、ここでは産物ＤＮ
Ａおよび副産物ＤＮＡを合わせて、挿入ドナーＤＮＡおよびベクタードナーＤＮ
Ａを産生し得る。さらに、本発明は、サブクローニング組換えを提供し、ここで
は産物ＤＮＡ（図１に従って産生される）を新しいベクタードナーＤＮＡと合わ
せて、新規な産物ＤＮＡ（異なるベクターバックグラウンド中で）および新規な
副産物を産生し得る。
【０２０１】 （実施例８：線状化したフラグメントのサブクローニング） プラスミドｐＥＺＣ７１０２（図１１Ａ）、ａａｔＰ親プラスミド（これはベ
クタードナーＤＮＡに対応し得る）は、セグメントａｔｔＰ１、複製起点、カナ
マイシン耐性、ａｔｔＰ３、クロラムフェニコール耐性、および毒性遺伝子ｃｃ
ｄＢを含み、そして本明細書中で記載される実験においてはスーパーコイル型で
あった。プラスミドｐＥＺＣ７５０１（図１１Ｂ）、ａｔｔＢ親プラスミド（こ
れは挿入ドナーＤＮＡまたは産物ＤＮＡに対応し得る）は、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ
２．０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の機能的ドメインを
含むベクター中のａｔｔＢ１とａｔｔＢ３部位との間にクローニングされたＧＦ
Ｐ遺伝子を含んだ。このａｔｔＰ部位は、Ｐ１およびＨ１ドメインを含んだ。プ
ラスミドｐＥＺＣ７５０１を切断せずに使用するか、またはＳｃａＩでアンピシ
リン耐性遺伝子内で直鎖状にするか、またはＸｂａＩおよびＳａｌＩで切断して
、ＳａｌＩ末端、２２ｂｐ、ａｔｔＢ１部位、ＧＦＰ遺伝子、ａｔｔＢ３部位、
およびＸｂａＩ末端まで１４ｂｐを含むフラグメントを得た： ＳａｌＩ末端−−２２ｂｐ−−ａｔｔＢ１−−ＧＦＰ−−ａｔｔＢ３−−１４ｂ
ｐ−−ＸｂａＩ末端。
【０２０２】 反応（８μｌ最終容量）は、約４０ｎｇの各ＤＮＡ、１×Ｉｎｔ緩衝液（２５
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
８．０、７０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ スペルミジンＨＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、および０．２５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、１２．５％グリセロール、８ｎｇ
ＩＨＦ、および４３ｎｇλインテグラーゼを含む。反応を２５℃で４５分間、次
いで７０℃で５分間インキュベートし、次いで冷却した。各反応の１μｌアリコ
ートを２連でＤＨ５α ＵｌｔｒａＭａｘ細胞に形質転換し、そしてカナマイシ
ン寒天プレート上に２連でプレートした。
【０２０３】 （スーパーコイル型）ｐＥＺＣ７１０２のみを含む反応は、平均２コロニー（
１〜４の範囲）を与えた。ｐＥＺＣ７１０２およびスーパーコイル型ｐＥＺＣ７
５０１の両方を含む反応は、平均６１２コロニー（４８２〜７６２の範囲）を与
えた。ｐＥＺＣ７１０２および直鎖状（ＳｃａＩ切断）ｐＥＺＣ７５０１を含む
反応は、平均３６０コロニー（１２７〜６０５の範囲）を与えた。ａｔｔＢ部位
を超えて（ＳａｌＩおよびＸｂａＩで切断したｐＥＺＣ７５０１）ａｔｔＢ部位
および２２ｂｐおよび１４ｂｐを有するフラグメント上にｐＥＺＣ７１０２およ
びＧＦＰ遺伝子を含む反応は、平均２７４コロニー（２４３〜３０８）を与えた
。
【０２０４】 ミニプレップＤＮＡを、ｐＥＺＣ７１０２×スーパーコイル型ｐＥＺＣ７５１
０反応由来の４つのコロニーから、そしてｐＥＺＣ７１０２×ｐＥＺＣ７５０１
／ＳａｌＩ＋ＸｂａＩ反応由来の１０個のコロニーから調製した。１４個すべて
のＤＮＡを、切断せずにアガロースゲル上で泳動し、そしてｐＥＺＣ７１０２×
ｐＥＺＣ７５０１／ＳａｌＩ＋ＸｂａＩ反応由来の１０個のＤＮＡをＮｃｏＩお
よびＰｓｔＩの混合液で切断し、そしてアガロースゲル上で泳動した。すべての
切断していないプラスミドは、約２．８ｋｂのサイズであった。ＮｃｏＩおよび
ＰｓｔＩの混合液で切断した１０個すべてのプラスミドは、約７００と２１００
ｂｐとの間のフラグメントを与えた。
【０２０５】 結果を表８に示す。
【０２０６】
【表８】 分析：プラスミドｐＥＺＣ７５０１上のａｔｔＢ部位とプラスミドｐＥＺＣ７
１０２上のａｔｔＰ部位との間の組込み反応は、ｐＥＺＣ７５０１からのＧＦＰ
セグメント、およびｐＥＺＣ７１０２からのカナマイシン起源セグメントを含む
、ａｔｔＬ産物プラスミド（図１１Ｃ）（挿入ドナーＤＮＡに相当する）を産生
することが予測された。ａｔｔＰ親プラスミドｐＥＺＣ７１０２（副産物ＤＮＡ
に対応する）上の毒性遺伝子ｃｃｄＢの存在は、このプラスミドを受容したすべ
ての細胞を殺傷することが予想された。ｐＥＺＣ７５０１が存在する場合にコロ
ニーの数の大きな増加は、所望の反応が起こり、そしてたとえａｔｔＢ親プラス
ミド（産物ＤＮＡに対応する）が直鎖状である（ＳｃａＩ切断）場合でも反応の
効率は十分であることを示し、またはａｔｔＢ部位およびＧＦＰ遺伝子が存在す
る場合に、フラグメントはａｔｔＢ部位を超えたさらなる配列をほとんど含まな
かったことを示した。
【０２０７】 これらの結果は、直鎖状のフラグメントが、本発明の方法によって異なるベク
ターに適切にサブクローニングされ得ることを示す。
【０２０８】 （実施例９：長いＰＣＲフラグメントのクローニング） ＰＣＲ産物を、一方の端にａｔｔＢ０（野生型）部位、および他の端にｌｏｘ
Ｐ部位を有するように設計した。その理論的根拠は、ａｔｔＰ０×ａｔｔＢ０反
応がａｔｔＢ０分子（ＰＣＲ産物）を用いて十分に線状化されること（これは正
常なラムダ組込み反応を含むので）、そして同時組込み物からのｌｏｘＰ×ｌｏ
ｘＰ切除はまた、効率的である（単一分子の切除反応が効率的であり、二分子組
込み反応がＣｒｅを用いて効率的ではない）ことである。
【０２０９】 ａｔｔＢ含有ＰＣＲプライマーの配列は、５’−ＴＣＣ ＧＴＴ ＧＡＡ Ｇ
ＣＣ ＴＧＣ ＴＴＴ ＴＴＴ ＡＴＡ ＣＴＡ ＡＣＴ ＴＧＡ ＧＣＧ Ａ
ＡＧ ＣＣＴ ＣＧＧ ＧＧＴ ＣＡＧ ＣＡＴ ＡＡＧ Ｇ−３’（配列番号
３１）であった。ｌｏｘＰプライマーの配列は、５’−ＣＣＡ ＡＴＡ ＡＣＴ
ＴＣＧ ＴＡＴ ＡＧＣ ＡＴＡ ＣＡＴ ＴＡＴ ＡＣＧ ＡＡＧ ＴＴＡ
ＴＴＧ ＣＣＣ ＣＴＴ ＧＧＴ ＧＡＣ ＡＴＡ ＣＴＣ Ｇ−３’ （配 列番号３２）であった。これらのプライマーは、ヒトミオシン重鎖の一部を増幅
する。ポリメラーゼ連鎖反応を、ＥＬＯＮＧＡＳＥTMおよびＫ５６２ヒトＤＮＡ
を鋳型として使用して行った。ポリメラーゼ連鎖反応を以下のように行った。反
応溶液（５０μｌ）は、ＥＬＯＮＧＡＳＥTMＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中で１００ｎｇ Ｋ５６２ヒトＤＮＡ（Ｌｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、０．２μＭの各プライマー、お
よび０．２ｍＭの各ｄＮＴＰを含んだ。薄い壁のチューブ中、ミネラルオイルの
下で反応溶液を、９４℃で１分間の変性、次いで９４℃で３０秒間、６５℃で３
０秒間、および６８秒間で８分３０秒間の３５回サイクルで行った。温度サイク
リングに続いて、反応液を４℃で維持した。５．２ｋｂのＰＣＲ産物（図９Ａ）
を、ゲル精製した。
【０２１０】 プラスミドｐＥＺＣ１２０２（図９Ｂ）は、野生型ａｔｔＰ部位、クロラムフ
ェニコール耐性遺伝子、ｔｅｔリプレッサーをコードする遺伝子、野生型ｌｏｘ
Ｐ部位、複製起点、およびカナマイシン耐性遺伝子を転写し、そして転写制御す
るｔｅｔオペレーター／プロモーターを含んだ。このプラスミドは、クロラムフ
ェニコール耐性を与えたが、カナマイシン耐性を与えなかった。なぜなら、プラ
スミドの１つのエレメントによって作られたｔｅｔリプレッサーが、カナマイシ
ン耐性遺伝子を遮断したままにしたからである。本実験において使用されたｐＥ
ＺＣ１２０２ ＤＮＡは、その濃度が１μｌあたり約５０ｎｇであると見積もら
れたミニプレップであった。
【０２１１】 約４０ｎｇのゲル精製された５．２ｋｂＰＣＲ産物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ ｐＨ 約７．８、１６ｍＭ ＮａＣｌ、３５ｍＭ ＫＣｌ、０．２５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．３７５ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン中に約５０ｎｇのス
ーパーコイル型ｐＥＺＣ１２０２、０．２ユニットのＣｒｅリコンビナーゼ、３
．６ｎｇ ＩＨＦ、および１１ｎｇのＩｎｔを含む１０μｌの反応液中に含めた
。ＰＣＲ産物を含まない第２の反応溶液を、コントロールとして含めた。２７℃
で４５分間、次いで７０℃で５分間のインキュベーションの後、１μｌのアリコ
ートをＤＨ５α ＵｌｔｒａＭａｘコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に形質転換した。各発現混合液の５分の
１を、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む寒天上にプレートし、そしてその
プレートを３７℃で一晩インキュベートした。ＰＣＲ産物を含んだその反応液は
、３４コロニーを与えたが、一方ＰＣＲ産物を欠く反応溶液は３１コロニーを与
えた。そのプレートを室温に４日間置いた後に、２６のさらなる小さいコロニー
が陽性（＋ＰＣＲ産物）反応からのプレート上に見られたが、一方１つのさらな
る小さいコロニーのみが陰性（−ＰＣＲ産物）反応からのプレート上に見られた
。
【０２１２】 ２６の小さいコロニーのうちの１２個を、２５μｇ／ｍｇ カナマイシンを含
む富化ブロス（ＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ）中で一晩増殖させ、そしてミニプレップ
ＤＮＡをこれらの培養物から調製した。１２すべてのミニプレップは約８ｋｂの
サイズであり、これらは５．２ｋｂＰＣＲ産物を有するｐＥＺＣ１２０２中のク
ロラムフェニコール耐性遺伝子およびｔｅｔリプレッサー遺伝子の置換について
予測されたサイズに対応した。予想された組換え産物を図９Ｃに示す。これらの
プラスミドのうちの２つをＡｖａＩ（予想された８部位）およびＢａｍＨＩ（予
想された４部位）で切断した。すべての予想されたＡｖａＩフラグメントは存在
すると思われた。ＰＣＲ産物中で予想されたＢａｍＨＩ部位のうちの１つの部位
（ａｔｔＢ端に最も近いもの）は、両方のミニプレップに存在しなかったが、他
のＢａｍＨＩフラグメントはクローニングされた５．２ｋｂのＰＣＲ産物の予測
された構造と一致した。
【０２１３】 分析：５．２ｋｂ ＰＣＲ産物（ヒトミオシン重鎖の一部）を有するｐＥＺＣ
１２０２中のクロラムフェニコール耐性遺伝子およびｔｅｔリプレッサー遺伝子
の置換は、カナマイシンに対する宿主Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の中程度の耐性を与えた
が、この耐性は一晩のインキュベーション後にコロニーが出現することを可能に
するには十分ではなかった。従って、所望の組換え産物を含むコロニーはカナマ
イシンプレートで増殖するが、一晩のインキュベーション後には見られなかった
。しかし、そのコロニーはさらなる室温でのインキュベーションの後にのみ見ら
れた。そのヌクレオチド配列から予想された１２のＡｖａＩおよびＢａｍＨＩ制
限部位のうち、１１が実験的に確かめられた。従って、以下の３つの観察は、５
．２ｋｂのＰＣＲ産物が組換えによってクローニングされたという結論を支持す
る：（ａ）小さく、遅い増殖コロニーはＰＣＲ産物を含む反応物からのプレート
上にのみ見られた；（ｂ）これらのコロニー由来のミニプレッププラスミドは、
予測されたサイズであった；そして（ｃ）診断的な制限切断は、予測されたフラ
グメントを与えた（上記の１つの例外を伴う）。
【０２１４】 （実施例１０：ＰＣＲフラグメントのクローニング） ＰＣＲプライマー対の３セット（表９）を設計し、ａｔｔＢ１−ＧＦＰ−ａｔ
ｔＢ３を含むプラスミドｐＥＺＣ７５０１（図１１Ｂ）内の８３０ｂｐの配列を
、２５ｂｐ ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ３組換え部位の外側末端に、さらなるヌ
クレオチドを有するか、またはさらなるヌクレオチドなしで、増幅した。（ここ
で「外側（ｏｕｔｅｒ）」とは、ＧＦＰ遺伝子配列に隣接しないａｔｔＢ配列の
末端をいう。）プライマーセットＡは、ａｔｔＢ１の上流に１７ヌクレオチドを
付加して、そしてａｔｔＢ３の下流に１５ヌクレオチドを付加した；プライマー
セットＢは、ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ３にそれぞれ５および８ヌクレオチドを
付加した；そしてプライマーセットＣは、ａｔｔＢ組換え配列のどちらにもさら
なるヌクレオチドを付加しなかった。
【０２１５】 このプライマー配列を表９に提供する。
【０２１６】
【表９】 （ＰＣＲ反応） 最初に、プライマーセットＡおよびＣを、二連で、５０μｌで、以下のＰＣＲ
反応とともに用いた。最終濃度は以下の通りであった： ２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．４ ５０ｍＭ ＫＣｌ ４つすべてのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）０．２ｍＭ スーパーコイル化ＤＮＡテンプレート、４００ｎｇ／ｍｌ ｐＥＺＣ７５０１ 各プライマー ０．５μＭ 組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ−ＧＩＢＣＯ）１００ Ｕ／ｍｌ 上記反応の二連セットは１Ｍベタインを含有した。
【０２１７】 この反応は最初、９４℃で１分間加熱して、次いで、９４℃で４５秒、５５℃
で３０秒、および７２℃で１分を２５回繰り返した。
【０２１８】 ＰＣＲ反応産物のサイズを、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム含有ＴＡＥ緩衝
液中で、１％アガロースゲル上で分析した。すべての反応が期待のサイズの産物
を生じ、従って二連の反応物をプールした。ベタインの有無により対応する反応
物は有意に異ならなかったので、これらもプールし、プライマーセットＡおよび
Ｃを用いた反応の最終プール容量それぞれ２００μｌを得た。
【０２１９】 次いで、プライマーセットＢを、上記で実行したものと同一の反応とともに用
いた（反応容量を１００μｌに増加したことを除いて）。二連の複製反応物なら
びにベタイン添加反応物およびベタイン無添加反応物をプールしたあと、プライ
マーセットＢを用いた反応物の最終容量は、４００μｌであった。
【０２２０】 この３つのプールしたプライマー反応産物を４週間、−２０℃で保存した。
【０２２１】 （ＰＣＲ産物精製） ３つのプールされたＰＣＲ産物のそれぞれを、Ｔｒｉｓ緩衝化フェノール、イ
ソアミルアルコールおよびクロロホルムの等量混合液を用いて１回抽出した。次
いで、水性の上清を等量のイソブタノールを用いて、２回抽出して、そして水性
層を、２容量のエタノール、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．２を用いてエタ
ノール沈殿した。このエタノール沈殿物を、室温で、１３，０００ｒｐｍ、１０
分間の遠心分離により回収して、そして上清を廃棄した。この乾燥ペレットをＴ
Ｅ（プライマーセットＡおよびＣを用いて調製された反応物については１００μ
ｌ；プライマーセットＢを用いた反応物については２００μｌ）に溶解した。
【０２２２】 ＰＣＲプライマーおよび外来の小さいＰＣＲ産物を除くために、１／２容量の
３０％ＰＥＧ ８０００（Ｓｉｇｍａ）、３０ｍＭ ＭｇＣｌ2溶液を添加して 、よく混合して、そしてすべて室温で１３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離
をすることにより、ＰＣＲ産物をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で沈殿させ
た。この上清を捨てて、そしてペレットをその前の容量のＴＥ緩衝液に溶解した
。３つのＰＣＲ産物それぞれの１μｌアリコートを、１％アガロースゲル上でチ
ェックして、回収を定量して、回収は９０％を超えると見積もられた。それぞれ
のＰＣＲ産物の濃度を、ＴＥを用いて４０ｎｇ／μｌに調整した。
【０２２３】 （プライマーセットＡ、ＢおよびＣのＰＣＲ産物を用いる組換え反応） ５つの８μｌ反応物を、４０ｎｇのｐＥＺＣ７１０２ ＤＮＡ、２μｌのリコ
ンビナーゼ混合物（１× Ｉｎｔ緩衝液、５０％グリセロール中に８ｎｇ／μｌ
ＩＨＦ、２２ｎｇ／μｌ Ｉｎｔ）を含有する、１× インテグラーゼ緩衝液
（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐ
Ｈ８．０，８０ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ スペルミジン，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，
０．２５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中で構築した。反応物は、プライマーセットＡ（
反応Ａ）、プライマーセットＢ（反応Ｂ）、もしくはプライマーセットＣ（反応
Ｃ）のＰＣＲ産物のどれかの添加により；ＰＣＲ産物を添加しないこと（反応Ｄ
）、または陽性コントロールとして４０ｎｇのｐＥＺＣ７５０１ ＳＣ（スーパ
ーコイル化）ＤＮＡの添加（反応Ｅ）により異なる。すべての反応を、二連で実
行した。
【０２２４】 この反応を、２５℃で４５分間、７０℃で１０分間インキュベートして、次い
で０〜５℃においた。それぞれの反応の２μｌアリコートを、５０μｌの形質転
換反応中で、Ｍａｘ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ５α中に形質転換して、そし
て、５０Ｃ培地中の発現後に、反応物の１／５（１００μｌ）および４／５（４
００μｌ）を、カナマイシン含有（５０μｇ／ｍｌ）ＬＢ培養プレート上にプレ
ートした。この二連反応物の結果を表１０に示す。
【０２２５】
【表１０】 （得られたコロニーの分析） ミニプレップＤＮＡを、プライマーセットＡ、ＢまたはＣを用いたそれぞれの
組換え反応物の８つのコロニーから調製した。得られたスーパーコイル化ＤＮＡ
を、１％アガロースゲル上で分析した：プライマーセットＡおよびＢの組換え産
物からの８つのすべてのコロニーは、ＰＣＲ産物（約８２４ｂｐ）とｐＥＺＣ
７１０２によって与えられたａｔｔＢ１−−ｏｒｉ−−ｋａｎ’−−ａｔｔＢ３
配列（１９６７ｂｐ）との間の正しい組換えについて予想されるサイズ（２７９
１ｂｐ）であった。プライマーセットＣの８つの反応産物のうち３つは、予想さ
れるサイズで；他の５つすべては４ｋｂよりわずかに大きかった。
【０２２６】 反応産物のさらなる分析を、２つの異なる制限酵素、ＡｖａＩおよびＰｖｕＩ
Ｉを用いて実行した。これら酵素の各々は、予想組換え産物中で２度切断（ただ
し違う位置で）する（一度は、ＰＣＲ産物配列中で、そして一度はｐＥＺＣ７１
０２により与えられる配列中で）。これらの酵素両方とも、２つの部位で完全な
ｐＥＺＣ７１０２組換えパートナーのプラスミドを切断し、期待される組換え産
物のフラグメントから容易に識別されるフラグメントをもたらすはずである。
【０２２７】 ２つの制限酵素消化物は、プライマーセットＡおよびＢを用いた組換え反応物
から生成されたコロニーから、ならびに期待されたサイズのスーパーコイル化Ｄ
ＮＡを示すプライマーセットＣからの３つのコロニーについて、期待されるサイ
ズのフラグメント（ＡｖａＩでは２３７３および４３０ｂｐ；ＰｖｕＩＩでは２
４７３および３３０ｂｐ）を生じた。しかし、より長いＳＣ ＤＮＡを生じたプ
ライマーセットＣからの他の５つのコロニーについて、ＰｖｕＩＩ消化は、ｐＥ
ＺＣ７１０２の消化から予想されるフラグメントに対して近似のサイズのフラグ
メントを示したが、ＡｖａＩ消化は、線状化ｐＥＺＣ７１０２（４１６１ｂｐ）
のサイズに近似の、単一フラグメントのみを示した。
【０２２８】 （分析） これらの結果は、ａｔｔＢ部位に隣接される遺伝子を含むテンプレートから生
成されたＰＣＲ産物が、逆組換え反応のための効率的基質として働き得ることを
示す。ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ３部位またはコア領域の末端への短いＤＮＡ配
列（例えば、プライマーセットＢにおいて、各々５ｂおよび８ｂｐ）でさえの付
加は、この反応を１００倍以上刺激した。驚くべきことに、ａｔｔＢ部位を越え
てさらなる配列を含有するＰＣＲ産物を用いる逆組換え反応物が、これらの反応
において、スーパーコイル化した陽性コントロールプラスミドｐＥＺＣ７５０１
よりも効率的な組換えパートナーであるようであった。
【０２２９】 すべての組換え産物が忠実に生成された。低レベルのバックグラウンドコロニ
ーが、プライマーセットＣを用いた相対的に非効率的な組換え反応物（２５ｂｐ
のａｔｔＢ部位を越える付加配列を欠いた）から出現した。このバックグラウン
ドは、活性ｃｃｄＢ死亡遺伝子を欠損するほぼ完全なｐＥＺＣ７１０２（これは
カナマイシン抵抗性をコードする）（このことにより、その生存を可能にする）
に起因するようであった。このプラスミドにおいてＡｖａＩについての２つの制
限部位の１つがまた変化したということがこの解釈と一致する。ＡｖａＩ部位の
１つは、ｐＥＺＣ７１０２のｃｃｄＢ領域内に存在する。従って、この部位の変
化は、ｃｃｄＢ遺伝子の変異性の不活化に対して二次的であるという可能性があ
る。
【０２３０】 （実施例１１：ＰＣＲフラグメントのさらなるクローニング） プラスミドｐＢＲ３２２からＰＣＲ産物を調製するための６プライマーの２つ
のセットを、テンプレートとして用いた。１つのセット（表１１）は、ＴｅｔＲ
プロモーターを含むＴｅｔＲ遺伝子に隣接する配列へアニールした。他のセット
（表１２）は、そのプロモーターを含むＡｍｐＲ遺伝子に隣接する配列へアニー
ルした。用いた「ｔｅｔ」および「ａｍｐ」プライマーは、ａｔｔＢ配列を含ま
ず、ｐＢＲ３２２プラスミドに固有の配列のみを含む；「ａｔｔＢ」プライマー
は、ｐＢＲ３２２配列に加えて、２５ｂｐのａｔｔＢ ＩまたはａｔｔＢ３配列
を含む；「ａｔｔＢ＋４」プライマーは、ｐＢＲ３２２特異的配列および２５ｂ
ｐ ａｔｔＢ ＩまたはａｔｔＢ３配列を含み、それぞれ４つのＧを外側末端に
有する。（ここで「外側」は、テンプレート特異的プライマー配列に隣接しない
ａｔｔＢ配列の末端をいう。） （ｐＢＲ３２２テンプレートの調製） ＰＣＲ反応の効率性を改善するために、３７℃で、１時間、１５ユニットの制
限酵素ＮｄｅＩおよび最終濃度５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０，１０
ｍＭ ＭｇＣｌ2、ならびに５０ｍＭ ＮａＣｌとともに、２００μｌ反応液中 で、３．５μｇのスーパーコイル化（ＳＣ）ｐＢＲ３２２ ＤＮＡをインキュベ
ートすることにより、スーパーコイル化したｐＢＲ３２２ ＤＮＡを、線状化し
た。
【０２３１】 消化したｐＢＲ３２２ ＤＮＡをフェノール、イソアミルアルコール、および
クロロホルムを用いて１回抽出して、イソブタノールで２回抽出して、そして０
．１５Ｍ酢酸ナトリウム添加のエタノール２容量を添加して沈殿させた。この沈
殿を、１００％エタノールで１回洗浄して、乾燥して、次いで、ＴＥ緩衝液に溶
解した。ＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲル上、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジ
ウムで定量した、ＤＮＡの回収は、８０％より大きいと見積もられた。
【０２３２】
【表１１】
【０２３３】
【表１２】 （ｔｅｔおよびａｍｐ遺伝子配列のＰＣＲ増幅） ６つのＰＣＲ反応を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４，５０ｍＭ
ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2，０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，２ｎｇ線状化ｐＢ Ｒ３２２，２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ），
ならびに表３および４に挙げたＰＣＲプライマー対それぞれの０．５μＭからな
る、１００μｌの中で行った。この反応物を最初、９４℃へ３分間、加熱し；次
いで９４℃で４５秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１分間の２５サイク
ルに供した。１％アガロースゲル分析に基づいて、反応物のすべてが、妥当な収
率で期待されたサイズの産物を生成した。
【０２３４】 （ＰＣＲ産物の精製） 上記のように、二連の反応からの産物をプールし；等容量のフェノール、イソ
アミルアルコールおよびクロロホルムを用いて抽出し；等容量のイソブタノール
を用いて２回抽出し；そして、２容量のエタノールを用いて沈殿した。６つの沈
殿物を、１００％エタノールで１回洗浄して、乾燥して、そして１００μｌ Ｔ
Ｅに溶解した。１μｌのアリコートを、ＰＥＧ沈殿の前に、産物のゲル分析のた
めに取り出した。
【０２３５】 それぞれのチューブに５０μｌの３０％ＰＥＧ ８，０００、３０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2を添加した。この溶液をよく混合して、そして室温で１３，０００ｒｐｍ で１０分間、遠心分離した。この上清を注意深く取り除き、そして沈殿を１００
μｌ ＴＥに溶解した。回収を１％アガロース上で定量して、そして９０％を超
えると見積もった。ゲル分析はまた、約３００ヌクレオチドより短い核酸産物が
、ＰＥＧ沈殿工程により効率的に除去されたことを示した。
【０２３６】 （組換え反応） それぞれ、総容量８μｌで、１×インテグラーゼ緩衝液、４０ｎｇ ｐＥＺＣ
７１０２（図１１Ａ）、および２μｌリコンビナーゼ混合物を含有する７つの組
換え反応を、実行した（上記、実施例１０参照のこと）。それぞれの反応物はま
た、６つの上記ＰＣＲ産物の１つの約４０ｎｇ、または陽性コントロールとして
、４０ｎｇのｐＥＺＣ７５０１（図１１Ｂ）を含んだ。末端にａｔｔＢ部位を有
するａｍｐおよびｔｅｔ ＰＣＲ産物を図１２Ａおよび１２Ｂに示す。この反応
物を、２５℃で４５分間、７０℃で１０分間インキュベートして、次いで、Ｅ．
ｃｏｌｉ．への形質転換に用いるまで０〜５℃で１〜２時間保持した。
【０２３７】 （組換え反応産物を用いるＥ．ｃｏｌｉ．形質転換） それぞれの組換え反応物の１μｌを、５０μｌ形質転換反応物中で、Ｍａｘ
Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ５αに形質転換し、そして、ＳＯＣ培地中の発現後
に、それぞれの反応物の１／５（１００μｌ）および４／５（４００μｌ）を、
カナマイシン５０μｇ／ｍｌ含有の培養プレート上にプレートした。このプレー
トを一晩インキュベートして、そしてコロニーをカウントした。それぞれの二連
反応セットから得られたコロニー数を表１３に示す。
【０２３８】
【表１３】 （得られたコロニーの分析） 迅速な表現型スクリーニングとして、ｔｅｔ ＥＺＣ反応物からの１０のコロ
ニーおよびａｔｔＢ＋４−ｔｅｔ ＥＺＣ反応物からの３３のコロニーを、テト
ラサイクリン含有（１５μｇ／ｍｌ）のＬＢ培養プレート上に画線した。テトラ
サイクリンの効力についてのコントロールとして、ＴｅｔＲ遺伝子を欠落するｐ
ＵＣ１９形質転換細胞の３つのコロニーもまた、プレートに画線した。ａｔｔＢ
＋４−ｔｅｔ ＥＺＣ反応物からのすべてのコロニーはよく増殖した；ｔｅｔＥ
ＺＣ反応物からのコロニーは、非常にわずかにのみ増殖して、そしてｐＵＣ１９
コロニーはまったく増殖しなかった。
【０２３９】 類似の結果が、ａｍｐ ＰＣＲ反応物からのコロニーをアンピシリン含有（１
００μｇ／ｍｌ）培養プレート上に画線することにより得られた。ａｔｔＢ＋４
−ａｍｐ組換え反応物から生成された２１のコロニーすべてがよく増殖し、一方
で、ａｔｔＢ−ａｍｐ反応物からの１３のコロニーでは１つだけがアンピシリン
の存在下で増殖した。ａｍｐ ＰＣＲ産物を用いた組換え反応物からの１５のコ
ロニーではいずれも増殖は見られなかった。
【０２４０】 プラスミドＤＮＡを特徴付けるために、ＰＣＲ産物を用いた６つのＥＺＣ反応
物から生成された８つのコロニーを、５０μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＬＢブロ
スに突ついて入れて、そして３７℃で一晩、増殖させた。ミニプレップＤＮＡを
、それぞれの培養物の０．９ｍｌから調製して、そしてスーパーコイル化ＤＮＡ
のサイズを、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム含有ＴＡＥ緩衝液中の１％アガロ
ースゲル上で分析した。この結果を表１４に示す。組換え産物の予想される構造
を、図１２Ｃおよび１２Ｄに示す。
【０２４１】
【表１４】 （分析） プラスミドｐＢＲ３２２の中の、２つの異なる遺伝子配列、ｔｅｔおよびａｍ
ｐの増幅に基づく、これらの結果は、２５ｂｐのａｔｔＢ１およびａｔｔＢ３組
換え配列を含むプライマーを用いて生成されたＰＣＲ産物が、組換え反応のため
の高度に効率的な基質として働くことを明らかに実証する。それぞれの２５ｂｐ
ａｔｔＢ部位の外側への短い配列の付加は、実施例１０の実験にも観察される
ように、組換え反応を１００倍を超えて刺激する。また実施例１０と同様に、ａ
ｔｔＢ部位を有する線状ＰＣＲ産物を用いる組換え反応の効率は、陽性コントロ
ールＳＣ ＤＮＡプラスミド、ｐＥＺＣ７５０１で得られる効率を超えた。
【０２４２】 さらに、高いパーセンテージの反応産物は予想される通りである。なぜならａ
ｔｔＢ＋４−ｔｅｔ反応物からの試験された３３コロニーすべてが、機能的なテ
トラサイクリン抵抗性を示して、そしてａｔｔＢ＋４−ａｍｐ反応物からの２１
コロニーすべてが、アンピシリン抵抗性を示したからである。ミニプレップＤＮ
Ａの１６すべて（ａｔｔＢ＋４−ｔｅｔまたはａｔｔＢ＋４ａｍｐのいずれかの
ＰＣＲ産物のｐＥＺＣ７１０２との組換え反応物から調べられた）が、スーパー
コイル化ＤＮＡおよび正しいサイズの制限消化フラグメントを生成した。
【０２４３】 （実施例１２：組換えを刺激するためのトポイソメラーゼの使用） 親のプラスミドの一方を線状にすることによる組換え反応の刺激は、期待され
なかった。この刺激が、２つの組換え反応の間に生じる、いくらかの高次構造強
制の緩和（コインテグレートの形成および２つの娘分子への分解）から得られる
場合、トポイソメラーゼによるプラスミドの巻き戻しはまた、一方または両方の
親プラスミドが環状であるときも刺激的であり得る。
【０２４４】 挿入ドナーは、ｐＥＺＣ２９０１（図７Ａ）であり、ベクタードナーは、ｐＥ
ＣＺ３１０１（図７Ｂ）であった。ｐＥＺＣ３１０１の部分を、Ｍｌｕ Ｉで線
状化した。２０ｎｇのｐＥＺＣ２９０１および／または ｐＥＣＺ３１０１を、
それぞれの１０μｌの反応（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ約７．８、１６
．５ｍＭ ＮａＣｌ，３５ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ スペルミジン、０．３７５ｍ
ｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、２％グリセロール中の２９ｎｇ
Ｉｎｔ，２．９ｎｇ Ｘｉｓ，５．４ｎｇ ＩＨＦ）中に用いた。トポイソメラ
ーゼＩ（ウシ胸腺；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｓ，Ｉｎｃより）を、１×
ＥＺＣ緩衝液中で、１５ｕｎｉｔｓ／μｌから、表１５に示す濃度へ希釈した
。
【０２４５】
【表１５】 これらの反応物を以下の順に構築した：緩衝液；ＴＥ；ＤＮＡｓ；クロナーゼ
；トポイソメラーゼ。反応物を、２２℃〜２８℃で４５分間、次いで７０℃で５
分間インキュベートした。１μｌのアリコートをＵｌｔｒａＭａｘ ＤＨ５αコ
ンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に
形質転換した。発現後に、アリコートを１００μｇ／ｍｌカナマイシンにプレー
トして、そして３０℃で４８時間インキュベートした。結果：表１６を参照のこ
と。
【０２４６】
【表１６】 （分析） ベクタードナーの線状化は、コロニー数を約１０倍に増加した（反応２対反応
７）。環状挿入ドナーおよび線状ベクタードナーを含む反応物へのトポイソメラ
ーゼＩ０．５〜５ユニットの添加は、コロニー数に対してほとんどまたはまった
く影響を有さなかった（反応３，４および５と比較して反応２；最大１．４倍）
。対照的に、両方の親プラスミドが環状であった場合（反応７〜１０）、トポイ
ソメラーゼＩの添加は、コロニー数を５〜９倍に刺激した。従って、両方の親プ
ラスミドが環状である反応物へのトポイソメラーゼＩの添加は、ベクタードナー
の親を線状化するのとほぼ同じぐらい、組換え反応を刺激した。トポイソメラー
ゼＩは、組換え緩衝液中で、３つの組換えタンパク質と組み合わせて用いた場合
、活性であった。組換え反応へのトポイソメラーゼＩの添加は、組換え反応の刺
激を獲得するためにベクタードナーを線状化する必要性を軽減する。
【０２４７】 理解を明確にするために例示および実施例によって本発明をいく分詳細に十分
に記載してきたが、同様のことが、発明の範囲またはそのいずれの特定の実施態
様にも影響することなく、条件、処方および他のパラメーターの広範なおよび同
等の範囲内で、本発明を改変または変更することにより実行され得ること、なら
びに、このような改変または変更が添付の請求項の範囲内に包含されることが意
図されることは当業者にとって明白である。
【０２４８】 本明細書において言及されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、本発
明が関係する当業者の技術水準を示しており、そして、それぞれ個々の刊行物、
特許および特許出願は、参考として援用されるように詳細および個別に示された
かのように同じ程度に、参考として本明細書に援用される。
【０２４９】
【表１７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明の１つの一般的な方法を示し、ここで、開始（親）ＤＮＡ分子
は、環状または直鎖状であり得る。目標は、新たなサブクローニングベクターＤ
をもとのクローニングベクターＢと交換することである。１つの実施態様におい
て、ＡＤについて、およびすべての他の分子（コインテグレートを含む）に対し
て選択することが所望される。四角および丸は、組換えの部位（例えば、ｌｏｘ
Ｐ部位、ａｔｔ部位など）である。例えば、セグメントＤは、発現シグナル、新
たな薬剤マーカー、新たな複製起点、またはマッピングもしくはＤＮＡ配列決定
のための特殊化された機能を含み得る。
【図２Ａ】 図２Ａは、挿入ドナープラスミド（ここでは、ｐＥＺＣ７０５）をベクタード
ナープラスミド（ここでは、ｐＥＺＣ７２６）と組換え、そして産物ＤＮＡおよ
び副産物娘分子を得るインビトロにおける方法を示す。２つの組換え部位は、ベ
クタードナー上のａｔｔＰおよびｌｏｘＰである。これらの部位により規定され
る１つのセグメント上に、そのプロモーターがトランスポゾンＴｎ１０由来のｔ
ｅｔＯＰオペレーター／プロモーターにより置換されているカナマイシン耐性遺
伝子が存在する。Ｓｉｚｅｍｏｒｅら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １
８（１０）：２８７５ （１９９０）を参照のこと。ｔｅｔリプレッサータンパ
ク質の非存在下において、Ｅ． ｃｏｌｉ ＲＮＡポリメラーゼは、ｔｅｔＯＰ
からカナマイシン耐性遺伝子を転写する。ｔｅｔリプレッサーが存在する場合、
それはｔｅｔＯＰに結合し、そしてカナマイシン耐性遺伝子の転写をブロックす
る。ｐＥＺＣ７２６の他のセグメントは、構成性プロモーターにより発現される
ｔｅｔリプレッサー遺伝子を有する。従って、ｐＥＺＣ７２６により形質転換さ
れる細胞は、ｔｅｔＲと同じセグメント上のクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子のためにクロラムフェニコールに耐性であるが、カナマイ
シンに感受性である。リコンビナーゼ媒介性反応は、ｔｅｔＲ遺伝子の、調節さ
れたカナマイシン耐性遺伝子からの分離を生じる。この分離は、所望の組換え産
物を受ける細胞においてのみ、カナマイシン耐性を生じる。第１の組換え反応は
インテグラーゼと呼ばれるリコンビナーゼの添加により駆動される。第２の組換
え反応はリコンビナーゼＣｒｅをコインテグレート（ここでは、ｐＥＺＣ７ Ｃ
ｏｉｎｔｅｇｒ）へ添加することにより駆動される。
【図２Ｂ】 図２Ｂは、ｐＥＺＣ７０５の制限地図を示す。
【図２Ｃ】 図２Ｃは、ｐＥＺＣ７２６の制限地図を示す。
【図２Ｄ】 図２Ｄは、ｐＥＺＣ７ Ｃｏｉｎｔの制限地図を示す。
【図２Ｅ】 図２Ｅは、Ｉｎｔｐｒｏｄの制限地図を示す。
【図２Ｆ】 図２Ｆは、Ｉｎｔｂｙｐｒｏの制限地図を示す。
【図３Ａ】 図３Ａは、挿入ドナープラスミド（ここでは、ｐＥＺＣ６０２）をベクタード
ナープラスミド（ここでは、ｐＥＺＣ６２９）と組換え、そして産物（ここでは
、ＥＺＣ６ｐｒｏｄ）および副産物（ここでは、ＥＺＣ６Ｂｙｐｒ）娘分子を得
るインビトロにおける方法を示す。２つの組換え部位は、ｌｏｘＰおよびｌｏｘ
Ｐ ５１１である。これらの部位により規定されるｐＥＺＣ６２９の１つのセグ
メントは、そのプロモーターがトランスポゾンＴｎ１０由来のｔｅｔＯＰオペレ
ーター／プロモーターにより置換されているカナマイシン耐性遺伝子である。ｔ
ｅｔリプレッサータンパク質の非存在下において、Ｅ． ｃｏｌｉ ＲＮＡポリ
メラーゼは、ｔｅｔＯＰからカナマイシン耐性遺伝子を転写する。ｔｅｔリプレ
ッサーが存在する場合、それはｔｅｔＯＰに結合し、そしてカナマイシン耐性遺
伝子の転写をブロックする。ｐＥＺＣ６２９の他のセグメントは、構成性プロモ
ーターにより発現されるｔｅｔリプレッサー遺伝子を有する。従って、ｐＥＺＣ
６２９により形質転換される細胞は、ｔｅｔＲと同じセグメント上のクロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のためにクロラムフェニコールに
耐性であるが、カナマイシンに感受性である。反応は、ｔｅｔＲ遺伝子の、調節
されたカナマイシン耐性遺伝子からの分離を生じる。この分離は、所望の組換え
産物のみを受ける細胞においてカナマイシン耐性を生じる。第１および第２の組
換え事象は、同じリコンビナーゼＣｒｅの添加により駆動される。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、ＥＺＣ６Ｂｙｐｒの制限地図を示す。
【図３Ｃ】 図３Ｃは、ＥＺＣ６ｐｒｏｄの制限地図を示す。
【図３Ｄ】 図３Ｄは、ｐＥＺＣ６０２の制限地図を示す。
【図３Ｅ】 図３Ｅは、ｐＥＺＣ６２９の制限地図を示す。
【図３Ｆ】 図３Ｆは、ＥＺＣ６ｃｏｉｎｔの制限地図を示す。
【図４Ａ】 図４Ａは、真核生物細胞における発現のために、ベクター中へクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子をサブクローニングするための組換え
クローニングのインビトロ方法の適用を示す。挿入ドナープラスミドｐＥＺＣ８
４３は、ｌｏｘＰ部位が遺伝子の５’末端に位置するようにｌｏｘＰ部位とａｔ
ｔＢ部位との間にクローニングされたＥ．ｃｏｌｉのクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。ベクタードナープラスミドｐＥＺＣ１０
０３は、ｌｏｘＰ部位に並置されたサイトメガロウイルス真核生物プロモーター
を含む。超らせんプラスミドをλインテグラーゼおよびＣｒｅリコンビナーゼと
インビトロで組み合わせた。インキュベーション後、コンピテントＥ． ｃｏｌ
ｉ細胞を組換え反応溶液を用いて形質転換した。形質転換のアリコートをカナマ
イシンを含有する寒天プレート上に広げて、産物分子（ここでは、ＣＭＶＰｒｏ
ｄ）を選択した。
【図４Ｂ】 図４Ｂは、ｐＥＺＣ８４３の制限地図を示す。
【図４Ｃ】 図４Ｃは、ｐＥＺＣ１００３の制限地図を示す。
【図４Ｄ】 図４Ｄは、ＣＭＶＢｙｐｒｏの制限地図を示す。
【図４Ｅ】 図４Ｅは、ＣＭＶＰｒｏｄの制限地図を示す。
【図４Ｆ】 図４Ｆは、ＣＭＶｃｏｉｎｔの制限地図を示す。
【図５Ａ】 図５Ａは、ｐＥＺＣ１３０１のベクター図を示す。
【図５Ｂ】 図５Ｂは、ｐＥＺＣ１３０５のベクター図を示す。
【図５Ｃ】 図５Ｃは、ｐＥＺＣ１３０９のベクター図を示す。
【図５Ｄ】 図５Ｄは、ｐＥＺＣ１３１３のベクター図を示す。
【図５Ｅ】 図５Ｅは、ｐＥＺＣ１３１７のベクター図を示す。
【図５Ｆ】 図５Ｆは、ｐＥＺＣ１３２１のベクター図を示す。
【図５Ｇ】 図５Ｇは、ｐＥＺＣ１４０５のベクター図を示す。
【図５Ｈ】 図５Ｈは、ｐＥＺＣ１５０２のベクター図を示す。
【図６Ａ】 図６Ａは、ｐＥＺＣ１６０３のベクター図を示す。
【図６Ｂ】 図６Ｂは、ｐＥＺＣ１７０６のベクター図を示す。
【図７Ａ】 図７Ａは、ｐＥＺＣ２９０１のベクター図を示す。
【図７Ｂ】 図７Ｂは、ｐＥＺＣ２９１３のベクター図を示す。
【図７Ｃ】 図７Ｃは、ｐＥＺＣ３１０１のベクター図を示す。
【図７Ｄ】 図７Ｄは、ｐＥＺＣ１８０２のベクター図を示す。
【図８Ａ】 図８Ａは、ｐＧＥＸ−２ＴＫのベクター図を示す。
【図８Ｂ】 図８Ｂは、ｐＥＺＣ３５０１のベクター図を示す。
【図８Ｃ】 図８Ｃは、ｐＥＺＣ３６０１のベクター図を示す。
【図８Ｄ】 図８Ｄは、ｐＥＺＣ３６０９のベクター図を示す。
【図８Ｅ】 図８Ｅは、ｐＥＺＣ３６１７のベクター図を示す。
【図８Ｆ】 図８Ｆは、ｐＥＺＣ３６０６のベクター図を示す。
【図８Ｇ】 図８Ｇは、ｐＥＺＣ３６１３のベクター図を示す。
【図８Ｈ】 図８Ｈは、ｐＥＺＣ３６２１のベクター図を示す。
【図８Ｉ】 図８Ｉは、ＧＳＴ−ＣＡＴのベクター図を示す。
【図８Ｊ】 図８Ｊは、ＧＳＴ−ｐｈｏＡのベクター図を示す。
【図８Ｋ】 図８Ｋは、ｐＥＺＣ３２０１のベクター図を示す。
【図９Ａ】 図９Ａは、５．２ｋｂ ＰＣＲ ｐｒｏｄを示す。
【図９Ｂ】 図９Ｂは、ｐＥＺＣ１２０２のベクター図を示す。
【図９Ｃ】 図９Ｃは、５．２ｋｂクローンのベクター図を示す。
【図１０Ａ】 図１０Ａは、ｐＥＺＣ５６０１のベクター図を示す。
【図１０Ｂ】 図１０Ｂは、ｐＥＺＣ６７０１のベクター図を示す。
【図１０Ｃ】 図１０Ｃは、ａｔｔＬ産物のベクター図を示す。
【図１０Ｄ】 図１０Ｄは、ａｔｔＲ産物を示す。
【図１１Ａ】 図１１Ａは、ｐＥＺＣ７１０２のベクター図を示す。
【図１１Ｂ】 図１１Ｂは、ｐＥＺＣ７５０１のベクター図を示す。
【図１１Ｃ】 図１１Ｃは、ａｔｔＬ産物を示す。
【図１２Ａ】 図１２Ａは、末端ａｔｔＢ部位を有するａｍｐ ＰＣＲ産物を示す。
【図１２Ｂ】 図１２Ｂは、末端ａｔｔＢ部位を有するｔｅｔ ＰＣＲ産物を示す。
【図１２Ｃ】 図１２Ｃは、ａｍｐ ７１０２のの制限地図を示す。
【図１２Ｄ】 図１２Ｄは、ｔｅｔ ７１０２の制限地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ブラッチ， マイケル エイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20882， ゲイザーズバーグ， サニーエイカーズ ロード 20931 (72)発明者 テンプル， ゲイリー エフ． アメリカ合衆国 メリーランド 20880， ワシントン グローブ， リッジ ロー ド 114 (72)発明者 フォックス， ドナ ケイ． アメリカ合衆国 メリーランド 21784， サイクスビル， ビレッジ ロード 7407 Ｆターム(参考） 4B024 CA04 DA06 EA04 FA10 FA18 4B063 QA01 QA13 QQ42 QR33 QR55 QR62 QS25 QS32

Claims (51)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 １つ以上の所望の核酸分子をクローンニングまたはサブクロ
    ーニングする方法であって、以下： （ａ）インビトロまたはインビボで以下を組合せる工程、 （ｉ）少なくとも２つの組換え部位と隣接する１つ以上の所望の核酸セ
    グメントを含む１つ以上の挿入ドナー分子であって、ここで該組換え部位は実質
    的に互いに組換わらない、挿入ドナー分子； （ｉｉ）少なくとも２つの組換え部位を含む１つ以上のベクタードナー
    分子であって、ここで、該組換え部位は実質的に互いに組換わらない、ベクター
    ドナー分子；および、 （ｉｉｉ）１つ以上の部位特異的組換えタンパク質； （ｂ）１つ以上の該所望のセグメントを１つ以上の該ベクタードナー分子に移
    すのに十分な条件下で該組合せ物をインキュベートし、これによって１つ以上の
    所望の産物核酸分子を生成する、工程； （ｃ）インビトロまたはインビボで以下を組合せる工程 （ｉ）２つ以上の組換え部位と隣接する該所望のセグメントを含む１つ
    以上の該産物分子であって、ここで、該組換え部位は実質的に互いに組換わらな
    い、産物分子； （ｉｉ）２つ以上の組換え部位を含む１つ以上の異なるベクタードナー
    分子であって、ここで、該組換え部位は実質的に互いに組換わらない、ベクター
    ドナー分子；および （ｉｉｉ）１つ以上の部位特異的組換えタンパク質；ならびに （ｄ）１つ以上の該所望のセグメントを１つ以上の異なるベクタードナー分子
    に移すのに十分な条件下で該組合せ物をインキュベートし、これにより１つ以上
    の異なる産物分子を生成する工程、 を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 １つ以上の前記所望のセグメントを前記異なるベクタードナ
    ー分子に移すのに十分な条件下で、１つ以上の異なるベクタードナー分子と前記
    異なる産物分子とをインキュベートする工程をさらに包含する、請求項１に記載
    の方法。
  3. 【請求項３】 所望の核酸分子をクローニングまたはサブクローニングする
    方法であって、以下： （ａ）インビトロまたはインビボで以下を組合せる工程、 （ｉ）２つ以上の組換え部位と隣接する１つ以上の核酸セグメントを含
    む１つ以上の挿入ドナー分子であって、ここで、該組換え部位は実質的に互いに
    組換わらない、挿入ドナー分子、 （ｉｉ）２つ以上の組換え部位を含む２つ以上の異なるベクタードナー
    分子であって、ここで該組換え部位は実質的に互いに組換わらないベクタードナ
    ー分子；および、 （ｉｉｉ）１つ以上の部位特異的組換えタンパク質；ならびに、 （ｂ）１つ以上の該所望のセグメントを該異なるベクタードナー分子に移すの
    に十分な条件下で該組合せ物をインキュベートし、これによって２つ以上の異な
    る産物分子を生成する工程、 を包含する、方法。
  4. 【請求項４】 前記挿入ドナー分子がゲノムＤＮＡ由来である、請求項１ま
    たは請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記挿入ドナー分子がｃＤＮＡ由来である、請求項１または
    請求項３に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記挿入ドナー分子が化学合成により生成される、請求項１
    または請求項３に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記ベクタードナー分子が少なくとも１つの選択マーカーを
    含む、請求項１または請求項３に記載の方法。
  8. 【請求項８】 請求項７に記載の方法であって、ここで、前記選択マーカー
    が以下： （ａ）レシピエント細胞が耐性を提供されなければ毒性である化合物に対する
    該耐性をレシピエント細胞に提供する産物をコードするＤＮＡセグメント； （ｂ）ＤＮＡセグメントがコードしなければレシピエント細胞において欠けて
    いる産物をコードする該ＤＮＡセグメント； （ｃ）レシピエント細胞中の遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードするＤ
    ＮＡセグメント； （ｄ）同定され得る産物をコードするＤＮＡセグメント； （ｅ）レシピエント細胞中で細胞機能を阻害する産物をコードするＤＮＡセグ
    メント； （ｆ）上記（ａ）〜（ｅ）の任意の該ＤＮＡセグメントの活性を阻害するＤＮ
    Ａセグメント； （ｇ）基質を修飾する産物に結合するＤＮＡセグメント； （ｈ）タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または化学物質により認識され得る特定
    のヌクレオチド認識配列をコードするＤＮＡセグメント； （ｉ）欠失した場合に、レシピエント細胞内の特定の化合物による細胞の殺傷
    に対する感受性を直接的または間接的に与える、ＤＮＡセグメント； （ｊ）レシピエント細胞中で毒性である産物をコードするＤＮＡセグメント；
    ならびに、 （ｋ）所望の分子を単離または同定するために使用され得るＤＮＡセグメント
    、 からなる群から選択された少なくとも１つのＤＮＡセグメントを含む、方法。
  9. 【請求項９】 前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子、ｔＲＮＡ遺伝子
    、栄養要求性マーカー、毒性遺伝子、表現型マーカー、アンチセンスオリゴヌク
    レオチド、制限エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ切断部位、酵素切
    断部位、タンパク質結合部位、およびＰＣＲプライマー配列に相補的な配列から
    なる群より選択される少なくとも１つのマーカーを含む、請求項８に記載の方法
    。
  10. 【請求項１０】 前記ベクタードナー分子が原核生物および／または真核生
    物ベクターを含む、請求項１または請求項３に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記真核生物ベクターが、酵母細胞、植物細胞、魚細胞、
    真核生物細胞、哺乳動物細胞、および／または昆虫細胞中で増殖および／または
    複製するベクターを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記原核生物ベクターが、グラム陰性またはグラム陽性細
    菌中で増殖および／または複製するベクターを含む、請求項１０に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記原核生物ベクターが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓ
    ａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属およ
    び／またはＰｓｅｕｄｅｍｏｎａｓ属の細菌中で増殖および／または複製するベ
    クターを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記原核生物ベクターが、Ｅ．ｃｏｌｉ中で増殖および／
    または複製するベクターを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記ベクタードナー分子が、クローニングベクター、配列
    決定ベクター、発現ベクター、融合ベクター、２−ハイブリッドベクター、逆２
    −ハイブリッドベクター、またはその誘導体または改変体からなる群から選択さ
    れる、請求項１０に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記真核生物ベクターが、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔ
    Ｂａｃ ＨＴ、ｐＦａｓｔＢａｃ ＤＵＡＬ、ｐＳＦＶ、ｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃ
    ｅ、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＰＵＲ、ｐＭＡＭ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＢＩ１０１、ｐ
    ＢＩ１２１、ｐＤＲ２、ｐＣＭＶＥＢＮＡ、ＹＡＣｎｅｏ、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶ
    Ｌ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、ｐＫＫ２３２−８、ｐ３’ＳＳ、ｐＸＴ１、ｐＳ
    Ｇ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、およびｐＯＧ４４、ｐＹＥＳ
    ２、ｐＡＣ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａ
    ｃＩＩＩ、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＲＥＰ
    ４、ｐＣＥＰ４、ならびにｐＥＢＶＨｉｓまたはその誘導体もしくは改変体から
    なる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記原核生物ベクターが、ｐｃＤＮＡＩＩ、ｐＳＬ３０１
    、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＲＳＥＴ、
    ｐＧＥＭＥＸ−１、ｐＧＥＭＥＸ−２、ｐＥＴ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３
    −３、ｐＧＥＸ、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＭＣ１８７１、ｐＫＫ２３３
    −２、ｐＫＫ３８８−１、ならびにｐＰｒｏＥｘ−ＨＴまたはその誘導体もしく
    は改変体からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記２−ハイブリッドおよび逆２−ハイブリッドベクター
    が、ｐＰＣ８６、ｐＤＢＬｅｕ、ｐＤＢＴｒｐ、ｐＰＣ９７、ｐ２．５、ｐＧＡ
    Ｄ１−３、ｐＧＡＤ１０、ｐＡＣｔ、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤＧＬ、ｐＧＡＤＧＨ
    、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＧＢＴ８、ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ−ＧＡＬ
    ４、ｐＬｅｘＡ、ｐＢＤ−ＧＡＬ４、ｐＨＩＳｉ、ｐＨＩＳｉ−１、ｐｌａｃＺ
    ｉ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＤＧ２０２、ｐＪＫ２０２、ｐＪＧ４−５、ｐＮＬｅｘＡ
    およびにｐＹＥＳＴｒｐまたはその誘導体もしくは改変体からなる群より選択さ
    れる、請求項１５に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記挿入ドナー分子がベクターを含む、請求項１または請
    求項３に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記挿入ドナー分子が増幅により生成されたＤＮＡセグメ
    ントを含む、請求項１または請求項３に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記増幅がＰＣＲである、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記挿入ドナーが直鎖状である、請求項２１に記載の方法
    。
  23. 【請求項２３】 前記挿入ドナーが、前記直鎖状分子の片側または両側の末
    端でまたはその近傍で少なくとも１つの組換え部位を含む、請求項２２に記載の
    方法。
  24. 【請求項２４】 前記組換え部位がｌｏｘＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔ
    Ｌ、およびａｔｔＲからなる群より選択される、請求項１または請求項３に記載
    の方法。
  25. 【請求項２５】 前記組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、Ｒｅ
    ｓからなる群より選択される、請求項１または請求項３に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 ２つ以上の組換え部位またはその部分を含む核酸分子を調
    製する方法であって、以下： （ａ）核酸鋳型と、ポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、および１つ以上
    の組換え部位またはその部分を含む１つ以上のプライマーとを混合する工程；な
    らびに、 （ｂ）全てまたは一部の該鋳型に相補的であり、かつ１つ以上の組換え部位ま
    たはその部分を含む核酸分子を合成するのに十分な条件下で該混合物をインキュ
    ベートする工程、 を包含する、方法。
  27. 【請求項２７】 請求項２６に記載の方法であって、前記第１の核酸分子の
    全てまたは一部と相補的な第２の核酸分子を合成するのに十分な条件下で、１つ
    以上の組換え部位またはその部分を含む１つ以上のプライマーの存在下において
    、前記合成された分子をインキュベートする工程であって、これによって２つ以
    上の組換え部位またはその部分を含有する２本鎖核酸分子を生成する工程をさら
    に包含する、方法。
  28. 【請求項２８】 前記組換え部位またはその部分が、前記合成された二本鎖
    核酸分子の１つ以上の末端またはその近傍に位置する、請求項２７に記載の方法
    。
  29. 【請求項２９】 前記鋳型がＲＮＡまたはＤＮＡである請求項２７に記載の
    方法。
  30. 【請求項３０】 前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡまたはポリＡ ＲＮＡ分子である
    、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記ポリペプチドが、逆転写酵素またはＤＮＡポリメラー
    ゼからなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記ＤＮＡポリメラーゼが耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであ
    る、請求項３１に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 請求項３２に記載の方法であって、前記耐熱性ＤＮＡポリ
    メラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリ
    メラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ
    、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラー
    ゼ、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、
    Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶＥＮＴ（登録
    商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆ
    ｕまたはＤＥＥＰＶＥＮＴ（登録商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃ
    ｃｕｓ ｗｏｏｓｉｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔ
    ｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌ
    ｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈ
    ｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ
    、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈ
    ｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒ
    ｏｃｋｉａｎｕｓ（ＤＹＮＡＺＹＭＥ（登録商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅ
    ｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍ
    ｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、改変体および誘導体から
    なる群より選択される、方法。
  34. 【請求項３４】 前記第１のおよび第２の核酸分子を増幅する工程をさらに
    包含する、請求項２７に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 請求項３４に記載の方法であって、ここで前記増幅は以下
    の工程： （ａ）前記第１の核酸分子と、該第１の核酸分子の一部と相補的である第１の
    プライマーとを、および第２の核酸分子と、該第２の核酸分子の一部と相補的で
    ある第２のプライマーとを、ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドとともに接
    触させる工程； （ｂ）該第１の核酸分子の全てまたは一部に相補的な第３の核酸分子を形成し
    、かつ該第２の核酸分子の全てまたは一部に相補的な第４の核酸分子を形成する
    のに十分な条件下で、前記混合物をインキュベートする工程； （ｃ）該第１および第３、ならびに該第２および第４の核酸分子を変性する工
    程；ならびに （ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）を１回以上繰り返す工程を包含する方法であって、
    ここで該第１のプライマーおよび／または該第２のプライマーが、１つ以上の組
    換え部位またはその部分を含む方法、 により達成される、方法。
  36. 【請求項３６】 核酸分子を増幅する方法であって、以下の工程： （ａ）第１の核酸分子と、該第１の核酸分子の一部と相補的である第１プライ
    マーとを、および第２の核酸分子と、該第２の核酸分子の一部と相補的である第
    ２のプライマーとをポリメラーゼ活性を有するポリペプチドとともに接触させる
    工程； （ｂ）該第１の核酸分子の全てまたは一部に相補的な第３の核酸分子を形成し
    、かつ該第２の核酸分子の全てまたは一部に相補的な第４の核酸分子を形成する
    のに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程； （ｃ）該第１および第３、ならびに該第２および第４の核酸分子を変性する工
    程；ならびに （ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）を１回以上繰り返す工程を包含する方法であって、
    ここで該第１のプライマーおよび／または第２のプライマーが、１つ以上の組換
    え部位またはその部分を含む、方法。
  37. 【請求項３７】 １つ以上のｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子の集団を生成
    する方法であって、以下の工程： （ａ）ＲＮＡ鋳型またはＲＮＡ鋳型の集団と、逆転写酵素および１つ以上のプ
    ライマーとを混合する工程であって、該プライマーは１つ以上の組換え部位また
    はその部分を含む、工程；ならびに （ｂ）該鋳型の全てまたは一部と相補的な第１のＤＮＡ分子を作製するのに十
    分な条件下で該混合物をインキュベートし、これにより１つ以上の組換え部位ま
    たはその部分を含有する第１のＤＮＡ分子を形成する工程、 を包含する、方法。
  38. 【請求項３８】 請求項３７に記載の方法であって、前記第１のＤＮＡ分子
    の全てまたは一部に相補的な第２のＤＮＡ分子を作製するのに十分な条件下で１
    つ以上の組換え部位またはその部分を含む１つ以上のプライマーとともに該第１
    のＤＮＡ分子をインキュベートし、これにより１つ以上の組換え部位またはその
    部分を含む二本鎖ＤＮＡ分子を生成する工程をさらに包含する、方法。
  39. 【請求項３９】 前記二本鎖ＤＮＡ分子が直鎖状である、請求項３８に記載
    の方法。
  40. 【請求項４０】 前記二本鎖ＤＮＡ分子が、該二本鎖ＤＮＡ分子の片側また
    は両側の末端で、またはその近傍で、１つ以上の組換え部位またはその部分を含
    む、請求項３９に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 １つ以上の組換え部位を含む１つ以上の核酸分子を合成す
    る方法であって、以下の工程： （ａ）１つ以上の直鎖状核酸分子を得る工程；および、 （ｂ）該分子を、１つ以上のアダプターを該直鎖状核酸分子の１つ以上の末端
    に添加するのに十分な条件下で、１つ以上の組換え部位またはその部分を含む１
    つ以上の該アダプターと接触させる工程、 を包含する、方法。
  42. 【請求項４２】 前記直鎖状核酸分子がゲノムＤＮＡ由来である、請求項４
    １に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記直鎖状核酸分子がｃＤＮＡ由来である、請求項４１に
    記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記直鎖状核酸分子が機械的または酵素学的技術により生
    成される、請求項４１に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記直鎖状核酸分子が、１つ以上の制限エンドヌクレアー
    ゼを用いて１つ以上の核酸分子を消化することにより生成される、請求項４１に
    記載の方法。
  46. 【請求項４６】 １つ以上の組換え部位またはその部分を１つ以上の核酸分
    子に添加する方法であって、以下の工程： （ａ）１つ以上の核酸分子を、１つ以上の組換え部位またはその部分を含む１
    つ以上の組込み配列と接触させる工程；および、 （ｂ）該組込み配列を該核酸分子に取り込むのに十分な条件下で該混合物をイ
    ンキュベートする工程、 を包含する、方法。
  47. 【請求項４７】 前記組込み配列が、トランスポゾン、組込みウイルス、組
    込みエレメント、インテグロン（ｉｎｔｅｇｒｏｎ）、および組換え配列からな
    る群より選択される、請求項４６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記組込み配列がゲノムＤＮＡに添加される、請求項４７
    に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 請求項１、３、２７、３７、４１、および４６に記載の任
    意の１つのプロセスにより生成される産物。
  50. 【請求項５０】 前記セグメントが化学合成により生成される、請求項１ま
    たは３に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 前記組込み配列がベクターに添加される、請求項４７に記
    載の方法。
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