IT8224948A1 - Virus vaccinico modificato e metodi per la produzione ed uso del medesimo - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

Quest 'invenzione tratta di virus vaccinico modificato, i metodi per la produzione ed uso del medesimo ed altri microrganismi modificati e non modificati, nonch? di certe sequenze del DNA, prodotte o coinvolte in qualit? di intermediari nella produzione di virus vaccinico modificato.?Pi? particolarmente, l'invenzione tratta di virus'vaccinico in cui il genoma naturalmente presente nel virus ? stato alterato (i cosiddetti mutanti vaccinici) e di metodi impiegati nella produzione ed utilizzo di tali mutanti vaccinici, nonch? di altri microrganismi non modificati e geneticamente modificati, e di certe sequenze del DNA, prodotte o coinvolte in qualit? di intermediari nella produzione di mutanti vaccinici.

Il virus vaccinico ? il prototipo del virus della famiglia dei poxvirus che, al pari di altri membri del gruppo dei poxvirus, si distingue dalle sue grandi dimensioni e complessit?.? Il DNA del virus vaccinico ? parimenti grande e complesso.?Ad esempio, il DNA vaccinico ? di misura pari a circa 120 megadalton, contro appena 3,6 megadalton per il-virus SV40 della scimmia. La molecola del DNA vaccinico ? a doppia catena ad avvolgimento elicoidale delle estremit?, sicch? la denaturazione del DNA porta alla formazione d'un anello a catena singola. La mappa fisica del DNA vaccinico ? stata costruita con l?ausilio d'un munero di differenti enzimi detti di restrizione e svariate mappe del genere sono riportate nella monografia di Panicali e coll, pubblicata sul J.?Virol.?37:1000-1010, 1981, che cita l'esistenza di due varianti principali del DNA nel ceppo WR del virus vaccinico (ATCC No. VR 119), vale a dire il ceppo pi? comunemente utilizzato per lo studio e la caratterizzazione dei poxvirus. La differenza tra le due varianti consiste nel fatto che la . variante S ("small, ossia corta) (ATCC No. VR 2034 dep.'18-11-81) possiede una delezione di 6, 3 megadalton che invece manca nel DNA della variante L ("large", ossia lunga) (ATCC No. VR 2035 dep. 18-11-81).-La citata pubblicazione presenta le mappe risultanti dal trattamento di queste varianti con gli enzimi di restrizione tipo Hind III, Ava I, Xho I, Sst I e Sma I.

Il virus vaccinico appartiene al gruppo eucariotico riprodotto per intero entro il citoplasma della cellula ospite.?E' un virus litico, vale a dire un virus la cui replicazione endocellulare porta alla lisi della cellula.'Questo virus ? ritenuto non oncogenico.? Esso ha trovato impiego da circa 200 anni nei vaccini usati per inoculazione contro il vaiolo e nei circoli medici sono ben note le propriet? del virus usato nel vaccino.'Per quanto l'inoculazione con il virus vaccinico comporti un certo rischio, tali rischi sono in linea di massima ben noti e definiti ed il virus stesso ? considerato di natura relativamente benigna.

L'invenzione essenzialmente riguarda la modifica del genoma naturalmente presente nel virus vaccinico al fine di produrre mutanti vaccinici mediante il riassetto del genoma naturale, l'eliminazione del DNA dal genoma, e/o la inserzione nel genoma vaccinico naturale del DNA atto a modificare il genoma naturale ("DNA estraneo"). Il DNA estraneo pu? essere naturalmente presente nel virus vaccinico oppure pu? essere di origine sintetica o anche naturale, ma in un organismo diverso da quello vaccinico. Nella misura in cui il DNA estraneo ? portatore di informazioni genetiche, esiste-,la possibilit? d'introdurre le informazioni stesse in un organismo eucariotico a mezzo del virus vaccinico modificato. In altri termini, il virus modificato rappresenta un vettore relativamente innocuo della clonazione eucariotica susseguente alla soppressione, l'inserzione o il riassetto dell'inforinazione genetica.' Poich? il virus si replica entro il citoplasma della cellula infetta, i.1 virus vaccinico modificato costituisce un singolare vettore di clonificazione eucariotica senza uguali tra quelli studiati nel passal'incirca, pari a circa 10 kbp (kilobasi accoppiate). Poich? i segmenti centrali del DNA sono simili in tutti i poxvirus, mentre quelli terminali differiscono di pi?, appare verosimile che il segmento centrale sia responsabile delle funzioni comuni a tutti i virus, ad esempio la replicazione, mentre i segmenti terminali sarebbero responsabili di altre caratteristiche, ad esempio la patogenicit?, lo spettro d'infettivit? e cos? via. Dovendosi modificare ,un genoma per il riassetto o l'eliminazione di frammenti del DNA o per l'introduzione di frammenti di DNA esogeno con il proposito di arrivare ad un mutante stabile e vitale, ? ovvio che la frazione del -DNA naturale che si voglia riordinare, sopprimere o disgregare mediante l'introduzione del DNA esogeno deve essere non essenziale alla vitalit? e stabilit? dell'organismo ospite, in questo caso il virus vaccinico. Nel ceppo WR del virus vaccinico esistono segmenti non essenziali del genoma, ad esempio nel tratto preservato nella variante L, ma soppresso in quella S, oppure nel frammento Hind III F del genoma.

La modifica del virus vaccinico tramite l'incorporazione di informazioni genetiche esogene trova un esempio nella modifica del ceppo WR del virus stesso nel frammento Hind III F, consistente nella incorpora? cos? il determinante antigenico in vivo.

Un ulteriore vantaggio dei mutanti vaccinici usati quali vettori nelle cellule eucariotiche, come vaccini o per la produzione di composti biologici diversi dagli antigeni, risiede nella possibilit? di modificare dopo il processo di translocazione le proteine risultanti dalla trascrizione dei geni esogeni introdotti nella cellula a mezzo del virus. Tali modifiche post-translocative , ad esempio la glucosilazione delle proteine, sono poco probabili entro un sistema procariotico, essendo invece possibili nelle cellule eucariotiche che dispongono degli enzimi supplementari necessairi per tali modifiche. Un ulteriore vantaggio dei mutanti vaccinici ad uso inoculazione sta nella possibilit? di ampliare la risposta anticorpo incorporando nel mutante coppie replicate del gene per l'antigeno o elementi genetici addizionali atti a stimolare la reazione immunologica, o mediante l'uso di potenti attivatori nel virus modificato. Un simile vantaggio si riscontra nella produzione di sostanze biologiche diverse dall'antigeno.

Riprendendo ora un esame pi? minuzioso del genoma vaccinico, le doppie catene elicoidali del DNA sono caratterizzate da elementi ripetitivi terminali invertiti, ciascuno della lunghezza di 8,6 megadalton al? marne la potenza antigenica. D?altronde, i vaccini derivati da organismi viventi attenuati comportano sempre il rischio che l'organismo attenuato possa riprendere la virulenza patogenetica.?Viceversa,?quando il vaccino consiste d'un mutante del virus vaccinico opportunamente modificato con un gene codificato per il determinante antigenico dell'organismo patogenetico, si evita la possibilit? d'una reversione allo stato patogenetico, in quanto il virus vaccinico contiene solamente il gene codificato per il determinante antigenico dell'organismo morboso e non invece quelle frazioni genetiche dell'organismo che sono responsabili della replicazione del patogeno.

L'invenzione oggetto della presente offre dei vantaggi anche rispetto alla moderna tecnologia basata sull 'ingegneria genetica intesa a produrre l'antigeno a mezzo d'un organismo procariotico recombinante contenente dei plasmidi come espressione d'una proteina antigenica estranea.?A titolo di esempio, una tale tecnologia richiede la produzione di.numerose cellule pr?? cariotiche di ricombinazione seguita dalla purificazione delle risultanti proteine antigeniche. Al contrario, il virus vaccinico modificato ad uso inoculazioni conforme all'invenzione in oggetto si replica nell'individuo inoculato a scopo di immunizzazione, accrescendo to o al momento attuale.??

Una tale scoperta comporta una variet? di conseguenze utili, tra cui (A) metodi innovativi,per la vaccinazione dei mammiferi suscettibili al virus vaccinico per indurre in essi una risposta anticorpale agli antigeni codificati per il DNA estraneo introdotto nel virus vaccinico, (B) metodi innovativi per la produzione tramite le cellule eucariotiche di prodotti biologici diversi dagli antigeni, e (C) metodi innovativi per l'introduzione negli individui o nelle popolazioni umane od animali, di geni mancanti o di materiale genetico atto a modificare, sostituire o riparare i geni difettosi in tali individui o popola? zioni.-I mutanti vaccinici opportunamente modificati come portatori di geni esogeni espressi nellOrganismo ospite sotto forma di fattori antigenici determinanti capaci di stimolare nell'ospite la produzione di anti? corpi verso l'antigeno, costituiscono un nuovo tipo di vaccini esenti dagli incovenienti dei vaccini comuni derivati da organismi uccisi o viventi ma attenuati. Cos? ad esempio la produzione di vaccini da organismi uccisi necessita la crescita di ingenti quantitativi dell'organismo seguita da un trattamento atto a distruggerne elettivamente la capacit? infettiva, senza meno zione entro quel frammento d'un gene del virus herpes simplex tipo I (HSV) responsabile della produzione

di timidina chinasi (TK). La TK ? un enzima atto a

fosforilare la timidina, una sostanza nucleoside, formando il relativo nucleotide mono?fosforilato che di seguito viene incorporato nel DNA.

Il gene HSV TK costituisce il DNA estraneo al virus vaccinico, che secondo l'invenzione attuale ? opportuno introdurre nel virus vaccinico per un numero di motivi. In primo luogo, la disponibilit? del gene ? relativamente elevata nel frammento DNA del virus herpes simplex risultante dalla scissione con l'endonucleasi Barn HI, secondo quanto pubblicato da

Colbere-Garapin e coll, in Proc. Nati. Acad. Sci.

USA 76:3755-3759, 1979. In secondo luogo, ? gi? nota

1 'introduzione di tale frammento del HSV Barn HI in plasmidi e sistemi eucariotici, ad esempio dalle pubblicazioni di Colbere-Garapin e coll., loc. cit. nonch? di Wigler e coll. Celi 1J_:223-232, 1977. In terzo luogo, l'esperienza dimostra che se il HSV TK pu? essere introdotto sotto forma di un gene esogeno in un sistema eucariotico - un 'espressione che richiede precisa e fedelissima traslocazione e trascrizione del locus genetico allora altri geni esogeni possono essere analogamente introdotti ed espressi.

Per miglior comprensione dell'invenzione, si fa riferimento agli acclusi grafici in cui,

La figura 1 ? una mappa delle citate varianti L ed S del ceppo WR vaccinico, determinate con l'ausilio del Hind III come enzima di restrizione, che illustra la delezione delle sequenze nel frammento C terminale della variante L, essendo la delezione al di fuori della zona terminale di ripetizione del genoma. Le sequenze DNA cos? delezionate sono caratteristica esclusiva della struttura L e poich? la crescita delle varianti S ed L (dep. 18-11-81) ? identica, la zona di delezione deve essere non essenziale;

La figura 2 illustra pi? dettagliatamente il frammento Hind III F vaccinico, compresi altri due siti di restrizione, e cio? Sst I e Barn HI, di cui almeno quest'ultimo offre un locus atto all'introduzione del DNA esogeno nel frammento Hind III F vaccinico, senza alcuna interferenza con i geni vaccinici essenziali; le figure 3 A - C illustrano schematicamente un metodo per l'introduzione del gene HSV TK nel frammento Hind III F vaccinico;

la figura 4 costituisce una mappa di restrizione di certi mutanti vaccinici prodotti secondo l'attuale invenzione, dove viene indicata in dettaglio la posizione del HSV TK inserito nel frammento Hind III F in due mutanti del Virus, contraddistinti dalla sigla VP-1 e VP-2 (dep. 18-11-81);

la figura 5 riassume in forma di specchietto certe tecniche utili nella cernita di virus potenzialmente idonei alla ricombina'zione, per determinarne la presenza o l?assenza del gene HSV TK; e

?le figure 6 A - C sono mappe di restrizione del segmento terminale di sinistra del genoma vaccinico WR che illustrano la correlazione entro i vari frammenti di restrizione e la caratteristica sequenza DNA riscontrata nella variante L e soppressa in quella S.

Riferendoci ora alla figura 1, se vogliamo sottoporre le varianti L ed S del virus vaccinico all?azione del Hind III, un ben noto enzima di restrizione gi? disponibile nel mercato, i genomi virali saranno scissi rispettivamente in 15 o in 14 segmenti contrassegnati dalle lettere A sino ad 0, essendo A il frambiento pi? -lungo ed 0 quello pi? corto. La citata pubblicazione di Panicali e coll., J. Virol. 37i1000-1010, 1981, descrive ed illustra la separazione elettroforetica dei frammenti di restrizione. Il frammento F ottenuto in questo modo da una delle varianti L o S possiede un peso molecolare pari a 8,6 megadalton.

L'ubicazione del frammento F ? segnata nella mappa di restrizione presentata in figura 1 allegata alla domanda di brevetto, ?mentre un'altra mappa di restrizione del frammento F ? illustrata nella figura 2. L'enzima di restrizione Hind III riconosce la sequenza nucleotidica -AAGCTT- e scinde il DNA tra i due gruppi adenosinici adiacenti, dando luogo *a frammenti dotati di 'monconi appiccicosi' e la sequenza AGCT-. Poich? i quantitativi del frammento Hind III F vaccinico necessari per le manipolazioni previste dall'attuale invenzione superano quelli convenientemente ottenibili dalla restrizione del genoma vaccinico, il frammento F va inserito in un vettore plasmidico di clonazione ai fini dell'accrescimento.

Pi? precisamente, il frammento vaccinico Hind III F prodotto in questa maniera viene convenientemente introdotto nel plasmide pBR 322 scisso una volta sola da un numero di enzimi di restrizione, compreso quello Hind III. Il plasmide pBR 322 fu descritto per la prima volta da Bolivar e coll, in Gene ??:95-113, 1977, ed ? attualmente disponibile nel mercato statunitense da svariati fornitori.

L'ubicazione del sito di scissione dell'Hind III sul plasmide pBR 322 ? segnata nella figura 3A in rapporto al sito di scissione di altri due enzimi di restrizione, e cio? l'Eco RI ed il Barn HI. Spezzando il plasmide pBR 322 con Hind III e miscelando il risultante DNA scisso con il frammento vaccinico Hind III F per legare poi i frammenti con la ligasi T DNA, come indicato nella figura 3A, il frammento F viene incorporato nel plasmide, dando luogo ad un nuovo plasmide pDF 3, illustrato schematicamente nella figura 3B, avente un peso molecolare pari a circa 11,3 magadalton. Il frammento vaccinico Hind III F comprende circa 13 kilobasi accoppiate, contro 4,5 kbp riscontrate nel segmento pBR 322 del pDP 3. La ligasi DNA ? un enzima disponibile nel mercato e le sue condizioni d'impiego nella modalit? indicata sono ben note agli esperti in materia.

Il plasmide pDP 3 viene ora introdotto in un microrganismo quale la Escherichia coli (E. coli) per mezzo di trasformazione con il proposito di replicare il frammento Hind III F e recuperare un quantitativo maggiore del frammento stesso. Queste tecniche per la scissione d'un plasmide allo scopo di produrre DNA lineare avente terminali legabili, per inserirne poi il DNA esogeno dotato di terminali complementari al fine di formare un replicon (in questo caso il pBR 322 contenente il frammento vaccinico Hind III F) sono gi? note e lo stesso dicasi dell'inserimento del replicon entro un microrganismo a mezzo di trasformazione

(vedi brevetto U.S.A. 4.237.224).

Il plasmide pBR 322 non modificato conferisce resistenza all?ampici-llina (Amp-) nonch? alla tetraciclina (TetR) al proprio microrganismo ospite, in questo caso la E. coli. Tuttavia, poich? il Hind III spezza il plasmide pBR 322 nel gene TetR, l?introduzione del frammento vaccinico Hind III F distrugge il gene R

Tet , perdendosi cos? la resistenza alla tetraciclina. Pertanto, i trasformanti della E. coli contenenti il plasmide pDP 3 si distinguono dalla E. coli non trasformata per la presenza simultanea della resistenza all?ampicillina e suscettibilit? alla tetraciclina. Sono questi batteri E. coli trasformati con pDP 3 che si accrescono grandemente per ricavarne grossi quantitativi del pDP.3.

Le condizioni dell'accrescimento plasmidico nei batteri E. coli sono ben note agli esperti in materia, ad esempio dalla relazione di Clewel pubblicata sulla rivista J. Bacteriol. 110:667-676, 1972. Parimenti ben note sono le tecniche per l?isolamento del plasmide accresciuto dall?ospite batteriano E. coli, come descritte ad esempio da Clewel e coll, nel Proc. Nati. Acad. Sci. USA 62:1159-1166, 1969.

Per analogia, il plasmide pBR 322 si pu? opportunamente scindere per trattamento con l?enzima di restrizione Ban HI, derivandone poi un plasmide modificato mediante l'inserzione d'un frammento Ban HSV TK, come precisato nel citato articolo di Colbere-Garapin e coll., loc. cit. Il plasmide modificato contenente il frammento Barn HI completo di gene HSV TK pu? essere re-introdotto nell'E. coli con tecniche gi? note ed i batteri trasformati possono coltivarsi per accrescere grossi quantitativi del plasmide. In seguito, l'accresciuto plasmide ricombinante Barn HSV TK-pBR 322 si pu? scindere con Barn HI onde isolarne il frammento Barn HI contenente il gene HSV TK con le medesime tecniche gi? note e citate in precedenza in relazione all'accrescimento del frammento vaccinico Hind III F.

Al fine di costruire un plasmide ricombinante avente il frammento Barn HI HSV TK incorporato nel frammento vaccinico Hind III F, il plasmide pDP 3 viene poi esposto ad una restrizione parziale con il Barn Hi, in modo che uno solo dei due siti di scissione Barn HI entro il plasmide sia_scisso, vale a dire o il sito Barn HI entro il frammento Hind III F o il sito Barn HI entro la frazione pBR 322 del plasmide pDP 3, come illustrato nella figura 3B. Il DNA scisso, ora lineare, viene poi combinato con il frammento Barn HSV TK purificato. I segmenti lineari vengono combinati e legati trattandoli con la ligasi T DNA secondo tecniche gi? note.

La combinazione del frammento Barn HSV TK con il plasmide pDP 3 scisso costituisce un avvenimento casuale o un'evenienza statistica potenzialmente atta a produrre numerose specie formate da diverse combinazioni dei frammenti presenti nella miscela, ognuno di essi dotato di identici 'monconi appiccicosi'. Pertanto, una delle possibilit? consiste d'una semplice rigiunzione delle estremit? scisse del plasmide pDP 3 per ricreare l'anello plasmidico.-Un'altra possibilit? consiste della giunzione di due o pi? frammenti

Barn HSV TK in una delle due orientazioni. Inoltre, il frammento Barn HSV TK (od un multiplo) pu? essere combinato con il DNA lineare d'un plasmide pDP 3 scisso al sito Barn HI entro il tratto pBR 322, anch'esso in una delle due orientazioni, oppure uno o pi? frammenti Barn HSV TK si possono combinare in una delle due orientazioni con il DNA lineare del plasmide pDP 3 scisso al sito Barn HI entro quel tratto del plasmide pDP 3 che costituisce il frammento vaccinico Hind III F.

Onde consentire l'identificazione e la separazione di queste varie possibilit?, i prodotti del legame vengono inseriti in un microrganismo monocellulare quale la E. coli con tecniche gi? note e descritte in precedenza. I batteri E. coli trattati in questa maniera vengono poi coltivati su un terreno contenente 1'ampicillina. Se i batteri contengono il plasmide, si mostreranno resistenti all'ampicillina in quanto tutti i plasmidi del genere contengono il gene del pBR 322 atto a conferirne la resistenza all'ampicillina.' Pertanto, i batteri sopravvissuti sono tutti prodotti di trasformazione, idonei ad una cernita ulteriore per determinarne la possibile presenza o assenza del frammento Barn HSV TK.

A tal uopo, i batteri dotati d'un gene TK vanno identificati mediante l'ibridazione con il TK DNA radiomarcato. Ove il gene TK ? presente nei batteri, il TK DNA radiomarcato former? un ibrido con la frazione plasmidica presente nel batterio. Essendo l'ibrido radioattivo, le colonie contenenti il TK plasmidico possono essere saggiate con l'ausilio della autoradiografia. A loro volta, i batteri contenenti il TK possono essere coltivati. Infine, i batteri contenenti i plasmidi dotati del TK incorporato nel tratto pBR 322 possono essere identificati e separati da quelli recanti il frammento TK entro il frammento vaccinico Hind

III F mediante analisi con endonucleasi di restrizione.? Pi? particolarmente, i batteri che sopravvivono alla coltivazione su lastre d'agar nutriente inoculate di ampicillina vengono trasferiti in parte ad un filtro nitrocellulosico per contatto tra il filtro e la lastra. Quei batteri che'permangono sulla lastra vengono ricoltivati mentre quelli trasferiti al filtro nitrocellulosico con il proposito di creare una replica della lastra originale vengono poi soggetti a trattamento atto a denaturarne il DNA.?La denaturazione si compie, ad esempio, trattando i batteri trasferiti con l?idrossido di sodio, al quale fanno seguito la neutralizzazione ed il lavaggio, dopo di che il DNA denaturato presente sul filtro nitrocellulosico viene ibridato mediante trattamento con HSV Barn TK marcato con 32p radioattivo. Dopo tale trattamento, il filtro nitrocellulosico viene esposto su pellicola roentgenografica che si opacizza nelle zone corrispondenti alla ibridazione con il Barn HSV TK radiomarcato. L?impressione roentgenografica sulla pellicola opacizzata viene poi paragonata con la lastra originale e le colonie coltivate su tale lastra originale in corrispondenza alle colonie che hanno dato luogo alle opacit? sulla pellicola vengono identificate quali colonie contenenti un plasmide avente il Barn HSV TK.

Infine, per poter distinguere i batteri contenenti il plasmide il cui gene Barn HSV TK ? stato incorporato nel tratto pBR 322 da quelli in cui il Barn HSV TK ? presente nel frammento plasmidico F, vengono impostate piccole colture batteriche per isolarne poi i plasmidi mediante t?cniche minilitiche gi? note e descritte nella relazione di Holmes e coll.,

Anal.?Bioch. 114:193-197, 1981. I plasmidi vengono in seguito fermentati con l'enzima di restrizione Hind III che spezza l'anello plasmidico nei due punti in cui il frammento F era originariamente congiunto con la catene pBR 322 DNA. Il peso molecolare del prodotto di fermentazione viene poi determinato mediante elettroforesi su gel agarosici, essendo la distanza di migrazione sul gel un indice del peso molecolare.

Qualora il plasmide fermentato contenga nel segmento F il frammento Barn HSV TK o un multiplo, il gel evidenzier? un frammento pBR 322 ed un altro frammento avente un peso molecolare superiore a quello del frammento F per il peso molecolare del segmento 0 dei segmenti Barn HSV TK DNA presenti nel medesimo. Viceversa, quando il Barn HSV TK ? presente nel pBR 322, l'elettroforesi evidenzier? un frammento F del peso molecolare normale in pi? ad un altro frammento superante il pBR 322 per il peso molecolare del frammento o dei frammenti Barn HSV TK inclusi nel medesimo.? 1 batteri modificati con il Barn HSV TK nella frazione plasmidica pBR 322 vengono scartati, lasciando invece quelli modificati nel frammento F del plasmide. Questi ultimi sono i plasmidi usati per 1*incorporamento vaccinico del framment? Barn HSV TK.

Come gi? detto, la combinazione dei,frammenti DNA intesa a rigenerare un plasmide costituisce un avvenimento casuale che pu? sfociare in una variet? di strutture plasmidiche recanti il Barn HSV TK nel frammento F.

Con il proposito di determinare l'rientazione del frammento Barn HSV TK entro il frammento F, nonch? il numero di tali frammenti di Barn HSV TK eventualmente presenti, i plasmidi vengono recuperati da tutte quelle colonie batteriane che risultano dotate del frammento Barn HSV TK nel frammento F del plasmide.

La citata tecnica di mini-lisi viene impiegata a questo proposito. I plasmidi vengono quindi nuovamente assoggettati all'analisi di restrizione, questa volta con l'ausilio dell'enzima di restrizione Sst I di provenienza commerciale. Poich? ogni frammento Barn HSV TK reca un sito di restrizione Sst I e poich? il frammento vaccinico F parimenti reca un unico sito di restrizione Sst I (vedi le rispettive raffigurazioni di tali frammenti nelle figure 3A e 3B), ci ? dato di individuare un numero diverso di frammenti di diverso peso molecolare mediante l'elettroforesi su gel agaro? sico, essendo il numero ed il peso molecolare dei segmenti una funzione dell'orientazione del frammento Barn HSV TK entro il franamento F e del numero dei frammenti Barn TK presenti. L'orientazione del frammento Barn TK entro il frammento F si pu? individuare grazie alla sistemazione asimmetrica del frammento 3am HSV TK in rapporto al relativo sito Sst I (vedi figura 33).

Ad esempio, nel corso degli esperimenti qui discussi fu possibile di individuare sei colonie batteriane, ciascuna recante uno o pi? frammenti Barn HSV TK entro il frammento F del plasmide, tra quelli atti a trasformare l'E. coli. A seguito d'un'analisi di restrizione dei plasmidi batteriani come tracciato in precedenza, due dei plasmidi ricombinanti furono selezionati per ulteriore esame grazie al fatto che i frammenti Barn HSV TK entro il frammento F furono orientati in direzione opposta.

A questo punto conviene precisare che l'introduzione del gene HSV TK nel frammento vaccinico F, come discusso in maggior dettaglio in precedenza, serve semplicemente a titolo di esempio come una di numerose possibili tecniche per modificare il genoma vaccinico con il proposito di arrivare a mutanti vaccinici auspicati. Pertanto, l'introduzione dello stesso gene esogeno in qualche altro tratto del genoma vaccinico, oppure l'introduzi?ne di diverso materiale genetico nel frammento vaccinico F o qualche altro frammento, possono necessitar? la modifica dello schema gi? discusso a titolo di esempio, per 1'identificazione degli organismi ricombinanti.

Ad esempio, quando la variante vaccinica L viene digestionata con Ava I, ne risulta un frammento H situato per intero nella regione di delezione della variante S (vedi figura 6 A e la relativa discussione pi? oltre). Il frammento H contiene siti Barn HI che ne consentono l'introduzione del gene HSV TIC. Tali ricombinanti del frammento H si prestano all'identificazione con le medesime tecniche suggerite per 1'identificazione dei ricombinanti del frammento F-HSV TK.

Infatti, esistono schemi per la costruzione e l 'identificazione dei ricombinanti del frammento F-HSV TK che rappresentano alternative al progetto gi? discusso dettagliatamente a titolo illustrativo. Ad esempio, il sito Barn HI nel pBR 322 si pu? sopprimere scindendo il plasmide con Barn HI e procedendo al trattamento con la polimerasi I del DNA quale 'riempitivo' dei monconi appiccicosi. Questo prodotto viene poi tagliato con Hind III ed il frammento lineare viene trattato con fosfatasi alcalina onde impedire la recircolazione del plasmide a seguito di legatura. Tuttavia, il DNA estraneo ed in particolare il frammento vaccinico F del Hind III si pu? legare al pBR 322 trattato ed il risultante plasmide sar? recircolarizzato. Il trattamento con Barn HI serve semplicemente a scindere il plasmide entro il relativo tratto del frammento vaccinico F. Il trattamento susseguente del prodotto di scissione con la fosfatasi alcalina e legatura con il frammento Barn Hi HSV TK produrr? ricombinanti con un?elevata efficienza, sicch? i ricombinanti potranno assoggettarsi a cernita mediante la scissione con endonucleasi di restrizione e l'elettroforesi sul gel. E? questa una tecnica che.elimina le dispendiose tappe di discriminazione tra i ricombinanti aventi il HSV TK nella frazione pBR 322 o nel frammento F e la ibridazione della colonia.

Riprendendo ora la discussione dei plasmidi prodotti a titolo di esempio nella mutazione vaccinica tramite l'introduzione del HSV TK nel frammento vaccinico F, i due plasmidi ricombinanti scelti per ulteriore investigazione sono illustrati nella figura 3C, essendo identificati come il primo plasmide nuovo pDP 132, recante un frammento Barn HSV TK nel tratto vaccinico Hind III F, ed il secondo plasmide nuovo pDP 137, recante due frammenti Barn HSV TK, uniti testa a coda. Il frammento singolo del Barn HSV TK ? stato incorporato nel pDP .132 in senso opposto a quello in cui i due frammenti Barn TK sono stati.inclusi in tandem nel pDP 137. In altri t?rmini, la regione del gene TK entro il frammento Barn HI codificato per il terminale 5 ' del mRNA prodotto dal gene ? situata tra il sito di scissione ed il pi? vicino dei due siti Barn HI corrispondenti (vedi figura 3B). La trascrizione del gene HSV TK sul frammento Barn TK procede in direzione dal terminale 5' a quello 3', in senso orario nel pDP 132 come indicato nella figura 3C. (vedi Smiley e coll., Virology 102:83-93, 1980). Viceversa, poich? i frammenti del Barn TK inclusi in tandem nel pDP 137 sono stati incorporati in senso inverso, sinch? la trascrizione dei geni HSV TK contenuti in esso proceder? in direzione opposta, vale a dire in un senso antiorario. La direzione in cui il frammento Barn HSV TK ? incluso nel frammento vaccinico Hind III F pu? rivestire una certa importanza caso mai la trascrizione del gene HSV TK fosse attivata da un sito di attivazione entro il frammento F stesso. Tuttavia, tali siti ,di attivazione del HSV esistono entro il frammento Barn HSV TK stesso, tanto che la trascrizione del gene HSV TK pu? verificarsi indipendentemente dalla direzione in cui il frammento Barn HSV TK ed il gene HSV TK siano stati incorporati nel frammento vaccinico Hind III F.

Vengono coltivati in seguito quei trasformanti dell'E. coli contenenti il pDP 132 od il pDP 137, per ricavarne maggiori quantitativi di plasinidi per ulteriore lavorazione. Una volta isolato un quantitativo sufficiente del plasmide DNA, la restrizione enzimatica mediante il Hind III rende un frammento vaccinico Hind III F modificato dotato 'del gene HSV TK. Questo frammento Hind III F modificato viene ora introdotto nel virus vaccinico con metodi originali, descritti in seguito, per produrre l'entit? infettiva.

Per passare in rassegna le cognizioni preesistenti, il vettore attualmente pi? usato per introdurre il DNA esogeno nelle cellule eucariotiche ? il SV 40. Il DNA dello SV40 ? circolare e suscettibile di trattamento come un plasmide. In altri termini, il DNA circolare viene scisso con un enzima di restrizione, indi combinato con il DNA esogeno e legato. Il DNA modificato pu? essere introdotto nelle cellule eucariotiche, ad esempio quelle animali, mediante tecniche standardizzate (vedi Hamer e coll., Nature 281:35-40, 1979). Il DNA ? infettivo e si replicher? nel nucleo cellulare producendo virus di mutazione vitali. Conversamente, il virus vaccinico si replica nel citoplasma della cellula eucariotica. Il DNA purificato di questo virus non ? infettivo e non si presta per se alla produzione di mutanti vaccinici nella cellula per analogia allo SV40. Piuttosto, si deve far ricorso a tecniche innovative basate sulla mutazione di virus vaccinici 'selvaggi' con DNA estraneo, vivo ed entro la cellula.

Una comunicazione inedita dei richiedenti, scritta in collaborazione con Eileen Nakano, descrive la dimostrazione del cosiddetto 'recupero' di marcatura nel virus vaccinico. Stando a queste sperimentazioni, quel tratto della variante L del DNA che ordinariamente manca nella variante S pu? essere reintrodotto ('recuperato') nella variante S in opportune circostanze.1A tal fine, le cellule eucariotiche vengono trattate con la variante S vivente ed infettiva del virus vaccinico insieme con frammenti non infettivi di restrizione della variante L del DNA, costituente il DNA 'estraneo' alla variante S, d'una struttura particolare. Pi? precisamente, quel tratto della variante L del DNA che va recuperato deve essere presente entro una catena DNA avente tratti co-lineari con la catena DNA del frammento S nel quale va introdotto. In altri termini, il DNA estraneo da introdursi nella variante S deve possedere ad ambo le estremit? della catena DNA una regione del DNA che sia l'omologo delle corrispondenti sequenze nella variante S. Tali sequenze omologhe possono essere intese come ?braccia" congiunte alla regione della variante L del DNA che ha da recuperarsi con la Variante S.

Il meccanismo di questa ricombinazione ? complesso e non si ? riusciti sinora a realizzarlo in vitro.

Apparentemente , la ricombinazione della variante L del DNA nella variante S consiste dell'appaiamento di basi omologhe nei segmenti circostanti la zona di delezione della variante S. Con tutta probabilit?, i cross-over cio? gli interscambi da un filamento del DNA ad un altro portano ad una ricombinazione del DNA in vivo, atta a recuperare il tratto soppresso.

Una tale tecnica di ricombinazione in vivo si presta all'introduzione del DNA estraneo che non sia il DNA vaccinico nelle varianti sia S o L del virus vaccinico. Quindi, il frammento modificato Hind III F che incorpora il frammento Barn HSV TK in qualit? di DNA estraneo al virus vaccinico pu? essere introdotto in quest'ultimo trattando le cellule eucariotiche con il frammento F modificato insieme con le varianti L e/o S infettive del virus vaccinico. In tal caso, i tratti del frammento F affiancati al frammento Barn HSV TK fungono da "braccia" come gi? citato, aventi il DNA omologo al DNA presente nelle varianti L o S nelle quali va introdotto il frammento F modificato. Anche qui, per via d'un processo intracellulare in vivo, il cui meccanismo non ? ancora conosciuto nei suoi particolari , il frammento F del HSV TK modificato viene incorporato nelle varianti vacciniche entro la cellula, essendo poi capace di replicazione ed espressione controllata dal virus vaccinico.

Questa tecnica di ricombinazione in vivo trova larga applicazione all'introduzione di altri DNA estranei nel virus vaccinico, offrendo cos? un percorso per cui il genoma vaccinico pu? essere modificato al fine di incorporarne una vasta gamma di materiale genetico estraneo, compreso il DNA estraneo di derivazione vaccinica, quello sintetico o derivato da organismi diversi dal virus vaccinico.

Diversissime cellule possono servire da ospite ai fini della citata ricombinazione in vivo. Tuttavia, l'efficienza della ricombinazione varier? a seconda della cellula ospite. Tra quelle investigate sinora, le cellule epatiche del criceto siriaco neonato

[BHK-21 (Clone 13) (ATCC No.CCLIO)] hanno evidenziato l'efficienza maggiore nei processi di ricombinazione. Comunque, altre cellule comprese le CV?1 (ATCC NO.' CCL70) , una linea di cellule epatiche della scimmia verde, cellule TK umane (linea 143) ed un mutante resistente alla 5'-BUdR derivato dalle cellule di linea umana R970-5, sono anche state infettate in questa maniera per generare dei mutanti vaccinici.

Queste cellule?vanno opportunamente trattate con il virus vaccinico ed il DNA estraneo per l?incorporazione vaccinica mentre per maggior convenienza le cellule si trovano sotto forma di uno strato monomolecolare. Ai fini della ricombinazione in vivo, le cellule si possono assoggettare all?infezione vaccinica, passando poi al trattamento con il DNA estraneo da incorporarsi nelle medesime, oppure possono essere prima messe a contatto con il DNA estraneo, per procedere poi all'infezione vaccinica. Un'ulteriore alternativa consiste nell?esporre le cellule simultaneamente al trattamento vaccinico e di DNA estraneo.

I virus vengono opportunamente posti a contatto con lo strato monomolecolare di cellule in un comune medium liquido, tale come una soluzione salina tamponata al fosfato, una soluzione salina tamponata all'Hepes o la soluzione speciale di Eagle (con o senza aggiunta di siero), ecc.f purch? compatibile con tali cellule e virus.

Opportunamente il DNA estraneo viene usato nel trattamento delle cellule sotto forma di fosfato di calcio precipitato. Tali metodiche per l'introduzione del DNA nelle cellule sono gi? note da descrizioni anteriori di Graham e coll.??, Virology 52:456-467, 1973.? Metodi modificati sono stati pubblicati da Stow e coll.', nel J. Gen. Virol.?33:447-458, 1976 e da Wigler e coll, nel Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76.:1373-1376, 1979.? I trattamenti suggeriti in queste pubblicazioni procedono opportunamente a temperatura ambiente, tuttavia le condizioni di temperatura possono essere variate entro certi limiti compatibili con la vitalit? cellulare, e lo stesso dicasi della durata del trattamento cellulare con il virus e/o il? precipitato del DNA estraneo, risultando in diversi gradi di efficienza nella ricombinazione in vivo. Inoltre, il tasso o il grado di ricombinazione sar? influenzato dalla concentrazione del virus vaccinico infettivo e dal quantitativo del precipitato DNA estraneo che sia impiegato. Gli altri fattori quali l'atmosfera ecc. sono tutti prescelti con il proposito di preservare la vitalit? cellulare. A parte questo, purch? siano presenti i tre costituenti necessari (la cellula, il virus ed il DNA), la ricombinazione in vivo proceder? almeno entro determinati limiti.?La scelta delle condizioni ottimali per il caso particolare ? senz'altro entro le capacit? degli esperti nelle arti microbiologiche.

Completata la fase di ricombinazione, si rende necessario procedere all'identificazione dei virus vaccinici mutati per ricombinazione in vivo, separandoli da quelli non modificati.

I virus vaccinici mutati a mezzo di ricombinazio? ne in vivo del DNA -estraneo possono -essere separati da quelli non modificati con l'alisilio di almeno due metodi, indipendenti dalla natura del DNA estraneo o dalla abilit? del mutante di esprimere un gene qualsiasi presente nel DNA estraneo. Cos?, in primo luogo, il DNA estraneo si pu? individuare nel genoma del mutante mediante analisi per restrizione del genoma, al fine di individuare la presenza d'un pezzo extra del DNA nell'organismo mutato.?In questo metodo, vengono col" tivati virus individuali isolati da piastrine purificate per estrarne il DNA destinato ad analisi per restrizione con l'uso di opportuni enzimi di restrizione.1Individuando il numero dei frammenti ed il relativo peso molecolare, si arriva per deduzione alla struttura del genoma antecedente la restrizione. Tuttavia, si tratta d'un metodo laborioso, dispendioso di tempo ed incerto, data la necessit? di coltivare piastrine purificate, ed il rischio che nonostante le numerose analisi richieste, le piastrine coltivate ed analizzate possano risultare prive di qualsiasi mutante.' Un ulteriore metodo per individuare il DNA estraneo nel virus vaccinico consiste in una modificazione della tecnica esposta da Villarreal e coll, nella rivista Science 196;183-185, 1977. Qui, il virus infettivo viene trasferito da'piastrine virali trovate sullo strato monomolecolare di cellule infette, ad un filtro di nitrocellulosa. Opportunamente si procede a replicare un'immagine speculare del virus trasferito sul filtro nitrocellulosico, ponendo a contatto un altro filtro del genere con quel lato del primo filtro nitrocellulosico sul quale sono stati trasferiti i virus. Una parte dei virus sul primo filtro viene cos? trasferita sul secondo. L'uno o l'altro dei filtri, generalmente il primo, viene ora usato per l'ibridazione.

L'altro filtro viene preservato per recuperarne il virus ricombinante, una volta individuato il relativo locus del compagno replicato sul filtro ad immagine speculare, mediante la tecnica di ibridazione.

Ai fini dell'ibridazione, i virus riscontrati sul filtro nitrocellulosico vengono denaturati con idrossido di sodio mediante tecniche gi? conosciute.?Il materiale genetico cos? denaturato viene ora ibridato con una controparte radiomarcata del gene la cui presenza si cerca di individuare. Ad esempio, per individuare la possibile presenza di mutanti vaccinici aventi il frammento Barn HSV TK, viene impiegato il corrispondente frammento del Barn HSV TK marcato con P, per analogia al metodo gi? discusso in rapporto all'individuazione di plasmidi modificati causa la presenza di questo,frammento. Il DNA non ibridato viene rimosso per lavaggio dal filtro di nitrocellulosa ed il rimanente DNA ibridato, che ? radioattivo, viene localizzato mediante autoradiografia, vale a dire ponendo zi filtro a contatto con una pellicola radiografica.

Una volta identificati i virus mutati, si procede ad individuare le corrispondenti piastrine virali sul secondo filtro, quello che contiene l'immagine speculare dei virus trasferiti sul primo filtro, allo scopo di coltivazione e replicazione di virus mutati.'

I due metodi appena descritti comportano l'analisi genotipica dell'organismo in questione e, come gi? detto, si possono usare indipendentemente dall'eventuale espressione del gene presente nel DNA estraneo incorporato nel virus vaccinico. Tuttavia, trovandosi espresso il DNA estraneo, si pu? ricorrere all'analisi fenotipica per individuare i mutanti.

Ad esempio, se il gene si manifesta attraverso la produzione d'una proteina avente un anticorpo relativo, i mutanti si possono individuare con metodi basati sulla formazione di complessi antigene-anticorpi (vedi Bieberfeld e coll.1, J.?Immunol. Methods 6x 249-259, 1975). Vale a dire, le piastrine virali contenenti i.presunti mutanti vengono trattate con 1'anticorpo attivo contro la proteina prodotta da genotipo vaccinico del mutante. L'eccesso di anticorpi viene tolto dalle piastrine per lavaggio, dopo di che queste ultime vengono trattate con proteina A radiomarcata con 125I. La proteina A ? atta a formare legami con le catene pesanti degli anticorpi, costituendo cos? una radiomarc atura specifica del compl?sso antigene-an,ticorpo residuato sullo strato monomolecolare della cellula.?Una volta eliminata l'eccessiva proteina A radioattiva, gli strati monomolecolari vengono di nuovo trasferiti dalle piastrine ai filtri nitrocellulosici a scopo di autoradiografia, per individuarne la presenza di complessi radiomarcati immuni. Questo metodo serve all'identificazione dei virus vaccinici di mutazione, atti a produrre le proteine antigeniche.

Nel caso particolare del DNA estraneo corredato d'un gene HSV TK, una volta accertato che il virus vaccinico di mutazione esprime il proprio gene HSV TK, esiste un metodo molto pi? semplice ed elegante per individuare la presenza del gene. Infatti, la facilit? di distinguere tra i mutanti vaccinici recanti il gene HSV TK ed il virus vaccinico non modificato ed esente dal gene stesso, costituisce un mezzo potente per distinguere i mutanti del virus vaccinico contenenti altri geni esogeni presenti sia da soli nel genoma vaccinico o in combinazione con il gene HSV TK.' Questi metodi saranno descritti in maggior dettaglio pi? oltre.

Poich? le cellule eucariotiche posseggono il proprio gene TK, cos? come il virus vacc?nico possiede il suo gene TK (utilizzato come gi? detto in precedenza per l'incorporazione della timidina nel DNA), si rende necessario trovare qualche modo per distinguere la presenza e l'espressione di questi geni dalla presenza e l'espressione del gene HSV TK nei mutanti vaccinici che sono oggetto di questa discussione. A tal fine ci si serve del fatto che il gene HSV TK ? capace di fosforilare la deossicitidina alogenata, pi? specificatamente la iododeossicitidina (IDC), un nucleoside, ma n? il gene vaccinico TK n? il gene TK cellulare posseggono quest'azione fosforilante.-Quando l'IDC viene incorporato nel DNA cellulare, diventa insolubile. Viceversa, l'IDC non incorporato si elutria agevolmente dalle colture cellulari con un mezzo acquoso, ad esempio una soluzione tampone fisiologica. Avvantaggiandosi di questi fatti, si procede come segue per individuare l'espressione del gene HSV TK nei mutanti vaccinici.

Gli strati cellulari mononucleari vengono infettati con virus di mutazione in condizioni atte a stimolare la formazione delle piastrine, attivando la erescita cellulare e l? replicazione virale. Le cellule infettate vengono poi trattate con l'IDC radiomarcato di provenienza commerciale (IDC*), marcato agevolmente con I. Purch? le cellule siano state infette con il virus contenente il gene HSV TK, e purch? il gene stesso ne sia espresso, la cellula prov eder? ad incorporare l'IDC* nel proprio DNA. Lavando ora.lo strato cellulare monomolecolare con la soluzione fisiologica tampone, l'IDC* non incorporato verr? eliminato per eluzione. Se gli strati cellulari monomolecolari vengono in seguito trasferiti ad un filtro nitrocellulosico ed esposti su una pellicola roentgen, la pellicola risulter? opacizzata in corrispondenza dell'IDC* presente nelle piastrine, a dimostrazione del gene HSV TK espresso dai mutanti vaccinici.

Servendosi delle citate analisi genotipiche e fenotipiche, i richiedenti sono riusciti ad identificare due mutanti vaccinici denominati VP-1 e VP-2.?Il mutante VP?1 (ATCC No. VR 2032 dep. 18-11-81) ? un virus viccinico ricombinante derivato dalla variante vaccinica S modificata mediante ricombinazione in vivo

con il plasmide pDP 13?2. Il mutante VP-2 (ATCC No.

VR 2030 dep. 18-1181) ? la variante S del virus vaccinico, modificato per ricombinazione con il plasmide pDP 137.

La figura 4A costituisce una mappa Hind III di restrizione del genoma vaccinico, indicante il sito d'inserimento del gene HSV TK. Le figure 4B e 4C illustrano su scala ingrandita il frammento Hind III F contenuto, rispettivamente, nei mutanti VF-1 e VP-2, per indicarne 1'orientamento del frammento Barn HI HSV TK. L'attenzione viene richiamata al fatto che la ricombinazione in vivo del pDP 137 con la variante S

(cio? VP-2) opera a sopprimere uno dei frammenti

Barn HI HSV TK presenti in coppia tandem nel plasmide d'origine.-Come gi? menzionato in precedenza, il fatto che il gene HSV TK sia espresso pu? servire alla rapida ed agevole individuazione ed identificazione dei mutanti con o senza il gene HSV TK, o d'un gene estraneo che sia presente da solo o in associazione con il gene HSV. La prova con le relative basi teoriche ? descritta in seguito.

I richiedenti sono riusciti ad isolare in forma biologicamente pura un mutante vaccinico, e pi? precisamente una variante S, esente da qualsiasi gene TK funzionale di origine naturale, che ? stato denominato VTK-79 (ATC-C NO.?VR 2031 dep. 18-11-81). Di regola, le varianti S ed L discusse in precedenza portano un gene TK nel frammento Hind III J. Ove,il .mutante in parola, privo di attivit? del gene vaccinico TK, viene impiegato nella produzione di altri organismi di mutazione dotati del gene HSV TK, incorporato nel mutante vaccinico con i metodi gi? descritti, il gene HSV TK presente in tali mutanti sar? l?unico gene funzionale TK presente nel virus/ -La presenza o l'assenza di tale gene HSV TK si individua agevolmente coltivando le cellule infette dai virus su uno dei vari nutrienti di elezione.

Uno dei nutrienti d'elezione contiene la bromodeossiuridina (BUdR), un nucleoside analogo alla timidina per? ad elevato potere mutagenico e tossico all'organismo, come quello cellulare o virale, se presente nel DNA incorporato nel medesimo.?Un tale medium nutriente ? stato descritto da Kit e coll., Exp/ Celi Res/ 31:297-312, 1963/ Altri medium d'elezione sono l'ipoxantina/aminopterina/timidina (HAT), il medium di Littlefield, Proc/ Nati. Acad. Sci. USA

50:568-573, 1963 e le relative varianti come il MTAGG descritto da Davis e coll., J. Virol/ 13:140-145, 1974 od un'altra variante del MTAGG descritta da Campione-Piccardo e coll, nel J. Virol. 3l_:281-287, 1979. Questi nutrienti sono tutti elettivamente capaci di distinguere tra organismi contenenti un gene TK espresso e quelli non contenenti alcun gene TK espresso.

L'azione elettiva del medium ? relazionata ai fattori descritti in seguito.

Esistono due percorsi metabolici per la fosforilazione della timidina. Quello principale ? indipendente dalla timidina chinasi e mentre sintetizza la timidina fosforilata per mezzo di meccanismi intermedi, non ? capace di fosforilare il BUdR n? di fosforilare direttamente la timidina. Il secondo percorso metabolico si basa sull'azione della timidina chinasi e porta alla fosforilazione tanto della timidina come del relativo analogo, BUdR.?Poich? il BUdR ? una sostanza tossica di elevato potere mutagenico, la presenza del TK, ad esempio il HSV TK in parola, entro l'organismo porter? alla fosforilazione del BUdR e la sua incorporazione nel DNA dell'organismo vivente risulter? nella morte di quest'ultimo. Al contrario, se il gene TK manca o non ? espresso ed il susseguente percorso metabolico primario porta alla sintesi della timidina fosforilata, ma non alla fosforilazione del BUdR, allora l'organismo metabolizzante potr? sopravvivere in presenza del BUdR, poich? quest'ultimo non viene incorporato nel relativo DNA.'

Il vario comportamento nella crescita qui esposto viene riassunto nella figura 5 riprodotta in allegato, che riporta il relativo comportamento e cio? gli organismi in cui il 'TK va espresso * (TK<+>) e quelli privi o non esprimenti il gene TK (TK ) su un mezzo di coltura normale, o su uno elettivo quale il HAT che blocca il percorso metabolico primario in assenza del TK, o ancora su uno contenente il BUdR. Gli organismi TK+ e TK~ cresceranno ambedue in un nutriente normale per via del percorso metabolico primario indipendente dal TK. In un nutriente elettivo quale il HAT che blocca il percorso metabolico primario indi? pendentemente dal TK, l'organismo TK cionondimeno seguit? la propria crescita in quanto l'enzima prow e? der? alla fosforilazione richiesta affinch? la timidina sia incorporata nel DNA/ Viceversa, l'organismo TK non potr? sopravvivere.?Conversamente, trattandosi di organismi coltivati su un mezzo nutriente che contiene il BUdR, le varianti TK+ non sopravvivono, dato che il TK attua la fosforilazione del BUdR, e questa sostanza tossica viene quindi incorporata nel DNA..Per contrasto, poich? il BUdR non ? fosforilato tramite il percorso metabolico primario, la variante TK? potr? accrescersi in quanto il BUdR non viene incorporato nel DNA.

Pertanto, se un virus vaccinico privo del TK vaccinico, come ad esempio il VTK 79? viene impiegato per inserirvi il gene HSV TK secondo le tecniche esposte in questa invenzione, riesce agevole determinare la presenza e l'espressione, o l?assenza del gene

HSV TK, coltivando semplicemente i ricombinanti in un medium elettivo quale l'HAT.Il virus di mutazione potranno sopravvivere poich? utilizzano il gene HSV TK per sintetizzare il DNA.

Difatti, i richiedenti sono riusciti a preparare svariati mutanti del virus vaccinico privi del TK vaccinico, denominati VP-3 (ATCC No. VR 2036 dep.'18-11-81), che ? un r ricombinante del VTK 79 e del pDP 132, e

VP-4 (ATCC No. VR 2033 dep. 18-11-81), che ? un ricombinante del VTK~ 79 e del pDO 137. Quest'ultimo esprime il gene HSV di agevole identificazione con l'ausilio dei medium elettivi gi? menzionati.1

Altri due virus di ricombinazione, denominati il VP?5 (ATCC No. VR 2028 dep.-18-11-81) ed il VP-6

(ATCC No.?VR 2029 dep.?18-11-81) sono rispettivamente i ricombinanti del pDP 132 e pDP 137 con il VTK**11 (ATCC No. VR 2027 dep. 18-11-81), che ? una nota variante L vaccinica incapace di esprimere il gene TK vaccinico, sicch? consente l'introduzione del DNA eccedente la lunghezza massima del genoma vaccinico.

Le tecniche esposte in quest'invenzione si prestano all'introduzione del gene HSV TK in pezzi diversi del genoma vaccinico al fine di identificare i tratti non essenziali del genoma stesso, in altri termini, ove il gene HSV TIC si pu? inserire nel genoma vaccinico, cos? come si inserisce nel frammento Hind III F, quella regione del genoma che ha subito l'introduzione ? evidentemente non essenziale. Ogni sito non essenziale entro il genoma ? un candidato verosimile per l'inserzione del gene esogeno, di modo che i metodi esposti nella presente invenzione sono utili al fine di costruire le mappe di tali siti non essenziali entro il genoma vaccinico.

Inoltre, se il gene HSV TK viene accoppiato con un altro gene esogeno ed il risultante materiale DNA di combinazione viene introdotto in un virus vaccinico esente del gene TK vaccinico, ad esempio il VTK 79, i ricombinanti che si formano e che contengono il gene estraneo esprimeranno il gene HSV TK e si possono agevolmente separare dalle varianti TK-*con la tecnica di cernita ora descritta.

Un'altra realizzazione di quest'invenzione riguarda la preparazione d'un frammento vaccinico Hind III F avente un gene esogeno, nonch? il trattamento delle cellule con tale frammento insieme con un mutante vaccinico incapace di esprimere il gene vaccinico TK, ma recante il gene HSV TK incorporato tramite ricombinazione in vivo, secondo le tecniche esposte nell'attuale invenzione.?Al pari del gi? discusso recupero di marcatura e delle tecniche utilizzate per l'incorporazione del frammento TK modificato di Hind III F nel virus vaccinico, si possono verificare 'cros-over' e ricombinazioni onde produrre un altro mutante in cui il frammento F modificato dal HSV TK viene sostituito da un frammento F avente un altro gene esogeno. Il risultante mutante vaccinico, in cui il frammento HSV TK F sia stato sostituito da un frammento F recante il gene esogeno, sar? completamente privo di TK, mentre il virus predominante, quello d'origine non mutato, sar? sempre il HSV TK+.?Analogamente, un gene estraneo pu? risultare inserito nel gene HSV TK presente in tale mutante vaccinico, sconvolgendo l'integrit? del gene e volgendo l'organismo ricombinante in TK?, al contrario del genitore non mutato che permane TK .?In ambo i casi, ? facile distinguere tra i mutanti vaccinici dotati del gene estraneo e quelli privi di qualsiasi TK, coltivandoli su terreno BUdR e/o nutrienti speciali quali l'HAT.

La comprensione dell'invenzione e dei suoi molteplici vantaggi potr? giovarsi di esempi specifici, citati qui a titolo illustrativo. Salvo indicazione contraria, le percentuali s'intendono rapportate al peso.'

Esempio I - Isolamento dei frammenti vaccinici Hind III su gelatina agarosica

L'endonucleasi Hind III di restrizione fu acquistata presso la soc.?Boehringer Mannheim.?La preparazione fermentativa del DNA fu compiuta in 0,6 mi di soluzione tampone Hind III avente un contenuto minimolare di 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2? 14 mM ditiotreitolo (DTT) e 10 mcg/ml di sieroalbumina bovina BSA, contenente 10-20 yig di DNA vaccinico e 20-40 unit? di Hind III (un'unit? corrisponde al quantitativo di enzima sufficiente a scindere 1 yig di X -DNA completamente nel giro di 30 minuti).?

Il DNA Vaccinico fu estratto e purificato dalle particelle virali (viri?ni) come segue. I virioni purificati furono disintegrati ad una concentrazione pari ad una densit? ottica di 50 per mi, determinata , a 260 nanometri (A260) 10 m d Tris?HC1 (PH 7,8), 50 mM ??mercaptoetanolo, 100 mM NaCl, 10 mM Na^EDTA, 1% Sarkosyl NL-97 e 26% di saccaroso. La proteinasi K fu aggiunta a 100 pg/ml ed il prodotto di lisi fu incubato per una notte a 37?C. Il DNA fu estratto con l'aggiunta dello stesso volume di fenolo-cloroformio nel rapporto di 1:1. Fu tolta la fase'organica procedendo alla ri-estrazione della fase acquosa fino ad ottenere una superficie di separazione limpida.?Seguirono altre due estrazioni al cloroformio dopo di che la fase acquosa fu dializzata a fondo contro 10 mM di Tris-HCl (pH 7,4) contenente 0,1 mM di Na3 EDTA a 4?C. Il DNA fu concentrato a circa 100 p.g/ml con Ficoll, un copolimero di sintesi ad elevato peso molecolare di saccaroso e di epicloroidrina.

La fermentazione del DNA procedette per 4 h a 37?C, poi, per arrestare la reazione, fu riscaldato a 65?C per 10 minuti, aggiungendovi poi una soluzione acquosa atta ad arrestare la reazione, consistente di agaroso 2,5%, glicerina 40%, dodecil solfato sodico 5% (SDS) e violetto bromofenolo 0,25% (BPB). I campioni furono applicati a strati su gelatina agarosica a 65?C e lasciati indurire prima di procedere all'elettroforesi.

L'elettroforesi fu eseguita su gelatina agarosica al 0,8% (0,3 x 14,5 x 30 cm) in soluzione tampone per elettroforesi contenente 36 mM Tris-HCl (pH 7,8),

30 mM NaH2PO4 e 1 mM EDTA. Si fece l'elettroforesi a 4?C per 42 h a 50 V. Le gelatine furono colorate con bromuro etidico (1 jzg/ml in soluzione tampone per elettroforesi) . I frammenti di restrizione furono visualizzati con luce ultravioletta (UV) per individuare frammenti da tagliare dalla gelatina.

Per separare i frammenti dalla gelatina agarosica ci si serv? del procedimento di Vogelstein e coll., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 7_6:615-519, 1979 utilizzando pulviscolo vitreo come segue. La gelatina agarosica contenente il frammento del DNA fu sciolta in 2,0 mi d'una soluzione acquosa satura di Nal. Si aggiunsero 10 mg di polvere vitrea per ogni ]*g di DNA presente secondo i calcoli. La soluzione fu agitata per una notte a 25?C per legare il DNA alla polvere vitrea ed 11 DNA cos? legato alla polvere fu raccolto mediante centrifugazione a 2000 giri/min per 5 minuti.?La miscela DNA-vetro fu indi lavata con 5 mi di Nal al 70% e raccolta nuovamente per centrifugazione, per lavaggio con una miscela di soluzione tampone al 50% [20 mM Tris-HCl (pH 7,2), 200 mM NaCl, 2 mM EDTA] ed etanolo al 50%. La miscela DNA-vetro fu nuovamente raccolta mediante centrifugazione e sospesa con cura in 0,5 mi di 20 mM Tris HC1 (pH 7,2), 200 mM NaCl e 2 mM EDTA.

Il DNA fu quindi tolto per eluzione dalla polvere vitrea a 37?C.mediante incubazione per 30 minuti. Il vetro fu estratto centrifugando a 10,000 giri/min per 15 minuti. Il DNA fu recuperato dal residuo mediante precipitazione etanolica, e fu sciolto in 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) contenente 1 mM EDTA.?

Il frammento F isolato in questa maniera fu impiegato negli esempi esposti in seguito.

Esempio II - Inserimento del frammento vaccinico

Hind III F nel sito Hind III del pBR 322 (costruzione del pDP 3 fplasmide ricombinante pBR 322 del frammento vaccinico Hind III F])

Il frammento vaccinico Hind III F fu isolato dalla gelatina agarosica di preparazione come esposto nell?Esempio I. Questo frammento fu poi inserito al sito Hind III del pBR 322 (Bolivar e coll...Gene, 2:95-113, 1977) come segue.

Circa 200 nanogrammi (ng) di pBR 322 furono scissi con Hind III in 10 mM Tris-HCl (pH 7,6). 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2 e 14 mM DTT (soluzione tampone Hind III) utilizzando 1 unit? d'enzima per 1 h a 37?C. La reazione fu arrestata riscaldando a 65?C per 10 minuti.-500 ng del frammento vaccinico Hind III F isolato furono aggiunti ed il DNA fu co-precipitato con 2 volumi di etanolo a -70?C per 30 minuti,-Il DNA fu poi lavato con etanolo acquoso al 70% , essiccato e ri-sospeso nella soluzione tampone di legatura consistente di 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT ed 1 mM di adenosina trifosfato (ATP). Circa 100 unit? di T DNA legasi (New England Biolabs) furono poi aggiunte e la miscela fu incubata a 10?C per una notte. Il DNA trattato con la legasi fu quindi impiegato per la trasformazione dell'E. coli HB101 (Boyer e coll.?, J. Mol.>Biol.'41,:459-472, 1969)

Esempio III - Trasformazione di E. Coli e selezione di plasmidi ricombinanti

Le cellule competenti furono preparate e trasformate con i plasmidi secondo il procedimento descritto da Dagert e coll.?, Gene 6:23-28, 1979.?Le cellule di E/ coli HB101 furono rese competenti inoculando 50 mi del brodo LB (bact?triptona 1%, estratto bacto-lievito 0,5% e NaCl 0,5% supplementato con 0,2% di glucosio) con 0,3 mi d?una coltura di cellule incubate per una notte e coltivate a 37?C quanto necessario per registrare una densit? ottica (estinzione) di 0,2 a 650 nanometri (A650) sullo spettrofotometro.?Quindi, le cellule furono refrigerate su ghiaccio per 10 minuti, centrifugate per formare pallottole, sospese nuovamente in 20 mi di CaCl2 decimolare (0,1 M) raffreddato ed incubate su ghiaccio per 20 minuti. Le cellule furono quindi compresse in pallottole e sospese nuovamente in 0,5 mi di 0,1 M CaClg raffreddato e lasciate per 24 h a 4?C. Le cellule furono trasformate aggiungendo DNA legato (o,2-0,5 mg in 0,01-0,02 mi di soluzione tampone di legatura) a 0,1 mi di cellule competenti. Queste ultime furono poi incubate su ghiaccio per 10 minuti e a 37?C per 5 minuti. Si aggiunsero-quindi 2,0 mi di brodo LB e le cellule furono incubate a 37?C per 1 h, agitando. Aliquote di 10 o 100 microlitri (??) furono poi spalmate'su lastre di agar LB contenente ampicillina (Amp) in concentrazione pari a 100 pg/ml.

Si procedette quindi alla cernita dei batteri di trasformazione per individuare i plasmidi ricombinanti, trasferendo le colonie resistenti all1ampieillina (Amp ) su terreno agar LB contenente tetraciclina (Tet) in concentrazione pari a 15 pg/ml. Quelle colonie che risultarono resistenti all?ampicillina (Amp<R>) ma sensibili alla tetraciclina (Tet ) (circa 1%) furono saggiate per frammenti vaccinici intatti di Hind III F inseriti nel pBR 322 secondo il procedimento suggerito da Holmes e coll., Anal. Bioch. 114?193-197, 1981.

?Colture di 2,0 mi di E_. coli di trasformazione furono coltivate per una notte a 3730. I batteri furono centrifugati per formarne pallottole, sospesi nuovamente in 105 ?l d'una soluzione di saccaroso 8%, Triton

X-100 5%, 50 mM EDTA e 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) al che segui l'aggiunta di 7,5 ?l d'una soluzione appositamente preparata di lisozima (worthington Biochemicals) [10 mg/ml in 50 mM Tris-HCl (pH 8,0)]. I lisati furono immessi per 1 minuto in un bagno d'acqua bollente, e quindi centrifugati per 15 minuti a 10,000 giri/min.? Il residuo fu estratto ed il plasmide DNA precipitato con l'identico volume di isopropanolo. I plasmidi furono nuovamente sospesi in 40 ?? di soluzione tampone Hind III e fermentati con 1 unit? di Hind III per 2 h. I pr?-4ot-ti-di digestione enzimatica furono poi analizzati su una gelatina agarosica all'1% uso analisi per individuare gli opportuni frammenti Hind III F. Uno di

tali" plasmidi di ricombinazione, avente un frammento Hind III F intatto, denominato il pDP 3, fu utilizzato per ulteriore modificazione (vedi figura 3B).?

Esempio IV - Isolamento preparativo di pDP 3

L'isolamento e la purificazione su larga scala

del plasmide DNA fu attuato adattando il procedimento di Clewel e coll., Proc. Nati.?Acad. Sci/ USA 62:1159-1166, 1969.? 500 mi di brodo LB furono inoculati con 1,0 mi di batteri E. coli HB 101 coltivati per una notte e contenenti il pDP 3. Raggiunta la densit? ottica di circa 0,6 ad A6? , si aggiunse 100 pg/ml di cloramfenicolo onde accrescere la produzione plasmidica (Clewel, J. Bacteriol. 110:667-676, 1972). I batteri furono incubati a 37?C per altre 12-16 ore, quindi raccolti per centrifugazione a 5.000 giri per 5 minuti, lavati una volta in 100 mi di soluzione tampone TEN [0,1 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl e 10 mM EDTA], raccolti per centrifugazione e sospesi nuovamente in 14 mi d?una soluzione di saccaroso al 25% in 0,05 M Tris-HCl

(pH 8,0).?4,0 mi di soluzione di lisozima [5 mg/ml in 0,25 M Tris-HCl (pH 8,0)] furono aggiunti e la miscela fu incubata a temperatura ambiente per 30 minuti, prima di aggiungervi 4.,0 ml di 0,25 M EDTA (pH 8,0), La miscela fu quindi posta su ghiaccio per 10 minuti. 2,0 ml di RNasi pancreatica A (sigma Chemical Co.) [1 mg/ml in 0,25 M Tris-HCl (pH 8,0)] furono aggiunti a tale miscela che venne poi incubata a temperatura ambiente per 1 minuto. Le cellule furono quindi soggette a lisi per l?aggiunta di 26 mi d'una soluzione litica al Tritone [Triton x-100 1%, 0,05 M EDTA, 0,05 M Tris-HCl (pH 8,0)]. La miscela fu incubata a temperatura ambiente per 30-60 minuti ed il lisato fu elarificato per centrifugazione a 17.000 giri per 30 minuti a 4?C. si estrasse poi il residuo e si procedette a separare il plasmide DNA dal DNA cromosomico su gradazioni di colorante CsCl galleggiante.

A tal fine si prepararono gradazioni di bromuro CsCl etidico, sciogliendo 22 g di CsCl in 23,7 ml di lisato chiarificato. Alla soluzione furono aggiunti 1,125 ml di bromuro etidico acquoso (10 mg/ml). La miscela fu quindi centrifugata in tubetti poliallomerici in un miscelatore Beckman 60 Ti a 44.000 giri/min per 48-72 h. I risultanti filamenti DNA nelle gradazioni furono visualizzati sotto luce ultravioletta ed il filamento inferiore, corrispondente al plasmide DNA a chiusura covalente, fu tolto perforando il tubetto con un ago calibro 18 connesso ad una siringa. Il bromuro etidico fu estratto dal plasmide mediante ripetuta estrazione con il doppio volume di cloroformioalcool isoamilico nel rapporto di 24:1. Si procedette quindi ad una dialisi a fondo dei plasmidi contro 10 mM di Tris-HCl (pH 7,4) contenente 0,1 mM EDTA per eliminare il CsCl. Il plasmide DNA fu poi concentrato per precipitazione etanolica.

Esempio V - Costruzione di plasmidi ricombinanti di pBR 322/virus herpes vaccinici TK

Le figure 3B e 3C riassumono le fasi coinvolte nella costruzione dei plasmidi ricombinanti utilizzati per 1'inserimento del frammento Barn HSV TK nelle varianti vacciniche S o L.

Circa 15 pg di pDP 3 a chiusura covalente furono scissi mediante fermentazione parziale con Barn HI (Bethesda Research Laboratories) cio? 1'incubazione in una soluzione tampone Barn HI, consistente di 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 7 mM MgCl2, 100 mM NaCl e 2 mM di ?-mercaptoetanolo , utilizzando 7 unit? di Barn HI per 10 minuti a 37?C. Poich? sia il pBR 322 che il frammento vaccinico Hind III F contengono un sito Barn HI, la scissione parziale risulta in una miscela di plasmidi lineari interrotti in corrispondenza al sito pBR 322 o quello del Barn HI vaccinico. Questi plasmidi lineari miscelati furono poi separati dai frammenti del pDF 3 tagliati ai due siti pBR 322 e quello Barn HI vaccinico per mezzo di elettroforesi su gelatina agarosica ed i plasmidi lineari ? taglio singolo furono isolati con il metodo della polvere vitrea descritto nell?esempio I.

Un pBR 322 ricombinante dotato del frammento HSV Barn HI di 2,3 megadalton (md) codificato per HSV TK, come esposto da Colbere?Garapin e coll., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76_:3755-3759, 1979, fu portato a digestione completa con Barn HI ed il frammento Barn TK di 2,3 megadalton fu isolato dal terreno agarosico come descritto in precedenza.

I plasmidi ricombinanti pDP 3 Barn TK furono costruiti provvedendo al legame di circa 1 pg di pDP 3 linearizzato per Barn HI a circa 0,2 pg del frammento Barn TK isolato in 20 pi di soluzione tampone da legame, contenente 100 unit? di legasi DNA, a 10?C per una notte. Questa miscela legante fu poi utilizzata per trasformare le cellule competenti di E. coli HB 101, come esposto nell?esempio III.

Esempio VI - La cernita di cellule di trasformazione per identificare quelle recanti i plasmidi ricombinanti dotati di inserti HSV TK

Le cellule di trasformazione dotate di plasmidi ricombinanti furono soggette a cernita per individuare gli-inserti HSV TK mediante l'ibridazione di colonie, come essenzialmente esposto da Hahahan e coll., Gene 10:63-67, 1980.

Un corredo iniziale di filtri nitrocellulosici (Schleicher & Schull BA85) furono sistemati su capsule di Petri riempite di nutriente agar LB contenente 100 pg/ml di ampicillina. Le cellule di trasformazione furono applicate sui filtri e si procedette ad incubare le capsule a 30?C per una notte, o quanto bastasse a rendere le colonie appena visibili. Si realizz? un filtro nitrocellulosico di replica per ciascuno dei filtri originali, sovrapponendo un filtro nitrocellulosico sterile su ciascuno dei predetti filtri originali e pressando l'uno fermamente contro l'altro. Indi si pratic? su ciascuna coppia di filtri un'incisione con una lama da bisturi sterile, dopo di che i filtri furono separati e trasferiti ad un'altra lastra di agar LB contenente ampicillina 100 pg/ml per 4?6 h. Il corredo originale di filtri fu poi sistemato su lastre di agar LB contenenti 200 ?g/ml di cloramfenicolo per aumentare la produzione plasmidica. I filtri di replica furono conservati a 4?C.

Dopo 24 h sul cloramfenicolo, i filtri nitrocellulosici originali furono preparati per l'ibridazione come segue. Ciascun filtro nitrocellulosico fu sistemato su un foglio di carta filtrante vhatman satura di 0,5 N NaOH per 5 minuti, asciugato con carta filtrante asciutta per 3 minuti e ricollocato sulla carta filtrante satura di NaOH per 5 minuti allo scopo di indurne la lisi dei batteri e denaturarne il DNA. Questa sequenza fu poi ripetuta utilizzando fogli di carta filtrante vhatman saturi di 1,0 M Tris-HCl (pH 8,0) e ripetuta per la terza volta su fogli di carta filtrante saturi di 1,0 M Tris-HCl (pH 8,0) contenenti 1,5 M NaCl ai fini della neutralizzazione. I filtri nitrocellulosici cosi trattati furono quindi essiccati all'aria e cotti al vuoto per 2 h alla temperatura di 80?C.

Prima di procedere all'ibridazione, i filtri nitrocellulosici furono poi trattati per 6-18 h incubandoli a 60?C in una soluzione tampone di pre-ibridazione e cio? una miscela acquosa di 6 x SSC [1 x SSC = 0,15 M NaCl con 0,015 M di citrato sodico (pH 7,2)], 1 x Denharts (1 x Denharts = una soluzione contenente 0,2% di Ficoll, BSA e polivinilpirrolidone, rispettivamente) e 100-200 ?g/ml di DNA dello sperma reciso denaturato di salmone (S.S.DNA), 1 mM EDTA e 0,1% SDS. Il trattamento ? inteso a ridurre la quantit? del legante tra il filtro ed il campione DNA non ibridato destinato all'applicazione'sul filtro.

Nella ricerca dei plasmidi ricombinanti dotati di inserti HSV TK, le colonie di trasformazione aderenti ai filtri nitrocellulosici originali cos? trattati, furono ibridate con il frammento Barn HSV TK marcato al P mediante l'immersione dei filtri m una soluzione tampone di ibridazione contenente 2 x SSC

(pH 7,2), 1 x la soluzione Denhart, 50 pg/ml di S.S.

DNA, 1 mM EDTA, 0,1% di SDS, 10% di solfato di dextran 32

nonch? P Barn TK quale sonda d'ibridazione. Il livello di radioattivit? della soluzione fu pari ad un conteggio di circa 100.000 al minuto (cpm) per millilitro.

L'ibridazione fu portata a termine a 60?C per 18-24 h (wahl e coll., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76:3683-3687, 1979).

[Per approntare la sonda d'ibridazione, il frammento 2,3 md Barn TK fu marcato per traslazione del tratto inciso secondo il metodo di Rigby e coll., J.

Mol, Biol. 113:237-251, 1977. Precisamente, si appront? 0,1 mi d'una miscela di reagente contenente 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 5 mM MgCl^, 20 pM di trifosfato di desossicit idina (dCTP), 20 pM di trifosfato di desossi? adenosina (dATP), 20 pM di trifosfato di desossiguanosina (dGTP), 2 pM (?- P) trifosfato di deossitimidina (dTTP) (410 curie/mMol) (Amersham Corporation), 1 ng di DNasi I, 100 unit? di DNA polimerasi I (Boehringer Mannheim) ed 1 pg del frammento Barn TK. La miscela di reagente fu incubata a 14?C per 2 h. Per arresicir?

la reazione, si aggiunsero 50 pi di 0,5 M EDTA, riscal? dando a 65?C per 10 minuti. I trifosfati non incorporati furono estratti per filtrazione su gelatina della miscela reagente su Sephadex G50.]

Dopo l'ibridazione, l'eccesso del campione di sondaggio fu estratto dai filtri nitrocellulosici mediante 5 lavaggi in 2 x SSC (pH 7,2) contenente 0,1% di

SDS a temperatura ambiente, seguiti da 3 lavaggi in

0,2 x SSC (pH 7,2) contenente 0,1% di SDS a 60?C, essendo ogni lavaggio protratto per 30 minuti. I filtri lavati furono poi essiccati all'aria ed utilizzati

per esposizione di pellicola radiografica (Kodak x-omat R) a -70?C per 6-18 h, usando uno schermo Cronex Lightening Plus della Soc. du Pont per intensificare l'immagine.

Dopo l'esposizione e lo sviluppo, la pellicola radiografica serv? poi ad individuare le colonie contenenti i plasmidi pBR 322 ricombinanti del Barn HSV TK vaccinico. Le pellicole radiografiche furono collocate sui corrispondenti filtri nitrocellulosici di replica. Le colonie che risultarono positive furono poi raccolte dai filtri di replica per ulteriore analisi.

Delle mille colonie all'incirca soggette a tale cernita, 65 risultarono tentativamente identificate per recare l?inserto Barn TK entro il plasmide pDP 3.

Esempio VII - Analisi per restrizione dei plasmidi ricombinanti dotati del Barn HSV TK

Ciascuna delle 65 colonie tentativamente identificate quali portatrici di plasmidi ricombinanti con l?inserto Barn HSV TK serv? ad inoculare colture di 2,0 ml di brodo LB contenente ampicillina alla ragione di 100 pg/ml. Le colture furono poi incubate a 37?C per una notte, prima di estrarne i plasmidi come gi? esposto all?esempio III. I plasmidi furono sciolti in 50 ?l d?acqua dopo la precipitazione all?isopropa? nolo.

Per accertare se i plasmidi contenessero un frammento 2,3 md Barn HSV TK intatto ed in quale sito Barn HI entro il pDF 3 fosse stato inserito il Barn HSV TK, furono miscelati 25 ?l di ciascun preparato plasmidico con 25 ?l di soluzione tampone 2 x Hind III, e fermentati a 37?C per 2 h con 1 unit? di Hind III. I risultanti frammenti furono poi analizzati per elettroforesi su una gelatina agarosica all'1%, come descritto in precedenza.

Dei 65 preparati plasmidici cos? analizzati, 6 risultarono dotati dei frammenti Barn HSV TK inseriti al sito Barn HI nel tratto Hind III F vaccinico del plasmide, vale a dire, se ne derivarono frammenti di restrizione Hind III d'un peso molecolare pari al pBR 322 lineare (2,8 md) nonch? frammenti d'un peso molecolare superiore a quello dei frammenti Hind III F vaccinici (8,6 md).

Questi 6 plasmidi furono soggetti ad ulteriore analisi con Sst I (un isoschizomero del Sac 1) per accertare il numero e l'orientamento dei frammenti

Barn HSV TK inseriti nel frammento vaccinico Hind III F, poich? Sst I (Sac I) scinde sia il frammento Barn HSV TK che il frammento vaccinico Hind III F asimmetricamente.?Si effettuarono le analisi miscelando 25 pi del plasmide con 25 pi della soluzione tampone 2 x Sst [50 mM Tris?HC1 (pH 8,0), 10 mM di MgCl2, 100 mM di NaCl e 10 mM di DTT) e fermentandoli con 1 unit? di Sst I (Bethesda Research Laboratories) a 37?C per 2 h. I risultanti frammenti furono analizzati per elettroforesi su gelatine agarosiche all'1%. Dei sei plasmidi cos? analizzati, 5 risultarono dotati d'una coppia di frammenti Sst I aventi un peso molecolare di 10,1 md e 3,5 md, indicativo d'un solo inserto Barn HSV TK.

Uno di questi plasmidi fu scelto per ulteriori indagini sotto la designazione pDP 132. L'altro plasmide frutt? tre frammenti Sst I del peso molecolare di 10,8 md, 2,8 md e 2,3 md, indicativi di coppie in tandem di inserti Barn HSV TK orientati testa a coda e di orientamento opposto a quello del pDP 132.?Questo plasmide fu designato pDP 137.'La Figura 30 ? un diagramma dei plasmidi pDP 132 e pDP 137.'

Esempio VIII - Isolamento d'una variante TK*?s del virus vaccinico

Per isolare una variante TK~ S del virus vaccinico mutante, una popolazione virale fu soggetta ad elevata pressione selettiva per ottenere un mutante del genere coltivando il virus nelle cellule alla presenza del BUdR che ? letale agli organismi portatori del gene TK. Pi? specificatamente, strati confluenti monomolecolari di cellule TK? umane (linea 143) coltivate sul nutriente speciale di Eagle in capsule di Petn di 150 mm furono infetti con circa 3 x 10<3 >di unit? formanti le piastrine (pfu, per 'plaque forming units') della variante S del virus vaccinico per ciascuna capsula (un totale di 20), alla presenza di 20 ?g di BUdR/ml. (il nutriente speciale di Eagle ? un medium disponibile nel commercio per la coltivazione di quasi tutte le linee cellulari.?Alternativamente si possono utilizzare altri nutrienti quali Eagle*s Minimum Essential Medium, Basai Eagle*s Medium, Ham*s-F1Q, Medium 199, RPMI-1640 ecc.) La coltivazione viene effettuata a 37?C in un'atmosfera arricchita di CO2. Per maggior'convenienza, ci si pu? servire d'un incubaiore a C02 che eroga aria sufficientemente arricchita di CO2 per averne una concentrazione del 5% all'incirca.

, Novantatre delle piastrine sviruppate furono isolate e ri-piastrinate su cellule umane TK (linea 143) nelle medesime condizioni gi? citate, sempre alla presenza di 20 ?g di BUdR/ml/ Un certo numero (5) di piastrine grandi e ben isolate fu prescelto per ulteriore analisi/

Le cinque piastrine isolate furono saggiate per crescita su strati cellulari monomolecolari nelle medesime condizioni usate in precedenza, con o senza 20 ?g di BUdR/ml. Si prese nota della relativa crescita di ciascuna piastrina con o senza il BUdR che fu paragonata alla crescita relativa in simili colture cellulari su strati monomolecolari dalla variante S del virus progenitore. Si ottennero i risultati esposti qui di seguito:

La crescita del materiale isolato dalla piastrina N. 79 fu esaminato ulteriormente alla pres?nza di 0,

20 e 40 pg di BUdR/ml e paragonato alla crescita della variante S del virus progenitore. Si ottennero i seguenti risultati:

Inoltre i predetti cinque isolati piastrinici e

la variante S del virus progenitore furono controllati in quanto alla crescita su cellule umane TK<- >(linea 143) in presenza di MTAGG che ? un nutriente speciale di Eagle, modificato per la presenza di:

(vedi Davis e coll.', op.:cit.) che possiede azione elettiva per la timidina chinasi e contro gli organismi privi del gene di timidina chinasi.?Il saggio port? ai seguenti risultati:

Dei tre materiali isolati dalle piastrine che manifestavano inibizione completa della crescita in presenza di MTAGG, l'isolato N. 79 fu scelto arbitrariamente e si approntarono estratti delle cellule infette con il virus N.?79 per confrontarli con gli estratti approntati da cellule non infette nonch? da quelle infette dalla variante s del virus progenitore, per saggiarne la capacit? di fosforilare la timidina al tritio ( H).?La tabella seguente riassume i risultati: a

Stando ai seguenti fattori, (1) resistenza al

BUdR, (2) inibizione di sviluppo su un terreno contenente il MTAGG,,e (3) mancanza di fosforilazione d?una certa entit? della timidina negli estratti cellulari infetti, si presume che il materiale isolato della piastrina N/ 79 manca di attivit? di timidina chinasi.?

Il materiale isolato porta la designazione VTK 79.

Esempio IX - Recupero di marcatura della variante L

del DNA vaccinico mediante la variante S

Per le indagini sul recupero di marcatura furono approntati quattro preparati della variante L del DNA.?

Il primo consisteva della variante L purificata ed

intatta del DNA vaccinico. Il secondo preparato era

una variante L del DNA vaccinico fermentata con Bst

E II, una endonucleasi di restrizione generante un

frammento DNA donatore, il frammento C, completo di

quel DNA che manca nella variante S ma ? proprio della variante L, essendo per di pi? corredato alle due

estremit? della catena DNA d?una regione del DNA omolo

go alla corrispond?nte sequenza nella variante S. Il preparato N/ 3 e N. 4, rispettivamente, consistevano della variante L del DNA fermentata con Ava I e Hind III, che sono endonucleasi di restrizione atte a scindere il genoma vaccinico entro la sequenza DNA caratteristica della variante L. Le indagini sul recupero di marcatura eseguite con 'i quattro preparati in parola dimostrano che i frammenti della variante L del DNA corredati della regione di delezione che invece manca nella variante S possono essere reintrodotti nella variante S mediante una tecnica di ricombinazione in vivo, purch? il frammento contenga oltre alla regione di delezione anche le regioni terminali omologhe alla corrispondente sequenza nella variante S.-Per una comprensione migliore dei frammenti impiegati in queste indagini si fa riferimento alle figure 6 A?C, essendo mappe di restrizione d'un tratto del terminale sinistro del genoma vaccinico. In particolare, ciascuna mappa si riferisce alla regione terminale sinistra del genoma comprendente circa 60 kilobasi accoppiate, come illustrato nella figura. Quel tratto del genoma vaccinico che risulta soppresso nella variante S viene rappresentato in ogni mappa come la regione tra le linee tratteggiate nelle figure, pari in lunghezza a circa 10 kilobasi accopp ate.

Con riferimento particolare alla figura 6AP ? manifesto che il frammento H ricavato dalla fermentazione con Ava I ? completamente situato entro la regione di delezione, per? manca di frammenti DNA terminali omologhi al DNA della variante S per il motivo che i siti di scissione Ava I sono situati per intero entro la regione soppressa nella variante S.

La mappa di restrizione illustrata nella figura 6B relativa al Hind III mostra che anche questo enzima di restrizione non riesce a produrre il frammento DNA della variante L omologa alla regione soppressa nella variante S. In questo caso, le sequenze omologhe alla variante S si trovano al terminale sinistro del frammento C del Hind III. Tuttavia, il sito di restrizione al terminale destro del frammento C ? situato entro la regione di delezione, mancando invece una sequenza terminale omologa alla sequenza DNA della variante S.?-Al contrario, la mappa di restrizione illustrata nella figura 6C corrispondente al Bst E II indica che la fermentazione con questo enzima produce un frammento, il frammento C, completo della regione di delezione che invece manca nella variante S, e corredato pure di tratti terminali all'estremit? destra e quella sinistra, che sono omologhe al tratto corrispondente della variante S.?

Secondo quanto discusso appresso, i risultati di queste indagini dimostrano che il DNA presente nella variante L ma soppresso nella variante S pu? essere recuperato dalla variante S con un elevato grado di efficienza dal genoma intatto della variante L e con minor efficienza dal frammento C del Bst E II; ' invece, non pu? essere recuperato dai frammenti DNA della variante L preparati con le endonucleasi di restrizione Ava I e Hind III.

L'elevato grado di efficienza con cui la sequenza soppressa viene recuperata dalla variante L intatta si pu? attribuire al fatto che basta un solo interscambio (crossover) tra la variante L intatta e quella S per produrre un genoma del tipo variante L. D'altro canto, per recuperare il tratto soppresso dal frammento .C del Bst E II, si rende necessario un interscambio tra il frammento e la variante S nel tratto terminale sia sinistro che destro del frammento C, al fine di incorporare la regione di delezione nella variante S. In ultimo, poich? n? la fermentazione con Ava I n? la fermentazione con Hind III pu? produrre frammenti DNA capaci di incorporazione nella variante S tramite qualsiasi interscambio, non si verifica alcun recupero del tratto soppresso.

Il recupero di marcatura fu eseguito su strati monomolecolari CV-1 utilizzando la tecnica del fosfato di calcio esposta da Graham e coll., Virology 52:456-467, 1973 nella modifica di Stow e coll, e Wigler e coll., gi? citati in precedenza. A tale scopo, strati monomolecolari confluenti di CV-1 furono infetti di virus vaccinico variante S per creare circa 50 - 200 piastrine in un numero (5-20) di capsule Petri del diametro di 6 cm. Per infettare le cellule, il nutriente (ad esempio il terreno speciale Eagle contenente siero vitellino 10%) viene aspirato ed una diluizione del virus contenente 50-200 pfu/0,2 mi in un nutriente compatibile con la cellula, ad esempio Eagle's Special con siero vitellino al 2%, viene applicata allo strato monomolecolare della cellula.

Dopo un periodo d'incubazione d'un'ora a 37?C in un incubatore a C02 per consentire alle cellule di assorbire il virus, diversi preparati della variante L del DNA, tra i quattro menzionati in precedenza, furono separatamente aggiunti agli strati monomolecolari sotto forma d'un precipitato di fosfato calcico contenente per ogni capsula un microgramma del preparato della variante L del DNA. Dopo 40 minuti si aggiunse il nutriente speciale di Eagle con siero vitellino al 10% e a quattro ore di distanza dall'aggiunta iniziale del DNA, lo strato cellulare monomolecolare fu esposto ad 1 ml di sulfossido dimetilico tamponato al 25% per quattro minuti. La soluzione tampone contiene 8 g di NaCl, 0,37 g di KC1, 0,125 g di Na2HP0 .2H20, 1 g di destrosio e 5 g di N-(2-idrossietil) piperazina, N'-(2-acido etanosulfonico) (Hepes) per litro, con un livello pH finale di 7,05. Si estrasse il sulfossido dimetilico e gli strati monomolecolari furono lavati e sormontati da uno?strato di nutriente all'agar. Dopo tre giorni in un incubatore al CO2 alla temperatura di 37?C, le cellule furono colorate con uno strato di nutriente all?agar contenente un colorante rosso neutro idoneo a colorare le cellule non infette (il nutriente all?agar = nutriente speciale di Eagle contenente siero vitellino al 10% ed agar 1%). L'indomani si tolse lo strato di agar e si trasferirono gli strati monomolecolari ai filtri nitrocellulosici,ove furono preparati per ibridazione in situ secondo il metodo di Villarreal e coll., loc. cit. Poich? la fermentazione del genoma della variante L con Ava I genera un frammento di 6,8 kilobasi accoppiate, il frammento H che risiede per intero entro la singolare sequenza DNA soppressa nel genoma della variante S (vedi figura 6A), il frammento Ava I H marcato al <32>P e traslato per incisione fornisce una sonda altamente specifica per individuare il recupero della .singolare sequenza DNA della -variante L da parte di quella S.

Per l'ibridazione i filtri nitrocellulosici furono posti fra cerchietti ritagliati di carta filtrante Whatman N.1 in capsule Petri del diametro di 6 cm e pre-ibridati per 6 h a 60?C in una soluzione tampone di preibridazione (SSC, soluzione di Denhardt, EDTA e S.S.DNA), come gi? descritto in precedenza nell'esempio VI. La sonda radioattiva costituita dal frammento Ava I H della variante L, marcato al <32>Pe traslato per incisione, avente un'attivit? specifica pari a circa 1 x 10<8 >cpm/pg fu impiegata per l'ibridazione in 2 x SSC, 1 x Denhardt, 1 mM EDTA, 0,1% 3DS, 10% di solfato di dextran e 50 yig/ml di S.S.DNA trattato ad onde sonore, per una notte a circa 1 x 10 cpm/ml a 60?C. La sonda radioattiva fu preparata secondo il metodo di Rigby e coll., J. Mol. Biol. 113:237-251,1977. I filtri furono lavati ripetutamente a temperatura ambiente ed a 60?c utilizzando il procedimento di lavaggio descritto all'esempio VI, poi essiccati all'aria e radioautografati.

I risultati di queste prove sono riassunti nella seguente Tabella I.

Per ciascun preparato donatore di DNA furono analizzate non meno di 5.000 piastrine.

Esempio X - Ricombinazione in vivo utilizzando il pDP 132 ed il pDP 137 per generare i mutanti del virus vaccinico VP?1 sino al VP-6 e la relativa identificazione

con l'ausilio di filtri di replica

Un primo precipitato di ortofosfato calcico del

DNA donatore fu approntato combinando 5 pg di DNA fermentato con pDP 132 Hind III in 50 pi d'acqua, 4 pg

del DNA portatore di variante S (preparato secondo l'esempio I) in 40 pi d'acqua e 10 pi di 2,5 M CaCl2, combinando la risultante miscela con pari volume di

2 x tampone fosfatico di Hepes comprendente 280 mM di NaCl, 50 mM di Hepes e 1,5 mM di fosfato sodico (pH 7,1) e lasciando il precipitato a formarsi per un periodo di 30 minuti a temperatura ambiente. Un secon

do precipitato fu approntato nella stessa modalit? e con identici quantitativi, salvo che il DNA fu quello fermentato con pDP 137 Hind'III,

(Secondo la descrizione pi? dettagliata di Stow e coll. loc. cit. e wigler e coll., loc. cit. le modifiche della tecnica di precipitazione di Graham e coll, citate in precedenza si valgono del DNA portatore quale composto ad elevato peso molecolare per incrementare l'efficienza della formazione del precipitato dell 'ortofosfato di calcio. Il DNA portatore che viene impiegato ? quello proveniente dal virus usato per infettare le cellule dello strato monomolecolare secondo la tecnica di ricombinazione in vivo.)

Ai fini della ricombinazione in vivo, strati confluenti monomolecolari di CV-1 coltivato sul nutriente speciale di Eagle contenente il siero vitellino al 10% furono infetti con la variante S del virus vaccinico ad un titolo infettivo d'un multiplo di 1 pfu/cellula. Il procedimento infettivo ? analogo a quello dell'esempio IX. Il virus fu lasciato ad assorbirsi per 60 minuti a 37?C in un incubatore al CO2, dopo di che si aspir? il materiale d'inoculazione e si lav? lo.strato cellulare monomolecolare. I preparati del DNA precipitato furono applicati su strati cellulari separati e dopo 40 minuti in un incubatore C02 a 37?0, si sovrimpose uno strato di nutriente liquido, cio? il medium speciale di Eagle contenente siero vitelli? no al 10%. In ogni caso, il virus fu raccolto dopo 24 ore a 37?C nell'incubaiore a CO2 mediante tre cicli di congelamento/disgelamento , e tritato su strati CV-1 monomolecolari. Furono saggiate circa 15.000 piastrine su strati monomolecolari CV-1 per individuare il virus di ricombinazione utilizzando filtri di replica approntati come descritto in seguito.

Le piastrine formate su strati confluenti monomolecolari di CV-1 sotto lo strato del nutriente all'agar furono trasferite su filtri nitrocellulosici, togliendo delicatamente lo strato su^erimposto di agar con un bisturi e ponendo i filtri nitrocellulosici sullo strato monomolecolare. Per stabilire un contatto adeguato tra il filtro e lo strato monomolecolare si collocarono fogli di carta filtrante Whatman N. 3, inumiditi con 50 mM di tampone Tris (pH 7,4) e 0,015 mM NaCl, sopra il filtro di nitrocellulosa pestandoli con un tappo di gomma sino a che lo strato monomolecolare trasferito sulla nitrocellulosa non mostrasse un colore uniforme intorno a zone distinte non colorate sulle piastrine. (Lo strato monomolecolare venne in precedenza colorato con rosso neutro che viene assorbito dalle cellule vitali, cio? quelle che non hanno subito la lisi dovuta all'infezione virale).

Il filtro nitrocellulosico recante lo strato monomolecolare di trasferimento viene ora tolto dalla capsula di Petri e collocato con il lato monomolecolare volto in su. Un altro filtro nitrocellulosico inumidito nella citata soluzione Tris-NaCl viene ora sistemato direttamente sul primo filtro ed i due vengono posti fermamente a contatto, pestandoli con un tappo di gomma, avendo preventivamente protetto i filtri con un cerchio ritagliato di carta Whatman N. 3?. Tolta la carta filtrante, i filtri di nitrocellulosa vengono intaccati per orientamento e poi separati. A questo punto il secondo filtro nitrocellulosico (la replica) contiene un'immagine speculare dello strato cellulare monomolecolare trasferito sul primo filtro di nitrocellulosa. Per convenienza, il secondo filtro viene posto in una capsula Petri pulita e viene congelato. Il primo filtro viene ibridato utilizzando a titolo di sonda il frammento Barn HSV TK marcato al <32>.P La preparazione della sonda e la tecnica d'ibridazione sono state descritte nell'esempio VI.

Circa 0,5% delle piastrine saggiate per ibridazione risultarono positive, vale a dire si trattava del virus ricombinante corredato del gene Barn HSV TK.

Le piastrine di virus ricombinante corrispondenti a quelle identificate nei primi filtri di nitrocellulosa per mezzo dell'ibridazione furono poi isolati

dai filtri nitrocellulosici di replica con la seguente tecnica, ai fini di ulteriore purificazione.

Utilizzando un trapano di sughero avente un diametro leggermente pi? grande della piastrina da prelevarsi, la piastrina prescelta viene punzonata dal

primo filtro nitrocellulosico, quello originale usato per l'identificazione dei virus ricombinanti mediante ibridazione. Il risultante filtro perforato viene poi usato come mascherino per individuare ed isolare la piastrina corrispondente sul filtro di replica. Precisamente, il filtro di replica viene collocato con il

lato monomolecolare volto in su, sopra una superficie sterile, e coperto con un foglio di plastica Saran.

Il primo od originale filtro perforato viene ora collocato con il rispettivo strato monomolecolare volto

in gi?, sopra il secondo filtro, e le tacche di orientamento segnate sui filtri vengono allineate per far coincidere le immagini speculari sulle piastrine.

Usando sempre il trapano di sughero, si leva un tappo dal filtro di replica, si toglie il foglio protettivo di Saran e si pone in 1 ml di nutriente speciale di

Eagle contenente siero vitellino al 2%. Il tappo nitrocellulosico viene trattato in questo medium con onde sonore per 30 secondi sul.ghiaccio per liberarne il virus.

0,2 ml di questo preparato virale e 0,2 ml di una diluizione 1:10 del preparato stesso vengono applicati sugli strati monomolecolari CV-1 nelle capsule Petri di 6 cm di diametro.

A titolo di purificazione della piastrina, fu poi ripetuta l'intera sequenza della preparazione del primo filtro nitrocellulosico, del filtro di replica, l'ibridazione e l'isolamento della piastrina dal filtro di replica.

Un campione della piastrina purificata approntato in questa maniera da un precipitato dOrtofosfato di calcio del DNA fermentato con pDP 132 Hind III fu denominato il virus vaccinico VP-1. Per analogia, ima piastrina contenente il virus ricombinante preparato dal DNA fermentato con PDF-137 Hind III fu denominata VP?2.?Ambedue i campioni furono coltivati su opportuni terreni cellulari per ulteriore indagine, compresa la identificazione mediante analisi di restrizione e altre tecniche.?

In maniera analoga furono approntati altri due mutanti vaccinici, denominati rispettivamente VP-3 e VP-4, per ricombinazione in vivo servendosi del VTK~79 (una variante S del virus vaccinico TK gi? descritto nell'esempio Vili) quale virus di recupero e del pDP 132 e PDP 137, rispettivamente, quale DNA donatore di pia? smidi. I precipitati furono formati come gi? descritto in precedenza, salvo che 5 pg del DNA donatore di plasmidi contenuto in 50 pi d'acqua, 4 pg di DNA portatore di VTK~79 in 150 pi d'acqua e 50 ?l di 2,5 M CaC12 furono combinati ed aggiunti goccia a goccia ad un?pari volume di 250 ?? del tampone fosfatico Hepes descritto in precedenza.

Inoltre, le cellule prescelte per l'infezione da parte del portatore virale VTK-79 furono quelle BHK-21 (Clone 13) invece di CV-1.

Altri due mutanti del virus vaccinico denominati VP-5 e VP-6 furono approntati utilizzando precipitati ortofosfatici di calcio del pDP 132 e pDP 137, rispettivamente, preparati analogamente ai mutanti VP-3 e VP-4. Tuttavia, nel caso dei mutanti VP-5 e VP-6, il DNA portatore fu il virus vaccinico VTK~11 anzich? VTK 79.

Anche qui, gli strati monomolecolari infetti furono quelli delle cellule BHK-21 (C-13), mentre il virus di recupero fu il VTK~11 in questo caso.

Esempio XI - Espressione del HSV TK mediante il mutante vaccinico VP?2 -e l'uso dell'IDC?* per la relativa identificazione

Il prodotto virale ottenuto nell'esempio X mediante la ricombinazione in vivo della variante s del virus vaccinico- ed il precipitato ortofosfatico di calcio del DNA fermentato con pDP-137 Hind III fu spalmato su strati confluenti monomolecolari di cellule CV-1 presenti in circa venti capsule Petri di 6 cm, ad una concentrazione sufficiente a formare circa 150 piastrine per ogni capsula. Le piastrine furono coperte con un nutriente liquido, ad esempio il medium speciale di?Eagle contenente siero vitellino al 10%. Dopo 24 fino a 48 ore d'incubazione a 37?C in un incubatore a CO2, il nutriente liquido di copertura fu tolto dalle capsule e sostituito in ogni caso da 1,5 mi dello stesso medium liquido di copertura contenente 1?10 ?Ci di iododesossicitidina marcata allo <125>I (IDC ). Le lastre furono poi incubate per una notte a 37?C in un'atmosfera ricca di C02, dopo di che lo strato cellulare monomolecolare fu colorato con l?aggiunta del rosso neutro per visualizzare le piastrine per contrasto.

A questo punto si tolse il nutriente per aspirazione, gli strati monomolecolari si lavarono tre volte con una soluzione salina tamponata al fosfato, e lo strato monomolecolare delle cellule su ogni?lastra venne impresso su un corrispondente filtro di nitrocellulosa. Quest'ultim? fu poi esposto a pellicola roentgen per 1 sino a 3'giorni, e quindi sviluppato.

- ---Quelle piastrine virali.che contengono ed esprimono il gene HSV TK sono capaci di fosforilare l'IDC ed incorporarlo nel proprio DNA, rendendo quest'ultimo insolubile. Il residuo di IDC* non fosforilato e non incorporato fu tolto per lavaggio, sicch? le piastrine che opacizzano la pellicola radiografica sono quelle atte ad esprimere il gene ricombinante HSV TK. N? le cellule CV-i n? il virus vaccinico, per quanto dotato di TK, sono capaci di fosforilare ed incorporare l'IDC* nel modo elettivo caratteristica del gene HSV TK.

Dopo 1'identificazione dell'organismo ricombinante a mezzo di radioautografia, si ritagliarono tappi di filtro dai filtri nitrocellulosici, che furono poi posti in 1 mi del nutriente di copertura (il medium speciale di Eagle contenente siero vitellino al 10%), trattati ad onde sonore e ri-spalmati sugli strati monomolecolari di CV?1. Il saggio all'lSD* fu quindi ripetuto per purificare ulteriormente il materiale virale isolato. In tale maniera, un virus identico al mutante VP-2 identificato per ibridazione all'esempio X fu isolato mediante una tecnica che si basa sull'espressione del gene HSV TK presente nel medesimo. ?

Anche qui, i risultati di questo esempio dimostrano l'espressione del gene HSV TK presente negli organismi ricombinanti .in conformit? all'attuale invenzione, a mezzo di taluni di questi organismi.

I mutanti vaccinici derivati del pDP 137, vale a dire il VP-2, VP-4 e VP-6 sono tutti atti'ad esprimere il gene HSV TK presente nei medesimi mediante la fosforilazione e l'incorporazione dell?lDC*, nella maniera descritta in precedenza. Conversamente, le varianti VP?1, VF-3 e VP-5 derivate dal pDP 132 non sono atte ad esprimere il gene, possibilmente per il fatto che l'orientamento del gene entro il virus ? opposto alla direzione in cui il gene viene trascritto.

Esempio XII - L'uso d'un terreno elettivo per l'identificazione e l'isolamento dei virus ricombinanti contenenti il gene HSV TK

I virus preparati secondo l'esempio X per la ricombinazione in vivo entro le cellule BHK-21 (C-13) del virus vaccinico VTK~79 e d'un precipitato ortofosfatico di calcio del pDP 137, furono usati per infettare le cellule TK umane (linea 143). Pi? specificatamente, strati cellulari .monomolecolari posti in cinque capsule Petri di 6 cm in diametro, furono infetti da virus descritto all'esempio X, in una diluizione virale da 10 a 10 in presenza del nutriente elettivo MTAGG.

La tecnica infettiva fu identica a quella gi? esposta.

Si isolarono cinque piastrine ben separate ed una

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI

   1. Un virus vaccinico modificato dalla presenza del DNA esogeno nel genoma vaccinico.

   2. Un virus vaccinico secondo la rivendicazione 1, in cui il suddetto DNA esogeno viene espresso in un organismo ospite per mezzo della produzione d?una proteina.

   3.'Un virus vaccinico secondo la rivendicazione 2, in cui la suddetta proteina ? un antigeno.?

   4. Un virus vaccinico secondo la rivendicazione 2, in cui il suddetto DNA esogeno ? un gene di herpes simplex espresso in un organismo ospite per mezzo?della prodvizione di timidina chinasi.

   5. Un virus vaccinico secondo la rivendicazione 4, in cui il suddetto1virus ? privo del gene vaccinico produttore di timidina chinasi.

   6.1 Il virus vaccinico VP-1 secondo la rivendicazione 1.

   7. Il virus vaccinico VP-2 secondo la rivendicazione 1.

   8. Il virus vaccinico VP-3 secondo la rivendicazione 1.

   9. Il virus vaccinico VP-4 secondo la rivendicazione 1.

   10. Il virus vaccinico VP-5 secondo la rivendicazione 1.*

   11. Il virus vaccinico VP-6 secondo la rivendicazione 1.

   12.?Un metodo per la ricombinazione in vivo del virus vaccinico e del DNA donatore che comprende la messa a contatto d'uno strato cellulare monomolecolare con un terreno di coltura compatibile con la cellula contenente il suddetto virus vaccinico e con un terreno di coltura compatibile con la cellula contenente il suddetto DNA donatore, il detto DNA donatore avente il DNA esogeno presente entro un segmento altrimenti co-lineare del DNA vaccinico in una regione-non essenziale entro tale segmento.

   13.?Un metodo secondo la rivendicazione 12, in 21.?Un metodo 'secondo la rivendicazione 20, in cui il suddetto DNA ? espresso da tale cellula.

   22.?Un metodo secondo la rivendicazione 21, in cui il suddetto DNA ? espresso dalla produzione in tale cellula d?una sostanza biologica.

   23.-Un metodo secondo la rivendicazione 22, in cui il suddetto DNA da replicarsi contiene il gene dell'herpes simplex TK e la suddetta sostanza biologica ? la timidina chinasi.

   24.1Un plasmide ricombinante comprendente il DNA del pBR 322 in uno con un membro scelto da un gruppo consistente del frammento vaccinico Hind III F del DNA ed almeno un frammento di Barn HI HSN TK.?

   25. Un plasmide secondo la rivendicazione 24, che ? il pDP 3.

   26/ Un plasmide secondo la rivendicazione 24, che ? il pDP 132.

   27.'Un plasmide secondo la rivendicazione 24, che ? il pDP 137.

   28. Il metodo di accrescere una proteina che comprende l'inoculazione dell'animale ospite, suscettibile al virus vaccinico, con un virus vaccinico secondo la rivendicazione 2.

   29. Il metodo di accrescere una proteina che comprende l'inoculazione dell?animale ospite, suscettibile cui il suddetto segmento" altrimenti co-lineare del DNA vaccinico ? clonabile con un plasmide.

   14. Un metodo secondo la rivendicazione 13, in cui il suddetto segmento co-lineare del DNA vaccinico ? il relativo frammento Hind III F.'

   15. Un metodo secondo la rivendicazione 14, in cui il suddetto DNA esogeno include il gene Barn HI TK dell'herpes simplex.

   16. Un metodo secondo la rivendicazione 12, in cui il suddetto DNA donatore ? presente sotto forma di precipitato ortofosfatico di calcio del detto DNA donatore.

   17. Un metodo secondo la rivendicazione 12, in cui il suddetto virus vaccinico ? privo d'un gene vaccinico produttore di timidina chinasi.

   18/ Una coltura biologicamente pura del virus vaccinico VTK~79.?

   19. Il metodo di replicazione del DNA in una cellula eucariotica mediante infezione della suddetta cellula con un virus vaccinico modificato per contenere tale DNA, essendo il DNA esogeno al suddetto virus vaccinico.

   20. Un metodo secondo la rivendicazione 19, in cui il suddetto DNA ? parimenti esogeno alla detta cellula.

   al virus vaccinico,' conun virus vaccinico secondo la rivendicazione 3.?

   30.' Il metodo d'immunizzazione dell'animale ospite, suscettibile al virus vaccinico, per sviluppare anticorpi contro un antigeno, il quale metodo comprende l'inoculazione dell'animale ospite con un virus vaccinico avente entro il genoma vaccinico il DNA esogeno a tale genoma e codificato per il detto antigeno.