HU198836B

HU198836B - Composition suitable for forming liposomes

Info

Publication number: HU198836B
Application number: HU863431A
Authority: HU
Inventors: Y John Park; A Shurl Thompson
Original assignee: Allergan Pharma
Priority date: 1985-08-07
Filing date: 1986-08-06
Publication date: 1989-12-28
Also published as: EP0211647A1; JPS6242733A; DK362786A; GR862020B; AU5914186A; IL79114A0; HUT43487A; HK1004530A1; EP0211647B1; PT83130B; IE862103L; CA1280975C; DE3689056D1; ES8801118A1; FI863227A; ZA864541B; FI863227A0; IL79114A; ATE94754T1; NO863176L

Description

A találmány tárgya új liposzóma-képző készítmény, mely révén a liposzómák új módszerrel állíthatók elő. A találmány szerint olyan hidratálószereket alkalmazunk, melyek legalább két ionizálható csoporttal rendelkeznek, és amelyek liposzóma-képző anyagokkal együtt vizes oldattal való hígítás hatására spontán liposzómákat képző gélt alkotnak.

Számos eljárást és módszert fejlesztettek ki különböző típusú és méretű liposzómák készítésére, és hatóanyagok kapszulázósóra. Ezeknek a módszereknek legnagyobb része szerint a foszfolipidek és zsírsavak teljes szolubilizációjónak és egyenletes elkeveredésének biztosítása céljából a vizes rendszerben való diszpergalás előtt, szerves oldószert alkalmaznak. Egy másik módszer szerint ultrahangos kezelést alkalmaznak a foszfolipid/zsírsav anyag eloszlatásához.

így pl. Robinson [Trans. Faraday Soc. 56, 1260 (1960)], valamint Papahadjopoulos és munkatársai [Biochem. Biophys. Acta, 135, 639 (1967)] leírják foszfolipid diszperziók képződését kétfázisú éter/víz rendszerből, mely eljárás sorén az étert úgy párolják le, hogy nitrogént buborékoltatnak az elegyen keresztül. Hasonló módszert alkalmaznak Chowan és munkatársai [Biochem. Biophy. Acta, 266, 320 (1972)] kloroformmal, hogy biztosítsák a foszfolipidek teljes és alapos elkeveredését a diszpergalás előtt.

A Papahadjopoulos D. és Miller N. által elsőként leirt [Biochem. Biophys. Acta, 135, 624 (1967)] ultrahangos diszpergálási módszerrel kis egyrétegű hólyagocskák (vesiculum) állíthatók eló, de a technika felhasználhatósága korlátozott a kis kapszulázási hatékonyság miatt.

Batzri és Korn [Biochem. Biophys. Acta 198, 1015 (1973)] a szerves fázisban (etanolban) lévő lipideket vizes oldatba injektálták. Lényegében azonos eljárásban Deamer és Baugham étert alkalmazott e célból [Biochem. Biophys. Acta, 443, 619 (1976)].

Egy másik módszer szerint foszfatidil-szeririböl származó vagy foszfatidil-szerint tartalmazó lipid hólyagocskában kalcium hatására szerkezeti változást idéznek elő, de a tapasztalatok azt mutatják, hogy viszonylag kicsiny a kapszulázás hatékonysága a hólyagocska ujraképzésének nehézsége miatt [Papahadjopoulos és munkatársai: Biochem. Biophys. Acta, 394, 483 (1975); és Hauser FI.: Trends in Pharm. Science 3, 274-77 (1982)].

Számos más szabadalmi leírás ismertet a jelen találmány szerinti eljárás szempontjából érdekes lipid hólyagocska képzési eljárásokat. A 3804776 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint polipeptidek előállításához alkalmas olajban vagy zsírban kapszulázott aminosavak előállítására a kiindulási anyagot száraz por formájában, a zsír vagy olaj megolvasztott keverékében diszpergálják, majd ezt a keveréket vízbe öntik. A kapszulázott.

anyagot viszonylag nagy zsircseppek foglalják magukba. Az ilyen hólyagocskák nem megfelelők intravénás (IV) injekciókhoz, és alkalmazásuk csak orális beadásra korlátozódik.

Bizonyos gyógyszereket úgy kapszuláznak lipid hólyagocskákba, hogy a gyógyszer és lipid vizes foszfolipid diszperzióját megfagyasztják (4016100 lajstromszámu- amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás).

Papahadjopoulos és Szoka (4235871 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) olyan módszert ismertet liposzómák előállítására, mely szerint a hólyagocska-képző anyagot szerves oldószerben feloldják, majd a kapszulázandó anyagot tartalmazó vizes oldattal összekeverik. Homogén víz-az-olajban emulzió képződik, majd a szerves fázist lepárolják, igy gélszerű keveréket kapnak. Ezt a gélt azután vízben szuszpendálják, így hólyagocskákal képeznek.

Egy másik ide tartozó eljárást ismertei a 3932567 lajst.romszániú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, amely szerint poliamino-polikarbonsav kelátképző szereket, EDTA és TDPA kapszuláznak. Egy másik amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, a 4217344 lajstromszámú leírás, megemlíti, hogy bizonyos adalékanyagok és nem-ionos lipid anyagok kombinálásával a lipid hólyagocskák permeabilitását és felületi töltését módosítani lehet. Az említett számos adalékanyagra példaként a polipeptideket és fehérjéket említik. Mackaness és munkatársai a 4192859 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban liposzómákat, mint hordozókat tartalmazó kontraszt közegeket írnak le. A kontraszt-anyagok sóira példaként az arginin sót, cisztein sót, glicin sót, glicil— glicin sót, és N-metil-glükózamin-sókat említik. Ezeket az anyagokat röntgensugár-kontraszl-anyagok vizoldható sóinak előállításához alkalmas alifás és aliciklusos amurokként jellemzik.

A Science 1984. márciusi számának egyik közleményében Fendler János ad tájékoztatást. egy sor szintetikus felületaktív anyagról, amelyeket hólyagocskák képzésére lehet alkalmazni, Fendler ismerteti a kvaterner ammóniuni- és karboxilát, szulfát, szulfonát és foszfát ikerionos anyagokat, amelyekkel a következő dokumentumok is foglalkoznak: Fendler J.H.: Acc. Chem. Rés. 13, 7 (1980); Kurdiaké T. és Shinkai S.: Adv. Phis. Org. Chem. 17, 435 (1980); Kurdiaké T. és munkatársai: J. Am. Chem. Soc. 103, 5401 (1981); F.rhrhop J.H. és Matthieu J.: J. Chem. Soc. Chem. Commun., 141. oldal (1983); és Talman M. és munkatársai: Science, 221, 1047 (1983).

Felfedeztük, hogy liposzómák spontán képződnek, amikor foszfolipideket és/vagy zsírsavakat, liposzóma képző anyagokat hidralálószerl tartalmazó vizes oldatban diszpergálunk. A találmány szerinti eljárásban 3

HU 198836 Β ilyen típusú vegyületek közül például az arginint és hasonló aminosavakat alkalmazhatjuk, amelyek a molekula mind alfa-, mind ómega terminális csoportján legalább egy ionizálható funkciós csoporttal rendelkeznek. Ezek a .hidratáló vegyületek vagy két azonos típusú ionizálható csoporttal, (pl. mindkettő kationos, vagy mindkettő anionos) vagy ellentétes töltésű ionizálható csoportokkal rendelkeznek. Nem feltétlenül szükséges, hogy az ionizálható csoportok az alfa és az ómega szénatomokon helyezkedjenek el, de az ilyen vegyületek előnyösek a találmány szerinti eljárásban.

Gyakorlati szempontból a találmány szerinti módon képzett liposzómákat .pre-liposzóma gél -ként szereljük ki, mely egy olyan gél, amely a liposzómák képzésére alkalmas foszfolipid és/vagy zsírsav keverékét valamint a hidratáló vegyület megfelelő koncentrált vizes oldatát tartalmazza. A gélt vizes oldatban diszpergálva hatékonyan és spontán képződnek liposzómák oldószer-bepérlás, ultrahangos kezelés vagy bármilyen más olyan módszer alkalmazása nélkül, amelyeket korábban azért fejlesztettek ki, hogy lipid hólyagocskék, azaz liposzómák megfelelő képződését biztosítsák.

A hidratálószerekkel készített liposzómák stabilabbak, mint azok, amelyeket hagyományos módszerekkel állítanak elő, beleértve a szerves oldószeres és az ultrahangos módszert. Az ezeket a hidratálószereket tartalmazó liposzóma-készítmények alkalmazása révén az eddigi technológia oldószer eltávolítással kapcsolatos problémái, a régi módszerek szerint használt, nem egyenletes, roncsoló hatású ultrahangos kezelés okozta liposzóma károsodás elkerülhető.

Ezen kívül a pre-liposzóma gél dehidratélö hatású és jelentős időtartamon ót tárolható úgy, hogy rehidratálásra spontán módon liposzómákat képez.

A pre-liposzóma gél rendkívül stabil, elég stabil ahhoz, hogy autoklávban sterilizáljuk. Ezen kívül a kapszulázandó vízoldható vagy vízben nem oldható agyagokat hozzáadhatjuk a gélhez, ezek a gél diszpergálásakor beépülnek a liposzómókba. A gél eme tulajdonsága a kapszulézás hatékonyságát nagymértékben növeli.

Ezen kívül azt is felfedeztük, hogy a hidratálószer koncentrációja előre meghatározható módon befolyásolja a keletkező liposzómák méretét adott pH-nál. Ha a díszpeigáló vizes közeg pH-ját változtatjuk, miközben a hidratálószer koncentrációját, állandó értéken tartjuk, szintén előre meghatározható módon befolyásolhatjuk a liposzómák méreléL, így a jelen találmány szerinti eljárással könnyebben, kényelmesebben és előre meghatározható módon szabályozhatjuk a hólyagocska inéreLél az eddig ismert, módszerekhez képest. Az eljárás során a liposzómák előállí4 kásához használt lipidek koncentrációja nincs korlátokhoz kötve.

A találmány tárgya megfelelő módon liposzóma képzésére alkalmas, vizes oldatokban diszpergélható készítmény, melynek összetétele a következő:

a) liposzóma-képzö anyag, előnyösen foszfolipidek, zsírsavak, zsírsavamidok vagy ezek elegye;

b) hidratálószer, melynek a liposzóma-képzö anyaghoz viszonyított mólaránya (1:20)-(1:0,05);

c) adott esetben víz, melynek a fenti anyagokhoz viszonyított mólaránya max. 300 mól.

Stabil liposzómákat úgy állítunk elő, hogy a hidratálószert a liposzóma-képzö anyaghoz viszonyított 1:20-1:0,05 mólarányban használjuk a liposzóma-képző anyagokhoz, és ezt az elegyet liposzómák képzésére alkalmas módon vizes oldatban diszpergáljuk. Úgy is eljárhatunk, hogy a hidratálószeri, a liposzóma-képző anyagot és a kapszulázandó anyagot külön-külön adjuk a vizes oldathoz, ezután liposzómák képzésére alkalmas módon diszpergáljuk.

Az alábbiakban pontosítjuk a találmány leírásában alkalmazandó definíciókat.

A leírásban a .hidratálószer olyan vegyületet jelent, amelynek legalább két, előnyösen ellenkező töltésű ionizálható csoportja van, melyek közül az egyik könnyen disszoc.'áló ionos sót képez, s ez a só komplexet alkot, a liposzóma-képző anyag ionos funkciós csoportjával. A hidratálószer nem képez liposzómákat önmagában és önmagától. Az ilyen szernek fiziológiailag elfogadhatónak kell lennie, azaz semmiféle kedvezőtlen vagy káros fiziológiai hatása nem lehet a kezelendő szervezetre.

A .komplex-képzés a leírásban olyan disszociálható ionos sók képződését jelzi, melyekben az egyik funkciós csoport a liposzóma-képző anyag ionos funkciós csoportjához kapcsolódik és a másik funkciós csoport hidrofil, melyek az igy létrejött komplexet vizo'dhatóvá teszik.

A .hidratált komplex a hidratálószer és a liposzóma-képző anyag komplexét jelenti, melyben a molekulák speciálisan félig-kristályosan rendeződnek el. Bizonyos speciális spektrum-adatok jelzik ennek a komplexnek a jelenlétét.

A hidratálószer és a liposzóma-képző anyagok keveréke bizonyos megadott vízmennyiséggé] gélszerű masszát képez. Ebben a gél-formában a hidratálószer és a liposzómaképző anyag hidratált komplex -be rendeződik, mely nagy rendezett.ségi fokú folyadékkrisláh Miközben a folyadék kristály szerkezete változik a pH és a hidratálószer mennyisége függvényében, maga a folyadékkristály-szerkezet megmarad. Az NMR spektroszkópiás vizsgálatok azt mutatják, hogy a kristályszerkezet egymással alternáló multila-35

HU 198836 Π mellárig lipid kettős rétegekből és hidrofil rétegekből áll. A ³¹P-NMR spektrum anizotrop csúcsokat mutat, mely bizonyíték a multilamelláris kettős rétegek jelenlétére.

A .liposzónia' szó a tudományos irodalomban szintetikus, többrétegű (oligolamelláris) lipid hólyagocskákra vonatkozik. Az ilyen hólyagocskák (vezikulumok) általában egy vagy több természetes vagy szintetikus lipid kettős rétegből állnak, amelyek egy belső vizes fázist vesznek körül.

A .liposzóma-képző anyag' minden olyan természetes és szintetikus anyagra vonatkozik, amely egy ionizálható funkciós csoportot és egy hídrofób komponenst, vagyis zsírkomponenst tartalmaz, ilyenek pl. a foszfolipidek, nem illő zsírsavak, nem illő alkil-aminok és hasonlók, amelyek egyedül vagy kombinációban vizes oldatban diszpergálva liposzómákat képeznek. A jelen találmányt nem kívánjuk a fenti definícióra korlátozni, és ezért bármely lipid hólyagocska képzésére alkalmas anyagot ideértünk.

Liposzóma-képző anyagokra példaként a szappanosítható és nem szappanositható lipidek, pl. a sav-glicerideket, a foszfoglicerideket, a szfingolipideket, a glikolipideket, stb. említhetjük. A zsírsavakon a telített vagy telítetlen 8-24 szénatomos alkil-karbonsavakat,

4-10 szénatomos dikarbonsavak mono- 8-27 szénatomos észtereit (pl. a koleszterin-hemiszukcinátot) és aminosavak zsírsav-származékait értjük; mint például N-acil-karbonsavakat is (pl. N-oleoil-treonin, N-lineoil-szerin, stb.). Mono- vagy di-(8-24 szénatomos alkil)-szulfonát észtereket és mono- vagy di-(8-24 szénatomos alkil)-foszfát észtereket is alkalmazhatunk a zsírsavak helyett. Ezen kívül foszforsav mono- vagy di-(8-24 szénaLomos acil)-glicerin származékait és kénsav monovagy di(8-24 szénatomos acil)-glicerin-származékait alkalmazhatjuk zsírsavak helyett.

Ezen kívül a zsírsavak helyettesíthetők telített vagy telítetlen alkil-aminokkal (pl.8-24 szénatomos alkil-aminokkal), aminok zsírsav-származékaival (pl. 8-24 szénatomos alkil-CONH-NHz-vel), aminosavak 8-24 szénatomos zsíralkohol-származékaival (pl.(8-24 szénatomos alkil)-OOC-NH2), és aminok 8-24 szénatomos zsírsavésztereivel [pl.(8-24 szénatomos alkil)-COO-NH2].

Fotopolimerizálható lipideket és/vagy zsírsavakat (vagy aminokat) (pl. diacetilénes zsírsavak), is alkalmazhatunk, amelyek fotoiniciálás hatására zárt liposzómát. képeznek térhálósított membrán kettős rétegekkel.

Bár ezeknek a liposzómáknak az elsődleges komponensei a lipidek, foszfolipidek és egyéb zsírsavak, egyéb komponenseket is alkalmazhatunk a liposzómák permeabililásának módosítása céljából. Ilyenekre példaként a nemionos lipid-komponenseket (mint pl. polioxi-alkohol vegyületeket, poliglicerin vegyületeket vagy poliolok észtereit, polioxialkilezett alkoholokat), a poliolok észtereit és szintetikus lipolipideket (mint pl. cerebrozidokat) említhetjük. Más anyagokat is alkalmazhatunk, pl. hosszú szénláncú alkoholokat és diótokat, szteroi dókat, hosszú szénláncú aminokat és kvaterner ammónium származékaikat; polioxi-etilénezett zsíralkohol-aminokat, hosszú szénláncú aminoalkoholok észtereit., ezek sóit. és kvaterner ammónium származékait.; zsiralkoholok foszforsav-észtereit, polipeptideket és fehérjéket.

A liposzónia készítmények több különböző lipid-komponenst is, pl. zsírsavakat, alkilaminokal vagy hasonlókat, tartalmazhatnak a hidratálószerrel együtt.

Azt is felfedeztük, hogy a lipid készítményben a .pre-liposzóma gél' vagy liposzóinák képzéséhez nem szükséges a zsírsav (vagy az amin) vagy a hidratálószer jelenléte feltétlenül, ha a lipid-komponens maga, vagy a kapszulázandó anyag (pl. gyógyszer, biológiailag aktív anyag, kozmetikum, stb.) rendelkezik a fentebb említett tulajdonságokkal, így pl· dipalmitoil-foszfatidil-kolin (DPPC) és a disztearoil-foszfatidil-etanol-amin keveréke .pre-liposzóma gél'-t vagy liposzómákat képez vizes glutaminsav-oldattal, és a DPPC és olajsav keveréke vizes epinefrin oldattal képzi a .pre-liposzóina gél'-t és a liposzómákat.

Gyógyászati alkalmazáshoz azonban a foszfolipidek, olajsav (vagy foszfatidil-etanol-amin) és arginin vagy lizin (vagy glutaininsav és/vagy aszparaginsav) kompozíciója az előnyös.

Amikor szilárd anyagokról beszélünk, ez a liposzóma-képző anyagokra, hidratálószerekre, és (ha vannak ilyenek) kapszulázandó anyagokra vonatkozik.

A találmány szerinti hidralálószerek az olyan alfa-aminosavak, amelyek az omega-helyzetben ionizálható helyettesítővel rendelkeznek, ilyenek az

X - (CHzJn - Y (I) általános képletű vegyületek, ahol

X jelentése H2N-C(NH)-NHvagy ZCteC-csoport, amelyen belül

Z jelentése hidrogénatom vagy szervetlen vagy szerves kation;

Y jelentése -CHÍNHzJ-COzH, n jelentése 1 és 5 közötti egész szám;

valamint a fentiek gyógyászatilag elfogadható sói. Az előnyös vegyületek közé tartoznak az Ν,Ν’-dialkil-helyellesitett arginin vegyületek és hasonló vegyületek, ahol az alkil-lánc hossza változó.

Még inkább előnyös hidratálószerek az ómega-helyzetben szubsztituált alfa-aminosavak, mint például az arginin, glutaminsav.

A hidratálószer és a liposzóma-képző anyag mőlaránya a készítményben kb. 1:20, maximum 1:0,05, előnyösen (1:2)-(1:0,5).

A találmány szerinti készítményekben egy vagy több hidratálószert alkalmazhatunk.

HU 198836 Β

A hidratálószereket bármilyen keverék formájában használhatjuk, korlátozás nélkül.

Gyakorlati szempontból előnyös, ha a liposzómákat negatív töltéssel rendelkező liposzóma-képzó anyagok segítségével készítjük, ez esetben előnyős olyan hidratálószereket alkalmazni, amelyek legalább egy ionizálható nitrogénatomot tartalmaznak; ilyen pl. az arginin. Fordítva viszont, ha a liposzórnák képzéséhez használt amfipatikus anyagok nitrogénalapúak, előnyös kétbázisú savakat alkalmazni, ilyen pl. a glutaminsav.

A találmány szerinti eljárásban szereplő hidratálószerek számos vegyszergyárló katalógusában szerepelnek, az ilyen gyártók rendszeresen gyártják ezeket, vagy a szakterületen ismert módszerekkel előállithatók.

Az arginin, homoarginin, lizin, glutaminsav, aszparaginsav és más természetben előforduló aminosavak fehérjék hidi'olízisével és az egyes aminosavak elkülönítésével vagy bakteriális forrásokból állíthatók elő.

A liposzóma-képző anyagok és egy vagy több hidratálószer keveréke az összes liposzóma-képző anyaghoz viszonyítva max. 300 mól vízmennyiséggel olyan gélt ad, amelyből közvetlenül liposzórnák keletkeznek vizes oldat hozzáadására. Ezt a gélt pre-liposzóma gélnek nevezzük,

i) szerkezeti jellemzői miatt, amely lényegében azonos a liposzórnák szerkezeti jellemzőivel, és ii) a gélnek azon tulajdonsága miatt, hogy liposzómakká alakul vizes oldattal való hígítására. Amennyiben a viz mennyisége

300 mól fölötti, megindul a liposzórnák képződése.

Ez a gél nagy rendezettségi fokú folyadék ( istály, amely optikailag tiszta oldatot kép» . A folyadékkristály X, Y és Z dimenziói változnak a hidratálószer koncentrációjának változtatásával állandó pH mellett, valamint az oldat pH-jának függvényében. A hidratálószer koncentrációját állandó pH-η változtatva, vagy a pH-t változtatva, miközben a hidratálószer koncentrációját állandó értéken tartjuk, a létrejövő liposzóma hólyagocskák lipid kettős rétege lamellás szerkezeteinek méretét és számát szabályozhatjuk.

A gélszerkezet maga mintegy 300 mól vizet tud befogadni 1 mól lipidre vagy zsírsavra számítva anélkül, hogy ez zavarná a gél szerkezetét. A gél szerkezete, amint ezt 31 P-NMR spektroszkópiával meghatároztuk, több lamelláris lipid kettős rétegből és hidrofil rétegből áll össze, egymással összetapadva, egymást kővető sorrendben. Az azonos gél ^3IP-NMR spektrum egy anizotrop csúcsot mutat, további bizonyítékot szolgáltatva, hogy a gél több lamelláris kettős rétegből áll.

Ezt a gélt autoklávban lehet sterilezni. Ezen kívül a gél nem mutat elszíneződést és világos marad szobahőmérsékleten legalább egy évig az autoklávozás után. A gélt továb6 bá szűréssel is lehet sterilezni megfelelő sterilező szűrőt alkalmazva.

A gélt vizes oldatban diszpergálva hatékonyan és spontán módon liposzórnák keletkeznek.

A pre-liposzóma gél a kapszulázandó anyaggal együtt, vagy anélkül dehidratálható (liofilizálható), és a por rehidratálható, és így spontán módon képződnek liposzórnák még hosszú időtartamú tárolás után is. A találmány szerinti készítmény különösen alkalmas vízérzékeny gyógyszerek esetén, ha hosszú időtartamú tárolás szükséges a felhasználás előtt.

A találmány szerinti készítmény ill. eljárás alkalmazásával akár vízben oldhatatlan, akár vizoldható vegyi anyagokat, gyógyszereket, kozmetikumokat, élelmiszereket és hasonlókat. építhetünk be a liposzómákba. Következésképpen gyógyászati kezelés céljából a gél orálisan, parenterálisan, helyileg, intravénás úton, végbélkúp formájában, stb. alkalmazható, és abból a hatóanyag felszabadul.

A liposzórnák alkalmazása nem korlátozódik csak emberben vagy emlősökben való felhasználásra, hanem bármilyen ipari, mezőgazdasági, gyógyszerészeti, kozmetikai vagy vegyi célra, felhasználhatók ahol a vegyületeket vagy anyagokat lipid bólyagocskában kapszulázva szükséges alkalmazni.

A találmányt az alábbi példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy a példákra korlátoznánk.

1. példa

Liposzórnák készítése (gélfázis) g dipalmitoil-foszfatidil-kolint mérünk be 50 nil-es főzőpohárba. 1,2 g olajsavat adunk hozzá és összekeverjük, hogy egységes pép képződjék.

0,72 g arginint 30 ml ionmentesitett vízben oldunk, majd hozzáadjuk a dipalmitoil-foszfatidil-kolin/olajsav péphez és 45 °C hőmérsékleten melegítjük. Kézzel keverve a keverék tiszta gélt képez. A gélt tároljuk, és később liposzómákat képezünk úgy, hogy a gélt foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatta] hígítjuk.

2. példa

Liposzórnák készítése

120 nig dipalmitoil-foszfatidil-kolint és 24 mg olajsavat mérünk össze és alaposan keverjük mindaddig, amíg homogén feltér pép nem képződik.

Ezután 20 mg arginint oldunk fel 60 ml foszfáttal pufferolt konyhasó-oldatban (ionerősség = 0,15; pH = 7,4).

HU 198836 Π

Az arginin-só oldatát a péphez adjuk, és 40 °C hőmérsékleten 1/2 órán át, vagy addig, amíg enyhén zavaros oldatot kapunk, melegítjük.

3. példa

Nagy mennyiségű üzemi gél- és liposzóma készítés

i) Gél készítése: 50 g tojás foszfatid port (20. típus, Ashai Chemicals) adunk 20 g olajsavhoz (USA gyógyszerkönyvi minőség). A keverés után fehér pépet kapunk, amelyet 4 °C hőmérsékletre lehűtünk, és finom porrá őriünk. Ezt a port 20 g arginin és 500 g desztillált, ionmentesített viz oldatához adjuk. A keveréket spatulával keverjük, miközben az oldatot mintegy 35 °C hőmérsékleten tartjuk, így segítve a foszfolipidek hidratálását. Ezt a gélt 4 °C hőmérsékleten tároljuk, vagy fagyasztjuk, és később hidratáljuk.

ii) Liposzómák készítése: Az előzőekben készített, fagyasztva tárolt gélt szobahőmérsékletre melegítjük. Ez után 2 liter foszfáttal pufferolt konyhasó-oldatot (pH 7,4) adunk hozzá. Fehér, átlátszatlan liposzóma oldat képződik.

4. példa

Liposzóma-képzés a gélből

Homogén pépet készítünk 1,0 g dipalniitoil-foszfatidil-kolinból (DPPC) és 400 mg olajsavból. Ezután 300 mg arginint összekeverünk 10 ml foszfáttal pufferolt konyhasó-oldattal, 45 °C hőmérsékletre melegítjük, és a DPPC/olajsav péphez adjuk, igy liposzómák képződnek.

5. példa

Pre-liposzóma gél gramm dipalmitoil-foszfatidil-kolint (DPPC) összekeverünk 400 mg olajsavval, hogy homogén pépet kapjunk. 300 mg arginint 2 ml vízzel oldódásig keverünk 45 °C hőmérsékleten. Az arginin oldatot összekeverjük a DPPC/olajsav péppel mintegy 45 °C hőmérsékleten, igy viszkózus gélt kapunk. A gélt foszfáttal pufferolt konyhasó-oldattal hígítva liposzómák képződnek.

6. példa

Koleszterint tartalmazó liposzómák mg koleszterint összekeverünk 100 mg dipalmiloil-foszfatidil-kolinnal (DPPC) igy homogén port. kapunk. Ezután 23 mg olajsavai adunk a porhoz és alaposan összekeverjük, így homogén pépet nyerünk. 30 mg arginint adunk 10 ml foszfáttal pufferolt konyhasó-oldathoz, 40 °C hőmérsékletre melegítjük) és hozzáadjuk a DPPC/koleszterin/olajsav péphez. A keveréket 40 °C hőmérsékleten keverve liposzómákat kapunk.

7. példa

Palmitinsavat tartalmazó liposzómák

250 mg dipalmitoil-foszfatidil-kolint (DPPC) összekeverünk 25 mg palmitinsavval, igy egységes port kapunk. Ezután 80 mg olajsavat összekeverünk ezzel a porral, és 45 °C hőmérsékleten tartjuk állandó keverés mellett, amíg egységes · pép keletkezik. 100 mg arginint feloldunk 25 ml desztillált, ionmentesitett, vízzel, és 45 °C hőmérsékleten, és addig keverjük, amíg egységes, homogén gél keletkezik. A gélt foszfáttal pufferolt konyhasó-oldattal tízszeresére hígítva liposzómák képződnek.

8. példa

Tzosztearinsaval tartalmazó liposzómák

100 mg dipalmitoil-foszfatidil-kolint összekeverünk 50 mg izosztearinsavval, így egységes, homogén paszta képződik. Arginin-oldatot készítünk 50 mg arginint 2,0 mg desztillált, ionmentesített vízben feloldva, és ezt hozzáadjuk az izosztearinsavas péphez, és 45 °C hőmérsékleten melegítjük. A keveréket addig kevertetjük, amíg tiszta gél képződik. Ebből liposzómákat foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal való hígítással állítunk elő.

9. példa

Oleoil-treonint tartalmazó liposzómák

125 mg dipalmitoil-foszfatidil-kolint és 75 mg oleoil-treonint összekeverünk és 40 °C hőmérsékleten melegítve pépet képezünk. Ezután 2 ml desztillált, ionmentesitett vizet adunk hozzá állandó keverés közben 40 °C hőmérsékleten. Tiszte gél képződik, amelyet foszfáttel pufferolt konyhasóoldattal hígíthatunk (pH 5) liposzómák előállítása céljából.

-611

10. példa

MiriszLil-amint tartalmazó liposzómák

192 mg dipalmitoil-foszfatidil-kolint adunk 72 mg mirisztil-aminhoz, és állandó keverés közben melegítjük, amíg egységes pép keletkezik. 65 mg glutaminsavat 5 ml desztillált, ionmentesitett vízben oldunk és ezt a péphez adjuk, majd addig melegítjük, amíg gél képződik. Liposzómák előállítására foszfáttal pufferolt konyhasóoldatot adunk a gélhez.

11. példa

DLPC-t tartalmazó liposzómák mg dilauril-foszfatidil-kolint (DLPC) 20 mg olajsavval összekeverve homogén pépet állítunk elő. 20 mg arginint adunk 10 nd foszfáttal pufferolt konyhasóoldathoz, ezt az oldatot a péphez adjuk, és kézzel keverjük, amig zavaros liposzóma oldat képződik.

12. példa

Foszfatidil-eLanolamin-glutaminsav liposzómák mg L-glutaminsavat feloldunk 2,0 ml desztillált, ionmentesitett vízben, és a pH-t 5,2-re állítjuk be 1,0 n nátriuni-hidroxiddal. Ezt az oldatot 60 °C hőmérsékletre melegítjük, és 100 mg foszfatidil-etanolamint adunk hozzá. Az oldatot 60 °C hőmérsékleten tartjuk állandó keverés mellett, amíg egységes, viszkózus gél keletkezik.

A foszfatidil-etanolaminsav gélt 1/10 arányban hígítjuk foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal. Hólyagocska-szerű szerkezeteket figyelhetünk meg fáziskontraszt-fénymikroszkóp alatt.

HV 198836 P

14. példa

Flurbiprofén liposzómák

980 mg dipalmitoil-foszfatidil-kolint,

370 mg olajsavat és 320 mg flurbiprofent (szabad sav) addig keverünk, amíg homogén pép képződik. Ezután 510 mg arginin és 10 ml tisztított víz oldalát adjuk a péphez, és 41 °C hőmérsékleten tartjuk állandó keverés mellett 30 percen át. Az így keletkezett pre-liposzóma gél 5 g-ját 50 ml, foszfáttal pufferolt 1 <ony hasóoldathoz adjuk, és keverőbottal kevergetjük, amíg kékes, áttetsző ol15 dat keletkezik.

15. példa

Levobunolol liposzómák mg dipalniitoil-foszfatidil-kolint és 15 mg koleszterint egy 4 ml-es ampullába mérünk. 10 mg linolsavat adunk hozzá és ke25 veréssel egységes pépet képezünk. 10 ing arginint is tartalmazó 2 ml 1%-os vizes levobunolol oldatot keverünk ezután a péphez, majd 10 ml foszfát-puffer oldatot adunk hozzá, és 45 °C hőmérsékleten melegítve liposzó30 mákat képezünk.

16. példa

Pilocarpin liposzómák

120 mg dipalmitoil-foszfatidil-kolinból és 40 mg olajsavból homogén pépet állítunk eló. 40 mg pilocarpin szabad bázist adunk 10 ml •10 desztillált, ionmentesitett vízhez. Ezt az oldatot a péphez adjuk, és 45 °C hőmérsékleten melegítve pre-liposzóma gélt állítunk elő. Az így kapott gélL 20 ml, foszfáttal pufferolt kcnyhasóoldatlal hígítjuk, így liposzómák képződnek.

13. példa

Dipivaloil-epinefrin liposzómák gramm dipalmitoil-foszfatidil-kolint 396 mg olajsavval összekeverve homogén pépet állítunk elő. Ezután 20 ml desztillált, ionmentesitett vízben oldott 400 mg arginint adunk hozzá, így tiszta pre-liposzóma gélt képezünk.

Liposzómák előállítása céljából 242 mg dipivaloil-epinefrint feloldunk 10 ml desztillált, ionmentesitett vízben. Ezután 5 gramm pre-lipoezóma gélt összekeverünk a dipivaloil-epinefrin oldat 5 g-jával, ezután pedig 50 ml foszfáttal pufferolt konyhasó-oldatot adunk hozzá, és így liposzóma oldat képződik.

17. példa

Epinefriti liposzómák

250 mg dipalmitoil-foszfatidil-kolinból és 100 ing olajsavból homogén pépet képzünk. 50 mg epinefrin szabad bázist feloldunk

5,0 ml desztillált vízben, 40 °C hőmérsékletre melegítjük, és hozzáadjuk a dipalmitoil-foszfa’.idil-kolin/olajsav péphez. Ezt az oldatot addig keverjük, amig homogén, viszkózus, finom gól keletkezik. Ezt a gélt 1/5 arányban foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal (pH 7,22) hígítva liposzómákat állítunk elő.

-713

HU 198836 8

18. példa

Az arginin-koricentráció hatása a liposzóma méretére

502 mg dipalmitoil-foszfatidil-kolirihoz (DPPC) 10 mikroliter (2-palniitoil-l-C¹⁴) (0,1 mCi/ml)-diplamitoil-foszfatidil-kolint adunk. Kloroformot adunk az oldathoz, hogy a radioaktív anyag tökéletesen elkeveredjen, majd az elegyet bepároljuk. 195 mg olajsavat (OA) keverünk ezután a lipidbe pépet képezve. 119 mg ar ginint tartalmazó 5 ml desztillált vizet adunk ezután a maradékhoz, és 45 °C hőmérsékleten keverve tiszta gélt képezünk.

A gélből 1-1 grammot bemérünk 4 különböző ampullába, és arginint adunk hozzá a következő összetételbe

I. TÁBLÁZAT

Minta Minta összetétele

DPPC:OA:Arg

1. ampulla + 1 ml víz (1:1:1)

2. ampulla + 1 ml 50 mg/ml koncentrációjú vizes arginin-oldat (1:1:3)

3. ampulla + 1 ml 84 mg/ml koncentrációjú vizes arginin-oldat (1:1:5)

4. ampulla + 1 ml 192 mg/ml koncentrációjú vizes arginin-oldat (1:1:10)

Az egyes oldatok 0,5 grammjait hígítjuk 50 ml foszfáttal pufferolt konyhasóoldatban (pH 7,8).

A becsűit átmérőt Sephacryl S-1000 oszlopkromatográfiás elemzésből kapjuk, ¹⁴C-izotóppal jelzett DPPC-t alkalmazva. A hatásokat az alábbi II. táblázatban adjuk meg.

II. TÁBLÁZAT

Az arginin hatása a Iiposzóma méretére

19. példa

A pH hatása a Iiposzóma méretére

A fentieken kívül a Iiposzóma mérete a vizes pufferoldat pH-jának változtatásával is változtatható.

100 mg dipalmitoil-foszfatidil-kolinhoz (DPPC) 25 mikroliter (2-palmítoil-l-C¹⁴) (0,1 mCi/ml) dipalmitoil-foszfatidil-kolinl adunk. Az oldalhoz kloroformot adunk, hogy a radioaktív anyag tökéletesen elkeveredjen, majd bepároljuk. 40,1 mg olajsavat keverünk ezután a lipidhez, és pépet képzünk. 24 mg/ml-es, vizes arginin-oldat 1 ml-ét adjuk a lipid-keverékhez, és 45 °C hőmérsékleten keverve tiszta gélt állítunk eló.

Ennek a gélnek 100 mg-os alikvotjait hígítjuk 10 ml foszfát-pufferban pH 9,0-nál, illetve pH 7,4-nél.

A becsült átmérőt (A) ismét a Sephacryl

S-1000 oszlopkromatográfiás elemzés adataiból kapjuk ineg, a ^,4C-izotóppal jelzett dipalmitoil-foszfatidil-kolint alkalmazva. Az eredményeket a III. táblázatban adjuk meg.

III. TÁBLÁZAT

Λ pH hatása a Iiposzóma méretére

Rendszer	pH	Becsült golyó- átmérő
DPPC:OA:Arg (1:1:1)	7.4	300
DPPC:OA:Arg (1:1:1),	7.8	220
DPPC:OA:Arg (1:1:1)	9.0	25.4

igy a liposzóma-hólyagocskák kivánt méretét be lehet állítani az arginin-koncentráció vagy a vizes pufferoldat pH-jának változtatásával.

Rendszer pH Becsült liposzóma átmérő (nm)

DPPC:OA:Arg	7.8	220
(1:1:1)
DPPC:OA:Arg (1:1:3)	7.8	140
DPPC:OA:Arg (1:1:5)	7.8	90
DPPC:OA:Arg (1:1:10)	7.7	20

20. példa

Liposzóma stabilitás

Steril liposzómákat készíthetünk a hővel sterilezett. pre-liposzóma-gélből. Egy másik módszer szerint a liposzóma gélt vagy a lil>oszómákat sterilre lehet szűrni megfelelő sterilező szűrőn.

DPCC:OA:Arg(l: 1:2) arányú, pH 8,0-nal készített liposzómákat hővel sterilezőnk, és szobahőmérsékleten tároljuk mintegy 1 éven át. antimikrobáns szerek és antioxidánsok nélkül. Baktérium fejlődést, elszíneződést vagy kicsapódást néni észlelünk. Az egy éves liposzómák negatív festésű elektronmikroszkópos vizsgálata szerint a líposzónia-hólyagocskák stabilak.

-815

HU 198836 Η

21. példa

Szacharóz kapszulázottságát mérjük, DPPC:OA:Arg (1:1:1) liposzóma rendszerben, pH 7,8-as vizes foszfát pufferoldatban, C¹⁴-szacharózt alkalmazva. Az eredményeket a

IV. táblázatban mutatjuk be.

IV. TÁBLÁZAT

Százalékos szacharóz kapszulázottság

Nap % kapszulázottság

100 1 97.4

93.4

91.4 így a találmány szerinti rendszer kiválóan alkalmas gyógyszerek kapszulázására.

22. példa

A kapszulázás hatékonysága

Gyógyszereket kapszulázunk 10 nig/nil-es DPPC:olajsav:Arg(l:l:l) liposzómákban. Az eredményeket az V. táblázatban mutatjuk be.

V. TÁBLÁZAT

Gyógyszertartalom

Gyógyszer pH %-os tartalom

Flurbiprofen 7.8 PBS 90%

Dipivaloil-epinefrin 7.1 PBS 80% (PBS = foszfáttal pufferolt konyhasóoldat)

23. példa

Liofilezett liposzómák g olajsavat és 7,5 g koleszterint (USA gyógyszerkönyvi minőség) összemérünk. Ezután 75,0 g foszfatidport (20. típusú por; Asahi Chemical Co.) összekeverünk az olajsav/koleszterin keverékkel, amíg homogén pép képződik.

Ezután 15 arginint (szabad sav) feloldunk 183 g desztillált, ionmente6Ített vízben. Ezt az arginin-oldatot lassan összekeverjük a lipid-péppel, így homogén gélt kapunk. A gél pH-ját. 7,4-re állítjuk be, 5 n HCL-L alkalmazva.

Ebből a pre-liposzóma gélből 10,0 g-ot bemérünk egy 10 ml-es ampullába, és liofilezzük. Az igy kapott porból liposzómákat állítunk elő, 5 ml, foszfáttal pufferolt konyhasóoldat hozzáadásával.

24. példa

Savas közegben stabil liposzóma készítmények

A találmány szerinti savas közegben stabil liposzómák ra példaként azokat a liposzómákat említhetjük, amelyeket a következő anyagokból készítünk: disztearoil-foszfatidil- koliri, dipalmitoil-foszfalidil-kolin, olajsav, arginin és koleszterin. Ezeket az anyagokat 1:2:2:2:0,2 mólarányban keverjük össze a kővetkező módon: 20 mg koleszterint összekeverünk 144 mg olajsavval és 40 °C hőmérsékletre melegítjük. 200 ing DSPC-t és 400 mg DPPC-t adunk hozzá, és 40 °C hőmérsékleten keverjük a kapott elegyet addig, amíg egységes, homogén pép képződik.

mg arginint feloldunk 1,15 g ionmentesített, desztillált vízben. Ezt az arginin-oldatot a péphez adjuk, és mintegy 45 °C hőmérsékleten keverjük, amíg homogén pre-liposzóma gél keletkezik. A gél pH-jét különböző pH értékekre állítjuk be 0,1 n HCL hozzáadásával. A gélt tízszeresére hígítjuk 0,9%—os sósav oldattal, így liposzómákat. állítunk elő.

Liposzóma-stabilitás pH 4,4-nél

Idő (nap) Méret (nm.10^{* 3})

1.024

1.136

1.127

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Liposzómák képzésére alkalmas készítmény, azzal jellemezve, hogy 1:20 és 1:0,05 közötti mólarányban 5

i) X-(CHz)n-Y általános képletű hidratálószert, ahol X jelentése karboxilcsoport vagy -NH-C-NIL

II

NH 10 képletű csoport, Y jelentése -CH-COOH

I

NHz képletű csoport, n jelentése 1 és 5 közötti egész szám, 15 ii) liposzómaképző anyagot, előnyösen foszfolipideket, zsírsavakat, zsirsavamidokat vagy ezek elegyét tartalmazza adott esetben a hidratálószer és a liposzómaképző anyag összmennyiségére számított legfeljebb 20 300 mól vizben.

2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy hidrat.álószerként ai— ginint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza. 25

3. Az 1. igényponl s/i-rinli készítmény, azzal jellemezve, hogy hid ralalószi'i k''iit ghitaminsaval. vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike sze- 30 rinti készítmény azzal jellemezve, hogy' a hidratálószer mennyisége (1:2) - (1:0,5) mól a liposzóma-képzö anyaghoz viszonyítva.