NO863176L - Fremgangsmaate og blanding ved fremstilling av liposomer. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører nye liposomdannende blandinger

som gir en ny metode til å danne liposomer. Nærmere bestemt vedrører denne oppfinnelse bruk av dehydratiseringsmidler, forbindelser med minst to joniserbare grupper, med liposomdannende materialer for å fremstille en gel som spontant danner liposomer når den fortynnes med en vandig løsning.

Mange prosesser og metoder er blitt utviklet for å fremstille forskjellige typer og størreler av liposomer for innkapsling av den aktive bestanddel. De fleste av disse metoder har vært konsentrert på anvendelsen av et organisk løsningsmiddel for å sikre fullstendig solubilisering og jevn blanding av fosfolipidene og fettsyrene før dispergering i et vandig system. En annen utvikling var bruk av ultralydbestråling for å dispergere fosfoii-pid/fettsyrematerialet.

For eksempel Robinson, Trans. Faraday Soc.,56 :1260 (1960) og Papahadjopoulos, et al. [ Biochim. Biophys. Acta, 135, 639 (1967)

] beskriver dannelsen av fosfolipiddispersjoner fra et to-fase eter/vann-system som medfører fordamping av eteren ved å boble nitrogen gjennom blandingen. På lignende måte har kloroform blitt brukt av Chowhan, et al., Biochim. Biophys. Acta, 266:320

(1972) for å sikre grundig og fullstendig blanding av fosfolipidene før dispergering.

Ultralyddispergering som først ble beskrevet av D. Papahadjopoulos og N. Miller i Biochim. Biophys. Acta. 135:624 (1967) gir små unilamellære vesikler, men teknikken er begrenset på

grunn av dårlig innkapslingsvirkning.

Batzri og Korn [ Biochim. Biophys. Acta, 198:1015 (1973)]har bruk teknikken til å injisere lipidene i en organisk fase (etanol) inn i en vandig løsning. Eter ble brukt av Deamer og Bangham i den hovedsakelig samme teknikk [ Biochim. Biophys. Acta, 443:619 (1976)]

Enda en annen teknikk er en kalsium-indusert strukturforandring i en lipidvesikkel som stammer fra eller inneholder fosfatidylserin, men opplyses å ha en relativt lav innkapslingsvirkning som skyldes rekonstitueringmetoden for vesikkelen. Se Papahadjopoulos, et al., Biochim. Biophys. Acta, 394:483 (1975) og H.Hauser, Trends in Pharm., Science 3, 274-77 (1982).

Flere andre patenter beskriver metoder for lipidvesikkel-dannelse av interesse for denne oppfinnelsen. U.S.patent nr. 3.804.776 beskriver en metode for fremstilling av olje- og fettinnkapslete aminosyrer for polypeptider ved å dispergere tørre pulvere av materialet i en smeltet blanding av fettet eller oljen og deretter helle blandingen i vann. Det innkapslete materialet befinner seg i relativt store dråper av lipid. Slike vesikler er ikke egnet for intravenøs injeksjon og er begrenset til bruk for bare oral administrering.

Innfanging av visse legemidler i lipidvesikler ved å fryse

den vandige fosfolipiddispersjon av legemiddel og lipid er beskrevet i U.S.patent nr. 4.016.100.

Papahadjoplous og Szoka beskriver i U.S.patent nr. 4.235.871

en fremgangsmåte for å lage liposomer, hvor det vesikkel-dannende materialet oppløses i et organisk løsningsmiddel og så biandes med en vandig løsning inneholdende materialet som skal innkapsles. En homogen vann-i-olje-emulsjon dannes, og det organiske løsnings-middel fordampes og gir en gel-liknende blanding. Denne gel oppslemmes så i vann for å danne vesiklene.

En annen interessant fremgangsmåte er beskrevet i U.S.patent nr. 3.932.657 , som beskriver innkapsling av polyaminopolykarbok-sylsyre-chelatiseringsmidler, EDTA og TDPA. Enda et annet U.S.patent nr. 4.217.344 angir at bestemte additiver kan kombineres med ikke-joniske lipidforbindelser, slik at gjennomtrengeligheten og overflateladningen til lipidvesikler modifiseres. Blandt de forskjellige nevnte additiverer polypeptider og proteiner. Mackaness et al. beskriver i U.S.patent nr. 4.192.859 kontrastmedier som inneholder liposomer som bærere. Listen av kontrastmiddel salter innbefatter argininsalt, cysteinsalt, glysinsalt, glysidylglysinsalt og N-metylglukosaminsalter. Disse materialer karakteriseres som alifatiske og alicykliske aminer som kan brukes til å fremstille vannløselige salter av de forskjellige kontrastmidler som kan anvendes i røntgenkontrastmidler.

En artikkel i Science, mars 1984 av Janos Fendler viser til

en rekke syntetiske overflateaktive midler som kan brukes til å danne vesikler. Fendler angir kvartærnære ammonium- og karboksylat-

, sulfat-, sulfonat- og fosfat-zwitterjoniske materialer som er omtalt i de følgende litteraturartikler: J.H. Fendler,A cc. Chem.

Res., 13, 7 (1980); T. Kunitake og S. Shinkai, Adv. Phys. Org. Chem., 177, 435 (1980); T.Kunitake et al., J. Am. Chem. Soc, 103, - 5401 (1981); J. H. Fuhrhop og J. Matthieu, J. Chem. Soc. Chem. Commun. s. 141 (1983); og W. Talmon et al., Science, 221, 1047

(1983) .

Man har oppdaget at liposomer dannes spontant når fosfolipider og/eller fettsyrer, liposomdannende materialer, dispergeres i en vandig løsning som inneholder et dispergeringsmiddel. Denne klasse forbindelser illustreres i forbindelse med oppfinnelsen ved arginin og lignende aminosyrer som har minst en funksjonell joniserbar gruppe ved både a- og Q-endene av molekylet. Disse "hydratiserende" forbindelser vil enten ha samme type joniserbare grupper på molekylet, bare katjoniske eller bare anjoniske, eller ha joniserbare grupper med motsatt ladning. Det er ikke påkrevet at de joniserbare gruppene er på a- og Q-karbonatomer, men slike forbindelser utgjør de foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen.

Dette betyr at liposomer som dannes ved bruk av denne oppfinnelse formuleres som en "preliposom gel" som her kalles en "gel" hvor en fosforlipid- og/eller fettsyreblanding som kan danne liposomer blandes med en passende, konsentrert vandig løsning av den hydratiserende forbindelse. Denne gel danner etter dispergering i en vandig løsning virkningsfullt og spontant liposomer uten løsningsmiddeltordampning, innføring av ultralydbestråling eller andre anordninger som er utviklet for å sikre riktig dannelse av lipid vesikler, liposomer.

Liposomer fremstilt med hydratiseringsmidler er stabilere

enn de som dannes ved vanlige metoder innbefattet slike som dannes ved å bruke organiske løsningsmidler og ultralydenergi. Liposomformuleringer med disse hydratiseringsmidler lider ikke av noen av de tidligere kjente problemer med å fjerne løsningsmiddel og liposomene utsettes ikke for ujevne, destruktive krefter fra ultralydbestråling som følger med de eldre metoder.

I tillegg kan preliposomgelen være dehydratisert og lagres over lengre tid og likevel spontant kunne danne liposomer etter rehydrering.

Pre-liposom gelen er uvanlig stabil, og stabil nok til å autoklaveres for sterilisering. Videre kan vannløselige eller vannuløselige substanser som skal innkapsles settes til gelen og vil da innføres i liposomene etter dispergering av gelen. Denne evnen bevirker meget forsterket innkapslingseffekt.

Videre er det også oppdaget at konsentrasjonen av hydratiseringsmiddel påvirker størrelsen av de resulterende liposomer på en forutsigbar måte ved en gitt pH. Følgelig påvirker variasjon av pH i den dispergerende vandige løsning mens hydratiseringsmidlet holdes konstant også størrelsen av liposomene som dannes på en forutsigbar måte.

Således gir foreliggende oppfinnelse en lettere, greiere og forutsigbar måte for å kontrollere vesikelstørrelse sammenlignet med tidligere tilgjengelige metoder. Denne metode har heller ingen begrensninger på konsentrasjonene av lipider i fremstillin-gen av liposomer.

Sammenfatning av oppfinnelsen

Denne oppfinnelse vedrører et liposomprodukt fremstilt ved å dispergere i en vandig løsning på hensiktsmessig måte for å danne liposomer en blanding sammensatt av: a. liposomdannende materiale; b. et hydratiseringsmiddel hvor hydratiseringsmidlet foreligger i et molarforhold mellom 1:20 og 1:0,05 i forhold til det liposomdannende materiale; c. vann i en mengde opptil 300 mol i forhold til fast-stoffene; og

d. eventuelt et materiale som skal innkapsles.

I et annet aspekt dekker oppfinnelsen en blanding som kan danne liposomer med dispergering i en vandig løsning, hvilken blanding omfatter: a. liposomdannende materiale;

b. et hydratiseringsmiddel hvor hydratiseringsmidlet foreligger i et molarforhold mellom 1:20 og 1:0,05 i forhold til det liposomdannende materialet;

c. eventuelt materiale som skal innkapsles; og

d. vann i en mengde opptil 300 mol i forhold til fast-stoffene .

Et annet aspekt av denne oppfinnelse vedrører en metode til å danne stabile liposomer, hvor metoden består i å sette et hydratiseringsmiddel til liposomdannende materialer i et molar forhold mellom 1:20 og 1:0,05 i forhold til det liposomdannende materialet og dispergere blandingen i en vandig løsning på en hensiktsmessig måte til å danne liposomer. Alternativt kan hydratiseringsmidlet, det liposomdannende materialet og substan-sen som skal innkapsles settes separat til den vandige løsning og deretter kan dispersjonsmidler tilføres for å danne liposomene.

SPESIFIKKE UTFØRELSESFORMER

Definisjoner

I denne oppfinnelse betyr et hydratiseringsmiddel en forbindelse med minst to ioniserbare grupper, fortrinnsvis av motsatt ladning, hvorav en kan danne et lett dissosierbart ionisk salt, hvilket salt kan kompleksere med den ioniske funksjonalitet i det liposomdannende materialet. Hydratiseringsmidlet danner ikke liposomer i og av seg selv. Et slikt middel ville også være fysiologisk akseptabelt, dvs. det vil ikke ha noen utilsiktet eller uheldig fysiologisk virkning på verten som det gis til i forbindelse med sin bruk i denne oppfinnelse.

Kompleksering i denne sammenheng betyr dannelse av dis-sosierbare ioniske salter, hvor en funksjonell gruppe forbinder seg med den ioniske funksjonelle gruppe i det liposomdannende materialet, og den andre funksjonelle gruppe har hydrofile egenskaper som påvirker vannløselighet til det resulterende kompleks.

Hydratisert kompleks betyr komplekset som dannes mellom hydratiseringsmidlet og det liposomdannende materialet, hvorved det dannes en spesifikk halvkrystallinsk anordning av molekyler. Visse særpregede spesifikke spektraldata karakteriserte nærværet av dette kompleks.

Blandinger av hydratiseringsmidlet og liposomdannende materialer med bestemte, avgrensede mengder vann danner en gellignende masse. I denne gelform anordner hydratiseringsmidlet og det liposomdannende materialet seg i et "hydratisert kompleks" som er en meget ordnet flytende krystall. Selv om den flytende krystallstruktur varierer med pH og mengden av hydratiseringsmiddel, forblir den flytende krystallstruktur. NMR-spektroskopi bekrefter at krystallstrukturen består av multilamellære lipide bisjikt og hydrofile sjikt stablet sammen på vekselvis måte.

<31>p<->NMR-spektret viser en anisotropitopp som videre bekrefter eksistensen av multilamellære bisjikt.

Ordet "liposom" har blitt foreslått og akseptert som betegnelsen som brukes i den vitenskapelige litteratur for å beskrive syntetiske, oligolamellære lipidvesikler. Slike vesikler består normalt av et eller flere naturlige eller syntetiske lipide bisjikt som omgir en innvendig vandig fase.

Frasen "liposomdannende materiale" viser til alle naturlige og syntetiske forbindelser som har en ioniserbar funksjon og en hydrofob komponent, en fettkomponent såsom fosfolipidene, ikke-flyktige fettsyrer, ikke-flyktige alkylaminer og lignende som enkeltvis eller i kombinasjon danner liposomer ved dispergering i en vandig løsning. Denne definisjon skal ikke sees som be-grensende i sitt omfang, men må leses til å omfatte alle forbindelser som har evne til å danne lipidvesicler, forut, nå og fremtidig.

Eksempler på liposomdannende materialer innbefatter forsåpbare og ikke-forsåpbare lipider, f.eks. acylglycerolene, fosfa-glyceridene, sfingolipidene, glycolipidene osv. Fettsyrene inneholder mettede eller umettede alkyl (C8-C24) karboksylsyrer, mono-alkyl (C8-C27) estere av Ca-Ci 0 dikarboksylsyrer (f.eks. kolesterol hemi-ravsyre) og fettsyrederivater av aminosyrer hvori enhver N-acyl karboksylsyre også inngår (f.eks. N-oleoyl treonin, N-linoleoyl serin osv.). Mono- eller di-alkyl (C8-C24) sulfonat-estere og mono- eller di-alkyl (C8-C24) fosfatestere kan anvendes i stedet for fettsyrene. Videre kan mono- eller di-acyl (C8-C24) glycerolderivater av fosforsyrer og mono- eller di-acyl (C8-C24) glycerolderivater av svovelsyrer brukes i stedet for fettsyrene.

I tillegg kan fettsyrene også erstattes av mettede eller umettede alkylaminer (f.eks.C8-C24 NH2), C8-C24fettsyrederivater av aminer (f.eks. Cs-Cz4CONH-NH2), C8-C24fettalkoholderivater av aminosyrer (f.eks. Cs-C24OOC-NH2), og Cs-C24fettsyreestere av aminer (f.eks. Cb-C24COO-NH2).

Fotopolymeriserbare lipider og/eller fettsyrer (eller aminer) (f.eks. diacetylenfettsyrer) kan også inngå, hvilket kan gi et lukket liposom med kryssbundede membranbisjikt etter foto-igangsetting av polymerisasjonen.

Selv om de primære komponenter i disse liposomer vil være lipider, fosforlipider, andre fettsyrer, skal det også tilsettes forskjellige andre komponenter for å modifisere liposomenes gjennomtrengelighet. F.eks.kan det tilsettes ikke-ioniske lipide komponenter såsom polyoksyalkoholforbindelser, polyglyceral-forbindelser eller estere av polyoler, polyoksyalkoholdenolerte alkoholer; estere av polyoler og syntetiske lipolipider såsom cerebrosider. Andre materialer såsom langkjedede alkoholer og dioler, steroler, langkjedede aminer og deres kvaternære ammo-niumderivater; polyoksyetylerte fettaminer, estere av langkjedede aminoalkoholer og deres salter og kvaternære ammonium-derivater; fosforsyreestere av fettalkoholer, polypeptider og proteiner.

Sammensetningen av liposomene kan bestå av flere enn en komponent av de forskjellige typer lipider, fettsyrer, alkylaminer eller lignende og hydratiseringsmidlene.

Det er også oppdaget at lipidblandinger ikke behøver å kreve at det inngår i fettsyrene (eller aminene) eller hydratiseringsmidlene for å danne "pre-liposom gelen" eller liposomene hvis lipidkomponenten selv eller substansene (f.eks. medikamenter, biologisk aktiv forbindelse, kosmetika osv.) som skal innkapsles, har de forannevnte egenskaper. F.eks. danner blandingen av de dipalmitoylfosfatidylcholin (DPPC) og distearoylfosfatidyletanol-amin "pre-liposom gelen" eller liposomene med vandig glutamin-syreløsning og blandingen av DPPC og oleinsyre med vandig epinefrinløsning danner "pre-liposom gelen" og liposomene.

For farmasøytisk anvendelse som et liposom-medikament avgivelsessystem imidlertid, foretrekkes blandingen av fosforlipider, oleinsyre (eller fosfatidyletanolamin) og arginin eller lysin (eller glutaminsyre og/eller aspartinsyre).

Når det gjelder faste stoffer er det de liposomdannende materialer, hydratiseringsmidler, og materialer som eventuelt skal innkapsles man tenker på.

Foretrukne utførelsesformer

De foretrukne hydratiseringsmidler i denne oppfinnelse er alfa-aminosyrer med en ioniserbar omega-substitusjon såsom en karboksylat-, amino- og guanidinofunksjon og slike forbindelser med formelen:

X-(CH2)n-Y I

hvor

X er H2N-C(NH)-NH-, H2N-, Z03S-, Z203P- eller Z02C- hvor Z er H eller et uorganisk eller organisk kation;

Y er -CH (NH2 ) -CO2 H , -NH2 , -NH-C (NH) -NH2 -COOH , CH(NH2)S03Z eller ZH(NH2)P03Z2hvor Z er definert overfor; og

n er heltallet 1-10; eller

et farmasøytisk akseptabelt salt derav. I listene av foretrukne forbindelser inngår også de N,N'-dialkyl substituerte argininforbindelser og lignende forbindelser hvor alkylkjede-lengden varierer.

Mer foretrukne hydratiseringsmidler er de omega-substituerte alfa-aminosyrer såsom arginin, dets N-acyl-derivater, homoarginin, gamma-aminosmørsyre, asparagin, lysin, ornitin, glutaminsyre, aspartinsyre eller en forbindelse med de følgende formler:

hvor n er 2-4.

De sterkest foretrukne forbindelser er arginin, homoarginin, gamma-aminosmørsyre, lysin, ornitin, glutaminsyre eller aspartinsyre.

Ca. 1:20 molar forhold av hydratiseringsmidlet i forhold til det liposomdannende vil gi de ønskelige virkninger i foreliggende oppfinnelse med en øvre grense på ca. 1:0,05. Det foretrukne konsentrasjonsområdet for hydratiseringsmidlet er mellom et 1:2 til 1:0,5 molar forhold av hydratiseringsmidlet i forhold til det liposomdannende materialet.

Hydratiseringsmidlene i denne oppfinnelse kan brukes alene eller som en blanding. Ingen begrensning er pålagt eller tilsiktet i bruken av blandinger av disse hydratiseringsmate-rialer.

Hvis liposomer fremstilles med liposomdannende materialer med en negativ ladning, foretrekkes det av praktiske grunner og følgelig fortrinnsvis å bruke hydratiseringsmidler som inneholder minst et ioniserbart nitrogen såsom arginin, homoarginin, lysin, ornitin og lignende. Hvis tilsvarende antipatiske materialer som brukes til å danne liposomene er nitrogenbasert, foretrekkes det å bruke en di-syre såsom glutaminsyre, aspartinsyre; enhver alkyl di-syre såsom de enkle di-syrer såsom valeriansyre, kaprylsyre, kapronsyre, kaprinsyre eller lignende, eller slike di-syrer med to fostfat- eller sulfatgrupper, eller slike di-syrer som har blandede -COOH/-S03H eller -COOH/-PO3H2-funksjoner.

Kilde for hydratiseringsmidler

Hydratiseringsmidlene i denne oppfinnelse er oppført i katalogen i til mange kjemiske fabrikanter, kan fremstilles på bestilling av slike produsenter, eller kan fremstilles på i og for seg kjente måter.

Arginin, homoarginin, lysin, glutaminsyre, aspartinsyre og andre naturlig forekommende aminosyrer kan erholdes ved hydrolyse av protein og separasjon av de enkelte aminosyrer eller fra bakteriekiIder.

Forbindelser med formel II kan fremstilles ved metoden til Eisele, K. et al, Justusliebigs. Ann. Chem.,s. 2033 (1975). Videre informasjon om flere representative eksempler på disse forbindelser er å finne gjennom deres respektive Chemical Abstracts Service nummere som følger: norarginin,

CAS # 14191-90-3; arginin, CAS # 74-79-3; og homoarginin,

CAS # 151-86-5.

For representative eksempler på formel III, se for 2,4-diaminobutonsyre CAS # 305-62-4 og for lysin CAS # 56-87-1.

Fremgangsmåter til å fremstille representative forbindelser med formel IV foreligger i Chemical Abstracts som følger: etan diamin, CAS # 305-62-4; propan diamin - 54618-94-9; og 1,4-diaminobutan, CAS # 52165-57-8. Se spesielt Johnson, T.B., J. Am. Chem. Soc., 38, 1854 (1916).

Av forbindelser med formel VI er glutaminsyre tidligere velkjent og kan kjøpes fra mange steder. Hvordan andre slike representative forbindelser fremstilles er kjent i litteraturen, f . eks . : 2-aminoheksandikarboksylsyre - CAS # 62787-49-9 og 2-aminoheptandikarboksylsyre - CAS # 32224-51-0.

Glutaminsyre, forebindelse med formel VII hvor n er 2 er velkjent og kan fremstilles ved fremgangsmåten til Maryel and Tuley, Org. Syn. 5, 69 (1925). Andre representative forbindelser i denne gruppe kan fremstilles som tidligere kjent ved henvisning til de følgende CAS nummere: heksandikarboksylsyre,

CAS # 123-04-09 og heptandikarboksylsyre, CAS # 111-16-0.

Homocysteinsyre er tidligere kjent idet det vises til

CAS # 56892-03-6. Forbindelsen 3-sulfovalin er beskrevet i litteraturhenvisningen CAS # 23405-34-2.

Pre- liposom gel

Blandinger av liposomdannende materialer og ett eller flere hydratiseringsmidler med opp til 300 mol vann i forhold til det totale liposomdannende materialet gir en gel som danner liposomer direkte etter tilsetning av en vandig løsning. Denne gel merkes en pre-liposom gel på grunn av i.) sine strukturelle egenskaper som hovedsakelig er lik liposomenes og, ii.) gelen lett omdannes til liposomer ved fortynning med en vandig løsning. Vånding fortynning utover ca. 300 mol bevirker begynnende liposomdannelse.

Denne gelens struktur er en sterkt ordnet flytende krystall som danner en optisk klar løsning. X-, Y- og Z-dimensjonene til den flytende krystall varierer med konsentrasjonene til hydratiseringsmidlet ved konstant pH samt ved løsningens pH. Ved å variere hydratiseringsmiddelkonsentrasjonen ved konstant pH eller forandre pH mens prosentdel hydratiseringsmiddel opprettholdes, kan størrelse og antall lamellstrukturer i de lipide bisjikt av de følgende liposomvesikler kontrolleres.

Selve gelstrukturen kan romme opptil ca. 300 mol vann pr. mol lipid eller fettsyre uten å forstyrre stabiliteten til gelstrukturen. Strukturen av gelen som bestemmes ved proton NMR-spektroskopi består av multilamellære lipid bisjikt og hydrofile sjikt stablet sammen på vekselvis måte.<31>P-NMR-spektret av den samme gel viser en anisotropitopp som videre bekrefter at gelen består av et multilamellært bisjikt.

Denne gelen kan autoklaveres, som er en grei steriliserings-måte. Videre viser gelen ingen misfarving og forblir klar ved romtemperatur i minst ett år etter å være autoklavert. Gelen kan videre steriliseres ved filtrering gjennom et tilsvarende steriliseringsfilter.

Etter dispergering av gelen i en vandig løsning dannes liposomer effektivt og spontant.

Pre-liposom gelen, med eller uten materialet som skal innkapsles, kan også dehydratiseres (frysetørkes) og pulveret rehydratiseres til å danne liposomer spontant, selv etter lengere tids lagring. Denne evne gjør oppfinnelsen anvendelig for administrering av vannømfintlige medikamenter hvor langtids-lagring før bruk er påkrevet.

Alle vannuløselige eller vannløselige kjemikalier, legemidler, kosmetika, næringsmidler og lignende kan inngå i liposomene som fremstilles ved å bruke dette materialet og ved denne fremgangsmåten. Følgelig kan gelen brukes som et avgivelsessystem for administreringen av medikamenter ad oral, parenteral, topisk, intravenøs, suppositorieveier eller alle andre veier for legemiddel- eller kjemikalieavgivelse.

Bruken av disse liposomer er ikke begrenset til mennesker eller pattedyr, men kan brukes for alle industrielle, agri-kulturelle, farmasøytiske, kosmetiske eller kjemiske formål hvor lipidvesikelinnkapsling og administrering av forbindelser eller materialer er ønsket eller anvendelig.

Mangfoldigheten av foreliggende oppfinnelse er illustrert, men ikke begrenset ved de følgende eksempler.

Eksempel # 1

Fremstilling av liposomer ( gelfase) Dipalmitoylfosfatidylcholin, 3,0 g, ble veid i et 50 ml begerglass. Oleinsyre, 1,2 g, ble tilsatt og blandet sammen til en ensartet pasta oppstod.

Arginin, 0,72 g, i 30 ml destillert ionefritt vann ble satt til dipalmitoylfosfatidylcholin-oleinsyrepastaen og oppvarmet til 45°C. Ved blanding for hånd dannet blandingen en klar stabil gel. Denne gelen ble lagret, og liposomer senere dannet ved å fortynne gelen med fosfatbufret saltvann.

Eksempel # 2

Fremstilling av liposomer

Dipalmitoylfosfatidylcholin, 120 mg og 24 mg oleinsyre ble slått sammen og blandet grundig inntil man så en hvit, homogen pasta.

Så ble 20 mg arginin oppløst i 60 ml fosfatbufret saltvann (ionestyrke = 0,15, pH = 7,4). Arginin-saltvannløsningen ble satt til pastaen og oppvarmet til 40°C i en halv time, eller inntil en svakt uklar løsning ble observert.

Eksempel # 3

Gel- og liposomfremstilling i stor skala

i) . Gelfremstilling: Til 50 g egg fosfatidpulver type 20 (Ashai Chemicals) satte man 20 g oleinsyre N.F. Blanding ga en hvit pasta som ble avkjølt til 4°C og malt til et fint pulver. Dette pulver ble satt til en vandig løsning inneholdende 20 g arginin og 500 g destillert ionefritt vann. Blandingen ble blandet med en spatel mens løsningen ble oppvarmet til ca. 35°C for å hjelpe å hydratisere fosforlipider. En homogen, lys gul gel ble dannet. Denne gel kan lagres ved 4°C, eller kan fryses og senere rekon-stitueres .

ii) . Fremstilling av liposomer: Gelen som var fremstilt i det foregående avsnitt ble tatt fra kold lagring og ført tilbake til romtemperatur. Den ble så blandet med 2 liter fosfatbufret saltvann, pH 7,4. En hvit opak liposomløsning ble dannet.

Eksempel # 4

Liposomdannelse fra gelen

En homogen pasta av 1,0 g dipalmitoylfosfatidylcholin (DPPC) og 400 g oleinsyre ble dannet. Så ble 300 mg arginin blandet i 10 ml fosfatbufret saltvann, oppvarmet til 45°C og satt til DPPC/oleinsyrepastaen for å danne liposomer.

Eksempel # 5

Pre- liposom gel

Et gram dipalmitoylfosfatidylcholin (DPPL) ble blandet med 400 mg oleinsyre for å danne en homogen pasta. 300 mg arginin ble blandet i 2 ml vann ved 45°C inntil oppløsning. Argininløsningen ble blandet med DPPC/oleinsyrepastaen ved ca. 45°C og ga en tykk gel. Liposomer oppstod når denne gel ble fortynnet med fosfatbufret saltvann.

Eksempel # 6

Kolesterolholdige liposomer

Kolesterol, 15 mg, ble blandet med 100 mg dipalmitoylfosfatidylcholin (DPPC) under dannelse av et homogent pulver. Så ble 23 mg oleinsyre satt til pulveret og grundig blandet under dannelse av en homogen pasta. For å fremstille liposomer ble 30 mg arginin satt til 10 ml fosfatbufret saltvann og oppvarmet til 40°C og satt til DPPC/kolesterol/oleinsyrepastaen. Kom-binasjonen ble blandet ved 40°C for å oppnå liposomer.

Eksempel # 7

Palmitinsyreholdige liposomer

Dipalmitoylfosfatidylcholin (DPPC), 250 g, ble blandet med 25 mg palmitinsyre og ga et jevnt pulver. Så ble 80 mg oleinsyre blandet med dette pulveret og oppvarmet til 45°C under konstant røring inntil en jevn pasta oppstod. 100 mg arginin ble oppløst i 25 ml destillert ionefritt vann og oppvarmet til 45°C. Denne argininløsning ble satt til pastaen ved 45° C og blandet inntil en jevn homogen gel ble dannet. Gelen ble fortynnet ti ganger med fosfatbufret saltvann for å danne liposomer.

Eksempel # 8

Isostearinsyreholdige liposomer

Dipalmitoylfosfatidylcholin, 100 mg, ble blandet med 50 mg

isostearinsyre og ga en jevn homogen pasta. En argininløsning av 50 mg arginin i 2,0 ml destillert ionefritt vann ble fremstilt og satt til isostearinsyrepastaen og oppvarmet til 45°C. Blandingen ble blandet inntil en klar gel oppstod. Liposomer dannes ved

fortynning med fosfatbufret saltvann.

Eksempel # 9

Oleoyl treoninholdige liposomer Dipalmitoylfosfatidylcholin, 125 mg, og 75 mg oleoyl treonin ble slått sammen og oppvarmet til 40°C for å danne en pasta. Så ble 2 ml destillert ionefritt vann tilsatt under konstant blanding ved 40°C. En klar gel oppstod, som kan fortynnes med fosfatbufret saltvann med pH 5 til å danne liposomer.

Eksempel # 10

Myristylaminholdig liposomer

Dipalmitoylfosfatidylcholin, 192 mg, ble satt til 72 mg myristylamin og oppvarmet ved konstant blanding inntil en jevn pasta ble dannet. Glutaminsyre, 65 mg, i 5 ml destillert ionefritt vann ble satt til pastaen og oppvarmet inntil en gel oppstod. Fosfatbufret saltvann ble satt til gelen for a danne liposomer.

Eksempel # 11

DLPC- holdige liposomer

Dilaurylfosfatidylcholin (DLPC), 50 mg, ble blandet med

20 mg oleinsyre for å danne en homogen pasta. 20 Mg arginin ble satt til 10 ml fosfatbufret saltvann, satt til pastaen og håndblandet inntil en turbid liposomløsning oppstod.

Eksempel # 12

Fosfatidyletanolamin- glutaminsyre liposomer

32 mg L-glutaminsyre ble oppløst i 2,0 ml destillert ionefritt vann, og pH ble justert til 5,2 med 1,0 N natrium-hydroksyd. Denne løsning ble oppvarmet til 60°C og 100 mg fosfatidyletanolamin ble tilsatt. Løsningen ble holdt ved 60°C under konstant røring, inntil man så en jevn viskøs gel.

Fosfatidyletanolamin-glutaminsyregelen ble fortynnet 1/10 med fosfatbufret saltvann. Vesikellignende strukturer observeres under fasekontrastlys-mikroskopi.

Eksempel # 13

Dipivalylepineprin liposomer

Et gram dipalmitoylfosfatidylcholin ble blandet med 396 mg oleinsyre inntil en homogen pasta oppstod. Så ble.400 mg arginin i 20 ml destillert ionefritt vann tilsatt for å danne en klar pre-vesikelgel.

For å fremstille liposomene ble 242 mg dipivalylepineprin oppløst i 10 ml destillert ionefritt vann. 5 G av pre-vesikel-gelen ble blandet med 5 g av dipivalylepineprinløsningen, hvoretter 50 ml fosfatbufret saltvann ble tilsatt under dannelse av en liposomløsning.

Eksempel # 14

Flurbiprofen liposomer

For å fremstille disse liposomer ble 980 mg dipalmitoylfosfatidylcholin, 370 mg oelinsyre og 320 mg flurbiprofen ( fri syre) blandet sammen, inntil man observerte en homogen pasta. Så ble 510 mg arginin i 10 ml renset vann satt til pastaen og oppvarmet til 41°C under konstant blanding i 30 minutter. En klar pre-vesikelgel oppstod, hvorav 5 g ble innført i 50 ml fosfatbufret saltvann og blandet med en rørestav inntil man observerte en blåaktig gjennomskinnelig løsning.

Eksempel # 15

Levobunolol liposomer

30 Mg dipalmitoylfosfatidylcholin og 15 mg kolesterol ble veid i et 4 ml glass. 10 Mg linolensyre ble tilsatt og blandet sammen under dannelse av en jevn pasta. To ml av en 1% vandig levobunololløsning inneholdende 10 mg arginin ble satt til pastaen og blandet sammen. Så ble 10 ml fosfatbufferløsning tilsatt og oppvarmet til 45°C for å danne liposomer.

Eksempel # 16

Pilokarpin liposomer

Til 120 mg dipalmitoylfosfatidylcholin satte man 40 mg oleinsyre for å danne en homogen pasta. Førti mg pilokarpinfri base ble satt til 10 ml destillert ionefritt vann. Denne løsning ble satt til pastaen og oppvarmet til 45°C for å danne en pre-liposom gel. Den resulterende gel ble fortynnet med 20 ml fosfatbufret saltvann for å danne liposomer.

Eksempel # 17

Epinefrin liposomer

Dipalmitoylfosfatidylcholin, 250 mg, ble blandet med 100 mg oleinsyre for å danne en homogen pasta. 50 Mg epinefrin, fri base, ble oppløst i 5 ml destillert ionefritt vann, oppvarmet til 40°C og satt til dipalmitoylfosfatidylcholin/oleinsyrepastaen. Denne løsning ble blandet inntil man observerte en homogen viskøs kremaktig gel. Denne gel ble fortynnet 1/5 med fosfatbufret saltvann (pH 7,22) for å danne liposomer.

Eksempel # 18

Virkning av argininkonsentrasjonen på liposomstørrelse

Til 502 mg dipalmitoylfosfatidylcholin (DPPC) satte man

10 mikroliter (2-palmitoyl-l-C1 4 ) (0,1 mCi/ml) dipalmitoylfosfatidylcholin. Kloroform ble tilsatt for å bevirke fullstendig blanding av radioaktiviteten og deretter fordampet. Oleinsyre (OA), 195 mg, ble så blandet inn i lipidet for å danne en pasta. Fem ml destillert vann inneholdende 119 mg arginin ble tilsatt og blandet ved 45°C for å danne en klar gel.

Et gram av gelen ble veid i fire forskjellige glass, og arginin ble tilsatt som følger:

Et halvt gram av hver løsning ble fortynnet i 50 ml fosfatbufret saltvann med pH 7,8.

Den anslåtte vektdiameter fikk man fra en Sephracyl S-1000 kolonne kromatografisk analyse ved anvendelse av<14>C-isotop merket DPPC. Virkningene er angitt i den følgende tabell.

Eksempel # 19

pH- vir kning på vesikelstørrelse

I tillegg kan vesikelstørrelsen varieres ved å variere pH i den vandige bufrede løsning.

Til 100 mg dipalmitoylfosfatidylcholin (DPPC) satte man

25 mikroliter (2-palmitoyl-l-C<14>) (0,1 mCi/ml) dipalmitoylfosfatidylcholin. Kloroform ble tilsatt for å bevirke fullstendig blanding av radioaktiviteten og deretter fordampet.

40,1 Mg oleinsyre (OA) ble så blandet inn i lipidet for å danne en pasta. En ml av en løsning som inneholdt 24 mg/ml argenin i vann, ble satt til lipidblandingen og blandet ved 45°C for å danne en klar gel.

200 Ml alikvoter av denne del bie fortynnet i 10 ml fosfat-buffer med pH 9,0 og henholdsvis 7,4.

Igjen ble den anslåtte vekt diameter (A) oppnådd fra Sephracyl S-1000 kolonnekromatografisk analyse ved anvendelse av<14>C-isotop merket dipalmitoylfosfatidylcholin. Resultatene er angitt i den følgende tabell.

Således kan liposomvesikler med ønsket størrelse fremstilles ved å variere argininkonsenstrasjonen eller pH i den vandige bufferløsning.

Eksempel # 20

Liposom stabilitet

Sterile liposomer kan fremstilles fra den varmesteriliserte pre-liposomgel. Alternativt kan liposomgelen eller liposomene sterilfiltreres gjennom et tilsvarende steriliseringsfilter.

Liposomer fremstilt fra DPPC:OA:Arg (1:1:2) ved pH 8,0 ble varmesterilisert og lagret ved romtemperatur i ca. et år uten tilsetning av antimikrobielle midler og anti-oksydanter. Ingen bakteriell vekst, misfarving eller utfelling ble observert. Negativt elektronmikroskopisk undersøkelse av et år gamle liposomer viste at liposomvesiklene er stabile.

Eksempel # 21

Innkapslet sukroselatens ble målt ved å bruke C<14->sukrose innkapslet med DPPC:OA:Arg (1:1:1) liposomsystemet i vandig fosfatbufferløsning ved pH 7,8. Resultatet er presentert i tabell IV.

Således har det foreliggende liposomsystem en utmerket latens for medikamentavgivelse.

Eksempel # 22

Innkapslingsvirkning

En rekke legemidler ble innkapslet med 10 mg/ml DPPCrolein-syre:Arg (1:1:1) liposomer for å illustrere medikamentinnkapsling for bruk som et drogeavgivelsessystem. Resultatene er presentert i tabell V.

Eksempel # 23

Frysetørkede liposomer

30,0 G oleinsyre og 7,5 g kolesterol U.S.P. ble satt sammen. Så ble 75,0 g fosfatid type 20 pulver (Ashai Chemical Co.) blandet med oleinsyre/kolesterolblandingen inntil en homogen pasta oppstod.

Deretter ble 15,0 g arginin (fri base) oppløst i 183 g destillert, ionefritt vann. Denne argininløsningen ble langsomt blandet med lipidpastaen og dannet en homogen gel. Gelen ble justet til 7,4 ved bruk av 5,0 N HC1.

En 10,0 g alikvot av denne pre-liposomgel ble overført til et 10 ml glass og frysetørket. Det resulterende pulver dannet liposomer ved fortynning med 5 ml fosfatbufret saltvann.

Eksempel # 24

Syrestabile liposompreparater

Et eksempel på syrestabile liposomer som benytter denne oppfinnelsen er illustrert ved liposomer fremstilt med de følgende materialer: distearoylfosfatidylcholin dipalmitoylfosfatidylcholin: oleinsyre, arginin og kolesterol. Disse materialer ble kombinert i et molarforhold 1:2:2:2:0,2 som følger: Colesterol, 20 mg, ble blandet med 144 mg oleinsyre og behandlet til 40°C. 200 Mg DSPC og 400 mg DPPC ble tilsatt og blandet ved 40°C. Blandingen ble rørt inntil en jevn homogen pasta ble dannet. 88 Mg arginin ble oppløst i 1,15 g ionefritt destillert vann. Denne argininløsning ble satt til lipidpastaen og blandet ved ca. 45°C inntil en homogen pre-liposom gel oppstod. Gelens pH ble justert til forskjellige pH-nivåer med 0,IN HC1. Gelen ble fortynnet ti ganger med 0,9% NaCl, under dannelse av vesikler.

Liposom stabilitet ved pH 4, 4

Claims (11)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en blanding som kan danne liposomer, karakterisert ved at fremgangsmåten består i å blande et hydratiseringsmiddel med liposomdannende materiale og materialet som skal innkapsles, hvor hydratiseringsmidlet foreligger i et molarforhold mellom 1:20 og 1:0,05 i forhold til det liposomdannende materialet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at hydratiseringsmidlet er en alfa-aminosyre med en omega-substitusjon som er en karboksylat-, amino- eller guanidinogruppe eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav eller en forbindelse med formel

hvor X er H2 N-C(NH)-NH, H2 N-, Z03 S-, Z2 03 P- eller Z02 C- hvor Z er H eller et uorganisk eller organisk kation; Y er -CH(NH2 )-C02 H, -NH2 , -NH-C(NH)-NH2 -COOH, CH(NH2 )S03 Z eller ZH(NH2 )P03 Z2 hvor Z er definert ovenfor; og n er heltallet 1-10; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at hydratiseringsmidlet anvendes i en mengde mellom 1:2 og 1:0,5 molarforhold i forhold til det liposomdannende materialet.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at det som hydratiseringsmiddel anvendes arginin, homoarginin eller deres N-acylderivater, gamma-aminosmø rsyre, asparagin, lysin, ornitin, glutaminsyre, aspartinsyre eller en forbindelse med formelen:

hvori n er 2-4, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det som hydratiseringsmiddel anvendes arginin, homoarginin, gamma-aminosmørsyre, lysin eller ornitin, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det som hydratiseringsmiddel anvendes glutaminsyre eller aspartinsyre eller et farma-søytisk akseptabelt salt derav.

7. Fremgangsmåte ved fremstilling av en liposomblanding, karakterisert ved at man dispergerer en vandig løsning på en hensiktsmessig måte for å danne liposomer, en blanding bestående av: a. liposomdannende materiale; b. et hydratiseringsmiddel hvori hydratiseringsmidlet foreligger i et molarforhold 1:20 og 1:0,05 i forhold til det liposomdannende materialet; og c. vann i en mengde av opptil 300 mol i forhold til fast-stoffene; og d. eventuelt materiale som skal innkapsles.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at det som hydratiseringsmiddel anvendes en alfa-aminosyre med en omega-substituent som er en karboksylat-, amino-, guanidinogruppe eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, eller en forbindelse med formelen X-(CH2 )n-Y I hvor X er H2 N-C (NH)-NH-, H2 N-, ZOsS-, Z2 03 P- eller Z02 C- hvori Z er H eller et uorganisk eller organisk kation; Y er -CH (NH2 )-C02 H, -NHz , -NH-C (NH)-NH2-COOH , CH(NH2 )S03 Z eller ZH(NH2 )P03 Z2 hvor Z er definert ovenfor; og n er heltallet 1-10; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at som hydratiseringsmiddel anvendes arginin, homoarginin eller deres N-acylderivater, gamma-aminosmørsyre, asparagin, lysin, ornitin, glutaminsyre, aspartinsyre eller en forbindelse med formel:

hvori n er 2-4, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at hydratiseringsmidlet er arginin, homoarginin, gamma-aminosmørsyre, lysin eller ornitin, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at hydratiseringsmidlet er glutaminsyre eller aspartinsyre eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.