NO305535B1

NO305535B1 - FremgangsmÕte for fremstilling av interdigitasjonfusjonsliposomer

Info

Publication number: NO305535B1
Application number: NO922735A
Authority: NO
Inventors: Lawrence T Boni; Andrew Stuart Janoff; Sharma R Minchey; Walter R Perkins; Christine E Swenson; Patrick L Ahl
Original assignee: Liposome Co Inc
Priority date: 1990-01-12
Filing date: 1992-07-10
Publication date: 1999-06-21
Also published as: GR3022701T3; DK0510086T3; WO1991010422A1; CA2073431C; AU652552B2; EP0510086A4; ES2096646T3; DE69123568T2; ATE146074T1; EP0510086B1; PT96465A; CA2073431A1; JPH05503521A; KR920703015A; DE69123568D1; PT96465B; EP0510086A1; HK1007499A1; AU7181791A; NO922735D0

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av interdigitasjonsfusjon (IF) liposomer. Disse liposomene har et høyt vektforhold mellom oppløst stoff og lipid. Uttrykket oppløst stoff omfatter bioaktive stoffer, inkludert bioaktive midler.

Foreliggende oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av IF-liposomer. I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen danner liposomer, som er dannet ved sonikering, ekstrusjon eller alternative størrelsesreduserende prosesser som homogenisering, til passende størrelse, blir sammensmeltet i nærvær av en passende inducer. Denne fremgangsmåten gir en gel. Selve gelen kan bli benyttet for eksempel for administrasjon av bioaktive midler eller kan bli anvendt for å danne IF-liposomer, som igjen har meget høye interne volumer og inneholder store mengder oppløst stoff.

For å danne IF-liposomer fra gelene, blir gelene inkubert ved en temperatur som vanligvis, men ikke nødvendigvis, er over transisjonstemperaturen (Tm) til det anvendte lipidet, slik at liposomer blir dannet. Den nødvendige temperaturen ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er den temperaturen for en hvilken som helst gitt blanding av lipid, oppløst stoff og inducer som induserer en forandring i materialegenskapene til blandingen og derved danner IF-liposomene ifølge oppfinnelsen. Liposomer dannet fra IF-geler er IF-liposomer. Fortrinnsvis, men ikke nødvendigvis, blir induceren fjernet under inkuberingstrinnet. Resultatet er en sammensetning som består av liposomer med høyt vektforhold mellom oppløst stoff og lipid.

De terapeutiske egenskapene til mange medikamenter kan bli drastisk bedret ved administrasjon i liposomalt innekapslet form (se for eksempel P. N. Shek og R. F. Barber, Mod. Med. Canada, 41, 314-382, (1986)]. I mange tilfeller, for eksempel ved administrasjon av amfotericin B og doksorubicin [Lopez-Berestein, et al., J. Infect. Dis., 151, 704-710, (1985) og Rahman, et al., Cancer Res., 40, 1532 (1980)] blir toksisi-teten redusert mens effektiviteten blir opprettholdt eller til og med øket. Fordelen oppnådd fra liposomalt innekapslede stoffer kan være tilfeldig og likeledes resultater fra de endrede farmokinetiske og biodistribusjonen av det innekapslede medikamentet. (Ostro, et al., Åmer. J. Hosp. Pharm., Vol. 46 Aug 1989).

Flere fremgangsmåter er tilgjengelige for "lading" av liposomer med bioaktive stoffer. For eksempel i et liposomt medikamentadministrasjonssystem, kan et bioaktivt stoff som et medikament bli fanget i liposomet og så administrert til pasienten som skal bli behandlet. Se for eksempel Rahman et al., US-PS 3.993.754; Sears, US-PS 4.145.410; Papahadjopou-los, et al., US-PS 4.235.871; Lenk et al., US-PS 4.522.803; og Fountain et al., US-PS 4.588.578. I tillegg til denne grunnmetoden for omslutting av et bioaktivt stoff, hvis det bioaktive stoffet er lipofilt, kan det bli forbundet med lipid bilaget. Mange av de farmasøytiske formuleringene som er fremstilt ved bruk av tradisjonelle fremgangsmåter, lider av ulempen ved lavt vektforhold mellom medikament og lipid, oppskaleringsproblemer og anvendelsen av toksiske oppløs-ningsmidler.

I tillegg til de ovenfor beskrevne fremgangsmåtene, har mange bioaktive stoffer vist seg å akkumulere i liposomer som respons til en pålagt proton eller iongradient kjent som "fjernlasting" ( se for eksempel Mayer, et al., Biochim. Biophys. Acta, 857, 123, (1986), Mayer, et al., Bio-chemistry, 27, 2053, (1988) og M. B. Bally, et al., Chem. Phys. Lipids, 47, 97, (1988)]. Denne lastingsteknikken tillater uavhengige variasjoner av en hvilken som helst av de liposomale parametere. Mye høyere vektforhold mellom medikament og lipid, kan bli oppnådd sammenlignet med konvensjonelle teknikker.

Mayer, et al. Chem. Phys. Lipids, 40, 333 (1986)]. Fremgangsmåten materialene for fjernlasting er beskrevet i Bally et al., US-søknad 284.751 og Mayer et al., US-søknad som er en avdelt søknad av US-søknad 164.557 som nå er oppgitt. De relevante delene av disse patentsøknadene som angår fjernlasting er her innlemmet som referanse.

Liposomer er fullstendig lukkede lipidbilagsmembraner som inneholder innekapslet vandig volum. Liposomer kan være unilamellære (enkelt bilagsmembran) eller multilammelære (løk-lignende strukturer kjennetegnet ved multipple bi-lagsmembraner, hver separert fra neste ved et vandig lag). Bilagene er sammensatt av to lipid monolag som har en hydrofob "hale"-region og en hydrofil "hode"-region. I membran bilaget er de hydrofobe (ikke-polare "halen" av lipid monolaget orientert mot senter av bilaget, mens de hydrofile (polare) hodene) er orientert mot den vandige fasen. Hoved-strukturen og liposomene kan bli fremstilt ved mange kjente teknikker.

En klasse liposomer som kan bli anvendt i utførelsen av oppfinnelsen er de kjennetegnet ved å ha hovedsakelig slik lamellær til oppløst stoff distrubsjon. Denne klassen liposomer er benevnet som stabile flerlamellære vesicler (SPLV) som definert i US-PS 4.522.803 av Lenk et al., monofasiske vesicler som beskrevet i US-PS 4.588.578 av Fountain et al og frosne og tinede multilamellære visicler (FAT MLV) hvor visiclene blir utsatt for minst en fryse- og tinesyklus; denne fremgangsmåten er beskrevet av Bally et al., i US-PS 4.975.282 og innlemmes her som referanse.

Liposomal innekapsling kan potensielt gi mange fordelaktige effekter for en stor variasjon farmasøytiske stoffer og et høyt medikament til llpldforhold skulle vise viktig relai-seringen av potensialet ved liposomal innekapsling av stoffer. Anvendelsen av liposomer for administrasjon av medikamenter har gitt problemer hva angår både medikament- innekapslingen og medikametfrigivingen under behandlingen. Det er for eksempel et vedvarende behov for å øke vektforholdet mellom medikament og lipid for å minimalisere lipidlasten som blir gitt pasienten.

Interdigitasjon av lipider er et fenomen som nylig har blitt undersøkt i betydelig detalj av James S. Slater og Ching-Hsien Huang i Progress in Lipid Res., 27, 325-359, 1988. Generelt beskriver teknikken interdigitasjon av forskjellige lipidtyper som et resultat av enten nærværet av forskjellige inducere og/eller acylkjedelengde asymmetri (se figur IA og IB). Det har riktignok ikke vært noen rapport i litteraturen om størrelsesavhengigheten for sammensmeltende liposomer under interdigitasjon for å gi IF-geler og liposomer ifølge oppfinnelsen.

McConnell et al., Biochemica et Biophysica, 818 (1985) 13 til 22, beskriver de biofysiske effektene av forskjellige faktorer på oppførselen til fosfolipidmembran ved anvendelse av liposomer som modellsystem for slike membraner. For studieformål beskriver dokumentet omslutningen av forbindelser slik som bromfenolblå, arsenazo III og natriumkromat i modellsystemliposomene, med vektforhold av forbindelsen til lipid på omkring 0,0055:1 (g/g). Slike forbindelser er detekterbare markører og ikke bioaktive midler, f.eks. radiokontrastmidler, beskrevet i foreliggende søknad, og de blir ikke omsluttet av liposomene ved vektforhold ved hvilke bioaktive midler blir innlemmet i foreliggende liposomer. Videre omslutter McConnel markører i deres liposomer, og induserer kun da liposomene for sammensmeltning. Ved foreliggende oppfinnelse tilsettes derimot forbindelser til enten de størrelsessorterte liposomene eller i gelen fremstilt av slike liposomer, hvor ingen av trinnene er beskrevet eller foreslått på noen måte i nevnte publikasjon.

I US-patent nr. 4.877.561 blir det beskrevet liposomer som omslutter forbindelser i hvilke vektforholdet av forbindelse til lipid er omkring 0,5:1 (g/g), dvs. også mye mindre enn liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse. Boni et al., Biochimica et Biophysica Acta 775 (1984) 409-418, er en akademisk studie av liposomsammensmeltningsprosessen, men det blir ikke noe sted beskrevet interdigitasjon av liposomale lipider, og det blir ikke noe sted foreslått den fremgangsmåten for fusjon og interdigitasjon som fører til fremstillingen av liposomer som har en stor innkapslIngskapa-sitet.

Ingen av disse publikasjonene beskriver således hverken interdigitasjon-fusjonsprosessen ifølge foreliggende oppfinnelse, eller liposomer som et resultat av en slik prosess.

Det er et mål for oppfinnelsen å fremskaffe en fremgangsmåte for fremstilling av interdigitasjon-fusjonsliposomer og geler som samler høye konsentrasjoner av bioaktive stoffer.

Dette mål er oppnådd ved en fremgangsmåte for fremstilling av interdigitasjonsfusjonsliposomer omfattende et bioaktivt middel, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: a) Forming av en interdigitasjons-fusjonsgel ved inkubering av dimensjonerte liposomer omfattende et mettet fosfolipid

i nærvær av:

(I) Det bioaktive midlet; (II) en mengde av en induser som er effektiv til å smelte sammen nevnte liposomer og interdigistere nevnte

fosfolipid,

hvor inkuberingen er gjort i en tid som er tilstrekkelig til å danne en interdigitasjons-fusjonsgel omfattende det bioaktive midlet fra de dimensjonerte liposomene;

b) inkubering av interdigitasjons-fusjonsgelen ved en temperatur som er høyere enn transisjonstemperaturen til

fosfolipidet i gelen for således å fremstille inter-

digitasjons-fusjonsliposomer omfattende det bioaktive midlet fra gelen,

hvori de dimensjonerte liposomene har en gjennomsnittlig diameter på mindre enn omkring 0,4 pm,

og hvor liposomet omfatter det bioaktive midlet ved et vektforhold mellom bioaktivt middel og lipid som er større enn 2:1 (g/g).

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av interdigitasjons-fusjons (IF) liposomer som inneholder oppløst stoff. Disse liposomene og gelene holder høye oppløst stoff til lipidforhold, Inkludert bioaktivt stoff. Disse IF-liposomene finner anvendelse i mange anvendelser, inkludert kosmetiske, farmasøytiske og agrikul-turelle anvendelser. I kombinasjon med bioaktive stoffer, kan disse liposomene bli administrert topikalt eller systemisk til planter og dyr, spesielt pattedyr, inkludert mennesker. I tillegg til de ovennevnte anvendelser, er IF-liposomene ifølge oppfinnelsen også anvendelige i kombinasjon med harpiksteknologi, spesielt i malingsteknologi.

Sammensetningene fremstilt ifølge oppfinnelsen omfatter liposomer av gitte størrelser, fortrinnsvis 0,4 um i diameter eller mindre, mer foretrukket 0,05 pm i diameter eller mindre og mest foretrukket 0,025 um i diameter, i kombinasjon med et oppløst stoff, for eksempel et bioaktivt middel og en mengde interdigitasjons Inducer som er effektive for å smelte sammen liposomene for å gi en IG-gel. De opprinnelige liposomene kan alternativt være FAT MLV. IF-liposomer kan bli fremstilt fra IF-geler. Fortrinnsvis kan det i IF-liposomene og gelene også bli anvendt et mettet lipid, for eksempel dipalmitoylfosfatidylcholin (DPPC), dimyristoylfosfatidylcholin (DMPC), di-0-heksadecylfosfatidylcholin og distearoylfosfatidylcholin, så vel som lipider hvor den umettede karbon-karbon dobbeltbindingen i acylsidekjedene av lipidet er i transkonfigura sjon, som transdielaidoylfosfatidylcholin og dipalmite-laidoyl-fosfatidylcholiner, eller blandede fettsyrelipider som palmiyoyloleoylfosfatidylcholin (POPC) eller 1-stearoyl-2-oleoyl fosfatidylcholin (SOPC) så vel som andre umettede lipider.

I enkelte utførelser, kan umettede lipider bli benyttet i kombinasjon med de mettede lipidene Ifølge oppfinnelsen. Det er vanligvis foretrukket at når DOPC er det umettede lipid som blir benyttet, blir det anvendt med det mettede lipid DPPC, et forhold på ikke mer enn 50 mol-% umettet lipid.

Interdigitasjons-fusjons gelene som blir fremstilt når dimensjonerte liposomer blir sammensmeltet, fortrinnsvis i nærvær av en inducer og som inneholder, eller ikke inneholder, et bioaktivt middel, kan bli anvendt uten ytterligere modifikasjon, eller alternativt kan gelene bli ytterligere modifisert, for eksempel vanligvis, men ikke nødvendigvis, oppvarmet til en temperatur over lipidets transisjons-temeratur (Tm), men i alle fall inkubering av blandingen til en temperatur som vil indusere forandring i materialegenskapene til blandingen og således indusere dannelsen av IF-liposomer fra IF-gelene ifølge oppfinnelsen, og videre mulig fjerning av interdigitasjonsinduceren som er inneholdt er, for å fremstille IF-liposomer.

IF-liposomene ifølge oppfinnelsen kan bli anvendt for å holde overraskende høye oppløst stoff til llpldforhold, Inkludert bioaktive midler. Disse IF-liposomene kan bli anvendt uten ytterligere modifikasjon eller de kan bli videre behandlet for å gi liposomer med varierende og/eller homogen størrelse ved hjelp av teknikker og metoder som er tilgjengelige i teknikken og som vil bli gjennomgått nedenfor.

I oppfinnelsens fremgangsmåte, er den foretrukne inter-digitas jonsinducer en kortkjedet alkohol, som de som har 1 til 4 karbonatomer, fortrinnsvis etanol på grunn av at denne enkelt kan bli fjernet for å gi IF-liposomer fra IF-gelene ifølge oppfinnelsen. En hvilken som helst inducer som produserer en sammensmeltet IF-gel fra dimensjonerte liposomer kan bli anvendt.

Eksempler på inducere for anvendelse i oppfinnelsen omfatter for eksempel polyoler som glycerol, etylenglycol, kortkjedede alkoholer som metanol, etanol, propanol, isopropanol og n-butanol og anestetika som klorpromazin, tetracain, fenyletanol, benzylalkohol og fenylbutanol, og andre omfattende polymixin, myelin basisk protein, cholin, acetylcholin, trisbuffer og chaotropiske salt som for eksempel thiocyanat. Etanol er riktignok foretrukket da det er enkelt å fjerne og farmasøytisk forenelig. Mengden av inducer som blir benyttet i oppfinnelsen, er en mengde som er effektiv for å produsere interdigitasjons-fusjons geler fra dimensjonerte liposomer. Det må noteres at i enkelte utførelser av oppfinnelsen kan det mettede lipidet som blir anvendt for å fremstille IF-geler og liposomer ifølge oppfinnelsen, være en selv-inducer, det vil si det mettede lipid vil gi IF-geler og liposomer ifølge oppfinnelsen uten behov for å tilsette en inducer. Spesielt er anvendelsen av di-O-heksadecyl-fosfatldylcholin (DHPC) notert som eksempel ved denne siden av oppfinnelsen. Alternativt eller i tillegg, kan som nevnt over, et oppløst stoff som kan være et bioaktivt stoff, selv også være en inducer.

IF-liposomene og gelene ifølge oppfinnelsen kan inneholde konsentrasjoner av nesten et hvilket som helst oppløst stoff inkludert bioaktive stoffer som vitaminer, hormonelle stoffer, antimetaboliter, antimikrobielle stoffer, antifungale stoffer, lokalanestetika, bronchodilatorer, beta-adreneriske blokker, antihypertensive midler, anti-depressanter, antikonvulsanter, antihistaminer, antimalaria midler, analgesika, antibiotika, immunogener, immunomodulatorer, antigener, næringsstoffer, proteiner, peptider, nukleosider, oligo- og polynukleotider, ribonukleinsyre (RNA) og deoksyribomikleinsyre (DNA) og analoger til RNA og DNA, antineoplastiske midler, antihlstamine stoffer, naurofarmakologiske midler inkludert sedativer og hypnotika, steroidale og ikke-steroidale antiinflammatoriske midler, diuretiske midler, antiarrytmetiske midler og vaskulær-dilatoriske, blant andre omfattende radiografiske kontrst-midler, kjernemagnetisk resonans (NMR)-kontrastmidler og antivirale midler. Ytterligere bioaktive midler for anvendelse ifølge oppfinnelsen omfatter næringsmidler som proteiner, fettsyrer og karbohydrater. I enkelte foretrukne utførelser i oppfinnelsen, blir radiokontrastmidler, NMR-kontrastmidler, polypeptider og enkelte antibiotika, for eksempel cefalosporiner, anvendt i oppfinnelsen. Eksempler på radiokontrastmidler for anvendelse ifølge oppfinnelsen omfatter for eksempel ioheksol, iopamidol, ioksoglat, iotrolan, ioversol, iothalamat, iodimid, iodidpamid, iopentol, iodiksanol, metrizamid, blandinger av disse og deres faramsøytisk akseptable salter. Bioaktive midler kan være naturlig forefinnende, syntetiske eller halvsyntetiske antimikrobielle midler. Eksempler på antimikrobielle midler er aminoglycosider som: gentamicin, amikacin og tobrabycin. De foretrukne sammensetninger ifølge oppfinnelsen, inneholder IF-gelene og/eller liposomene høye konsentrasjoner av det bioaktive middelet. Generelt er bioaktivt vektforhold middel/lipid; IF-gelene og liposomene fremstilt ifølge oppfinnelsen så høye som fra omkring 1:10 til omkring 15:1. Naturligvis er disse vektforholdene kun eksempler og 1 enkelte tilfeller kan det være nødvendig å tilveiebringe medikament og lipid i vektforhold over eller under disse forholdene.

I enkelte utførelser av oppfinnelsen kan det oppløste eller bioaktive middelet også fungere som induceren. I slike tilfeller er det ikke nødvendig å fjerne Induceren/bioaktive middelet som i andre utførelser av oppfinnelsen.

Passende bioaktive midler for anvendelse i oppfinnelsen omfatter et hvilket som helst middel som gir biologisk aktivitet når de blir administrert tropikalt eller systemisk I liposomene eller gelene ifølge oppfinnelsen. Mange bioaktive midler kan bli inkludert i IF-gelene ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis fir tropikal eller oral levering. De samme midlene kan bli inkludert i IF-liposomene ifølge oppfinnelsen for tropikal administrasjon.

For å fremstille IF-liposomer ifølge oppfinnelsen, blir IF-gelene eksponert for en temperatur som vanligvis, men ikke nødvendigvis, er over transisjonstemperaturen til det anvendte lipidet og i tillegg kan induceren bli fjernet. Den nødvendige temperaturen ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er den temperaturen, for en gitt blanding av lipid, oppløst stoff og inducer som gir en forandring i materialegenskapene til blandingen for derved å danne IF-gelene og IF-liposomene ifølge oppfinnelsen. Resultatet er en sammensetning bestående av IF-liposomer som inneholder høye konsentrasjoner av bioaktivt middel.

IF-liposomene som blir fremstilt ved denne fremgangsmåten, kan variere i størrelse vanligvis fra omkring 100 pm til omkring 0,25 pm, mer foretrukket omkring 20 pm til omkring 0,025 pm, og kan inneholde høye konsentrasjoner av bioaktivt middel. Disse liposomene kan ytterligere bli redusert i størrelse ved hjelp av teknikker som er tilgjengelige i teknikken.

Figur 1 er en skjematisk fremstilling av de forskjellige acylkjedelengde arrangementene som er mulige i bilag. A representerer et ikke-interdigitatert bilag bestående av et fosforlipid som inneholder et symmetrisk, mettet fosforlipid C(16):C(16)fosfatidylcholin. B representerer et delvis interdigitåtert bilag bestående av et asymmetrisk mettet fosfolipid C(16):C(10)fosfatidylcholin. C representerer et blandet lnterdigitatert bilag bestående av C(16):C(10)- fosfatidylcholin. D representerer et fullt interdigitatert bilag bestående av C(16 ):C(16 )fosfatldylcholln 1 kombinasjon med en effektiv mengde av en inducer.

Figur IB er en skjematisk fremstilling som viser effekten av temperatur og en inducer (etanol) på interdigitasjonen av en mettet type fosfolipid. Figur 2 viser interdigitasjon av dipalmitoylfosfatidylcholin (DPPC) liposomer som en funksjon av den opprinnelige størrelsen til liposomene og konsentrasjonen av etanol. Interdigitasjon blir bestemt ved difenylheksatrien (DPH) fluorescence intensitet. DPH fluoriserer maksimalt når den blir innarbeidet i lipid-bilaget. Interdigitasjon resulterer i reorienteringen av DPH med en følgende reduksjon i fluorescence. F0= DPH fluorescence i fravær av etanol. F= DPH fluorescence i nærvær av etanol. Excitasjon = 351 nm. Emisjonen ble målt mellom 380 og 580 nm og kvantifisert ved veiing. Figur 3 viser lipidblanding av DPPC-liposomer som en funksjon av størrelse og etanolkonsentrasjon bedømt ved resonanse-energi overføring (RET) mellom NBD-PE og rhodamln-PE inkorporert sammen i en markørpopulasjon av liposomer. Figur 4 A viser grafisk<14>C sucrose innekapsling prosenten som en funksjon av etanolkonsentrasjon. Interne volumer av DPPC IF liposomer som en funksjon av øket etanolkonsentrasjon er vist i figur 4 B, fylte sirkler viser intern volum bestemt ved<14>C sucrose innekapsling; åpne sirkler refererer til CAT 1 EPR målingen. Figur 4C viser prosentdelen av DPPC gjenvunnet som et resultat av svikten i IF-liposomdannelse i 1,0 M etanol konsentrasjon, hvor resultatet var at SUVene som var igjen ikke lot seg sentrifugere ned. Figur 5 viser interne volum av IF liposomer dannet fra forskjellige lipider ved bruk av<12>C sucrose, TEMPONE EPR og

CÅT 1 EPR metoder (henholdsvis diagonal ned, diagonal opp og prikkete søyler). Figur 6 viser det interne volum til DPPC IF liposomer som funksjon av opprinnelig størrelse av liposomer før tilsetningen av etanol. Interne volumer av disse liposomene ble beregnet ved<14>C sucrose innekapsling så vel som CAT 1 EPR og TEMPONE EPR metoder (henholdsvis diagonal ned, diagonal opp og prikkete søyler). Figur 7 viser grafisk inkorporeringen av DPPG i DPPG-DPPC IF liposomer. De interne volumene av IF-liposomene er vist i figur 7A som en funksjon av mol-fraksjon av DPPG (volumene målt ved<14>C innekapsling, åpne sirkler; volumer målt ved utvidelsesmidlet TEMPONE EPR-teknlkken, fylte sirkler). Figur 7B viser gjenvinningsprosenten av Pi (fylte sirkler) og<14>C merket sucrose (åpne sirkler) som en funksjon av DPPG. Figur 8 viser grafisk det interne volum og innekapslingen som en funksjon av opprinnelig DPPC konsentrasjon, hvor figur 8A viser at innekapsl ingsprosenten av sucrose øker med den opprinnelige DPPC-liposom konsentrasjonen. Figur 8B viser det interne volum av DPPC IF-liposomer målt ved både ^<4>C sucrosemetoden (fylte sirkler) og EPR metoden (åpne sirkler). Figur 9 er Malvern partikkelstørrelse distribusjon av IF-liposomer ved (A) 10 mg/ml og (B) 20 mg/ml lipid. Figur 10 viser grafisk effekten av kolesterol på dannelsen av DPPC IF-liposomer. Figur 10A viser den "endelige" kolesterol konsentrasjonen 1 IF-liposomer (åpne sirkler) og endelig prosentdel av ^<4>C sucroseinnekapslet (åpne kvadrater) som en funksjon av opprinnelig kolesterolprosent i liposomene før tilsetning av etanol. Figur 10 viser synkingen i internt volum til DPPC-kolesterol IF-liposomer som en funksjon av kolesterol innhold (<14>C sucrose innekapsling, CAT 1 EPR og

TEMPONE EPR metoder; henholdsvis åpne sirkler, åpne triangler og fylte sirkler).

Figur 11 viser grafisk effekten på dioleoylfosfatidylcholin (DOPC), (umettet lipid) på dannelsen av IF-liposomer. Figur 11A viser det interne volumet til IF-liposomer som inneholder varierende mengder av DOPC ved ^<4>C sucrose innekapsling og TEMPONE EPR metoder (henholdsvis åpne kvadrater og fylte kvadrater). Figur 11B viser lipidgjenvinningen etter dannelsen av IF-liposomer som inneholder varierende mengder

DPOC.

Figur 12 er et histogram som demonstrerer effekten av lipidinkuberingstid over og under DPPC Tm (5 minutter, 30 minutter, 60 minutter og 120 minutter) og inkuberings-prosedyre (romtemperatur "RT", eller 50°C), og det resulterende interne volum til IF-liposomene. Gjennom denne beskrivelsen angir uttrykket "RM temp" 25"C dersom ikke annet er spesifisert.

Som en klargjøring vil de følgende definisjonene bli anvendt gjennom diskusjonen av oppfinnelsen: "Interdigitasjon" og "interdigitasert" er anvendt gjennom beskrivelsen for å beskrive et lipid-bilag hvor acylkjede-reglonen av et lipid i bilaget trenger inn i det andre laget av llpid-bilaget. Uttrykket interdigitasjon skal omfatte full interdigitasjon, blandet interdigitasjon og delvis interdigitasjon. Full lnterdigitasjonsliposomer inkluderer interdigitaserte liposomer hvor acylkjedene i lipidet fullt eller delvis trenger gjennom bilaget som vist i figur IA (D). Blandet interdigitaserte liposomer omfatter interdigitaserte liposomer hvor enkelte acylkjeder i usymmetriske fosforlipider, vanligvis den lange acylkjeden, fullstendig krysser bilagsspennvidden, mens de korte kjedene møter ende mot ende i bilagsmidtplanet som vist i figur 1A(C). Et annet eksempel på blandet lnterdigitasjonsliposomer omfatter liposomer hvor regioner av liposomet er enten fullt eller delvis interdigitasert og kan sameksistere med regioner som ikke er interdigitasert. Delvis interdigitaserte liposomer omfatter interdigitaserte liposomer hvor acylkjedene av usymmetriske fosforlipider danner par slik at den lange acylkjeden fra et bilag danner par med den korte acylkjeden fra det andre bilaget som vist i figur 1A(B).

"Inducer" ble gjennom beskrivelsen brukt for å beskrive molekyler, inkludert amfipatiske molekyler med begrenset størrelse som er lokalisert ved lipidbilagets vandige fase grenseflatedel av liposomet og produserer en inter-digitas jons-fusjonsgel som også kan være en væske, ifølge oppfinnelsen. Uttrykket omfatter også lipider og/eller oppløste stoffer som bioaktive midler som også kan virke som "selv-inducere". Hydrostatisk trykk kan også være en inducer.

"Interdigitasjons-fusjonsgel" (IF-gel) blir anvendt gjennom beskrivelsen for å beskrive produktet som er resultatet når en inducer blir blandet i tilstrekkelig mengde for å smelte sammen dimensjonerte liposomer. De resulterende lipidarkene er sammensmeltede geler i oppfinnelsens hensikt og kan omfatte produkter med varierende viskositet inkludert væsker, geler og enkelte gasser, og selv svært viskøse produkter som nærmer seg fast tilstand.

"Interdigitasjons-fusjonsliposomer" (IF-liposomer) blir gjennom beskrivelsen anvendt for å beskrive liposomet som er resultatet fra IF-geler som vanligvis, men ikke nødvendig-vis, er hevet over lipidets transisjonstemperatur ("Tm"), men i alle tilfeller er inkubert ved en temperatur for å fremstille IF-liposomer. Induceren kan i tillegg, men ikke nødvendigvis, bli fjernet fra interdigitasjons-fusjonsgelen. I enkelte utførelser hvor liposomet inneholder selv-in-ducerende lipid eller hvor oppløsningsmiddelet er en inducer, bli induceren ikke fjernet. IF-liposomene kan inneholde store

konsentrasjoner av oppløst stoff som et bioaktivt middel i et biaktivt middel: llpldforhold på omkring 1:10 til 15:1.

"Oppløst stoff" blir gjennom beskrivelsen anvendt for å beskrive et hvilket som helst kjemisk stoff inkludert buffere og oppløsningsmidler, som kan bli omsluttet av IF-gelene og liposomene ifølge oppfinnelsen. De oppløste stoffene kan omfatte buffere, salter, toksiner, mikrober og bakterier, pesticider, insectisider, herbicider, fungicider, emul-geringsmidler, kosemtika, encellede organismer og et stort antall kjemiske stoffer, spesielt inkludert bioaktive midler.

"Bioaktivt middel" blir gjennom beskrivelsen vendt for å beskrive et hvilket som helst middel som et kjemisk middel, som viser biologisk aktivitet når det blir administrert til levende organismer, inkludert plnater, dyr som pattedyr, spesielt inkludert mennesker. Bioaktive midler omfatter blant annet medikamenter og næringsmidler.

"Mettet lipid" er gjennom beskrivelsen anvendt for beskrevet lipid som kan bli anvedt for å fremstille interdigitasjons-fusjonsgelen og liposomene ifølge oppfinnelsen. Utrrykket mettet lipid omfatter, men er ikke begrenset til, lipider som har symmetriske og/eller asymmetriske acylsidekjeder som er mettet, det vil si inneholder ingen dobbeltbindinger, lipider som har umettede sidekjeder hvor det umettede karbon-karbon dobbeltbindingen er orientert i transkonfigurasjon og enkelte lipider som har uemettede sidekjeder hvor den umettede karbon-karbon dobbeltbindingen er orientert i ciskonfigurasjon, eller blandede fettsyrelipider som for eksempel SOPC og POPC.

"Interdigltasjons-fusjons lipidinneholdende sammensetning" blir anvendt for å beskrive IF-gelene og liposomene ifølge oppf innelsen.

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av 1ipidinneholdende sammensetninger som består av et dimensjonert liposom, fortrinnsvis omkring 0,4 um eller mindre til omkring 0,05 pm eller mindre og helst omkring 0,025 pm i diameter eller mindre, og en mengde av en inducer som er effektiv for å sammensmelte liposomene i kombinasjon med et oppløst stoff. De opprinnelige liposomene kan alternativt være FTA MLV. I enkelte utførelser er det oppløste stoffet et bioaktivt middel. Sammensetningene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan med fordel omfatte bioaktive midler med høy konsentrasjon, for eksempel ved bioaktivt middel:llpldforhold på omkrin 1:10 til 15:1.

De dimensjonerte liposomene som gir opphav til IF-geler og liposomer ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis dannet fra zwitterioniske, kationiske og anioniske lipider og fosforlipider som består av fettacylkjeder som inneholder 12 til 35 karbonatomer, også inkludert mettede (fullmettede og delvis mettede) og umettede og polare eller upolare lipider og fosforlipider.

For eksempel, inkluderer de mettede lipidene ifølge oppfinnelsen, men er ikke begrenset til, for eksempel dimyristoylfosfatidylcholin, disteraroylfosfatidylcholin, dipalmitoylfosfatidylcholin, dimyristoylfosfatidylserin, dipalmitoylfosfatidylserin, disteraroylfosfatidylserin, dimyristoylfosfatidyletanolamin.dipalmitoylfosfatidyletanol-amin, distearoylfosfatidyletanolamin, dimyristoylfosfatin-syre, distearoylfosfatinsyre, dipalmitoylfosfatinsyre, dimyristoylfosfatidylinostiol, distearoylfosfatidylinostiol, dipalmltoylfosfatidylinostiol, hydrogenert soyfosfatidyl-cholin, hydrogenert soylecithin, dipalmitoylfosfatidyl-glycerol, di-O-heksadecylfosfatidylcholin, dipalmitoyl-fosf atidylglycerol , distearoylfosfatidylglycerol, dimyr-istoylf osf atidylglycerol , blant andre.

Andre mettede lipider omfatter, men ikke begrenset til, de mettede lipidene som har symmetriske og/eller asymmetriske acylsidekjeder som er mettet, det vil si inneholder ingen dobbeltbindinger, lipider som har umettede sidekjeder hvor den umettede karbon-karbon dobbeltbindingen er orientert i transkonfigurasjonen og enkelte lipider som har umettede sidekjeder hvor den umettede karbon-karbon dobbeltbindingen er orientert i ciskonfigurasjon, eller blandede fettsyrelipider som for eksempel COPC og POPC.

Andre lipider som kan inkluderes med de mettede symmetriske lipidene omfatter andre liposomdannende lipider inkludert, for eksempel syntetisk eller naturlig fosforlipider som omfatter blandede kjedesammensetninger, for eksempel fosfatidylcholiner (PC), fosfatidyletanolaminer (PE), fosfatidylseriner (PS), fosfatidylglyceroler (PG), fos-fatinsyrer (PA), fosfatidylinositoler (PI), sphingomyliner (SPM) og cardiollpiner, blant andre, enten alene eller i blanding.

I tillegg til lipidene over, kan ytterligere lipider inkludert forskjellige lysolipider, for eksempel n-octadecyl-2-metylfosfatidylcholin, n-octadecylfosfatidylcholin, 1-laurylpropandiol-3-fosfocholin, erythro-N-lignoceroylsphingo-fosfatidylcholin, kolesterol, og vannoppløselige derivater av disse som for eksempel kolesterol hemlsuccinat, og alfatoco-feroler og vannoppløselige derivater av disse som tocoferol hemlsuccinat, og gangliosider, glycolipider og glycosphingo-lipid kan også bli inkludert i sammensetningene ifølge oppfinnelsen. En med vanlige kunnskaper innen teknikken vil forstå at mengden og typen lipid som kan bli Inkludert 1 sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan bli variert innen læren av oppfinnelsen for å gi de ønskede sammensetningene.

I sammensetningen fremstilt ifølge oppfinnelsen, blir de dimensjonerte liposomene som inneholder signifikante mengder av minst et mettet lipid, interdigitasert-sammensmeltet med tilsetning av en inducer. De dimensjonerte liposomene som vanligvis inneholder et mettet fosforlipid, vil gjennomgå full, partiell eller blandet interdigitasjon i blanding med en effektiv mengde av interdigitasjons-induceren. Uten å ville bli begrenset av teorien, er det antatt at induceren kan fungere ved å erstatte en del av de hodegruppe assosierte vannmolekylene og generelt forårsake en økning i hode-gruppenes overflateareal. Det er foretrukket at de valgte lipidene skal gjennomgå full interdigitasjon i nærvær av induceren; det må riktignok bil forstått at lipider som gir mindre enn fullstendig interdigitasjon, for eksempel enten blandet eller partiell interdigitasjon, også er omfattet og er innen rammen av oppfinnelsen. Eksempler på inter-digitasjonsinducere for bruk ved oppfinnelsens fremgangsmåte, omfatter for eksempel kortkjedede alkoholer inkludert metanol, etanol, propanol, isopropanol og n-butanol, polyoler som glycerol og etylenglycol, enestetika som klorpromazin, tetracain, fenyletanol, benzylalkohol og fenylbutanol, blant andre, buffere som tris og chaotropiske salter som thiocyanat (SCN-), så vel som andre angitt over.

I enkelte tilfeller er det mettede lipidet som blir anvendt ifølge oppfinnelsen for å danne IF-gelene og liposomene selv-inducere, det vil si disse lipidene vil interdigitasere for å danne IF-geler og liposomer ved blanding av lipidet i nærvær av et oppløsningsmiddel ved varierende temperaturer uten behov for å tilsette en kjemisk inducer (for eksempel, DHPC). I tillegg, kan i enkelte tilfeller ekstremt høyt trykk bli anvendt for å fremstille interdigitasjon uten behov for å omfatte en inducer.

Generelt omfatter sammensetningen en mengde av en inducer som er effektiv for sammensmelting av dimensjonerte liposomer. Mengden og typen av inducer som blir anvendt for å produsere liposomfusjon vil variere som en funksjon av typen av liposom som blir benyttet. Generelt vil riktignok mengden av inducer som blir anvendt utgjøre omkring 1,0 % til omkring 50 ^ av den totale vekt av oppløsningen som omfatter en blanding av de dimensjonerte liposomene, inducer og oppløst stoff. En med vanlig kunnskap innen teknikken vil forstå å enkelt variere konsentrasjonen av inducer innen læren i teknikken og oppfinnelsen for å fremstille interdigitasjonsgeler og liposomer.

Uten å være begrenset av teorien, er det antatt at dimensjonerte liposomer smelter sammen til lipidark (geler) ved visse inducerkonsentrasjoner for å lette bilagsbelastningen pålagt ved liten kurveradius (se for eksempel figur 3). Den resulterende interdigitasjons-fusjonsgelen kan holde i en stor konsentrasjon av oppløst stoff. Dette omfatter innekapslede substanser som ellers ikke kan bli holdt ved høye vektforhold mellom oppløst stoff og lipid i liposomer. Ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, når IF-gelene blir utsatt for temperaturer som vanligvis, men ikke nødvendigvis, er over deres L beta I-L alfa transisjonstemperatur ("Tm"), men i alle tilfeller ved en temperatur som forandrer materialets egenskaper til blandingen slik at IF-liposomene blir dannet, og induceren blir helst, men ikke nødvendigvis, fjernet, vil liposomer med høyt innekapslet volum være resultatet. Hvis liposomene kan variere i størrelse som funksjon av oppløst stoff, liposom og benyttet inducer, men vil generelt være 1 området fra lOOpm og mer foretrukket omkring 20 pm til omkring 0,025 pm.

Uten å bli begrenset av teorien er det antatt at interdigitasjon, som fører til lipidbilag som er mindre utsatte for forstyrrelser under liposomdannelse, kan bli benyttet for innekapsle substanser som normalt påvirker membranen og er vanskelig å innekapsle. For eksempel har interdigitasjons-fusjonsliposomer ifølge oppfinnelsen blitt anvendt for å innekapsle høye konsentrasjoner av aminoglycosider som er meget vanskelige å innekapsle med høye konsentrasjoner på grunn av deres tendens til å påvirke membranene. IF-liposomer har blitt vist å innekapsle gentamicin med et vektforhold medikant/lipid på omkring 1:2 (w:w) mens typiske modifiserte flerlamellære liposomer (SPLV) innekapsler gentamicin med et vektforhold på omkring 1:10 (w:w).

Fremstillingen av interdigitasjons-fusjonsgeler og liposomer Ifølge oppfinnelsen omfatter den første dannelsen av dimensjonerte liposomer med omkring 0,4 pm i diameter eller mindre, mer foretrukket 0,05 pm eller mindre og mest foretrukket ikke større enn omkring 0,025 pm. Alternativt kan FAT MLV bli benyttet, i noen tilfeller kan større liposomer bli anvendt. I en hvilken som helst av fremgangsmåtene som er tilgjengelig i teknikken for fremstilling av dimensjonerte liposomer kan bli benyttet, inkludert de metodene beskrevet i større detalj nedenfor. Typisk kan liposomer bli fremstilt ved vakuumtørking av en oppløsning av et lipid i organisk oppløsnlngsmiddel, for eksempel kloroform, en tynn film i en rundbundet eller annen passende flaske eller kar, fulgt av hydrering av llpldfilmen med et vandig oppløsnlngsmiddel som for eksempel vandig buffer eller saltvannsoppløsning. Alternativt kan liposomer bli dannet fra en blanding av tørt lipidpulver og vandig oppløsnlngsmiddel, fortrinnsvis for eksempel saltvannsoppløsning eller vandig buffer.

Liposomene blir så dimensjonert ifølge en hvilken som helst av metodene kjent i teknikken som sonikering, ekstrudering eller homogenisering og videre beskrevet nedenfor. Etter dannelsen av dimensjonerte liposomer, blir det oppløste stoffet, fortrinnsvis et bioaktivt stoff som skal bli innekapslet, vanligvis blandet 1 det vandige oppløsnings-middelet. To tilnærminger er vanligvis brukt for å innekapsle oppløst stoff avhengig av om det oppløste stoffet påvirker liposomene. Dersom det oppløste stoffet ikke påvirker liposomene, kan det oppløste stoffet bli blandet ved den vandige eller vandige/buffer oppløsningsmiddelet etter dannelsen av de dimensjonerte liposomene som skal gjennomgå interdigitasjon. Dersom det oppløste stoffet påvirker liposomene, blir det oppløste stoffet vanligvis blandet med det vandige oppløsningsmiddelet etter dannelsen av interdigitasjons-fusjonsgeler .

En med vanlige kunnskaper innen teknikken vil naturligvis forstå at rekkefølgen til de forskjellige komponentene til IF-gelene og liposomene ifølge oppfinnelsen blir tilsatt, kan vareiere og er avhengig av typen oppløst stoff som skal bli innekapslet og typen anvendt mettet lipid.

Den endelige konsentrasjonen av lipider anvendt for å innekapsle oppløste stoff ifølge oppfinnelsen vil variere som en funksjon av konsentrasjonen og typen av det oppløste stoffet som var ønsket så vel som typen av anvendt lipid, men vanligvis vil vektforholdet av medikament I lipid i det vandige oppløsningsmiddelet være i området fra 50:1 til omkring 1:100 hvor den endelige konsentrasjonen av lipid faller innen området fra omkring 5 til lOOmM. Det endelige vektforholdet av medikament i lipid i interdigitasjons-fusjonsgelene og liposomene ifølge oppfinnelsen varierer fra omkring 1:10 til omkring 15:1.

Etter at de dimensjonerte liposomene er dannet, blir inducer tilsatt det vandige oppløsningsmiddelet. Mengden av tilsatt inducerer varierer generelt fra omkring 1,0 vekt-36 (av den sammensatte vekten av lipid, oppløst stoff og induser (opptil omkring 50 vekt-56). Når etanol blir brukt som induceren, er vanligvis mengden av inkludert etanol omkring 5-# (1,0 M) til omkring 20 vekt-# (4,0 M) og for glyceryl kan mengden benyttet glycerol være så mye som omkring 90 til 100 vekt-#. Mengden av andre inducere som blir benyttet, vil variere. For etanol faller den endelige etanolkonsentrasjonen innen området fra omkring 0,50 til omkring 10,0 molar og er fortrinnsvis i området fra omkring 1,75 til omkring 4,0 molar.

Nærværet av inducer i en effektiv mengde vllforårsake de dimensjonerte liposomene og smelte sammen og resultere 1 sammensmeltede flater av lipid. IF-gelen fremstil ved denne fremgangsmåten kan bli anvendt topikalt eller for oral administrasjon, for eksempel som formuleringer innekapslet i bløt gelatin eller andre orale doseringsformer. Alternativt kan gelen bli videremodifisert for å gi IF-liposomene ifølge oppfinnelsen.

For å fremstille IF-liposomer ifølge oppfinnelsen, blir blandingen inkubert ved en temperatur over en tidsperiode som er tilstrekkelig for å danne en gel. Typisk varierer denne perioden fra omkring 1 minutt til omkring 1 time. Deretter blir temperaturen vanligvis, men ikke nødvendigvis, øket over Tm til lipidet i en periode fra omkring 1 minutt til omkring 1 time. Den nødvendige inkubasjonstemeraturen kan være Tm til blandingen, men er den temperaturen for en gitt blanding av lipid, oppløst stoff eller Inducer som gir en forandring i materialegenskapen til blandingen, og derved gir IF-liposomene ifølge oppfinnelsen. Under opprettholdelse av denne inkubasjonstemperaturen, kan induceren bli fjernet ved avdamping (spesielt når induceren er alkohol), positivt nitrogentrykk (det vil si N£overrisling bestående hovedsakelig av bobl ing av N2gjennom blandingen) eller ved fortynning. Dette gir IF-liposomer som varierer i størrelse vanligvis mellom 0,025 og omkring lOOum, mer foretrukket omkring 0,025 til omkring 20 um. Ikke-innekapslet medikament kan bli fjernet fra oppløsningsmiddelet hvis ønskelig. IF-liposomne produsert ved metoden over kan bli videre redusert i størrelse for å gi liposomer med varierende eller homogen størrelse.

I tillegg til ekstrusjon, kan de opprinnelige liposomene (før tilsetningen av inducer) for IF-gel eller liposommetoden, og resulterende IF-liposomer blir redusert i størrelse ved sonikering eller homogenisering. Sonikering benytter ultralydenergi for å ødelegge eller dele de større liposomene spontant vil gjendannes til små liposomer. Se for eksempel Chapman, et al., BBA, 163, 255 (1968). Sonikering blir oppnådd ved å dykke ned et glassrør inneholdende liposomsuspensjonen i det soniske episenter fremstilt i en sonikator av hadtypen. Alternativt kan en sonikator av sondetypen bli anvendt hvor ultralydenergien ble generert ved vibrasjon av en titansonde som er i direkte kontakt med liposomsuspensjonen .

Ved homogenisering blir skjærkrefter som forårsaker ned-bryting av større liposomer til mindre ved at for eksempel innretninger av rotorstatortypen, som Polytron (Brinkman Instruments Co., Westbury, New York, USA), en stator-stator type innretning som Microfluidizer (Mikrofluidics Corp., Newton, MA, USA), eller en hvilken som helst av andre slike innretninger som er vanlig benyttet for å sprenge celler. På grunn av det faktum at alle de ovennevnte fremgangsmåtene omfatter sprenging av IF-liposomene, vil innekapslet oppløst stoff bli tapt når IF-liposomene blir utsatt for en av disse fremgangsmåtene. Tapet kan riktignok bli minimalisert dersom det ikke-innekapslede oppløste stoffet ikke blir fjernet fra liposomsuspensjonen før størrelsesreduksjonen av liposomene.

Mange andre teknikker kan bli anvendt for fremstilling av dimensjonerte liposomer som skal gjennomgå interdigitasjon-fusjon og for fremstilling av dimensjonerte IF-liposomer etter at prosessen er fullført. Disse fremgangsmåtene omfatter revers fase fordamping, en fusjonsfremgangsmåte, homogenisering, sonikering, mikrofluidisering og detergent-fortynning eller en kombinasjon av disse fremgangsmåtene. En oversikt over enkelte av disse og andre fremgangsmåte for fremstilling av liposomer kan bli funnet i teksten Liposomes, Marc J. Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, kaitell 1, hvor relevante deler Inkluderer som referanse. Dimensjonerte liposomer kan også fremstilt ved en eks-trusjonsprosess.

I ekstrusjonsprosessen for å produsere dimensjonerte liposomer, blir liposomene ledet gjennom filtere som har porestørrelser som vanligvis varierer fra 30 nm til omkring 1 pm for å gi liposomer som varierer i størrelser fra omkring 30 nm til omkring 1 pm i diamter. Porestørrelsen av filtrene gjennom hvilke liposomene kan bli ekstrudert, bør være i området fra 100 nm til omkring 1 pm. Filtrene er vanligvis laget av polykarbonat, men filtrene kan være laget av et hvilket som helst holdbart materiale som ikke samvirker med liposomene og som er tilstrekkelig sterkt til å tillate ekstrudering under tilstrekkelig trykk. Foretrukne filtere omfatter "rett gjennom" filtere fordi de vanligvis kan motstå høye trykk ved den foretrukne ekstruderingsprosessen ifølge oppfinnelsen. Filtere med "buktede porer" kan også bli brukt. I den foretrukne utførelsen av oppfinnelsen, blir pre-IF fusjons liposomer ekstrudert gjennom 50 til 100 nm polykarbonatfiltere for å gi liposomer som har en diameter på omkring 50 til 100 nm.

En hvilken som helst ekstruderingsprosess som er tilgjengelig i teknikken kan bli anvendt for å produsere dimensjonerte liposomer ved å gjennomgå interdigatsjon-fusjon. Ekstrusjonsprosessen kan bli utfør sekvensielt eller på én gang under høyt trykk. Spesielt foretrukne ekstruderingsprosesser for anvendelse for oppfinnelsen omfatter de beskrevet i Cullis, et al., PCT-søknad PCT/US85/01161, publikasjonsnummer WO 86/00238, hvor relevante deler inntas som referanse.

Andre fremgangsmåter for dimensjonering av liposomene enten før eller etter fusjon, er filtrasjonsmetoder som benytter asymmetriske filtere som for eksempel Anotec<®->filtere ifølge den parallelt løpende US-søknad 593.200, som omfatter ekstrudering av liposomer gjennom et forgrenet poretype aluminiumoksyd porøst filter, relevante deler av denne søknad tas her inn som referanse.

Alternativt kan liposomene bli dimensjonert ved hjelp av homogenisering eller maleprosedyre som en kollodial mølle, for eksempel Gifford Wood kollodial møllen. Liposomene kan bli ledet en eller flere ganger gjennom møllen inntil den passende størrelsen og homogen!siteten er oppnådd, analysert for størrelsedistribusjon ved hjelp av enten Nicomp par-tikkel-sorterer eller Malvern partikkelsorterer. Liposomene kan alternativt bli ledet gjennom en mikrofluidizer innretning, diskutert over, som likeledes homogeniserer liposomene.

Hvis ønskelig kan de resulterende liposomene bli adskilt i populasjoner ved hjelp av kjente fremgangsmåter for separering; en slik prosess er for eksempel tagential gjennomstrøm-mingsfiltrering. Denne fremgangsmåten benyttet for separering av liposomer Ifølge størrelsen er beskrevet i den parallelt løpende US-søknad nr. 225.327, og relevante deler er her tatt inn som referanse.

I denne fremgangsmåten, blir en heterogent dimensjonert populasjon av liposomer ledet gjennom en eller flere tagentiale gjennomstrømmingsfiltere for derved å resultere 1 en størrelsesdistribusjon med en øvre og/eller nedre størrelsesgrense. For eksempel, når to filtere med forskjellige størrelser blir brukt, for eksempel et første filter med 5 um porestørrelse, passerer liposomer mindre enn 5,0 pm gjennom filtere og inn i filtratet som så blir ledet gjennom et annet filter med en mindre porestørrelse, for eksempel 2,0pm porestørrelse. I dette tilfellet inneholder det tilbakeholdte materialet liposomer med en homogen størrelsesdistribuering som har klare størrelsesgrenser på 5,0 og 2,0 pm. Filteret med forskjellige porestørrelser kan bli anvendt for å gi adskilte populasjoner som har øvre og nedre størrelsesgrenser.

Liposomene som undergår interdigitasjon-fusjon i nærvær av en inducer har helst en diameter på 0,4 pm eller mindre, helst omkring 0,05 pm eller mindre og aller helst er omkring 0,025 pm eller mindre diameter. Alternativt kan de initielt dimensjonerte liposomene ifølge oppfinnelsen være FAT MLV. IF-liposomene som er fremstilt ved de generelle fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen varierer vanligvis i størrelse fra omkring lOOpm, og mer foretrukket omkring 20 pm til omkring 0,025 pm og vanligvis i området fra omkring 2 til 20 pm. Disse resulterende IF-liposomene kan bli ytterligere størrelsesredusert for de liposomer med varierende størrelse ved sonikering, homogenisering og ekstruderingsteknikker som beskrevet over. Det må riktignok noteres at selv om disse IF-liposomene ifølge oppfinnelsen kan bli gjort mindre, vil størrelsesreduseringen ofte resultere I tap av bioaktive stoffer fra liposomene. IF-liposomer som gjennomgår ytterligere størrelsesreduksjon, for eksempel med den tidligere diskuterte ekstruderingsprosessen eller andre fremgangsmåter som sonikering og homogenisering for å variere størrelsen til de produserte liposomer, kan inneholde minkede konsentrasjoner av bioaktive stoffer.

Bioaktive stoffer for anvendelse i oppfinnelsen kan omfatte vitaminer, hormoner, antimetaboliter, antimikrobielle stoffer, antifungale stoffer, antibiotika, proteiner, peptider, ribo og deoksyribonukleinsyrer, nukleotider, nukleocider, oligonukleotider, antihistamine stoffer, naurofarmakologiske stoffer inkludert sedativer og hypnotika, stereoidal og ikke-stereoldale antlinflammatorlske stoffer, diuretiske stoffer, antihypertensive stoffer, anti-arrhymetiske stoffer, immunogener, immunomodulatorer, kontraseptive stoffer, radiografiske kontrastmidler, NMR-kontrastmidler, antivirale midler og vaskulærdillaterende stoffer blant andre. De enkelte foretrukne utførelser av oppfinnelsen, gir radiokontrast midler, NMR-kontrastmidler, peptider og naturlig forefinnende, syntetiske og halvsyntetiske antimikrobielle stoffer for eksempel cepfalo-sporiner og aminoglycoslder, benyttet i oppfinnelsen. Eksempler på radiokontrast midler for anvendelse i oppfinnelsen omfatter for eksempel ioheksol, iopamidol, ioksoglat, iotrolan, ioversol, iothalamat, iodimid, iodipamid, iopromid, iopentol, iodiksanol, metrizamid, blandinfer av disse og deres farmasøytisk akseptable salter. Eksempler på aminoglycosider omfatter gentamicin, tobramycin og amikasin.

Passende biologiske midler for anvendelse i oppfinnelsen omfatter et hvilket som helst stoff som viser ønskelig biologisk aktivitet når de blir administrert tropikalt eller systemisk og er stabile overfor sammensetningene ifølge oppfinnelsen. Midler som kam bli tropikalt administrert for sin virkning på huden omfatter salicylsyre, resorcinol, fenol, retinoinsyre og deres ekvivalenter. Andre midler for anvendelse i oppfinnelsen omfatter visse desensibiliserende midler, for eksempler anti-gener og vaksiner, vitaminer, næringsstoffer, som aminosyrer, essensielle fettsyrer og mineraler, retinoider, anti-neoplastiske og anti-tumormidler, inkludert enkelte alkylerende midler blant annet.

Ytterligere bioaktive midler for anvendelse i oppfinnelsen omfatter benzodiazepinene, antipyretiske midler, antispasmotika, antipruritiskemidler, sympathomimetika, deconge-stanter, beroligende midler, antispasmotika, akrdioaktive, andre hjertemedisiner, antiemetika, sedativer og hypnotika, stereoidale midler, progestationale midler, lokal anestetika og antibiotika. Andre antimikrobielle stoffer som også kan bli anvendt i oppfinnelsen omfatter blant annet antifungale midler.

Den ovenfor opplistede gruppen av bioaktive stoffer, blant andre stoffer, inkludert deres farmasøytisk akseptable salter, er omfattet for bruk i oppfinnelsen. Bestemmelse av forenelighet med de ovenfor opplistede stoffene med og mengdene som skal bli benyttet i sammensetning ifølge oppfinnelsen er innen de vanlige kunnskaper I formulerings-teknikken. Stabiliteten og anvendelsen av individuelle farmasøytiske stoffer ligger innenfor normale kunnskaper for den som praktiserer innen teknikken.

Det må noteres at de aktuelle foretrukne mengdene av bioaktive midler benyttet i et spesielt tilfelle kan variere ifølge alvoret av farmakologisk eller sykdomstilstand og antatt farmakokinetikk til bioaktive stoffer hos den individuelle pasient. Doseringer for en gitt vert kan bli avgjort ved bruk av vanlige betraktninger, det vil si ved vanlig sammenligning av forskjellige aktiviteter til det bestemte bioaktive middelet ved hjelp av en passende, konvensjonell farmakologisk protokoll.

IF-liposomene fremstilt Ifølge oppfinnelsen kan bli administrert til et hvilket som helst dyr inkludert pattedyr, som mennesker. For administrasjon til mennesker i behandling av lidelser, vil den behandlende legen til sist bestemme den passende doseringen for et gitt individ og dette kan antas å variere med alderen, vekten og responsen til individet så vel som naturen og alvoret av pasientens symptomer. Det tillates store variasjoner i llposomale medikamentkonsentrasjoner.

Administrasjonsmetoden for sammensetningen fremstilt ifølge oppfinnelsen, kan bli bestemt ut fra stede i organismen til hvilke sammensetningene skal bli administrert. For eksempel kan administrering til et spesifikt infisert sted enklest bli gjort ved topikal påføring (hvis infeksjonen er utvendig, det vil si på arealer som øynene, huden, i ørene eller på lidelser slik som sår eller forbrenninger) eller ved absorbsjon gjennom epithel eller slimhinnevegger (for eksempel nasalt, oralt, rektalt, gastrointenssinalt, mucosalt, etc). Slike topiske anvendelser kan være i form av kremer eller salver. Interdigitasjons-fusjons gelene ifølge oppfinnelsen blir fordelaktig benyttet topikalt.

IF-liposomene som inneholder bioaktive midler, kan bli administrert alene, men vil vanligvis bli administrert i blanding med farmasøytiske bærere valgt med hensyn til administrasjonsveien og standard farmasøytisk praksis for å danne farmasøytiske sammensetninger. IF-liposomene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan bli injisert parentalt, for eksempel intravenøst, intramuskulært eller subkutant. For parental administrasjon, blir disse liposomene best anvendt i form av sterile vandige oppløsninger som kan inneholde andre oppløste stoffer, for eksempel nødvendige salter, glycose eller dekstrose for å gjøre oppløsningen isoton.

For oral administrasjon, kan liposomene bli anvendt i form av

tabletter, kapsler, pastiller, drogeer, pulvere, siruper, elixirer, vandige oppløsninger og suspensjoner og lignende. For tabletter inkluderer bærere som kan bli brukt lactose, natriumsitrat og salter av fosforsyre. Forskjellige dis-integranter som stivelse og smørende stoffer som for eksempel stivelse kan bli anvendt. For ural administrasjon i kap-selform, er nyttige fortynner laktose og høy molekylvekt polyetylenglycoler. Når vandige suspensjoner blir krevd for oral anvendelse, kan forskjellige søtningsstoffer og/eller smaksstoffer bli tilsatt.

Bioaktive stoffer for anvendelse i oppfinnelsen kan omfatte, men er ikke begrenset til, de som er listet over og kan omfatte deres farmasøytisk akseptable salter. Bestemmelse av forenelighet med de ovenfor opplistede stoffene og mengdene som skal bli anvendt i sammensetningen ifølge oppfinnelsen er innen vanlig kunnskap i formuleringsteknologien. Stabiliteten og anvendeligheten til individuelle farmasøytiske stoffer er innenfor ordinære kunnskaper til praksisen innen teknikken. Det må noteres at de bestemte foretrukne mengdene av bioaktive midler benyttet i et bestemt tilfelle kan variere ifølge alvoret av en fysiologisk eller sykdomstilstand og den antatte farmakokinetikk til bioaktive midler hos den individuelle pasient. Doseringer for en gitt vert kan bli bestemt ved bruk av vanlige betraktninger, det vil si ved vanlig sammenligning av de forskjellige aktivitetene til det bestemte bioaktive stoffet bruk av en passende, konvensjonell farmakologisk protokoll.

IF-liposomene kan for eksempel bli fjernlastet for å innlemme bioaktive stoffer. Hvis ønskelig kan IF-liposomer bli dehydrert ved hjelp av for eksempel fremgangsmåten til Janoff et al. US-PS 4.880.635 eller Schneider et al., US-PS (TLC-163).

De følgende eksempler skal illustrere foreliggende oppfinnelse og ikke begrense den.

EKSEMPEL 1

Liposomer bestående av dipalmitoylfosfatidylcholin (DPPC, anskaffet fra Avanti Polar Lipids, Birmingham, Alabama, USA), ble formet i en 1 ml vandig bufferoppløsning til en konsentrasjon på 20 mM DPPC og i tillegg inneholde 0,04 mM difenylheksatrien (DPH, anskaffet fra Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA). Etter dannelsen av liposomene ble etanol tilsatt til den endelige konsentrasjonen på fra 0,3M til 2,5M av den vandige oppløsningen.

DPH fluoriserer maksimalt når den blir innlemmet i liposom-bilaget. Interdigitasjon resulterer i reorientering av DHP fra bilagsmembranen, med en følgende minking av fluorescence. Som vist i figur 2, er interdigitasjonen større når høyere konsentrasjoner av etanol er tilstede for alle liposomer. Interdigitasjonseffekten ved samme mengde etanol er større i de liposomene som har større diameter. I figur 2, FO = DPH fluorescence i fravær av etanol; F = DPH fluorescence i nærvær av alkohol. Excitasjon = 351 nm: Emisjonen ble målt mellom 380 og 580 nm og kvantifisert ved veiing.

EKSEMPEL 2

Lipidblanding av liposomer

Lipidblanding av dimensjonerte DPPC-liposomer ble bestemt som en funksjon av størrelsen til liposomene og konsentrasjonen av inducer. Liposomene bestående av DPPC ble formet i en vandig bufferoppløsning inneholdende 20 mM DPPC. En markør- populasjon av liposomer inneholdende 99 vekt-# DPPC, 0,35 vekt-96 N-benzyldifosfatidyl-etanolamin (NBD-PE) og 0,65 vekt-% rhodamin-fosfatidyletanolamin ble dannet i 1 ml av en vandig bufferoppløsning. Disse sondene danner et donor-akseptorpar. NBD-delen blir eksitert ved 465 nm og via resonans energioverføring (RET) blir de slukket av rotamin-akseptoren som selv blir eksitert i et avstandsavhengig fenomen. Disse liposomene blir blandet med blanke liposomer i et 1:10 forhold. Emissjonsspekterene ble målt mellom 480 og 680 nm. Lipid-blanding i DPPC-liposomer av varierende størrelse som en funksjon av etanolkonsentrasjonen kan bli bestemt ved tapet av RET fra NBD-delen til rhodamindelen. En standardkurve ble laget ved fremstilling av liposomer ved 0,35 mol-% NBD-PE og 0,65 mol-# rhodamin-PE med sekvensiell minking av disse mol-% til henholdsvis 0,035 og 0,065. En direkte sammenligning fra 1 til 10 blandingseksperimentene med denne standardkurven indikerer graden av lipidblanding, en indikasjon på membranfusjon.

EKSEMPEL 3

Sammenligning av innekapslet oppløst stoff i forskjellige vesikkel-typer.

Flere liposomale formuleringer blir fremstilt. Mengden av innekapslet vandig fase ble bestemt og sammenlignet for hver fremstilte liposomtype. Resultatene . er vist i tabell 1 nedenfor.

For fremstillingen av IF-liposomer, ble MLV fremstilt som beskrevet nedenfor til en endelig konsentrasjon på 20 u-mol DPPC pr ml vandig buffer. MLV ble så sonikert i en badtype sonikator evd 50"C inntil gjennomskinnelig (SUV). Etter at SUV ble avkjølt til romtemperatur, ble etanol tilsatt til en endelig konsentrasjon på 2,0 M i den endelige vandige suspensjonen. For eksemplene Al og A2 (se tabell 1 nedenfor), ble etanol fjernet ved fortynning fulgt av vasking. For Bl og B2, ble etanol fjernet ved positiv trykkerstatning ved hjelp av Ng hvoretter prøvene hie fortynnet og vasket. Prøve C hadde halvparten av opprinnelig lipidkonsentrasjon av A og B og etanolfjerning ble oppnådd som for prøve A.

For fremstilling av MLV, ble 100 mg DPPC i 5 ml kloroform rotasjonsfordampet til en tynn, tørr film i en rundbundet flaske hvorpå 1 ml vandig bufferoppløsning inneholdende 0,04 mM difenylheksatrien ble tilsatt. Deretter ble lipid-blandingen kraftig virvlet inntil alt lipidet var fjernet fra veggen.

FATMLV ble dannet ved å utsette uvasket MLV som beskrevet over, for 5 fryse- og tinesykluser som beskrevet av Bally et al., US-PS 4.975.282.

SPLV ble fremstilt ved dannelse av den tynne filmen av DPPC som beskrevet over for MLV og så oppløsning av lipidfilmen i 5 ml etyleter til hvilken 0,5 ml vandig buffer også ble tilsatt. Denne blandingen ble så emulgert i en sonikator av badtypen, en strøm N<2>ble for å røre emulsjonen og samtidig fjerne eteren som beskrevet av Lenk, et al., US-PS 4.522.803. Eterfjerning ble fortsatt inntil ingen gjenværene lukt ble oppdaget (omkring 5 minutter). Den resulterende lipid-blandingen ble resuspendert i 1 ml vandig buffer.

MLV ble dannet som beskrevet i US-PS 4.588.578 ved fremstilling av en monofase av 100 mg DPPC og 5 ml kloroform, 5 ml etanol og 0,5 ml vandig buffer, rotasjonsfordamping til tørrhet og resuspendering av den suspenderte filmen i 1 ml vandig buffer ved kraftig virvling.

For å bestemme det innekapslede vandige volumet, ble 20 ul av 10 mM 4-trimetylammonium TEMPO (4-TMAT) oppløsning tilsatt til 0,98 ml av de liposomale suspensjonene. Prøvene ble så virvlet og den ytre vandige fasen ble separert fra liposomene ved sentrifugering. Fordi 4-TMAT hverken binder eller trenger gjennom liposomene anvendt i disse studiene, blir det konsentrert I den ytre vandige fasen. Målinger av 4-TMAT konsentrasjon tillot utregninger av det interne vandige fasen eller innekapslet volum som beskrevet av Perkins et al., BBA, 943, 103 (1988). Resultatene av denne analysen er vist i tabell 1 nedenfor. Som vist, opptar IF-liposomene betraktelig større volumer, i noen tilfeller så mye som ti ganger mer enn det oppnådd med andre liposomtyper.

EKSEMPEL 4

Fremgangsmåte for dannelsen av IF-liposomer

Liposomer (LUV, MLV, SPLV etc. som fremstilt over (bestående av et mettet lipid som dimyristoylfosfatidylcholin, dipalmitoylfosfatidylcholin eller distearoylfosfatldylcholln blir fremstilt og dimensjonert til 0,4 um eller mindre (fortrinnsvis 0,025 pm) ved ekstrudering, sonikering eller homogenisering. Bioaktivt middel som ikke samvirker med lipidet blir så blandet med det vandige oppløsningsmiddelet som blir anvendt for å danne liposomene (endelig lipidkonsentrasjon skal være omkring 5 til 100 mM, fortrinnsvis omkring 10 til 35 mM). temperaturen til liposomene er under hovedfase-transisjonstemperaturen for lipidet. Deretter blir etanol tilsatt til en endelig konsentrasjon på omkring 1,75 til omkring 2,5 M i den vandige oppløsningen. For bioaktive midler som vekselvirker med lipidet, blir midlene vanligvis tilsatt oppløsningsmiddelet etter tilsetningen av etanol og dannelsen av IF-gelen. I dette trinnet, kan fremgangsmåten bli stoppet ved den resulterende gelen anvendt i topikale og orale formuleringer. Alternativt kan gelen bli anvendt for å danne IF-liposomer ifølge oppfinnelsen.

For å danne IF-liposomer, blir gelen inkubert ved en temperatur under Tm til lipidet for en tid som varierer fra 1 minutt til omkring 1 time fulgt av en inkubasjonsperiode på omkring 1 minutt til omkring 1 time ved en temperatur over lipidets Tm. Induceren blir så fjernet ved avdamping, positivt nitrogentrykk eller fortynning. For etanol kan etanolen bli fortynnet til en konsentrasjon under omkring 0,2 M. Når induceren er fjernet, dannes liposomer som vanligvis varierer i størrelse fra omkring 0,25 pm til omkring 20 pm.

EKSEMPEL 5

Oppskalering av diatrizoat-DPPC IF-liposomer

600 mg av DPPC ble tørket til en film fra kloroform ved rotasjonsfordamplng, så tørket videre under vakuum i 16 timer. Lipidet ble resuspendert i 6 ml 0,9$ saltvanns-oppløsning ved inkubering i et 51"C bad i omkring 15 minutter. De resulterende multimultilamiHære liposomene (MLV) ble overført til et 30 ml Corexrør og badsonikert 1 2

timer ved 51 °C inntil oppløsningen var gjennomsiktig. På dette tidspunkt kunne kun 4,1 ml av liposomsuspensjonen bli gjenvunnet. 12 ml diatrizoat (Renografin-76tm, tilgjengelig fra Bristol-Myers Squibb), 12 ml deutrert vann ("dH20"), og 2 ml etanol ble blandet i en 50 1 sentrifugeflaske til hvilken 4,1 ml lipid (enda ved 51°C) ble tilsatt og så kort virvlet. Innen 10 minutter ble blandingen en løs, hellbar gel som ble tillatt å sette ved romtemperatur i 2 timer. Deretter, ble suspensjonen inkubert i et 51 "C bad i 1 time. På dette tidspunktet ble prøven splittet i to halvdeler for å lette etanolfordamplngen. Fremdeles neddykket i badet, ble N2 boblet gjennom hver prøve i 12 minutter. Prøvene ble avkjølt ved romtemperatur fulgt av fortynning med 20 ml 0, 9% saltvannsoppløsning pr. prøve. Preparatene ble vasket ved gjentatt sentrifugering ved 10000 x g ved 20"C i 10 minutter 3 ganger. Prøvene ble analysert som beskrevet for eksempel 6 nedenfor. Resultatene finnes i tabell 2 nedenfor.

EKSEMPEL 6

Diatrizoat-HSPC IF-liposomer

400 mg HSPC (Natterman Phospholids) ble dehydrert ved 70°C i 10 ml dH20 ved omkring 1 time og sondesonikert inntil den var gjennomsiktig (30 minutter). 14 ml diatrizoat (Squibb) inneholdende omkring 1 pCl/ml<*25>i-diatrizoat ble blandet med 2,1 ml dH20 og 4,9 ml etanol i et 50 ml Corex^rør med skrutopp. 7 ml av HSPC små unilamillære liposomer (SUV) ble tilsatt under omrøring; dette var gjort mens SUV fremdeles var over sin Tm. En fast gel ble øyeblikkelig dannet og ble

tillatt og sette ved romtemperatur, dekket i omkring i 1 time. Preparatet ble så inkubert udekket i 2 timer i et 70°C vannbad hvoretter N2 ble boblet gjennom det nå flytende preparatet i 23 minutter. Ng gjennomstrømningshastigheten var på10 på Manostat<tm>strømningsmåleren. En 4 ml prøve ble fordelt i et 39 ml Corex<tm>rør og tillatt å avkjøle til romtemperatur. 10 ml i 900 mOsm megluminbuffer (fremstilt fra meglumin, NaCl, sitrat, EDTA) ble tilstt og preparatet ble virvlet svakt. Ikke-innekapslet diatrizoat ble fjernet ved gjentatt sentrifugering ved 10000 x g ved 18°C i 15 minutter i 3 omganger. Den endelige iodkonsentrasjonen ble bestemt ved ekstra polering fra en UV spektrofotometrisk analyse av diatrizoat (A256) til å være 106,3 mg/ml. Den endelige lipidkonsentrasjonen var 12,1 mg/ml bestemt ved standard metoder beskrevet av Chen et al.. Det endelige I:L var 8,8 (w/w). Den resulterende liposomale suspensjonen ble lagret under omgivelsesbetingelser.

EKSEMEPL 7

Iotrolan-HSPC IF-liposomer

1 g HSPC (Natterman Phospholipids) ble dehydrert ved 70" C i 25 ml dHgO i omkring 1 time og sondesonikert inntil den var gjennomsiktig (omkring 30 minutter). De fremstilte SUV ble overført til et 50 ml Corex<tm->rør med skrutopp og sentrifugert ved 5000 g i omkring 5 minutter for å pelletere eventuelt tilstedeværende titan. SUV ble dekantert fra titanpelleten og Inkubert i et 70°C vannbad i omkring 5 minutter før den ble tilsatt den følgende oppløsningen: 44 ml<125>I' iotrolan ble blandet med 15,6 ml etanol og 6,4 dHgO. Denne oppløsningen ble delt i 4 x 16,5 ml deler i 50 ml Corex<tm->rør med skrutopp. 5,5 ml SUV ble tilsatt til hvert rør under blanding og resultert i dannelsen av løse geler. Gelene ble satt dekket i 1 time ved romtemperatur, så ble hver overført til et 70"C vannbad 1 omkring 1 time udekket, hvoretter Ng ble boblet gjennom væsken 1 hvert rør i 13 minutter med en gjennomstrømningshastighet på 40 på gass- gjennomstrømningsmåleren. Hvert rør ble tømt i en 250 ml Erlenmeyer kolbe hvor den ble avkjølt ved romtemperatur. Omkring 150 ml steril PBS (fosfatbuffret saltvannsoppløsning uten Ca og Mg, pH 7) ble tilsatt under virvl ing av kolben. Den ikke-fangede iotrolan ble fjernet ved gjentatt sentrifugering ved 10000 g i 10 minutter ved 18°C i 3 omganger. Den endelige iodkonsentrasjonen ble basert på den opprinnelige spesifikke aktiviteten til iotrolanoppløsningen ved 300 mm/ml lod og ble funnet å være 152,7 mg/ml. Den endelige fosfolipidkonsentrasjonen ble bestemt til å være 32,7 mg/ml ved fremgangsmåten fra Chen, et al., Analytical Chem., 28, 11, 1756 (1956) og ble korrigert for nærværet av fosfat i bufferen. Disse verdiene resulterte i endelig I:L forhold på 4,7 (w/w). Den resulterende liposomsuspensjonen ble lagret under omgivelsesbetingelser.

EKSEMPEL 8

Lagringsstabilitet til radiokontrastmiddel IF-liposomerlagret under omgivelsesbetingelser 50 pl av enten diatrizoat eller iotrolan HSPC IF-liposom-preparater (radiomerket) ble fortynnet med 1 ml av deres opprinnelige suspensjonsbuffere sentrifugert ved 16000 g i en mikrosentrifuge ved romtemperatur i 10 minutter. Supernatantene ble fjernet og begge pelletene og supernatantene tellet for 1251. Etter 62 dager ved 25 "C, var 4# av det radlomerkede i supernatanten fra ditrizoatliposomene og etter 54 dager var 3$ i supernatanten fra iotrolanliposomene. Basert på disse resultatene viser preparatene en lagringstid på minst omkring 1 år de blir lagret under omgivelses-betingleser.

EKSEMPEL 9

Effekt på opprinnelig lipidkonsentrasjon på innekapslingen av diatrizoat i DPPC IF-liposomer

Resultatene som vises i tabell 3 nedenfor representerer IF-liposompreparater fremstilt som tidligere beskrevet i eksempel 5, med variasjon i den opprinnelige lipidkonsentrasjonen. Kort beskrevet ble i 15 ml Corex^-rør 1 ml diatrizoat blandet med dHgO og DPPC dimensjonerte unilamellære liposomer (SUV) ved 50 mg/ml for å oppnå de endelige volumene vist nedenfor. Før lipidtilsetning ble 87,5 ul etanol pr. ml (endelig volum 2M) tilsatt til diatrizoat oppløsningen. Preparatene sto dekket i 1 time ved romtemperatur fulgt av inkubering i et 51"C bad udekket. Etter 1 time ble Ng boblet gjennom hver prøve i 2 minutter. Etter avkjøling til romtemperatur ble hver prøve fortynnet med 10 ml 0,956 saltvannsoppløsning og vasket ved gjentatte sentri-fugeringer ved 10000 g i 15 minutter ved 20°C i 3 omganger. Prøvene ble analysert som tidligere beskrevet (eksempel 3). Resultatene vises i tabell 3 nedenfor.

EKSEMPEL 10

Innekapsling av gentamicin i IF-liposomer

En oppløsning av gentamicinsulfat (Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, USA) ble fremstilt i 0,9$ saltvanns-oppløsning til en endelig konsentrasjon på 500 mg/ml. Preparat ble 100 mg DPPC (Avanti Polar Lipids) avdampet til tørrhet og hydrert 1 2,5 ml saltvannsoppløsning til en endelig konsentrasjon på 40 mg/ml. DPPC blandingen ble sonikert på en badsonikator til klarhet.

De følgende blandingene ble fremstilt. Noter at etanol-induceren ble tilsatt før oppløsningen inneholdende gentamicinsulfat.

A - 0,5 ml DPPC-oppløsning, pluss etanol ("EtOH") (til en endelig konsentrasjon på 2M) og 0,5 ml gentamicinoppløsning;

B - 0,25 ml DPPC-oppløsning, pluss 0,25 ml 0, 9% NaCl saltvannsoppløsning, EtOH (til en endelig konsentrasjon på 2M) og 0,5 ml gentamicinoppløsning;

C - 0,25 ml DPPC-oppløsning, pluss 0,75 ml saltvanns-oppløsning, EtOH (til en endelig konsentrasjon på 2M) og 1,0 ml gentamicinoppløsning.

Hver av preparatene ovenfor ble analysert for gentamicin-aktivitet ved agar brønndiffusjons bioanalysen for å bestemme lipid:gentamicinkonsentrasjonen. Kort sagt ble liposomene i hver av preparatene over så sprengt med 0, 2% triton-X 100 (Biorad Laboratories, Richmond CA) og analysert for genta-micinaktivitet ved hjelp av en agar brønndiffusjons bio-analyse med Bacillus subtilis (ATCC #6633) som indikator-organismen. Lipidkonsentrasjon ble bestemt ved standard-metoder som beskrevet av Ames, et al., Journal of Biological Chem. 235, 236, 769 (1960).

Resultatene fra bioanalysebestemmelsene er vist i tabell 4 nedenfor. Resultatene indikerer at meget lave lipid/gentamicin vektforhold kan bli oppnådd.

EKSEMPEL 11

Oppskalering av DPPC - iotrolan IF-liposomer

8 g DSPC ble blandet i 200 ml vann for injeksjon ("WFI") ved 70°C i 30 minutter. Den resulterende suspensjonen ble ledet gjennom en Mikrofluidizer homogenisator 25 ganger ved et trykk på 733 kg/cm<2>for derigjennom å danne SUV. De resulterende SUV ble filtrert gjennom et 0,22 um porestørrelse millipor buktet sti polymert filtert.

Iotrolan (92 ml, ved 300 mg/ml), 13,4 ml WFI og 32,6 ml etanol ble blandet i en 2000 ml rundbundet flaske. SUV (44 ml) ble blandet 1 flasken ved romtemperatur (omkring 25°C) og blandet ved hjelp av en bananåreblander i 10 sekunder. Gelen som ble dannet etter blandingen ble tillatt å stå uforstyrret i 1,25 timer.

Den rundbundede flasken ble plassert i et 70'C vannbad og blandet ved hjelp av bananåren ved 66 rpm i 1 time. Etanol ble så fjernet ved nitrogeninnsprøyting over den vandige overflaten ved en hastighet på 4,7 liter Ng/minutt i 1 time, oppsamling av etaholen i en felle og øking av blande-hastigheten til omkring 135 rpm. Det endelige volumet ble justert til 400 ml med karbonatbuffer (0,4 mg/ml NaHCOs, 0,1 mg/ml dinatrium EDTA, i 0,9$ saltvannsoppløsning. De resulterende IF-liposomene ble vasket deretter ble liposomene skilt fra ikke-innekapslet iotrolan ved difiltrering gjennom en 0,2 pm mikrogen filtreringsinnretning. Syv vasker i 100 ml ble benyttet ved fjerning av 300 ml til sist som et konsen-trerende trinn. Dette vasketrinnet fortsatte i 25 minutter.

Analyser av de resulterende iotrolan/DSPC-liposomene ga de følgende resultatene vist i tabell 5 nedenfor.

EKSEMPEL 12

Innekapslingseffektivitet til DPPC - IF-vesikler

som en funksjon av etanolkonsentrasjon

DPPC (pulver) ble blandet med 10 mM tris HC1, 150 mM NaCl som også inneholdt bormengder av<14>C sucrose, ved pE 7,4 til en konsentrasjon av 20 mg/ml DPPC, i et totalvolum på 2 ml. Blandingen ble utført ved en temperatur over fase-transisjonstemperaturen til DPPC, ved 50°C til 53"C og resulterte i MVL. MLV ble sonikert i 1 time ved 50 til 53° C og avkjølt til romtemperatur og resulterte 1 SUV med diameter omkring 30 til 50 nM. Til de 2,0 ml SUV ble det tilsatt nok etanol (100#) for å gi en 3,0 M etanolkonsentrasjon (0,43 ml etanol; 20 vekt-# etanol): blandingen ble virvlet til homogeniblanldingen ble virvlet til homogenitet. Suspensjonen ble satt tildekket og uforstyrret i 1 time ved romtemperatur ble så inkubert ved en temperatur over transisjonstemperaturen til DPPC, det vil si ved 50° C til 55° C, ble korkene løsnet. Under fortsatt inkubering over lipidets Tm, en forsiktig strøm Ng boblet gjennom blandingen i 3 minutter. En prøve (100 ul) ble fjernet for en<14>C sucrose innekapsl ingsundersøkel se og en 4 ul og en 8 pl prøve ble også fjernet for bestemmelse av Pi ifølge Barletts fosforanalyse ifølge Chen et al. 10 ml tris/NaCl buffer ble tilsatt de resulterende liposomene og blandingen ble sentrifugert ved 9000 g i 15 minutter, supernatanten dekantert og pelleten resuspendert i tris/NaCl-buffer og sentrifugert ytterligere 2 ganger for totalt 3 vasker. Pelleten ble til slutt resuspendert i 2,0 ml buffer. En 200 pl ble fjernet for inn-kapsl ingsundersøkel sen, så vek som 4,0 pl og 8,0 pl prøver for Pi analysen.

Fremgangsmåten over ble gjentatt med totale etanolkonsentrasjoner på 1,0, 2,0, 2,5, 3,5 og 4,0 M i opp-løsningen .

Det interne volum av IF-liposomene er uttrykt som pl pr pm av fosfor Pl og ble målt ved<14>C sucrose innekapsling og CAT 1 EPR-fremgangsmåtene.

<14>C innekapslingen ble utført som føler:

etter Ng gjennomboblingstrinnet ble 100 pl prøven dom ble fjernet for<14>C sucrose innekapslingsanalyse, talt i et Beckman modell Ls 6800 scintillasjonsteller. Tilsvarende etter sentrifugeringstrinnet ble 200 pl prøven som ble fjernet, sentrifugert ved 3000 g på en bordsentrifuge og både pelleten og supernatanten ble talt 1 scintillasjonstelleren. I tillegg ble Pi bestemt som før.<14>C sucrose innekapslingen ble derved bestemt og resultatene er vist grafisk i figur 4A.

CAT 1 EPR studien ble utført som i eksempel 13 nedenfor.

Som vist i figur 4B øket det interne volumet til DPPC IF-liposomene som en funksjon av øket etanolkonsentrasjon, samsvar med høyere innekapslingseffektivitet til liposomene ved høyere etanolkonsentrasjoner. Prosentdelen av gjenvunnet DPPC etter 3 sentrifugeringsvasker er vist i figur 4C.

EKSEMPEL 13

Innekapslingseffektivitet til DSPC, DHPC, DOPC og

EPC IF-vesikler målt ved sucrose og EPR-metoder

Fremgangsmåtene for eksempel 12 hie gjentatt ved bruk av lipidene DSPC, DHPC, DOPC og EPC, ved bruk av en endelig konsentrasjon av 3,0 M etanol. Lavtemperaturinkuberingene etter etanoltllsetning ble gjort ved 50"C for DOPC og EPC. Høytemperaturinkuberingene ble gjort ved 70" C for alle prøver.

Inkubering av DSPC fant sted ved 70° C DHPC ved 50° C og DOPC og EPC ved 5°C.

DOPC og EPC-prøvene ble ikke vasket ved sentrifugering, men filtrert gjennom Amicon 30K mikrokonsentrasjonsinnretning (Grace Co.) filtere. 100 ul prøver ble fjernet fra filtratet og fra prøven før og etter filtreringen for innekapslings-effektivitetsanalyse.

Innekapslingseffektiviteten ble beregnet ved sucrose Innekapsling, CAT 1 EPR og TEMPONE EPR metodene, metoder som er gjengitt nedenfor.

Som vist i figur 5, produserer de tre fosfatidylcholinene som er kjent og interdigitasere (DPPC, DSPC og DHPC), alle IF-llposmer med høyt internt volum. EPC og DOPC er det relativt lave interne volum, var relativt små og kunne ikke bli pellertert ved hjelp av bordsentrifuge (9000 g). Det var derfor ikke mulig å måle det interne volumet til disse liposomene ved hjelp av CAT 1 EPR-metoden.

CAT 1 EPR-METODE FOR BESTEMMELSE AV INNKAPSLING

Denne fremgangsmåten er alternativt kjent som den eksterne oppløsningsmiddelvolummetoden, beskrevet av Perkins et al., 1988, Biochem. Biophys. Acta, 943:103-107. Det interne volumet til liposomer ble bestemt ved å trekke fra det eksterne oppløsningsmiddelvolumet, beregnet ved måling av konsentrasjonen av et membran med spinnsonde fra det toale volumet av liposomsuspensjonen. Det eksterne oppløsnings-middelvolumet ble beregnet ved tilsetning av en kjent mengde av en spinnsponde 4-trimetylammonium-2,2,6,6-tetrametyl-piperidin-l-oksyliodid ("CAT 1") til en liposomsuspensjon. Liposomsuspensjonen ble sentrifugert for å pelletere liposomene. Konsentrasjonen av CAT 1 i oppløsningsmiddelet ble bestemt ved sammenligning av styrken av CAT 1 EPR signal fra supernatanten til et EPR-slgnal mot CAT 1 konsentrasjon kalibrerlngskurven. CAT 1 konsentrasjonen i supernatanten var høyere enn hva som ville være ventet basert på mengden CAT 1 tilsatt, fordi volumet som var tilgjengelig for spinnsonden var redusert etter som sonden var eksludert fra det indre volumet til liposomene. Korreksjonen ble også gjort for prøvevolumet på grunn av selve lipidene.

Prosedyre: En lageroppløsning inneholdende 10 mM CAT 1, 10 mM tris HC1 (pH 7,4), 150 mM NaCl ble anvendt for kalibrerings-bufferoppløsningene inneholdende 100, 200, 300 og 400 pm CAT 1. EPR-spekteret for hver lageroppløsning ble målt med et Brucker ER 100D spektrometer. Topp til topp høyden på Mj=+1 resonanslinje til hvert spektrum målt for hver konsentrasjon og en topphøyde mot CAT1 konsentrasjonskurve ble tegnet.

CAT 1 lageroppløsning (0,20 um) ble tilsatt til 1,00 ml av liposomsuspensjonen (V-t) blandet ved virvling. Liposomene ble pelletert ved sentrifugering på en borsentrifuge ved 9000 g og små andeler av supernatanten "ble trukket inn i et EPR kaplllærrør og forseglet. Opptil topphøyden av M^=l reso-nanslinjen ble målt, oppløsningsmiddelkonsentrasjonen av CAT 1 ble bestemt fra styrken av prøve EPR signalet og kali-breringskurven.

Det eksterne oppløsningsmiddelvolumet ble funnet ved kallbreringskurven. Det eksterne, oppløsningsmiddelvolumet Vo er lik M/C hvor M er mol tilsatt CAT 1 og C er CAT 1 konsentrasjonen i supernatanten. VI er volumet opptatt av lipidet, uttrykt som Vi=l,00-Vt-Vl, hvor VI er volumet av lipidet. Det interne volumet, Vi, delt på fosfatinnholdet i prøven gir det interne volumet pr. um Pi som er standardmåten for å uttrykke det interne volumet av liposomer.

TEMPONE EPR-METODE FOR BESTEMMELSE AV INNEKAPSLING

Denne metoden er alternativt kjent som den utvidende reagensmetode, beskrevet av Anzai et al., Biochim. Biophys. Acta 1988, 937:73-80. Det interne volumet av liposomer blir bestemt ved måling av mengden av membran gjennomtrengelig EPR-spinnsponde utvidende middel. Normalt har hurtig tumlende vandig EPR-spinnsonde relativt smale spektrallinjeformer, tilsetning av paramagnetiske ioner avtar riktignok spinn-spinn relaksjonstiden (Tg). Hvis det utvidende middelet har høy nok konsentrasjon kan det gjøre spektrallinjens form drastisk mye bredere og drastisk senke topp til topp høyden av EPR-signaler. I effekt blir sondesignalet eliminert hvis det EPR-utvidende middelet har tilgang til spinnsonden.

Målingen ble utført ved tilsetning av den membran-gjennomtrengelige EPR spinnsonden 4-okso-2,3,6,6-tetrametyl-piperidin-l-oksyl ("TEMPONE") til liposomsuspensjoner. De to 200pl prøvene ble fjernet fra hver liposomsuspensj on. En av de to prøvene ble fortynnet med 200 pl buffer mens den andre ble fortynnet med 200 pl buffer pluss det membranugjennom-trengelige utvidende middelet kaliumtris(oksalato)-kromat(III). EPR-slgnalet fra prøven fortynnet med bufferen er proporsjonal med det toale prøvevolumet, mens EPR-signalet fra prøven fortynnet med kaliumtris(oksalat)kromat(III) er proprosjonal med prøvevolumet på innsiden av liposomene.

Prosedyre: En lageroppløsning på 50 mM TEMPONE, lOmM tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl lageroppløsning ble fremstilt. TEMPONE lageroppløsning (10 ul) ble tilsatt til en 0,5 ml suspensjon av liposomer og blandet ved virvling. En 200 pl prøve ble tatt fra hver prøve og fortynnet med 200 pl buffer. En annen 2 pl prøve ble tatt og fortynnet med en 100 mM kaliumtris-(oksalato)kromat (III), 50 mM NaCl-oppløsning. Den osmotiske styrken til bufferen og kromatoppløsningen ble på forhånd sjekket med damptrykket for å sikre at de var like innenfor grenser på 1 til 2%. Prøvene ble blandet evd virvling.

EPR-spekteret ble målt ved en Bruker ER 100D spektrometer. Prøver ble trukket inn i EPR-kapillærrør og forseglet. EPR-spekteret til bufferprøven ble målt først, kromatprøven ble så fremstilt og EPR-spekteret til denne prøven ble så øyeblikkelig målt. Topp til topp høyden av M^=-l resonans-1 injen ble anvendt for å måle de relative konsentrasjonene av den ikke-påvirkede spinnsonden i begge prøvene. Det totale prøvevolumet var proporsjonalt til EPR-signalstørrelsen til bufferfortynnede prøver dividert med spesktrometerforsterker innstillingen (ST), mens det interne volumet til liposomene var proporsjonale med EPR-signalet til prøven fortynnet med kromatoppløsningen dividert med forsterkerinnstillingen (SI). Det interne prøvevolumet (VI) var gitt ved SI/ST ganger prøvevolumet V. Det interne volumet, Vi, til prøven ble dividert med fosfatinnholdet til prøven for å gi det interne volumet pr. pm Pi som er standardmåten for å uttrykket det interne volumet av liposomer.

EKSEMPEL 14

Innekapslingseffektivitet til DPPC LTJVET - IF vesikler som en funksjon av opprinnelig liposomstørrelse

DPPC (422 mg pulver) ble hydrert med 21 ml tris/NaCl med spåmengder av ^<4>C sucrose ifølge fremgangsmåten fra eksempel 12, til en total konsentrasjon av DPPC på 20 mg/ml. Blanding ved virvling av prøven ved 50 til 55°C resulterte i DPPC MLV. FAT MLV ble fremstilt ifølge fremgangsmåten til Cullis et al., US-PS 4.975.282, med totalt 10 fryse og tine sykluser. De resulterende DPPC FATMLV ble ekstrudert 10 ganger ved hjelp av LUVET apparatet ved 60°C til 65"C ifølge fremgangsmåten til Cullis et al., PCT-søknad PCT/US85/01161, publikasjonsnummer WO 86/00238, og ved bruk av et enkelt 1,0 pm nuklepor polykarbonatfilter. To milliliter av LUVET be-arbeidede liposomene ble satt til side.

Fremgangsmåten over blir gjentatt ved bruk av 0,4, 0,2 og 0,1 um polykarbonatfiltere inntil 2,0 ml LUVET-prøver med de følgende diametere var produsert: 0,1, 0,2, 0,4 og l,0jjm.

Når FAT MLV ble benyttet for bruk i dette eksempelet, ble de benyttet som de var uten ekstrudering. SUV ble fremstilt ifølge fremgangsmåten fra eksempel 12 ved sonikering av de gjenværende fra 0,1 um filtrerte LUVET.

Interne volumer til disse liposomene ble beregnet ved ^<4>C sucrose innekapsling så vel som CAT 1 EPR og TEMPONE EPR metode som beskrevet over.

Som vist i figur 6 øket det interne volum for IF-liposomene, bortsett fra for FAT MVL, med avtagende størrelse av "start" liposomene, det vil si liposomene før tilsetningen av etanol; disse resultatene indikerer at diamenteren til start-liposomene var en viktig parameter i bestemmelsen av det endelig volumet for IF-llposomene.

EKSEMPEL 15

Innelmmming av DPPG i DPPC IF-liposomer

IF-liposomer ble fremstilt fra DPPC/dipalmitoylfosfatidyl-glycerol (DPPG) SUV ifølge fremgangsmåten fra eksempel 12 med de følgende modifikasjoner. Totalt 30mM fosfolipid (DPPC og DPPG) ble benyttet, 0,17 molfraksjon (17 mol-*) DPPG, DPPC og DPPG hver i kloroform ble tilsatt en rundbundet flaske (50 ml kapasitet) og blandet godt. Lipidene ble tørket til tørr film i flasken ved negativt trykk (rotasjonsfordamping) og den resulterende filmen ble hydrert med 2,0 ml tris/NaCl-buffer og oppvarmet til en temperatur på 50 til 55° C. En total konsentrasjon på 3,0 M etanol ble benyttet. En spormengde av<14>C sucrose ble tilsatt prøven og suspensjonen ble sonikert til klarhet. Etter fjerning av etanolen og Inkubering av blandingen med 50 til 55"C ble IF-liposomer dannet.

Det interne volumet til liposomene ble beregnet ved<*4>C sucrose innekapsling og TEMPONE EPR metode ifølge fremgangsmåtene fra eksempel 13.

Fremgangsmåtene over ble gjentatt med 1,0, 0,83, 0,66, 0,50 og 0,00 molfraksjon (100, 83, 66, 50 og 0 mol-*) DPPG. Resultatene er grafisk vist i figur 7A og B.

Ved høyere DPPG-fraksjoner, ble IF-liposomer gjenvunnet kun i små prosentdeler etter som liposomene ikke pelleterte bra under vasketrinnet, et problem som er typisk for negativt ladede liposomer. De interne volumene til IF-liposomene som ble gjenvunnet i pelleten, er vist i figur 7A. De åpne siktene er volumene målt ved<*4>C Innekapsling, mens de fylte sirklene er volumene målt ved den utvidende middel (TEMPONE) EPR teknikken. Figur 7B viser prosenten gjenvunnet av Pi (fylte sirkler) og 14C sukrose (åpne sirkler) som en funksjon av DPPG.

EKSEMPEL 16

Fanget volum og innekapsling som funksjon av opprinnelig DPPC-konsentrasjon

Materialer og fremgangsmåter fra eksempel 12 ble fulgt for å danne 2,0 ml DPPC IF-liposomer ved 20 mg/ml.

Fremgangsmåten over ble gjentatt ved bruk av 2,0, 10,0, 20,0, 80,0 og 160 mg DPPC som resulterte i 4 prøevr på 2,00 ml av DPPC IF-liposomer med de følgende DPPC konsentrasjoner: 2,5, 5,0, 10,0, 40,0 og 80,0 mg/ml DPPC.

<14>C sucrose innekapslingsprosent og interne volumer av hver av prøvene ble beregnet ifølge fremgangsmåten fra eksempel 13.

Resultatene er vist grafisk i figur 8A og B. Figur 8A viser at innekapsl ingen av sucrose øker med den initielle DPPC lipidkonsentrasjonen. Figur 8B viser det interne volumet av DPPC IF-liposomene målt ved både<14>C sucrosemetoden (åpne sirkler) eller EPR metoden (fylte sirkler). Interne volum av IF-liposomene var omkring 15 til 20 pl/pm Pi når den opprinnelige konsentrasjonen av DPPC var 1 til 20 mg/ml. Målinger gjort ved Malvern partikkelsorterer indikerte at den gjennomsnittlige diameteren av disse liposomene (Inneholdende 10 mg/ml og 20 mg/ml lipid) var omkring 7,0 til 7,5 pm (se figur 9A og B). Dette demonstrerer at det interne volumet av DPPC-liposomer dannet ved IF-metoden var mye større enn konvensjonelle MVL.

EKSEMPEL 17

Effekt på kolesterol på dannelsen av DPPC

IF-liposomer

Materialene og fremgangsmåtene fra eksempel 12 ble fulgt for å fremstille IF-liposmer ved bruk av DPPC og kolesterol, ved totalt 30mM lipid, ved bruk av en total konsentrasjon på 3,0 M etanol. Kolesterolet og DPPC, fremskaffet 1 stamkloroform oppløsninger ved konsentrasjoner på 20 mg/ml, ble blandet i en 50 ml grunnbundet flaske med 95* DPPC og 5* kolesterol. Lipidene ble tørket til en tynn film på overflaten av flasken og hydrert med tris/NaCl som tidligere. Inkuberingstemperaturen var 50°C-55°C.

Prøver ble tatt for å analysere på kolesterol før og etter IF-prosessen for å sikre at liposomene inneholdt kolesterol og for å analysere innekapslingen av<14>C sucrose.

Fremgangsmåten over ble gjentatt ved bruk av 0,00, 0,02, 0,10, 0,15 og 0,30 molfraksjon (0, 2,0, 10, 15 og 30 molprosent) kolesterol.

De interne volumene av liposomene ble målt ved<14>C sucrose innekapsling foruten CAT 1 EPR og TEMPONE EPR metodene. Kolesterolinnholdet av IF-liposomene ble målt ved hjelp av oftalaldehyd ifølge fremgangsmåten fra Rudel og Morris, 1973, J. Lipid Res. , 14:14.

Resultatene er grafisk vist i figur 10A og B. Figur 10A viser den "endelige" kolesterolkonsentrasjonen til IF-liposomene (åpne sirkler) og den endelige prosenten av<14>C sucrose innekapslet (åpne kvadrater). Etter som kolesterolinnholdet ble øket, avtok mengden innekapslet sucrose.

Figur 10B viser vinkingen i indre volum av DPPC-kolesterol-liposomer som funksjon av kolesterolinnhold. Mens dataene for Cat 1 EPR og TEMPONE EPR-metodene (åpne trekanter og fylte sirkler) er nært samsvarende, viser dataene fra<14>C sucrose analysen betraktelig høyere interne volum. Uten å være bundet av teorien, synes det som<14>C sucrose blir "klistret" til liposomene og således gir høyere avlesninger for interne volum.

Disse studiene av figur 10 indikerer at størrelsen til IF-liposomene avtar sterkt med økende kolesterolinnhold, en konklusjon som ble støttet av resultatene fra Malvern partikkelsortereren; IF-liposomer inneholdende 0* kolesterol hadde en gjennomsnittlig diameter på 7,66 p mens 30* kolesterol IF-liposomer hadde 3,99 um.

EKSEMPEL 18

Effekt av dioleylfosfatidylcholin (DOPC)

på dannelsen av DPPC IF-liposomer

Materialene og prosedyrene fra eksempel 12 ble fulgt for å fremstille IF-liposomer ved bruk av DPPC og dioleylfosfatidylcholin ("DOPC"), et umettet lipid i en total konsentrasjon på 30 mM lipid, med en total konsentrasjon på 3,0 M etanol. De opprinnelige liposomene ble dannet av DPPC og DOPC, fremskaffet i lager i kloroformoppløsninger med konsentrasjoner på 20 mg/ml, som ble blandet i en rundbundet flaske, med 0,20 molfraksjon (20 mol-*) DOPC. Lipidene ble tørket til en tørr film på overflaten 1 flasken ved rotasjonsfordamping og hydrert med Tris/NaCl som tidligere. Inkuberingstemperaturen var 50 til 55°C.

Fremgangsmåten over ble gjentatt ved bruk av 0,00, 0,11, 0,55, 0,72 og 1,00 molfraksjon (0, 11, 55, 72 og 100 mol-*) av DOPC.

Det interne volumet av IF-liposomene ble målt ved<*4>C sucroselnnekapslingsmetoden og TEMPONE EPR-metoden og resultatene er vist grafisk i HA.

Som det kan sees fra grafen, avtar størrelsen av IF-liposomene ved øking av mengden DOPC. Selv så lite som 10* DOPC synes å redusere liposomvolumet med over 50*. Over 0,4 molfraksjoner (40 mol-*) DOPC førte til at etanol-lipidgelen ikke ble dannet og SUV syntes ikke å smelte sammen. Det interne volumet av liposomene ved 0,6 og 0,8 molfraksjoner DOPC var 0,2 og 0,24 pl/pm Pi som er i SUV området. I tillegg avtok prosenten av lipider som kunne gjenvinnes ved sentr!-fugering i forhold til 0,4 molfraksjon DOPC (se figur HB).

EKSEMPEL 19

Innkapsling av radiokontrastmiddel ioversol

i DSPC IF-liposomer

DSPC (200 mg, lyofillsert pulver) hie suspendert i 5,0 ml destillert vann og sonikert til en gjennomsiktig SUV . suspensjon (sonlkeringstld var omkring 20 minutter). SUV suspensjonen ble sentrifugert i 10 minutter ved 10000 g for å pelletere tltanresten; SUV ble dekantert fra titanium-pelleten. Ioversol (Optiray 320R, Mallinckrodt) (11,5 mg), 4,1 ml etanol og 1,7 ml destillert vann ble blandet og 3,3 ml deler av denne blandingen ble pipettert i tre 15 ml Corex<R->rør. Prøver (1,1 ml) av SUV-suspensjonen ble tilsatt hvert rør. Rørene ble brukket og virvlet kraftig og ga en gjennomsiktig gel.

Rørene ble satt i romtemperatur i 1 time, så ble korkene tatt av og rørene ble inkubert ved 70°C i et bad i en time i gjentatt blanding ved virvling. Etter inkubering ble rørene gjennomboblet med en rolig strøm av Ng gjennom blandingen i 8 minutter. Etter avkjøling av innholdet til romtemperatur ble buffer (30 mM tris, 150 mM NaCl, 0,6 mM Na2EDTA, pH 6,7) tilsatt hvert rør og blandet ved vending av røret. Den ikke-fangede ioversolen ble fjernet ved sentrifugeringsvasker (3 minutter ved 5000 g) som ble gjentatt tre ganger.

Den resulterende ioversol innekapslet i IF-liposomene ble analysert spektrofotometrisk ved absorbsjon ved 245 nm og regressjon mot en standardkurve av ioversol i etanol. Lipidkonsentrasjonen ble bestemt ved fremgangsmåten til Chen et al. Oppfangingsresultåtene er vist nedenfor I tabell 6. IF-liposomene hadde en gjennomsnittelig diameter på 4,0-5,0 pm bestemt med Malvern partikkelstørrelsesanalyse.

EKSEMPEL 20

Innkapsling av radiokontrastmiddel ioksoglat

i DSPC IF-liposomer

Materialene og prosedyrene fra eksempel 19 ble fulgt for å innekapsle radiokontrastmiddelet ioksoglat (Hexabrix<R>, Mallinckrodt) i IF-liposomer. Innekapslingen ble målt Ifølge fremgangsmåtene fra eksempel 19 og resultatene er vist i tabell 7 nedenfor.

EKSEMPEL 21

Innekapsling av radiokontrastmiddel iopamidol

i DSPC IF-liposomer

Materialene og fremgangsmåtene ifølge eksempel 19 ble fulgt for å innekapsle radiokontrastmiddelet iopamidol (isovue<R>, Bristol-Myers Squibb) i IF-liposomer. Innekapslingen ble analysert ifølge fremgangsmåtene fra eksempel 19 og resultatene er vist i tabell 8 nedenfor.

EKSEMPEL 22

Effekt på inkuberingstid på interne volum til IF-llposomer

Materialene og fremgangsmåtene fra eksempel 12 ble benyttet, bruk av 20 mg/ml DPPC og hvor etanolkonsentrasjonen var 3,0 M, hvor inkubasjonstiden til gelen ved en temperatur over og under Tm ble variert. Inkubasjonstiden ble satt til 5 minutter og det interne volumet av de resulterende IF-liposomene ble målt ved<*4>C sucrose innkapslingsmetode (søyle med diagonale linjer nedover) både CAT 1 EPR (prikket søyle) og TEMPONE EPR metoden (søyle diagonal er oppover). Resultatene av målingene er vist i histogrammet på figur 12.

Fremgangsmåten over ble gjentatt hvor inkubasjonstidene var 30 minutter, en tim og to timer. Tilsvarende intern-volum-målinger ble gjort og sammenlignet.

Som vist i figur 12 synes det ikke å være noen signifikant forskjell 1 IF-liposomenes interne volumer som en funksjon av inkuberingstiden mellom 5 minutter og 2 timer.

EKSEMPEL 23

Effekt på forandring av inkubasjonsprosedyren på

det interne volumet til IF-liposomer

Materialene og prosedyrene fra eksempel 12 ble gjentatt mens inkubasjonsbetingelsene ble variert, det vil si hvor DPPC SUV ble inkubert ved romtemperatur, uten inkubasjon over DPPC Tm (det vil si ved 50 til 55" C). De interne volumene til de resulterende IF-liposomene ble bestemt ved<*4>C sucrose innekapslingsmetode (søyle med diagonaler nedover) så vel som både CAT 1 EPR (prikkede søyler) og TEMPONE EPR metodene

(søyler med diagonaler oppover) og resultatene er vist i histogrammet som "RT" på figur 12.

Prosedyren over ble gjentatt uten romtemperatur inkubering, hvor etanolen ble tilsatt og inkuberingen ble utført ved en temperatur over DPPC Tm (50 til 55°C). Siden liposomene som resulterte fra denne inkuberingsfremgangsmåten ikke pelleterte, ble liposomene vasket ved fortynning av DPPC prøven 6 ganger med 10 ml tris/NaCl buffer, fjerning av 4,0 ml prøve og konsentrering av denne prøven med en Amicon 30K mikro-konsentrator (Grace Co.) som ble spunnet i en time ved 30000 g i en Beckman J-2 sentrifuge i stedet for sentrifugerings-vasking. Prøvevolumet som ble holdt tilbake ble konsentrert igjen ved hjelp av den samme fremgangsmåten. Resultatene fra denne prøven er merket "50°C" på figur 12.

Med referanse til figur 12 er det tydelig at begge inku-berlngsperiodene er nødvendige for dannelsen av store IF-liposomer .

EKSEMPEL 24

Sammenligning av internt volum til IF-liposomer

i forhold til MLV

I

DPPC (80 mg, pulverisert form) (Avantl Polar Lipids) ble tilsatt til 2,00 ml tris/NaCl buffer ifølge fremgangsmåtene fra eksempel 12. DPPC suspensjonen ble sonikert til klarhet som beskrevet i eksempel 12. En endelig konsentrasjon av 3,0 M etanol (tilsetning av 0,43 ml etanol) ble benyttet for dannelsen av IF-liposomer. Prøven ble inkubert og vasket ved sentrIfugering som I eksempel 12 og det interne volum ble bestemt to ganger ved CAT 1 EPR metodene beskrevet 1 eksempel 13 og resultatene er vist i tabell 9 nedenfor.

II

Fremgangsmåtene fra del I over ble gjentatt ved bruk av 80 mg DPPC i 2,00 ml tris/NaCl bufefr, ved avling ved 50 til 55"C for å fremstille MLV. Disse ble riktignok ikke sonikert og intet etanol ble tilsatt.

De identiske fremgangsmåtene ble gjentatt ved anvendelse av 40 mg DPPC. Prøven ble inkubert og vasket ved sentrifugering som i eksempel 12 og det interne volumet ble bestemt to ganger ved CAT 1 EPR metoden beskrevet i eksempel 13 og resultatene er vist i tabell 9 nedenfor.

III

Fremgangsmåten fra del II ble gjentatt hvor 0,43 ml etanol til den endelige konsentrasjon av 3,0 M etanol i den endelige oppløsning ble tilsatt. Prøven ble inkubert og vasket ved sentrifugering som i eksempel 12 og det interne volum ble bestemt to ganger med CAT 1 EPR metoden beskrevet i eksempel 13 og resultatene er fremstilt i tabell 9 nedenfor.

Tabell 9 viser det relativt store interne volumet av IF-llposomer sammenlignet med konvensjonelle MLV eller MLV utsatt for relativt høye etanolkonsentrasjoner.

EKSEMPEL 25

Iotrolan-DSPC IF-liposomer

Materialene og prosedyrene fra eksempel 7 ble fulgt ved fremstilling av en IF-liposom populasjon inneholdende iotrolan.

EKSEMPEL 26

Innekapsling av radiokontrastmiddel iopromid

i DSPC IF-liposomer

Materialene og fremgangsmåtene fra eksempel 21 ble fulgt for fremstilling av IF-liposomer inneholdende iopromid.

Denne oppfinnelsen har blitt beskrevet evd bruk av spesifikke utførelser beskrevet i detalj her, men det må forstås at disse er ment som illustrasjoner og at oppfinnelsen ikke nødvendigvis er begrenset til disse. Modifikasjoner og variasjoner vil være tydelige fra beskrivelsen og kan bli utført uten å forlate ånden til oppfinnelsen. Følgelig er slike variasjoner og modifikasjoner ansett å være innenfor ånden av rammen av oppfinnelsen og de følgende krav.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av interdigitasjons-fusjonsliposomer omfattende et bioaktivt middel,karakterisert vedat den omfatter trinnene: a) Forming av en interdigitasjons-fusjonsgel ved inkubering av dimensjonerte liposomer omfattende et mettet fosfolipid i nærvær av: (I) Det bioaktive midlet; (II) en mengde av en induser som er effektiv til å smelte sammen nevnte liposomer og interdigistere nevnte fosfolipid, hvor inkuberingen er gjort i en tid som er tilstrekkelig til å danne en interdigitasjons-fusjonsgel omfattende det bioaktive midlet fra de dimensjonerte liposomene; b) inkubering av interdigitasjons-fusjonsgelen ved en temperatur som er høyere enn transisjonstemperaturen til fosfollpidet I gelen for således å fremstille interdigitasjons-fusjonsliposomer omfattende det bioaktive midlet fra gelen, hvori de dimensjonerte liposomene har en gjennomsnittlig diameter på mindre enn 0,4 pm, og hvor liposomet omfatter det bioaktive midlet ved et vektforhold mellom bioaktivt middel og lipid som er større enn 2:1 (g/g).

2. Fremgangsmåte for fremstilling av et interdigitasjons-fusjonsllposom omfattende et bioaktivt middel,karakterisert vedat den omfatter trinnene: a) forming av en interdigitasjons-fusjonsgel ved inkubering av dimensjonerte liposomer omfattende et mettet fosfolipid i nærvær av en mengde av en induser som er effektiv til å smelte sammen nevnte liposomer og interdigitere nevnte fosfolipid, i en tid som er tilstrekkelig for å danne en interdigitasjons-fusjonsgel fra de dimensjonerte liposomene ; b) kombinering av et bioaktivt middel med interdigitasjons-fusjonsgelen; c) inkubering av interdigitasjons-fusjonsgel/bioaktivmid-delkombinasjonen ved en temperatur som er høyere enn transisjonstemperaturen til fosfolipidet i gelen for således å fremstille interdigitasjons-fusjonsliposomer inneholdende det bioaktive midlet fra gelen, hvori de dimensjonerte liposomene har en gjennomsnittsdiameter på mindre enn 0,4 pm, og hvor liposomet omfatter det bioaktive midlet ved et vektforhold mellom bioaktivt middel og lipid som er større enn 2:1 (g/g).

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat de dimensjonerte liposomene har en gjennomsnittsdiameter på mindre enn 0,05 pm.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisertved at de dimensjonerte liposomene har en gjennomsnittsdiameter som er mindre enn 0,025 pm.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat det mettede fosfolipidet er et symmetrisk mettet fosfolipid valgt fra gruppen omfattende dimyristoylfosfatidylcholin, distearoylfosfatidylcholin, dipalmitoylfosfatidylcholin, dimyristoylfosfatidylserin, dipalmitoylfosfatidylserln, distearoylfosfatidylserin, dimyristoylfosfatidyletanolamin, dipalmitoylfosfatidyletanol-amin, distearoylfosfatidyletanolamin, dimyristoylfosfatsyre, distearoylfosfatsyre, dipalmitoylfosfatsyre, dimyristoylfos-fatidylinositol, distearoylfosfatidylinositol, dipalmitoyl-fosfatidylinositol, hydrogenert soyafosfatidylcholin, dipalmitoylfosfatidylglyserol, di-0-heksadesylfosfatidyl-cholin, distearoylfosfatidylglyserol og dimyristoylfos-fatidylglyserol.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat liposomene omfatter et ytterligere lipid valgt fra gruppen omfattende mettede fosfolipider, umettede fosfolipider, glykolipider, glykospingolipider, steroler og alfa-tocoferoler.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat Induseren er valgt fra gruppen omfattende kortkjedede alkoholer, polyoler, anestetika, buffere og kaotropsalter.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7,karakterisertved at induseren er en kortkjedet alkohol valgt fra gruppen omfattende metanol, etanol, propanol og n-butanol.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisertved at induseren er etanol.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisertved at den effektive mengden etanol er en mengde lik 5 vekt-* av liposomene til 20 vekt-* av liposomene.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisertved at den effektive mengden etanol er en mengde lik 7 • vekt-* av liposomene.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat induseren er hydrostatisk trykk.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat inkuberingen av de dimensjonerte liposomene er for en tidsperiode på minst 1 minutt.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisertved at inkubasjonen skjer i en tid fra 1 minutt til 1 time.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat det bioaktive midlet er valgt fra gruppen omfattende iodinerte radiokontrastmidler, NMR-konstrastmidler, antimikrobielle midler og peptider.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15,karakterisertved at de bioaktive midlet er et jodinert radiokontrastmiddel valgt fra gruppen omfattende ioheksol, iopamidol, ioksaglat, iotrolan, ioversol, iotalamat, iodipamid, iopromid, metrizamid, iopentol, iodiksanol og diatrizoat.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat den ytterligere omfatter kombinering av interdigitasjons-fusjonsllposomet med en farmasøytisk akseptabel bærer for å gi en farmasøytisk sammensetning.