FI82253B - Foerfarande foer framstaellning av farmakologiskt vaerdefulla tigogencellubiocider. - Google Patents

Description

, 82253

Menetelmä valmistaa farmakologisesti arvokkaita tigogeeni-se11ubiosideja - Förfarande för framstä11 ning av farma-kologiskt värdefulla tigogence11ubiocider Tämän keksinnön kohteena on menetelmä valmistaa farmakologisesti arvokkaita tigogeenise 11ubiosideja, joiden kaava (A) on

H

J---CH-j cm p y/

\ J ^----J

CH3 1 J

/r /r rT <*> jossa R on vety tai -C(0)CH3, sen a- ja Q-anomeerien seoksena tai erillisenä α-anomeerina tai ö-anomeerina.

Ranskalaisessa patentissa 2,425,859 ja US-patentissa 4,260,603 on kuvattu tiettyjä steroliglykosideja ja spiroketaalisteroidi-glukosideja, jotka inhiboivat prostag 1 andiinisyntetaasia.

Tigogfeniini-a-L-rampyranosidin ja tigogenyy1i-B-maltosidin emolyyttisiä ominaisuuksia on kuvattu julkaisussa: J. Pharm. Sei.. 67(11):1589 (1978).

Neotigogeniini-diglykosidi1 la on ilmoitettu olevan hypokoles-tereeminen aktiivisuus, Kr im.Farm.Zh.. 15(9):55-60 ( 1981 ).

2 82253

Kaavan (A) aaltoviiva tarkoittaa, että steroidi on kiinnittynyt sellubiosidiosaan joko sen kuusijäsenisen renkaan, johon steroidi on kiinnittynyt, tasoon yläpuolella tai alapuolella.

"α-anomeeri" tarkoittaa yhdistettä, jossa steroidi on kiinnittynyt kuusijäsenisen renkaan tason alapuolella.

"β-anomeeri" tarkoittaa yhdistettä, jossa steroidi on kiinnittynyt kuusijäsenisen renkaan tason yläpuolella.

Parhaana pidettyjä yhdisteitä ovat ne, joissa R on vety, so.: a-tigogeniini-sellubiosidi; β-tigogeniini-sellubiosidi; tai a- ja β-tigogeniini-sellubiosidin seos.

Valmistusmenetelmät

Reaktiokaaviossa 1 on havainnollistettu tigogeniini-sellu-biosidin (A) valmistaminen. Kaavassa (A) ja seuraavassa tekstissä nimitys "tigogeniini-sellubiosidi" sisältää tigogeniini-sellubiosidin a- ja β-anomeerin seoksen, erillisen α-anomeerin ja erillisen β-anomeerin.

Reaktiokaaviossa I on X kaavan (I) mukaisessa yhdisteessä OR tai Br, R kaavassa (III) -C(0)CH3 ja R kaavassa (A) vety.

82253 REAKTIOKAAVIO 1 ch2or ch2or

JfH? OR OR u (I) p__CH3 \ 9HJ .C---7 γ ,^ν1

Vaihe 1 ^>·\ _! tm ή Η J---CH,

OR OR _I

|/R|\ U-\ „ J (III)

Ro1 or Hr h ^Y~CH3

Vaihe 2 CH p-</ '' cJ—f* /

/°R /°R

; <^0Xw~~0

R0 OR OR

(A) * 82253

Reaktiokaavio 1 havainnollistaa erillisen α-anomeerin, erillisen β-anomeerin tai kummankin erottamattoman seoksen valmistusmenetelmiä. Lähtöyhdisteitä ovat sellubioosi-okta-asetaatti (I, jossa X on -0C(0)CH3) tai bromisellubioosi-hepta-asetaatti (l, jossa on X on Br) ja tigogeniini (II). Kaikki kolme menetelmää, joissa X on -0C(0)CH3, kulkevat tigogeniini-sellubiosidi-hepta-asetaatti-välituotteen (III) kautta ja päätyvät samaan lopputuotteeseen (A).

Käyttämällä eri lähtöaineita ja reaktio-olosuhteita saadaan erilliset a- ja B-anomeerit (menetelmät 1 ja 2) tai kummankin seos (menetelmä 3).

Menetelmä 1 Käyttämällä eri liuottimia saadaan a- tai B-anomeeri. Tetrahedron Letters. 28:1379 (1984) artikkelissa on kuvattu tällainen liuotin, joka indusoi stereokemiallisen modifikaation. Tässä tapauksessa käyttämällä asetonitriiliä saadaan a-anomeeri. Kun taas käytetään metyleenikloridia, saadaan B-anomeeri.

Vaihe 1 Vaihe 1 havainnollistaa sellubiosidi-hepta-asetaatin (III) valmistamista.

Lähtöaineena käytettyjä sellubioosi-okta-asetaattia ja tigo-geniinia on kaupallisesti saatavissa Aldrich, Research Plus-yhtiöltä tai muista lähteistä.

Sellubioosi-okta-asetaatti (I, jossa X on -0C(0)CH3) saatetaan reagoimaan tigogeniinin (II) kanssa orgaanisessa liuottimessa, parhaiten asetonitriilissä α-anomeeria valmistettaessa ja metyleenikloridissä B-anomeeria valmistettaessa, jolloin määrät ovat noin 65:200:5000 (Paino:paino:tilavuus). 1-5 minuutin, parhaiten 2 minuutin aikana, lisätään metallikloridia, 5 82253 parhaiten stannikloridia. Reaktioseos lämmitetään lämpötilaan välille 50 - 75°C, parhaiten 65°C:een tai lämpötilaan, jossa seos tulee homogeeniseksi.

Tämä lämpötila pidetään 10 - 60 minuuttia, parhaiten noin 20 minuuttia, minkä jälkeen jäähdytetään 20 - 40°C:een, parhaiten 30'Creen. Sen jälkeen seos puhdistetaan alalla tunnetuilla menetelmillä, jolloin käytetystä liuottimesta riippuen saadaan a- tai β-tigogeniini-sellubiosidi-hepta-asetaattia (III).

Vaihe 2 Vaihe 2 havainnollistaa tigogeniini-sellubiosidin (A) valmistamista hydrolysoimalla yhdiste (III).

Yhdiste (lii) saatetaan reagoimaan veden ja orgaanisten liuottimien, parhaiten metyleenikloridin, trietyyliamiinin ja metanolin seoksessa määrien ollessa noin 4:10:6:12:14 (Paino: tilavuus:tilavuus:tilavuus:tilavuus), lämpötilassa 20 - 80°C, parhaiten refluksointilämpötilassa, noin 2-10 tunnin, parhaiten noin 6 tunnin aikana. Sen jälkeen reaktioseosta sekoitetaan yön yli 15 - 30eC:ssa, parhaiten huoneen lämpötilassa. Saatu aine haihdutetaan, puhdistetaan ja erotetaan alalla tunnetuilla menetelmillä a- tai β-tigogeniini-sellubiosidiksi (A) riippuen siitä, mitä tigogeniini-sellubiosidi-hepta-asetaatin isomeeriä käytettiin vaiheessa 2.

Menetelmä 2 Tämä on vaihtoehtoinen menetelmä erillisten a- ja β-anomeerien valmistamiselle.

Vaihe 1

Bromisellubioosi-hepta-asetaatti (I), jossa X on Br, valmistetaan saattamalla suurin piirtein yhtä suuret moolimäärät sellubioosi-okta-asetaattia ja bromausainetta, kuten titaani 6 82253 tetrabroraidia polaarittomassa orgaanisessa liuottimessa, kuten klooratussa hiilivedyssä, erityisesti 1,2-dikloorietaa-nissa, hieman korotetussa lämpötilassa, joka on yleensä pienempi kuin käytetyn liuottimen kiehumispiste, esimerkiksi 60 -65°C:ssa. Reaktio tapahtuu loppuun alle noin 10 tunnissa, yleensä alle noin 5 tunnisssa. Alalla tunnettuja puhdistus-menetelmiä käyttämällä saadaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa X on Br. Tämä yhdiste saatetaan sen jälkeen reagoimaan suurin piirtein yhtä suuren moolimäärän kanssa tigogeniinia, kun mukana on reaktiota jouduttavaa ainetta, joka on raskasmetalli-suola, kuten elohopea(11)syanidi. Tätä voidaan kutsua Koenigs-Knoor-reaktioksi. Saatu tuote on fl-tigogeniini-sellubiosidi-hepta-asetaatti.

Tigogeniini-sellubiosidi-hepta-asetaatin α-anomeeri valmistetaan saattamalla mooliylimäärä bromisellubioosi-hepta-asetaat-tia reagoimaan tigogeenin kanssa (moolisuhde noin 2:1) di-isopropyyliamiinin ja tetraetyyliammoniumbromidin läsnäollessa sopivassa halogenoidussa hiilivetyliuottimessa, kuten metylee-nikloridissa. Reaktio tapahtuu noin 10 - 40eC, parhaiten noin 20 - 25eC lämpötilassa muutaman tunnin - usean päivän aikana, yleensä noin 2 päivässä tai lyhyemmässä ajassa, a-anomeeri saadaan tämän jälkeen käyttämällä tunnettuja puhdistusmenetelmiä.

Vaihe 2 a- tai β-tigogeniini-sellubiosidi-hepta-asetaatti hydrolysoidaan menetelmän 1 vaiheessa 2 esitetyllä menetelmällä.

Menetelmä 3

Menetelmä 3 havainnollistaa pääosaltaan fl-tigogeniini-sellu-biosidia sisältävän seoksen valmistamista.

7 82253

Vaihe 1 Sekä tigogeniini (I) että sellubioosi-okta-asetaatti (11) liuotetaan orgaaniseen liuottimeen, parhaiten metyleeni-kloridiin, määrien ollessa vastaavasti noin 4:80 (paino/tila-vuus) ja 14:80 (Paino/tilavuus). Sellubioosi-asetaattiin lisätään suurin piirtein sellubioosi-okta-asetaattia vastaava määrä metallisuolaa, parhaiten stannitetrakloridia. Saatu liuos lisätään sen jälkeen tigogeniiniliuokseen ja annetaan reagoida 1-8 tuntia, parhaiten 3 tuntia 15 - 30°C:ssa, parhaiten huoneen lämpötilassa. Seos pestään puskurilla, parhaiten bikarbonaatilla, ja reaktion aikana kehittyvä kaasu poistetaan. Seos puhdistetaan ja erotetaan alalla tunnetuilla menetelmillä, kuten TLC:lla, jolloin saadaan a- ja fl-tigoge-niini-sellubiosidi-hepta-asetaatin (III) seos.

Vaihe 2 Orgaanisten liuottimien ja veden seos, parhaiten trietyyliamiini/metanoli/metyleenikloridi/vesi ja edellä saatu hepta-asetaatin (III) liuos saatetaan reagoimaan koko ajan sekoittaen noin 6-24 tuntia, parhaiten yön yli 15 - 30°C lämpötilassa, parhaiten huoneen lämpötilassa. Liuotin poistetaan ja jäännös puhdistetaan ja erotetaan alalla tunnetuilla tekniikoilla. Puhdistettu seos dialysoidaan muuttuvapintai-sessa dialysaattorissa (kuvattu esimerkissä 3) 1 - 4 päivän aikana, parhaiten 3 päivän aikana. Seos puhdistetaan uudelleen ja uutetaan orgaanisella liuottimena, parhaiten heptaanilla, soxhlet-uuttolaitteessa. Saatu jäännös kuivataan 15 - 30°C:ssa, parhaiten huoneen lämpötilassa 1-4 päivän, parhaiten 3 päivän aikana, jolloin saadaan pääasiallisesti β-tigogeniini-sellubio-sidia.

a- ja β-tigogeniini-sellubiosidin seos saadaan sekoittamalla sopivat määrät erillisiä a- ja β-anomeerejä.

Tässä kuvattujen yhdisteiden ja välituotteiden eristäminen ja puhdistaminen voidaan haluttaessa suorittaa millä tahansa sopivalla erotus- tai puhdistusmenetelmällä, kuten esimerkiksi β 82253 suodattamalla, uuttamalla, kiteyttämällä, pylväskromatograa-fisesti, ohutlevykromatograafisesti tai paksukerroskromato-graafisesti tai näiden menetelmien yhdistelmällä. Sopivista erotus- ja eristysmenetelmistä on esitetty yksittäisiä tapoja seuraavissa esimerkeissä. Kuitenkin voidaan luonnollisesti käyttää muita vastaavia erotus- tai eristysmenetelmiä.

KÄYTTÖTAVAT JA ANTAMISTAVAT

Tämän keksinnön kohteena ovat tietyt glykosidit, jotka ovat kolesterolin absorption tehokkaita inhibiittejä ja jotka sen vuoksi ovat pääasiassa hyödyllisiä hyperkolesterolemian hoidossa. Koska hyperkolesterolemia liittyy läheisesti yleisluonteisten kardiovaskulaaristen, serebraalivaskulaaristen tai periferaali-vaskulaaristen tautien kehittymiseen, nämä yhdisteet estävät myös arterioskleroosin kehittymistä.

Kolesteroli, joka kuuluu kehon pääasiallisiin plasmalipideihin, liukenee erittäin hyvin rasvaan mutta vain hieman veteen. Se kykenee muodostamaan estereitä rasvahapon kanssa. Noin 70 % plasman kolesterolista on kolesteroliestereinä.

Kehossa oleva kolesteroli on alkuperältään joko endogeenista tai eksogeenista. Eksogeenista kolesterolia on ruokavaliossa ja se absorboituu hitaasti ruoansulatuskanavasta suolien imu-nesteeseen. Endogeenista kolesterolia muodostuu melko suuri määrä kehon soluissa. Maksa muodostaa oleellisesti kaiken endogeenisen kolesterolin, jota kiertää plasman lipoproteii-neissa, mutta kehon kaikki muut solut voivat muodostaa kolesterolia ja itse asiassa muodostavatkin ainakin osan siitä.

Pääasialliset plasmalipidit, mukaanlukien kolesteroli, eivät kierrä plasmassa vapaana vaan ovat sidottuina proteiineihin ja siirtyvät lipoproteiineiksi kutsuttuina makromolekyylikomplek-seina.

9 82253

Plasman lipoproteiinit voidaan erottaa neljään pääluokkaan: o maitiaishiukkaset/ o hyvin pienitiheyksiset lipoproteiinit (VLDL)/ o pienitiheyksiset lipoproteiinit (LDL); ja o suuritiheyksiset lipoproteiinit (HDL).

Koska lipidin suhde proteiiniin vaihtelee, ovat lipoproteiinien tiheydet erilaisia. Lipoproteiinit voidaan menestyksellisesti erottaa ultrasentrifugoimalla tai elektroforeesin avulla. Patologiset hyperlipoproteinemiat, joita hoidetaan tämän keksinnön mukaisella menetelmällä, luokitellaan lipoproteiinien epänormaalisuuskuvan perusteella.

Plasman lipoproteiinikuvasta riippuen on mahdollista luokitella potilaat kolmeksi tyypiksi, joilla on epänormaalit hyperlipe-miat: hyperkolesterolemia, yhdistetty hyperlipemia ja hypertri-glyseridemia.

Hyperkolesterolemiaa, yhdistettyä hyperlipemiaa ja hypertri-glyseridemiaa esiintyy yleisesti ja niihin liittyy kaksi lipo-proteiiniluokkaa (VLDL ja LDL), joilla on positiivinen korrelaatio plasman konsentraation ja ateroskleroosin esiintymistiheyden välillä.

Edellistä koskevia viitteitä ovat Guyton, Medical Biolocrv, 5. painos, s. 926-927 (1976); The Merck Index. 13. painos, s. 381-383 (1977) ja Goodman ja Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics. 5. painos, s. 744-747 (1975).

Tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden kolesterolin absorptiota inhiboivaa vaikutusta tutkittiin apinoilla käyttämällä seulon-tatestiä, joka on kuvattu artikkelissa J. Clin. Invest.. 67:156 (1981). Tämän keksinnön mukaisen yhdisteen inhiboivaa aktiivisuutta verrattiin kolestyramiinin, joka on tunnettu antili-poproteinemia-lääke, vaikutukseen ja sen havaittiin olevan ίο 82253 viisi kertaa tehokkaampi. Samat tulokset, jotka saatiin 2 %:lla kolestyramiinia, saatiin 0,4 %:lla tigogeniini-sellubiosidia. Koska on yleisesti tunnettua, että hyperkolesterolemian tämän hetkinen hoito vaatii valtavia päiväannoksia, tämä havainto on erittäin tärkeä. Esimerkiksi aikuisille suositeltu kolestyra-miiniannos on 4 g 3 - 4 kertaa päivässä, mikä merkitsee 12-16 g kolestyramiinin kokonaisannosta seoksena 15 - 20 g kanssa apuainetta. Lääkkeen päivittäin annettu kokonaismäärä on siten 27 - 36 g. Toisaalta sama vaikutus on havaittu saatavan antamalla päivittäin vain 0,8 g 3 - 4 kertaa päivässä eli yhteensä 2,4 - 3,2 g seoksena 3-4 g:n kanssa apuainetta, so. päivittäin annettavan lääkkeen kokonaismäärä tulee olemaan 5,4 - 7,2 g päivässä.

Kolesterolin prosentuaalista absorptiota rotilla tutkittiin käyttämällä testiä, joka on kuvattu artikkelissa Am. J. Clin. Nutr.. 30:2061 (1977). Verrattaessa muihin synteettisiin glykosideihin kuten rakenteellisesti samankaltaisiin diosge-niini-sellubiosidiin, tigogeniini-glukosidiin, diosgeniini-glukosidiin tai alfalfa-saponiineihin, tämän keksinnön mukaisilla yhdisteillä oli pienempi prosentuaalinen kolesterolin absorptio ja ne poistivat siten tehokkaammin kolesterolin plasmasta.

Antamistapa

Tigogeniini-sellubiosidi voidaan antaa millä tahansa hyväksytyllä antamistavalla, joka sopii hyperkolesterolemian tai arterioskleroosin hoitoon. Näihin menetelmiin kuuluvat oraaliset tiet, parenteraaliset tiet, kuten intravenöösi, subkutaani, intradermaalinen tai lihaksensisäinen tie tai muut systeemiset antamistiet, kuten esimerkiksi lääkepuikkojen avulla.

Tigogeniini-sellubiosidin annettu määrä riippuu luonnollisesti hoidettavasta kohteesta, taudin vaikeudesta, antamistavasta ja hoitavan lääkärin harkinnasta. Tehokas annostus on kuitenkin 11 82253 välillä 7-115 mg/kg/päivä, parhaiten 28 - 57 mg/kg/päivä. Keskimäärin 70 kg painavalle ihmiselle tämä merkitsisi 0,5 -8 g/päivä, parhaiten 2-4 g/päivä, kaikkein parhaiten 2,4 - 3,2 g/päivä.

Oraalisessa antamistavassa, jota pidetään parhaimpana, farmaseuttinen seos on liuoksena, suspensioina, tabletteina, pillereinä, kapseleina, jauheina, hitaasti vapautuvina formulaatioi-na ja vastaavina.

Parenteraalisessa antamistavassa lääkkeet annetaan potilaalle injisoimalla ihon tai limakalvon yhden tai useamman kerroksen alle tai niiden läpi. Parenteraalinen antamistapa varataan parhaiten kriisitilanteisiin, joissa kohde ei kykene itse nielemään tai ottamaan lääkettä.

Systeemisessä antamistavassa lääkepuikon kautta lääke annetaan kiinteässä mutta helposti sulavassa kartiossa tai sylinterissä, joka on tehty tigogeniini-sellubiosidista ja sopivasta farmaseuttisesta apuaineesta. Lääkepuikko on voitava laittaa kehon käytävään tai onteloon. Tavallisesti se laitetaan peräsuoleen. Tätä antamistapaa pidetään parhaana potilaalla, jolla on vakava ravinnonottohäiriö, kuten toistuvia oksennuskohtauksia.

Farmaseuttinen seos

Aiotusta antamistavasta riippuen farmaseuttiset seokset voivat olla kiinteinä, puolikiinteinä tai nestemäisinä annostusmuotoi-na, kuten esimerkiksi tabletteina, pillereinä, kapseleina, jauheina, nesteinä, suspensioina tai vastaavina, parhaiten yksikköannostusmuodoissa, joiden avulla saadaan tarkka annostus yhdellä ainoalla antamiskerralla. Farmaseuttiset seokset sisältävät tavanomaista farmaseuttista kantajaa tai apuainetta ja aktiivisena ainesosana tigogeniinisellubiosidia. Lisäksi ne voivat sisältää muita lääketieteellisiä tai farmaseuttisia aineita, kantajia, apuaineita jne.

i2 82253

Farmaseuttinen seos voi sisältää 0,1 - 95 % tigogeniini-sellu-biosidia, parhaiten 1 - 70 %. Annettavan seoksen tai formu-laation tulee joka tapauksessa sisältää niin suuri määrä tigogeniini-sellubiosidia, että se lieventää hoidettavan kohteen oireita, so. hyperkolesterlemiaa tai arterioskleroosia.

Kiinteisiin farmaseuttisiin seoksiin tarkoitettuja tavanomaisia toksittomia kiinteitä kantajia ovat esimerkiksi farmaseuttiset laadut seuraavista: mannitoli, laktoosi, tärkkelys, magnesium- stearaatti, natriumsakariini, talkki, selluloosa, glukoosi, sakkaroosi, magnesiumkarbonaatti ja vastaavat.

Farmaseuttisesti annettavat nestemäiset seokset voidaan valmistaa liuottamalla tai dispergoimalla tai muulla tavoin valmistamalla tigogeniini-sellubiosidi ja sekoittamalla se valinnaisesti farmaseuttisen apuaineen kanssa kantajaan, esimerkiksi veteen, suolaliuokseen, vesipitoiseen dekstroosiin, glyseroliin, etanoliin ja vastaavaan, jolloin muodostuu liuos tai suspensio.

Parenteraalista antamistapaa varten, kuten esimerkiksi laski-monsisäisiä ruiskeita varten tigogeniini-sellubiosidi liuotetaan väliteaineeseen. väliteaine voi olla esimerkiksi vesipitoinen väliteaine, kuten natriumkloridi-injektioliuos,

Ringer'in injektioliuos, dekstroosi-injektioliuos tai jokin muu, veden kanssa sekoittuva väliteaine, kuten etyylialkoholi, nestemäinen polyetyleeniglykoli tai propyleeniglykoli tai vedetön väliteaine, kuten maissiöljy, maapähkinäöljy tai sesamöljy. Liuos stabiloidaan kemiallista hajoamista vastaan puskuroimalla väliteaine oikeaan pH-arvoon ja väliteaine muodostetaan siten, että injektioliuoksen isotonisuus on säädetty. Muita aineita voidaan myös lisätä mikrobien vastaisina aineina tai antioksidantteina.

Parenteraaliseen antamistapaan kehitetyssä uudemmassa lähesty- i3 82253 inistävässä käytetään hitaasti vapauttavan tai vapauttamista hidastavan järjestelmän siirrostamista niin, että annostus pysyy vakiotasolla. Kt. esim. US-patentti 3,710,/95.

Lääkepuikkona tapahtuvassa systeemisessä antamistavassa voidaan tigogeniini-sellubiosidi formuloida lääkepuikoiksi käyttämällä kantajana tavanomaisia sideaineita ja kantajia, kuten esim. polyalkyleeniglykoleita tai triglyseridejä. Tällaiset lääke-puikot voidaan muodostaa seoksista, jotka sisältävät tigoge-niini-sellubiosidia 0,5 - 10 %, parhaiten 1 - 2 %.

Alan ammattimiehet tuntevat, tai ne ovat heille ilmeisiä, menetelmiä, joilla valmistetaan erilaisia farmaseuttisia seoksia, jotka sisältävät tietyn määrän aktiivista ainesosaa. Esimerkkejä on annettu julkaisussa: Remington's Pharmaceutical

Sciences. Mark Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 15. painos (1975).

ESIMERKKIl g-tigoaeniini-sellubiosidin valmistaminen 1. a-tigoaeniini-sellubiosidi-hepta-asetaatin valmistaminen 12 litran kolmikaulainen pyörökolvi, joka oli varustettu mekaanisella sekoittimella ja 500 ml tiputussuppilolla, huuhdeltiin typellä ja siihen laitettiin 650 g (0,96 moolia) sellubioosi-okta-asetaattia, 200 g (0,48 moolia) tigogeniinia ja 5 1 aseto-nitriiliä. Sen jälkeen lisättiin 2 minuutin aikana tiputussup-pilon läpi yhteensä 250 g (0,96 moolia) stannikloridia. Reak-tioseosta lämmitettiin höyryhauteella, kunnes se tuli homogeeniseksi (65eC). 65eC lämpötilaa pidettiin 20 minuuttia, minkä jälkeen seos jäähdytettiin 30°C:een. Lisättiin varovasti 4 litraa kyllästettyä natriumbikarbonaatin vesiliuosta ja seosta sekoitettiin voimakkaasti 90 minuuttia. Kerrokset erotettiin i4 82253 ja vesifaasi uutettiin 4 litralla metyleenikloridia. Yhdistetyt orgaaniset faasit kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin alipaineessa kumimaiseksi aineeksi. Tämä kumimainen aine johdettiin silikageelipylvään (1,5 kg) läpi eluoimalla 25-prosenttisella metyleenikioridi/heksaanilla (tilavuus/tila-vuus). Saatu jae haihdutettiin tyhjiössä. Jäännös kiteytettiin etanolista, jolloin saatiin 120 g (saanto 24 % teoreettisesta) a-tigogeniini-sellubiosidi-hepta-asetaattia.

2. a-tiqoqeniini-sellubiosidin valmistaminen

Seosta, joka sisälsi 38,2 g a-tigogeniini-sellubiosidi-hepta-asetaattia, 60 ml metyleenikloridia, 240 ml metanolia, 120 ml trietyyliamiinia ja 100 ml vettä, refluksoitiin 6 tuntia ja sen jälkeen sekoitettiin yön yli huoneen lämpötilassa. Reaktioseos haihdutettiin alipaineessa paksuksi tahnaksi, joka pestiin vedellä ja heksaanilla ja kuivattiin. Saatu aine kromatogra-foitiin silikageelipylväässä (3 kg) eluoimalla haluttu aine 10 % metanoli/metyleenikloridillä (tilavuus/tilavuus). a-tigoge-niini-sellubiosidia sisältävä jae haihdutettiin, minkä jälkeen jäännöstä sekoitettiin kiehuvassa isopropanolissa, jäähdytettiin ja otettiin talteen, jolloin saatiin 13,9 g a-tigogeniini-sellubiosidia.

Esimerkin 3 jälkeen tulevassa taulukossa I on annettu NMR-arvot a- ja B-tigogeniini-sellubiosidille.

ESIMERKKI 2 q-tigoqeniini-sellubiosidin valmistaminen 1. ot-tioooeniini-sellubiosidi-hepta-asetaatin valmistaminen 12 litran kolmikaulainen pyörökolvi, joka oli varustettu mekaanisella sekoittimella ja 40 ml tiputussuppilolla, is 82253 huuhdeltiin typellä ja siihen laitettiin 650 g (0,96 moolia) sellubioosi-okta-asetaattia, 200 g (0,48 moolia) tigogeniinia ja 500 ml metyleenikloridia. Sen jälkeen lisättiin 2 minuutin aikana tiputussuppilon läpi yhteensä 250 g (0,96 moolia) stannikloridia, Reaktioseosta lämmitettiin höyryhauteella, refluksoitiin 20 minuuttia ja sen jälkeen jäähdytettiin 30oC:een. Lisättiin varovasti 4 litraa natriumbikarbonaatin kyllästettyä vesiliuosta ja seosta sekoitettiin voimakkaasti 90 minuuttia. Kerrokset erotettiin ja vesifaasi uutettiin uudelleen 4 litralla metyleenikloridia. Yhdistetyt orgaaniset faasit kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin alipaineessa kuitumaiseksi aineeksi. Tämä kuitumainen aine johdettiin silikageelipylvään (1,5 kg) läpi eluoiden 25 % metyleeniklo-ridi/heksaanilla (tilavuus/tilavuus). β-tigogeniini-sellubio-sidia sisältävä jae haihdutettiin tyhjiössä. Jäännös kiteytettiin etanolista, jolloin saatiin β-tigogeniini-sellubiosidi-hepta-asetaattia.

2. β-tiqoqeniini-sellubiosidin valmistaminen

Seosta, joka sisälsi 38,2 g β-tigogeniini-sellubiosidi-hepta-asetaattia, 60 ml metyleenikloridia, 240 ml metanolia, 120 ml trietyyliamiinia ja 100 ml vettä, refluksoitiin 6 tuntia, minkä jälkeen sekoitettiin yön yli huoneen lämpötilassa. Reaktioseos haihdutettiin alipaineessa paksuksi tahnaksi, joka pestiin vedellä ja heksaanilla ja uutettiin. Saatu aine kromatografoltiin silikageelipylväässä (3 kg) käyttämällä halutun aineen eluoimiseen 10 % metanoli/metyleenikloridia (tilavuus/tilavuus). Kyseeseen tulevien jakeiden haihduttamisen jälkeen jäännöstä sekoitettiin kiehuvassa isopropanolissa, jäähdytettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin β-tigogeniini-sellubio-sidia.

ESIMERKKI 3 fl-tiqooeeni-sellubiosidin valmistaminen ie 82253

Yleisinformaatio ia menetelmät

Tiqoaeniini saatiin Reserach Plus-yhtiöltä.

Sellubioosi-okta-asetaatti saatiin Aldrich-yhtiöltä.

Muuttuvaointainen dialvsaattori Muuttuvapintainen dialysaat-tori rakennettiin käyttämällä suurta säiliötä, joka oli varustettu sellaisella tavalla sifonilla, että veden pinta koko ajan nousi ja laski. Dialyysipussit sidottiin metalliseen pystytan-koon veden ylärajan ja alarajan välille. Pussit poistivat jauhemaisen aineen ja lisäsivät sen kosketusta veden kanssa.

Koemenetelmä

Tiqoqeniini 41,9 g tigogeniinia (100 millimoolia) liuotettiin 800 ml:aan vedetöntä metyleenikloridia.

Vedetön metvleenikloridi Vedetön metyleenikloridi valmistettiin lisäämällä magnesiumkloridia kaupallisesti saatuun mety-leenikloridiin. Liuosta sekoitettiin 30 minuuttia ja suodatettiin.

Sellubioosi-okta-asetaatti 135 g sellubioosi-okta-asetaattia (200 millimoolia) liuotettiin 800 ml:aan vedetöntä metyleenikloridia ja lisättiin 25 ml stanni-tetrakloridia (200 millimoolia). Seosta sekoitettiin 10 minuuttia.

Edellä saatu sellubioosi-okta-asetaattiseos laitettiin erotus-suppiloon ja lisättiin tipottain edellä saatuun tigogeniinin liuokseen noin 150 ml/min. nopeudella. Seosta sekoitettiin 3 tuntia. Saatu liuos kaadettiin 4 litran erotussuppiloon, joka sisälsi 500 ml metyleenikloridilla kyllästettyä bikarbonaatti-liuosta. Lisättiin 500 ml metyleenikloridilla kyllästettyä vettä ja kaasun annettiin poistua. Liuos sekoitettiin käänte i7 82253 lemällä ympäri ja erotettiin orgaaniseksi faasiksi ja vesifaa siksi. Alemmat faasit siirrettiin erotussuppiloon, pestiin kaksi kertaa metyleenikloridilla kyllästetyllä vedellä ja erottamisen jälkeen ylempi faasi poistettiin imulla ja heitettiin pois. Jäljelle jäänyt faasi pestiin kaksi kertaa 250 ml:11a vettä, erotettiin ja jälleen yläfaasi heitettiin pois. Alempi faasi pestiin kaksi kertaa vedellä, erotettiin ja jälleen alemmat faasit otettiin talteen ja haihdutettiin 100 -200 ml:ksi noin 50®C:ssa voimakkaasti sekoittaen ja typpikaasun alla, jolloin saatiin pääasiallisesti β-tigogeniini-sellubio-sidi-hepta-asetaattia.

1400 ml seosta, joka sisälsi trietyleeniamiinia, metanolia ja vettä (1:2:1), lisättiin hitaasti ja koko ajan sekoittaen edellä saadun tigogeniini-sellubiosidi-hepta-asetaatin liuokseen. Seosta sekoitettiin yön yli. Metyleenikloridi poistettiin 30°C:ssa tyhjiössä. Lisättiin 3 litraa vettä ja seoksen annettiin seistä jääkaapissa 1-2 tuntia. Tämän jälkeen seosta sentrifugoitiin 20 minuuttia nopeudella 4000 kierr./min., sakka kuivattiin huoneen lämpötilassa, murskattiin, liuotettiin pieneen määrään metanolia ja vettä ja dialy-soitiin 3 päivää muuttuvapintaisessa dialysaattorissa juoksevaa vesijohtovettä vasten. Saatu seos suodatettiin, kuivattiin huoneen lämpötilassa, murskattiin hienojakoiseksi jauheeksi ja uutettiin Soxhlet-laitteessa (vaipan lämpötila 40°) heptaanilla 3 päivän ajan. Uuttoastiaan jäänyt β-tigogeniini-sellubiosidi poistettiin ja kuivattiin huoneen lämpötilassa 2-3 päivän aikana heptaanin haihduttamiseksi. Tällä menetelmällä saatiin 20 - 40 % B-tigogeniini-sellubiosidia.

1' a- ja 1' β-tigogeniini-sellubiosidin Ή NMR-spektrit mitattiin NMR-spektrometrillä (Bruker WM300 Fourier transform NMR spectrometer) deDMSO-liuoksessa käyttämällä sisäisenä referenssinä tetrametyylisilaania.

ie 82253

Taulukko I

300 MHz Ή NMR tulokset, deDMS0

Tulkinnat Kemialliset siirtymät, ppm Protonien määrä

Sellubiosidi q-tiqoaeniini_β-tiqoqeniini 16 4,28m 4,25 m 1 18 0,72s 0,/2S 3 19 0,78S 0,78S 3 21 0,89 d, 0,89 3 d,J=6,8Hz d,J=6,8Hz 26 0,74 0,73 3 d,J=6,3Hz d,J=6,3Hz 1' 4,/8 4,29 d,J=3,5Hz d,J=7,9Hz 1” 4,23 4,23 1

d,J=7,6Hz d,J=7,6HZ

J = kytkentävakio s = singletti d = dubletti m = multipletti ESIMERKKI 4

Tiqoqeniini-sellubiosidin vaikutus plasman kolesteroliin Tämä esimerkki havainnollistaa tigogeniini-sellubiosidin vaikutusta plasman kolesteroliin Macaca fascicularis apinoilla. Menetelmä on kuvattu artikkelissa J. Clin. Invest.. 67:156 (1981).

Koemenetelmä

Koejärjestelyt

Eläimet jaettiin ryhmiin I ja II. Ryhmä I käsiteltiin i9 82253 2% kolestyramiinilla, ryhmä II käsiteltiin 0,4 % tigogeniini-sellubiosidilla. Jokainen ryhmä jaettiin kahteen alaryhmään. Ensimmäisen alaryhmän eläimet toimivat kolesterolivertailuina, so. niitä ei hoidettu lääkkeellä, mutta niitä ruokittiin koles-terolivaliolla. Toisen alarynmän eläimet hoidettiin lääkkeillä ja niitä myös ruokittiin kolesterolivaliolla.

Alaryhmä 1: Ennen kokeen aloittamista kummankin ryhmän kaikis ta eläimistä otettiin vertailuverta ja määritettiin kolesterolin kokonaismäärä ja suuritiheyksinen lipoproteiinikolesteroli. Sen jälkeen eläimiä ruokittiin kolesterolivaliolla. Sen jälkeen, kun eläimiä oli pidetty 3 viikkoa ruokavaliolla ilman hoitoa, käsitellyistä apinoista otettiin verta ja määritettiin kolesterolin kokonaismäärä ja suuritiheyksinen lipoproteiinikolesteroli.

Alaryhmä 2: Ennen alaryhmän 2 kokeen aloittamista ruokittiin alaryhmän 1 eläimiä 5 viikon ajan kolesterolia sisältämättömällä, puolittain puhdistetulla ruokavaliolla. Sen jälkeen, kun eläimiä oli pidetty 5 viikkoa kolesterolia sisältämättömällä ruokavaliolla, otettiin jälleen vertailuverta kaikista eläimistä ja määritettiin kolesterolin kokonaismäärä ja suuritiheyksinen lipoproteiinikolesteroli. Sen jälkeen eläimet laitettiin kolesterolivaliolle, mihin oli yhdistetty lääkehoito. Sen jälkeen, kun eläimiä oli pidetty 3 viikkoa kolesterolivaliolla ja hoidettu kyseeseen tulevalla tavalla, kaikista apinoista otettiin verta ja määritettiin kolesterolin kokonaismäärä ja suuritiheyksinen lipoproteiinikolesteroli.

Eläimet ia ruokavalio

Kaksitoista täysikasvuista cynomolgus-naarasta (Macaca fascicularis) ruokittiin 3 viikon ajan kolesterolia sisältämättömällä puoliksi puhdistetulla ruokavaliolla (SPD), jolla oli seuraava koostumus: 20 82253

Ainesosat α/100 g ruokavalio

Kaseiini 18

Sokeri 30

Hunaja 10

Alphacei 12

Voi 3

Kookospähkinäöljy 8,5

Saffloröljy 2,5

Vitamiinit (0WP) 2

Suolat (hegsted IV) 4

Vitamiini D-3 (2.000 IU/ml) 0,2 ml

Banaani (märkäpaino) 10

Proteiinit (% kaloreita) 20,6

Rasva (% kaloreista) 33,5

Hiilihydraatti (% kaloreista) 45,9 Tämä ruokavalio voi valinnaisesti sisältää kolesterolia 0,118 g/100 g ruokavaliosta laskettuna tai 0,35 mg/kCal.

Koejärjestelyt ja tulokset on hahmoteltu ja koottu taulukkoon A.

Tulokset (koottu taulukkoon A)

Apinat jaettiin kahteen ryhmään (I ja II, kummassakin kuusi apinaa) seerumikolesterolivasteensa perusteella. Ryhmittely ja jako tapahtui mielivaltaisesti, jolloin saatiin ryhmät, joissa kolesterolemia oli samalla tavoin kohonnut.

Vertailu 1. näyte 1

Analyysiä varten otettiin vertailuna käytettyä laskimoverta. Seerumikolesterolin keskimääräinen arvo ryhmällä I oli 240 mg/dl ja ryhmällä II 228 mg/ml.

21 82253

Sen jälkeen apinoille annettiin kolme viikkoa puolittain puhdistettua ruokavaliota, joka sisälsi 0,1 % kolesterolia. Tämän jakson lopussa otettiin verinäyte 2.

Kolesterolivalio. näyte 2

Kolmen viikon pituisen kolesterolivalion jälkeen kolesterolin keskimääräinen arvo ryhmällä I oli 324 mg/dl ja ryhmällä II 316 mg/dl. Kolesterolin määrä oli merkittävästi korkeampi näytteessä 2 merkitsevyyden ollessa 0,01.

Apinoille annettiin jälleen 5 viikon ajan puolittain puhdistettua ruokavaliota ilman kolesterolia ja verinäytteet otettiin tämän jakson lopussa.

Vertailu 2, näyte 3

Viiden viikon pituisen kolesterolia sisältämättömän ruokavalion jälkeen kolesterolin määrä kummassakin ryhmässä pieneni, ryhmässä I arvoon 221 mg/dl ja ryhmässä II arvoon 189 mg/dl.

Eläimille annettiin sen jälkeen kolmen viikon ajan puolittain puhdistettua ruokavaliota, joka sisälsi 0,1 % kolesterolia, ja joko 2 % kolestyramiinia (ryhmä I) tai 0,4 % sellubioosi-tigo-geniinia (ryhmä II). Tämän jakson lopussa saatiin näyte 4.

Kolesterolivalio ia lääkehoito, näyte 4

Kolmen viikon pituisen kolesterolivalion, johon oli yhdistetty lääkehoito, kolesteroliarvo ryhmällä I oli 226 mg/dl ja ryhmällä II 202 mg/dl.

Taulukossa A esitetyt tulokset osoittavat, että kummatkin lääkkeet estivät odotetun seerumikolesterolin nousun.

22 82253 Lääkkeen käyttämiseen liittyi pieniä, ei-merkitseviä suuri-tiheyksisen lipoproteiini-kolesterolin nousuja. Kts. näytteet 1, 2, 3 ja 4 taulukon A HDL-kolesteroliosassa. Vaikkakin triglyseridimäärissä voitaisiin odottaa muutoksia luonnollisena reaktiona runsaasti kolesterolia sisältävälle ruokavaliolle, mitään muutoksia ei havaittu. Tämä osoittaa, että kummatkin lääkkeet estivät pienitiheyksisen lipoproteiini-kolesterolin nousun.

23 82253 0) co r-»

:2 <* +| ιΑ +| '—I

” vO Ο ΙΑ O

1-1 vO LO - LO O LO - tO

+ --i Z O Z Z O Z

N :a P :C0 O :co m ^ OV, -H, e _S +1 CSI + Ά 3 "t" lA O CO Oi r?iA LO- <t LO- 3 -g Ή Z O -H Z O -3

-H ° O

2 ^ "e 05 ω g CSI in :co ^ -U 5 +| +1 *A i—| O tn τί co o O) to <u Ξ <r I co ro I -

. ? rH i z f—i IO II

+ 1 o z ^ ή e _i .2 —i •H O 3 2 2 2

+| +| lA QJ

n 7 H VO 3 O -i->

0) " esi LOI O - I CO CO

v z I i—i o i z a)

—I

— o m ω vo 3 \ :g <* ^1 -· *?l -h la -5

rj, 1™ VO O esi OO -H

C ^"1 esi - tO to O - - tl) fc , tsi O Z Z CSI O O Jj

w + O

:eo Λ1 ^ H t-1 ^ Q.

M :ra 3 g_

° :C0 ^ OV CD -H

^ E ’2 ΙΆ H, >—I H, -H

<D CD fj +| O +| Ή LA

O Ov OO C

C7CSI -LO 00 -- O)

” ® -g Cs| O Z Ή OO C

^ O CO

° o -* 5 5 3 i ^ 5 Ό · Ή -3 3 e 2 N N. esi, J-> M -H S +1 Ή +1 -H '3 0) rH TO <f O 'β O 3 tS Ξ a s I o * i o §

(D

< j-i . Il m .

o ω 3 3

^ ^ Ov Ov O

* O ‘2 <H -H, rH U

3 ^ ™ +| M +| —I 0) ,-h ti cd -h o oo I o 3 £ <t e -I «M -rH -I to — esi -h oi cm to o * a) eo -* h Q h

I- E O O

CO -H V ·

f4 -H X ·Η -H I

S LI N H O 3 e -U CM ι-H IA —l>

-U CO ' * -H CO O CD

CO 55 -H -H -H rrj ·Η O) H H -H X CO

1) D > » > C 4-» > > > -*-> 1—I I , Ή ·Η Ή ΙΛ ω I , ·Η H -H ·· ·Η O 4JI (4 U (4 VO CO 441 U t4 (4 44 J3t VO _* >,>s>» Il o? O >,>»>. <Uf4 n e -ui 4-) -lj z <r ο e 4J 4-i 4J coo)

Zo?a)«ocora - -3 a) co co co j* e N C >> >> >< -H O 44 e >> >4 >* >s

i—I -H Q. Q. Q. !—I -HQ-Q-Q. C -H

O ·· —I ·· —I C 11) m<D:*ta)-HCD«co :<a) —i co en co <u

v44Z-* H>>> Z -* ·Η>>> XII

-* >χ X :co 3 X :co u >,

CO :co >- :co co >- :to to J lO

O Z C£ _l CL Q. X_IQ.Q. CO Z

24 82253 ESIMERKKI 5

Synteettisten qlykosidien vaikutus kolesterolin absorptioon suolistossa rotilla Tässä esimerkissä on verrattu kolesterolin absorptiota suolistossa rotilla, jotka oli käsitelty tigogeniini-sellubiosidilla tai muilla synteettisillä glykosideilla. Malinow et ai.,

Am. J. Clin. Nutr., 30:2061 (1977), on kuvannut yksityiskohtaisesti tässä kokeessa käytettyä menetelmää.

Koejärjestelyt

Rotille annettiin mahan sisäisesti 2 mg boli 4/14C/kolestero-lia. Ulosteet otettiin talteen 72 tunnin aikana ja määritettiin leimattujen neutraalien steroidien määrä ulosteissa.

Rotat jaettiin kolmeen ryhmään I - III.

Ryhmien I ja II eläimet jaettiin kuuden rotan alaryhmiin. Ensimmäinen alaryhmä toimi vertailuna eikä sitä millään tavoin käsitelty. Toinen ja kolmas alaryhmä käsiteltiin joko tämän keksinnön mukaisella yhdisteellä tai jollakin muulla lähisukuisella yhdisteellä. Ryhmissä I ja II rotat käsiteltiin siten tigogeniini-sellubiosidilla, diosgeniini-sellubiosidilla, tigogeniini-glukosidilla ja diosgeniiniglukosidilla.

Taulukkoon B kootut tulokset vahvistavat, että tigogeniini-sellubiosidi pienensi kolesterolin absorptiota suolistossa enemmän kuin rakenteellisesti saman kaltaiset diosgeniini-sellubiosidi, tigogeniini-glukosidi ja diosgeniini-glukosidi. Tigogeniini-sellubiosidi oli merkitsevästi tehokkaampi kuin kaikkein lähisukuisin diosgeniini-sellubiosidi (kts. ryhmä I, alaryhmät 2 ja 3). Vertailuryhmään verrattuna tigogeniini-sellubiosidi pienensi kolesterolin absorptiota lähes 50 % 25 8 2 2 5 3 (merkitsevyys = 0,001). Tigogeniini-sellubiosidi oli myös tehokkaampi kuin tigogeniini-glukosidi ja diosgeniini-glukosidi (kts. ryhmä IX, alaryhmät 2 ja 3/ vrt. ryhmiä I ja II).

Ryhmässä lii on kaksi alaryhmää, joissa kummassakin on 12 eläintä. Kolesterolin absorption inhiboitumista rotilla, jotka oli käsitelty tigogeniini-sellubiosidilla, verrattiin kolesterolin absorption inhiboitumiseen käsittelemättömissä vertailu-eläimissä.

Samoinkuin ryhmässä I, jossa käsittely tigogeniini-sello-biosidilla esti kolesterolin absorptiota 47 % (No=6), ryhmässä (III) käsittely tigogeniini-sellubioosidiila esti kolesterolin absorptiota 41,> % (No=12). Kolesterolin absorptio ryhmän (I) koerotissa oli vain 53 % ja kolesterolin absorptio ryhmässä (III) oli vain 58,5 % kolesterolin absorptiosta vertailuryhmässä.

26 82253

Taulukko B

Synteettisten saponiinien vaikutus kolesteroliabsorptioon rotilla

Eläin- Kolesteroli P_ |/Seif ten Annos adsoprito (Studentin

Ryhmat tely maara (?> I-D>) vertailu absorptio I ei 6 0 74,8+1,6 100 C-T 6 14 39,6+1,8 0,001 53 C-D 6 14 53,/+1,3 0,01 72 II ei 6 0 74,6+2,3 100 G-T 6 14 46,2+1,β 0,001 62 G-D 6 14 52,6+3,7 0,001 71 III ei 12 0 75,2+1,8 100 C-T 12 14 43,6+1,6 0,001 58,5

Keskiarvot + SD. Lyhennykset: C-D = sellubioosi-diosgeniini; C-T = sellubicxosi-tigogeniini; G-D= glukoosidiosgeniini; G-T = glukoosi-tigogeniini.

ESIMERKKI 6

Tiqoqeniini-sellubiosidin β-anomeerin valmistaminen 5,i> g (15 mil li ekv i vai ent t i a) t i ta an i tet r abr omidi a siirrettiin vedettömissä olosuhteissa seokseen, joka sisälsi 10,2 g (15 milliekvivalent tia) sollubioosiokta-asetnattia 150 ml:ssa 1,2-etyleenidikloridia (kuivattu seuloilla). Seosta sekoitettiin 5 tuntia 60-65-asteiseli a öljyhauteella.

Seos jäähdytettiin jäähauteen avulla huoneen lämpötilaan, minkä jälkeen se pestiin peräkkäin 50 ml:lla jäävettä, sen jälkeen 50 mltlla kylmää kyllästettyä natriumbikarbo-naattiliuosta ja tämän jälkeen 50 ml:lla vettä. Saatu pesty seos kuivattiin sen jälkeen magnesiumsulfaatilla, 27 82253 suodatettiin ja stripattiin lämpimällä vesihauteella ja lopuksi käyttämällä pumpulla varustettua pyöröhaihdutinta. Saatiin 11 g kiinteää jäännöstä.

Tähän jäännökseen lisättiin 2,9 g (7,3 milliekvivalenttia) tigogeniinia, 100 ml asetonitriiliä ja 7,6 g (30 milliekvivalenttia) elohopea(ll)syanidia. Saatua seosta kuumennettiin typen alla voimakkaasti sekoittaen 1 1/2 tunnin ajan 60-65-asteisella öljyhauteella (seos tuli homogeeniseksi 30 minuutin kuluttua) ja sen jälkeen yön yli. Liuotin poistettiin reaktio-seoksesta pyöröhaihduttimella, saatu aine liuotettiin dikloori-metaaniin ja liukenematon aines erotettiin suodattamalla. Orgaaninen liuos pestiin peräkkäin kyllästetyllä KHC03 30% KI-liuoksella ja vedellä. Vesiuutteet yhdistettiin ja uutettiin takaisin dikloorimetaanilla. Orgaaniset faasit yhdistettiin, kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja stripattiin. Etanolista kiteyttämällä saatiin 4,9 g β-tigogeniini-sellubiosidi-hepta-asetaattikiteitä. Kiteyttämällä uudelleen etanolista saatiin 3,9 g kiteistä β-anomeeriä.

Näin saatu β-tigogeniini-sellubiosidi-hepta-asetaatti hydrolysoidaan esimerkin 2 osassa 2 esitetyllä tavalla, jolloin saadaan β-tigogeniini-sellubioosia. Tuotteella on oleellisesti sama NMR-spektri kuin esimerkin 3 taulukossa I.

ESIMERKKI 7

Tioogeniini-sellubiosidin α-anomeerin valmistaminen Tämä reaktio on muunnos R.U. Lemieux'in et ai.. J. Am. Chem.

Soc.. 97 4056 (1975), esittämästä menetelmästä.

Seosta, joka sisältää 10,7 g (15 millimoolia) bromisellubioosi-hepta-asetaattia (valmistettu kuten esimerkissä 6), 1,95 q (15 millimoolia) di-isopropyyliamiinia, 3,15 g (15 millimoolia) 20 82253 tetraetyyliammoniumbromidia ja 3,0 g (7,5 millimoolia) tigogeniinia 100 ml:ssa metyleenikloridia, sekoitetaan 2 päivää huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen reaktioseos pestään peräkkäin vedellä ja IN suolahapolla ja kuivataan natriumsulfaa-tilla. Suodatetaan ja liuotin haihdutetaan alipaineessa, minkä jälkeen jäännös puhdistetaan kiteyttämällä etanolista. Näin saadaan tigogeniini-sellubiosidi-hepta-asetaatin a-anomeeria, joka vuorostaan hydrolysoidaan esimerkin 2 mukaisella menetelmällä tigogeniini-sellubiosidin α-anomeeriksi. Tällä anomee-rilla on oleellisesti samat NMR-arvot kuin mitä on esitetty esimerkin 3 taulukossa I.

ESIMERKKI 8

Tiaoaeniini-sellubiosidi-hepta-asetaatin a- ja β-anomeerien erottaminen a- ja β-anomeerien seos valmistetaan sekoittamalla yhtä suuret moolimäärät erillisiä isomeerejä tai saattamalla tigogeniini-sellubiosidin a- ja β-anomeerien seos reagoimaan sopivan asetylointiaineen kanssa. Tigogeniini-sellubiosidi-hepta-asetaatin yksittäiset a- ja β-anomeerit erotetaan TLC-mikromenetelmillä käyttämällä etyyliasetaatin ja heksaanin 60:40 seosta silikageelillä. Anomeerien erottamisen jälkeen yksittäinen anomeeri uutetaan TLC-levystä.

Claims (1)

1. 29 82253 Patenttivaatimus Menetelmä valmistaa farmakologisesti arvokkaita tigogeeni-sellubiosideja, joiden kaava (A) on H OR OR CH3j I) R0 OR OR jossa R on vety tai -C(0)CH3, sen a- ja β-anomeerien seoksena tai erillisenä α-anomeerina tai β-anomeerina, tunnettu siitä, että a) kaavan (A) mukainen yhdiste, jossa R on -C(0)CH3, saatetaan reagoimaan veden kanssa orgaanisessa liuottimessa niin, että muodostuu kaavan (A) mukainen yhdiste, jossa R on vety, b) sellubioosi-okta-asetaatti tai bromisellubioosi-hepta-ase-taatti saatetaan reagoimaan tigogeniinin kanssa orgaanisessa liuottimessa metallisuolan läsnäollessa tai c) että α-anomeeri tai β-anomeeri uutetaan näiden kahden ano-meerin seoksesta. 3o 82253 Förfarande för framställning av farmakologiskt värdefulla tigogen-cellubiosider med formeln (A) H CH P- lLJ'--7 CH3 ' T OR OR U OR OR där R är väte eller -C(0)CH3/ i form av en blandning av de a- och β-anomerer eller som α-anomer eller β-anomer skilt för sig, kä nnetecknat därav, att a) en förening med formeln (A), där R är -C(0)CH3, bringas att reagera med vatten i ett organiskt lösningsmedel s&, att en förening med formeln (A), där R är väte, bildas b) cellubios-okta-acetat eller bromcellubios-hepta-acetat bringas att reagera med tigogenin i ett organiskt lösningsmedel i närvaro av metallsalt c) en α-anomer eller β-anomer extraheras frän en blandning av dessa tvä anomer.