FI115912B - Antiparasiittiset markfortiini- ja paraherkvamidijohdannaiset - Google Patents

Description

Antiparasiittiset markfortiini- ja paraherkvamidijohdannai set - Antiparasitiska markfortin- och paraherqvamidderivat 115912 5 Keksintö koskee markfortiini- ja paraherkvamidijohdannaisia, jotka ovat käyttökelpoisia antiparasiittisina aineina.

Markfortiinit ovat tunnettuja yhdisteitä, katso julkaisua Journal of the Chemical Society Chemical Communications, 601-10 602 (1980), jossa kuvataan markfortiini A, ja julkaisua

Tetrahedron Letters, 22, 1977-1980 ((1981), jossa kuvataan markfortiini B ja C. Nämä yhdisteet ovat Penicillium roque-fortin sienimetaboliitteja. Markfortiinit ovat rakenteellisesti sukua paraherkvamideille, jotka myös ovat tunnettuja 15 yhdisteitä.

Paraherkvamidit kuvataan julkaisuissa Tetrahedron Letters, 22, 135-136 (1981), ja Journal of Antibiotics, 44, 492-497 (1991). US-patenttijulkaisuissa 4,866,060 ja 4,923,867 kuva-20 taan markfortiini A:n, B:n ja C:n ja niiden määrättyjen johdannaisten käyttö käyttökelpoisina eläinten parasiittisai-.·, : rauksien hoitoon ja ennaltaestoon.

« « » t · , Julkaisussa W0 92/22555 (julkaistu 23. joulukuuta 1992) kuva- (11 25 taan geneerisesti markfortiini- tai paraherkvamidijohdan- nainen, ts. osittaiskaava (III), joka on substituoitu 14-ase-maan metyylillä tai metyylillä ja hydroksilla. Tässä julkai-V · sussa ei kuitenkaan kuvata kuinka tällaisia 14-metyyli-14- hydroksimarkfortiiniyhdisteitä valmistetaan.

: : : 30

Julkaisussa the Journal of Antibiotics, 43, 1380-1386 (1990) .* . kuvataan paraherkvamidi A, jolla on seuraava rakenne: • 1 t 1 2 115912

H,C

\ /H3 . H3C/H3|fT^0 \ JL I? /)25 \—1/ 0 24 H3/:h Lf;|-NH un//18 \ '1 0 ch3 0

Markfortiini A:11a on seuraava rakenne:

H,C

\ ,· CH3 ’k-\ H>cv/0HM^° \ Οι-λ/ ill r

\ 13/ 21 J

Υλ^±Α\Ά1/ 24 \ 20/^ A-NH /7-N 10 // 0 \h3 0

Markfortiini B:llä on seuraava rakenne:

H.C

,V. \.-CH3 :·:· "n ^/ΗΜ^°λ AÄ // 1.1 : VZ^f m fl-1* /" H o'

» I

I » 3 115912

Markfortiini C:llä on seuraava rakenne:

HjC

\ .CH3 ( VaX Ji I r \ 13/ 12\ 21 ‘--/x/X Ί '-‘-V. ίο ,·Χ /\3 , / 24 r h o

Markfortiini D:llä on seuraava rakenne: SH3 /—\ H3C(f j™3 C> CHj °

Julkaisussa WO 91/09961 (julkaistu 11. heinäkuuta 1991) kuva-taan erilaisia markfortiini- ja paraherkvamidijohdannaisia ja 5 niiden 12a-N-oksideja, samoin kuin VM 29919 :n (paraherkva- *·' ‘ midi) ja VM 55596 :n (paraherkvamidin 12a-N-oksidi) valmistus mm. Penicillium Sp. IMI 332995:stä.

• · a j US-patenttijulkaisussa 4,873,247 kuvataan paraherkvamidijoh- ,·, ; 10 dannaisia ja Penicillium charlessi MF 5123-kanta (ATCC 20841) paraherkvamidin valmistukseen. US-patentti julkaisussa 4,978,656 (samoin kuin EP-390532-A, EP-301742-A) kuvataan : erilaisia synteettisiä paraherkvamidi johdannaisia samoin kuin : paraherkvamidin valmistus Penicillium charlessi MF 5123 :sta 15 (ATCC 20841) .

11 5 912 4

Kansainvälisessä PCT-patenttijulkaisussa W0 92/22555 (julkaistu 23. joulukuuta 1992) kuvataan geneerisesti 14a-hydrok-simarkfortiiniyhdisteet ja menetelmä, jossa 14-hydroksi-14-5 metyylimarkfortiiniyhdisteitä käytetään antiparasiittisten lääkkeiden valmistukseen. Ei kuitenkaan esitetä mitään mahdolliseksi tekevää tapaa valmistaa 14cf-hydroksimarkfortiini-tai 14a-hydroksi-14S-metyylimarkfortiiniyhdisteitä.

10 Kansainvälisessä PCT-patenttijulkaisussa W094/29319 kuvataan erilaisia 14-substituoituja markfortiineja ja niiden johdannaisia .

Kaavan III mukaiset 15-alkyyli-14-hydroksiyhdisteet, jossa nx 15 on 0, ovat tunnettuja, katso kansainvälistä PCT-patenttijulkaisua W094/29319.

Keksintö koskee 2-deoksoparaherkvamidi B- ja 2-desoksomark-fortiiniyhdisteitä, joilla on kaava XXXI

20 ” ! ?H3 >\>n »3c ch3 \0H3 L Λ λ’···ΛΑ Jj (XXXI) 14 0 ch3 r18 • > • * » I · « *.’*· jossa n on 1 tai 2; R14 on -H tai C^4-alkyyli; R15 on -H tai C^-alkyyli; R16 on -H tai -OH; 25 R18 on -H tai C14-alkyyli, ja sen farmaseuttisesti hyväksyttä viä suoloja.

5 115912

Kaavaan XXXI sisältyy seuraavien kaavojen XXI (14-hydroksi-2-desoksomarkfortiini A-yhdisteet), XXIII (2-desoksomarkfortiimi A) ja XXV (14-hydroksi-2-deoksoparaherkvamidiyhdisteet) mukai-5 set yhdisteet ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

f3 /"“\ f^Y° \ CH3 "«—( /"λΑ ΛΛ //

Λ—jf oJ/ (XXD

m n° i V-n^v^v-nh ^ ^14 Q \ ° ch3 jossa Ru on -H tai C^-alkyyli ja R15 on -H tai C^-alkyyli.

15 CH, r-\ ,ψχχγ O (XXIII) 20 CH» ·:·’· HjC CH, r^V0 \ CH* Ηο-πνίΛ^ΟΓ ° (xxv) R”° 30 : jossa Ru on -H tai C^-alkyyli ja R15 on -H tai C^-alkyyli.

• I

Edullisia kaavan XXXI mukaisia yhdisteitä ovat 2-deoksopara-herkvamidi B, 2-desokso-14a-hydroksi-14p-metyylimarkfortiini A :: : 35 ja 2p-metyyli-2-desoksomarkfortiini A.

Keksintö koskee lisäksi 1,2-dehydroyhdisteitä, joilla on kaava XXIX

6 115912 CHg

Rig. H3C^CH3^Y°4-CH3 (XXIX) R’4 0 \h3 kun n on 1; R14 on -H tai C14-alkyyli; R15 on -H tai C1_4-alkyyli ; R16 on -OH, 5 kun n on 2 ja R1S on -OH, R14 on -H tai C^-alkyyli ; R15 on -H tai C^-alkyyli; kun n on 2 ja R16 on -H, R14 on -H; 10 R15 on -H; ja sen farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja.

• · * » * *'·’ · Edullisia kaavan XXIX mukaisia yhdisteitä ovat seuraavat:

• I

15 1,2-dehydromarkfortiini A, ·.*. 1,2-dehydroparaherkvamidi A, 1.2- dehydro-14(x-hydroksi-14p-metyylimarkfortiini A ja 1.2- dehydro-14a-hydroksi-15a-metyylimarkfortnni A.

• * · • * · 2 0 Keksinnön mukaiset yhdisteet valmistetaan ammattimiesten tun- ternillä menetelmillä ammattimiesten tuntemista ammattimiesten : tuntemilla tavoilla tunnetuista yhdisteistä helposti valmis- • · tettavista lähtöaineista. Tunnettua kemiaa käytetään tunne-tuilla lähtöaineilla uusissa jaksoissa keksinnön mukaisten 25 uusien yhdisteiden valmistamiseksi.

7 115912

Seuraavissa kaavioissa A-E ja I-N kuvataan sellaisten yhdisteiden valmistamista, joita voidaan käyttää lähtöaineina tai välituotteina keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi. Kaavioissa F-H ja 0 kuvataan keksinnön mukaisten yhdis-5 teiden valmistusta.

Kaaviossa A kuvataan edullinen menetelmä kaavan III mukaisten 15-alkyyli-14-hydroksiyhdisteiden valmistamiseksi. Kaavan I mukainen 14-hydroksi-a,β-tyydyttymätön lähtöaineyhdiste on 10 tunnettu, katso kansainvälistä PCT-patenttijulkaisua W094/29319. Kaavan I mukaiset 14-hydroksi-a,β-tyydyttymättämä t yhdisteet voidaan muuttaa kaavan II mukaisiksi vastaaviksi 15-alkyyli-17-oksoyhdisteet reaktiolla alkylointireagens-sien kuten Grignard-reagenssin tai alkyylikupraattien kanssa; 15 edullisesti alkylointireagenssi on kaavan CH3-(CH2) nl-Mg-X0 mukaista Grignard-reagenssia, jossa nt on 0-3, ja X0 on halogeeni. Edullisesti nL on 1 ja X0 on -Br. Edullinen menetelmä on saattaa kaavan I mukainen 14-hydroksi-a,β-tyydyttymätön yhdiste reagoimaan etyylimagnesiumbromidin ja kupari(I)jodidin 20 kanssa standardi-1,4-additio-oloissa, jolloin muodostuu kaavan II mukaisia 15-alkyyli-17-oksoyhdisteitä. Sitten kaavan ; II mukaiset 15-alkyyli-17-oksoyhdisteet pelkistetään ämmät- • » · timiesten tuntemilla tavoilla karbonyyli ryhmän pelkistämi- . seksi alkyleeniryhmäksi, kuten pelkistämällä boraani-dimetyy- ... 25 lisulfidi -kompleksilla tai muilla pelkistysreagensseilla, • · kuten boraani-THF -kompleksilla tai litiumaluminiumhydri- • t · dillä. On edullista käyttää pelkistykseen boraani-dimetyyli-V * sulfidi -kompleksia. Kaavan III mukaisilla 15-alkyyli-14-hyd- roksiyhdisteillä on edullista, että nx on 1. Kaavan III }j j 30 mukaiset 15-alkyyli-14-hydroksiyhdisteet, jossa n3 on 0, ovat : : tunnettuja, katso kansainvälistä PCT-patenttijulkaisua / . W094/29319 .

·;’ Kaaviossa B kuvataan menetelmä kaavan VIII mukaisten fluori- : ; : 35 yhdisteiden tuottamiseksi. Kaavan I mukainen 14-hydroksi-a,S- tyydyttymätön lähtöaine muutetaan kaavan IV mukaiseksi vastaavaksi tyydyttymättömäksi yhdisteeksi Grignard-additiol-la, joka on samanlainen kuin additio, jota kaaviossa A käy- 8 115912 tettiin kaavan I mukaisen 14-hydroksi-a,β-tyydyttymättämän yhdisteen alkyloimiseen, mutta nyt käyttäen CH3-(CH2) nl-Mg-X0: n (kaavio A) sijasta CH2=CH-(CH2)n2-Mg-X0/kuparijodidia, jossa n2 on 0-3. Sitten kaavan IV mukainen tyydyttymätön yhdiste 5 muutetaan kaavan V mukaiseksi vastaavaksi dihydroksiyhdis- teeksi hapettamalla C15-sivuketjun tyydyttymättömän osan kak- soissidoksen saattamalla reagoimaan hapetusreagenssin kuten osmiumtetroksidin (katalyyttinen) ja 4-metyylimorfoliini-N- oksidin kanssa; edullisesti hapetusreagenssi on osmiumtetrok-

10 sidia ja 4-metyylimorfoliini-N-oksidia. Sitten kaavan V

mukaiset dihydroksiyhdisteet muutetaan vastaaviksi kaavan VI

mukaisiksi hydroksialkyyliyhdisteiksi hapettamalla, sen jälkeen pelkistämällä. Edullisesti hapetusreagenssi on nat- riumperjodaattia ja pelkistysreagenssi natriumborohydridiä.

15 Kaavan VI mukaiset hydroksialkyyliyhdisteet muutetaan kaavan VII mukaisiksi fluorioksoyhdisteiksi fluorausreagenssilla kuten tetrabutyyliammoniumfluoridilla ja p-tolueenisulfonyy- lifluoridilla. Kaavan VII mukaisten fluorioksoyhdisteiden endosyklinen kaksoissidos pelkistetään tunnetuilla menetel- 20 millä, edullisesti boraani-tetrahydrofuraani -kompleksilla, jolloin saadaan kaavan VIII mukainen haluttu fluoriyhdiste.

.·. : Kaavan VIII mukaisilla fluoriyhdisteillä n, on edullisesti 1.

♦ » · z % . Kaaviossa C kuvataan menetelmä kaavan X mukaisten 15-alkyyli- * · ... 25 16-hydroksiyhdisteiden tuottamiseksi. Ensin poistetaan 14- hydroksyyliryhmä, jolloin saadaan 14,15-dehydrofunktionaali-'·*.* suus hyvin tunnetulla menetelmällä käyttämällä dietyyliamino-

* » I

V ’ rikkitrifluoridia (DAST), jolloin saadaan kaavan IX mukaisia A14-15-alkyyliyhdisteitä. Kaavan IX mukaiset A14-15-alkyyliyh-J .* 30 disteet hydroksyloidaan, jolloin saadaan kaavan X mukaisia haluttuja 15-alkyyli-16-hydroksiyhdisteitä saattamalla rea-.’ . goimaan hydroksylointireagenssin, edullisesti seleenidioksi- din kanssa kuumentaen palautus jäähdyttäen inertissä liuotti- • · messa kuten p-dioksaanissa. Kaavan X mukaisissa 15-alkyyli- : : ; 35 16-hydroksiyhdisteissä n2 on edullisesti 0.

• * I · i

Kaaviossa D kuvataan menetelmä kaavan XIII mukaisten 15-alkyyli -paraherkvamidi B-yhdisteiden tuottamiseksi. Kaavan III

9 115912 mukaiset 15-alkyyli-14-hydroksi-lähtöaineyhdisteet hapetetaan kaavan XI mukaisiksi vastaaviksi 15-alkyyli-16,16-dioksomark-fortiini A-yhdisteiksi reaktiolla hapen kanssa katalysaattorin kuten Pt/C:n läsnä ollessa. Tällöin kaavan XI 5 mukaisissa 15-alkyyli-16,17-dioksomarkfortiini A-yhdisteissä pelkistetään kuusijäseninen dioksorengas viisijäseniseksi renkaaksi, jolloin muodostuu kaavan XII mukaisia 15-alkyyli-

16- oksoparaherkvamidi B-yhdisteitä käsittelemällä perhapolla, edullisesti m-klooriperbentsoehapolla. Sitten kaavan XII

10 mukaisista 15-alkyyli-16-oksoparaherkvamidi B-yhdisteistä poistetaan 16-oksoryhmä käyttämällä pelkistysreagenssia, edullisesti litiumaluminiumhydridi/alumiinikloridia, jolloin saadaan kaavan XIII mukaisia haluttuja 15-alkyylipara-herkvamidi B-yhdisteitä. Kaavan XIII mukaisilla 15-alkyyli-15 paraherkvamidi B-yhdisteillä n1 on edullisesti 0.

Kaaviossa E kuvataan tapoja tuottaa erilaisia oksoyhdisteitä, jotka ovat kaavan XV mukainen 16,17-dioksomarkfortiini A, kaavan XVI mukainen 16-oksoparaherkvamidi B ja kaavan XVII 20 mukainen 14,15-dehydro-16-oksoparaherkvamidi B, esimerkkien 13 ja 14 menetelmillä.

t I ·

Kaaviossa F kuvataan tapoja tuottaa kaavan XXI mukaisia 2- • · . deokso-14-hydroksiyhdisteitä lähtien kaavan XVIII mukaisista

,,, 25 14-hydroksi-a,β-tyydyttymättömistä ketoneista, jossa R14 on -H

• * ' tai C14-alkyyli ja R15 on -H tai Cx 4-alkyyli. Kaavan XVIII mu- • ► · V.‘ kaisista 14-hydroksi-a,S-tyydyttymättömistä amideista pelkis- V ’ tetään A15-kaksoissidos reaktiolla sopivan litiumreagenssin

Rls-Li kanssa litiumbromidin läsnä ollessa, jolloin saadaan j : | 30 kaavan XIX mukaisia 14-hydroksi-17-oksoyhdisteitä. C15-asema voidaan haluttaessa alkyloida tämän reaktion aikana. Seuraa- V . vaksi kaavan XIX mukaisista 14-hydroksi-17-oksoyhdisteistä pelkistetään 17-oksoryhmä boraani-dimetyylisulfidi -komplek- • * ·;· sin avulla (aikaisemmin kaaviossa A kuvatulla tavalla), katso ί 35 esimerkkiä 15. Tämä pelkistys tuottaa kaavan XX mukaisen 14-: : hydroksiyhdisteen samoin kuin yhdisteen, jossa sekä 2- että 17- karbonyyliryhmä on pelkistynyt, kaavan XXI mukaisen halutun 2-deokso-14-hydroksiyhdisteen.

115912 ίο

Kaaviossa G kuvataan menetelmä kaavan XXIII mukaisten 2-deok-soyhdisteiden tuottamiseksi, katso esimerkkiä 16.

5 Kaaviossa H kuvataan menetelmä kaavan XXV mukaisten vastaavien 14-hydroksi-2-deoksoparaherkvamidien valmistamiseksi.

Vaihtoehtoisesti, ja edullisesti, kaavan XXIII mukaista 2-desoksomarkfortiinia, kaavan XXV mukaisia 14-hydroksi-2-des-10 oksoparaherkvamidi B- ja 14-hydroksimarkfortiini A-johdannaisia voidaan valmistaa 40-70-prosenttisella saannolla menetelmillä, jotka esitetään kaaviossa O. Kaaviossa 0 kuvataan, että kaavan XXVI mukainen amidi saatetaan reagoimaan sopivan alkyyliklooriformiaatin tai anhydridijohdannaisen 15 kanssa käsittelemällä joko kaliumhydridillä tai natriumhydri-dillä, jolloin saadaan kaavan XXVII mukaista vastaavaa imidiä, joka pelkistetään natriumborohydridillä, jolloin saadaan kaavan XXVII mukaista vastaavaa 2-hydroksiyhdistettä. Kuten ammattimiehet tietävät, on typen kaavan XXVII mukaisen 20 imidin N-l:ssä on oltava suojattu (katso kaavan XXVII ryhmää R17) kunnes C-2-karbonyyli on pelkistetty. Edullisia suojaryh-: miä ovat mm. fenyyli, 4-nitrofenyyli ja t-butyylifluore- .,,,: nyy lime tyyli. Sitten kaavan XXVIII mukaisesta 2-hydroksiyh- » · tti-. disteestä poistetaan suojaus erilaisilla ammattimiesten ... 25 tuntemilla menetelmillä, jolloin saadaan kaavan XXIX mukaista vastaavaa 1,2-dehydroyhdistettä, joka voidaan pelkistää nat- • · ·

’·**' riumborohydridillä, jolloin saadaan vastaavaa kaavan XXIII

* t · V * mukaista 2-desoksomarkfortiinia, kaavan XXV mukaista 14- hydroksi-2-desoksoparaherkvamidi B:tä ja 14-hydroksimarkfor- >,· 30 tiini A: ta 40-7 0-prosenttisella kokonaissaannolla. Kun R17 on : : t-butyyli, lyhyempi tapa kaavan XXIII mukaisen 2-desokso- . markfortiinin, kaavan XXV mukaisten 14-hydroksi-2-desokso- 1,7 paraherkvamidi B:n ja 14-hydroksimarkfortiini A:n saamiseksi • » *; on saattaa kaavan XXVII mukainen imidi reagoimaan natrium- : 35 borohydridin kanssa kuumentaen palautus jäähdyttäen glymissä tai diglymissä.

11 115912

Kaavan XXXI mukainen 2-alkyyli-2-desoksoparaherkvamidi A saadaan kaavan XXIX mukaisesta vastaavasta 1,2-dehydromarkfor-tiini A:sta saattamalla ammattimiesten tuntemalla tavalla reagoimaan sopivan alkyylilitiumreagenssin kanssa.

5 ANTIPARASIITTISET YHDISTEET viittaavat kaavan XXI mukaisiin 2-deokso-14-hydroksiyhdisteisiin, kaavan XXIII mukaiseen 2-desoksomarkfortiiniin, kaavan XXV mukaiseen 14-hydroksi-2-de-soksoparaherkvamidi B:hen, kaavan XXIX mukaiseen 1,2-dehydro-10 yhdisteeseen ja kaavan XXXI mukaiseen 2-desoksoyhdisteeseen ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviin suoloihin kun sellaisia esiintyy, ja nämä yhdisteet luetaan ANTIPARASIITTISIIN YHDISTEISIIN.

15 ANTIPARASIITTISET YHDISTEET ovat amiineja ja muodostavat sellaisina happoadditiosuoloja saatettaessa reagoimaan riittävän vahvojen happojen kanssa. Farmaseuttisesti hyväksyttäviin suoloihin luetaan sekä epäorgaanisten että orgaanisten happojen suoloja. Farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat ovat 20 edullisia vastaaviin vapaisiin amiineihin verrattuna, koska ne tuottavat yhdisteitä, jotka ovat vesiliukoisempia ja : kiteisempiä. Edullisia farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja

• I

.,..; ovat mm. seuraavien happojen suolat: metaanisulfoni-, suola-, bromi vety-, rikki-, fosfori-, typpi-, bentsoe-, sitruuna-, * · ... 25 viini-, fumaari-, maleiinihappo, CH3-(CH2)n-COOH, jossa n on 0-4, HOOC-(CH2) n-COOH, jossa n on edellä määritelty.

• * t * * · '·’ ‘ ANTIPARASIITTISET YHDISTEET ovat amiineja, ja saattamalla niitä reagoimaan perhappojen kuten m-klooriperbentsoehapon ·,* · 30 kanssa saadaan ammattimiesten tuntemalla tavalla vastaavia 1 4 4 : ; 12a-N-oksideja.

• i t t i

Keksinnön mukaiset ANTIPARASIITTISET YHDISTEET ovat odotta- • t ;* mattoman tehokkaita antiparasiittisia aineita sisä- ja ulko- -/·/> 35 loisia, erityisesti loismatoja ja niveljalkaisia vastaan, ; ; jotka aiheuttavat ihmisillä, eläimillä ja kasveilla lukuisia loissairauksia.

12 115912

Loissairauksia voivat aiheuttaa joko sisäloiset tai ulkoloi-set. Sisäloiset ovat niitä loisia, jotka elävät isännän kehon sisäpuolella, joko elimen (kuten mahan, keuhkojen, sydämen, suolien ja vastaavien) sisällä tai yksinkertaisesti ihon 5 alla. Ulkoloiset ovat niitä loisia, jotka elävät isännän ulkopinnalla, mutta silti imevät ravinteita isännästä.

Sisäloissairaudet, joita kutsutaan yleisesti loismatotau-diksi, johtuvat isännän tulehduksesta, jota aiheuttavat 10 parasiittimadot, jotka tunnetaan loismatoina. Loismatotauti on yleinen ja vakava maailmanlaajuinen taloudellinen ongelma johtuen kotieläimiksi otettujen eläinten kuten sikojen, lampaiden, hevosten, nautojen, vuohien, koirien, kissojen ja siipikarjan infektiosta. Useita näistä infektioista aiheuttaa 15 sukkulamadoiksi kutsuttujen matojen ryhmä, joka aiheuttaa eri eläinlajeilla sairauksia kautta maailman. Nämä sairaudet ovat usein vakavia, ja voivat aiheuttaa infektoidun eläimen kuoleman. Yleisimmät sukkulamatosukuja, jotka infektoivat edellä mainittuja eläimiä, ovat Haemonchus, Trichostrongylus, 20 Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum,

Oesophagostomum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, .·. : Trichonema, Dictyocaulus, Capillaria, Heterakis, Toxocara,

Ascaridia, Oxyuris, Ancylostoma, Uncinaria, Toxascaris ja . Parascaris. Useat loiset ovat lajispesifisiä (infektoivat ... 25 vain yhtä isäntää) , ja useimmilla on myös edullinen infektio- kohta eläimen sisällä. Täten Haemonchus ja Ostertagia infek- • · · ***** toivat pääasiassa mahaa, kun taas Nematodirus ja Cooperia V ' vaivaavat enimmäkseen suolistoa. Muut loiset pysyvät mielel lään sydämessä, silmissä, keuhkoissa, verisuonissa ja vastaani | 30 vissa, kun taas edelleen muut ovat ihonalaisia loisia. Lois- matotauti voi johtaa heikkouteen, painonmenetykseen, ane- . miaan, sisäelimien vaurioitumiseen, vajaaruokintaan ja se voi • » » vaurioittaa muita elimiä. Hoitamattomina nämä sairaudet • · voivat johtaa eläimen kuolemaan.

: V: 35

Myös ulkoparasiittiniveljalkais-, kuten punkki-(tick), punkki-(mite) , täi-, tallikärpäs-, sarvikärpäs-, raatokärpäs-, kirppu- ja vastaavat infektiot ovat vakava ongelma. Näiden 13 115912 loisten aiheuttamasta infektiosta seuraa verenmenetystä, ihovaurioita, ja ne voivat häiritä normaaleja syömistapoja aiheuttaen täten painonmenetystä. Näistä infektioista voi myös olla seurauksena vakavien sairauksien, kuten aivojen ja sel-5 käytimen tulehdus, anaplasmoosin, sikarokon (swine pox), ja vastaavien leviäminen, jotka sairaudet voivat olla kohtalokkaita .

Eläimillä voi olla samanaikaisesti useiden syöpäläisiäjien 10 aiheuttamia infektioita, koska yhden syöpäläisen aiheuttama infektio voi heikentää eläintä ja tehdä sen alttiimmaksi toisen syöpäläislajin aiheuttamalle infektiolle. Täten yhdiste, jolla on laaja aktiivisuuskinjo, on näiden sairauksien hoidossa erityisen edullinen. ANTIPARASIITTISILLA YHDISTEILLÄ 15 on odottamattoman hyvä aktiivisuus näitä loisia vastaan, ja lisäksi ne ovat aktiivisia myös Dirofilariaa vastaan koirilla, Nematospiroidesia ja Syphaciaa vastaan jyrsijöillä, purevia hyönteisiä ja vaeltavia kaksisiipistoukkia kuten Hypoderma sp.rtä vastaan naudoilla, ja Gastrophilusia vastaan 20 hevosilla.

.·. : ANTI PARAS II TT IS ET YHDISTEET ovat myös käyttökelpoisia sisä- t<(j. ja ulkoloisia vastaan, jotka aiheuttavat loissairauksia ihmi- . sillä. Esimerkkejä sellaisista sisäloisista, jotka infektoi- • •iti • » ti> 25 vat ihmistä, ovat mm. ruoansulatuskanavan loiset, jotka ovat • * sukua Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichi- * * · neliä, Capillaria, Trichuris, Enterobius ja vastaavia. Muita V : sisäloisia, jotka infektoivat ihmisiä, esiintyy veressä tai muissa elimissä. Esimerkkejä sellaisista loisista ovat rihma-t : : 3 0 madot Wucheria, Brugia, Onchocerca ja vastaavat, samoin kuin suolistomatojen Strongylides ja Trichinella suolistonulkoiset . vaiheet. Ulkoloisia, jotka esiintyvät ihmisen syöpäläisinä, ovat mm. niveljalkaiset kuten punkit (ticks), kirput, punkit

• I

*;·’ (Acarica) , täit ja vastaavat ja, kuten kotieläimillä, näiden :V: 35 loisien aiheuttamista infektioista voi olla seurauksena vaka- vien ja jopa kohtalokkaiden sairauksien leviäminen. ANTIPA-RASIITTISET YHDISTEET ovat aktiivisia näitä sisä- ja ulkoloisia vastaan ja lisäksi ne ovat myös aktiivisia purevia hyön 14 115912 teisiä ja ihmisiä vaivaavia muita kaksisiipisiä syöpäläisiä vastaan. Kun ANTIPARASIITTISIA YHDISTEITÄ annetaan oraalisesti tai parenteraalisesti, niitä annetaan annostelutasolla 0,05-20 mg/kg eläimen kehonpainoa.

5 ANTIPARASIITTISET YHDISTEET ovat myös käyttökelpoisia tavallisia kotitalouden syöpäläisiä kuten Blatella sp. : tä (torakka), Tineola sp.:tä (koi), Attagenus sp.:tä (carpet beetle), Musca domesticaa (huonekärpänen) ja Solenopsis Invictaa 10 (imported fire ant) vastaan.

Edelleen ANTIPARASIITTISET YHDISTEET ovat käyttökelpoisia maatalouden syöpäläisiä kuten lehtitäitä (Acyrthiosiphon sp.), heinäsirkkoja ja puuvillakärsäkkäitä vastaan samoin 15 kuin hyönteissyöpäläisiä vastaan, jotka tuhoavat varastoituja viljoja, kuten Tribolium sp. , ja kasviskudoksella elävien hyönteisten epäkypsiä vaiheita vastaan. ANTIPARASIITTISET YHDISTEET ovat myös käyttökelpoisia sukkulamatomyrkkyinä kontrolloimaan maaperän sukkulamatoja, jotka voivat olla 20 maatalouden kannalta tärkeitä.

.·, : Antiparasiittisena aineena eläimillä käyttöä varten ANTIPA- RASIITTISIA YHDISTEITÄ voidaan antaa sisäisesti joko oraali- • · . sesti tai injektiolla, tai paikallisesti nesteeseen upotta- ,,, 25 maila tai shampoona.

• $ • » V·* Oraalisesti annettaessa ANTIPARASIITTISIA YHDISTEITÄ voidaan V · antaa kapseli-, tabletti- tai upotusbolusmuodossa, tai vaih toehtoisesti ne voidaan sekoittaa eläinrehuun. Kapselit, tab-: : : 30 letit ja upotusbolukset koostuvat aktiivisesta yhdisteestä * « ♦ a yhdistelmänä sopivan väliainevehikkelin kuten tärkkelyksen, ,* , talkin, magnesiumstearaatin tai dikalsiumfosfaatin kanssa.

• > I

h.‘ Nämä yksikköannostelumuodot valmistetaan sekoittamalla aktii- i » visen valmistusaineen perusteellisesti sopivien hienoksi 35 jauhettujen inerttien valmistusaineiden, mm. laimennusainei-den, täyteaineiden, hajoamista edistävien aineiden, suspen- » · < doimisaineiden ja/tai sideaineiden kanssa siten, että saadaan tasaista liuosta tai suspensiota. Inertti valmistusaine on 15 115912 sellaista, ettei se reagoi ANTIPARASIITTISTEN YHDISTEIDEN kanssa ja on ei-toksista hoidettavalle eläimelle. Sopivia inerttejä valmistusaineita ovat mm. tärkkelys, laktoosi, talkki, magnesiumstearaatti, kasviskumit ja -öljyt ja vastaa-5 vat. Nämä formulaatiot voivat sisältää laajalti vaihtelevan määrän aktiivisia ja ei-aktiivisia valmistusaineita riippuen lukuisista tekijöistä kuten hoidettavan eläinlajin koosta ja tyypistä ja infektion tyypistä ja vakavuudesta. Aktiivista valmistusainetta voidaan myös antaa rehulisänä yksinkertai-10 sesti sekoittamalla ANTIPARASIITTISET YHDISTEET ruoan kanssa tai lisäämällä yhdistettä rehun pinnalle. Vaihtoehtoisesti aktiivinen valmistusaine voidaan sekoittaa inertin väliaineen kanssa, ja tulokseksi saatu koostumus voidaan joko sekoittaa rehun kanssa, tai sitä voidaan syöttää suoraan eläimelle. 15 Sopivia inerttejä väliaineita ovat mm. maissijauho, sitrus-jauho, fermentointitähteet, soijarouhe, kuivatut jyvät ja vastaavat. Aktiiviset valmistusaineet sekoitetaan perusteellisesti näiden inerttien väliaineiden kanssa jauhamalla, sekoittamalla, jauhamalla myllyssä tai sekoittamalla rummussa 20 siten, että lopullinen koostumus sisältää 0,001-5,0 paino-% aktiivista valmistusainetta.

Vaihtoehtoisesti ANTIPARASIITTISIA YHDISTEITÄ voidaan antaa parenteraalisesti injisoimalla formulaatiota, joka koostuu ,,, 25 aktiivisesta valmistusaineesta liuotettuna inerttiin neste- mäiseen väliaineeseen. Injektio voi olla joko lihaksensisäi- '·*·' nen, pötsinsisäinen, henki torvensisäinen tai ihonalainen.

V * Injisoitava formulaatio koostuu aktiivisesta valmistusai neesta, joka on sekoitettu sopivan inertin nestemäisen I t jj 30 väliaineen kanssa. Hyväksyttäviä nestemäisiä väliaineita ovat mm. kasvisöljyt kuten maapähkinäöljy, puuvillansiemenöljy, , seesamiöljy ja vastaavat, samoin kuin orgaaniset liuottimet !,.* kuten solketaali, glyserolif ormaali ja vastaavat. Eräänä • t vaihtoehtona voidaan käyttää myös vesipohjaisia parenteraali- : : : 35 siä formulaatioita. Kasvisöljyt ovat edullisia nestemäisiä väliaineita. Formulaatiot valmistetaan liuottamalla tai sus-pendoimalla aktiivisen valmistusaineen nestemäiseen väliai- 1159 ί 2 16 neeseen siten, että lopullinen formulaatio sisältää 0,005-20 paino-% aktiivista valmistusainetta.

ANTIPARASIITTISTEN YHDISTEIDEN paikallinen anto on mahdollis-5 ta käyttämällä nesteupotusta tai shampoota, joka sisältää ANTIPARASIITTISIA YHDISTEITÄ vesiliuoksena tai -suspensiona. Nämä formulaatiot sisältävät yleensä suspendoimisainetta kuten bentoniittia, ja normaalisti ne sisältävät myös vaah-donestoainetta. Hyväksyttäviä ovat formulaatiot, jotka sisäl-10 tävät 0,005-20 paino-% aktiivista valmistusainetta. Edullisia formulaatioita ovat ne, jotka sisältävät 0,5-5 paino-% ANTIPARASIITTISIA YHDISTEITÄ.

ANTIPARASIITTISET YHDISTEET ovat pääasiassa käyttökelpoisia 15 antiparasiittisina aineina loismatotaudin hoitoon ja/tai en-naltaestoon kotieläimillä kuten naudoilla, lampailla, hevosilla, koirilla, kissoilla, vuohilla, sioilla ja siipikarjalla. Ne ovat myös käyttökelpoisia estettäessä ja hoidettaessa näiden eläinten loisinfektioita ulkoloisilla kuten punkeilla 20 (ticks), punkeilla (mites), täillä, kärpäsillä ja vastaavilla. Ne ovat myös tehokkaita ihmisten loisinfektioiden

: hoidossa. Sellaisten infektioiden hoidossa ANTIPARASIITTISIA

• · ftit; YHDISTEITÄ voidaan antaa yksittäin tai yhdistelmänä keskenään . tai muiden ei-läheisten antiparasiittisten aineiden kanssa.

• · · * * ,,, 2 5 Parhaisiin tuloksiin vaadittava ANTI PARAS II TT IS TEN YHDISTEI- DEN annostelu riippuu useista tekijöistä, kuten eläimen la- '·’·* jista ja koosta, infektion tyypistä ja vakavuudesta, antome-

V : netelmästä, ja erityisistä käytetyistä ANTIPARASIITTISISTA

YHDEISTEISTÄ. Yleensä ANTIPARASIITTISTEN YHDISTEIDEN oraali- j j .* 30 nen anto annostasolla 0,005-50 mg/kg eläimen kehonpainoa joko : yhtenä ainoana annoksena tai useina annoksina muutaman päivän

. välein antaa hyvät tulokset. Yhden ANTIPARASIITTISISTA

h,' YHDISTEISTÄ yksi ainoa anto antaa normaalisti erinomaisen * * *·;·* kontrollin, mutta voidaan kuitenkin antaa toistoannoksia uu- :Y: 35 delleeninfektoitumisen estämiseksi tai loislajeja varten, jotka ovat epätavallisen kestäviä. Tekniikat ANTIPARASIITTIS-TEN YHDISTEIDEN antamiseksi eläimille ovat eläinlääketieteen ammattimiesten tuntemia.

17 115912 ANTIPARASIITTISIA YHDISTEITÄ voidaan myös käyttää torjuttaessa maataloussyöpäläisiä, jotka tuhoavat satokasveja joko pellolla tai varastoitaessa. ANTIPARASIITTISIA YHDISTEITÄ anne-5 taan sellaisiin käyttöihin suihkeina, pölyinä, emulsioina ja vastaavina joko kasvaviin kasveihin tai kerättyihin satoihin. Tekniikat ANTIPARASIITTISTEN YHDISTEIDEN antamiseksi tällä tavalla ovat maatalousalojen ammattimiesten tuntemia.

10 Annon täsmällinen annostelu ja taajuus riippuu erityisistä käytetyistä ANTIPARASIITTISISTA YHDISTEISTÄ, erityisestä hoidettavasta tilasta, hoidettavan tilan vakavuudesta, erityisen potilaan iästä, painosta, yleisestä terveydentilasta, muusta yksilön mahdollisesti saamasta lääkinnästä, kuten ammattimie- 15 het tietävät, ja se voidaan määrittää tarkemmin mittaamalla ANTIPARASIITTISTEN YHDISTEIDEN veritason tai konsentraation potilaan veressä ja/tai potilaan vasteen erityiseen hoidettavaan tilaan.

20 Määritelmiä ja sopimuksia

Alla olevat määritelmät ja selitykset ovat käsitteille, joita : käytetään koko tässä julkaisussa, mukaan lukien sekä selityk- sen että patenttivaatimukset.

25 I. Kaavojen sopimukset ja muuttujien määritelmät • ·

Kemialliset kaavat, jotka edustavat erilaisia yhdisteitä tai molekyyli fragmentteja selityksessä ja patenttivaatimuksissa, » » » ’ voivat sisältää nimenomaisesti määriteltyjen rakenneominais- piirteiden lisäksi muuttujasubstituentteja. Nämä muuttaja-l 30 substituentit ilmaistaan kirjaimella tai kirjaimella, jota : seuraa numeerinen alaindeksi, esimerkiksi, "Z3" tai "RV1, jos- , sa "i" on kokonaisluku. Nämä muuttujasubstituentit ovat joko yhdenarvoisia tai kahdenarvoisia, ts. ne edustavat ryhmää, ·;·' joka on kiinnittynyt kaavaan yhdellä tai kahdella kemialli- ::: 35 sella sidoksella. Esimerkiksi ryhmä Zx edustaisi kahdenar- voista muuttujaa jos se olisi kiinnittynyt kaavaan CH3-C(=Z1)H. Ryhmät R. ja R_. edustaisivat yhdenarvoisia muuttujasubstituentteja jos ne olisivat kiinnittyneet kaavaan CH3- is 115912 CH,-C (R.) (R.)-H. Kun kemialliset kaavat on piirretty lineaari-sesti, kuten edellä olevat, sulkujen sisällä olevat muuttuja-substituentit ovat liittyneet atomiin, joka on välittömästi vasemmalle sulkujen sisällä olevasta muuttujasubstituentista.

5 Kun kaksi tai useampia peräkkäisiä muuttujasubstituentteja on suljettu sulkuihin, kukin peräkkäisistä muuttujasubstituen-teista on kiinnittynyt välittömästi vasemmalla olevaan edeltävään atomiin, joka ei ole sulkujen sisällä. Täten edellä olevassa kaavassa sekä R. että Rd ovat kiinnittyneet edeltä-10 vään hiiliatomiin. Myös, millä hyvänsä molekyylillä, jolla on vakiintunut hiiliatominumerointijärjestelmä, kuten steroideilla, nämä hiiliatomit merkitään Cl, jossa "i" on hiiliatomin numeroa vastaava kokonaisluku. Esimerkiksi C6 edustaa 6-asemaa tai hiiliatomin numeroa steroidiytimessä, kuten ste-15 roidikemian ammattimiehet perinteisesti merkitsevät. Samoin käsite "R6" edustaa (joko yhdenarvoista tai kahdenarvoista) muuttujasubstituenttia C6-asemassa.

Lineaarisesti piirretyt kemialliset kaavat tai niiden osat 20 edustavat suorassa ketjussa olevia atomeja. Symboli "-" yleensä edustaa kahden ketjussa olevan atomin välistä si-. , : dosta. Täten CH3-0-CH2-CH (R.) -CH3 edustaa 2-substituoitu-l-me- _ toksipropaaniyhdistettä. Samalla lailla symboli " = " edustaa kaksoissidosta, esimerkiksi CH2=C (Ri) -0-CH3, ja symboli " = " ,,, 25 edustaa kolmoissidosta, esimerkiksi, HC=C-CH (Ri) -CH2-CH3. Kar- bonyyliryhmät esitetään jommalla kummalla kahdesta tavasta: -CO- tai -C(=0)-, jolloin aikaisempi on yksinkertaisuuden V * vuoksi edullinen.

j j ; 30 Syklisten rengasyhdisteiden tai molekyylitragmenttien kemial- liset kaavat voidaan esittää lineaarisesti. Täten yhdiste 4-. kloori-2-metyylipyridiini voidaan esittää lineaarisesti kaa- valla N*=C (CH3)-CH=CC1-CH=C*H sopimuksella, että atomit, ’·;·* jotka on merkitty tähdellä (*), ovat liittyneet yhteen, jol- : 35 loin tuloksena muodostuu rengas. Samoin syklinen molekyyli- fragmentti, 4-(etyyli)-1-piperatsinyyli, voidaan esittää kaavalla -N*- (CH2)2-N(C2H5) -CH2-C*H2.

19 115912

Minkä hyvänsä tässä olevan yhdisteen jäykkä syklinen (rengas) rakenne määrittelee orientaation suhteessa renkaan tasoon substituenteille, jotka ovat kiinnittyneet jäykän syklisen yhdisteen kuhunkin hiiliatomiin. Tyydyttyneillä yhdisteillä, 5 joissa on kaksi substituenttia kiinnittyneinä hiiliatomiin, joka on osa syklistä järjestelmää, -C(XJ (X2)-, kaksi substituenttia voivat olla joko aksiaalisessa tai ekvatoriaalisessa asemassa suhteessa renkaaseen, ja voivat muuttua aksiaali-sen/ekvatoriaalisen välillä. Kahden substituentin asema 10 suhteessa renkaaseen ja toisiinsa pysyy kuitenkin kiinteänä. Vaikka kumpikin substituentti voi aika ajoin olla renkaan tasossa (ekvatoriaalisesti) tason yläpuolella tai alapuolella olon sijasta (aksiaalisesti) , toinen substituentti on aina toisen yläpuolella. Sellaisia yhdisteitä kuvaavissa kemialli-15 sissa rakennekaavoissa substituentin (Χ2) , joka on toisen substituentin (X2) alapuolella, tunnistetaan olevan alfa(a) -konfiguraatiossa, ja tunnistetaan murto-, katko- tai piste- viivakiinnityksellä hiiliatomiin, ts. symbolilla "---” tai

Vastaavan substituentin, joka on kiinnittynyt toisen 20 (X1) yläpuolelle (X2) , tunnistetaan olevan beta(S) -konfigu- raatiossa, ja tunnistetaan jatkuvalla viivakiinnityksellä .·. : hiiliatomiin.

* » * • · . Kun muuttujasubstituentti on kahdenarvoinen, valenssit voi- ... 25 daan ottaa yhdessä ja/tai erikseen muuttujan määritelmässä.

• I

Esimerkiksi muuttuja Rif joka on kiinnittynyt hiiliatomiin ’·*.* kuten -(2(=11)-, voisi olla kahdenarvoinen ja olla määritelty ·.·: oksoksi (muodostaen täten karbonyyliryhmän (-CO-) tai kahdek si erillään kiinnittyneeksi yhdenarvoiseksi muuttujasubsti-: : : 30 tuentiksi α-ff^ ja β-R. k. Kun kahdenarvoisen muuttujan, Rif on määritelty koostuvan kahdesta yhdenarvoisesta muuttujasubsti-. tuentista, kahdenarvoisen muuttujan määrittelyyn käytetty so- · pimus on muotoa "α-R.^:β-R. k" tai jotakin sen muunnelmaa. Sii- • » *···’ nä tapauksessa sekä a-R^ että β-R. k ovat kiinnittyneet hiili- :Y; 35 atomiin, jolloin saadaan -C(a-R^) (β-R^J - · Esimerkiksi kun kahdenarvoisen muuttujan R6, -C(=R6)- määritellään koostuvan kahdesta yhdenarvoisesta muuttujasubstituentista, kaksi yh-denarvoista muuttujasubstituenttia ovat a-R6_x: β-Rj.,, ··· a- 20 115912 R69:p-R610 ja niin edelleen, jolloin saadaan -C (α-Rj.J ^-R6_2) -, ... -C (a-R6_9) (p-R6.10) -, ja niin edelleen. Samoin kahdenarvoisel-la muuttujalla Ru, -C(=Ru)-# kaksi yhdenarvoista muuttuja-substituenttia ovat a-R11_1: β-R^ 2. Rengassubstituentilla, jolla 5 ei esiinny erillisiä a- ja β-orientaatioita (johtuen esimerkiksi hiili-hiili -kaksoissidoksen läsnäolosta renkaassa), ja substituentilla, joka on kiinnittynyt hiiliatomiin, joka ei ole renkaan osa, käytetään edelleen edellä olevaa sopimusta, mutta a- ja β-merkinnät jätetään pois.

10

Aivan kuten kahdenarvoinen muuttuja voidaan määritellä kahdeksi erilliseksi yhdenarvoiseksi muuttujasubstituentiksi, voidaan kaksi erillistä yhdenarvoista muuttujasubstituenttia määritellä otettavaksi yhdessä muodostamaan kahdenarvoisen 15 muuttujan. Esimerkiksi kaavassa -Cx (RJ H-C2 (R5) H- (C2 ja C2 määrittävät mielivaltaisesti ensimmäistä ja toista hiiliatomia, vastaavasti) R. ja Rj voidaan määritellä otettavaksi yhdessä muodostamaan (1) toisen sidoksen Cx:n ja C2:n välille tai (2) kahdenarvoiseksi ryhmäksi kuten oksa (-0-), ja täten kaava 20 kuvaa epoksidia. Kun R. ja R. otetaan yhdessä muodostamaan monimutkaisemman kokonaisuuden, kuten ryhmän -X-Y-, niin ko-, , : konaisuuden orientaatio on sellainen, että Cx edellä olevassa kaavassa on kiinnittynyt X:ään ja C2 on kiinnittynyt Y:hyn. Täten merkintä "... RA ja Rd otetaan yhdessä muodostamaan ryh- ,,, 25 män -CH2-CH2-0-C0- ..." tarkoittaa sopimuksella laktonia, jossa karbonyyli on kiinnittynyt C2:een. Kuitenkin merkittäessä "... Rj ja Ra otetaan yhdessä muodostamaan ryhmän -C0-0-CH2-CH2-" V : sopimus tarkoittaa laktonia, jossa karbonyyli on liittynyt C1: een.

i.i : 30 ; Muuttujasubstituenttien hiiliatomipitoisuus ilmaistaan toi- . sella kahdesta tavasta. Ensimmäisessä menetelmässä käytetään etuliitettä koko muuttujalle kuten "C^-", jossa sekä "1"

I

että "4" ovat kokonaislukuja, jotka edustavat muuttujassa : 35 olevien hiiliatomien minimi- ja maksimilukumäärää. Etuliite erotetaan muuttujasta viivalla. Esimerkiksi, "C^-alkyyli" edustaa alkyyliä, jossa on 1-4 hiiliatomia, (mukaan lukien sen isomeerisiä muotoja ellei nimenomaisesti esitetä toisin).

21 115912

Kun tämä yksi ainoa liite ilmoitetaan, liite ilmoittaa määritellyn muuttujan koko hiiliatomipitoisuuden. Täten C24-alkoksikarbonyyli kuvaa ryhmää CH3-(CH2) n-0-C0-, jossa n on 0, 1 tai 2. Toisessa menetelmässä ilmaistaan vain määritelmän 5 kunkin osan hiiliatomipitoisuus erikseen sulkemalla "Ci;j" -merkinnän sulkuihin ja sijoittamalla sen välittömästi (ei väliviivaa) ennen määriteltävää määritelmän osaa. Tällä valinnaisella sopimuksella (03_3)alkoksikarbonyylillä on sama merkitys kuin C2_4-alkoksikarbonyylillä, koska "Cl_3" viittaa 10 vain alkoksiryhmän hiiliatomipitoisuuteen. Samalla lailla vaikka sekä C2_6-alkoksialkyyli että (C3 3) alkoksi (03_3) alkyyli määrittelevät alkoksialkyyliryhmiä, joissa on 2-6 hiiliatomia, kaksi määritelmää poikkeavat toisistaan, koska aikaisempi määritelmä sallii joko alkoksi- tai alkyyliosan yksinään 15 sisältää 4 tai 5 hiiliatomia, kun taas viimeksi mainittu määritelmä rajoittaa kummankin näistä ryhmistä 3 hiiliatomiin.

Kun patenttivaatimukset sisältävät melko monimutkaisen (syklisen) substituentin, tuon erityisen substituentin nimeavän/-20 sitä merkitsevän fraasin lopussa on merkintä (suluissa), joka vastaa samaa nimeä/merkintää yhdessä kaavioista, jossa esite- : tään myös tuon erityisen substituentin kemiallinen rakenne- • · ... : kaava.

» ,,, 2 5 II. Määritelmiä • · ANTI PARAS II TT IS ET YHDISTEET viittaavat seuraaviin ja sisältä- * « * vät ne: t « * V * 2-deokso-14-hydroksiyhdisteet XXI, 2-deoksoyhdisteet XXIII, |J j 30 14-hydroksi-2-deoksoparaherkvamidiyhdisteet XXV, 1,2-dehydroyhdiste XXIX ja . 2-alkyyli-2-desoksoyhdiste XXXI, ja niiden farmaseuttisesti * .· » hyväksyttävät suolat mikäli sellaisia esiintyy.

i » : : 35 Kaikki lämpötilat ovat yksikössä °C.

THF tarkoittaa tetrahydrofuraania.

22 115912

Suolaliuos tarkoittaa kylläistä natriumkloridin vesiliuosta.

Kromatografia (pylväs- ja flash-kromatografia) tarkoittaa yhdisteiden puhdistusta/erotusta ilmaistuna muodossa (kantaja; 5 eluentti). Ymmärretään, että sopivat fraktiot yhdistetään ja konsentroidaan, jolloin saadaan haluttu/halutut yhdiste(et).

^-NMR tarkoittaa ydin(protoni)magneettista resonanssispekt-roskopiaa, kemialliset siirtymät ilmaistaan yksikössä ppm (5) 10 alakenttään tetrametyylisilaanista.

MS viittaa massaspektrometriaan ilmaistuna m/e-, mz- tai mas-sa/varaus-yksikkönä. [M+H]+ viittaa emäyhdisteen plus vety- atomin positiiviseen ioniin. EI tarkoittaa "electron impact". 15 CI tarkoittaa kemiallista ionisointia. FAB tarkoittaa "fast atom bombardment".

HRMS tarkoittaa "high resolution mass spectrometry".

20 Farmaseuttisesti hyväksyttävä tarkoittaa niitä ominaisuuksia ja/tai aineita, jotka ovat potilaalle hyväksyttäviä farmako-logiselta/toksikologiselta kannalta ja valmistavalle farma- » · ; seuttiselle kemistille fysikaaliselta/kemialliselta kannalta * t tiii· koostumuksen, formuloinnin, stabiilisuuden, potilaan hyväk- ... 25 synnän ja hyötyosuuden suhteen.

t I

» I »

Farmaseuttisesti hyväksyttäviä anionisuoloja ovat mm. seuraa- • * · *·' * vien happojen suolat: metaanisulfoni-, suola-, bromivety-, rikki-, fosfori-, typpi-, bentsoe-, sitruuna-, viini-, fumaa-·,; ; 30 ri-, maleiinihappo, CH3-(CH2) n-COOH, jossa n on 0-4, HOOC- ; (CH2) n-COOH, jossa n on edellä määritelty.

» > »

Liuotinpareja käytettäessä käytetyt liuotinsuhteet ovat tila-

* I

* » vuus/tilavuus (tilavuus/tilavuus) .

35 : ; Kun käytetään kiinteän aineen liukoisuutta liuottimeen, kiin- teä/liuotin -suhde on paino/tilavuus (paino/tilavuus).

23 115912

Esimerkit

Ilman lisävalmistelua uskotaan, että ammattimies voi edellä olevaa kuvausta käyttäen toteuttaa keksintöä sen täydellisim-mässä laajuudessa. Seuraavissa yksityiskohtaisissa esimer-5 keissä kuvataan kuinka eri yhdisteet valmistetaan ja/tai kuinka keksinnön eri menetelmät suoritetaan, ja ne on tarkoitettu pelkästään kuvaaviksi eikä millään lailla edellä olevaa kuvausta rajoittaviksi. Ammattimiehet ymmärtävät heti sopivat vaihtelut menettelytavoista sekä reagoivien aineiden että 10 reaktio-olojen ja tekniikkojen suhteen.

Esimerkit 15-17 ja 32-40 kuvaavat keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistamista.

15 Menettelytapa n:o 1

Markfortiini A:n tuotanto ja eristys Siirrostusfermentointiprosessi: 20 Siirrostusfermentoinnit siirrostetaan käyttämällä isolaatin Penicillium sp. UC 7780 (NRRL 18887) nestetypessä varastoitu-.: ja agarkappaleita. Sulatetaan kolme kappaletta, ja käytetään .siirrosteena. GS-7 koostuu glukoosista ja puuvillansiemen-, jauhosta (myydään kauppanimellä "Pharmamedia" yhtiössä ,,, 25 Traders Protein, Procter & Gamble Oilseed Products Co.,

Memphis, TN, USA) . Väliainekomponenttien kostuttamiseen käy-tetään täydentämätöntä vesijohtovettä, ja väliaineen pH sää-V * detään ammoniumhydroksidilla pH-arvoon 7,2. Väliaine jaetaan jakolevyttömiin sulkukiertokolveihin tasolle 300 ml/1000-ml • \ 30 kolvi, ja steriloidaan autoklavoimalla 30 min ajan

121 °C:ssa. Kukin sulkukiertokolvi, joka sisältää 300 ml GS-7 . -väliainetta, siirrostetaan kolmella Penicillium sp. UC

7780:n (NRRL 18887) agarkappaleella, ja ravistellaan 36 * t tuntia pyörivällä ravisteli j alla nopeudella 250 r/min : : : 35 22 °C:ssa.

» I

24 115912

Sekundäärinen siirrostusferxnentointiprosessi:

Kypsiä siirrostusviljelmiä käytetään sekundäärisen väliaineen siirrosteena siirrostustasolla 0,3 %. Sekundäärinen väliaine koostuu glukoosimonohydraatista (yhtiö C.P.C. International 5 myy kauppanimellä Cerelose) 25 g, puuvillansiemenjauho (myydään kauppanimellä " Pharmamedia") 25 g, MgCl,.6H20: sta 329,8 mg, MnS04.H20: sta 11,4 mg, FeS04.7H20: sta 3,2 mg, Na2Mo04.2H20: sta 1,8 mg, CaCl2.2H20: sta 3 67,6 mg, NaCl: stä 84,2 mg, KC1: stä 5,8 mg, ZnS04.7H20: sta 0,1 mg, CoC12.6H20 : sta 10 0,1 mg, CuS04. 5H20:sta 3,1 mg ja silikonivaahdonestoaineesta (myydään kauppanimellä SAG-471 Antifoam) 0,5 ml/1 käänteisos-moosilaatuista vettä. Kostutetaan käänteisosmoosilaatuiseen veteen riittävästi väliainekomponentteja 200 l:aa varten sekundääristä siirrostusväliainetta riittävään tilavuuteen 15 190 1 250-litraisessa fermenttorissa. Formuloinnin jälkeen väliaineen pH säädetään NH4OH:lla pH-arvoon 7,2, ja sitten väliainetta steriloidaan 30 min ajan 121 °C:ssa. Siirrosteena käytetään kahta primäärisen siirrostusviljelmän sulkukier-toista kolvia siirrostustasolla 0,3 %. Sekundääristä siirros-20 tusviljelmää inkuboidaan 36 tuntia 22 °C:ssa ilmastuksella 125 slm, vastapaineessa 34,5 kPa (5 psia) ja pyöritysnopeu- : della 250 r/min.

• · ♦ • · « » t » * , Tuotantofermentointiprosessi: ... 25 Tuotantoväliaine koostuu sokerijuurikasmelassista 50 g, kala- ;·; jauhosta (myydään kauppanimellä Menhaden Select Fish Meal) • V » 16 g, hiivauutteesta (myydään kauppanimellä Fidco) 10 g, V * MgCl2. 6H20:sta 329,8 mg, MnS04.H20: sta 11,4 mg, FeS04.7H20: sta 3,29 mg, Na2Mo04.2H20: sta 1,8 mg, CaCl2.2H20: sta 367,6 mg, ; j .* 30 NaCl:stä 84,2 mg, KCl:stä 5,8 mg, ZnS04.7H20: sta 0,1 mg,

CoCl2.6H20: sta 0,1 mg, CuS04.5H20: sta 3,1 mg ja silikonivaah- / , donestoaineesta (myydään kauppanimellä SAG-471 Antifoam) • * 0,5 ml/l käänteisosmoosilaatuista vettä.

i t • » : : : 35 Kostutetaan käänteisosmoosilaatuiseen veteen riittävästi vä- ; liainekomponentteja 5000 1: aa varten väliainetta riittävään tilavuuteen 4700 1 5000-1:isessa fermenttorissa. Formuloinnin jälkeen väliaineen pH säädetään KOH:lla pH-arvoon 7,0, ja 25 115912 sitten väliainetta steriloidaan 30 min ajan 123 °C:ssa. Kypsää sekundääristä siirrostusviljelmää käytetään siirrosteena siirrostustasolla 1,0 %. Viljelmää inkuboidaan 96 tuntia 22 °C:ssa, ilmastuksella 2,500 slm, vastapaineessa 34,5 kPa 5 (5 psia) ja nopeudella 250 r/min.

Markfortiini A:tn eristys: 4900-1:inen fermentointitilavuus kerätään ajamalla suurileik-kauksisen sekoittimen kautta keräysastiaan. Siirron jälkeen 10 lisätään 4 paino/tilavuus-% piimaata ja 1/2 tilavuutta mety-leenikloridia. Sitten keräysliuos suodatetaan suodatinpuris-tinta käyttäen. Suodatuskakku pestään kahdesti 10-prosentti-sella tilavuudella metyleenikloridia.

15 Saatu suodos dekantoidaan vesifaasin poistamiseksi. Sitten jäljelle jäävä tuoterikas metyleenikloridifaasi konsentroidaan tilavuuteen 44 1. Sitten konsentraatti kiillotetaan käyttämällä 2O-prosenttista tiivistetilavuutta (9 1) metyleenikloridia ja piimaata suodattimena.

20 53 1:ista kiillotettua tiivistettä puhdistetaan edelleen : silikageelikromatografiällä ja kiteyttämällä markfortiini A:n • · erottamiseksi muista komponenteista.

t · 25 Ennen kromatograf iaa kiillotettu tiiviste jaetaan neljään

• I

• · I’; suunnilleen yhtä suureen osaan. Kukin osa kromatografoidaan * t * * * * * * vasta pakatulla kolonnilla, jonka halkaisija on 22,9 cm (9"), i » » ’·' ' ja joka on valmistettu 25 kgrsta kuivaa silikageeliä (kerros- tilavuus 59 1). Panostettuja kolonneja eluoidaan 120 1:11a ;,| > 30 10-prosenttista asetonia metyleenikloridissa, 120 1:11a 20- l prosenttista asetonia metyleenikloridissa, 120 1:11a 30- t*’ . prosenttista asetonia metyleenikloridissa, 160 1:11a 40-

* ' I

prosenttista asetonia metyleenikloridissa ja 130 1:11a aseto- * i nia keräten 30- ja 40-prosenttiset eluaatit 20 1: isinä frak-!(!3 5 tioina. Eluaatteja tarkkaillaan TLC:llä käyttäen esimerkiksi ; liuotinjärjestelmää, joka koostuu 6 %:ista isopropanolia ja • 0,3 %:ista ammoniumnhydroksidia metyleenikloridissa Whatman LK6DF-silikageelilevyjen kehittämiseksi. Markfortiini A-frak- 26 115912 tioita (jotka sisältävät pienen määrän markfortiini D:tä, joka kromatografoituu yhdessä D:n kanssa) kiteytetään asetonista. Sopivia fraktioita (40- - 100 1) konsentroidaan alennetussa paineessa tilavuuteen noin 5 1. Sitten liuos (tai 5 keveä suspensio) siirretään kiertohaihduttimeen, ja konsent-rointia jatketaan alennetussa paineessa. Konsentroinnin aikana lisätään useita 1 l:isia asetonieriä, kunnes metyleeni-kloridi on täysin korvattu. Tulokseksi saatua asetonisuspen-siota (tilavuus noin 1 1) pidetään yön yli jääkaapissa, ja 10 markfortiini A-kiteet kerätään ja pestään useita kertoja pienillä erillä kylmää asetonia, ja kuivataan tyhjössä. Sellaiset kiteet voivat olla kontaminoituneet usealla prosentilla markfortiini D:tä. Toistuvalla kiteytyksellä metyleeniklori-di/asetonista (korvaten metyleenikloridin kuvatulla tavalla) 15 saadaan puhdasta markfortiini A:ta.

Markfortiini D:n eristys: 4900 l:n fermentointitilavuus kerätään ajamalla suurileik-kauksisen sekoittimen kautta keräysastiaan. Siirron jälkeen 20 lisätään 4 paino/tilavuus-% piimaata ja 1/2 tilavuutta mety-leenikloridia. Sitten keräysliuos suodatetaan suodatinpuris-: tinta käyttäen. Suodatin pestään kahdesti 10 tilavuus-%: illa * i ,,,,,* metyleenikloridia.

• · M » · * 25 Saatu suodos dekantoidaan vesifaasin poistamiseksi. Sitten * » 1'[ jäljelle jäänyt runsastuotteinen metyleenikloridifaasi kon- '·’·* sentroidaan tilavuuteen 44 1. Sitten konsentraatti kiillote- V * taan käyttäen 20 % tiivisteen tilavuudesta (9 1) metyleeni kloridia ja piimaata suodattimena.

30 : · 53 1 kiillotettua konsentraattia puhdistetaan edelleen mark- ; fortiini A:n erottamiseksi muista komponenteista silikageeli- !,,* kromatograf iällä ja kiteyttämällä.

i * ! » 35 Kiillotettu konsentraatti jaetaan ennen kromatografiaa nel- ; jään suunnilleen yhtä suureen osaan. Kukin osa kromatograf oi- f * i daan vastapakatulla kolonnilla, jonka halkaisija on 22,9 cm (9"), ja joka on valmistettu 25 kg:stä kuivaa silikageeliä 27 115912 (kerrostilavuus 59 1). Ladatut kolonnit eluoidaan 120 1:11a 10-prosenttista asetonia metyleenikloridissa, 120 1:11a 20- prosenttista asetonia metyleenikloridissa, 120 l:illa 30-pro-senttista asetonia metyleenikloridissa, 160 1:11a 40-prosent-5 tista asetonia metyleenikloridissa, ja 130 1:11a asetonia keräten 30- ja 40-prosenttiset eluaatit 20-1:isinä fraktioina. Eluaatteja tarkkaillaan TLC:llä käyttäen esimerkiksi liuotinjärjestelmää, joka koostuu 6 %:ista isopropanolia ja 0,3 %:ista ammoniumhydroksidia metyleenikloridia Whatman 10 LK6DF -silikageelilevyjen kehittämiseksi. Konsentroidaan markfortiini A-fraktioita, jotka sisältävät markfortiini D:tä. 1 g tätä materiaalia liuotetaan muurahaishappoon (20 ml, 93 %) ja annetaan seistä 16 tuntia 20-25 °C:ssa.

Haihtuvat komponentit poistetaan alennetussa paineessa, minkä 15 jälkeen jäännös alistetaan silikageelikromatografiälle (1:20 MeOH:CH2Cl2) , jolloin saadaan markfortiini D:tä (100 mg) valkoisena kiinteänä aineena. Tuotteen rakenne voidaan varmistaa NMR-spektroskopialla ja massaspektrometrialla. HRMS (FAB) M/Z [M+H] laskettu C28H35N303+H: lie: 462,2756; mitattu: 462,2739.

20

Menettelytapa IA

: Markfortiini A:n ja C:n tuotanto ja eristys.

Primäärinen siirrostusfermentointiprosessi: _ . Siirrostusfermentoinnit siirrostetaan käyttämällä Penicillium ... 25 sp. UC 7780-isolaatin (NRRL 18887) agarpaloja, joita on säily lytetty nestetypessä. Sulatetaan kolme palasta, ja käytetään ’·'** siirrosteena 100 ml: aa varten GS-7-siirrostusväliainetta. GS- V ' 7 koostuu glukoosista ja puuvillansiemenjauheesta (myy kaup panimellä "Pharmamedia" yhtiö Traders Protein, Procter & 30 Gamble Oilseed Products Co., Memphis, TN, USA), joita kumpaa-; ; kin lisätään konsentraatioon 25 g/1 vesijohtovettä. Formu- . loinnin jälkeen GS-7:n pH säädetään pH-arvoon 7,2 käyttämällä NH4OH:ta. Väliainetta autoklavoidaan 30 min ajan 100-ml: isinä • * * *; * ’ tilavuuksina 500 ml:isissä väliseinättömissä fermentointi- : ; 35 astioissa. Steriiliä GS-7:ää siirrostetaan edellä kuvatulla tavalla, ja ravistellaan 35-58 tunnin ajan nopeudella 250 r/min 20 °C:ssa.

28 115912

Tuotantofermentointiprosessi (ravistelupullo): Käytetään kypsiä siirrostusviljelmiä tuotantoväliaineen siir-rosteena siirrostustasolla 1 %. Tuotantoväliaine koostuu glukoosista 45 g, entsymaattisesti sulatetusta kaseiinista (myy 5 kauppanimellä Peptonized Milk Nutrient yhtiö Sheffield Products, Norwich, N.Y., USA) 25 g, hiivauutteesta (myy kauppanimellä BACTO Yeast Extract Code: 0127 yhtiö Difco Laborato ries, Detroit, MI) 2,5 g litrassa vesijohtovettä. Formuloinnin jälkeen tuotantoväliaineen pH säädetään kaliumhydrok-10 sidia käyttämällä neutraaliin pH-arvoon 7,0. Sitten tätä väliainetta autoklavoidaan 30 min ajan 100-ml:isinä tilavuuksina 500-ml:isissä väliseinällisissä fermentointipulloissa. Steriiliä tuotantoväliainetta siirrostetaan edellä kuvatulla tavalla, ja ravistellaan 7-14 päivän ajan nopeudella 15 250 r/min 21 °C:ssa.

Tuotantofermentointiprosessi (Labraferm-tankit):

Kypsiä siirrostusviljelmiä käytetään steriilin tuotantoväliaineen siirrosteena siirrostustasolla 0,5 %. Tuotantoväliaine 20 on edellä kuvattua. pH säädetään neutraaliin pH-arvoon 7,0 KOH:ta käyttämällä, minkä jälkeen 10 1 tätä väliainetta auto-,: klavoidaan 90 min ajan 12 1 lisissä Labraferm-tankeissa (New >j<<; Brunswick Scientific Co., Inc.). Tankit siirrostetaan . siirrostustasolla 0,5 %, ja sekoitetaan 5-9 päivän ajan no- ... 25 peudella 500 r/min. lmavirtausnopeus pidetään välillä 10- » · 15 1/min.

f 4 t V * Markfortiini A:n ja Csn eristys:

Koko fermentointiliemi (35 1) maseroidaan alhaisessa nopeu-: : : 30 dessa suuressa kaupallisessa Waring-sekoittimessa, ja sekoi- tetaan sitten yhtä suuren tilavuuden kanssa metyleeniklori-, dia. Seosta säilytetään yön yli jääkaapissa, ja alistetaan sitten sentrifugoinnille emulsion hajottamiseksi. Tulokseksi > * saatu kirkas metyleenikloridikerros vedetään pois, ja haihdu-: ; : 35 tetaan alennetussa paineessa. Jäännöksen (37,4 g) konsentroi- ; tua liuosta metyleenikloridissa lisätään kolonniin, jossa on silikageelin (1 kg) suspensiota, joka on pakattu metyleeni-kloridiin. Pylvästä eluoidaan kasvavilla asetonikonsentraa- 29 115912 tioilla metyleenikloridissa (10, 20, 30, 40 ja 50 % aseto nia) . Fraktioita tarkkaillaan TLC:llä, ja haihdutetaan sopivat fraktiot, ja kiteytetään asetonista, jolloin saadaan markfortiini A:ta ja markfortiini C:tä.

5

Menettelytapa IB

Markfortiini A:n ja C:n tuotanto ja eristys Siirrostefermentointiprosessi:

Siirrostefermentoinnit siirrostetaan käyttämällä Penicillium 10 sp. UC 7780-isolaatin (NRRL 18887) agarpaloja, joita on säilytetty nestetypessä. Sulatetaan kolme palaa, ja käytetään siirrosteena 100 ml:lie GS-7-siirrosteväliainetta. GS-7 koostuu glukoosista ja puuvillansiemenjauhosta (myy kauppanimellä "Pharmamedia" yhtiö Traders Protein, Procter & Gamble Oilseed 15 Products Co., Memphis, TN, USA), joita kumpaakin lisätään konsentraatio 25 g/1 vesijohtovettä. Formuloinnin jälkeen GS-7:n pH säädetään pH-arvoon 7,2 NH4OH:ta käyttämällä. Väliainetta autoklavoidaan 30 min ajan 100 ml:isinä tilavuuksina 500 ml lisissä väliseinättömissä fermentointipulloissa. Ste-20 rilliä GS-7:ää siirrostetaan edellä kuvatulla tavalla, ja ravistellaan 35-58 tunnin ajan nopeudella 250 r/min 25 °C:ssa.

iii<; Tuotantofermentointiprosessi (ravistelupullot) : . Käytetään kypsiä siirrosteviljemiä tuotantoväliaineen siir- ... 25 rosteena siirrostustasolla 1 %. Tuotantoväliaine koostuu glu- • » ';·· koosista 20 g, glyserolista 15 ml, puuvillansiemenjauhosta (myy kauppanimellä "Pharmamedia" yhtiö Traders Protein, V ’ Procter & Gamble Oilseed Products Co., Memphis, TN, USA) 20 g, soijajauhosta 10 g ja K2HP04:stä 3 g litrassa vesijohtoni j 30 vettä. Formuloinnin jälkeen tuotantoväliaineen pH säädetään ; kaliumhydroksidia käyttäen pH-arvoon 6,8. Sitten tätä väliai- . netta autoklavoidaan 30 min ajan 100 ml:isinä tilavuuksina ‘ 500-ml:isissä väliseinällisissä fermentointipulloissa. Ste- riiliä tuotantoväliainetta siirrostetaan edellä kuvatulla ta-; ; : 35 valla, ja ravistellaan 7-14 päivän ajan nopeudella 250 r/min 21 °C:ssa.

30 115912

Tuotantofermentointiprosessi (Labraferm-tankit):

Kypsiä siirrosteviljelmiä käytetään steriilin tuotantoväliai-neen siirrosteena siirrostetasolla 0,5 %. Tuotantoväliaine on edellä kuvattua. pH säädetään KOH:ta käyttäen pH-arvoon 7,0, 5 minkä jälkeen 10 l:aa tätä väliainetta autoklavoidaan 90 min ajan 12 1:isissä Labraferm-tankeissa (New Brunswick Scientific Co., Inc.). Tankit siirrostetaan siirrostustasolla 0,5 %, ja sekoitetaan 5-9 päivän ajan nopeudella 500 r/min 20 °C:ssa. Ilmavirran nopeus pidetään välillä 10-15 1/min.

10

Markfortiini A:n ja C:n eristys:

Koko fermentointilientä (35 1) maseroidaan alhaisella no peudella suuressa kaupallisessa Waring-sekoittimessa, ja sekoitetaan sitten yhtäsuuren tilavuuden kanssa metyleeniklo-15 ridia. Seosta säilytetään yön yli jääkaapissa, ja sitten se alistetaan sentrifugoinnille emulsion hajottamiseksi. Tulokseksi saatu kirkas metyleenikloridikerros vedetään pois, ja haihdutetaan alennetussa paineessa. Jäännöksen (37,4 g) konsentroitua liuosta metyleenikloridissa lisätään kolonniin, 20 jossa on silikageelisuspensiota (1 kg), joka pakattu metyleenikloridissa. Pylvästä eluoidaan kasvavilla asetonikonsent-: raatioilla metyleenikloridissa (10, 20, 30, 40 ja 50 % aseto- nia) . Fraktioita tarkkaillaan TLC:llä, ja sopivat fraktiot « . haihdutetaan, ja kiteytetään asetonista, jolloin saadaan ,,, 25 markfortiini A: ta ja markfortiini C: tä.

« · • * · 14-substituoitujen markfortiini en synteesi V ‘ Käsittelemällä markfortiini A: ta (kaava la, kaavio I) syano- geenijodidilla saadaan seosta (kaava 5) 16a-jodi-17p-syaani- : : 30 markfortiini A:sta ja 16β-jodi-17a-syaanimarkfortiini A:sta, jotka voidaan erottaa silikageelikromatograf iällä. Tämän , seoksen dehydrojodaus kaiiumhydroksidillä metanolissa johtaa 16,17-dehydro-17-syaanimarkfortiini A:han (kaava 6), joka ha-' petetään seleenidioksidilla 17-ketomarkfortiini A:ksi (kaava : : : 35 7) . Kaksoissidoksen lisäys C15:n ja C16:n välille toteutetaan 16-aseman selenoinnilla (fenyyliselenyylikloridi ja LDA), sen jälkeen hapettamalla seleenivälituotteen vetyperoksidilla. Poistamalla seuraavaksi fenyyliseleenihappoa saadaan 15,16- 31 115912 dehydro-17-ketomarkfortiini A:ta (kaava 8). Tämä yhdiste on avainväliaine syntetisoitaessa 14a-hydroksimarkfortiini A: ta (kaava 10), joksi se voidaan muuttaa jommalla kummalla kahdesta erilaisesta synteesireitistä.

5

Ensimmäisessä reitissä suoritetaan tämän materiaalin 14-ase-man allyylinen hapetus kaliumbis(trimetyylisilyyli)amidia ja 2-fenyylisulfonyyli-3-fenyylioksatsiridiinia käyttäen hapettamalla 16-aseman, jolloin saadaan seosta vaaditusta 14a-10 hydroksi-15,16-dehydro-17-ketomarkfortiini A:sta (kaava 9a) ja 14,15-dehydro-16-hydroksi-17-ketomarkfortiini A:sta (kaava 9b). Nämä kaksi tuotetta erotetaan silikageelikromatografiällä. Kaavan 9a mukainen yhdiste pelksitetään litiumaluminium-hydridillä THF:ssä, jolloin saadaan 14a-hydroksimarkfortiini 15 A:ta (kaava 10), keksinnön kuvauksen mukaista otsikkoyhdis-tettä. Vaihtoehtoisesti kaavan 8 mukaista yhdistettä (kaavio J) hapetetaan seleenidioksidilla dioksaanissa, jolloin saadaan 2:l-seosta 14a-hydroksi-15,16-dehydro-17-ketomarkfortii-ni A:sta (kaava 9a) ja 15,16-dehydro-14,17-diketomarkfortiini 20 A:sta (kaava 11). Nämä erotetaan silikageelikromatografiällä. Kumpikin näistä yhdisteistä muuettaan toisistaan riippumatto-: masti 14a-hydroksi-17-ketomarkfortiini A:ksi (kaava 12a): kaavan 9a mukainen yhdiste pelkistämällä 15,16-kaksoissidok- * * . sen litiumtrietyyliborohydridillä; kaavan 11 mukainen yhdiste 2 5 pelkistämällä 14-aseman karbonyylin litiumborohydridillä.

;·;* Viimeksi mainitussa tapauksessa muodostuu myös yhtäsuuri määrä 14p-hydroksi-17-ketomarkfortiini A:ta (kaava 12b), joka * voidaan poistaa kromatografiällä. Kaavan 12b mukainen yhdiste pelkistetään boraani-tetrahydrofuraani(THF) -kompleksilla, : : : 30 jolloin saadaan 14a-hydroksimarkfortiini A:ta (kaava 10).

. 14a-hydroksi-15,16-dehydro-17-ketomarkfortiini A (kaava 9a, kaavio K) pelkistetään litiumtrietyyliborohydridillä 14a- » · *;·’ hydroksi-17-ketomarkfortiini A:ksi (kaava 12a). Tämä muute- : 35 taan Swern-hapetuksella oksalyylikloridia ja DMS0:ta käyttä- ; ’ ; mällä 14,17-diketomarkfortiini A:ksi (kaava 13). Käsittele mällä tätä metyylimagnesiumbromidilla Grignard-reaktiossa saadaan seosta 14a-hydroksi-14p-metyyli-17-ketomarkfortiini 32 115912 A:sta (kaava 14a) ja 14p-hydroksi-14a-metyyli-17-ketomarkfor-tiini A:sta (kaava 14b), jotka erotetaan silikageelikroma-tografialla. Tuotteiden suhde riippuu käytetystä liuottimes-ta: metyleenikloridilla saadaan 6:l-suhde, kun taas THF:llä 5 saadaan >50:1 -suhde, vastaavasti. Pelkistämällä kaavan 13a mukaisen yhdisteen litiumaluminiumhydridillä saadaan 14a-hydroksi-14p-metyylimarkfortiini A:ta (kaava 15).

14a-hydroksimarkfortiini A:n (kaava 10, kaavio L) Swern-hape-10 tuksella saadaan 14-ketomarkfortiini A:ta (kaava 16), joka pelkistetään natriumborohydridillä 14-p-hydroksimarkfortiini A:ksi (kaava 17). Käsittelemällä 14-ketomarkfortiini A:ta (kaava 16) etyylimagnesiumbromidilla Grignard-reaktiossa saadaan 14a-hydroksi-14-etyylimarkfortiini A:ta (kaava 19). Kä-15 sittelemällä 14a-hydroksimarkfortiini A:ta (kaava 10) m-kloo-riperoksibentsoehapolla saadaan 14a-hydroksimarkfortiini A-N-oksidia (kaava 18). 14p-metyylimarkfortiini A:ta voidaan valmistaa 14a-hydroksi-14p-metyylimarkfortiini A:sta dehydroksy-loinnilla. Täten 14a-hydroksi-14p-metyylimarkfortiini A:ta 20 käsitellään fenyyliklooritionoformiaatilla emäksen läsnä ollessa. Tämä 14a-hydroksi-14p-metyylimarkfortiini A:n tiono-: formiaattijohdannainen pelkistetään tri-n-butyylitinahydri- dillä, jolloin saadaan 14p-metyylimarkfortiini A: ta.

25 Vaihtoehtoisesti 14a-hydroksimarkfortiini A voidaan synteti-;·;* soida markfortiini A:sta (kaavio M). Käsittelemällä markfor- *'·* tiini A: ta natriumbikarbonaatilla ja jodilla tetrahydrofuraa- *.* ‘ nin vesiliuoksessa saadaan 17-ketomarkfortiini A: ta (kaava 7), joka voidaan disulfenyloida LDA:ta ja fenyylidisulfidia : : : 30 käyttämällä, jolloin saadaan 16-ditiofenyyli-17-ketomarkfor- ; tiini A: ta (kaava 20, kaavio M) 60-prosenttisella saannolla . markfortiini A:sta. Hapettamalla m-klooriperoksibentsoehapol- la saadaan 16-tiofenyyli-16-sulf oksif enyyli-17-ketomarkf or-tiini A:ta (kaava 21), joka poistetaan ref luksoimalla ::: 35 tolueenissa, jolloin saadaan 15,16-dehydro-16-tiofenyyli-17- ketomarkfortiini A:ta (kaava 22). Käsittelemällä seuraavaksi m-klooriperoksibentsoehapolla saadaan 15,16-dehydro-16-sul-foksifenyyli-17-ketomarkfortiini A:ta (kaava 23), joka toi- 33 115912 siintuu käytettäessä dietyyliamiinia metanolissa, jolloin saadaan 15,16-dehydo-14a-hydroksi-17-ketomarkfortiini A: ta (kaava 9a).

5 14a-hydroksi-15a-metyylimarkfortiini A (kaava 35, kaavio N) voidaan syntetisoida 15,16-dehydro-14a-hydroksi-17-ketomark-fortiini A:sta (kaava 9a, kaavio N). Täten 15,16-dehydro-14a-hydroksi-17-ketomarkfortiini A:ta (kaava 9a) käsitellään joko metyylimagnesiumbromidilla tai litiumdimetyylikuparilla, jol-10 loin muodostuu 15a-metyyli-14a-hydroksi-17-ketomarkfortiini A: ta (kaava 34), joka pelkistetään boraani-dimetyylisulfidi -kompleksilla, jolloin muodostuu 15a-metyyli-14a-hydroksi-markfortiini A:ta (kaava 35). 15a-metyyli-14a-hydroksi-17-ke-tomarkfortiini A (kaava 34) muutetaan Swern-hapetuksella 15 oksalyylikloridia ja DMSO:ta käyttäen 15a-metyyli-14,17-dike-tomarkfortiini A:ksi (kaava 36). Käsittelemällä metyylimagnesiumbromidilla Grignard-reaktiossa saadaan 15a-metyyli-14a-hydroksi-14p-metyyli-17-ketomarkfortiini A:ta (kaava 37), joka pelkistetään boraani-dimetyylisulfidi -kompleksilla, 20 jolloin saadaan 15a-metyyli-14a-hydroksi-14p-metyylimarkfor tiini A:ta (kaava 38).

Näitä aikaisemmin kuvattuja menettelytapoja voidaan käyttää 14-substituoitujen markfortiini B-, C- ja D-johdannaisten ,,, 25 valmistukseen.

t * ·

Valmistus 1 ’ 16-jodi-17-syaanimarkfortiini A diastereomeerien seoksena (kaava 5) : 30 Kiinteää syanogeenijodidia (11,7 g, 7 6,5 mmol) lisätään : liuokseen, jossa on markfortiini A: ta (10,5 g, 22 mmol) / . CHCl3:ssa (150 ml), ja reaktioseosta kuumennetaan palautus- *.. * jäähdyttäen, kunnes kaikki markfortiini A on kulunut (noin 5

* I

*;* tuntia) . Tulokseksi saatu musta liuos jäähdytetään 20- : 35 25 °C:seen, laimennetaan CH2Cl2:lla (100 ml), pestään kylläi- sellä NaHC03:lla, ja pestään sitten Na2S03-liuoksella. Orgaaninen faasi erotetaan, kuivataan MgS04:llä, ja konsentroidaan kuiviin. Tulokseksi saatu raaka kiinteä aine alistetaan 34 115912 silikageelikromatografiälle (3:2 EtOAc:heksaani), jolloin saadaan 16-jodi-17-syaanimarkfortiini A: ta (12,5 g, 90 %) valkoisena jauhemaisena kiinteänä aineena. Tuotteen rakenne voidaan varmistaa NMR:llä ja massaspektrometrialla.

5

Valmistus 2 16,17-deh,ydro-17-syaanimarkf ortiini A (kaava 6) 16- jodi-17-syaanimarkfortiini A: ta (9,5 g, 15 mmol) liuotetaan MeOHrhon (150 ml), ja lisätään KOH:n vesiliuosta (45 %, 10 3 ml). Reaktioseosta sekoitetaan 2 tuntia 20-25 °C:ssa.

Lisätään vettä, ja tulokseksi saatu valkoinen sakka kerätään suodattamalla, pestään vedellä, ja kuivataan yön yli tyhjössä, jolloin saadaan 16,17-dehydro-17-syaanimarkfortiini A:ta (6,6 g, 75 %) valkoisena jauheena. Tuotteen rakenne voidaan 15 varmistaa NMRrllä ja massaspektrometrialla. MS (FAB) M/Z [M+H]: 501.

Valmistus 3 17- ketomarkfortiini A (kaava 7) 20 Seleenidioksidia (2,9 g, 26 mmol) lisätään liuokseen, jossa on 16,17-dehydro-17-syaanimarkfortiini A: ta (6,0 g, 10 mmol) : 95-prosenttisessa EtOH:ssa (100 ml), ja reaktioseosta sekoi- tetaan 2 tuntia 20-25 °C:ssa. Reaktio sammutetaan lisäämällä kylläistä NaHC03: a (100 ml). Tulokseksi saatu seos uutetaan ... 25 CH2Cl2:lla (2 x 200 ml). Uutteet yhdistetään, kuivataan ;·; (MgSOJ , ja konsentroidaan, jolloin saadaan 7 g raakatuotet- * » i ta. Tämä materiaali puhdistetaan silikageelikromatograf iällä V ’ (EtOAc), jolloin saadaan 17-ketomarkfortiini A:ta (3,6 g,

75 %) valkoisena kiinteänä aineena. Tuotteen rakenne voidaan j ; j 30 varmistaa NMR:llä ja massaspektrometrialla. HRMS (FAB) M/Z

[M+H] laskettu C28H33N305+H: lie: 492,2498; mitattu: 492,2478.

Vaihtoehtoisesti, ja edullisemmin, otsikkoyhdiste voidaan ·; ’ syntetisoida p-tolueenisulfonihappoa käyttämällä. Täten p-to- : ; 35 lueenisulfonihappomonohydraattia (1 g) liuokseen, jossa on ; 16,17-dehydro-17-syaanimarkfortiini A:ta (10 g) 95-prosentti sessa MeOH:ssa (60 ml), ja reaktioseosta sekoitetaan 1 tunti 20-25 °C:ssa. Seokseen lisätään trietyyliamiinia (2 ml), ja 35 115912 liuotin haihdutetaan. Jäännös trituroidaan 10-prosenttisella natriumkarbonaatin vesiliuoksella (100 ml), ja kiinteä aine suodatetaan ja kuivataan, jolloin saadaan otsikkoyhdistettä kiinteänä aineena (90 % saanto). Tuotteen rakenne voidaan 5 varmistaa NMRrllä ja massaspektrometrialla.

Valmistus 4 15,16-dehydro-17-ketomarkfortiini A (kaava 8)

Liuos, jossa on litiumdi-isopropyyliamidia, valmistetaan 10 liuoksesta, jossa on n-butyylilitiumia (1,6 M, 9,9 ml, 15,4 mmol) heksaanissa, ja di-isopropyyliamiinistä (2,2 ml, 15,7 mmol). Tämä laimennetaan vedettömällä tetrahydrofuraa-nilla (THF, 20 ml), ja jäähdytetään -78 °C:seen. Lisätään tipoittain liuos, jossa on 17-ketomarkfortiini A: ta (2,0 g, 15 4,1 mmol) vedettömässä THFrssä (20 ml), ja reaktioseoksen annetaan lämmetä 1 tunnin aikana -40 °C:seen. Seos jäähdytetään jälleen -78 °C:seen, ja käsitellään tipoittain fenyyli-seleenikloridilla (19 mg, 5,2 mmol) THF:ssä (10 ml). 5 min kuluttua reaktio sammutetaan kylläisellä NaHC03:lla, uutetaan 20 CH2Cl2:lla, kuivataan (MgS04) , ja konsentroidaan, jolloin saadaan keltaista kiinteää ainetta, jota voidaan käyttää enempää puhdistamatta. Tämä materiaali liuotetaan THF:ään (150 ml), » f · ja käsitellään H202 :lla (30 %, 1,5 ml) 0 °C:ssa. Jäähdytys- t . haude poistetaan, ja reaktioseosta sekoitetaan 30 min ajan 25 20-25 °C:ssa. Reaktio sammutetaan lisäämällä NaOH:ta (1 N, 100 ml) . Seos uutetaan CH2Cl2:lla (2 X 200 ml) . Uutteet yhdis- I I > tetään, kuivataan (MgSOJ , ja konsentroidaan, jolloin saadaan V ' raakatuotetta. Tämä materiaali puhdistetaan silikageelikroma- tografialla (EtOAc), jolloin saadaan 15,16-dehydro-17-keto-j 30 markfortiini A:ta (1,3 g, 65 %) valkoisena kiinteänä aineena.

: Tuotteen rakenne varmistetaan NMRrllä ja massaspektro- /t . metrialla. HRMS (FAB) M/Z [M+H] laskettu C28H31N305+H: lie: 490,2342; mitattu: 490,2345.

:Y: 35 I i 36 115912

Valmistus 5 14<x-hydroksi-15,16-dehydro-17-ketomarkfortiini A (kaava 9a) osaksatsiridiinikemiaa käyttämällä

Liuosta, jossa on kaliumbis(trimetyylisilyyli)amidia toluee-5 nissa (0,5 M, 1 ml, 0,5 mmol), lisätään tipoittain liuokseen, jossa on 15,16-dehydro-17-ketomarkfortiini A: ta (66 mg, 0,14 mmol) THF:ssä (2 ml) -78 °C:ssa. Tulokseksi saadun vaaleankeltaisen, samean liuoksen annetaan lämmetä 1 tunnin aikana -40 °C:seen. Reaktioseos jäähdytetään -78 °C:seen, 10 sekoitetaan 15 min, ja käsitellään sitten lisäämällä tipoittain liuosta, jossa on 2-fenyylisulfonyyli-3-fenyylioksatsi-ridiinia (42 mg, 0,16 mmol) THFrssä (2 ml). Seosta sekoitetaan 5 min ajan, minkä jälkeen reaktio sammutetaan lisäämällä NaHC03:a. Seos uutetaan CH2Cl2:lla (2 x 25 ml). Uutteet yhdis-15 tetään, kuivataan (MgS04) , ja konsentroidaan, jolloin saadaan raakamateriaalia. Tämä puhdistetaan preparatiivisella TLC:llä (silikageeli , EtOAc), jolloin saadaan 14a-hydroksi-15,16-de-hydro-17-ketomarkfortiini A:ta (8 mg, 12 %) valkoisena kiinteänä aineena. Rakenne voidaan varmistaa NMR:llä ja massa-20 spektrometrialla. HRMS (FAB) M/Z [M+H] laskettu C28H31N306+H: lie: 506,2291; mitattu: 506,2280. Kerroksesta : saadaan myös 14,15-dehydro-16-hydroksi-17-ketomarkfortiini » ·- » ,,, ; A:ta (14 mg, 20 %) . Sen rakenne voidaan varmistaa NMR:llä.

... 25 Valmistus 6 • k 14a-hydroksi-15,16-dehydro-17-ketomarkfortiini A (kaava 9a), * k I t * 15, 16-dehydro-14,17-diketomarkfortiini A (kaava 11) ja 14,15-' dehydro-16,17-diketomarkfortiini A (kaava 24) seleenidioksi- dia käyttäen • · 30 15,16-dehydro-17-ketomarkf ortiini A: ta (1,29 g, 2,6 mmol) : : liuotetaan p-dioksaaniin (30 ml), ja käsitellään seleenidiok- . sidilla (390 mg). Seosta kuumennetaan palautusjäähdyttäen 1 tunnin ajan, ja liuotin haihdutetaan tyhjössä. Jäännös tritu-roidaan metyleenikloridilla (30 ml) , ja suodatetaan. Suodos ; : 35 konsentroidaan, ja jäännös alistetaan silikageelikromatogra- ; : fialle (1:20 MeOH:EtOAc), jolloin saadaan 14a-hydroksi-15,16- dehydro-17-ketomarkfortiini A:ta (430 mg, 32 %) kiinteänä aineena. Kromatografiästä saadaan myös 15,16-dehydro-14,17-di- 37 115912 ketomarkfortiini A:ta (kaava 11, 212 mg, 16 %). Kromatogra- fiasta saadaan myös 14,15-dehydro-l6,17-diketomarkfortiini A:ta (kaava 24, 106 mg, 8 %). Näiden tuotteiden rakenne voidaan varmistaa NMR:llä ja massaspektrometrialla.

5

Valmistus 7 15,16-dehydro-14,17-diketomarkfortiini A (kaava 11) 14a-hydroksi-15,16-dehydro-17-ketomarkfortiini A: ta (60 mg, Formula 9a) liuotetaan metyleenikloridiin (10 ml), ja käsi-10 teilaan mangaanidioksidilla (60 mg). Seosta sekoitetaan 1 tunti 20-25 °C:ssa, ja konsentroidaan. Jäännöksen preparatii-visella ohutlevykromatografiällä silikageelillä (50 % mety-leenikloridi EtOAc:ssä) saadaan 15,16-dehydro-14,17-diketo-markfortiini A:ta (kaava 11, 35 mg, 60 %) . Näiden tuotteiden 15 rakenne voidaan varmistaa NMR:llä ja massaspektrometrialla.

Valmistus 8 14a-hydroksimarkfortiini A (kaava 10) 14a-hydroksi-15,16-dehydro-17-ketomarkfortiini A: ta (20 mg, 20 0,040 mmol) liuotetaan THF:ään (5 ml), ja käsitellään liuok sella, jossa on litiumaluminiumhydridiä (1 g, 0,11 ml, , : 0,11 mmol) THF:ssä 0 °C:ssa. Seosta sekoitetaan 0,5 tuntia ; 0 °C:ssa, minkä jälkeen lisätään NaHC03-liuosta (10 %). Seos . uutetaan CH2Cl2:lla (2 x 10 ml) . Uutteet yhdistetään, kuiva- ,,, 25 taan (MgSOJ , ja liuotin poistetaan alennetussa paineessa.

Jäännöksen preparatiivisella ohutlevykromatograf iällä silika-t’.’ geelillä (10 % MeOH EtOAc:ssä) saadaan otsikkoyhdistettä, V : HRMS (FAB, M/Z) [M+H] laskettu C28H35N305+H: lie = 494,2655, mitattu = 494,2653.

i : 30

Valmistus 9 14a-hydroksi-17-ketomarkfortiini A (kaava 12a) 14a-hydroksi-15,16-dehydro-17-ketomarkfortiini A: ta (kaava 9a, 50 mg, 0,1 mmol) liuotetaan THF: ään (5 ml), ja käsitel- : ‘: 35 lään litiumtrietyyliborohydridin liuoksella THFrssä (1 g, ; ; 0,7 ml) -78 °C:ssa. Seosta sekoitetaan 0,5 tuntia -78 °C:ssa.

Reaktio sammutetaan lisäämällä MeOH:ta (1 ml), ja seos konsentroidaan. Tulokseksi saatu kiinteä aine alistetaan silika- 38 115912 geelikromatografiälle (1:20 MeOH: CH2C12) , jolloin saadaan 14α-hydroksi-17-keto-markfortiini A: ta (43 mg, 86 %) valkoisena kiinteänä aineena. Tuotteen rakenne voidaan varmistaa NMR-spektroskopialla ja massaspektrometrialla. HUMS (FAB) M/Z 5 [M+H] laskettu C28H33N306+H: lie: 508,2447; mitattu: 508,2437.

Valmistus 10 14(x-hydroksi-17-ketoinarkfortiini A:n (kaava 12a) valmistus 15,16-dehydro-14,17-diketomarkfortiini A:sta (kaava 11) 10 15,16-dehydro-14,17-diketomarkfortiini A:ta (470 mg,

0,93 mmol) liuotetaan THF:ään, ja käsitellään liuoksella, jossa on litiumborohydridiä THF:ssä (1 g, 2 ml) huoneenlämpö-tilassa. Seosta sekoitetaan 2 tuntia, minkä jälkeen lisätään NaHC03-liuosta (10 %) . Seos uutetaan CH2Cl2:lla (2 x 20 ml). 15 Uutteet yhdistetään, kuivataan (MgSOJ , ja liuotin haihdutetaan. Jäännös sisältää seosta kahdesta epimeeristä, jotka eroavat helposti silikageelikromatografiällä (1:20 MeOH

EtOAc) : 14a-hydroksi-17-ketomarkfortiini A (90 mg, 19 %) ja 14β -hydroksi-17-ketomarkfortiini A (94 mg, 20 %). Kummankin 20 tuotteen rakenne voidaan varmistaa NMR-spektroskopialla ja massaspektrometrialla.

t I

I : * .....: Valmistus 11 , 14a-hydroksimarkfortiini Asn (kaava 10) valmistus 14a-hydrok- t ' » ► » 25 si-17-ketomarkfortiini A:sta (kaava 12a) 14a-hydroksi-17-ketomarkfortiini A: ta (413 g, 0,81 mmol) i » · liuotetaan THF: ään (20 ml), ja käsitellään liuoksella, jossa V ' on boraani-THF -kompleksia THF:ssä (1 g, 2,43 ml) 0 °C:ssa.

Seosta sekoitetaan 2,25 tuntia. Seosta sekoitetaan 0,5 tun- i : ; ; 30 tia, minkä jälkeen lisätään MeOH:ta (3 ml). Liuotin haihdute- i taan, minkä jälkeen jäännös alistetaan silikageelikromatogra- , fialle (1:16 MeOH:EtOAc), jolloin saadaan 14a-hydroksimark- “ fortiini A: ta (250 mg, saanto 92 % talteenotetun lähtöaineen ’* ‘ perusteella) ja 14a-hydroksi-17-ketomarkfortiini A:ta (lähtö- : ; 35 ainetta, 140 mg, 34 %).

i i 39 115912

Valmistus 12 14,17-diketomarkfortiini A (kaava 13)

Liuosta, jossa on oksalyylikloridia (40 μΐ) vedettömässä CH2Cl2:ssa (5 ml), käsitellään dimetyylisulfoksidilla (45 μΐ) 5 -78 °C:ssa. Seosta sekoitetaan 1 tunti -78 °C:ssa. Lisätään tipoittain liuos, jossa on 14a-hydroksi-17-ketomarkfortiini A:ta (27 mg) CH2Cl2:ssa (2 ml). Reaktioseosta sekoitetaan 20 min -78 °C:ssa. Lisätään trietyyliamiinia (0,3 ml) reak-tioseokseen, jonka annetaan lämmetä huoneenlämpötilaan 20 min 10 aikana. Seos jaetaan 10-prosenntisen Na2C03:n (10 ml) ja CH2Cl2:n (10 ml) välillä. Orgaaninen kerros kuivataan (MgSOJ , ja konsentroidaan. Jäännös alistetaan silikageelikromatogra-fialle (1:20 MeOH:CH2Cl2) , jolloin saadaan 14,17-diketomarkfortiini A: ta (22 mg, 80 %) valkoisena kiinteänä aineena.

15 Tuotteen rakenne voidaan varmistaa NMR-spektroskopialla ja massaspektrometrialla. HRMS (FAB) M/Z [M+H] laskettu C28H31N306+H: lie: 506,2291; mitattu: 506,2280.

Valmistus 13 2 0 14<x-hydroksi-14fi-metyyli-17-ketomarkfortiini A (kaava 14a)

Liuosta, jossa on 14,17-diketomarkfortiini A:ta (16 mg, : 0,032 mmol) CH2Cl2:ssa (5 ml) -78 °C:ssa, käsitellään liuok- sella, jossa on metyylimagnesiumbromidia (3 M, 0,16 ml, . 0,48 mmol) Et,0:ssa -78 °C:ssa. Tulokseksi saatua seosta se- * · t i » ‘ 25 koitetaan 0,5 tuntia -78 °C:ssa. Reaktio sammutetaan lisää- t t ;·;* mällä 10-prosenttista Na2C03:a (muutamia tippoja). Seos lai- mennetaan CH2Cl2:lla (10 ml), kuivataan (MgSOJ , ja konsent-’ roidaan. Jäännös alistetaan silikageelikromatografiälle (1:20

MeOH:CH2Cl2) , jolloin saadaan 14a-hydroksi-14p-metyyli-17-·,« ; 30 ketomarkfortiini A: ta (8 mg, 50 %, Rf = 0,25) valkoisena : ; kiinteänä aineena. Tuotteen rakenne voidaan varmistaa NMR-

. spektroskopialla ja massaspektrometrialla. HRMS (FAB) M/Z

’ [M+H] laskettu C29H35N306+H: lie: 522,2604; mitattu: 522,2620.

t I

‘ Kerroksesta saadaan myös 14p-hydroksi-14cc-metyyli-17-keto- : 35 markfortiini A:ta (1,2 mg, 7 %, Rf = 0,4) valkoisena kiinteä- ; nä aineena. Tuotteen rakenne voidaan varmistaa NMR-spektros- kopialla ja massaspektrometrialla. HRMS (FAB) M/Z [M+H] laskettu C29H35N306+H: lie: 522,2604; mitattu: 522,2630. Täten 40 115912 saatujen tuotteiden suhde 6:1 kasvaa suhteeseen yli 50:1, ja saanto kasvaa 80 %:iin, kun reaktion liuottimena käytetään CH2Cl2:n sijasta THF:ää.

5 Valmistus 14 14a-hydroksi-14p-metyylimarkfortiini A (kaava 15)

Liuosta, jossa on 14a-hydroksi-14p-metyyli-17-keto-markfor-tiini A: ta (5 mg, 0,01 mmol) THF:ssä (5 ml), käsitellään liuoksella, jossa on litiumaluminiumhydridiä (1 M, 0,03 ml, 10 0,03 mmol) THF:ssä 0 °C:ssa. Seosta sekoitetaan 0,5 tuntia 0 °C:ssa, minkä jälkeen lisätään NaHC03-liuosta (10 %) . Seos uutetaan CH2Cl2:lla (2 x 5 ml). Uutteet yhdistetään, kuivataan (MgSOj , ja liuotin haihdutetaan. Jäännöksen preparatiivi-sella ohutlevykromatografiällä silikageelillä (1:20 15 MeOH:CH2Cl2) saadaan 14a-hydroksi-14p-metyylimarkfortiini A:ta (2 mg, 40 %) . Tuotteen rakenne voidaan varmistaa NMR-spekt-roskopialla ja massaspektrometrialla. HRMS (FAB) M/Z [M+H] laskettu C29H37N305+H: lie: 508,2811; mitattu: 508,2816.

2 0 Valmistus 15 14-ketomarkfortiini A (kaava 16) ·, ; Liuos, jossa on oksalyylikloridia (150 μΐ) vedettömässä *. CH2Cl2:ssa (20 ml), käsitellään DMSO:lla (170 μΐ) -78 °C:ssa.

, Seosta sekoitetaan 1 tunti -78 °C:ssa. Lisätään tipoittain 25 liuosta, jossa on 14a-hydroksimarkfortiini A: ta (110 mg) ’CH2C12: ssa (5 ml). Reaktioseosta sekoitetaan 20 min » > » 78 °C:ssa. Trietyyliamiinia (1 ml) lisätään reaktioseokseen, * · t V * jonka annetaan lämmetä huoneenlämpötilaan 20 min aikana. Seos jaetaan 10-prosenttisen Na2C03:n (20 ml) ja CH2Cl2:n (20 ml) : : ; 30 välillä. Orgaaninen kerros kuivataan (MgSOJ ja konsentroi- ; daan. Jäännös alistetaan silikageelikromatografiälle (1:25 , MeOH:CH2Cl2) , jolloin saadaan 14-ketomarkfortiini A:ta (82 mg, ; ‘ 75 %) valkoisena kiinteänä aineena. Tuotteen rakenne voidaan varmistaa NMR-spektroskopialla ja massaspektrometrialla. HRMS : 35 (FAB) M/Z [M+H] laskettu C28H33N305+H: lie: 492,2498; mitattu: ; 492,2510.

41 115912

Valmistus 16 14S-hydroksimarkfortiini A (kaava 17)

Liuosta, jossa on 14-ketomarkfortiini A: ta (10 mg) MeOH:ssa (2 ml), käsitellään natriumborohydridilla (5 mg) 0 °C:ssa. 5 Seosta sekoitetaan 0,5 tunnin ajan 0 °C:ssa, minkä jälkeen lisätään NaHC03-liuosta (10 %). Seos uutetaan CH2Cl2:ssa (2 x 10 ml) . Uutteet yhdistetään, kuivataan (MgSOJ , ja liuotin haihdutetaan. Jäännöksen preparatiivisella ohutlevykromato-grafiällä silikageelillä (1:16 MeOH:EtOAc) saadaan 14p-hyd-10 roksimarkfortiini A:ta (5 mg, 50 %). Tuotteen rakenne voidaan varmistaa NMR-spektroskopialla ja massaspektrometrialla. HRMS (FAB) M/Z [M+H] laskettu C28H35N305+H: lie: 494,2655; mitattu: 494,2653 .

15 Valmistus 17 14a-hydroksimarkfortiini A-N-oksidi (kaava 18)

Liuosta, jossa on 14a-hydroksimarkfortiini A:ta (15 mg) CH2Cl2:ssa (3 ml), käsitellään m-klooriperoksibentsoehapolla (15 mg) 0 °C:ssa. Seosta sekoitetaan 0,5 tuntia 0 °C:ssa, 2 0 minkä jälkeen se käsitellään trietyyliamiinilla (30 μΐ) , ja konsentroidaan. Jäännöksen preparatiivisella ohutlevykromato-, ; grafiällä silikageelillä (1:8 MeOH:CH,Cl,) saadaan 14a-hydrok- > · Δ Δ * · simarkfortiini A-N-oksidia (12 mg, 80 %) . Tuotteen rakenne

I I

, voidaan varmistaa massaspektrometrialla. HRMS (FAB) M/Z [M+H] 25 laskettu C28H35N306+H: lie: 510,2604; mitattu: 510,2615.

i « i

Valmistus 18 14<x-hydroksi-14p-etyylimarkfortiini A (kaava 19)

Liuosta, jossa on 14-ketomarkfortiini A:ta (25 mg, 0,05 mmol) i • - 30 THF: ssä (5 ml) -78 °C:ssa, käsitellään liuoksella, jossa on : etyylimagnesiumbromidilla (3 M, 0,15 ml, 0,45 mmol) Et20:ssa . . -78 °C:ssa. Tulokseksi saatua seosta sekoitetaan 0,5 tuntia I » ' -78 °C:ssa. Reaktioseoksen annetaan lämmetä huoneenlämpöti laan 20 min aikana. Reaktio sammutetaan lisäämällä 10-pro-: 35 senttistä Na2C03: a (muutamia tippoja). Seos laimennetaan ; ; CH2Cl2:lla (10 ml), kuivataan (MgS04) , ja konsentroidaan.

Jäännös alistetaan silikageelikromatografiälle (1:20

MeOH:CH2C12), jolloin saadaan 14α-hydroksi-14β-etyylimarkfor- 42 115912 tiini A:ta (10 mg, 45 %) valkoisena kiinteänä aineena. Tuotteen rakenne voidaan varmistaa NMR-spektroskopialla ja massaspektrometrialla. HRMS (FAB) M/Z [M+H] laskettu C30H39N3O5+H: lie: 522,2968; mitattu: 522,2983.

5

Valmistus 19 14p-metyylimarkfortiini Asn valmistus 14<x-hydroksi-14p-metyylimarkfortiini A:sta

Liuosta, jossa on kaliumbis(trimetyylisilyyli)amidia toluee-10 nissa (0,5 M, 1 ml, 0,5 mmol), lisätään tipoittain liuokseen, jossa on 14a-hydroksi-14p-metyylimarkfortiini A: ta (66 mg, 0,14 mmol) THF:ssä (2 ml) -78 °C:ssa. Tulokseksi saadun vaaleankeltaisen, samean liuoksen annetaan lämmetä -40 °C: seen 1 tunnin aikana. Reaktioseos jäähdytetään -78 °C:seen, sekoite-15 taan 15 min ajan, ja käsitellään sitten lisäämällä tipoittain liuosta, jossa on fenyyliklooritionoformiaattia (0,094 ml, 0,7 mmol) THF:ssä (2 ml). 10 min kuluttua hiilihappojäähaude poistetaan. Annetaan reagoida edelleen 3 tunnin aikana, minkä jälkeen reaktio sammutetaan NaHC03:a lisäämällä. Seos uute- 20 taan CH2Cl2:lla (2 x 25 ml). Uutteet yhdistetään, kuivataan (MgSOJ , ja konsentroidaan, jolloin saadaan raakamateriaalia.

: Tämä puhdistetaan preparatiivisella TLC:llä (silikageeli, • » ·

EtOAc), jolloin saadaan 14a-0-fenoksitiokarbonyyli-14p-metyy-. limarkfortiini A:ta.

25

Liuokseen, jossa on 14a-0-f enoksitiokarbonyyli-14p-metyyli-markfortiini A: ta (64 mg, 0,1 mmol) tolueenissa (5 ml), lisä-* tään AIBNrää (3,3 mg), minkä jälkeen lisätään tributyylitina- hydridiä (54 μΐ, 0,2 mmol). Seosta kuumennetaan 3 tuntia pa- : : j 30 lautusjäähdyttäen. Liuotin haihdutetaan, minkä jälkeen jään-; nös puhdistetaan preparatiivisella TLC:llä (silikageeli, .* . EtOAc), jolloin saadaan 14p-metyylimarkfortiini A:ta. Rakenne voidaan varmistaa NMR:llä ja massaspektrometrialla.

: : : 35 Valmistus 20 17-ketomarkfortiini Asn (kaava 7) vaihtoehtoinen synteesi

Markfortiini A:han (65 g, 0,136 mol) ja natriumbikarbonaattiin (137 g, 1,63 mol) tetrahydrofuraanissa (THF, 2 1) ja 43 115912 vedessä (1,25 1), jota kuumennetaan palautusjäähdyttäen, lisätään tipoittain jodia (206 g, 0,81 mol) THF:ssä (1,25 1) 1 tunnin aikana. (Vaihtoehtoisesti seosta voidaan sekoittaa huoneenlämpötilassa 16 tunnin ajan.) Annetaan jäähtyä hitaas-5 ti ympäristön lämpötilaan (2,5 tuntia), minkä jälkeen reaktio sammutetaan kylläisellä natriumtiosulfaatilla (Na2S203, 1,5 1) ja uutetaan etyyliasetaatilla (2x11). Yhdistetyt orgaaniset kerrokset pestään kylläisellä natriumtiosulfaatilla (1 1), kuivataan (MgSOj , suodatetaan, haihdutetaan, ja 10 kuivataan yön yli tyhjöuunissa (80 °C) , jolloin saadaan 62 g raakaa 17-ketomarkfortiini A: ta (kaava 7) keltaisena kiinteänä aineena. ^-NMR (300 MHz, CDC13) : δ 7,68 (s, 1H) , 6,80 (d, 1H), 6,70 (d, 1H), 6,32 (d, 1H), 4,90 (d, 1H), 3,75 (q, 2H) , 3,23 (t, 1H) , 3,09 (s, 3H) , 2,80 (d, 1H) , 2,65 (d, 15 1H) , 2,49-2,21 (m, 2H), 2,08 (d, 1H) , 1,98-1,45 (m, 5H), 1,46 (s, 3H), 1,44 (s, 3H), 1,09 (s, 3H), 0,90 (s, 3H).

Vaihtoehtoisesti voidaan jodin sijasta käyttää ICIrtä.

20 Valmistus 21 16-ditiofenyyli-17-ketomarkfortiini A (kaava 20) : Raakaa 17-ketomarkfortiini A: ta (5 g, 10,2 mmol) THF:ssä (150 ml) -78 °C:ssa lisätään kanyylillä LDA-liuokseen, joka ♦ » valmistettiin lisäämällä n-BuLi: tä (1,6 M, 24,8 ml, 0,04 mol) ... 25 tipoittain di-isopropyyliamiiniin (5,7 ml, 0,041 mol) ;*;* 0 °C:ssa THF:ssä (100 ml). Reaktioseoksen annetaan lämmetä *·’>· hitaasti 1 tunnin aikana -50 °C:seen. Sitten tulokseksi saatu ’.* * samea punaruskea seos käsitellään fenyylidisulfidillä (4,4 g, 0,02 mol). Reaktio sammutetaan välittömästi kylläisellä nat- • \ [ J 30 riumbikarbonaattiliuoksella (100 ml) , ja uutetaan metyleeni- : : kloridilla (CH2C12, 300 ml) . Orgaaninen faasi kuivataan / . (MgSOJ, konsentroidaan (8 g), ja kromatografoidaan silika- geelillä (120 g, 60-prosenttisella etyyliasetaatti/heksaani-eluentilla) , jolloin saadaan otsikkoyhdistettä likaisenval-::: 35 koisena kiinteänä aineena (4,4 g, 61 % markfortiini A:sta).

FAB-MS 708 (M++H) ; "H-NMR (300 MHz, CDC13) δ 7,74 (s, 1H) , 7.71 (d, 2H), 7,64 (d, 2H), 7,45-7,30 (m, 6H), 6,81 (d, 1H) , 6.72 (d, 1H), 6,32 (d, 1H), 4,91 (d, 1H), 3,70 (q, 2H) , 3,16 44 115912 (t, 1H), 3,01 (s, 3H), 2,76 (d, 1H), 2,53 (dt, 1H), 2,35 (dt, 1H), 2,15-1,50 (m, 5H), 1,47 (s, 3H), 1,45 (s, 3H), 1,06 (s, 3H), 0,82 (s, 3H).

5 Valmistus 22 16-tiofenyyli-16-sulfoksifenyyli-17-ketomarkfortiini A (kaava 21) 16-ditiofenyyli-17-ketomarkfortiini A:han (10 g, 14 mmol) CH2Cl2:ssa (250 ml) -78 °C:ssa typpi-ilmakehässä lisätään 10 tipoittain 15 min ajan m-klooriperoksibentsoehappoa (m-CPBA, 64 %, 4,2 g, 15,5 mmol) CH2Cl2:ssa (200 ml) . Reaktio sammutetaan välittömästi kylläisellä natriumtiosulfaatilla (200 ml), laimennetaan kylläisellä NaHC03:lla (200 ml), ja uutetaan CH2Cl2:een (200 ml). Kuivataan (MgS04) , sen jälkeen konsent-15 roidaan alennetussa paineessa, jolloin saadaan 11 g raakaa 16-tiofenyyli-16-sulfoksifenyyli-17-ketomarkfortiini A:ta (kaava 21). Y-NMR (300 MHz, CDC13) δ 8,0-7,29 (m, UH) , 6,80 (d, 1H) , 6,70 (d, 1H) , 6,31 (d, 1H) , 4,90 (d, 1H) 3,68 (d, 1H), 3,41 (d, 1H), 3,14 (t, 1H), 3,07 (s, 3H), 2,82 (dt, 1H), 20 2,80-2,65 (m, 2H) , 2,16 (dt, 1H) , 2,05-1,1 (m, 4H) , 1,47 (s, 3H), 1,43 (s, 3H), 0,96 (s, 3H), 0,83 (s, 3H).

Valmistus 23 16-tiofenyyli-15,16-dehydro-17-ketomarkfortiini A (kaava 22) ... 25 Raakaa 16-tiofenyyli-16-sulfoksifenyyli-17-ketomarkfortiini A: ta (kaava 21, 11 g) kuumennetaan 45 min ajan palautusjääh- • * * dyttäen tolueenissa (250 ml) , jäähdytetään huoneeniämpöti-V ’ laan, laimennetaan kylläisellä natriumbikarbonaatilla (300 ml), ja uutetaan EtOAcrllä (300 ml). Orgaaninen kerros jtj : 30 kuivataan (MgSOJ ja konsentroidaan, jolloin saadaan 10,6 g : raakaa 16-tiofenyyli-15,16-dehydro-17-ketomarkfortiini A:ta . (kaava 22). FAB-MS 598 (M++H) ; HRMS M/Z (M++H, Ο,,Η,^Ο^+Η,) , laskettu 598,2376, saatu 598,2387. XH-NMR (300 MHz, CDC13)

« I

8,18 (s, 1H), 7,55-7,45 (m, 2H), 7,29-7,45 (m, 3H), 6,83 (d, :Y: 35 1H) , 6,70 (d, 1H), 6,34 (d, 1H), 5,92 (dt, 1H), 4,91 (d, 1H) , 3,87 (q, 2H), 3,30 (dd, 1H), 3,21 (t, 1H), 3,08 (s, 3H), 2,80 (d, 1H) , 2,35 (dd, 1H) , 2,10 (d, 1H) , 2,03 (dd, 1H) , 1,78 45 115912 (dd, 1H) , 1,46 (s, 3H), 1,44 (s, 3H), 1,11 (s, 3H), 0,88 (s, 3H) .

Valmistus 24 5 16-sulfoksifenyyli-15,16-dehydro-17-ketomarkfortiini A (kaava 23)

Raakaan 16-tiofenyyli-15,16-dehydro-17-ketomarkfortiini A:han (kaava 22, 10,6 g) metyleenikloridissa (300 ml) -78 °C: ssa lisätään tipoittain m-CPBA:ta (64 %, 2,8 g) CH2Cl2:ssa 10 (125 ml) . Reaktio sammutetaan kylläisellä natriumtiosul- faatilla (300 ml) ja kylläisellä natriumbikarbonaatilla (300 ml), sitten uutetaan metyleenikloridiin (300 ml). Orgaaninen kerros kuivataan (MgSOJ , suodatetaan, ja konsentroidaan, jolloin saadaan 13 g raakaa 16-sulfoksifenyyli-15,16-dehydro-15 17-ketomarkfortiini A:ta (kaava 23). ^-NMR (300 MHz, CDC13) 7,75-7,3 (m, 5H) , 6,81 (s, 1H) , 6,75-6,6 (m, 2H) , 6,31 (d, 1H), 4,90 (d, 1H), 3,78-3,58 (m, 2H), 3,22 (t, 1H), 2,98 (s, 3H) , 2,88-2,45 (m, 2H) , 2,12-1,55 (m, 5H), 1,46 (s, 3H), 1,44 (s, 3H), 1,12 (s, 3H), 0,88 (s, 3H).

20

Valmistus 25 . : 14<x-hydroksi-15/ 16-dehydro-17-ketomarkfortiini A (kaava 9a)

Raakaan 16-sulfoksif enyyli-15,16-dehydro-17-ketomarkfortiini <t>i; A:han (kaava 23, 13 g) MeOH:n vesiliuoksessa (10/1, 300 ml) ... 25 lisätään dietyyliamiinia (15 ml) . Kuumennetaan palautusjääh- dyttäen 0,5 tunnin ajan, minkä jälkeen reaktioseos jäähdyte-tään huoneenlämpötilaan, laimennetaan vedellä (450 ml) , ja ’ uutetaan CH2Cl2:een (500 ml). Kuivataan (MgSOJ , sitten kon sentroidaan, ja kromatografoidaan silikageelillä (130 g, 30 % : 30 asetoni/CH2Cl2 eluenttina) , jolloin saadaan 14a-hydroksi- : ; 15,16-dehydro-17-markfortiini A: ta (kaava 9a, 3,6 g, 50 % _·] . saanto 16-ditiofenyyli-17-ketomarkfortiini A:sta) valkoisena kiinteänä aineena.

: : : 35 Valmistus 26 14a-hydroksi-14p-vinyylimarkfortiini A (kaava 30)

Liuosta, jossa on 14-ketomarkfortiini A:ta (200 mg, 0,4 mmol) THFrssä (5 ml) -78 °C:ssa, käsitellään liuoksella, jossa on 46 115912 vinyylimagnesiumbromidia (1 M, 4,0 ml, 4 mmol) THF:ssä -78 °C:ssa. Tulokseksi saatua seosta sekoitetaan 2 tunnin ajan -78 °C:ssa, ja lämmitetään huoneenlämpötilaan. Sitä sekoitetaan 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Reaktio lämmitetään 5 lisäämällä 10-prosenttista Na2C03:a (3 ml). Seos laimennetaan CH2Cl2:lla (30 ml), pestään kylläisellä ammoniumkloridiliuok-sella, kuivataan (MgS04) , ja konsentroidaan. Jäännös alistetaan silikageelikromatografiällä (6:4 heksaani:asetoni), jolloin saadaan 14a-hydroksi -14β -vinyylimarkfortiini A: ta (12 0 10 mg, 60 %, Rf = 0,45) valkoisena kiinteänä aineena. ^-NMR (3 00 MHz, CDC13) δ 7,86 (s, NH) , 6,78 & 6,67 (d, J = 8,1 Hz, C4-H & C5-H) , 6,32 (d, J = 7,7 Hz, C24-H) , 6,58 (dd, J = 17,4, 10,9

Hz, 1H, vinyyli), 5,43 (d, J = 17,4 Hz, 1H, vinyyli), 5,18 (d, J = 10,9 Hz, 1H, vinyyli), 4,89 (d, J = 7,7 Hz, C25-H) , 15 3,7 (br, 1H) , 3,11 (s, 3H, N-Me) , 2,95 (t, 1H, C20-H) , 2,8-1,5 (m, 12H) , 1,44 (s, 6H, C27-H & C28-H) , 1,08 (s, 3H) , 0,82 (s, 3H), MS (FAB) M/Z [M + H]: 520

Valmistus 27 20 14a-hydroksi-14p-metyylimarkfortiini A-N-oksidi (kaava 32)

Liuosta, jossa on 14a-hydroksimarkfortiini A:ta (30 mg) : CH2Cl2:ssa (3 ml), käsitellään m-klooriperoksibentsoehapolla (20 mg) 0 °C:ssa. Seosta sekoitetaan 0,5 tuntia, minkä . jälkeen se jaetaan 5-prosenttisen natriumbikarbonaatin vesi- ,,, 25 liuoksen (10 ml) ja metyleenikloridin (20 ml) välillä. Ker- rokset erotetaan, ja vesikerros uutetaan metyleenikloridilla *·** (10 ml) . Yhdistetyt uutteet kuivataan magnesiumsulfaatilla, v ' suodatetaan, ja haihdutetaan tyhjössä 0 °C:ssa, käsitellään

trietyyliamiinilla (30 μΐ) , ja konsentroidaan, jolloin [ · j 30 saadaan otsikkoyhdistettä kiinteänä aineena (20 mg) . ^-NMR

: (300 MHz, CD3OD) δ 6,91 & 6,70 (d, J= 8,1 Hz, C4-H & Cs-H) , / . 6,36 (d, J = 7,7 Hz, C24-H) , 4,91 (d, J = 7,7 Hz, C„-H) , 4,08 & 3,76 (AB q, J = 12,9 Hz, 2H, C12-H) , 3,5-3,1 (m, 4H) , 3,12 *·; (s, 3H, N-Me), 2,8-1,6 (m, 7H) , 1,46 & 1,44 (2s, 6H, C27-H & :V: 35 C28-H) , 1,50 (s, 3H, C14-Me) , 1,20 (s, 3H) , 0,93 (s, 3H) .

47 115912

Valmistus 28 14a-hydroksi-15a-nietyylimarkfortiini A (kaava 85) 14a-hydroksi-15a-metyyli-17-ketomarkfortiini A: ta (90 mg, 0,18 mmol) liuotetaan THFrään (10 ml), ja käsitellään boraa-5 ni-dimetyylisulfidi -kompleksilla (12 M, 0,18 ml) 0 °C:ssa. Seosta sekoitetaan 2 tuntia 0 °C:ssa, sitten lisätään MeOHrta (0,4 ml), ja sekoitetaan vielä 1 tunnin ajan. Liuotin haihdutetaan, minkä jälkeen jäännös alistetaan silikageelikromato-grafialle (30:70 asetonirmetyleenikloridi), jolloin saadaan 10 14a-hydroksi-15a-metyylimarkfortiini A: ta (20 mg) kiinteänä aineena. 'h-NMR (300 MHz, CDC13) δ 8,39 (s, NH) , 6,79 & 6,70 (d, J = 8,1 Hz, C4-H & Cs-H) , 6,36 (d, J = 7,7 Hz, C24-H) , 4,91 (d, J = 7,7 Hz, C25-H), 3,81 (br, 1H, C14-H) , 3,67 (d, 1H, J = 11,7 Hz, C12-H) , 3,03 (t, 1H, C20-H) , 3,11 (s, 3H, N-Me) , 2,68 15 & 1,86 (d, 2H, J = 15,7 Hz, C10-H) , 2,7-1,2 (m, 3H) , 1,44 (2s, 6H, C27-H & C28-H) , 1,02 (d, 3H, J = 6,8 Hz, Cls-Me) , 1,11 (s, 3H) , 0,85 (s, 3H) . HRMS (FAB) M/Z [M+H] laskettu C29H37N305+H: lie: 508,2811; mitattu: 508,2840.

20 Valmistus 29 14,17-diketo-15a~nietyylimarkfortiini A (kaava 36) .·. : Liuosta, jossa on oksalyylikloridia (40 μΐ) vedettömässä CH2Cl2:ssa (5 ml), käsitellään DMSO:lla (45 μΐ) -78 °C:ssa. Seosta sekoitetaan 1 tunti -78 °C:ssa. Lisätään tipoittain 25 liuosta, jossa on 14a-hydroksi-15a-metyyli-17-ketomarkfortii-;*;* ni A: ta (27 mg) CH2Cl2:ssa (2 ml). Reaktioseosta sekoitetaan 20 min -78 °C:ssa. Trietyyliamiinia (0,3 ml) lisätään reak-V ' tioseokseen, jonka annetaan lämmetä huoneenlämpötilaan 20 min aikana. Seos jaetaan 10-prosenttisen Na2C03:n (10 ml) ja J 30 CH2Cl2:n (10 ml) välillä. Orgaaninen kerros kuivataan (MgSOJ , ; : ja konsentroidaan. Jäännös alistetaan silikageelikromatogra- ‘ . fialle (1:20 MeOH:CH3C12) , jolloin saadaan 14,17-diketomark- fortiini A: ta (22 mg, 80 %) valkoisena kiinteänä aineena.

Tuotteen rakenne voidaan varmistaa NMR-spektroskopialla ja : : : 35 massaspektrometrialla. HRMS (FAB) M/Z [M+H] laskettu ; C28H31N306+H: lie: 506,2291; mitattu: 506,2280.

48 115912

Valmistus 30 14<x-hydroksi-14p-metyyli-15cc-metyyli-17-ketomarkfortiini A (kaava 37)

Liuosta, jossa on 14,17-diketo-15a-metyylimarkfortiini A: ta 5 (25 mg, 0,05 mmol) CH2Cl2:ssa (5 ml) -78 °C:ssa, käsitellään liuoksella, jossa on metyylimagnesiumbromidia (3 M, 0,2 ml, 0,6 mmol) Et20:ssa -78 °C:ssa. Tulokseksi saatua seosta sekoitetaan 0,5 tuntia -78 °C:ssa. Reaktio sammutetaan lisäämällä 10-prosenttista Na2C03:a (muutamia tippoja). Seos lai-10 mennetaan CH2Cl2:lla (10 ml), kuivataan (MgSOJ , ja konsentroidaan. Jäännös alistetaan silikageelikromatografiälle (1:25 MeOH:CH2C12), jolloin saadaan 14a-hydroksi-14p-metyyli-15a-metyyli-17-ketomarkfortiini A: ta (16 mg, 62 %) valkoisena kiinteänä aineena. ^-NMR (300 MHz, CDC13) δ 8,13 (s, 1H) , 15 6,78 (d, 1H), 6,70 (d, 1H) , 6,33 (d, 1H) , 4,91 (d, 1H) , 3,75 (q, 2H), 3,16 (t, 1H), 3,05 (s, 3H), 2,78 (d, 1H), 2,68-2,57 (m, 1H) , 2,42-2,0 (m, 6H) , 1,64 (s, 3H) , 1,45 (s, 3H) , 1,44 (s, 3H), 1,11 (s, 3H), 1,04 (d, 3H), 0,92 (d, 3H).

2 0 Valmistus 31 14a-hydroksi-14p-metyyli-15<x-nietyyliinarkfortiini A (kaava 38) .*. : 14a-hydroksi-14p-metyyli-15a-metyyli-17-ketomarkfortiini A:ta (15 mg, 0,028 mmol) liuotetaan THF:ään (10 ml), ja käsi-tellään boraani-dimetyylisulf idi -kompleksilla (10 M, ... 25 0,02 ml) 0 °C:ssa. Seosta sekoitetaan 2 tuntia 0 °C:ssa, sitten lisätään MeOH:ta (0,4 ml), ja sekoitetaan vielä 1 tunti. Liuotin haihdutetaan, minkä jälkeen jäännös alistetaan ’ silikageelikromatograf iälle (30:70 asetoni :metyleenikloridi) , jolloin saadaan 14a-hydroksi-14p-metyyli-15a-metyylimarkfor-·,· · 30 tiini A:ta (4 mg, 29 %) kiinteänä aineena. ^-NMR (300 MHz, CDClj) δ 7,82 (s, 1H) , 6,79 (d, 1H) , 6,67 (d, 1H) , 6,33 (d, . 1H) , 4,90 (d, 1H) , 3,65 (d, 1H) , 3,09 (s, 3H) , 2,98 (t, 1H) , 2,69 (d, 1H) , 2,60-2,22 (m, 7H) , 2,06 (dd, 1H) , 1,87 (d, 1H) , 1,85-1,75 (m, 1H) , 1,44 (s, OH), 1,43 (s, 3H) , 1,10 (s, 3H) , :V: 35 0,94 (d, 3H) , 0,86 (s, 3H) .

49 115912

Esimerkki 1 15<x-etyyli-14(x-hydroksi-17-oksoinarkfortiini A (II)

Kupari (I) jodidiin (0,18 g, 0,95 itimol) THF:ssä (10 ml) 0 °C:ssa lisätään tipoittain etyylimagnesiumbromidia (IM in 5 THF, 2 ml, 2 mmol) . Sekoitetaan 0,25 tuntia 0 °C:ssa, minkä jälkeen reaktio käsitellään tipoittain 14a-hydroksi-15,16-dehydro-17-oksomarkfortiini A:11a (I, 0,1 g, 0,2 mmol) THF:ssä (5 ml) 0 °C:ssa. Reaktioseos sammutetaan 1 tunti myöhemmin ammoniumkloridilla (kylläistä, 25 ml), sitten uutetaan 10 etyyliasetaattiin (2 x 25 ml) . Yhdistetyt orgaaniset uutteet kuivataan magnesiumsulfaatilla, suodatetaan, ja konsentroidaan alennetussa paineessa, jolloin saadaan jäännöstä. Jäännös kromatografoidaan (silikageeli; metanoli/metyleeni-kloridi (4/96), jolloin saadaan otsikkoyhdistettä, ^-NMR 15 (400 MHz, CDClj) 7,75, 6,80, 6,70, 6,32, 4,91, 4,66, 3,75, 3,20, 3,06, 2,79, 2,09, 2,40-1,50, 1,48, 1,44, 1,11, 1,02 ja 0,90 δ; MS (FAB, M/Z) [M+H] = 536.

Esimerkki 2 20 15a-etyyli-14a-hydroksimarkfortiini A (III) 15a-etyyli-14a-hydroksi-17-oksomarkfortiini A:ta (I, esimerk-: ki 1, 40 mg, 0,075 mmol) liuotetaan THF:ään (5 ml), ja käsi- tellään boraani-dimetyylisulf idi -kompleksilla (10 M, * · , 0,08 ml, 0,8 mmol) 0 °C:ssa. Seosta sekoitetaan 1 tunti 0 ,,, 25 °C:ssa, sitten sammutetaan metanolilla (0,2 ml), ja sekoitetaan vielä 0,25 tuntia 20-25 °C:ssa. Liuotin poiste-taan, jolloin saadaan jäännöstä, joka kromatogroidaan (sili-V · kageeli; metanoli/metyleenikloridi (4/96)), jolloin saadaan otsikkoyhdistettä, NMR (400 MHz, CDCl3) 7,85, 6,80, 6,67, : ; j 3 0 6,33, 4,90, 3,92, 3,67, 3,10, 3,01, 2,69, 1:87, 2,65-1,20, ; 1,45, 1,44, 1,12, 0,97 ja 0,88 δ; HRMS (FAB, M/Z) [M+H] . laskettu C30H39N3O5+H: lie = 522,2968, mitattu = 522,2958.

’ Esimerkki 3 35 14a-hydroksi-15a-vinyyli-17-oksomarkfortiini A (IV) ; ; Noudattamalla esimerkin 1 yleistä menettelytapaa ja tehden ei-kriittisiä muutoksia mutta käyttäen etyylimagnesiumbromi-din sijasta vinyylimagnesiumbromidia (1 M THF:ssä, 39,5 ml, 50 115912 0,04 mol) saadaan otsikkoyhdistettä, NMR (400 MHz, CDC13) 7,69, 6,80, 6,71, 6,32, 4,91, 6,11-5,95, 5,32-5,20, 4,50, 3,21, 3,08, 3,07-3,0, 2,80, 2,10, 2,66, 2,32, 2,20-1,80, 1,46, 1,44, 1,11 ja 0,89 δ.

5

Esimerkki 4 140t-hydroksi-15C(- (1,2 -dihydroksietyyli) -17-oksomarkfortiini A (V)

Yhdistetään osmiumtetroksidiliuosta (2,5/97,5) 2-metyyli-2-10 propanolissa, 1,9 ml), 4-metyylimorfoliini-N-oksidia (1,9 g, 0,016 mol) ja 14a-hydroksi-15a-vinyyli-17-oksomarkfortiini A: ta (IV, esimerkki 3, 1,9 g, 0,0035 mol), ja sekoitetaan 6 tuntia 20-25 °C:ssa asetoni/vedessä (9/1, 100 ml). Reaktio jaetaan veden (200 ml) ja metyleenikloridin (250 ml) välillä. 15 Orgaaninen kerros kuivataan magnesiumsulfaatilla, suodate taan, ja konsentroidaan alennetussa paineessa, jolloin saadaan jäännöstä. Jäännös kromatografoidaan (silikageeli; me-tanoli/metyleenikloridi (10/90)), jolloin saadaan otsikkoyhdistettä, HRMS (FAB, M/Z) [M+H] laskettu C30H37N3O8+H: lie = 20 568,2659, mitattu = 568,2670.

: Esimerkki 5 * « · #t<ij 14a-hydroksi-15(x-hydroksimetyyli-17-oksomarkfortiini A (VI) 14a-hydroksi-15a-(1,2 -dihydroksietyyli)-17-oksomarkfortiini ... 25 A:han (V, esimerkki 4, 1 g, 1,8 mmol) etanolissa (100 ml) • · ;;* 0 °C:ssa lisätään tipoittain natriumperjodaattia (0,68 g f ! · 40 ml:ssa vettä). Sekoitetaan 10 min 0 °C:ssa, minkä jälkeen ' lisätään natriumborohydridiä, ja tulokseksi saatua seosta se koitetaan vielä 10 min 0 °C:ssa. Reaktioseos sammutetaan suo-j.: | 30 laliuoksella (150 ml), ja uutetaan metyleenikloridiin (200 ; : ml). Orgaaninen uute kuivataan magnesiumsulfaatilla, suodate- . taan, ja konsentroidaan alennetussa paineessa, jolloin » « · saadaan jäännöstä, joka kromatograf oidaan (silikageeli; » t metanoli/metyleenikloridi (5/95)), jolloin saadaan otsikko-:Yl 35 yhdistettä, NMR (400 MHz, CDC13) 7,73, 6,81, 6,71, 6,32, Γ'; 4,92, 4,72, 4,06, 3,83, 3,76, 3,21, 3,06, 2,90-2,30, 2,80, 2,10, 2,22, 2,01, 1,46, 1,44, 1,12 ja 0,89 δ; MS (FAB, M/Z) [M+H] = 538.

51 115912

Esimerkki 6 15<x-fluorimetyyli-14ot-hydroksi-17-oksomarkfortiini A (VII)

Yhdistetään 14a-hydroksi-15a-hydroksimetyyli-17-oksomarkfor-5 tiini A: ta (VI, esimerkki 5, 0,06 g, 0,1 mmol), tetrabutyy-

liammoniumfluoridia (1 M THF:ssä, 0,66 ml, 0,66 mmol) ja p-tolueenisulfonyylifluoridia (0,075 g, 0,43 mol), ja kuumennetaan 0,5 tunnin palautusjäähdyttäen THF:ssä (10 ml). Seos jäähdytetään, ja konsentroidaan. Konsentraatti kromatografoi-10 daan (silikageeli), jolloin saadaan otsikkoyhdistettä, NMR

(400 MHz, CDC13) 7,93, 6,80, 6,70, 6,32, 4,90, 4,80-4,50, 4,67, 3,75, 3,21, 3,06, 2,78, 2,15, 2,70-1,50, 1,46, 1,44, 1,12 ja 0,89 δ.

15 Esimerkki 7 15<x-fluorimetyyli-14{x-hydroksimarkfortiini A (VII) 15a-fluorimetyyli-14a-hydroksi-17-oksomarkfortiini A:ta (VII, esimerkki 6, 15 mg, 0,027 mmol) liuotetaan THF:ään (5 ml), ja

käsitellään boraani-tetrahydrofuraani -kompleksilla (1 M

20 THF:ssä, 0,15 ml, 0,15 mmol) 0 °C:ssa. Seosta sekoitetaan 1,5 tuntia 0 °C:ssa, sitten sammutetaan metanolilla (0,75 ml), ja : sekoitetaan vielä 0,25 tuntia 20-25 °C:ssa. Liuotin poiste- * · taan, jolloin saadaan jäännöstä. Jäännös kromatograf oidaan » · iij<; (silikageeli; metanoli/metyleenikloridi (5/95)), jolloin saa- ,,, 25 daan otsikkoyhdistettä, NMR (400 MHz, CDC13) 7,57, 6,80, V:* 6,68, 6,33, 4,90, 4,75-4,30, 4,09, 4,80, 3,50, 3,12, 3,05, v : 2,70, 1,88, 2,80-1,40, 1,45, 1,44, 1,12 ja 0,86 δ; HRMS (FAB, V : M/Z) [M+H] laskettu C29H36FN305+H: lie = 526,2717, mitattu = 526,2727.

j ; I 30 ; Esimerkki 8 14,15-dehydro-15-metyylimarkfortiini A (IX)

Dietyyliaminorikkitrifluoridia (DAST, 0,15 ml, 1,1 mmol) li-sätään tipoittain 20-25 °C:ssa 14a-hydroksi-15a-metyylimark-: 35 fortiini A:han (III, n3 = 0, 0,2 g, 0,39 mmol), joka on liuo- ; tettu metyleenikloridiin (15 ml). Reaktioseosta sekoitetaan 5 min, minkä jälkeen se jaetaan veden (25 ml) ja mety- leenikloridin (25 ml) välillä. Orgaaninen kerros kuivataan 52 115912 magnesiumsulfaatilla, suodatetaan, konsentroidaan alennetussa paineessa, ja kromatografoidaan (silikageeli), jolloin saadaan otsikkoyhdistettä, NMR (400 MHz, CDC13) 7,67, 6,81, 6,68, 6,33, 4,90, 5,46, 3,66, 3,14, 3,10, 2,70, 1,88, 2,75-5 2,54, 2,30, 1,92, 1,78, 1,46, 1,44, 1,12 ja 0,86 δ·

Esimerkki 9 14,15-dehydro-16o-hydroksi-15-metyylimarkfortiini A (X)

Seleenidioksidia (8 mg, 0,07 mmol) ja 14,15-dehydro-15-metyy-10 limarkfortiini A: ta (IX, esimerkki 8, 30 mg, 0,06 mmol) kuumennetaan 1,5 tunnin ajan palautusjäähdyttäen p-dioksaanissa. Konsentroidaan alennetussa paineessa, sen jälkeen kromatogra-foidaan (silikageeli), jolloin saadaan otsikkoyhdistettä, NMR (400 MHz, CDClj) 7,60, 6,81, 6,69, 6,32, 4,90, 5,55, 3,75, 15 2,53, 3,67, 3,14, 3,10, 2,88-2,70, 2,30, 1,90, 1,95-1,50, 1,46, 1,45, 1,11 ja 0,87 δ; MS (FAB, M/Z) [M + H] = 506.

Esimerkki 10 14a-hydroksi-16,17-diokso-15<x-metyylimarkfortiini a (XI) 2 0 14a-hydroksi-15a-metyylimarkfortiini A: ta (III, 100 mg) liuo tetaan dioksaani/veteen (3/1: 20 ml), ja käsitellään Pt/C:llä , : (10 %, 1 g) . Tulokseksi saatu seos pannaan hapen alle (palloa i * käyttäen), ja sekoitetaan 16 tuntia 20-25 °C:ssa. Kataly- . saattori suodatetaan pois, minkä jälkeen liuos jaetaan nat- 25 riumbikarbonaatin vesiliuoksen (10 %) ja metyleenikloridin ' ·*' välillä. Orgaaninen kerros erotetaan, kuivataan magnesiumsul- * ' faatilla, ja konsentroidaan. Konsentraatti alistetaan kromato- V* grafialle (silikageeli; metanoli/metyleenikloridi (5/95)).

Yhdistetään sopivat fraktiot ja konsentroidaan, jolloin saa-: ; 30 daan neljää yhdistettä: (1) 14a-hydroksi-16,17-diokso-15cx-me- ; tyylimarkfortiini A:ta, NMR (400 MHz, CDC13) 8,35, 6,82, 6,71, . 6,32, 4,90, 4,53, 3,90, 3,76, 3,4-3,3, 3,26, 3,00, 2,80, 2,14, ’· : 2,20, 1,98, 1,45, 1,43, 1,31, 1,12 ja 0,86 δ; HRMS (FAB, M/Z)

[M+H] laskettu C2 H3 N307+H:lle = 536,2397, mitattu = 536,2392; 35 (2) 14a-hydroksi-16-okso-15a-metyyliparaherkvamidi B:tä, NMR

; (400 MHz, CDC13) 7,81, 6,82, 6,72, 6,33, 4,91, 4,94, 3,73, 3,53, 3,4-3,3, 3,26, 3,06, 2,82, 2,04, 2,9-2,8, 1,9-2,1, 1,46, 1,44, 1,27, 1,11 ja 0,88 δ; HRMS (FAB, M/Z) [M+H] laskettu 53 115912 C28H33N306+H: lie = 508,2447, mitattu = 508,2453, (3) 14α- hydroksi-17-okso-15a-metyylimarkfortiini A:ta, NMR (400 MHz, CDClj) 7,89, 6,80, 6,71, 6,32, 4,91, 4,35, 3,65, 3,20, 3,06, 2,79, 2,09, 1,9-2,5, 1,46, 1,44, 1,13, 1,12 ja 0,88 δ; (4) 5 l4a-hydroksi-16-hydroksi-17-okso-15a-metyylimarkfortiini A:ta, HRMS (FAB, M/Z) [M+H] laskettu C29H35N307+H: lie = 538,2553, mitattu = 538,2544.

Esimerkki 11 10 14a-hydroksi-16-okso-15a-metyyliparaherkvamidi B (XII) 14a-hydroksi-16,17-diokso-15a-metyylimarkfortiini A:ta (XI, esimerkki 10) liuotetaan metyleenikloridiin (5 ml) , ja käsitellään m-klooriperbentsoehapolla (65 % puhdasta, 30 mg). Tulokseksi saatua seosta sekoitetaan 1,5 tuntia 20-25 °C:ssa. 15 Seos jaetaan metyleenikloridin (20 ml) ja kaliumkarbonaatin (10 % vesiliuos, 20 ml) välillä. Orgaaninen kerros erotetaan, kuivataan magnesiumsulfaatilla, ja konsentroidaan. Konsent-raatti krromatografoidaan (silikageeli; metanoli/metyleeniklo-ridi (5/95)), jolloin saadaan otsikkoyhdistettä, NMR (400 MHz, 20 CDC13) NMR (400 MHz, CDC13) 7,81, 6,82, 6,72, 6,33, 4,91, 4,94, 3,73, 3,53, 3,4-3,3, 3,26, 3,06, 2,82, 2,04, 2,9-2,8, 1,9-2,1, ·. ; 1,46, 1,44, 1,27, 1,11 ja 0,88 δ.

, Esimerkki 12 2 5 14α-hydroksi-15a -me tyy 1iparaherkvamidi B (XIII) ·;’ Litiumaluminiumhydridiä (1 M liuos THF:ssä, 0,21 ml) THF:ssä ' ' ‘ (10 ml) -60 °C:ssa käsitellään alumiinikloridilla (15 mg, 3 : erää). Seosta sekoitetaan, ja se lämmitetään -25 °C:seen, ja lisätään hitaasti 14a-hydroksi-16-okso-15a-metyyliparaherkva-: : 30 midi B:tä (XII, esimerkki 11) (20 mg, 2 ml in THF) . Seosta : : sekoitetaan 20 min -25 °C:ssa. Seokseen lisätään metanolia 7 . (0,8 ml), sitten natriumsyaaniborohydridiä (50 mg). Tulokseksi ‘ saatu seos lämmitetään 20-25 °C:seen, ja konsentroidaan. Kon- sentraatti jaetaan metyleenikloridin (20 ml) ja kaliumkar-; 35 bonaatin (10 % vesiliuos, 20 ml) välillä. Orgaaninen kerros : ; erotetaan, kuivataan magnesiumsulfaatilla, ja konsentroidaan.

Konsentraatti alistetaan kromatografiälle (silikageeli; ase-toni/heksaani (40/60)), jolloin saadaan otsikkoyhdistettä, NMR

54 115912 (400 MHz, CDClj) 7,56, 6,82, 6,69, 6,32, 4,90, 4,42, 3,64, 2,62, 3,08, 3,04, 2,9-1,5, 1,46, 1,45, 1,12, 1,08 ja 0,86 δ; HRMS (FAB, M/Z) [M+H] laskettu C28H35N305+H: lie = 494,2662, mitattu = 494,2655.

5

Esimerkki 13

16,17-dioksomarkfortiini Λ (XV), 16-oksoparaherkvamidi B (XVI), 15-hydroksi-16-oksoparaherkvamidi B, 15,16-dioksopara-herkvamidi B

10 Markfortiini A: ta (XIV, 1,1 g, 2,3 mmol) liuotetaan dioksaa-ni/veteen (3/1, 150 ml), ja käsitellään Pt/C:llä (10 %, 10 g). Tulokseksi saatua seosta sekoitetaan 48 tuntia happi-ilmake-hässä (happipallo) 20-25 °C:ssa. Katalysaattori suodatetaan pois, ja tulokseksi saatu seos jaetaan metyleenikloridin ja 15 veden välillä. Orgaaninen faasi erotetaan, kuivataan magnesiumsulfaatilla, suodatetaan, ja haihdutetaan alennetussa paineessa, jolloin saadaan jäännöstä. Jäännös kromatografoidaan (silikageeli; asetoni/metyleenikloridi, 30/70), jolloin saa daan: 20 (1) 16,17-dioksomarkfortiini A: ta, NMR (400 MHz, CDC13) 7,69, : 6,81, 6,74, 6,32, 4,92, 3,95, 3,80, 3,32, 3,15, 3,14-2,70, « # 9 ! 2,19-1,86, 1,47, 1,45, 1,12 ja 0,88 δ; » n » I • · 25 (2) 16-oksoparaherkvamidi B:tä, NMR (400 MHz, CDC13) 7,81, I · 6.80, 6,71, 6,32, 4,91, 3,74, 3,52, 3,29, 3,08, 3,0-2,85, 2.80, 2,00, 2,55-2,49, 2,08-1,75, 1,46, 1,44, 1,10 ja 0,88 δ; HRMS (FAB, M/Z [M+H]) laskettu C27H31N305+H: lie = 478,2342, mitattu = 478,2384; ; 30 (3) 15-hydroksi-16-oksoparaherkvamidi B:tä, diastereomeerit vaikeuttavat NMR:ää. HRMS (FAB M/Z [M+H]) laskettu : C27H31N306+H: lie = 494,2291, mitattu = 494,2292; 35 (4) 15,16-dioksoparaherkvamidi B:tä, NMR (400 MHz, CDC13) ; 7,60, 6,83, 6,74, 6,32, 4,92, 4,12, 3,84-3,70, 3,46, 3,14,

2,89, 2,13, 2,50, 2,25, 1,95, 1,47, 1,45, 1,11 ja 0,90 δ; HRMS

55 115912 (FAB M/Z [M+H] ) laskettu C27H29N306+H: lie = 492,2134, mitattu = 492,2141.

Esimerkki 14 5 14,15-dehydro-16-oksoparaherkvamidi B (XVII)

Seosta, jossa on THF:ssä (4 ml) litiumdi-isopropyyliamidia, joka on valmistettu n-butyylilitiumista (1,6 M heksaanissa, 1,2 mmol,0,78 ml) ja di-isopropyyliamiinista (1,3 mmol, 0,17 ml), jäähdytetään -60 °C:seen. Lisätään tipoittain seos-10 ta, jossa on 16-oksoparaherkvamidi B:tä (XVI, esimerkki 13, 0,15 g, 0,3 mmol) THF:ssä (1,5 ml), ja reaktioseoksen annetaan lämmetä 0,25 tunnin aikana -20 °C:seen. 2 Seos käsitellään tipoittain fenyyliselenyylikloridilla (0,075 g, 0,39 mmol) THF:ssä (1 ml), sitten sammutetaan 5 min myöhemmin kylläisellä 15 natriumbikarbonaatilla (20 ml) . Reaktioseos uutetaan metylee-nikloridiin (30 ml) , kuivataan magnesiumsulfaatilla, suodatetaan, ja konsentroidaan alennetussa paineessa, jolloin saadaan kiinteää ainetta, jota käytetään enempää puhdistamatta. Tämä materiaali liuotetaan THF:ään (8 ml) , ja käsitellään vetype-20 roksidilla (30 %, 0,12 ml) 0 °C:ssa. Jäähdytyshaude poiste taan, ja reaktioseosta sekoitetaan 0,25 tuntia 20-25 °C:ssa. ·, ; Reaktio sammutetaan natriumhydroksidilla (1 N, 10 ml), uute- 4 t . taan metyleenikloridiin (30 ml), kuivataan magnesiumsulfaatil- , la, suodatetaan, konsentroidaan alennetussa paineessa, ja * ' i 25 alistetaan kromatografiälle (silikageeli; metanoli/metyleeni- ·* kloridi, 5/95), jolloin saadaan otsikkoyhdistettä, NMR (400 V MHz, CDC13) 7,78, 7,36, 6,25, 6,81, 6,70, 6,32, 4,91, 3,96, , : 3,60, 3,36, 3,09, 2,88, 2,09, 2,36, 1,56, 1,46, 1,45, 1,06 ja 0,88 δ; HRMS (FAB, M/Z) [M+H] laskettu C27H25N305+H: lie = : , 30 476,2185, mitattu = 476,2195.

Esimerkki 15 14a-hydroksi-15a-metyyli-2-desoksoznarkfortiini a (XXI) 14a-hydroksi-15a-metyyli-17-oksomarkfortiini A:han (XIX, 21 g, ; 35 0,04 mol) THF:ssä (1,3 1) 0 °C:ssa lisätään tipoittain boraa- ; ni-dimetyylisulfidi -kompleksia (12 M, 40 ml, 0,48 mol). Tu lokseksi saatua seosta sekoitetaan 2,5 tuntia 0 °C:ssa, sitten sammutetaan lisäämällä hitaasti tipoittain metanolia (50 ml).

56 115912

Liuotin poistetaan alennetussa paineessa, jolloin saadaan jäännöstä, joka alistetaan kromatografiälle (silikageeli; metanoli/metyleenikloridi, 3/97), jolloin saadaan 14a-hydrok- si-15a-metyylimarkfortiini A:ta ja 14a-hydroksi-15a-metyyli-2-5 desoksomarkfortiini A: ta, NMR (400 MHz, CDC13) δ 6,66, 6,40, 6,29, 4,79, 3,92, 3,41, 3,78, 3,55, 2,92, 2,62, 2,35, 2,25,

2,26, 2,15, 2,10-1,40, 1,40, 1,04, 1,02, 0,89, 0,91; HRMS

(FAB, m/z) [M+H] laskettu C29H39N304+H: lie = 494,3019, mitattu = 494,3208.

10

Esimerkki 16 2-desoksomarkfortiini A (XXIII)

Markfortiini A:han (XXII, 0,16 g, 0,335 mmol) THF:ssä (25 ml) 0 °C:ssa lisätään tipoittain alaani-N,N-dimetyylietyyliamiini 15 -kompleksia (0,5 M, 2,6 ml, 13,4 mmol). Tulokseksi saatua

seosta sekoitetaan 1 tunti 0 °C:ssa, sitten sammutetaan lisäämällä hitaasti tipoittain metanolia (5 ml) . Sitten liuotin poistetaan alennetussa paineessa, jolloin saadaan jäännöstä, joka alistetaan kromatografialle (silikageeli; asetoni/mety-20 leenikloridi, 30/70), jolloin saadaan otsikkoyhdistettä, NMR

(400 MHz, CDC13) δ 6,67, 6,40, 6,29, 4,79, 3,91, 3,40, 3,57, 2,36, 2,95, 2,30-2,05, 1,95-1,25, 1,39, 0,88, 0,85; 13C-NMR

(CDC13, 100 MHz) δ 175,40, 146,26, 143,77, 139,74, 137,06, t>. 126,78, 120,11, 114,88, 114,19, 79,67, 63,66, 61,13, 61,05, 25 60,74, 56,23, 54,68, 45,77, 41,92, 32,15, 31,94, 31,83, 30,30, 26,28, 26,19, 23,38, 21,13, 19,75; HRMS (FAB, m/z) [M+H] * t * laskettu C28H37N303+H: lie = 464,2913, mitattu = 464,2929.

Esimerkki 17

30 C-2-deoksoparaherkvamidi A

: ’ ; Paraherkvamidi A:han (0,05 g, 0,1 mmol) tetrahydrofuraanissa .* . (THF, 6 ml) 20-25 °C:ssa typpi-ilmakehässä lisätään tipoittain alaani -N, N-dimetyyliamiini -kompleksia (0,5 M tolueenissa, 2 ml, 1 mmol). Tulokseksi saatua reaktioseosta sekoitetaan 0,5 : : : 35 tuntia, sitten sammutetaan metanolilla (1 ml) . Seos kon- : ; sentroidaan alennetussa paineessa, jolloin saadaan jäännöstä, joka puhdistetaan kromatografoimalla (silikageeli; asetoni/me-tyleenikloridi (30/70)), jolloin saadaan otsikkoyhdistettä, 57 115912 NMR (400MHz, CDC13) 6,69, 6,30, 4,80, 3,94, 3,51, 3,39, 3,19, 2,92, 2,53, 2,38-2,12, 2,08, 1,95-1,74, 1,65, 1,43, 0,92 & 0,89 δ; HRMS (FAB, M/Z [M+H] laskettu C^NjO^H: lie = 480,2862, mitattu = 480,2869.

5

Esimerkki 18 N(l)-fenoksikarbonyylimarkfortiini A (XXVII)

Markfortiini A:ta (XXVI, 2,4 g, 5,0 mmol) THF:ssä (120 ml) ja kaliumhydridiä (35-paino-%, 0,7 g, 6,2 mmol) sekoitetaan 1 10 tunti 20-25 °C:ssa. Tähän seokseen lisätään fenyylikloori-formiaattia (1,2 ml, 9,6 mmol). Seosta sekoitetaan 0,5 tuntia, sammutetaan kaliumkarbonaattiliuoksella (10 %, 50 ml), ja uutetaan etyyliasetaattiin (150 ml). Orgaaninen kerros kuivataan magnesiumsulfaatilla, suodatetaan, ja konsentroidaan. Jäännös 15 trituroidaan eetteri/heksaanilla, ja sakka suodatetaan, kerätään ja kuivataan, jolloin saadaan otsikkoyhdistettä kiinteänä aineena, NMR (400 MHz, CDC13) 0,89, 1,08, 1,2-3,0, 1,45, 1,49, 3,06, 3,69, 4,83, 6,26, 6,89 ja 7,2-7,5 δ; HRMS (FAB, m/z) [M+H] laskettu C33H39N306+H+: lie = 598,2917, mitattu = 598,2919.

20

Esimerkki 19 .*. : N(l)-tert-butoksikarbonyylimarkfortiini A (XXVII) • I t

Markfortiini A: ta (XXVI) THF/metyleenikloridissa (50 ml/50 ml) • · . ja kaliumhydridiä (35-paino-%, 0,62 g, 5,5 mmol) sekoitetaan 1 t * ,,, 25 tunti 2 0-25 °C:ssa. Tähän seokseen lisätään di-tert-butyyli- bikarbonaattia (3,4 g, 15,6 mmol). Seosta sekoitetaan 0,5 tuntia, sammutetaan kaliumkarbonaattiliuoksella (10 %, 50 ml) .* ’ ja uutetaan etyyliasetaattiin (150 ml). Orgaaninen kerros ero tetaan, ja kuivataan magnesiumsulfaatilla, suodatetaan, ja j j 30 konsentroidaan. Konsentraatti trituroidaan eetteri/heksaanil-la, ja sakka suodatetaan, kerätään ja kuivataan, jolloin saa-,* . daan otsikkoyhdistettä, NMR (400 MHz, CDC13) 0,83, 1,05, 1,2- 3,0, 1,46, 1,53, 1,59, 3,12, 3,67, 4,85, 6,28 ja 6,82 δ; HRMS (FAB, m/z) [M+H] laskettu C35H43N306C+H+: lie = 578,3230, mitattu ;Y: 35 = 578,3230.

58 115912

Esimerkki 20 N(l)-4'-nitrofenoksikarbonyylimarkfortiini A (XXVII)

Noudattamalla esimerkkien 18 ja 19 yleistä menettelytapaa ja tehden ei-kriittisiä muutoksia mutta käyttämällä 4-nitrofenyy-5 liklooriformiaattia (423 mg, 2,1 mmol) saadaan otsikkoyhdis-tettä, NMR (400 MHz, CDC13) 0,89, 1,08, 1,2-3,0, 1,45, 1,49, 3,06, 3,69, 4,83, 6,26, 6,92, 7,50 ja 8,33 δ; HRMS (FAB, m/z) [SI+H] laskettu C35H38N408+H+: lie = 643,2767, mitattu = 643,2766.

10 Esimerkki 21 N(l)-91-fluorenyylimetyylioksikarbonyylimarkfortiini A (XXVII)

Noudattamalla esimerkkien 18-20 yleistä menettelytapaa ja tehden ei-kriittisiä muutoksia mutta käyttämällä 9-fluorenyy-limetyyliklooriformiaattia (1,6 g, 6 m mol) saadaan otsikkoyh-15 distettä, valittu NMR (400 MHz, CDC13) 7,78, 7,66, 7,42, 6,89, 6,20, 4,82, 4,70-4,60, 4,39, 3,16, 2,85, 1,45 ja 1,43 δ; MS

(FAB, m/z) [M+H] = 700.

Esimerkki 22 2 0 N(l) -tert-butoksikarbonyyliparaherkvamidi A (XXVII)

Paraherkvamidi A:ta (XXV, 70 mg, 0,14 mmol) THFissä (10 ml) ja .*. : kaliumhydridia (35-paino-%, 0,062 g, 0,55 mmol) sekoitetaan 2 • * * tuntia 20-25 °C:ssa. Tähän seokseen lisätään di-tert-bu tyyli dikarbonaattia (86 mg, 0,42 mmol). Seosta sekoitetaan 0,5 » · * « * ... 25 tuntia, sammutetaan 10-prosenttisella kaliumkarbonaattiliuok- sella (50 ml), ja uutetaan etyyliasetaattiin (150 ml). Orgaa-’·’* ninen kerros kuivataan magnesiumsulfaatilla, suodatetaan, ja : konsentroidaan. Tiiviste puhdistetaan preparatiivisella TLC:llä (metanoli/metyleenikloridi, 5/95), jolloin saadaan : 30 otsikkoyhdistettä, NMR (400 MHz, CDC13) 0,89, 1,02, 1,42, : ’ ; 1,46, 1,59, 1,63, 1,2-3,3, 3,06, 3,69, 4,83, 6,26 ja 6,80 δ.

• » » ’ Esimerkki 23 • ‘ N(1)-4'-nitrofenoksikarbonyyliparaherkvamidi A (XXVII) : : 35 Noudattamalla esimerkin 22 yleistä menettelytapaa, ja tehden ; ei-kriittisiä muutoksia mutta käyttämällä 4-nitrofenyylikloo- riformiaattia (814 mg, 4,2 mmol) saadaan otsikkoyhdistettä, NMR (400 MHz, CDC13) 0,85, 0,94, 1,2-3,9, 1,40, 1,47, 3,02, 59 115912 4,79, 5,85, 6,18, 6,88, 7,35 ja 8,29 δ; HRMS (FAB, m/z) [M+H] laskettu C35H38N409+H+: lie = 659,2717, mitattu = 659,2732.

Esimerkki 24 5 N(l) -4 1 -nitrofenoksikarbonyyli-14oi-hydroksi-14p-metyylimark-fortiini A (XXVII) 14a-hydroksi-14p-metyylimarkfortiini A:ta (XXVI, n = 2, R14 =

Me, R15 = H, R16 = OH, 0,188 g, 0,37 mmol) THF: ssä (30 ml) ja natriumhydridiä (60-paino-%, 0,075 g, 1,875 mmol) sekoitetaan 10 2 tuntia 20-25 °C:ssa. Tähän seokseen lisätään 4-nitrofenyy- liklooriformiaattia (150 mg, 0,74 mmol). Seosta sekoitetaan 0,5 tuntia, sammutetaan puskuriliuoksella pH 7 (15 ml), ja uutetaan etyyliasetaattiin (50 ml) . Orgaaninen kerros erotetaan, ja kuivataan magnesiumsulfaatilla, suodatetaan, ja kon-15 sentroidaan, jolloin saadaan otsikkoyhdistettä, NMR (400 MHz, CDC13) 0,92, 1,07, 1,2-3,0, 1,44, 1,47, 1,48, 3,13, 3,67, 4,87, 6,25, 6,92, 7,50 ja 8,35 δ; HRMS (FAB, m/z) [M+H] laskettu C36H42N409+H+: lie = 673,2873, mitattu = 673,2866.

20 Esimerkki 25 N(l) -4' -nitrof enoksikarbonyyli-14α-hydroksi-15α“ΠιetyyliIIιark-.·. : fortiini A (XXVII)

Noudattamalla esimerkkien 18-24 yleisiä menettelytapoja ja , tehden ei-kriittisiä muutoksia mutta käyttämällä 14a-hydroksi- ,,, 25 15a-metyylimarkfortiini A: ta (XXVI, n = 2, R14 = H, R15 = Me, R16 = OH, 1,98 g, 3,9 mmol) ja 4-nitrof enyylikloorif ormiaattia '·*·’ (150 mg, 0,74 mmol) saadaan otsikkoyhdistettä, NMR (400 MHz, V : CDC13) 0,92, 1,02, 1,09, 1,2-3,0, 1,44, 1,47, 3,14, 3,68, 3,95, 4,87, 6,24, 6,92, 7,50 ja 8,34 δ; HRMS (FAB, m/z) [M+H] ·,: j 30 laskettu C36H40N4O9+H+: lie = 673,2873, mitattu = 673,2866.

. Esimerkki 26

N(l)-f enoksikarbonyyli-2a-hydroksi-2-desoksomarkf ortiini A

i » (=VIII) : 35 N(l)-fenoksikarbonyylimarkfortiini A:ta (esimerkki 18, 2,4 g, : 4,0 mmol) liuotetaan metanoliin (100 ml), ja käsitellään 15 min ajan natriumborohydridillä (540 mg) 0 °C:ssa. Reaktioseos sammutetaan kaliumkarbonaatilla (10 %, 100 ml). Tulokseksi 60 11 591 2 saatu sakka kuivataan, jolloin saadaan otsikkoyhdistettä, NMR (400 MHz, CDCl3) 0,85, 0,92, 1,3-2,7, 1,37, 1,48, 3,06, 3,18, 3,43, 3,61, 4,75, 5,87, 6,28, 6,84 ja 7,2-7,5 δ; HRMS (FAB, m/z) [M+H] laskettu C35H41N306+H+: lie = 600,3073, mitattu = 5 600,3080.

Esimerkki 27 N(l) -41 -nitrof enoksikarbonyyli-2<x-hydroksi-2-desoksomarkfor-tiini A (XXVIII)

10 Noudattamalla esimerkin 26 yleistä menettelytapaa ja käyttämällä N(1)-4'-nitrofenoksikarbonyylimarkfortiini A:ta (esimerkki 20, 0,5 g, 0,78 mmol) saadaan otsikkoyhdistettä, NMR

(400 MHz, CDC13) 0,82, 0,89, 1,3-2,7, 1,39, 1,47, 3,06, 3,18, 3,59, 4,78, 5,85, 6,20, 6,84, 7,36 ja 8,28 δ; HRMS (FAB, m/z) 15 [M+H] laskettu C35H40N4O8+H*: lie = 645,2924, mitattu = 649,2925.

Esimerkki 28 N(l)-9'-fluorenyy1imetyy1ioks ikarbonyy1i-2α-hydroks i - 2 -desoksomarkfortiini A (XXVIII) 20 Noudattamalla esimerkin 26 yleistä menettelytapaa ja tehden ei-kriittisiä muutoksia mutta käyttämällä N(1)-9'-fluorenyyli- .·. : metyylioksikarbonyylimarkfortiini A: ta (esimerkki 21, 30 mg, • < · t<>>; 0,043 mmol) saadaan otsikkoyhdistettä, valikoitu NMR (400 MHz, . CDC13) 7,88-7,20, 6,72, 6,64, 6,38, 4,76, 4,28, 3,01, 2,85 ja *.,* 25 2,60 δ· ! t t ·'>' Esimerkki 29 • · N(l)-4'-nitrofenoksikarbonyyli-2a-hydroksi-2-desoksoparaherk- vamidi A (XXVIII) ; 30 Noudattamalla esimerkin 26 yleistä menettelytapaa ja tehden ei-kriittisiä muutoksia mutta käyttämällä N(1)-4'-nitrofenok-. sikarbonyyliparaherkvamidi A: ta (esimerkki 23, 1,0 g, 1,52 mmol) saadaan otsikkoyhdistettä, NMR (400 MHz, CDC13) '·;·* 0,85, 0,93, 1,3-2,7, 1,40, 1,47, 1,63, 3,02, 3,2-3,6, 4,79, :Y: 35 5,85, 6,18, 6,88, 7,35 ja 8,28 δ; HRMS (FAB, m/z) [M+H] laskettu C35H40N4O9+H+: lie = 661,2873, mitattu = 661,2877.

61 115912

Esimerkki 30 N(l) -4 1 -nitrofenoksikarbonyyli-14oc-hydroksi-14β-metyyli-2α-hydroksi-2-desoksomarkfortiini A (XXVIII)

Noudattamalla esimerkin 26 yleistä menettelytapaa ja tehden 5 ei-kriittisiä muutoksia mutta käyttämällä N(l)-4'-nitrofenok-sikarbonyyli-14a-hydroksi-14p-metyylimarkfortiini A:ta (esimerkki 24, 180 mg, 0,27 mmol) saadaan otsikkoyhdistettä, NMR

(400 MHz, CDClj) 0,85, 0,91, 1,3-2,7, 1,40, 1,45, 1,48, 3,09, 3.1- 3,7, 4,79, 5,88, 6,21, 6,87, 7,36 ja 8,29 δ; HRMS (FAB, 10 m/z) [M+H] laskettu C36H42N409+H*: lie = 675,3030, mitattu = 675,3031.

Esimerkki 31 N(l) -4' -nitrof enoksikarbonyyli-14a-hydroksi-15a~nietyyli-2a-15 hydroksi-2-desoksomarkfortiini A (XXVIII)

Noudattamalla esimerkin 26 yleistä menettelytapaa ja tehden ei-kriittisiä muutoksia mutta käyttämällä N(l)-4'-nitrofenok-sikarbonyyli-14a-hydroksi-15a-metyylimarkfortiini A:ta (esimerkki 25, 2 g, 2,97 mmol) saadaan otsikkoyhdistettä, NMR

20 (400 MHz, CDC13) 0,85, 0,92, 1,01, 1,3-2,7, 1,39, 1,48, 3,05,

3.1- 3,7, 4,79, 5,86, 6,19, 6,87, 7,36 ja 8,29 δ; HRMS (FAB

: M/Z) [M+H] laskettu C36H42N409+H+: lie = 675,3030; mitattu = 675,3036.

25 Esimerkki 32 1.2- dehydromarkfortiini A (XXIX)

* ' ‘ Menetelmä A

’ N(1)-fenoksikarbonyyli-2a-hydroksi-2-desoksomarkfortiini A:ta (XXVIII, esimerkki 26, 1 g, 1,67 mmol) liuotetaan glymiin · 30 (15 ml), ja käsitellään natriumhydroksidilla (1 N, 20 ml).

; Seosta kuumennetaan 1-2 tuntia palautusjäähdyttäen. Seos / , jäähdytetään 20-25 °C:seen, minkä jälkeen lisätään kaliumkar- bonaattia (10 %, 60 ml) . Tulokseksi saatu sakka kerätään ja kuivataan, jolloin saadaan otsikkoyhdistettä, NMR (400 MHz, :V: 35 CDCI3) 0,67, 1,25, 1,3-2,7, 1,44, 1,47, 3,04, 3,70, 4,91, ; 6,48, 6,95 ja 8,18 δ; HRMS (FAB M/Z) [M+H] laskettu C28H35N303+H+:lle = 462,2756, mitattu = 462,2762.

62 115912

Menetelmä B

N (1)-4'-nitrofenoksikarbonyyli-2a-hydroksi-2-desoksomarkfor-tiini A:ta (XXVIII, esimerkki 27, 50 mg, 0,08 mmol) liuotetaan glymiin (1 ml) , ja käsitellään natriumhydroksidilla (IN, 1 5 ml). Seosta sekoitetaan 1 tunti 20-25 °C:ssa. Seokseen lisätään kaliumkarbonaattia (10 %, 5 ml) , minkä jälkeen se uute taan etyyliasetaatilla (20 ml) . Orgaaninen kerros erotetaan, ja kuivataan magnesiumsulfaatilla, ja konsentroidaan, jolloin saadaan otsikkoyhdistettä.

10

Menetelmä C

N(l)-9'-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli-2a-hydroksi-2-desok-somarkfortiini A:han (XXVIII, esimerkki 28, 30 mg, 0,043 mmol) DMF:ssä (3 ml) 20-25 °C:ssa lisätään tipoittain tetrabutyy-15 liammoniumfluoridia (1,0 M THF:ssä, 0,04 ml, 0,04 mmol). Reak-tioseosta sekoitetaan 10 min, minkä jälkeen se sammutetaan kaliumkarbonaatilla (10 %, 30 ml), ja uutetaan etyyliasetaatilla (30 ml) . Orgaaninen uute kuivataan magnesiumsulfaatilla, suodatetaan, ja konsentroidaan, jolloin saadaan jäännöstä, joka 20 kromatografoidaan (silikageeli; metanoli/metyleenikloridi, 5/95), jolloin saadaan otsikkoyhdistettä.

; Esimerkki 33 1,2-dehydroparaherkvamidi A (XXIX) ... 25 Noudattamalla esimerkin 32 menetelmien A ja B yleisiä menette- lytapoja ja tehden ei-kriittisiä muutoksia mutta käyttämällä N(1) -4 ' -nitrofenoksikarbonyyli-2a-hydroksi-2-desoksoparaherk-V ‘ vamidi A:ta (XXVIII, esimerkki 29, 880 mg, 1,33 mmol) saadaan otsikkoyhdistettä, NMR (400 MHz, CDCl3) 0,69, 1,22, 1,3-2,7, 30 1,43, 1,46, 1,66, 2,97, 3,22, 3,62, 4,90, 6,29, 6,94 ja 8,13 δ; HRMS (FAB M/Z) [M+H] laskettu C28H35N304+H+: lie = 478,2705, .·’ : mitattu = 478,2717.

t *

Esimerkki 34 : ; 35 1,2-dehydro-14<x-hydroksi-14p-metyylimarkfortiini A (XXIX)

Noudattamalla esimerkin 32 menetelmien A ja B yleisiä menettelytapoja ja tehden ei-kriittisiä muutoksia mutta käyttämällä N (1)-4'-nitrofenoksikarbonyyli-14a-hydroksi-15a-metyyli-2a- 63 115912 hydroksi-2-desoksomarkfortiini A:ta (XXVIII, esimerkki 31, 150 mg, 0,22 mmol) saadaan otsikkoyhdistettä, NMR (400 MHz, CDC13) 0,68, 1,21, 1,3-2,7, 1,44, 1,46, 1,47, 3,05, 3,65, 4,91, 6,46, 6,93, ja 8,19 δ · 5

Esimerkki 35 1.2- dehydro-14a-hydroksi-15oc-metyylimarkfortiini A (XXIX)

Noudattamalla esimerkin 32 menetelmien A ja B yleisiä menettelytapoja ja tehden ei-kriittisiä muutoksia mutta käyttämällä 10 N(l)-4'-nitrofenoksikarbonyyli-14a-hydroksi-15a-metyyli-2a- hydroksi-2-desoksomarkfortiini A: ta (XXVIII, esimerkki 31, 2 g, 2,96 mmol) saadaan otsikkoyhdistettä, NMR (400 MHz, CDC13) 0,69, 1,04, 1,24, 1,3-2,7, 1,45, 1,47, 3,02, 3,69, 3,85, 4,92, 6,48, 6,95 ja 8,19 δ.

15

Esimerkki 36 2-desoksomarkfortiini A (XXIII)

Menetelmä A

1.2- dehydromarkfortiini A: ta (XXIX, esimerkki 32, 220 mg, 20 0,48 mmol) liuotetaan metanoliin (10 ml), ja käsitellään 15 min ajan natriumborohydridillä (30 mg) 0 °C:ssa. Reaktio-seos sammutetaan kaliumkarbonaatilla (10 %, 20 ml) . Tulokseksi • · saatu sakka kuivataan, jolloin saadaan otsikkoyhdistettä, NMR >>>; (400 MHz) on sama kuin esimerkissä 16.

25

Menetelmä B

’·* N(1) -tert-butoksikarbonyylimarkfortiini A:ta (XXVII, esimerkki 19, 100 mg, 0,17 mmol) liuotetaan diglymiin (5 ml), ja käsitellään natriumborohydridillä (20 mg) 20-25 °C:ssa. Sitten * 30 seosta kuumennetaan 0,5 tunnin ajan palautusjäähdyttäen. Seos : jäähdytetään 20-25 °C:seen, minkä jälkeen lisätään kalium- . ’ ; karbonaattia (10 %, 10 ml). Tulokseksi saatu sakka kuivataan, . ’ jolloin saadaan otsikkoyhdistettä.

> » : 35 64 115912

Esimerkki 37 2-desoksoparaherkvamidi Λ (XXX)

Menetelmä A

1,2-dehydroparaherkvamidi A: ta (XXIX, esimerkki 33, 1,5 g, 5 3,14 mmol) liuotetaan metanoliin (30 ml), ja käsitellään 15 min ajan natriumborohydridillä (250 mg) 0 °C:ssa. Reaktioseos sammutetaan kaliumkarbonaatilla (10 %, 60 ml), ja uutetaan etyyliasetaattiin (100 ml) . Orgaaninen uute kuivataan magnesiumsulfaatilla, suodatetaan, ja konsentroidaan, jolloin saa-10 daan jäännöstä, joka kromatografoidaan (silikageeli; metano-li/metyleenikloridi, 5/95), jolloin saadaan otsikkoyhdistettä, NMR (400 MHz) on sama kuin esimerkissä 17.

Menetelmä B

15 N (1)-tert-butoksikarbonyyliparaherkvamidi A:ta (XXVII, Esimerkki 22, 30 mg, 0,05 mmol) liuotetaan glymiin (2 ml), ja käsitellään natriumborohydridillä (20 mg) 20-25 °C:ssa. Sitten seosta kuumennetaan 4 tunnin ajan palautusjäähdyttäen. Seos jäähdytetään 20-25 °C:seen, minkä jälkeen lisätään ka-20 liumkarbonaattia (10 %, 5 ml), ja uutetaan etyyliasetaattiin (10 ml) . Orgaaninen kerros kuivataan magnesiumsulfaatilla, . : suodatetaan, ja konsentroidaan, jolloin saadaan jäännöstä, . : joka kromatografoidaan (silikageeli; metanoli/metyleeniklori- di, 5/95), jolloin saadaan otsikkoyhdistettä.

25

Menetelmä C

Paraherkvamidi A:han (XXVI, 1 g, 2 mmol) THF:ssä (tislattu » * bentsofenonista ja kaliummetallista, 40 ml) typpi-ilmakehässä lisätään natriumhydridiä (60 % öljyssä, 0,24 g, 6 mmol) yhdes-• j 30 sä erässä. Tulokseksi saatua reaktioseosta sekoitetaan 0,75 : : tuntia 20-25 °C:ssa, jäähdytetään 0 °C:seen, ja käsitellään 9- , . fluorenyylimetyyliklooriformiaatilla (0,8 g, 3 mmol) yhdessä « t erässä. Reaktio sammutetaan 5 min myöhemmin fosfaattipuskuri-liuoksella (pH = 7, ostettu yhtiöstä EM Science, 40 ml), lai-! : 35 mennetaan vedellä (40 ml), ja uutetaan etyyliasetaattiin (2 x 50 ml). Yhdistetyt orgaaniset uutteet kuivataan magnesiumsulfaatilla, suodatetaan, ja konsentroidaan alennetussa paineessa, jolloin saadaan raakaa N(1)-9'-fluorenyylimetyylioksikar- 65 115912 bonyyliparaherkvamidi A:ta XXVII, 1,4 g, 2 mmol), joka liuotetaan metanoliin, jäähdytetään 0 °C:seen, ja käsitellään nat-riumborohydridillä (0,3 g, 7,9 mmol) yhdessä erässä. Reaktio sammutetaan 10 min myöhemmin natriumbikarbonaatilla (kylläis-5 tä, 100 ml), ja uutetaan etyyliasetaattiin (2 x 50 ml). Yhdistetyt orgaaniset uutteet kuivataan magnesiumsulfaatilla, suodatetaan, ja konsentroidaan alennetussa paineessa, jolloin saadaan raakaa N(l)-9'-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli-2a-hydroksi-2-desoksoparaherkvamidi A:ta (XXVIII, 1,4 g, 2 mmol), 10 joka liuotetaan THF:ään (50 ml) 20-25 °C:ssa, ja käsitellään tetrabutyyliammoniumfluoridilla (1,0 M THF:ssä, 8 ml, 8 mmol). Sekoitetaan 0,5 tuntia, minkä jälkeen reaktioseos sammutetaan vedellä (50 ml), ja uutetaan etyyliasetaattiin (2 x 50 ml). Yhdistetyt orgaaniset uutteet kuivataan magnesiumsulfaatilla, 15 suodatetaan, ja konsentroidaan alennetussa paineessa, jolloin saadaan 1,2-dehydroparaherkvamidi A:ta (XXIX, 0,96 g, 2 mmol). Tämä yhdiste liuotetaan metanoliin 0 °C:ssa, ja käsitellään natriumborohydridillä (0,5 g, 13 mmol) yhdessä erässä. Reaktio sammutetaan 10 min myöhemmin natriumbikarbonaatilla (kylläinen 20 vesiliuos, 100 ml), ja uutetaan etyyliasetaattiin (2 x 50 ml). Yhdistetyt orgaaniset uutteet kuivataan magnesiumsulfaatilla, >*. : suodatetaan, konsentroidaan alennetussa paineessa, ja kromato- • · grafoidaan (silikageeli; asetoni/metyleenikloridi, 30/70), jolloin saadaan otsikkoyhdistettä .

• · 25 ;; Esimerkki 38 ’·'·* 2-desokso-14a-hydroksi-14p-metyylimarkfortiini A (XXX) ’·" * Noudattamalla esimerkin 37 yleistä menettelytapaa (menetelmä A) ja tehden ei-kriittisiä muutoksia mutta käyttämällä 1,2- t I ; : 30 dehydro-14a-hydroksi-14p-metyylimarkfortiini A: ta (XXIX, esi-

; merkki 34, 50 mg, 1 mmol) saadaan otsikkoyhdistettä, NMR

./ . (400 MHz, CDClj) 0,86, 0,90, 1,3-2,7, 1,42, 1,46, 2,94, 3,40, 1 3,52, 3,93, 4,79, 6,29, 6,39 ja 6,66 δ; HRMS (FAB M/Z) [M+H] laskettu C29H39N304+H+: lie = 494,3018, mitattu = 494,3018.

:V: 35 66 115912

Esimerkki 39 2-desokso-14a-hydroksi-15a-metyyli-2(x-hydroksi-2-desokso-markfortiini A (XXX)

Noudattamalla esimerkin 37 (menetelmä A) yleistä menettelyta-5 paa ja tehden ei-kriittisiä muutoksia mutta käyttämällä 1,2-dehydro-14a-hydroksi-15a-metyylimarkfortiini A: ta (XXIX, esimerkki 35, 1,0 g, 2,0 mmol) saadaan otsikkoyhdistettä.

Esimerkki 40 10 2S-metyyli-2-desoksomarkfortiini A (XXXI)

1,2-dehydromarkfortiini A:ta (XXIX, esimerkki 32, 42 mg, 0,09 mmol) liuotetaan THFrään (10 ml), ja käsitellään 15 min ajan metyylilitiumilla (litium-bromidi -kompleksi, 1,5 M

eetterissä, 0,06 ml) -78 °C:ssa. Seos lämmitetään 20— 15 25 °C:seen, ja sammutetaan kaliumkarbonaatilla (10 %, 5 ml), ja uutetaan etyyliasetaattiin (20 ml). Orgaaninen uute kuivataan magnesiumsulfaatilla, suodatetaan, ja konsentroidaan, jolloin saadaan jäännöstä, joka kromatografoidaan (silikagee-li; metanoli/metyleenikloridi, 5/95), jolloin saadaan otsikko-20 yhdistettä, 'H-NMR (400 MHz, CDC13) 0,81, 0,92, 1,17, 1,3-2,7,

1,41, 1,43, 3,02, 3,63, 3,95, 4,79, 6,29, 6,38 ja 6,63 δ; HRMS

.'. I (FAB M/Z) [M+H] laskettu C29H39N303+H+: lie = 478,3069, mitattu = 478,3083.

• I

* * » * * • > t t V > * ft * » I r * i *

Kaavio A

67 115912 CH, <? λ 0—l—CH, r~\ HT / HCiV-N^^l-Nn ® 0 CH, ° CH3 9 0—U-CHi / ^ HjC CHg \ ch —Wt^--y^A0j/ HO N V™NH ,_γ.

{Γ \ Ö (II) CH3 CH3 .’** r-Λ, H,C CH,

;·*; CH,— (cn2)nl W-Ύ···/%Α0 J

: : ho' ]S-n/Nv^I-nh o' \ ο (ΙΠ) ,··, 0 ch.

68

Kaavio B

115912 gh3 <-( H* OH, (^Y°-rCH· «Γν/'Ο-*

Λ \ O

0 ch3 ( ' ch3 A H3C CHS fY-X^ CH2=ch— "-Ζ^''χγ^ο-Λ ^^\ΓΝΗ ωο ° ch3 ch3 A h3c ch3 ^Y°-TCH3 ' ** HO- CHj- CH(OH) (CHj)^ /1 Λ

• ’ ’ * HO \—N ^ >/“NH

.... ° ch3 (V) i » i t

Kaavio B - jatkoa (V) 69 115912 ch3 /? ~ —l—ch3

f-\ H3CCH3 f^Y

HO— CH2— (CHj)^ LIJ^o Jj (VI)

HO \—NH

° U0

Ola /9 O—i— CH3 r-\ H3C CH, YY \T 3 F- CH2- (CHj)^-·/ HO —NH (VII) cf \ o CH3 * 1 ch3 ; · · 0'4 -CH·.

/-^ H3C CH3 'K

: 1": f— ch2— (CHj)^ ----/ /-X's/V^0-^ no V~Nv NH (Vili) ;:·. ° V 0 t· t »

Kaavio C

70 115912 ch3 n—L—CH, h3c ch3 yy 3 CH3— (CH2)n1

HO V~"n^^^“NH

o' \ 0 ° CH3 ch3 0-4-CH3 J-\ H3CyCH3 \ cHj (CH2)n1 “Λ/-7χ····ν^Α0_^ (IX) 0 ch3 0 ••f HO ?H3 • \ o—l—ch3

*·: j—\ h3c ch3 yy 'T

..: ch3— (CH2)nl V-N^^-Nn (X) ’ ·,,' o' \ 0 . , ( 0 ch3 t r »

Kaavio D

71 115912 CH3 J—\ H3c ch3 f^Y°'“V"' CH — (CH2)„1 HO \— H*)}—NH (HI) rf \ 0 ° CH3 0 0 ?H3 H n*^/0”3 r^V° \ CHa

CH3 (CH2)nl vX... J

Ho^M_r 0 ®) 0 'CH, ° 0 ?H3 ll H3C CH3 j<^^Y°\~CH3 •.: ch3 (CH2)n1 • HO \ N \—NH ΓΥΤΠ & \ 0 (X1I) ...j υ ch3 » * * * * * : , . ch3 ‘λ’,* H3C CH3 ^^Y°\~CH3 CH — (CH2)b1

HO \_n^^^—NH

;'· j ° CH3 ° (ΧΙΠ) 72 115912

I Kaavio E

j C»3 I 0 :v^°^cH3 WV\ „ I o' \CH O (XIV) ! ! O O CH3 HV3 f^°~vCH3

Tf^oi ch3 u + o CH3 K H3 VCHM^^°~V CH3

V-N/NsYA—NH

·"·; I 0 ^0 «Vi) O f1» _„ n^o-yc, o \ o CH3 0; (xvii) i j 73 115912

Kaavio F

//° ?Hs H H3CyCH3 I ·χν,Γ,:· ! 'c,° i ,.° CH3 / Λ KjC CH3 ^x^O-L-CHa r«5 < r \

Ηθ·'·'Γν··'λίν oi ««J

R λ—NH

14 O \ O

ch3 ch3 /-\ HsC CH3

Rn.....< ^y. ^ • H0 R >^~N. ^λ~ΝΗ ” * Nch3 « rr': -h I ch3 ' · · / \ H3c. CH3 (^\γ^Ο~~Τ-0Η3 .•Tr (XXI) *. : R'4 o' \ ch3

Kaavio G

74 115912 ch3 „ H3C CH, m)

*\ ° NH

CHj „ M» oran 0 ^

Kaavio H

75 115912 ch3 HäC ch3 ^?γ0·-γ1

Rl5' (XXIV)

ho’ 1 NH

R,< o vCh3 ° CH» H3c CH3 f^Y° \ CHs R,S" "κ'Α'Χί0^ ™

HO’" I \_N^ 1NH

R'4 0 \;h3 > I 1 * I « « » * » f ? V 1 f I ♦ * * 1 (

Kaavio I

76 115912 ch3 . .CN f3 o—Ϊ—ch3 \—( h3c ch3 (i^C° \ CHa 5 oH3C CHya j~_* QN_\cy^ j ^~m 0 X°H3 0 kaava la o kaava 5 ch3 1 n c=n ?H3 /f c CH ^-,o-Uch3 10 =<N T"-_- O^vVv) r\H o* * 'ch3 ° y, CH3 15 kaava 6 ° ?H3 kaava 7 H Λ O—k—CH* r~\ H3C^CH3 3 0 ch3 0 2 0 / kaava 8 O r ^3 HO 0 9^3 ·. : r-i h3c ch3 ^Y°^TCH3 W h3c ch3 (^° \"CH3

HO \— N NH

25 ° \ ° -° : *: * ^ ch3 kaava h3c^ch3j^^|j^0CH3 kaava 9b

HO \—N ^ λ-NH n \ O

’ j 3 0 ^ , kaava 10 1 4 t *

Kaavio J

77 1 1 59 1 2 O o ?H3 5 o ?H3 H3c CHS |^Y° \ CHs Z'' HsC CHaJ^^0_yCH3 J/ V-n^^A-NH \ S 0 XCH o 0 'CH3 0 /< 10 kaava 8 y' kaava 24 o ?H3 / Λ oJIch rJ «jO OH, r^0-VCH·

^—\ M,yCHl fjf \ 3 J^T

n HO'V-N^^A—NH ° N\ θ' 15 (f \ o' 0 ch3 kaava 9 a s \ kaava 11 oi 9h3 o 9h3 λ Η3ψ3 fY)3 r\ H3vCH3 jOC°T"CH3

HO V-N^^jir-NH /A ^NH

cT \CHa d H° o7 ^ o . kaava 12a ?Hs kaava 12b ’; · ^ o—I—ch·.

25 /—\ yjQ_^ : ; ho' \— n ^ A—nh Ί : ° X°H3 ° : ; j 3 0 kaava 10 I t

Kaavio K

78 1 1 591 2 o f» .9 Tl

HO \— n^^A-nh no V~N\ ^“NH

S Sx, ° . ° 0 kaava 9a / kaava 12a 10 o ' ?"* (~^\ yH3fXj 0 \ o /° CH3 kaava 13 o ?H3 ?Hj rJ/ hcch ^s^0-*rCH3 // ___O—L—CH, f—\ f' |f \ /—\ ^ iTjf J/ 3 i \_NH 0H rv N\ o οη/Λ o7^ ch3 ° CH3 \ 2 0 kaava 14a ^ ch3 kaava 14b o—t— ch3 °h y~\ ’*.*·: 0 CH3 25 '·· ' kaava 15 l » 4

Kaavio L

ί i „Q 115912 79 CH 9Hs 5 H3CyCH3 ^Υ-J^ (~\ ^CHVTX°^CH3 HO' \—NH 0 N\ 0~ « SCHS ° °Hs kaava 10 kaava 16 10 / / ?Ha f Γ / /-k H3CvPH3 \ CHi /-^| + H3CyCH3 / /^N-^

15 HO* / HO V-’X 0^”NH

o' \ o / CH3 ° CHa / kaava 18 ?Η3 kaava 17 o—>t—CHa /--χ

OH

CH3 25 kaava 19

Kaavio M

80 115912 ch3 o ^3 5 hc ch ^rv0_rCH3 r~\ h3cwch3 r^V° \CHa

— Q^SmJ

Kr /- °NM

kaava la kaava 7 10 SPh o ?H3 °-^s q CH3 I // _ O—l—CHa fPh/f 0-4— CHa

phs ^ \ \~~y H'G^CH*Jk/C

° 'chj 0 o \:h3 0 15 kaava 2 0 kaava 21 /? o CH3 SPh O ?Hs Ph—S /j o—L—CH3 \jj u c ch ^rcH3 )r\ H3°\/cH3 rr h Q^y^ncoj—.

^λ», °^n" ° “·0 20 kaava 2 2 ch3 kaava 23 // __. o—l—ch3

:\: O.T/X J

* O

': * : ° ch3 25 - kaava 9a

Kaavio N

115912 81

CH, O

S hc ch, .^wO-Uch, r~K ph3 5 0'rS-J^J—

HO V-N ^-NH HO V~\ 0^~NH

0 CH, 0 . CH|J

kaava 9a kaava 34 10 ch, 0 ^H» j—\ h5cv,ch3 r~^ hVHs ΠΓ°ΤεΗ3 h,c --/ j HiC \

HO* Υ-ν',^ΝΗ O V“N, k NH

o' \ Q O Vh, 0 ° CHa CH3 15 kaava 35 kaava 36 CH, 0 J^3 „ H,C CH, |^Y° V"CHa H,c CH, ^V°TCHä H,C—-/ \ —yM J) -_ H,C—·/ ,N—Jj H,c tNH HjC C) \H, o 2 0 CHa » » 25 kaava 38 kaava 37 i <. · 82 1 1 591 2

Kaavio 0 CH>

Wj ^ n I

n ~t FL, J\>n CHj

Ra 0 '‘-.ö Vo-R.7 *14 ° CH,0 ° (XXVII) (XXVI) CHa

Rft. A|nt%CCHj^ O CHä 0H f^0-*’7

Rm n' \ O

0 CH3 v \ (XXVIII) (xxix) N.

CHa ojjL 0H> ^vH-0”3 *«... >4» m"SS\7 ^

Rm O Vu.-r- "" Γ ^ ^ (XXX) (XXXI) • * · * I _ . , (XXX) * · (XXVII) - ' ' ti»

Claims (5)

115912

1. Kaavan (XXXI) mukaiset 2-deoksoparaherkvamidi B- ja 2-de-soksomarkfortiiniyhdisteet ch3 R15.. >v)n H3C CH3 f^Y0"VCH3 L NJ (XXXI)

16. V-n^/"NH 14. ch3 r18 5 jossa n on 1 tai 2; R14 on -H tai C1_4-alkyyli ; R1S on -H tai C^-alkyyli ; R16 on -H tai -OH; R18 on -H tai C1_4-alkyyli, ja niiden farmaseuttisesti hyväksyt-10 tävät suolat.

' · 2. Patenttivaatimuksen 1 kaavan (XXXI) mukainen 2-deoksopara- > herkvamidi B ja 2-desokso-14a-hydroksi- 14p-metyylimarkfortiini A. :V: 15

3. Kaavan (XXIX) mukainen 1,2-dehydroyhdiste : 9H3 X: R15-..>\)n H3C^CH3^^0-yCH3 (XXIX) R,< ° \h3 115912 kun n on 1; Ru on -H tai C14-alkyyli; Rl5 on -H tai C14-alkyyli; R16 on -OH, 5 kun n on 2 ja R16 on -OH, R14 on -H tai 0Χ 4-alkyyli ; Rl5 on -H tai C14-alkyyli; kun n on 2 ja R16 on -H, R14 on -H;

10 R15 on -H; ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

4. Patenttivaatimuksen 3 kaavan (XXIX) mukainen 1,2-dehydroyh-diste, joka on: 15 1,2-dehydromarkfortiini A, 1.2- dehydroparaherkvami di A, 1.2- dehydro-14(x-hydroksi-14p-metyylimarkfortiini A ja 1.2- dehydro-14a-hydroksi-15cc-metyylimarkfortiini A.

5. Patenttivaatimuksen 1 kaavan (XXXI) mukainen yhdiste, joka on 2β-metyyli-2-desoksomarkfortiini A. • ’·’ Patentkrav > « · > « • · ·'· 25 1. 2-deoxoparaherquamid B- och 2-desoxomarkfortinföreningar ;ti<: med formeln (XXXI) CH3 H,C CH3 Γ^γ°-\-°Η3 d yV'o-» (XXXI) 16J 14. ch3r18 115912 väri n är 1 eller 2; R14 är -H eller C1.4-alkyl; R15 är -H eller C1_4-alkyl; R16 är -H eller -OH;

5 R1S är -H eller C14-alkyl, och farmaceutiskt acceptabla salter därav. 2. 2-deoxoparaherquamid B och 2-desoxo-14a-hydroxy-14p-metyl-markfortin A med formeln (XXXI) enligt patentkrav 1. 10 3. 1,2-dehydroförening med formeln (XXIX) CH3 R15... H3C^CH3^^°-t-CH3 (XXIX) R” * \h3 · da n är 1; “ί R14 är -H eller C1_4-alkyl; ! R15 är -H eller C1_4-alkyl;

15 R16 är -OH, dä n är 2 och R16 är -OH, R14 är -H eller C14-alkyl; • ' I R15 är -H eller C1_4-alkyl; dä n är 2 och R16 är -H,

20 R14 är -H; Rj5 är -H; ; · i och farmaceutiskt acceptabla salter därav. 4. 1,2-dehydroförening med formeln (XXIX) enligt patentkrav 3 ; " 2 5 som är: ‘ 1,2-dehydromarkfortin A, 1,2-dehydroparaherquamid A, 115912 1.2- dehydro-14a-hydroksi-14p-metylmarkfortin A och 1.2- dehydro-14a-hydroksi-15(x-metylmarkfortin A.

5. Förening med formeln (XXXI) enligt patentkrav 1 som är 2β-5 metyl-2-desoxomarkfortin A. * * · * * » 1 i I t