ES3032115T3

ES3032115T3 - Antigen-presenting cell-mimetic scaffolds and methods for making and using the same

Info

Publication number: ES3032115T3
Application number: ES17828455T
Authority: ES
Inventors: Alexander Cheung; David Mooney
Original assignee: Harvard University
Current assignee: Harvard University
Priority date: 2016-07-13
Filing date: 2017-07-13
Publication date: 2025-07-15
Anticipated expiration: 2037-07-13
Also published as: CA3030427A1; WO2018013797A1; EP4606890A2; JP2022001069A; EP3484448B1; EP4606890A3; JP2019522486A; JP7497054B2; CN115404196A; US20190292517A1; CN109789092A; AU2023248053A1; AU2023248053B2; US11555177B2; JP2024071516A; CN115537372A; CN115305229B; DK3484448T3; JP7758384B2; AU2017295704A1

Abstract

Embodiments herein described provide antigen-presenting cell-mimetic scaffolds (APC-MS) and use of such scaffolds to manipulating T-cells. More specifically, the scaffolds are useful for promoting growth, division, differentiation, expansion, proliferation, activity, viability, exhaustion, anergy, quiescence, apoptosis, or death of T-cells in various settings, e.g., in vitro, ex vivo, or in vivo. Embodiments described herein further relate to pharmaceutical compositions, kits, and packages containing such scaffolds. Additional embodiments relate to methods for making the scaffolds, compositions, and kits/packages. Also described herein are methods for using the scaffolds, compositions, and/or kits in the diagnosis or therapy of diseases such as cancers, immunodeficiency disorders, and/or autoimmune disorders. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno y métodos para elaborar y usar los mismos

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0001] La inmunoterapia que implica el cebado y la expansión de linfocitos T (células T) es prometedora para el tratamiento del cáncer y las enfermedades infecciosas, particularmente en humanos (Meliefet al., Immunol. Rev. 145: 167-177 (1995); Riddell et al., Annu. Rev. Immunol. 13:545-586 (1995)). Los estudios actuales de transferencia adoptiva en pacientes con infecciones víricas y/o cáncer implican la infusión de células T que han sido estimuladas, clonadas y expandidas durante muchas semanasin vitroen células dendríticas (DC) autólogas, células B infectadas víricamente y/o células alimentadoras alogénicas (Riddell et al., Science 257:238-241 (1992); Yee et al., J. Exp. Med.

192:1637-1644 (2000), Brodie et al., Nat. Med. 5:34-41 (1999); Riddell et al., Hum. Gene Ther. 3:319-338 (1992), Riddell et al., J. Immunol. Methods 128:189-201 (1990)). Sin embargo, como los ensayos clínicos de inmunoterapia adoptiva con células T requieren a menudo miles de millones de células (Riddellet al.,1995), los protocolos de expansión de células Tin vitroexistentes son a menudo inadecuados para satisfacer las demandas de tales ensayos.

[0002] Además, un injerto óptimo requiere el uso de células T funcionales, y no senescentes, en el momento de la reinfusión. Para las aplicaciones clínicas, es importante garantizar que las células T tengan la funcionalidad deseada, es decir, que proliferen, realicen funciones efectoras y produzcan citoquinas en una manera deseable (Liebowitz et al., Current Opinion Oncology, 10, 533-541, 1998). En el entorno natural, la activación de las células T se inicia por la activación del complejo receptor de células T/CD3 (TCR/CD3) por un antígeno peptídico unido a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en la superficie de una célula presentadora de antígeno (APC) (Schwartz, Science 248:1349 (1990)). Aunque ésta es la señal principal en la activación de las células T, para la activación completa también se requieren otras interacciones receptor-ligando entre las APC y las células T. Por ejemplo, la estimulación del TCR en ausencia de otras interacciones moleculares puede inducir un estado de anergia, de tal manera que estas células no pueden responder a señales de activación completa tras una reestimulación (Schwartz, 1990; Harding, et al., Nature 356:607, 1992; Dudley et al., Clinical Cancer Research., 16, 6122-6131,2010; Rosenberg et al., Clinical Cancer Research., 17, 4550-4557, 2011). Como alternativa, las células T pueden morir por muerte celular programada (apoptosis) cuando se activan por el TCR únicamente (Webb et al., Cell 63:1249, 1990; Kawabe et al., Nature 349:245, 1991; Kabelitz et al., Int. Immunol. 4:1381, 1992; Groux et al., Eur J. Immunol. 23:1623, 1993).

[0003] Por consiguiente, la funcionalidad óptima puede conferirse mediante el uso de una segunda molécula de señalización, por ejemplo, una proteína unida a la membrana o un producto secretado de la APC. En el contexto de proteínas unidas a membrana, tales interacciones secundarias son generalmente de naturaleza adhesiva, reforzando el contacto entre las dos células (Springer et al., Ann. Rev. Immunol. 5:223, 1987). También pueden estar implicadas otras moléculas de señalización, como la transducción de señales de activación adicionales de la APC a la célula T (Bierer et al., Adv. Cancer Res. 56:49, 1991)). Por ejemplo, la CD28 es una glicoproteína de superficie presente en el 80% de las células T periféricas en humanos y está presente tanto en células T en reposo como activadas. CD28 se une a B7-1 (CD80) o B7-2 (CD86) y es una de las moléculas coestimuladoras más potentes conocidas (June et al., Immunol. Today 15:321 (1994), Linsley et al., Ann. Rev. Immunol. 11:191 (1993)). La ligadura de CD28 en las células T junto con la activación del TCR induce la producción de interleucina-2 (IL-2) (June et al., 1994; Jenkins et al., 1993; Schwartz, 1992). La IL-2 secretada es un factor importante para la expansión ex vivo de células T (Smith et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 332:423-432 (1979); Gillis et al., Nature 268:154-156 (1977)).

[0004] Se ha demostrado que la coestimulación de células T afecta a múltiples aspectos de la activación de células T (Juneet al.,1994). Reduce la concentración de anti-CD3 necesaria para inducir una respuesta proliferativa en cultivo (Gimmi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6575 (1991)). La coestimulación con CD28 también aumenta notablemente la producción de linfoquinas por parte de las células T auxiliares mediante la regulación transcripcional y postranscripcional de la expresión génica Lindsten et al., Science 244:339 (1989); Fraser et al., Science 251:313 (1991)), y puede activar el potencial citolítico de las células T citotóxicas. La inhibición de la coestimulación CD28in vivopuede bloquear el rechazo de xenoinjertos, y el rechazo de aloinjertos se retrasa significativamente (Lenschow et, al., Science 257:789 (1992); Turka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11102 (1992)).05*

[0005] Lo que es más importante, los efectores mencionados anteriormente para la simulación estimuladora/coestimuladora se han aplicado ampliamente en el contexto de la manipulación de células Tin vitro.En este contexto, se usa más generalmente una combinación de anticuerpo monoclonal anti-CD3 (primera señal) y anticuerpo monoclonal anti-CD28 (segunda señal) para simular las APC. Las señales proporcionadas por los anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 se transmiten mejor a las células T cuando los anticuerpos se inmovilizan en una superficie sólida, como placas de plástico (Baroja et al., Cellular Immunology, vol. 120, 205-217, 1989; Damle et al., The Journal of Immunology, vol. 143, 1761-1767, 1989) o perlas de sefarosa (Anderson et al., Cellular Immunology, vol. 115, 246-256, 1988). Véase también la Patente de Estados Unidos N° 6.352.694 concedida a June et al.

[0006] Para obtener y expandir células T para varias aplicaciones se han desarrollado una variedad de superficies y reactivos que contienen anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28. Por ejemplo, Levine et al. (The Journal of Immunology, vol. 159, No. 12: págs. 5921-5930, 1997) divulgan perlas paramagnéticas activadas con tosilo con un diámetro de 4,5 micras (|jM) que contienen anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28, que pueden utilizarse para estimular y proliferar células T e inducirlas a que produzcan citoquinas proinflamatorias. También se ha demostrado que las células T activadas con estas perlas presentan propiedades, como la producción de citoquinas, que las hace potencialmente útiles para la inmunoterapia adoptiva (Garlie et al., J Immunother 22(4): 336-45, 1999; Shibuya et al., Arch Otolaryngol Head Neck Surg, vol. 126, N° 4: 473-479, 2000). Estas perlas están disponibles en el mercado de Thermo-Fisher Scientific, Inc. con el nombre comercial DYNABEADS CD3/CD28 T-cell expansion.

[0007] El uso de perlas paramagnéticas con anticuerpos monoclonales inmovilizados para la expansión de células T en terapia celular requiere la separación y extracción de las perlas de las células T antes de la infusión al paciente. Se trata de un proceso muy laborioso que conlleva la pérdida de células, daños celulares, un riesgo incrementado de contaminación y un mayor coste de procesamiento. Debido a la estrecha asociación de los anticuerpos monoclonales inmovilizados en las perlas con los ligandos correspondientes en la superficie de las células T diana, la extracción de las perlas de las células T es difícil. Los conjugados célula-perla se separan a menudo esperando hasta que las células T internalicen los antígenos diana y usando después técnicas de disrupción mecánica para separar las perlas de las células T. Esta técnica puede provocar daños a las células T y también puede hacer que los antígenos ligados en las células T se desprendan de la superficie celular (Rubbi et al., Journal of Immunology Methods, 166, 233-241, 1993). Además, como las células T activadas son a menudo las más deseadas para su uso en protocolos de terapia celular y las propiedades deseables de las células se pierden durante el tiempo de espera de 24-72 horas, la separación paramagnética tiene un uso limitado en el entorno de la terapia celular adoptiva.

[0008] Las técnicas de separación y purificación de células unidas a perlas paramagnéticas también son inutilizables en el contexto clínico. Por ejemplo, el proceso de eliminar las perlas paramagnéticas después de la separación de las células T requiere pasar la solución de células/perlas por un imán. Este proceso, aunque reduce en gran medida el la cantidad de perlas que permanecen con las células T, no elimina las perlas por completo. La implantación en pacientes de composiciones que contienen perlas puede provocar efectos tóxicos. El proceso de eliminación de perlas también reduce el número de células T disponibles para la terapia, ya que muchas células T permanecen asociadas con las perlas paramagnéticas, incluso después de la disociación mecánica. También se produce cierta pérdida celular con respecto a las células T que se manipulan pero que por lo demás no están unidas a las perlas, ya que estas células se lavan antes del paso o pasos de internalización y/o eliminación mecánica.

[0009] Hay, por lo tanto, una necesidad insatisfecha de composiciones y métodos que permitan el aislamiento de células T, que puedan utilizarse fácilmente para la terapia de enfermedades humanas, como trastornos de inmunodeficiencia, trastornos autoinmunes y cánceres. Las realizaciones de la presente invención, que se describen en detalle a continuación, abordan estas necesidades.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0010] La presente invención proporciona composiciones y métodos para manipular, por ejemplo, activar, estimular, expandir, proliferar o energizar, células T. En este contexto, las realizaciones de la presente invención proporcionan métodos para generar grandes cantidades (o subpoblaciones sustancialmente puras) de células T activadas que expresan ciertos marcadores y/o receptores de superficie celular o producen ciertas citoquinas que son óptimas para las respuestas inmunitarias mediadas por células T. Tales células T manipuladas pueden usarse en el tratamiento y la prevención de muchas enfermedades, como el cáncer, enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes, alergias, disfunción inmunitaria relacionada con el envejecimiento o cualquier otro estado de enfermedad en el que se deseen células T para el tratamiento. En la presente se describen métodos y composiciones para la terapia eficaz de cualquiera de las enfermedades mencionadas anteriormente utilizando células T con reactividad óptima, células que se seleccionan o criban utilizando las composiciones y/o métodos de la presente invención. Las composiciones y métodos de la presente invención son más eficaces que las composiciones y métodos existentes no sólo con respecto a la capacidad de generar una mayor cantidad de células T activadas, sino también con respecto a la eficacia significativamente mejorada de dichas células T en el entornoin vivo.Por consiguiente, las composiciones y métodos de la presente invención son útiles para la generación de linfocitos T humanos altamente deseables para injertos, transferencias autólogas y para aplicaciones terapéuticas.

[0011] La invención proporciona un andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS), que comprende una capa base que comprende microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de área superficial alta; una bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) sobre la capa base de MSR; y una o más moléculas funcionales seleccionadas entre una molécula activadora de células T y una molécula coestimuladora de células T o una combinación de las mismas.012

[0012] La invención proporciona además un dispositivo que comprende una pluralidad de andamiajes de la invención, en donde los andamiajes se apilan para permitir selectivamente la infiltración de células T en el Ms R.

[0013] La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un andamiaje de acuerdo con la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

[0014] La invención proporciona además una composición que comprende un andamiaje de acuerdo con la invención y células T agrupadas en el mismo; opcionalmente, en donde las células T se seleccionan del grupo que consiste en células T asesinas naturales, células T gamma delta, células T CD3+, células T CD4+, células T CD8+ y células T reguladoras (Tregs), o una combinación de las mismas, opcionalmente además en donde las células T reguladoras (Tregs) se seleccionan del grupo que consiste en células Treg FOXP3+ y células Treg FOXP3.

[0015] La invención proporciona además un métodoex vivopara la manipulación de células T, que comprende cultivar una muestra que contiene células T con el andamiaje de acuerdo con la invención.

[0016] La invención proporciona además un método para elaborar el andamiaje de acuerdo con la invención, que comprende:

(a) proporcionar una capa de base que comprende MSR de alta área superficial;

(b) opcionalmente, cargar los agentes homeostáticos de células T en el MSR;

(c) estratificar una SLB fluida sobre la capa base que comprende las MSR, generando de este modo un material compuesto de MSR-SLB;

(d) cargar los agentes homeostáticos de células T en el material compuesto de MSR-SLB si no se lleva a cabo el paso (b);

(e) opcionalmente, bloquear uno o más sitios de integración no específicos en el material compuesto de MSR-SLB con un bloqueador; y

(f) cargar las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T en el material compuesto de MSR-SLB, elaborando de este modo el andamiaje de acuerdo con la invención.

[0017] Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS), que comprenden una capa base que comprende microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial; una bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua estratificada sobre la capa base de MSR; una pluralidad de moléculas activadoras de células T y moléculas coestimuladoras de células T adsorbidas en el andamiaje; y una pluralidad de agentes homeostáticos de células T adsorbidos en el andamiaje.

[0018] En una realización, la presente invención proporciona andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que secuestran células T seleccionadas del grupo que consiste en células asesinas naturales (NK), células T CD3+, células T CD4+, células T CD8+ y células T reguladoras (Tregs), o una combinación de las mismas.

[0019] En una realización, la presente invención proporciona andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que contienen la pluralidad de agentes homeostáticos de células T que se adsorben en la capa SLB.

[0020] En una realización, la presente invención proporciona andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que contienen la pluralidad de agentes homeostáticos de células T que se adsorben en la capa MSR.

[0021] En una realización, la presente invención proporciona andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que contienen la pluralidad de agentes homeostáticos de células T que se liberan del andamiaje de manera controlada. En algunas realizaciones, el agente homeostático de células T se libera del andamiaje de manera controlada durante un periodo de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días, 22 días, 23 días, 24 días, 25 días, 30 días, 35 días, 40 días, 45 días, 50 días, 60 días, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, o más.

[0022] En una realización, la presente invención proporciona andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que contienen la pluralidad de agentes homeostáticos de células T que se liberan del andamiaje de manera sostenida durante hasta 15 días. En algunas realizaciones, el agente homeostático de células T se libera del andamiaje de manera sostenida durante hasta 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días, 22 días, 23 días, 24 días, 25 días, 30 días, 35 días, 40 días, 45 días, 50 días, 60 días, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, o más. En algunas realizaciones, el agente homeostático de células T se libera del andamiaje de manera sostenida durante por lo menos 30 días. En algunas realizaciones, el agente homeostático de células T se libera del andamiaje de manera sostenida durante por lo menos 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días, 22 días, 23 días, 24 días, 25 días, 30 días, 35 días, 40 días, 45 días, 50 días, 60 días, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, o más.

[0023] En una realización, la presente invención proporciona andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que contienen la pluralidad de agentes homeostáticos de células T que se seleccionan del grupo que consiste en IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, y factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), o un agonista del mismo, un mimético del mismo, una variante del mismo, un fragmento funcional del mismo, o una combinación de los mismos.

[0024 En una realización, la presente invención proporciona andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que contienen una pluralidad de agentes homeostáticos de células T que son IL-2, un agonista de la misma, un mimético de la misma, una variante de la misma, un fragmento funcional de la misma, o una combinación de los mismos con un segundo agente homeostático seleccionado del grupo que consiste en un superagonista de IL-7, IL-21, IL-15, y IL-15. En una realización, el agente homeostático de células T puede seleccionarse del grupo que consiste en un fragmento N-terminal de IL-2 que comprende los primeros 30 aminoácidos de IL-2 (p1-30), un péptido superquina de IL-2 y un péptido agonista parcial de IL-2, o una combinación de los mismos.

[0025] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que contienen una pluralidad de moléculas activadoras y coestimuladoras, en donde las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T se adsorben, cada una independientemente, en la bicapa lipídica soportada por fluido (SLB). En una realización, las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T pueden adsorberse mediante emparejamiento por afinidad o ligación química. En algunas realizaciones, la ligación química comprende un reactivo de química de clic (por ejemplo, DBCO o azida). En una realización, las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T pueden adsorberse mediante emparejamiento por afinidad que comprende un par biotina-estreptavidina, un par anticuerpoantígeno, un par anticuerpo-hapteno, un par de afinidad aptámero, un par de proteína de captura, un par de receptor Fc-IgG, un par lípido quelante de metal, un par de lípido quelante de metal-proteína marcada con histidina (HIS), o una combinación de las mismas. En una realización, las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T pueden adsorberse mediante ligación química que comprende reacción química de azida-alquino (AAC), ligadura de dibenzo-ciclooctano (DCL) o ligadura de tetrazina-alqueno (TAL).

[0026] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que contienen una pluralidad de moléculas activadoras y coestimuladoras, en donde las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T están recubiertas, cada una independientemente, sobre la bicapa lipídica soportada por fluido (SLB). Alternativamente, en otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que contienen una pluralidad de moléculas activadoras y coestimuladoras, en donde las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T están cada una, independientemente, parcialmente incrustadas en la bicapa lipídica soportada por fluido (SLB).

[0027] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que contienen una pluralidad de moléculas activadoras y coestimuladoras, en donde las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T se adsorben, cada una independientemente, en las microvarillas de sílice mesoporosa (MSR).

[0028] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que contienen una pluralidad de moléculas activadoras y coestimuladoras, en donde las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T son cada una, independientemente, moléculas de anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de las mismas.

[0029] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que contienen una pluralidad de moléculas activadoras y coestimuladoras, en donde las moléculas activadoras de células T se seleccionan del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo anti-CD2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo anti-CD47 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo antirreceptor depurador de macrófagos (MSR1) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo antirreceptor de células T (TCR) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) o un multímero del mismo cargado con un péptido MHC, y un conjugado MHC-inmunoglobulina (Ig) o un multímero del mismo, o una combinación de los mismos.

[0030] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que contienen una pluralidad de moléculas activadoras y coestimuladoras, en donde las moléculas coestimuladoras de células T son anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a un antígeno coestimulador seleccionado del grupo que consiste en CD28, 4.1BB (CD137), OX40 (CD134), CD27 (TNFRSF7), GITR (CD357), CD30 (TNFRSF8), HVEM (CD270), LTpR (TNFRSF3), DR3 (TNFRSF25), ICOS (CD278), CD226 (DNAM1), CRTAM (CD355),TIM1 (HAVCR1, KIM1), CD2 (LFA2, OX34), SLAM (CD150, SLAMF1), 2B4 (CD244, SLAMF4), Ly108 (NTBA, CD352, SLAMF6), CD84 (SLAMF5), Ly9 (CD229, SLAMF3), CD279 (PD1) y CRACC (CD319, BLAME).

[0031] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que contienen una pluralidad de moléculas activadoras y coestimuladoras, en donde las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T comprenden anticuerpos biespecíficos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

[0032] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que contienen una pluralidad de moléculas activadoras y coestimuladoras, en donde las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T comprenden un par seleccionado del grupo que consiste en CD3/CD28, CD3/ICOS opcionalmente junto con CD28, CD3/CD27 opcionalmente junto con CD28, y CD3/CD137 opcionalmente junto con CD28, o una combinación de los mismos.

[0033] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que comprenden además una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a una proteína de fusión Fc.

[0034] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que comprenden además un compuesto de reclutamiento seleccionado del grupo que consiste en factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), ligando de quimioquinas (motivo C-C) 21 (CCL-21), ligando de quimioquina (motivo C-C) 19 (CCL-19), ligando de quimioquina (motivo C-C) 12 (CXCL12), interferón gamma (IFNy), o ligando de tirosina quinasa 3 similar a FMS (Flt-3), o un agonista de los mismos, un mimético de los mismos, una variante de los mismos, un fragmento funcional de los mismos, o una combinación de los mismos. En una realización, los andamiajes comprenden además un compuesto de reclutamiento que es el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), o un agonista del mismo, un mimético del mismo, una variante del mismo, o un fragmento funcional del mismo.

[0035] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que comprenden además un antígeno. En una realización, el antígeno comprende un antígeno tumoral. Además en esta realización, el antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, CEA, tirosinasa, midkin, BAGE, CASP-8, p-catenina, p-catenina, Y-catenina, CA-125, CDK-1, CDK4, ESO-1, gp75, gp100, MART-1, MUC-1, MUM-1, p53, PAP, PSA, PSMA, ras, trp-1, HER-2, TRP-1, TRP-2, IL13Ralpha, IL13Ralpha2, AIM-2, AIM-3, NY-ESO-1, C9orf 112, SART1, SART2, SART3, BRAP, RTN4, GLEA2, TNKS2, KIAA0376, ING4, HSPH1, C13orf24, RBPSUH, C6orf153, NKTR, NSEP1, U2AF1L, CYNL2, TPR, SOX2, GOLGA, BMI1, COX-2, EGFRvlII, EZH2, LICAM, Livin, Livinp, MRP-3, Nestin, OLIG2, ART1, ART4, B-ciclina, Gli1, Cav-1, catepsina B, CD74, E-cadherina, EphA2/Eck, Fra-1/Fosl 1, GAGE-1, Gangliósido/GD2, GnT-V, p1,6-N, Ki67, Ku70/80, PROX1, PSCA, SOX10, SOX11, Survivina, UPAR, WT-1, Dipeptidil peptidasa IV (DPPIV), proteína de unión a la adenosina desaminasa (AD Abp), ciclofilina b, antígeno colorrectal asociado (CRC)- C017-1A/GA733, receptor de células T/cadena CD3-zeta, familia GAGE de antígenos tumorales, RAGE, LAGE-I, NAG, GnT-V,, R<c>A<s>I, afetoproteína, pl20ctn, Pmel117, PRAME, glucógeno fosforilasa cerebral, SSX-I, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-I, SSX-4, SSX-5, SCP-I, CT-7, cdc27, proteína coli de la poliposis adenomatosa (APC), fodrina, PIA, conexina 37, Ig-idiotipo, pl5, GM2, gangliósidos GD2, familia Smad de antígenos tumorales, lmp-1, antígeno nuclear codificado por EBV (EBNA)-I, transcrito 1 similar a la proteína de unión UL16 (Mult1), proteínas RAE-1, H60, MICA, MICB, c-erbB-2, un neoantígeno identificado de manera específica para un paciente, o un péptido inmunogénico del mismo, o una combinación de los mismos.

[0036] En una realización relacionada, la presente invención se refiere a andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS), que comprenden una capa base que comprende microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial; una bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua, estratificada sobre la capa base de MSR; una pluralidad de moléculas activadoras de células T y moléculas coestimuladoras de células T adsorbidas en el andamiaje; y una pluralidad de agentes homeostáticos de células T adsorbidos en el andamiaje, en donde la relación de peso de la bicapa lipídica soportada (SLB) con respecto a las microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) está comprendida entre aproximadamente 10:1 y aproximadamente 1:20. En una realización, la relación de peso refleja la relación de SLB a MSR antes de la carga. En otra realización, la relación de peso se ajusta para lograr la composición de andamiaje deseada. En una realización, la relación de peso entre la SLB y la MSR puede estar entre aproximadamente 9:1 y aproximadamente 1:15, entre aproximadamente 5:1 y aproximadamente 1:10, entre aproximadamente 3:1 y aproximadamente 1:5, incluyendo todas las relaciones intermedias, por ejemplo, aproximadamente 3:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 1:1, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:6, aproximadamente 1:7, aproximadamente 1:8, aproximadamente 1:9, aproximadamente 1:10. En otra realización, la relación de peso se ajusta para lograr la composición de andamiaje deseada.

[0037] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS), que comprenden una capa base que comprende microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial; una bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua, estratificada sobre la capa base de MSR; una pluralidad de moléculas activadoras de células T y moléculas coestimuladoras de células T adsorbidas en el andamiaje; y una pluralidad de agentes homeostáticos de células T adsorbidos en el andamiaje, en donde la bicapa lipídica continua soportada por fluidos (SLB) comprende un lípido con 14 a 23 átomos de carbono. En una realización, el lípido es fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilcolina (PC), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilserina (PS), o fosfoinositido, o un derivado de los mismos. En una realización, el APC-MS comprende bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) comprende un lípido que se selecciona del grupo que consiste en dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), distearoilfosfatidilcolina (DSPC), palmitoil-oleoilfosfatidilcolina (POPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE), y dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE) o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la bicapa lipídica comprende una composición lipídica que imita la composición lipídica de la membrana de una célula de mamífero (por ejemplo, la membrana plasmática de una célula humana). Se ha caracterizado la composición lipídica de muchas membranas celulares de mamíferos y puede ser determinada fácilmente por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Essaid et al. Biochim. Biophys. Acta 1858(11): 2725-36 (2016)). En algunas realizaciones, la bicapa lipídica comprende colesterol. En algunas realizaciones, la bicapa lipídica comprende un esfingolípido. En algunas realizaciones, la bicapa lipídica comprende un fosfolípido. En algunas realizaciones, el lípido es una fosfatidiletanolamina, una fosfatidilcolina, una fosfatidilserina, un fosfoinosípido, un fosfoesfingolípido con colas saturadas o insaturadas que comprenden 6-20 carbonos, o una combinación de los mismos.

[0038] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS), que comprenden una capa base que comprende microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial; una bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua, estratificada sobre la capa base de MSR; una pluralidad de moléculas activadoras de células T y moléculas coestimuladoras de células T adsorbidas en el andamiaje; y una pluralidad de agentes homeostáticos de células T adsorbidos en el andamiaje, en donde el andamiaje de bicapa lipídica de microvarillas de sílice mesoporosa (MSR-SLB) conserva una arquitectura fluida continua durante por lo menos 14 días. En algunas realizaciones, el andamiaje de MSR-SLB conserva una arquitectura fluida continua durante 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días, 25 días, 30 días, 35 días, 40 días, 50 días, o más. En algunas realizaciones, las MSR del andamiaje de MSR-SLB se degradan en aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días, 25 días, 30 días, 35 días, 40 días, 50 días, o más. En algunas realizaciones, la bicapa lipídica del andamiaje de MSR-SLB se degrada en aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días, 25 días, 30 días, 35 días, 40 días, 50 días, o más.

[0039] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS), que comprenden una capa base que comprende microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial; una bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua, estratificada sobre la capa base de MSR; una pluralidad de moléculas activadoras de células T y moléculas coestimuladoras de células T adsorbidas en el andamiaje; y una pluralidad de agentes homeostáticos de células T adsorbidos en el andamiaje, en donde la relación de peso seco de las microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) con respecto a las moléculas activadoras/coestimuladoras de células T está comprendida entre aproximadamente 11 a aproximadamente 50:1. En una realización, la proporción entre las MSR y las moléculas activadoras/coestimuladoras de células T refleja el peso de las MSR con respecto al peso de los anticuerpos que se usan como moléculas activadoras/coestimuladoras de células T. En otra realización, la relación de peso MSR:anticuerpo se ajusta para lograr la composición de andamiaje deseada. En una realización, la relación de peso de la SLB con respecto a la composición de anticuerpo está comprendida entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 20:1, entre aproximadamente 3:1 y aproximadamente 10:1, entre aproximadamente 4:1 y aproximadamente 8:1, incluyendo todas las proporciones intermedias, por ejemplo, aproximadamente 1:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 4:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 6:1, aproximadamente 7:1, aproximadamente 8:1, aproximadamente 9:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 15:1, aproximadamente 20:1, aproximadamente 25:1, aproximadamente 30:1, aproximadamente 40:1.

[0040] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS), que comprenden una capa base que comprende microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial; una bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua, estratificada sobre la capa base de MSR; una pluralidad de moléculas activadoras de células T y moléculas coestimuladoras de células T adsorbidas en el andamiaje; y una pluralidad de agentes homeostáticos de células T adsorbidos en el andamiaje, en donde los andamiajes se apilan para permitir selectivamente la infiltración de células T en las microvarillas de sílice mesoporosa (MSR). En una realización, la presente invención proporciona además APC-MS en donde las moléculas activadoras y/o coestimuladoras de células T están presentes en los andamiajes a una concentración suficiente para permitir la manipulaciónin situde células T.

[0041] En otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que comprenden una capa base que comprende microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial; una bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua sobre la capa base de MSR; una pluralidad de moléculas activadoras de células T y moléculas coestimuladoras de células T adsorbidas en el andamiaje; y una pluralidad de agentes homeostáticos de células T adsorbidos en el andamiaje; y un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización, la presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que están formuladas para administración intravenosa, administración subcutánea, administración intraperitoneal o administración intramuscular.

[0042] En otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que comprenden una capa base que comprende microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial; una bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua sobre la capa base de MSR; una pluralidad de moléculas activadoras de células T y moléculas coestimuladoras de células T adsorbidas en el andamiaje; y una pluralidad de agentes homeostáticos de células T adsorbidos en el andamiaje; y células T agrupadas en el mismo. En una realización, la presente invención proporciona además composiciones que contienen APC-MS y células T seleccionadas del grupo que consiste en células asesinas naturales (NK), células T CD3+, células T CD4+, células T CD8+ y células T reguladoras (Treg), o una combinación de las mismas. El andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en métodos para tratar una enfermedad en un sujeto que lo necesite, que comprenden poner en contacto una muestra que comprende una población de células T obtenida del sujeto con los APC-M<s>, activando, coestimulando y manteniendo homeostáticamente de este modo la población de células T; opcionalmente expandir la población de células T; y administrar las células T activadas, coestimuladas, mantenidas y opcionalmente expandidas al sujeto, tratando de este modo la enfermedad en el sujeto. Los APC-MS puede usarse en métodos para tratar una enfermedad en un sujeto que lo necesite, en donde el método comprende además reestimular la población de células T antes del paso de administración. El método puede incluir expandir la población de células T después de poner en contacto con el andamiaje durante un periodo de entre 2 y 5 días.

[0043] El andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en métodos para tratar una enfermedad en un sujeto que lo necesite, que comprenden poner en contacto una muestra que es una muestra de sangre, una muestra de médula ósea, una muestra linfática o una muestra esplénica que comprende una población de células T obtenida del sujeto con el APC-MS, activando, coestimulando y manteniendo homeostáticamente de este modo la población de células T; opcionalmente expandir la población de células T; y administrar las células T activadas, coestimuladas, mantenidas y opcionalmente expandidas al sujeto, tratando de este modo la enfermedad en el sujeto. El sujeto puede ser un sujeto humano. El método puede proporcionar el tratamiento de un cáncer y el andamiaje puede comprender por lo menos una molécula activadora específica de células T citotóxicas y por lo menos una molécula coestimuladora específica de células T citotóxicas.

[0044] El andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en métodos para tratar un cáncer en un sujeto que lo necesite, que comprenden poner en contacto una muestra que comprende una población de células T obtenida del sujeto con el APC-MS, activando, coestimulando y manteniendo homeostáticamente de este modo la población de células T; opcionalmente expandir la población de células T; y administrar las células T activadas, coestimuladas, mantenidas y opcionalmente expandidas al sujeto, tratando de este modo el cáncer en el sujeto. El cáncer puede seleccionarse del grupo que consiste en cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de esófago, cáncer óseo, cáncer testicular, cáncer de cuello uterino, cáncer gastrointestinal, glioblastoma, leucemia, linfoma, linfoma de células del manto, lesiones preneoplásicas de pulmón, cáncer de colon, melanoma y cáncer de vejiga. El método puede incluir además clasificar y opcionalmente enriquecer las células T citotóxicas a partir de la muestra y/o la población celular expandida.

[0045] El andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en métodos para tratar un trastorno de inmunodeficiencia en un sujeto que lo necesite, que comprenden poner en contacto una muestra que comprende una población de células T obtenida del sujeto con el APC-MS, activando, coestimulando y manteniendo homeostáticamente de este modo la población de células T, opcionalmente, expandir la población de células T; y administrar al sujeto células T activadas, coestimuladas, mantenidas y opcionalmente expandidas, tratando de este modo el trastorno de inmunodeficiencia en el sujeto. El andamiaje puede comprender por lo menos una molécula activadora específica de células T auxiliares (Th) y por lo menos una molécula coestimuladora específica de células T auxiliares (Th). El método puede usarse para tratar un trastorno de inmunodeficiencia seleccionado del grupo que consiste en un trastorno de inmunodeficiencia primaria y un trastorno de inmunodeficiencia adquirida. El método puede usarse para tratar el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) o un trastorno hereditario seleccionado del grupo que consiste en el síndrome de DiGeorge (DGS), el síndrome de rotura cromosómica (CBS), la ataxia telangiectasia (AT) y el síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS), o una combinación de los mismos.

[0046] El andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en métodos para tratar una enfermedad en un sujeto que lo necesite, que comprenden poner en contacto una muestra que comprende una población de células T obtenida del sujeto con el APC-MS, activando, coestimulando y manteniendo homeostáticamente de este modo la población de células T; opcionalmente expandir la población de células T; además clasificar y opcionalmente enriquecer las células T de la muestra y/o la población celular expandida; y administrar las células T activadas, coestimuladas, mantenidas y opcionalmente expandidas al sujeto, tratando de este modo la enfermedad en el sujeto. Las células T pueden seleccionarse del grupo que consiste en células asesinas naturales (NK), células T CD3+, células T CD4+, células T CD8+ y células T reguladoras (Treg), o una combinación de las mismas.

[0047] El andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en métodos para tratar un trastorno autoinmune en un sujeto que lo necesite, que comprenden poner en contacto una muestra que comprende una población de células T obtenida del sujeto con el APC-MS, activando, coestimulando y manteniendo homeostáticamente de este modo la población de células T; opcionalmente, expandir la población de células T; además, opcionalmente, clasificar y enriquecer las células T de la muestra y/o de la población celular expandida; y administrar las células T activadas, coestimuladas, mantenidas y opcionalmente expandidas al sujeto, tratando de este modo el trastorno autoinmune en el sujeto.

[0048] El andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en métodos para tratar una enfermedad en un sujeto que lo necesite, que comprenden poner en contacto una muestra que comprende una población de células T obtenida del sujeto con el APC-MS, activando, coestimulando y manteniendo homeostáticamente de este modo la población de células T; opcionalmente, expandir la población de células T; opcionalmente, además, clasificar y enriquecer las células T de la muestra y/o de la población celular expandida; y administrar por vía subcutánea o intravenosa las células T activadas, coestimuladas, mantenidas y opcionalmente expandidas al sujeto, tratando de este modo la enfermedad en el sujeto. Las células T pueden activarse, coestimularse, mantenerse homeostáticamente y, opcionalmente, expandirse poniendo en contacto la muestra con el andamiaje durante un periodo comprendido entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 20 días.

[0049] En otra realización, la presente invención se refiere a métodos para la manipulación de células T, que comprenden poner en contacto el andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) con una muestra biológica de un sujeto, activando, coestimulando, manteniendo homeostáticamente y opcionalmente expandiendo de este modo una población de células T presentes dentro de la muestra, manipulando de este modo las células T. En una realización, la manipulación puede incluir estimulación, activación, cambios en la viabilidad, promoción del crecimiento, división, diferenciación, expansión, proliferación, agotamiento, anergia, quiescencia, apoptosis, muerte de las células T. En una realización, la manipulación incluye preferiblemente promover la expansión o proliferación de células T. En una realización adicional, las células T manipuladas pueden transformarse aún más. En una realización específica, las células T pueden transformarse para que expresen un receptor de antígeno quimérico (CAR). El producto de células T CAR puede expandirse aún más incubándolo con los andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) que contienen un antígeno que es específico para la célula T CAR. En ciertas realizaciones, el antígeno específico de la célula T CAR se selecciona del grupo que consiste en CD19, CD22, o un fragmento de los mismos o una variante de los mismos. En algunas realizaciones, el antígeno específico de la célula T CAR es un antígeno tumoral. Los antígenos tumorales son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, un antígeno asociado a glioma, antígeno carcinoembrionario (CEA), p-gonadotropina coriónica humana, alfafetoproteína (AFP), AFP reactiva a lectina, tiroglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, transcriptasa inversa de telomerasa humana, RU1, RU2 (AS), carboxilesterasa intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, prostasa, antígeno prostático específico (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, prosteína, PSMA, Her2/neu, survivina y telomerasa, antígeno tumoral del carcinoma de próstata-1 (PCTA-1), MAGE, ELF2M, elastasa de neutrófilos, efrinaB2, CD22, factor de crecimiento insulínico (IGF)-I, IGF-II, receptor de IGF-I y mesotelina. En algunas realizaciones, un producto de células T CAR puede expandirse policlonalmente después de la producción para generar una población más grande de células T CAR.

[0050] En otra realización, la presente invención se refiere a métodos para la manipulación de células T, que comprenden poner en contacto el andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS), en donde el método confiere una expansión aumentada de la población de células T después de aproximadamente 1 semana de contacto con el andamiaje en comparación con un andamiaje de control que comprende la capa base que comprende microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial y la bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua pero que no contiene las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T. En una realización, el método confiere un aumento de aproximadamente 50 veces a 800 veces en la expansión de la población de células T después de aproximadamente 1 semana de contacto con el andamiaje en comparación con un andamiaje de control que comprende la capa base que comprende microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial y la bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua pero que no contiene las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T.

[0051] En otra realización, la presente invención se refiere a métodos para la manipulación de células T, que comprenden poner en contacto el andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS), en donde el método confiere una expansión aumentada de la población de células T después de aproximadamente 1 semana de contacto con el andamiaje en comparación con una partícula polimérica esférica superparamagnética (DYNABEAD) que comprende las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T. En una realización, el método confiere un aumento de aproximadamente 5 veces a 20 veces en la expansión de la población de células T después de aproximadamente 1 semana de contacto con el andamiaje en comparación con una partícula polimérica esférica superparamagnética (DYNABEAD) que comprende las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T.

[0052] En otra realización, la presente invención se refiere a métodos para mejorar la actividad metabólica de las células T, que comprenden poner en contacto el andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) con una muestra biológica de un sujeto, activando, coestimulando, manteniendo homeostáticamente y opcionalmente expandiendo de este modo una población de células T presentes dentro de la muestra, mejorando de este modo la actividad metabólica de las células T. En una realización, el método confiere una actividad metabólica mejorada de la población de células T después de aproximadamente 1 semana de contacto con el andamiaje en comparación con un andamiaje de control que comprende la capa base que comprende microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial y la bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua pero que no contiene las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T. En una realización, el método confiere una actividad metabólica mejorada de aproximadamente 5 veces a 20 veces de la población de células T después de aproximadamente 1 semana de contacto con el andamiaje en comparación con un andamiaje de control que comprende la capa base que comprende microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial y la bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua pero que no contiene las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T. En una realización, el método confiere una actividad metabólica mejorada de la población de células T después de aproximadamente 1 semana de contacto con el andamiaje en comparación con una partícula polimérica esférica superparamagnética (DYNABEAD) que comprende las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T. En una realización, el método confiere además un aumento de aproximadamente 1 vez a 10 veces en la expansión de la población de células T después de aproximadamente 1 semana de contacto con el andamiaje en comparación con una partícula polimérica esférica superparamagnética (DYNABEAD) que comprende las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T.

[0053] En otra realización, la presente invención se refiere a métodos para cribar células T metabólicamente activas, que comprenden poner en contacto el andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) con una muestra biológica de un sujeto, activando, coestimulando, manteniendo homeostáticamente y opcionalmente expandiendo de este modo una población de células T presentes en la muestra; identificar células metabólicamente activas en la población de células T activadas, coestimuladas, mantenidas homeostáticamente y opcionalmente expandidas; cribando de este modo células T metabólicamente activas. En una realización, las células T expandidas son metabólicamente activas durante por lo menos aproximadamente 7 días después del contacto con el andamiaje. En una realización, las células T expandidas forman agregados durante por lo menos aproximadamente 7 días después del contacto con el andamiaje.

[0054] En otra realización más, la presente invención se refiere a métodos para generar una población policlonal de células T, que comprenden poner en contacto el andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) con una muestra biológica de un sujeto, activando, coestimulando, manteniendo homeostáticamente y opcionalmente expandiendo de este modo una población de células T presentes en la muestra; identificar una población específica de células T de la población expandida de células T basándose en la expresión de una pluralidad de marcadores en las células T expandidas; opcionalmente aislar o purificar la población de células T identificada, generando de este modo una población policlonal de células T. En una realización, el método puede adaptarse para la generación de una población policlonal de células CD4+ o células CD8+. En una realización relacionada, el método puede adaptarse para la generación de una población policlonal de células T CD4+/FOXP3+. Además, el método puede adaptarse para la generación de una población policlonal de células T CD44+/CD62L- (células T de memoria efectora y/o efectoras). En otra realización, el método puede adaptarse para la generación de una población policlonal de células T CD8+/CD69+ (células T activadas). En otra realización, el método puede adaptarse para la generación de una población policlonal de células T CD8+ que expresan granzima B+ (células T secretoras de citotoxinas). En otra realización más, el método puede adaptarse para la generación de una población policlonal de células T IFNy+ (células T secretoras de citoquinas activadoras). En otra realización más, el método puede adaptarse para la generación de una población policlonal de células T CD62L+/CCR7+ (células T de memoria).

[0055] En otra realización, la presente invención se refiere a métodos para generar una subpoblación policlonal de células T, que comprenden poner en contacto el andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) con una muestra biológica de un sujeto, activando, coestimulando, manteniendo homeostáticamente y opcionalmente expandiendo de este modo una población de células T presentes en la muestra; identificar una población específica de células T agotadas de la población expandida de células T basándose en la expresión de una pluralidad de marcadores en las células T expandidas; eliminar opcionalmente la población identificada de células T, generando de este modo una subpoblación policlonal de células T. En una realización, las células T agotadas se identifican o aíslan basándose en la expresión en la superficie celular de CD8+/PD-1+. En otra realización, las células T agotadas se identifican o aíslan basándose en la expresión en la superficie celular de LAG3+/TIM3+.

[0056] En otra realización, la presente invención se refiere a métodos para la manipulación de células Tex vivo,que comprenden poner en contacto el andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) con una muestra biológica de un sujetoex vivo,activando, coestimulando, manteniendo homeostáticamente y opcionalmente expandiendo de este modo una población de células T presentes dentro de la muestra, manipulando de este modo las células Tex vivo.En una realización, la muestra se pone en contacto con el andamiaje durante un periodo de entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 20 días. En una realización, el método puede implicar detectar la producción de una o más citoquinas o citotoxinas producidas por las células T manipuladas. En una realización, el método comprende además detectar la producción de una citoquina seleccionada del grupo que consiste en interferón gamma (IFNy), factor de necrosis tisular alfa (TNFa), IL-2, IL-1, IL-4, IL-5, IL-10, e IL-13, IL-17 o una combinación de las mismas por las células T manipuladas.

[0057] En una realización relacionada, la presente invención se refiere a métodos para la manipulación de células Tex vivode acuerdo con los métodos anteriores, en donde las células T manipuladas son células T auxiliares 1 (Th1) y el método comprende detectar la producción de una citoquina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, interferón gamma (IFNy) y factor de necrosis tisular alfa (TNFa), o una combinación de las mismas. Alternativamente, en una realización relacionada, la presente invención se refiere a métodos para la manipulación de células Tex vivode acuerdo con los métodos anteriores, en donde las células T manipuladas son células T auxiliares 2 (Th2) y el método comprende detectar la producción de una citoquina seleccionada del grupo que consiste en IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, o una combinación de las mismas. En una realización relacionada más, la presente invención se refiere a métodos para la manipulación de células Tex vivode acuerdo con los métodos anteriores, en donde las células T manipuladas son células T citotóxicas (Tc) y el método comprende detectar la producción de una citoquina seleccionada del grupo que consiste en interferón gamma (IFNy) y linfotoxina alfa (LTa/TNFp), o una combinación de las mismas. En una realización, las células T manipuladas son células T citotóxicas (Tc) y el método comprende detectar la secreción de una citotoxina seleccionada del grupo que consiste en una granzima o una perforina, o una combinación de las mismas.

[0058] En una realización relacionada, la presente invención se refiere a métodos para la manipulación de células Tex vivode acuerdo con los métodos anteriores, en donde el método comprende además detectar la expresión de un marcador de superficie celular en las células T manipuladas. En una realización, el marcador de superficie celular se selecciona del grupo que consiste en CD69, CD4, CD8, CD25, CD62L, FOXP3, HLA-DR, CD28 y CD134, o una combinación de los mismos. Alternativa o adicionalmente, en una realización, el marcador de superficie celular es un marcador de células no T seleccionado del grupo que consiste en CD36, CD40 y CD44, o una combinación de los mismos.

[0059] En otra realización relacionada, la presente invención se refiere a métodos para la manipulación de células Tex vivode acuerdo con los métodos anteriores, en donde el sujeto es un sujeto humano.

[0060] El andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en métodos para la manipulación de células Tin vivode acuerdo con los métodos anteriores, en donde el andamiaje se administra al sujeto para permitir que la muestra biológica que comprende las células T entre en contacto con el andamiajein vivo.El andamiaje puede mantenerse en el sujeto durante un periodo comprendido entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 15 días, preferiblemente durante un periodo comprendido entre aproximadamente 7 días y aproximadamente 11 días. El andamiaje puede mantenerse en el sujeto durante un período de por lo menos 1 día, por lo menos 2 días, por lo menos 3 días, por lo menos 4 días, por lo menos 5 días, por lo menos 6 días, por lo menos 7 días, por lo menos 8 días, por lo menos 9 días, por lo menos 10 días, por lo menos 11 días, por lo menos 12 días, por lo menos 13 días, por lo menos 14 días, por lo menos 15 días, por lo menos 16 días, por lo menos 17 días, por lo menos 18 días, por lo menos 19 días, por lo menos 20 días, por lo menos 21 días, por lo menos 25 días, por lo menos 30 días, por lo menos 35 días, por lo menos 40 días, por lo menos 50 días, o más.

[0061] En otra realización más, la presente invención se refiere a métodos para elaborar el andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS), que comprenden (a) proporcionar una capa base que comprende microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial; (b) opcionalmente, cargar los agentes homeostáticos de células T en las MSR; (c) estratificar una bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua sobre la capa base que comprende las MSR, generando de este modo un andamiaje de MSR-SLB; (d) cargar los agentes homeostáticos de células T en el andamiaje de MSR-SLB si no se lleva a cabo el paso (b); (e) opcionalmente bloquear uno o más sitios de integración no específicos en el andamiaje de MSR-SLB con un bloqueador; y (f) cargar las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T en el andamiaje de MSR-SLB, generando de este modo el APC-MS. En una realización, los métodos pueden implicar además ensamblar una pluralidad de andamiajes para generar pilas con suficiente porosidad para permitir la infiltración de células T. En una realización, el método puede incluir cargar por lo menos un agente adicional seleccionado del grupo que consiste en un factor de crecimiento, una citoquina, una interleucina, una molécula de señalización de adhesión, una molécula de señalización de integrina, o un fragmento de los mismos o una combinación de los mismos.

[0062] Otras características y ventajas de la invención se desprenderán de la siguiente descripción detallada y de los dibujos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0063]

LaFIG. 1muestra imágenes de microscopio de contraste de fase y fluorescencia de lípidos en asociación con microvarillas de sílice mesoporosa (MSRs). El panel superior muestra imágenes fusionadas de los lípidos y las microvarillas de sílice mesoporosa en una relación lípido:MSR de 1:20 (Escala = 200 |jm). El panel central muestra imágenes combinadas de los lípidos y los microvarillas de sílice mesoporosa en una relación lípido:MSR de 1:4 (Escala = 200 jm ). El panel inferior muestra una imagen de microscopio de contraste de fase fusionada de los lípidos en asociación con los MSR a mayor aumento (Escala = 20 jm).

LasFIGS. 2A, 2B, 2Cy2Dmuestran que el ensamblaje y las características de los andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) dependen del tipo de lípido y del contenido del lípido. LaFIG. 2Amuestra las estructuras químicas de varios lípidos. Abreviaturas: DOPC-dioleoilfosfatidilcolina; POPC-palmitoiloleoilfosfatidilcolina; y DSPC-distearoilfosfatidilcolina. LaFIG. 2Bmuestra el porcentaje de lípido que se retiene en varias composiciones que contienen microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) y bicapa lipídica soportada por fluido (SLB). En este experimento, se introdujo una carga útil de 250 jg de lípidos en una composición de 500 jg de MSR. LaFIG. 2Cmuestra los cambios en la fluorescencia relativa de varias composiciones de MSR-SLB que contienen DOPC, POPC o DSPC en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante un periodo de dos semanas (14 días) a 37°C. LaFIG. 2Dmuestra cambios en la fluorescencia relativa de varias composiciones de MSR-SLB que contienen DOPC, POPC o DSPC en medio completo del Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) durante un periodo de dos semanas (14 días) a 37°C.

LaFIG. 3muestra la estabilidad de varias composiciones de MSR-SLB en PBS en el día 0, el día 3, el día 7 y el día 14, según se analiza mediante microscopía de contraste de fase y fluorescencia (recubrimiento lipídico). El panel superior muestra la estabilidad de DOPC en la composición de MSR-SLB; el panel central muestra la estabilidad de POPC en la composición de MSR-SLB; y el panel inferior muestra la estabilidad de DSPC en la composición de MSR-SLB.

LasFIGS. 4A, 4B, 4C, 4Dy4Emuestran cambios en el ensamblaje y las características de las estructuras fluidas de MSR-SLB a lo largo del tiempo. LaFIG. 4Amuestra imágenes de microscopio de contraste de fase y fluorescencia de lípidos en asociación con microvarillas de sílice mesoporosa (MSRs) tomadas a gran aumento (escala = 2 jM ) antes del blanqueo (pre), justo después del blanqueo (t=0) y 5 minutos después del blanqueo (t=5 min) de la composición lipídica. LaFIG. 4Bmuestra los cambios en la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) con el tiempo. La "fuente" de fluorescencia se representa en la región (2), el "sumidero" de fluorescencia se representa en la región (3), y el punto de normalización es indicado por la región (1). La distribución diferencial se observó mejor en los primeros puntos temporales después de la siembra y alcanzó un equilibrio a alrededor de los 2 minutos (120 s). LaFIG. 4Cmuestra curvas de ajuste suave que representan los cambios medios en FRAP, derivados de las imágenes normalizadas, a lo largo del tiempo. LasFIGS. 4D y 4Emuestran dos conjuntos de imágenes de alta resolución de estructuras fluidas MSR-SLB antes del blanqueo (pre), justo después del blanqueo (t=0) y 3 minutos después del blanqueo (t=3 min) de la composición lipídica.

LasFIGS. 5Ay5Bmuestran las propiedades estructurales y funcionales de las composiciones de MSR-SLB que contienen varias moléculas. Sobre la base de experimentos que usan la línea de células T informadoras B3Z, se observó la máxima funcionalidad del andamiaje APC-MS cuando en el andamiaje se encuentran todos los componentes individuales. LaFIG. 5Amuestra una representación esquemática de la estructura de APC-MS que contiene una bicapa lipídica de POPC que contiene ficoeritrina biotina (biotina PE), que se conjuga con una molécula de estreptavidina (por ejemplo, un dímero de estreptavidina), que a su vez se conjuga con un anticuerpo biotinilado (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3 biotinilado o un anticuerpo anti-CD28 biotinilado u otro anticuerpo específico o no específico). LaFIG. 5Bmuestra el análisis espectrofotométrico de la expresión de p-galactosidasa de células informadoras B3Z después del tratamiento con combinaciones de MPS (sílice), POPC (lípido), material compuesto de MPS-POPC, material compuesto de MPS-POPC biotinilado (en presencia o ausencia de estreptavidina) y el material compuesto de MPS-POPC junto con el anticuerpo biotinilado en presencia o ausencia de ficoeritrina biotina (biotina PE) y/o estreptavidina. En los materiales compuestos de MSR-SLB que contienen todos los componentes individuales-biotina fosfoetanolamina (biotina PE) conjugada con un anticuerpo biotinilado a través de un conector de estreptavidina se observa un aumento significativo de la absorbancia (barras oscuras; ** indica significancia estadística (p<0,001, analizado usando ANOVA unidireccional, seguido de la prueba post hoc Tukey HSD; los datos representan la media ± s.d, de tres réplicas experimentales y son representativos de por lo menos dos experimentos independientes).

LasFIGS. 6Ay6Bmuestran la liberación controlada de IL-2 a partir de composiciones de MSR-SLB que contienen IL-2. LaFIG. 6amuestra una micrografía electrónica de la estructura porosa de la MSR que contiene IL-2 (barra de escala = 100 nm). LaFIG. 6Bmuestra un gráfico de la liberación acumulativa de niveles de IL-2 durante un período de 15 días.

LasFIGS. 7Ay7Bmuestran imágenes de microscopía confocal que muestran la infiltración de células T (esferas) en los andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno que contienen materiales compuestos de MSR-SLB. LaFIG. 7Amuestra células que han sido teñidas con dos colorantes diferentes. LaFIG. 7Bmuestra células que han sido teñidas con un único colorante (indicando células vivas).

LaFIG. 8muestra imágenes de microscopio de contraste de fase y fluorescencia de lípidos en asociación con microvarillas de sílice mesoporosa (MSRs) cocultivados con células T primarias. Se observó que las células T primarias tienden a formar agrupaciones de células/materiales cuando las señales activadoras de células T se unen a la superficie del material. El panel inferior muestra imágenes fusionadas de los lípidos y las microvarillas de sílice mesoporosa en los materiales compuestos de MSR-SLB que contienen anticuerpos conjugados, IL-2 o una combinación de anticuerpos conjugados e IL-2. Las imágenes de la derecha muestran materiales compuestos de MSR-SLB que contienen tanto anticuerpos conjugados como IL-2 (Escala = 20 jm ) a gran aumento.

LasFIGS. 9Ay9Bmuestran gráficos de respuesta a la dosis de cambios inducidos por anticuerpos en células T esplénicas de ratón. LaFIG. 9Amuestra la expansión policlonal de células T después de una estimulación de 3 días de células T con andamiajes de control (simulado; libre; lípido POPC solamente; y una combinación de POPC e IL-2) y andamiajes experimentales (que contienen una combinación de POPC e IL-2, junto con anticuerpo). Se estudiaron tres dosis diferentes del anticuerpo (MSR: relación de anticuerpo de 1:50, 1:25 y 1:10). LaFIG. 9Bmuestra la secreción de IFN<y>después de una estimulación de 3 días de células T con andamiajes de control (simulado; libre; lípido POPC solamente; y una combinación de POPC e IL-2) y andamiajes experimentales (que contienen una combinación de POPC e IL-2, junto con anticuerpo). Se estudiaron tres dosis diferentes del anticuerpo (MSR: relación de anticuerpo de 1:50, 1:25 y 1:10).

LasFIGS. 10y11muestran que los andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) de la presente invención promueven la expansión rápida de células T metabólicamente activas. LaFIG. 10muestra las veces de expansión de células T primarias tras la incubación con composiciones de control (simulada; libre; SLB+IL-2; DYNABEAD+IL-2) o experimentales. La incubación de células T primarias con la composición de la presente invención indujo significativamente la expansión de células T (con o sin reestimulación) en comparación con las composiciones simuladas o las composiciones sin SLB. Lo que es más importante, en comparación con una composición de DINABEADS e IL-2, la incubación de células T primarias con los andamiajes de la invención dio como resultado una proliferación mediblemente más fuerte tras la reestimulación en el día 7. LaFIG. 11muestra un gráfico de barras de la actividad metabólica celular de las células T (medida por unidades de fluorescencia relativa (RFU) de la reducción de azul Alamar normalizada con respecto al número de células) que se incubaron con los andamiajes de la presente invención cargados con IL-2 (SLB/IL2/ABS) o DYNABEADS cargados con IL-2 (DYNABEADS-IL2).

LasFIGS. 12Ay12Bmuestran que los andamiajes de la invención (APC-MS) confieren expansión policlonal de células T esplénicas (ratón) y facilitan la formación de agregados de células T. LaFIG. 12Amuestra fotomicrografías (con un aumento de 4 X) de agregados de células T esplénicas tras la incubación con DYNABEADS o APC-MS en el día 0, día 3 y día 7. LaFIG. 12Bmuestra fotomicrografías (con un aumento de 10 X) de agregados de células T esplénicas tras la incubación con DYNABEADS o APC-MS el día 0, el día 3 y el día 7. (Barras de escala blancas = 100 pM).

LasFIGS. 13Ay13Bmuestran la expansión policlonal de células T esplénicas de ratón tras incubación con APC-MS o DYNABEADS. LaFIG. 13Amuestra diagramas de dispersión de citometría de flujo (FACS) de población o poblaciones de células T en varios puntos temporales (t=0 días, 5 días, 7 días, 11 días y 13 días) después de la incubación con APC-MS o DYNABEADS (con reestimulación o tratamiento con IL-2 después de 7 días de incubación), en donde los valores en el eje X representan la intensidad de la tinción CD8+ y los valores en el eje Y representan la intensidad de la tinción CD4+. Los datos de flujo se compararon con los controles de fluorescencia menos UNO (FMO) para cada muestra, en cada punto temporal. Los datos son representativos de por lo menos dos experimentos independientes. LaFIG. 13Bes un gráfico de líneas que muestra los cambios en el porcentaje de subpoblaciones de células T CD4+ frente a CD8+ después de la incubación con APC-MS (cuadrados) o DYNABEADS (triángulos) en varios puntos temporales (t=0 días, 5 días, 7 días, 11 días y 13 días). Después de 7 días de incubación, las células se dividieron en dos subpoblaciones, en donde la primera subpoblación se volvió a estimular (línea discontinua) y la segunda subpoblación se trató con IL-2 (línea continua). Para la reestimulación de las condiciones APC-MS se usó el APC-MS, para la reestimulación de las condiciones DYNABEADS se usaron DYNABEADS.

LaFIG. 14muestra la medición de la expansión policlonal de un subconjunto de células T esplénicas de ratón FoxP3+ tras la incubación con APC-MS o DYNABEADS. Los resultados se representan en forma de diagramas de dispersión de citometría de flujo (FACS) de la población o poblaciones de células T en varios puntos temporales (t=0 días, 5 días, 7 días, 11 días y 13 días) tras la incubación con APC-MS o DYNABEADS (con reestimulación o tratamiento con IL-2 después de 7 días de incubación), en donde los valores en el eje X representan la intensidad de la tinción FoxP3+ y los valores en el eje Y representan la intensidad de la tinción CD4+. Se aplicó una puerta rectangular para contar el número y/o la proporción de células FoxP3+ en las distintas fracciones. Como se muestra, hubo una expansión limitada o nula de células T FoxP3+ esplénicas de ratón con la formulación particular. LaFIG. 15muestra la expansión policlonal de un subconjunto de células T esplénicas de ratón CD62L+ tras la incubación con APC-MS o DYNABEADS. Los resultados se representan en forma de diagramas de dispersión de citometría de flujo (FACS) de la población o poblaciones de células T en varios puntos temporales (t=0 días, 5 días, 7 días, 11 días y 13 días) después de la incubación con APC-MS o DYNABEADS (con reestimulación o tratamiento con IL-2 después de 7 días de incubación), en donde los valores en el eje X representan la intensidad de la tinción de CD62L+ y los valores en el eje Y representan la intensidad de la tinción de CD44+. Las células CD62L+ aparecen en la parte derecha (cuadrantes superior e inferior derechos) de los diagramas de dispersión.

LaFIG. 16muestra la expansión policlonal de un subconjunto de células T esplénicas de ratón CD8+/CD69+ tras la incubación con APC-MS o DYNABEADS. Los resultados se representan en forma de diagramas de dispersión de citometría de flujo (FACS) de la población o poblaciones de células T en varios puntos temporales (t=0 días, 5 días, 7 días, 11 días y 13 días) después de la incubación con APC-MS o DYNABEADS (con reestimulación o tratamiento con IL-2 después de 7 días de incubación), en donde los valores en el eje X representan la intensidad de la tinción CD8+ y los valores en el eje Y representan la intensidad de la tinción CD69+. Las células CD8+/CD69+ aparecen en el cuadrante superior derecho de los diagramas de dispersión.

LaFIG. 17muestra la expansión policlonal de un subconjunto de células T esplénicas de ratón CD8+/Granzima B+ tras la incubación con APC-MS o DYNABEADS. Los resultados se representan en forma de diagramas de dispersión de citometría de flujo (FACS) de la población o poblaciones de células T en varios puntos temporales (t=0 días, 5 días, 7 días, 11 días y 13 días) después de la incubación con APC-MS o DYNABEADS (con reestimulación o tratamiento con IL-2 después de 7 días de incubación), en donde los valores en el eje X representan la intensidad de la tinción de c D8+ y los valores en el eje Y representan la intensidad de la tinción de Granzima B+. Las células CD8+/Granzima B+ aparecen en el cuadrante superior derecho de los diagramas de dispersión.

LaFIG. 18muestra la secreción de células T de IFN<y>(pg/célula) en varios puntos temporales (t=0 días, 5 días, 7 días, 11 días y 13 días) después de la incubación con APC-MS (cuadrados) o DYNABEADS (triángulos). Después de 7 días de incubación, las células se dividieron en dos subpoblaciones: la primera subpoblación se reestimuló (línea discontinua) y la segunda se trató con IL-2 (línea continua). En este caso, se usó APC-MS en la reestimulación de las poblaciones celulares incubadas tanto con APC-MS como con DYNABEAD.

LaFIG. 19muestra los niveles de células T esplénicas de ratón PD-1+ tras la incubación con APC-MS o DYNABEADS. Los resultados se representan en forma de diagramas de dispersión de citometría de flujo (FACS) de la población o poblaciones de células T en varios puntos temporales (t=0 días, 5 días, 7 días, 11 días y 13 días) después de la incubación con APC-MS o DYNABEADS (con reestimulación o tratamiento con IL-2 después de 7 días de incubación), en donde los valores en el eje X representan la intensidad de la tinción de CD8+ y los valores en el eje Y representan la intensidad de la tinción de PD-1+ (un posible marcador de agotamiento).

LasFIGS. 20Ay20Bmuestran el efecto de incubar células T de sangre periférica humana con varias composiciones. LaFIG. 20Amuestra un gráfico lineal de la expansión policlonal de células T primarias que se incubaron con andamiajes de control o andamiajes experimentales en varios puntos temporales (t=0 días, 5 días, 7 días, 11 días y 13 días). Los andamiajes de control incluyen composiciones simuladas ("simulado"; línea negra) y composiciones que no tienen SLB ("libre"; línea roja). Los andamiajes experimentales incluyen (1) DYNABEADS (línea azul) y (2) bicapas lipídicas (SLB) de la presente invención (línea verde). LaFIG. 20Bmuestra un gráfico de barras que muestra la actividad metabólica de células T primarias (medida con el ensayo de tinción con azul de Alamar estándar) que se incubaron con andamiajes de control o andamiajes experimentales en varios puntos temporales (t=0 días, 5 días, 7 días, 11 días y 13 días). Los andamiajes de control incluyen composiciones simuladas ("simulado"; "m") y composiciones libres de SLB ("libre"; "f"). Los andamiajes experimentales incluyen (1) DYNABEADS ("d") y (2) bicapas lipídicas (SLB) de la presente invención ("s").

LasFIGS. 21Ay21Bmuestran el efecto de incubar células T de sangre periférica humana con varios anticuerpos anti-CD3. Las muestras de sangre humana obtenidas del sujeto 1(FIG.2lA )y del sujeto 2(FIG.21B) se incubaron con andamiajes de control ("simulado") o andamiajes experimentales que contenían los anticuerpos anti-CD3 enumerados - muromonab (OKT3), un anticuerpo que reconoce la cadena £ de 17-19 kD de<c>D3 dentro del complejo antígeno de CD3/receptor de antígeno de células T (TCR) (HIT3a) y un anticuerpo monoclonal que reconoce una subunidad de 20 kDa del complejo TCR dentro de CD3e (UCHT1). Se investigaron tres dosificaciones diferentes: 5 |jg (diapositivas superiores), 1 |jg (diapositiva inferior para el sujeto 2) y 0,5 |jg (diapositiva inferior para el sujeto 1). En cada caso, se proporcionó coestimulación con anticuerpos anti-CD28, en donde la relación de anticuerpo anti-CD3:anticuerpo anti-CD28 se mantuvo en 1:1. Se midió el nivel de cambio de expansión de células T en varios puntos temporales (t=0 días, 7 días, 11 días y 13 días).

LaFIG. 22muestra la expansión policlonal de células T humanas tras la incubación con andamiajes de control ("simulado") o andamiajes experimentales que contienen los anticuerpos anti-CD3 enumerados - OKT3, HIT3a y UCHT1. Los paneles inferiores muestran diagramas de dispersión de citometría de flujo (FACS) de la población o poblaciones de células T en varios puntos temporales (t = 8 días, 11 días y 14 días) después de la incubación con APC-MS que contienen cada uno de los anticuerpos anti-CD3 como molécula estimuladora y un anticuerpo anti-CD28 como molécula coestimuladora. Los valores del eje X de los diagramas de dispersión representan la intensidad de la tinción de CD8+ y los valores del eje Y representan la intensidad de la tinción de CD4+. Los diagramas se resumen en los gráficos de líneas del panel superior, que muestran los cambios en el porcentaje de subpoblaciones de células T CD4+ frente a CD8+ después de la incubación con APC-MS que contienen los anticuerpos anti-CD3 mencionados anteriormente: OKT3 (círculos), HIT3a (cuadrados) y UCHT1 (triángulos). Se investigaron dos dosificaciones diferentes de anticuerpos - 5 jg (dilución 1x) y 0,5 jg (dilución 1:10x).

LaFIG.23muestra la expresión de CD62L y CCR7 en células T vivas expandidas durante 14 días usando el APC-MS que contiene IL-2 y los anticuerpos anti-CD3 mencionados anteriormente- OKT3 (paneles izquierdos), HIT3a (paneles centrales) y UCHT1 (paneles derechos) y el anticuerpo anti-CD28 en una proporción 1:1, a una concentración de carga 1x (aproximadamente 5 jg). En los paneles superiores se muestra la expresión de CD62L y CCR7 en el total de células vivas y en los paneles inferiores se muestra la expresión de estos marcadores en células CD8+ activadas. La mayoría de las células expandidas con el APC-MS de la presente invención permanecen CD62L+CCR7+ después de 14 días de incubación, lo que ha demostrado ser importante para la funcionalidadin vivoen pacientes humanos. Además, los andamiajes de APC-MS que contienen OKT3 fueron particularmente eficaces en la expansión y/o retención de células T CD62L+CCR7+ en comparación con los andamiajes que contienen UCHT1 y/o HIT3a.

LaFIG. 24esboza un esquema representativo para elaborar los andamiajes de la presente invención.

LasFIGS. 25Ay25Brepresentan el diseño de andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS). LaFIG. 25arepresenta un proceso ejemplar para preparar APC-MS: 1) se sintetizan microvarillas de sílice mesoporosa (MSR); 2) las MSR se adsorben con IL-2; 3) las MSR adsorbidas con IL-2 se recubren con liposomas, formando las MSR-SLB; 4) se unen a la superficie de las MSR-SLB las señales de activación de células T; 5) las MSR-SLB se cultivan con células T; y 6) las MSR-SLB se asientan y apilan para formar un andamiaje que es infiltrado por células T. Los andamiajes formados a partir de las M<s>R-SLB que se cargaron con IL-2 y se funcionalizaron en superficie con señales de activación de células T se denominan APC-MS. LaFIG. 25Brepresenta estructuras y funciones ejemplares de distintas formulaciones de APC-MS. La IL-2 se libera de las APC-MS con el tiempo, lo que da como resultado la administración paracrina de IL-2 a las células T locales. La incorporación de cantidades predefinidas de un fosfolípido biotinilado en formulaciones liposómicas permite la unión precisa en superficie de señales de activación de células T biotiniladas mediante interacciones estreptavidina-biotina, imitando la presentación en superficie celular de señales por APC naturales a células T. Para la expansión policlonal de células T, se unen anticuerpos activadores contra CD3 (aCD3) y CD28 (aCD28) (izquierda). Para la expansión de células T específicas del antígeno, se unen MHC cargados con péptidos (pMHC) y aCD28 (derecha).

LasFIGS. 26Ay26Brepresentan la caracterización física de los componentes usados para ensamblar las MSR-SLB. LaFIG.26Amuestra una imagen representativa de microscopía de campo claro de las MSR. Barra de escala = 100 |jm. LaFIG. 26Brepresenta la distribución de tamaño de los liposomas de POPC medida por dispersión dinámica de luz (DLS). Los datos de laFIG. 26Brepresentan la distribución media del tamaño de 3 muestras. LasFIG. 27Ay27Bson imágenes de microscopía de MSR recubiertas de lípidos. LaFIG. 27Aes una imagen de microscopía que muestra la agregación de las MSR con una relación lípidos:MSR baja. Imágenes de microscopía representativas de las MSR recubiertas de lípidos (lípido:MSR 1:20 p/p) que muestran la imagen de campo claro de las MSR (izquierda), fosfolípido marcado con fluoróforo (1% molar del lípido total; centro), y colocalización de las MSR y lípido (derecha). Barra de escala = 200 jm . LaFIG. 27Bes una imagen de microscopio de MSR recubiertas de lípidos (lípido:MSR 1:4 p/p) que muestra una imagen de campo claro de MSR (izquierda), fosfolípido marcado con fluoróforo (1% molar del lípido total; centro) y colocalización de MSR y lípido (derecha). Barra de escala = 200 jm.

LasFIGS. 28A-28Erepresentan el ensamblaje y caracterización de APC-MS. LaFIG.28Arepresenta la retención del recubrimiento lipídico (que contiene un 1% molar de lípidos marcados con fluoróforos) en las MSR a lo largo del tiempo en medio PBS o RPMI con un 10% de suero (cRPMI), mantenido en condiciones de cultivo celular. LaFIG. 28Bes una imagen representativa superpuesta de microscopía de fluorescencia de las MSR recubiertas de lípidos (MSR, campo claro; lípido (1% molar de lípido marcado con fluoróforo), verde), mantenidos en cRPMI en condiciones de cultivo celular estándar, a lo largo del tiempo. Barra de escala = 100 jm . Los datos representan la media ± s.d. de tres réplicas experimentales y son representativos de por lo menos dos experimentos independientes. LaFIG. 28ces un gráfico que representa la cuantificación de IL-2 liberada de las MSR-SLB (500 jg de MSR)in vitroa lo largo del tiempo (puntos de datos) con ajuste exponencial de una fase (línea discontinua; R2= 0,98). Los datos representan la media ± s.d. de tres réplicas experimentales y son representativos de por lo menos dos experimentos independientes. LaFIG. 28Des un gráfico que representa la cuantificación de la unión de varias entradas de IgG biotinilada en las MSR recubiertas con formulaciones lipídicas que contienen un 0,01% molar, un 0,1% molar o un 1% molar de lípido biotinilado. Los valores sobre las barras indican la concentración ( jg ) de IgG unida para cada condición respectiva. Los datos representan la media ± s.d. de cuatro réplicas experimentales y son representativos de por lo menos dos experimentos independientes. LaFIG. 28Ees una imagen SEM que muestra la estrecha asociación de células T humanas primarias con APC-MS. Barra de escala = 10 jm .

LaFIG.29muestra la asociación de células T con APC-MS. Imágenes de microscopía representativas de las MSR-SLB que no presentan ninguna señal en la superficie (señal-), o que presentan aCD3 y aCD28 en la superficie (señal+), a bajo aumento (izquierda) y a alto aumento (derecha), cultivadas con células T primarias de ratón durante un día. Las células y el material son visibles en las imágenes de campo claro (arriba) y los recubrimientos lipídicos MSR-SLB son visibles en el canal verde (1% molar de lípido marcado con fluoróforo; centro). Las imágenes fusionadas se muestran en la parte inferior. Barra de escala de bajo aumento = 500 jm , barra de escala de alto aumento = 100 jm .

LasFIGS. 30A, 30B, 30C, 30D, 30E, 30Fy30Gmuestran la expansión policlonal de células T primarias de ratón y humanas. LaFIG. 30Ason imágenes representativas de microscopía de campo claro de células T primarias de ratón cultivadas con DYNABEADS o APC-MS, en varios puntos temporales, a bajo aumento (izquierda) o alto aumento con APC-MS (derecha). Barras de escala = 100 jm . LaFIG. 30Bmuestra la expansión de células T primarias de ratón que no se trataron (simulado) o se cultivaron con señales libres (110 nM aCD3, 110 nM aCD28, 1,3 jg/m l de IL-2), perlas de expansión de células T de ratón CD3/CD28 comerciales e IL-2 exógena (DYNABEADS), MSR-SLB cargadas con IL-2 sin señales de células T presentadas en la superficie de la bicapa (MSR-SLB (señal-)), o APC-MS (cargadas con aCD3, aCD28, IL-2). Las curvas para simulado y libre eran indistinguibles de la curva MSR-SLB (señal-). LaFIG. 30Crepresenta las frecuencias de células<c>D4+ y CD8+ entre células individuales vivas a lo largo del tiempo en cultivos APC-MS o Dynabead, medidas usando FAC<s>. Los datos se analizaron usando ANOVA de dos vías, seguido de la prueba post-hoc HSD de Tukey. LaFIG. 30Dson imágenes representativas de microscopía de campo claro de células T humanas primarias cultivadas con DYNABEADS o formulaciones de APC-Ms , en varios puntos temporales. Barras de escala = 100 jm . (F1) APC-MS que presenta aCD3y aCD28 saturando al 1% molar de lípido biotinilado, entrada a 333 jg/m l de las MSR al cultivo inicial, (F2) APC-MS que presenta aCD3y aCD28 saturando al 1% molar de lípido biotinilado, entrada a 33 jg/m l de las Ms R al cultivo inicial, (F3) APC-MS que presenta aCD3y aCD28 saturando al 0,1% molar de lípido biotinilado, entrada a 333 jg/m l de las MSR en el cultivo inicial, y (F4) APC-MS que presenta aCD3y aCD28 saturando al 0,1% molar de lípido biotinilado, entrada a 33 jg/m l de las MSR en el cultivo inicial. LaFIG. 30Emuestra la expansión de células T humanas primarias que fueron o no tratadas (simuladas), o cultivadas con perlas de expansión de células T humanas CD3/CD28 comerciales e IL-2 exógena (DYNABEADS), o con varias formulaciones de APC-MS. LaFIG. 30Frepresenta la cuantificación FACS de células CD4 y CD8 individuales positivas entre células CD3+ individuales vivas, en muestras expandidas durante 14 días con DYNABEADS o con varias formulaciones de APC-MS. LaFIG. 30Grepresenta la cuantificación FACS de células que coexpresan PD-1 y LAG-3 entre células individuales vivas, en muestras expandidas o con DYNABEADS o con varias formulaciones de APC-MS. Los datos de las FIGS. 30F y 30G representan la media ± s.d. de tres réplicas experimentales y son representativos de por lo menos dos experimentos independientes. Los datos de la FIG. 30E representan la media ± s.d. de por lo menos tres muestras donantes diferentes de dos experimentos independientes. Los datos de las FIG. 30F y 30G representan la media ± s.d. de tres muestras de donantes diferentes y son representativos de por lo menos dos experimentos independientes. **p < 0,01, ***p < 0,001.

LaFIG. 31representa diagramas FACS representativos de la expresión de CD4 y CD8 en células T primarias de ratón expandidas policlonalmente. FIG. 32. Diagramas FACS representativos que muestran la expresión CD4 y CD8 en células individuales vivas que se expandieron policlonalmente con APC-MS o DYNABEADS. Los datos de flujo se procesaron en controles de fluorescencia menos UNO (FMO) para cada muestra, en cada punto temporal. Los datos son representativos de por lo menos dos experimentos independientes.

LasFIGS. 32A, 32B, 32Cy32Drepresentan la caracterización fenotípica ampliada de células T primarias de ratón expandidas policlonalmente. LaFIG. 32Arepresenta la cuantificación FACS de células positivas para Granzima B entre células CD8+ vivas individuales, en muestras expandidas o con DYNABEADS o con APC-MS (izquierda), y diagramas FACS representativos (derecha). LaFIG. 32Brepresenta la cuantificación FACS de células FoxP3 positivas entre células CD4+ vivas, en muestras expandidas con DYNABEADS o con APC-MS. LasFIGS. 32Cy32Dmuestran diagramas FACS representativos que muestran la expresión de PD-1 en células individuales vivas, en función de la expresión de CD8. Los datos de flujo se procesaron en controles de fluorescencia menos UNO (FMO) para cada muestra, en cada punto temporal. Los datos representan la media ± s.d. de tres réplicas experimentales y son representativos de por lo menos dos experimentos independientes.

LaFIG. 33muestra la expresión de moléculas de adhesión en células T humanas primarias expandidas policlonalmente. Cuantificación FACS de células individuales vivas que coexpresan CD62L y CCR7, en muestras expandidas o con DYNABEADS o con varias formulaciones de APC-MS. (F1) APC-MS que presenta aCD3y aCD28 que saturan al 1% molar de lípido biotinilado, entrada a 333 pg/ml de las MSR al cultivo inicial, (F2) APC-MS que presenta aCD3y aCD28 que saturan al 1% molar de lípido biotinilado, entrada a 33 pg/ml de MSR al cultivo inicial, (F3) APC-MS que presenta aCD3y aCD28 que saturan al 0,1% molar de lípido biotinilado, entrada a 333 pg/ml de MSR en el cultivo inicial, y (F4) APC-MS que presenta aCD3y aCD28 que saturan al 0,1% molar de lípido biotinilado, entrada a 33 pg/ml de las MSR en el cultivo inicial. Los datos representan la media ± s.d. de tres muestras de donantes diferentes y son representativos de por lo menos dos experimentos independientes.

LasFIGS. 34A, 34B, 34C, 34Dy34Erepresentan la expansión específica del antígeno de células T primarias de ratón. LaFIG. 34Amuestra imágenes representativas de microscopía de campo claro de células T CD8+ OT-I primarias cultivadas durante dos días con APC-MS que presenta un péptido irrelevante (SVYDFFVWL (SEQ ID NO: 3); izquierda) o el péptido relevante (SIINFEKL (S<e>Q ID NO: 4); derecha) en H-2K(b). Barra de escala = 100 pm. LaFIG. 34Bmuestra la expansión de células T CD8+ OT-I primarias que se cultivaron sin tratar (simuladas) o con varias formulaciones de A p C-MS. (F1) APC-MS que presenta SIINf Ek L (SEQ ID NO: 4)/H-2K(b) y aCD28 que saturan al 1% molar de lípido biotinilado, entrada a 333 pg/ml de las MSR al cultivo inicial, (F2) APC-MS que presenta SIINFEKL (SEQ ID NO: 4)/H-2K(b) y aCD28 que saturan al 1% molar de lípido biotinilado, entrada a 33 pg/ml de las MSR al cultivo inicial, (F3) APC-MS que presenta SIINFEKL (SEQ ID NO: 4)/H-2K(b) y aCD28 que saturan al 0,1% molar de lípido biotinilado, entrada a 333 pg/ml de las MSR al cultivo inicial, y (F4) APC-MS que presenta SIINFEKL (SEQ<i>D NO: 4)/H-2K(b) y aCD28 que saturan al 0,1% molar de lípido biotinilado, entrada a 33 pg/ml de las MSR al cultivo inicial. LaFIG. 34Cmuestra la cuantificación FACS de la expresión de IFNy y TNFa por células T CD8+ OT-I individuales vivas expandidas durante 13 días con varias formulaciones de APC-MS y luego cocultivadas con células B16-F10 que se pulsaron de manera simulada (-), o se pulsaron con el péptido SIINFEKL (SEQ ID NO: 4) (+). LaFIG. 34Drepresenta la cuantificación de la destrucción in vitro de células diana B16-F10 pulsadas de manera simulada (-) o pulsadas con SIINFEKL (SEQ ID NO: 4) (+) por células T CD8+ OT-I que se expandieron durante 13 días con varias formulaciones de APC-MS y luego se cocultivaron a varias proporciones de células efectoras:células diana. LaFIG. 34Erepresenta la cuantificación de la secreción de IFNy por células T CD8+ OT-I expandidas durante 13 días con varias formulaciones de APC-MS en respuesta al cocultivo en varias proporciones de células efectoras:células diana con células B16-F10 que se pulsaron de manera simulada (pep-), o se pulsaron con el péptido SIINFEKL (SEQ ID NO: 4) (pep+). Los datos en lasFIGS. 34B, 34C, 34Dy34Erepresentan la media ± s.d. de tres réplicas experimentales y son representativos de por lo menos dos experimentos independientes.

LasFIGS. 35A, 35B, 35C, 35Dy35Emuestran la caracterización ampliada de células T humanas primarias expandidas con formulaciones APC-MS específicos de antígeno. LaFIG.35Amuestra la expansión total de células T CD8+ humanas primarias aisladas que se trataron de manera simulada (30 U/ml de IL-2), o se cultivaron con APC-MS (cargadas con pMHC, aCD28, IL-2) presentando el péptido CLG o GLC en HLA-A2. Los datos de las células tratadas de manera simulada sólo están disponibles para los días 0 y 7. LasFIGS. 35B, 35Cy35Dmuestran la cuantificación de la secreción de IFNy de aislados de células T CD8+ que se trataron de manera simulada (30 U/ml de IL-2), o se cultivaron con ApC-MS que presentaban el péptido CLG (APC-MS CLG) o el péptido GLC (APC-MSGLC), después del cocultivo con células T2 que no se habían pulsado (péptido)(FIG. 35B),se habían pulsado con péptido CLG (+péptido CLG)(FIG. 35C)o se habían pulsado con péptido GLC (+péptido GLC)(FIG. 35D).Los datos de las células tratadas de manera simulada sólo están disponibles para el día 7. LaFIG. 35Emuestra diagramas FACS representativos que muestran la expresión de IFNy y TNFa, de aislados de células T CD8+ que se cultivaron con APC-MS que presentaban el péptido CLG (APC-m S / CLG) o el péptido GLC (APC-MS / GLC), después del cocultivo con células T2 que o no se habían pulsado (sin péptido; arriba), se habían pulsado con péptido CLG (+péptido CLG; centro), o se habían pulsado con péptido g Lc (+péptido GLC; abajo). Los datos de lasFIGS.35Ay35Brepresentan la media ± s.d. de tres réplicas experimentales y son representativos de dos experimentos con dos muestras de donantes diferentes.

LasFIGS. 36A, 36B, 36C, 36D, 36E, 36F, 36G, 36H, 36I, 36J, 36K, 36L, 36My36Nmuestran la expansión específica del antígeno de células T humanas primarias. LasFIGS. 36A, 36B, 36C, 36D, 36E, 36F, 36G, 36H, 36Iy36Jmuestran la expansión específica del antígeno de células T humanas primarias a partir de aislados de células T CD8+. LasFIGS. 36A, 36By36Drepresentan el análisis de tetrámeros de células individuales CD8+ vivas específicas para los péptidos derivados del EBV CLGGLLTMV (SEQ ID NO: 1) (CLG;FIGS. 36Ay36B)y GLCTLVAML (SEQ ID NO. 2) (GLC;FIGS. 36Dy36E).Diagramas FACS representativos con números en compuertas que denotan el porcentaje de células CD8+ individuales vivas que son positivas para el tetrámero respectivo(FIGS. 36Ay36D),y cuantificación de datos FACS en varios puntos temporales(FIG. 36By36E), de células T CD8+ humanas HLA-A2+ primarias que se trataron de manera simulada (30 U/ml de IL-2), o se cultivaron con APC-MS (cargadas con pMHC, aCD28, lL-2) que presentaban el péptido CLG o GLC en HLA-A2. Los datos de las células tratadas de manera simulada sólo están disponibles para los días 0 y 7. LaFIG. 36Fmuestra la expansión de células T CD8+ humanas primarias específicas para CLG(FIG. 36C)o GLC(FIG. 36F) que se trataron de manera simulada o se cultivaron con APC-Ms que presentaban el péptido CLG o GLC en HLA-A2. Los datos de las células tratadas de manera simulada sólo están disponibles para los días 0 y 7. LasFIGS. 36G, 36Hy36Imuestran las frecuencias de células TNFa+IFNY+ entre las células T CD8+ individuales vivas que se trataron de manera simulada o se cultivaron con APC-MS que presentaban el péptido CLG o GLC en HLA-A2, después del cocultivo con células T2 que no se habían pulsado (péptido;FIG. 36G),se habían pulsado con péptido CLG (+péptido CLG;FIG.36H),o se habían pulsado con péptido GLC (+péptido GLC;FIG. 36I).Los datos de las células tratadas de manera simulada sólo están disponibles para el día 7. LaFIG. 36Jmuestra la cuantificación de la destrucciónin vitrode células diana T2 que se habían pulsado de manera simulada (sin péptido), o se habían pulsado con el péptido CLG (+CLG) o el péptido GLC (+GLC), por células T CD8+ humanas primarias expandidas durante 14 días con APC-MS que presentaban el péptido C<l>G o GLC en HLA-A2. LasFIGS. 36K, 36L,36<m>y36Nmuestran la expansión específica del antígeno de células T humanas primarias a partir de PBMC. LaFIG. 36Krepresenta la frecuencia de células específicas de GLC entre células T CD8+ vivas individuales, dentro de PBMC cultivadas durante 7 días en 30 U/ml de IL-2 (simulado), o con APC-MS que presentan el péptido GLC en HLA-A2. LaFIG. 36Lmuestra el número de células T CD8+ específicas de GLC dentro de PBMC cultivadas durante 7 días en 30 U/ml de IL-2 (simulado), o con APC-MS que presentan el péptido GLC en HLA-A2. Los números sobre las barras indican el nivel de cambio de la expansión (media ± s.d.). LasFIGS. 36My36Nmuestran la frecuencia de las células TNFa+IFNY+ entre las células T CD8+ individuales vivas(FIG. 36M),y la secreción de IFNy(FIG. 36N),a partir de PBMC cultivadas durante 7 días en 30 U/ml de IL-2 (simulado), o con APC-MS que presentaban el péptido GLC en HLA-A2, después del cocultivo con células T2 que no se habían pulsado (sin péptido), se habían pulsado con el péptido CLG (+CLG), o se habían pulsado con el péptido GLC (+GLC). Todos los datos representan la media ± s.d. de tres réplicas experimentales y son representativos de dos experimentos con dos muestras de donantes diferentes.

LaFIG.37representa la degradación del andamiaje APC-MSin vitro.Se cultivó APC-MS (167 |jg) que presentaba aCD3/aCD28 (lípido biotinilado al 1%) y liberaba IL-2 con células T primarias de ratón (25 ><104 células T/167 jg de APC-MS). En varios puntos temporales, los cultivos se centrifugaron a 700 rcf durante 5 min, y el contenido de Si en los sedimentos se cuantificó mediante espectrometría de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES; Galbraith Laboratories). El Si es indetectable en los sedimentos de cultivo una semana después del inicio del cultivo.

LaFIG. 38muestra la liberación controlada de varias cargas útiles solubles de dirección inmunitaria de APC-MS. Se generaron 4 APC-MS, cada uno de los cuales comprendía 2 jg de IL-2, IL-21, TGFp o IL-15SA cargados en 500 jg de APC-MS antes del recubrimiento lipídico. Las muestras se lavaron a fondo para eliminar la proteína no cargada y posteriormente se mantuvieron a 37°C durante un máximo de 28 días. La liberación de la carga útil a lo largo del tiempo se evaluó mediante ELISA.

LasFIGS. 39Ay39Brepresentan experimentos de recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) usando las MSR-SLB que contienen un 10% de lípido marcado con grupo de cabeza de carboxifluoresceína. LaFIG. 39Ason imágenes representativas de tres eventos FRAP independientes. Las imágenes muestran MSR-SLB marcadas con fluorescencia antes del fotoblanqueo (izquierda), inmediatamente después del fotoblanqueo (centro) y después de la recuperación de la fluorescencia (derecha). Las regiones fotoblanqueadas se indican con flechas rojas. LaFIG. 39Bmuestra la cuantificación de la recuperación de la fluorescencia a lo largo del tiempo. La recuperación de fluorescencia de 8 fotoblanqueos independientes en diferentes MSR-SLB se muestra en negro discontinuo y la tendencia media se muestra en sólido.

LasFIGS. 40A, 40B, 40Cy40Drepresentan los resultados de experimentos de expansión de células T realizados usando APC-MS en comparación con DYNABEAD, en donde la cantidad de las DYNABEAD se normalizó para que comprendiesen la misma cantidad de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 que los APC-MS.FIG. 40A.Análisis de ensayo de ácido bicinconínico (BCA) para cuantificación de proteína total realizado para determinar la cantidad de proteína unida en la superficie del activador de células T CD3/CD28 de ratón o humanas comercial DYNABEADS. Se lavaron a fondo las soluciones madre de DYNABEAD y la carga de anticuerpos DYNABEAD se evaluó mediante el ensayo BCA. Se observó que las DYNABEAD dirigidas a células T humanas y de ratón tenían cargas de anticuerpos similares (~20 |jg/ml). Sobre una base por célula, una relación de DYNABEAD:célula de 5:1 (condición D-B) correspondía a la misma dosis de anticuerpos anti-CD28/anti-CD3 que APC-MS que presentaba una entrada de señales de células T del 0,1% a 16,7 jg (condición M-D).FIG. 40B.Se observó una expansión dependiente de la dosis de células T primarias de ratón con APC-MS durante un periodo de cultivo de 13 días, pero no con las DYNABEAD dentro del intervalo de dosis probado. El APC-MS promovió significativamente una mayor expansión de células T en comparación con DYNABEADS presentando la misma cantidad de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (ver condición M-D frente a D-B).FIG. 40C.A pesar de una mayor expansión, las células expandidas con APC-MS condición M-D no mostraron una coexpresión mejorada de los marcadores de agotamiento PD-1 y LAG-3 en comparación con las células expandidas con DYNABEAD que presentaban la misma cantidad de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (condición D-B).FIG.40D.Las células T expandidas con dosis bajas a moderadas de DYNABEAD mostraron un sesgo principalmente desplazado a CD4 (condiciones D-A, D-B). Cuando se añadieron DINABEAD en dosis extremadamente altas, se observó un sesgo moderado hacia CD8 (condición D-C). Por el contrario, los APC-MS tendieron a mostrar un fuerte sesgo hacia CD8, el grado de sesgo dependiendo de la formulación de los APC-MS. Los datos de las FIGS.40B, 40Cy40Drepresentan la media ± s.d. de muestras de cuatro ratones diferentes y son representativos de por lo menos dos experimentos independientes. ***p<0,001, (b) analizados mediante ANOVA de dos vías, seguido de la prueba post-hoc HSD de Tukey.

LasFlGS. 41Ay41Brepresentan los resultados de experimentos realizados para evaluar el efecto sobre la expansión de células T primarias de ratón de la dosis de IL-2 y la liberación sostenida de APC-MS en comparación con las DYNABEAD. LaFIG. 41Amuestra la expansión de células T primarias de ratón tratadas con APC-MS cargadas con IL-2 (M-D), APC-MS e IL-2 añadida al medio (M-D bIL2); DYNABEAD (D-B) o DYNABEAD e IL-2 añadida al medio (D-B bIL-2). D-B: DYNABEAD 5:1; D-B-bIL-2: DYNABEAD 5:1 bolo de IL-2; M-D: 0,1% de señales de células T/1:10X material/ L-2 cargada; M-S/bIL-2: 0,1% de señales de células T/1L10X material/bolo de IL-2. LaFIG. 41Bmuestra la coexpresión de los marcadores de agotamiento PD-1 y LAG-3 en células T primarias de ratón expandidas o con APC-MS cargadas con IL-2 (M-D); APC-MS e IL-2 añadidas al medio (M-D bIL2); DYNABEAD (D-B); o DYNABEAD e IL-2 añadidas al medio (D-B bIL-2). Los datos representan la media ± desviación estándar de muestras de cuatro ratones diferentes y son representativos de por lo menos dos experimentos independientes. ***p<0,001, analizados mediante ANOVA de dos vías, seguido de la prueba posthoc HSD de Tukey.

LasFIGS. 42Ay42Brepresentan la unión de IgG marcada con azida a MSR-SLB que presentan DBCO mediante conjugación por química de clic.FIG. 42A.Se incubaron varias cantidades de IgG modificada con azida (como se indica) con MSR-SLB que contenían cantidades variables de lípido modificado con DBCO (como se indica). Los valores sobre las barras representan los ug de IgG modificada con azida que se unieron a MSR-SLB. LaFIG. 42Bmuestra la titulación de dosis más amplia de IgG modificada con azida que se unió a las MSR-SLB que contenían cantidades variables de lípido modificado con DBCO. nIgG representa IgG que no estaba modificada con azida. Los valores sobre las barras representan los jg de IgG modificada con azida que se unieron a las MSR-SLB.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0064] La presente invención proporciona una solución al problema de la manipulación de células T. Específicamente, la presente invención proporciona andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS), que son útiles en la manipulación de tales células. Los APC-MS comprenden una capa base que comprende microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial; una bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) estratificada sobre la capa base de MSR; y una o más moléculas funcionales seleccionadas entre una molécula activadora de células T y una molécula coestimuladora de células T o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, los andamiajes incluyen varillas de sílice mesoporosa (MSR), que incorporan o están recubiertas con una bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua, formando de este modo andamiajes de MSR-SLB. En algunas realizaciones, el andamiaje de MSR-SLB contiene además una pluralidad de moléculas activadoras de células T y coestimuladoras de células T que , junto con una pluralidad de agentes homeostáticos de células T, que juntos componen una estructura que imita las células presentadoras de antígeno (APC) y permite que los andamiajes provoquen varias funciones efectoras en las células diana, por ejemplo, las células T. En algunas realizaciones, el andamiaje media estos efectos a través de la interacción directa o indirecta entre las moléculas de la superficie celular que residen en las células diana y los varios compañeros de unión presentados por los andamiajes. Dependiendo de la aplicación para la que se use el andamiaje, el andamiaje regula la supervivencia y el crecimiento de las células diana a través de las características físicas o químicas del propio andamiaje. Dependiendo de la aplicación, la composición del andamiaje puede modificarse para que contenga ciertas señales activadoras y coestimuladoras, así como moléculas de señalización homeostáticas, que actúan conjuntamente para mediar varias funciones efectoras, por ejemplo, activación, división, promoción de la diferenciación, crecimiento, expansión, reprogramación, anergia, quiescencia, senescencia, apoptosis o muerte, de las células diana. En estas aplicaciones, se observó que los andamiajes mejoraban sorprendentemente la actividad metabólica celular y el crecimiento de las células diana. Además, la mejora en el crecimiento y la actividad metabólica conferida por los andamiajes de la invención fue inesperadamente superior a las plataformas existentes, como las perlas magnéticas.

[0065] Para permitir la manipulación de células específicas, como las células T, la permeabilidad de la composición del andamiaje puede regularse, por ejemplo, seleccionando o diseñando un material para que tenga un tamaño de poro, densidad, reticulación polimérica, rigidez, dureza, ductilidad o elasticidad mayor o menor. La composición del andamiaje puede contener canales o rutas físicas a través de las cuales las células diana interactúan con el andamiaje y/o se desplazan a un compartimento o región específicos del andamiaje. Para facilitar la compartimentación, la composición del andamiaje puede organizarse opcionalmente en compartimentos o capas, cada una con una permeabilidad diferente, de tal manera que las células se clasifiquen o filtren para permitir el acceso sólo a una cierta subpoblación de células. El secuestro de las poblaciones de células diana en el andamiaje también puede regularse mediante la degradación, deshidratación o rehidratación, oxigenación, alteración química o del pH, o autoensamblaje en curso de la composición del andamiaje. Tras su captura, puede permitirse que las células diana crezcan o se expandan dentro del andamiaje con la ayuda de moléculas estimuladoras, citoquinas y otros cofactores presentes en el andamiaje. En otros casos, las células no diana que se hayan infiltrado de otro modo en el andamiaje pueden rechazarse o eliminarse mediante agentes de selección negativa.

[0066] Las células que están contenidas o secuestradas dentro de los andamiajes de la invención son principalmente células inmunitarias. En ciertas realizaciones, la invención se refiere a andamiajes para secuestrar y/o manipular células T. En otras realizaciones, la invención se refiere a andamiajes que son permeables a otros linfocitos, por ejemplo, células B. En otras realizaciones más, la invención se refiere a una combinación de andamiajes, por ejemplo, una combinación de andamiajes de células T y andamiajes de células B. Las células inmunitarias, por ejemplo, las células T, se recogen y analizan opcionalmente para identificar subpoblaciones distintas que sean útiles en el diagnóstico o la terapia de enfermedades. Las células recogidas también pueden reprogramarse o expandirse para desarrollar composiciones o formulaciones que se van a usar en la terapia.

[0067] La invención se describe adicionalmente con más detalle en las subsecciones siguientes.

I. Andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS)

[0068] En una realización, la presente invención proporciona andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS). Los andamiajes contienen una capa base que comprende microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial; una bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua sobre la capa base de MSR; una pluralidad de moléculas activadoras de células T y moléculas coestimuladoras de células T adsorbidas sobre el andamiaje; y una pluralidad de agentes homeostáticos de células T adsorbidos sobre el andamiaje.

A. Sílice mesoporosa

[0069] Los componentes de los andamiajes de la invención incluyen sílice mesoporosa. La sílice mesoporosa es un cuerpo poroso con poros uniformes, con forma de cilindro, compactos, hexagonales. Este material se sintetiza usando una micela con forma de varilla de un surfactante como plantilla, que se forma en agua disolviendo e hidrolizando una fuente de sílice como alcoxisilano, solución de silicato de sodio, kanemita, partícula fina de sílice en agua o alcohol en presencia de catalizador ácido o básico. Véase, la Publicación de Estados Unidos N° 2015-0072009 y Hoffmann et al., Angewandte Chemie International Edition, 45, 3216-3251, 2006. Se han examinado muchos tipos de surfactantes como surfactantes catiónicos, aniónicos y no iónicos como el surfactante y se ha sabido que, en general, una sal de alquiltrimetilamonio de surfactante catiónico lleva a una sílice mesoporosa que tiene la mayor superficie específica y un volumen de poro. Véase, Publicación de Estados Unidos N° 2013/0052117 y Katiyar et al. (Journal of Chromatography 1122 (1-2): 13-20). Los términos "mesoescala", "mesoporo", "mesoporoso" y similares, como se usan en esta memoria descriptiva, pueden referirse a estructuras que tienen tamaños de características en el intervalo de 5 nm a 100 nm, en particular en el intervalo de 2 nm a 50 nm. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un material mesoporoso incluye poros, que pueden estar ordenados o distribuidos aleatoriamente, con un diámetro comprendido entre 5 nm y 100 nm.

[0070] La sílice mesoporosa usada en los andamiajes de la invención puede proporcionarse en varias formas, por ejemplo, microesferas, partículas irregulares, varillas rectangulares, nanovarillas redondas, etc., aunque se prefieren particularmente las formas de varilla estructurada (MSR). Las partículas pueden tener varias formas predeterminadas incluyendo, por ejemplo, una forma esferoide, una forma elipsoide, una forma de varilla o una forma cilíndrica curvada. En la técnica se conocen los métodos para ensamblar sílice mesoporosa para generar microvarillas. Véase, Wang et al., Journal of Nanoparticle Research, 15:1501, 2013. En una realización, las nanopartículas de sílice mesoporosa se sintetizan haciendo reaccionar ortosilicato de tetraetilo con una plantilla hecha de varillas micelares. El resultado es una colección de esferas o varillas de tamaño nanométrico que están llenas de una disposición regular de poros. A continuación, la plantilla puede eliminarse lavando con un solvente ajustado al pH adecuado. En este ejemplo, después de la eliminación de las plantillas de surfactante, se preparan nanopartículas de sílice hidrófilas caracterizadas por una mesoporosidad uniforme, ordenada y conectada con un área superficial específica de, por ejemplo, aproximadamente 600 m2/g a aproximadamente 1200 m2/g, en particular de aproximadamente 800 m2/g a aproximadamente 1000 m2/g y especialmente de aproximadamente 850 m2/g a aproximadamente 950 m2/g. En otra realización, la partícula mesoporosa podría sintetizarse usando un método sol-gel simple o un método de secado por pulverización. El ortosilicato de tetraetilo también se usa con un monómero polimérico adicional (como plantilla). En otra realización más, pueden condensarse conjuntamente uno o más tetraalcoxisilanos y uno o más (3-cianopropil)trialcoxisilanos para proporcionar las partículas mesoporosas de silicato como varillas. Véase, las Publicaciones de Estados Unidos N° 2013-0145488, 2012-0264599 y 2012-0256336.

[0071] Las varillas de sílice mesoporosa pueden comprender poros entre 2 y 50 nm de diámetro, por ejemplo, poros entre 2 y 5 nm, 10 y 20 nm, 10 y 30 nm, 10 y 40 nm, 20 y 30 nm, 30 y 50 nm, 30 y 40 nm, 40 y 50 nm. En realizaciones particulares, las microvarillas comprenden poros de aproximadamente 5 nm, 6 nm, 7 nm, 8 nm, 9 nm, 10 nm, 11 nm, 12 nm, o más de diámetro. El tamaño de los poros puede modificarse dependiendo del tipo de aplicación.

[0072] En otra realización, la longitud de las microvarillas está en el intervalo de micrómetros, variando de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 500 pm. En un ejemplo, las microvarillas comprenden una longitud de 5 50 pm, por ejemplo, 10-20 pm, 10-30 pm, 10-40 pm, 20-30 pm, 30-50 pm, 30-40 pm, 40-50 pm. En otra realización, las varillas comprenden una longitud de 50 pm a 250 pm, por ejemplo, aproximadamente 60 pm, 70 pm, 80 pm, 90 pm, 100 pm, 120 pm, 150 pm, 180 pm, 200 pm, 225 pm, o más. Para el reclutamiento de células, puede ser preferible emplear composiciones de MSR que tengan una mayor relación de aspecto, por ejemplo, con varillas que comprendan una longitud de 50 pm a 200 pm, en particular una longitud de 80 pm a 120 pm, especialmente una longitud de aproximadamente 100 pm o más.

[0073] En otra realización más, las MSR proporcionan un área de superficie alta para la adhesión y/o unión a células diana, por ejemplo, células T. En la técnica se conocen los métodos de obtención de silicatos mesoporosos de alta área superficial. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 8.883.308 y la Publicación de Estados Unidos N° 2011-0253643. En una realización, la alta área superficial se debe a la morfología fibrosa de las nanopartículas, que permite obtener una elevada concentración de elementos altamente dispersos y fácilmente accesibles en la superficie. En ciertas realizaciones, las MSR de alta área superficial tienen un área superficial de por lo menos aproximadamente 100 m2/g, por lo menos 150 m2/g, o por lo menos 300 m2/g. En otras realizaciones, las MSR de alta área superficial tienen un área superficial de aproximadamente 100 m2/g a aproximadamente 1000 m2/g, incluyendo todos los valores o subintervalos intermedios, por ejemplo, 50 m2/g, 100 m2/g, 200 m2/g, 300 m2/g, 400 m2/g, 600 m2/g, 800 m2/g, 100-500 m2/g, 100-300 m2/g, 500-800 m2/g o 500-1000 m2/g.

B. Lípidos

[0074] Los andamiajes de la invención pueden comprender una bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua, sobre la capa base de MSR. El término "lípido" generalmente denota un grupo heterogéneo de sustancias asociadas con sistemas vivos que tienen la propiedad común de ser insolubles en agua, pueden extraerse de las células mediante solventes orgánicos de baja polaridad como el cloroformo y el éter. En una realización, "lípido" se refiere a cualquier sustancia que comprenda cadenas de ácidos grasos largas, preferiblemente que contengan 10-30 unidades de carbono, particularmente que contengan 14-23 unidades de carbono, especialmente que contengan 16-18 unidades de carbono.

[0075] El lípido se proporciona en forma de bicapa. Una bicapa lipídica es una membrana polar delgada formada por dos capas de moléculas lipídicas. Preferiblemente, la bicapa lipídica es fluida, en donde las moléculas lipídicas individuales pueden difundirse rápidamente dentro de la monocapa. Las moléculas lipídicas de la membrana son preferiblemente anfipáticas.

[0076] En una realización, las capas lipídicas son bicapas continuas, por ejemplo, parecidas a las que se encuentran en las membranas biológicas naturales, como las membranas plasmáticas celulares. El lípido se proporciona en forma de bicapa soportada (SLB). Una SLB es una estructura planar que se asienta sobre un soporte sólido, por ejemplo, varillas de sílice mesoporosa (MSR). En tal disposición, la cara superior de la bicapa soportada está expuesta, mientras que la cara interior de la bicapa soportada está en contacto con el soporte. Los andamiajes de MSR-SLB son estables y permanecen intactos en gran medida incluso cuando se someten a altas velocidades de flujo o vibración y pueden soportar orificios, por ejemplo, orificios que están alineados con los poros de la capa base de sílice mesoporosa. Gracias a esta estabilidad, es posible realizar experimentos de semanas e incluso meses con bicapas soportadas. Las SLB también son susceptibles de modificación, derivatización y conjugación química con muchas fracciones químicas y/o biológicas.

[0077] En una realización, el SLB puede inmovilizarse en la capa base de MSR usando cualquier método conocido, incluyendo interacciones covalentes y no covalentes. Los tipos de interacciones no covalentes incluyen, por ejemplo, interacciones electrostáticas, interacciones de van der Waals, efectos n, interacciones hidrófobas, etc. En una realización, los lípidos se adsorben en la capa base de MSR. En otra realización, los SLB se unen o atan a la capa base de MSR mediante interacciones covalentes. En la técnica se conocen los métodos para unir lípidos a silicatos, por ejemplo, absorción superficial, inmovilización física, por ejemplo, usando un cambio de fase para atrapar la sustancia en el material del andamiaje. En una realización, las bicapas lipídicas se estratifican en capas sobre la capa base de MSR. Por ejemplo, una película lipídica (que contiene, por ejemplo, una solución de DPPC/colesterol/DSPE-PEG en una relación molar de 77,5:20:2,5 en cloroformo) puede extenderse sobre la sílice mesoporosa y el solvente se evapora usando un evaporador rotatorio. Véase Meng et al., ACS Nano, 9 (4), 3540-3557, 2015. En una realización, la bicapa lipídica puede prepararse, por ejemplo, por extrusión de películas lipídicas hidratadas a través de un filtro con tamaño de poro de, por ejemplo, aproximadamente 100 nm, usando protocolos estándar. A continuación, las películas de bicapa lipídica filtradas pueden fusionarse con los núcleos de partículas porosas, por ejemplo, mediante un mezclado con pipeta.

[0078] Alternativamente, puede usarse acoplamiento covalente mediante agentes alquilantes o acilantes para proporcionar una retención estable, estructurada y a largo plazo de la SLB en la capa de<m>S<r>. En tales realizaciones, las bicapas lipídicas pueden inmovilizarse de manera reversible o irreversible sobre las capas de MSR usando técnicas conocidas. Por ejemplo, la capa base de MSR puede ser hidrófila y puede tratarse adicionalmente para proporcionar una superficie más hidrófila, por ejemplo, con hidróxido de amonio y peróxido de hidrógeno. La bicapa lipídica puede fusionarse, por ejemplo, usando técnicas de acoplamiento conocidas, sobre la capa base porosa de MSR para formar los andamiajes de MSR-SLB. Los andamiajes pueden procesarse y derivatizarse adicionalmente con fracciones adicionales para permitir la unión y/o inmovilización de otros agentes secundarios en la estructura.

[0079] Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona andamiajes de MSR-SLB, en donde el componente de SLB es un fosfolípido. Ejemplos representativos de tales lípidos incluyen, entre otros, liposomas anfotéricos descritos en las Patentes de Estados Unidos N° 9,066,867 y 8,3676,28. Por ejemplo, la bicapa lipídica puede comprender un lípido seleccionado entre dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), distearoilfosfatidilcolina (DSPC), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE) y dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE) o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la bicapa lipídica comprende una composición lipídica que imita la composición lipídica de la membrana de una célula de mamífero (por ejemplo, la membrana plasmática de una célula humana). Se ha caracterizado la composición lipídica de muchas membranas celulares de mamíferos y puede ser determinada fácilmente por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Essaid et al. Biochim. Biophys. Acta 1858(11): 2725-36 (2016)). La composición de la bicapa lipídica puede alterarse para modificar la carga o fluidez de la bicapa lipídica. En algunas realizaciones, la bicapa lipídica comprende colesterol. En algunas realizaciones, la bicapa lipídica comprende un esfingolípido. En algunas realizaciones, la bicapa lipídica comprende un fosfolípido. En algunas realizaciones, el lípido es una fosfatidiletanolamina, una fosfatidilcolina, una fosfatidilserina, un fosfoinosípido, un fosfosfingolípido con colas saturadas o insaturadas que comprenden 6-20 carbonos, o una combinación de los mismos.

[0080] En otra realización, el lípido es un lípido DIYNE PC. Ejemplos representativos de tales lípidos incluyen, entre otros, 1-palmitoil-2-10,12-tricosadiinoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0-23:2 DIYNE PC) y 1,2-bis(10,12-tricosadiinoil)-SN-glicero-3-fosfocolina (23:2 Diyne PC).

[0081] En una realización, el andamiaje de MSR-SLB de la invención retiene una arquitectura continua y fluida durante por lo menos 1 día, por lo menos 2 días, por lo menos 3 días, por lo menos 4 días, por lo menos 5 días, por lo menos 6 días, por lo menos 7 días, por lo menos 8 días, por lo menos 9 días, por lo menos 10, por lo menos 11 días, por lo menos 12 días, por lo menos 13 días, por lo menos 14 días, por lo menos 15 días, por lo menos 16 días, por lo menos 17 días, por lo menos 18 días, por lo menos 19 días, por lo menos 20 días, por lo menos 21 días, por lo menos 25 días, por lo menos 30 días, por lo menos 35 días, por lo menos 40 días, por lo menos 50 días, o más.

[0082] La arquitectura del andamiaje de MSR-SLB puede estudiarse con cualquier técnica conocida, incluyendo las técnicas de visualización microscópica ilustradas en los Ejemplos siguientes.

C. Moléculas funcionales

[0083] De acuerdo con la presente invención, el andamiaje de MSR-SLB contiene una o más moléculas funcionales seleccionadas entre una molécula activadora de células T y una molécula coestimuladora de células T o una combinación de las mismas. El término "molécula funcional" incluye cualquier molécula que posea propiedades biológicamente deseables. En el contexto de la invención, ejemplos de tales moléculas funcionales incluyen proteínas, péptidos, antígenos, anticuerpos, ADN, ARN, carbohidratos, haptenos y otras moléculas pequeñas, por ejemplo, fármacos. En una realización, la molécula funcional es una molécula activadora de células T. En otra realización, la molécula funcional es una molécula coestimuladora de células T. Además, en una realización, la molécula funcional es un agente homeostático de células T. En ciertas realizaciones, los andamiajes de MSR-SLB comprenden una pluralidad de moléculas funcionales, por ejemplo, por lo menos una molécula activadora de células T, por lo menos una molécula coestimuladora de células T, y por lo menos un agente homeostático de células T.

Moléculas activadoras de células T

[0084] En una realización, la presente invención proporciona andamiajes de MSR-SLB que contienen una pluralidad de moléculas activadoras de células T. Estas moléculas activadoras pueden mediar la activación directa, indirecta o semidirecta de una población diana de células T. Véase, Benichou et al., Immunotherapy, 3(6): 757-770, 2011. Preferiblemente, las moléculas activadoras de células T median en la activación directa de las células T.

[0085] En una realización, la presente invención proporciona andamiajes de MSR-SLB que contienen moléculas que activan directamente las células T, por ejemplo, mediante la unión a receptores de la superficie celular en células T diana. En particular, la activación directa puede mediarse mediante el cúmulo de diferenciación 3 (CD3), que es un correceptor de células T que ayuda a activar las células T citotóxicas. En otra realización, las células T pueden activarse directamente sin la participación concomitante de CD3, por ejemplo, de manera independiente de CD3.

[0086] En una realización, las células T diana se activan de manera dependiente de CD3. En general, se piensa que la activación de células T requiere que un receptor de células T (TCR) reconozca su péptido afín en el contexto de una molécula del MHC. Además, la asociación de CD3 con el complejo TCR-péptido-MHC transmite la señal de activación a moléculas de señalización intracelulares para iniciar una cascada de señalización en la célula T. Véase, Ryan et al., Nature Reviews Immunology 10, 7, 2010. El complejo receptor de CD3 que se encuentra en las células T contiene una cadena CD3y, una cadena CD38 y dos cadenas c D3£, que se asocian con el TCR y la cadena Z (cadena zeta; CD247) para generar una señal de activación en las células T. El TCR, la cadena Z y las moléculas de CD3 constituyen en conjunto el complejo del receptor de células T (TCR). La unión de una molécula activadora, por ejemplo, un anticuerpo, a uno o más de los miembros del complejo TCR puede activar la célula T.

[0087] En una realización, la molécula activadora de células T es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Cuando la molécula activadora de células T actúa de manera dependiente de CD3, la molécula activadora de células T es preferiblemente un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En otras realizaciones, la molécula activadora de células T puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo anti-CD47 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo antirreceptor depurador de macrófagos (MSR1) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo antirreceptor de células T (TCR) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, etc. En otra realización, la molécula activadora de células T es una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) o un multímero del mismo que está opcionalmente cargado con un péptido del MHC. Además, la molécula activadora de células T es un conjugado que contiene MHC e inmunoglobulina (Ig) o un multímero de los mismos.

[0088] El término "anticuerpo", como se usa en la presente, se refiere de manera amplia a cualquier molécula de inmunoglobulina (Ig) compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), o cualquier fragmento funcional, mutante, variante o derivación de la misma, que conserve las características esenciales de unión al epítopo de una molécula de Ig. En la técnica se conocen tales formatos de anticuerpos mutantes, variantes o derivados. En la presente se analizan realizaciones no limitativas de los mismos. En una realización, el anticuerpo activador de células T usado en las composiciones y métodos de la divulgación es el anticuerpo anti-CD3 seleccionado del grupo que consiste en muromonab (OKT3), otelixizumab (TRX4), teplizumab (hOKT3Yl(Ala-Ala)), visilizumab, un anticuerpo que reconoce la cadena £ de 17-19 kD de CD3 dentro del complejo antígeno de CD3/receptor de antígeno de células T (TCR) (HIT3a), y un anticuerpo que reconoce una subunidad de 20 kDa del complejo TCR dentro de CD3e (UCHT1), o un fragmento de unión a antígeno de los mismos. Otros anticuerpos anti-CD3, incluyendo, fragmentos de unión a antígeno de los mismos se describen en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2014-0088295.

[0089] Las realizaciones de la invención incluyen anticuerpos de "longitud completa". En un anticuerpo de longitud completa, cada cadena pesada se compone de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de la cadena pesada se compone de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera se compone de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como LCV<r>o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera se compone de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse a su vez en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas de extremo terminal amino a extremo terminal carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG 1, IgG2, IgG 3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.

[0090] El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), como se usa en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, IL-13). Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede ser realizada por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Tales realizaciones de anticuerpos también pueden ser formatos biespecíficos, específicos duales o multiespecíficos; que se unen específicamente a dos o más antígenos diferentes. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')<2>, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546, Winter et al., publicación de PCT WO 90/05144 A1), que comprende un único dominio variable; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR aislada). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un conector sintético que permite elaborarlos como una única cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véanse, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos de cadena sencilla también están incluidos en el término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. También se incluyen otras formas de anticuerpos de cadena sencilla, como los diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes y biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena polipeptídica, pero usando un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, obligando de este modo a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993); Poljak et al., Structure 2:1121-1123 (1994)). En la técnica se conocen tales porciones de unión a anticuerpos (Kontermann y Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 págs. (ISBN 3 540-41354-5).

[0091] Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden sólo una porción de un anticuerpo intacto, en donde la porción retiene preferiblemente por lo menos una, y típicamente la mayoría o todas, las funciones asociadas normalmente con esa porción cuando está presente en un anticuerpo intacto. En una realización, un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de unión a antígeno del anticuerpo intacto y, por tanto, conserva la capacidad de unirse al antígeno. En otra realización, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo uno que comprende la región Fc, conserva por lo menos una de las funciones biológicas asociadas normalmente con la región Fc cuando está presente en un anticuerpo intacto, como la unión a FcRn, la modulación de la vida media del anticuerpo, la función ADCC y la unión al complemento. En una realización, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una vida mediain vivosustancialmente similar a la de un anticuerpo intacto. Por ejemplo, dicho fragmento de anticuerpo puede comprender un brazo de unión al antígeno enlazado a una secuencia Fc capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento.

[0092] El término "constructo de anticuerpo", como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que comprende una o más de las porciones de unión a antígeno de la divulgación enlazadas a un polipéptido conector o a un dominio constante de inmunoglobulina. Los polipéptidos conectores comprenden dos o más residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos y se usan para enlazar una o más porciones de unión a antígeno. Tales polipéptidos conectores son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993); Poljak et al., Structure 2:1121-1123 (1994)). Un dominio constante de inmunoglobulina se refiere a un dominio constante de cadena pesada o ligera. En la técnica se conocen las secuencias de aminoácidos de dominio constante de cadena pesada y cadena ligera de IgG humana y se divulgan en la Tabla 2 de la Patente de Estados Unidos N° 7.915.388.

[0093] Además, un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo puede formar parte de moléculas de inmunoadhesión más grandes, formadas por asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o más proteínas o péptidos. Ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región central de estreptavidina para hacer una molécula scFvtetramérica (Kipriyanov et al., Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101 (1995)) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y una etiqueta de polihistidina C-terminal para hacer moléculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov et al., Mol. Immunol. 31:1047-1058 (1994)). Las porciones de anticuerpo, como los fragmentos Fab y F(ab')<2>, pueden prepararse a partir de anticuerpos enteros usando técnicas convencionales, como la digestión con papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos enteros. Además, los anticuerpos, las porciones de anticuerpos y las moléculas de inmunoadhesión pueden obtenerse usando técnicas estándar de ADN recombinante, como se describe en la presente.

[0094] Un "anticuerpo aislado", como se usa en la presente, se pretende que se refiera a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a CD3 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de CD3). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a<c>D3 puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, como moléculas CD3 de otras especies. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o sustancias químicas.

[0095] El término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, se pretende que incluya anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la divulgación pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitioin vitroo por mutación somáticain vivo),por ejemplo en las CDR y en particular en la CDR3. Sin embargo, como se usa en la presente, no se pretende que el término "anticuerpo humano" incluya los anticuerpos en los que secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, como el ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.

[0096] El término "anticuerpo humano recombinante", como se usa en la presente, se pretende que incluya todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan mediante medios recombinantes, como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped (descrito con más detalle en la Patente de Estados Unidos N° 7.915.388), anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios, recombinantes (Hoogenboom et al., TIB Tech. 15:62-70 (1994); Azzazy et al., Clin. Biochem.

35:425-445 (2002); Gavilondo et al., BioTechniques 29:128-145 (2002); Hoogenboom et al., Immunology Today 21:371-378 (2000)), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor et al., Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 (1992); Kellermann et al., Current Opinion in Biotechnology 13:593-597 (2002); Little etal., Immunology Today 21:364-370 (2002)) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Sin embargo, en ciertas realizaciones, tales anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesisin vitro(o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humanas, a mutagénesis somáticain vivo)y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan de secuencias VH y VL de la línea germinal humana y están relacionadas con ellas, pueden no existir de manera natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo. Una realización proporciona anticuerpos completamente humanos capaces de unirse a CD3 humano que pueden generarse usando técnicas bien conocidas en la técnica como, entre otras, el uso de bibliotecas de fagos de Ig humana como las divulgadas en Jermutus et al., publicación de PCT N° WO 2005/007699 A2.

[0097] El término "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie y secuencias de región constante de otra especie, como anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera murinas enlazadas con regiones constantes humanas. En la técnica se conocen los métodos para producir anticuerpos quiméricos y se analizan en detalle en el Ejemplo 2.1. Véase, por ejemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; Patentes de Estados Unidos N° 5.807.715; 4.816.567; y 4.816.397. Además, los "anticuerpos quiméricos" pueden producirse mediante técnicas conocidas en la técnica. Véase, Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454.

[0098] Los términos "unión específica" o "se une específicamente", como se usan en la presente, en referencia a la interacción de un anticuerpo, una proteína o un péptido con una segunda especie química, significan que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante o epítopo antigénico) en la especie química; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura proteica específica en lugar de a proteínas en general. Si un anticuerpo es específico para el epítopo "A", la presencia de una molécula que contenga el epítopo A (o A libre, no marcado), en una reacción que contenga "A" marcado y el anticuerpo, reducirá la cantidad de A marcado unido al anticuerpo.

[0099] Los anticuerpos usados en los andamiajes de la presente invención pueden ser "monoespecíficos", "biespecíficos" o "multiespecíficos". Como se usa en la presente, se pretende que la expresión "anticuerpo" en la presente incluya tanto anticuerpos monoespecíficos (por ejemplo, anticuerpo anti-CD3) así como anticuerpos biespecíficos que comprenden un brazo que se une a un antígeno de interés (por ejemplo, un brazo de unión a CD3) y un segundo brazo que se une a un segundo antígeno diana. El antígeno diana al que se une el otro brazo del anticuerpo biespecífico de CD3 puede ser cualquier antígeno expresado en o en las cercanías de una célula, tejido, órgano, microorganismo o virus, contra el que se desea una respuesta inmunitaria dirigida. En ciertas realizaciones, el brazo de unión a CD3 se une a CD3 humano e induce la proliferación de células T humanas. En el significado del término también se incluyen los anticuerpos que se unen a diferentes regiones de la molécula de CD3, por ejemplo, un brazo que se une a una cadena £ de 17-19 kD de CD3 dentro del complejo antígeno de CD3/receptor de antígeno celular (TCR) (por ejemplo, derivado de HIT3a), y un brazo que se une a una subunidad de 20 kDa del complejo TCR dentro de CD3e (por ejemplo, derivado de UCHT1). Preferiblemente, el anticuerpo anti-CD3 es OKT3 o un fragmento de unión a CD3 del mismo.

[0100] En una realización, la molécula de anticuerpo usada en los andamiajes de la invención es un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos pueden emplearse en el contexto de la invención para poner una célula de interés, por ejemplo, una célula cancerosa o un patógeno, en estrecha proximidad con la célula efectora diana de la invención, por ejemplo, una célula T citotóxica, de tal manera que la función efectora de la célula efectora diana esté mediada específicamente sobre la célula de interés. Por tanto, en una realización, la invención proporciona andamiajes que contienen anticuerpos biespecíficos, en donde un brazo del anticuerpo se une a CD3 y el otro brazo se une a un antígeno diana que es un antígeno asociado a tumor. Ejemplos no limitativos de antígenos específicos asociados a tumores incluyen, por ejemplo, AFP, ALK, proteínas BAGE, p-catenina, brc-abl, BRCA1, BORIS, CA9, anhidrasa carbónica IX, caspasa-8, CCR5, CD19, CD20, CD30, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, ciclina-B1, CYP1 B1, EGFR, EGFRvlll, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EpCAM, EphA2, Fra-1, FOLR1, proteínas GAGE (por ejemplo, GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, glipican-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, H LA/MAG E-A3, hTERT, LMP2, proteínas MAGE (por ejemplo, MAGE-1, - 2, -3, -4, -6, y -12), MART-1, mesotelina, ML-IAP, Mud, Muc2, Muc3, Muc4, Muc5, Muc16 (CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ES01, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAME, PSMA(FOLHI), proteínas RAGE, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, Steap-1, Steap-2, survivina, TAG-72, TGF-p, TMPRSS2, Tn, T<r>P-1, TRP-2, tirosinasa y uroplakina-3.

[0101] En una realización específica, el antígeno del cáncer es un miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), por ejemplo, un receptor seleccionado del grupo que consiste en EGFR (ErbB-1), HER2/c-neu (ErbB-2), Her 3 (ErbB-3) y Her 4 (ErbB-4), o un mutante del mismo.

[0102] En otra realización, la invención se refiere a andamiajes que contienen una molécula activador de células T biespecífica (BiTE). La molécula BiTE es específicamente un anticuerpo que reconoce por lo menos uno de los antígenos tumorales mencionados anteriormente y por lo menos una molécula de superficie de células T, por ejemplo, CD3. Ejemplos representativos de tales moléculas activadoras de células T biespecíficas incluyen, pero no se limitan a, solitomab (CD3xEpCAM), blinatumomab (CD3xCD19), MAB MT-111 (CD3xCEA) y BAY-2010112 (CD3xPSMA).

[0103] Los anticuerpos biespecíficos también pueden usarse en el contexto de la invención para dirigirse a células efectoras como células T o células B para mediar el efecto sobre patógenos, por ejemplo, bacterias, virus, hongos, protistas y otros microbios, ya sea directa o indirectamente. En una realización, el patógeno es un virus. En otra realización, el patógeno es una bacteria. Los anticuerpos biespecíficos se han usado para tratar infecciones bacterianas, por ejemplo,Pseudomonas aeruginosaresistente a fármacos. Véase, DiGiandomenico et al., Sci Transl Med., 6(262), 2014; Kingwell et al., Nat Rev Drug Discov., 14(1):15, 2015. Se han desarrollado otros agentes biespecíficos para redirigir los linfocitos T citotóxicos para eliminar el VIH (Berg et al., Proc Natl Acad Sci., 88(11):4723-7, 1991), proteger contra la infección por el VHB (Park et al., Mol Immunol., 37(18):1123-30, 2000), y otros patógenos prototípicos (Taylor et al., J Immunol., 159(8):4035-44, 1997).

[0104] Por consiguiente, en una realización, la invención proporciona andamiajes que contienen anticuerpos biespecíficos, en donde un brazo del anticuerpo se une a CD3 y el otro brazo se une a un antígeno diana que es un antígeno asociado a una enfermedad infecciosa (por ejemplo, un antígeno bacteriano, protozoario, vírico o fúngico). Ejemplos no limitativos de antígenos asociados a enfermedades infecciosas incluyen, por ejemplo, un antígeno que se expresa en la superficie de una partícula vírica, o que se expresa preferentemente en una célula que está infectada con un virus, en donde el virus se selecciona del grupo que consiste en VIH, hepatitis (A, B o C), virus del herpes (por ejemplo, HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, virus de Epstein Barr), adenovirus, virus de la gripe, flavivirus, echovirus, rinovirus, virus coxsackie, coronavirus, virus sincitial respiratorio, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubéola, parvovirus, virus vaccinia, HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus del molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus JC y virus de la encefalitis arboviral. Alternativamente, el antígeno diana puede ser un antígeno que se exprese en la superficie de una bacteria, o que se exprese preferentemente en una célula que esté infectada con una bacteria, en donde la bacteria sea de un género seleccionado del grupo que consiste enChlamydia, Rickettsia, Mycobacteria, Staphylococci, Streptococci, Pneumonococci, Meningococci, Gonococci, Klebsiella, Proteus, Serratia, Pseudomonas, Legionella, Diphtheria, Salmonella, Bacilli, Clostridium,yLeptospira.En algunas realizaciones, la bacteria provoca cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste o la enfermedad de Lyme. En ciertas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno que se expresa en la superficie de un hongo, o se expresa preferentemente en una célula que está infectada con un hongo, en donde el hongo se selecciona del grupo que consiste enCandida(por ejemplo,C. albicans, C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis, etc.), Crytococcus neoformans, Aspergillus(por ejemplo,A. fumigatus, A. niger, etc.), Mucorales(por ejemplo,M. mucor, M. absidia, M. rhizopus, etc.), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitiseHistoplasma capsulatum.En ciertas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno que se expresa en la superficie de un parásito, o se expresa preferentemente en una célula que está infectada con un parásito, en donde el parásito se selecciona del grupo que consiste enEntamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp, Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, Nippostrongylus brasiliensis, Taenia crassicepsyBrugia malayi.Ejemplos no limitativos de antígenos específicos asociados a patógenos incluyen, por ejemplo, gp120 del VIH,<c>D4 del VIH, glucoproteína L de la hepatitis B, glucoproteína M de la hepatitis B, glucoproteína S de la hepatitis B, E1 de la hepatitis C, E2 de la hepatitis C, proteína específica de hepatocitos, gB del virus del herpes simple, gB del citomegalovirus y proteína de envoltura del HTLV.

[0105] En algunas realizaciones, el andamiaje de la invención puede usarse para el tratamiento y/o prevención de una reacción alérgica o respuesta alérgica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el andamiaje puede usarse para generar células T (por ejemplo, Tregs) que suprimen una respuesta o reacción alérgica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los andamiajes comprenden un anticuerpo anti-CD3 y TGF-p. En algunas realizaciones, los andamiajes comprenden un anticuerpo anti-CD3 e IL-10. En algunas realizaciones, los andamiajes comprenden un anticuerpo anti-CD3 y rapamicina. En algunas realizaciones, los andamiajes comprenden un anticuerpo anti-CD3, TGF-p, IL-10 y rapamicina. En algunas realizaciones, los andamiajes comprenden un anticuerpo anti-CD3, TGF-p e IL-10. En algunas realizaciones, los andamiajes comprenden un anticuerpo anti-CD3 y TGF-p y rapamicina. En algunas realizaciones, los andamiajes comprenden un anticuerpo anti-CD3 e IL-10 y rapamicina.

[0106] En algunas realizaciones, el andamiaje de la invención puede usarse para expandir selectivamente las células T reactivas al alérgeno (por ejemplo, Tregs). En algunas realizaciones, el andamiaje comprende un péptido derivado de un alérgeno. En algunas realizaciones, el péptido derivado de un alérgeno se presenta en (por ejemplo, formando complejo con) una molécula de MHC (por ejemplo, una molécula de MHC de clase I o MHC de clase II). En algunas realizaciones, la molécula de MHC es un monómero. En algunas realizaciones, el alérgeno es un alérgeno alimentario (por ejemplo, un alérgeno de plátano, leche, legumbres, marisco, frutos secos, fruta con hueso, huevo, pescado, soja o trigo). En una realización, el alérgeno se selecciona del grupo que consiste en un alérgeno alimentario, un alérgeno vegetal, un alérgeno de insecto, un alérgeno animal, un alérgeno fúngico, un alérgeno vírico, un alérgeno de látex y un alérgeno de espora de moho. En una realización, el polipéptido alergénico es un alergeno de insecto. En una realización, el alérgeno de insecto es un alérgeno de ácaro del polvo (por ejemplo, un alérgeno deDermatophagoides fariñaoDermatophagoides pteronyssinus).En una realización, el polipéptido alergénico es un polipéptido de ovoalbúmina. En una realización, el polipéptido alergénico es un polipéptido alergénico alimentario. En algunas realizaciones, el andamiaje comprende un péptido derivado de un alérgeno y una citoquina Th1 (por ejemplo, IL-12 o IFNy). En una realización, el polipéptido alergénico es un polipéptido alergénico alimentario. En algunas realizaciones, el andamiaje comprende un péptido derivado de un alérgeno presentado en una molécula del MHC y una citoquina de desviación de Th1 (por ejemplo, IL-12 o IFN<y>). De acuerdo con ciertas realizaciones ejemplares, la presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen específicamente a<c>D3 y CD28. Tales moléculas pueden denominarse en la presente, por ejemplo, moléculas biespecíficas "anti-CD3/anti-CD28", o "anti-CD3xCD28" 0 "CD3xCD28", u otra terminología similar.

[0107] El término "CD28", como se usa en la presente, se refiere a la proteína CD28 humana, a menos que se especifique que procede de una especie no humana (por ejemplo, "CD28 de ratón", "CD28 de mono", etc.). La proteína c D28 humana tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en los Números de registro del GENBANK NP_001230006.1, NP_001230007.1 o NP_006130.1. La proteína CD28 de ratón tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el Número de registro del GENBANK NP_031668.3. Las varias secuencias polipeptídicas abarcadas por los números de registro mencionados incluyen las secuencias genéticas y de ARNm correspondientes. Como se usa en la presente, la expresión "molécula de unión a antígeno" significa una proteína, polipéptido o complejo molecular que comprende o consiste en por lo menos una región determinante de la complementariedad (CDR) que sola, o en combinación con una o más CDR y/o regiones marco (FR) adicionales, se une específicamente a un antígeno particular. En ciertas realizaciones, una molécula de unión a antígeno es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, tal como se definen estos términos en otras partes de la presente.

[0108] Como se usa en la presente, la expresión "molécula de unión a antígeno biespecífica" significa una proteína, polipéptido o complejo molecular que comprende por lo menos un primer dominio de unión a antígeno y un segundo dominio de unión a antígeno. Cada dominio de unión a antígeno dentro de la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende por lo menos una CDR que sola, o en combinación con una o más CDR y/o FR adicionales, se une específicamente a un antígeno particular. En el contexto de la presente invención, el primer dominio de unión a antígeno se une específicamente a un primer antígeno (por ejemplo, CD3), y el segundo dominio de unión a antígeno se une específicamente a un segundo antígeno distinto (por ejemplo, CD28).

[0109] El primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno de los anticuerpos biespecíficos pueden estar conectados directa o indirectamente entre sí. Alternativamente, el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno pueden estar conectados cada uno a un dominio de multimerización separado. La asociación de un dominio de multimerización con otro dominio de multimerización facilita la asociación entre los dos dominios de unión a antígeno, formando de este modo una molécula de unión a antígeno biespecífica. Como se usa en la presente, un "dominio de multimerización" es cualquier macromolécula, proteína, polipéptido, péptido o aminoácido que tenga la capacidad de asociarse con un segundo dominio de multimerización de la misma estructura o constitución o unas similares. Por ejemplo, un dominio de multimerización puede ser un polipéptido que comprenda un dominio CH3 de inmunoglobulina. Un ejemplo no limitativo de componente de multimerización es una porción Fc de una inmunoglobulina (que comprende un dominio CH2-CH3), por ejemplo, un dominio Fc de una IgG seleccionada entre los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, así como cualquier alotipo dentro de cada grupo de isotipos.

[0110] Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención comprenderán típicamente dos dominios de multimerización, por ejemplo, dos dominios Fc que son cada uno individualmente parte de una cadena pesada de anticuerpo separada. El primer y el segundo dominios de multimerización pueden ser del mismo isotipo de IgG como, por ejemplo, lgG1/lgG1, lgG2/lgG2, IgG4/lgG4. Alternativamente, el primer y el segundo dominios de multimerización pueden ser de isotipos de IgG diferentes, como, por ejemplo, lgG1/lgG2, lgG1/lgG4, lgG2/lgG4, etc.

[0111] En ciertas realizaciones, el dominio multimerización es un fragmento Fc o una secuencia de aminoácidos de 1 a aproximadamente 200 aminoácidos de longitud que contiene por lo menos un residuo de cisteína. En otras realizaciones, el dominio de multimerización es un residuo de cisteína o un péptido corto que contiene cisteína. Otros dominios de multimerización incluyen péptidos o polipéptidos que comprenden o consisten en una cremallera de leucina, un motivo hélice-giro o un motivo de espiral enrollada.

[0112] Para elaborar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención puede usarse cualquier formato o tecnología de anticuerpo biespecífico. Por ejemplo, puede enlazarse funcionalmente (por ejemplo, mediante ligación química, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) un anticuerpo o fragmento del mismo que tenga una primera especificidad de unión a antígeno a una o más entidades moleculares, como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tenga una segunda especificidad de unión a antígeno para producir una molécula de unión a antígeno biespecífica. Los formatos biespecíficos ejemplares específicos que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen, sin limitación, por ejemplo, formatos biespecíficos basados en scFv o diacuerpos, fusiones IgG-scFv, dominio variable dual (DVD)-lg, Quadroma, ensamblaje de botón en ojal, cadena ligera común (por ejemplo, cadena ligera común con ensamblaje de botón en ojal, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)cuerpo, cremallera de leucina, Duocuerpo, lgG1/lgG2, Fab de acción dual (DAF)-lgG, y formatos biespecíficos de Mab2 (para una revisión de los formatos anteriores véase, por ejemplo, Klein et al., mAbs 4:6, 1-11, 2012 y referencias citadas en el mismo).

[0113] Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Los anticuerpos anti-CD3 de la presente invención pueden enlazarse o coexpresarse con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede enlazarse funcionalmente (por ejemplo, mediante ligación química, fusión genética, asociación no covalente o de otra moanera) a una o más entidades moleculares, como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión. Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo comprenderá típicamente por lo menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno separado o a un epítopo diferente del mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpos biespecíficos ejemplares divulgados en la presente, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención usando técnicas rutinarias disponibles en la técnica. las moléculas de unión a antígeno multiespecíficas de la invención se derivan de anticuerpos quiméricos, humanizados o totalmente humanos. En la técnica son bien conocidos los métodos para elaborar anticuerpos multiespecíficos. Por ejemplo, una o más de las cadenas pesadas y/o ligeras de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención pueden prepararse usando la tecnología VELOCIMMUNE™. Usando la tecnología VELOCIMMUNE™ (o cualquier otra tecnología de generación de anticuerpos humanos), inicialmente se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra un antígeno particular (por ejemplo, CD3 o CD28) que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Los anticuerpos se caracterizan y seleccionan en función de sus características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se sustituyen por una región constante humana deseada para generar cadenas pesadas y/o ligeras completamente humanas que puedan incorporarse en las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención.

[0114] En el contexto de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención, los dominios de multimerización, por ejemplo, los dominios Fc, pueden comprender uno o más cambios de aminoácidos (por ejemplo, inserciones, deleciones o sustituciones) en comparación con la versión de origen natural de tipo salvaje del dominio Fc. Por ejemplo, la invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden una o más modificaciones en el dominio Fc que dan como resultado un dominio Fc modificado que tiene una interacción de unión modificada (por ejemplo, aumentada o disminuida) entre Fc y FcRn. En una realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende una modificación en una región CH2 o CH3, en donde la modificación aumenta la afinidad del dominio Fc para FcRn en un entorno ácido (por ejemplo, en un endosoma en el que el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Ejemplos no limitativos se proporcionan en, por ejemplo, la Publicación de Estados Unidos N° 2014-0088295. La presente invención también incluye moléculas biespecíficas de unión a antígeno que comprenden un primer dominio de CH3 y un segundo dominio de CH3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominios de CH3 de Ig difieren entre sí en por lo menos un aminoácido, y en donde por lo menos una diferencia de aminoácidos reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carezca de la diferencia de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el dominio Fc puede ser quimérico, combinando secuencias Fc derivadas de más de un isotipo de inmunoglobulina.

[0115] En otra realización, la molécula activadora de células T es una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que se une a CD3. Ejemplos representativos incluyen, pero no se limitan a, MHC tipo I que se une a TCR y CD8 o MHC tipo II que se une a TCR y CD4. Las moléculas del m Hc pueden cargarse opcionalmente con antígenos, por ejemplo, péptidos biotinilados. En otras realizaciones, las moléculas del MHC pueden conjugarse con inmunoglobulinas, por ejemplo, la porción Fc de una cadena de inmunoglobulina G (IgG). En otra realización, puede emplearse una pluralidad de complejos MHC-péptido. En este último caso, pueden unirse múltiples copias de complejos MHC-péptido, de manera covalente o no covalente, a dominios de multimerización. Ejemplos conocidos de tales multímeros de MHC incluyen, pero no se limitan a, MHC-dímeros (contiene dos copias de MHC-péptido; se usa IgG como dominio de multimerización, y uno de los dominios de la proteína de MHC está enlazado covalentemente a IgG); MHC-tetrámeros (contiene cuatro copias del MHC-péptido, cada una de las cuales está biotinilada y los complejos del MHC se mantienen juntos en un complejo por la proteína tetrámero de estreptavidina, que proporciona un enlace no covalente entre un monómero de estreptavidina y la proteína de MHC); pentámeros del MHC (contiene cinco copias de complejos MHC-péptido multimerizados por un dominio de espiral enrollada de autoensamblaje). Dextrámeros del MHC (típicamente contienen más de diez complejos de MHC que están unidos a un polímero de dextrano) y estreptámeros del MHC (contienen entre 8 y 12 complejos MHC-péptído que están unidos a estreptactina). Los tetrámeros del MHC se describen en la Patente de Estados Unidos N° 5.635.363; los pentámeros del MHC se describen en la Patente de Estados Unidos 2004209295; los dextrámeros del MHC se describen en la solicitud de patente WO 02/072631. Los estreptámeros del MHC se describen en Knabel M et al., Nature Medicine 6. 631-637, 2002).

[0116] Las células T diana también pueden activarse de manera independiente de CD3, por ejemplo, a través de la unión y/o ligadura de uno o más receptores de superficie celular distintos de CD3. Ejemplos representativos de tales moléculas de superficie celular incluyen, por ejemplo, CD2, CD47, CD81, MSR1, etc.

[0117] En este contexto, CD2 se encuentra en prácticamente todas las células T (y también en las células asesinas naturales (NK)) y es importante en la función de los linfocitos T. CD2 se asocia con varias proteínas que incluyen CD3, CD5 y CD45. La interacción CD2-CD58 facilita el contacto célula-célula entre las células T y las APC, mejorando de este modo el reconocimiento del antígeno a través del complejo TCR /CD3. CD2 también desempeña una función de transducción de señales. El bloqueo de la coestimulación usando anticuerpos dirigidos contra CD2 puede ser una potente estrategia inmunosupresora en el trasplante de órganos. Así, en una realización, las células T se activan mediante el uso de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD2. Ejemplos representativos de anticuerpos anti-CD2 incluyen, por ejemplo, siplizumab (MEDI-507) y LO-CD2b (N° de registro de la ATCC PTA-802; depositado el 22 de junio de 1999).

[0118] CD47 (IAP) pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y se asocia con integrinas de membrana y también se une a los ligandostrombospondina-1 (TSP-1) y proteína reguladora de señales alfa (SIRPa). Véase Barclay et al., Curr. Opin. Immunol. 21 (1): 47-52, 2009; Br. J. Pharmacol., 167 (7): 1415-30, 2012. CD47 interactúa con la proteína reguladora de señales alfa (SIRPa), un receptor transmembrana inhibidor presente en las células mieloides. La interacción CD47/SIRPa lleva a una señalización bidireccional, que da como resultado diferentes respuestas de célula a célula, incluyendo la inhibición de la fagocitosis, la estimulación de la fusión célula-célula y la activación de células T. Véase, Reinhold et al., J Exp Med., 185(1): 1-12, 1997. De acuerdo con la presente invención, en una realización, las células T se activan mediante el uso de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD47. Ejemplos representativos de anticuerpos anti-CD47 incluyen, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal Hu5F9-G4, que se está investigando en varios ensayos clínicos contra la leucemia mieloide y los anticuerpos monoclonales MABL-1 y MABL-2 (N° de Depósito de FERM BP-6100 y BP-6101). Véase, por ejemplo, el documento WO1999/12973.

[0119] CD81 es un miembro de la superfamilia tetraspanina de proteínas. Se expresa en una amplia variedad de tejidos, incluyendo las células T y las células hematopoyéticas. Se sabe que CD81 desempeña una función inmunomoduladora. En particular, la reticulación de CD81 potencia la activación mediada por CD3 de los linfocitos T ap y y6 e induce la producción independiente del TCR de citoquinas por los linfocitos T y§in vitro.De acuerdo con la presente invención, en una realización, las células T se activan mediante el uso de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD81. Véase, Menno et al., J. Clin. Invest., 4:1265, 2010. Ejemplos representativos de anticuerpos anti-CD81 incluyen, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 5A6. Véase, por ejemplo, Maecker et al., BMC Immunol., 4:1, 2003.

[0120] El MSR1 (CD204) pertenece a la familia de receptores depuradores de macrófagos de clase A, que incluye tres tipos diferentes (1, 2, 3) generados por corte y empalme alternativo del gen MSR1. Estos receptores o isoformas son glicoproteínas de membrana integrales triméricas y se han implicado en muchos procesos fisiológicos y patológicos asociados a los macrófagos, incluyendo la aterosclerosis, la enfermedad de Alzheimer y la defensa del huésped. Véase, Matsumoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (23): 9133-7, 1990. Estudios recientes demuestran que el MSR1 dendrítico (DC) influye en la activación y proliferación de las células T CD8 y que el bloqueo del MSR1 mediado por anticuerpos aumenta la proliferación y expansión de las células Tin vitro.Lerret et al., PLoS One., 7(7):e41240, 2012. De acuerdo con la presente invención, en una realización, las células T se activan mediante el uso de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MSR1. Ejemplos representativos de anticuerpos anti-MSR1 incluyen, por ejemplo, anticuerpo de rata anti-CD204 humano (Thermo N° de catálogo MA5-16494) y el anticuerpo de cabra anti-CD204/MSR1 humano (Biorad N° de catálogo AHP563).

[0121] En otra realización, las células T se activan mediante ligadura/unión a una molécula de receptor de células T (TCR), que se expresa ubicuamente en las células T. El TCR es un heterodímero compuesto por dos cadenas de proteínas diferentes. En los humanos, en el 95% de las células T el TCR consiste en una cadena alfa (a) y beta (p), mientras que en el 5% de las células T el TCR consiste en cadenas gamma y delta (<y>/5). Cuando el TCR se liga con el péptido antigénico y el MHC (péptido/MHC), el linfocito T se activa a través de la transducción de señales. De acuerdo con la presente invención, en una realización, las células T se activan mediante el uso de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al TCR. Ejemplos representativos de anticuerpos anti-TCR incluyen, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal de ratón anti-TCR humano IMMU510 (Immunotech, Beckman Coulter, Fullerton, CA) (descrito en Zhou et al., Cell Mol Immunol., 9(1): 34-44, 2012) y el anticuerpo monoclonal que define el TCR WT31 alfa/beta (descrito en Gupta et al., Cell Immunol., 132(1):26-44, 1991).

[0122] En otra realización, la molécula activadora de células T es una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que está opcionalmente cargada con un péptido del MHC. Hay dos clases generales de moléculas del MHC. Las moléculas del MHC de clase I (pMHC) se encuentran en casi todas las células y presentan péptidos para los linfocitos T citotóxicos (CTL). Las moléculas del MHC de clase II se encuentran principalmente en las células inmunitarias presentadoras de antígenos (APC), que ingieren antígenos polipeptídicos (en, por ejemplo, microbios) y los digieren en fragmentos peptídicos. A continuación, las moléculas del MHC-II presentan los fragmentos peptídicos a las células T auxiliares, que, después de su activación, proporcionan la actividad auxiliar generalmente necesaria para las respuestas de otras células del sistema inmunitario (por ejemplo, CTL o células B productoras de anticuerpos). La interacción entre el péptido unido en la hendidura de unión de la cadena pesada del MHC de clase I (pMHC) y las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del receptor de células T (TCR) determina el potencial de activación de las células T durante las etapas aferente y eferente de la inmunidad celular. La afinidad que existe entre el TCR y el complejo MHC-péptido regula el destino de las células T durante el desarrollo, la activación inicial y durante la ejecución de las funciones efectoras.

[0123] Por consiguiente, en una realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen una molécula del MHC humana opcionalmente cargada con un péptido. Ejemplos representativos de tales moléculas del MHC incluyen HLA-A, HLA-B, HLA-C, DP, DQ y DR, o una combinación de las mismas. Las moléculas del MHC pueden ser monovalentes o bivalentes. En algunas realizaciones, la bivalencia o multivalencia de las moléculas del MHC es deseable para la administración de señales (señales de activación o inhibición) a la célula T. Por lo tanto, en algunas realizaciones, los andamiajes de MSR-SLB de la presente invención incluyen por lo menos dos moléculas del MHC idénticas unidas a un conector.

[0124] El conector de la molécula del MHC bivalente cumple tres funciones. En primer lugar, el conector contribuye a la bivalencia o multivalencia requerida. En segundo lugar, el conector aumenta la vida media de toda la proteína de fusiónin vivo.En tercer lugar, el conector determina si la proteína de fusión activará o suprimirá las células T. El cebado de las células T requiere la estimulación a través del TCR y una segunda señal adicional, generalmente emitida por la APC. En ausencia de una segunda señal, las células T pueden ser hipersensibles. Mediante la construcción de una proteína de fusión en la que el conector permite la transmisión de una segunda señal, la estimulación de las células T da como resultado una inmunidad de células T mejorada. Mediante la construcción de una proteína de fusión en la que el conector no permite la transmisión de una segunda señal, la supresión de células T da como resultado la inmunosupresión. Una proteína de fusión con propiedades estimuladoras de células T puede construirse usando un conector que permita la transmisión de una segunda señal a la célula T además de la señal transmitida a través del TCR. Esto puede lograrse usando un conector que tenga afinidad de unión por una estructura de la superficie celular de otra célula, que sea capaz de transmitir una segunda señal a la célula T. Por tanto, el conector sirve de puente entre la célula T y la otra célula. Al acercar la otra célula a la célula T, la otra célula puede transmitir una segunda señal a la célula T.

[0125] Los ejemplos incluyen conectores que pueden unirse a receptores Fc en otras células como ciertas cadenas de inmunoglobulina o porciones de cadenas de inmunoglobulina. Los ejemplos específicos incluyen IgG, IgA, IgD, IgE e IgM. Cuando se usa una inmunoglobulina, no se requiere toda la proteína. Por ejemplo, el gen de la inmunoglobulina puede escindirse en la región bisagra y para formar la proteína de fusión sólo se usa el gen que codifica los dominios bisagra, CH2 y CH3 de la cadena pesada. El conector puede unirse a otras estructuras de la superficie celular. Por ejemplo, el conector puede incluir una fracción afín para muchos antígenos de la superficie celular que puede servir de puente para acercar la segunda célula a la célula T. El conector también puede transmitir una segunda señal de manera independiente. Por ejemplo, un conector con afinidad de unión por el antígeno de células T CD28 puede transmitir una segunda señal. Además, el conector puede aumentar la vida media de toda la proteína de fusiónin vivo.Una proteína de fusión con propiedades inhibidoras de células T puede construirse usando un conector que no dé como resultado la transmisión de una segunda señal. Los ejemplos incluyen cadenas de Ig que no se unen al receptor Fc, fragmentos de Ig F(ab')2, un motivo de dedo de zinc, una cremallera de leucina y materiales no biológicos. Los ejemplos de materiales no biológicos incluyen microperlas de plástico, o incluso un miembro de plástico más grande como una varilla o tubo de plástico, así como otros portadores fisiológicamente aceptables que pueden implantarsein vivo.

[0126] En algunas realizaciones, las moléculas del MHC no están unidas a un conector. Sin querer estar limitados por ninguna teoría particular, se cree que la naturaleza fluida de la bicapa lipídica permite a las células T reorganizar la membrana y formar agrupaciones multivalentes. Estas agrupaciones pueden desmontarse posteriormente, lo que no sería posible si las moléculas de señalización estuvieran unidas entre sí mediante un conector. La incapacidad para deshacer estas agrupaciones multivalentes puede llevar potencialmente a la sobreestimulación y al agotamiento o anergia de las células T (véase, por ejemplo, Lee K-H et al. Science 302(5648): 1218-22 (2003)).

[0127] En algunas realizaciones, la bicapa lipídica del APC-MS comprende una composición lipídica que favorece la partición espontánea de especies lipídicas en dominios ordenados en líquido (véase, por ejemplo, Wang T-Y et al. Biochemistry 40(43):13031-40 (2001)).

[0128] Opcionalmente, las moléculas del MHC pueden cargarse con un péptido específico (por ejemplo, un péptido derivado de un antígeno viral, un antígeno bacteriano o un alérgeno). El péptido específico de la proteína de fusión puede cargarse en las moléculas del MHC después de que se haya elaborado la proteína de fusión. El péptido también puede unirse posteriormente de manera covalente al m Hc , por ejemplo mediante reticulación por UV. Alternativamente, puede incorporarse una secuencia peptídica a la secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión, de tal manera que el péptido se cargue en las moléculas del MHC durante la generación de la proteína de fusión. En este último caso, el péptido puede unirse con un anclaje, como la polilisina, que le permite formar un complejo con la porción del MHC de la proteína de fusión. Los péptidos específicos que se cargan en las moléculas del MHC son prácticamente ilimitados y se determinan sobre la base de la aplicación deseada. Por ejemplo, para potenciar la inmunidad de las células T, pueden usarse péptidos de varias fuentes, por ejemplo infecciones víricas, fúngicas y bacterianas, o para tumores. Para suprimir la inmunidad de las células T en la autoinmunidad, pueden usarse péptidos autoreactivos. Para suprimir la inmunidad de las células T frente a tejidos trasplantados, pueden usarse péptidos propios presentados por aloantígenos.

[0129] Las toxinas, como la ricina y la toxina diftérica, y los radioisótopos, pueden formar complejos con la proteína de fusión (por ejemplo, usando 5-metil-2-inotiolano) para matar los clones de células T específicos. Estas toxinas pueden acoplarse químicamente al conector o a la porción del MHC de la proteína de fusión, o pueden incorporarse en la secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión de tal manera que la toxina forme el complejo con la proteína de fusión durante la generación de la proteína de fusión.

[0130] La proteína de fusión MHC-péptido/inmunoglobulina puede prepararse construyendo un gen que codifique para la producción de la proteína de fusión. Alternativamente, los componentes de la proteína de fusión pueden ensamblarse usando métodos químicos de conjugación. Las fuentes de los genes que codifican las moléculas del MHC y los conectores pueden obtenerse de varias bases de datos. En el caso de las proteínas de fusión del MHC de clase I, el fragmento del MHC puede unirse al conector y puede permitirse que la p2 microglobulina se autoasocie. Alternativamente, el gen de la proteína de fusión puede construirse de tal manera que la p2 microglobulina se una al fragmento del MHC por un éter. En el caso de la proteína de fusión del MHC de clase II, la cadena alfa o la beta pueden unirse al conector y puede permitirse que la otra cadena se autoasocie. Alternativamente, el gen de la proteína de fusión puede construirse de tal manera que las cadenas alfa y beta estén conectadas por un éter. Los péptidos pueden prepararse codificándolos en el constructo del gen de la proteína de fusión o, alternativamente, con sintetizadores de péptidos usando metodologías estándar disponibles para un experto en la materia. Las proteínas de fusión completas resultantes pueden administrarse usando técnicas rutinarias.

Moléculas coestimuladoras de células T

[0131] En una realización, la presente invención proporciona andamiajes de MSR-SLB que contienen una pluralidad de moléculas coestimuladoras de células T. Estas moléculas coestimuladoras pueden mediar la estimulación directa, indirecta o semidirecta de la población diana de células T. Preferiblemente, las moléculas coestimuladoras median la activación de células T en presencia de una o más moléculas activadoras de células T.

[0132] En la presente, el término "molécula coestimuladora" se usa de acuerdo con su significado reconocido en la activación de células T inmunitarias. Específicamente, una "molécula coestimuladora" se refiere a un grupo de receptores/ligandos de superficie de células inmunitarias que se ligan entre las células T y las células presentadoras de antígeno y generan una señal estimuladora en las células T que se combina con la señal estimuladora (es decir, "coestimulación") en las células T que resulta del reconocimiento por el receptor de células T ("TCR") del antígeno en las células presentadoras de antígeno. Como se usa en la presente, una forma soluble de una molécula coestimuladora "derivada de una APC" se refiere a una molécula coestimuladora expresada normalmente por células B, macrófagos, monocitos, células dendríticas y otras APC. Véase, Huppa et al., Nature Reviews Immunology. 3, 973-983 (2003). Un "coestimulador de la activación de células T" se refiere a la capacidad de un ligando coestimulador para unirse y activar células T que han sido activadas mediante cualquiera de los mecanismos o vías mencionados anteriormente, por ejemplo, mediante la activación de células T dependiente de CD3 o independiente de CD3. La activación coestimuladora puede medirse para las células T mediante la producción de citoquinas como es bien sabido y mediante ensayos de proliferación que son bien conocidos (por ejemplo, tinción CFSE) y/o como se describe en los ejemplos a continuación.

[0133] En una realización, la presente invención proporciona andamiajes de MSR-SLB que contienen moléculas que se unen específicamente a un antígeno coestimulador. En particular, los andamiajes de MSR-SLB contienen una pluralidad de moléculas coestimuladoras de células T que se unen específicamente a CD28, 4.1BB (CD137), OX40 (CD134), CD27 (TNFRSF7), GITR (CD357), CD30 (TNFRSF8), HVEM (CD270), LTpR (TNFRSF3), DR3 (TNFRSF25), ICOS (CD278), CD226 (DNAM1), CRTAM (CD355),TIM1 (HAVCR1, KIM1), CD2 (LFA2, OX34), SLAM (CD150, SLAMF1), 2B4 (CD244, SLAMF4), Ly108 (NTBA, CD352, SLAMF6), CD84 (SLAMF5), Ly9 (CD229, SLAMF3), CD279 (PD-1) y/o CRACC (CD319, BLAME).

[0134] En una realización, la molécula coestimuladora es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a uno o más de los antígenos coestimuladores mencionados con anterioridad. En este contexto, CD28 es el antígeno coestimulador prototípico de células T y se une a moléculas de la familia B7 expresadas en APC como células dendríticas y células B activadas. El CD28 humano se encuentra en todas las células T CD4+ y en aproximadamente la mitad de las células T CD8+. Las actividades de las células T atribuidas a CD28 incluyen la prevención de la energía, la inducción de la transcripción de genes de citoquinas, la estabilización del ARNm de citoquinas y la activación de linfocitos T citotóxicos CD8+. Los ligandos de CD28 identificados como CD80(B7-1) y CD86(B7-2) son glicoproteínas transmembrana monoméricas de la superfamilia de las inmunoglobulinas de 60 kd y 80 kd respectivamente.

[0135] En una realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD28. Ejemplos representativos de anticuerpos anti-CD28 incluyen, por ejemplo, lulizumab pegol y TGN1412. Véase también la Patente de Estados Unidos N° 8,785,604.

[0136] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a ICOS (CD278). ICOS es una molécula coestimuladora de la superfamilia CD28 que se expresa en células T activadas. Se cree que es importante para las células Th2 en particular. Ejemplos representativos de anticuerpos anti-ICOS incluyen, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 2C7, que reconoce la molécula ICOS expresada en células T activadas e induce la activación así como la proliferación de células T preestimuladas por anticuerpos monoclonales anti-CD3 humano. Véase Deng et al., Hybrid Hybridomics., 23(3):176-82, 2004.

[0137] En otra realización, la presente invención proporciona andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD152 (CTLA4). Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante o un anticuerpo bloqueante. CD152 se expresa en células T CD4+ y CD8+ activadas, y en células T reguladoras (Tregs). Sus funciones en la biología de las células T, durante las respuestas inmunitarias a las infecciones y como diana para la inmunoterapia del cáncer han sido bien descritas (Egen et al., Nat. Immunol., 3(7):611-618, 2002). CTLA-4 es una contrapartida homóloga de CD28, y ambos se unen a CD80 y CD86 en las APC. La importancia de CTLA-4 para la tolerancia inmunitaria es evidente (Waterhouse et al., Science, 270(5238):985-988, 1995). Estas incluyen la competencia con moléculas CD28 de menor afinidad para la unión del ligando con el fin de minimizar la coestimulación de las células T, el reclutamiento de fosfatasas inhibidoras para el complejo TCR para alterar las cascadas de señalización positiva y la eliminación de CD80 y CD86 de la superficie de las APC por transendocitosis, disminuyendo de este modo la capacidad de las APC para activar adecuadamente las células T que, por lo demás, responderían. Por consiguiente, la explotación de la vía/receptor de CTLA-4 es una estrategia atractiva para modular la inmunidad de las células T. De hecho, el anticuerpo anti-CTLA-4 fue el primer anticuerpo monoclonal (ipilimumab) en ser aprobado por la FDA para el tratamiento de bloqueo de puntos de control en pacientes con cáncer. Otros ejemplos de anticuerpos contra CTLA-4 que pueden emplearse de acuerdo con la presente invención incluyen tremelimumab y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

[0138] En otra realización, la presente invención proporciona andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la muerte programada-1 (PD-1; CD279). PD1 es un miembro de la misma familia de receptores que CD28 y CTLA-4, y se expresa ampliamente en células linfoides y mieloides. PD-1 se une de manera única a los ligandos de B7 PD-L1 y PD-L2 en APC y otros tejidos circundantes, lo que influye en gran medida en el destino de las células T CD8+ que responden en entornos de infecciones crónicas. En las células T, PD-1 se expresa después del encuentro con el antígeno, pero actúa casi inmediatamente para impedir la activación de las células T reclutando a las fosfatasas SHP-1 y SHP-2 a través de motivos de señalización en la cola citoplasmática de PD-1, lo que reduce la fosforilación de Akt y disminuye el metabolismo, la proliferación y la supervivencia de las células T. Por consiguiente, el anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo neutralizante o un anticuerpo bloqueante. Ejemplos representativos de tales anticuerpos anti-PD-1 incluyen, por ejemplo, nivolumab, lambrolizumab (MK-3475), pidilizumab(CT-011) y AMP-224.

[0139] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD81. La ligación de CD81 reduce el umbral de señalización requerido para desencadenar ADN proviral mediado por células T/CD3 en células T CD4+ (Tardif et al., J. Virol. 79 (7): 4316-28, 2005). Ejemplos representativos de anticuerpos anti-CD81 incluyen, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 5A6. Véase, por ejemplo, Maeckeret al., BMC Immunol., 4:1, 2003.

[0140] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD137. La reticulación de CD137 aumenta la proliferación de células T, la secreción de IL-2, la supervivencia y la actividad citolítica. Además, puede aumentar la actividad inmunitaria para eliminartumoresin vivo.Por consiguiente, los anticuerpos que se unen a CD137 son preferiblemente anticuerpos agonistas. Ejemplos representativos de anticuerpos anti-CD137 incluyen, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal utomilumab, que es una IgG humana que se está investigando actualmente en ensayos clínicos. Véase National Clinical Trials ID: NCT01307267.

[0141] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a OX40 (CD134). El OX40L se une a los receptores de OX40 de las células T, impidiendo que mueran y aumentando posteriormente la producción de citoquinas. El OX40 tiene una función fundamental en el mantenimiento de una respuesta inmunitaria más allá de los primeros días y en adelante para una respuesta de memoria, debido a su capacidad de aumentar la supervivencia. El OX40 también desempeña una función crucial en las reacciones mediadas tanto por Th1 como por Th2in vivo.Por consiguiente, los anticuerpos que se unen a OX40 son preferiblemente anticuerpos agonistas. Ejemplos representativos de anticuerpos anti-OX40 incluyen, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-OX40 utomilumab, que se está investigando en varios ensayos clínicos (véanse los ID de ensayos clínicos nacionales: NCT01644968, NCT01303705 y NCT01862900).

[0142] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD27 (TNFRSF7). CD27 es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF y es necesario para la generación y el mantenimiento a largo plazo de la inmunidad de células T. Se une al ligando de CD70 y desempeña una función clave en la regulación de la síntesis de inmunoglobulinas. CD27 apoya la expansión específica del antígeno (pero no la maduración de células efectoras) de células T vírgenes, independientemente de las actividades promotoras del ciclo celular de CD28 e IL2 (Hendriks et al., Nature Immunology 1, 433-440, 2000)). Como tales, los andamiajes de MSR-SLB de la invención incluyen preferiblemente anticuerpos agonistas que se unen a CD27. Ejemplos representativos de anticuerpos anti-CD27 incluyen, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal varlilumab. Véase Ramakrishna et al., Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 3:37, 2015.

[0143] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al gen regulado por la familia de receptores de TNF inducidos por glucocorticoides (GITR o CD357). El GITR es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF de 25 kD que se expresa en linfocitos activados. El GITR se regula por incremento por ligación al receptor de células T. El dominio citoplasmático de GITR es homólogo a CD40, 4-1BB y CD27. Se ha demostrado que la señalización del GITR regula la proliferación de células T y la apoptosis mediada por el TCR, y rompe la autotolerancia inmunológica. Además, el GITR se une al GITRL y está implicado en el desarrollo de células T reguladoras y en la regulación de la actividad de subconjuntos de Th1. Se ha demostrado que la modulación del GITR con anticuerpos agonistas amplifica las respuestas inmunitarias antitumorales en modelos animales a través de múltiples mecanismos. Los anticuerpos anti-GITR están diseñados para activar el receptor GITR, aumentando de este modo la proliferación y la función de las células T efectoras. Al mismo tiempo, la ligadura del GITR en la superficie de las Tregs podría anular la función supresora de estas células sobre las células T efectoras específicas del tumor, aumentando así aún más la respuesta inmunitaria de las células T. Ejemplos representativos de anticuerpos anti-GITR incluyen, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-GITR humano, humanizado, con Fc inhabilitado TRX518, que induce tanto la activación de células efectoras T específicas de antígeno tumoral, como la anulación de la supresión inducida por células reguladoras T activadas inapropiadamente. El TRX518 se está investigando en varios ensayos clínicos (véase el ID nacional de ensayos clínicos: NCT01239134).

[0144] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD30 (TNFRSF8). El antígeno CD30 es una glicoproteína transmembrana perteneciente a la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral que, cuando se estimula, ejerce efectos pleiotrópicos sobre el crecimiento y la supervivencia celular. En los tejidos normales o inflamados, la expresión de CD30 se limita a los linfocitos B y/o T activados medianos/grandes. Se expresa en células T y B activadas, pero no en reposo (Guo et al., Infect. Immun., 81 (10), 3923-3934, 2013). La estimulación de la señalización de CD30L/CD30 mediante la administracióninvivo de anticuerpo monoclonale (MAb) agonista anti-CD30 restauró la producción de IL-17A por células T Vy1- Vy4- y§ en ratones con desactivación de CD30L. Ejemplos representativos de anticuerpos anti-CD30 incluyen, por ejemplo, brentuximab vedotin (Adcetris).

[0145] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HVEM (CD270). CD270 es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF. Este receptor fue identificado como mediador celular de la entrada del virus del herpes simple (VHS). Las mutaciones en este gen se han asociado de manera recurrente a casos de linfoma difuso de células B grandes. Ejemplos representativos de anticuerpos anti-CD270 incluyen, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal HVEM-122. Véase, Cheung et al., J. Immunol., 185:1949, 2010; Hobo et al., J Immunol., 189:39, 2012.

[0146] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al receptor de linfotoxina beta (LTpR; TNFRSF3). LTpR está implicado en el cebado de células T CD4+ (Summers deLuca et al., J Exp Med., 204(5):1071-81, 2007). Ejemplos representativos de anticuerpos anti-LTpR incluyen, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anticuerpo b Bf6. Véase también el documento WO2010/078526.

[0147] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a DR3 (TNFRSF25). Se piensa que DR3 está implicado en el control de la proliferación de linfocitos inducida por la activación de células T. Específicamente, la activación de DR3 depende de la ligación anterior del receptor de células T. Después de la unión a TL1A, la señalización de DR3 aumenta la sensibilidad de las células T a IL-2 endógena a través del receptor de IL-2 y aumenta la proliferación de células T. Como la activación del receptor depende del receptor de células T, la actividad del DR3in vivoes específica de las células T que se encuentran con el antígeno afín. En reposo, y en individuos sin autoinmunidad subyacente, la mayoría de las células T que se encuentran regularmente con el antígeno afín son células T reguladoras FoxP3+. La estimulación de TNFRSF25, en ausencia de otras señales exógenas, estimula la proliferación profunda y altamente específica de células T reguladoras FoxP3+ desde el 8-10% de todas las células T CD4+ hasta el 35-40% de todas las células T CD4+ en 5 días. Ejemplos representativos de agonistas de DR3 incluyen, por ejemplo, anticuerpos que se unen específicamente al DR3 (Reddy et al., J. Virol., 86 (19) 10606-10620, 2012) y el agonista 4C12 (Wolf et al., Transplantation, 27;94(6):569-74, 2012).

[0148] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD226 (DNAM1). CD226 es una glicoproteína de ~65 kDa que se expresa en la superficie de células asesinas naturales, plaquetas, monocitos y un subconjunto de células T. Es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y media en la adhesión celular a otras células que portan sus ligandos, CD112y CD155. La reticulación de CD226 con anticuerpos provoca la activación celular y la ligadura de CD226 y LFA-1 con sus ligandos respectivos coopera en el desencadenamiento de la citotoxicidad y la secreción de citoquinas por las células T y NK (Tahara et al., Int. Immunol. 16 (4): 533-8, 2004).

[0149] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CRTAM (CD355). CTRAM es una molécula asociada a células T restringida al MHC de clase I, que regula la fase tardía de la polaridad celular en algunas células T CD4+. CTRAM también regula la producción de interferón-Y (IFNy) e interleucina-22 (IL-22). En una realización, los andamiajes de MSR-SLB comprenden un anticuerpo monoclonal anti-CTRAM. Ejemplos representativos de anticuerpos anti-CTRAM incluyen, por ejemplo, el anticuerpo anti-CTRAM humano de ratón 21A9 (GENTEXInc. USA, Irvine, CA).

[0150] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a TIM1 (HAVCR1, KIM1). Los genes TIM pertenecen a las glicoproteínas de superficie celular de tipo I, que incluyen un dominio similar a la inmunoglobulina (Ig) N-terminal, un dominio mucina de distinta longitud, un único dominio transmembrana y una cola citoplasmática corta C-terminal. La localización y las funciones de los genes TIM son divergentes entre cada miembro. TIM-1 se expresa preferiblemente en células Th2 y se ha identificado como molécula estimuladora de la activación de células T (Umetsu et al., Nat. Immunol. 6 (5): 447-54, 2005). En una realización, los andamiajes de MSR-SLB comprenden un anticuerpo monoclonal anti-TIM1. Ejemplos representativos de anticuerpos TIM1 incluyen, por ejemplo, el anticuerpo de conejo anti TIM1 humano ab47635 (ABCa M, Cambridge, MA).

[0151] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a SLAM (CD150, SLAMF1). SLAM (CD150) es un autoligando y receptor de superficie celular que funciona como molécula coestimuladora y también como sensor microbiano que controla la destrucción de bacterias Gram negativas por los macrófagos. En particular, SLAM regulaba la actividad del complejo NADPH oxidasa NOX2 y la maduración fagolisosomal después de entrar en el fagosoma, después de la interacción con las proteínas de la membrana exterior bacteriana (Berger et al., Nature Immunology 11, 920-927, 2010). Slamf1 se expresa en la superficie de células T activadas y de memoria, así como en células B activadas, células dendríticas, macrófagos y plaquetas (Calpe et al., Adv. Immunol. 2008;97:177). En una realización, los andamiajes de MSR-SLB comprenden un anticuerpo monoclonal anti-SLAM1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Ejemplos representativos de anticuerpos contra SLAM1 incluyen, por ejemplo, el anticuerpo de conejo anti SLAM1 humano 600-401-EN3 (Rockland Antibodies, Limerick, PA).

[0152] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a 2B4 (CD244, SLAMF4). CD244 es un receptor de la superficie celular expresado en células asesinas naturales (células NK) (y algunas células T) que media en la destrucción restringida no del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Se piensa que la interacción entre las células NK y las células diana a través de este receptor modula la actividad citolítica de las células NK. CD244 es un miembro coinhibidor de la familia SLAM que atenúa las respuestas primarias de células T CD8(+) específicas de antígeno en presencia de modulación inmune con bloqueo selectivo de CD28. Estudios recientes revelan una regulación por incremento específica de 2B4 en células T CD8(+) específicas de antígeno en animales en los que se bloqueó la señalización de CD28 (Liu et al., J Exp Med. 10 de febrero de 2014;211(2):297-311). En una realización, los andamiajes de MSR-SLB comprenden un anticuerpo monoclonal anti-CD244 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Ejemplos representativos de anticuerpos CD244 incluyen, por ejemplo, el anticuerpo anti-2B4 C1.7 o anti-2B4 conjugado con PE (C1.7), que se han caracterizado en Sandusky et al. (Eur J Immunol. 2006 Dic;36(12):3268-76).

[0153] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Ly108 (NTBA, CD352, SLAMF6). SLAMF6 es una proteína transmembrana de tipo I, perteneciente a la subfamilia CD2 de la superfamilia de las inmunoglobulinas, que se expresa en los linfocitos asesinos naturales (NK), T y B. La coestimulación de los linfocitos T a través de las vías SLAMF3/SLAMF6 produce efectos más potentes sobre la expresión de IL-17A en comparación con la vía canónica CD28. La señalización de SLAMF3/SLAMF6 media en el aumento de la abundancia nuclear y el reclutamiento de RORYt al promotor proximal de IL17A, lo que da como resultado un aumento de la trans-activación y la expresión génica (Chatterjee et al., J Biol Chem., 287(45): 38168-38177, 2012). En una realización, los andamiajes de MSR-SLB comprenden un anticuerpo monoclonal anti-CD244 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Ejemplos representativos de anticuerpos contra CD244 incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti NTB-A caracterizados en Flaig et al. (J. Immunol. 2004. 172: 6524-6527) y Stark et al. (J. Immunol. Methods 2005. 296: 149-158).

[0154] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno- del mismo que se une específicamente a CD84 (SLAMF5). CD84 es un miembro del subgrupo CD2 de la superfamilia de receptores de inmunoglobulinas. Los miembros de esta familia se han implicado en la activación de células T y células NK. CD84 aumenta las respuestas proliferativas de las células T activadas y las interacciones homofílicas aumentan la secreción de interferón gamma en los linfocitos. CD84 también puede servir como marcador de células progenitoras hematopoyéticas. Véase la divulgación en las referencias con los N° de ID de PUBMED 11564780, 12115647, 12928397, 12962726, 16037392, que indican que es necesaria para un contacto prolongado entre células T: células B, una función Th óptima y la formación de centros germinales. En una realización, los andamiajes de MSR-SLB comprenden un anticuerpo monoclonal anti-CD84 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Ejemplos representativos de anticuerpos CD84 incluyen, por ejemplo, el anticuerpo PE anti-CD84 humano CD84.1.21, que es capaz de aumentar la producción de IFN-y inducida por CD3 y bloquear parcialmente la unión de CD84-Ig a linfocitos (BioLegend, San Diego, CA; N° de catálogo 326008).

[0155] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Ly9 (CD229, SLAMF3). CD229 participa en reacciones de adhesión entre linfocitos T y células accesorias mediante interacción homofílica. También promueve la diferenciación de las células T hacia un fenotipo Th17 de células T auxiliares que lleva a un aumento de la secreción de IL-17; la actividad costimuladora requiere SH2D1A (Chatterjee et al., J Biol Chem., 287(45): 38168-38177, 2012). En particular, la ligadura concurrente de CD229 y TCR con proteína CD229-His inmovilizada y anticuerpo anti-CD3 mejoró significativamente la proliferación celular y la secreción de IFN-<y>en esplenocitos CD3+ murinos de manera dependiente de la dosis (Wang et al., The Journal of Immunology, 188 (sup. 1) 176.7, mayo de 2012). Por consiguiente, en una realización, los andamiajes de MSR-SLB comprenden un anticuerpo monoclonal anti-CD229 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Ejemplos representativos de anticuerpos contra CD229 incluyen, por ejemplo, el anticuerpo de PE anti-CD229 humano HLy-9.1.25 (BIOLEGEND, San Diego, CA; N° de catálogo 326108) o el anticuerpo de ratón anti-CD229 humano (N° de catálogo AF1898 de R&D Systems).

[0156] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD279 (PD-1). PD-1 funciona como un punto de control inmunitario y desempeña una función importante en la regulación del sistema inmunitario impidiendo la activación de las células T, lo que a su vez reduce la autoinmunidad y promueve la autotolerancia. El efecto inhibidor de PD-1 se logra a través de un mecanismo dual de promoción de la apoptosis (muerte celular programada) en las células T específicas de antígeno en los ganglios linfáticos, a la vez que reduce simultáneamente la apoptosis en las células T reguladoras (células T supresoras). Ejemplos representativos de anticuerpos contra CD229 incluyen, por ejemplo, nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab (CT-011, Cure Tech), BMS936559 y atezolizumab.

[0157] En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CRACC (CD319, BLAME). CD319 media la activación de células NK a través de una vía mediada por ERK regulada por la señal extracelular independiente de SH2D1A (Bouchon et al., J Immunol. 2001 Nov 15;167(10):5517-21). CD319 también regula positivamente las funciones de las células NK y puede contribuir a la activación de las células NK. Por consiguiente, en una realización, los andamiajes de MSR-SLB comprenden un anticuerpo monoclonal anti-CD319 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Ejemplos representativos de anticuerpos contra CD319 incluyen, por ejemplo, elotuzumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0158] En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona andamiajes de MSR-SLB que contienen un par de unión que contiene por lo menos una molécula activadora de células T y por lo menos una molécula coestimuladora de células T. Los ejemplos representativos de tales pares incluyen, entre otros, por ejemplo, anticuerpos que se unen a CD3/CD28, CD3/ICOS, CD3/CD27 y CD3/CD137 o una combinación de los mismos. En este contexto, dependiendo de la modulación deseada de la actividad de las moléculas coestimuladoras, puede ser deseable emplear un anticuerpo agonista para el primer componente (CD3) y un anticuerpo agonista o antagonista para el segundo componente.

[0159] En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona andamiajes de MSR-SLB que contienen un par de unión que contiene por lo menos una molécula activadora de células T que es un anticuerpo que se une a CD3 y por lo menos una molécula coestimuladora de células T que es un anticuerpo que se une a CD28, opcionalmente junto con una segunda molécula coestimuladora que es un anticuerpo que se une a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en ICOS, CD27 y CD137. En una realización, el andamiaje de MSR-SLB contiene una combinación de moléculas funcionales seleccionadas entre las siguientes combinaciones: (a) anticuerpos que se unen a CD3, CD28 e ICOS, (b) anticuerpos que se unen a CD3, CD28 y CD27, (c) anticuerpos que se unen a CD3, CD28 y CD137, (d) anticuerpos que se unen a CD3, CD28, ICOS y<c>D27. A este respecto, los datos experimentales sugieren que la estimulación de estos factores secundarios de coestimulación de células T puede estimular la diferenciación de ciertos tipos de células T cuando se aplica con estímulos de activación apropiados como CD3+CD28. Por ejemplo, la estimulación de ICOS favorece la diferenciación de células Th efectoras cuando coopera con la estimulación de CD3+CD28+, mientras que favorece la diferenciación de células T reguladoras cuando las señales coestimuladoras son insuficientes. Véase, Mesturini et al., Eur J Immunol., 36(10):2601-12, 2006. De manera similar, los anticuerpos anti-CD27 pueden usarse para afinar el sistema. En este contexto, el anticuerpo anti-CD27 1F5 (cuando se usó junto con anticuerpos anti-CD3) no desencadenó una activación policlonal de células T potencialmente peligrosa, un fenómeno observado con anticuerpos superagonísticos específicos de CD28 coestimuladores. Véase, Thomas et al., Oncoimmunology, 3: e27255, 2014.

[0160] En una realización, el par de unión incluye anticuerpos monoespecíficos, en donde un primer anticuerpo se une a un primer miembro del par, por ejemplo, CD3, y un segundo anticuerpo se une a un segundo miembro del par, por ejemplo, CD28. En otra realización, el par incluye anticuerpos biespecíficos, en donde un único anticuerpo se une a los miembros individuales del par, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que se une a CD3 y CD28. En este contexto, se prefieren los anticuerpos biespecíficos debido a su capacidad para conferir una activación aumentada de las células T. Véase, Willems et al., Cancer Immunol Immunother. Noviembre de 2005;54(11):1059-71.

[0161] Alternativamente, el par de unión incluye anticuerpos monoespecíficos, en donde un primer anticuerpo se une a CD3 y un segundo anticuerpo se une a ICOS. En el contexto de la unión del anticuerpo a ICOS, en la medida en que la molécula se haya implicado en la etiología de enfermedades de injerto contra huésped (véase, Sato et al., Transplantation, 96(1): 34-41, 2013), puede ser preferible emplear un anticuerpo antagonista que neutralice ICOS. También puede emplearse un anticuerpo biespecífico que contenga un fragmento de anticuerpo agonista de unión a CD3 y un fragmento de anticuerpo antagonista de unión a ICOS.

[0162] Alternativamente, el par de unión incluye anticuerpos monoespecíficos, en donde un primer anticuerpo se une a CD3 y un segundo anticuerpo se une a CD27. En esta realización, ambos anticuerpos son preferiblemente anticuerpos estimuladores o agonistas. Se ha notificado que la coestimulación de CD27 aumenta la supervivencia y la actividad antitumoral de células T humanas redirigidasin vivo(Song et al., Blood, 119(3):696-706, 2012). También puede emplearse un anticuerpo biespecífico que contenga un fragmento de anticuerpo agonista de unión a CD3 y un fragmento de anticuerpo agonista de unión a CD27.

[0163] Alternativamente, el par de unión incluye anticuerpos monoespecíficos, en donde un primer anticuerpo se une a CD3 y un segundo anticuerpo se une a CD137. En esta realización, ambos anticuerpos son preferiblemente anticuerpos estimuladores o agonistas. Se ha informado que la coestimulación con CD137 mejora la expansión y la función de los linfocitos CD8(+) infiltrantes de tumores de melanoma para la terapia adoptiva con células T (Chacon et al., PLoS One. 2013;8(4):e60031, 2013). También puede emplearse un anticuerpo biespecífico que contenga un fragmento de anticuerpo agonista de unión a CD3 y un fragmento de anticuerpo agonista de unión a CD27.

Agentes homeostáticos de células T

[0164] En una realización, los andamiajes de MSR-SLB y/o los andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno contienen un agente homeostático seleccionado del grupo que consiste en IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, y factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), o un agonista de los mismos, un mimético de los mismos, una variante de los mismos, un fragmento funcional de los mismos, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los andamiajes de MSR-SLB y/o los andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno contienen una pluralidad de agentes homeostáticos seleccionados del grupo que consiste en IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21 y factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), o un agonista de los mismos, un mimético de los mismos, una variante de los mismos, un fragmento funcional de los mismos o una combinación de los mismos. También pueden emplearse fragmentos funcionales de estos agentes homeostáticos, que se caracterizan por su capacidad para modular la actividad de las células diana. En la Tabla 1 se proporcionan tipos representativos de agentes homeostáticos, incluidos los números de registro del NCBI de homólogos humanos y/o de ratón de los mismos.

continuación

[0165] En la técnica se conocen los fragmentos y variantes de los agentes homeostáticos de células T mencionados anteriormente. Por ejemplo, la entrada de la base de datos UNIPROT de cada uno de los agentes homeostáticos mencionados anteriormente enumera "variantes naturales", incluyendo la relación estructural entre la variante y el biomarcador de tipo salvaje. Puramente como representación, la proteína IL-1p humana (UNIPROT: P01584) incluye una variante natural (VAR_073951) que tiene una sustitución de aminoácidos E ^N en el residuo de aminoácido 141 de la secuencia putativa de la proteína IL-1p humana. Los fragmentos, si se conocen, se enumeran de manera similar en esta sección.

[0166] Preferiblemente, el agente homeostático de células T es interleucina-2 (IL-2) o un agonista de la misma, un mimético de la misma, una variante de la misma, un fragmento funcional de la misma, o una combinación de la misma con uno o más agentes homeostáticos de células T enumerados en la Tabla 1. Ejemplos de agonistas de IL-2 incluyen, por ejemplo, BAY 50-4798 (Margolin et al., Clin Cancer Res. 1 de junio de 2007;13(11):3312-9). Los ejemplos de miméticos de IL-2 incluyen, por ejemplo, el péptido 1-30 (P1-30), que actúa en sinergia con IL-2 (Eckenberg et al., J Immunol 2000; 165:4312-4318). Los ejemplos de fragmentos de IL-2 incluyen, por ejemplo, una porción de lastre que contiene los primeros 100 aminoácidos de IL-2 (véase, la Patente de Estados Unidos N° 5.496.924). Los ejemplos de variantes de IL-2 incluyen, por ejemplo, la variante natural VAR_003967 y la variante natural VAR_003968. También se incluyen proteínas de fusión que contienen IL-2, por ejemplo, F16-IL2, que es un scFv contra el extradominio A1 de la tenascina-C que se fusiona, mediante un conector corto de 5 aminoácidos, a una forma recombinante de la IL-2 humana. La porción de anticuerpo monoclonal de la proteína de fusión F16-IL2 se une a las células tumorales que expresan el antígeno asociado al tumor (TAA) tenascina-C. A su vez, la fracción de IL-2 de la proteína de fusión estimula las células asesinas naturales (NK), los macrófagos y los neutrófilos e induce respuestas inmunitarias celulares antitumorales de células T. Otros miméticos de IL-2 que pueden emplearse de acuerdo con la invención incluyen, por ejemplo, un péptido de superquina de IL-2 (Levin et al., Nature 484, 529-533, 2012), y un péptido agonista parcial de IL-2 (Zurawski et al., EMBO Journal, 9(12): 3899-3905, 1990 y Patente de Estados Unidos N° 6.955.807), o una combinación de los mismos.

[0167] Las realizaciones de la presente invención incluyen además andamiajes de MSR-SLB, incluyendo andamiajes APC-MS hechos de tales andamiajes, que comprenden además una pluralidad de los agentes homeostáticos de células T mencionados con anterioridad. Así, en una realización, la invención proporciona andamiajes de MSR-SLB que contienen un primer agente homeostático de células T que es IL-2 y un segundo agente homeostático de células T que es IL-7, IL-21, IL-15, o superagonista de IL-15. En este contexto, el superagonista de IL-15 (IL-15 SA) es una combinación de IL-15 con receptor-a soluble de IL-15, que posee mayor actividad biológica que la IL-15 sola. La IL-15 SA se considera un agente antitumoral y antiviral atractivo debido a su capacidad para expandir selectivamente los linfocitos T NK y CD8+ de memoria (mCD8+ T). Véase, Guo et al., J Immunol. 1 de septiembre de 2015195(5):2353-64.

[0168] Las realizaciones de la presente invención se refieren además a un andamiaje que comprende una pluralidad de moléculas estimuladoras de células T, moléculas coestimuladoras de células T y agentes homeostáticos de células T. Un andamiaje típico puede comprender por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6, por lo menos 7, por lo menos 8, por lo menos 9, por lo menos 10, por lo menos 11, o más de cada una de las moléculas estimuladoras de células T, moléculas coestimuladoras de células T y agentes homeostáticos de células T mencionadas anteriormente.

[0169] En los andamiajes de la invención, cualquier molécula funcional, por ejemplo, antígenos, anticuerpos, proteínas, enzimas, incluyendo fragmentos de los mismos, puede inmovilizarse directa o indirectamente sobre la capa base de MSR y/o la SLB usando técnicas rutinarias. En ciertas realizaciones, las moléculas funcionales pueden proporcionarse en un orgánulo (por ejemplo, la membrana de golgi o la membrana plasmática), una célula, un grupo de células, un tejido, un microorganismo, un animal, una planta o un extracto del mismo, que a su vez se inmoviliza en la capa de MSR o la capa de SLB. También puede sintetizarse una molécula funcional mediante ingeniería genética o reacciones químicas en el sitio deseado, por ejemplo, la cara externa de la capa SLB.

[0170] Los andamiajes descritos en la presente comprenden y liberan moléculas de señalización, por ejemplo, agentes homeostáticos de células T, para provocar respuestas funcionales de células T. En una realización, los agentes homeostáticos de células T liberados son polipéptidos que se han aislado de fuentes endógenas o se han sintetizadoin vivooin vitro.Por ejemplo, los polipéptidos de IL-2 endógenos pueden aislarse de tejido humano sano. Alternativamente, las moléculas funcionales sintéticas pueden sintetizarse mediante transfección o transformación de ADN plantilla en un organismo o célula huésped, por ejemplo, una línea celular humana cultivada o un mamífero (por ejemplo, ratón o conejo humanizado). Alternativamente, las moléculas funcionales sintéticas en forma de proteína pueden sintetizarsein vitromediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros métodos reconocidos en la técnica (Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989)).

[0171] Las moléculas funcionales pueden modificarse para aumentar la estabilidad de la proteínain vivo.Alternativamente, las moléculas funcionales se diseñan para que sean más o menos inmunogénicas. Por ejemplo, en la medida en que se conozcan las estructuras de las varias moléculas funcionales, las secuencias pueden modificarse en uno o más residuos de aminoácidos, por ejemplo, sitios de glicosilación, para generar variantes inmunogénicas.

[0172] En una realización, las moléculas funcionales son recombinantes. Alternativamente, las moléculas funcionales son derivados humanizados de homólogos de mamíferos. Las especies de mamíferos ejemplares de las que se derivan las moléculas funcionales incluyen, pero no se limitan a, ratón, rata, hámster, cobaya, hurón, gato, perro, mono o primate. En una realización preferida, las moléculas funcionales son humanas o una versión humanizada de las moléculas funcionales mencionadas con anterioridad.

[0173] Cada una de las moléculas funcionales mencionadas anteriormente, por ejemplo, moléculas estimuladoras de células T, moléculas coestimuladoras de células T y agentes homeostáticos de células T, pueden, independientemente unas de otras, adsorberse o integrarse en la capa base de MSR o en la capa base de SLB. Por lo tanto, en una realización, se proporciona un APC-MS, en donde las moléculas estimuladoras de células T se adsorben o integran en la capa base de MSR. Preferiblemente, se proporciona un APC-MS, en donde las moléculas estimuladoras de células T se adsorben o integran en la capa de SLB. En otra realización, se proporciona un APC-MS, en el que las moléculas estimuladoras de células T se adsorben o integran tanto en la capa base de MSR como en la capa de SLB. En otra realización, se proporciona un APC-MS, en donde las moléculas coestimuladoras de células T se adsorben o integran en la capa base de MSR. Preferiblemente, se proporciona un APC-MS, en donde las moléculas coestimuladoras de células T se adsorben o integran en la capa de SLB. En otra realización más, se proporciona un APC-MS en donde las moléculas coestimuladoras de células T se adsorben o integran tanto en la capa base de MSR como en la capa de SLB. En otra realización, se proporciona un APC-MS, en donde los agentes homeostáticos de células T se adsorben o integran en la capa base de MSR. En otra realización, se proporciona un APC-MS, en donde los agentes homeostáticos de células T se adsorben o integran en la capa de SLB. En otra realización, se proporciona un APC-MS en donde los agentes homeostáticos de células T se adsorben o integran tanto en la capa base de MSR como en la capa de SLB.

[0174] En general, las moléculas funcionales y la capa base de MSR y/o la capa de SLB, pueden enlazarse entre sí mediante el uso de grupos reactivos, que son típicamente transformados por el proceso de enlace en un nuevo grupo funcional orgánico o especie no reactiva. El grupo o grupos funcionales reactivos pueden estar situados en cualquiera de los componentes mencionados con anterioridad. Los grupos reactivos y las clases de reacciones útiles en la puesta práctica de la presente invención son generalmente aquellos que son bien conocidos en la técnica de la química de bioconjugados. Las clases de reacciones actualmente favorecidas disponibles con quelatos reactivos son aquellas que se desarrollan en condiciones relativamente suaves. Estas incluyen, pero no se limitan a sustituciones nucleofílicas (por ejemplo, reacciones de aminas y alcoholes con haluros de acilo, ésteres activos), sustituciones electrofílicas (por ejemplo, reacciones de enamina) y adiciones a enlaces múltiples carbono-carbono y carbonoheteroátomo (por ejemplo, reacción de Michael, adición de Diels-Alder). Estas y otras reacciones útiles se analizan, por ejemplo, en March, Advanced Organic Chemistry, 3a Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; y Feeney et al., Modification of Proteins; vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982.

[0175] Los grupos funcionales colgantes reactivos útiles incluyen, por ejemplo:

(a) grupos carboxilo y varios derivados de los mismos incluyendo, entre otros, ésteres de N-hidroxisuccinimida, ésteres de N-hidroxibenztriazol, halogenuros de ácido (por ejemplo, I, Br, Cl), acilimidazoles, tioésteres, ésteres de p-nitrofenilo, ésteres de alquilo, alquenilo, alquinilo y aromáticos;

(b) grupos hidroxilo, que pueden convertirse, por ejemplo, en ésteres, éteres, aldehídos, etc.

(c) grupos haloalquilo, en los que el haluro puede desplazarse posteriormente con un grupo nucleófilo como, por ejemplo, una amina, un anión de carboxilato, un anión de tiol, un carbanión o un ion de alcóxido, dando como resultado de este modo la unión covalente de un nuevo grupo en el grupo funcional del átomo de halógeno; (d) grupos dienófilos, capaces de participar en reacciones de Diels-Alder como, por ejemplo, los grupos maleimido; (e) grupos aldehído o cetona, de tal manera que la derivatización posterior sea posible mediante la formación de derivados de carbonilo como, por ejemplo, iminas, hidrazonas, semicarbazonas u oximas, o mediante mecanismos como la adición de Grignard o la adición de alquilditio;

(f) grupos haluro de sulfonilo para su posterior reacción con aminas, por ejemplo, para formar sulfonamidas; (g) grupos tiol, que pueden, por ejemplo, convertirse en disulfuros o reaccionar con haluros de acilo;

(h) grupos amina o sulfhidrilo, que pueden estar, por ejemplo, acilados, alquilados u oxidados;

(i) alquenos, que pueden someterse, por ejemplo, a cicloadiciones, acilación, adición de Michael, etc;

(j) epóxidos, que pueden reaccionar, por ejemplo, con aminas y compuestos de hidroxilo; y

(k) fosforamiditas y otros grupos funcionales estándar útiles en la síntesis de ácidos nucleicos.

[0176] Los grupos funcionales reactivos pueden elegirse de tal manera que no participen ni interfieran en las reacciones necesarias para ensamblar los quelatos reactivos. Alternativamente, un grupo funcional reactivo puede protegerse de participaren la reacción mediante la presencia de un grupo protector. Los expertos en la materia saben cómo proteger un grupo funcional particular de tal manera que no interfiera con un conjunto de condiciones de reacción elegidas. Véase, por ejemplo, Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nueva York, 1991.

[0177] En una realización, las moléculas funcionales se cargan/adsorben en la capa base de MSR o en la SLB o tanto en la capa de MSR como en la SLB mediante emparejamiento por afinidad o ligación química.

[0178] El término "par de afinidad", como se usa en la presente, incluye secuencias de hibridación antígenoanticuerpo, receptor-hormona, receptor-ligando, agonista-antagonista, lectina-carbohidrato, ácido nucleico (ARN o ADN), receptor Fc o IgG-proteína A de ratón, avidina-biotina, estreptavidina-biotina, agente de unión biotina/biotina, Ni2+ o Cu2+/Etiqueta His (6* histidina) e interacciones virus-receptor. Para su uso en la puesta en práctica de los métodos de esta invención se contemplan varios otros pares de unión específicos.

[0179] Como se usa en la presente, "agente de unión a biotina" engloba avidina, estreptavidina y otros análogos de avidina como conjugados de estreptavidina o avidina, especies altamente purificadas y fraccionadas de avidina o estreptavidina, y variantes de aminoácidos parciales o no, análogos de avidina recombinantes o sintetizados químicamente con sustituciones de aminoácidos o químicas que siguen permitiendo la unión a biotina. Preferiblemente, cada molécula de agente de unión a biotina une por lo menos dos fracciones de biotina y, más preferiblemente, por lo menos cuatro fracciones de biotina. Como se usa en la presente, la "biotina" abarca la biotina además de la biocitina y otros análogos de la biotina como el éster de N-hidroxisuccinimida de caproato amido de biotina, el ácido 4-amidobenzoico de biotina, la hidrazida de caproilo de biotinamida y otros derivados y conjugados de la biotina. Otros derivados incluyen la biotina-dextrano, el éster de biotina-disulfuro-N-hidroxisuccinimida, la biotina-6 amidoquinolina, la hidrazida de biotina, el éster de d-biotina-N-hidroxisuccinimida, la maleimida de biotina, el éster de d-biotina p-nitrofenilo, los nucleótidos biotinilados y los aminoácidos biotinilados como la Ne-biotinil-1-lisina.

[0180] Los ligandos que pueden funcionalizarse mediante emparejamiento por afinidad incluyen, entre otros, receptores, anticuerpos monoclonales o policlonales, virus, agentes quimioterapéuticos, agonistas y antagonistas de receptores, fragmentos de anticuerpos, lectina, albúmina, péptidos, proteínas, hormonas, aminoazúcares, lípidos, ácidos grasos, ácidos nucleicos y células preparadas o aisladas de fuentes naturales o sintéticas. En resumen, para cualquier epítopo molecular o receptor que vaya a detectarse mediante la puesta en práctica de la invención puede utilizarse cualquier ligando específico. Preferiblemente, el ligando es una proteína anclada a la membrana. El ligando también puede ser un derivado de una proteína anclada a membrana, como un dominio extracelular soluble. Un ligando puede ser un receptor implicado en interacciones celulares receptor-receptor, como la unión del TCR al receptor del MHC.

[0181] Los ligandos de la presente invención pueden expresarse y purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica. En cierta realización, las proteínas se expresan mediante un sistema de expresión de insectos basado en baculovirus o un sistema de expresión de mamíferos. A los extremo s C-terminales de todas las moléculas pueden añadirse quince residuos del péptido AVITAG™. El residuo de lisina del péptido AVITAG™ (Avidity, CO) puede biotinilarse específicamente mediante la enzima BirA (Avidity, CO). Las proteínas también pueden diseñarse para que sean secretadas en el sobrenadante del cultivo celular.

[0182] Las moléculas funcionales, como se ha indicado anteriormente en la presente, pueden ser cualquier proteína o péptido. Preferiblemente, las proteínas están implicadas en interacciones ligando-receptor. Por ejemplo, un acontecimiento importante de la activación de células T es el resultado del contacto membrana-membrana entre células T y las APC, en donde se produce una variedad de interacciones ligando-receptor entre las dos membranas opuestas, incluyendo, MHC-péptido y TCR, LFA-1 e ICAM-1, CD2 y CD48, así como B7 o CTLA-4 y CD28. La comprensión de los requisitos de valencia de estas interacciones facilitará el diseño de agentes terapéuticos que potencien o inhiban la respuesta inmunitaria a ciertos antígenos. La presente invención también puede usarse como herramienta para estudiar las sutiles diferencias en las vías de señalización intracelular de células T inducidas por antígenos agonistas y antagonistas. Los andamiajes proporcionan un entorno fisiológico limpio para probar las sutiles diferencias sin usar células presentadoras de antígeno nativas que a menudo complican los análisis bioquímicos.

[0183] Aunque las interacciones estreptavidina-biotina se ejemplifican a lo largo de la memoria descriptiva y los ejemplos, en los métodos de la presente invención pueden emplearse miembros de pares de unión específicos como se ha descrito anteriormente en la presente en lugar de estreptavidina y biotina. Además, puede emplearse más de un conjunto de pares de unión específicos, en particular cuando hay más de un ligando unido a la superficie de la membrana. En este contexto, también puede usarse la tecnología tradicional de tetrámeros pep-MHC-estreptavidina para cribar células T de cierta especificidad pep-MHC. Sin embargo, las células T con la misma especificidad pueden activarse o no por la misma estimulación antigénica. Para estudiar las respuestas inmunitarias (por ejemplo, respuestas a la vacunación [vacunas víricas o contra el cáncer], tolerancia inmunitaria, autoinmunidad), es importante discriminar las células T sobre la base de su capacidad de respuesta al antígeno. Usando el flujo de calcio por microscopía como indicador de la activación de células T, la presente invención también proporciona un ensayo de cribado para cuantificar las células T primarias que responden a un antígeno específico. Alternativamente, las moléculas pep-MHC y coestimuladoras biotiniladas pueden acoplarse a chips recubiertos de estreptavidina, y los chips se emparejan con los andamiajes de la invención.

[0184] En otra realización, las moléculas funcionales se acoplan químicamente a la capa base de MSR y/o a la capa de SLB. En ciertas realizaciones, la ligación química incluye reactivos de química de clic, por ejemplo, reacción química de azida-alquino (AAC), ligadura de dibenzo-ciclooctano (DCL) o ligadura de tetrazina-alqueno (TAL). Por ejemplo, en el contexto de la AAC, las MSR o la SLB contienen una pluralidad de funcionalidades de química de clic individuales, y frecuentemente contiene dos, tres o más de tales funcionalidades. Se prefieren una o dos de tales funcionalidades por molécula. En una realización, un reactivo para química de clic como la 3-azidopropilamina o el ácido 10-cecinoico puede unirse mediante amida al extremo terminal carboxi o amino, respectivamente, de un péptido o proteína mediante una reacción de clic con un alquino o compuesto azido correspondiente y un catalizador apropiado para formar los grupos de enlace del anillo 1,2,3-triazol. Véase, por ejemplo, Publicación de Estados Unidos N° 2007/0060658. Para ampliar aún más el arsenal de reactivos de clic bioortogonales sin de cobre, los compuestos que contienen azadibenzociclooctano (ADIBO) para reacciones de acoplamiento con azida pueden usarse para el anclaje covalente específico del sitio de moléculas funcionales proteicas, por ejemplo, anticuerpos, interleucinas y citoquinas. Para la PEGilación de áreas no funcionalizadas de la superficie se emplea la misma reacción de clic libre de metales. Este tratamiento permite reducir drásticamente o eliminar por completo las uniones no específicas. Los métodos de inmovilización por clic sin cobre pueden aplicarse a la preparación de varios tipos de matrices, así como a la derivatización de microperlas y nanopartículas. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 8,912,322. En algunas realizaciones, las moléculas funcionales se acoplan a la capa base de MSR y/o a la capa de SLB usando un reactivo de clic seleccionado del grupo que consiste en azida, dibenzociclooctano (DBCO), transciclooctano, tetrazina y norborneno y variantes de los mismos. En algunas realizaciones, la molécula funcional comprende azida y un lípido de la bicapa lipídica de la MSR-SLB comprende DBCO.

[0185] El término "química de clic" se refiere a una filosofía química introducida por K. Barry Sharpless de The Scripps Research Institute, que describe la química adaptada para generar enlaces covalentes de manera rápida y fiable mediante la unión de pequeñas unidades que comprenden grupos reactivos entre sí. La química del clic no se refiere a una reacción específica, sino a un concepto que incluye reacciones que imitan reacciones que se encuentran en la naturaleza. En algunas realizaciones, las reacciones de química de clic son modulares, de amplio alcance, dan altos rendimientos químicos, generan subproductos inofensivos, son estereoespecíficas, muestran una gran fuerza de impulsión termodinámica >84 kJ/mol para favorecer una reacción con un único producto de reacción, y/o pueden llevarse a cabo en condiciones fisiológicas. Una reacción exotérmica distinta hace que un reactivo se "cargue por resorte". En algunas realizaciones, una reacción de química de clic presenta una gran economía de átomos, puede llevarse a cabo en condiciones de reacción sencillas, usa materiales de partida y reactivos fácilmente disponibles, no usa solventes tóxicos o usa un solvente benigno o fácilmente eliminable (preferiblemente agua), y/o proporciona un aislamiento sencillo del producto por métodos no cromatográficos (cristalización o destilación).

[0186] El término "asa de química de clic", como se usa en la presente, se refiere a un reactivo, o un grupo reactivo, que puede participar en una reacción de química de clic. Por ejemplo, un alquino tensado, por ejemplo, un ciclooctano, es un asa de química de clic, ya que puede participar en una cicloadición promovida por tensión. En general, las reacciones de química de clic requieren por lo menos dos moléculas que comprendan asas de química de clic que puedan reaccionar entre sí. Tales pares de asas de química de clic que son reactivas entre sí se denominan a veces en la presente asas de química de clic asociadas. Por ejemplo, una azida es un asa química de clic asociada a un ciclooctano o a cualquier otro alquino. En la presente se describen asas de química de clic ejemplares adecuadas para su uso de acuerdo con algunos aspectos de la presente invención, por ejemplo, US 2014/0249296. Otras asas de química de clic adecuadas son conocidas por los expertos en la materia.

[0187] En una realización, la presente invención proporciona APC-MS que comprenden una pluralidad de moléculas activadoras de células T y moléculas coestimuladoras de células T opcionalmente junto con agentes homeostáticos de células T, que se adsorben en el andamiaje a través de grupos de cabeza lipídicos quelantes de metal. Véase, Maloney et al., Chem Biol., 3(3):185-92, 1996. Se han descrito varios enfoques que usan iones metálicos quelados que permiten inmovilizar proteínas marcadas con histidina en varios tipos de interfaces, como interfaces lipídicas y monocapas lipídicas con lípidos quelantes de metales, superficies de oro con monocapas autoensambladas formadas con alcanotioles quelantes de metales y superficies de óxido con silanos quelantes de metales. Por ejemplo, Peterson et al. (US 5,674,677) describe un método para unir dos secuencias de aminoácidos acoplando un quelante orgánico a una proteína, por ejemplo, una enzima, y cargando el quelante con un ion metálico. Este complejo se mezcla después con cualquier proteína que contenga una etiqueta de histidina para acoplar el complejo con la proteína marcada con histidina. Véase también, US 6,087,452.

[0188] Las moléculas funcionales de la invención son preferiblemente proteínas. Los términos "proteína", "péptido" y "polipéptido" se usan indistintamente, y se refieren a un polímero de residuos de aminoácidos enlazados entre sí por enlaces peptídicos (amida). Los términos se refieren a una proteína, péptido o polipéptido de cualquier tamaño, estructura o función. Típicamente, una proteína, péptido o polipéptido tendrá por lo menos tres aminoácidos de longitud. Una proteína, péptido o polipéptido puede referirse a una proteína individual o a un conjunto de proteínas. Uno o más de los aminoácidos de una proteína, péptido o polipéptido pueden modificarse, por ejemplo, mediante la adición de una entidad química como un grupo carbohidrato, un grupo hidroxilo, un grupo fosfato, un grupo farnesilo, un grupo isofarnesilo, un grupo ácido graso, un conector para conjugación, funcionalización u otra modificación, etc. Una proteína, péptido o polipéptido también puede ser una molécula única o un complejo multimolecular. Una proteína, péptido o polipéptido puede ser sólo un fragmento de una proteína o péptido de origen natural. Una proteína, péptido o polipéptido puede ser de origen natural, recombinante o sintético, o cualquier combinación de los mismos.

[0189] El término "conjugado" o "conjugación" se refiere a una asociación de dos moléculas, por ejemplo, dos proteínas, entre sí de tal manera que estén enlazadas por una interacción covalente o no covalente directa o indirecta.

En el contexto de la conjugación a través de la química del clic, la conjugación es a través de un enlace covalente formado por la reacción de las asas de la química del clic. En ciertas realizaciones, la asociación es covalente, y se dice que las entidades están "conjugadas" entre sí. En algunas realizaciones, una proteína se conjuga postraduccionalmente con otra molécula, por ejemplo, una segunda proteína, mediante la formación de un enlace covalente entre la proteína y la otra molécula después de que se haya traducido la proteína y, en algunas realizaciones, después de que se haya aislado la proteína. En algunas realizaciones, la conjugación postraduccional de la proteína y la segunda molécula, por ejemplo, la segunda proteína, se efectúa instalando un asa de química de clic en la proteína, y una segunda asa de química de clic, que puede reaccionar con la primera asa de química de clic, en la segunda molécula, y llevando a cabo una reacción de química de clic en la que los asas de química de clic reaccionan y forman un enlace covalente entre la proteína y la segunda molécula, generando así una proteína quimérica. En algunas realizaciones, dos proteínas se conjugan en sus extremos C-terminales respectivos, generando una proteína quimérica conjugada C-C. En algunas realizaciones, dos proteínas se conjugan en sus extremos N-terminales respectivos, generando una proteína quimérica conjugada N-N.

[0190] En ciertas realizaciones, pueden usarse una pluralidad de marcadores detectables para analizar y/o estudiar el proceso de conjugación. Como se usa en la presente, un "marcador detectable" se refiere a una fracción que tiene por lo menos un elemento, isótopo o grupo funcional incorporado en la fracción que permite la detección de la molécula, por ejemplo, una proteína o polipéptido, u otra entidad, a la que está unida el marcador. Los marcadores pueden estar unidos directamente (es decir, mediante un enlace) o pueden unirse mediante un anclaje (como, por ejemplo, un alquileno opcionalmente sustituido; un alquenileno opcionalmente sustituido; un alquinileno opcionalmente sustituido; un heteroalquileno opcionalmente sustituido; un heteroalquenileno opcionalmente sustituido; un heteroalquinileno opcionalmente sustituido; un arileno opcionalmente sustituido; un heteroarileno opcionalmente sustituido; o un acileno opcionalmente sustituido, o cualquier combinación de los mismos, que puede constituir un anclaje). Se apreciará que el marcador puede unirse o incorporarse a una molécula, por ejemplo, una proteína, polipéptido u otra entidad, en cualquier posición.

[0191] En general, un marcador puede pertenecer a una cualquiera (o más) de las cinco clases siguientes a) un marcador que contiene moléculas isotópicas, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados, que incluyen, entre otros, 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18F, 31P, 32P, 35S, 67Ga, 99mTc (Tc-99 m), 111In, 125I, 131I, 153Gd, 169Yb, y 186Re; b) un marcador que contenga una fracción inmunitaria, que pueden ser anticuerpos o antígenos, que pueden estar unidos a enzimas (por ejemplo, como la peroxidasa de rábano picante); c) un marcador que sea una fracción coloreada, luminiscente, fosforescente o fluorescente (por ejemplo, como el marcador fluorescente isotiocianato de fluoresceína (FITC) o carboxifluoresceína); d) un marcador que tenga una o más fracciones de fotoafinidad; y e) un marcador que sea un ligando para uno o más compañeros de unión conocidos (por ejemplo, biotina-estreptavidina, FK506-FKBP). En ciertas realizaciones, un marcador comprende un isótopo radiactivo, preferiblemente un isótopo que emite partículas detectables. En ciertas realizaciones, el marcador comprende una fracción fluorescente. En ciertas realizaciones, el marcador es el marcador fluorescente isotiocianato de fluoresceína (FITC). En ciertas realizaciones, el marcador comprende una fracción de ligando con uno o más compañeros de unión conocidos. En ciertas realizaciones, el marcador comprende biotina. En algunas realizaciones, un marcador es un polipéptido fluorescente (por ejemplo, GFP o un derivado del mismo como GFP mejorada (EGFP)) o una luciferasa (por ejemplo, una luciferasa de luciérnaga, Renilla o Gaussia). Se apreciará que, en ciertas realizaciones, un marcador puede reaccionar con un sustrato adecuado (por ejemplo, una luciferina) para generar una señal detectable. Ejemplos no limitativos de proteínas fluorescentes incluyen GFP y derivados de la misma, proteínas que comprenden cromóforos que emiten luz de diferentes colores, como proteínas fluorescentes rojas, amarillas y cian, etc. Las proteínas fluorescentes ejemplares incluyen, por ejemplo, Sirio, Azurita, EBFP2, TagBFP, mTurquoise, ECFP, Cerúleo, TagCFP, mTFP1, mUkG1, mAG1, AcGFP1, TagGFP2, EGFP, mWasabi, EmGFP, TagYPF, EYFP, Topacio, SYFP2, Venus, Citrine, mKO, mKO2, Orange, mOrangea2, TagRFP, TagRFP-T, mStrawberry, mRuby, mCherry, mRaspberry, mKate2, mPlum, mNeptune, T-Sapphire, mAmetrine, mKeima. Véase, por ejemplo, Chalfie, M. y Kain, S R (eds.) Green fluorescent protein: properties, applications, and protocols (Methods of Biochemical Analysis, v. 47). Wiley-Interscience, Hoboken, N.J., 2006, y/o Chudakov et al., Physiol Rev. 90(3):1103-63, 2010 para el análisis de GFP y numerosas otras proteínas fluorescentes o luminiscentes. En algunas realizaciones, un marcador comprende un supresor oscuro, por ejemplo, una sustancia que absorbe la energía de excitación de un fluoróforo y disipa la energía en forma de calor.

[0192] En otra realización, las moléculas funcionales pueden cargarse en la sílice mesoporosa y/o en la bicapa lipídica usando técnicas de carga covalentes o no covalentes conocidas. En una realización, las moléculas funcionales se cargan no covalentemente. Por ejemplo, Lei et al. (Publicación de Estados Unidos N° 2011-0256184) describen silicatos mesoporosos que proporcionan una carga mejorada y espontánea de anticuerpos como IgG a través de enlace no covalente dentro de la estructura nativa o funcionalizada. Por consiguiente, los andamiajes de la invención pueden formularse con tales silicatos.

[0193] En otra realización, las moléculas funcionales se ligan químicamente sobre las MSR. En tales realizaciones, la ligación puede llevarse a cabo usando una o más de las siguientes moléculas y los grupos reactivos contenidos en las mismas: cisteína (grupo tiol), serina o treonina (grupo hidroxilo), lisina (grupo amino), aspartato o glutamato (grupo carboxilo). Alternativamente, las moléculas funcionales pueden conjugarse con las MSR usando una etiqueta de polihistidina (etiqueta His), un péptido que contenga una etiqueta de polihistidina o un anticuerpo que contenga una etiqueta de polihistidina. En este caso, la etiqueta de polihistidina consiste en por lo menos cuatro, cinco, seis o siete residuos de histidina (His).

[0194] En una realización, se usa un anclaje para conectar la molécula funcional a la pared del poro. Sin embargo, el anclaje no es un componente esencial. En ciertas realizaciones, cada poro de la sílice mesoporosa aloja por lo menos una molécula funcional. Por tanto, los poros deben tener un tamaño apropiado para inmovilizar una sustancia biológica. El tamaño de los poros depende del tamaño de la molécula funcional que se va a inmovilizar. Cuando se inmoviliza una molécula funcional en un poro, la molécula funcional puede adsorberse en una superficie interna del poro mediante enlace electrostático. Una molécula funcional también puede mantenerse en un poro mediante enlace no covalente, como las fuerzas de van der Waals, enlace de hidrógeno o enlace iónico.

[0195] En la realización mencionada anteriormente en la que la MSR comprende fracciones de anclaje, el anclaje puede tener el efecto de reducir un gran cambio estructural de la molécula funcional para mantenerla estable. Preferiblemente, el anclaje está compuesto sustancialmente del mismo componente que el material mesoporoso. El anclaje puede comprender uno o más grupos funcionales para permitir la unión a una molécula funcional deseada: un grupo hidroxilo, un grupo amida, un grupo amino, un grupo piridina, un grupo urea, un grupo uretano, un grupo carboxilo, un grupo fenol, un grupo azo, un grupo hidroxilo, un grupo maleimida, un derivado de silano o un grupo aminoalquileno.

[0196] Las realizaciones de la invención se refieren además a los andamiajes de MSR-SLB de la invención, incluyendo, andamiajes que contienen tales andamiajes, que comprenden, una pluralidad de las moléculas funcionales mencionadas con anterioridad que se adsorben en la matriz lipídica.

[0197] En una realización, las moléculas funcionales se adsorben en la bicapa lipídica soportada mediante inserción física. En la técnica se conocen las técnicas para insertar proteínas en la bicapa de moléculas anfipáticas. En una realización, las proteínas en el entorno de la bicapa, por ejemplo en el medio hidrófobo y/o en el cuerpo hidrófilo y/o en el soporte hidratado, pueden insertarse espontáneamente en la bicapa. Alternativamente, las proteínas pueden ser conducidas hacia la bicapa mediante la aplicación de un voltaje y/o por fusión de vesículas cargadas de proteínas con la bicapa. Las vesículas pueden estar contenidas en el cuerpo hidrofílico o introducirse en el mismo. En un caso, las proteínas pueden introducirse en la membrana usando el método de sonda divulgado en la Publicación de PCT N° WO 2009/024775. La proteína insertada puede ser una proteína asociada a la membrana conocida, por ejemplo, una o más de las moléculas activadoras de células T y/o moléculas coestimuladoras de células T mencionadas con anterioridad.

[0198] En otra realización, la molécula funcional puede ser un antígeno que se usa en la expansión de células T. Ejemplos representativos de tales antígenos utilizables en la expansión de células T incluyen, CD19 de longitud completa o un fragmento del mismo o una variante del mismo. El CD19 es un antígeno prototípico usado en la expansión de células T de receptores de antígenos quiméricos (CAR). Véase, Turtle et al., Blood, 126:184, 2015; Turtle et al., J Clin Invest., 126, 2123-38, 2016. En otra realización, el antígeno es CD22 de longitud completa o un fragmento del mismo o una variante del mismo, que también son útiles en la expansión de células T CAR. Véase, Haso et al., Blood, 121(7): 1165-1174, 2013; Qin et al., Blood, 122:1431, 2013.

[0199] En una realización alternativa, la molécula funcional puede ser una proteína asociada a la membrana que se ancla directa o indirectamente a la bicapa. Mediante este método también pueden insertarse en el SLB otras moléculas funcionales, por ejemplo, proteínas de transporte de membrana selectivas o no selectivas, canales iónicos, proteínas formadoras de poros o receptores residentes de membrana, etc.

[0200] En otra realización, las moléculas funcionales pueden conjugarse con proteínas asociadas a la membrana que se asocian y/o insertan en el SLB, por ejemplo gramicidina; haces de hélices a, por ejemplo bacteriorrodopsina o canales K+; y barril p, por ejemplo a-hemolisina, leucocidina o porinas de E. coli; o combinaciones de las mismas.

[0201] En ciertas realizaciones, la SLB fabricada (que contiene una o más moléculas funcionales) puede estabilizarse mediante compuestos como surfactantes iónicos o no iónicos. Los surfactantes adecuados incluyen, entre otros, los siguientes ejemplos: fosfolípidos sintéticos, sus derivados hidrogenados y mezclas de los mismos, esfingolípidos y glicoesfingolípidos, ácidos grasos saturados o insaturados, alcoholes grasos, copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno, ácidos grasos etoxilados así como ésteres o éteres de los mismos, dimiristoil fosfatidil colina, dimiristoil fosfatidil glicerol o una combinación de dos o más de los mencionados anteriormente. Un surfactante preferido de acuerdo con la invención es el dimiristoil fosfatidil glicerol.

[0202] Las SLB fabricadas pueden estabilizarse opcionalmente mediante por lo menos un cosurfactante seleccionado en el grupo que comprende o que consiste en butanol, ácido butírico, ácido hexanoico, colato de sodio, taurocolato de sodio y glicocolato de sodio, más particularmente colato de sodio.

[0203] Las SLB fabricadas también pueden incluir otros excipientes, como polímeros que tengan propiedades bioadhesivas o de mejora de la absorción y seleccionados del grupo que comprende o consiste en polímeros acrílicos (CARBOPOL®, Polycarbophil, NOVEON®), ácidos grasos de cadena media y polietilenglicoles. Los excipientes preferidos son los polímeros acrílicos mencionados con anterioridad.

[0204] La SLB puede modificarse con reactivos para detectar proteínas asociadas a la membrana. Preferiblemente, las proteínas asociadas a la membrana son proteínas de canal iónico y/o proteínas formadoras de poros. Preferiblemente, las proteínas asociadas a la membrana se difunden en la bicapa y/o se asocian con ella, provocando un cambio detectable en las propiedades de la bicapa. Las propiedades modificadas pueden ser físicas, ópticas, eléctricas o bioquímicas.

[0205] En algunas realizaciones, los andamiajes de MSR-SLB y/o los andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno comprenden un fármaco de molécula pequeña. En algunas realizaciones, los andamiajes de MSR-SLB y/o los andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno comprenden un análogo de talomida. En algunas realizaciones, los andamiajes de MSR-SLB y/o los andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno comprenden un inhibidor de IDO/MEK. En algunas realizaciones, los andamiajes de MSR-SLB y/o los andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno comprenden un fármaco de molécula pequeña que tiene efectos inmunomoduladores. En la técnica se conocen los fármacos de molécula pequeña con efectos inmunomoduladores (véase, por ejemplo, Murphy et al. Hum. Vaccin. Immunother. 11(10): 2463-8 (2015)).

[0206] En ciertas realizaciones, los andamiajes de MSR-SLB que contienen las moléculas funcionales pueden usarse para detectar células que son capaces de interactuar con las moléculas anfipáticas de la bicapa y/o con la molécula funcional de la bicapa. La interacción puede ser de naturaleza específica o no específica. Alternativamente, las células pueden interactuar con la molécula funcional o con la bicapa lipídica para provocar cambios físicos, ópticos, eléctricos o bioquímicos. Dicha interacción puede detectarse de muchas maneras diferentes incluyendo, entre otras, mediante cambios visuales, a través de la activación de lípidos o proteínas marcados fluorescentemente en la SLB, o cambios en la capacitancia de la SLB.

Andamiajes biodegradables

[0207] Las realizaciones de la invención se refieren además a andamiajes biodegradables. En una realización, la estructura del andamiaje puede degradarse sustancialmente cuando se expone a un medio biológico. En una realización, el medio biológico es una condición de cultivo tisular, por ejemplo, un medio de cultivo tisular que ha sido opcionalmente adaptado para cultivar linfocitos como células T. En otra realización, el medio biológico es un fluido biológico, por ejemplo, sangre, linfa, LCR, fluido peritoneal o similar. En otra realización más, el medio biológico es el entorno tisular en el lugar del implante, por ejemplo, vasos sanguíneos, sistema linfático, tejido adiposo o similares.

[0208] En ciertas realizaciones, los andamiajes biodegradables se degradan sustancialmente después del contacto con un medio biológicoin vivodurante 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 20 días, 30 días, 45 días, 60 días, 90 días, o más. En ciertas realizaciones, los andamiajes biodegradables se degradan sustancialmente después del contacto con un medio biológicoin vivoen menos de 1 semana. En ciertas realizaciones, los andamiajes biodegradables se degradan sustancialmente después del contacto con un medio biológicoin vitrodurante 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7, días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 20 días, 30 días, 45 días, 60 días, 90 días, o más. En ciertas realizaciones, los andamiajes biodegradables se degradan sustancialmente después del contacto con un medio biológicoin vitroen menos de 1 semana. Por degradación sustancial se entiende que por lo menos el 30%, por lo menos el 50%, por lo menos el 60%, por lo menos el 70%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95% o más de la composición del andamiaje se degrada cuando la composición del andamiaje entra en contacto con el medio biológico.

[0209] En ciertas realizaciones, puede ser ventajoso usar andamiajes biodegradables. Por ejemplo, fabricando la composición del andamiaje de tal manera que se degrade sustancialmente durante el periodo de incubación (por ejemplo, cuando se permite que las células T se expandan), puede ser posible usar las células T expandidas sin someterlas a purificación adicional y/o pasos de formulación. Evitar los pasos de purificación y/o formulación en sentido descendente garantizaría que las células T son aptas y poseen la funcionalidad deseada para la aplicación deseada.

[0210] Por consiguiente, en ciertas realizaciones, puede ser ventajoso adaptar la cinética de degradación de las composiciones de andamiaje modificando las propiedades de las varillas de sílice mesoporosa, como tamaño, geometría, porosidad. Alternativamente, la cinética de degradación de las composiciones de andamiaje puede modificarse cambiando las condiciones de cultivo (por ejemplo, ajustando el pH del medio).

[0211] De acuerdo con los objetivos mencionados anteriormente, las realizaciones de la invención se refieren a andamiajes de MSR-SLB que comprenden una pluralidad de moléculas funcionales que son opcionalmente biodegradables. En una realización, los andamiajes de la presente invención pueden encapsularse en otros andamiajes biodegradables. En la técnica se conocen reactivos y técnicas que son útiles en la elaboración de tales composiciones de andamiajes biodegradables compuestos. Véase, Liao et al., J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater., 102(2):293-302, 2014. En una realización, los andamiajes se componen de polímeros fisiológicamentecompatibles y opcionalmente biodegradables. En la técnica se conocen ejemplos de polímeros que pueden emplearse en los andamiajes. Véase, por ejemplo, la Publicación de Estados Unidos N° 2011/0020216. Ejemplos representativos de tales polímeros incluyen, pero no se limitan a, poli(lactida)s, poli(glicolida)s, poli(ácido láctico)s, poli(ácido glicólico)s, polianhídridos, poliortoésteres, polieterésteres, policaprolactonas, poliésteramidas, policarbonatos, policianoacrilatos, poliuretanos, poliacrilatos, y mezclas o copolímeros de los mismos. Los andamiajes biodegradables pueden comprender materiales biodegradables, por ejemplo, colágeno, alginatos, polisacáridos, polietilenglicol (PEG), poli(glicolida) (PGA), poli(L-lactida) (PLA), o poli(lactida-co-glicolida) (PLGA) o seda. En la técnica se conocen métodos para fabricar las composiciones de andamiaje. Véase, por ejemplo, Martinsen et al. (Biotech. & Bioeng., 33(1989) 79 89), (Matthew et al. (Biomaterials, 16 (1995) 265-274), Atala et al. (J Urology, 152 (1994) 641-643), y Smidsrod (TIBTECH 8 (1990) 71-78).

[0212] Los andamiajes ejemplares utilizan glicólidos o alginatos de un peso molecular relativamente bajo, preferiblemente de un tamaño que, después de la disolución, se encuentra en el umbral renal para la depuración por humanos, por ejemplo, el alginato o polisacárido se reduce a un peso molecular de 1000 a 80.000 daltons. Preferiblemente, la masa moleculares de 1000 a 60.000 daltons, particularmente preferible de 1000 a 50.000 daltons. También es útil usar un material de alginato de alto contenido en guluronato, ya que las unidades de guluronato, en oposición a las unidades de manuronato, proporcionan sitios para la reticulación iónica a través de cationes divalentes para gelificar el polímero. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.642.363 divulga métodos para elaborar y usar polímeros que contienen polisacáridos como los alginatos.

[0213] Los andamiajes de la invención pueden ser porosos de tal manera que los andamiajes puedan sostener la presentación de antígenos y atraer y manipular células inmunitarias. En una realización, los andamiajes contienen matrices porosas, en las que los poros tienen un diámetro entre 10 nm y 500 jm , particularmente entre 100 nm y 100 |jm. En estas realizaciones, la invención utiliza andamiajes que comprenden andamiajes mesoporosos. Los métodos para elaborar matrices poliméricas que tienen los tamaños de poro y alineaciones de poro deseados se describen en la técnica, por ejemplo, la Publicación de Estados Unidos N° 2011/0020216 y la Patente de Estados Unidos N° 6.511.650.

[0214] Las varillas de sílice mesoporosa pueden modificarse en plataformas de administración multifuncionales para la administración de fármacos como agentes quimioterapéuticos y ADN/ARNip, anticuerpos y proteínas biológicas, células, etc. (Lee et al., Adv. Funct. Mater., 215-222, 2009; Liong et al., ACS Nano, 889-896, 2008; Meng et al., ACS Nano, 4539-4550, 2010; Meng et al., J. Am. Chem. Soc., 12690-12697, 2010; Xia et al., ACS Nano, 3273-3286, 2009; Radu et al., J. Am. Chem. Soc., 13216-13217, 2004; Slowing et al., J. Am. Chem. Soc., 8845-8849, 2007). Esta plataforma de administración permite el envasado eficaz y protector de fármacos anticancerígenos hidrófobos y cargados para su administración controlada y a demanda, con la capacidad adicional de obtener también imágenes del sitio de administración (Liong et al., ACS Nano, vol. 2, págs. 889-896, 2008). El desafío clave ahora es optimizar las características de diseño para una administración eficiente y segura de fármacosin vivo(He et al., Small, vol. 7, págs. 271-280, 2011; Lee et al., Angew. Chem. Int. Ed., vol. 49, págs. 8214-8219, 2010; Liu et al., Biomaterials, vol.

32, págs. 1657-1668, 2011; Al Shamsi et al., Chem. Res. Toxicol., vol. 23, págs. 1796-1805, 2010), que puede evaluarse mediante el uso de tumores humanos de xenoinjerto en ratones desnudos (Lu et al., Small, vol. 6, págs.

1794-1805, 2010).

[0215] Las realizaciones descritas en la presente se refieren además a andamiajes de MSR-SLB, incluyendo andamiajes que contienen tales andamiajes, en donde la relación de peso seco de las microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) con respecto a las moléculas activadoras/coestimuladoras de células T se encuentra entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 100:1, preferiblemente entre aproximadamente 10:1 y aproximadamente 50:1, particularmente entre aproximadamente 20:1 y aproximadamente 50:1. En algunas realizaciones, la relación de peso seco de las microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) con respecto a las moléculas activadoras/coestimuladoras de células T de los andamiajes de MSR-SLB está entre aproximadamente 10.000:1 y aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la relación de peso seco de las microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) con respecto a las moléculas activadoras/coestimuladoras de células T de los andamiajes de MSR-SLB está entre aproximadamente 5.000:1 y aproximadamente 1:1, entre aproximadamente 1.000:1 y aproximadamente 1:1, entre aproximadamente 500:1 y aproximadamente 1:1, entre aproximadamente 100:1 y aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la relación de peso seco de las microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) con respecto a las moléculas activadoras/coestimuladoras de células T de los andamiajes de MSR-SLB es de aproximadamente 10.000:1, aproximadamente 5.0001, aproximadamente 2.500:1, aproximadamente 1.000:1, aproximadamente 750:1, aproximadamente 500:1, aproximadamente 250:1, aproximadamente 100:1, aproximadamente 75:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 40:1, aproximadamente 30:1, aproximadamente 25:1, aproximadamente 20:1, aproximadamente 10:1, o aproximadamente 1:1.

[0216] Las realizaciones descritas en la presente se refieren además a composiciones y dispositivos que contienen los andamiajes mencionados anteriormente que contienen los andamiajes de MSR-SLb junto con las moléculas funcionales, por ejemplo, molécula activadora de células T, molécula coestimuladora de células T y agente homeostático de células T, opcionalmente junto con uno o más agentes adicionales (enumerados a continuación). En una realización, la invención proporciona composiciones que comprenden el andamiaje y las células T agrupadas en el mismo. En una realización, las células T se seleccionan del grupo que consiste en células asesinas naturales (NK), células T CD3+, células T CD4+, células T CD8+ y células T reguladoras (Tregs), o una combinación de las mismas. En otras realizaciones, la composición puede ser una composición farmacéutica, que puede producirse usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden ser producidas por los expertos en la técnica empleando principios aceptados de química médica. Las composiciones, los andamiajes y los dispositivos pueden estar provistos con uno o más reactivos para seleccionar, cultivar, expandir, mantener y/o trasplantar las células de interés. En la técnica se conocen ejemplos representativos de kits de selección celular, kits de cultivo, kits de expansión, kits de trasplante para células T, células B y células presentadoras de antígeno. Por ejemplo, cuando la célula diana de interés son células T, éstas pueden seleccionarse inicialmente usando DYNABEADS, perlas MACS (Miltenyi Biosciences), manteniendo en medio de base de células T humanas STEMXVIVO (R&D Systems) y expandirse con medio de cultivo OPTIMIZER (Thermo Fisher Scientific). Las células pueden enriquecerse en la muestra usando técnicas de centrifugación conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, gradientes de FICOLL®. Las células también pueden enriquecerse en la muestra usando selección positiva, selección negativa o una combinación de las mismas, basándose en la expresión de ciertos marcadores.

[0217] Realizaciones adicionales de la invención se refieren a dispositivos de manipulación de células T. Los dispositivos contienen andamiajes de la invención junto con una pluralidad de moléculas que atraen/se unen a células T diana. En una realización, la invención se refiere a dispositivos que contienen andamiajes que se apilan para permitir selectivamente la infiltración de células T en las microvarillas de sílice mesoporosa (MSR). Por infiltración selectiva, se entiende que debido a la permisibilidad/permeabilidad selectiva, especificidad de unión, eliminación selectiva (de células no deseadas) y/o expansión (de células deseadas), el andamiaje contiene por lo menos un 10% más, 20% más, 30% más, 40% más, 50% más, 60% más, 70% más, 80% más, 90% más, 100% más, 150% más, 200% más, 300% más, 400% más, 500% más, 600% más, 800% más, 1000% más, o una cantidad mayor de células T diana después de un periodo de incubación en comparación con el que está presente en la sangre completa. En ciertas realizaciones, el periodo de incubación es de entre 1 y 30 días, preferiblemente entre 4 y 15 días, particularmente entre 7 y 12 días. En otras realizaciones, la infiltración selectiva se refiere a la retención y/o expansión de células T en comparación con otras células sanguíneas, por ejemplo, células B, células dendríticas, macrófagos, glóbulos rojos o plaquetas que están presentes en la sangre completa.

[0218] En otras realizaciones, los andamiajes de la invención permiten la infiltración selectiva de una subpoblación específica de células T, por ejemplo, células asesinas naturales (NK), células T CD3+, células T CD4+, células T CD8+ o células T reguladoras (Tregs). En este caso, el andamiaje contiene por lo menos un 10% más, un 20% más, un 30% más, un 40% más, un 50% más, un 60% más, un 70% más, un 80% más, un 90% más, un 100% más, un 150% más, un 200% más, un 300% más, un 400% más, un 500% más, un 600% más, un 800% más, un 1000% más, o una cantidad mayor de células T diana después de 4-14 días de incubación en comparación con el que está presente en la sangre completa. Los porcentajes y los intervalos de varios tipos de linfocitos en la sangre completa humana son los siguientes: Células NK 7% (intervalo: 2-13%); células T auxiliares 46% (intervalo: 28-59%); células T citotóxicas 19% (intervalo: 13-32%); células T y§ 5% (intervalo: 2%-8%); células B 23% (intervalo: 18-47%) (Berrington et al., Clin Exp Immunol 140 (2): 289-292, 2005).

Agentes adicionales

[0219] Los andamiajes de la invención incluyen uno o más agentes, que pueden ser compuestos de origen natural, producidos sintéticamente o recombinantes, por ejemplo, péptidos, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, moléculas pequeñas, haptenos, carbohidratos u otros agentes, incluyendo fragmentos de los mismos o combinaciones de los mismos. En una realización, los agentes son antígenos. En una realización, los antígenos son péptidos o proteínas o fragmentos inmunológicamente activos de los mismos. En una realización, los antígenos descritos en la presente están purificados. Los compuestos purificados contienen por lo menos un 60% en peso (peso seco) del compuesto de interés. En particular, los antígenos son por lo menos un 75% puros, preferiblemente por lo menos un 90% puros, y más preferiblemente por lo menos un 99% puros. La pureza se mide mediante cualquier método estándar apropiado, por ejemplo, por cromatografía en columna, electroforesis en gel o análisis HPLC. Los antígenos pueden ser autoantígenos o no autoantígenos.

[0220] Ejemplos representativos de antígenos no propios incluyen, por ejemplo, antígenos derivados de un patógeno seleccionado del grupo que consiste en un virus, una bacteria, un protozoo, un parásito y un hongo. Los antígenos pueden cargarse opcionalmente en moléculas del MHC, por ejemplo, HLA-A, HLA-B, HLA-C, DP, DQ y DR, que luego se incorporan a los andamiajes.

[0221] Alternativamente, los andamiajes contienen una pluralidad de autoantígenos, que opcionalmente están enlazados o asociados con una enfermedad o trastorno. Preferiblemente, los autoantígenos están específicamente asociados con una enfermedad o trastorno humano. En una realización, el autoantígeno está asociado con un trastorno autoinmune seleccionado del grupo que consiste en artritis reumatoide, lupus, enfermedad celíaca, enfermedad inflamatoria intestinal o enfermedad de Crohn, síndrome de Sjogren, polimialgia reumática, esclerosis múltiple, espondilitis anquilosante, diabetes de tipo 1, alopecia areata, vasculitis, arteritis temporal, etc. En la bibliografía se han caracterizado tipos específicos de antígenos, incluyendo fragmentos de los mismos, que están asociados con la diabetes de tipo 1, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Crohn y la artritis reumatoide y similares.

Por ejemplo, el antígeno relacionado con la artritis reumatoide es una proteína de 47kDa (RA-A47). Véase Hattori et al, J Bone Miner Metab., 18(6):328-34 (2000). En la enfermedad de Crohn, el antígeno puede ser la flagelina bacteriana. Véase, Lodes et al., J Clin Invest. 113(9):1296-306 (2004). De igual manera, es probable que las principales proteínas de la mielina, como la proteína básica de la mielina (MBP) y la proteína proteolipídica (PLP), tengan importancia en el curso de la esclerosis múltiple (EM). Véase, deRosbo et al., J Clin Invest. 92(6): 2602-260 (1993). En el contexto de la diabetes de tipo 1, puede estar implicada una pluralidad de autoantígenos, como la preproinsulina (PPI), la glucosa-6-fosfatasa específica de los islotes (IGRP), la glutamato descarboxilasa (GAD65), el antígeno-2 del insulinoma (IA-2), la cromogranina A y la proteína 60 de choque térmico. Véase Roep et al., Cold Spring Harb Perspect Med.2(4), 2012 (PMID: 22474615).

[0222] En otra realización, los autoantígenos están asociados con un cáncer. Los tipos representativos de antígenos contra el cáncer incluyen, por ejemplo, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, CEA, tirosinasa, midkin, BAGE, CASP-8, pcatenina, p- catenina, Y-catenina, CA-125, CDK-1, CDK4, ESO-1, gp75, gp100, MART-1, MUC-1, MUM-1, p53, PAP, PSA, PSMA, ras, trp-1, HER-2, TRP-1, TRP-2, IL13Ralfa, IL13Ralf2, AIM-2, AIM-3, NY-ESO-1, C9orf 112, SART1, SART2, SART3, BRAP, RTN4, GLEA2, TNKS2, KIAA0376, ING4, HSPH1, C13orf24, RBPSUH, C6orf153, NKTR, NSEP1, U2AF1L, CYNL2, TPR, SOX2, GOLGA, BMI1, COX-2, EGFRvIlI, EZH2, LICAM, Livin, Livin0, MRP-3, Nestin, OLIG2, ART1, ART4, B-ciclina, Gli1, Cav-1, catepsina B, CD74, E-cadherina, EphA2/Eck, Fra-1/Fosl 1, GAGE-1, Gangliósido/GD2, GnT-V, p1,6-N, Ki67, Ku70/80, PROX1, PSCA, SOX10, SOX11, Survivina, UPAR, WT-1, Dipeptidil peptidasa IV (DPPIV), proteína de unión a la adenosina desaminasa (AD Abp), ciclofilina b, antígeno asociado colorrectal (CRC)- C017-1A/GA733, receptor de células T/cadena CD3-zeta, familia GAGE de antígenos tumorales, RAGE, La Ge-I, NAG, GnT-V,, RCASl, a-fetoproteína, pl20ctn, Pmel117, PRAME, glucógeno fosforilasa cerebral, SSX-I, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-I, SSX-4, SSX-5, SCP-I, CT-7, cdc27, proteína de la poliposis adenomatosa coli (APC), fodrina, PlA, conexina 37, idiotipo de Ig, pl5, GM2, gangliósidos GD2, familia Smad de antígenos tumorales, lmp-1, antígeno nuclear codificado por el VEB (EBNA)-I, transcrito 1 similar a la proteína de unión UL16 (Mult1), proteínas RAE-1, H60, MICA, MICB y c-erbB-2, o un péptido inmunogénico de los mismos, y combinaciones de los mismos.

[0223] En otra realización, el antígeno es una diana de células T modificadas, por ejemplo, las células T CAR descritas anteriormente. En tales realizaciones, el antígeno es CD19 o un fragmento del mismo o una variante del mismo. En otra realización, el antígeno es CD22 o un fragmento del mismo o una variante del mismo.

[0224] Los antígenos mencionados anteriormente pueden combinarse con las composiciones de andamiaje usando cualquier método conocido, incluyendo interacciones covalentes y no covalentes. Algunos de estos métodos se han esbozado anteriormente en las secciones relativas a la fabricación de los andamiajes de MSR-SLB con las moléculas funcionales de la invención. Los ejemplos de interacciones no covalentes incluyen, por ejemplo, interacciones electrostáticas, interacciones de van der Waals, efectos n, interacciones hidrofóbicas, inserción física, etc. Por ejemplo, en la bicapa lipídica pueden incorporarse antígenos proteicos transmembrana de longitud completa mediante inserción física usando métodos rutinarios. Véase, Cymer et al., Journal of Molecular Biology, 427.5: 999-1022, 2015 y Patente de Estados Unidos N° 7.569.850.

[0225] Los antígenos también pueden unirse o anclarse a las composiciones de andamiaje mediante interacciones covalentes. En la técnica se conocen los métodos para unir antígenos a andamiajes/superficies, por ejemplo, absorción superficial, inmovilización física, por ejemplo, usando un cambio de fase para atrapar la sustancia en el material del andamiaje. Alternativamente, puede usarse acoplamiento covalente mediante agentes alquilantes o acilantes para proporcionar una presentación estable y a largo plazo de un antígeno en el andamiaje en una conformación definida. En la técnica se conocen reactivos y métodos ejemplares para el acoplamiento covalente de péptidos/proteínas a polímeros. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6,001,395. En otras realizaciones, los antígenos se encapsulan en los andamiajes. En la técnica se conocen métodos para encapsular antígenos en andamiajes adecuados, por ejemplo, microesferas de PLGA. Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 6,913,767 y la Publicación Internacional N° WO 1995/011010.

[0226] Los antígenos pueden formularse para que interactúen con la célula inmunitaria mediante unión directa o unión indirecta. Los tipos de unión directa incluyen, por ejemplo, la ligación o acoplamiento del antígeno con el receptor afín, por ejemplo, el receptor de células T. La unión indirecta puede producirse a través de la intermediación de uno o varios agentes o tipos celulares secundarios. Por ejemplo, el antígeno puede unirse primero a una célula B o a una célula presentadora de antígenos (APC), procesarse (por ejemplo, degradarse) y presentarse en los complejos mayores de histocompatibilidad (MHC) de la superficie celular, a los que se une la población celular diana, por ejemplo, la célula T. Alternativamente, el antígeno puede reclutar otras células intermediarias que segregan varias citoquinas, factores de crecimiento, quimiocinas, etc., que a su vez atraen a la población de células inmunitarias diana. Cualquiera que sea el mecanismo, los componentes mencionados actúan conjuntamente para manipular o modificar las células inmunitarias.

[0227] El antígeno puede derivarse de un lisado celular, un lisado celular fraccionado, células recién recogidas, fluidos biológicos (incluyendo sangre, suero, ascitis), extractos de tejido, etc. En una realización, los antígenos se derivan de lisados de células diana a las que se unen las células inmunitarias deseadas, por ejemplo, células T. En estas realizaciones, los antígenos se fraccionan primero en el lisado celular antes de cargar los andamiajes. Los lisados pueden derivarse de un tejido diana deseado, por ejemplo, células específicas de una enfermedad autoinmune obtenidas de tejidos primarios. Alternativamente, los lisados pueden derivarse de células cancerosas, por ejemplo, células individuales obtenidas de muestras tumorales o cultivos de tejidos o células tumorales obtenidas de histologías de biopsias.

[0228] Los andamiajes de la invención también pueden contener uno o más agentes de reclutamiento. El agente de reclutamiento puede ser un agente seleccionado del grupo que consiste en un agente de reclutamiento de células T, un agente de reclutamiento de células B, un agente de reclutamiento de células dendríticas y un agente de reclutamiento de macrófagos.

[0229] En una realización, los andamiajes contienen agentes de reclutamiento de células T. Ejemplos no limitativos de agentes de reclutamiento de células T incluyen, por ejemplo, factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF), ligando de quimioquinas (motivo C-C) 21 (CCL-21), ligando de quimioquinas (motivo C-C) 19 (CCL-19), o un ligando de tirosina quinasa 3 similar a FMS (Flt-3), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), IFNy, un ligando de quimiocinas con motivo C-X-C (CXCL) seleccionado del grupo que consiste en CXCL12 y CXCR4, o un fragmento de los mismos, una variante de los mismos, o una combinación de los mismos. Otros tipos de agentes de reclutamiento de células T incluyen, ligandos para los receptores CCR5 y CXCR3 para reclutar el subconjunto T auxiliartipo 1 (Th1). Se conocen los ligandos para CCR5, CCL5 y proteínas inflamatorias de macrófagos (MIP-1a). Alternativamente, para el reclutamiento específico del subconjunto Th2 pueden emplearse ligandos para CCR3, CCR4, CCR8 y CXCR4. También puede emplearse una combinación de ligandos.

[0230] En la técnica se conocen varios homólogos de los agentes de reclutamiento de células T mencionados anteriormente, incluyendo fragmentos funcionales de los mismos, o variantes de los mismos. Ejemplos representativos de homólogos incluyen proteínas relacionadas de mosca, ratón, rata, cerdo, vaca, mono, humanos o similares. Los homólogos incluyen preferiblemente homólogos de humano o de ratón de los agentes de reclutamiento mencionados anteriormente.

[0231] Los andamiajes de la presente invención están adaptados para el reclutamiento preferencial de un único tipo o un único subtipo de célula, por ejemplo, el reclutamiento preferencial de células T y particularmente un subconjunto de células Treg o células NK. El reclutamiento preferente se caracteriza por una acumulación de por lo menos el 10%, por lo menos el 20%, por lo menos el 30%, por lo menos el 50%, por lo menos el 75%, por lo menos el 100%, por lo menos 2 veces, por lo menos 5 veces, por lo menos 8 veces, por lo menos 10 veces, o un aumento mayor en una o más de un tipo particular de células inmunitarias (por ejemplo, células T, células B, DC/macrófagos) en el dispositivo en comparación con otros tipos de células inmunitarias en el dispositivo (o en andamiajes de control que carecen de agentes de reclutamiento). En los andamiajes que están adaptados para reclutar una combinación de células inmunitarias, por ejemplo, una combinación de células T y DC/macrófagos, el reclutamiento preferente se caracteriza por que el porcentaje total de células reclutadas es de por lo menos el 10%, por lo menos el 20%, por lo menos el 30%, por lo menos el 50%, por lo menos el 75%, por lo menos el 100%, por lo menos 2 veces (es decir, el 200%), por lo menos 5 veces, por lo menos 8 veces, por lo menos 10 veces, o mayor que otros tipos de células inmunitarias en el dispositivo (o en los andamiajes de control). En particular, el reclutamiento preferente se caracteriza por un aumento de 1-10 veces en la cantidad de las células de interés en comparación con otras células inmunitarias.

[0232] En una realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que comprenden además un agente de reclutamiento que es GM-CSF, un agonista del mismo, un mimético del mismo, un fragmento del mismo, una variante del mismo o una combinación de los mismos. Preferiblemente, el agente de reclutamiento es GM-CSF en combinación con por lo menos uno de CCL-21, CCL-19, Flt-3 o GCSF. Ejemplos representativos de tales agentes de reclutamiento incluyen, por ejemplo, GM-CSF humano (N° de registro NCBI NP_000749.2) y GM-CSF de ratón (N° de registro NCBI NP_034099.2). En otra realización, la presente invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen fragmentos de GM-CSF, por ejemplo, un polipéptido que contiene los aminoácidos 18 -144 de la secuencia hGM-CSF. En otra realización más, la invención se refiere a andamiajes que contienen variantes de GM-CSF que incluyen, por ejemplo, VAR_013089 y VAR_001975, cuyas secuencias se han registrado en UNIPROT (N° de registro P04141). En otra realización, la invención se refiere a andamiajes de MSR-SLB que contienen miméticos de GM-CSF incluyendo, por ejemplo, anticuerpos que se unen al receptor de GM-CSF, por ejemplo, los descritos por Monfardini et al., Curr Pharm Des., 8(24): 2185-99, 2002.

[0233] Las realizaciones de la invención proporcionan además andamiajes para manipular células inmunitarias que comprenden una pluralidad de agentes adicionales. En tales realizaciones, el agente adicional puede comprender un factor de crecimiento, una citoquina, una quimioquina, una interleucina, una molécula de señalización de adhesión, una molécula de señalización de integrina o un fragmento de los mismos o una combinación de los mismos.

[0234] Ejemplos representativos de factores de crecimiento/citoquinas incluyen, entre otros, adrenomedulina (AM), angiopoyetina (Ang), factor de motilidad autocrino, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor de crecimiento epidérmico (EGF) eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), somatotropina bovina fetal (FBS) factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor de diferenciación del crecimiento 9 (GDF9), factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF), factor de crecimiento derivado del hepatoma (HDGF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor estimulante de la migración (MSF), miostatina (GDF-8), factor de crecimiento nervioso (NGF), neurotrofinas, factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), trombopoyetina (TPO), factor de crecimiento de células T (TCGF), factor de crecimiento transformante (TGF-a o TGF-p), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), Wnt, factor de crecimiento placentario (PGF), o un fragmento funcional de los mismos, o una combinación de los mismos.

[0235] Los tipos representativos de interleucinas incluyen, pero no se limitan a, IL-1 (activa células T, células B, células NK y macrófagos), IL-2 (activa células B y células NK), IL-3 (estimula células no linfoides), IL-4 (factor de crecimiento para células B activadas, células T en reposo y mastocitos), IL-5 (para la diferenciación de las células B activadas), IL-6 (factor de crecimiento para las células plasmáticas y células T), IL-7 (factor de crecimiento para las pre células B/pre células T y las células NK), IL-10 (activa los macrófagos, las células B, los mastocitos y las células Th1/Th2), IL-12 (activa las células T y las células NK), IL-17 (activa las células Th). También pueden emplearse fragmentos funcionales de interleucinas, que se caracterizan por su capacidad para modular la actividad de las células diana.

[0236] Opcionalmente, los andamiajes pueden contener moléculas de adhesión, que también pueden servir como agentes de señalización. Ejemplos representativos de moléculas de señalización de adhesión incluyen, entre otras, fibronectina, laminina, colágeno, trombospondina 1, vitronectina, elastina, tenascina, aggrecan, agrina, sialoproteína ósea, proteína de matriz de cartílago, fibronógeno, fibrina, fibulina, mucinas, entactina, osteopontina, plasminógeno, restrictina, serglicina, SPARC/osteonectina, versican, factor de von Willebrand, sulfato de heparina polisacárido, anexinas, colágeno, péptidos RGD (Arg-Gly-Asp) e YIGSR (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) y péptidos cíclicos, glicosaminoglicanos (GAG), ácido hialurónico (HA), condroitina-6-sulfato, ligandos de integrina, selectinas, cadherinas y miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Otros ejemplos son las moléculas de adhesión de células neurales (NCAM), las moléculas de adhesión intercelular (ICAM), la molécula de adhesión de células vasculares (VCAM-1), la molécula de adhesión de células plaquetarias-endoteliales (PECAM-1), L1 y CHL1. También pueden emplearse fragmentos funcionales de las moléculas de adhesión, que se caracterizan por su capacidad para modular la unión de células diana a los andamiajes de la invención. En particular, las moléculas de adhesión comprenden péptidos o péptidos cíclicos que contienen la secuencia de aminoácidos ácido arginina-glicina-aspártico (RGD), que se sabe que es un ligando de unión celular y se encuentra en varias moléculas naturales de matriz extracelular. En otra realización, el péptido de adhesión es un imitador del colágeno. Ejemplos representativos incluyen el péptido que tiene la estructura GGYGGGPC(GPP)5GFOGER(GPP)5GPC, donde O es hidroxiprolina. Tales péptidos pueden denominarse colectivamente péptidos GFOGER. Se ha demostrado previamente que los péptidos GFOGER son particularmente buenos para la adhesión de células T. Véase, Stephan et al, Nature Biotechnology 33, 2015.

[0237] Una matriz polimérica con tal modificación proporciona propiedades de adhesión celular al andamiaje de la invención, y sostiene la supervivencia a largo plazo de sistemas celulares de mamíferos, además de apoyar el crecimiento y la diferenciación celular. Las moléculas de adhesión pueden acoplarse a la matriz polimérica usando métodos sintéticos que son conocidos en general por los expertos en la materia y se describen en los ejemplos. Véase, por ejemplo, Hirano et al., Advanced Materials, 17-25, 2004; Hermanson et al., Bioconjugate Techniques, p. 152-185, 1996; Massia and Hubbell, J. Cell Biol. 114:1089-1100, 1991; Mooneyetal., J. Cell Phys. 151:497-505, 1992; y Hansen et al., Mol. Biol. Cell 5:967-975, 1994.

[0238] Dependiendo del tipo de célula diana, puede ser preferible emplear moléculas de señalización de adhesión que sean específicas para las células diana. Por tanto, en una realización, los andamiajes contienen receptores de adhesión que son útiles en la unión/secuestro de células T. En estas realizaciones, los andamiajes pueden contener moléculas de adhesión específicas de células T, por ejemplo, un receptor seleccionado del grupo que consiste en MHC clase II (para células CD4+), MHC clase I (para células CD8+), L<f>A-3 (ligando de CD2), ICAM<1>(ligando de LFA-1) o una variante de los mismos, un fragmento de los mismos o una combinación de los mismos.

[0239] Dependiendo de las necesidades, los andamiajes pueden formularse específicamente para que contengan un subconjunto de agentes de reclutamiento y moléculas de adhesión con el fin de manipular un subconjunto particular de células inmunitarias, por ejemplo, una subpoblación particular de células T. En estas realizaciones, los andamiajes pueden formularse/fabricarse usando agentes que se unen específicamente a los marcadores de superficie celular que se expresan en las células diana. Por ejemplo, en el contexto de las células T, los andamiajes pueden adaptarse para el reclutamiento preferente de células T auxiliares (células Th; que expresan diferencialmente CD4+), células T citotóxicas (células Tc; que expresan diferencialmente CD8+), células T de memoria (células Tm; que expresan diferencialmente CD45RO), células T supresoras (células Ts), células T reguladoras (Tregs; caracterizadas además como células Treg FOXP3+ y Treg FOXP3-), células T asesinas naturales (células NK; expresan diferencialmente CD1d+), invariantes asociadas a mucosas (MAIT; expresan diferencialmente MR1), células T gamma delta, (células T Y8; comprenden TCRs que contienen una cadena<y>y una cadena 8). Tales agentes que se unen a marcadores de la superficie celular pueden incluir, por ejemplo, haptenos, péptidos, ligandos, anticuerpos o similares. Opcionalmente, pueden usarsein situoex situotras técnicas rutinarias para enriquecer los aislados con uno o más subtipos celulares.

[0240] Los andamiajes también pueden adaptarse para reclutar células inmunitarias que sean específicas para una enfermedad. Por ejemplo, pueden reclutarse una pluralidad de células T que sean específicas para un tipo particular de enfermedad autoinmune. Así, en una realización, los andamiajes que son útiles en el diagnóstico de trastornos autoinmunitarios pueden formularse para que contengan agentes de reclutamiento que son específicos de las células inmunitarias implicadas en el trastorno. Tales agentes de reclutamiento pueden, por ejemplo, ser específicos de células T reguladoras (Tregs), células T supresoras (Ts) o una combinación de las mismas. En una realización relacionada, los andamiajes que son útiles en el diagnóstico de cánceres pueden formularse para que contengan agentes de reclutamiento para reclutar preferentemente tipos de células T específicas de cáncer, por ejemplo, células T citotóxicas (Tc), células asesinas naturales (NK) o una combinación de las mismas.

[0241] En ciertas realizaciones, el andamiaje es útil para seleccionar células específicas de la enfermedad. Estas puede incluir, por ejemplo, células que promueven directamente la progresión de la enfermedad. En el contexto de muchas enfermedades autoinmunes, la enfermedad puede estar mediada y promovida por la destrucción dirigida de una población específica de células, por ejemplo, las células beta del páncreas en la T1D y las células neuronales en la esclerosis múltiple. En otras enfermedades autoinmunes, la enfermedad puede precipitarse por el ataque dirigido de epítopos específicos como, por ejemplo, factores reumatoides (RF) y péptidos citrulinados (ACPA) en el contexto de la artritis reumatoide y antígenos presentes en la flora intestinal en el contexto de la enfermedad de Crohn. La destrucción dirigida de las células generalmente implica a un tipo o subconjunto específico de células inmunitarias. Así, basándose en la naturaleza y las propiedades de las dianas celulares, las células inmunitarias que son específicas para ellas pueden manipularse preferiblemente usando los andamiajes de la presente invención.

[0242] En las realizaciones mencionadas anteriormente, los andamiajes están provistos de antígenos a los que se unen las células inmunitarias específicas de la enfermedad, por ejemplo, células T. Estas células autoinmunitarias pueden manipularse y opcionalmente reprogramarse a un fenotipo no autoinmune. En la técnica se conocen los métodos de reprogramación de células T a pluripotencia. Véase, Nishimura et al., Stem Cell 12, 114-126 (2013); Themeli et al., Nature Biotechnology 31, 928-933 (2013). En ciertos casos, particularmente en el contexto de células T específicas para el cáncer, las células reprogramadas pueden rejuvenecerse para dirigirse al cáncer. Alternativamente, en el contexto de las células T que son específicas para enfermedades autoinmunes, las células pueden eliminarse.

[0243] En ciertas realizaciones, los andamiajes de la invención se fabrican como estructuras porosas que han sido diseñadas para sostener la presentación de antígenos. En la técnica se han descrito los métodos para fabricar andamiajes porosos. Véase, por ejemplo, Publicación de Estados Unidos N° 2011/0020216, 2013/0202707, 2011/0020216 y Patente de Estados Unidos N° 8.067.237.

[0244] Las realizaciones de la invención proporcionan además andamiajes que contienen MSR-SLB que poseen la estabilidad deseada para varias aplicacionesex vivoein vivo.Por ejemplo, los andamiajes son estables en aplicaciones de cultivo de tejidos, experimentos de crecimiento celular, o como material de trasplante para ser administrado en tejidos (recogidos o manipulados) y también en sujetos. En una realización, la invención se refiere a andamiajes de microvarillas de sílice mesoporosa-bicapa lipídica (MSR-SLB) que conservan una arquitectura fluida continua durante por lo menos 0,5 días, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días, 25 días, 30 días, 35 días, 40 días, 45 días, 50 días, o más. La estabilidad y/o la arquitectura fluida de los andamiajes pueden monitorizarse usando técnicas rutinarias, por ejemplo, las técnicas de visualización microscópica ilustradas en los Ejemplos siguientes.

II. Métodos de elaboración de los andamiajes de la invención

[0245] Las realizaciones de la invención se refieren además a métodos para elaborar los andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) de la invención. El método comprende proporcionar una capa base que comprende microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial; opcionalmente, cargar los agentes homeostáticos de células T en las MSR; estratificar una bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua, sobre la capa base que comprende las MSR, generando de este modo un andamiaje de MSR-SLB; cargar los agentes homeostáticos de células T en el andamiaje de MSR-SLB si no se lleva a cabo el paso (b); opcionalmente, bloquear uno o más sitios de integración no específicos en el andamiaje de MSR-SLB con un bloqueador; y cargar las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T en el andamiaje de MSR-SLB, generando de este modo el APC-MS. En estas realizaciones, el método o métodos pueden incluir la carga adicional de por lo menos un agente adicional que sea un factor de crecimiento, una citoquina, una interleucina, una molécula de señalización de adhesión, una molécula de señalización de integrina, o un fragmento de los mismos o una combinación de los mismos en el andamiaje. Los métodos para cargar los ingredientes adicionales se han descrito con anterioridad en la sección de fabricación del dispositivo. En laFIG. 24se proporciona un método representativo para elaborar los andamiajes de la invención.

[0246] En una realización, se combina una mezcla de moléculas funcionales que contiene una mezcla 1:1 de las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T (por ejemplo, anticuerpo anti-CD3 y anticuerpo anti-CD28) con el andamiaje de MSR-SLB de tal manera que la relación de peso de las moléculas funcionales: MSR-SLB esté comprendida entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:20, preferiblemente entre aproximadamente 1:4 y aproximadamente 1:15, y particularmente entre aproximadamente 1:5 y aproximadamente 1:10. La relación de peso de la molécula activadora de células T y la molécula coestimuladora de células T puede ajustarse, por ejemplo, entre aproximadamente 5:1 y aproximadamente 1:5, mientras se mantiene la misma relación de peso seco entre las moléculas funcionales y el andamiaje de MSR-SLB.

[0247] Además, las realizaciones de la invención se refieren adicionalmente a métodos de elaboración de APC-MS ensamblando una pluralidad de andamiajes para generar pilas con suficiente porosidad para permitir la infiltración de células T, más específicamente, distintas subpoblaciones de células T auxiliares o células T citotóxicas.

MI. Métodos de uso de los andamiajes de la invención

[0248] Los andamiajes de la invención pueden usarse para varias aplicaciones incluyendo, entre otras, la manipulación de células efectoras diana, por ejemplo, células T, el aislamiento de una población específica de células efectoras, por ejemplo, una subpoblación de células T CD8+, el diagnóstico y la terapia de enfermedades, y la producción de composiciones y kits para el diagnóstico y la terapia de enfermedades.

Métodos para la manipulación de células diana

[0249] En una realización, la presente invención proporciona un método para manipular células efectoras diana o una subpoblación de las mismas (por ejemplo, células T auxiliares o células T citotóxicas). En este contexto, el término "manipulación" incluye, por ejemplo, activación, división, diferenciación, crecimiento, expansión, reprogramación, anergia, quiescencia, senescencia, apoptosis o muerte de las células efectoras diana.

[0250] En una realización, las células efectoras diana, por ejemplo, las células T, se manipulan (por ejemplo, se activan)in situproporcionando andamiajes de la invención de tal manera que las células efectoras diana entren en contacto con los andamiajes. Para facilitar el contacto, los andamiajes pueden implantarse en un sitio adecuado de un sujeto, por ejemplo, por vía subcutánea o intravenosa. En otras realizaciones, las células diana se manipulanex vivocultivando una muestra que contiene células efectoras diana con los andamiajes de la invención.

[0251] Puede manipularse una variedad de células efectoras diana, incluyendo, muestras frescas empleadas de sujetos, células primarias cultivadas, células inmortalizadas, líneas celulares, hibridomas, etc. Las células manipuladas pueden usarse para varias aplicaciones inmunoterapéuticas, así como para la investigación.

[0252] El sitio de manipulación de las células efectoras diana puede serin situoex situ.Así, en una realización, las células se manipulanin situ(por ejemplo, dentro del andamiaje). En este contexto, no es necesario que las células del andamiaje se retiren físicamente para manipularlas. En otra realización, las células se manipulanex situ(por ejemplo, retirando primero las células del andamiaje y manipulando las células retiradas). Cuando los andamiajes se implantan en un sujeto, las células pueden manipularse en el sitio del implante o cerca de él. En otras realizaciones, los andamiajes implantados pueden retirarse primero del sitio del implante y las células efectoras pueden manipularsein situoex situ,como se ha descrito anteriormente.

[0253] En ciertas realizaciones, los andamiajes usados en la manipulación de células efectoras pueden estar provistos de células presentadoras de antígeno (APC) y/o varios antígenos derivados de tales APC. Estos agentes secundarios (por ejemplo, APC o antígenos derivados de APC) pueden proporcionarse en la estructura del andamiaje 0 proporcionarse extrínsecamente, por ejemplo, en medios de cultivo. En ciertas realizaciones, los andamiajes pueden estar provistos de varios antígenos que atraen y/o reclutan APC. En las secciones anteriores se han proporcionado ejemplos representativos de tales moléculas atrayentes y/o reclutadoras.

[0254] Los andamiajes que contienen antígenos pueden usarse para manipular células efectoras dianain vivo.Para tales aplicaciones, los andamiajes pueden implantarse dentro de un vaso sanguíneo, en el tejido linfático, en el sitio del tumor, en el sitio de una enfermedad (por ejemplo, áreas que rodean tejidos afectados por artritis reumatoide) o subcutáneamente, de tal manera que las células efectoras diana entren en contacto con los andamiajes. Alternativamente, los andamiajes pueden inyectarse de manera mínimamente invasiva, por ejemplo, mediante aguja, catéter o similar. Puede permitirse que los andamiajes implantados permanezcan en el sitio del implante durante aproximadamente 0,5 días, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mes, 2 meses, 3, meses, 6 meses, 7,meses, 8 meses, 9 meses. 1 año, 2 años o más. Periódicamente, los andamiajes pueden ser explantados para estudiar, analizar o incluso manipular aún más las células efectoras.

[0255] En una realización relacionada, la presente invención se refiere a la manipulación de células efectoras específicas de antígenoin situ.En este contexto, los andamiajes de la presente invención pueden contener antígenos de interés que se adsorben en el andamiaje usando las mismas estrategias para adsorber las moléculas funcionales. Alternativamente, los andamiajes de la invención pueden incubarse con una muestra que contenga las células T efectoras específicas del antígeno en medios de cultivo junto con APC que presenten el antígeno de interés. A continuación, se permite que las células efectoras diana entren en contacto con los andamiajes y las moléculas funcionales contenidas en los andamiajes actúan conjuntamente para promover la manipulación de las células efectoras. Puramente como una realización representativa, como se describe en la sección de Ejemplos, una muestra que contiene células T se incuba con los andamiajes de la presente invención, que activa, coestimula y mantiene homeostáticamente las células efectoras diana. La muestra puede incubarse con el andamiaje durante aproximadamente de 1 día a 30 días, durante aproximadamente de 1 a 15 días o durante aproximadamente de 4 a 13 días, por ejemplo, durante aproximadamente 7-8 días, lo que da como resultado la manipulación selectiva de la población de células efectoras. Las células efectoras específicas de antígeno pueden manipularse adicionalmente seleccionando células basándose en la expresión de ciertos productos génicos, por ejemplo, receptores de células T (TCR) que reconocen el antígeno o las células presentadoras de antígeno de interés.

[0256] Las realizaciones descritas en la presente se refieren además a métodos para manipular células efectoras específicas de antígenoexsitu,en donde los andamiajes están provistos de APC que expresan el antígeno de interés o el propio antígeno. El paso de manipulación puede llevarse a caboex situoin situ.

[0257] En otra realización, las células diana efectoras que son específicas del antígeno o APC pueden manipularse selectivamente sobre otras células efectoras (por ejemplo, favoreciendo las células T CD8+ sobre las células T CD4+). Por ejemplo, una muestra que contenga células T CD8+ (junto con células T CD4+) puede incubarse con los andamiajes de la presente invención fabricados mecánica o químicamente para permitir la infiltración y/o el secuestro de células T CD8+. Las células T CD8+ infiltradas y/o secuestradas pueden expandirse, activarse, proliferarse o cultivarse mediante técnicas conocidas en la técnica. Anteriormente se han descrito métodos representativos.

[0258] En otra realización, pueden no desearse las células diana efectoras que son específicas del antígeno o las APC (por ejemplo, células T reguladoras/supresoras) y se inducen para que experimenten apoptosis, anergia o muerte tras el contacto con los andamiajes de la presente invención. Por ejemplo, una muestra que contiene células T reguladoras (junto con otras células T) puede incubarse con los andamiajes de la presente invención que están fabricados mecánica o químicamente para permitir la infiltración y/o el secuestro de células T reguladoras/supresoras. Las células T infiltradas y/o secuestradas pueden eliminarse usando técnicas conocidas en la técnica.

[0259] En este contexto, la identidad de las células que se han infiltrado y/o están secuestradas en los andamiajes de la invención puede determinarse adicionalmente usando técnicas conocidas en la técnica. Así, en una realización, el producto génico para identificar o seleccionar células T activadas puede ser un marcador de superficie celular o una citoquina, o una combinación de los mismos. Los marcadores de superficie celular para identificar células T activadas incluyen, entre otros, CD69, CD4, CD8, CD25, HLA-DR, CD28 y CD134. CD69 es un marcador de activación temprana que se encuentra en linfocitos B y T, células NK y granulocitos. CD25 es un receptor de IL-2 y es un marcador de células T y células B activadas. CD4 es un coreceptor del TCR y es marcador de timocitos, células T de tipo TH1 y TH2, monocitos y macrófagos. El CD8 también es un coreceptor del TCR y es un marcador de las células T citotóxicas. CD134 se expresa solamente en células T CD4+ activadas.

[0260] Los marcadores de superficie celular para seleccionar células T activadas incluyen, entre otros, CD36, CD40 y CD44. CD28 actúa como una vía de activación de células T estimuladoras independiente de la vía del receptor de células T y se expresa en células CD4+ y CD8+. CD36 es una glicoproteína de membrana y es un marcador de plaquetas, monocitos y células endoteliales. CD40 es un marcador de células B, macrófagos y células dendríticas. CD44 es un marcador de macrófagos y otras células fagocíticas. Los subconjuntos de células T pueden aislarse usando selección positiva, selección negativa o una combinación de las mismas para la expresión de productos génicos de la superficie celular de células T auxiliares o células T citotóxicas (por ejemplo,<c>D4 frente a CD8). Las citoquinas para identificar células T activadas de la presente invención incluyen, entre otras, citoquinas producidas por células T de tipo TH1 (respuesta mediada por células) y células T de tipo TH2 (respuesta de anticuerpos). Las citoquinas para identificar células T de tipo t H1 activadas incluyen, entre otras, IL-2, interferón gamma (y IFN) y factor de necrosis tisular alfa (TNFa). Las citoquinas para identificar células T de tipo TH2 activadas incluyen, pero no se limitan a, IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13. Los subconjuntos de células T también pueden aislarse usando selección positiva, selección negativa o una combinación de las mismas para la expresión de productos génicos de citoquinas de células T auxiliares o citotóxicas (por ejemplo,<y>IFN frente a lL4).

[0261] Una célula T de tipo TH1 activada específica para un antígeno de interés puede aislarse identificando células que expresan CD69, CD4, CD25, IL-2, IFNy, TNFa, o una combinación de las mismas. Una célula T de tipo TH1 activada específica para un antígeno de interés también puede aislarse identificando células que expresen CD69 y CD4 junto con IFN<y>o TNFa. Una célula T de tipo TH2 activada específica para un antígeno de interés puede aislarse identificando células que expresen CD69, CD4, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, o una combinación de las mismas. Una combinación de una célula T de tipo TH1 activada y una célula T de tipo TH2 específica para un antígeno de interés puede aislarse identificando células que expresen CD69, CD4, CD25, IL-2, IFNy, TNFa, o una combinación de las mismas, y células que expresen CD69, CD4, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, o una combinación de las mismas.

[0262] Los productos génicos usados para la selección positiva o negativa de las células T activadas de la presente invención pueden identificarse mediante técnicas de inmunoselección conocidas por los expertos en la materia que utilizan anticuerpos, incluyendo, entre otras, la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), la clasificación magnética de células, el barrido y la cromatografía. La inmunoselección de dos o más marcadores en células T activadas puede realizarse en uno o más pasos, en donde cada paso selecciona positiva o negativamente uno o más marcadores. Cuando la inmunoselección de dos o más marcadores se realiza en un paso usando FACS, los dos o más anticuerpos diferentes pueden marcarse con fluoróforos diferentes. Alternativamente, como se ha descrito anteriormente, las células pueden seleccionarse usando microperlas.

[0263] Para productos génicos expresados en la superficie celular, el anticuerpo puede unirse directamente al producto génico y puede usarse para la selección celular. Para productos génicos de la superficie celular expresados a concentraciones bajas, para la selección celular pueden usarse liposomas magnetofluorescentes. A bajos niveles de expresión, los anticuerpos convencionales marcados con fluorescencia pueden no ser lo suficientemente sensibles como para detectar la presencia del producto génico expresado en la superficie celular. Los liposomas que contienen fluoróforos pueden conjugarse con anticuerpos con la especificidad de interés, permitiendo de este modo la detección de los marcadores de la superficie celular.

[0264] Para productos génicos intracelulares, como citoquinas, el anticuerpo puede usarse después de permeabilizar las células. Alternativamente, para evitar la muerte de las células por permeabilización, el producto génico intracelular, si finalmente es secretado de la célula, puede detectarse a medida que es secretado a través de la membrana celular usando un anticuerpo de "captura" en la superficie celular. El anticuerpo de captura puede ser un anticuerpo doble que es específico para dos antígenos diferentes: (i) el producto génico secretado de interés y (ii) una proteína de la superficie celular. La proteína de superficie celular puede ser cualquier marcador de superficie presente en las células T, en particular, o en los linfocitos, en general (por ejemplo, CD45). El anticuerpo de captura puede unirse primero a la proteína de la superficie celular y luego unirse al producto génico intracelular de interés a medida que se secreta a través de la membrana, reteniendo de este modo el producto génico en la superficie celular. A continuación, puede usarse un anticuerpo marcado específico para el producto génico capturado para unirse al producto génico capturado, lo que permite la selección de la célula T activada. En la superficie celular también se encuentran expresadas a baja concentración ciertas formas de citoquinas. Por ejemplo, el y IFN se muestra a baja concentración en la superficie celular con una cinética similar a la de la expresión intracelular de y IFN (Assenmacher, et al. Eur J. Immunol, 1996, 26:263-267). Para las formas de citoquinas expresadas en la superficie celular, para detectar la citoquina de interés pueden usarse anticuerpos convencionales marcados con fluorescencia o liposomas que contengan fluoróforos. Un experto en la materia reconocerá otras técnicas para detectar y seleccionar productos génicos extracelulares e intracelulares específicos de células T activadas.

[0265] Las células T aisladas por los métodos de la presente invención pueden enriquecerse en por lo menos un 40%-90% a partir de sangre completa. Las células T también pueden enriquecerse en por lo menos un 95% a partir de sangre completa. Las células T también pueden enriquecerse por lo menos en un 98% a partir de sangre completa. Las células T también pueden enriquecerse por lo menos en un 99,5% a partir de sangre completa. En la manipulaciónin situoex situde células B pueden usarse métodos similares. En ciertas realizaciones, las células crioconservadas se descongelan y lavan como se describe en la presente y se dejan reposar durante una hora a temperatura ambiente antes de la activación.

[0266] Dependiendo de la aplicación, pueden ajustarse las relaciones de peso seco de los andamiajes con la muestra celular. Por ejemplo, la relación del peso seco de andamiaje: célula puede variar entre 1:500 y 500:1 y para manipular las células efectoras puede usarse cualquier valor entero intermedio. Como pueden apreciar fácilmente los expertos en la materia, la relación entre el andamiaje y las células puede depender del tamaño del andamiaje con respecto a la célula diana.

Expansión de la población de células T

[0267] En una realización relacionada, la presente invención se refiere además a métodos para expandir células T de una población de células inmunitarias, por ejemplo, expandir células T contenidas en una muestra que contiene células B, células dendríticas, macrófagos, células plasmáticas y similares. En otra realización, la presente invención también se refiere a métodos para expandir una población específica de células T, por ejemplo, expandir células T citotóxicas a partir de una muestra que contiene células T auxiliares, células T asesinas naturales, células T reguladoras/supresoras, y similares. La subpoblación específica de células T puede usarse posteriormente en varias aplicaciones inmunoterapéuticas. Sin querer estar limitados por ninguna teoría particular, se cree que los APC-MS de la presente invención son particularmente eficaces para la expansión de células T porque el tamaño relativamente grande y la alta relación de aspecto de las varillas de sílice mesoporosa permiten la formación de grandes grupos de células T que interactúan con cada varilla, lo que puede promover la expansión efectiva de células T permitiendo interacciones célula T/célula T y/o señalización paracrina.

[0268] En una realización, las células efectoras diana, por ejemplo, células T, se expanden (por ejemplo, crecen o se diferencian)in situproporcionando andamiajes de la invención de tal manera que las células efectoras diana entren en contacto con los andamiajes. Para facilitar el contacto, los andamiajes pueden implantarse en un sitio adecuado de un sujeto, por ejemplo, por vía subcutánea o intravenosa. En otras realizaciones, las células diana se expandenexvivocultivando una muestra que contiene células efectoras diana con los andamiajes de la invención. En una realización, la expansión de células T ex vivo puede llevarse a cabo aislando primero las células T de una muestra y estimulando posteriormente las células T mediante contacto con los andamiajes de la invención, de tal manera, que las células T efectoras se activen, coestimulen y mantengan homeostáticamente.

[0269] En una realización de la invención, las células T son células T primarias obtenidas de un sujeto. Se pretende que el término "sujeto" incluya organismos vivos en los que puede provocarse una respuesta inmunitaria (por ejemplo, mamíferos). Ejemplos de sujetos incluyen humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas no humanas de los mismos. Las células T pueden obtenerse de una variedad de fuentes, como células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre de cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, tejido del bazo y tumores. En ciertas realizaciones de la presente invención, puede usarse cualquier cantidad de células T primarias y/o líneas de células T disponibles en la técnica.

[0270] Los estudios sobre recuentos de sangre completa revelan que la cantidad de células T en sangre completa es muy baja. Por ejemplo, de acuerdo con el catálogo de productos publicado por Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, CA<n>A<d>A (Documento N° 23629, VERSION 2.1.0), la población de leucocitos en sangre completa es de aproximadamente un 0,1-0,2% (debido al predominio de eritrocitos), de los cuales las células T constituyen aproximadamente 7-24% de la población total de leucocitos. Entre las células T, las células T CD4+ constituyen aproximadamente el 4-20% de la población total de leucocitos (lo que se traduce en menos del 0,04% de la población total de células en sangre completa) y las células T CD8+ constituyen aproximadamente el 2-11% de la población total de leucocitos (lo que se traduce en menos del 0,022% de la población total de células en sangre completa). Por tanto, en ciertas realizaciones de la presente invención, los métodos de la invención pueden acoplarse con otras técnicas conocidas en la técnica para el enriquecimiento de células diana. El paso de enriquecimiento puede llevarse a cabo antes de poner en contacto la muestra con los andamiajes de la presente invención. En otra realización, el paso de enriquecimiento puede llevarse a cabo después de que se haya puesto en contacto la muestra con los andamiajes de la presente invención.

[0271] En una realización, la población de células efectoras puede enriquecerse usando la separación de FICOLL. En una realización, las células de la sangre circulante de un individuo se obtienen por aféresis o leucaféresis. El producto de aféresis contiene típicamente linfocitos, incluyendo células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. Las células recogidas por aféresis pueden lavarse para eliminar la fracción plasmática y colocar las células en un tampón o medio apropiado para los pasos de procesamiento posteriores. A continuación, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Alternativamente, la solución de lavado carece de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos, si no de todos, los cationes divalentes. También puede usarse una centrifugadora semiautomática de "flujo continuo" de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del lavado, las células pueden volver a suspenderse en varios tampones biocompatibles, como, por ejemplo, PBS sin Ca ni Mg. Alternativamente, pueden eliminarse los componentes indeseables de la muestra de aféresis y volver a suspender las células directamente en medios de cultivo.

[0272] En otra realización, las células T periféricas o de sangre completa pueden enriquecerse lisando los glóbulos rojos y agotando los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente PERCOLL™. Adicionalmente, puede aislarse una subpoblación específica de células T, como las células T CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ y CD45RO+, mediante técnicas de selección positiva o negativa.

[0273] De acuerdo con la presente invención, opcionalmente pueden emplearse varias técnicas de clasificación. Por ejemplo, la población de células T expandida o manipulada puede clasificarse adicionalmente usando una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie exclusivos de las células. Un método preferido es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética o citometría de flujo que usa un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de superficie celular presentes en las células seleccionadas. Por ejemplo, para enriquecer las células CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales incluye típicamente anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. En ciertas realizaciones, puede ser deseable enriquecer o seleccionar negativamente células T reguladoras que típicamente expresan CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ y FoxP3+.

[0274] Para el aislamiento de una población deseada de células, puede variarse la concentración de células y la superficie del andamiaje. En ciertas realizaciones, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que los andamiajes y las células se mezclan entre sí (es decir, aumentar la concentración de células), para garantizar el máximo contacto de células y andamiajes. Por ejemplo, en una realización, se usa una concentración de 2.000 millones de células/ml. En una realización, se usa una concentración de 1.000 millones de células/ml. En una realización adicional, se usan más de 100 millones de células/ml. En una realización adicional, se usa una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. En otra realización más, se usa una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. En realizaciones adicionales, pueden usarse concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml. El uso de concentraciones elevadas puede dar como resultado un aumento del rendimiento celular, la activación celular y la expansión celular. Además, el uso de concentraciones altas de células permite una captura más eficaz de células que pueden expresar débilmente antígenos diana de interés, como células T negativas para CD28, o de muestras en las que hay muchas células tumorales (es decir, sangre leucémica, tejido tumoral, etc.). Tales poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas. Por ejemplo, el uso de una concentración alta de células permite una selección más eficiente de células T CD8+ que normalmente tienen una expresión de CD28 más débil.

[0275] En una realización relacionada, puede ser deseable usar concentraciones más bajas de células. Esto puede lograrse reduciendo la relación andamiaje/célula, de tal manera que se minimicen las interacciones entre los andamiajes y las células. Este método selecciona las células que expresan cantidades elevadas de antígenos deseados que se unirán a los andamiajes. Por ejemplo, las células T CD4+ expresan niveles más altos de CD28 y se capturan de manera más eficaz que las células T CD8+ en concentraciones diluidas. En una realización, la concentración de células usada es de 5x106/ml. En otras realizaciones, la concentración usada puede ser de aproximadamente 1x105/ml a 1x109/ml, y cualquier valor entero intermedio, por ejemplo, de 1x105/ml a 1x108/ml, de 1x106/ml a 1x107/ml, de 1x107/ml a 1x109/ml.

[0276] En una realización, la presente invención puede incluir procedimientos conocidos en la técnica para la preparación de muestras. Por ejemplo, las células T pueden congelarse después del paso de lavado y descongelarse antes de su uso. La congelación y posterior descongelación proporciona un producto más uniforme al eliminar los granulocitos y, en cierta medida, los monocitos de la población celular. Después de la fase de lavado que elimina el plasma y las plaquetas, las células pueden suspenderse en una solución de congelación. Aunque en la técnica se conocen muchas soluciones y parámetros de congelación y serán útiles en este contexto, un método implica el uso de PBS que contiene 20% de DMSO y 8% de albúmina de suero humano, u otros medios de congelación celular adecuados que contengan por ejemplo, HESPAN y PLASMALYTE A, luego las células se congelan a -80° C a una velocidad de 1° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un depósito de almacenamiento de nitrógeno líquido. Pueden usarse otros métodos de congelación controlada, así como la congelación incontrolada inmediata a -20° C o en nitrógeno líquido.

[0277] En el contexto de la invención también se contempla la recogida de muestras de sangre o producto de leucaféresis de un sujeto en un periodo de tiempo anterior a cuando las células expandidas como se describe en la presente puedan ser necesarias. Como tal, la fuente de las células a expandir puede ser recogida en cualquier punto temporal necesario, y las células deseadas, tales como células T, aislarse y congelarse para su uso posterior en terapia de células T para cualquier número de enfermedades o afecciones que se beneficiarían de la terapia de células T, como las descritas en la presente. En una realización, se toma una muestra de sangre o una leucaféresis de un sujeto generalmente sano. En ciertas realizaciones, se toma una muestra de sangre o una leucaféresis de un sujeto generalmente sano que está en riesgo de desarrollar una enfermedad, pero que aún no ha desarrollado una enfermedad, y las células de interés se aíslan y congelan para su uso posterior. En ciertas realizaciones, las células T pueden expandirse, congelarse y usarse en un momento posterior. En ciertas realizaciones, las muestras se recogen de un paciente poco después del diagnóstico de una enfermedad particular como se describe en la presente, pero antes de cualquier tratamiento. En una realización adicional, las células se aíslan de una muestra de sangre o de una leucaféresis de un sujeto antes de cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes incluyendo, entre otras, al tratamiento con agentes como agentes antivirales, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228 e irradiación. Estos fármacos o inhiben la fosfatasa calcineurina dependiente del calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la quinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina). (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 199l; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993; Isoniemi (supra)). En una realización adicional, las células se aíslan para un paciente y se congelan para su uso posterior junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después de) un trasplante de médula ósea, una terapia ablativa de células T usando agentes quimioterapéuticos como fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos como OKT3 o CAMPAT<h>. En otra realización, las células se aíslan antes y pueden congelarse para su uso posterior para el tratamiento después de la terapia ablativa de células B, como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan.

[0278] En una realización adicional de la presente invención, las células T se obtienen de un paciente directamente después del tratamiento. A este respecto, se ha observado que después de ciertos tratamientos contra el cáncer, en particular tratamientos con fármacos que dañan el sistema inmunitario, poco después del tratamiento durante el periodo en el que los pacientes normalmente se estarían recuperando del tratamiento, la calidad de las células T obtenidas puede ser óptima o mejorada para su capacidad de expandirseex vivo.De igual manera, después de la manipulación ex vivo usando los métodos descritos en la presente, estas células pueden encontrarse en un estado preferido para mejorar el injerto y la expansiónin vivo.Así, dentro del contexto de la presente invención se contempla recoger células sanguíneas, incluyendo células T, células dendríticas u otras células del linaje hematopoyético, durante esta fase de recuperación. Además, en ciertas realizaciones, pueden usarse la movilización (por ejemplo, movilización con GM-CSF) y los regímenes de acondicionamiento para crear una condición en un sujeto en la que se favorezca la repoblación, recirculación, regeneración y/o expansión de tipos celulares particulares, especialmente durante una ventana de tiempo definida después de la terapia. Los tipos celulares ilustrativos incluyen células T, células B, células dendríticas y otras células del sistema inmunitario.

[0279] Los andamiajes que contienen cualquier relación de moléculas activadoras de células T: las moléculas coestimuladoras de células T pueden usarse de acuerdo con los presentes métodos. En una realización, en la que la molécula activadora de células T y las moléculas coestimuladoras de células T son ambas anticuerpos, puede usarse una relación de 1:1 de cada anticuerpo. En una realización, la relación de anticuerpo CD3: CD28 unido a los andamiajes varía de 100:1 a 1:100 y todos los valores enteros intermedios. En un aspecto de la presente invención, se une más anticuerpo anti-CD28 a los andamiajes que anticuerpo anti-CD3, es decir, la relación de CD3: CD28 es menor de uno. En ciertas realizaciones de la invención, la relación de anticuerpo anti CD28 a anticuerpo anti CD3 unido a los andamiajes es mayor de 2:1. En una realización particular, se usa una relación de CD3: CD28 de 1:100 de anticuerpo unido a los andamiajes. En otra realización, se usa una relación de CD3: CD28 de 1:75 de anticuerpo unido a los andamiajes. En otra realización, se usa una relación de CD3: CD28 de 1:50 de anticuerpo unido a los andamiajes. En otra realización, se usa una relación de CD3:CD28 de 1:30 de anticuerpo unido a los andamiajes. En una realización preferida, se usa una relación de CD3: CD28 de 1:10 de anticuerpo unido a los andamiajes. En otra realización, se usa una relación de CD3: CD28 de 1:3 de anticuerpo unido a los andamiajes. En otra realización, se usa una relación de CD3: CD28 de 3:1 de anticuerpo unido a los andamiajes.

[0280] Un aspecto de la presente invención se deriva del sorprendente descubrimiento de que el método confiere una mayor expansión de la población de células T después de aproximadamente 1 semana de contacto con el andamiaje en comparación con un andamiaje de control que contiene la capa base que contiene microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial y la bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua pero que no contiene las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T. En una realización, de acuerdo con los métodos de la invención, se observó un aumento de aproximadamente 10 veces a 1000 veces, preferiblemente de 50 veces a 500 veces, o más, en la expansión de la población de células T después de aproximadamente 1 semana de contacto con el andamiaje en comparación con un andamiaje de control que contiene la capa base que contiene microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial y la bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua pero que no contiene las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T.

[0281] Otro aspecto de la presente invención se deriva del sorprendente descubrimiento de que el método confiere una mayor expansión de la población de células T después de aproximadamente 1 semana de contacto con el andamiaje en comparación con una partícula polimérica esférica superparamagnética (DYNABEAD) que contiene las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T. En una realización, de acuerdo con los métodos de la invención, se observó un aumento de aproximadamente 2 a 100 veces, preferiblemente de aproximadamente 5 a 20 veces, o más, en la expansión de la población de células T después de aproximadamente 1 semana de contacto con el andamiaje en comparación con una partícula polimérica esférica superparamagnética (DYNABEAD) que contiene las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T.

[0282] Otro aspecto más de la presente invención se deriva del sorprendente descubrimiento de que la manipulación de las células T de acuerdo con los métodos mencionados anteriormente mejora la actividad metabólica de las células T. En particular, se observó una mejora de la actividad metabólica de las células T después de 1 semana de contacto con el andamiaje en comparación con un andamiaje de control que contenía la capa base que contenía microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial y la bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua pero que no contenía las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T. En una realización, de acuerdo con los métodos de la invención, se observó una mejora de aproximadamente 2 veces a 100 veces, preferiblemente de aproximadamente 5 veces a 20 veces, o más, en la actividad metabólica de la población de células T después de aproximadamente 1 semana de contacto con el andamiaje en comparación con un andamiaje de control que comprende la capa base que comprende microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial y la bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua pero que no contiene las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T.

[0283] Otro aspecto de la presente invención se deriva del sorprendente descubrimiento de que el método confiere una mejor actividad metabólica de la población de células T después de aproximadamente 1 semana de contacto con el andamiaje en comparación con una partícula polimérica esférica superparamagnética (DYNABEAD) que contiene las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T. En una realización, de acuerdo con los métodos de la invención, se observó un aumento de aproximadamente 1 vez (por ejemplo, un aumento del 100%) a 20 veces, preferiblemente un aumento de 2 veces a 10 veces, o un aumento mayor, en la expansión de la población de células T después de aproximadamente 1 semana de contacto con el andamiaje en comparación con una partícula polimérica esférica superparamagnética (DYNABEAD) que contiene las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T.

[0284] Además, de acuerdo con los métodos de la invención, se descubrió que las células T expandidas son metabólicamente activas durante por lo menos aproximadamente 7 días después del contacto con el andamiaje. La actividad metabólica de las células T se midió mediante técnicas rutinarias, por ejemplo, analizando los niveles de producción de citoquinas o monitorizando las duplicaciones celulares. Además, de acuerdo con los métodos de la invención, las células T expandidas formaron agregados más grandes y estables (por ejemplo, que duraban más) que los andamiajes de control. Por ejemplo, en un experimento, las células T expandidas formaron agregados estables durante por lo menos aproximadamente 7 días después del contacto con el andamiaje, mientras que los agregados se habían disgregado considerablemente en las muestras incubadas con el andamiaje de control que contenía sólo la capa base de MSR y la capa de SLB.

[0285] Realizaciones adicionales de la invención se refieren a métodos para obtener una población policlonal de células CD8+, que comprenden, poner en contacto los andamiajes de la invención con una muestra biológica de un sujeto, activando, coestimulando, manteniendo homeostáticamente y opcionalmente expandiendo de este modo una población de células T presentes en la muestra; poner en contacto las células T de la muestra con un reactivo para la detección de células CD8+; y aislar de la muestra una subpoblación de células T CD8+ detectadas.

[0286] En una realización relacionada, la presente invención se refiere a métodos para obtener una población policlonal de células CD4+, que comprenden, poner en contacto los andamiajes de la invención con una muestra biológica de un sujeto, activando, coestimulando, manteniendo homeostáticamente y opcionalmente expandiendo de este modo una población de células T presentes en la muestra; poner en contacto las células T de la muestra con un reactivo para la detección de células CD4+; y aislar una subpoblación de células T CD4+ detectadas de la muestra.

[0287] En una realización relacionada, la presente invención se refiere a métodos para obtener una población policlonal de células CD4+/FOXP3+ o CD4+/FOXP3-. El método comprende poner en contacto los andamiajes de la invención con una muestra biológica de un sujeto, activando, coestimulando, manteniendo homeostáticamente y opcionalmente expandiendo de este modo una población de células T presentes en la muestra; poner en contacto las células T en la muestra con un reactivo para la detección de células CD4+; poner en contacto además las células T con un reactivo para la detección de células FOXP3+; y aislar una subpoblación de células T CD4+/FOXP3+ o CD4+/FOXP3- detectadas de la muestra. En estas realizaciones, el reactivo para la detección y/o aislamiento de células T CD4+ y/o FOXP3+ es preferiblemente un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a los marcadores CD4+ y FOXP3. En este contexto, en la medida en que FOXP3 se reconoce como un regulador maestro de la vía reguladora en el desarrollo y la función de las células T reguladoras (que disminuyen la respuesta inmunitaria), puede ser deseable aislar células FOXP3+ para ciertas aplicaciones y células FOXP3- para otras aplicaciones. Por ejemplo, en aplicaciones de terapia contra el cáncer, puede ser deseable eliminar o reducir la actividad de las células T reguladoras en las composiciones farmacéuticas de células T. Por consiguiente, los métodos pueden adaptarse para seleccionar células FOXP3. Alternativamente, en el contexto del tratamiento de enfermedades autoinmunes, puede ser deseable aumentar la actividad de células T reguladoras en las composiciones farmacéuticas de células T (ya que la actividad atenuada de células T reguladoras puede estar contribuyendo a la afección autoinmune del organismo). Por consiguiente, en tales casos, los métodos de formulación pueden modificarse para seleccionar positivamente e incluir células FOXP3+.

[0288] En otra realización más, la presente invención se refiere a un método para obtener una población policlonal de células T efectoras y/o de memoria efectoras. El método comprende poner en contacto los andamiajes de la invención con una muestra biológica de un sujeto, activando, coestimulando, manteniendo homeostáticamente y opcionalmente expandiendo de este modo una población de células T presentes en la muestra; poner en contacto las células T de la muestra con un reactivo para la detección de células CD44+; poner en contacto además las células T con un reactivo para la detección de CD62L; y aislar una subpoblación de células T CD4+//CD62L+ o CD4+//CD62L-detectadas de la muestra. En estas realizaciones, las células T efectoras y/o de memoria son preferiblemente CD4+//CD62L-.

[0289] En otra realización más, la presente invención se refiere a un método para obtener una población policlonal de células T CD8+ activadas. El método comprende poner en contacto los andamiajes de la invención con una muestra biológica de un sujeto, activando, coestimulando, manteniendo homeostáticamente y opcionalmente expandiendo de este modo una población de células T presentes en la muestra; poner en contacto las células T de la muestra con un reactivo para la detección de células CD8+; poner en contacto además las células T con un reactivo para la detección de CD69+; y aislar de la muestra una subpoblación de células T CD8+//CD69+ o CD8+//CD69- detectadas. En estas realizaciones, las células T activadas son preferiblemente CD8+/CD69+.

[0290] En otra realización más, la presente invención se refiere a un método para obtener una población policlonal de células T secretoras de citotoxinas. El método comprende poner en contacto los andamiajes de la invención con una muestra biológica de un sujeto, activando, coestimulando, manteniendo homeostáticamente y opcionalmente expandiendo de este modo una población de células T presentes en la muestra; poner en contacto las células T de la muestra con un reactivo para la detección de células CD8+; poner en contacto además las células T con un reactivo para la detección de granzima B; y aislar de la muestra una subpoblación de células T CD8+//granzima B+ o CD8+//Granzima B- detectadas. En estas realizaciones, las células T secretoras de citotoxinas son preferible¡'¡¡mente CD8+/Granzima B+.

[0291] En otra realización más, la presente invención se refiere a un método para obtener una población policlonal de células T secretoras de citoquinas activadoras. El método comprende poner en contacto los andamiajes de la invención con una muestra biológica de un sujeto, activando, coestimulando, manteniendo homeostáticamente y opcionalmente expandiendo de este modo una población de células T presentes en la muestra; poner en contacto las células T de la muestra con un reactivo para la detección de IFNy+; y aislar una subpoblación de células T IFNy+ detectadas de la muestra. En estas realizaciones, las células T son preferiblemente células secretoras de IFN<y>.

[0292] En otra realización más, la presente invención se refiere a un método para obtener una población policlonal de células T de memoria. El método comprende poner en contacto los andamiajes de la invención con una muestra biológica de un sujeto, activando, coestimulando, manteniendo homeostáticamente y opcionalmente expandiendo de este modo una población de células T presentes en la muestra; poner en contacto las células T de la muestra con un reactivo para la detección de células T CD62L+CCR7+; y aislar una subpoblación de células T CD62L+CCR7+ detectadas de la muestra. En estas realizaciones, las células T son preferiblemente células T de memoria central CD4+ CD62L+CCR7+. Véase, Okada et al., Int Immunol., 20(9):1189-99, 2008. En otra realización, la presente invención se refiere a un método para obtener una población policlonal de células T de memoria que comprende poner en contacto los andamiajes de la invención con una muestra biológica de un sujeto, activando, coestimulando, manteniendo homeostáticamente y opcionalmente expandiendo de este modo una población de células T presentes en la muestra; poner en contacto las células T de la muestra con un reactivo para la detección de células T CD62L+CCR7+; y aislar de la muestra una subpoblación de células T CD62L-CCR7- detectadas. En estas realizaciones, las células T CD62L-CCR7- son células T efectoras de memoria. Véase, Sallusto et al., Nature 401: 708-712, 1999.

[0293] En otra realización más, la presente invención se refiere aun método para detectar y/o eliminar una población policlonal de células T agotadas de una muestra. El método comprende poner en contacto los andamiajes de la invención con una muestra biológica de un sujeto, activando, coestimulando, manteniendo homeostáticamente y opcionalmente expandiendo de este modo una población de células T presentes en la muestra; poner en contacto las células T de la muestra con un reactivo para la detección de células T CD8+; poner en contacto además las células T con un reactivo para la detección de células T PD-1+; y aislar una subpoblación de células T CD8+/ PD-1+ detectadas de la muestra. Las células T CD8+/ PD-1+, que indican células agotadas, pueden eliminarse opcionalmente de la muestra.

[0294] En otra realización para detectar y/o eliminar células T de una muestra, la presente invención proporciona un método que comprende poner en contacto los andamiajes de la invención con una muestra biológica de un sujeto, activando, coestimulando, manteniendo homeostáticamente y opcionalmente expandiendo de este modo una población de células T presentes dentro de la muestra; poner en contacto las células T de la muestra con un reactivo para la detección de un receptor coinhibidor en las células T; y aislar de la muestra una subpoblación de células T que expresan el receptor coinhibidor. La expresión del receptor coinhibidor indica generalmente células agotadas, que pueden eliminarse opcionalmente de la muestra. En estas realizaciones, el receptor coinhibidor es un receptor seleccionado del grupo que consiste en CTLA-4, TIM3, LAG3, 2B4, BTLA, CD160 y KLRG1. Véase, Legat et al., Front Immunol., 2013 Dec 19;4:455

[0295] En las realizaciones mencionadas anteriormente, los reactivos para la detección y/o aislamiento de células son preferiblemente anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, por ejemplo, anticuerpos que se unen específicamente a los marcadores mencionados anteriormente, por ejemplo, CD8, CD4, FOXP3, CD62L, PD-1, granzima B, etc. La detección de estos marcadores de superficie celular se lleva a cabo preferiblemente mediante análisis FACS.

[0296] La invención se refiere además al aislamiento de poblaciones de células T policlonales usando uno o más de los métodos mencionados anteriormente y detectando además la producción de una citoquina seleccionada del grupo que consiste en interferón gamma (IFNy), factor de necrosis tisular alfa (TNFa), IL-2, IL-1, IL-4, IL-5, IL-10, e IL-13, o una combinación de las mismas. Las citoquinas pueden permitir la validación de los métodos de aislamiento. Por ejemplo, cuando las células T manipuladas son células T auxiliares 1 (Th1), los métodos pueden comprender la detección de la producción de una citoquina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, interferón gamma (IFN<y>) y factor de necrosis tisular alfa (TNFa), o una combinación de los mismos. De igual manera, cuando las células T manipuladas son células T auxiliares 2 (Th2), el método comprende detectar la producción de una citoquina seleccionada del grupo que consiste en IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, o una combinación de las mismas. Además, cuando las células T manipuladas son células T (Tc) citotóxicas, los métodos pueden comprender además detectar la producción de una citoquina seleccionada del grupo que consiste en interferón gamma (IFN<y>) y linfotoxina alfa (LTa/TNFp), o una combinación de las mismas, opcionalmente junto con la detección de una citotoxina secretada seleccionada del grupo que consiste en una granzima o una perforina, o una combinación de las mismas.

[0297] Usando ciertas metodologías puede ser ventajoso mantener la estimulación a largo plazo de una población de células T después de la activación y estimulación inicial, separando las células T del estímulo después de un periodo de aproximadamente 12 a aproximadamente 14 días. La tasa de proliferación de células T se monitoriza periódicamente (por ejemplo, diariamente), por ejemplo, examinando el tamaño o midiendo el volumen de las células T, como con un contador Coulter. A este respecto, una célula T en reposo tiene un diámetro medio de aproximadamente 6,8 micras, y tras la activación y estimulación iniciales, en presencia del ligando estimulante, el diámetro medio de la célula T aumentará a más de 12 micras en el día 4 y empezará a disminuir en el día 6 aproximadamente. Cuando el diámetro medio de las células T disminuye a aproximadamente 8 micras, las células T pueden reactivarse y volver a estimularse para inducir una proliferación adicional de las células T. Alternativamente, la tasa de proliferación de células T y el tiempo para la reestimulación de células T pueden monitorizarse mediante el ensayo de la presencia de moléculas de superficie celular como un marcador de superficie celular seleccionado del grupo que consiste en CD69, CD4, CD8, CD25, CD62L, FOXP3, HLA-DR, CD28, y CD134, o una combinación de los mismos. Además, los métodos pueden complementarse analizando la presencia de moléculas de superficie que no sean células T, como CD36, CD40 y CD44, o una combinación de las mismas. En ciertos casos, los métodos pueden complementarse analizando la presencia de moléculas de superficie que no sean células T, como CD154, CD54, CD25, CD137, CD134, que se inducen en células T activadas.

Diagnóstico y terapia de enfermedades

[0298] El andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) descrito en la presente puede usarse en métodos para tratar una enfermedad o un trastorno en un sujeto. La enfermedad puede ser cáncer. La enfermedad puede ser un trastorno autoinmune. La enfermedad puede ser una enfermedad provocada por un patógeno.

[0299] Un sujeto con una enfermedad puede tratarse poniendo en contacto la muestra del sujeto que comprende una población de células T con el andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) de la invención, activando, coestimulando y manteniendo homeostáticamente de este modo la población de células T; opcionalmente expandir la población de células T; y administrar las células T activadas, coestimuladas, mantenidas y opcionalmente expandidas al sujeto, tratando de este modo la enfermedad en el sujeto. La población de células T puede ponerse en contacto con el andamiaje durante un periodo, por ejemplo, 0,5 días, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días, 25 días, 30 días, 35 días, 38 días, 45 días, 50 días, 60 días, o más, y las células contenidas en el mismo se manipulan usando una o más de las técnicas mencionadas con anterioridad. Los ejemplos de manipulación incluyen, por ejemplo, activación, división, diferenciación, crecimiento, expansión, reprogramación, anergia, quiescencia, senescencia, apoptosis, muerte, etc. No es necesario que las células se retiren físicamente del andamiaje para manipularlas. Así, los andamiajes pueden ponerse en contacto con la muestra del sujetoin situ(por ejemplo, implantando el andamiaje en el sujeto). En otras realizaciones, las células se manipulanex situ(por ejemplo, incubando el andamiaje y la muestra de sangre extraída del sujeto).

[0300] Las células T administradas al mamífero pueden tener entre aproximadamente 4 y aproximadamente 35 días, con lo que se promueve la regresión de la enfermedad en el mamífero. Las células T administradas pueden tener menos de 14 días, por ejemplo, de 7 a 21 días. Estos métodos proporcionan numerosas ventajas. Por ejemplo, se cree que las células T que tienen entre 4 y 14 días proporcionan una proliferación, supervivencia y actividadin vivomejoradas en comparación con las células T que tienen 60 días o más. El periodo de tiempo necesario para generar células T para la terapia celular adoptiva (ACT) puede acortarse de una media de aproximadamente 44 días a un intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 15 días (o menos de aproximadamente 35 días, por ejemplo, de aproximadamente 7 a aproximadamente 15 días). Por consiguiente, puede tratarse a más pacientes antes de que la carga de su enfermedad progrese aun estadio en el que la administración de TCA ya no sea segura o posible. Además, como el andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en métodos que no requieren pruebasin vitrode reactividad a antígenos específicos antes de la administración, estos métodos reducen el tiempo, los gastos y la mano de obra asociados con el tratamiento de los pacientes. Además, los métodos pueden administrar ventajosamente células T que se han agrupado a partir de cultivos a granel en lugar de las derivadas de microcultivos. Se cree que el desarrollo de un método más sencillo y más rápido para generar células T clínicamente eficaces contribuirá a un uso más generalizado de la terapia celular adoptiva. Los métodos también pueden utilizar ventajosamente cultivos de células T que podrían predecirse falsamente como no reactivosin vivomediante pruebasin vitrode reactividad a antígenos específicos. Como los cultivos de células T generados a partir de un único espécimen tumoral tienen varias reactividades específicas, la falta de pruebas de reactividad a antígenosin vitroevita ventajosamente tener que elegir sólo unos pocos cultivos de células T para expandir y, por lo tanto, proporciona un repertorio más diverso de reactividades tumorales para administrar al paciente. Las células T que tienen entre 4 y 30 días de edad también contienen una mayor diversidad de células y una frecuencia más alta de células activas/sanas que las células T. Además, uno o más aspectos (por ejemplo, pero no limitados a, el cultivo y/o la expansión) de los métodos pueden ser automatizables.

[0301] Una realización del método comprende cultivar células T autólogas. Se obtienen muestras tumorales de pacientes y se obtiene una suspensión de células individuales. La suspensión de células individuales puede obtenerse de cualquier manera adecuada, por ejemplo, mecánicamente (disgregando el tumor usando, por ejemplo, un disociador GENTLEMACS™, Miltenyi Biotec, Auburn, Calif.) o enzimáticamente (por ejemplo, colagenasa o DNasa). Las suspensiones de células individuales de los digeridos enzimáticos tumorales se cultivan en andamiajes o andamiajes de la invención. Las células se cultivan hasta su confluencia (por ejemplo, aproximadamente 2x106 linfocitos), por ejemplo, de aproximadamente 2 a aproximadamente 21 días, preferiblemente de aproximadamente 4 a aproximadamente 14 días. Por ejemplo, las células pueden cultivarse de 5 días, 5,5 días o 5,8 días, 6,0 días, 6,5 días, 7,0 días a 21 días, 21,5 días o 21,8 días, preferiblemente de 10 días, 10,5 días o 10,8 días a 14 días, 14,5 días o 14,8 días.

[0302] Una realización del método comprende expandir células T cultivadas. Las células T cultivadas se agrupan y se expanden rápidamente. La expansión rápida proporciona un aumento en el número de células T específicas de antígeno de por lo menos aproximadamente 10 veces (por ejemplo, 10-, 20-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, 90-, o 100 veces, o mayor) durante un periodo de aproximadamente 7 a aproximadamente 14 días, preferiblemente aproximadamente 14 días. Más preferiblemente, la expansión rápida proporciona un aumento de por lo menos aproximadamente 200 veces (por ejemplo, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o más) durante un período de aproximadamente 7 a aproximadamente 14 días, preferiblemente aproximadamente 14 días. Más preferiblemente, la expansión rápida proporciona un aumento de por lo menos aproximadamente 400 veces o más durante un periodo de 10 a 14 días, preferiblemente aproximadamente 14 días. Opcionalmente, las células pueden someterse a una expansión inicial en los andamiajes, tras la cual se someten a una expansión rápida. Con este protocolo de expansión en dos pasos, puede conseguirse un aumento de aproximadamente 1000 veces en un periodo de aproximadamente 7 a 14 días.

[0303] La expansión puede lograrse mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células T pueden expandirse rápidamente usando estimulación no específica del receptor de células T en presencia de linfocitos alimentadores e interleucina-2 (IL-2) o interleucina-15 (IL-15), prefiriéndose la IL-2. El estímulo no específico del receptor de células T puede incluir alrededor de 30 ng/ml de OKT3, un anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD3 (disponible en Ortho-McNeil®, Raritan, N.J.). Alternativamente, las células T pueden expandirse rápidamente mediante la estimulación de células mononucleares de sangre periférica (PBMCJin vitrocon uno o más antígenos (incluyendo porciones antigénicas de los mismos, como epítopos, o una célula) del cáncer, que pueden expresarse opcionalmente a partir de un vector, como un péptido de unión al antígeno leucocitario humano A2 (HLA-A2), por ejemplo, 0,3 pM M<a>RT-1:26-35 (27 L) o gp100:209-217 (210M), en presencia de un factor de crecimiento de células T, como 300 Ul/ml de IL-2 o IL-15, prefiriéndose la IL-2. Las células T inducidasinvitro se expanden rápidamente por reestimulación con el mismo antígeno o antígenos del cáncer pulsado sobre células presentadoras de antígeno que expresan HLA-A2. Alternativamente, las células T pueden volver a estimularse con linfocitos autólogos irradiados o con linfocitos alogénicos HLA-A2+ irradiados e IL-2, por ejemplo.

[0304] El andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en un método que comprende administrar al sujeto las células T expandidas, en donde las células T administradas al mamífero tienen de aproximadamente 4 a aproximadamente 35 días de edad. Por ejemplo, las células administradas pueden tener 6, 7 u 8 a 14, 15 o 16 días de edad. Las células T administradas al mamífero pueden tener de aproximadamente 4 a aproximadamente 29 días, de aproximadamente 7 a aproximadamente 15 días, o aproximadamente 10 días. A este respecto, las células T que pueden administrarse al mamífero son células T "jóvenes",es decir,células T mínimamente cultivadas.

[0305] Los cultivos de células T jóvenes que pueden administrarse al mamífero tienen ventajosamente características asociadas con la persistenciain vivo, la proliferación y la actividad antitumoral. Por ejemplo, los cultivos de células T jóvenes tienen una expresión más alta de CD27 y/o CD28 que las células T de aproximadamente 44 días de edad. Sin querer estar limitados por ninguna teoría en particular, se cree que CD27 y CD28 están asociados a la proliferación, la persistenciain vivoy un estado menos diferenciado de las células T (se cree que el aumento de la diferenciación de las células T afecta negativamente a la capacidad de las células T para funcionarin vivo).Se cree que las células T que expresan niveles más altos de CD27 tienen mejor actividad antitumoral que las células con niveles bajos de CD27. Además, los cultivos de células T jóvenes tienen una mayor frecuencia de células CD4+ que las células T de aproximadamente 44 días de edad.

[0306] Además, los cultivos de células T jóvenes tienen una longitud media de telómeros más larga que la de las células T de aproximadamente 44 días de edad. Sin querer estar limitados por una teoría en particular, se cree que las células T pierden una longitud de telómero estimada de 0,8 kb por semana en cultivo, y que los cultivos de células T jóvenes tienen telómeros que son aproximadamente 1,4 kb más largos que las células T que tienen aproximadamente 44 días de edad. Sin querer estar limitados por una teoría en particular, se cree que una mayor longitud de los telómeros está asociada a respuestas clínicas objetivas positivas en los pacientes y a la persistencia de las célulasin vivo.

[0307] Las células T pueden administrarse mediante cualquier vía adecuada conocida en la técnica. Preferiblemente, las células T se administran como infusión intraarterial o intravenosa, que dura preferiblemente de querer estar limitados por una teoría en particular 30 a querer estar limitados por una teoría en particular 60 minutos. Otros ejemplos de vías de administración incluyen la subcutánea, intraperitoneal, intratecal e intralinfática.

[0308] Pueden usarse varios modos de administración de las composiciones terapéuticas que comprenden las células expandidas. Las células expandidas pueden primero purificarse y luego administrarse a un sujeto. Alternativamente, las células expandidas pueden mezclarse con los andamiajes de la invención antes de su administración al sujeto. Bajo este enfoque alternativo, los andamiajes (APC-MS) pueden continuar estimulando las célulasin vivoy también pueden funcionar para manipular selectivamente las células sanguíneas completas diana en el entornoin vivo.

[0309] Los métodos pueden implicar la reestimulación de la población de células T antes del paso de administración.

El paso de reestimulación puede llevarse a cabo usando técnicas conocidas en la técnica. En una realización, el paso de reestimulación se lleva a cabo volviendo a incubar las células con la composición de andamiaje. En otra realización, la reestimulación se lleva a cabo mediante la adición de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA, 10 ng/ml, Sigma-Aldrich, Inc.), ionomicina (0,5 |jg/ml, Sigma-Aldrich, Inc.) y Brefeldina A (eBiosciences, Inc.). En otra realización, el paso de reestimulación se lleva a cabo mediante la inclusión de un antígeno (por ejemplo, un antígeno patógeno o un antígeno del cáncer) en el andamiaje o extrínsecamente en el cultivo.

[0310] Los métodos pueden llevarse a cabo manipulando células T que se obtienen de una muestra de sangre, una muestra de médula ósea, una muestra linfática o una muestra esplénica de un sujeto.

[0311] Por consiguiente, el andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en métodos para tratar el cáncer en un sujeto. El método puede comprender poner en contacto la muestra del sujeto que comprende una población de células T con el APC-MS de la invención, activando, coestimulando y manteniendo homeostáticamente de este modo la población de células T; opcionalmente expandir la población de células T; y administrar las células T activadas, coestimuladas, mantenidas y opcionalmente expandidas al sujeto, tratando de este modo el cáncer en el sujeto. Los andamiajes pueden estar provistos de un antígeno del cáncer. El antígeno del cáncer puede presentarse, por ejemplo, para su reconocimiento por las células T, en una molécula del MHC o un fragmento de la misma. En ciertos casos, pueden proporcionarse productos celulares completos.

[0312] Ejemplos representativos de antígenos de cáncer incluyen, entre otros, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, CEA, Tirosinasa, midkin, BAGE, CASP-8, p-catenina, p- catenina, Y-catenina, CA-125, CDK-1, CDK4, ESO-1, gp75, gp100, MART-1, MUC-1, MUM-1, p53, PAP, PSA, PSMA, ras, trp-1, HER-2, TRP-1, TRP-2, IL13Ralfa, IL13Ralfa2, AIM-2, AIM-3, NY-ESO-1, C9orf 112, SART1, SART2, SART3, BRAP, RTN4, GLEA2, TNKS2, KIAA0376, ING4, HSPH1, C13orf24, RBPSUH, C6orf153, NKTR, NSEP1, U2AF1L, CYNL2, TPR, SOX2, GOLGA, BMI1, COX-2, EGFRvlII, EZH2, LICAM, Livin, Livinp, MRP-3, Nestina, OLIG2, ART1, ART4, B-ciclina, Gli1, Cav-1, catepsina B, CD74, E-cadherina, EphA2/Eck, Fra-1/Fosl 1, GAGE-1, Gangliósido/GD2, GnT-V, p1,6-N, Ki67, Ku70/80, PROX1, PSCA, SOX10, SOX11, Survivina, UPAR, WT-1, Dipeptidil peptidasa IV (DPPIV), proteína de unión a adenosina desaminasa (AD Abp), ciclofilina b, antígeno asociado colorrectal (CRC)- C017-1A/GA733, receptor de células T/cadena CD3-zeta, familia G<a>GE de antígenos tumorales, RAGE, LAGE-I, NAG, GnT-V, RCASl, a-fetoproteína, pl20ctn, Pmel117, PRAME, glucógeno fosforilasa cerebral, SSX-I, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-I, SSX-4, SSX-5, SCP-I, CT-7, cdc27, proteína coli de la poliposis adenomatosa (APC), fodrina, PlA, conexina 37, idiotipo de Ig, pl5, GM2, gangliósidos GD2, familia Smad de antígenos tumorales, Imp-1, antígeno nuclear codificado por el VEB (EBNa )-I, transcrito 1 similar a la proteína de unión UL16 (Mult1), proteínas RAE-1, H60, MICA, MICB y c-erbB-2, o un péptido inmunogénico de los mismos, y combinaciones de los mismos.

[0313] El antígeno del cáncer puede ser un neoantígeno identificado en un paciente. Un determinante neoantigénico es un epítopo en un neoantígeno, que es un antígeno recién formado que no ha sido reconocido previamente por el sistema inmunitario. Los neoantígenos están asociados a menudo a antígenos tumorales y se encuentran en células oncogénicas. Los neoantígenos y, por extensión, los determinantes neoantigénicos pueden formarse cuando una proteína experimenta una modificación adicional dentro de una vía bioquímica como la glucosilación, la fosforilación o la proteólisis, lo que lleva a la generación de nuevos epítopos. Estos epítopos pueden ser reconocidos por anticuerpos separados y específicos. Véase, Schumacher et al., Science 348 (6230): 69-74, 2015. El neoantígeno puede detectarse de manera específica del paciente. Los métodos para detectar neoantígenos a partir de una muestra de paciente, por ejemplo, una muestra de sangre, se describen en el documento US 9,115,402. En una realización, el neoantígeno es un péptido derivado de SF3B1, MYD88, TP53, ATM, Abl, A FBXW7, a DDX3X, MAPK1, GNB1, CDK4, MUM1, CTNNB1, CDC27, TRAPPC1, TPI, ASCC3, HHAT, FN1, OS-9, PTPRK, CDKN2A, HLA-A11, GAS7, GAPDH, SIRT2, GPNMB, SNRP116, RBAF600, SNRPD1, Prdx5, CLPP, PPP1R3B, EF2, ACTN4, ME1, NF-YC, HLA-A2, HSP70-2, KIAA1440, CASP8, o una combinación de los mismos. Véase, Lu et al., Seminars in Immunology, 28(1), 22 27, 2016.

[0314] En la puesta en práctica de los métodos terapéuticos contra el cáncer esbozados anteriormente, puede ser ventajoso proporcionar andamiajes que se hayan fabricado con moléculas activadoras específicas de células T citotóxicas y moléculas coestimuladoras específicas de células T citotóxicas, opcionalmente junto con uno o más agentes adicionales que confieran activación, división, diferenciación, crecimiento, expansión o reprogramación de células T citotóxicas. Anteriormente se han proporcionado ejemplos representativos de tales moléculas y agentes.

[0315] En ciertas realizaciones, las células secuestradas y/o aisladas pueden modificarse genéticamente. En una realización, las células efectoras se modifican genéticamente para que expresen un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para CD19 (células CAR-T CD19). Este tipo particular de células T ha producido una alta tasa de remisión completa (RC) en pacientes adultos y pediátricos con leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL) recidivante y refractaria en pequeños ensayos clínicos de fase I. Véase, Turtle et al. (J Clin Invest., 126, 2123-38, 2016) y las referencias citadas en el mismo. También se han observado resultados favorables en ensayos clínicos de terapia con células CAR-T CD19 en linfoma no de Hodgkin (NHL) y leucemia linfocítica crónica (CLL). Estos estudios sugieren que la proliferación robusta de células CAR-T transferidas en el receptor se correlaciona con la respuesta clínica y que la persistencia prolongadain vivode células CAR-T funcionales puede prevenir la recaída de la enfermedad. Por consiguiente, el andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en métodos para formular composiciones de células T para la terapia contra el cáncer, que comprenden modificar genéticamente adicionalmente las células T obtenidas a partir de los andamiajes. La modificación genética puede mediarseexsituoinsitu.Para modificar genéticamente las células T puede usarse cualquier técnica, incluyendo, pero sin relacionarse con, el uso de vectores virales, plásmidos, sistemas detransposón/transposasa, ARNhc, ARNio, A<r>N antisentido, y similares. En algunas realizaciones, la célula T se ha modificado genéticamente usando un sistema de edición de genes (por ejemplo, un sistema CRISPR/Cas9). En algunas realizaciones, las células T aisladas se modifican genéticamente usando un sistema de administración viral. En algunas realizaciones, las células T aisladas se modifican genéticamente usando un sistema lentiviral. En algunas realizaciones, las células T aisladas se modifican genéticamente usando un sistema retroviral. En algunas realizaciones, las células T aisladas se modifican genéticamente usando un sistema adenoviral. En algunas realizaciones, las células T aisladas se ponen en contacto con un agente que promueve la interacción con el sistema de administración viral o el secuestro viral (por ejemplo, un agente que promueve interacciones mediadas por receptores con el sistema de administración viral o agentes que promueven interacciones electrostáticas con el sistema de administración viral).

[0316] En algunas realizaciones, las células T aisladas se modifican genéticamente usando un sistema de administración viralin situ.En las realizaciones en las que las células T aisladas se modifican genéticamentein situ, el andamiaje puede comprender un agente que promueva el secuestro viral. El agente o agentes que promueven el secuestro viral pueden estar presentes en la superficie de la bicapa lipídica del MSR-SLB mediante adsorción o por unión a un grupo de cabeza lipídico. En algunas realizaciones, el agente que promueve el secuestro viral es un péptido de fibronectina, como RetroNectin®. En algunas realizaciones, el agente que promueve el secuestro viral es un péptido anfipático, como Vectofusin-1®. En algunas realizaciones, el andamiaje puede comprender además una molécula activadora de células T, una molécula coestimuladora de células T y/o un agente homeostático de células T. Sin querer estar limitados por ninguna teoría en particular, se cree que cuando una célula T entra en contacto con un andamiaje que comprende un agente que promueve el secuestro en combinación con una molécula activadora de células T, una molécula coestimuladora de células T y/o un agente homeostático de células T, el andamiaje puede facilitar la activación y expansión de las células T, lo que puede llevar a la agrupación celular y permitir que un sistema de administración vírica esté en estrecha proximidad con las células T, promoviendo de este modo una transducción más eficaz de las células. La molécula activadora de células T, una molécula coestimuladora de células T y/o un agente homeostático de células T presente en el andamiaje pueden seleccionarse para dar como resultado el fenotipo de célula T deseado que puede mejorar la eficacia terapéutica de la célula T resultante (véase, por ejemplo, Sommermeyer et al, Leukemia 30(2): 492-500 (2016)).

[0317] En algunas realizaciones, las células T aisladas se modifican genéticamente para que expresen un receptor de antígeno quimérico (CAR). En una realización, las células T CD4+ y CD8+ se transducen lentiviralmente para que expresen el CAR CD19 y un receptor del factor de crecimiento epidérmico humano truncado (EGFRt) que permite la identificación de las células transducidas mediante citometría de flujo usando el anticuerpo monoclonal anti-EGFR cetuximab. Las células T CD4+ y CD8+ EGFRt+ transducidas se enriquecen durante el cultivo mediante una única estimulación con células linfoblastoides CD19+ irradiadas (LCL). La frecuencia mediana de células CAR-T EGFRt+ dentro de los subconjuntos CD3+CD4+ y CD3+CD8+ en los productos en el momento de la liberación para infusión, que confiere un buen resultado terapéutico, es de aproximadamente el 80% (intervalo del 50,0% al 95,9%) y aproximadamente el 85% (intervalo del 13,0% al 95,6%), respectivamente. Véase, Turtle et al. (J Clin Invest., 126, 2123-38, 2016). Las células T modificadas genéticamente pueden expandirse aún más incubando el producto de células T con los andamiajes de la invención. En una realización, para expandir selectivamente las células T CAR deseadas pueden emplearse andamiajes que contienen antígenos específicos de células T CAR, por ejemplo, CD19, CD22 o un fragmento de los mismos o una variante de los mismos.

[0318] En ciertas realizaciones, los andamiajes están provistos de productos que son útiles en la puesta en práctica de los métodos de terapia contra el cáncer. Ejemplos representativos incluyen, por ejemplo, hibridomas de células B, linajes estables de células T, anticuerpos derivados de células B o hibridomas de las mismas, receptores que se unen a los antígenos del cáncer (receptores que se unen a moléculas del MHC que presentan los antígenos), incluyendo fragmentos de los mismos, ácidos nucleicos que codifican los receptores o dominios de unión a antígeno de los mismos, ácidos nucleicos que codifican anticuerpos, incluyendo células completas.

[0319] El andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en métodos para tratar un trastorno de inmunodeficiencia en un sujeto que comprenden poner en contacto la muestra del sujeto que comprende una población de células T con el APC-MS de la invención, activando, coestimulando y manteniendo homeostáticamente de este modo la población de células T; opcionalmente expandir la población de células T; y administrar las células T activadas, coestimuladas, mantenidas y opcionalmente expandidas al sujeto, tratando de este modo el trastorno de inmunodeficiencia en el sujeto.

[0320] El andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en un método para tratar un trastorno de inmunodeficiencia seleccionado del grupo que consiste en un trastorno de inmunodeficiencia primaria y un trastorno de inmunodeficiencia adquirida, que comprende poner en contacto la muestra del sujeto que comprende una población de células T con el APC-MS de la invención, activando aí, coestimulando y manteniendo homeostáticamente de este modo la población de células T; opcionalmente expandir la población de células T; y administrar las células T activadas, coestimuladas, mantenidas y opcionalmente expandidas al sujeto, tratando de este modo el trastorno de inmunodeficiencia en el sujeto. El trastorno de inmunodeficiencia puede ser un trastorno de inmunodeficiencia adquirida, por ejemplo, el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) o un trastorno hereditario, por ejemplo, el síndrome de DiGeorge (DGS), el síndrome de rotura cromosómica (CBS), la ataxia telangiectasia (AT) y el síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS), o una combinación de los mismos.

[0321] En la puesta en práctica de la terapia para trastornos de inmunodeficiencia, como se ha explicado anteriormente, puede ser ventajoso proporcionar andamiajes que han sido fabricados con moléculas activadoras específicas de células T auxiliares y moléculas coestimuladoras específicas de células T auxiliares, opcionalmente junto con uno o más agentes adicionales que confieren activación, división, diferenciación, crecimiento, expansión o reprogramación de células T auxiliares. Con anterioridad se han proporcionado ejemplos representativos de tales moléculas y agentes.

[0322] El andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en métodos para tratar una enfermedad patógena en un sujeto que comprende poner en contacto la muestra del sujeto que comprende una población de células T con el APC-M<s>de la invención, activando, coestimulando y manteniendo homeostáticamente de este modo la población de células T; opcionalmente expandir la población de células T; y administrar las células T activadas, coestimuladas, mantenidas y opcionalmente expandidas al sujeto, tratando de este modo la enfermedad patógena en el sujeto. En algunos casos, las células inmunitarias o las composiciones derivadas del paso de manipulación pueden administrarse profilácticamente, por ejemplo, antes de la aparición de los síntomas de la enfermedad en el sujeto. Las enfermedades patógenas que pueden tratarse de acuerdo con el método mencionado anteriormente incluyen enfermedades bacterianas, enfermedades víricas, enfermedades fúngicas o una combinación de las mismas.

[0323] El andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en métodos para tratar una enfermedad autoinmune en un sujeto. El método comprende poner en contacto la muestra del sujeto que comprende una población de células T con el APC-MS de la invención, activando, coestimulando y manteniendo homeostáticamente de este modo la población de células T; opcionalmente expandir la población de células T; y administrar las células T activadas, coestimuladas, mantenidas y opcionalmente expandidas al sujeto, tratando de este modo la enfermedad autoinmune en el sujeto.

[0324] En el contexto del tratamiento de enfermedades autoinmunes, puede ser preferible no administrar células inmunitarias activas (ya que éstas son autorreactivas) sino células inmunitarias quiescentes, senescentes o inactivadas. Preferiblemente, las células inmunitarias son células T. Alternativamente, pueden administrarse reguladores de células inmunitarias, por ejemplo, células T reguladoras o células T supresoras. Los andamiajes/dispositivos pueden fabricarse para la manipulación de subpoblaciones de células Ts/Treg, que luego se administran a los sujetos.

[0325] Por consiguiente, el andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en un método para tratar una enfermedad autoinmune administrando al sujeto que lo necesite el andamiaje de la invención, en donde la pluralidad de antígenos en el andamiaje son específicos para la enfermedad autoinmune, recogiendo una pluralidad de células T reguladoras o supresoras en el andamiaje/dispositivo, en donde la pluralidad de células T reguladoras o supresoras son específicas de los antígenos autoinmunes, y administrando al sujeto la pluralidad de células T reguladoras o supresoras o productos derivados de las mismas, tratando de este modo la enfermedad autoinmune.

[0326] Los productos celulares que son útiles en la puesta en práctica de la terapia de enfermedades autoinmunes incluyen, por ejemplo, anticuerpos y receptores que se unen a células autorreactivas, proteínas reguladoras localizadas en células T supresoras o reguladoras, incluyendo secuencias de ácidos nucleicos que codifican tales moléculas.

[0327] Las células pueden formularse a concentraciones celulares totales que incluyen de aproximadamente 5x102 células/ml hasta aproximadamente 1x109 células/ml. Las dosis preferidas de células T varían de aproximadamente 2x106 células a aproximadamente 9x107 células.

[0328] El andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en la terapia de enfermedades mediante la administración de una o más de las composiciones mencionadas anteriormente. La composición puede ser una composición farmacéutica, que se administra mediante cualquier medio que logre su propósito pretendido. Por ejemplo, la administración puede ser por vía parenteral, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, transmucosal, intracerebral, intratecal o intraventricular. Alternativa o concurrentemente, la administración puede ser por vía oral. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por vía parenteral mediante inyección en bolo o por perfusión gradual a lo largo del tiempo.

[0329] La dosificación administrada puede depender de la edad, el sexo, la salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento concurrente, si lo hay, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. Los intervalos de dosis para la administración de las composiciones farmacéuticas pueden ser lo suficientemente grandes como para producir el efecto deseado, mediante el cual, por ejemplo, se agotan las células T autorreactivas y/o se previene, suprime o trata significativamente la enfermedad autoinmune. Las dosis pueden no ser tan grandes como para provocar efectos secundarios adversos, como reacciones cruzadas no deseadas, inmunosupresión generalizada, reacciones anafilácticas y similares.

[0330] El andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en métodos para detectar o diagnosticar una enfermedad o un trastorno en un sujeto. Cualquier enfermedad o trastorno puede detectarse o diagnosticarse usando los métodos mencionados con anterioridad. Particularmente preferiblemente, la enfermedad es una enfermedad autoinmune seleccionada del grupo que consiste en artritis reumatoide, lupus, enfermedad celíaca, enfermedad inflamatoria intestinal o enfermedad de Crohn, síndrome de Sjogren polimialgia reumática, esclerosis múltiple, espondilitis anquilosante, diabetes de tipo 1, alopecia areata, vasculitis, arteritis temporal, etc. La enfermedad puede ser un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de esófago, cáncer de hueso, cáncer de testículo, cáncer de cuello uterino, cáncer gastrointestinal, glioblastoma, leucemia, linfoma, linfoma de células del manto, lesiones preneoplásicas de pulmón, cáncer de colon, melanoma y cáncer de vejiga. Las enfermedades patógenas que pueden diagnosticarse de acuerdo con el método mencionado con anterioridad incluyen enfermedades bacterianas, enfermedades víricas, enfermedades fúngicas o una combinación de las mismas.

[0331] Puede diagnosticarse a un sujeto con una enfermedad poniendo en contacto primero una muestra del sujeto que contiene la célula inmunitaria de interés con un andamiaje de la invención, en donde los antígenos en el andamiaje son específicos de la enfermedad. La muestra puede contener células T y el andamiaje/dispositivo puede ponerse en contacto con la muestra durante un periodo, por ejemplo, 0,5 días, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días, 25 días, 30 días, 35 días, 40 días, 45 días, 50 días, 60 días, o más, y las células en el andamiaje pueden analizarse usando una o más de las técnicas mencionadas con anterioridad. Por ejemplo, en el contexto del diagnóstico de enfermedades autoinmunes, las células analizadas pueden incluir células T activadas. En el contexto del diagnóstico del cáncer, las células analizadas pueden incluir células T específicas de antígenos tumorales. En el contexto de enfermedades patógenas, las células que se analizan pueden incluir células T que eliminan específicamente los patógenos (por ejemplo, analizando células Th1 en caso de patógenos intracelulares y células Th2 en caso de patógenos extracelulares).

[0332] El sujeto es un animal, preferiblemente un mamífero o un ave. Particularmente preferiblemente, el sujeto se selecciona del grupo que consiste en humanos, perros, gatos, cerdos, vacas, búfalos y caballos. Más preferiblemente, el sujeto es un humano. En el diagnóstico de la enfermedad o trastorno puede usarse cualquier célula inmunitaria. Preferiblemente, el diagnóstico se realiza con un linfocito, por ejemplo, células T.

[0333] El paso analítico puede llevarse a cabo usando cualquier método rutinario. Por consiguiente, el paso analítico puede implicar determinar la cantidad de células inmunitarias que son específicas para la enfermedad autoinmune. Para determinar la especificidad de unión a antígeno de las células inmunitarias puede usarse cualquier técnica rutinaria, por ejemplo, cargando muestras celulares en superficies recubiertas de antígeno, lavando las células unidas de manera no específica y cuantificando el número de células específicas de antígeno (ya sea en forma libre liberando las células unidas o en forma unida) usando un agente de detección (por ejemplo, un anticuerpo que se une a un epítopo de la superficie celular localizado en las células específicas de antígeno). El paso analítico puede implicar la determinación de las características físicas o biológicas de las células inmunitarias específicas de antígeno. Ejemplos de características físicas incluyen, por ejemplo, tamaño, forma, reflectividad, morfología, densidad. Los ejemplos de características biológicas incluyen, por ejemplo, la expresión de marcadores particulares de la superficie celular, la secreción de citoquinas, la reactividad a antígenos o agentes particulares, los patrones de expresión génica.

[0334] El paso analítico puede estar vinculado a un paso de correlación, en donde los resultados del paso analítico se correlacionan con el parámetro de interés. Los tipos representativos de parámetros incluyen, presencia (o ausencia de enfermedad), tipo de enfermedad (por ejemplo, trastorno autoinmune agresivo frente a no agresivo; enfermedad medicable frente a no medicable, por ejemplo, infección bacteriana susceptible a antibióticos frente a resistente a antibióticos, cáncer resistente a inmunoterapia frente a sensible a inmunoterapia), estadio de la enfermedad, progresión/regresión de la enfermedad (a lo largo del tiempo), etc. El parámetro puede referirse a la presencia o ausencia de enfermedad (que puede expresarse en términos binarios). El parámetro puede referirse al estadio de la enfermedad (que puede expresarse en una escala nominal, por ejemplo, estadio I-IV, siendo el estadio IV el más alto). El parámetro puede referirse a las probabilidades de aparición de la enfermedad, por ejemplo, por lo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces o más.

[0335] En los métodos de diagnóstico mencionados con anterioridad, los parámetros pueden compararse con un valor de referencia. El valor de referencia puede ser un valor predeterminado, por ejemplo, en una población de sujetos sanos. Por ejemplo, cuando el antígeno de interés es el antígeno de la artritis reumatoide (AR), en el paso de correlación puede usarse un nivel de referencia de anticuerpos (o células T) específicos de la AR en sujetos sanos. Alternativamente, el valor de referencia puede identificarse experimentalmente usando controles adecuados. El trabajador cualificado puede usar técnicas rutinarias para correlacionar y/o hacer inferencias entre varios grupos de sujetos.

[0336] Por consiguiente, el andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse para detectar o diagnosticar una enfermedad autoinmune, cáncer o enfermedad patógena en un sujeto, poniendo en contacto una muestra del sujeto con los andamiajes de la invención que contienen antígenos que son específicos para la enfermedad autoinmune, cáncer o enfermedad patógena, y analizando las células inmunitarias contenidas en los mismos. El paso de contacto puede realizarsein vivo(por ejemplo, implantando el andamiaje en un sujeto) oex vivo(por ejemplo, cultivando una muestra de sangre extraída de un sujeto con el andamiaje). El paso analítico puede realizarse eliminado primero las células inmunitarias de los andamiajes mediante técnicas rutinarias, es decir, mediante análisisex situ.Por ejemplo, para desprender las células de los andamiajes pueden usarse detergentes suaves y enzimas. Alternativamente, los pasos de detección/análisis pueden llevarse a cabo sin retirar las células de los andamiajes, es decir, mediante análisisin situ.

[0337] Las realizaciones relacionadas están dirigidas a métodos para monitorizar la progresión de una enfermedad en un sujeto. El método comprende poner en contacto la muestra de un sujeto con los andamiajes de la invención que contienen antígenos específicos de la enfermedad y analizar las células inmunitarias contenidas en los mismos. La cantidad/tipos de células inmunitarias contenidas en el dispositivo puede ofrecer indicaciones valiosas sobre la progresión de la enfermedad. Alternativamente, cuando el sujeto ha sido sometido a una intervención terapéutica, pueden usarse métodos análogos para monitorizar la terapia de la enfermedad y/o el tratamiento de la enfermedad.

[0338] Los métodos mencionados con anterioridad pueden usarse para monitorizar la progresión/terapia de trastornos autoinmunes, cánceres, enfermedades patógenas y similares. Preferiblemente, las células inmunitarias que se usan en los métodos de diagnóstico son células T.

[0339] En el contexto de los trastornos autoinmunes, la progresión de la enfermedad puede monitorizarse analizando el número y/o tipo de células T autorreactivas. Dependiendo del resultado del análisis, pueden diseñarse métodos de intervención y/o terapia para minimizar la gravedad de los síntomas. En otros casos, pueden llevarse a cabo métodos preventivos, incluyendo proporcionar recomendaciones a los sujetos sobre cambios dietéticos, nutricionales y/u otros en el estilo de vida.

[0340] El andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS) puede usarse en métodos para concebir y producir composiciones novedosas para tratar una enfermedad. El método puede comprender la administración de los andamiajes de la invención que contienen antígenos específicos de la enfermedad a un sujeto, que luego manipula células inmunitarias que son específicas de la enfermedad, opcionalmente aislar, enriquecer y expandir las células inmunitarias manipuladas en el dispositivo, y luego administrar las células inmunitarias de nuevo al sujeto. Alternativamente, pueden administrarse a los sujetos productos derivados de dichas células inmunitarias. Los ejemplos de productos derivados de las células inmunitarias incluyen ácidos nucleicos (incluidos vectores y células que contienen dichos ácidos nucleicos), péptidos, proteínas, anticuerpos, citoquinas, etc.

[0341] Preferiblemente, la enfermedad es una enfermedad autoinmune. Las células T autorreactivas que han sido aisladas (y opcionalmente expandidas en cultivo como se describe en la presente) mediante los métodos mencionados anteriormente pueden ser inactivadasin situoex situ.En la técnica se conocen los métodos para inactivar células T. Los ejemplos incluyen, entre otros, la inactivación química o la irradiación. Las células T autorreactivas pueden conservarse antes o después de la inactivación usando una serie de técnicas conocidas por los expertos en la materia, que incluyen, entre otras, la crioconservación. Como se describe a continuación, la composición puede usarse como vacuna para eliminar las células T autorreactivas en pacientes autoinmunes.

[0342] Las realizaciones descritas en la presente se refieren además a composiciones y vacunas producidas mediante los métodos mencionados con anterioridad. La composición puede ser una composición farmacéutica, que puede producirse usando métodos bien conocidos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas usadas como terapéuticas preclínicas y clínicas en el tratamiento de enfermedades o trastornos pueden ser producidas por los expertos, empleando principios aceptados de diagnóstico y tratamiento.

[0343] En una realización, la vacuna puede comprender células T autorreactivas que comprenden patrones homogéneos ("monoclonales") o heterogéneos ("policlonales") de uso del gen Vp-Dp-Jp. Los estudios clínicos indican que los pacientes autoinmunes que reciben una vacunación autóloga con células T monoclonales pueden mostrar una disminución gradual de la inmunidad contra las células T autorreactivas. En algunos casos, las células T autorreactivas que reaparecen pueden provenir de poblaciones clonales diferentes, lo que sugiere que las células T pueden experimentar un desplazamiento clonal o una propagación de epítopos potencialmente asociada al proceso de la enfermedad en curso. El desplazamiento clonal o la propagación de epítopos puede ser un problema en las enfermedades autoinmunes mediadas por células T autorreactivas. Una vacuna que comprende células T autorreactivas policlonales capaces de agotar múltiples poblaciones de células T autorreactivas puede evitar problemas con el cambio clonal o la propagación de epítopos. Las composiciones/vacunas de la invención que contienen células T deseadas pueden proporcionarse con un portador farmacéuticamente aceptable. También pueden proporcionarse preparaciones liofilizadas de células T.

IV. Kits/Dispositivos

[0344] Se proporcionan kits que pueden comprender, en uno o compartimentos separados, los andamiajes de la presente invención. Los kits pueden comprender además ingredientes adicionales. Los kits pueden comprender opcionalmente instrucciones para formular los andamiajes para aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas. Los kits también pueden incluir instrucciones para utilizar los componentes del kit, individualmente o en conjunto, en la terapia o el diagnóstico de varios trastornos y/o enfermedades.

[0345] Los kits pueden comprender los andamiajes de la invención junto con reactivos para seleccionar, cultivar, expandir, sostener y/o trasplantar las células manipuladas de interés. En la técnica se conocen ejemplos representativos de kits de selección celular, kits de cultivo, kits de expansión, kits de trasplante para células T, células B y células presentadoras de antígeno.

[0346] Esta invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitativos.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1: Construcción de andamiajes y análisis microscópico de las estructuras ensambladas

[0347] Los andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) se ensamblaron usando la metodología descrita a continuación. Brevemente, se proporcionó primero una capa base que contenía microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de área superficial alta, sobre la que se cargan opcionalmente varios agentes homeostáticos de células T, por ejemplo, interleucinas como IL2 y/o citoquinas como TGF-beta. En ciertas realizaciones, puede ser preferible cargar los agentes homeostáticos en la capa de MSR. A continuación, se coloca una bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) continua sobre la capa base, generando de este modo un andamiaje de MSR-SLB. Si los agentes homeostáticos no se cargan directamente en la capa de MSR, pueden cargarse después de aplicar la carga útil de SLB sobre la capa de MSR. A continuación, puede aplicarse un agente bloqueante como BSA para bloquear los sitios de integración no específicos en el andamiaje de MSR-SLB, después de lo cual en el andamiaje de MSR-SLB se cargan una o más moléculas activadoras de células T y moléculas coestimuladoras de células T. En laFIG. 1se muestran las estructuras de los lípidos en asociación con microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) con microscopía de contraste de fase, en donde se usó una cámara digital montada en el microscopio para obtener imágenes de las estructuras.El panel superior muestra imágenes fusionadas de los lípidos (verde) y los microvarillas de sílice mesoporosa (gris) en una relación lípido:MSR de 1:20 (Escala = 200 pm). El panel central muestra imágenes fusionadas de los lípidos (verde) y los microvarillas de sílice mesoporosa (gris) en una relación lípido:MSR de 1:4 (Escala =<2 0 0>pm). El panel inferior muestra una imagen de microscopio de contraste de fase fusionada de los lípidos en asociación con los MSR a mayor aumento (Escala = 20 pm).

[0348] Se descubrió que las características de los andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) dependían del tipo de lípido y del contenido del lípido. LaFIG. 2Aproporciona una lista de lípidos que pueden usarse para conseguir la arquitectura y/o propiedades deseadas del andamiaje, por ejemplo, dioleoilfosfatidilcolina (DOPC); palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina (POPC); o distearoil-fosfatidilcolina (DSPC). Además, se descubrió que la retención de lípidos estratificados sobre las composiciones de MSR-SLB depende del tipo y/o contenido del lípido (véase laFIG. 2B). A continuación, se estudió la organización de las bicapas lipídicas en los andamiajes de la invención mediante análisis de fluorescencia. LaFIG. 2Cmuestra los cambios en la fluorescencia relativa de varias composiciones de MSR-SLB que contienen DOPC, POPC o DSPC en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante un periodo de dos semanas (14 días). LaFIG. 2Dmuestra cambios en la fluorescencia relativa de varias composiciones de MSR-SLB que contienen DOPC, POPC o DSPC en medio completo del Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) durante un periodo de dos semanas (14 días) a 37°C.

[0349] Adicionalmente, se investigó la estabilidad de varias composiciones MSR-SLB en varios puntos temporales suspendiendo los andamiajes en PBS durante 3 días, 7 días, y 14 días. A continuación, se analizó la arquitectura y/o estructura del andamiaje con microscopía de fluorescencia de contraste de fase. Los resultados se muestran en laFIG. 3.El panel superior muestra la estabilidad del DOPC en la composición de MSR-SLB; el panel central muestra la estabilidad del POPC en la composición de MSR-SLB; y el panel inferior muestra la estabilidad del DSPC en la composición de MSR-SLB.

[0350] Posteriormente, se estudiaron el ensamblaje y las características de las estructuras fluidas de MSR-SLB a lo largo del tiempo con microscopía de contraste de fase. Los resultados se muestran en lasFIGS. 4A-4E. LaFIG. 4Amuestra imágenes de microscopio de fluorescencia confocal de contraste de fase de lípidos en asociación con microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) tomadas a gran aumento (escala = 2 pM) antes de blanquear la composición lipídica ("pre"), en el momento de blanquear la composición lipídica (t=0) y 5 minutos después de blanquear la composición lipídica (t=5 min). LaFIG. 4Bmuestra los cambios en la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) con el tiempo. Las fuentes se representan en la región (2), los sumideros se representan en la región (3) y el punto de normalización se indica en la región (1). La distribución diferencial se observó mejor en los primeros puntos temporales después del blanqueo y alcanzó un equilibrio a alrededor de los 2 minutos (120 s). La figura de la derecha muestra curvas de ajuste suave que representan los cambios medios en FRAP, derivados de las imágenes normalizadas, a lo largo del tiempo. LasFIG. 4CyFIG. 4Dmuestran dos conjuntos de imágenes de alta resolución de estructuras fluidas de MSR-SLb antes del blanqueo (pre), en el blanqueo (t=0) y después de 3 minutos post-blanqueo (t=3 min) con la composición lipídica.

[0351] Además, se estudiaron las propiedades estructurales y funcionales de las composiciones de MSR-SLB que contenían varias moléculas lipídicas mediante análisis espectrofotométrico. Los resultados se muestran en lasFlGs.

5Ay5B. LaFIG. 5Amuestra una representación esquemática de composiciones de MSR-SLB que contienen una bicapa lipídica de POPC que contiene biotina fosfoetanolamina (biotina PE), que se conjuga con una molécula de estreptavidina (por ejemplo, un dímero de estreptavidina), que a su vez se conjuga con un anticuerpo biotinilado (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3 biotinilado o un anticuerpo anti-CD28 biotinilado u otro anticuerpo específico o no específico). LaFIG.5b muestra el análisis espectrofotométrico de MPS (sílice), POPC (lípido), material compuesto de MPS-POPC, material compuesto de MPS-POPC biotinilado (en presencia o ausencia de estreptavidina) y el material compuesto de MPS-POPC junto con el anticuerpo biotinilado en presencia o ausencia de biotina ficoeritrina (biotina PE) y/o estreptavidina. Se observa un aumento significativo de la absorbancia en los materiales compuestos de MSR-SLB que contienen biotina fosfoetanolamina (biotina PE) conjugada con un anticuerpo biotinilado mediante un conector de estreptavidina (barras oscuras; ** indica significancia estadística). Se observó un aumento de la actividad de las células de hibridoma B3Z, que producen p-galactosidasa en respuesta a la activación, con todos los componentes presentes, lo que indica que APC-MS adopta principalmente la estructura representada en (A).

EJEMPLO 2: Análisis de las propiedades funcionales del APC-MS

Liberación de factores homeostáticos como la IL-2

[0352] Los APC-MS que contienen varillas de sílice mesoporosa (MSR) y bicapa lipídica soportada (SLB), que contienen además IL-2 se fabricaron usando los métodos descritos en el Ejemplo 1. La liberación de IL-2 a partir de estas composiciones de MSR-SLB se analizó usando técnicas de tinción y/o ensayos de unión. Los resultados se presentan en lasFIGS. 6Ay6B.Como se ilustra en la micrografía electrónica de laFIG. 6A, los poros de alta área superficial de las MSR están disponibles para la adsorción potencial de IL-2 u otras cargas útiles solubles (barra de escala = 100 nm). El gráfico que muestra la liberación acumulativa de IL-2 durante un periodo de 15 días(FIG. 6B)muestra que los APC-MS de la invención son capaces de liberar agentes homeostáticos como IL-2 de manera controlada y sostenida durante todo el transcurso del periodo de estudio de dos semanas.

Asociación con células T

[0353] Los andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno que contienen andamiajes de MSR-SLB (APC-MS) se incubaron con medios que contenían células T funcionales y la infiltración de células T en los andamiajes se analizó con microscopía de contraste de fase. Los resultados se presentan en lasFIGS. 7Ay7B. LaFIG. 7Amuestra células completas teñidas con un colorante de células vivas y un colorante nuclear. La imagen muestra células T vivas que se han infiltrado en el espacio interparticular de los andamiajes de MSR-SLB apilados y recubiertos de lípidos de alta relación de aspecto. LaFIG. 5Bmuestra células que han sido teñidas con un único colorante.

EJEMPLO 3: Carga de anticuerpos

[0354] Los APC-MS que contenían MSR-SLB se cargaron luego con varias moléculas estimuladoras, moléculas costimuladoras y/o agentes homeostáticos de células T y las estructuras resultantes se analizaron con microscopía de fluorescencia. Se analizaron cuatro tipos diferentes de andamiajes de MSR-SLB: (1) andamiaje de MSR-SLB desnudo (control); (2) MSR-SLB que contenía anticuerpos conjugados; (3) MSR-SLB que contenía IL-2; y (4) MSR-SLB que contenía anticuerpos conjugados e IL-2. Las fotomicrografías se muestran en laFIG. 8(las imágenes de baja resolución están a la izquierda y las de alta resolución a la derecha). El panel superior (imágenes en escala de grises) contiene imágenes de microscopio de contraste de fase de cada uno de los mencionados andamiajes de MSR-SLB. El panel inferior fusiona las imágenes que captan la fluorescencia de los lípidos con las imágenes en escala de grises de los microvarillas de sílice mesoporosa (m Sr ). Las imágenes de la derecha muestran los andamiajes de MSR-SLB a gran aumento (barra de escala =<2 0>pm).

EJEMPLO 4: Propiedades de los APC-MS cargados con anticuerpos

[0355] Se investigó el efecto de los APC-MS cargados con anticuerpos sobre la expansión de células T usando ensayos citológicos de rutina. Para ello, las células T se pusieron en contacto con varios andamiajes de control y experimentales y se midió el efecto de cada uno sobre las poblaciones de células T mediante colorante azul Alamar (indica actividad metabólica) y la producción de IFNy se midió mediante ELISA. Los andamiajes de control incluyen andamiajes simulados ("simulado"), andamiajes sin SLB ("libre"), andamiajes que contienen únicamente el lípido POPC ("POPC") y andamiajes que contienen una combinación de POPC e IL-2. Los andamiajes experimentales contienen una combinación de POPC e IL-2, junto con anticuerpo. Se investigaron tres dosis diferentes del anticuerpo (MSR: relación de anticuerpo de 1:50, 1:25 y 1:10). Los resultados se presentan en lasFIGS. 9Ay9B.Como se muestra en laFIG. 9A, una estimulación de 3 días de las células T con el andamiaje experimental aumentó significativamente la expansión de las células T. Además, se observó que el efecto del anticuerpo sobre la expansión de las células T dependía de la dosis. A continuación, se usó una configuración idéntica para analizar la producción de IFN<y>por las células T. Los resultados se presentan en laFIG. 9B.Se observó que la incubación de las células T en los andamiajes experimentales (que contenían POPC e IL-2 y el anticuerpo) mejoraba considerablemente la secreción de IFNy en comparación con las células T incubadas en los andamiajes de control. Además, se observó que el efecto del anticuerpo sobre la secreción de IFNy dependiente de las células T dependía de la dosis.

[0356] Se analizó el efecto de los andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) de la presente invención sobre la expansión de células T metabólicamente activas usando estudios de citometría rutinarios. Los resultados se presentan en lasFIGS. 10y11.En general, se descubrió que los andamiajes de la invención promueven la expansión rápida de células Tin vitro.A este respecto, laFIG. 10muestra el nivel de cambio de expansión de las células T primarias tras la incubación con los andamiajes de control o experimentales. Se descubrió que la incubación de células T primarias con las composiciones de la presente invención inducía significativamente la expansión de células T (con o sin reestimulación) en comparación con composiciones simuladas o composiciones sin SLB. Lo que es más importante, en comparación con una composición de DINABEADS e IL-2, la incubación de células T primarias con los andamiajes de la invención dio como resultado una proliferación mediblemente mayor tras la reestimulación en el día 7. LaFIG. 11muestra un diagrama de barras de la actividad metabólica de las células T (medida por azul de Alamar relativo (RFU) por célula) que se incubaron con los andamiajes de la presente invención cargados con IL-2 (SLB/IL2/ABS) o DY<n>AB<e>ADS cargadas con IL-2 (DYNABEADS-IL2). Se observó una actividad metabólica significativamente mayor en las muestras incubadas con los andamiajes de la presente invención (columnas de la izquierda) en los días 5 y 7 (antes de la reestimulación), y también en el día 11 (en las muestras no reestimuladas, como se indica en las barras verde y naranja). La reestimulación en el día 7 aumentó la actividad metabólica de ambos grupos de células T, es decir, las incubadas con la composición de SLB/IL2/ABS o la composición de DYNABEADS-IL2, en comparación con las células no reestimuladas, alcanzando los niveles que se habían observado previamente en el día 7. La reestimulación no consiguió elevar la actividad mitótica en el día 13, indicando el agotamiento de las células T en este punto.

[0357] También se estudió el efecto de los andamiajes de la presente invención sobre la formación de agregados de células T usando análisis microscópico. Los resultados se presentan en laFIG. 12.Las imágenes en el panel de la izquierda muestran fotomicrografías (con un aumento de 4 X) de agregados de células T esplénicas tras la incubación con DYNABEADS o APC-MS en el día 0, día 3 y día 7. Las imágenes del panel derecho muestran fotomicrografías (con un aumento de 10 X) de agregados de células T esplénicas tras la incubación con DYNABEADS o APC-MS el día 0, el día 3 y el día 7. (Barras de escala blancas = 100<j>M). Se descubrió que los andamiajes de la invención (APC-MS) confieren una mayor expansión policlonal de células T esplénicas (ratón) y facilitan la formación de agregados de células T que DYNAb Ea DS.

EJEMPLO 5: Uso de andamiajes para estimular y expandir distintas subpoblaciones de células T

[0358] Se realizó la utilidad de las composiciones de APC-MS de la invención para estimular y expandir subpoblaciones específicas de células T usando técnicas de clasificación celular. Las células T esplénicas se incubaron con APC-MS o DYNABEADS y los cambios en el fenotipo celular (basados en la expresión de marcadores de superficie celular) se analizaron mediante FACS en varios puntos temporales después de la incubación (t=0 días, 5 días, 7 días, 11 días y 13 días). En el primer experimento, los cambios en las frecuencias relativas de las subpoblaciones de células T CD4+ y CD<8>+ se analizaron usando FACS, en donde los valores del eje X representan la intensidad de la tinción CD<8>+ y los valores del eje Y representan la intensidad de la tinción CD4+. En un segundo experimento, se analizó la expansión policlonal de un subconjunto de células T esplénicas de ratón FoxP3+ tras la incubación con APC-MS o DYNABEADS. En un tercer experimento, se analizó la expansión policlonal de un subconjunto de células T esplénicas de ratón CD62L+ tras la incubación con los andamiajes de la invención (APC-MS) o DYNABEADS. En un cuarto experimento, expansión policlonal de un subconjunto de células T esplénicas de ratón CD8+/CD69+ tras la incubación con APC-MS o DYNABEADS. En un quinto experimento, expansión policlonal de un subconjunto de células T esplénicas de ratón CD<8>+/Granzima B+ tras la incubación con APC-MS o DYNABEADS. En cada uno de los experimentos mencionados con anterioridad, después de 7 días, se sometió una primera subpoblación de células T a tratamiento con IL-2, mientras que una segunda subpoblación de células T se volvió a estimular y las suspensiones celulares se cultivaron durante<6>días adicionales. Además, se garantizó que tanto las APC-MS como las DYNABEADS usadas en los experimentos contuvieran un repertorio idéntico de moléculas estimuladoras y coestimuladoras.

[0359] En lasFIGS. 13Ay13Bse presentan los resultados del primer experimento. Los resultados muestran que en comparación con la incubación con DYNABEADS, la incubación con los andamiajes de la invención (APC-MS) consiguió una mayor expansión de células T policlonales CD<8>+ esplénicas de ratón al final del periodo de incubación de 14 días. Además, mientras que el tratamiento con IL-2 inhibió la expansión de las células estimuladas con DYNABEADS (aproximadamente un 20% de reducción), no se observó tal efecto con las células incubadas con APC-MS.

[0360] En el segundo experimento, se aplicó una compuerta rectangular para contar el número y/o proporción de células FoxP3+ en las varias fracciones. Los resultados se presentan en laFIG. 14.

[0361] En el tercer experimento, cuyos resultados se muestran en laFIG. 15,se descubrió que las composiciones de APC-MS de la invención confieren expansión policlonal de un subconjunto de células T esplénicas de ratón CD62L+ de manera similar y comparable a las logradas con DYNABEADS. Los resultados se representan en forma de diagramas de dispersión de citometría de flujo (FACS) de la población o poblaciones de células T en varios puntos temporales (t=0 días, 5 días, 7 días, 11 días y 13 días) después de la incubación con APC-MS o DYNABEADS (con reestimulación o tratamiento con IL-2 después de 7 días de incubación). Las células CD62L+ aparecen en los cuadrantes de la derecha (superior e inferior) de los diagramas de dispersión. Los resultados demuestran que las composiciones de APC-MS de la invención son igualmente eficaces para expandir selectivamente las subpoblaciones de células T diana, que luego pueden manipularse o formularse mediante técnicas citológicas conocidas.

[0362] En el cuarto experimento, cuyos resultados se muestran en laFIG. 16, se descubrió que las composiciones de APC-MS de la invención confieren expansión policlonal de un subconjunto de células T esplénicas de ratón CD8+/CD69+ de una manera que es similar y comparable a las logradas con DYNABEADS. Los resultados se representan en forma de diagramas de dispersión de citometría de flujo (FACS) de la población o poblaciones de células T en distintos puntos temporales (t=0 días, 5 días, 7 días, 11 días y 13 días) después de la incubación con APC-MS o DYNABEADS (con reestimulación o tratamiento con IL-2 después de 7 días de incubación). Las células CD8+/CD69+ aparecen en el cuadrante superior derecho de los diagramas de dispersión. Los resultados demuestran que, en comparación con la incubación con DYNABEADS, la incubación con APC-MS consiguió una mayor expansión de células T CD8+/CD69+ policlonales al final del periodo de incubación de 14 días (proporción relativa de aproximadamente el 90% de células T CD8+/CD69+ en las muestras incubadas con APC-MS frente a aproximadamente el 50% de células T CD8+/CD69+ en las muestras incubadas con DYNABEADS).

[0363] En el quinto experimento, cuyos resultados se muestran en laFIG. 17, se descubrió que las composiciones de APC-MS de la invención confieren expansión policlonal de un subconjunto de células T esplénicas de ratón CD<8>+/Granzima B+ de una manera que es similar y comparable a las logradas con DYNABEADS. Los resultados se representan en forma de diagramas de dispersión de citometría de flujo (FACS) de la población o poblaciones de células T en varios puntos temporales (t=0 días, 5 días, 7 días, 11 días y 13 días) después de la incubación con APC-MS o DYNABEADS (con reestimulación o tratamiento con IL-2 después de 7 días de incubación). Las células CD<8>+/Granzima B+ aparecen en el cuadrante superior derecho de los diagramas de dispersión. Los resultados demuestran que, en comparación con la incubación con DYNABEADS, la incubación con APC-MS consiguió una mayor expansión de células T policlonales CD<8>+/Granzima B+ al final del periodo de incubación de 14 días (relación relativa de aproximadamente el 95% de células T CD<8>+/Granzima B+ en las muestras incubadas con APC-MS frente a aproximadamente el 80% de células T CD<8>+/Granzima B+ en las muestras incubadas con DYNABEADS).

EJEMPLO 6: Uso de andamiajes para estimular y expandir células secretoras de citoquinas

[0364] Se incubaron células T esplénicas de ratón durante varias duraciones (t=0 días, 5 días, 7 días, 11 días y 13 días) con APC-MS o DYNABEADS. Después de 7 días de incubación, una primera subpoblación de células T se volvió a estimular con APC-MS o DYNABEADS, respectivamente, y una segunda subpoblación se trató con IL-2. La secreción de citoquinas (IFNy) se midió usando ensayos estándar para medir las concentraciones de IFNy en muestras biológicas, por ejemplo, ensayos ELISA. Los resultados, que se presentan en laFIG. 18, demuestran que en comparación con la incubación con DINABEADS, la incubación con APC-MS logró una mayor expansión de células T policlonales CD<8>esplénicas de ratón después de 5 días de incubación. Este efecto se mantuvo durante todo el periodo experimental de 13 días. La incubación de las células T esplénicas con los andamiajes aumentó la secreción de IFNy. Además, se observó que la reestimulación era especialmente eficaz para aumentar la secreción de IFNy en la subpoblación de células incubadas con DYNABEADS.

EJEMPLO 7: Uso de andamiajes para eliminar células T anérgicas, quiescentes o gastadas

[0365] Se han descubierto varias moléculas coestimuladoras nuevas basadas en su homología con las familias B7 y Cd 28. La proteína de muerte celular programada 1 (PD-1; N° de Registro de UNIPROT Q15116) se expresa en células T activadas y tiene dos ligandos similares a B7, PD-L1 y PD-L2 (Freeman et al., J. Exp. Med. 192:1027-1034 (2000); Latchman et al., Nat. Immunol. 2:261-268 (2001); Dong et al., Nat. Med. 5:1365-1369 (1999); Tseng et al., J. Exp. Med. 193:839-846 (2001)). Se cree que Pd-1 es un marcador de anergia (Chikuma et al., J Immunol., 182(11):6682-9, 2009). Por tanto, se investigó el efecto de los andamiajes de la presente invención sobre la inducción de anergia de células T usando citometría de flujo. Se incubaron células T esplénicas de ratón durante varios periodos de tiempo (t=0 días, 5 días, 7 días, 11 días y 13 días) con los andamiajes de la invención (APC-MS) o DYNABEADS.

Después de 7 días de incubación, se volvió a estimular una primera subpoblación de células T y una segunda subpoblación se trató con IL-2. Se analizó la expresión de marcadores de superficie celular de cada subpoblación de células T usando diagramas de dispersión FACS, en donde los valores del eje X representan la intensidad de la tinción CD<8>+ y los valores del eje Y representan la intensidad de la tinción PD-1+. Los resultados, que se presentan en laFIG. 19, muestran un aumento de la expresión de PD-1 (es decir, un aumento de la anergia) de las células T esplénicas de ratón con el tiempo. Se alcanzó el agotamiento de las células T en ambas subpoblaciones Los resultados indican que la mayoría de las células durante todo el periodo de cultivo son negativas para PD-1 (cuadrantes inferiores), aunque algunas células regulan por incremento la expresión de PD-1. La reestimulación con APC-MS tiende a aumentar la expresión de PD-1. Nota: en todas las configuraciones se proporcionó exposición a IL-2.

EJEMPLO 8: Uso de andamiajes para aumentar la expansión de células T y mejorar la actividad celular

[0366] Se analizó el efecto de las composiciones de APC-MS de la invención en la mejora de la expansión de células T y/o la actividad metabólica usando citometría. Se incubaron células T de sangre periférica humana con andamiajes de control o andamiajes experimentales y se midió el número y/o la actividad metabólica de las células T en varios puntos temporales (t=0 días, 5 días, 7 días, 11 días y 13 días) usando ensayos estándar, por ejemplo, recuentos celulares manuales de células vivas usando exclusión de azul de tripano/hemocitómetro, actividad metabólica analizada usando ensayo de azul Alamar. Los resultados se presentan en lasFIGS. 20Ay20B.En el caso de los estudios de expansión de células T, los andamiajes de control incluyen composiciones simuladas (etiquetadas: "simulada"; representadas con una línea negra) y composiciones que contienen forma soluble y libre de estimulantes anti-CD3, anti-CD28, IL-2 ("libre"; representada con una línea roja), mientras que los andamiajes experimentales incluyen (1) DYNABEADS (línea azul) y (2) bicapas lipídicas (SLB) de la presente invención (línea verde). Los resultados se muestran en laFIG. 20A. Puede observarse que al final del periodo experimental de 13 días, la incubación con SLB dio como resultado una expansión de células T casi dos veces mayor en comparación con la incubación con DYNABEADS. Más sorprendentemente, incluso los andamiajes "libres" provocaron un efecto estimulador sobre las células T comparable al efecto de los DYNABEADS.

[0367] En laFIG. 20Bse presentan los resultados sobre el efecto de los andamiajes de la presente invención sobre la actividad metabólica de las células T primarias. Las células T esplénicas se incubaron con andamiajes de control o andamiajes experimentales y la actividad metabólica de las células T se midió en varios puntos temporales (t=0 días, 5 días, 7 días, 11 días y 13 días) se midió usando tinción de Azul Alamar. Los andamiajes de control incluyen composiciones simuladas ("simulada"; "m") y composiciones sin SLB ("libre"; "f"), mientras que los andamiajes experimentales incluyen (1) DYNABEADS ("d") y (2) bicapas lipídicas (SLB) ("s"). Puede observarse que al final del periodo experimental de 14 días, las células incubadas con los andamiajes "simulados" perecen, mientras que las células incubadas con los andamiajes experimentales (SLB o DYNABEADS) experimentan un crecimiento y una expansión sostenidos a lo largo del tiempo. Lo que es más importante, los andamiajes de SLB de la invención promovieron un mejor crecimiento y actividad metabólica de las células T al final del periodo experimental de 14 días en comparación con los efectos conferidos por DYNABEADS.

EJEMPLO 9: Uso de andamiajes para promover la expansión de células T humanas

[0368] Se incubaron muestras de sangre humana obtenidas del sujeto 1(FIG. 21A)y del sujeto 2(FIG. 21B)con andamiajes de control ("simulado") o andamiajes experimentales que contenían los anticuerpos anti-CD3 enumerados - muromonab (OKT3), un anticuerpo que reconoce la cadena £ de 17-19 kD de CD3 dentro del complejo antígeno CD3/receptor de antígeno de células T (TCR) (HIT3a) y un anticuerpo monoclonal que reconoce una subunidad de 20 kDa del complejo TCR dentro de CD3e (UCHT1). Se investigaron tres dosificaciones diferentes: 5 |jg (diapositivas superiores), 1 jg (diapositiva inferior para el sujeto 2) y 0,5 jg (diapositiva inferior para el sujeto 1). En cada caso, se proporcionó coestimulación con anticuerpos anti-CD28, en donde la proporción de anticuerpo anti-CD3:anticuerpo anti-CD28 se mantuvo en 1:1. Se midió el nivel de cambio de expansión de células T en varios puntos temporales (t=0 días, 7 días, 11 días y 13 días). Los resultados, que se presentan en lasFIG.21Ay21B,muestran que a dosificaciones más altas de anticuerpo (5 jg), los tres anticuerpos anti-CD3 fueron capaces de estimular la expansión de células T humanas. En todos los casos, la expansión de la población de células T fue inicialmente lenta hasta el día 7, tras lo cual aumentó exponencialmente. A la dosis más alta, se alcanzó un aumento de 600-800 veces en el número de células T al final del periodo experimental (día 13). Con la dosificación intermedia (1 jg), sólo OKT3 y HIT3a (pero no UCHT1) fueron capaces de estimular la expansión de las células T, con lo que se consiguió un aumento de 300-400 veces en el número de células T al final del periodo experimental (día 13). A la dosificación más baja (0,5 jg), sólo OKT3 (pero no UCHT1 y/o HIT3a) fue capaz de estimular la expansión de células T, con lo que se consiguió un aumento de 600-700 veces en el número de células T al final del periodo experimental (día 13). Los resultados muestran un efecto tanto del clon de anticuerpo anti-CD3 como de la dosis del anticuerpo sobre la tasa de expansión.

[0369] A continuación, se analizó mediante citometría de flujo la expansión policlonal de células T humanas tras la incubación con andamiajes de control ("simulada") o andamiajes experimentales que contenían los anticuerpos anti-CD3 enumerados - OKT3, HIT3a y UCHT1. Los resultados se presentan en laFIG. 22, en la que los paneles inferiores muestran diagramas de dispersión de citometría de flujo (FACS) de la población o poblaciones de células T en varios puntos temporales (t=<8>días, 11 días y 14 días) después de la incubación con APC-MS que contenía cada uno de los anticuerpos anti-CD3 como molécula estimuladora y un anticuerpo anti-CD28 como molécula coestimuladora de células T. Los valores en el eje X de los diagramas de dispersión representan la intensidad de la tinción CD<8>+ y los valores en el eje Y representan la intensidad de la tinción CD4+. Los diagramas de dispersión se resumen en los gráficos de líneas del panel superior, que muestran los cambios en el porcentaje de subpoblaciones de células T CD4+ frente a CD<8>+ después de la incubación con APC-MS que contienen los anticuerpos anti-CD3 mencionados anteriormente - OKT3 (círculos), HIT3a (cuadrados) y UCHT1 (triángulos). Se estudiaron dos dosificaciones diferentes de anticuerpos: una primera dosis de 5 |jg (dilución 1x) y una segunda dosis de 0,5 |jg (dilución 1:10x). Los resultados muestran que a dosificaciones bajas de anticuerpo (dilución 1:10x; 0,5 jg), los tres anticuerpos anti-CD3 fueron capaces de enriquecer las células T específicas CD<8>+ usando una concentración de anticuerpo baja frente a una concentración de anticuerpo alta. Al final del periodo experimental (día 14) se alcanzó un aumento de 3-4 veces en la cantidad de células T específicas CD<8>+. Por ejemplo, la frecuencia relativa de las células T CD<8>+ era del 20% al inicio del experimento, que había aumentado hasta aproximadamente el 60%-80% en el día 14. Además, se descubrió que los anticuerpos anti-CD3 UHCT1 y OKT1 eran igual de eficaces y superiores al anticuerpo anti-CD3 HIT3a a la hora de promover la expansión de las células T CD<8>+. A dosis elevadas (5 jg ) de anticuerpo, la relación de CD8+:CD4+ en la población global de células T no se modificó (o incluso se atenuó) en el día 14. Los resultados muestran un efecto tanto del clon de anticuerpo anti-CD3 como de la dosis del anticuerpo sobre la expansión de las células T específicas CD<8>+.

EJEMPLO 10: Uso de andamiajes para promover la expansión de una subpoblación específica de células T humanas

[0370] Se incubaron muestras de sangre humana con andamiajes experimentales que contenían los anticuerpos anti-CD3 enumerados - muromonab (OKT3), HIT3a y UCHT1 a dosificaciones 1X (5 jg). En cada caso, se proporcionó coestimulación con anticuerpos anti-CD28. El nivel de cambio de la expansión de las células T se midió después de 14 días. La expresión de CD62L y CCR7 en células vivas totales se muestra en los paneles superiores y la expresión de estos marcadores en células CD<8>+ activadas se muestra en los paneles inferiores. Los resultados, que se presentan en laFIG. 23,muestran que los tres anticuerpos anti-CD3 fueron capaces de estimular la expansión de una subpoblación distinta de células T humanas. Sorprendentemente, la mayoría de las células expandidas con los varios andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS) de la presente invención permanecen CD62L+CCR7+ incluso después de 14 días después de la incubación. Los resultados indican que las células T expandidas conservan su funcionalidadin vivodespués de la expansiónex vivo.Por consiguiente, es posible expandir selectivamente y mantener una subpoblación distinta de células T CD62L+CCR7+ (por ejemplo, células de memoria) usando los andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno.

[0371] Además, los andamiajes de APC-MS que contenían OKT3 fueron particularmente eficaces en la expansión y/o retención de células T CD62L+CCR7+ en comparación con los andamiajes que contenían UCHT1 y/o HIT3a.

EJEMPLO 11: Expansión de células T ex vivo usando andamiajes miméticos de células presentadoras de antígeno (APC-MS)

[0372] La transferencia celular adoptiva (ACT) de células T es un tratamiento prometedor para el cáncer y las enfermedades infecciosas. Sin embargo, los enfoques actuales para la expansiónex vivode células T, un paso clave en la ACT, proporcionan frecuentemente tasas de expansión subóptimas y una funcionalidad limitada de las células. En este trabajo desarrollamos bicapas lipídicas soportadas por microvarillas de sílice mesoporosa que presentaban señales para la estimulación y coestimulación de receptores de células T en densidades predefinidas localmente en una bicapa lipídica fluida, y facilitaban la liberación controlada de interleucina<- 2>soluble, de manera similar a como estas señales son presentadas de manera natural por las células presentadoras de antígeno (APC). En cultivo celular, el material formó un andamiaje mimético de APC (APC-MS) que promovió la activación de células T humanas y de ratón infiltradas. El APC-MS promovió una expansión de células T policlonales de dos a diez veces mayor que las perlas de expansión comerciales después de dos semanas, y una expansión robusta específica de antígeno de subpoblaciones raras de células T citotóxicas funcionales. Este estudio demuestra una nueva plataforma para expandir rápidamente células T funcionales para ACT.

[0373] La transferencia celular adoptiva (ACT) usando células T es un enfoque prometedor para el tratamiento de varias enfermedades malignas y enfermedades infecciosas (véanse, por ejemplo, Rosenberg, S.A. & Restifo, N.P. Science 348, 62-68 (2015); June, C.H. et al. Science Translational Medicine 7(280): 280ps7 (2015); y Fesnak, A.D. et al. Nature Reviews Cancer 16, 566-581 (2016)). Sin embargo, la rápida expansiónex vivode células T funcionales, un paso clave en la producción de células T para ACT, sigue siendo un desafío importante. La activación de células T requiere tres señales: (1) estimulación del receptor de células T (TCR), (2) coestimulación y (3) citoquinas prosupervivencia (Huppa, J.B. & Davis, M.M. Nature Reviews Immunology 3, 973-983 (2003)). En el organismo, estas señales son proporcionadas por las células presentadoras de antígeno (APC), que presentan estas señales a las células T en patrones espaciotemporales específicos (Huppa y Davis (2003); Lee, K.-H. et al. Science 302, 1218-1222 (2003); Alarcón, B. et al. Immunology 133, 420-425 (2011); y Minguet, S. et al. Immunity 26, 43-54 (2007)). Para expandir células T ex vivo para ACT se usan varios enfoques, son particularmente convenientes y las APC artificiales sintéticas (aAPC) (Rosenberg y Restifo (2015); Hasan, A. et al. Advancements in Genetic Engineering 2015 (2015); Hollyman, D. et al. Journal of Immunotherapy (Hagerstown, Md.: 1997) 32, 169 (2009); Maus, M.V. et al. Nature Biotechnology 20, 143-148 (2002); Zappasodi, R. et al. Haematologica 93, 1523-1534 (2008); Perica, K. et al. ACS Nano 9, 6861-6871 (2015); Mandal, S. et al. ACS Chemical Biology 10, 485-492 (2014); Steenblock, E.R. & Fahmy, T.M. Molecular Therapy<1 6>, 765-772 (2008); Fadel, T.R. et al. Nature Nanotechnology 9, 639-647 (2014); Sunshine, J.C. et al. Biomaterials 35, 269-277 (2014); Fadel, T.R. et al. Nano letters<8>, 2070-2076 (2008); Meyer, R.A. et al. Small 11, 1519-1525 (2015); y Steenblock, E.R. et al. Journal of Biological Chemistry 286, 34883-34892 (2011)). Actualmente, las microperlas comerciales (DYNABEADS) funcionalizadas con anticuerpos activadores para CD3 (aCD3; estímulo del TCR) y CD28 (aCD28; señal costimuladora) son el único sistema sintético aprobado por la FDA para expandir las células T (Hollymanet al.(2009)). Estas perlas promueven la activación de células T policlonales con suplementación exógena de interleucina-2 (IL-2). Aunque estos cultivos proporcionan a las células T las tres señales críticas, el contexto en el que se presentan estas señales no es representativo de cómo son presentadas de manera natural por las APC. Esta incongruencia contextual puede dar como resultado tasas de expansión de células T subóptimas y productos de células T con funciones limitadas o desreguladas (Zappasodiet al.(2008); Fadelet al.(2014); Li, Y. & Kurlander, R.J. Journal of Translational Medicine<8>, 1 (2010); y JJin, C. et al. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development 1 (2014)). Además, estas perlas no se prestan a la presentación de grandes conjuntos de señales, lo que puede ser importante para la generación de células T terapéuticas altamente funcionales (Hasanet al.(2015); y Hendriks, J. et al. Nature immunology<1>, 433-440 (<2 0 0 0>)).

[0374] Se desarrolló un material compuesto de bicapas lipídicas soportadas (SLB) formadas sobre microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta relación de aspecto (Kim, J. et al. Nature Biotechnology 33, 64-72 (2015); y Li, W.A. et al. Biomaterials 83, 249-256 (2016)). Las SLB permitieron la presentación de combinaciones de señales de activación de células T en densidades predefinidas en una bicapa lipídica fluida, mientras que las MSR facilitaron la liberación paracrina sostenida de señales solubles a las células T cercanas. Por tanto, las MSR-SLB compuestas permitieron la presentación de señales superficiales y solubles a las células T en un contexto análogo al de las APC naturales. En cultivo celular, las varillas de alta relación de aspecto se asentaron y apilaron para formar una estructura de andamiaje 3D. Los andamiajes formados a partir de MSR-SLB funcionalizadas con señales de activación de células T se denominan andamiajes miméticos de APC (APC-MS). Los APC-MS facilitaron una expansión policlonal de células T primarias de ratón y humanas entre dos y diez veces mayor que las DYNABEADS comerciales al cabo de dos semanas. Los APC-MS también facilitaron una expansión robusta específica del antígeno de células T citotóxicas funcionales de ratón y humanas. En particular, los APC-MS que presentaban antígenos asociados al virus de Epstein bar (VEB) expandieron y enriquecieron subpoblaciones raras de células T humanas de manera específica del antígeno. En general, los APC-MS representan una tecnología de plataforma flexible y ajustable que podría permitir la rápida expansión de células T altamente funcionales para patrones espaciotemporales específicos de ACT (Huppa y Davis (2003); Leeet al.(2003); Alarcónet al.(2011); y Minguetet al.(2007)).

E nsam blaje y caracterización de APC -M S

[0375] Se prepararon APC-MS para la activación de células T(FIG. 25A),usando señales únicas para la expansión policlonal y específica de antígeno(FIG. 25B).Se sintetizaron MSR de alta relación de aspecto con dimensiones medias de<8 8>pm de longitud, 4,5 pm de diámetro (relación de aspecto ~20), y poros de 10,9 nm como se ha descrito anteriormente (Kimet al.(2015); y Liet al.(2016)) (véaseFIG. 26A), y se adsorbieron con IL-2.

[0376] Se prepararon liposomas (140 nm) que contenían cantidades predefinidas de un lípido biotinilado y se recubrieron sobre los MSR cargados con 1L-2, formando MSR-SLB (véase laFIG. 26B). A continuación, se fijaron a las superficies de las MSR-SLB señales biotiniladas para la activación y coestimulación del TCR mediante un producto intermedio de estreptavidina. En cultivo celular, se formaron espontáneamente andamiajes 3D mediante el asentamiento y apilamiento aleatorio de las varillas, formando APC-MS. Las células T se infiltraron en el espacio entre partículas de los andamiajes. Juntos, los andamiajes presentan señales para la activación del TCR y la coestimulación en la superficie de la bicapa lipídica, y liberan IL-2 soluble con el tiempo de forma paracrina a las células T infiltrantes, de manera similar a cómo las APC naturales presentan estas señales a las células T (véase Huppa y Davis (2003)).

[0377] Las MSR se recubrieron con el fosfolípido 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), que se usa comúnmente como modelo para las membranas celulares de mamíferos (Jerabek, H.R. et al. Journal of the American Chemical Society 132, 7990-7 (2010); y Torres et al. Lab on a Chip 13, 90-99 (2013)). A relaciones bajas de lípidos:MSR, se observó una agregación de MSR mediada por lípidos(FIG. 27A),mientras que a relaciones más altas de lípidos:MSR, las MSR recubiertas de lípidos se mantuvieron en un estado bien disperso, de una sola partícula(FIG.

27B).A esta mayor relación lípidos:MSR, el 34,1 ± 0,9% del POPC de entrada se asoció inicialmente con las m Sr , y el recubrimiento de POPC se perdió lentamente con el tiempo en condiciones de cultivo celular(FIG. 28A)a medida que se degradaban las MSR recubiertas de POPC(FIG. 28B).Las MSR también se recubrieron con éxito con 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) y 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC). La cantidad de lípido asociada a las MSR estaba inversamente relacionada con la saturación del lípido, probablemente debido a un empaquetamiento más apretado de los lípidos más altamente saturados en las bicapas lipídicas. No se observaron diferencias significativas en la estabilidad de los distintos recubrimientos lipídicos. Para evaluar si los recubrimientos lipídicos de MSR eran estructuras de SLB continuas y fluidas, se realizaron estudios de recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) usando un lípido marcado con un fluoróforo. Se observó la recuperación de la fluorescencia en las regiones fotoblanqueadas de los MSR recubiertos de lípidos y la normalización coincidente de la fluorescencia en las varillas blanqueadas, lo que demostró que los recubrimientos lipídicos de las MSR eran SLB fluidas y continuas (FIGS. 39Ay39B).

[0378] También se analizaron la carga y liberación de señales solubles y la carga de señales superficiales. Las MSR tienen una superficie muy alta disponible para la adsorción superficial de cargas moleculares (Kimet al.(2015)), y cuando se cargaron 500 |jg de MSR con 2|jg de IL-2 (0,04 mg/ml de IL-2), se retuvo con las Ms R el 50 ± 1% de la IL-2 de entrada. La IL-2 cargada se liberó posteriormente de manera controlada durante 9 días. La tendencia pudo aproximarse bien usando una función exponencial monofásica (R2 = 0,98), lo que indica que la liberación de IL-2 siguió una cinética de primer orden(FIG. 28E).

[0379] También se analizó la unión de señales superficiales a medida que variaba la cantidad de la especie lipídica biotinilada incorporada en la formulación lipídica. Se añadió estreptavidina al 30% de la cantidad molar de grupos lipídicos biotinilados en las respectivas formulaciones de MSR-SLB, y se añadió IgG biotinilada como sustituto de señal superficial. En saturación, la cantidad máxima de IgG biotinilada que podía cargarse en las varias formulaciones de MSR-SLB difería en un factor de ~10(FIG. 28F).Esta diferencia es congruente con las diferencias relativas en las cantidades de lípido biotinilado en las varias formulaciones de MSR-SLB, lo que indica que la densidad de IgG unida a la superficie podría controlarse con precisión definiendo la cantidad de lípido adhesivo en la formulación lipídica de recubrimiento. En todos los experimentos posteriores, las MSR-SLB se saturaron con señales de superficie como se ha descrito, y la densidad relativa de señales de superficie se describe por el % molar de lípido biotinilado en la formulación.

[0380] Para confirmar que la presentación de señales de activación en la superficie del andamiaje promovía las interacciones de las células T, se cultivaron células T primarias con MSR-SLB sin señales superficiales de células T o con APC-MS completos. Mientras que las células T ignoraron en gran medida las MSR-SLB sin señales superficiales de células T, interactuaron robustamente con APC-MS, reorganizando la estructura de los andamiajes para formar extensas agrupaciones de material celular de alta densidad(Fig. 28GyFIG. 29).

E xpansión p o lic lonal de células T p rim arias de ratón y hum anas

[0381] Se cultivaron células T primarias de ratón con DYNABEADS o con APC-MS. El cultivo con APC-MS llevó a la formación de grandes agrupaciones de material celular, y el tamaño y la frecuencia de estas agrupaciones fue mayor en los cultivos con APC-MS que en los cultivos con Dynabead(FIG. 30A).El cultivo con APC-MS promovió una expansión más de dos veces mayor que el cultivo con DYNABEADS(FIG. 30B).Curiosamente, mientras que DYNABEADS promovió un sesgo moderado hacia CD<8>de la población de células T durante el periodo de cultivo, APC-MS promovió que más del 95% de las células T totales fuesen CD<8>+(FIG. 30CyFIG. 31).Las células T CD<8>+ efectoras expandidas con APC-MS aumentaron la regulación del mediador citotóxico Granzima B más rápidamente y en mayor medida durante el periodo de cultivo que las células T CD<8>+ expandidas con DYNABEADS(FIG. 32A).

Tanto en los productos de células T expandidas con Dynabeads como con APC-MS, no se observó expansión de células CD4+ FoxP3+ (FIG. 32B). Significativamente, a pesar de la rápida tasa de expansión observada, la mayoría de las células T expandidas por APC-MS siguieron siendo negativas para el marcador de agotamiento PD-1(FIG.

32C).

[0382] También se evaluaron las formulaciones de APC-MS para determinar la expansión policlonal de células T humanas primarias. El cultivo de células T humanas primarias con APC-MS también llevó a la formación de grandes agrupaciones células-materiales, siendo el tamaño y la frecuencia de estas agrupaciones mayores en los cultivos de APC-MS que en los cultivos de Dynabead. Se observó que la estabilidad y persistencia de estas agrupaciones dependía tanto de la densidad de las pistas superficiales como del aporte inicial de material(FIG. 30D).El cultivo durante 14 días con todas las formulaciones de APC-MS probadas llevó a una expansión entre dos y diez veces mayor que con DYNABEADS(FIG. 30E).Curiosamente, las formulaciones de APC-MS que contenían cantidades más altas de estímulos de células T, ya fuera a través de una mayor densidad de señales superficiales o una mayor masa de material inicial, promovieron un sesgo extremo hacia CD4 después de 14 días de cultivo. Por el contrario, la formulación de APC-MS que contenía una menor cantidad total de estímulos de células T con respecto a las otras formulaciones de APC-MS (F4), promovió una expansión CD4+ y CD<8>+ más equilibrada, comparable a la de las DYNABEADS(FIG. 30F).Entre las formulaciones de APC-MS probadas, se observó una correlación positiva entre la cantidad total de estímulos de células T en la formulación y la frecuencia de células que coexpresaban los marcadores de agotamiento PD-1 y LAG-3 al final del periodo de cultivo. Sorprendentemente, a pesar de una expansión casi 10 veces mayor durante un periodo de cultivo de dos semanas, se observó una baja frecuencia de células que coexpresaban PD-1 y LAG-3 (<5%) con la formulación de APC-MS de bajo estímulo de células T (F4), similar a DYNABEADS. Sin embargo, se observó una mayor frecuencia de células que coexpresaban PD-1 y LAG-3 en la condición de DYNABEADS en el día 7(FIG. 30G).No se observaron diferencias significativas entre los productos de células T expandidas con Dynabead o APC-MS en la frecuencia de células que coexpresaban las moléculas de direccionamiento linfoide CCR7 y CD62L(FIG. 33),que indican un fenotipo de células T más virgen y han demostrado ser importantes para la función después de la transferenciain vivo(Gattinoni, L. et al. The Journal of Clinical Investigation 115, 1616-1626 (2005)). En conjunto, estos datos demuestran que los APC-MS fueron capaces de expandir policlonalmente células T humanas y de ratón más rápidamente que las DYNABEADS.

E xpansión específica de antígeno de células T prim arias de ratón

[0383] Para determinar si el APC-MS podría adaptarse para la expansión específica de antígeno usando células T CD<8>+ de ratón primarias aisladas de ratones OT-I, que expresan un TCR específico para el péptido SIINFEKL (SEQ ID NO: 4) de ovoalbúmina de pollo en el contexto de H-2K(b) MHC clase I. Se observaron interacciones célulasmateriales mínimas cuando estas células se cultivaron con una formulación de APC-MS que presentaba un MHC cargado con péptido irrelevante (pMHC). Sin embargo, cuando las células se cultivaron con una formulación de APC-MS que presentaba SIINFEKL (SEQ ID NO: 4), se observaron interacciones robustas que dieron como resultado la formación de agrupaciones extensas de material celular(FIG. 34A).Las formulaciones de APC-MS que presentaban SIINFEKL (SEQ ID NO: 4) promovieron una expansión robusta de células T CD<8>+ OT-I, incluso con señales de superficie presentadas en tan solo un 0,01% molar de los lípidos(FIG. 34B).En respuesta a la presentación de SIINFEKL (SEQ ID NO: 4) de células de melanoma B16-F10, las células T expandidas secretaron IFNy(FIG. 34E), regularon por incremento la coexpresión de IFNy y TNFa(FIG. 34C),y mataron células dianain vitro(FIG. 34D).

E xpansión específica de antígeno de células T hum anas prim arias

[0384] Para determinar si el APC-MS podría usarse para el enriquecimiento y expansión específicos del antígeno de subpoblaciones de células T humanas raras, lo que podría ser útil para la expansión selectiva de células T raras específica de antígenos de cáncer a partir de tumores o sangre (Cohen, C.J. et al. The Journal of Clinical Investigation 125, 3981-3991 (2015); y Streinen, E. et al. Science 352, 1337-1341 (2016)). Las formulaciones de APC-MS presentaban uno de dos péptidos (abreviados o CLG o GLC), de diferentes proteínas asociadas al VEB, en el contexto del alotipo HLA-A2 del MHC de clase I. Se aislaron células T CD<8>+ de muestras de sangre humana de donantes compatibles con HLA-A2 con exposición previa al VEB, y se trataron con IL-2 soluble (30 U/ml) sola (simulado), o se cultivaron con APC-MS que presentaban el péptido CLG o GLC. Se observó un enriquecimiento y expansión robustas específicos del antígeno de los dos subconjuntos de células T, mientras que se observó un aumento mínimo de las células T totales(FIG. 35A). La frecuencia de células T CD<8>+ específicas de CLG aumentó del 0,04% de todas las células T CD<8>+ en el día 0, al 3,3 ± 0,9% de las células T CD<8>+ en el día 14 cuando se cultivaron con APC-MS que presentaban CLG(FIGS. 36Ay36B), lo que corresponde a una expansión de 170 ± 70 veces en el número de células(FIG. 36C). De manera similar, la frecuencia de células T CD<8>+ específicas de CLG aumentó del 0,66% de todas las células T CD<8>+ en el día 0, al 48 ± 9% en el día 14 cuando se cultivaron con APC-MS presentadoras de CLG(FIGS.

36Dy36E), lo que corresponde a una expansión de 300 ± 100 veces en el número de células(FIG. 36F). Las funcionalidades de los varios productos de células T se analizaron en experimentos de cocultivo con células estimuladoras T2 evaluando la secreción de IFNy(FIG. 35B), la coexpresión de IFN<y>y TNFa(FIG. 35C, yFIGS. 36G, 36H,y36I), y la destruccióninvitro de células diana cargadas con péptido(Fig. 36J). Las poblaciones de células T CD<8>+ expandidas con APC-MS que presentaban CLG o GLC respondieron fuertemente a las células estimuladoras que presentaban su antígeno afín. Particularmente, después del cocultivo con células T2, la frecuencia de células específicas de CLG y GLC detectadas mediante tinción con tetrámeros fue similar a la frecuencia de células que coexpresaban IFNy y TNFa, lo que indica que la mayoría de las células T expandidas eran funcionales.

[0385] Para determinar si las células T específica de antígenos podrían expandirse directamente de poblaciones celulares heterogéneas, como PBMC, obviando la necesidad de aislamiento de células T, se realizaron los siguientes experimentos. Se cultivaron muestras de PBMC de donantes compatibles con BLA-A2 con exposición previa al VEB con una formulación de APC-MS presentadora de GLC. Sorprendentemente, la frecuencia de células T específicas de GLC aumentó del 0,66% del total de células T CD<8>+ en el día 0, al 15 ± 1% en el día 7; se encontraron cambios mínimos en las muestras tratadas de manera simulada(FIG.36K).Esto corresponde a una expansión de 60 ± 9 veces de las células T específicas de GLC(FIG. 36L). La funcionalidad de las células T expandidas se evaluó mediante cocultivo con células T2 que estaban sin pulsar o pulsadas con el péptido CLG o GLC. La cuantificación de la frecuencia de células que coexpresan TNFa e IFNy(FIG. 36M), y la secreción de 1FN1(FIG. 36N), demostraron que las poblaciones de células T CD<8>+ que se expandieron a partir de PBMC con APC-MS que presentaban GLC respondieron sólidamente sólo a células T2 que presentaban su antígeno afín. En conjunto, estos datos demuestran la capacidad de las APC-MS para expandir de manera robusta células T humanas y de ratón de una manera específica de antígeno.

[0386] Para determinar si las mejoras observadas usando APC-MS sobre DYNABEADS no eran atribuibles únicamente a diferencias en la cantidad de anticuerpo anti-CD3 y anticuerpo anti-CD28 presentado, la cantidad de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 en los DYNABEADS fue normalizada para que se correspondiese con la concentración de estos anticuerpos en los APC-MS. Como se muestra en lasFIGS. 40B, 40Cy40D, cuando se igualó la cantidad de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 presentes en las APC-MS y las DYNABEADS, las APC-MS promovieron una expansión más rápida de células T de ratón primarias(FIG. 40B)mientras se mantenían niveles de coexpresión comparables de los marcadores de agotamiento PD-1 y LAG-3(FIG. 40C). Además, ajustando la formulación APC-MS, puede ajustarse la proporción CD4:CD8(FIG. 40D).

[0387] Se observó que la IL-2 se liberaba del APC-MS de manera sostenida en el transcurso de aproximadamente una semana. Para evaluar el efecto de la dosis de IL-2 y la liberación sostenida de APC-MS, se cultivaron células T primarias de ratón durante 7 días con DYNABEADS o APC-MS que presentaban la misma cantidad de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. Para las condiciones APC-MS, la IL-2 se cargó en la APC-MS y se dejó que se liberase a lo largo del tiempo (M-D), o se añadió la misma dosis de IL-2 como un bolo soluble en el medio en d0 (M-D/bIL-2). Para las condiciones de DYNABEAD, la IL-2 se suplementó en los medios a la dosis recomendada por el fabricante y se renovó en cada cambio de medios (D-B), o se añadió como un bolo soluble en los medios en el d0 a la misma dosis que se cargó en APC-MS (D-B/bIL-2). Como se muestra en laFIG. 41A, la APC-MS promovió una mayor expansión de células T primarias de ratón cuando la IL-2 se cargó en la APC-MS y se permitió que se liberase con el tiempo que cuando la misma dosis de IL-2 se añadió a los medios como un bolo soluble, lo que demuestra el beneficio de presentar IL-2 en este contexto. Las APC-MS promovieron una mayor expansión de células T primarias de ratón que las DYNABEAD cuando se igualaron las cantidades de anti-CD3, anti-CD28 e IL-2 presentadas (M-D/bIL-2 frente a D-B/eIL-2) demostrando el beneficio de presentar estas señales en el contexto de APC-MS. Como se muestra en laFIG.

41B, cuando se emparejan las cantidades de anti-CD3, anti-CD28 e IL-2 presentadas, las células T expandidas con APC-MS mostraron menor coexpresión de los marcadores de agotamiento PD-1 y LAG-3 que las expandidas con DYNABEADs (M-D/bIL-2 vs D-B/bIL-2).

[0388] Los experimentos anteriores demuestran que los APC-MS son un material multifuncional que puede presentar estímulos TCR y señales costimulatorias localmente en la superficie de una bicapa lipídica fluida, y facilitar la administración sostenida y paracrina de citoquinas solubles a células T cercanas. Las formulaciones ternarias que presentan aCD3 o pMHC, aCD28 e IL-2 promovieron una rápida expansión policlonal y específica de antígeno de células T primarias de ratón y humanas, incluyendo una expansión policlonal significativamente más rápida que las DYNABEADS comerciales. Lo que es más importante, a pesar de la mayor tasa de expansión observada con el APC-MS usado en este ejemplo, las células T expandidas pudieron conservar un fenotipo funcional, lo que demuestra que la tasa de expansión no está fundamentalmente acoplada de manera inversa a la función. Las células T ignoraron en gran medida los APC-MS a menos que se hubiesen formulado para presentar señales de TCR relevantes, lo que permitió la expansión específica de subpoblaciones raras de células T incluso a partir de mezclas celulares complejas, como las PBMC.

[0389] Los resultados de estos estudios apoyan la importancia de presentar señales tanto superficiales como solubles a las células T de una manera comparable a la forma en que estas señales se presentan de manera natural. Trabajos anteriores sobre aAPC sintéticas han demostrado que la administración de citoquinas como la IL-2 a células T de manera paracrina puede potenciar los efectos de la citoquina (Steenblocky Fahmy (2008); y Fadelet al.(2014)). Los sistemas actuales se centran principalmente en potenciar la activación de células T mediante la presentación estática de alta densidad de estímulos para promover la agrupación de TCR (Zappasodiet al.(2008); Fadelet al.(2014); y Fadelet al.(2008)). Sin embargo, la agrupación de los TCR es solo un paso en un proceso dinámico que implica la reorganización de muchas moléculas de la superficie celular a lo largo del tiempo y que sirve no solo para mejorar la activación de las células T, sino también para limitar la duración de la señalización de los TCR con el fin de proteger contra la sobreestimulación de las células T (Huppa y Davis (2003); Leeet al.(2003); Alarcónet al.(2011)). Al presentar señales de células T a través de la superficie de una bicapa lipídica fluida, emulando la forma en que estas señales se encuentran de manera natural en la superficie de las membranas plasmáticas de APC, se observó que densidades de señales superficiales relativamente más bajas promovían tasas de expansión más rápidas y generaban células T con un fenotipo más funcional y menos agotado.

[0390] Se usaron partículas de muy alta relación de aspecto para formar APC-MS, lo que contrasta con la mayoría de los materiales aAPC sintéticos descritos con anterioridad (Steenblocky Fahmy (2008); Fadelet al.(2014); Sunshineet al.(2014); Fadelet al.(2008); Meyeret al.(2015); y Steenblock (2011)). Estas partículas se asentaron y apilaron espontáneamente para formar estructuras tridimensionales de gran superficie, que las células T infiltrantes remodelaron para formar agrupaciones densas de células-material, creando un microambiente en el que las células T están muy próximas al material. Es probable que esto permita una administración paracrina más eficaz de IL-2 a través de y un aumento de la señalización paracrina entre células T (Long, M. & Adler, A.J.The Journal of Immunology 177, 4257-4261 (2006)). El tamaño relativamente grande y la alta relación de aspecto de las varillas probablemente contribuyeron a la formación de los grupos más grandes observados en los cultivos de APC-MS frente a los cultivos de Dynabeads, ya que muchas más células T podían interactuar con cada varilla en vez de con los DYNABEADS esféricos más pequeños. La persistencia de estas agrupaciones en los cultivos de APC-MS dependía de la densidad de las pistas superficiales y de la cantidad de material en el cultivo, lo que probablemente contribuyó a los diferentes fenotipos observados en las distintas condiciones APC-MS.

[0391] En estudios de expansión de células T policlonales de ratón, el APC-MS promovió un sesgo extremo hacia CD<8>de la población de células T. Esto es congruente con observaciones anteriores de que la administración paracrina de IL-2 aumentó la proliferación de células T CD<8>+ de ratón, pero promovió la muerte celular inducida por activación en células T CD4+ de ratón (Steenblocket al.(2011)). Sin embargo, en los estudios de expansión de células T policlonales humanas, el sesgo dependía de la cantidad total de estímulos de células T presentados por el APC-MS, con condiciones que contenían mayores cantidades de estímulos de células T que promovían un sesgo extremo hacia CD4. Esta discrepancia podría indicar diferencias fundamentales en la forma en que las células T humanas y de ratón responden a estas señales. Una mejor comprensión de este comportamiento podría permitir formulaciones de materiales que sesguen las poblaciones de células T mixtas hacia relaciones de CD4:CD8 específicas, una propiedad que recientemente ha demostrado ser importante para la función de las células T transferidas adoptivamente (Turtle, C.J. et al. The Journal of Clinical Investigation 126 (2016)).

[0392] La necesidad de generar rápidamente cantidades terapéuticamente relevantes de células T funcionalesex vivoes un desafío significativo en las terapias personalizadas de células T, y los resultados de este estudio indican que los APC-MS proporcionan un avance significativo hacia la satisfacción de esta necesidad (Turtle, C.J. & Riddell, S.R. Cancer Journal (Sudbury, Mass.) 16, 374 (2010); y Eggermont, L.J. et al. Trends in Biotechnology 32, 456-465 (2014)). Se observó que una única estimulación con formulaciones ternarias de APC-MS promovía una expansión de células T significativamente más rápida que las DYNABEADS comerciales, y demostró que los parámetros del material podían manipularse para mejorar el fenotipo del producto celular sin comprometer la rápida tasa de expansión. Como APC-MS es una tecnología de plataforma modular, los componentes del sistema pueden alterarse o cambiarse para modificar el contexto espacial y temporal en el que se presentan las señales. Por ejemplo, alterar las propiedades de las MSR puede permitir ajustar el microentorno del andamiaje o la cinética de degradación. Cambiar la formulación lipídica puede permitir ajustar la estabilidad, fluidez o partición de las señales en la superficie de la SLB, o la fijación de señales a través de diferentes procesos químicos (Torreset al.(2013); Puu, G. & Gustafson, I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes 1327, 149-161 (1997); Anderson, N.A. et al. Journal of the American Chemical Society 129, 2094-2100 (2007); Collins, M.D. & Keller, S.L. Proceedings of the National Academy of Sciences 105, 124-128 (2008); Reich, C. et al. Biophysical Journal 95, 657-668 (2008); Longo, G.S. et al. Biophysical Journal 96, 3977-3986 (2009); Kwong, B. et al. Biomaterials 32, 5134-5147 (2011); Koo, H. et al. Angewandte Chemie International Edition 51, 11836-11840 (2012); y Desai, R.M. et al. Biomaterials 50, 30-37 (2015)). Los APC-MS descritos en la presente también pueden modificarse para que presenten conjuntos más amplios de señales tanto superficiales como solubles, lo que puede permitir la generación de células T aún más optimizadas para ACTS (Hasanet al.(2015); y Hendrikset al.(2000)).

Métodos

Células y reactivos

[0393] Se obtuvo la línea celular de melanoma murino B16-F10 de ATCC, y se confirmó que era negativa para micoplasma. Las células B16-F10 se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS) (HI-FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina. Las células de hibridoma murino de células T B3Z se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con un 10% de HI-FBS, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato sódico, 50 pM de beta-mercaptoetanol y un 1% de penicilina-estreptomicina. Los linfoblastos humanos T<2>(174 x CEM.T2) se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% HI-FBS, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato sódico, 50 pM de beta-mercaptoetanol, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato sódico, 10 mM de HEPES y 1% de penicilina-estreptomicina. Se cultivaron células T primarias de ratón y humanas en RPMI 1640 suplementado con 10% de HI-FBS, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato sódico, 50 pM de beta-mercaptoetanol, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato sódico, 10 mM de HEPES y 1% de penicilina-estreptomicina, suplementado con 30 U/ml de IL-2 recombinante de ratón o humana, respectivamente.

[0394] Todos los reactivos químicos para la síntesis de MSR se adquirieron de Sigma-Aldrich. Todos los lípidos se adquirieron de Avanti Polar Lipids. Los lípidos específicos usados en estos estudios son los siguientes: DOPC (850375C), POPC (850457C), DPSC (850365C), PE-cap-biotina (870273C), PE-carboxifluoresceína 18:1 (810332C). Los anticuerpos FoxP3 se adquirieron de eBioscience. Todos los demás anticuerpos se adquirieron de Biolegend. La IL-2 recombinante murina y humana se adquirió de Biolegend. Los monómeros MHC cargados con péptidos biotinilados y los tetrámeros marcados con fluoróforos se obtuvieron del National Institutes of Health Tetramer Core Facility. Los DYNABEADS de expansión de células T CD3/CD28 humanas y de ratón se adquirieron de ThermoFisher Scientific. El péptido SIINFEKL derivado de ovoalbúmina (SEQ ID NO: 4) se adquirió de Anaspec. Los péptidos derivados del VEB CLGGLLTMV (SEQ ID NO: 1) y GLCTLVAML (SEQ ID NO: 2) se adquirieron de Proimmune.

S íntesis de m icrovarillas de s ílice m esoporosa (M SR)

[0395] Las MSR se sintetizaron como se ha informado con anterioridad (Kimet al.(2015); y Liet al.(2016)). Brevemente, se disolvieron 4 g de surfactante Pluronic P123 (Mn medio ~5.800, Sigma-Aldrich) en 150 g de solución de HCl 1,6 M y se agitaron con<8 , 6>g de ortosilicato de tetraetilo (TEOS, 98%, Sigma-Aldrich) a 40°C durante 20 h, seguido de envejecimiento a 100°C durante 24 h. Posteriormente, se eliminó el surfactante de las partículas así preparadas mediante extracción en HCl/etanol al 1% (v/v) a 70°C durante 20 horas. Las partículas se recuperaron pasando la suspensión por un filtro de<0 , 2 2>pm, se lavaron con etanol y se secaron.

A islam iento de células T p rim arias de ratón

[0396] Todos los procedimientos que implicaban animales se realizaron de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud e institucionales. Los animales se adquirieron de The Jackson Laboratory. Para los estudios de expansión de células T policlonales, se usaron ratones C57BL/6J como donantes de células. Para los estudios de expansión de células T específica de antígenos, se usaron ratones C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT-I) como donantes de células. Todos los animales eran hembras y tenían entre<6>y 9 semanas de edad al inicio del experimento. Para aislar las células T, los esplenocitos se prepararon triturando bazos a través de coladores celulares de nailon de 70 |jm, y los glóbulos rojos se lisaron en tampón ACK. Posteriormente, se aislaron células T CD3+ para estudios de expansión de células T policlonales usando un kit MACS de aislamiento de células pan Ta (Miltenyi Biotec), o se aislaron células T CD<8>+ para estudios de expansión de células T específicas de antígeno usando un kit MACS de aislamiento de células T cD<8>a+ (Miltenyi Biotec).

A islam iento de células T hum anas p rim arias

[0397] Los collares de leucorreducción desidentificados se obtuvieron del Banco de Especímenes del Hospital Brigham and Women's. Las PBMC se aislaron de las leucorreducciones en un gradiente de Ficoll, seguido de dos lavados para eliminar los contaminantes plaquetarios. Posteriormente, en algunos estudios, se aislaron células T CD3+ para estudios de expansión de células T policlonales usando un kit MACS de aislamiento de células pan T (Miltenyi Biotec), o se aislaron células T CD<8>+ para estudios de expansión de células T específicas de antígenos usando un kit MACS de aislamiento de células T<c>D<8>+ (Miltenyi Biotec).

P reparación de andam iajes m im éticos de células presentadoras de antígeno (APC-M S)

[0398] Las MSR y los liposomas se prepararon antes del ensamblaje de APC-MS. Para preparar liposomas, primero se prepararon películas lipídicas compuestas de formulaciones lipídicas predefinidas mezclando suspensiones de lípidos-cloroformo, evaporando el cloroformo a granel bajo nitrógeno y eliminando el cloroformo residual durante la noche en una cámara de vacío. Para todos los estudios funcionales, se usó 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) como lípido primario, y las formulaciones lipídicas se doparon con entre un 0,01-1% molar del lípido etiquetado con carboxifluoresceína 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(carboxifluoresceína), o del lípido biotinilado 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotinil). Para algunos estudios de caracterización, se usaron alternativamente los lípidos 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) y 1,2-destearoilsn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) como lípido primario. Las películas lipídicas se volvieron a suspender en PBS a 2,5 mg/ml de lípido y se rehidrataron agitándolas en vórtex cada 10 minutos durante una hora. Posteriormente, las suspensiones lipídicas se extruyeron a través de filtros de policarbonato de 100 nm usando un miniextrusor (Avanti Polar Lipids) para obtener suspensiones monodispersas de liposomas. Las suspensiones de liposomas se almacenaron a 4°C y se usaron en el plazo de una semana. Para preparar las formulaciones de APC-MS, las MSR (10 mg/ml) se incubaron con IL-2 recombinante (0,04 mg/ml) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Para formar MSR-SLB, se añadieron liposomas en relación lípido:MSR 1:4 (p/p), y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente pipeteando cada 10 minutos. A continuación, se lavó el material dos veces con PBS y luego se bloqueó durante 15 minutos volviendo a suspender el material a 2,5 mg/ml (con respecto a las MSR) en 0,25% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS (p/v). A continuación se añadió estreptavidina, en una cantidad molar correspondiente al 30% de saturación teórica de la cantidad de lípido biotinilado en la formulación particular (suponiendo una retención de lípidos del 34% para POPC) (25 jg de estreptavidina por 500 jg de MSR para formulaciones de lípido biotinilado al 1%), y la suspensión se mezcló pipeteando cada 5 minutos durante 20 minutos. A continuación, se añadieron señales activadoras de células T biotiniladas (relación molar 1:1 de señal activadora de TCR:aCD28) en una cantidad correspondiente al 80% de saturación molar de la estreptavidina añadida, y la suspensión se mezcló pipeteando cada<1 0>minutos durante<1>hora. Por último, el material se lavó dos veces con PBS y se volvió a suspender en medio de cultivo celular para ensayos in vitro. Las formulaciones de APC-MS se usaron inmediatamente para experimentos de expansión de células T, o se almacenaron a 4°C y se usaron en el plazo de una semana para estudios de caracterización.

C aracterización de la estructura y estab ilidad de la bicapa lip íd ica soportada p o r M SR (M SR-SLB)

[0399] La microscopía de campo claro y de fluorescencia, usada para evaluar el recubrimiento lipídico de MSR, la dispersabilidad de MSR-SLB y la degradación de MSR-SLB, se realizaron con un sistema de imagenología celular EVOS FL. La microscopía confocal se realizó usando un sistema confocal Zeiss LSM 710. Para evaluar la retención de lípidos con las MSR, las MSR se recubrieron con formulaciones lipídicas que contenían un 1% molar de lípidos marcados con fluoróforos, y la retención de lípidos se cuantificó usando un lector de placas. Para calcular el porcentaje de retención de lípidos a lo largo del tiempo, el material cultivado se recuperó en puntos temporales específicos centrifugándolo a 700 rcf durante 5 minutos, y la intensidad de fluorescencia se normalizó con respecto a la intensidad de fluorescencia antes del cultivo. Para evaluar la fluidez de las MSR-SLB, se llevaron a cabo experimentos de recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) en MSR recubiertas con formulaciones lipídicas que contenían un 1% molar de lípidos marcados con fluoróforos, usando un sistema confocal Zeiss LSM 710. El fotoblanqueo se realizó en la línea láser de 488 nm y se tomaron imágenes cada 10 segundos durante por lo menos 150 segundos. La recuperación de la fluorescencia se analizó usando ImageJ normalizando la intensidad de la fluorescencia dentro de la región fotoblanqueada con la intensidad de la fluorescencia en una región no blanqueada en una varilla diferente, en cada punto temporal.

[0400] Para cuantificar la carga y liberación de IL-2, se cargaron 500 jg de MSR con 2 jg de IL-2, y luego se recubrieron con lípidos como se ha descrito. Después de lavar dos veces con PBS, las MSR-SLB cargadas con IL-2 se volvieron a suspender en 500 |jl de tampón de liberación (1% de BSA en PBS (p/v)) y se incubaron en condiciones de cultivo celular. En los puntos temporales indicados, se centrifugaron las muestras (700 rcf durante 5 minutos) y se recogieron los sobrenadantes. Posteriormente, las MSR se volvieron a suspender en tampón de liberación fresco y se devolvieron al cultivo. La IL-2 en las muestras sobrenadantes se cuantificó mediante ELISA (Biolegend).

[0401] Para cuantificar la carga de señal superficial, se prepararon muestras de MSR-SLB usando formulaciones lipídicas que contenían un 0,01, 0,1 o 1% molar de lípido biotinilado. Se añadió estreptavidina, en una cantidad correspondiente al 30% de saturación teórica del lípido biotinilado retenido (suponiendo una retención de lípidos del 35% para el POPC), seguido de la adición de IgG biotinilada en una cantidad igual al 40% o al 80% de saturación de la estreptavidina añadida. Como controles, también se prepararon muestras que contenían la misma cantidad de IgG biotinilada pero sin material. Todas las muestras se centrifugaron a 700 rcf durante 5 minutos para sedimentar el material, y la cantidad de IgG en las fracciones sobrenadantes se cuantificó mediante ELISA (eBioscience). El stock de IgG biotinilada que se usó para preparar las muestras también se usó para preparar curvas estándar. La cantidad de IgG cargada en el material se calculó restando la cantidad de IgG detectada en los sobrenadantes de las muestras de control de la cantidad de IgG detectada en los sobrenadantes de las respectivas muestras de material. Para la microscopía electrónica de barrido (SEM), las células se cultivaron con APC-Ms en cubreobjetos de vidrio durante la noche, se fijaron en paraformaldehído al 4% y, a continuación, se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 minutos. Las muestras fijadas se hicieron pasar en serie por un gradiente del 0, 30, 50, 75, 90 y 100% de etanol en agua. Las muestras se sumergieron en hexametildisilazano (Electron Microscopy Sciences) y se mantuvieron en un desecador de sobremesa durante toda la noche. Los cubreobjetos secos se montaron en soportes de microscopio electrónico de barrido con cinta de carbono, se recubrieron con 5 nm de platino-paladio por pulverización catódica y se visualizaron mediante detección de electrones secundarios en un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo Carl Zeiss Supra 55 VP.

Estudios de expansión de células T in vitro

[0402] Se llevaron a cabo experimentos de expansión de células T policlonales de ratón y humanas usando células T CD3+ primarias. Los experimentos de expansión de células T de ratón específicas de antígeno se llevaron a cabo usando células T CD<8>+ aisladas de ratones OT-I. Los experimentos de expansión de células T humanas específicas de antígeno se llevaron a cabo usando células T CD<8>+ o PBMCS aisladas de muestras de sangre de donantes desidentificados. Las células T primarias aisladas de ratón o humanas, o las PBMC humanas, se mezclaron con estímulos de activación y se cultivaron durante hasta dos semanas. En todos los experimentos se usaron recipientes de cultivo no tratados. Para los estudios de expansión de células T humanas específicas de antígenos, antes de establecer los cultivos, se analizaron muestras de donantes para determinar la expresión de HLA-A2 MEWI mediante FACS, y la exposición previa al VEB mediante ELISA VCA anti-VEB (1BL International) del suero. Para los estudios de expansión sólo se usaron muestras de seropositivos para HLA-A2+ VEB.

[0403] Las muestras tratadas de manera simulada en los experimentos de expansión de células T específicas de antígeno humano se cultivaron en medios suplementados con 30 U/ml de IL-2 recombinante. Las muestras tratadas de manera simulada en todos los demás experimentos de expansión de células T se cultivaron en medios no suplementados. Para las condiciones de Dynabead comerciales, se usaron DYNABEADS de acuerdo con el protocolo optimizado por el fabricante incluido con el kit. Brevemente, las células T se sembraron a una densidad de 1x10<6>células T/ml con DYNABEADS prelavadas a una relación de perlas a célula de 1:1, en medios suplementados con 30 U/ml de IL-2 recombinante. Para los cultivos de Dynabead, se sembraron 1x10<5>células en el cultivo inicial. Se contaron las células cada tres días y se añadió medio fresco suplementado con IL-2 para llevar la suspensión celular a una densidad de 0,5-1x10<6>células/ml. En general, las células se mantuvieron por debajo de una densidad de 2,5x10<6>células/ml durante todo el periodo de cultivo.

[0404] Para estudios policlonales en ratones, se prepararon APC-MS que presentaban señales de superficie (aCD3 aCD28) en entre un 0,2-1% molar de los lípidos en una relación molar de 1:1, y se añadieron al cultivo inicial a 333 jg/ml. Para estudios policlonales humanos, se prepararon APC-MS que presentaban señales de superficie (aCD3 aCD28) en 0,1% molar o 1% molar de los lípidos a una relación molar de 1:1, y se añadieron al cultivo inicial a 33 jg/m l o 333 jg/ml. Para estudios específicos de antígeno de ratón, se prepararon APC-MS que presentaban señales de superficie (SVYDFFVWL (SEQ ID NO: 3)/H-2K(b) o SIINFEKL (SEQ ID NO: 4)/H-2K(b) aCD28) en 0,01% molar o 0,1% molar de los lípidos en una relación molar de 1:1, y se añadieron al cultivo inicial a 33 jg/m l o 333 jg/ml. Para estudios específicos de antígeno humano, se prepararon APC-MS que presentaban señales de superficie (CLGGLLTMV (SEQ ID NO: 1)/HLA-A2 o GLCTLVAML (SEQ ID NO: 2)/HLA-A2 aCD28) en el 1% molar de los lípidos en una relación molar de 1:1, y se añadieron al cultivo inicial a 333 jg/ml. Los APC-MS que presentan señales en 1% molar de lípidos, añadidas a 333 jg/ml, corresponden a ~55 nM de estímulos de TCR y aCD28 en el cultivo inicial. Para las condiciones de APC ms, las células T se sembraron con la cantidad especificada de material a 5x104 células/ml en medios que no estaban suplementados con IL-2. En todas las condiciones de APC-MS, se sembraron 2,5x104 células en el cultivo inicial. Se añadieron medios durante todo el periodo de cultivo para mantener las células por debajo de una densidad de 2,5x10<6>células/ml. A partir del día 7, cuando se ha liberado la mayor parte de la IL-2 cargada de material, se añadieron medios nuevos suplementados con 30 U/ml de IL-2 recombinante. En los puntos temporales especificados, las células vivas se enumeraron manualmente con un hemocitómetro usando exclusión por azul de tripano, para evitar posibles artefactos con sistemas de recuento automatizados como resultado de contaminantes del material. Después de la enumeración, se evaluó el fenotipo celular usando citometría de flujo. Las compuertas se establecieron para cada punto temporal y muestra de manera independiente basándose en controles de fluorescencia menos uno (FMO).

Estudios funcionales in vitro de células T

[0405] Para los experimentos de cocultivo en los que se evaluó la expresión de IFN<y>y TNFa en células T mediante tinción intracelular de citoquinas, las células estimuladoras (ratón, B16-F10; humano, T2) primero o no se pulsaron o se pulsaron con 1 pg/ml del péptido (ratón, SIINFEKL (SEQ ID NO: 4); humano, CLGGLLTMV (SEQ ID NO: 1) o GLCTLVAML (SEQ ID NO: 2)) durante 30 minutos a 37°C. Posteriormente, se cultivaron 1x105células expandidas con 2x10<4>células estimuladoras durante una hora antes de añadir Brefeldina A (BD Biosciences) para inhibir la secreción de citoquinas, y se cultivaron durante otras cuatro horas. A continuación, se tiñeron las células y se analizaron mediante FACS.

[0406] Los ensayos de destrucciónin vitrose llevaron a cabo incubando en primer lugar las células diana (ratón, B16-F10; humano, T2) en 20 pg/ml de Calceína AM (Biotium) durante 30 minutos a 37°C. Posteriormente, las células diana o no se pulsaron o se pulsaron con 1 pg/ml de péptido (ratón, SIINFEKL (SEQ ID NO: 4); humano, CLGGLLTMV (SEQ ID NO: 1) o GLCTLVAML (SEQ ID NO: 2)) durante 30 minutos a 37°C. A continuación, se cultivaron 5x10<3>células diana con células efectoras expandidas en relaciones de células efectoras:células diana (E:T) de 0, 1, 10, 25 o 50 durante cuatro horas. A continuación, las células se precipitaron y la intensidad de fluorescencia de las muestras sobrenadantes se cuantificó usando un lector de placas. Las concentraciones de IFNy en las muestras sobrenadantes también se cuantificaron mediante ELISA (Biolegend).

A nális is estadístico

[0407] Todos los valores se expresaron como media ± s.d., a menos que se especifique lo contrario. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism y los métodos estadísticos se indican en el texto. En todos los casos, p<0,05 se consideró significativo.

EJEMPLO 12: Análisis de la degradación de APC-MS in vitro

[0408] Para estudiar la degradación de un APC-MS ejemplarin vitro,se realizó el siguiente experimento. Se cultivó APC-ms (167 pg) que comprendía anticuerpos contra aCD3/aCD28 (1% de lípido biotinilado) y liberaba IL-2 con células T primarias de ratón (25e4 células T/167 pg MSRs). En varios puntos temporales, los cultivos se centrifugaron a 700 rcf durante 5 min, y el contenido de sílice (Si) en los sedimentos se cuantificó mediante espectrometría de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES; Galbraith Laboratories). Como se muestra en laFig.

37,el sílice era indetectable en los sedimentos de cultivo después de aproximadamente 1 semana.

EJEMPLO 13: Liberación controlada de varias cargas útiles inmunodirigidas solubles de los APC-MS

[0409] Para estudiar la liberación de cargas útiles de citoquinas a partir de APC-MS ejemplares, se realizó el siguiente experimento. Se cargaron cuatro APC-MS que contenían cada una 2 pg de IL-2, IL-21, TGFp o IL-15SA en microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de 500 pg antes del recubrimiento lipídico. Las muestras se lavaron a fondo para eliminar cualquier proteína no cargada y posteriormente se mantuvieron a 37°C durante un máximo de 28 días. La liberación de la carga útil a lo largo del tiempo se evaluó mediante ELISA. Como se muestra en la Fig. 38, se observó una liberación controlada de las citoquinas de los APC-MS a lo largo del experimento. Es probable que la cinética de liberación dependa de las propiedades fisicoquímicas de la citoquina en particular.

EJEMPLO 14: Conjugación de anticuerpos para las MSR-SLB mediante reacción química de clic

[0410] Para determinar si una molécula funcional podría ser conjugada con la bicapa lipídica de MSR-SLB se realizó el siguiente experimento. La IgG se marcó específicamente con grupos azida usando el Sistema de Marcado de Anticuerpos Thermo SiteClick. También se prepararon MSR-SLB que contenían cantidades variables (% molar) de lípidos modificados con DBCO (Avanti Polar Lipids). Como se muestra en lasFigs. 42Ay42B, la IgG modificada con azida se conjugó con éxito en la bicapa lipídica de las MSR-SLB de manera dependiente de la concentración.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un andamiaje mimético de células presentadoras de antígeno (APC-MS), que comprende

una capa de base que comprende microvarillas de sílice mesoporosa (MSR) de alta área superficial;

una bicapa lipídica soportada por fluido (SLB) estratificada sobre la capa base de MSR; y

una o más moléculas funcionales seleccionadas entre una molécula activadora de células T y una molécula coestimuladora de células T o una combinación de las mismas.

2. El andamiaje de la reivindicación 1, en donde el andamiaje comprende por lo menos una molécula activadora de células T y por lo menos una molécula coestimuladora de células T.

3. El andamiaje de la reivindicación 1 o 2, en donde el andamiaje comprende además por lo menos un agente homeostático de células T.

4. El andamiaje de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el andamiaje comprende una pluralidad de moléculas activadoras de células T, moléculas coestimuladoras de células T y agentes homeostáticos de células T.

5. El andamiaje de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde las una o más moléculas funcionales se adsorben en la capa base de MSR y/o en la capa de SLB.

<6>. El andamiaje de la reivindicación 1, en donde las células T se seleccionan del grupo que consiste en células T asesinas naturales, células T gamma delta, células T CD3+, células T CD4+, células T CD<8>+ y células T reguladoras (Tregs), o una combinación de las mismas,

opcionalmente, en donde las células T reguladoras (Tregs) se seleccionan del grupo que consiste en células Treg FOXP3+ y células Treg FOXP3.

7. El andamiaje de la reivindicación 3 o 4, en donde el agente homeostático de células T se adsorbe en la capa base de MSR y en donde las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T se adsorben, cada una independientemente, en la capa de SLB;

opcionalmente, en donde las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T se adsorben en la capa de SLB mediante emparejamiento por afinidad o ligación química.

<8>. El andamiaje de la reivindicación 1, en donde el andamiaje comprende:

una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a una proteína de fusión Fc;

un compuesto de reclutamiento seleccionado del grupo que consiste en factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), ligando de quimiocina (motivo C-C) 21 (CCL-21), ligando de quimiocina (motivo C-C) 19 (CCL-19), ligando de quimiocina (motivo C-X-C) 12 (Cx Cl 12), interferón gamma (IFNy), o un ligando de tirosina quinasa 3 similar al FMS (Flt-3); o un antígeno.

9. El andamiaje de la reivindicación 1, en donde la relación de peso entre la SLB y las MSR está comprendida entre aproximadamente<1 0 : 1>y aproximadamente<1>:<2 0>;

opcionalmente, en donde la relación de peso es de aproximadamente 1:4,

opcionalmente, además, en donde la relación de peso refleja la relación entre el lípido y las MSR antes de la carga.

10. El andamiaje de la reivindicación 1, en donde la relación de peso seco de las MSR con respecto a las moléculas activadoras/coestimuladoras de células T está comprendida entre aproximadamente 500:1 y aproximadamente 1:1.

11. El andamiaje de la reivindicación 1, en donde las MSR comprenden una longitud de 50 pm a 200 pm, opcionalmente en donde la longitud es de 100 pm o 70 pm.

12. El andamiaje de la reivindicación 1, en donde las MSR comprenden un diámetro medio de 4,5 pm, opcionalmente en donde las MSR comprenden una relación de aspecto media de 20; opcionalmente además en donde las MSR comprenden una longitud media de<8 8>pm.

13. Un dispositivo que comprende una pluralidad de andamiajes de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde los andamiajes se apilan para permitir selectivamente la infiltración de células T en las MSR.

14. Una composición farmacéutica que comprende el andamiaje de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 y un portador farmacéuticamente aceptable.

15. Una composición que comprende el andamiaje de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 y células T agrupadas en el mismo; opcionalmente, en donde las células T se seleccionan del grupo que consiste en células T asesinas naturales, células T gamma delta, células T CD3+, células T CD4+, células T CD8+ y células T reguladoras (Tregs), o una combinación de las mismas, opcionalmente, en donde las células T reguladoras (Tregs) se seleccionan del grupo que consiste en células Treg FOXP3+ y células Treg FOXP3.

16. Un métodoex vivopara la manipulación de células T, que comprende cultivar una muestra que contiene células T con el andamiaje de cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

17. El método de la reivindicación 16, que comprende

poner en contacto el andamiaje con la muestra biológica de un sujeto, activando, coestimulando, manteniendo homeostáticamente y opcionalmente expandiendo de este modo una población de células T presentes en la muestra, manipulando de este modo las células T.

18. El método de la reivindicación 17, en donde las células T se expanden selectivamente para generar una población policlonal de células T de memoria efectora, efectoras, de memoria central y/o vírgenes.

19. El método de la reivindicación 17, en donde la manipulación comprende identificar o aislar células T agotadas y, opcionalmente, eliminar las células T agotadas; opcionalmente, en donde las células T agotadas se identifican o aíslan basándose en la expresión de la superficie celular de CD8+/PD-1+ y/o LAG3+/TIM3+.

20. El método de la reivindicación 17, en donde una muestra biológica se obtiene de un sujeto; y el andamiaje de la reivindicación 1 se pone en contacto con la muestra biológicaex vivopara manipular las células T del sujetoex vivo;opcionalmente, en donde el método comprende además detectar la expresión de un marcador de superficie celular en las células T manipuladas; opcionalmente, en donde el marcador de superficie celular se selecciona del grupo que consiste en CD69, CD4, CD8, CD25, CD62L, FOXP3, HLA-DR, CD28 y CD134, o una combinación de los mismos.

21. Un método para elaborar el andamiaje de la reivindicación 3 o 4, que comprende:

(a) proporcionar una capa de base que comprenda MSR de alta área superficial;

(b) opcionalmente, cargar los agentes homeostáticos de células T en las MSR;

(c) estratificar una SLB fluida sobre la capa base que comprende las MSR, generando de este modo un material compuesto de MSR-SLB;

(d) cargar los agentes homeostáticos de células T en el material compuesto de MSR-SLB si no se lleva a cabo el paso (b);

(e) opcionalmente, bloquear uno o más sitios de integración no específicos en el material compuesto de MSR-SLB con un bloqueador; y

(f) cargar las moléculas activadoras de células T y las moléculas coestimuladoras de células T sobre el material compuesto de MSR-SLB, elaborando de este modo el andamiaje de la reivindicación 3 o 4.