ES2952050T3 - Composiciones de exosomas y métodos para su preparación y uso para la regulación y el acondicionamiento de la piel y el cabello - Google Patents

Abstract

Se proporcionan composiciones mejoradas que contienen exosomas de células madre, junto con métodos para su preparación y uso para regular la condición de la piel. Las composiciones proporcionadas contienen exosomas de células madre aisladas que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico. Los usos de las composiciones que contienen exosomas para regular la piel humana incluyen inducir una mayor integridad de la piel mediante la renovación celular, mejorar el contenido de agua o la humedad de la piel, reducir la pérdida de agua transepidérmica, la descamación y la descamación de la piel, mejorar el espesor de la piel, mejorar las propiedades de tracción de la piel, reducir la apariencia de líneas finas y arrugas dérmicas, mejora la textura de la piel, reduce el tamaño de los poros de la piel, mejora la suavidad de la piel, mejora las manchas de la edad de la piel, mejora el tono de la piel y mejora la apariencia de cicatrices y abrasiones de la piel. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de exosomas y métodos para su preparación y uso para la regulación y el acondicionamiento de la piel y el cabello

Campo técnico

La presente descripción se refiere a composiciones de exosomas de células madre y su preparación para usos que incluyen la regulación y el acondicionamiento de la piel y el cabello.

Antecedentes

Los tratamientos existentes para el envejecimiento y la piel arrugada son temporales y muchos tratamientos son ineficaces o tienen efectos secundarios no deseados. Durante el proceso de envejecimiento, la piel pierde grosor y elasticidad debido a la pérdida de colágeno y otras proteínas elásticas en las capas dérmicas. Estas pérdidas pueden resultar en líneas finas y arrugas. Los métodos comunes no invasivos para tratar las líneas finas y las arrugas incluyen la aplicación tópica de formulaciones sobre la piel. Las formulaciones comúnmente incluyen ácidos alfa y beta hidroxilo, ácidos retinoicos, argirelinas y vitaminas. Ninguna de estas formulaciones elimina por completo las arrugas y muchas son costosas. Además, aunque algunas formulaciones irritan la piel para provocar una respuesta de cicatrización de heridas, esto no da como resultado la reposición de la piel adelgazada para tratar y/o prevenir suficientemente los defectos relacionados con la edad.

El envejecimiento de la piel se caracteriza por una disminución en la síntesis de colágeno y un aumento en la descomposición del colágeno. En general, se acepta que la descomposición del colágeno está mediada por metaloproteinasas (1). Se cree que la pérdida de colágeno dérmico contribuye a la aparición de líneas finas y arrugas. Se cree que los factores biológicos que estimulan la producción de colágeno en la cicatrización de heridas podrían ser beneficiosos para la piel envejecida. Como resultado, las formulaciones para regular el estado de la piel tales como aquellas para tratar y/o reducir la apariencia de líneas finas y arrugas pueden incluir factores de crecimiento, fragmentos de péptidos y otras moléculas biológicamente activas.

Los factores de crecimiento son típicamente péptidos con diversos efectos biológicos. Algunas familias de factores de crecimiento que se han identificado como útiles en la cicatrización de heridas y la remodelación epidérmica incluyen, por ejemplo, factor de crecimiento transformante p (TGF-p), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factores de crecimiento similares a la insulina (IGF), derivados de plaquetas factor de crecimiento (PDGF) y factores de crecimiento de fibroblastos (FGF). Una fuente de factores de crecimiento para regular el estado de la piel incluye los secretados por células vivas cultivadas. Los factores de crecimiento y otras moléculas extracelulares, incluidas las proteínas y los péptidos, se secretan en el medio nutritivo en el que se cultivan. El medio expuesto a las células en cultivo se denomina "medio acondicionado".

Además de secretar proteínas extracelulares como factores de crecimiento, las células cultivadas también secretan vesículas extracelulares conocidas como microvesículas o exosomas. Estas microvesículas secretadas, que alguna vez se consideraron desechos contaminantes en el cultivo celular, también se denominan exosomas y están empaquetadas con cargas de proteínas y ARN. Los exosomas contienen moléculas funcionales de ARNm, ARNml, ADN y proteínas que pueden ser captadas por las células diana. El análisis proteómico y genómico de la carga de exosomas ha revelado una amplia gama de factores de señalización que son tanto específicos del tipo de célula como regulados diferencialmente en función del entorno de las células secretoras [2]. Se ha demostrado previamente que HSP70 es un componente de carga de los exosomas [3, 4, 5]. La información genética contenida en los exosomas puede influir o incluso dirigir el destino de la célula diana, por ejemplo, desencadenando la activación, migración, crecimiento, diferenciación o desdiferenciación de la célula diana, o promoviendo la apoptosis o la necrosis. Como tales, los exosomas pueden proporcionar factores celulares adicionales para ayudar en la cicatrización de heridas y la remodelación epitelial.

Las terapias con células madre también representan un medio convincente para reparar el tejido dañado, y varias de estas estrategias se han evaluado para la reparación de tejidos orales y huesos craneomaxilofaciales [6-8]. Por ejemplo, las células madre mesenquimales (MSC) representan una fuente accesible, numerosa y bien caracterizada de células madre. Una variedad de estudios ha examinado la capacidad de las células madre para regenerar tejidos periodontales, con estudios que incluyen células madre derivadas del tejido adiposo y la médula ósea [9, 10]. Sin embargo, aunque estos informes respaldan el potencial de las terapias basadas en células madre para la gingivitis y la periodontitis, todavía no hay ninguna disponible comercialmente.

A pesar de la demostración repetida de mejoras inducidas por MSC en la reparación de tejidos como huesos, cartílagos y tendones, sigue siendo difícil encontrar un mecanismo de consenso para la reparación inducida por MSC. El concepto intuitivo de que las células madre terapéuticas se injertan y se diferencian en sitios de daño tisular no está bien respaldado dada la baja cantidad de células retenidas con el tiempo en sitios de inyección in vivo, con una serie de tecnologías de encapsulación y administración, como microesferas y láminas celulares en desarrollo [11, 12]. Alternativamente, se ha demostrado que las MSC ejercen efectos de reparación de tejidos a través de una modalidad paracrina, secretando factores que desencadenan cascadas de reparación de daños en el sitio del huésped [13-15]. También se ha demostrado que las células del ligamento periodontal proliferan en respuesta a medios acondicionados derivados de células madre [16]. Además, se ha demostrado que los factores ambientales, como las citoquinas proinflamatorias y el lisado de plaquetas, estimulan cambios en la composición y abundancia del factor paracrino de las MSC [17, 18]. Concomitantemente con el creciente interés en la actividad paracrina de MSC, los exosomas derivados de MSC se han convertido en un objetivo relativamente nuevo para la investigación [19]. La hipótesis de que los exosomas ejercen las actividades paracrinas primarias de las células madre ha ganado apoyo a través de modelos in vivo de reparación de tejidos [20, 21].

Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad insatisfecha de formulaciones tópicas más eficaces para regular el estado de la piel, como mejorar el daño de la piel, las arrugas y otros defectos que incluyen cicatrices, queloides, decoloraciones de la piel y abrasiones de la piel.

El objeto descrito en la presente proporciona composiciones de exosomas mejoradas y métodos de preparación y uso de las mismas para regular el estado de la piel.

Resumen

En una realización, se proporciona una composición tópica para regular un estado cosmético de la piel o el cabello, comprendiendo la composición: i) una cantidad eficaz de exosomas aislados que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico; y ii) un vehículo, en el que los exosomas aislados se producen mediante un proceso que comprende: (a) cultivar células madre en medio de cultivo, en el que el cultivo incluye una etapa de aplicar un choque térmico a las células madre en un medio de cultivo libre de suero aumentando la temperatura de cultivo de aproximadamente 41 °C a aproximadamente 43 °C durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 3 horas, y en el que el medio de cultivo sin suero contiene los exosomas que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico; y (b) aislar los exosomas que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico del medio sin suero.

En una realización, se proporciona un método para preparar una composición tópica para regular una condición cosmética de la piel o el cabello, comprendiendo el método combinar una cantidad efectiva de exosomas aislados que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico con un vehículo.

En una realización, se proporciona un método para regular el estado de la piel que comprende aplicar a la piel humana al menos una vez al día durante al menos siete días una composición tópica que comprende: i) una cantidad eficaz de exosomas de células madre aisladas que tienen niveles aumentados de estrés por choque térmico -moléculas de respuesta; y ii) un vehículo, en el que los exosomas de células madre se producen mediante un proceso que comprende: (a) cultivar células madre en medio de cultivo, en el que el cultivo incluye una etapa de aplicar un choque térmico a las células madre en un medio de cultivo libre de suero aumentando la temperatura de cultivo de aproximadamente 41 °C a aproximadamente 43 °C durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 3 horas, y en el que el medio de cultivo sin suero contiene los exosomas que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico; y (b) aislar los exosomas que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico del medio sin suero, en el que la regulación de la condición de la piel incluye uno o más de inducir una mayor integridad de la piel mediante la renovación celular, mejorar el contenido de agua o la humedad de la piel, reducir pérdida de agua transepidérmica, descamación y descamación de la piel, mejora del grosor de la piel, mejora de las propiedades de tracción de la piel, reducción de la apariencia de líneas finas y arrugas dérmicas, mejora de la textura de la piel, reducción del tamaño de los poros de la piel, mejora de la suavidad de la piel, mejora de las manchas de la edad de la piel, mejora de la piel tono, o mejorar la apariencia de cicatrices y abrasiones de la piel.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1 es un gráfico que muestra la distribución de tamaños (media 152 nm, moda 107 nm) de una muestra representativa de exosomas de choque térmico aislados según una o más realizaciones de la presente divulgación. El recuadro de la fig. 1 es una imagen de microscopía electrónica de barrido de una muestra representativa separada de los exosomas de choque térmico aislados según una o más realizaciones de la presente divulgación que muestra el tamaño y la forma de las partículas del exosoma.

FIG. 2 es un gráfico de barras de datos de transferencia Western cuantificados que muestra la cantidad de proteína HSP70 en relación con la proteína p-actina en dos preparaciones separadas de exosomas: 1) secretada por células cultivadas a 37°C sin un paso de choque térmico (Control; las barras en blanco y rayadas representan las preparaciones separadas); y 2) secretada por células sometidas a un paso de choque térmico de 2 horas a 43 °C (choque térmico; las barras en blanco y rayadas representan las preparaciones separadas), según una o más realizaciones de la presente divulgación.

FIG. 3 es un gráfico de histogramas de datos de citometría de flujo de células HPAE incubadas con exosomas aislados que muestra la transferencia del tinte cargado en los exosomas a las células HPAE. Las células HPAE se incubaron con exosomas cargados con tinte a 4 °C (histograma más a la izquierda) o a 37 °C (histograma más a la derecha). Los exosomas aislados se prepararon a partir de células madre sometidas a un paso de choque térmico según una o más realizaciones de la presente divulgación.

FIG. 4A es un gráfico que muestra la cantidad de proliferación celular en fibroblastos del ligamento periodontal después de una incubación de 3 días con medio libre de suero, varios factores de crecimiento o exosomas secretados a partir de células cultivadas con o sin un paso de choque térmico de acuerdo con una o más realizaciones de la presente descripción . Los valores que se muestran en el eje Y son unidades relativas de fluorescencia (RFU).

FIG. 4B es un gráfico que muestra la cantidad de proliferación celular en fibroblastos dérmicos después de una incubación de 3 días con medio sin suero, diversos factores de crecimiento o exosomas secretados a partir de células cultivadas con o sin un paso de choque térmico según una o más realizaciones de la presente descripción. Los valores que se muestran en el eje Y son unidades relativas de fluorescencia (RFU).

FIG. 5A es un gráfico que muestra la cantidad de producción de colágeno I en fibroblastos del ligamento periodontal después de una incubación de 48 horas con control de medio, varios factores de crecimiento o exosomas secretados a partir de células cultivadas con o sin un paso de choque térmico de acuerdo con una o más realizaciones de la presente divulgación. Los valores que se muestran en el eje Y son ng/ml de colágeno.

FIG. 5B es un gráfico que muestra la cantidad de producción de colágeno I en fibroblastos dérmicos después de una incubación de 48 horas con control de medio, varios factores de crecimiento o exosomas secretados a partir de células cultivadas con o sin un paso de choque térmico según una o más realizaciones de la presente descripción. Los valores que se muestran en el eje Y son ng/ml de colágeno.

FIG. 6 es un gráfico que muestra datos cuantificados de RT-qPCR de la citocina inflamatoria IL6 de fibroblastos del ligamento periodontal (PDLF) después de incubarse durante la noche con los siguientes tratamientos: sin HKPG ni exosomas (sin Tx), con 107/ml HKPG y sin exosomas (No Exosomes), o con 107/ml HKPG en combinación con exosomas aislados derivados de células madre adiposas preparados a partir de cultivos celulares con un paso de choque térmico (Exosomas de choque térmico) y sin un paso de choque térmico (Exosomas estándar), según una o más realizaciones de la presente divulgación.

FIG. 7 es un gráfico que muestra la reducción en la producción de IL-8 por queratinocitos adultos humanos en ausencia de radiación UVB (sin UVB) con varias cantidades de exosomas de choque térmico en comparación con un control de medios (solo medios) de acuerdo con una o más realizaciones de la presente divulgación.

FIG. 8 es un gráfico que muestra la reducción en la producción de IL-8 por queratinocitos adultos humanos en presencia de radiación UVB (40 mJ/cm2 UVB) con diversas cantidades de exosomas de choque térmico en comparación con un control de medios (solo medios) según una o más realizaciones de la presente revelación.

FIG. 9 es un gráfico que muestra una comparación lado a lado de los datos en la fig. 7 y la figura. 8 gráficos.

FIG. 10 es un gráfico que muestra la cantidad de TNF-a producido en presencia de varias concentraciones de exosomas de choque térmico en presencia (40 mJ/cm2 UVB) y ausencia (sin UVB) de radiación UVB en comparación con un control de solo medio (Solo medios) según una o más realizaciones de la presente divulgación.

Descripción detallada

Con el fin de promover la comprensión de los principios de la presente divulgación, ahora se hará referencia a las realizaciones preferidas y se usará un lenguaje específico para describirlas. No obstante, se entenderá que no se pretende limitar el alcance de la divulgación, estando contempladas tales alteraciones y modificaciones adicionales de la divulgación como se ilustra aquí como normalmente se le ocurriría a un experto en la técnica a la que se refiere la divulgación.

Existe una necesidad insatisfecha de formulaciones tópicas más eficaces para regular el estado de la piel, como el tratamiento y la prevención de daños en la piel, arrugas y otros defectos que incluyen cicatrices, queloides, decoloraciones de la piel y abrasiones de la piel. Sigue existiendo otra necesidad importante e insatisfecha de formulaciones más eficaces para reparar el daño de los tejidos blandos, incluida la reparación del tejido periodontal, y la reparación de quemaduras, incluidas las quemaduras resultantes del tratamiento con radiación. Para resolver estas necesidades no satisfechas, el objeto descrito actualmente proporciona composiciones de exosomas derivadas de células madre mejoradas, incluidas composiciones de exosomas derivadas de células madre mesenquimales (MSC), y métodos para su preparación y uso, para regular el estado de la piel y reparar daños en los tejidos blandos.

Los exosomas representan una terapéutica convincente para una variedad de indicaciones, especialmente aquellas que requieren la entrega a tejidos con vasculatura reducida o necrosis prominente. Los exosomas, a diferencia de las células madre, no requieren un suministro de sangre oxigenada para ejercer su impacto. Y, debido a que los exosomas se fusionan directamente con las membranas celulares, no hay ningún requisito para la captación mediada por receptores de sus cargas procurativas. En consecuencia, los exosomas aislados producidos de acuerdo con los métodos proporcionados en este documento pueden tener ventajas sobre los productos farmacéuticos sistémicos existentes o la aplicación directa de células madre para regular el estado de la piel y reparar el daño de los tejidos blandos.

Las composiciones mejoradas que contienen exosomas de la presente descripción se basan en la dependencia del contexto de la carga de exosomas. Más específicamente, la presente descripción proporciona métodos que demuestran que la carga de exosomas puede diseñarse para dar como resultado exosomas que tengan actividades de curación mejoradas, como e incluyendo actividades proliferativas y antiinflamatorias aumentadas. Los exosomas aislados de la presente divulgación se preparan a partir de cultivos de células madre en un entorno altamente controlado y se administran varios estímulos a los cultivos de células madre para manipular la carga exosomal. En un ejemplo de suministro de exosomas diseñados para una actividad favorable a la curación, los cultivos de células madre se someten a altas temperaturas (también conocido como "choque térmico") para producir exosomas con mayores niveles de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico, incluida la proteína de respuesta al estrés. , HSP70. Se demuestra aquí que los exosomas aislados que tienen moléculas de respuesta al estrés por choque térmico aumentadas tienen actividad proliferativa y antiinflamatoria aumentada en cultivos celulares.

Los términos "exosomas", "microvesículas", "microvesículas secretadas", "vesículas extracelulares" y "vesículas secretadas" se usan indistintamente en el presente documento para los fines de la memoria descriptiva y las reivindicaciones.

Los términos "secado por congelación" y "liofilización" se usan indistintamente en este documento para los fines de la especificación y las reivindicaciones.

Los términos "moléculas de respuesta al estrés" y "moléculas de respuesta al estrés por choque térmico" se usan indistintamente en el presente documento para los fines de la memoria descriptiva y las reivindicaciones. Estos términos pretenden incluir moléculas presentes en los exosomas que son secretadas por células madre cultivadas sujetas a altas temperaturas (también conocido como "choque térmico"). De manera similar, los términos "exosomas" y "exosomas de choque térmico" y "exosomas de choque térmico" se usan indistintamente aquí para los fines de la especificación y las reivindicaciones para representar exosomas que son secretados por células madre cultivadas sometidas a alta temperatura (también conocido como " Golpe de calor").

Los términos "un", "uno, una" y "el, la" se refieren a "uno, una o más" cuando se usan en esta solicitud, incluidas las reivindicaciones.

A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones, los términos "comprende", "comprende" y "que comprende" se utilizan en un sentido no exclusivo, excepto cuando el contexto requiera lo contrario. Del mismo modo, el término "incluir" y sus variantes gramaticales pretenden ser no limitativos, de modo que la recitación de elementos en una lista no excluya otros elementos similares que puedan sustituirse o agregarse a los elementos enumerados.

A los efectos de esta memoria descriptiva y reivindicaciones, el término "sobre", cuando se utiliza en relación con uno o más números o rangos numéricos, debe entenderse que se refiere a todos esos números, incluidos todos los números en un rango y modifica ese rango al extender el límites por encima y por debajo de los valores numéricos establecidos. La recitación de rangos numéricos por puntos finales incluye todos los números, por ejemplo, números enteros, incluidas sus fracciones, incluidos dentro de ese rango. Por ejemplo, la enumeración de aproximadamente 41 a aproximadamente 43 incluye 41,42 y 43, así como fracciones de los mismos, por ejemplo, entre otros, 40.5, 40.6, 40.7, 40.8, 40.9, 41.5, 42.25, 42.5, 43.1 , 43.2, 43.3, 43.4, 43.5 y similares, y la enumeración de 1 a 3 incluye 1,2 y 3, así como fracciones de los mismos, por ejemplo, entre otros, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,5,2.25, 3.5 y similares y cualquier rango dentro de ese rango.

Más específicamente, en una realización de la presente divulgación se proporciona una composición, la composición incluye: i) exosomas de células madre aisladas que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico; y ii) un vehículo, en el que los exosomas de células madre se producen mediante un proceso que incluye: (a) cultivar células madre en un medio de cultivo, en el que el cultivo incluye una etapa de aplicar un choque térmico a las células madre en un medio de cultivo libre de suero aumentando la temperatura de cultivo a alrededor de 41 °C a alrededor de 43 °C durante alrededor de 1 hora a alrededor de 3 horas; y (b) aislar los exosomas que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico del medio de cultivo sin suero.

La composición puede estar en forma de líquido, loción, crema, gel, espuma, mousse, spray, pasta, polvo o sólido.

En la composición, el aislamiento de los exosomas se puede realizar mediante uno o más pasos de centrifugación. Los uno o más pasos de centrifugación pueden incluir la centrifugación a 100.000X go más. En la composición, el aislamiento de los exosomas puede incluir además la liofilización de los exosomas aislados. En la composición, el proceso puede comprender además cultivar las células madre en el medio de cultivo sin suero a una temperatura de aproximadamente 36 °C a 38 °C durante aproximadamente 24 horas a aproximadamente 72 horas posteriores a la etapa de choque térmico. El medio sin suero puede estar libre de productos animales. Las células madre pueden ser células madre mesenquimatosas. Las células madre mesenquimales pueden ser de origen placentario o adiposo. Las moléculas de respuesta al estrés por choque térmico pueden incluir HSP70.

En una realización, se proporciona un método para fabricar exosomas de células madre que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico, el método incluye: cultivar células madre en un medio de cultivo, en el que el cultivo incluye un paso de aplicar un golpe térmico a las células madre en un medios de cultivo sin suero aumentando la temperatura de cultivo de aproximadamente 41 °C a aproximadamente 43 °C durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 3 horas, y en los que el medio de cultivo sin suero contiene los exosomas que tienen niveles aumentados de respuesta al estrés por choque térmico moléculas.

El método puede incluir además el aislamiento de los exosomas del medio de cultivo sin suero. El aislamiento puede realizarse mediante uno o más pasos de centrifugación. El uno o más pasos de centrifugación pueden incluir centrifugación a 100.000 X go más.

El método puede incluir además la liofilización de los exosomas aislados, de modo que los exosomas se puedan almacenar a temperatura ambiente.

El método puede incluir además el cultivo de las células madre en el medio de cultivo sin suero a una temperatura de aproximadamente 36 °C a 38 °C durante aproximadamente 24 horas a aproximadamente 72 horas posteriores a la etapa de choque térmico.

En el método, el medio sin suero puede estar libre de productos animales. Las células madre pueden ser células madre mesenquimatosas. Las células madre mesenquimales pueden ser de origen placentario o adiposo. Las moléculas de respuesta al estrés por choque térmico pueden incluir HSP70.

La caracterización del tamaño y la forma de los exosomas aislados producidos según los métodos de la presente descripción se describe en el Ejemplo 3 y los resultados se muestran en el gráfico de la FIG. 1. FIG. 1 muestra la distribución de tamaños de una muestra representativa de exosomas aislados con una media de 152 nm y una moda de 107 nm. En el recuadro de la FIG. 1.

El ejemplo 4 describe el análisis de los exosomas aislados producidos de acuerdo con los métodos de la presente descripción para marcadores proteicos específicos que incluyen Hsp70. Los datos resultantes se muestran en la FIG.

2. FIG. 2 es un gráfico de barras de datos de transferencia Western cuantificados que muestran la cantidad de HSP70 en relación con la p-actina en los exosomas secretados por células madre cultivadas a 37 °C sin un paso de choque térmico (Control) y exosomas de las mismas células madre sometidas a un Paso de choque térmico de 2 h a 43 °C (choque térmico). Los datos de la fig. 2 indican que existe una regulación al alza significativa en la HSP70 exosómica en relación con la p-actina en los exosomas de las células sometidas a un choque térmico en comparación con los exosomas de las células cultivadas sin el paso de choque térmico.

La capacidad de los exosomas aislados preparados de acuerdo con los métodos de la presente descripción para entregar carga a las células se evaluó monitoreando la capacidad de los exosomas aislados para transferir un colorante lipófilo a las células en cultivo. El experimento se describe en el Ejemplo 5 y los resultados se muestran en la FIG. 3. Los resultados indican una transferencia eficiente del tinte desde los exosomas aislados a las células endoteliales de la arteria pulmonar humana (HPAE) con el 75 % de las células marcadas.

Los efectos de los exosomas aislados producidos de acuerdo con los métodos de la presente divulgación en células periodontales y dérmicas cultivadas se describen en el Ejemplo 6. Las figuras 4A y 4^b muestran que el tratamiento con los exosomas aislados de las células sometidas a un choque térmico aumentó significativamente la proliferación tanto de los fibroblastos del ligamento periodontal (PDLF) como de los fibroblastos dérmicos (DF), en comparación con los exosomas aislados preparados a partir de células que no se sometieron a calor. paso de choque Además, el nivel de proliferación de los Pd Lf y DF inducidos por los exosomas aislados de las células sometidas a choque térmico se acercó o superó al inducido por el medio completo y los factores de crecimiento individuales.

Además de la degradación de la fibra de colágeno y la matriz extracelular asociada con el envejecimiento de la piel y su relación con la reparación de heridas, la enfermedad periodontal está asociada con la degradación de la matriz extracelular y la degeneración de la fibra de colágeno. Los experimentos adicionales descritos en el Ejemplo 6 demuestran que los exosomas aislados preparados a partir de células sometidas a un choque térmico según los métodos de la presente divulgación pueden inducir la síntesis de colágeno I en PDLF y DF. Los gráficos de la fig. 5A y 5B muestran que el tratamiento con los exosomas aislados de las células sometidas a un choque térmico aumentó la producción de colágeno I tanto de PDLF como de DF, en comparación con los exosomas aislados preparados a partir de células que no se sometieron a un paso de choque térmico. Además, el aumento en la producción de colágeno I de los PDLF y D^f inducido por los exosomas aislados de las células sometidas a choque térmico superó al de los factores de crecimiento individuales. Estos datos indican que los exosomas aislados pueden desempeñar un papel en la regulación del estado de la piel y la reparación del daño de los tejidos blandos.

P gingivalis es una de las especies bacterianas conocidas por contribuir a la patogénesis de la periodontitis al secretar varias toxinas letales para las células de los tejidos blandos orales. Informes anteriores indican la inducción de cascadas inflamatorias en queratinocitos gingivales (GK) y PDLF en respuesta a P. gingivalis lisados, incluidas las moléculas inflamatorias IL6 e IL8 [22-24]. En el experimento descrito en el Ejemplo 7, las células PDLF se expusieron concomitantemente a calor liofilizado muerto P gingivalis (HKPG, 107/ml) y los exosomas aislados del medio de cultivos celulares sometidos a choque térmico de acuerdo con los métodos de la presente descripción. Los resultados indican una elevación estadísticamente significativa en la expresión del gen IL-6 en células HPLF inducidas por calor PAG. encía (HKPG) a 1 x 10AHml. La elevación se reduce significativamente con los exosomas estándar aislados, y aún más con los exosomas de células aisladas producidos con un paso de choque térmico. Estos datos indican que los exosomas aislados de la presente descripción pueden inhibir la producción de citoquina inflamatorias, incluida la IL6, que actúan localmente para reclutar monocitos en el sitio de la inflamación.

Se divulga un método para tratar una condición de la piel, el método incluye uno o más de poner, incrustar o rellenar un área en la piel de un cuerpo vivo una composición de la presente divulgación que incluye exosomas de células madre aisladas que tienen niveles aumentados de calor moléculas de respuesta al estrés por choque, en las que se trata el estado de la piel.

La afección de la piel puede incluir, por ejemplo, una o más de una herida, una quemadura, una quemadura resultante de un tratamiento con radiación, una decoloración, una cicatriz y un queloide.

En una realización, se proporciona una composición tópica para regular el estado de la piel, comprendiendo la composición una cantidad eficaz de exosomas aislados que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico y un vehículo.

En una realización, se proporciona una composición tópica para regular el estado de la piel, la composición incluye: i) una cantidad eficaz de exosomas aislados que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico; y ii) un vehículo, en el que los exosomas aislados se aíslan de un medio de cultivo sin suero acondicionado mediante el cultivo de células madre en condiciones que incluyen un choque térmico de las células madre en el medio de cultivo sin suero a una temperatura de aproximadamente 41 °C. a aproximadamente 43°C durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 3 horas.

En una realización, se proporciona una composición tópica para regular el estado de la piel, comprendiendo la composición: i) una cantidad eficaz de exosomas aislados que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico; y ii) un vehículo, en el que los exosomas aislados se producen mediante un proceso que comprende: (a) cultivar células madre en medio de cultivo, en el que el cultivo incluye una etapa de aplicar un choque térmico a las células madre en un medio de cultivo libre de suero aumentando la temperatura de cultivo de aproximadamente 41 °C a aproximadamente 43 °C durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 3 horas, y en el que el medio de cultivo sin suero contiene los exosomas que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico; y (b) aislar los exosomas que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico del medio sin suero.

En una realización, se proporciona un método para preparar una composición tópica para regular el estado de la piel, comprendiendo el método combinar una cantidad eficaz de exosomas aislados que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico con un vehículo.

En una realización, se proporciona un método para hacer una composición tópica para regular la condición de la piel, el método incluye: combinar exosomas aislados que tienen niveles elevados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico con un vehículo, en el que los exosomas se aíslan de un cultivo libre de suero medio acondicionado mediante el cultivo de células madre en condiciones que incluyen un choque térmico de las células madre a una temperatura de aproximadamente 41°C a aproximadamente 43°C durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 3 horas.

En una realización, se proporciona un método para hacer una composición tópica para regular la condición de la piel, el método comprende combinar una cantidad efectiva de exosomas aislados que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico con un vehículo, donde los exosomas se producen mediante un proceso que comprende: (a) cultivar células madre en medio de cultivo, en el que el cultivo incluye una etapa de aplicar un choque térmico a las células madre en un medio de cultivo libre de suero aumentando la temperatura de cultivo de aproximadamente 41 °C a aproximadamente 43 °C durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 3 horas, y en el que el medio de cultivo sin suero contiene los exosomas que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico; y (b) aislar los exosomas que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico del medio sin suero.

En las composiciones proporcionadas para regular la condición de la piel, la regulación de la condición de la piel puede incluir uno o más de inducir una mayor integridad de la piel mediante la renovación celular; mejorar el contenido de agua o la humedad de la piel; reducir la pérdida de agua transepidérmica, la descamación de la piel y la descamación; mejorar el grosor de la piel; mejorar las propiedades de tracción de la piel; reducir la aparición de líneas finas y arrugas dérmicas; mejorar la textura de la piel; reducir el tamaño de los poros de la piel; mejorar la suavidad de la piel; mejorar las manchas de la edad de la piel; mejorar el tono de la piel; o mejorar la apariencia de cicatrices y abrasiones en la piel.

En las composiciones proporcionadas para regular el estado de la piel, la composición puede incluir además de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20% de un agente humectante. El agente humectante puede incluir uno o más de pantenol, derivados del ácido pantoténico, glicerina, glicerol, dimeticona, vaselina, ácido hialurónico o ceremidas y mezclas de los mismos.

En las composiciones proporcionadas para regular el estado de la piel, la composición puede incluir además una vitamina B³ compuesto. El compuesto de vitamina B3 puede incluir nicotinato de tocoferol.

En las composiciones proporcionadas para regular el estado de la piel, la composición puede incluir además un antioxidante. El antioxidante puede incluir uno o una combinación de tocoferol o ésteres de tocoferol.

En las composiciones proporcionadas para regular el estado de la piel, los exosomas aislados pueden liofilizarse.

En una realización, se proporciona un método para regular una condición de la piel humana que incluye aplicar a la piel humana al menos una vez al día durante al menos siete días una composición tópica de acuerdo con la presente descripción que comprende exosomas aislados que tienen niveles aumentados de respuesta al estrés por choque térmico. moléculas. El método puede incluir además aplicar la composición tópica de acuerdo con la presente descripción a la piel humana al menos dos veces al día durante al menos catorce días.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se han incluido para proporcionar una guía a un experto normal en la técnica para practicar realizaciones representativas de la materia presentemente desvelada. A la luz de la presente divulgación y el nivel general de experiencia en la técnica, los expertos pueden apreciar que los siguientes ejemplos pretenden ser solo ilustrativos y que se pueden emplear numerosos cambios, modificaciones y alteraciones sin apartarse del alcance de la materia actualmente divulgada.

Ejemplo 1

Preparación de exosomas con niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico mediante choque térmico

Los siguientes experimentos describen la producción de exosomas aislados que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico para proporcionar una actividad proliferativa y antiinflamatoria mejorada.

Se cultivaron células madre mesenquimales (de origen placentario o adiposo) en un biorreactor de cartucho de fibra hueca (FIBERCELL BIOSYSTEMS) para producir exosomas con mayores niveles de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico de la siguiente manera. Antes de la siembra, el biorreactor se acondicionó con medio de cultivo completo (DMEM/F12 que contenía 10 % de FBS) durante 24 horas a 37 °C en un 5 % de CO humidificado.² atmósfera que contiene. El biorreactor se sembró con 300 * 106 células madre mesenquimales (de origen placentario o adiposo) y mantenidas a 37°C en un 5% CO humidificado² atmósfera que contiene. Las células se cultivaron durante 2 semanas antes de comenzar la recolección de exosomas. Antes de recolectar el medio que contenía el exosoma, el biorreactor se lavó 5 veces con DMEM/F12 sin suero para eliminar los exosomas bovinos. Después del lavado, las células se sometieron a un paso de choque térmico como sigue. El medio en el biorreactor se reemplazó con medio DMEM/F12 sin suero calentado a 41 °C, y el biorreactor se colocó en un 41 °C, humidificado, 5 % de CO² atmósfera que contiene durante 1 h. A continuación, el medio de 41 °C se reemplazó con el mismo medio calentado a 37 °C, y el biorreactor se colocó en un 37 °C, humidificado, 5 % de CO² atmósfera contenedora durante 48 h. Después de la incubación de 48 h, se recuperó el medio DMEM/F12 sin suero acondicionado y, en algunos casos, se almacenó a -80 °C para el procesamiento futuro.

En preparaciones separadas de exosomas aislados que tenían niveles elevados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico, se siguió el mismo procedimiento que se describió anteriormente, excepto que la temperatura del medio utilizado en el paso de choque térmico fue de aproximadamente 42 °C en algunas preparaciones y de aproximadamente 43 °C. C en otras preparaciones y el período de tiempo del choque térmico osciló entre tan solo aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 3 horas.

Después de descongelar o recolectar en fresco el medio acondicionado descrito anteriormente, los exosomas se aislaron del medio acondicionado mediante centrifugación del medio a 3000 xg durante 20 min a temperatura ambiente para sedimentar los restos celulares (en recipientes con tapa roscada de 50, 250 o 500 ml). ). El sobrenadante clarificado se recogió y centrifugó a 100.000 xg (promedio ^r C^f ) durante 2 horas a 4°C. Se aspiró el sobrenadante y se resuspendieron los sedimentos en un volumen mínimo de DPBS (300-1000 j L). Se siguieron las instrucciones del fabricante para estimar la concentración de proteína y ARN usando un espectrofotómetro NANODROP (THERMO FISHER, Corp). El número de partículas (exosomas) por ml y el tamaño de las partículas (exosomas) se determinaron utilizando q Na NO (IZON SCIENCE, Ltd) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los exosomas aislados se dividieron en alícuotas en volúmenes apropiados en tubos con tapón de rosca de 1,5 ml.

Se descubrió que los exosomas aislados descritos anteriormente podían almacenarse a -80 °C y luego descongelarse en una fecha posterior para su uso sin una disminución detectable en la actividad. También se descubrió que los exosomas aislados podrían liofilizarse y almacenarse a temperatura ambiente sin una disminución detectable de la actividad.

Ejemplo 2

Preparación de exosomas con actividad proliferativa y antiinflamatoria mejorada utilizando suplementos medios

Los siguientes experimentos describen la producción de exosomas aislados que tienen una mayor actividad proliferativa y antiinflamatoria.

Las células madre mesenquimatosas (de origen placentario o adiposo) se cultivan en un biorreactor para producir exosomas que tienen actividad proliferativa y antiinflamatoria aumentada de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en el Ejemplo 1 con las siguientes excepciones. Después del período de crecimiento celular de 2 semanas, el biorreactor se lava varias veces con DMEM/F12 sin suero para eliminar los exosomas bovinos. Después del lavado, el medio en el biorreactor se reemplaza con medio DMEM/F12 libre de suero complementado con uno o una combinación de lisado de plaquetas, lisado de plaquetas humanas, PDGF-BB, TGF-p3, TGF-p1 u otros pro y anti -citoquinas inflamatorias y el biorreactor se coloca en un 37°C, humidificado, 5% CO² atmósfera contenedora durante 48 h. Después de la incubación de 48 h, el medio DMEM/F12 suplementado sin suero acondicionado se recupera y, en algunos casos, se almacena a -80 °C para el procesamiento futuro.

Después de la descongelación o la recolección fresca del medio acondicionado descrito anteriormente, los exosomas se aíslan del medio acondicionado y se almacenan para uso futuro como se describe en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3

Caracterización del tamaño de exosomas de choque térmico aislados

Los exosomas aislados producidos según el Ejemplo 1 se caracterizaron como se describe en los siguientes experimentos.

Para determinar el tamaño de los exosomas derivados de células madre producidos según el Ejemplo 1, los exosomas aislados se analizaron utilizando QNANO (IZON SCIENCE, Ltd) siguiendo las instrucciones del fabricante. El gráfico de la fig. 1 muestra la distribución de tamaños resultante de una muestra representativa con una media de 152 nm y una moda de 107 nm. Se analizó una muestra de exosoma tomada de una preparación de exosomas separada mediante microscopía electrónica de barrido (LABORATORIOS DE MÅRMOL) para determinar el tamaño y la forma relativos de las partículas del exosoma. Los exosomas se prepararon para SEM secándolos en espárragos de montaje, recubiertos con platino y visualizados por SEM (ver FIG. 1 recuadro). Si bien el tamaño de partícula resultante calculado por SEM fue mayor que el determinado por QNANO, es probable que la diferencia se deba a la preparación de SEM y los artefactos de secado en lugar de una variación de tamaño significativa en las preparaciones de exosomas.

Ejemplo 4

HSP70 está regulado al alza en exosomas de choque térmico aislados

Como parte del proceso de caracterización, los exosomas preparados de acuerdo con el Ejemplo 1 se analizaron mediante análisis de transferencia Western para marcadores proteicos específicos, incluidos CD63, Hsp70 y TSG101. Específicamente, exosomas producidos por células a temperatura de cultivo normal (37 °C) (es decir, sin un paso de choque térmico) y exosomas producidos por células en condiciones de cultivo que incluyen el cultivo de células a 43 °C durante 2 horas de acuerdo con el Ejemplo 1. examinado por análisis de transferencia Western para la presencia de proteínas de respuesta al estrés, incluida HSP70. FIG. 2 es un gráfico de barras de los datos de transferencia Western cuantificados que muestra la cantidad de proteína HSP70 en relación con la proteína p-actina en dos preparaciones separadas de exosomas: 1) secretada por células cultivadas a 37°C sin un paso de choque térmico (Control; las barras en blanco y rayadas representan las preparaciones separadas); y 2) secretada por células sometidas a un paso de choque térmico de 2 horas a 43°C como se describe en el ejemplo 1 (choque térmico; las barras en blanco y rayadas representan las preparaciones separadas). Los datos de la fig. 2 indican que existe una regulación positiva significativa en HSP70 exosomal en relación con la p-actina en los exosomas de choque térmico en comparación con los exosomas de las células cultivadas sin el paso de choque térmico.

Ejemplo 5

Transferencia de tinte de exosomas de choque térmico aislados a células HPAE

La capacidad de los exosomas aislados preparados de acuerdo con el Ejemplo 1 para suministrar carga a las células se evaluó controlando la capacidad de los exosomas aislados para transferir un tinte lipófilo a las células en cultivo. Los experimentos se realizaron como se describe a continuación.

Una alícuota de exosomas aislados producidos según el Ejemplo 1 se marcó con solución de marcaje celular VYBRANT DII (LIFE TECHNOLOGIES) durante 20 minutos a 37 °C y a 4 °C y se evaluó la transferencia de colorante a cada temperatura mediante citometría de flujo [25]. FIG. 3 muestra histogramas de los datos de las células incubadas a 4 °C (histograma más a la izquierda) y aquellas incubadas a 37 °C (histograma más a la derecha) con exosomas cargados de tinte. Los resultados indican una transferencia eficiente del tinte desde los exosomas a las células endoteliales de la arteria pulmonar humana (HPAE) con el 75 % de las células marcadas.

Ejemplo 6

Efectos de exosomas de choque térmico aislados en células periodontales cultivadas

Los efectos de los exosomas aislados producidos según el Ejemplo 1 sobre células periodontales cultivadas se determinaron como se describe a continuación.

Exosomas aislados de células madre derivadas de tejido adiposo producidos por células a temperatura de cultivo normal (37 °C) (es decir, sin un paso de choque térmico) y exosomas aislados producidos por células en condiciones de cultivo que incluyeron el cultivo de células con un paso de choque térmico de acuerdo con El ejemplo 1 se añadió a fibroblastos de ligamento periodontal de baja densidad (PDLF) y fibroblastos dérmicos (DF) (3000 células/pocillo) en placas de cultivo de 96 pocillos en medio sin suero y se incubaron durante 3 días. Para comparar los efectos proliferativos de los exosomas aislados, las células también se trataron con otros inductores, incluidos FBS al 10 %, PDGF, TGF-P1 o IGF-1. Después de 3 días, las células se trataron con CELL TITER BLUE REAGENT (PROMEGA) durante 2 horas para evaluar la proliferación. Los datos se muestran en la FIG. 4A (PDLF) y 4B (DF). FIG. 4A y 4B muestran que el tratamiento con los exosomas aislados de las células sometidas a un choque térmico aumentó significativamente la proliferación tanto de PDLF como de DF, en comparación con los exosomas aislados preparados a partir de células que no se sometieron a un paso de choque térmico. Además, el nivel de proliferación de los PDLF y DF inducidos por los exosomas aislados de las células sometidas a choque térmico se acercó o superó al inducido por el medio completo y los factores de crecimiento individuales.

La enfermedad periodontal se asocia con la degradación de la matriz extracelular y la degeneración de las fibras de colágeno. Se realizaron los siguientes experimentos para determinar si los exosomas aislados preparados a partir de células sometidas a un choque térmico podrían inducir la síntesis de colágeno I en PDLF y DF. Para el experimento, exosomas aislados producidos por MSC a temperatura de cultivo normal (37 °C) (es decir, sin un paso de choque térmico) y exosomas aislados producidos por MSC en condiciones de cultivo que incluían el cultivo de células con un paso de choque térmico según el ejemplo 1 se analizaron junto con medio acondicionado sin suero del vehículo y factores de crecimiento utilizando un ensayo ELISA de péptido C de procolágeno I (TAKARA). Las células PDLF se trataron durante 48 horas con el control de medio (sin tratamiento), 20 ng/ml de TGFp-1, 10 ng/ml de IGF, 100 ng/ml de PDGF o los exosomas aislados. Después de las 48 horas, se retiró el medio acondicionado, se aclaró por centrifugación y se diluyó en el ensayo ELISA. Los datos resultantes se muestran en la FIG. 5A (PDLF) y la FIG. 5B (DF). Los gráficos de la fig. 5A y 5B muestran que el tratamiento con los exosomas aislados de las células sometidas a un choque térmico aumentó la producción de colágeno I tanto de PDLF como de DF, en comparación con los exosomas aislados preparados a partir de células que no se sometieron a un paso de choque térmico. Además, el aumento en la producción de colágeno I de los PDLF y DF inducido por los exosomas aislados de las células sometidas a choque térmico superó al de los factores de crecimiento individuales. Estos datos indican que los exosomas aislados pueden tener un papel en la reparación del ligamento periodontal.

Ejemplo 7

Los exosomas de choque térmico derivados de ASC inhiben la expresión de citoquinas inflamatorias

El potencial de los exosomas aislados derivados de ASC producidos según el Ejemplo 1 para inhibir la expresión de IL6 en fibroblastos del ligamento periodontal (PDLF) se examinó como se describe a continuación.

P gingivalis es una de las especies bacterianas conocidas por contribuir a la patogénesis de la periodontitis al secretar varias toxinas letales para las células de los tejidos blandos orales. Informes anteriores indican la inducción de cascadas inflamatorias en GK y PDLF en respuesta a P. gingivalis lisados, incluidas las moléculas inflamatorias IL6 e IL8 [22-24]. Para evaluar el impacto antiinflamatorio del tratamiento con los exosomas aislados preparados a partir de células cultivadas con un paso de choque térmico las células PDLF se expusieron concomitantemente a liofilizados muertos por calor. P. gingivalis (HKPG, 107/ml) y los exosomas aislados del medio de cultivos celulares sometidos a choque térmico.

Para el experimento, exosomas aislados producidos por ASC a temperatura de cultivo normal (37 °C) (es decir, sin una etapa de choque térmico) y exosomas aislados producidos por ASC en condiciones de cultivo que incluían el cultivo de células con un paso de choque térmico según el ejemplo 1 fueron probados. Específicamente, para medir la respuesta inflamatoria, se realizó RT-qPCR para el ARNm de la citoquina IL6 inflamatoria. Los PDLF se sembraron en placas de 6 pocillos y se incubaron durante la noche: sin HKPG y sin exosomas (Sin Tx), con 107/ml HKPG y sin exosomas (Sin Exosomas), con 107/ml HKPG en combinación con exosomas aislados derivados de células madre adiposas preparados a partir de cultivos celulares con una etapa de choque térmico (Exosomas sometidos a choque térmico) y sin un paso de choque térmico (Exosomas est.). Los datos de RT-qPCR cuantificados se muestran en el gráfico de la FIG. 6. Los resultados indican una elevación estadísticamente significativa en la expresión del gen IL-6 en células HPLF inducidas por calor P. gingivalis (HKPG) a 1 x 10AHml. La elevación se reduce significativamente con los exosomas estándar aislados, y aún más con los exosomas de células aisladas producidos con un paso de choque térmico. Estos datos indican que los exosomas aislados de la presente descripción pueden inhibir la producción de citoquina inflamatorias, incluida la IL6, que actúan localmente para reclutar monocitos en el sitio de la inflamación.

Ejemplo 8

Efecto protector de los exosomas de choque térmico contra la luz UVB en queratinocitos adultos humanos

El efecto protector de los exosomas aislados derivados de MSC producidos según el Ejemplo 1 frente a la radiación UVB en queratinocitos adultos humanos se examinó como se describe a continuación.

La exposición a la luz solar ultravioleta (UV) en la piel provoca fotoenvejecimiento, quemaduras solares, daños en el ADN y carcinogénesis. UVB (290-320 nm) induce eritema y daños en el ADN como los dímeros de ciclobutano pirimidina (CPD) en la epidermis. La radiación UVB también produce inflamación, que puede medirse mediante mediadores proinflamatorios in vitro, por ejemplo, TNF-a, IL-8 y PGE2. Además, los rayos UVB podrían dañar las células de forma irreversible (células de quemaduras solares) que se eliminan por inducción de la apoptosis.

Los métodos biológicos in vitro proporcionan una excelente herramienta para evaluar el daño molecular causado por los rayos UVB y para evaluar la eficacia de los productos de protección solar y las formulaciones tópicas que contienen tecnologías químicas o biológicas para proteger la piel de los rayos UVB. Los modelos de cultivo de queratinocitos adultos humanos se han establecido como herramientas de investigación para evaluar el efecto protector de las moléculas pequeñas y otras formulaciones, y para superar las limitaciones de las pruebas en sujetos humanos.

En este estudio, se usaron queratinocitos adultos humanos para la evaluación del daño celular inducido por UVB y la actividad protectora de los exosomas de choque térmico descritos aquí en medios KM-2. Se aplicaron medios que contenían los exosomas a los queratinocitos durante 1 hora y luego se aspiraron. Luego se colocó PBS en los queratinocitos y se expuso a 40 mJ/cm2 UVB. Después de la exposición, se aspiró PBS y se aplicaron medios KM-2 stock frescos a las células (200 j L). Los medios se recogieron a las 24 horas. Las muestras no irradiadas con UVB se sometieron al mismo protocolo con la excepción de la exposición a UVB.

Los efectos de los exosomas de choque térmico se evaluaron midiendo la producción reducida de IL-8 y TNF-a por parte de las células, y los resultados se muestran en la FIG. 7, la figura. 8, figura. 9, y la fig. 10 Específicamente, la FIG. 7 es un gráfico que muestra la reducción de IL-8 en los queratinocitos adultos humanos en ausencia de radiación UVB (sin UVB) con diversas cantidades de exosomas de choque térmico en comparación con un control de medio. Los resultados muestran que los exosomas de choque térmico en todas las concentraciones probadas redujeron la producción de IL-8. Además, una concentración de exosomas de choque térmico 8.23E 05 redujo significativamente la producción de IL-8 (prueba t, 2 colas, varianza desigual).

FIG. 8 es un gráfico que muestra la reducción de IL-8 en los queratinocitos adultos humanos en presencia de radiación UVB (40 mJ/cm2 UVB) con diversas cantidades de exosomas de choque térmico en comparación con un medio de control. Los resultados fueron similares al experimento en ausencia de UVB donde los exosomas de choque térmico en todas las concentraciones probadas, con la excepción de 2.00E 08, redujeron la producción de IL-8. Específicamente, las concentraciones de 2.74E 05, 2.47E 06, 7.41E 06, 2.22E 07 y 6.67E 07 exosomas de choque térmico/mL redujeron significativamente la producción de IL-8 (prueba t, 2 colas, varianza desigual).

FIG. 9 es un gráfico que muestra una comparación lado a lado de los datos en la fig. 7 y la figura. 8 gráficos. La comparación muestra que las muestras expuestas a UVB (40 mJ/cm2 UVB) y no UVB (sin UVB) siguen la misma tendencia. Los niveles basales de producción de IL-8 (sin UVB, solo medios) son 202 μg/mL (marcados por la línea discontinua). Los niveles basales de producción de IL-8 en presencia de radiación UVB (40 mJ/cm2 UVB, Media Only) son 685 μg/mL (marcados con la línea de puntos). Las concentraciones de exosomas de 8.23E 05, 2.47E 06, 7.41E 06 y 2.22E 07 exosomas/mL en las células expuestas a UVB no dieron como resultado una diferencia significativa en comparación con las células en el control de medio sin UVB. Estos resultados demuestran el efecto protector de los exosomas de choque térmico contra la inflamación inducida por UVB.

FIG. 10 es un gráfico que muestra la cantidad de TNF-a en presencia de varias concentraciones de exosomas de choque térmico en presencia (40 mJ/cm2 UVB) y ausencia (sin UVB) de radiación UVB en comparación con un control de medio solo (medio Solo). Los datos muestran que la liberación de TNF-a en las muestras expuestas a UVB sigue la misma tendencia que la observada para IL-8, con una disminución máxima de TNF-a de aproximadamente 3 veces con exosomas de choque térmico a una concentración de 2,22E 07 exosomas/ ml. Los valores de TNF-a están en el límite inferior de la detección del ensayo, por lo que no se muestran datos para la mayoría de las muestras Sin UVB. En resumen, los resultados indican que la liberación de IL-8 de las células expuestas a UVB tratadas con concentraciones de exosomas de choque térmico de 8.23E 05, 2.47E 06, 7.41E 06 y 2.22E 07 exosomas/ml no mostró diferencias significativas en comparación con las células sin UVB. control de medios, que muestra el efecto protector de los exosomas de choque térmico contra la inflamación inducida por UVB. Además, la liberación de IL-8 se redujo significativamente en las células tratadas con exosomas de choque térmico a una concentración de 8,23 E05 exosomas/mL en ausencia de radiación UVB en comparación con el control de medio sin UVB. Además, la liberación de TNF-a de las células tratadas con los exosomas de choque térmico se redujo hasta 3 veces. Los resultados anteriores demuestran el efecto protector de los exosomas de choque térmico contra la inflamación inducida por UVB. Referencias

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición tópica para regular una afección cosmética de la piel o el cabello, comprendiendo la composición una cantidad eficaz de exosomas aislados que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico, en la que los exosomas aislados son exosomas por choque térmico derivados de células madre mesenquimatosas sometidas a choque térmico de placenta u origen adiposo y un portador y en el que los exosomas de choque térmico se producen mediante un proceso que comprende:

(a) cultivar las células madre en medio de cultivo, en el que el cultivo incluye una etapa de aplicar un choque térmico a las células madre en un medio de cultivo libre de suero aumentando la temperatura de cultivo de 41 °C a 43 °C durante 1 hora a 3 horas, y en el que el medio de cultivo libre de suero contiene los exosomas que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico; y

(b) aislar los exosomas que tienen niveles aumentados de moléculas de respuesta al estrés por choque térmico del medio sin suero.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que los exosomas de choque térmico tienen niveles aumentados de HSP70 en relación con la p-actina en comparación con exosomas comparables derivados de células madre mesenquimales de origen placentario o adiposo cultivadas sin choque térmico.

3. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende además de 0,1 a 20% de un agente humectante, opcionalmente donde el agente humectante comprende uno o más de pantenol, derivados del ácido pantoténico, glicerina, glicerol, dimeticona, vaselina, ácido hialurónico, o ceremidas, y mezclas de los mismos.

4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende además un compuesto de vitamina B3.

5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende además nicotinato de tocoferol.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende además un antioxidante, opcionalmente uno o una combinación de tocoferol o ésteres de tocoferol.

7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que los exosomas de choque térmico se liofilizan.

8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que:

a) el medio de cultivo libre de suero está libre de productos de origen animal; y/o

(b) la composición está en forma de líquido, loción, crema, gel, espumante, espuma, aerosol, pasta, polvo o sólido.

9. Las composiciones de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en las que la condición cosmética de la piel o el cabello es causada por radiación UVB.

10. Un método para preparar una composición tópica para regular un estado cosmético de la piel o el cabello, comprendiendo el método combinar una cantidad eficaz de exosomas de choque térmico según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 con un vehículo.

11. Un método para regular una condición cosmética de la piel que comprende la administración tópica de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la condición cosmética de la piel comprende la integridad de la piel, el contenido de agua o la humedad de la piel, la pérdida transepidérmica de agua, la descamación de la piel y la escamación. grosor de la piel, propiedades de tracción de la piel, apariencia de líneas finas y arrugas dérmicas, textura de la piel, tamaño de los poros de la piel, suavidad de la piel, manchas de la edad en la piel, tono de la piel o apariencia de cicatrices y abrasiones en la piel.

12. El método de la reivindicación 11, en el que los exosomas de choque térmico inducen la producción de colágeno I de fibroblastos dérmicos.

13. El método de la reivindicación 11, en el que los exosomas de choque térmico inducen la proliferación de fibroblastos dérmicos.

14. El método de la reivindicación 11, en el que los exosomas de choque térmico inhiben la expresión de citoquinas inflamatorias.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 - 14, en el que la condición cosmética de la piel o el cabello es provocada por radiación UVB.