ES2909419T3 - Métodos para el tratamiento de infecciones por coronaviridae - Google Patents

Abstract

Un compuesto que tiene la fórmula: **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para usar en un método para tratar una infección por Coronaviridae en un ser humano que lo necesite, en el que el método comprende administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para el tratamiento de infecciones por coronaviridae

[0001] Esta solicitud de patente es una solicitud divisional de EP16770866.8.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0002] La invención se refiere en general a compuestos para usar en el tratamiento de infecciones por el virus Coronaviridae, particularmente métodos y nucleósidos y profármacos de los mismos para tratar el virus SARS y el virus MERS.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0003] El virus Lassa es un virus de ARN de sentido negativo segmentado que pertenece a la familia Arenaviridae. Los arenavirus se subdividen en los complejos de virus del Viejo Mundo y del Nuevo Mundo en función de la reactividad cruzada serológica, las relaciones filogenéticas y la distribución geográfica (Wulff, 1978; Bowen, 1997). El complejo de arenavirus del Nuevo Mundo comprende virus que circulan en América del Norte (es decir, los virus Whitewater Arroyo (WWAV), Tamiami (TAMV) y Bear Canyon (Bc Nv )) y América del Sur (es decir, Tacaribe (TACV), Junín (JUNV), virus Machupo (MACV), Guanarito (GTOV) y Sabia (SABV). El complejo del Viejo Mundo incluye arenavirus que circulan en África, Europa y Asia (es decir, los virus de la coreomeningitis linfocítica (LCMV) y Lassa (LASV)). El rango de especies de roedores reservorio restringe la ocurrencia geográfica de arenavirus, con la excepción de LCMV que se distribuye en todo el mundo debido a su asociación con Mus domesticus y M. musculus, que han migrado globalmente (Salazar-Bravo, 2002). Los huéspedes reservorio de LASV son roedores del género Mastomys que son enzoóticos en el África subsahariana (Salazar-Bravo, 2002). Se sabe que al menos siete arenavirus causan fiebre hemorrágica grave en humanos, entre los que se encuentran LASV, JUNV, MACV, GTOV y SABV que son endémicos en África occidental, Argentina, Bolivia, Venezuela y Brasil, respectivamente, y recientemente descubierto Lujo (LUJV) y Chapare (CHAPV) que se originaron en Zambia y Bolivia, respectivamente (Breise, 2009; Delgado, 2008).

[0004] El virus Lassa (LASV) es endémico en África Occidental con aproximadamente 300.000-500.000 personas infectadas anualmente (McCormick, 1987). La transmisión ocurre a través del contacto con roedores infectados (Mastomys natalensis) o excrementos de roedores contaminados con virus, y se ha documentado la transmisión de persona a persona, especialmente en entornos hospitalarios (McCormick, 1987). La enfermedad causada por LASV varía desde una infección subclínica hasta una fiebre hemorrágica de leve a grave que se asocia con falla multiorgánica. Las tasas de mortalidad asociadas con la infección por LASV varían y oscilan entre aproximadamente el 2% y el 15% para casos hospitalizados y pueden superar el 50% en ciertos escenarios de brotes (McCormick, 1987; Fisher-Hoch, 1995). A pesar de la alta incidencia y la morbilidad y mortalidad asociadas, no existe una terapia aprobada para tratar la infección por LASV en humanos. La atención de apoyo y la administración temprana de ribavirina son el estándar actual de atención.

[0005] El LASV inicialmente infecta monocitos, macrófagos y células dendríticas y se propaga sistémicamente para producir una viremia primaria que conduce a la infección de órganos internos. La replicación del virus conduce a un aumento de los niveles de citocinas inflamatorias y al desarrollo de coagulopatías que provocan fugas vasculares, shock hipovolémico y fallo multiorgánico (Hensley, 2011).

[0006] La replicación de los arenavirus está catalizada por la proteína L polimerasa que utiliza moldes de ARN viral que consisten en ARN genómico encapsidado por la proteína NP de la nucleocápside viral y comprende ribonucloproteína viral (RNP) (Buchmeier, 2007). La replicación se inicia con la entrada viral en la célula huésped donde la polimerasa L, asociada con el RNP viral, inicia la transcripción desde el promotor del genoma ubicado en el extremo 3' de cada segmento de ARN genómico, L y S. El evento de transcripción principal da como resultado la síntesis de ARNm de polimerasa NP y L codificado en orientación antigenómica a partir de los segmentos S y L, respectivamente. La transcripción termina en el lado distal de la estructura de bucle de tallo (SL) dentro de la región intergenómica (IGR). Los arenavirus utilizan una estrategia de arrebatamiento de la tapa para adquirir las estructuras de la tapa de los ARNm celulares para facilitar la traducción. El arrebatamiento de la tapa está mediado por la actividad endonucleasa de la polimerasa L que está cofactorizada por la actividad de unión a la tapa de NP para producir ARNm no poliadenilados con tapa. Posteriormente, la polimerasa L adopta un modo de replicasa y se mueve a través del IGR para generar un ARN antigenómico complementario de longitud completa (ARNag). Este ARNg sirve como molde para la síntesis de ARNm de GPC y Z codificados en orientación genómica a partir de los segmentos S y L, respectivamente, y para la síntesis de ARN genómico completo (ARNg) (Buchmeier, 2007; Franze-Fernandez, 1987; Meyer, 1993; Qi, 2010; Lelke, 2010; Morin, 2010).

[0007] Los coronavirus humanos, identificados por primera vez a mediados de la década de 1960, son virus comunes que infectan a la mayoría de las personas en algún momento de su vida, causando generalmente enfermedades del tracto respiratorio superior y gastrointestinal de leves a moderadas. El nuevo coronavirus conocido como "Coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio" (MERS-CoV o MERS) se informó por primera vez en Arabia Saudita en 2012 y se ha extendido a varios otros países. El SARS-CoV, el coronavirus responsable del Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS), se reconoció por primera vez en China en 2002 y provocó un brote mundial en 2002 y 2003.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0008] Se proporciona un compuesto que tiene la fórmula:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para usar en un método para tratar una infección por Coronaviridae en un humano que lo necesite, en el que el método comprende administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0009] En otra forma de realización, la infección por Coronaviridae está provocada por un virus MERS.

[0010] En otra forma de realización, la infección por Coronaviridae está causada por un virus SARS.

[0011] En otra forma de realización, el método comprende además administrar un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

[0012] En otra forma de realización, el método comprende además administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos otro agente terapéutico, en el que al menos otro agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un corticosteroide, un modulador de la transducción de señales antiinflamatorias, un broncodilatador agonista de los receptores adrenérgicos p2, un anticolinérgico, un agente mucolítico, una solución salina hipertónica y otros fármacos para tratar una infección por el virus Coronaviridae; o mezclas de los mismos.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0013]

FIG. 1: Cambios en el peso corporal después de la infección en ratones tratados con vehículo y Compuesto 32 FIG. 2A y FIG. 2B: Carga viral en tejido pulmonar en los días 2 y 5 posteriores a la infección en ratones tratados con vehículo y Compuesto 32

FIG. 3A-F: Pletismografía de cuerpo entero de ratones infectados con SARS-CoV

FIG. 4A. Cambios en el peso corporal después de la infección en monos tratados con vehículo y Compuesto 32 FIG. 4B. Cambios en la temperatura corporal después de la infección en monos tratados con vehículo y Compuesto 32

FIG. 4C. Cambios en la tasa respiratoria después de la infección en monos tratados con vehículo y Compuesto 32

FIG. 5. Concentraciones de ARN viral tisular por grupo de tratamiento. La carga viral se midió qRT-PCR.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

I. DEFINICIONES

[0014] A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos y frases, tal como se usan en este documento, pretenden tener los siguientes significados:

[0015] Cuando se usan nombres comerciales en este documento, los solicitantes tienen la intención de incluir de forma independiente el nombre comercial del producto y el (los) ingrediente(s) farmacéutico(s) activo(s) del producto de nombre comercial.

[0016] Como se usa en el presente documento, "un compuesto para usar de acuerdo con la invención" o "un Compuesto como se describe en el presente documento" significa el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. De manera similar, con respecto a los intermedios aislables, la frase "un compuesto de Fórmula (número)" significa un compuesto de esa fórmula y sus sales farmacéuticamente aceptables.

[0017] "Alquilo" es un hidrocarburo que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos. Por ejemplo, un grupo alquilo puede tener de 1 a 20 átomos de carbono (es decir, alquilo C¹-C²⁰), de 1 a 8 átomos de carbono (es decir, alquilo C¹-C⁸) o 1 a 6 átomos de carbono (es decir, alquilo C¹-C⁶). Los ejemplos de grupos alquilo adecuados incluyen, entre otros, metilo (Me, -CH³), etilo (Et, -CH²CH³), 1 -propilo (n-Pr, n-propilo, -CH²CH²CH³), 2-propilo (i-Pr, ipropilo, -CH(CH3)2), 1 -butilo (n-Bu, n-butilo, -CH²CH²CH²CH³), 2-metil-1 -propilo (i-Bu, i-butilo, -CH2CH(CH3)2), 2-butilo (s-Bu, s-butilo, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propilo (t-Bu, t-butilo, -C(CH3)3), 1 -pentilo (n-pentilo, -CH²CH²CH²CH²CH³), 2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentilo (-CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butilo (-C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butilo (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metil-1 -butilo (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil-1 -butilo (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-hexilo (-CH²CH²CH²CH²CH²CH³), 2-hexilo (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-hexilo (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentilo (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CHa), 4-metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH(CHa)2), 3-metil-3-pentilo (-C(CH³)(CH²CH³)²), 2-metil-3-pentilo (-CH(CH²CH³)CH(CH³)²), 2,3-dimetil-2-butilo (-C(CH³)²CH(CH³)²), 3,3-dimetil-2-butilo (-CH(CH3)C(CHa)3, y octilo (-(CH2)7CHa).

[0018] "Alcoxi" significa un grupo que tiene la fórmula -O-alquilo, en el que un grupo alquilo, como se define anteriormente, es unido a la molécula original a través de un átomo de oxígeno.La porción alquilo de un grupo alcoxi puede tener de 1 a 20 átomos de carbono (es decir, alcoxi C¹-C²⁰), de 1 a 12 átomos de carbono (es decir, alcoxi C¹-C¹²), o de 1 a 6 átomos de carbono (es decir, alcoxi C¹-C⁶). Los ejemplos de grupos alcoxi adecuados incluyen, entre otros, metoxi (-O-CH³ o -OMe), etoxi (-OCH²CH³ o -OEt), t-butoxi (-OC(CH3)3 o -OtBu) y similares

[0019] "Haloalquilo" es un grupo alquilo, como se define anteriormente, en el que uno o más átomos de hidrógeno del grupo alquilo se reemplazan con un halógeno La porción alquilo de un grupo haloalquilo puede tener de 1 a 20 átomos de carbono (es decir, haloalquilo C¹-C²⁰), de 1 a 12 átomos de carbono (es decir, haloalquilo C¹-C¹²) o de 1 a 6 átomos de carbono (es decir, alquilo C¹-C⁶). Los ejemplos de grupos haloalquilo adecuados incluyen, entre otros, -CF³ , -CHF² , -CFH² , -CH²CF³ y similares.

[0020] "Alquenilo" es un hidrocarburo que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un doble enlace sp2 carbono-carbono. Por ejemplo, un grupo alquenilo puede tener de 2 a 20 átomos de carbono (es decir, alquenilo C²-C²⁰), de 2 a 8 átomos de carbono (es decir, alquenilo C²-C⁸) o de 2 a 6 átomos de carbono (es decir, alquenilo C²-C⁶). Los ejemplos de grupos alquenilo adecuados incluyen, entre otros, etileno o vinilo (-CH=CH²), alilo (-CH²CH=CH²), ciclopentenilo (-C⁵H⁷) y 5-hexenilo (-CH²CH²CH²CH²CH=CH²).

[0021] "Alquinilo" es un hidrocarburo que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un triple enlace sp carbono-carbono. Por ejemplo, un grupo alquinilo puede tener de 2 a 20 átomos de carbono (es decir, alquinilo C²-C²⁰), de 2 a 8 átomos de carbono (es decir, alquino C²-C⁸) o de 2 a 6 átomos de carbono (es decir, alquinilo C²-C⁶). Los ejemplos de grupos alquinilo adecuados incluyen, pero no se limitan a, acetilénico (-C=CH), propargilo (-CH²C=CH) y similares.

[0022] "Alquileno" se refiere a un radical hidrocarburo saturado, ramificado o de cadena lineal o cíclico que tiene dos centros radicales monovalentes derivados de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un alcano original. Por ejemplo, un grupo alquileno puede tener de 1 a 20 átomos de carbono, de 1 a 10 átomos de carbono o de 1 a 6 átomos de carbono. Los radicales alquileno típicos incluyen, entre otros, metileno (-CH²-), 1,1 -etilo (-CH(CH3)-), 1,2-etilo (-CH²CH²-), 1,1-propilo (-CH(CH2CH3)-), 1,2-propilo (-CH2CH(CH3)-), 1,3-propilo (-CH²CH²CH²-), 1,4-butilo (-CH²CH²CH²CH²-) y similares.

[0023] "Alquenileno" se refiere a un radical hidrocarburo insaturado, ramificado o de cadena lineal o cíclico que tiene dos centros radicales monovalentes derivados de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un alqueno original. Por ejemplo, un grupo alquenileno puede tener de 1 a 20 átomos de carbono, de 1 a 10 átomos de carbono o de 1 a 6 átomos de carbono. Los radicales alquenileno típicos incluyen, pero no se limitan a, 1,2-etileno (-CH=CH-).

[0024] "Alquinileno" se refiere a un radical hidrocarburo cíclico o de cadena lineal o ramificada insaturado que tiene dos centros radicales monovalentes derivados de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un alquino original. Por ejemplo, un grupo alquinileno puede tener de 1 a 20 átomos de carbono, de 1 a 10 átomos de carbono o de 1 a 6 átomos de carbono. Los radicales alquinileno típicos incluyen, entre otros, acetileno (-CeC-), propargilo (-CH²CEC-) y 4-pentinilo (-CH²CH²CH²CEC-).

[0025] "Amino" se refiere generalmente a un radical nitrogenado que puede considerarse un derivado del amoníaco, que tiene la fórmula -N(X)² , donde cada "X" es independientemente H, alquilo sustituido o no sustituido, carbociclilo sustituido o no sustituido, heterociclilo sustituido o no sustituido, etc. La hibridación del nitrógeno8es aproximadamente sp3. Los tipos no limitantes de amino incluyen -NH² , -N(alquilo)² , -NH(alquilo), -N(carbociclilo)² , -NH(carbociclilo), -N(heterociclilo)² , -NH(heterociclilo), -N(arilo)² , -NH(arilo), -N(alquil)(arilo), -N(alquil)(heterociclilo), -N(carbociclilo)(heterociclilo), N(arilo)(heteroarilo), -N(alquilo))(heteroarilo), etc. El término "alquilamino" se refiere a un grupo amino sustituido con al menos un grupo alquilo. Los ejemplos no limitantes de grupos amino incluyen -NH² , -NH(CH³), -N(CH³)² , -NH(CH²CH³), -N(CH2CH3)2, -NH(fenilo), -N(fenilo)² , -NH(bencilo), -N(bencil)² , etc. Alquilamino sustituido se refiere generalmente a grupos alquilamino, como se define anteriormente, en los que al menos un alquilo sustituido, como se define aquí, está unido al átomo de nitrógeno amino. Los ejemplos no limitantes de alquilamino sustituido incluyen -NH(alquileno-C(O)-OH), -NH(alquileno-C(O)-O-alquilo), -N(alquilenoC(O)-OH)² , -N (alquileno-C(O)-O-alquilo)² , etc.

[0026] “Arilo” significa un radical hidrocarbonado aromático derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un sistema de anillo aromático original. Por ejemplo, un grupo arilo puede tener de ⁶ a 20 átomos de carbono, de ⁶ a 14 átomos de carbono o de ⁶ a 10 átomos de carbono. Los grupos arilo típicos incluyen, entre otros, radicales derivados del benceno (p. ej., fenilo), benceno sustituido, naftaleno, antraceno, bifenilo y similares.

[0027] "Arilalquilo" se refiere a un radical alquilo acíclico en el que uno de los átomos de hidrógeno unido a un átomo de carbono, típicamente un átomo de carbono terminal o sp3, se reemplaza con un radical arilo. Los grupos arilalquilo típicos incluyen, pero no se limitan a bencilo, ² -feniletan-¹ -ilo, naftilmetilo, ² -naftiletan-¹ -ilo, naftobencilo, ² -naftofeniletan-¹ -ilo y similares. El grupo arilalquilo puede comprender de 7 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, el resto alquilo tiene de 1 a ⁶ átomos de carbono y el resto arilo tiene de ⁶ a 14 átomos de carbono.

[0028] "Arilalquenilo" se refiere a un radical alquenilo acíclico en el que uno de los átomos de hidrógeno unido a un átomo de carbono, típicamente un átomo de carbono terminal o sp3, pero también un átomo de carbono sp² , se reemplaza con un radical arilo. La porción arilo del arilalquenilo puede incluir, por ejemplo, cualquiera de los grupos arilo descritos en el presente documento, y la porción alquenilo del arilalquenilo puede incluir, por ejemplo, cualquiera de los grupos alquenilo descritos en el presente documento. El grupo arilalquenilo puede comprender de ⁸ a 20 átomos de carbono, por ejemplo, el resto alquenilo tiene de 2 a ⁶ átomos de carbono y el resto arilo tiene de ⁶ a 14 átomos de carbono.

[0029] "Arilalquinilo" se refiere a un radical alquinilo acíclico en el que uno de los átomos de hidrógeno unido a un átomo de carbono, típicamente un átomo de carbono terminal o sp3, pero también un átomo de carbono sp, se reemplaza con un radical arilo. La porción arilo del arilalquinilo puede incluir, por ejemplo, cualquiera de los grupos arilo descritos en el presente documento, y la porción alquinilo del arilalquinilo puede incluir, por ejemplo, cualquiera de los grupos alquinilo descritos en el presente documento. El grupo arilalquinilo puede comprender de ⁸ a 20 átomos de carbono, por ejemplo, el resto alquinilo tiene de 2 a ⁶ átomos de carbono y el resto arilo tiene de ⁶ a 14 átomos de carbono.

[0030] El término "sustituido" en referencia a alquilo, alquileno, arilo, arilalquilo, alcoxi, heterociclilo, heteroarilo, carbociclilo, etc., por ejemplo, "alquilo sustituido", "alquileno sustituido", "arilo sustituido", "arilalquilo sustituido", "heterociclilo sustituido" y "carbociclilo sustituido" significan alquilo, alquileno, arilo, arilalquilo, heterociclilo, carbociclilo respectivamente, en los que uno o más átomos de hidrógeno están reemplazados cada uno independientemente con un sustituyente que no es hidrógeno. Los sustituyentes típicos incluyen, entre otros, -X, -Rb, -O-, =O, -ORb, -SRb, -S-, -NR^b2 , -N+Rb3, =NRb, -CX³ , -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO² =N² , -N³ , -NHC(=O)Rb, -OC(=O)Rb, -NHC(=O)NR^b2 , -S(=O)2-, -S(=O)2OH, -S(=O)2Rb, -OS(=O)2ORb, -S(=O)2NRb2, -S(=O)Rb, -OP(=O)(ORb)2, -P(=O)(ORb)2, -P(=O)(O-)2, -P(=O)(OH)2, -P(O)(ORb)(O-), -C(=O)Rb, -C(=O)X, -C(S)Rb, -C(O)ORb, -C(O)O-, -C(S))ORb, -C(O)SRb, -C(S)SRb, -C(O)NR^b2 , -C(S)NR^b2 , -C(=NRb)NR^b2 , donde cada X es independientemente un halógeno: F, Cl, Br o I; y cada Rb es independientemente H, alquilo, arilo, arilalquilo, un heterociclo o un grupo protector o fracción profármaco. Los grupos alquileno, alquenileno y alquinileno también pueden estar sustituidos de manera similar. A menos que se indique lo contrario, cuando el término "sustituido" se usa junto con grupos como arilalquilo, que tienen dos o más restos capaces de sustitución, los sustituyentes pueden estar unidos al resto arilo, al resto alquilo o a ambos.

[0031] Un "profármaco" se define en el campo farmacéutico como un derivado biológicamente inactivo de un fármaco que tras la administración al cuerpo humano se convierte en el fármaco original biológicamente activo de acuerdo con alguna ruta química o enzimática.

[0032] "Heteroalquilo" se refiere a un grupo alquilo en el que uno o más átomos de carbono se han reemplazado con un heteroátomo, como O, N o S. Por ejemplo, si el átomo de carbono del grupo alquilo que está unido al la molécula original se reemplaza con un heteroátomo (p. ej., O, N o S), los grupos heteroalquilo resultantes son, respectivamente, un grupo alcoxi (p. ej., -OCH³ , etc.), una amina (p. ej., -NHCH³ , -N(CH3)2, etc.), o un grupo tioalquilo (por ejemplo, -SCH³). Si un átomo de carbono no terminal del grupo alquilo que no está unido a la molécula principal se reemplaza con un heteroátomo (p. ej., O, N o S), los grupos heteroalquilo resultantes son, respectivamente, un éter alquílico (p. ej., -CH²CH² -O-CH³ , etc.), una amina de alquilo (p. ej., -CH²NHCH³ , -CH2N(CH3)2, etc.) o un éter de tioalquilo (p. ej., -CH²-S-CH³). Si un átomo de carbono terminal del grupo alquilo se reemplaza con un heteroátomo (p. ej., O, N o S), los grupos heteroalquilo resultantes son, respectivamente, un grupo hidroxialquilo (p. ej., -CH²CH²-OH), un grupo aminoalquilo (p. ej., -CH²NH²) o un grupo alquiltiol (p. ej., -CH²CH²-SH). Un grupo heteroalquilo puede tener, por ejemplo, de 1 a 20 átomos de carbono, de 1 a 10 átomos de carbono o de 1 a ⁶ átomos de carbono. Un grupo heteroalquilo C¹-C⁶ significa un grupo heteroalquilo que tiene de ¹ a ⁶ átomos de carbono.

[0033] "Heterociclo" o "heterociclilo" como se usa en el presente documento incluye a modo de ejemplo y sin limitación los heterociclos descritos en Paquette, Leo A.; Principles of Modern Heterocyclic Chemistry (W.A. Benjamin, Nueva York, 1968), en particular los capítulos 1, 3, 4, ⁶ , 7 y 9; The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A Series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 al presente), en particular los Volúmenes 13, 14, 16, 19 y 28; y J. Am. Chem. Soc. (1960) 82: 5566. "Heterociclo" puede incluir un "carbociclo" como se define en el presente documento, en el que uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) átomos de carbono han sido reemplazados por un heteroátomo (por ejemplo, O, N o S) Los términos "heterociclo" o "heterociclilo" incluyen anillos saturados, anillos parcialmente insaturados y anillos aromáticos (es decir, anillos heteroaromáticos). Los heterociclilos sustituidos incluyen, por ejemplo, anillos heterocíclicos sustituidos con cualquiera de los sustituyentes descritos en este documento, incluidos los grupos carbonilo. ejemplo no limitante de un heterociclilo sustituido con carbonilo es:

[0034] Los ejemplos de heterociclos incluyen, a modo de ejemplo y sin limitación, piridilo, dihidroipiridilo, tetrahidropiridilo (piperidilo), tiazolilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiofenilo oxidado con azufre, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, octahidroquinolinilo, octahidroquinolinilo azocinilo, triazinilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, 1 H-indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinnolinilo, pteridinilo, 4aH-carbazolilo, carbazolilo, p-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, bencisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo, isatinoilo y bis-tetrahidrofuranilo:

[0035] A modo de ejemplo y no de limitación, los heterociclos unidos por carbono están unidos en la posición 2, 3, 4, 5 o 6 de una piridina, posición 3, 4, 5, o 6 de una piridazina, posición 2, 4, 5 o 6 de una pirimidina, posición 2, 3, 5 o 6 de una pirazina, posición 2, 3, 4 o 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol, posición 2, 4 o 5 de un oxazol, imidazol o tiazol, posición 3, 4 o 5 de un isoxazol, pirazol o isotiazol, posición 2 o 3 de una aziridina, posición 2, 3 o 4 de una azetidina, posición 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una quinolina o posición 1, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una isoquinolina. Aún más típicamente, los heterociclos con enlaces de carbono incluyen 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5-piridilo, 6-piridilo, 3-piridazinilo, 4-piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridazinilo, 2-pirimidinilo, 4-pirimidinilo, 5-pirimidinilo, 6-pirimidinilo, 2-pirazinilo, 3-pirazinilo, 5-pirazinilo, 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo o 5-tiazolilo.

[0036] A modo de ejemplo y sin limitación, los heterociclos unidos por nitrógeno están unidos en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1H-indazol, posición 2 de un isoindol o isoindolina, posición 4 de una morfolina y posición 9 de un carbazol o p-carbolina. Todavía más típicamente, los heterociclos unidos por nitrógeno incluyen 1-aziridilo, 1-azedilo, 1 -pirrolilo, 1 -imidazolilo, 1 -pirazolilo y 1 -piperidinilo.

[0037] "Heterociclilalquilo" se refiere a un radical alquilo acíclico en el que uno de los átomos de hidrógeno unido a un átomo de carbono, típicamente un átomo de carbono terminal o sp3, se reemplaza con un radical heterociclilo (es decir, un resto heterociclil-alquileno). Los grupos alquilo heterociclilo típicos incluyen, entre otros, heterociclil-CH²-, 2-(heterociclil)etano-1-ilo y similares, en los que la porción "heterociclilo" incluye cualquiera de los grupos heterociclilo descritos anteriormente, incluidos los descritos en Principles of Modern Heterocyclic Chemistry. Un experto en la técnica también entenderá que el grupo heterociclilo se puede unir a la porción alquilo del heterociclilalquilo por medio de un enlace carbono-carbono o un enlace carbono-heteroátomo, con la condición de que el grupo resultante sea químicamente estable. El grupo heterociclilo alquilo comprende de 3 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, la porción alquilo del grupo arilalquilo es de 1 a 6 átomos de carbono y el resto heterociclilo es de 2 a 14 átomos de carbono. Los ejemplos de heterociclilalquilos incluyen, a modo de ejemplo y sin limitación, heterociclos que contienen azufre, oxígeno y/o nitrógeno de 5 miembros tales como tiazolilmetilo, 2-tiazoliletan-1 -ilo, imidazolilmetilo, oxazolilmetilo, tiadiazolilmetilo, etc., azufre de 6 miembros, heterociclos que contienen oxígeno y/o nitrógeno tales como piperidinilmetilo, piperazinilmetilo, morfolinilmetilo, piridinilmetilo, piridizilmetilo, pirimidilmetilo, pirazinilmetilo, etc.

[0038] Típicamente un átomo de carbono terminal o sp3, pero también un átomo de carbono sp2, se reemplaza con un radical heterociclilo (es decir, un resto heterociclilo-alquenileno). La porción heterociclilo del grupo heterociclil alquenilo incluye cualquiera de los grupos heterociclilo descritos en este documento, incluidos los descritos en Principles of Modern Heterocyclic Chemistry, y la porción alquenilo del grupo heterociclil alquenilo incluye cualquiera de los grupos alquenilo descritos en este documento. Un experto en la técnica también entenderá que el grupo heterociclilo se puede unir a la porción alquenilo del heterociclil alquenilo por medio de un enlace carbono-carbono o un enlace carbono-heteroátomo, con la condición de que el grupo resultante sea químicamente estable. El grupo heterociclilo alquenilo comprende de 4 a 20 átomos de carbono, p. ej., la porción alquenilo del heterociclil alquenilo el grupo tiene de 2 a 6 átomos de carbono y el resto heterociclilo tiene de 2 a 14 átomos de carbono.

[0039] "Heterociclilalquinilo" se refiere a un radical alquinilo acíclico en el que uno de los átomos de hidrógeno unido a un átomo de carbono, típicamente un átomo de carbono terminal o sp3, pero también un átomo de carbono sp, se reemplaza con un radical heterociclilo (es decir, un resto heterociclil-alquinileno). La porción heterociclilo del grupo heterociclil alquinilo incluye cualquiera de los grupos heterociclilo descritos aquí, incluidos los descritos en Principies of Modern Heterocyclic Chemistry, y la porción alquinilo del grupo heterociclil alquinilo incluye cualquiera de los grupos alquinilo descritos aquí. Un experto en la técnica también entenderá que el grupo heterociclilo se puede unir a la porción alquinilo del heterociclil alquinilo por medio de un enlace carbono-carbono o un enlace carbono-heteroátomo, con la condición de que el grupo resultante sea químicamente estable. El grupo heterociclil alquinilo comprende de 4 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, la porción alquinilo del grupo heterociclil alquinilo tiene de 2 a 6 átomos de carbono y el resto heterociclilo tiene de 2 a 14 átomos de carbono.

[0040] "Heteroarilo" se refiere a un heterociclilo aromático que tiene al menos un heteroátomo en el anillo. Los ejemplos no limitativos de heteroátomos adecuados que se pueden incluir en el anillo aromático incluyen oxígeno, azufre y nitrógeno. Los ejemplos no limitativos de anillos de heteroarilo incluyen todos los anillos aromáticos enumerados en la definición de "heterociclilo", incluidos piridinilo, pirrolilo, oxazolilo, indolilo, isoindolilo, purinilo, furanilo, tienilo, benzofuranilo, benzotiofenilo, carbazolilo, imidazolilo, tiazolilo, isoxazolilo., pirazolilo, isotiazolilo, quinolilo, isoquinolilo, piridazilo, pirimidilo, pirazilo, etc.

[0041] "Carbociclo" o "carbociclilo" se refiere a un anillo saturado (es decir, cicloalquilo), parcialmente insaturado (por ejemplo, cicloaquenilo, cicloalcadienilo, etc.) o anillo aromático que tiene de 3 a 7 átomos de carbono como monociclo, de 7 a 12 átomos de carbono como biciclo y hasta aproximadamente 20 átomos de carbono como policiclo. Los carbociclos monocíclicos tienen de 3 a 7 átomos en el anillo, aún más típicamente 5 o 6 átomos en el anillo. Los carbociclos bicíclicos tienen de 7 a 12 átomos en el anillo, por ejemplo, dispuestos como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6], o 9 o 10 átomos en el anillo dispuestos como un sistema bicíclico [5,6] o [6,6], o anillos espiro fusionados. Los ejemplos no limitantes de carbociclos monocíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-1-enilo, 1-ciclopent-2-enilo, 1-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-1-enilo, 1- ciclohex-2-enilo, 1-ciclohex-3-enilo y fenilo. Los ejemplos no limitantes de biciclocarbociclos incluyen naftilo, tetrahidronaftaleno y decalina.

[0042] "Carbociclilalquilo" se refiere a un radical alquilo acíclico en el que uno de los átomos de hidrógeno unido a un átomo de carbono se reemplaza con un radical carbociclilo como se describe en el presente documento. Los ejemplos típicos, pero no limitativos, de grupos carbociclilalquilo incluyen ciclopropilmetilo, ciclopropiletilo, ciclobutilmetilo, ciclopentilmetilo y ciclohexilmetilo.

[0043] "Arilheteroalquilo" se refiere a un heteroalquilo como se define aquí, en el que un átomo de hidrógeno (que puede estar unido a un átomo de carbono o a un heteroátomo) ha sido reemplazado por un grupo arilo como se define aquí. Los grupos arilo pueden unirse a un átomo de carbono del grupo heteroalquilo, o a un heteroátomo del grupo heteroalquilo, siempre que el grupo arilheteroalquilo resultante proporcione un resto químicamente estable. Por ejemplo, un grupo arilheteroalquilo puede tener las fórmulas generales -alquileno-O-arilo, -alquileno-O-alquileno-arilo, -alquileno-NH-arilo, -alquileno-NH-alquileno-arilo, -alquileno-S-arilo, -alquileno-S-alquilen-arilo, etc. Además, cualquiera de los restos alquileno en las fórmulas generales anteriores puede sustituirse adicionalmente con cualquiera de los sustituyentes definidos o ejemplificados en este documento.

[0044] "Heteroarilalquilo" se refiere a un grupo alquilo, como se define aquí, en el que un átomo de hidrógeno se ha reemplazado con un grupo heteroarilo como se define aquí. Los ejemplos no limitantes de heteroaril alquilo incluyen -CH²-piridinilo, -CH²-pirrolilo, -CH²-oxazolilo, -CH²-indolilo, -CH²-isoindolilo, -CH²-purinilo, -CH²-furanilo, -CH²-tienilo, -CH²-tienilo, -CH²-benzofuranilo, -CH²-benzotiofenilo, -CH²-carbazolilo, -CH²-imidazolilo, -CH²-tiazolilo, -CH²-isoxazolilo, -CH²-pirazolilo, -CH²-isotiazolilo, -CH²-quinolilo, -CH²-isoquinolilo, -CH²-piridazilo, -CH²-pirimidilo, -CH²-pirazilo, -CH(CH3)-piridinilo, -CH(CH3)-pirrolilo, -CH(CH3)-oxazolilo, -CH(CH3)-indolilo, -CH(CH3)-isoindolilo, -CH(CH3)-purinilo, -CH(CH³)-furanilo, -CH(CH³)-tienilo, -CH(CH³)-benzofuranilo, -CH(CH³)-benzotiofenilo, -CH(CH³)-carbazolilo, -CH(CH³)-imidazolilo, -CH(CH³)-tiazolilo, -CH(CH³)-isoxazolilo, -CH(CH³)-pirazolilo, -CH(CH³)-isotiazolilo, -CH(CH³) -quinolilo, -CH(CH3)-isoquinolilo, -CH(CH3)-piridacilo, -CH(CH3)-pirimidilo, -CH(CH3)-pirazilo, etc.

[0045] El término "opcionalmente sustituido" en referencia a un resto particular (p. ej., un grupo arilo opcionalmente sustituido) se refiere a un resto en el que todos los sustituyentes son hidrógeno o donde uno o más de los hidrógenos del resto pueden estar reemplazados por sustituyentes tales como los enumerados bajo la definición de "sustituido".

[0046] El término "reemplazado opcionalmente" en referencia a un resto particular (p. ej., los átomos de carbono de dicho alquilo (C¹-C⁸) pueden reemplazarse opcionalmente por -O-,-S- o -NRa-) significa que uno o más de los grupos metileno del alquilo (C¹-C⁸) pueden estar reemplazados por 0, 1, 2 o más de los grupos especificados (por ejemplo, -O-, -S- o -NRa-).

[0047] El término "átomo(s) de carbono no terminal(es)" en referencia a un resto alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno o alquinileno se refiere a los átomos de carbono en el resto que intervienen entre el primer átomo de carbono del resto y el último átomo de carbono en el resto. Por tanto, a modo de ejemplo y no de limitación, en la fracción alquilo -CH2(C*)H2(C*)H2CH3 o alquileno -CH²(C*)H²(C*)H²CH²- los átomos de C* se considerarían ser los átomos de carbono no terminales.

[0048] "Enlazador" o "enlace" significa un resto químico que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos. Los enlazadores incluyen unidades repetitivas de alquiloxi (p. ej., polietilenoxi, PEG, polimetilenoxi) y alquilamino (p. ej., polietilenamino, Jeffamine™); y éster de diácido y amidas que incluyen succinato, succinamida, diglicolato, malonato y caproamida.

[0049] Los términos como "enlazado con oxígeno", "enlazado con nitrógeno", "enlazado con carbono", "enlazado con azufre" o "enlazado con fósforo" significa que si se puede formar un enlace entre dos fracciones usando más de un tipo de átomo en una fracción, entonces el enlace formado entre las fracciones es a través de la átomo especificado. Por ejemplo, un aminoácido unido a nitrógeno estaría unido a través de un átomo de nitrógeno del aminoácido en lugar de a través de un átomo de oxígeno o de carbono del aminoácido.

[0050] Los ejemplos de aminoácidos naturales incluyen isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, prolina, selenocisteína, serina, tirosina, arginina, histidina, ornitina y taurina. Los ésteres de estos aminoácidos comprenden cualquiera de los descritos para el sustituyente R, particularmente aquellos en los que Ri es alquilo (C¹-C⁸) opcionalmente sustituido.

[0051] El término base "purina" o "pirimidina" comprende, entre otros, adenina, N6-alquilpurinas, N6-acilpurinas (donde acilo es C(O)(alquilo, arilo, alquilarilo o arilalquilo), N6-bencilpurina, N6-halopurina, N6-vinilpurina, N6-acetilénico purina, N6-acilpurina, N6-hidroxialquilpurina, N6-alilaminopurina, N6-tioalilpurina, N2-alquilpurinas, N2-alquil-6-tiopurinas, timina, citosina, 5-fluorocitosina, 5-metilcitosina, 6-azapirimidina, incluida la 6-azacitosina, 2- y/o 4-mercaptopirmidina, uracilo, 5-halouracilo, incluido el 5-fluorouracilo, C5-alquilpirimidinas, C5-bencilpirimidinas, C5-halopirimidinas, C5-vinilpirimidina, C5-pirimidina acetilénica, C5-acilpirimidina, C5-hidroxialquil purina, C5-amidopirimidina, C5-cianopirimidina, C5-5-yodopirimidina, C6-yodo-pirimidina, C5-Br-vinilpirimidina, C6-Br-vinilpiriniidina, C5-nitropirimidina, C5-aminopirimidina, N2-alquilpurinas, N2-alquil-6-tiopurinas, 5-azacitidinilo, 5-azauracilo, triazolopiridinilo, imidazolopiridinilo, pirrolopirimidinilo y pirazolopirimidinilo. Las bases de purina incluyen, pero no se limitan a guanina, adenina, hipoxantina, 2,6-diaminopurina y 6-cloropurina. Las bases de purina y pirimidina están unidas al azúcar ribosa, o análogo del mismo, a través de un átomo de nitrógeno de la base. Los grupos funcionales de oxígeno y nitrógeno en la base pueden protegerse según sea necesario o deseado. Los grupos protectores adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen trimetilsililo, dimetilhexilsililo, t-butildimetilsililo y t-butildifenilsililo, tritilo, grupos alquilo y grupos acilo tales como acetilo y propionilo, metanosulfonilo y p-toluenosulfonilo.

[0052] A menos que se especifique lo contrario, se pretende que los átomos de carbono tengan una valencia de cuatro. En algunas representaciones de estructuras químicas donde los átomos de carbono no tienen un número suficiente de variables unidas para producir una valencia de cuatro, se debe suponer que los sustituyentes de carbono restantes necesarios para proporcionar una valencia de cuatro son hidrógeno. Por ejemplo,

tiene el mismo significado que

[0053] "Grupo protector" se refiere a un resto de un compuesto que enmascara o altera las propiedades de un grupo funcional o las propiedades del Compuesto como un todo. La subestructura química de un grupo protector varía ampliamente. Una función de un grupo protector es servir como intermediario en la síntesis de la sustancia farmacológica original. Los grupos protectores químicos y las estrategias para la protección/desprotección son bien conocidos en la técnica. Véase: "Protective Groups in Organic Chemistry", Theodora W. Greene (John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1991).

[0054] Los grupos protectores se utilizan a menudo para enmascarar la reactividad de ciertos grupos funcionales, para ayudar en la eficacia de las reacciones químicas deseadas, por ejemplo, formar y romper enlaces químicos de forma ordenada y planificada. La protección de los grupos funcionales de un compuesto altera otras propiedades físicas además de la reactividad del grupo funcional protegido, como la polaridad, la lipofilicidad (hidrofobicidad) y otras propiedades que pueden medirse con herramientas analíticas comunes. Los productos intermedios químicamente protegidos pueden ser biológicamente activos o inactivos. "Grupos protectores de hidroxi" se refiere a aquellos grupos protectores útiles para proteger los grupos hidroxi (-OH).

[0055] Los compuestos protegidos también pueden exhibir propiedades alteradas y, en algunos casos, optimizadas in vitro e in vivo, tales como el paso a través de las membranas celulares y la resistencia a la degradación o secuestro enzimático. En este papel, los compuestos protegidos con efectos terapéuticos previstos pueden denominarse profármacos. Otra función de un grupo protector es convertir el fármaco original en un profármaco, por lo que el fármaco original se libera tras la conversión del profármaco in vivo. Debido a que los profármacos activos pueden absorberse más eficazmente que el fármaco original, los profármacos pueden tener mayor potencia in vivo que el fármaco original. Los grupos protectores se eliminan in vitro, en el caso de los productos químicos intermedios, o in vivo, en el caso de los profármacos. Con intermedios químicos, no es particularmente importante que los productos resultantes después de la desprotección, por ejemplo, alcoholes, sean fisiológicamente aceptables, aunque en general es más deseable si los productos son farmacológicamente inocuos.

[0056] El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no superponerse con la pareja de imagen especular, mientras que el término "aquiral" se refiere a moléculas que son superponibles con su pareja de imagen especular.

[0057] El término "estereoisómeros" se refiere a compuestos que tienen una constitución química idéntica, pero difieren en cuanto a la disposición de los átomos o grupos en el espacio.

[0058] "Diastereómero" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tienen diferentes propiedades físicas, por ejemplo, puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales, reactividades y propiedades biológicas. Por ejemplo, los compuestos que se describen en este documento pueden tener un átomo de fósforo quiral cuando R7 es

y Z1 y Z2 son diferentes. Cuando al menos uno de Z1 o Z2 también tiene un centro quiral, por ejemplo, con Z1 o Z2 es un éster de a-aminoácido quiral de origen natural unido a nitrógeno, entonces el compuesto existirá como diastereoisómeros porque hay dos centros de quiralidad en la molécula. Las mezclas de diastereoisómeros pueden separarse mediante procedimientos analíticos de alta resolución como electroforesis, cristalización y/o cromatografía. Los diastereoisómeros pueden tener diferentes atributos físicos tales como, entre otros, solubilidad, estabilidad química y cristalinidad y también pueden tener diferentes propiedades biológicas tales como, entre otros, estabilidad enzimática, absorción y estabilidad metabólica.

[0059] Los "enantiómeros" se refieren a dos estereoisómeros de un compuesto que son imágenes especulares no superponibles entre sí.

[0060] El modificador "sobre" utilizado en relación con una cantidad incluye el valor establecido y tiene el significado dictado por el contexto (p. ej., incluye el grado de error asociado con la medición de la cantidad particular).

[0061] El término "tratar", como se usa en este documento, a menos que se indique lo contrario, significa revertir, aliviar, inhibir el progreso o prevenir el trastorno o condición al que se aplica dicho término, o uno o más síntomas de dicho trastorno o condición. El término "tratamiento", como se usa en este documento, se refiere al acto de tratar, como "tratar" se define inmediatamente antes.

[0062] El término "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en este documento, es la cantidad de compuesto como se describe en este documento presente en una composición descrita en este documento que se necesita para proporcionar un nivel deseado de fármaco en las secreciones y tejidos de las vías respiratorias y los pulmones o alternativamente, en el torrente sanguíneo de un sujeto a tratar para dar una respuesta fisiológica anticipada o un efecto biológico deseado cuando dicha composición se administra por la vía de administración elegida. La cantidad precisa dependerá de numerosos factores, por ejemplo, el compuesto particular como se describe en este documento, la actividad específica de la composición, el dispositivo de administración empleado, las características físicas de la composición, su uso previsto, así como las consideraciones del paciente, como la gravedad de la el estado de la enfermedad, la cooperación del paciente, etc., y puede ser determinado fácilmente por un experto en la técnica basándose en la información proporcionada en este documento.

[0063] El término "solución salina normal" significa una solución de agua que contiene 0,9% (p/v) de NaCl.

[0064] El término "solución salina hipertónica" significa una solución de agua que contiene más del 0,9 % (p/v) de NaCl. Por ejemplo, La solución salina hipertónica al 3% contendría NaCl al 3% (p/v).

[0065] "Formar una mezcla de reacción" se refiere al proceso de poner en contacto al menos dos especies distintas de modo que se mezclen y puedan reaccionar. Debe apreciarse, sin embargo, que el producto de reacción resultante puede producirse directamente a partir de una reacción entre los reactivos añadidos o a partir de un intermedio de uno o más de los reactivos añadidos que pueden producirse en la mezcla de reacción.

[0066] "Agente de acoplamiento" se refiere a un agente capaz de acoplar dos compuestos diferentes. Los agentes de acoplamiento pueden ser catalíticos o estequiométricos. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento pueden ser un agente de acoplamiento a base de litio o un agente de acoplamiento a base de magnesio tal como un reactivo de Grignard. Los ejemplos de agentes de acoplamiento incluyen, pero no se limitan a n-BuLi, MgCl² , iPrMgCl, tBuMgCl, PhMgCl o combinaciones de los mismos.

[0067] "Silano" se refiere a un grupo que contiene silicio que tiene la fórmula SiR4, donde cada grupo R puede ser alquilo, alquenilo, cicloalquilo, fenilo u otros grupos que contienen silicio. Cuando el silano está unido a otro compuesto, el silano se denomina "sililo" y tiene la fórmula -SiR3.

[0068] "Halo-silano" se refiere a un silano que tiene al menos un grupo halógeno unido al átomo de silicio. Los halo-silanos representativos tienen la fórmula Halo-SiR3, donde cada grupo R puede ser alquilo, alquenilo, cicloalquilo, fenilo u otros grupos que contienen silicio. Los halo-silanos específicos incluyen Cl-Si(CH3)3 y Cl-Si(CH3)2CH2CH2Si(CH3)2-Cl.

[0069] "Base no nucleófila" se refiere a un donante de electrones, una base de Lewis, como bases nitrogenadas que incluyen trietilamina, diisopropiletilamina, N,N-dietilanilina, piridina, 2,6-lutidina, 2,4,6-colidina, 4-dimetilaminopiridina y quinuclidina.

[0070] El "grupo saliente" se refiere a grupos que mantienen el par de electrones de enlace durante la escisión del enlace heterolítico. Por ejemplo, un grupo saliente se desplaza fácilmente durante una reacción de desplazamiento nucleófilo. Los grupos salientes adecuados incluyen, entre otros, cloruro, bromuro, mesilato, tosilato, triflato, 4-nitrobencenosulfonato, 4-clorobencenosulfonato, 4-nitrofenoxi, pentafluorofenoxi, etc. Un experto en la técnica reconocerá otros grupos salientes útiles en la presente invención.

[0071] "Agente de desprotección" se refiere a cualquier agente capaz de eliminar un grupo protector. El agente de desprotección dependerá del tipo de grupo protector utilizado. Los agentes de desprotección representativos se conocen en la técnica y se pueden encontrar en Protective Groups in Organic Chemistry, Peter G. M. Wuts y Theodora W. Greene, 4a ed., 2006.

II. COMPUESTOS PARA SU USO DE ACUERDO CON LA PRESENTE INVENCIÓN

[0072] Ahora se hará referencia en detalle a ciertas formas de realización de la invención, cuyos ejemplos se ilustran en la descripción adjunta, estructuras y fórmulas. Si bien la invención se describirá junto con las formas de realización enumeradas, se entenderá que no pretenden limitar la invención a dichas formas de realización. Por el contrario, la invención pretende cubrir todas las alternativas, modificaciones y equivalentes, que pueden estar incluidas dentro del alcance de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0073] Se proporciona un compuesto que tiene la fórmula:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para usar en un método para tratar una infección por Coronaviridae en un ser humano que lo necesita, en el que el método comprende administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0074] En otra forma de realización, la infección por Coronaviridae está provocada por un virus Coronaviridae. En otro aspecto de esta realización, el virus Coronaviridae es un virus MERS o un virus SARS. En otro aspecto de esta realización, el virus Coronaviridae es un virus MERS. En otro aspecto de esta realización, el virus Coronaviridae es un virus SARS. En otro aspecto de esta realización, el virus Coronaviridae está causado por un virus MERS causado por una cepa seleccionada de cepas conocidas.

[0075] El uso en métodos para tratar una infección por Coronaviridae en el presente documento incluye el uso en el tratamiento de infecciones causadas por los coronavirus alfa 229E (HCoV-229E) y NL63 (HCoV-NL63, coronavirus de New Haven), coronavirus beta OC43 (HCoV-OC43), HKU1, SARS-CoV (el coronavirus responsable del Síndrome Respiratorio Agudo Severo, o SARS) y MERS-CoV (el coronavirus responsable del Síndrome Respiratorio de Oriente Medio), anteriormente conocido como nuevo coronavirus 2012 y HCoV-EMC.

[0076] Los nombres de los compuestos de la presente descripción se proporcionan utilizando el software ACD/Nombre para nombrar compuestos químicos (Advanced Chemistry Development, Inc., Toronto, Canadá). Otros compuestos o radicales pueden nombrarse con nombres comunes o nombres sistemáticos o no sistemáticos. La denominación y numeración de los compuestos de la divulgación se ilustra con un compuesto representativo:

que se denomina (2S)-2-etilbutil 2-((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-aminopirrolo[1.2-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-² -il)metoxi)(fenoxi)fosforilamino)propanoato. el compuesto de la presente invención:

se denomina (S)-2-etilbutil 2-(((S)-(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-² -il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato, mientras que otro compuesto:

se denomina (S)-2-etilbutil 2-(((R)-(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-² -il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato.

[0077] Cualquier referencia al compuesto para uso de acuerdo con la invención descrito en el presente documento también incluye una referencia a una sal fisiológicamente aceptable del mismo. Los ejemplos de sales fisiológicamente aceptables del compuesto para uso de acuerdo con la invención incluyen sales derivadas de una base apropiada, como un metal alcalino o alcalinotérreo (por ejemplo, Na+, Li+, K+, Ca+2 y Mg+2), amonio y NR⁴+ (donde R se define aquí). Las sales fisiológicamente aceptables de un átomo de nitrógeno o un grupo amino incluyen (a) sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácidos sulfámicos, ácido fosfórico, ácido nítrico y similares; (b) sales formadas con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido isetiónico, ácido lactobiónico, ácido tánico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácido naftalenosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido naftalendisulfónico, ácido poligalacturónico, ácido malónico, ácido sulfosalicílico, ácido glicólico, 2-hidroxi-3-naftoato, pamoato, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido ftálico, ácido mandélico, ácido láctico, ácido etanosulfónico, lisina, arginina, ácido glutámico, glicina, serina, treonina, alanina, isoleucina, leucina y similares; y (c) sales formadas a partir de aniones elementales, por ejemplo, cloro, bromo y yodo. Las sales fisiológicamente aceptables de un compuesto de un grupo hidroxi incluyen el anión de dicho compuesto en combinación con un catión adecuado tal como Na+ y NR⁴+.

[0078] Un compuesto como se describe en este documento y sus sales farmacéuticamente aceptables pueden existir como diferentes polimorfos o pseudopolimorfos. Como se usa en este documento, polimorfismo cristalino significa la capacidad de un compuesto cristalino de existir en diferentes estructuras cristalinas. El polimorfismo cristalino puede resultar de diferencias en el empaquetamiento del cristal (polimorfismo de empaquetamiento) o diferencias en el empaquetamiento entre diferentes confórmeros de la misma molécula (polimorfismo conformacional). Como se usa en este documento, pseudopolimorfismo cristalino significa la capacidad de un hidrato o solvato de un compuesto para existir en diferentes estructuras cristalinas. Los pseudopolimorfos de la presente divulgación pueden existir debido a diferencias en el empaquetamiento de cristal (pseudopolimorfismo de empaquetamiento) o debido a diferencias en el empaquetamiento entre diferentes confórmeros de la misma molécula (pseudopolimorfismo conformacional). el compuesto para uso de acuerdo con la presente invención comprende todos los polimorfos y pseudopolimorfos del Compuesto como se describe en este documento y sus sales farmacéuticamente aceptables.

[0079] Un compuesto como se describe en este documento y sus sales farmacéuticamente aceptables también pueden existir como un sólido amorfo. Como se usa en este documento, un sólido amorfo es un sólido en el que no existe un orden de largo alcance de las posiciones de los átomos en el sólido. Esta definición se aplica también cuando el tamaño del cristal es de dos nanómetros o menos. Pueden usarse aditivos, incluidos disolventes, para crear las formas amorfas. El compuesto para uso de acuerdo con la presente invención comprende todas las formas amorfas del compuesto como se describe en este documento y sus sales farmacéuticamente aceptables.

[0080] Para uso terapéutico, las sales de los ingredientes activos del compuesto para usar según la invención serán fisiológicamente aceptables, es decir, serán sales derivadas de un ácido o base fisiológicamente aceptable. Sin embargo, las sales de ácidos o bases que no son fisiológicamente aceptables también pueden encontrar uso, por ejemplo, en la preparación o purificación de un compuesto fisiológicamente aceptable. Todas las sales, derivadas o no de un ácido o base fisiológicamente aceptable, están dentro del alcance del compuesto para su uso según la presente invención.

[0081] Finalmente, debe entenderse que las composiciones de la presente invención comprenden un compuesto para usar de acuerdo con la invención en su forma no ionizada, así como zwitteriónica, y combinaciones con cantidades estequiométricas de agua como en hidratos.

[0082] Debe señalarse que todos los enantiómeros, mezclas racémicas, tautómeros, polimorfos, pseudopolimorfos de un compuesto como se describe en el presente documento y sus sales farmacéuticamente aceptables están abarcados por la presente descripción.

[0083] El compuesto como se describe en el presente documento tiene centros quirales, por ejemplo, átomos de carbono quiral y fósforo. Tanto las mezclas racémicas como las diastereoisómeras, así como los isómeros ópticos individuales aislados o sintetizados, sustancialmente libres de sus asociados enantioméricos o diastereoisómeros, están todos dentro del alcance del compuesto para su uso según la invención. Las mezclas racémicas se separan en sus isómeros individuales sustancialmente ópticamente puros a través de técnicas bien conocidas tales como, por ejemplo, la separación de sales diastereoisómeras formadas con adjuntos ópticamente activos, por ejemplo, ácidos o bases, seguido de conversión de nuevo a las sustancias ópticamente activas. En la mayoría de los casos, el isómero óptico deseado se sintetiza por medio de reacciones estereoespecíficas, comenzando con el estereoisómero apropiado del material de partida deseado.

[0084] Las definiciones y convenciones estereoquímicas usadas aquí generalmente siguen a S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York; y Eliel, E. y Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de rotar el plano de la luz polarizada en el plano. Al describir un compuesto ópticamente activo, los prefijos D y L o R y S se utilizan para indicar la configuración absoluta de la molécula en torno a su(s) centro(s) quiral(es). Los prefijos d y 1, D y L, o (+) y (-) se emplean para designar el signo de rotación de la luz polarizada en el plano por el compuesto, con S, (-) o 1 significando que el compuesto es levorrotatorio, mientras que un compuesto con el prefijo R, (+) o d es dextrógiro. Para una estructura química dada, estos estereoisómeros son idénticos excepto que son imágenes especulares entre sí. Un estereoisómero específico también puede denominarse enantiómero, y una mezcla de tales isómeros a menudo se denomina mezcla enantiomérica. Una mezcla 50:50 de enantiómeros se denomina mezcla racémica o racemato, que puede ocurrir cuando no ha habido estereoselección o estereoespecificidad en una reacción o proceso químico. Los términos "mezcla racémica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas, desprovistas de actividad óptica.

[0085] El compuesto para uso de acuerdo con la invención también puede existir como isómeros tautoméricos en ciertos casos. Aunque sólo se puede representar una estructura de resonancia deslocalizada, todas estas formas se contemplan dentro del alcance del compuesto para uso según la invención. Por ejemplo, pueden existir tautómeros de ene-amina para sistemas de purina, pirimidina, imidazol, guanidina, amidina y tetrazol y todas sus posibles formas tautómeras están dentro del alcance del compuesto para uso según la invención.

[0086] Cualquier fórmula o estructura proporcionada en el presente documento también pretende representar formas no marcadas así como formas isotópicamente marcadas de los compuestos. Los compuestos marcados isotópicamente tienen estructuras representadas por las fórmulas dadas en este documento, excepto que uno o más átomos se reemplazan por un átomo que tiene una masa atómica o un número de masa seleccionados. Los ejemplos de isótopos que se pueden incorporar en los compuestos de la descripción incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, flúor y cloro, tales como, entre otros, 2H (deuterio, D), 3H (tritio), 11C, 13C, 14C, 15N, 18F, 31P, 32P, 35S, 36Cl y 125I. Diversos compuestos marcados isotópicamente de la presente descripción, por ejemplo aquellos en los que se incorporan isótopos radiactivos tales como 3H, 13C y 14C. Dichos compuestos marcados isotópicamente pueden ser útiles en estudios metabólicos, estudios cinéticos de reacción, técnicas de detección o de imagen, como la emisión de positrones. tomografía (PET) o tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) que incluye ensayos de distribución de tejido de sustrato o fármaco o en el tratamiento radiactivo de pacientes.

[0087] La descripción también incluye compuestos en los que de 1 a n hidrógenos unidos a un átomo de carbono se reemplazan por deuterio, en los que n es el número de hidrógenos en la molécula. Dichos compuestos exhiben una mayor resistencia al metabolismo y, por lo tanto, son útiles para aumentar la vida media de cualquier compuesto como se describe en el presente documento cuando se administran a un mamífero, particularmente a un ser humano. Véase, por ejemplo, Foster, "Deuterium Isotope Effects in Studies of Drug Metabolism", Trends Pharmacol", Trends Pharmacol. ciencia 5(12):524-527 (1984). Dichos compuestos se sintetizan por medios bien conocidos en la técnica, por ejemplo empleando materiales de partida en los que uno o más hidrógenos han sido reemplazados por deuterio.

[0088] Los compuestos terapéuticos de la descripción marcados con deuterio o sustituidos pueden tener propiedades DMPK (farmacocinética y metabolismo de fármacos) mejoradas, relacionadas con la distribución, el metabolismo y la excreción (ADME). La sustitución con isótopos más pesados, como el deuterio, puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas resultantes de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, una mayor vida media in vivo, requisitos de dosificación reducidos y/o una mejora en el índice terapéutico. Un compuesto marcado con 18F puede ser útil para estudios PET o SPECT. Los compuestos marcados isotópicamente de esta descripción y sus profármacos generalmente se pueden preparar llevando a cabo los procedimientos descritos en los esquemas o en los ejemplos y preparaciones descritos a continuación sustituyendo un reactivo marcado isotópicamente disponible fácilmente por un reactivo no marcado isotópicamente. Se entiende que el deuterio en este contexto se considera un sustituyente en el compuesto descrito en el presente documento.

[0089] La concentración de tal isótopo más pesado, específicamente deuterio, puede definirse mediante un factor de enriquecimiento isotópico. En los compuestos de esta divulgación, cualquier átomo no designado específicamente como un isótopo particular pretende representar cualquier isótopo estable de ese átomo. A menos que se indique lo contrario, cuando una posición se designa específicamente como "H" o "hidrógeno", se entiende que la posición tiene hidrógeno en su composición isotópica de abundancia natural. Por consiguiente, en los compuestos de esta descripción, cualquier átomo designado específicamente como deuterio (D) pretende representar deuterio.

[0090] Siempre que un compuesto descrito en el presente documento se sustituya con más de uno del mismo grupo designado, por ejemplo, "R" o "R1", entonces se entenderá que los grupos pueden ser ¡guales o diferentes, es decir, cada grupo es seleccionado de forma independiente. Las líneas onduladas •'www, indican el sitio de unión de enlaces covalentes a las subestructuras, grupos, fracciones o átomos adyacentes.

[0091] El compuesto para uso de acuerdo con la presente invención se puede preparar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el compuesto para uso de acuerdo con la presente invención se puede preparar de acuerdo con los métodos descritos en la patente de EE. UU. N° 8.008.264 y la publicación de solicitud de EE. UU. N° US 2012/0027752.

A. Metabolitos

[0092] Los metabolitos son los productos metabólicos in vivo del compuesto como se describe en el presente documento. Dichos productos pueden resultar, por ejemplo, de la oxidación, reducción, hidrólisis, amidación, esterificación y similares del compuesto administrado, principalmente debido a procesos enzimáticos. Los metabolitos pueden producirse mediante un proceso que comprende poner en contacto un compuesto para usar de acuerdo con esta invención con un mamífero para un período de tiempo suficiente para producir un producto metabólico del mismo. Dichos productos normalmente se identifican preparando un compuesto radiomarcado (p. ej., 14C o 3H), administrándolo por vía parenteral en una dosis detectable (p. ej., superior a aproximadamente 0,5 mg/kg) a un animal como rata, ratón, conejillo de Indias, mono o a hombre, dejando suficiente tiempo para que ocurra el metabolismo (típicamente alrededor de 30 segundos a 30 horas) y aislando sus productos de conversión de la orina, sangre u otras muestras biológicas. Estos productos se aíslan fácilmente ya que están marcados (otros se aíslan mediante el uso de anticuerpos capaces de unirse a los epítopos que sobreviven en el metabolito). Las estructuras de los metabolitos se determinan de forma convencional, por ejemplo mediante análisis de EM o RMN. En general, el análisis de metabolitos se realiza de la misma manera que los estudios de metabolismo de fármacos convencionales bien conocidos por los expertos en la materia.

[0093] Se conocen recetas y métodos para determinar la estabilidad de compuestos en secreciones gastrointestinales sucedáneas. Los compuestos se definen aquí como estables en el tracto gastrointestinal donde menos de aproximadamente el 50 por ciento en moles de los grupos protegidos están desprotegidos en jugo intestinal o gástrico sustituto tras la incubación durante 1 hora a 37°C. El simple hecho de que los compuestos sean estables en el tracto gastrointestinal no significa que no puedan hidrolizarse in vivo. Los profármacos normalmente serán estables en el sistema digestivo pero pueden hidrolizarse sustancialmente al fármaco original en el lumen digestivo, el hígado u otro órgano metabólico, o dentro de las células en general.

III. FORMULACIONES FARMACÉUTICAS

[0094] El compuesto para uso de acuerdo con esta invención se puede formular con vehículos y excipientes convencionales, que se seleccionarán de acuerdo con la práctica habitual. Los comprimidos contendrán excipientes, deslizantes, rellenos, aglutinantes y similares. Las formulaciones acuosas se preparan en forma estéril, y cuando están destinadas a una administración distinta a la oral, generalmente serán isotónicas. Todas las formulaciones contendrán opcionalmente excipientes como los establecidos en el "Handbook of Pharmaceutical Excipients" (1986). Los excipientes incluyen ácido ascórbico y otros antioxidantes, agentes quelantes como EDTA, carbohidratos como dextrano, hidroxialquilcelulosa, hidroxialquilmetilcelulosa, ácido esteárico y el pH de las formulaciones varía de aproximadamente 3 a aproximadamente 11, pero normalmente es de aproximadamente 7 a 10. En algunas formas de realización, el pH de las formulaciones varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, pero normalmente es de aproximadamente 3 a 4.

[0095] Si bien es posible que los ingredientes activos se administren solos, puede ser preferible presentarlos como formulaciones farmacéuticas. Las formulaciones para usar de acuerdo con la invención comprenden al menos un ingrediente activo, como se define anteriormente, junto con uno o más portadores aceptables para los mismos y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos como se describe en este documento. El o los portadores deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la formulación y fisiológicamente inocuos para el receptor de los mismos.

[0096] Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para las vías de administración anteriores. Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Las técnicas y formulaciones generalmente se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA). Dichos métodos incluyen el paso de asociar el ingrediente activo con el vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el ingrediente activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario, dando forma al producto.

[0097] Las formulaciones adecuadas para la administración oral pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas, sellos o comprimidos, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo; como polvo o gránulos; como solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite. El ingrediente activo también se puede administrar como bolo, electuario o pasta.

[0098] Una tableta se hace por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las tabletas comprimidas se pueden preparar comprimiendo en una máquina adecuada el ingrediente activo en una forma de flujo libre, como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante, activo de superficie o agente dispersante. Los comprimidos moldeados pueden fabricarse moldeando en una máquina adecuada una mezcla del ingrediente activo en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos se pueden recubrir o ranurar opcionalmente y se formulan opcionalmente para proporcionar una liberación lenta o controlada del ingrediente activo de los mismos.

[0099] Para infecciones de los ojos u otros tejidos externos, por ejemplo, boca y piel, las formulaciones se aplican preferiblemente como un ungüento o crema tópica que contiene el ingrediente o ingredientes activos en una cantidad de, por ejemplo, 0,075 a 20 % p/p. (incluyendo ingrediente(s) activo(s) en un rango entre 0,1% y 20% en incrementos de 0,1% p/p tal como 0,6% p/p, 0,7% p/p, etc.), preferiblemente 0,2 a 15% p/p y lo más preferiblemente del 0,5 al 10% p/p. Cuando se formulan en una pomada, los ingredientes activos se pueden emplear con una base de pomada parafínica o miscible en agua. Alternativamente, los ingredientes activos pueden formularse en una crema con una base de crema de aceite en agua.

[0100] Si se desea, la fase acuosa de la base de crema puede incluir, por ejemplo, al menos 30% p/p de un alcohol polihídrico, es decir, un alcohol que tiene dos o más grupos hidroxilo como propilenglicol, butano 1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol y polietilenglicol (incluyendo PEG 400) y mezclas de los mismos. Las formulaciones tópicas pueden incluir deseablemente un compuesto que mejore la absorción o penetración del ingrediente activo a través de la piel u otras áreas afectadas. Los ejemplos de tales potenciadores de la penetración dérmica incluyen sulfóxido de dimetilo y análogos relacionados.

[0101] La fase oleosa de las emulsiones puede estar constituida por ingredientes conocidos de manera conocida. Aunque la fase puede comprender simplemente un emulsionante (también conocido como emulgente), deseablemente comprende una mezcla de al menos un emulsionante con una grasa o un aceite o con una grasa y un aceite. Preferiblemente, se incluye un emulsionante hidrófilo junto con un emulsionante lipófilo que actúa como estabilizador. También se prefiere incluir tanto un aceite como una grasa. Juntos, el(los) emulsionante(s) con o sin estabilizador(es) forman la llamada cera emulsionante, y la cera junto con el aceite y la grasa forman la llamada base de ungüento emulsionante que forma la fase oleosa dispersa de las formulaciones de la crema.

[0102] Los emulgentes y estabilizadores de emulsión adecuados para usar en las formulaciones incluyen Tween® 60, Span® 80, alcohol cetoestearílico, alcohol bencílico, alcohol miristílico, monoestearato de glicerilo y laurilsulfato de sodio. Otros emulgentes y estabilizadores de emulsión adecuados para su uso en la formulación de la invención incluyen Tween® 80.

[0103] La elección de aceites o grasas adecuados para la formulación se basa en lograr las propiedades cosméticas deseadas. La crema debe ser preferentemente un producto no graso, que no manche, lavable y de consistencia adecuada para evitar derrames de los tubos u otros recipientes. Ésteres alquílicos mono o dibásicos de cadena lineal o ramificada, como diisoadipato, estearato de isocetilo, diéster de propilenglicol de ácidos grasos de coco, miristato de isopropilo, oleato de decilo, palmitato de isopropilo, estearato de butilo, palmitato de 2-etilhexilo o una mezcla de cadena ramificada. Pueden usarse ésteres conocidos como Crodamol CAP, siendo los tres últimos ésteres preferidos. Estos pueden usarse solos o en combinación dependiendo de las propiedades requeridas. Alternativamente, se utilizan lípidos de alto punto de fusión como parafina blanda blanca y/o parafina líquida u otros aceites minerales.

[0104] Las formulaciones farmacéuticas para usar según la presente invención comprenden un compuesto para usar según la invención junto con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, otros agentes terapéuticos. Las formulaciones farmacéuticas que contienen el ingrediente activo pueden estar en cualquier forma adecuada para el método de administración pretendido. Cuando se usa para uso oral, por ejemplo, se pueden preparar comprimidos, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas o oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, jarabes o elixires. Composiciones destinadas a uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y dichas composiciones pueden contener uno o más agentes, incluidos los agentes edulcorantes., aromatizantes, colorantes y conservantes, con el fin de proporcionar una preparación agradable al paladar. Son aceptables los comprimidos que contienen el ingrediente activo mezclado con un excipiente no tóxico farmacéuticamente aceptable que es adecuado para la fabricación de comprimidos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato cálcico o sódico, lactosa, fosfato cálcico o sódico; agentes de granulación y disgregación, tales como almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, como almidón, gelatina o goma arábiga; y agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden estar sin recubrir o pueden recubrirse mediante técnicas conocidas que incluyen la microencapsulación para retrasar la desintegración y la adsorción en el tracto gastrointestinal y, por lo tanto, proporcionar una acción sostenida durante un período más prolongado. Por ejemplo, puede emplearse un material retardador de tiempo tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo solo o con una cera.

[0105] Las formulaciones para uso oral también pueden presentarse como cápsulas de gelatina dura donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un aceite. medio, como el aceite de cacahuete, la parafina líquida o el aceite de oliva.

[0106] Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos mezclados con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Dichos excipientes incluyen un agente de suspensión, como carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma acacia, y agentes dispersantes o humectantes como un fosfátido natural (p. ej., lecitina), un producto de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso (p. ej., estearato de polioxietileno), un producto de condensación de óxido de etileno con un alcohol alifático de cadena larga (p. ej., heptadecaetilenoxietanol), un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un hexitol anhídrido (p. ej., monooleato de sorbitán polioxietilenado). La suspensión acuosa también puede contener uno o más conservantes como p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o más colorantes, uno o más aromatizantes y uno o más edulcorantes, como sacarosa o sacarina. Otros ejemplos no limitantes de agentes de suspensión incluyen ciclodextrina y captisol (=sulfobutil éter beta-ciclodextrina; SEB-beta-CD).

[0107] Las suspensiones de aceite pueden formularse suspendiendo el ingrediente activo en un aceite vegetal, como aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral como parafina líquida. Las suspensiones orales pueden contener un agente espesante, como cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Pueden añadirse agentes edulcorantes, como los expuestos anteriormente, y agentes aromatizantes para proporcionar una preparación oral apetecible. Estas composiciones pueden conservarse mediante la adición de un antioxidante como el ácido ascórbico.

[0108] Los polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el ingrediente activo mezclado con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes y los agentes de suspensión adecuados se ejemplifican mediante los descritos anteriormente. También pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo, agentes edulcorantes, aromatizantes y colorantes.

[0109] Las composiciones farmacéuticas para uso según la invención también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, como el aceite de oliva o el aceite de cacahuete, un aceite mineral, como la parafina líquida, o una mezcla de estos. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen gomas naturales, como goma arábiga y goma tragacanto, fosfátidos naturales, como lecitina de soja, ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, como monooleato de sorbitán, y productos de condensación de estos ésteres parciales con óxido de etileno, tales como monooleato de sorbitán polioxietilenado. La emulsión también puede contener agentes edulcorantes y aromatizantes. Los jarabes y elixires pueden formularse con agentes edulcorantes, como glicerol, sorbitol o sacarosa. Dichas formulaciones también pueden contener un emoliente, un conservante, un aromatizante o un agente colorante.

[0110] Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la invención pueden estar en forma de una preparación inyectable estéril, tal como una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión se puede formular de acuerdo con la técnica conocida utilizando los agentes dispersantes o humectantes y los agentes de suspensión adecuados que se han mencionado anteriormente. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico aceptable por vía parenteral, tal como una solución en 1,3-butanodiol o preparado como un polvo liofilizado. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites fijos estériles se pueden emplear convencionalmente como disolvente o medio de suspensión. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluidos los monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos como el ácido oleico también pueden usarse en la preparación de inyectables. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran el agua, la solución isotónica de cloruro sódico de solución de Ringer y la solución hipertónica de cloruro sódico.

[0111] La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con el material portador para producir una única forma de dosificación variará dependiendo del huésped tratado y el modo particular de administración. Por ejemplo, una formulación de liberación prolongada destinada a la administración oral a seres humanos puede contener aproximadamente de ¹ a ^{1 0 0 0} mg de material activo combinado con una cantidad apropiada y conveniente de material de vehículo que puede variar de aproximadamente el 5 a aproximadamente el 95 % de las composiciones totales (en peso). :peso). La composición farmacéutica se puede preparar para proporcionar cantidades fácilmente medibles para la administración. Por ejemplo, una solución acuosa destinada a infusión intravenosa puede contener de aproximadamente 3 a 500 gg del ingrediente activo por mililitro de solución para que la infusión de un volumen adecuado a una velocidad de aproximadamente 30 mL/h puede ocurrir.

[0112] Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en el ojo también incluyen gotas para los ojos en las que el ingrediente activo se disuelve o suspende en un vehículo adecuado, especialmente un disolvente acuoso para el ingrediente activo. El ingrediente activo está preferiblemente presente en tales formulaciones en una concentración de 0,5 a 20%, ventajosamente de 0,5 a 10% y particularmente alrededor de 1,5% p/p.

[0113] Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en la boca incluyen pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base aromatizada, normalmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un vehículo líquido adecuado.

[0114] Las formulaciones para administración rectal pueden presentarse como un supositorio con una base adecuada que comprende, por ejemplo, manteca de cacao o un salicilato.

[0115] Las formulaciones adecuadas para la administración intrapulmonar o nasal tienen un tamaño de partícula por ejemplo en el rango de 0,1 a 500 micras, como 0,5, 1, 30, 35, etc., que se administra por inhalación rápida a través del conducto nasal o por inhalación. por la boca para llegar a los sacos alveolares. Las formulaciones adecuadas incluyen soluciones acuosas u oleosas del ingrediente activo. Las formulaciones adecuadas para la administración en aerosol o en polvo seco se pueden preparar de acuerdo con métodos convencionales y se pueden administrar con otros agentes terapéuticos.

[0116] Las formulaciones adecuadas para la administración vaginal pueden presentarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en aerosol que contienen, además del ingrediente activo, los vehículos que se sabe que son apropiados en la técnica.

[0117] Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes.

[0118] Las formulaciones se presentan en envases de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en una condición liofilizada (liofilizada) que solo requiere la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua. para inyección, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporánea se preparan a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente. Las formulaciones de dosificación unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis diaria o una subdosis diaria unitaria, como se indica anteriormente en el presente documento, o una fracción apropiada de la misma, del ingrediente activo.

[0119] Debe entenderse que, además de los ingredientes particularmente mencionados anteriormente, las formulaciones pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica teniendo en cuenta el tipo de formulación en cuestión, por ejemplo, aquellos adecuados para la administración oral pueden incluir agentes saborizantes.

[0120] Los compuestos para uso según la invención se usan para proporcionar formulaciones farmacéuticas de liberación controlada que contienen como ingrediente activo uno o más compuestos para uso según la invención ("formulaciones de liberación controlada") en las que la liberación del ingrediente activo está controlada y regulado para permitir una dosificación de menor frecuencia o para mejorar el perfil farmacocinético o de toxicidad de un ingrediente activo determinado.

IV. VÍAS DE ADMINISTRACIÓN

[0121] Un compuesto para usar de acuerdo con la invención (denominados aquí como los ingredientes activos) se administra por cualquier vía apropiada para la afección a tratar. Las rutas adecuadas incluyen oral, rectal, nasal, pulmonar, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal y parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y epidural) y similares. Se apreciará que la ruta preferida puede variar con, por ejemplo, la condición del receptor. Una ventaja de los compuestos para uso según esta invención es que son biodisponibles por vía oral y se pueden dosificar por vía oral.

[0122] La dosis efectiva de ingrediente activo depende al menos de la naturaleza de la afección que se está tratando, la toxicidad, si el compuesto se usa de manera profiláctica (dosis más bajas) o contra una infección viral activa, el método de administración y la formulación farmacéutica. y lo determinará el médico utilizando estudios de escalada de dosis convencionales. Puede esperarse que sea de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día; típicamente, de alrededor de ^{0 , 01} a alrededor de ¹⁰ mg/kg de peso corporal por día; más típicamente, de alrededor de 0,01 a alrededor de 5 mg/kg de peso corporal por día; más típicamente, de alrededor de 0,05 a alrededor de 0,5 mg/kg de peso corporal por día. Por ejemplo, la dosis candidata diaria para un ser humano adulto de aproximadamente 70 kg de peso corporal variará de 1 mg a 1000 mg, preferiblemente entre 5 mg y 500 mg, y puede adoptar la forma de dosis únicas o múltiples.

[0123] Se contempla cualquier periodo de tiempo adecuado para la administración del compuesto para su uso según la presente invención. Por ejemplo, la administración puede ser de 1 día a 100 días, incluidos 2, 3, 4, 5, ⁶ , 7, ⁸ , 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, o 90 días. La administración también puede ser de 1 semana a 15 semanas, incluyendo 2, 3, 4, 5, ⁶ , 7, ⁸ , 9, 10, 11, 12, 13 o 14 semanas. T ambién se contemplan periodos de administración más prolongados.

V. TERAPIA DE COMBINACIÓN

[0124] El compuesto para usar de acuerdo con la invención también se puede usar en combinación con otros ingredientes activos.

[0125] También es posible combinar cualquier compuesto para uso de acuerdo con la invención con uno o más agentes terapéuticos activos adicionales en una forma de dosificación unitaria para administración simultánea o secuencial a un paciente. La terapia de combinación se puede administrar como un régimen simultáneo o secuencial. Cuando se administra secuencialmente, la combinación se puede administrar en dos o más administraciones.

[0126] La coadministración de un compuesto para usar de acuerdo con la invención con uno o más agentes terapéuticos activos generalmente se refiere a la administración simultánea o secuencial de un compuesto para usar de acuerdo con la invención y uno o más agentes terapéuticos activos, de manera que cantidades terapéuticamente eficaces del compuesto para su uso según la invención y uno o más de otros agentes terapéuticos activos están presentes en el cuerpo del paciente.

[0127] La coadministración incluye la administración de dosis unitarias del compuesto para usar según la invención antes o después de la administración de dosis unitarias de uno o más de otros agentes terapéuticos activos, por ejemplo, la administración del compuesto para usar según la invención dentro segundos, minutos u horas de la administración de uno o más agentes terapéuticos activos. Por ejemplo, se puede administrar primero una dosis unitaria de un compuesto para usar de acuerdo con la invención, seguida en segundos o minutos por la administración de una dosis unitaria de uno o más agentes terapéuticos activos. Alternativamente, se puede administrar primero una dosis unitaria de uno o más de otros agentes terapéuticos, seguido de la administración de una dosis unitaria de un compuesto para uso según la invención en segundos o minutos. En algunos casos, puede ser deseable administrar primero una dosis unitaria de un compuesto para usar de acuerdo con la invención, seguido, después de un período de horas (p. ej., ^{1 - 1 2} horas), por la administración de una dosis unitaria de uno o más otros agentes terapéuticos activos. En otros casos, puede ser deseable administrar primero una dosis unitaria de uno o más agentes terapéuticos activos, seguido, después de un período de horas (p. ej., ^{1 - 1 2} horas), por la administración de una dosis unitaria de un compuesto para uso según la invención.

[0128] La terapia de combinación puede proporcionar "sinergia" y "sinérgica", es decir, el efecto logrado cuando los ingredientes activos se usan juntos es mayor que la suma de los efectos que resultan del uso de los compuestos por separado. Se puede lograr un efecto sinérgico cuando los ingredientes activos son: (1) coformulados y administrados o entregados simultáneamente en una formulación combinada; (² ) entregados por alternancia o en paralelo como formulaciones separadas; o (3) por algún otro régimen. Cuando se administran en terapia de alternancia, se puede lograr un efecto sinérgico cuando los compuestos se administran o entregan secuencialmente, por ejemplo, en tabletas, píldoras o cápsulas separadas, o mediante diferentes inyecciones en jeringas separadas. En general, durante la terapia de alternancia, se administra secuencialmente, es decir, en serie, una dosis efectiva de cada ingrediente activo, mientras que en la terapia de combinación, se administran juntas dosis efectivas de dos o más ingredientes activos. Un efecto antiviral sinérgico denota un efecto antiviral que es mayor que los efectos puramente aditivos previstos de los compuestos individuales de la combinación.

[0129] Se puede proporcionar como un kit un compuesto como se describe en el presente documento, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables para usar según la presente invención. El kit puede comprender un compuesto como se describe en el presente documento, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. Cada uno de los kits individuales descritos en el presente documento puede comprender una etiqueta y/o instrucciones para el uso del compuesto en el tratamiento de una enfermedad o afección en un sujeto (p. ej., humano) que lo necesite. En otras formas de realización, cada kit separado también puede contener instrucciones para el uso de agentes médicos adicionales en combinación con el compuesto como se describe en el presente documento en el tratamiento de una enfermedad o afección en un sujeto (p. ej., humano) que lo necesite. En cada uno de los kits del presente documento, el kit puede comprender unidades de dosis individuales de un compuesto como se describe en el presente documento, o una de sus sales, racematos, enantiómeros, tautómeros, polimorfos, pseudopolimorfos, formas amorfas, hidratos o solvatos farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de unidades de dosificación individuales pueden incluir píldoras, tabletas, cápsulas, jeringas precargadas o cartuchos de jeringa, bolsas intravenosas, etc., cada uno de los cuales comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto en cuestión, o una sal, racemato, enantiómero, tautómero, polimorfo farmacéuticamente aceptable, pseudopolimorfo, forma amorfa, hidrato o solvato del mismo. En algunas formas de realización, el kit puede contener una sola unidad de dosificación y en otras están presentes múltiples unidades de dosificación, como el número de unidades de dosificación requeridas para un régimen o período específico.

[0130] El compuesto para uso de acuerdo con la presente invención también se puede proporcionar como artículos de fabricación que incluyen un compuesto como se describe en este documento, o una sal farmacéuticamente aceptable; y un contenedor. El recipiente del artículo de fabricación puede ser un vial, tarro, ampolla, jeringa precargada, blíster, lata, lata, botella, caja o bolsa intravenosa.

VI. PREPARACIÓN DE COMPUESTOS

[0131] El compuesto para uso de acuerdo con la presente invención se puede preparar por una variedad de medios. Por ejemplo, los nucleósidos protegidos de fórmula V se pueden preparar mediante la reacción de una lactona protegida con una base sustituida con yodo en condiciones de acoplamiento adecuadas. A continuación, los nucleósidos se pueden modificar con un resto de profármaco mediante la reacción de un nucleósido parcialmente protegido con un resto de profármaco adecuado, después de la eliminación de los grupos protectores, para proporcionar el compuesto para uso según la presente invención.

A. Preparación de nucleósidos vía base yodo

[0132] A continuación se proporciona un método para preparar un compuesto de Fórmula V:

El método para preparar el compuesto de Fórmula V incluye formar una mezcla de reacción que tiene un agente de acoplamiento, un halosilano, un compuesto de Fórmula VI:

y un compuesto de Fórmula VII:

en condiciones adecuadas para preparar el compuesto de Fórmula V, en la que cada PG es independientemente un grupo protector de hidroxi, alternativamente, dos grupos PG en carbonos adyacentes pueden combinarse para formar un grupo -C(R19)²-, R10 es H o un grupo sililo, y R19 es H, alquilo C¹-C⁸ , fenilo o fenilo sustituido.

[0133] Se puede usar cualquier agente de acoplamiento adecuado en el método para preparar el compuesto de Fórmula V. El agente de acoplamiento puede ser un agente de acoplamiento de litio, un agente de acoplamiento de sodio, un agente de acoplamiento de magnesio u otros. Por ejemplo, el agente de acoplamiento puede ser un agente desprotonante como n-butillitio (n-BuLi), hidruro de sodio (NaH), hidruro de litio y aluminio (LAH o LiAlH4) y otros. El agente de acoplamiento también puede ser un agente de acoplamiento a base de magnesio como, entre otros, MgCl² , iPrMgCl, tBuMgCl, PhMgCl o combinaciones de los mismos. El agente de acoplamiento puede ser un agente de acoplamiento de litio o un agente de acoplamiento de magnesio. El agente de acoplamiento puede ser n-BuLi, MgCl² , iPrMgCl, tBuMgCl, PhMgCl o combinaciones de los mismos. El agente de acoplamiento puede ser n-BuLi. El agente de acoplamiento puede ser PhMgCl e iPrMgCl.

[0134] El agente de acoplamiento puede estar presente en cualquier cantidad adecuada. Por ejemplo, el agente de acoplamiento puede estar presente en una cantidad de al menos 1,0 eq. (mol/mol) al compuesto de Fórmula V, tal como aproximadamente 1,0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o aproximadamente 10,0 eq. (mol/mol). El agente de acoplamiento también puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 10,0 eq. (mol/mol) al compuesto de Fórmula V, tal como de alrededor de 1,0 a alrededor de 5,0 eq. (mol/mol), o de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 2,0 eq. (mol/mol). El agente de acoplamiento puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 5,0 eq. (mol/mol) al compuesto de Fórmula V. El agente de acoplamiento puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 2,0 eq. (mol/mol) al compuesto de Fórmula V.

[0135] Cualquier halo-silano adecuado se puede usar en el método para preparar el compuesto de Fórmula V. Por ejemplo, el halo-silano puede ser un fluoro-silano, un cloro-silano, un bromo-silano o un yodo-silano. La porción de silano puede tener cualquier sustituyente adecuado, como alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo o fenilo. Los halo-silanos ejemplares incluyen, pero no se limitan a Cl-Si(CH3)3 o Cl-Si(CH3)2CH2CH2Si(CH3)2-Cl. El halo-silano puede ser un clorosilano. El halo-silano puede ser Cl-Si(CH3)3 o Cl-Si(CH3)2CH2CH2Si(CH3)2-Cl. El halo-silano puede ser TMS-Cl.

[0136] El grupo sililo de R10 puede ser cualquier grupo adecuado, pero puede depender de la elección del halo-silano. Por ejemplo, cuando el halo-silano es TMS-Cl, el grupo sililo puede ser trimetilsililo.

[0137] El halo-silano puede estar presente en cualquier cantidad adecuada. Por ejemplo, el halo-silano puede estar presente en un cantidad de al menos 1,0 eq. (mol/mol) al compuesto de Fórmula V, tal como aproximadamente 1,0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o aproximadamente 10,0 eq. (mol/mol). El halo-silano también puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 10,0 eq. (mol/mol) al compuesto de Fórmula V, tal como de alrededor de 1,0 a alrededor de 5,0 eq. (mol/mol), o de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 2,0 eq. (mol/mol). El halo-silano puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 5,0 eq. (mol/mol) al compuesto de Fórmula V. El halo-silano puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 2,0 eq. (mol/mol) al compuesto de Fórmula V.

[0138] El grupo protector de hidroxi puede ser cualquier grupo protector adecuado para un grupo funcional hidroxi. Los grupos protectores de hidroxi representativos incluyen, entre otros, silanos como trimetilsilano (TMS), t-butildimetilsilano (TBDMS) o t-butildifenilsilano (TBDPS), éteres como metilmetoxi (MOM), tetrahidropirano (THP), t-butilo, alilo o bencilo, y ésteres tales como acetilo, pivaloilo o benzoilo. El grupo protector de hidroxi puede ser trimetilsilano (TMS), tbutildimetilsilano (TBDMS), t-butildifenilsilano (TBDPS), metilmetoxi (MOM), tetrahidropirano (THP), t-butilo, alilo, bencilo, acetilo, pivaloilo o benzoilo. El grupo protector de hidroxi puede ser bencilo.

[0139] Los grupos hidroxi en carbonos adyacentes, denominados grupos 1,2-hidroxi, pueden formar un grupo protector cíclico denominado acetónido por reacción con una cetona de diéter. Los acetónidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a acetónido y acetal de bencilideno. Los grupos protectores de hidroxi de los grupos hidroxi en carbonos adyacentes se pueden combinar para formar acetónido.

[0140] Cuando el grupo R19 es alquilo C¹-C⁸ , R19 puede ser metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, tbutilo, pentilo, iso-pentilo, neopentilo, hexilo, isohexilo, neohexilo, septilo u octilo. El grupo R19 puede ser metilo.

[0141] Se puede utilizar cualquier disolvente adecuado en el método. Los disolventes representativos incluyen, entre otros, pentano, pentanos, hexano, hexanos, heptano, heptanos, éter de petróleo, ciclopentanos, ciclohexanos, benceno, tolueno, xileno, trifluorometilbenceno, halobencenos como clorobenceno, fluorobenceno, diclorobenceno y difluorobenceno, cloruro de metileno, cloroformo, acetona, acetato de etilo, éter dietílico, tetrahidrofurano o combinaciones de los mismos. El disolvente puede ser tetrahidrofurano. Otros disolventes representativos incluyen, entre otros, 2-metiltetrahidrofurano, dibutiléter, metil terc-butiléter, dimetoxietano, dioxanos (1,4 dioxano), N-metilpirrolidinona (NMP) o combinaciones de los mismos.

[0142] La mezcla de reacción del método puede estar a cualquier temperatura adecuada. Por ejemplo, la temperatura de la mezcla de reacción puede ser de aproximadamente -78 °C a aproximadamente 100 °C, o de aproximadamente -50 °C a aproximadamente 100 °C, o de aproximadamente -25 °C a aproximadamente 50 °C, o de aproximadamente -10 °C a aproximadamente 25 °C, o de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 20 °C. La temperatura de la mezcla de reacción puede ser de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 20 °C. La temperatura de la mezcla de reacción puede ser de aproximadamente -30 °C a aproximadamente -10 °C.

[0143] La mezcla de reacción del método puede estar a cualquier presión adecuada. Por ejemplo, la mezcla de reacción puede estar a presión atmosférica. La mezcla de reacción también se puede exponer a cualquier entorno adecuado, como gases atmosféricos o gases inertes como nitrógeno o argón.

[0144] El método puede proporcionar el compuesto de Fórmula V con cualquier rendimiento adecuado. Por ejemplo, el compuesto de Fórmula V se puede preparar con un rendimiento de al menos alrededor del 50%, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o al menos alrededor del 95%.

[0145] El método puede proporcionar el compuesto de Fórmula V en cualquier pureza adecuada. Por ejemplo, el compuesto de Fórmula V se puede preparar con una pureza de al menos aproximadamente 90, 95, 96, 97, 98 o al menos aproximadamente 99%. El compuesto de Fórmula V se puede preparar con una pureza de al menos el 95%. El compuesto de Fórmula V se puede preparar con una pureza de al menos el 98%. el compuesto de Fórmula V se puede preparar con una pureza de al menos el 99%.

[0146] El método puede incluir preparar el compuesto de Fórmula V:

en el que el método incluye formar la mezcla de reacción que tiene TMS-Cl, PhMgCl, iPrMgCl, el compuesto de Fórmula VI:

y el compuesto de Fórmula VII:

en condiciones adecuadas para preparar el compuesto de Fórmula V.

[0147] La presente descripción proporciona el compuesto:

B. Adición de profármaco Resto

[0148] Se proporciona un método para acoplar un resto de profármaco a un nucleósido para proporcionar un compuesto para uso de acuerdo con la presente invención. Se proporciona un método para preparar un compuesto de Fórmula VIII:

en el que el método incluye formar una mezcla de reacción que incluye un agente de acoplamiento, una base no nucleófila, un compuesto de Fórmula IX:

y un compuesto de Fórmula X:

en condiciones adecuadas para formar el compuesto de Fórmula VIII, donde cada Ra es H o PG, cada grupo PG es un grupo protector de hidroxi, o ambos grupos PG son combinados para formar -C(R19)²-, Re1 y Re2 son cada uno independientemente H, alquilo C¹-C⁶ o bencilo, Rf es H, alquilo C¹-C⁸ , bencilo, cicloalquilo C³-C⁶ o -CH²-cicloalquilo C³-C6, R19 es H, alquilo C¹-C⁸ , fenilo o fenilo sustituido, y LG es un grupo saliente.

[0149] Se puede usar cualquier agente de acoplamiento adecuado en el método para preparar el compuesto de Fórmula VIII, como se describe anteriormente para el método para preparar el compuesto de Fórmula V. El agente de acoplamiento puede ser un agente de acoplamiento de magnesio. El agente de acoplamiento puede ser MgCh, iPrMgCl, tBuMgCl, PhMgCl o combinaciones de los mismos. El agente de acoplamiento puede ser MgCl².

[0150] Se puede usar cualquier base no nucleófila adecuada en el método para preparar el compuesto de Fórmula VIII. Las bases no nucleófilas representativas incluyen, entre otras, trietilamina, diisopropiletilamina, N,N-dietilanilina, piridina, 2,6-lutidina, 2,4,6-colidina, 4-dimetilaminopiridina y quinuclidina. La base no nucleófila puede ser diisopropiletilamina (DIPEA).

[0151] Los grupos protectores PG pueden ser cualquier grupo protector de hidroxi adecuado, como se describe anteriormente para el método de preparación del compuesto de Fórmula V. Los grupos protectores PG ejemplares pueden ser bencilo, o los grupos PG pueden combinarse para formar un acetónido. Los acetónidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a acetónido y acetal de bencilideno. Los grupos protectores de hidroxi de los grupos hidroxi en carbonos adyacentes se pueden combinar para formar acetónido. Los grupos PG se pueden combinar para formar -C(R19)²-. Cada Ra puede ser el grupo protector PG donde los grupos PG se combinan para formar -C(Me)²-.

[0152] Cuando el grupo Re es alquilo C¹-C⁸ , cada Re puede ser metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, pentilo, iso-pentilo, neopentilo, hexilo, isohexilo, neohexilo, septilo u octilo. Cada grupo Re puede ser metilo.

[0153] Cuando el grupo Rf es alquilo Ci-Cs, Rf puede ser metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, ¡sobutilo, sec-butilo, tbutilo, pentilo, iso-pentilo, neopentilo, hexilo, isohexilo, neohexilo, septilo u octilo. El grupo Rf puede ser metilo, etilo, isopropilo, t-butilo o isohexilo. Cuando el grupo Rf es cicloalquilo C³-C⁶ , Rf puede ser ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo. Rf puede ser ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo.

[0154] Cuando el grupo R19 es alquilo Ci-Cs, R19 puede ser metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, tbutilo, pentilo, iso-pentilo, neopentilo, hexilo, isohexilo, neohexilo, septilo u octilo. El grupo R19 puede ser metilo.

[0155] El grupo saliente puede ser cualquier grupo saliente adecuado. Los grupos salientes LG adecuados incluyen, entre otros, cloruro, bromuro, mesilato, tosilato, triflato, 4-nitrobencenosulfonato, 4-clorobencenosulfonato, 4-nitrofenoxi, pentafluorofenoxi, etc. El grupo saliente LG puede ser 4-nitrofenoxi o pentafluorofenoxi. El grupo saliente LG puede ser 4-nitrofenoxi.

[0156] Cada Ra puede ser PG donde los grupos PG se combinan para formar -C(R19)²-, Rf puede ser alquilo C¹-Cs, R19 es alquilo C¹-C⁸ y el grupo saliente LG puede ser 4-nitrofenoxi o pentafluorofenoxi.

[0157] El agente de acoplamiento puede ser MgCl² y la base no nucleófila puede ser diisopropiletilamina.

[0158] El compuesto de Fórmula VIII puede ser

El compuesto de Fórmula VIII puede ser

El compuesto de Fórmula VIII puede ser

[0159] El método para preparar el compuesto de Fórmula VIII puede incluir formar la mezcla de reacción que incluye MgCl² , DIPEA, el compuesto de Fórmula IX:

y el compuesto de Fórmula X:

en condiciones adecuadas para formar el compuesto de Fórmula VIII:

[0160] Cuando los grupos Ra del compuesto de Fórmula VIII son los grupos protectores de hidroxi PG, el método puede incluir el paso adicional de eliminar el grupos protectores para formar el compuesto de Fórmula VIII donde cada Ra es H. El método para preparar el compuesto de Fórmula VIII puede incluir la formación de una segunda mezcla de reacción que incluye un agente de desprotección y el compuesto de Fórmula VIII donde cada grupo Ra es el grupo protector PG, en condiciones adecuadas para formar el compuesto de Fórmula VIII donde cada Ra es H. El agente de desprotección puede ser cualquier agente adecuado para eliminar los grupos protectores PG tal como hidrógeno y un catalizador de hidrogenación, o ácido. Por ejemplo, si el grupo protector PG es bencilo, el agente de desprotección puede ser hidrógeno y platino sobre carbono. Alternativamente, cuando el grupo protector PG es un acetónido, el agente de desprotección puede ser un ácido. Los ácidos representativos incluyen, pero no se limitan a ácido acético, ácido acético glacial, ácido trifluoroacético (TFA), ácido clorhídrico, ácido clorhídrico concentrado y otros. El método de preparación del compuesto de Fórmula VIII puede incluir formar una segunda mezcla de reacción que incluya un ácido y el compuesto de Fórmula VIII en el que los grupos Ra se combinan para formar -C(R19)²-, en condiciones adecuadas para formar el compuesto de Fórmula VIII. donde cada Ra es H. El ácido puede ser ácido clorhídrico.

[0161] Se puede utilizar cualquier disolvente adecuado en el método. Los solventes representativos incluyen, pero no se limitan a pentano, pentanos, hexano, hexanos, heptano, heptanos, éter de petróleo, ciclopentanos, ciclohexanos, benceno, tolueno, xileno, trifluorometilbenceno, halobencenos tales como clorobenceno, fluorobenceno, diclorobenceno y difluorobenceno, cloruro de metileno, cloroformo, acetona, acetato de etilo, éter dietílico, tetrahidrofurano, acetonitrilo o combinaciones de los mismos. El disolvente puede ser acetonitrilo.

[0162] La mezcla de reacción del método puede estar a cualquier temperatura adecuada. Por ejemplo, la temperatura de la mezcla de reacción puede ser de aproximadamente -78 °C a aproximadamente 100 °C, o de aproximadamente -50 °C a aproximadamente 100 °C, o de aproximadamente -25 °C a aproximadamente 50 °C, o de aproximadamente -10 °C a aproximadamente 25 °C, o de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 20 °C. La temperatura de la mezcla de reacción puede ser de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 20 °C.

[0163] La mezcla de reacción del método puede estar a cualquier presión adecuada. Por ejemplo, la mezcla de reacción puede estar a presión atmosférica. La mezcla de reacción también se puede exponer a cualquier entorno adecuado, como gases atmosféricos o gases inertes como nitrógeno o argón.

[0164] El método puede proporcionar el compuesto de Fórmula VIII con cualquier rendimiento adecuado. Por ejemplo, el compuesto de Fórmula VIII se puede preparar con un rendimiento de al menos alrededor del 50%, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o al menos alrededor del 95%.

[0165] El método puede proporcionar el compuesto de Fórmula VIII en cualquier pureza adecuada. Por ejemplo, el compuesto de Fórmula VIII se puede preparar con una pureza de al menos 90, 95, 96, 97, 98 o al menos 99%. el compuesto de Fórmula VIII se puede preparar con una pureza de al menos el 95%. El compuesto de Fórmula VIII se puede preparar con una pureza de al menos el 98%. El compuesto de Fórmula VIII se puede preparar con una pureza de al menos el 99%.

[0166] La presente descripción puede proporcionar el compuesto

VII. EJEMPLOS

[0167] Ciertas abreviaturas y acrónimos se utilizan para describir los detalles experimentales. Aunque la mayoría de estos serían entendidos por un experto en la materia, la Tabla 1 contiene una lista de muchas de estas abreviaturas y acrónimos.

Tabla 1. Lista de abreviaturas y siglas.

(Continuación)

A. Preparación de compuestos

Ejemplo de referencia 1. (2S)-etil 2-(cloro(fenoxi)fosforilam ino)propanoato (cloridato A)

[0168]

[0169] Se disolvió la sal clorhidrato de éster de etil alanina (1,69 g, 11 mmol) en CH²CI² anhidro (10 mL) y la mezcla se agitó con enfriamiento a 0 °C en N²(g). Se añadió diclorofosfato de fenilo (1,49 ml, 10 mmol) seguido de la adición gota a gota de Et3N durante 10 min. A continuación, la mezcla de reacción se calentó lentamente a TA y se agitó durante 12 h. Se añadió Et²O anhidro (50 mL) y la mezcla se agitó durante 30 min. El sólido que se formó se eliminó por filtración y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía en gel de sílice eluyendo con EtOAc al 0­ 50 % en hexanos para proporcionar el intermedio A (1,13 g, 39 %). 1H RMN (300 MHz, CDCh) 57,39-7,27 (m, 5H), 4,27 (m, 3H), 1,52 (m, 3H), 1,32 (m, 3H). 31P RMN (121,4 MHz, CDCla) 58,2, 7,8.

Ejemplo 2. (2S)-2-etilbutil 2-(cloro(fenoxi)fosforilam ino)propanoato (cloridato B)

[0171] El éster B de clorofosforamidato de 2-etilbutilalanina se preparó usando el mismo procedimiento que el cloridato A excepto que se sustituye el éster de etilalanina por éster de 2-etilbutilalanina. El material se usa crudo en la siguiente reacción. El tratamiento con metanol o etanol forma el producto desplazado con la señal LCMS requerida.

Ejemplo de referencia 3. 2-(cloro(fenoxi)fosforilam ino)propanoato de (2S)-isopropilo (cloridato C)

[0172]

[0173] El éster C de clorofosforamidato de isopropilalanina se preparó usando el mismo procedimiento que el cloridato A excepto que se sustituyó el éster de etilalanina por éster de isopropilalanina. El material se usa crudo en la siguiente reacción. El tratamiento con metanol o etanol forma el producto desplazado con la señal LCMS requerida.

Ejemplo______4.______(2R,______3R ______4S.______5R)-2-(4-aminopirrolo[1.2-f][1.2.4]triazin-7-il)-3.4-dihidroxi-5-(hidroxim etilo)tetrahidrofurano-2-carbonitrilo (Compuesto 1)

[0174]

[0175] La preparación de (2R, 3R, 4S, 5R)-2-(4-aminopirrolo[1.2-f][1.2.4]triazina-7-il)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetil)tetrahidrofuran-² -carbonitrilo se describe a continuación.

[0176] El lactol comercialmente disponible (10 g, 23,8 mmol) se disolvió en DMSO anhidro (30 mL) bajo N²(g). Se añadió AC²O (20 mL) y la mezcla de reacción resultante se agitó a TA durante 48 h. La mezcla de reacción se vertió sobre hielo H²O (500 mL) y la mezcla se agitó durante 20 min. La mezcla se extrajo con EtOAc (3 x 200 mL) y los extractos orgánicos combinados luego se lavaron con H²O (3 x 200 mL). El extracto orgánico se secó sobre MgSO4 anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en CH²Cl² y se sometió a cromatografía en gel de sílice eluyendo con EtOAc al 25 % en hexanos para proporcionar la lactona (9,55 g, 96 %). 1H RMN (400 MHz, DMSO) 57,30-7,34 (m, 13H), 7,19-7,21 (m, 2H), 4,55-4,72 (m, 6H), 4,47 (s, 2H), 4,28 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 3,66 (m, 2H). LCMS m/z 436,1 [M+H²O], 435,2 [M+OH]- Tr = 2,82 min. HPl C Tr = 4,59 [2-98 % de ACN en H²] durante 5 min a un flujo de 2 ml/min.

[0177] El bromopirazol (preparado según WO2009/132135) (0,5 g, 2,4 mmol) se suspendió en anhidro THF (10 mL) bajo N²(g). La suspensión se agitó y se añadió TMSCl (0,67 ml, 5,28 mmol). La mezcla se agitó durante 20 min. a TA y luego se enfrió a -78 °C, después de lo cual se añadió lentamente una solución de n-BuLi (6 ml, 1,6 N en hexanos, 9,6 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 10 min. a -78 °C y luego se añadió la lactona (1 g, 2,4 mmol) a través de una jeringa. Cuando la reacción se completó según lo medido por LCMS, se añadió AcOH para extinguir la reacción. La mezcla se concentró a presión reducida y el residuo se disolvió en una mezcla de CH²Cl² y H²O (100 ml, 1:1). La capa orgánica se separó y se lavó con H²O (50 mL). A continuación, la capa orgánica se secó sobre MgSO4 anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía en gel de sílice eluyendo con 0-50 % de EtOAc en hexanos para proporcionar el producto como una mezcla 1:1 de anómeros (345 mg, 26 % de rendimiento). LCMS m/z 553 [M+H].

[0178] El hidroxinucleósido (1,1 g, 2,0 mmol) se disolvió en CH²Cl² anhidro (40 mL) y la solución se enfrió con agitación a 0 °C en N²(g). Se añadió TMSCN (0,931 ml, 7 mmol) y la mezcla se agitó durante 10 min más. Se añadió lentamente TMSOTf (1,63 ml, 9,0 mmol) a la reacción y la mezcla se agitó durante 1 hora. A continuación, la mezcla de reacción se diluyó con CH²Cl² (120 mL) y se añadió NaHCO3 acuoso (120 mL) para extinguir la reacción. La mezcla de reacción se agitó durante 10 min más y la capa orgánica se separó. La capa acuosa se extrajo con CH²Cl² (150 mL) y los extractos orgánicos combinados se secaron sobre MgSO4 anhidro, se filtraron y concentraron a presión reducida. El residuo se disolvió en una cantidad mínima de CH²Cl² y se sometió a cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente de EtOAc al 0-75 % y hexanos para proporcionar el cianonucleósido de tribencilo como una mezcla de anómeros. (0,9 g, 80%). 1H RMN (300 MHz, CD³CN) 57,94 (s, 0,5H), 7,88 (s, 0,5H), 7,29-7,43 (m, 13H), 7,11-7,19 (m, 1H), 6,82-6,88 (m, 1H), 6,70-6,76 (m, 1H), 6,41 (bs, 2H), 5,10 (d, J = 3,9 Hz, 0,5H), 4,96 (d, J = 5,1 Hz, 0,5H), 4,31-4,85 (m, 7H), 4,09-4,18 (m, 2H), 3,61-3,90 (m, 2H). LCMS m/z 562 [M+H].

[0179] El cianonucleósido de tribencilo (70 mg, 0,124 mmol) se disolvió en CH²CI² anhidro (2 mL) y se enfrió a -78 °C en N²(g). Se añadió una solución de BCl3 (1N en CH²Cl² , 0,506 mL, 0,506 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 h a -78 °C. Cuando la reacción se completó por LC/MS, se añadió MeOH para extinguir la reacción. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta la temperatura ambiente y el disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo se sometió a HPLC de fase inversa C18, eluyendo durante 5 min con H²O (0,1 % TFA), seguido de un gradiente de 0-70 % de MeCN en H²O (0,1 % TFA) durante 35 min, para eluir el anómero a (20 mg, 37 %) y anómero p 1 (20 mg, 37 %). (anómero a) 1H RMN (300 MHz, D²O) 57,96 (s, 1H), 7,20 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 6,91 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 4,97 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 4,56-4,62 (m, 1H), 4,08-4,14 (m, 1H), 3,90 (dd, J = 12,9, 2,4 Hz, 1H), 3,70 (dd, J = 13,2, 4,5 Hz, 1H). (anómero p) 1H RMN (400 MHz, DMSO) 57,91 (s, 1H), 7,80-8,00 (br s, 2H), 6,85-6,89 (m, 2H), 6,07 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,17 (br s, 1H), 4,90 (br s, 1H), 4,63 (t, J = 3,9 Hz, 1H), 4,02-4,06 (m, 1H), 3,94 (br s, 1H), 3,48-3,64 (m, 2H). LCMS m/z 292,2 [M+H], 290,0 [MH]. Tr= 0,35 min. 13C RMN (400 MHz, DMSO), 156,0, 148,3, 124,3, 117,8, 117,0, 111,2, 101,3, 85,8, 79,0, 74,7, 70,5, 61,4. HPLC Tr= 1,32 min

Ejemplo de referencia 5. (2R.3R.4R.5R)-2-(4-am¡nop¡rrolo[1.2-f][1.2.4]tr¡az¡n-7-il)-3-fluoro-4-h¡drox¡-5-(hidroxim etil)tetrahidrofuran-2-carbonitrilo (Compuesto 2)

[0180]

[0181] La preparación de (2R,3R,4R,5R)-2-(4-aminopirrolo[1.2-f][1.2.4]triazin-7-il)-3-fluoro-4-hidroxi-5-(hidroximetil)tetrahidrofuran-² -carbonitrilo se describe a continuación.

[0182] 2-Desoxi-2-fluoro-4,5-0,0Ld¡benc¡l-D-arabinosa . 1'-Metoxi-2-desoxi-2-fluoro-4,5-0,0-dibencil-D-arabinosa (1,0 g, 2,88 mmol) en TFA (13,5 mL) se trató con H²O (1,5 mL) y el resultante mezcla agitada durante 5 h. Luego, la mezcla se diluyó con EtOAc (100 mL) y se trató con NaHCO3 saturado (50 mL). La capa orgánica se separó y se lavó con NaCl (50 mL), se secó sobre MgSO4 anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía en gel de sílice (80 g de SiO² Combiflash HP Gold Column) eluyendo con 0-100 % de EtOAc en hexanos para producir 2-desoxi-2-fluoro-4,5-0,0-dibencil-D-arabinosa (695 mg, 72 %) como un sólido blanco: Rf = 0,52 (25 % de EtOAc en hexanos). 1H RMN (300 MHz, CDCls) 57,30 (m, 10H), 5,35 (m, 1H), 4,68-4,29 (m, 7H), 3,70 (d, J= 10,5 Hz, 1H), 3,50 (d, J= 10,5 Hz, 2H). 19F RMN (282,2 MHz, CDCla) 5 -207 (m), -211 (m). LCMS m/z 350 [M+H²O].

[0183] ( 3R, 4R, 5fí)-4-(benc¡lox¡)-5-(bencilox¡met¡l)-3-fluorod¡h¡drofuran-2(3jH)-ona. Se disolvió 2-desoxi-2-fluoro-4,5-0,0-dibencil-D-arabinosa (4,3 g, 12,8 mmol) en CH²Cl² (85 mL) se trató con 4 Á MS (10 g) y dicromato de piridinio (14,4 g, 38,3 milimoles). La mezcla resultante se agitó durante 24 horas y luego se filtró a través de una capa de Celite. El eluyente se concentró a presión reducida y el residuo se sometió a cromatografía en gel de sílice (120 g SiO² HP Gold Combiflash Column) eluyendo con 0-100 % de EtOAc en hexanos para producir (3R, 4R, 5Rj-4-(benciloxi)-5-(benciloximetil)-3-fluorodihidrofuran-2(3H)-ona como un aceite transparente (3,5 g, 83 %): Rf = 0,25 (25 % de EtOAc en hexanos). 1H RMN (300 MHz, CDCI³) 5 7,37 (m, 10H), 5,45 (dd, J = 49, 5,7, Hz, 1H), 4,85 (d, J= 11,7 Hz, 1H), 4,52 (m, 4H), 4,29 (d, J= 5,4 Hz, 1H), 2,08 (dd, J = 15,3, 10,2 Hz, 2H). 19F RMN (282,2 MHz, CDCla) 5 -216. LCMS m /z348 [M+H²O]. HPLC (gradiente de MeCN al ^{6 - 9 8} %-H²O, modificador de TFA al 0,05 %) tR = 5,29 min. Phenomenex Synergi 4 m Hydro-RP 80 A, 50 X 4,60 mm, 4 micras; Caudal de 2 ml/min.

[0184] (3R, 4R, 5R)-2-(4-aminop¡rrolo[1.2-f][1.2.4]tr¡az¡n-7-¡l)-4-(benc¡lox¡)-5-(bencilox¡met¡l)-3-fluorotetrahidrofuran-2-ol. Se trató 7-bromopirrolo[1.2-f][1.2.4]-triazin-4-amina ^{( 6 8} mg, 0,319 mmol) en THF (1,4 mL) con TMSCl (89 ml, 0,703 mmol) y la mezcla agitada durante 2 h. Luego, la mezcla se enfrió a -78 °C y se trató con nBuLi (1,0 M en hexanos, 1,09 ml, 1,09 mmol). La solución se agitó durante 30 min y luego se trató con (3R, 4R, 5R)-4-(benciloxi)-5-(benciloximetil)-3-fluorodihidrofuran-2(3H)-ona (106 mg, 0,319 mmol) gota a gota. en THF (1,4 mL). La mezcla resultante se agitó durante 30 min y luego se añadió AcOH (83 ml, 1,44 mmol) en THF (1,0 mL) para extinguir la reacción. La mezcla se calentó a TA y luego se concentró a presión reducida. El residuo se diluyó con EtOAc (100 mL) y se lavó con solución saturada de NaCl (50 mL). La capa orgánica se secó sobre MgSO4 anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía en gel de sílice (40 g SiO² HP Gold Combiflash Column) eluyendo con 0-100 % de EtOAc en hexanos seguido de un gradiente de 0-100 % de (20 % de MeOH en EtOAc) en EtOAc para producir (3R, 4R, 5R)-2-(4-aminopirrolo[1.2-f][1.2.4]triazin-7-il)-4-(benciloxi)-5-(benciloximetil)-3-fluorotetrahidrofurano-2- ol como un sólido blanco ^{( 6 8} mg, 44%, mezcla 60/40 de isómeros a/p). Rf = 0,32 (EtOAc). 1H RMN (300 MHz, CDCh) 58,05 (s, 1H), 7,86 (s, 1H), 7,81 (s, 1H), 7,64 (s, 1H), 7,26 (m, 10H), 6,95 (m, 1H), 6,71 (m, 1H), 6,08 (m, 1H), 5,34 (m, 1H), 4,65 (m, ⁶ H), 4,71 (m, 2H). 19F RMN (282,2 MHz, CDCls) 5 -211 (m). LCMS m/z 465 [M+H]. HPLC (gradiente de MeCN al 6-98 %-H²O, modificador de TFA al 0,05 %) tR = 4,37 min. (isómero a), 4,54 min. (isómero p).

[0185] (3R, 4R, 5R)-2-(4-aminopirrolo[1.2-f][1.2.4]triaz¡n-7-¡l)-4-(benc¡lox¡)-5-(benc¡lox¡metilo)-3-fluorotetrahidrofurano-2-carbonitrilo: (3R, 4R, 5Rj-2-(4-aminopirrolo[1.2-f][1.2.4]triazin-7-il)-4-(benciloxi)-5-(benciloximetil)-3-fluorotetrahidrofuran-2-ol (195 mg, 0,42 mmol) se disolvió en MeCN (1,4 mL) se trató con Tm SCN (336 mL, 2,52 mmol) e In(OTf)3 (708 mg, 1,26 mmol). La solución se agitó a 70 °C durante 18 h y luego se enfrió a 0 °C. La mezcla se trató con solución saturada de NaHCO³ (20 gotas), luego se calentó a temperatura ambiente y se diluyó con EtOAc (100 mL) y H²O (50 mL). La capa orgánica se separó y se lavó con solución saturada de NaCl (50 mL), se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía en gel de sílice (40 g SO ² HP Gold Combiflash Column) eluyendo con 0-100 % de EtOAc en hexanos para proporcionar (3R, 4R, 5R)-2-(4-aminopirrolo[1.2-f][1.2.4]triazin-7-il)-4-(benciloxi)-5-(benciloximetil)-3-fluorotetrahidrofuran-2-carbonitrilo como un sólido blanco (110 mg, 55 %, mezcla 60/40 de isómeros a/p). Datos para ambos isómeros: Rf = 0,53 (EtOAc). 1H RMN (300 MHz, CDCls) 58,01 (s, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,30 (m, 10H), 7,00 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 6,93 (d, J = 4,8 Hz), 1 H), 6,87 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 6,70 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 5,85 (dd, J = 52, 3,3 Hz, 1H), 5,55 (dd, J = 53, 4,5 Hz, 1H), 4,71 (m, 7H), 3,87 (m, 2H), 3,72 (m, 2H). 19F RMN (282,2 MHz, CDCla) 5 -196 (m), -203 (m). LCMS m/z 474 [M+H]. HPLC (gradiente de MeCN al ⁶ ­ 98 %-H²O, modificador de TFA al 0,05 %) tR = 4,98 min.

[0186] (2R, 3R, 4R, 5fí)-2-(4-am¡nop¡rrolo[1.2-f][1.2.4]tr¡az¡n-7-il)-3-fluoro-4-h¡drox¡-5-(h¡drox¡met¡l)tetrah¡drofuran-2-carbonitrilo (2) (3R, 4R, 5RJ-2-(4-aminopirrolo[1.2-f][1.2.4]triazin-7-il)-4-(benciloxi)-5-(benciloximetil)-3-fluorotetrahidrofuran-2-carbonitrilo (110 mg, 0,23 mmol) se disolvió en CH²Cl² (1,5 mL) y enfriado a 0 °C. La mezcla de reacción se trató con BCl 3 (1,0 M en CH²Cl² , 766 ml, 0,77 mmol) y se agitó durante 2 h. Luego, la mezcla se enfrió a -78 °C y se trató con Et3N (340 ml, 2,44 mmol) seguido de MeOH (2 mL) antes de dejar que se calentara a temperatura ambiente. La reacción se concentró a presión reducida y luego se coevaporó con MeOH (3 x 5 mL). A continuación, el residuo se suspendió en H²O (5 mL) y se trató con NaHCOa (1 g). La solución se agitó durante 10 min y luego se concentró a presión reducida. El residuo se filtró y se lavó con MeOH (3 x 10 mL) en un embudo de vidrio fritado (grueso) y el eluyente se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a HPLC de fase inversa (6-98 % de MeCN en gradiente de H²O con 0,05 % de modificador de TFA) para producir (2R, 3R, 4R, 5R)-2-(4-aminopirrolo[1.2-f][1.2.4]triazin-7-il)-3-fluoro-4-hidroxi-5-(hidroximetil)tetrahidrofuran-2-carbonitrilo 2 como un sólido blanco (16,8 mg, 25 %) y el isómero a. Datos para el isómero p: Rf = 0,13 (MeOH al 10 % en EtOAc). 1H RMN (300 MHz, CD³OD) 5 8,09 (s, 1H), 7,28 (d,J= 5,1 Hz, 1H), 7,17 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 5,42 (dd, J = 53, 3,3 Hz, 1H), 4,20 (m, 2H), 3,99 (d, J= 3,6 Hz, 1H), 3,77 (d, J= 3,6 Hz, 1H).

19F RMN (282,2 MHz, CDCl3) 5-197 (m). Lc Ms m/z 294 [M+H]. HpLC (gradiente de MeCN al 2-98 %-HaO, modificador de TFA al 0,05 %) tR = 1,49 min.

Ejemplo de referencia 6. (2R, 3R, 4R, 5S)-5-(4-am¡nop¡rrolo[1.2-f][1.2.4]tr¡az¡n-7-il)-4-fluoro-2-(h¡drox¡met¡lo)-5-met¡ltetrah¡drofuran-3-ol (Compuesto 3)

[0187]

[0188] La preparación de (2R, 3R, 4R, 5S)-5-(4-aminopirrolo[1.2-f][1.2.4]triazin-7-il)-4-fluoro-2-(hidroximetil)-5-metiltetrahidrofuran-3-ol se describe a continuación.

[0189] El nucleósido de partida (preparado como se describe en la síntesis del compuesto 2) (0,355 g, 0,765 mmol) se disolvió en THF anhidro (35 mL) y se enfrió a 0 °C con agitación bajo N²(g). Se añadió una solución de cloruro de metilmagnesio ^{( 2} ml, ⁶ mmol) (3N en THF) y la mezcla resultante se agitó durante la noche. Se añadió ácido acético (7 mmol) para sofocar la reacción y luego los disolventes se eliminaron por rotación a presión reducida. El residuo se volvió a disolver en CH²Cl² y la solución se sometió a un tapón de gel de sílice para aislar el producto (0,355 g) como una mezcla bruta. LC/MS (m/z: 480, M+1). El material bruto se disolvió en CH²Cl² anhidro (20 mL) y se colocó bajo N²(g). La solución se agitó y se trató con ácido metanosulfónico (0,2 ml, 2,74 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 12 h a TA y luego se inactivó mediante la adición de Et3N (3,5 mmol). La mezcla se concentró a presión reducida y el residuo se sometió a cromatografía en gel de sílice para proporcionar el nucleósido sustituido con metilo (0,174 g, 0,377 mmol, 44 % de rendimiento) como una mezcla 4:1 de anómeros beta y alfa respectivamente. 1H RMN (300 MHz, CD³CN) anómero principal 5 7,87 (s, 1H), 7,27-7,40 (m, 10 H), 6,77 (d, J = 4,5 HZ, 1H), 6,70 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 6,23 (br s, 2H), 5,53 (dd, J = 55, 3,3 Hz, 1H), 4,42-4,75 (m, 4H), 4,19-4,26 (m, 1H), 3,65-4,00 (m, 3H), 1,74 (d, J = 3,9 Hz, 3H). 19F RMN (282,2 MHz, CD³CN) anómero principal 5 -207 (m, IF). LCMS m/z 463 [M+H].

[0190] Se mezclaron juntos el material de nucleósido bencilado (0,134 g, 0,290 mmol), el catalizador Degussa (0,268 g) y AcOH (30 mL). La atmósfera de reacción se cargó con H² (g) y la reacción se agitó durante 2 h. El catalizador se eliminó por filtración y la mezcla se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en una cantidad mínima de H²O y se sometió a HPLC de fase inversa (columna C18 hydro RP) para aislar el anómero p 3 (0,086 g, 0,217 mmol, 57% de rendimiento). 1H RMN (300 MHz, D²O) 57,87 (s, 1H), 7,22 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 6,87 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 5,35 (dd, J = 54, 3,6 Hz, 1H), 3,97-4,10 (m, 2H), 3,81 (dd, J = 12,6, 2,1 Hz, 1H), 3,64 (dd, J = 12,6, 4,8 Hz, 1H), 1,65 (d, J = 4,2 Hz, 3H).

19F RMN (282,2 MHz, CD³CN) 5 -207 (m, 1 F).

[0191] Se caracterizó una pequeña cantidad de anómero alfa como sigue. 1H RMN (300 MHz, D²O) 57,86 (s, 1H), 7,26 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 6,85 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 5,31 (dd, J = 54, 3,9 Hz, 1H), 4,39 (ddd, J = 26,1,9,9, 3,6 Hz, 2H), 4,00 -4,05 (m, 1H), 3,90 (dd, J = 12,3, 2,1 Hz, 1H), 3,66 (dd, J = 12,6, 4,8, 1H), 1,56 (s, 3H). 19F RMN (282,2 MHz, CD³CN) 5 -198 (dd, J = 54, 26 Hz, FI).

Ejemplo de referencia 7. (2R)-isoprop¡l 2-((((2R.3R.4R.5S)-5-(4-am¡nop¡rrolo[1.2-f][1.2.4]triaz¡n-7-¡l)-4-fluoro-3-h¡drox¡-5-met¡ltetrah¡drofuran-2-¡l)metoxi)-(fenox¡)fosfor¡lam¡no)propanoato (Compuesto 4)

[0192]

[0193] El nucleósido 3 (0,011 g, 0,04 mmol) se disolvió en trimetilfosfato (2 mL) y se enfrió a 0°C. La mezcla se agitó en una atmósfera de N²(g) y se añadió 1-metilimidazol (0,320 ml, 5 mmol) seguido de monofenolfosforcloridato de alaninilmonoisopropilo C (0,240 ml, 4,4 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 2 h a 0°C y luego se dejó calentar lentamente a TA. mientras se monitorea por LC/MS. Cuando se completó por LCMS, la mezcla de reacción se trató con H²O (5 mL) y luego se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en CH²Cl² y se sometió a cromatografía en gel de sílice eluyendo con 0-100 % de EtOAc en hexanos. Las fracciones del producto se recogieron y concentraron. El residuo se sometió a HPLC preparatoria para producir el profármaco 4 de monoamidato de isopropilo de alanina como una mezcla de isómeros (4,7 mg, 0,003 mmol, 6%). 1H RMN (300 MHz, CD³CN) 57,87 (s, 1H), 7,17-7,44 (m, 5 H), 6,71­ 6,83 (m, 2H), 6,14 (br, s, 2H), 5,38 (dd, J = 56, 3,3 Hz, 1H), 4,92-5,01 (m, 1H), 3,86-4,46 (m, 6H), 3,58 (m, 1H), 1,73 (m, 3H), 1,18-1,34 (m, 9H). LCMS m/z 552 [M+H].

Ejemplo de referencia 8. (2R)-etil 2-((((2R.3R.4R.5S)-5-(4-am¡nop¡rrolo[1.2-f][1.2.4]triaz¡n-7-¡l)-4-fluoro-3-h¡drox¡-5-m etiltetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)foshorilam ino)propanoato (Compuesto 5)

[0194]

[0195] El nucleósido 3 (0,026 g, 0,092 mmol) se disolvió en trimetilfosfato (2 mL) y se enfrió a 0°C. La mezcla se agitó en N²(g) y se añadió 1-metilimidazol (0,062 ml, 0,763 mmol) seguido del cloridato A (0,160 g, 0,552 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 2 h a 0°C y luego se dejó calentar lentamente a TA. Se añadió H²O (5 mL) para extinguir la reacción y luego la mezcla se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en CH²CL y se sometió a cromatografía en gel de sílice eluyendo con 0-100 % de EtOAc en hexanos. Las fracciones del producto se recogieron y concentraron. El producto bruto se eluyó utilizando EtOAc del 0 al 100 por ciento en hexanos. El producto bruto se recogió y se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a HPLC preparatoria para producir 5 (2,0 mg, 4% de rendimiento). LCMS m/z 538 [M+H].

Ejemplo de referencia 9. Trifosfato de ((2R. 3R, 4R, 5S)-5-(4-aminopirrolo[1.2-f][1 ■2.4]tr¡az¡n-7-il)-4-fluoro-3-h¡drox¡-5-metiltetrahidrofuran-2-i0metiltetrahidroaeno (Compuesto 6)

[0196]

[0197] El nucleósido 3 (0,022 g, 0,056 mmol) se disolvió en trimetilfosfato (1 mL) y se agitó en N²(g). Se añadió oxicloruro de fósforo (0,067 ml, 0,73 mmol) y la mezcla se agitó durante 2 h. El seguimiento mediante una columna analítica de intercambio iónico determinó el tiempo en el que se formó > 80 por ciento de monofosfato. Se añadió una solución de tributilamina (0,44 ml, 1,85 mmol) y pirofosfato de trietilamonio (0,327 g, 0,72 mmol) disueltos en DMF anhidro (1 mL). La mezcla de reacción se agitó durante ^{2 0} min y luego se inactivó mediante la adición de una solución de bicarbonato de trietilamonio 1N en H²O (5 mL). La mezcla se concentró a presión reducida y el residuo se volvió a disolver en H²O. La solución se sometió a cromatografía de intercambio iónico para producir el producto del título ⁶ (1,7 mg, ⁶ % de rendimiento). LCMS m/z 521 [MH]. Tr = 0,41. Intercambio iónico HPLC Tr = 9,40 min

Ejemplo de referencia 10. (2R.3R.5S)-2-(4-aminopirrolo[1.2-f][1.2.4]triazin-7-il)-3-hidroxi-5-(hidroximetil)-tetrahidrofurano-2-carbonitrilo (Compuesto 7)

[0198]

[0199] La preparación de (2R,3R,5S)-2-(4-aminopirrolo[1.2-f][1.2.4]triazin-7-il)-3-hidroxi-5-(hidroximetil)-tetrahidrofuran-2-carbonitrilo se describe a continuación.

[0200] ((3aR,5S,6aR)-2,2-dimetil-tetrahidrofuro[2.3-d][1.3]dioxol-5-il)metanol. El material de acetato (1,2 g, 5,5 mmol) (J. Org. Chem. 1985, 50, 3547, De Bernardo et al) se disolvió en una mezcla 1:1 de MeOH y THF (10 mL). Se añadió una solución IN de NaOH (ac) (10 mL) hasta que el pH fue 13. La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas y luego se neutralizó a pH 8-9 mediante la adición de AcOH. La mezcla se extrajo con EtOAc (10 x 30 mL) y los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía en gel de sílice eluyendo con EtOAc al 0-70 % en hexanos para dar el producto deseado ^{( 8 6 6} mg, 90 %).

1H RMN (300 MHz, CDCls) 55,84 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 4,78 (t, J = 4,5 Hz, 1H), 4,38 (m, 1H), 3,93-3,54 (m, 2H), 2,04 -1,84 (m, 2H), 1,52 (s, ³H), 1,33 (s, 3H).

[0201] (3aR,5S,6aR)-5-(benc¡lox¡metil)-2,2-d¡met¡l-tetrah¡drofuro[2.3-d][1.3]d¡oxol. Se disolvió hidruro de sodio (188 mg, 7,46 mmol) en THF anhidro (5 mL) y se agitó bajo N²(g) a temperatura ambiente. El alcohol ^{( 8 6 6} mg, 4,97 mmol) se disolvió en THF anhidro (3 mL) y luego se añadió en porciones durante 5 min. a la mezcla de hidruro de sodio. La mezcla resultante se agitó durante 20 min. y luego se añadió bromuro de bencilo (892 ml, 7,46 mmol). La reacción se agitó durante 2 h y luego se vertió en una mezcla de NaHCO³ acuoso enfriado con hielo y EtOAc (30 mL). La capa orgánica se separó y luego la capa acuosa se volvió a extraer con EtOAc (30 mL). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía en gel de sílice eluyendo con 0-40 % de EtOAc en hexanos para dar el producto de éter bencílico (912 mg, 69 %). 1H RMN (300 MHz, CDCls) 57,35-7,27 (m, 5H), 5,86 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 4,74 (t, J = 4,2 Hz, 1H), 4,60 (s, 2H), 4,42 (m, 1H), 3,69-3,53 (m, 2H), 2,10-2,04 (m, 1H), 1,83-1,77 (m, 1H), 1,52 (s, ³H), 1,33 (s, 3H).

[0202] (3R,5S)-5-(benc¡lox¡met¡l)-tetrah¡drofuran-2,3-d¡ol. El éter bencílico (910 mg, 3,44 mmol) se disolvió en una mezcla 1:1 de AcOH y H²O (20 mL) y se agitó a 60 °C durante 7 h. La mezcla se concentró a presión reducida y el residuo se sometió a cromatografía en gel de sílice eluyendo con 0-70 % de EtOAc en hexanos para dar el producto diol (705 mg, 91 %). 1H RMN (300 MHz, CDCla) 57,36-7,27 (m, 5H), 5,40 (d, J= 3,9 Hz, 0,5H), 5,17 (s, 0,5H), 4,67-4,56 (m, 3H), 4,33 (m, 0,5H), 4,24 (d, J= 4,8 Hz, 0,5H), 3,71-3,67 (m, 1H), 3,56-3,42 (m, 2H), 2,31-2,22 (m, 1H), 2,08-1,89 (m, 2H).

[0203] (3R,5S)-5-(benc¡lox¡met¡l)-3-h¡drox¡-d¡h¡drofuran-2(3H)-ona. El diol (705 mg, 3,14 mmol) se disolvió en benceno (30 mL) y se trató con una mezcla de celita de carbonato de plata (3,46 g, 6,28 mmol). La mezcla resultante se agitó a 80°C bajo N²(g) durante 2 h. Luego, la mezcla se enfrió a TA, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía en gel de sílice eluyendo con EtOAc al 0-70 % en hexanos para dar el producto de lactona (600 mg, ^{8 6} %). ¹H RMN (300 MHz, CDCls) 57,39-7,27 (m, 5H), 4,75-4,68 (m, 1H), 4,60-4,49 (m, 2H), 3,74-3,54 (m, 2H), 2,61­ 2,35 (m, 2H), 2,38-2,28 (m, 1H).

[0204] (3R, 5S)-3-(benc¡lox¡)-5-(benc¡lox¡met¡l)-d¡h¡drofuran-2(3H)-ona. La lactona (600 mg, 2,7 mmol) se disolvió en EtOAc (30 mL) y se trató con óxido de plata (626 mg, 2,7 mmol) seguido de bromuro de bencilo (387 |uL, 3,24 mmol). A continuación, la mezcla de reacción se agitó a 50 °C bajo N²(g) durante ⁸ h. Luego se añadió óxido de plata adicional (300 mg) y la mezcla resultante se agitó a 50°C durante 16 h. Se añadieron más bromuro de bencilo (50 uL) y óxido de plata (150 mg) y la mezcla se agitó durante ⁸ h más. La mezcla de reacción se dejó enfriar, se filtró y luego se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía en gel de sílice eluyendo con ^{0 - 2 0} % de EtOAc en hexanos para dar el producto del título (742 mg, ^{8 8} %). 1H RMN (300 MHz, CDCla) 57,39-7,27 (m, 10H), 4,99 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 4,72 (m, 2H), 4,56 (m, 2H), 4,39 (t, J= 8,1 Hz, 1H), 3,72-3,51 (m, 2H), 2,42-2,25 (m, 2H).

[0205] (3R,5S)-2-(4-aminopirrolo[1.2-f][1.2.4]tr¡az¡n-7-¡l)-3-(benc¡lox¡)-5-(benc¡lox¡met¡l)-tetrah¡drofurano-2-ol. La 7-bromopirrolo[1.2-f][1.2.4]triazin-4-amina (607 mg, 2,85 mmol) se disolvió en THF anhidro (10 mL) y se agitó bajo Ar(g) a TA. Se añadió gota a gota TMSCl (1,1 ml, 8,55 mmol) y la mezcla se agitó durante 2 h. La reacción se concentró a presión reducida y luego se secó a alto vacío. El residuo se suspendió en THF (20 mL) y se agitó bajo Ar(g) a -78°C. Se añadió gota a gota una solución de n-BuLi 2,5 M en hexano (2,28 ml, 5,7 mmol) durante 10 min. y la mezcla resultante se agitó durante 60 min. La lactona (742 mg, 2,37 mmol) disuelta en THF anhidro (7 mL) se añadió a la mezcla anterior durante 20 min. La mezcla de reacción se agitó durante 2 h. y luego se inactivó con AcOH hasta que el pH fue de 5-6. La mezcla se dejó calentar a TA y luego se diluyó con EtOAc. La solución se lavó con solución saturada de NaHCO³ , NaCl saturado, se secó sobre Na²SO⁴ anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía en gel de sílice eluyendo con 0-80 % de EtOAc en hexanos para dar el producto del título (250 mg, 24 %). LCMS m/z 447,2 [M+H], 445,1 [MH].

[0206] (3R,5S)-2-(4-am¡nop¡rrolo[1.2-f][1.2.4]tr¡az¡n-7-¡l)-3-(benc¡lox¡)-5-(benc¡lox¡met¡l)-tetrah¡drofurano-2-carbon¡tr¡lo. El alcohol (250 mg, 0,56 mmol) se disolvió en CH²Cl² anhidro (10 mL) y se agitó bajo Ar(g) a -15 °C. Se añadió gota a gota TMSCN (448 pL, 3,36 mmol) y la mezcla se agitó durante 10 min. Se añadió gota a gota TMSOTf (466 pL, 2,58 mmol) durante 10 min y la mezcla resultante se agitó durante 90 min. a -15°C. Se añadió TMSCN adicional (224 pL, 3 eq.) y TMSOTf (202 pL, 2 eq.) y se continuó agitando durante 5 h. Se añadió solución acuosa saturada de NaHCO³ para sofocar la reacción y la mezcla se agitó durante 10 min. La capa orgánica se separó y se lavó con solución acuosa saturada de NaHCO³ , solución saturada de NaCl, se secó sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía en gel de sílice eluyendo con EtOAc al 0-70 % en hexanos para dar el producto del título (150 mg, 59 %). LCMS m/z 456,3 [M+H], 454,1 [MH].

[0207] (2R,3R,5S)²-(4-am¡nop¡rrolo[1.2-f][1.2.4]tr¡az¡n-7-¡l)-3-h¡drox¡-5-(h¡drox¡met¡l)-tetrah¡drofurano-2-carbon¡tr¡lo (7). El éter bencílico (150 mg, 0,329 mmol) se disolvió en CH²Cl² anhidro (2 mL) y la mezcla se agitó bajo Ar(g) a -^{2 0} °C. Se añadió gota a gota una solución de ¹ M BCl³ en CH²Cl² (724 pL, 0,724 mmol) y la mezcla resultante se agitó durante ² horas. Se añadió ¹ M BCI³ adicional en CH²CI² (724 gL, 0,724 mmol) y se continuó agitando durante ² h a continuación, la mezcla se enfrió a -78 °C y se trató lentamente con una mezcla 2:1 de Et3N y MeOH (3 mL). La mezcla se agitó durante 10 min y luego se trató con MeOH (10 mL). La reacción se dejó calentar a TA y luego se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en MeOH y se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió nuevamente en MeOH y se trató con NaHCO3 sólido. La mezcla se agitó durante 5 min y luego el sólido se eliminó por filtración. La solución se concentró a presión reducida y se sometió a HPLC preparativa para proporcionar el producto deseado 7 (10 mg, 11%). 1H RMN (300 MHz, D²O) 5 7,71 (s, 1H), 6,75 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 6,65 (d, J= 4,8 Hz, 1H), 4,91 (t, J= 6,3 Hz, 1H)), 4,57 (m, 1H), 3,67-3,47 (m, 2H), 2,18 (m, 2H). LCMS m/z 276,1 [M+H], 274,0 [MH].

Ejemplo de referencia 11. (2S)-isopropil 2-((((2R.3S.4R.5R)-5-(4-am¡nop¡rrolof1.2-f1f1.2.41tr¡azin-7-¡l)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)-fosforilamino)propanoato (Compuesto 8)

[0208]

[0209] El nucleósido 1 (45 mg, 0,15 mmol) se disolvió en fosfato de trimetilo anhidro (0,5 mL) y la solución se agitó bajo N²(g) a 0°C. Se añadió metilimidazol (36 gL, 0,45 mmol) a la solución. Se disolvió clorofosforamidato C (69 mg, 0,225 mmol) en THF anhidro (0,25 mL) y se añadió gota a gota a la mezcla de nucleósidos. Cuando la reacción se completó por LCMS, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con solución acuosa saturada de NaHCO³ , NaCl saturado, se secó sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía en gel de sílice eluyendo con MeOH al 0-5 % en CH²Cl² seguido de HPLC preparativa para dar el producto (20,9 mg, 25 %). ¹H RMN (300 MHz, CD³OD) 57,95 (m, 1H), 7,31-6,97 (m, 7H), 4,94 (m, 1H), 4,78 (m, 1H), 4,43 (m, 3H), 4,20 (m, 1H), 3,80 (d, 1H), 1,30-1,18 (m, 9H). ³¹P RMN (121,4 MHz, CD³OD) 53,8. LCMS m/z 561,0 [M+H], 559,0 [MH].

Ejemplo 12. (2S)-2-etilbutil 2-((((2R.3S.4R.5R)-5-(4-am¡nop¡rrolo[1.2-f1[1.2.41triaz¡n-7-¡l)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-il)m etoxi)(fenoxi)fosforilamino)propanoato (Compuesto 9)

[0210] El Compuesto 9 puede ser preparado por varios métodos descritos a continuación.

[0211] Preparado a partir del compuesto 1 y cloridato B de acuerdo con el mismo método que para la preparación del Compuesto 8. ¹H RMN (300 MHz, CD³OD) 57,87 (m, 1H), 7,31-7,16 (m, 5H), 6,92-6,89 (m, 2H), 4,78 (m, 1H), 4,50-3,80 (m, 7H), 1,45-1,24 (m, ⁸ H), 0,95-0,84 (m, ⁶ H). ³¹P RMN (121,4 MHz, CD³OD) 53,7. LCMS m/z 603,1 [M+H], 601,0 [MH].

[0212] (2S)-2-etilbutil 2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato. Se disolvió (2S)-2-etilbutil 2-(((4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato (1,08 g, 2,4 mmol) en DMF anhidro (9 mL) y se agitó en atmósfera de nitrógeno a TA. (2R,3R,4S,5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetil)tetrahidrofurano-2-carbonitrilo (350 mg, 1,2 mmol) se añadió a la mezcla de reacción en una porción. A continuación, se añadió gota a gota a la reacción una solución de cloruro de f-butilmagnesio en THF (1 M, 1,8 ml, 1,8 mmol) durante 10 minutos. La reacción se agitó durante 2 h, momento en el que la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (50 mL) y se lavó con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (3 x 15 mL) seguido de una solución acuosa saturada de cloruro de sodio (15 mL). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a presión reducida. El aceite resultante se purificó con cromatografía en columna de gel de sílice (0-10 % de MeOH en DCM) para producir (2S)-2-etilbutil 2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino) propanoato (311 mg, 43 %, mezcla diastereoisómera en fósforo 1:0,4) como un sólido blanco. 1H RMN (400 MHz, CDaOD) 57,85 (m, 1H), 7,34-7,23 (m, 2H), 7,21 - 7,09 (m, 3H), 6,94 - 6,84 (m, 2H), 4,78 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,46 - 4,33 (m, 2H), 4,33 - 4,24 (m, 1H), 4,18 (m, 1H), 4,05 - 3,80 (m, 3H), 1,52 - 1,39 (m, 1H), 1,38 - 1,20 (m, 7H), 0,85 (m, ⁶ H). 31P RMN (162 MHz, CDaOD) 5 3,71, 3,65. LCMS m/z 603,1 [M+H], 600,9 [MH]. HPLC (gradiente de M eCN-Hp al 2-98 % con modificador TFA al 0,1 % durante 8,5 min, 1,5 ml/min, columna: Phenomenex Kinetex C18, 2,6 um 100 Á, 4,6 x 100 mm) fn = 5,544 min, 5,601 min

Separación de los diastereoisómeros (S) y (R)

[0213] Se disolvió (2S)-2-etilbutil 2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-² -il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato en acetonitrilo. La solución resultante se cargó en una columna quiral Lux Cellulose-2, se equilibró en acetonitrilo y se eluyó con acetonitrilo/metanol isocrático (95:5 vol/vol). El primer diastereómero eluido tenía un tiempo de retención de 17,4 min y el segundo diastereómero eluido tenía un tiempo de retención de 25,0 min.

[0214] El primer diastereómero de elución es (S)-2-etilbutil 2-(((R)-(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato:

¹H RMN (400 MHz, CD³OD) 58,05 (s, 1H), 7,36 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 7,29 (br t, J = 7,8 Hz, 2H), 7,19 - 7,13 (m, 3H), 7,11 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 4,73 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,48 -4,38 (m, 2H), 4,37 -4,28 (m, 1H), 4,17 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 4,08 - 3,94 (m, 2H), 3,94 - 3,80 (m, 1H), 1,48 (sep, J = 12,0, 6,1 Hz, 1H), 1,34 (p, J = 7,3 Hz, 4H), 1,29 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 0,87 (t, J = 7,4 Hz, ⁶ H). ³¹P RMN (162 MHz, CD³OD) 53,71 (s). HPLC (gradiente de MeCN-Hjp al 2-98 % con modificador TFA al 0,1 % durante 8,5 min, 1,5 ml/min, columna: Phenomenex Kinetex C18, 2,6 um 100 Á, 4,6 x 100 mm) fn = 5,585 min.

[0215] El segundo diastereoisómero de elución es (S)-2-etilbutil 2-(((S)-(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato:

¹H RMN (400 MHz, CD³OD) 58,08 (s, 1H), 7,36 - 7,28 (m, 3H), 7,23 - 7,14 (m, 3H), 7,08 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 4,71 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 4,45 - 4,34 (m, 2H), 4,32 -4,24 (m, 1H), 4,14 (t, J = 5,8 Hz, 1H), 4,08 - 3,94 (m, 2H), 3,93 - 3,85 (m, 1H), 1,47 (sep, J = 6,2 Hz, 1H), 1,38 - 1,26 (m, 7H), 0,87 (t, J = 7,5 Hz, ⁶ H). ³¹P RMN (162 MHz, CD³OD) 53,73 (s). HPLC (gradiente de MeCN-HP al 2-98 % con modificador TFA al 0,1 % durante 8,5 min, 1,5 ml/min, columna: Phenomenex Kinetex C18, 2,6 um 100 Á, 4,6 x 100 mm) tn = 5,629 min.

Ejemplo de referencia 13. (2S)-etil 2-((((2R.3S.4R.5R)-5-(4-am¡nop¡rrolof1.2-f1f1.2.41tr¡azin-7-¡l)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforilam ino)propanoato (Compuesto 10)

[0216]

[0217] La preparación de (2S)-etil 2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-² -il)metoxi) (fenoxi)fosforil)amino)propanoato se describe a continuación.

Procedimiento 1. Preparación vía cloridato A

[0218]

[0219] Preparado a partir del compuesto 1 y cloridato A utilizando el mismo método que para la preparación del compuesto 8. ¹H RMN (300 MHz, CD³OD) 57,95 (m, 1H), 7,32-6,97 (m, 7H), 4,78 (m, 1H), 4,43-4,08 (m, ⁶ H), 3,83 (m, 1H), 1,31-1,18 (m, ⁶ H). ³¹P RMN (121,4 MHz, CD³OD) 53,7. LCMS m/z 547,0 [M+H], 545,0 [M-H].

Procedimiento 2. Preparación mediante Nitro-Benceno Compuesto L

[0220]

[0221] El Compuesto 1 (50 mg, 0,17 mmol) se disolvió en NMP-THF (1:1 mL) y se enfrió con un baño de hielo. A continuación se añadió tBuMgCl (0,257 ml, 0,257 mmol) durante 5 min. La mezcla resultante se dejó calentar a TA y se agitó durante 30 min. A continuación se añadió una solución del compuesto L (Preparado según US20120009147, 74,6 mg, 0,189 mmol) en THF (2 mL). Después de 30 min, la mezcla de reacción se purificó por HPLC (acetonitrilo del 10 al 80 % en agua) para dar el Compuesto 29 como un sólido amarillo. El sólido se purificó adicionalmente con cromatografía en gel de sílice (MeOH del 0 al 20 % de DCM) para proporcionar el Compuesto 29 (23 mg, 24 % como una mezcla de diastereoisómeros 2,5:1). ¹H RMN (400 MHz, CD³OD) 57,76 (d, J= 6,0 Hz, 1H), 7,25 - 7,14 (m, 2H), 7,11 - 6,99 (m, 3H), 6,87 - 6,72 (m, 2H), 4,70 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,39 - 4,24 (m, 2H), 4,20 (dddd, J = 9,7, 7,9, 5,1, 2,8 Hz, 1H), 4,10 (dt, J = 12,8, 5,5 Hz, 1H), 4,06 - 3,91 (m, 2H), 3,72 (ddq, J = 14,3,9,3, 7,1 Hz, 1H), 1,17 (dd, J = 7,1, 1,0 Hz, 1H), 1,14 - 1,06 (m, 5H). ³¹P RMN (162 MHz, CD³OD) 53,73, 3,68. EM m/z = 547 (M+1)+.

Ejemplo de referencia 14. (2S)-etil 2-((((2R.3R.4R.5R)-5-(4-am¡nop¡rroloM.2-f1M.2.41tr¡az¡n-7-il)-5-c¡ano-4-fluoro-3-hidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforilamino)propanoato (Compuesto 11)

[0222]

[0223] El Compuesto 11 se preparó a partir del Compuesto 2 y el cloridato A usando el mismo método que para la preparación del compuesto 8. ¹H RMN (300 MHz, CD³OD) 57,91 (m, ¹ H), 7,33-7,16 (m, 5H), 6,98-6,90 (m, ² H), 5,59 (m, 1H), 4,50-4,15 (m, 4H), 4,12-3,90 (m, 3H), 1,33-1,18 (m, ⁶ H). ³¹P RMN (121,4 MHz, CD³OD) 5 3,8. LCMS m/z 549,0 [M+H], 547,1 [M-H].

Ejemplo de referencia 15. (2S.2'S)-dietil 2.2'-((((2R.3S.4R.5R)-5-(4 -aminop¡rrolo[1.2-f1[1.2.41tr¡az¡n-7-¡l)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)fosforil)bis(azanodiil)dipropanoato (Compuesto 12)

[0224]

[0225] El nucleósido 1 (14,6 mg, 0,05 mmol) se disolvió en fosfato de trimetilo anhidro (0,5 mL) y se agitó bajo N²(g) a temperatura ambiente. Se añadió POCl³ (9,2 gL, ^{0 , 1} mmol) y la mezcla se agitó durante ^{6 0} min. Se añadió clorhidrato de éster etílico de alanina (61 mg, 0,4 mmol) y luego Et³N (70 gL, 0,5 mmol). La mezcla resultante se agitó durante 15 min. y luego se añadió Et³N adicional (70 gL, 0,5 mmol) para dar una solución con un pH de 9-10. La mezcla se agitó durante 2 h. y luego se diluyó con EtOAc, se lavó con una solución acuosa saturada de NaHCO³ seguido de una solución acuosa saturada de NaCl. La capa orgánica se secó sobre Na²SO⁴ anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a HPLC preparativa (columna C¹⁸ ) para producir el producto 12 (5,5 mg, 16%). 1H RMN (400 MHz, CD³OD) 5 8,13 (s, 1H), 7,41 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 7,18 (d, J= 4,8 Hz, 1H), 4,78 (d, J = 5,6 Hz, 1H)), 4,36 (m, 1H), 4,25-4,08 (m, 7H), 3,83 (m, 2H), 1,33-1,23 (m, 12H). ³¹P RMN (121,4 MHz, CD³OD) 5 13,8. LCMS m/z 570,0 [M+H], 568,0 [M-H].

Ejemplo de referencia 16. (2S.3R.4S.5R)-2-(4-am¡nop¡rrolof1.2-f1f1.2.41tr¡az¡n-7-¡l)-2-et¡nil-5-(h¡drox¡met¡l) tetrahidrofurano-3.4-diol (Compuesto 13)

[0226]

[0227] La preparación de (2S,3R,4S,5R)-2-(4-aminopirrolo[1.2-f][1.2.4]triazin-7-il)-2-etinil-5-(hidroximetil)tetrahidrofuran-3,4-diol se describe a continuación.

[0228] El alcohol nucleósido (0,6 g, 1,08 mmol) (preparado como se describe en la síntesis del compuesto 1) se disolvió en THF anhidro ^{( 8} mL) y se colocó bajo N²(g). La mezcla de reacción se agitó y se enfrió a 0°C y luego se trató con una solución 0,5 N de bromuro de etinilo magnésico en THF (17,2 ml, 17,2 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se añadió AcOH (1,5 mL) para extinguir la reacción. La mezcla se concentró a presión reducida y el residuo se volvió a disolver en CH²CL. La solución se sometió a un tapón de gel de sílice eluyendo con 0 a 80 % de EtOAc en hexanos para proporcionar el producto del título como una mezcla bruta. LCMS m/z 579 [M+H].

[0229] El alcohol etinílico bruto (0,624 g, 1,08 mmol) se disolvió en CH²Cl² anhidro (10 mL) y se colocó bajo N²(g). La mezcla se agitó y se añadió ácido sulfónico (0,2 ml, 2,74 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 12 h en RT. Cuando se completó mediante LCMS, se añadió Et³N (0,56 mL) para extinguir la reacción. La reacción se concentró a presión reducida y el residuo se sometió a cromatografía en gel de sílice eluyendo con EtOAc del 0 al 75 % en hexanos para producir el nucleósido de etinilo como una mezcla de anómeros (0,200 g, 33 % en 2 etapas). LCMS m/z 561 [M+H].

[0230] El nucleósido de tribencilo (0,650 g, 1,16 mmol) se disolvió en CH²CI² anhidro (30 mL) y se enfrió a -78 °C en N²(g). Se añadió una solución de tribromuro de boro (1N en CH²Cl² , 5,5 mL) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 h a -78°C. Se añadió una solución de MeOH (10 mL) y piridina (2 mL) para extinguir la reacción y se dejó que la mezcla alcanzara la temperatura ambiente. La mezcla se concentró a presión reducida y se sometió a HPLC preparativa para proporcionar el anómero a ^{( 2 0} mg) y el anómero p 13 ^{( 1 1 0} mg). (anómero p) 1H RMN (300 MHz, DMSO) 57,81 (s, ¹ H), 7,76 (br s, 2H), 6,80-6,85 (m, 2H), 5,11 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 4,90 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 4,82 (dd, J = 7,2, 4,8 Hz, 1H), 4,62 (t, J = 6,3 Hz, 1H), 3,95-3,99 (m, 1H), 3,85-3,91 (dd, J = 11,4, 5,7 Hz, 1H), 3,61 -3,67 (m, 1H), 3,47-3,55 (m, 1H), 3,52 (d, J = 0,9 Hz, 1H). (anómero a) 1H RMN (300 MHz, DMSO) 57,80 (s, 1H), 7,59 (bs, 2H), 6,80 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 6,54 (d, J = 4,2 Hz, 1H), 5,00 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 4,89 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 4,74 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 4,58 (t, J = 4,5 Hz, 1H), 4,27 (m, 1H), 3,88 (m, 1H), 3,64-3,72 (m, 1H), 3,51-3,59 (m, 1H), 3,48 (d, J = 0,6 Hz, 1H). LCMS m/z 291 [M+H].

Ejemplo de referencia 17. (2R.3R.4R)-5-(4-am¡nop¡rrolo[1.2-f][1.2.4]tr¡az¡n-7-¡l)-1.3.4-tr¡s(benc¡lox¡)hexano -2,5-diol (Compuesto 14)

[0231]

[0232] La preparación de (2R,3R,4R)-5-(4-aminopirrolo[1.2-f][1.2.4]triazin-7-il)-1,3,4-tris(benciloxi)hexano-2,5-diol se describe a continuación.

[0233] El alcohol tribencílico de la síntesis del Compuesto 1 (0,250 g, 0,453 mmol) se disolvió en THF anhidro (25 mL) y se agitó bajo N²(g). La mezcla de reacción se enfrió a 0°C y luego se añadió una solución 3,0 N de cloruro de metilmagnesio en THF (1,2 ml, 3,62 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se añadió ácido acético (1,5 mL) para extinguir la reacción y luego la mezcla se concentró a presión reducida. El residuo se volvió a disolver en CH²Cl² y se sometió a un tapón de gel de sílice eluyendo con 0 a 80% de EtOAc en hexanos. El producto bruto (0,452 g) se usó luego en la siguiente reacción sin más purificación. LCMS m/z 569 [M+H].

[0234] El nucleósido de metilo bruto (0,452 g, 0,796 mmol) se disolvió en CH²Cl² anhidro (20 mL) y se agitó en N²(g). Se añadió ácido metanosulfónico (0,2 ml, 2,78 mmol) y la reacción se agitó durante 12 ha TA. Se añadió Et³N (0,56 mL) para extinguir la reacción y luego la mezcla se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía en gel de sílice eluyendo con 0 a 75 % de EtOAc en hexanos para producir el producto como una mezcla de anómeros (0,20 g, 46 % en 2 etapas). LCMS m/z 551 [M+H].

[0235] El nucleósido de tribencilo (0,20 g, 0,364 mmol) se disolvió en AcOH (30 mL) se cargó con Pd/C (Degussa) (400 mg). La mezcla agitada se lavó tres veces con N²(g) y luego se introdujo H²(g). La reacción se agitó bajo H²(g) durante 2 h y luego el catalizador se eliminó por filtración. La solución se concentró a presión reducida y el residuo se volvió a disolver en H²O. La solución se sometió a HPLC preparativa en condiciones neutras para proporcionar el anómero a y el anómero p 14 con un rendimiento del 81 %. (anómero a) 1H RMN (300 MHz, D²O) 57,81 (s, 1H), 7,22 (d, 1H), 6,75 (d, 1H), 4,47 (d, 1H), 4,25-4,31 (m, 1H), 3,88-4,95 (m, 1H), 3,58-3,86 (dd, 2H), 1,50 (s, 3H). (anómero p) 1H RMN (300 MHz, D²O) 57,91 (s, 1H), 7,26 (d, 1H), 6,90 (d, 1H), 4,61 (d, 1H), 4,00-4,09 (m, 2H), 3,63-3,82 (dd, 2H), 1,67 (s, 3H). LCMS m/z 281 [M+H].

Ejemplo de referencia 18. S.S'-2.2'-((((2R.3S.4R.5R)-5-(4-am¡nop¡rrolo[1.2-f][1.2.4]triaz¡n-7-¡l)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)fosforil)bis(oxi)bis(etano-2.1-diil)bis(2.2-dimetilpropanotioato) (Compuesto 15)

[0236]

[0237] El nucleósido 1 (0,028 g, 0,096 mmol) se disolvió en trimetilfosfato (1 mL). La reacción se agitó en N²(g) y, a continuación, se trató con 1 H-tetrazol (0,021 g, 0,29 mmol). La mezcla de reacción se enfrió a 0°C y el fosfano (Nucleoside Nucleotides, Nucleic acids; 14; 3-5; 1995; 763 - 766. Lefebvre, Isabelle; Pompon, Alain; Perigaud, Christian; Girardet, Jean-Luc; Gosselin, Gilles; et al.) (87 mg, 0,192 mmol). La reacción se agitó durante 2 h. y luego se inactivó con peróxido de hidrógeno al 30 % (0,120 mL). La mezcla se agitó durante 30 min a temperatura ambiente y luego se trató con tiosulfato de sodio acuoso saturado (1 mL). La mezcla se agitó durante 10 min. y luego se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a HPLC preparativa para aislar el producto del título 15. ¹H RMN (300 MHz, CD³CN) 5 7,98 (s, 1H), 6,92 (d, 1H), 6,81 (d, 1H), 6,44 (bs, 2H), 4,82 (m, 2H), 4,47 (m, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,00 (m, 4H), 3,80 (bs, 1H), 3,11 (m, 4H), 1,24 (s, 9H). ³¹P RMN (121,4 MHz, CD³CN) 5 -1,85 (s). LCMS m/z 661 [M+H].

Ejemplo de referencia 19. S.S'-2.2'-((((2R.3S. 4R. 5S)-5-(4-am¡nop¡rrolo[1.2-f][1.2.4]tr¡az¡n-7-¡l)-5-et¡nil-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)fosforil)bis(oxi)bis(etano-2.1-diil)bis(2.2-dimetilpropanotioato)

(Compuesto 16)

[0238]

[0239] El Compuesto 16 se preparo utilizando el mismo método que el compuesto 15 excepto que se sustituyo el Compuesto 13 como nucleósido de partida. 1H RMN (300 MHz, CD³CN) 57,91 (s, 1H), ^{6 , 8 6} (d, J = 4,8 Hz, 1H), 6,76 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 6,29 (bs, 2H), 4,69 (t, J = 2,7 Hz, 1H), 4,58 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,14-4,33 (m, 5H), 3,99-4,07 (m, 4H), 3,53 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 3,11 (q, J = 5,7 Hz, 4H), 1,22 (s, 18H). LCMS m/z 658,9 [M+]. Tr=2,31

Ejemplo de referencia 20. Trifosfato de ((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-am¡nopirrolo[1.2-f][1.2.4]tr¡az¡n-7-¡l)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metil etrahidrógeno (Compuesto 17)

[0240]

[0241] El compuesto 17 se preparó a partir del compuesto 1 utilizando un procedimiento similar al de la preparación del compuesto 6. El producto se aisló como la sal de sodio. 1H RMN (400 MHz, D²O) 57,76 (s, 1H), ^{6 , 8 8} (d, J = 4,8 Hz, 1H), 6,73 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 4,86 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,43 (m, 1H), 4,39 (m, 1H), 4,05 (m, 1H), 3,94 (m, 1H). 31P RMN (121,4 MHz, D²O) 5 -5,4 (d, ¹ P), -^{1 0 , 8} (d, ¹ P), -^{21 , 1} (t, ¹ P). l Cm S m/z 530 [MH], 531,9 [M+H] Tr = ^{0 , 2 2} min. Intercambio iónico HPLC TR=9,95 min.

Ejemplo de referencia 21. Trifosfato de ((2R.3S. 4R. 5S)-5-(4-am¡nop¡rrolo[1.2-f][1.2.4]tr¡az¡n-7-¡l)-5-et¡nil-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metiltetrahidrogeno

(Compuesto 18)

[0242]

[0243] El Compuesto 18 se preparó a partir del compuesto 13 utilizando un procedimiento similar al de la preparación del compuesto ⁶. El producto se aisló como la sal de TEA. 1H RMN (300 MHz, D²O) 57,85 (s, 1H), 7,09 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 4,23 (m, 2H), 4,08 (m, 2H), 3,06 (q, J = 7,4 Hz, 20H), 1,14 (t, J = 7,3 Hz, 30H). RMN de ³¹P (121,4 MHz, D²O) 5 -10,8 (d, 1P), -11,2 (d, 1P), -23,2 (t, 1P). LCMS m/z 530,8 [M+H], Tr = 0,46. Intercambio iónico HPLC Tr = 9,40 min.

Ejemplo de referencia 22. Trifosfato de ((2R.3S. 4R, 5S)-5-(4-am¡nop¡rroloM.2-f1M.2.41tr¡az¡n-7-il)-3.4-d¡h¡drox¡-5-metiltetrahidrofuran-2-il)metiltetrahidrógeno (Compuesto 19)

[0244]

[0245] El compuesto 19 se preparó a partir del compuesto 14 utilizando un procedimiento similar al de la preparación del compuesto ⁶. 1H RMN (400 MHz, D²O) 57,78 (s, 1H), 6,98 (m, 1H), 6,84 (m, 1H), 4,45 (m, 1H), 4,04 (m, 4H), 1,54 (s, 3H).

31P RMN (161 MHz, D²O) 5 -10,6 (m), -23,0 (m). LCMS m/z 521,0 [M+H].

Ejemplo de referencia 23. Trifosfato de ((2R.3R.4R.5R)-5-(4-am¡nop¡rrolo[1.2-f1[1.2.41tr¡az¡n-7-il)-5-c¡ano-4-fluoro-3-hidroxitetrahidrofuran-2-il)metiltetrahidrógeno

(Compuesto 20)

[0246]

[0247] El Compuesto 20 se preparó a partir del Compuesto 2 utilizando un procedimiento similar al de la preparación del Compuesto 6. 1H RMN (400 MHz, D²O) 57,78 (s, 1H), 6,93 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 6,78 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 5,45 (dd, J = 53, 4,4 Hz, 1H), 4,38-4,50 (m, 2H), 4,13-4,20 (m, 2H). 31P RMN (161 MHz, D²O) 5 -5,7 (d, 1P), -11,0 (d, 1P), -21,5 (t, 1P). LCMS m/z 533.9.0 [M+H], 532.0 [MH] Tr = 1,25 min. Intercambio de iones h Pl C Tr = ^{1 1 , 0} min.

Ejemplo de referencia 24. (2S)-etil 2-(((((2R.3S.4R.SR)-5-(4-am¡nop¡rrolo[2■1-f1[1■2■41tr¡az¡n-7-¡l)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)-3-fenilpropanoato (21)

[0248]

[0249] La preparación de (2S)-etil 2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)-3-fenilpropanoato se describe a continuación.

Preparación de clorhidrato de (S)-etil 2-amino-3-fenilpropanoato.

[0250]

[0251] Se recogió L-fenilalanina (5 g, 30 mmol) en EtOH (30 mL). Se añadió TMSCl (6,915 ml, 54 mmol) a la reacción a temperatura ambiente. El recipiente de reacción se equipó con un condensador de reflujo y la reacción se colocó en un baño a 80 °C. La reacción se agitó durante la noche. Al día siguiente, la reacción se enfrió a TA, se concentró a presión reducida y el residuo resultante se recogió en Et²O. La suspensión resultante se filtró y los sólidos aislados se lavaron adicionalmente con Et²O. Los sólidos lavados se colocaron a alto vacío para producir el clorhidrato de (S)-etil 2-amino-3-fenilpropanoato del ejemplo (^{6 , 8 6} g, 99%). ¹H RMN (400 MHz, DMSO-d⁶) 58,52 (s, 3H), 7,30 (m, 5H), 4,24 (ABX, Jax = 7,8 Hz, Jbx = 6,2 Hz, 1H), 4,11 (m, 2H), 3,17, 3,05 (ABX, JAB = -14 Hz, JBX = 5,8 Hz, JAX = 7,6 Hz, 2H), 1,09 (t, J = ^{6 , 8} Hz, 3H).

Preparación de (2S)-etil 2-(((4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)-3-fenilpropanoato

(Compuesto D)

[0252]

[0253] Se disolvió clorhidrato de (S)-etil 2-amino-3-fenilpropanoato (1,01 g, 4,41 mmol) en DCM (50 mL). Esta solución se enfrió a ⁰ °C y se añadió PhOP(O)Cl² (0,656 ml, 4,41 mmol), seguido de la adición lenta de EtsN (1,62 ml, ^{1 1} ,5 mmol) durante 5 min. Se retiró el baño frío y se permitió que la reacción se calentara a TA y se agitara durante un período de 80 min. Se añadió p-NO² PhOH (0,583 g, 4,19 mmol), seguido de más Et³N (0,3 ml, 2,1 mmol). El progreso de la reacción se controló mediante LC/MS. Una vez completada la reacción, se diluyó con Et²O y los sólidos resultantes se eliminaron por filtración. El filtrado se concentró y el compuesto D (1,25 g, 60 %, como una mezcla de diastereoisómeros) se aisló mediante cromatografía en columna de gel de sílice (cartucho de carga seca de 25 g, columna de 120 g; eluyente: 100 % de hexanos aumentando gradualmente a 55 % de EtOAc en hexanos). 1H RMN (400 MHz, CD³OD) 58,17 (m, 2H), 7,33 (m, 2H), 7,09-7,25 (m, 10H), 4,17 (m, 1H), 4,07 (m, 2H), 3,08 (m, 1H), 2,84 (m, 1H), 1,14 (m, 3H). 31P RMN (162 MHz, DMSO-d6) 5 -1,479 (s), -1,719 (s). EM m/z = 471,01 [M+1].

Preparación_______ de_______(2S)-etil_______ 2-(((((2R.3S.4R.5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f1M ,2.41triazin-7-il)-5-ciano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)-3-fenilpropanoato (Compuesto 21)

[0254]

[0255] El Compuesto 1 (0,030 g, 0,103 mmol) se disolvió en DMF (1 mL) y luego se añadió THF (0,5 mL). Se añadió t-BuMgCl (1 M/THF, 154,5 ml, 0,154 mmol) a la reacción gota a gota con agitación vigorosa. La suspensión blanca resultante se agitó a TA durante 30 min. Se añadió gota a gota a la reacción a temperatura ambiente una solución del compuesto D (0,058 g, 0,124 mmol) en THF (1 mL). El progreso de la reacción se controló mediante LC/MS. Cuando la reacción progresó hasta una conversión del 50 %, la reacción se enfrió en un baño de hielo y se inactivó con ácido acético glacial (70 |uL). La reacción se concentró y el compuesto 21 (22 mg, 34 %, como una mezcla 2,6:1 de diastereoisómeros) se aisló del residuo mediante HPLC de fase inversa. ¹H RMN (400 MHz, DMSO-d⁶) 5 7,91 (d, J = 4 Hz, 1H), 7,90 (brs, 2H), 7,09-7,30 (m, ⁸ H), 7,01, (t, J = 8,2 Hz, 2H), 6,89 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 6,82 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 6,27 (m, 1H), 6,14 (m, 1H), 5,34 (m, 1H), 4,62 (t, J= 5,6 Hz, 1H), 4,15 (m, 1H), 3,78-4,01 (m, ⁶ H), 2,92 (m, 1H), 2,78 (m, 1H), 1,04 (m, 3H). ³¹P RMN (162 MHz, DMSOd⁶ ) 53,69 (s), 3,34 (s). EM m/z = 623,0 [M+H].

Ejemplo de referencia 25. (2S)-etil 2-(((((2R.3S.4R.5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)-3-metilbutanoato (22)

[0256]

[0257] La preparación de (2S)-etil 2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)-3-metilbutanoato se describe a continuación.

Preparación de (2S)-etilo 3-metil-2-(((4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)butanoato

(Compuesto E)

[0258]

[0259] El (S)-etil 2-amino-3-butanoato de metilo (0,351 g, 1,932 mmol) se disolvió en DCM (17 mL). Esta solución se enfrió en un baño de hielo y se añadió PhOP(O)Cl² (0,287 mL, 1,932 mmol), seguido de la adición lenta de Et³N (1,62 mL, 11,4 mmol) durante 5 min. Se retiró el baño frío y se permitió que la reacción se calentara a temperatura ambiente y se agitara durante un período de 1 h. Se añadió p-NO² PhOH (0,255 g, 1,836 mmol) y se controló el progreso de la reacción mediante LC/MS. Una vez completada la reacción, la mezcla se diluyó con Et²O y los sólidos resultantes se eliminaron por filtración. El filtrado se concentró y el compuesto E (0,642 g, 79 % como una mezcla de diastereoisómeros) se aisló mediante cromatografía en columna de gel de sílice (cartucho de carga seca de ¹² g, columna de 80 g; eluyente: ^{1 0 0} % de hexanos aumentando gradualmente a 55 % de EtOAc en hexanos). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d⁶) 58,30 (d, J = 9,2 Hz, 2H), 7,48 (t, J = 9,6 Hz, 2H), 7,40 (t, J = 7,8 Hz, 2H), 7,20-7,27 (m, 3H), 6,60 (cuarto, J = 11,6 Hz, 1H), 4,01 (m, 2H), 3,61 (m, 1H), 1,93 (m, 1H), 1,11 (m, 3H), 0,79 (m, ⁶ H). 31P RMN (162 MHz, DMSO-ds) 5 -0,342 (s), -0,578 (s). EM m/z = 422,9 [M+H].

Preparación_______ de_______ (2S)-etil_______2-(((((2R.3S.4R.5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f1M ,2.41triazin-7-il)-5-ciano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)-3-metilbutanoato (Compuesto 22)

[0260]

[0261] Se disolvió el Compuesto 1 (0,040 g, 0,137 mmol) en NMP (1,5 mL) y luego se añadió THF (0,25 mL). Esta solución se enfrió en un baño de hielo y se añadió gota a gota f-BuMgCl (1 M/THF, 425,7 ml, 0,426 mmol) con agitación vigorosa. Se retiró el baño de hielo y la suspensión blanca resultante se agitó a TA durante 15 min. Se añadió gota a gota a la reacción a temperatura ambiente una solución del compuesto E (0,081 g, 0,192 mmol) en THF (0,5 mL). El progreso de la reacción se controló mediante LC/MS. Cuando la reacción progresó hasta una conversión del 50 %, la reacción se enfrió en un baño de hielo y se inactivó con ácido acético glacial (70 mL). La reacción se concentró y el compuesto 22 (22 mg, 34%) se semipurificó del residuo mediante HPLC de fase inversa. El material semipuro se purificó adicionalmente mediante cromatografía en columna de gel de sílice (cartucho de carga seca de 12 g, columna de 40 g; eluyente: EtOAc al 100 % aumentando progresivamente a MeOH al 10 % en EtOAc) para producir el compuesto 22 (0,034 g, 43 % como 1,8:1 mezcla de diastereómeros). ¹H RMN (400 MHz, DMSO-d⁶) 57,91 (d, J = 1^{, 6} Hz, 1H), 7,88 (brs, 2H), 7,32 (m, 2H), 7,15 (m, 3H), 6,90 (t, J = 4,2 Hz, 1H), 6,84 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 6,26 (dd, J = 13,4, 6,2 Hz, 1H), 5,87 (cuartos J = 11,2 Hz, 1H), 5,35 (m, 1H), 4,64 (m, 1H), 4,25 (m, 2H), 3,93-4,15 (m, 4H), 3,45 (m, 1H), 1,87 (m, 1H), 1,09-1,16 (m, 3H), 0,70-0,83 (m,⁶ H). ³¹P RMN (162 MHz, DMSO-ds) 54,59 (s), 4,47 (s). EM m/z = 575,02 [M+H].

Ejemplo de referencia 26. (S)-isopropil 2-(((R)-(((2R.3S.4R.5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-il)-5-ciano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato (23)

[0262]

[0263] A continuación se describe la preparación de (S)-isopropil 2-(((R)-(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato.

[0264] Se disolvió el compuesto 1 (60,0 mg, 206 mmol) en NMP (0,28 mL). Se añadió THF (0,2 mL) seguido de cloruro de terc-butilmagnesio (solución 1,0 M en tetrahidrofurano, 0,309 mL) a temperatura ambiente en atmósfera de argón. Después de 20 min, se añadió una solución del compuesto F (Preparado según Cho, A. et al J. Med. Chem. 2014, 57, 1812-1825., 81 mg, 206 mmol) en THF (0,2 mL) y la mezcla resultante se calentó a 50 °C. Después de 3 h, la mezcla de reacción se dejó enfriar a TA y se purificó directamente mediante HPLC preparatoria (columna de Phenominex Synergi 4u Hydro-RR 80Á 150 x 30 mm, 5-100 % de gradiente de acetonitrilo/agua) para proporcionar el compuesto 23 (44 mg, 38% como un solo diastereoisómero). ¹H RMN (400 MHz, CD³OD) 57,86 (s, 1H), 7,34 - 7,26 (m, 2H), 7,21 - 7,12 (m, 3H), 6,91 (d, J= 4,6 Hz, 1H), 6,87 (d, J= 4,6 Hz, 1H), 4,92 (sept, J = 6,3 Hz, 1H), 4,80 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,43 - 4,34 (m, 1H), 4,33 - 4,24 (m, 1H), 4,18 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 3,82 (dq, J = 9,7, 7,1 Hz, 2H), 1,27 (dd, J = 7,1, 1,0 Hz, 3H), 1,18 (dd, J = 6,3, 4,8 Hz, ⁶ H). ³¹P RMN (162 MHz, CD³OD) 53,72 (s). LC/MS: tR = 1,39 min, EM m/z = 561,11 [M+H]; Sistema CL: Thermo Accela 1250 UHPLC; Sistema EM: Thermo l Cq Fleet; Columna: Kinetex 2,6 g XB-C18 100A, 50 X 4,6 mm; Disolventes: ACN con ácido acético al 0,1%, agua con ácido acético al 0,1%; Gradiente: 0 min-2,0 min 2-100 % ACN, 2,0 min-3,05 min 100 % ACN, 3,05 min-3,2 min 100 %-2 % ACN, 3,2 min-3,5 min 2 % ACN a 2 gl/min. HPLC: tR = 2,523 min; Sistema HPLC: Agilent serie 1100; Columna: Géminis 5g C18 110A, 50 X 4,6 mm; Disolventes: ACN con TFA al 0,1 %, Agua con TFA al 0,1 %; Gradiente: 0 min-5,0 min 2-98 % ACN, 5,0 min-6,0 min 98 % ACN a 2 mL/min.

Ejemplo de referencia 27. (2S)-ciclobutil 2-(((((2R.3S.4R.5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-ilo)-5-ciano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato (24)

[0265]

[0266] A continuación se describe la preparación de (2S)-ciclobutil 2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato.

Preparación de (2S)-ciclobutil 2-(((4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato

(Compuesto G)

[0267]

[0268] Se disolvió diclorofosfato de fenilo (1,49 mL, 10 mmol) en 10 mL de DCM anhidro y se agitó bajo atmósfera de nitrógeno en un baño de hielo. Se añadió clorhidrato de éster isobutílico de L-alanina (0,9 g, 5 mmol) en una porción. A continuación, se añadió gota a gota trietilamina (765 gL, 5,5 mmol). La reacción se agitó durante 1 h. Se añadió gota a gota más trietilamina (765 ml, 5,5 mmol) y la reacción se agitó durante 45 min. Se añadió p-nitrofenol (1,25 g, 9 mmol) en una porción y se agitó durante 30 min. Se añadió trietilamina (765 gL, 5,5 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 2 h a continuación, se añadieron más p-nitrofenol (1,25 g, 9 mmol) y trietilamina (765 gL, 5,5 mmol) y la reacción se agitó durante otras 2 h. La reacción de la mezcla fue concentrada a baja presión. El crudo resultante se diluyó con EtOAc y se lavó dos veces con una solución acuosa de ácido cítrico al 5%, seguido de una solución acuosa saturada de cloruro de sodio. Luego, la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo bruto se purificó con una columna de gel de sílice (0-20-50 % de EtOAc en hexanos) para dar el compuesto G (1,48 g, 70 % de rendimiento como una mezcla de diastereoisómeros). ¹H RMN (400 MHz, CD³OD) 58,33 - 8,23 (m, 2H), 7,52 - 7,33 (m, 4H), 7,33-7,17 (m, 3H), 4,96 -4,85 (m, 1H), 4,07 - 3,96 (m, 1H), 2,27 (m, 2H), 2,07 - 1,91 (m, 2H), 1,83 - 1,70 (m, 1H), 1,70 - 1,55 (m, 1H), 1,32 (m, 3H). ³¹P RMN (162 MHz, CD³OD) 5 -1,36, -1,59. EM m/z = 420,9 [M+H].

Preparación_________ (2S)-ciclobutil_________ 2-(((((2R.3S.4R.5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1,2.41triazin-7-il)-5-ciano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-² -il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato

(Compuesto 24)

[0269]

[0270] El compuesto 1 (58 mg, 0,2 mmol) se mezcló con el compuesto G (101 mg, 0,24 mmol) en 2 ml de DMF anhidra. Se añadió cloruro de magnesio (42 mg, 0,44 mmol) en una porción. La mezcla de reacción se calentó a 50 °C. Se añadió DIPEA (87 ml, 0,5 mmol) y la reacción se agitó durante 2 h a 50 °C. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc y se lavó con una solución acuosa de ácido cítrico al 5% seguido de una solución acuosa saturada de cloruro de sodio. Luego, la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo bruto se purificó con una columna de gel de sílice (0-2-5 % de MeOH en DCM) para proporcionar el compuesto 24 (42 mg, 37 % de rendimiento, como una mezcla de diastereoisómeros). 1H RMN (400 MHz, metanol-d4) 5 7,85 (m, 1H), 7,34 - 7,22 (m, 2H), 7,22 - 7,08 (m, 3H), 6,94 - 6,84 (m, 2H), 4,95 -4,85 (m, 1H), 4,79 (m, 1H), 4,46 - 4,34 (m, 2H), 4,34 - 4,24 (m, 1H), 4,19 (m, 1H), 3,81 (m, 1H), 2,27 (m, 2H), 2,01 (m, 2H), 1,84 - 1,68 (m, 1H), 1,62 (m, 1H), 1,30 - 1,16 (m, 3H). 31P RMN (162 MHz, CDaod) 53,70, 3,65. EM m/z = 573,0 [M+H].

Ejemplo de referencia 28. (2S)-isopropil 2-(((((2R.3S.4R.5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)-3-fenilpropanoato (25)

[0271]

[0272] La preparación de (2S)-isopropil 2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)-3-fenilpropanoato se describe a continuación.

Preparación de 2-(((4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)-3-fenilpropanoato de (2S)-isopropilo (Compuesto H)

[0273]

[0274] Se disolvió diclorofosfato de fenilo (718 gL, 4,8 mmol) en 10 mL de DCM anhidro y se agitó en atmósfera de nitrógeno en un baño de hielo. Se añadió hidrocloruro de éster isopropílico de L-fenilalanina (1 g, 4,1 mmol) en una porción. Se añadieron otros 10 ml de DCM anhidro. Se añadió gota a gota trietilamina (736 gL, 5,3 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 30 min. A continuación, se añadió gota a gota más trietilamina (736 gL, 5,3 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 30 min. A continuación, se añadió gota a gota trietilamina adicional (736 gL, 5,3 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 15 min. A continuación se añadió p-nitrofenol (600 mg, 4,32 mmol). A continuación se retiró el baño de hielo y la mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 2 h. Se añadieron más p-nitrofenol (50 mg) y trietilamina (736 gL, 5,3 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 h.

[0275] Después, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida, se diluyó con EtOAc y se lavó dos veces con una solución acuosa de ácido cítrico al 5 %, seguido de una solución acuosa saturada de cloruro de sodio. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a presión reducida. El crudo se purificó con columna de gel de sílice (0-15 % de EtOAc en hexanos) para dar el compuesto H (1,57 g, ^{6 8} % de rendimiento como una mezcla de diastereómeros). 1H RMN (400 MHz, CDCla) 58,17 (m, 2H), 7,38 - 7,13 (m, 10H), 7,13 - 7,02 (m, 2H), 4,95 (m, 1H), 4,31 (m, 1H), 3,69 (m, 1H), 3,02 (dd, J= 6,1, 1,8 Hz, 2H), 1,21 - 1,08 (m, ⁶ H). 31P RMN (162 MHz, cdCla) 5 -2,96, -2,98. EM m/z = 485,0 [M+H].

Preparación_____ de_____ (2S)-isopropil_____ 2-(((((2R.3S.4R.5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.41triazin-7-il)-5-ciano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)-3-fenilpropanoato (Compuesto 25)

[0276]

[0277] El Compuesto 1 (58 mg, 0,2 mmol) y el Compuesto H (116 mg, 0,24 mmol) se mezclaron y se añadió 2 ml de DMF anhidra. La mezcla de reacción se agitó en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. Se añadió gota a gota tBuMgCl 1M en THF (300 gL, 0,3 mmol) durante 3 minutos y después la mezcla de reacción se agitó durante 16 h. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con solución acuosa de ácido cítrico al 5%, solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio y luego solución acuosa saturada de cloruro de sodio. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo crudo se purificó con columna de gel de sílice (0-5 % de MeOH en DCM) para dar el compuesto 25 (40 mg, 32 % de rendimiento como una mezcla de diastereoisómeros). ¹H RMN (400 MHz, CD³OD) 5 7,84 (m, 1H), 7,27 - 7,08 (m, ⁸ H), 7,08 - 6,97 (m, 2H), ^{6 , 8 8} (m, 2H), 4,91 - 4,84 (m, 1H), 4,74 (m, 1H), 4,26 (m, 1H), 4,19 - 4,04 (m, 2H), 4,04 - 3,91 (m, 2H), 2,97 (m, 1H), 2,82 (m, 1H), 1,14 (m, 3H), 1,06 (m, 3H). ³¹P RMN (162 MHz, CD³OD) 53,63, 3,25. EM m/z = 637,0 [M+H].

Ejemplo de referencia 29. (S)-metil 2-(((S)-(((2R.3S.4R.SR)-5-(4-am¡nop¡rrolof2.1-f1f1.2.41tr¡az¡na-7-¡l)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato (26)

[0278]

[0279] La preparación de (S)-metil 2-(((S)-(((2R,3S,4R,SR)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-² -il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato es descrita abajo.

[0280] Se disolvió el compuesto 1 (100 mg, 0,34 mmol) en THF (2 mL) y se enfrió con un baño de agua con hielo. A continuación se añadió gota a gota lentamente t-BuMgCl 1 M (0,52 ml, 0,77 mmol). La mezcla resultante se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación se añadió el compuesto I (preparado según WO 2012142085, 219 mg, 0,52 mmol) en THF (2 mL) durante 5 min y la mezcla resultante se agitó durante 24 h a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc, se enfrió en un baño de hielo y agua, se lavó con NaHCO³ acuoso (2 mL), se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio y se concentró al vacío. La mezcla resultante se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH del 0 al 20 % en DCM) y HPLC preparatoria (acetonitrilo del 10 al 80 % en agua) para dar el Compuesto 26 (12 mg, ^{6 , 6} % como un solo diastereoisómero). ¹H RMN (400 MHz, CD³OD) 5 7,86 (s, 1H), 7,29 (dd, J= ⁸ ,⁶ , 7,2 Hz, 2H), 7,21 - 7,09 (m, 3H), 6,94-6,81 (m, 2H), 4,79 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,38 (ddq, J = 10,8, 5,3, 2,7 Hz, 2H), 4,33-4,23 (m, 1H), 4,18 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 3,86 (dq, J= 9,9, 7,1 Hz, 1H), 3,62 (s, 3H), 1,27 (dd, J = 7,2, 1,1 Hz, 3H). EM m/z = 533 (M+1)+.

Ejemplo de referencia 30. (S)-neopentilo 2-(((S)-(((2R.3S.4R.SR)-5-(4-am¡nop¡rrolo[2.1-f1[1.2.41triaz¡na-7-¡l)-5-c¡ano-3.4-d¡h¡drox¡tetrah¡drofuran-2-¡l)metox¡)(fenox¡)fosforil)am¡no)propanoato (27)

[0281]

[0282] A continuación se describe la preparación de (S)-neopentil 2-(((S)-(((2R,3S,4R,SR)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato.

[0283] Se disolvió el compuesto 1 (100 mg, 0,34 mmol) en THF (2 mL) y se enfrio en un baño de agua con hielo. A continuación se añadió gota a gota lentamente 1M tBuMgCl (0,52 ml, 0,77 mmol). La mezcla resultante se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación se añadió el compuesto J (preparado según WO2012075140, 248 mg, 0,52 mmol) durante 5 min y la mezcla resultante se agitó durante 24 h a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc, se enfrió en un baño de agua con hielo y se trató con NaHCO³ acuoso (2 mL), se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio y se concentró al vacío. La mezcla resultante se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH del 0 al 20 % en DCM) y HPLC preparatoria (acetonitrilo del 10 al 80 % en agua) para dar el compuesto 27 (12 mg, 10 % como un solo diastereoisómero). ¹H RMN (400 MHz, CD³OD) 57,86 (s, 1H), 7,36 - 7,24 (m, 2H), 7,23 - 7,10 (m, 3H), 6,96 - 6,85 (m, 2H), 4,78 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,38 (tdd, J = 10,0, 4,9, 2,5 Hz, 2H), 4,32 -4,24 (m, 1H), 4,17 (t, J= 5,6 Hz, 1H), 3,91 (dq, J= 9,8, 7,1 Hz, 1H), 3,81 (d, J= 10,5 Hz, 1H), 3,69 (d, J= 10,5 Hz, 1H), 1,31 (dd, J = 7,2, 1,1 Hz, 3H), 0,89 (s, 9H). EM m/z = 589 (M+1)+.

Ejemplo de referencia 31. (2S)-ciclopentilo 2-(((((2R.3S.4R.SR)-5-(4-am¡nop¡rrolo[2.1-f][1.2.41triaz¡n-7-¡l)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxO(fenoxi)fosforiDamino)propanoato (28)

[0284]

[0285] La preparación de (2S)-ciclopentil 2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-² -il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato se describe a continuación.

[0286] Se disolvió el compuesto 1 (100 mg, 0,34 mmol) en THF (2 mL) y se enfrió en un baño de agua con hielo. A continuación se añadió gota a gota lentamente 1M tBuMgCl (0,52 ml, 0,77 mmol). La mezcla resultante se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación se añadió el compuesto K (preparado según WO2012075140, 247 mg, 0,52 mmol) en THF (2 mL) durante 5 min y la mezcla resultante se agitó durante 24 h a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc, se enfrió en un baño de agua helada, se trató con NaHCO³ acuoso (2 mL), se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio y se concentró al vacío. La mezcla resultante se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH del 0 al 20 % en DCM) y HPLC preparatoria (acetonitrilo del 10 al 80 % en agua) para dar el ejemplo 28 (47 mg, 23 % como una mezcla 27:1 de diastereoisómeros). ¹H RMN (400 MHz, CD³OD) 5 7,85 (s, 1H), 7,33-7,22 (m, 2H), 7,14 (tdd, J = 7,6, 2,1, 1,1 Hz, 3H), 6,95 - 6,87 (m, 2H), 5,13 - 5,00 (m, 1H), 4,78 (d, J= 5,4 Hz, 1H), 4,48 -4,35 (m, 2H), 4,30 (ddd, J= 10,6, 5,7, 3,6 Hz, 1H), 4,19 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 3,78 (dq, J = 9,2, 7,1 Hz, 1H), 1,81 (dtd, J= 12,5, 5,9, 2,4 Hz, 2H), 1,74- 1,49 (m, ⁶ H), 1,21 (dd, J = 7,1, 1,2 Hz, 3H). EM m/z = 587 (M+1)+.

Ejemplo de referencia 32. (2S)-ciclohexil 2-(((((2R.3S.4R.SR)-5-(4-am¡nop¡rrolof2.1-f1f1.2.41tr¡az¡n-7-¡lo)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato (29)

[0287]

[0288] La preparación de (2S)-ciclohexil 2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-² -il) a continuación se describe metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato.

[0289] A una mezcla del compuesto 1 (50 mg, 0,343 mmol), compuesto M (preparado según US20130143835, 93 mg, 0,209 mmol) y MgCl² (24,5 mg, 0,257 mmol) en DMF (1 mL) se le añadió diisopropiletilamina. (0,075 mL, 0,43 mmol) gota a gota durante 5 min a 0 °C. La mezcla resultante se agitó a 50 °C durante 1 h a continuación, la mezcla de reacción se enfrió con un baño de agua con hielo, se trató con ácido cítrico 1 M (0,5 mL) y se purificó directamente mediante HPLC preparativa (0 a 70 % de ACN en agua) para producir el compuesto 29 (20 mg, 19 % como una mezcla de diastereómeros).

¹H RMN (400 MHz, CD³OD) 5 7,84 (s, 1H), 7,32 - 7,23 (m, 2H), 7,18 - 7,10 (m, 3H), 6,93 - 6,87 (m, 2H), 4,78 (d, J= 5,4 Hz, 1H), 4,67 (td, J= 8,7, 4,2 Hz, 1H), 4,48 -4,35 (m, 2H), 4,30 (ddd, J= 10,8, 5,7, 3,7 Hz, 1H), 4,20 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 3,88 - 3,71 (m, 1H), 1,83 - 1,63 (m, 4H), 1,58 - 1,46 (m, 1H), 1,46 - 1,24 (m, 5H), 1,24 (s, 3H). ³¹P RMN (162 MHz, CD³OD) 5 3,75. EM m/z = 601 (M+1)+

Ejemplo de referencia 33. Etil 2-(((((2R.3S.4R.SR)-5-(4-am¡nop¡rrolo[2.1-f1[1.2.41tr¡azin-7-¡l)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)-2-metilpropanoato (30)

[0290]

[0291] La preparación de 2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-² -il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)-² -metilpropanoato se describe a continuación.

Preparación de 2-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpropanoato de etilo

[0292]

[0293] Recoger trifenilfosfina (6,18 g, 25,00 mmol) en THF (30 mL). A continuación, cargue DIAD (4,92 ml, 25,00 mmol) y agite a temperatura ambiente durante 10 min. Disolver ácido 2-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpropanoico (5,08 g, 25,00 mmol) en THF (20 mL) y añadir a la mezcla de reacción seguido de la adición de etanol (2,19 ml, 37,49 mmol). Permita que la reacción se agite a temperatura ambiente durante 1 hora. Los disolventes se eliminaron a presión reducida y el crudo se recogió en Et²O:hexanos 1:1 (120 mL). Se filtró el óxido de trifenilfosfina sólido y se eliminó el disolvente a presión reducida. El crudo se recogió en una cantidad mínima de CH²Cl² y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice 0-50 % EtOAc/Hex para proporcionar etil 2-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpropanoato (2,71 g, 47 %). 1H RMN (400 MHz, cloroformo- d) 54,18 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 1,49 (s, ⁶ H), 1,43 (s, 9H), 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3H).

Preparación de clorhidrato de etil 2-amino-2-metilpropanoato

[0294]

[0295] Recoger 2-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpropanoato de etilo (2,71 g, 11,72 mmol) en CH²CL (25 mL) y añadir lentamente 4N HCl en dioxano (25 mmol) y agitarse a temperatura ambiente. A la hora, se determinó que la reacción se había completado por TLC. Los disolventes se eliminaron a presión reducida y el crudo se coevaporó con Et²O dos veces y luego se colocó a alto vacío para proporcionar clorhidrato de etil 2-amino-2-metilpropanoato (2,02 g, 102%). 1H RMN (400 MHz, DMSO) 58,70 (s, 3H), 4,18 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 1,46 (s, ⁶ H), 1,21 (t, J = 7,1 Hz, 3H).

Preparación de etil 2-metil-2-(((4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato

(Compuesto N)

[0296]

[0297] Recoger diclorofosfato de fenilo (0,97 ml, 6,50 mmol) y clorhidrato de etil 2-amino-2-metilpropanoato (1,09 g, 6,50 mmol) en CH²Cl² (50mL). Enfríe la mezcla de reacción a 0 °C y agregue lentamente TEA (1,75 ml, 12,45 mmol). Retire el baño frío y permita que la mezcla de reacción se agite a temperatura ambiente. Después de 2 h, se determinó que la adición del aminoácido estaba completa por 31P RMN. Cargar p-nitrofenol (0,860 g, 6,17 mmol) seguido de la adición de TEA (0,87, 7,69 mmol). Permita que la reacción se agite a temperatura ambiente. Después de 2 h, se determinó que la reacción se había completado por LCMS. La reacción se diluyó con Et²O y las sales de TEA*HCl se filtraron. El crudo se concentró y se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc al 0-50 %/Hex) para proporcionar el compuesto N (¹ ,79 g, ^{6 8} %). 1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 5 8,37 - 8,21 (m, 2H), 7,55 - 7,44 (m, 2H), 7,43 - 7,33 (m, 2H), 7,30 - 7,09 (m, 3H), 6,57 (d,J= 10,1 Hz, 1H), 3,99 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 1,39 (s, ⁶ H), 1,08 (t, J = 7,1 Hz, 3H). 31P RMN (162 MHz, DMSO efe) 5 -2,87. LC/MS: ír = 1,65 min, EM m/z = 408,97 [M+1]; Sistema CL: Thermo Accela 1250 UHPLC; Sistema EM: Thermo LCQ Fleet; Columna: Kinetex 2,6 m XB-C18 100A, 50 X 3,00 mm; Disolventes: Acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1 %, Agua con ácido fórmico al 0,1 %; Gradiente: 0 min-2,4 min 2-100 % ACN, 2,4 min-2,80 min 100 % ACN, 2,8 min-2,85 min 100 %-2 % ACN, 2,85 min-3,0 min 2 % ACN a 1,8 mL/min.

Preparación de 2-(((((2R.3S.4R.5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1,2.41triazin-7-il)-5-ciano 3,4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)-² -metilpropanoato

(Compuesto 30)

[0298]

[0299] Recoger el compuesto 1 ^{( 6 6} mg, 0,23 mmol) en NMP (2,0 mL). Enfríe la mezcla a 0 °C y agregue lentamente tBuMgCl (1,0 M en THF, 0,34 ml, 0,34 mmol). Permita que la reacción se agite a 0 °C durante 30 minutos, luego agregue una solución del compuesto N (139 mg, 0,34 mmol) disuelta en THF (1,0 mL). Retire el baño frío y coloque la reacción en un baño de aceite precalentado a 50 oC. Después de 2 h, la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se inactivó con ácido acético y metanol. El crudo se concentró y purificó por HPLC de fase inversa sin modificador para proporcionar el compuesto 30 (32 mg, 25 % como una mezcla de diastereoisómeros). 1H RMN (400 MHz, DMSO-efe) 57,89 (m, 3H), 7,31 (q, J = 8,1 Hz, 2H), 7,22 - 7,05 (m, 3H), 6,87 (d, J = 4,5, 1H), 6,80 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 6,27 (d, J= 11,7, 1H), 5,81 (d, J = 9,7, 1H), 5,35 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,64 (dt, J = 9,0, 5,6 Hz, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,11 (m, 1H), 4,04-3,90 (m, 3H), 1,39 - 1,23 (m, ⁶ H), 1,10 (t, J = 7,1, 3H). 31P RMN (162 MHz, DMSO-cfe) 82,45, 2,41. LC/MS: ír = 1,03 min, EM m/z = 561,03 [M+1]; Sistema CL: Thermo Accela 1250 UHp Lc ; Sistema EM: Thermo LCQ Fleet; Columna: Kinetex ^{2 , 6} m XB-C18 ^{1 0 0} A, 50 X 3,00 mm; Disolventes: Acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1 %, Agua con ácido fórmico al 0,1 %; Gradiente: 0 min-2,4 min 2-100 % ACN, 2,4 min-2,80 min 100 % ACN, 2,8 min-2,85 min 100 %-2 % ACN, 2,85 min-3,0 min 2 % ACN a 1,8 ml/min.

Ejemplo de referencia 34. Isopropil 2-(((((2R.3S.4R.SR)-5-(4-am¡nop¡rrolo[2.1-f][1.2.4]triaz¡n-7-¡l)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxO(fenoxi)fosforiDamino)-2-metilpropanoato (31)

[0300]

[0301] Se describe a continuación la preparación de isopropil 2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-ammopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)-2-metilpropanoato.

Preparación de isopropil 2-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpropanoato

[0302]

[0303] Recoger trifenilfosfina (6,17 g, 25,00 mmol) en THF (30 mL). A continuación, cargue DIAD (4,92 ml, 25,00 mmol) y agite a temperatura ambiente durante 10 min. Disolver ácido 2-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpropanoico (5,07 g, 25,00 mmol) en THF (20 mL) y añadir a la mezcla de reacción seguido de isopropanol (1,91 ml, 25,00 mmol). Permita que la reacción se agite a temperatura ambiente durante 1 hora. Los disolventes se eliminaron a presión reducida y el crudo se recogió en Et²O:hexanos 1:1 (120 mL). Se filtró el óxido de trifenilfosfina sólido y se eliminó el disolvente a presión reducida. El producto bruto se recogió en una cantidad mínima de CH²Cl² y se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc al 0-50 %/Hex) para proporcionar isopropil 2-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpropanoato (4,09 g, 67 %). 1H RMN (400 MHz, cloroformo- d) 55,03 (p, J = 6,2 Hz, 1H), 1,48 (s, ⁶ H), 1,40 (d, J= 6,2 Hz, 9H), 1,24 (d, J = 6,3 Hz, ⁶ H).

Preparación de clorhidrato de isopropil 2-amino-2-metilpropanoato

[0304]

[0305] Recoger isopropil 2-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpropanoato (4,09 g, 16,67 mmol) en CH²Cl² (50 mL) y añadir lentamente 4N HCl en dioxano (50 mmol) y agitarse a temperatura ambiente. A 1h, se determinó que la reacción se había completado por TLC. Los disolventes se eliminaron a presión reducida y el producto bruto se coevaporó dos veces con Et²O y luego se colocó a alto vacío para proporcionar clorhidrato de isopropil 2-amino-2-metilpropanoato (3,06 g, 101%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 58,61 (s, 3H), 4,96 (p, J = 6,2 Hz, 1H), 1,44 (s, ⁶ H), 1,22 (d, J = 6,2 Hz, ⁶ H).

Preparación de isopropil 2-metil-2-(((4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato

(Compuesto O)

[0306]

[0307] Absorber diclorofosfato de fenilo (0,83 ml, 5,58 mmol) y clorhidrato de 2-amino-2-metilpropanoato de isopropilo (1,01 g, 5,58 mmol) en CH²Cl² (50mL). Enfríe la mezcla de reacción a 0 °C y agregue lentamente TEA (1,61 ml, 11,45 mmol). Retire el baño frío y permita que la mezcla de reacción se agite a temperatura ambiente. Después de 2 h, se determinó que la adición del aminoácido estaba completa por ³¹P RMN. Cargar p-nitrofenol (0,74 g, 5,30 mmol) seguido de la adición de TEA (0,81, 5,84 mmol). Permita que la reacción se agite a temperatura ambiente. Después de 2 h, se determinó que la reacción se había completado por LCMS. La reacción se diluyó con Et²O y las sales de TEA*HCl se filtraron. El crudo se concentró y se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc al 0-50 %/Hex) para proporcionar el compuesto O (1,45 g, 62 %). ¹H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 58,42 - 8,19 (m, 2H), 7,55 - 7,43 (m, 2H), 7,39 (dd, J = ⁸ ,⁶ , 7,2 Hz, 2H), 7,30-7,12 (m, 3H), 6,53 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 4,82 (hept, J = 6,3 Hz, 1H), 1,38 (s, ⁶ H), 1,09 (d, J = 6,3, ⁶ H).

³¹P RMN (162 MHz, DMSO-ak) 5 -2,84. LC/MS: tR = 1,73 min, EM m/z = 422,92 [M+1]; Sistema c L: Thermo Accela 1250 UHPLC; Sistema EM: Thermo LCQ Fleet; Columna: Kinetex 2,6 g XB-C18 100A, 50 X 3,00 mm; Disolventes: Acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1 %, Agua con ácido fórmico al 0,1 %; Gradiente: 0 min-2,4 min 2-100 % ACN, 2,4 min-2,80 min 100 % ACN, 2,8 min-2,85 min 100 %-2 % ACN, 2,85 min-3,0 min 2 % ACN a 1,8 ml/min.

Preparación______ de______ isopropilo______ 2-(((((2R.3S.4R.5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.41triazin-7-il)-5-ciano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)-2-metilpropanoato (Compuesto 31)

[0308]

[0309] Recoger el compuesto 1 ^{( 6 6} mg, 0,23 mmol) en NMP (2,0 mL). Enfríe la mezcla a 0 °C y agregue lentamente tBuMgCl (1,0 M en THF, 0,57 ml, 0,57 mmol). Permita que la reacción se agite a 0 °C durante 30 minutos, luego agregue una solución del compuesto O (143 mg, 0,34 mmol) disuelto en THF (1,0 mL). Retire el baño frío y coloque la reacción en un baño de aceite precalentado a 50 °C. Después de 2 h, la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se inactivó con ácido acético y metanol. El crudo se concentró y purificó por HPLC de fase inversa sin modificador para proporcionar el compuesto 31 (48 mg, 37 % como una mezcla de diastereoisómeros). 1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 57,88 (m, 3H), 7,30 (td, J= 8,5, 7,0 Hz, 2H), 7,20-7,04 (m, 3H), 6,87 (d, J= 4,5, 1H), 6,80 (d, J= 4,5 Hz, 1H), 6,27 (d, 6,1 Hz, 1H), 5,75 (t, J= 9,1 Hz, 1H), 5,34 (d, J= 5,7 Hz, 1H), 4,81 (p, J = 6,3 Hz, 1H), 4,71 -4,50 (m, 1H), 4,23 (m, 2H), 4,11 (m, 1H), 4,03 -3,83 (m, 1H), 1,37 - 1,23 (m, ⁶ H), 1,18 - 1,04 (m, ⁶ H). 31P RMN (162 MHz, dmso) 5 2,47, 2,43. LC/MS: tR = 1,08 min, EM m/z = 575,06 [M+1]; Sistema CL: Thermo Accela 1250 UHPLC; Sistema EM: Thermo Lc Q Fleet; Columna: Kinetex 2,6 g XB-C18 100a , 50 X 3,00 mm; Disolventes: Acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1 %, Agua con ácido fórmico al 0,1 %; Gradiente: 0 min-2,4 min 2-100 % ACN, 2,4 min-2,80 min 100 % ACN, 2,8 min-2,85 min 100 %-2 % ACN, 2,85 min-3,0 min 2 % ACN a ^{1 , 8} ml/min.

Ejemplo 35. (S)-2-etilbutil 2-(((S)-(((2R.3S.4R.SR)-5-(4-am¡nop¡rrolo[2.1-f][1.2.4]tr¡azin-7-¡l)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato (32)

[0310]

[0311] La preparación de (S)-2-etilbutil 2-(((S)-(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-amopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-² -il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino) propanoato se describe a continuación.

Preparación de (3R.4R.5R)-3.4-bis(benciloxi)-5-((benciloxi)metil)dihidrofuran-2(3H)-ona.

[0312]

[0313] (3R,4R,5R)-3,4-bis(benciloxi)-5-((benciloxi)metil)tetrahidrofuran-2-ol (15,0 g) se combinó con MTBE (60,0 mL), KBr (424,5 mg), solución acuosa de K²HPO⁴ (2,5 M, 14,3 mL) y TEMPO (56 mg). Esta mezcla se enfrió a aproximadamente 1 °C. La solución acuosa de lejía (7,9% en peso) se cargó lentamente en porciones hasta el consumo completo del material de partida como se indicó a través de una prueba de almidón/yoduro. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con MTBE. La fase orgánica combinada se secó sobre MgSO4 y se concentró a presión reducida para dar el producto como un sólido.

Preparación (4-amino-7-vodopirrolof2.1-f1f1.2.41triazina)

[0314]

[0315] A una solución fría de 4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]-triazina (10,03 g; 74,8 mmol) en N,N-dimetilformamida (70,27 g), N-yodosuccinimida (17,01 g; 75,6 mmol) se cargó en porciones, mientras se mantenía el contenido a aproximadamente 0 °C. Una vez completada la reacción (alrededor de 3 h a aproximadamente 0 °C), la mezcla de reacción se transfirió a una solución acuosa de hidróxido de sodio 1 M (11 g de NaOH y 276 ml de agua) mientras se mantenía el contenido a aproximadamente 20-30 °C. La suspensión resultante se agitó a aproximadamente 22 °C durante 1,5 horas y luego se filtró. Los sólidos se enjuagan con agua (50 mL) y se secan a aproximadamente 50 °C al vacío para producir 4-amino-7-yodopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina como un sólido. ¹H RMN (400 MHz, DMSO-d⁶) 57,90 (s, ¹ H), 7,78 (br s, ² H), 6,98 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 4,4 Hz, 1H). ¹³C RMN (101 MHz, DMSO-d⁶) 5 155,7, 149,1, 118,8, 118,1, 104,4, 71,9. EM m/z = 260,97 [M+H].

Preparación (3R.4R.5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f1[1.2.41triazin-7-il)-3.4-bis(benciloxi)-5-((benciloxi)metil)tetrahidrofuran-2-01 vía (4-amino-7-vodopirrolo[2.1-f1[1.2.41triazina)

[0316]

[0317] En un reactor bajo atmósfera de nitrógeno se cargó yodobase 2 (81 g) y THF (1,6 LV). La solución resultante se enfrió a aproximadamente 5 °C y se cargó TMSCl ^{( 68} g). A continuación, se cargó lentamente PhMgCl (345 mL, 1,8 M en THF) mientras se mantenía una temperatura interna de aproximadamente < 5°C. La mezcla de reacción se agitó a alrededor de 0 °C durante 30 min y luego se enfrió a alrededor de -15 °C. /'PrMgCl-LiCl (311 ml, 1,1 M en THF) se cargó lentamente mientras se mantenía una temperatura interna por debajo de aproximadamente -12 °C. Después de aproximadamente 10 minutos de agitación a aproximadamente -15 °C, la mezcla de reacción se enfrió a aproximadamente -20 °C y se cargó una solución de lactona 1 (130 g) en THF (400 mL). A continuación, la mezcla de reacción se agitó a aproximadamente -20 °C durante aproximadamente 1 hora y se inactivó con AcOH (57 mL). La mezcla de reacción se calentó a aproximadamente ⁰ °C y se ajustó a pH 7-8 con NaHCO³ acuoso (5% en peso, 1300 mL). A continuación, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (1300 mL) y las capas orgánica y acuosa se separaron. La capa orgánica se lavó con 1N HCl (1300 mL), NaHCO³ acuoso (5 % en peso, 1300 mL) y salmuera (1300 mL), y luego se secó sobre Na²SO⁴ anhidro y se concentró a sequedad. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice usando un gradiente que constaba de una mezcla de MeOH y EtOAc proporcionó el producto.

Preparación ((2S)-2-etilbutil 2-(((perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato) (mezcla de Sp y Rp):

[0318]

[0319] Clorhidrato de éster L-alanina 2-etilbutílico (5,0 g, 23,84 mmol) se combinó con cloruro de metileno (40 mL), se enfrió hasta aproximadamente -78 °C y se añadió diclorofosfato de fenilo (3,65 ml, 23,84 mmol). Se añadió trietilamina (^{6 , 6} mL, 47,68 mmol) durante aproximadamente 60 min a aproximadamente -78 °C y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. La mezcla de reacción se enfrió a alrededor de 0 °C y se añadió pentafluorofenol (4,4 g, 23,84 mmol). Se añadió trietilamina (3,3 mL, 23,84 mmol) durante aproximadamente 60 min. La mezcla se agitó durante aproximadamente 3 ha temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en EtOAc, se lavó varias veces con una solución acuosa de carbonato de sodio y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice usando un gradiente de EtOAc y hexanos (0 a 30%). Las fracciones que contenían el producto se concentraron a presión reducida para dar (2S)-2-etilbutil 2-(((perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato en forma de un sólido. 1H RMN (400 MHz, cloroformo-d) 57,41 - 7,32 (m, 4H), 7,30 - 7,17 (m, ⁶ H), 4,24 - 4,16 (m, 1H), 4,13 - 4,03 (m, 4H), 4,01 - 3,89 (m, 1H), 1,59 - 1,42 (m, ⁸ H), 1,40 - 1,31 (m, ⁸ H), 0,88 (t, J = 7,5 Hz, 12H). 31P RMN (162 MHz, cloroformo) 5 -1,52. 19F r Mn (377 MHz, cloroformo-d)

5 -153,63, -153,93 (m), -160,05 (td, J = 21,9, 3,6 Hz), -162,65 (qd, J = 22,4, 20,5, 4,5 Hz). EM m/z = 496 [M+H].

Preparación del compuesto del título (mezcla de Sp y Rp)

[0320]

[0321] El nucleósido (29 mg, 0,1 mmol) y la fosfonamida (60 mg, 0,12 mmol) y N,N-dimetilformamida (2 mL) se combinaron a temperatura ambiente. Se añadió lentamente cloruro de ferc-butilmagnesio (1 M en THF, 0,15 mL). Después de aproximadamente 1 h, la reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con solución acuosa de ácido cítrico (5% en peso), solución acuosa saturada de NaHCO³ y solución saturada de salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na²SO⁴ y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice usando un gradiente de metanol y CH²Cl² (0 a 5%). Las fracciones que contenían el producto se concentraron a presión reducida para proporcionar el producto.

Preparación de (3aR.4R.6R.6aR)-4-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.41triazin-7-il)-6-(hidroximetil)-2.2-dimetiltetrahidrofuro[3.4-d][1.31dioxol-4-carbonitrilo:

[0322]

[0323] A una mezcla de (2R,3R,4S,5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazin-7-il)-3,4-dihidroxi-5 (hidroximetil)tetrahidrofuran-2-carbonitrilo (5,8 g, 0,02 mol), 2,2-dimetoxipropano (11,59 ml, 0,09 mol) y acetona (145 mL) a temperatura ambiente se le añadió ácido sulfúrico (18M, 1,44 mL). La mezcla se calentó a aproximadamente 45 °C. Después de aproximadamente 30 min, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se añadieron bicarbonato de sodio (5,8 g) y agua (5,8 mL). Después de 15 min, la mezcla se concentró a presión reducida. El residuo se recogió en acetato de etilo (150 mL) y agua (50 mL). La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 50 mL). La fase orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida para dar (2R,3R,4S,5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f][¹.2.4]triazin-7-il)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetil)tetrahidrofuran-2-carbonitrilo crudo. ¹H RMN (400 MHz, CD³OD) 57,84 (s, 1H), 6,93 (d, J= 4,6 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 5,40 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 5,00 (dd, J = 6,7, 3,3 Hz, 1H), 4,48 - 4,40 (m, 1H), 3,81 - 3,72 (m, 2H), 1,71 (s, 3H), 1,40 (s, 3H). EM m/z = 332,23 [M+1].

Preparación_____de_____ (2S)-2-etilbutil____ 2-(((((2R.3S.4R.5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f1M ,2.41triazin-7-ilo)-5-ciano-3.4-dihidroxitetrahidrofuran-² -il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato:

[0324]

[0325] Se combinó acetonitrilo (100 mL) con (2S)-2-etilbutil 2-(((4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforil)-amino)propanoato (9,6 g, 21,31 mmol), el sustrato alcohol (^{6 , 6} g, 0,02 mol), cloruro de magnesio (1,9 g, 19,91 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó durante aproximadamente 15 min y se añadió W,W-diisopropiletilamina (8,67 ml, 49,78 mmol). Después de aproximadamente 4 h, la reacción se diluyó con acetato de etilo (100 mL), se enfrió a aproximadamente 0 °C y se combinó con una solución acuosa de ácido cítrico (5% en peso, 100 mL). La fase orgánica se lavó con solución acuosa de ácido cítrico (5 % en peso, 100 mL) y solución acuosa saturada de cloruro de amonio (40 mL), solución acuosa de carbonato de potasio (10 % en peso, 2 x 100 mL) y salmuera acuosa saturada. solución (100 mL). La fase orgánica se secó con sulfato de sodio y se concentró a presión reducida para proporcionar el producto bruto. ¹H RMN (400 MHz, CD³OD) 57,86 (s, 1H), 7,31 - 7,22 (m, 2H), 7,17 - 7,09 (m, 3H), 6,93 - 6,84 (m, 2H), 5,34 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 4,98 (dd, J = ⁶ ,⁶ , 3,5 Hz, 1H), 4,59 - 4,50 (m, 1H), 4,36 - 4,22 (m, 2H), 4,02 (dd, J = 10,9, 5,7 Hz, 1H), 3,91 (dd, J= 10,9, 5,7 Hz, 1H), 3,83 (dq, J = 9,7, 7,1 Hz, 1H), 1,70 (s, 3H), 1,50-1,41 (m, 1H), 1,39 (s, 3H), 1,36 - 1,21 (m, 7H), 0,86 (t, J= 7,4 Hz, ⁶ H). EM m/z = 643,21 [M+1].

Preparación de (S)-2-etilbutil 2-(((S)-(((2R.3S.4R.5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f1[1 .2.41triazina-7-il)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato (Compuesto 32)

[0326]

[0327] El acetónido bruto (12,85 g) se combinó con tetrahidrofurano (50 mL) y se concentró a presión reducida. El residuo se recogió en tetrahidrofurano (100 mL), se enfrió a aproximadamente 0 °C y se añadió lentamente HCl concentrado (20 mL). La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente. Después del consumo del acetónido de partida como indica el análisis de HPLC, se añadió agua (100 mL) seguido de solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (200 mL). La mezcla se extrajo con acetato de etilo (100 mL), la fase orgánica se lavó con solución acuosa saturada de salmuera (50 mL), se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice usando un gradiente de metanol y acetato de etilo (0 a 20%). Las fracciones que contenían el producto se concentraron a presión reducida para proporcionar el producto.

B. Actividad antiviral

[0328] Si se desea, la actividad antivirus de un compuesto para usar de acuerdo con la invención después de la aplicación de la composición se puede observar mediante cualquier método, incluidos los métodos directos e indirectos para detectar dicha actividad. Se contemplan todos los métodos cuantitativos, cualitativos y semicuantitativos para determinar tal actividad. Por lo general, se aplica uno de los métodos de detección descritos anteriormente, sin embargo, también es aplicable cualquier otro método, como la observación de las propiedades fisiológicas de un organismo vivo.

[0329] La actividad antiviral de un compuesto para usar de acuerdo con la invención se puede medir usando la detección estándar protocolos que son conocidos. Por ejemplo, la actividad antiviral de un compuesto se puede medir utilizando los siguientes protocolos generales:

Ejemplo de referencia 36. Ensayos de citotoxicidad y actividad antiviral del virus Lassa y el virus Junín

[0330] La actividad antiviral del compuesto 1, Compuesto 9 y Compuesto 32 se midió frente a Virus Lassa (LASV) y virus Junín (JUNV). Todos los estudios realizados con virus de tipo salvaje se realizaron en contención de nivel 4 de bioseguridad (BSL-4) en el Instituto de Investigación Médica de Enfermedades Infecciosas del Ejército de EE. UU. (USAMRIID). Los ensayos antivirales realizados con una cepa atenuada de JUNV se realizaron en la Universidad Estatal de Utah en un laboratorio BSL-2. Los ensayos antivirales del virus Lassa se realizaron con células HeLa. Los ensayos antivirales del virus Junín se realizaron en células Vero y HeLa.

[0331] Se realizaron ensayos antivirales en placas de 384 o 96 pocillos en contención BSL-4 utilizando un sistema de formación de imágenes de alto contenido para cuantificar la producción de antígeno viral como medida de la replicación viral. Se incluyeron en cada placa un control "sin virus" (Columna 2) y un control "DMSO al 1%" (Columna 3) para determinar la señal de replicación del virus al 0% y al 100%, respectivamente. Los anticuerpos primarios utilizados para la detección de antígenos virales fueron mm L52-161-6 anti-GP; LASV y mm Y-GQC03_BF11 anti-GP; se utilizó Ju Nv y DyLight 488 anti-ratón-IgG como anticuerpo de detección secundario. El anticuerpo primario se diluyó 1000 veces en tampón de bloqueo (13PBS con BSA al 3 %) y se añadió a cada pocillo de la placa de ensayo. Las placas de ensayo se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el anticuerpo primario y se lavaron las células 3 veces con 13PBS. El anticuerpo secundario se diluyó 1000 veces en tampón de bloqueo y se añadió a cada pocillo de la placa de ensayo. Las placas de ensayo se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente. Los núcleos se tiñeron usando Draq5 (Biostatus, Shepshed Leicestershire, RU, Cat# DR05500) diluido en 13PBS. Las imágenes de las células se adquirieron usando el microscopio confocal Perkin Elmer Opera (Perkin Elmer, Waltham, MA) usando un objetivo de aire 10x para recolectar cinco imágenes por pocillo. El antígeno específico del virus se cuantificó midiendo la emisión de fluorescencia a una longitud de onda de 488 nm y los núcleos se cuantificaron midiendo la emisión de fluorescencia a una longitud de onda de 640 nm. Los valores de Z' para todos los ensayos antivirales fueron > 0,3.

[0332] Se calculó el porcentaje de inhibición para cada concentración ensayada en relación con los controles de inhibición del 0 % y el 100 % y se determinó el valor de CE⁵⁰ para cada Compuesto mediante regresión no lineal como la concentración eficaz del compuesto que inhibía la replicación del virus en un 50 %.

Ejemplo de referencia 37. Ensayo del virus Junín - Vero

[0333] Se sembraron células Vero o Vero E⁶ en placas de 96 pocillos a razón de 20.000 células por pocillo en 100 ul de MEM FBS al 2 %. Los compuestos diluidos en DMSO se mezclaron con 120 uL de MEM+2% FbS. Se transfieren 100 uL de cada Compuesto de ensayo a 2 pocillos de una placa de 96 pocillos. Se añaden 20 uL de solución de virus en MEM+20% FBS para que las concentraciones finales de ensayo sean 47, 4,7, 0,47, 0,047 uM y la multiplicidad de infección sea de 0,003 pfu/célula. Las placas de prueba se incubaron hasta que los controles de virus no tratados se acercaron a los efectos citopáticos máximos (CPE) (5 a 7 días). Luego, las placas se tiñen con tinte rojo neutro durante 2 horas, luego se eluyen en tampón de citrato/etanol y se leen en un espectrofotómetro a 540 nm. El valor de CE⁵⁰ se calcula mediante análisis de regresión como la concentración de compuesto de prueba requerida para reducir el CPE inducido por virus en un 50 % medido mediante tinción con rojo neutro.

Ejemplo de referencia 38. Ensayo del virus Junín - HeLa

[0334] Se sembraron células HeLa a razón de 2000 células por pocillo en una placa de 384 pocillos y se añadieron compuestos a las placas de ensayo como se describe en la sección 3,2,1. Las placas de ensayo se transfirieron al conjunto BSL-4 y se infectaron con 0,3 pfu por célula JUNV, lo que dio como resultado que ~50 % de las células expresaran antígeno viral en un período de 48 h. Las placas de ensayo se incubaron durante 48 h y la replicación del virus se cuantificó mediante inmuno-tinción usando anticuerpos que reconocían las glicoproteínas virales.

Ejemplo de referencia 39. Ensayo de virus Lassa

[0335] Se sembraron células HeLa a razón de 2000 células por pocillo en una placa de 384 pocillos y se añadieron compuestos a las placas de ensayo como descrito en la sección 3.2.1. Las placas de ensayo se transfirieron a la suite BSL-4 y se infectaron con 0,1 ufp por célula LASV, lo que dio como resultado que > 60 % de las células expresaran el antígeno del virus en un período de 48 horas. Las placas de ensayo se incubaron durante 48 horas y la replicación del virus se cuantificó mediante inmunotinción utilizando anticuerpos que reconocían las glicoproteínas virales.

Tabla 2: Ensayos antivirales del virus Lassa y el virus Junín

Tabla 2: Actividad antiviral in vitro de los compuestos 1,9 y 32 contra arenavirus

JUNV = virus Junín, LASV = virus Lassa

Ejemplo 40. Ensayos de citotoxicidad y actividad antiviral de MERS-CoV y SARS-CoV

[0336] Se midió la actividad antiviral del Compuesto 9 y el Compuesto 32 contra el virus MERS (MERS-CoV) y el virus del SARS (SARS-CoV).

[0337] Los ensayos antivirales se realizaron en USAMRIID y la Universidad de Carolina del Norte en Chape1Hill.

Ejemplo 41. Ensayo antiviral MERS-CoV (USAMRIID)

[0338] Se añadieron células Vero E⁶ sembradas en placas de 384 pocillos y diluciones en serie del Compuesto 32 o el compuesto 9 a las placas de ensayo mediante valoración directa utilizando un dispensador digita1HP D300 (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA). Las placas se transfirieron al conjunto BSL-4 y se infectaron con MERS-CoV (Cepa Jordan N3) a una multiplicidad de infección de 0,5 unidades formadoras de placa (ufp) por célula. Los cultivos infectados se incubaron durante 48 horas. El nivel de replicación del virus en los cultivos tratados con el compuesto y los tratados con el vehículo de control se determinó cuantificando el nivel de antígeno específico del virus después de la inmunotinción con el anticuerpo contra la proteína de la punta (S) del MERS-CoV. El anticuerpo primario (40069-RP02 rb - espícula viral(S) HCoVEMC/2012) se diluyó 1000 veces en tampón de bloqueo (solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1 x con BSA al 3 %) y se añadió a cada pocillo de la placa de ensayo. Las placas de ensayo se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el anticuerpo primario y se lavaron las células 3 veces con PBS 1x. El anticuerpo de detección secundario fue una IgG anti-conejo conjugada con Dylight488 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Cat# 405310). El anticuerpo secundario se diluyó 1000 veces en tampón de bloqueo y se añadió a cada pocillo de la placa de ensayo. Las placas de ensayo se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente. Los núcleos se tiñeron usando Draq5 (Biostatus, Shepshed Leicestershire, RU, Cat# DR05500) diluido en 13PBS. Las células se tiñeron en contraste con CellMask Deep Red (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Cat# C10046) para mejorar la detección del compartimiento del citoplasma. Las imágenes de las células se adquirieron usando el microscopio confocal Perkin Elmer Opera (Perkin Elmer, Waltham, MA) usando un objetivo de aire 10x para recolectar 5 imágenes por pocillo. El antígeno específico del virus se cuantificó midiendo la emisión de fluorescencia a una longitud de onda de 488 nm y los núcleos se cuantificaron midiendo la emisión de fluorescencia a una longitud de onda de 640 nm. Se realizó un análisis de imágenes de alto contenido para cuantificar el porcentaje de células infectadas y la viabilidad celular. El análisis de la respuesta a la dosis para determinar los valores de CE⁵⁰ se realizó utilizando el software GeneData Screener aplicando el algoritmo de Levenberg-Marquardt para la estrategia de ajuste de curvas.

Ejemplo 42. Ensayo antiviral de MERS-CoV y SARS-CoV

[0339] Se cultivaron cultivos de células HAE aisladas de tejido pulmonar durante ⁶ semanas en la interfaz aire-líquido para promover la diferenciación. Las superficies apicales de los cultivos de HAE se lavaron 24 h y 1 h antes de la infección con 13 PBS durante >1 hora a 37 °C. La proteína fluorescente roja que expresa MERS-CoV recombinante (MERS-CoV RFP) y la proteína fluorescente verde que expresa SARS-CoV (SARS-CoV GFP) se usaron para infectar apicalmente los cultivos de HAE diferenciados en una multiplicidad de infección de 0,1 ufp por célula. Para infectar los cultivos de HAE, se eliminaron los lavados apicales, se añadió inoculo viral y los cultivos inoculados se incubaron a 37 °C durante 2,5 horas. Se eliminó el inóculo y las superficies apicales de los cultivos de HAE se lavaron 3 veces con 500 pL de 1x PBS para eliminar el virus residual. Se prepararon por triplicado cinco diluciones en serie de 3 veces del compuesto 9 a partir de 10 pM y se añadieron a medio HAE ALI en el lado basolateral del cultivo aproximadamente 30 minutos antes de la infección. La replicación del virus se evaluó mediante imágenes de fluorescencia de cultivos celulares después de una incubación de 48 horas. Además, la replicación del virus se cuantificó midiendo la producción de virus infecciosos en lavados apicales de HAE mediante un ensayo de placas en monocapas de células Vero y cuantificando la producción de ARN viral a partir del ARN celular total mediante un ensayo de PCR en tiempo real.

Tabla 3: Ensayos antivirales de MERS

Tabla 3: Actividad Antiviral In Vitro del Compuesto 32 contra coronavirus

Ejemplo 43. Ensayo de PCR en tiempo real de MERS-CoV y SARS-CoV

[0340] A las 48 horas después de la infección, los cultivos de HAE primario del ensayo antiviral descrito anteriormente se recolectaron en 500 pL de TRIzol. El ARN se purificó utilizando un kit Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research Corporation, Irvine, CA, EE. UU.). Se generó ADNc de primera cadena para cada muestra utilizando SuperScript III (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.) con incubación a 55 °C. Después de la generación de ADNc de primera cadena, ORF1 (ARN del genoma) y ORF⁸ u ORF9 (ARN subgenómico de MERS-CoV y SARS-CoV, respectivamente) se cuantificaron mediante PCR en tiempo real utilizando los siguientes cebadores: MERS-CoV: de avance líder (5'-GAA TAG CTT GGC TAT CTC AC -3'), ORF1 inversa (5'- CAC AAT CCC ACC AGA CAA -3'), ORF⁸ Inversa (5'- TTG TTA TCG GCA AAG GAA AC -3'); y SARS-CoV: de avance líder (5'- AGC CAA CCA ACC TCG ATC TCT TGT -3'), ORF1 inversa (5'-TGA CAC CAA GAA CAA GGC TCT CCA -3'), ORF9 inversa (5'- ATT GGT GTT GAT TGG AAC GCC CTG -3'). Las lecturas se normalizaron a GAPDH utilizando los siguientes cebadores: GAPDH de avance (5'- TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC -3') y GAPDH inversa (5'- GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG -3'). Los resultados se expresan como cambios de pliegue log 10 en el número de copias de ARN codificante de ORF1 y ORF⁸ viral (MERS-CoV) y ARN codificante de ORF9 (SARS-CoV) en células tratadas frente a células no tratadas utilizando el método AACt {10431}.

Ejemplo 44. Eficacia in vitro en células Calu-3 2B4

[0341] 48 horas antes de la infección, se sembraron células Calu-3 2B4 en una placa de fondo transparente de paredes negras de 96 pocillos a 5 x 104 células/pocillo. 24 horas antes de la infección, se reemplazó el medio de cultivo. Se diluyó en serie una reserva 20 mM del Compuesto 32 en DMSO al 100 % en incrementos de 3 veces para obtener una serie de dilución de diez puntos. MERS-nLUC se diluyó en DMEM 10 % FBS y 1 % de antibióticos/antimicina para lograr una multiplicidad de infección (MOI) de 0,08. Las células se infectaron por triplicado por dilución de fármaco durante 1 h, después de lo cual se aspiró el virus, los cultivos se enjuagaron una vez y se añadió medio fresco que contenía fármaco o vehículo. A las 48 horas después de la infección, se cuantificó la replicación del virus en un lector de placas Spectramax (Molecular Devices) mediante un ensayo de nano-luciferasa (Promega) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para nuestro control de inhibición del 100 %, se expuso MERS-nLUC diluido a luz ultravioleta de onda corta (LLC, Upland, CA) durante ⁶ minutos para inhibir la capacidad de replicación del virus. Para nuestro control de inhibición del 0%, las células se infectaron en presencia de vehículo. El DMSO se mantuvo constante en todas las condiciones al 0,05 % en volumen (v/v). Los valores de pocillos triplicados por condición se promediaron y compararon con los controles para generar un valor de inhibición porcentual para cada dilución de fármaco. El valor CE⁵⁰ se definió como la concentración a la que hubo una disminución del 50% en la replicación viral. Los datos se analizaron utilizando GraphPad Prism 6.0 (La Jolla, CA). Los valores de CE⁵⁰ y CC⁵⁰ se calcularon mediante un análisis de regresión no lineal utilizando la ecuación dosis-respuesta (pendiente variable) (ecuación logística de cuatro parámetros): Y = Inferior (Superior-Inferior)/(¹ + ^{1 0} A((LogCE5ü-X)*HillSlope)). Los valores "Inferior" y "Superior" están definidos por los valores Y mínimo y máximo. La pendiente de la colina es un parámetro utilizado para definir la pendiente de una curva de dosis-respuesta. Los valores CE50 y CC50 se calcularon como un promedio de dos a cuatro experimentos independientes.

Tabla 4: Actividad antiviral del Compuesto 1 y el Compuesto 32 contra MERS-CoV y SARS-CoV y citotoxicidad.

Ejemplo 45. Evaluación del compuesto subcutáneo 32 contra el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) en ratones deficientes en esterasa (C eslc-/-)

[0342] Ratones machos y hembras (25-28 semanas) genéticamente delecionados para carboxilesterasa 1C (Ces1c-l-) (Jackson Laboratories stock 014096). Se usaron ratones (Ces1c-l-) ya que los roedores expresan altos niveles de actividad carboxilesterasa en plasma en relación con otras especies animales, lo que reduce la vida media plasmática del Compuesto 32. La eliminación genética de la carboxilesterasa 1C mejoró la estabilidad plasmática del Compuesto 32 generando perfiles farmacocinéticos similares a los observados en humanos y otras especies animales.

[0343] El diseño del estudio se captura en la Tabla 4. Los estudios de eficacia se realizaron en una instalación de bioseguridad animal de nivel 3 (ABSL3). Todo el trabajo se realizó bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en UNC Chapel Hill de acuerdo con las pautas establecidas por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC) y el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA).

Tabla 4: Diseño Experimental (Inyección Subcutánea)

[0344] Los Grupos 1 (vehículo), Grupo 2 (Compuesto 32 BID 25 mg/kg) y Grupo 3 (Compuesto 32 QD 50 mg/kg) se anestesiaron con ketamina/xilazina expuestos a 104 ufp de SARS-CoV/50ul a través del vía intranasal. El Grupo 4 (Vehículo) y el Grupo 5 (Compuesto 32 BID 25 mg/kg) permanecieron sin infectar y se usaron como controles para evaluaciones de pletismografía de cuerpo completo. El vehículo comprendía sulfobutiléter-p-ciclodextina al 12% en agua (con HCl/NaOH) a pH 5,0). El día 0, los animales fueron expuestos al virus. En los días 2 y 5 posteriores a la infección, grupos de animales fueron sacrificados por sobredosis de isofluorano y el lóbulo izquierdo grande del pulmón se colocó en un tubo con tapón de rosca de 2 mL con 1 mL de DPBS con perlas de vidrio y se congeló a -80 °C hasta que se analizó por ensayo de placa El lóbulo inferior derecho se colocó en formalina tamponada al 10% y se almacenó a 4 °C hasta el análisis histológico.

[0345] Los cambios en la función pulmonar se determinaron mediante pletismografía de cuerpo entero (WBP, sistema de prueba de función pulmonar Buxco, Data Sciences International). Después de una aclimatación de 30 minutos en la cámara del pletismógrafo, se midieron continuamente ¹¹ respuestas respiratorias y varias métricas de control de calidad cada 2 segundos durante 5 minutos para un total de 150 puntos de datos. Los valores medios de cada parámetro se determinaron con el software DSI Finepoint.

[0346] El análisis histológico se realizó en muestras fijadas con formalina y tejidos embebidos en parafina con 5 pm. Para evaluar la patología pulmonar, las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina. El antígeno viral en el pulmón se tiñó usando un anticuerpo policlonal anti-nucleocápside (Imgenex). Los portaobjetos se cegaron al evaluador y se evaluaron para determinar la patología pulmonar asociada al virus, así como la ubicación espacial y la prevalencia del antígeno viral. Las imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio Olympus BX41 equipado con una cámara Olympus DP71.

[0347] Se usó el ensayo de placas virales para cuantificar virus infecciosos de tejido pulmonar congelado. Se sembraron células Vero E⁶ en placas de ⁶ pocillos a razón de 5 x 10⁵ células/pocillo. El tejido pulmonar se descongeló, se homogeneizó mediante Roche Magnalyzer y la suspensión de tejido se diluyó en serie y las diluciones se usaron para infectar las células Vero E⁶. A las 72 h después de la infección, las placas se fijaron y tiñeron y se cuantificó el número de placas mediante inspección visual.

[0348] El criterio principal de valoración para este estudio fue la carga viral en el tejido pulmonar en el día 5 después de la infección. Los criterios de valoración adicionales incluyeron cambios en el peso corporal del animal y la función pulmonar. El peso corporal del animal se registró diariamente durante la fase de vida. En los días -1, 1,2, 3 y 5 después de la inoculación, se realizó una pletismografía de cuerpo completo para evaluar la función pulmonar. El Día 5, se realizó una necropsia programada en todos los animales restantes; la patología pulmonar macroscópica fue evaluada por un patólogo veterinario certificado por la junta. Se recogió tejido pulmonar para análisis histopatológico y virológico.

[0349] Peso corporal y carga viral: Los cambios en el peso corporal y la carga viral tisular para cada grupo de estudio en el día 5 se muestran en la FIG. 1, FIG. 2A y FIG. 2B. Como se muestra en la FIG. 1, los animales tratados con el Compuesto 32 no mostraron evidencia de pérdida de peso asociada con la infección por SARS-CoV en comparación con los animales tratados con vehículo. El virus infeccioso se midió en tejido pulmonar recogido en la necropsia mediante ensayo de placas. Como se muestra en la FIG. 2A y la FIG. 2B, el virus infeccioso disminuyó significativamente en los animales tratados con el Compuesto 32 en el día 2 y el día 5 después de la infección en relación con los animales tratados con vehículo. Estos datos sugieren que el Compuesto 32 reduce la replicación del SARS-CoV en el pulmón.

[0350] Mediciones de la función pulmonar: El efecto del tratamiento con el Compuesto 32 sobre la función pulmonar en ratones infectados con SARS-CoV se evaluó mediante pletismografía de cuerpo entero (WBP) (FIG. 3A, FIG. 3B, FIG.

3C, FIG. 3D, FIG. 3E y FIG. 3F). WBP mostró un aumento en los valores de Penh en ratones tratados con vehículo, lo que sugiere que la replicación del virus en el pulmón aumentó la resistencia de las vías respiratorias. En los animales tratados con 25 mg/kg del Compuesto 32 dos veces al día o con 50 mg/kg del Compuesto 32 una vez al día, los valores de Penh fueron inferiores en comparación con los animales tratados con vehículo y fueron más similares a los animales con infección simulada.

[0351] En ratones tratados con vehículo infectados con SARS-CoV, la duración del tiempo para liberar una respiración (tiempo de expiración) o el tiempo entre respiraciones (pausa de expiración final) medido por WBP aumentó, lo que indica dificultad para respirar. Como se muestra en la FIG. 3A, FIG. 3B, FIG. 3C, FIG. 3D, FIG. 3E, y FIG. 3F, estos parámetros de respiración se redujeron en los animales tratados con el Compuesto 32 acercándose a los valores obtenidos de animales infectados de forma simulada.

Ejemplo 46. Una evaluación enmascarada, aleatorizada y controlada por vehículo del compuesto intravenoso 32 contra el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) en monos Rhesus

[0352] Se usó aislado MERS-CoV HCoV-EMC/2012 para el virus de desafío en la Instalación de prueba. El aislado MERS-CoV HCoV-EMC/2012 fue proporcionado por Viroscience Laboratory, Erasmus Medical Center, Rotterdam, Países Bajos, y se propagó en células VeroE⁶ en DMEM (Sigma) suplementado con FCS al 2 % (vol/vol) (Logan), 1 mM de L-glutamina (Lonza), 50 U/ml de penicilina y 50 pg/ml de estreptomicina (Gibco). Se asignaron aleatoriamente monos rhesus machos sin experiencia experimental a grupos de tratamiento y se equilibraron por peso corporal.

[0353] El diseño del estudio se captura en la Tabla 5.

Tabla 5: Diseño Experimental (Intervenoso)

[0354] Todos los animales se expusieron a una dosis objetivo de 7 x 10⁶ unidades formadoras de placa del virus MERS-CoV diluidas en cloruro de sodio al 0,9 % para la inoculación. Los animales fueron inoculados por múltiples vías que incluyeron la administración intranasal, ocular e intratraqueal. El día en el que se expusieron los animales se designó como Día 0.

[0355] Los métodos para controlar el sesgo incluyeron el enmascaramiento experimental. Específicamente, el personal del estudio que administró los tratamientos con el Compuesto 32 o el vehículo o que evaluó la salud de los animales de forma rutinaria fue cegado experimentalmente a la asignación de grupos de todos los animales durante la fase en vida. El personal no cegado, que no era responsable de evaluar la salud de los animales, preparó dosis individuales a partir de formulaciones a granel listas para usar proporcionadas por el Patrocinador. Las formulaciones de Vehículo y Compuesto 32 eran idénticas en apariencia física.

[0356] En los Grupos 1 y 2, se administró un tratamiento con vehículo una vez al día durante 7 días comenzando el Día -1 (un día antes de la exposición al virus). Cada dosis del Compuesto 32 o vehículo se administró como una inyección IV lenta en bolo único en la vena safena a un volumen de 2,0 ml/kg de peso corporal en el transcurso de 1 a 2 min. Las dosis se administraron a animales anestesiados mediante inyección IM de una solución que contenía ketamina (100 mg/mL) y acepromacina (10 mg/mL) a un volumen de 0,1 mL/kg de peso corporal. El peso de cada animal se obtuvo el Día - 7, y estos pesos se usaron para la determinación del volumen de dosis para todas las dosis administradas del Compuesto 32 o vehículo.

[0357] El criterio principal de valoración para este estudio fue la carga viral en el tejido pulmonar en el día 6 después de la infección. La salud de los animales se controló al menos dos veces al día durante la fase de vida y se registraron los signos clínicos de la enfermedad. Los días -7, 0, 1, 3, 5 y 6 después de la inoculación, se realizaron exámenes clínicos en todos los animales para determinar el peso corporal, la temperatura corporal, las respiraciones/minuto (bajo anestesia), y para recolectar radiografías, frotis de nariz y garganta. Se recogieron sangre entera y suero para análisis de hematología, bioquímica y citoquinas. El día 6, se realizó una necropsia programada en todos los animales; la patología pulmonar macroscópica fue puntuada (como % del lóbulo pulmonar afectado por lesiones macroscópicas) por un patólogo veterinario certificado por la junta y se registró el peso pulmonar para determinar la relación peso pulmonar/peso corporal. Se recogieron diecinueve tejidos para análisis histopatológico y virológico.

[0358] Los signos de enfermedad en animales tratados con vehículo se atribuyeron a la infección por MERS-COV. Las puntuaciones clínicas acumulativas fueron notablemente más altas en los animales tratados con vehículo en comparación con los animales tratados con el Compuesto 32. Estos síntomas de enfermedad fueron menos pronunciados en los animales tratados con el Compuesto 32.

[0359] Peso corporal y carga viral: Los cambios en el peso corporal, la temperatura y la respiración se muestran en la FIG. 4A, FIG. 4B, y FIG. 4C. El peso corporal y la temperatura corporal no cambiaron apreciablemente durante el curso de la infección en presencia o ausencia del tratamiento con el Compuesto 32. Las tasas de respiración aumentaron durante el curso de la infección y tendieron a ser más altas en el Día 6 en los animales tratados con vehículo en comparación con los animales tratados con el Compuesto 32.

[0360] Carga viral tisu lar: Se midió el ARN viral en tejido pulmonar y otros órganos recogidos en la necropsia. Los cambios en las concentraciones de ARN viral tisular para cada grupo de estudio en el Día 6 se muestran en la FIG. 5. Se detectó virus en todos los tejidos del tracto respiratorio en animales tratados con vehículo. El ARN viral en el tracto respiratorio se redujo significativamente en los animales tratados con el Compuesto 32. El ARN viral estuvo por debajo del límite de detección en los tejidos de hígado, bazo, riñón y vejiga de animales tratados y no tratados. Se detectó ARN viral en todos los animales en el ganglio linfático mediastínico, pero sólo en un animal tratado con vehículo en el ganglio linfático mandibular.

[0361] Se detectó virus en frotis nasales y faríngeos en los días 1,3, 5 y 6 después de la infección. No hubo diferencia en la carga viral entre los animales tratados con vehículo y los tratados con el Compuesto 32. Se detectó ARN viral en un animal tratado con vehículo en la orina recolectada el día 6. Los cambios en los recuentos de glóbulos blancos, neutrófilos y linfocitos se muestran en la FIG. 5.

[0362] La invención se ha descrito con referencia a varias realizaciones y técnicas específicas y preferidas. Sin embargo, un experto en la técnica comprenderá que se pueden realizar muchas variaciones y modificaciones permaneciendo dentro del alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que tiene la fórmula:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para usar en un método para tratar una infección por Coronaviridae en un ser humano que lo necesite, en el que el método comprende administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable para su uso según la reivindicación 1, en el que el método comprende administrar el compuesto.

3. El compuesto o sal farmacéuticamente aceptable para su uso según la reivindicación 1 o 2, en el que el método además comprende administrar un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

4. El compuesto o sal farmacéuticamente aceptable para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el método comprende además administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos otro agente terapéutico, en el que al menos otro agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un corticosteroide, un modulador de la transducción de señales antiinflamatorias, un broncodilatador agonista de los receptores adrenérgicos p² , un anticolinérgico, un agente mucolítico, solución salina hipertónica y otros fármacos para tratar una infección por el virus Coronaviridae; o mezclas de los mismos.

5. El compuesto o sal farmacéuticamente aceptable para usar según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la infección por Coronaviridae está causada por un virus Coronaviridae seleccionado del grupo que consiste en SARS, MERS, 229E, NL63, OC43 y HKU1.

⁶. El compuesto o sal farmacéuticamente aceptable para su uso según la reivindicación 5, en el que la infección por Coronaviridae está provocada por un virus SARS.

7. El compuesto o sal farmacéuticamente aceptable para usar según la reivindicación 5, en el que la infección por Coronaviridae está causada por un virus MERS.

⁸. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable se administra por vía oral, rectal, nasal, pulmonar, tópica, vaginal o parenteral.

9. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable para su uso según la reivindicación ⁸ , en el que el compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable se administra por vía parenteral.

10. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable para su uso según la reivindicación 9, en el que el compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable se administra por administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal o epidural.

11. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable para su uso según la reivindicación 10, en el que el compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable se administra por vía intravenosa.