CN111875638A

CN111875638A - 一种瑞德西韦衍生物的制备方法、瑞德西韦衍生物及其应用

Info

Publication number: CN111875638A
Application number: CN202010684736.0A
Authority: CN
Inventors: 杨敏; 潘栋辉; 徐宇平; 严骏杰; 王辛宇; 王立振
Original assignee: Jiangsu Institute of Nuclear Medicine
Current assignee: Jiangsu Institute of Nuclear Medicine
Priority date: 2020-07-16
Filing date: 2020-07-16
Publication date: 2020-11-03

Abstract

本发明公开了一种瑞德西韦衍生物的制备方法、瑞德西韦衍生物及其应用，包括制备标记前体，合成瑞德西韦衍生物¹⁸F‑Remdesivir，前体Remdesivir‑OTs产率达90％。¹⁸F‑Remdesivir标记产率2％，放化纯度大于95％。探针在血浆及PBS中稳定性良好。探针从血液和正常组织中快速消除，主要通过泌尿系统排泄。可在与新冠肺炎相关的疾病诊断及新药疗效评价等方面发挥独特作用。

Description

一种瑞德西韦衍生物的制备方法、瑞德西韦衍生物及其应用

技术领域

本发明属于新型冠状病毒肺炎治疗药物技术领域，具体涉及一种瑞德西韦衍生物的制备方法、瑞德西韦衍生物及其应用。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，简称“新冠肺炎”，是严重危害人类健康的急性呼吸道传染病。当前尚未有治疗新冠肺炎的特效药物。核苷类似物，瑞德西韦(Remdesivir)，是由美国吉利德公司开发的一种广谱抗病毒药物，可与RNA聚合酶特异性结合，从而抑制埃博拉 (Ebola)、中东呼吸综合征(MERS-CoV)等病毒的复制。据现有临床结果显示，瑞德西韦对COVID-19有一定的疗效。5月1日,美国FDA授予瑞德西韦紧急使用授权,用于治疗重症COVID-19成人和儿童患者。

正电子核素显像(PET)具有无创、微量、定量、实时、特异、灵敏度高等优势，可从细胞和分子水平定量观测活体生化及功能改变。华中科技大学同济医学院附属协和医院曾对四例疑似新冠肺炎患者实施广谱葡萄糖代谢显像剂¹⁸F-FDG的PET/CT扫描，初步结果表明¹⁸F-FDGPET不适于新冠肺炎的常规影像诊断。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明提供一种瑞德西韦衍生物的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种瑞德西韦衍生物的制备方法,其包括，

制备标记前体(2-乙基丁基((R)-((((2R，3S，4R，5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3羟基-4-磺酰基-四氢呋喃-2- 基氧基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸)；

合成瑞德西韦衍生物¹⁸F-Remdesivir。

作为本发明所述的瑞德西韦衍生物的制备方法的一种优选方案：所述制备标记前体(2-乙基丁基((R)-((((2R，3S，4R，5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f] [1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3羟基-4-磺酰基-四氢呋喃-2-基氧基)(苯氧基) 磷酰基)-L-丙氨酸)，其包括，取瑞德西韦溶于乙腈中，加入N,N-二异丙基乙胺混匀，在0℃中滴加4-甲苯磺酰氯的乙腈溶液，室温反应过夜，旋蒸移除溶剂后，用水及二氯甲烷萃取，收集有机层；干燥，过滤，浓缩，剩余物经硅胶柱层析得白色固体，将该固体用乙腈溶解后，注入HPLC纯化，旋蒸移除溶剂后，用水及二氯甲烷萃取，收集有机层，干燥，过滤，浓缩得白色固体。

作为本发明所述的瑞德西韦衍生物的制备方法的一种优选方案：所述取瑞德西韦溶于乙腈中，为取24.1mg(0.04mmol)的瑞德西韦溶于20mL乙腈中；所述N,N-二异丙基乙胺，其加入量为5.7mg(0.044mmol)；所述4-甲苯磺酰氯，其用量为8.4mg(0.044mmol)。

作为本发明所述的瑞德西韦衍生物的制备方法的一种优选方案：所述硅胶柱层析，其展开剂为二氯甲烷：甲醇＝15:1,R_f＝0.30；所述HPLC纯化，采用反相C18柱，乙腈：水＝55:45，流速5mL/min。

作为本发明所述的瑞德西韦衍生物的制备方法的一种优选方案：所述合成瑞德西韦衍生物¹⁸F-Remdesivir，包括将回旋加速器生产的¹⁸F经活化的QMA 柱吸附后，经1.5mLK₂₂₂/碳酸钾(mg/mg)乙腈水溶液洗脱入反应瓶，90℃干燥除水，再经无水乙腈干燥除水后，加入所述标记前体乙腈溶液，反应后，用半制备型HPLC纯化分段收集馏分后，用水稀释后注入Sep-Pak C18小柱富集，用0.5mL乙醇淋洗小柱得标记产物。

作为本发明所述的瑞德西韦衍生物的制备方法的一种优选方案：所述反应，为90℃反应15分钟；所述标记前体为1.6mg；所述HPLC纯化，采用反相C18 柱，乙腈：水＝55:45，流速5mL/min。

作为本发明的另一个方面，本发明提供所述的方法制得的瑞德西韦衍生物，其特征在于：所述瑞德西韦衍生物为¹⁸F-Remdesivir。

作为本发明的另一个方面，本发明提供所述的瑞德西韦衍生物在制备新冠肺炎相关的疾病诊断及新药疗效评价药物中的应用。所述新冠肺炎相关的疾病诊断及新药疗效评价，包括临床PET成像。

本发明的有益效果：本研究成功制得探针¹⁸F-Remdesivir。探针产率及放化纯满意，体内药代动力学性能良好。前体Remdesivir-OTs产率达90％。 ¹⁸F-Remdesivir标记产率2％，放化纯度大于95％。探针在血浆及PBS中稳定性良好。探针从血液和正常组织中快速消除，主要通过泌尿系统排泄。 ¹⁸F-Remdesivir可在与新冠肺炎相关的疾病诊断及新药疗效评价等方面发挥独特作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为冷化合物¹⁹F-Remdesivir和探针¹⁸F-Remdesivir合成路线。

图2为标记前体冷Remdesivir-OTs(A)和化合物¹⁹F-Remdesivir(B)的 ①HPLC、②MS和③¹H NMR图。

图3为探针¹⁸F-Remdesivir体外稳定性HPLC分析图。

图4为正常小鼠尾静脉注射¹⁸F-Remdesivir后不同时间点microPET显像图(A)；ROI分析所得主要器官摄取值(B)。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1：

实验材料：

试剂：

瑞德西韦购自爱必信(上海)生物科技有限公司，化学纯度大于98％。乙腈、四丁基氟化胺、4-甲苯磺酰氯和氨基聚醚(Kryptofix，K₂₂₂)购自百灵威试剂公司。其他试剂为分析纯国产试剂。¹⁸F由江苏省原子研究所提供。

仪器与设备：

QMA柱(美国Waters公司)、Sep-Pak C18柱(美国Waters公司)、分析性高效液相色谱(HPLC)(美国waters公司1525型)、紫外检测器(美国waters 公司2487型)、放射性检测器(美国Perkin Elmer公司)、分析型反相C18色谱柱(Luna C18,4.6×250mm)(美国Phenomenex公司)；制备型HPLC(美国 waters公司)、紫外检测器(美国waters公司2545型)、放射性检测器(美国BioScan公司)制备型反相C18色谱柱(Luna C18,10×250mm)、(美国Phenomenex公司)；放射性TLC薄层扫描仪(美国BioScan公司)；电子天平 (德国Sartorius公司)；放射性核素活度计量仪(美国Capintec公司)、micro PET(德国Simens INVEON)、小动物麻醉机(SAR-830/P型，美国CWE公司)、 Wizard1470γ计数仪(美国Perkin-Elmer公司)。

实验动物：

ICR小鼠购自常州卡文斯有限公司。所有动物研究均遵守国家法律法规和相应的动物实验指导原则。

实验方法：

标记前体的制备：

标记前体(2-乙基丁基((R)-((((2R，3S，4R，5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3羟基-4-磺酰基-四氢呋喃-2-基氧基) (苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸)(Remdesivir-OTs)合成路线如图1所示。称取24.1mg Remdesivir(0.04mmol)溶于20mL乙腈中，加入5.7mg(0.044 mmol)N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)混匀。在0℃中滴加4-甲苯磺酰氯的乙腈溶液(8.4mg,0.044mmol)。滴加完毕后，室温反应过夜。旋蒸移除溶剂后，用水及二氯甲烷萃取，收集有机层。干燥，过滤，浓缩，剩余物经硅胶柱层析 (展开剂：二氯甲烷：甲醇＝15:1,R_f＝0.30)得白色固体(25.2mg)。将该固体用乙腈溶解后，注入HPLC纯化(反相C18柱，乙腈：水＝55:45，流速5 mL/min)，旋蒸移除溶剂后，用水及二氯甲烷萃取，收集有机层。干燥，过滤，浓缩得白色固体。取样进行质谱、HPLC(反相C18柱，乙腈：水＝55:45，流速1mL/min)及NMR分析。

冷化合物¹⁹F-Remdesivir的合成：

冷化合物(2-乙基丁基((R)-((((2R，3S，4R，5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3羟基-4-氟-四氢呋喃-2-基氧基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸)(Remdesivir-OTs)合成路线如图1所示。称取7.56 mgRemdesivir-OTs(0.01mmol)溶于5mL四氢呋喃中，加入四丁基氨氟THF 溶液(2eq)，回流反应2小时。旋蒸移除溶剂后，用水及二氯甲烷萃取，收集有机层。干燥，过滤，浓缩，剩余物经硅胶柱层析(展开剂：二氯甲烷：甲醇＝15:1,R_f＝0.2)得白色固体(3.1mg)。取样进行质谱、HPLC(反相C18 柱，乙腈：水＝55:45，流速1mL/min)及NMR分析。

¹⁸F-Remdesivir的合成：

¹⁸F-Remdesivi(2-乙基丁基((R)-((((2R，3S，4R，5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3羟基-4-氟[¹⁸F]-四氢呋喃-2- 基氧基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸)(Remdesivir-OTs)合成路线如图1 所示。回旋加速器生产的¹⁸F(1×10⁴MBq)经活化的QMA柱吸附后，经1.5mL K₂₂₂/碳酸钾(mg/mg)乙腈水溶液洗脱入5mL反应瓶，90℃干燥除水。再经2 次无水乙腈(2mL)干燥除水后，加入0.5mL标记前体(1.6mg)乙腈溶液。90℃ 反应15分钟后。用半制备型HPLC纯化(反相C18柱，乙腈：水＝55:45，流速5mL/min)。分段收集馏分后，用20mL水稀释后注入Sep-PakC18小柱富集。用0.5mL乙醇淋洗小柱得标记产物，5mL灭菌注射用水稀释后经无菌滤膜过滤后得到¹⁸F-Remdesivi注射液。

放化纯度的测定：

TLC将¹⁸F-Remdesivi点样于硅胶层析条一段，以二氯甲烷：甲醇(v:v＝ 15:1)为展开剂上行展开。晾干后用薄层扫描仪检测。

HPLC取¹⁸F-Remdesivi样品进行HPLC分析，条件如下：反相C18柱，乙腈：水(v:v＝55:45)为流动相，流速为1mL/min。

探针稳定性检测：

将100μL1.85MBq的¹⁸F-Remdesivi注射液加入到1mLPBS和鼠血浆中，混匀，37℃孵育4小时。在预定时间点，PBS溶液直接用TLC和HPLC进行放化纯测定。血浆加入乙腈沉淀蛋白后离心，取上清液进行TLC和HPLC分析。

小动物microPET显像：

ICR小鼠经异氟烷麻醉后置于microPET扫描仪中，尾静脉注入生理盐水稀释过的1.85MBq的¹⁸F-Remdesivi注射液。给药后定期进行10分钟静态扫描，采集模式为三维模式，能峰511keV，时窗3.432ns。采用三维有序子集期望最大化(3D OSEM)算法进行图像重建。应用ASIPROV软件通过感兴趣区技术对主要器官(脑、肌肉、肝和肾等)进行定量分析。

离体生物分布：

取ICR小鼠随机分组，尾静脉注射200μL约74KBq¹⁸F-Remdesivi后30、 60和120分钟断头处死，收集血液并取感兴趣脏器(脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、胰、骨等)称湿重，置γ计数管中，测量放射性计数，计算％ID/g。

统计分析：

统计分析用统计软件GraphPad Prism7.0处理，采用非配对t检验，所有数据均以3次独立测量的平均值±SD表示，P<0.05表示有统计学意义。

实验结果：

标记前体的制备：

标记前体的产率为90％，质谱检测[M+H]⁺＝757.2与理论分子量(756.2) 吻合。结构经¹H NMR确证。HPLC分析表明标记前体保留时间为17min，化学纯度大于95％(图2A)。

冷化合物的合成：

¹⁹F-Remdesivir的产率为2％，质谱检测[M+H]+681与理论分子量(604.2) 吻合。结构经1H NMR确证。HPLC分析表明标记前体保留时间为20min，化学纯度大于95％(图2B)。

瑞德西韦在血液中逐渐代谢为单磷酸、双磷酸、三磷酸产物(均带负电荷)，与四丁基氟化铵的四丁基胺正离子络合，所得产物加H分子量为681，推测出结构为：

¹⁸F-Remdesivir的合成：

¹⁸F-Remdesivir(1mg)与TBAF(0.07M)溶于1mL无水乙腈，90℃反应15分钟，后经HPLC制备柱分离。¹⁸F-Remdesivir总制备时间为60min。校正后的产率为2％。HPLC检测表明探针保留时间为9min，放射化学纯度大于 95％(图3)。

稳定性检测：

室温PBS分别放置2和4小时后，HPLC示¹⁸F-Remdesivir以单峰形式存在，无游离¹⁸F显现，放化纯大于95％。

小动物microPET显像：

由图可见，¹⁸F-Remdesivir在脑、心、肝、肺等正常组织中快速清除。尾静脉注射¹⁸F-Remdesivir1小时后，上述器官的摄取值均约为1％ID/g。膀胱放射性浓聚明显高于消化系统(胃、肝和小肠等)，提示该探针主要通过肾排泄。此外，骨中可见放射性浓聚。尾静脉注射¹⁸F-Remdesivir1小时后，骨中摄取值约为2.5％ID/g。

氟原子与羟基范德华半径相近，分别为

和

将羟基取代成氟不会显著影响化合物生物活性。研究证明将Remdesivir四氢呋喃环上的羟基替换成氟的衍生物仍具备抗病毒活性。因此，本研究选择将Remdesivir四氢呋喃环上的羟基替换成¹⁸F，首次制得正电子核素标记的Remdesivir衍生物。

有研究将¹⁴C标记的Remdesivir注入猴体内观测药物在体内的分布情况。但由于¹⁴C衰变出的β射线穿透距离较近(约1cm)，无法实施活体放射性监测。因此，相关研究采用离体实验进行，即将组织消化溶解后使用液体闪烁液将β 射线转换成光子从而进行测量。除操作繁琐外，一些难以消化的组织如骨的放射性活度无法检测。与传统需要在不同时间点大批杀死动物的做法不同，PET 可在同一动物身上重复研究和连续实验，避免了种属差异，同时极大减少实验动物数量，节约研发费用。此外，动物用PET与临床PET成像原理相同，故动物PET的实验结果可以直接类推到人体研究并被临床PET验证，从而缩短新药临床研究时间，加快新药研发。

本研究成功制得探针¹⁸F-Remdesivir。探针产率及放化纯满意，体内药代动力学性能良好。¹⁸F-Remdesivir可在与新冠肺炎相关的疾病诊断及新药疗效评价等方面发挥独特作用。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种瑞德西韦衍生物的制备方法,其特征在于：包括，

制备标记前体(2-乙基丁基((R)-((((2R，3S，4R，5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3羟基-4-磺酰基-四氢呋喃-2-基氧基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸)；

合成瑞德西韦衍生物¹⁸F-Remdesivir。

2.如权利要求1所述的瑞德西韦衍生物的制备方法,其特征在于：所述制备标记前体(2-乙基丁基((R)-((((2R，3S，4R，5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3羟基-4-磺酰基-四氢呋喃-2-基氧基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸)，其包括，取瑞德西韦溶于乙腈中，加入N,N-二异丙基乙胺混匀，在0℃中滴加4-甲苯磺酰氯的乙腈溶液，室温反应过夜，旋蒸移除溶剂后，用水及二氯甲烷萃取，收集有机层；干燥，过滤，浓缩，剩余物经硅胶柱层析得白色固体，将该固体用乙腈溶解后，注入HPLC纯化，旋蒸移除溶剂后，用水及二氯甲烷萃取，收集有机层，干燥，过滤，浓缩得白色固体。

3.如权利要求2所述的瑞德西韦衍生物的制备方法,其特征在于：所述取瑞德西韦溶于乙腈中，为取24.1mg(0.04mmol)的瑞德西韦溶于20mL乙腈中；所述N,N-二异丙基乙胺，其加入量为5.7mg(0.044mmol)；所述4-甲苯磺酰氯，其用量为8.4mg(0.044mmol)。

4.如权利要求2或3所述的瑞德西韦衍生物的制备方法,其特征在于：所述硅胶柱层析，其展开剂为二氯甲烷：甲醇＝15:1,R_f＝0.30；所述HPLC纯化，采用反相C18柱，乙腈：水＝55:45，流速5mL/min。

5.如权利要求1～3中任一项所述的瑞德西韦衍生物的制备方法,其特征在于：所述合成瑞德西韦衍生物¹⁸F-Remdesivir，包括将回旋加速器生产的¹⁸F经活化的QMA柱吸附后，经1.5mL K₂₂₂/碳酸钾(mg/mg)乙腈水溶液洗脱入反应瓶，90℃干燥除水，再经无水乙腈干燥除水后，加入所述标记前体乙腈溶液，反应后，用半制备型HPLC纯化分段收集馏分后，用水稀释后注入Sep-Pak C18小柱富集，用0.5mL乙醇淋洗小柱得标记产物。

6.如权利要求5所述的瑞德西韦衍生物的制备方法,其特征在于：所述反应，为90℃反应15分钟；所述标记前体为1.6mg；所述HPLC纯化，采用反相C18柱，乙腈：水＝55:45，流速5mL/min。

7.权利要求1所述的方法制得的瑞德西韦衍生物，其特征在于：所述瑞德西韦衍生物为¹⁸F-Remdesivir。

8.权利要求7所述的瑞德西韦衍生物在制备新冠肺炎相关的疾病诊断及新药疗效评价药物中的应用。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于：所述新冠肺炎相关的疾病诊断及新药疗效评价，包括临床PET成像。