CN113292565B

CN113292565B - 核苷类化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113292565B
Application number: CN202010385598.6A
Authority: CN
Inventors: 请求不公布姓名
Original assignee: Zhejiang Senke Construction Co ltd
Current assignee: Jiaxing Jinpaite Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-02-24
Filing date: 2020-05-09
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2040-05-09
Also published as: CN113292565A

Abstract

本发明涉及一种核苷类化合物及其制备方法和应用。该核苷类化合物具有式(I)所示结构：

Description

核苷类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，特别涉及核苷类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

RNA病毒利用RNA作为其遗传物质，可以有双链(ds)RNA或单链RNA，且也可以是正链或负链RNA，其中冠状病毒科属于单链RNA。冠状病毒科病毒感染包括甲型冠状病毒属、乙型冠状病毒属(其包括严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV))、丙型冠状病毒属和丁型冠状病毒属的病毒的感染。人和其他很多哺乳动物如猫均为冠状病毒宿主，较易感染，且感染后发病率较高，传染性较大，因此严重危机生物体生命健康危害社会秩序。因此迫切需要开发一系列安全、有效的抗RNA病毒药物。

发明内容

基于此，有必要提供一种具有抗病毒作用的核苷类化合物及其制备方法和应用。

一种核苷类化合物，其特征在于，具有式(I)所示结构：

其中，X为CR₁、Y为OH；或X为N、Y为OH或NH₂；

R₁和R₂各自独立地选自：H、取代或未取代的C_1-8烷基、羟基、氰基、异氰基或卤素；

R₃选自：H、

R₄-R₉各自独立地选自：HH、取代或未取代的C_1-8烷基、取代或未取代的C_1-8烷氧基、取代或未取代的3-8元环烷基、取代或未取代的3-8元杂环基、取代或未取代的5-10元芳香基团、取代或未取代的5-10元杂芳香基团、氨基、氰基、异氰基、异氰酸酯基、硫氰酸酯基、异硫氰酸酯基、羟基、硝基或卤素；

表示单键或双键。

上述核苷类化合物的制备方法，包括以下步骤：

其中，M表示卤素；

提供式(I-1)和(I-2)所示结构化合物；

使式(I-1)和(I-2)所示结构化合物进行反应，制得式(I-3)所示结构化合物；

使式(I-3)所示结构化合物进行取代反应，制得式(I)所示结构化合物。

一种组合物，包括上述核苷类化合物或其药学上可接受的盐，与药学上可接受辅料。

一种前药，由上述核苷类化合物或其药学上可接受的盐制备而成。

上述核苷类化合物、上述组合物、上述前药在制备抗病毒药中的应用。

上述核苷类化合物具有优异的抗病毒作用，有望开发为抗病毒药物，特别是抗猫冠状病毒感染药物。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

定义和通用术语

除非有相反陈述，否则下列用在说明书和权利要求书中的术语具有下述含义。

本发明中“*”表示连接位点，例如式(I)所示结构中R₃选自

表示P为与式(I)所示结构中-OR₃中的O连接。

本发明中的若化合物存在立体异构体，在没有特别指明时，应理解为包括R构型、S构型以及消旋体。

本发明中所述的“取代”表示被一个或多个基团所替代。当多个基团从同一系列候选取代基中选择时，它们可以相同，也可以不同。

本发明中所述的“任选地”表示所定义基团可从一系列候选基团中进行选择，也可以不选。

本发明中所述的“取代或未取代”表示所定义的基团可以被取代，也可以不被取代。当所定义的基团被取代时，应理解为任选被本领域可接受的基团所取代，包括但不限于：C_1-30烷基、含有3-20个环原子的环烷基、含有3-20个环原子的杂环基、含有5-20个环原子的芳基、含有5-20个环原子的杂芳基、硅烷基、羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、氨基甲酰基、卤甲酰基、甲酰基、-NRR′、氰基、异氰基、异氰酸酯基、硫氰酸酯基、异硫氰酸酯基、羟基、三氟甲基、硝基或卤素，且上述基团也可以进一步被本领域可接受取代基取代；可理解的，-NRR′中的R和R′各自独立地为本领域可接受的基团所取代，包括但不限于H、C_1-6烷基、含有3-8个环原子的环烷基、含有3-8个环原子的杂环基、含有5-20个环原子的芳基或含有5-10个环原子的杂芳基；所述C_1-6烷基、含有3-8个环原子的环烷基、含有3-8个环原子的杂环基、含有5-20个环原子的芳基或含有5-10个环原子的杂芳基任选进一步被一个或多个以下基团取代：C_1-6烷基、含有3-8个环原子的环烷基、含有3-8个环原子的杂环基、卤素、羟基、硝基或氨基。

“烷基”是指饱和脂肪族烃基，包括直链和支链基团。C₁-C₆烷基是指含有1至6个碳原子的烷基。非限定性实施例包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基。C₁-C₄烷基烷基是指含有1至4个碳原子的烷基。在一实施例中，C₁-C₄烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基。烷基可以是取代的或未取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代。

“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃基取代基。3-8元环烷基是指包括3至8个碳原子。在一实施例中，3-8元单环环烷基为环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等。多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。环烷基可以是任选被一个或一个以上的取代基取代。

“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其中一个或多个环原子选自氮、氧或S(O)_m(其中m是整数0至2)的杂原子，优选氮或氧杂原子；但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的环部分，其余环原子为碳。4-10元杂环基是指环包含4至10个环原子，其中1～3个是杂原子；优选杂环基环包含5至6个环原子，其中1～2个是杂原子。在一实施例中，单环杂环基为二氢呋喃基、四氢呋喃基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基或高哌嗪基等。

“芳基”指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，优选为6至10元，更优选苯基和萘基，最优选苯基。芳基环可以稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上，芳基可以是取代的或未取代的。

5-10元“杂芳基”指包含1至4个杂原子，5至10个环原子的杂芳族体系，其中杂原子包括氧、硫和氮。杂芳基优选为是5元或6元，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其与母体结构连接在一起的环为杂芳基环。杂芳基可以任选取代或未取代。

本发明的化合物可以以非溶剂化形式和含有药学上可接受的溶剂(如水、乙醇等)的溶剂化形式存在，即包括溶剂化和非溶剂化形式。

本发明中，某可取代位点可被一个或多个取代基取代，且当该可取代位点存在多个取代基时，多个取代基可以彼此相同或不同。

“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分。例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

组合物中所含有的赋形剂，可以为一种或多种缓冲剂、稳定剂、抗粘剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、吸附剂、涂料(肠的或缓释的)防腐剂、抗氧化剂，不透明的剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、调味剂和其它已知的添加剂。

“药学上可接受的盐”即“可药用的盐”，是指医药上可接受的化合物的有机或无机盐。

当化合物是酸性或包括足够酸性生物电子等排体时，适当的“可药用的盐”指从医药上可接受的包括无机碱和有机碱的无毒碱中制备的盐。该盐衍生自含有铝、铵、钙、铜、铁、铁、锂、镁、锰盐、锰、钾、钠、辛等的无机碱。特定的实施方式包括铵、钙、镁、钾和钠盐。盐衍生自医药上可接受的有机无毒碱，该有机无毒碱包括一级、二级和三级胺的盐、包括自然存在的取代胺的取代胺、环胺和碱性离子交换树脂，如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N，N.sup.1-二苄基乙二胺、乙二胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基六氢吡啶、还原葡糖胺、氨基葡萄糖、组氨酸、海巴明、异丙胺、赖氨酸、葡甲胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙基胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等等。

当化合物是碱性的或包括足够碱性生物电子等排体时，盐可以从医药上可接受的无毒酸中制备，包括无机和有机酸。这样的酸包括乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡萄糖酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、苦杏仁酸，甲基磺酸、粘液酸、硝酸、双羟萘酸、泛酸、磷酸、硫酸、琥珀酸、酒石酸、对甲苯磺酸等等。特定的实施方式包括柠檬酸、氢溴酸、盐酸、磷酸、硫酸、马来酸、酒石酸。其它示例性的盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐，硫酸盐，磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸、乳酸、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、葡萄糖酸盐，葡萄糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲基磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(例如，1，1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。

另外，包含化合物的药物制剂可以为片剂、胶囊剂、口服液体剂、丸剂、颗粒剂、散剂、软膏剂、贴剂、栓剂、口含片、滴眼剂、眼膏剂、眼膏剂、滴耳剂、喷剂、气雾剂、吸入剂、注射剂等。

术语“治疗有效量”是指有效化合物或药物试剂的用量，改善、治愈或治疗疾病或病症的一种或多种症状的必要的最小量。

另外，本发明所述的化合物和药物组合物可单独给药，也可以与其他药剂联合施用。对于与一种以上的活性剂的联合治疗，当该活性剂在分开的剂量制剂中时，该活性剂可以分开施用或联合施用。另外，一种药剂的施用可在另一种药剂施用之前、同时或之后进行。当与其他药剂联合施用时，第二药剂的“有效量”将视所用药物的类型而定。

施用途径

本发明的一种或多种化合物通过适合于受治疗的生物体(如猫)的任何途径施用。合适的途径包括口服、直肠、鼻、肺、局部(包括口腔和舌下)、和胃肠外(包括皮下、肌内)等。

本发明的化合物或药物组合物也可以包含在试剂盒中。

详细说明

本发明提供了一种核苷类化合物，具有式(I)所示结构：

其中，X为CR₁、Y为OH；或X为N、Y为OH或NH₂；

R₃选自：H、

R₄-R₉各自独立地选自：H、取代或未取代的C_1-8烷基、取代或未取代的C_1-8烷氧基、取代或未取代的3-8元环烷基、取代或未取代的3-8元杂环基、取代或未取代的5-10元芳香基团、取代或未取代的5-10元杂芳香基团、氨基、氰基、异氰基、异氰酸酯基、硫氰酸酯基、异硫氰酸酯基、羟基、硝基或卤素；

表示单键或双键。

进一步地，R₁和R₂各自独立地选自：H、C_1-8烷基、羟基、氰基、异氰基或卤素；所述C_1-8烷基任选进一步被以下基团取代：卤素、羟基或氰基。

更进一步地，R₁和R₂为H。

进一步地，R₄和R₅中一个为H，一个为羟基或氟；更进一步地，R₄和R₅中一个为H，一个为为羟基。

进一步地，R₆和R₇中一个为H，一个为羟基或氟；更进一步地，R₆和R₇中一个为H，一个为羟基。

进一步地，R₈为H。

进一步地，R₉为C_1-4烷基、氰基或异氰基。

进一步地，R₉为甲基或氰基。

进一步地，上述核苷类化合物具有式(II)～(IV)所示任一结构：

进一步地，上述核苷类化合物具有式(II-1)～(IV-1)所示任一结构：

进一步地，上述核苷类化合物选自如下化合物(A)-(C)中任一化合物：

本发明还提供了上述核苷类化合物的制备方法，包括以下步骤：

S101：提供式(I-1)和(I-2)所示结构化合物；

其中，M表示卤素；

可理解的，可以根据最终产物的需求选择具有合适取代基的原料，该原料可以为市售原料，也可以采用现有的方法制备而成，在此不进行特别限定。

S102：使式(I-1)和(I-2)所示结构化合物进行反应，制得式(I-3)所示结构化合物；

进一步地，步骤S102包括以下步骤：将式(I-2)所示结构化合物溶解在有机溶剂中，并加入正丁基锂溶液，在温度为-70℃～-65℃的条件下反应15-45min，然后加入式(I-1)所示结构化合物，进行反应，反应完成后，分离提纯即可。

可理解的，可以根据反应的需要，对部分基团进行保护，此时应理解为上述制备方法还包括上保护基和脱除保护基的步骤，上保护基和脱除保护基的方法可以采用本领域的常规方法，在此不进行特别限定。

S103：使式(I-3)所示结构化合物和相应试剂进行取代反应，制得式(I)所示结构化合物。

可理解的，步骤S103中的取代反应可以采用本领域的常规反应条件，在此不进行特别限定。其中，“相应试剂”是指取代反应所对应的试剂，例如当R₉为氰基，可以采用TMSCN。

更进一步地，核苷类化合物具有式(II-1)～(IV-1)所示结构，其制备方法包括以下步骤：

S201a：提供式(I-1a)和(I-2a)所示结构化合物；

其中，R₂₁表示C_1-4烷基；R₂₂表示羟基保护基；进一步地，R₂₁为甲基；R₂₂为苄基。

S202a：使式(I-1a)和(I-2a)所示结构化合物进行反应，制得式(I-3a)所示结构化合物。

该步骤同步骤S102，在此不再进行赘述。

S203a：使式(I-3a)所示结构化合物与TMSCN反应，制得式(I-4a)所示结构化合物；

进一步地，步骤S203a包括以下步骤：

将式(I-3a)所示结构化合物溶于有机溶剂(例如无水二氯甲烷)中，在-70℃～-65℃的条件下加入TMSCN，反应5min-20min后，加入TMSOTf，待反应完全后，后处理，分离纯化即可。

S204a：脱除式(I-4a)所示结构化合物上的保护基，制得式(II-1)或(III-1)所示化合物。

步骤S204a为脱除保护基的步骤，可以根据具体基团选择合适的方法。

在一实施例中，R₂₂为苄基，步骤S204a包括以下步骤：

将式(I-4a)所示结构化合物溶解在有机溶剂中(例如二氯甲烷)，在0℃左右加入BCl₃，反应2.5h-3.5h，然后冷却至-70℃～-80℃，加入三乙胺和甲醇，然后升温至室温，浓缩，后处理，分离提纯即可。

可理解的，当R₃为

可以先制得R₃为H的化合物，然后再采用现有的方法与相应的磷酸酯等试剂反应即可，在此不做特别限定。

S201b：提供式(I-1b)和(I-2a)所示结构化合物；

其中，R₂₂表示羟基保护基；

S202b：使式(I-1b)和(I-2a)所示结构化合物进行反应，制得式(I-3b)所示结构化合物；

步骤S202b同步骤S102，在此不再进行赘述。

S203b：使式(I-3b)所示结构化合物与TMSCN反应，制得式(I-4b)所示结构化合物；

步骤S203b同步骤S203a，在此不再进行赘述。

S204b：脱除式(I-4b)所示结构化合物上的保护基，制得式(IV-1)所示化合物；

步骤S204b同步骤S204a，在此不再进行赘述。

本发明还提供了一种组合物，包括上述核苷类化合物或其药学上可接受的盐，与药学上可接受辅料。

本发明还提供了一种前药，由上述核苷类化合物或其药学上可接受的盐制备而成。

进一步地，所述抗病毒药为用于治疗RNA病毒的药物，所述RNA病毒包括：正粘病毒科病毒、副黏科病毒、黄病毒科病毒、冠状病毒或其组合。

更进一步地，所述的冠状病毒为人冠状病毒或猫科冠状病毒，优选为猫科冠状病毒。

本发明还提供了一种抗病毒方法，包括施加有效量的上述核苷类化合物、上述组合物或上述前药。

本法还提供了一种抑制冠状病毒科RNA依赖性RNA聚合酶的方法，该方法包括使被冠状病毒科病毒感染的细胞施加有效量上述核苷类化合物。

另外，需要说明的是，本文所述化合物的体内代谢产物应理解为落入本发明的保护范围之内，其程度是，这样的产物相对于现有技术是新颖的且非显而易见的。这些产物可产生自，例如，施用的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等，主要是由于酶过程。因此，本发明包括通过以下方法生产的新颖的且非显而易见的化合物，该方法包括，使本发明化合物与哺乳动物接触足够产生其代谢产物的一段时间。此类产物典型如下鉴定：制备放射标记(例如，¹⁴C或³H)的本发明化合物，将它以可检测的剂量(例如大于约0.5mg/kg)肠胃外地施用给动物，例如大鼠、小鼠、豚鼠、猴或人，允许发生代谢的足够时间(典型地，约30秒到30小时)，并从尿、血或其它生物样品中分离它的转化产物。由于它们被标记，这些产物很容易分离(其它是使用能结合残留在代谢产物中的表位的抗体来分离)。代谢产物的结构以常规方式测定，例如用MS或NMR分析。一般而言，代谢产物的分析以与本领域技术人员公知的常规药物代谢研究相同的方法进行。

实施例1：

(2R，3R，4S，5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)-2-(4-羟基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢呋喃-2-碳腈的制备

在氮气保护下，往化合物1(5.00g)的四氢呋喃(50mL)溶液中滴加入正丁基锂溶液(2.5M,9.46mL)，滴加时控制温度在-70～-65℃，滴加完毕后在混合液在-70～-65℃反应0.5小时。随后将化合物2(9.00g)溶于20m四氢呋喃，在-70～-65℃温度下滴加入反应体系,滴加完毕后在该温度下继续反应0.5小时.薄层硅胶色谱监测反应进程(展开剂：石油醚:乙酸乙酯＝3:1).反应完毕后在0℃下向体系内加入20mL饱和氯化铵溶液，然后加入50mL水,用50mL*2的乙酸乙酯萃取水相，有机相浓缩后用硅胶柱层析分离(洗脱液石油醚:乙酸乙酯＝1:0到1:1)，得到1.72g黄色液体状中间体3。LCMS：m/z:568.2[M+H]

在氮气保护下，向反应瓶中加入1g中间体3和20mL无水二氯甲烷，搅拌冷却至-70～-65℃，加入1.5mL TMSCN，搅拌反应10分钟。将4mL TMSOTf缓慢加入到该反应中，搅拌反应1小时。然后将反应液加入到100mL二氯甲烷中，加入100mL饱和碳酸氢钠水溶液。萃取分液，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩。浓缩液用30％乙酸乙酯的石油醚溶液洗脱，硅胶柱层析分离，得到0.55g白色固体中间体4。LCMS：m/z:577.2[M+H]

向反应瓶中加入0.4g中间体4和10mL二氯甲烷，搅拌冷却至0℃。将15mL 1.0MBCl₃的二氯甲烷溶液加入到反应液中，搅拌3小时。然后将反应液冷却至-78℃，加入10mL三乙胺，然后加入20mL甲醇，升温至室温。反应液减压浓缩，加入50mL饱和碳酸氢钠溶液和50mL二氯甲烷，萃取分液，有机相减压浓缩。将浓缩液用硅胶柱层析色谱分离，得到0.11g白色固体产物A。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.78(s,1H),6.98(d,1H),6.88(d,1H),4.76(d,1H),4.24-4.23(m,1H),4.17-4.15(m,1H),3.87-3.83(m,1H),3.74-3.71(m,1H).LCMS：m/z:293.1[M+H]

实施例2：(2R，3R，4S，5R)-3,4-二羟基-2-(4-羟基咪唑[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-碳腈的制备

在氮气保护下，往化合物1(5.00g)的四氢呋喃(50mL)溶液中滴加入正丁基锂溶液(2.5M,9.46mL)，滴加时控制温度在-70～-65℃，滴加完毕后在混合液在-70～-65℃反应0.5小时。随后将化合物5(9.10g)溶于20m四氢呋喃，在-70～-65℃温度下滴加入反应体系,滴加完毕后在该温度下继续反应0.5小时.薄层硅胶色谱监测反应进程(展开剂：石油醚:乙酸乙酯＝2:1).反应完毕后在0℃下向体系内加入20mL饱和氯化铵溶液，然后加入50mL水,用50mL*2的乙酸乙酯萃取水相，有机相浓缩后用硅胶柱层析分离(洗脱液石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得到4.25g黄色液体状中间体6。LCMS：m/z:569.2[M+H]

在氮气保护下，向反应瓶中加入3.00g中间体6和100mL无水二氯甲烷，搅拌冷却至-70～-65℃，加入5.2mL TMSCN，搅拌反应10分钟。将15mL TMSOTf缓慢加入到该反应中，搅拌反应1小时。然后将反应液加入到200mL二氯甲烷中，加入200mL饱和碳酸氢钠水溶液。萃取分液，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩。浓缩液用30％乙酸乙酯的石油醚溶液洗脱，硅胶柱层析分离，得到2.52g白色固体中间体7。LCMS：m/z:578.2[M+H]

向反应瓶中加入2.00g中间体7和30mL二氯甲烷，搅拌冷却至0℃。将40mL 1.0MBCl₃的二氯甲烷溶液加入到反应液中，搅拌3小时。然后将反应液冷却至-78℃，加入30mL三乙胺，然后加入60mL甲醇，升温至室温。反应液减压浓缩，加入200mL饱和碳酸氢钠溶液和200mL二氯甲烷，萃取分液，有机相减压浓缩。将浓缩液用硅胶柱层析色谱分离，得到0.48g淡黄色固体产物B。.LCMS：m/z:294.1[M+H]

实施例3：(2R，3R，4S，5R)-2-(4-氨基咪唑[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-碳腈的制备

在氮气保护下，往化合物1(5.00g)的四氢呋喃(50mL)溶液中滴加入正丁基锂溶液(2.5M,9.46mL)，滴加时控制温度在-70～-65℃，滴加完毕后在混合液在-70～-65℃反应0.5小时。随后将化合物8(9.20g)溶于40m四氢呋喃，在-70～-65℃温度下滴加入反应体系,滴加完毕后在该温度下继续反应0.5小时.薄层硅胶色谱监测反应进程(展开剂：石油醚:乙酸乙酯＝2:1).反应完毕后在0℃下向体系内加入25mL饱和氯化铵溶液，然后加入80mL水,用100mL*2的乙酸乙酯萃取水相，有机相浓缩后用硅胶柱层析分离(洗脱液石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得到6.12g淡黄色液体状中间体9。LCMS：m/z:555.2[M+H]

在氮气保护下，向反应瓶中加入5.00g中间体9和150mL无水二氯甲烷，搅拌冷却至-70～-65℃，加入7.2mL TMSCN，搅拌反应15分钟。将20mL TMSOTf缓慢加入到该反应中，搅拌反应1小时。然后将反应液加入到200mL二氯甲烷中，加入200mL饱和碳酸氢钠水溶液。萃取分液，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩。浓缩液用25％乙酸乙酯的石油醚溶液洗脱，硅胶柱层析分离，得到3.6g淡黄色固体中间体10。LCMS：m/z:563.2[M+H]

向反应瓶中加入3.00g中间体10和40mL二氯甲烷，搅拌冷却至0℃。将50mL 1.0MBCl₃的二氯甲烷溶液加入到反应液中，搅拌3小时。然后将反应液冷却至-78℃，加入40mL三乙胺，然后加入60mL甲醇，升温至室温。反应液减压浓缩，加入200mL饱和碳酸氢钠溶液和200mL二氯甲烷，萃取分液，有机相减压浓缩。将浓缩液用硅胶柱层析色谱分离，得到0.92g淡黄色固体产物B。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ8.39(br,2H),8.16(s,1H),7.77(s,1H),6.21(s,1H),5.27(s,1H),4.91(s,1H),4.69(t,1H),4.06～4.10(m,1H),4.02～4.04(m,1H),3.65(d,1H),3.50(d,1H).LCMS：m/z:293.1[M+H]

抗病毒活性测定

测定方法：猫传染性腹膜炎病毒细胞的保护测定使用猫肾(CRFK)细胞和FIPV-79-1146(猫传腹病毒)。通俗的讲就是混合病毒和细胞，并在测试化合物的存在下温育7天。预滴定病毒，使对照孔出现由于病毒复制引起的85％至95％的细胞凋亡。由于测试化合物可以抑制病毒复制，所以有受试化合物存在的条件下可以观察到抗病毒效果。每个测定板包含细胞对照孔(仅细胞)、病毒对照孔(细胞和病毒)、化合物毒性对照孔(仅细胞和化合物)、化合物比色对照孔(仅化合物)以及实验孔(化合物、细胞和病毒)。通过MTS(MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓)细胞增殖试剂盒测定细胞的EC₅₀(50％细胞存活的浓度)以及细胞毒性CC₅₀(导致50％细胞死亡的浓度)。

细胞制备：

猫肾(CRFK)细胞(美国典型培养物保藏中心(ATCC)商购)在补充有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(2.0mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中生长。使用标准细胞培养物技术以1：10的分流比一周两次地继代培养该细胞。使用血球计数仪和台盼蓝排除法进行总细胞数和生存力百分数测定。对于测定中使用的细胞，细胞生存力必须大于95％。在测定前一天以1x10⁴个细胞/孔的浓度在96孔组织培养板中接种细胞。

病毒制备：

用于测定的病毒是猫传腹病毒FIPV-79-1146(美国典型培养物保藏中心(ATCC)商购)在CRFK细胞中生长，产生病毒并作为储备病毒池。每次测定，从-70℃条件下移除病毒的预滴定等分部分，并在生物安全柜中将其解冻到室温。然后将病毒悬浮并稀释到组织培养基中，使得加入到每个孔的病毒的量是被确定为产生感染后4-5天在85％到95％的细胞杀死之间的量。

细胞染色：

在感染5天后，用MTS细胞增殖试剂盒染色测定细胞存活率并量化化合物毒性。通过由定量分析代谢活性细胞的线粒体酶代谢MTS产生的可溶性甲臜产物，测得细胞存活率和化合物的细胞毒性。每个孔加入20-25μL的MTS试剂，然后在37℃、5％CO₂条件下温育微量滴定板4-6小时，然后测定细胞存活率。在490/650nm下按分光光度法SpectraMax Plus板读数器对该板读数。

数据分析：

使用计算机计算化合物对病毒抑制的EC₅₀和细胞毒性CC₅₀。下表1为测试化合物的活性结果。

表1

由表1可以看到，上述化合物A、B和C比阳性对照化合物GS-441524具有更加显著的抑制效果。说明本发明提供的化合物具有优异的抗病毒作用，有望开发为抗病毒药物，特别是抗猫冠状病毒感染药物。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。