ES2661539T3 - Rebaudiósido D de pureza elevada y aplicaciones - Google Patents

Abstract

Producto que comprende: una composición edulcorante que comprende por lo menos 95% en peso en base seca de rebaudiósido D, en el que el producto es seleccionado de entre el grupo que consiste en alimento, bebida, composición farmacéutica, tabaco, producto nutricéutico, composición higiénica oral, o cosméticos.

Description

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Tabla 2

Nombre

Fórmula Tfusión, ºC Peso molecular Rotación óptica [α]25 D (H2O, 1%, p/v) Solubilidad en agua, % Dulzor relativo Tipo de sabor

Esteviol

C20H30O3 212-213 318,45 ND ND ND Muy amargo

Esteviolmonósido

C26H40O8 ND 480,58 ND ND ND ND

Esteviósido

C38H60O18 196-198 804,88 -39,3 0,13 210 Amargo

Rebaudiósido A

C44H70O23 242-244 967,01 -20,8 0,80 200-400 Menos amargo

Rebaudiósido B

C38H60O18 193-195 804,88 -45,4 0,10 150 Amargo

Rebaudiósido C

C44H70O22 215-217 951,01 -29,9 0,21 30 Amargo

Rebaudiósido D

C50H80O28 248-249 1129,15 -29,5 (etanol) 1,00 220 Parecido a la sacarosa

Rebaudiósido E

C44H70O23 205-207 967,01 -34,2 1,70 170 Parecido a la sacarosa

Rebaudiósido F

C43H68O22 ND 936,99 -25,5 (metanol) ND

Dulcósido A

C38H60O17 193-195 788,87 -50,2 0,58 30 Muy amargo

Esteviolbiósido

C32H50O13 188-192 642,73 -34,5 0,03 90 Desagradable

Rubusósido

C32H50O13 ND 642,73 642,73 ND 110 Muy amargo

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opcionalmente, una o más etapas de lavado con agitación, y (4) una etapa de purga de etanol y de secado. En las formas de realización que utilizaban un material de partida de Stevia de menor calidad, habitualmente se añadió una segunda etapa de reflujo antes de la etapa de lavado con agitación a fin de maximizar la pureza del producto final de rebaudiósido A. En el método descrito, se llevó a cabo una etapa de formulación de EtOH con el fin de formular un disolvente de reflujo adecuado para su utilización en la etapa o etapas de reflujo. Habitualmente, el disolvente de reflujo era una mezcla de etanol y agua con entre aproximadamente un 5% y un 15% en volumen de agua. El procedimiento incluía además una o más etapas de reflujo de alto consumo energético que generalmente se llevaban a cabo a una temperatura comprendida aproximadamente entre 89ºC y 90ºC durante aproximadamente 1 hora. Según se afirma, el método produjo rebaudiósido A soluble en agua 100% puro.

La solicitud de patente US nº 2006/0134292 da a conocer un procedimiento para la recuperación de glucósidos dulces de material vegetal de Stevia rebaudiana. Las hojas secas y pulverizadas se trataron con agua en presencia de pectinasa, celulasa y alfa-amilasa. Se afirma que la utilización de dichas enzimas aumenta considerablemente el índice de extracción y facilita las siguientes etapas de purificación. El extracto resultante se purificó mediante tratamiento con hidróxido de calcio y ultrafiltración. El permeado se hizo pasar a través de la columna rellena con bentonita y se concentró al vacío hasta el estado de jarabe. El tratamiento con etanol permitió la separación del rebaudiósido A prácticamente puro de la mezcla. El rebaudiósido A de pureza elevada se obtuvo tras lavar los cristales con etanol al 88-95%.

La solicitud de patente US nº 2007/0082103 da a conocer un procedimiento para preparar extracto de Stevia y obtener esteviósido y rebaudiósido A altamente purificados. Las hojas secas y pulverizadas se sometieron a extracción con agua y el extracto resultante se purificó mediante tratamiento con una base, como el hidróxido de calcio, seguida de cloruro de hierro. El filtrado se desionizó con resinas de intercambio iónico, se concentró al vacío y se secó por pulverización. Se obtuvieron rebaudiósido A y esteviósido de pureza elevada disolviendo el extracto en metanol a fin de precipitar el esteviósido. La solución restante tras el aislamiento del esteviósido se secó y el rebaudiósido A se aisló mediante tratamiento con etanol. La purificación final del rebaudiósido A se llevó a cabo mediante tratamiento con solución de etanol y agua. La pureza fue de por lo menos 98%.

La solicitud de patente publicada US nº 20070292582 da a conocer una purificación del rebaudiósido A. El método comprendía las etapas de combinación del rebaudiósido A crudo y un disolvente orgánico acuoso para formar una solución de rebaudiósido A, comprendiendo dicha solución acuosa orgánica agua en una cantidad comprendida aproximadamente entre el 10% y aproximadamente el 25% en peso, y la cristalización a partir del rebaudiósido A crudo, en una sola etapa, obteniéndose rebaudiósido A sustancialmente puro con una pureza superior al 95%. Cuando se utilizó una mezcla de metanol, etanol y agua, el rendimiento de rebaudiósido A con una pureza mayor del 97% fue del 32,5% a partir del material de partida, que contenía un 77,4% de rebaudiósido A. El rendimiento a partir de material de partida con un 80,37% de rebaudiósido A estaba comprendido entre el 54,6% y el 72,0%. Otros codisolventes utilizados junto con el etanol, tales como el acetato de etilo, el 1-butanol, el 2-butanol, el terc-butanol, el sec-butanol, el acetonitrilo, el isopropanol y el 1-propanol no eran adecuados para la producción de rebaudiósido A con una pureza mayor del 97%. Cuando se utilizó etanol con diversas cantidades de agua como disolvente de cristalización, el rendimiento de rebaudiósido A resultó comprendido dentro del intervalo 39,6%-76,4% a partir de material de partida con un 80,37% de rebaudiósido A. El procedimiento utilizaba una mezcla de dos disolventes orgánicos, cuya recuperación y purificación a gran escala resultaba muy compleja. Por otra parte, a escala comercial, si la centrifugación tiene una duración relativamente larga, se puede producir la coprecipitación de esteviósido, rebaudiósido C y rebaudiósido D.

La solicitud de patente US nº 2008/0300402 y la patente china 101200480 dan a conocer un método para producir rebaudiósido A purificado que comprende las siguientes etapas: separación del rebaudiósido A en columna cromatográfica rellena con gel de sílice utilizando una mezcla de acetato de etilo, etanol y agua como fase móvil. Las fracciones de rebaudiósido A se combinaron y se secaron. El sólido se trató con etanol con entre el 2% y el 10% de agua, y el rebaudiósido A se cristalizó enfriando la mezcla a -20ºC. La pureza del rebaudiósido A puede superar el 99%. Para la purificación del rebaudiósido A, el filtrado obtenido tras la separación del esteviósido se concentró y se enfrió a 0ºC hasta el día siguiente durante aproximadamente 16 horas. El precipitado resultante de rebaudiósido A se filtró, se lavó con un pequeño volumen de metanol frío y se secó para obtener rebaudiósido A con un 79,0% de pureza y un 3,3% de rendimiento con respecto al extracto inicial. Este rebaudiósido A crudo se purificó adicionalmente por reflujo en metanol anhidro o mezcla de metanol y agua. A partir del material de partida, que contenía un 90,2% de rebaudiósido A, el rendimiento del producto fue aproximadamente del 67% con un 98,6% de pureza. Sin embargo, el método de mejora de la pureza del rebaudiósido A del 79% al 90,2% no está disponible. El principal inconveniente del procedimiento es el bajo rendimiento de los productos finales, que hace que el procedimiento no sea adecuado para la producción a escala comercial de esteviósido y rebaudiósido A de pureza elevada.

Diversas patentes japonesas se centran también en la preparación de extracto de Stevia rebaudiana Bertoni.

La patente JP 52-100500 describe la purificación y concentración de extracto de esteviósido acuoso por tratamiento del extracto con una resina de intercambio iónico específica con una elevada capacidad decolorante, seguido del tratamiento con un adsorbente específico de tipo Amberlite XAD. El tratamiento únicamente con intercambiadores

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de iones y adsorción/desorción no es capaz de proporcionar un extracto de alta calidad.

La patente JP 52-136200 da a conocer la preparación de una solución de esteviósido por extracción con agua caliente o alcohol hidratado, seguida de separación por membrana. El peso molecular de los glucósidos dulces y el de las esterebinas son muy parecidos, y los sistemas de membrana no pueden dar una resolución satisfactoria de estos compuestos, lo que afecta a la pureza del extracto. El contenido salino en el producto final es elevado.

La patente JP 52-005800 da a conocer un método de preparación de esteviósido purificado a partir de hojas de Stevia rebaudiana por extracción y tratamiento con una resina de intercambio catiónico. Dicho tratamiento produce un polvo amarillo, aparentemente con un contenido bajo de glucósidos dulces.

La patente japonesa JP54030199 da a conocer un procedimiento para la preparación de un agente edulcorante de Stevia sin su olor y sabor amargo característicos mediante la extracción de las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni con agua, el tratamiento del extracto con una resina adsorbente sintética apolar, seguido de desorción, y el tratamiento adicional con una resina de intercambio iónico. Dicho procedimiento es muy similar a la tecnología tradicional china, que permite la producción de extracto de Stevia con un contenido de glucósidos de esteviol no superior a 85-86%.

La patente JP 54-132599 da a conocer una separación y purificación de esteviósido mediante la extracción de las hojas de Stevia con agua caliente, el tratamiento del extracto con un adsorbente sintético apolar, el lavado de la resina con una solución acuosa de cal apagada y la elución del esteviósido de la resina con un disolvente orgánico hidrófilo o un disolvente orgánico hidrófilo hidratado. El tratamiento únicamente con un adsorbente sintético apolar no es capaz de proporcionar un extracto de alta calidad; no se toma ninguna medida para evitar las sales residuales y la coloración del producto.

La patente JP 55-159770 da a conocer una extracción y purificación de esteviósido mediante la extracción de las hojas de Stevia con agua o alcohol hidratado. El extracto se concentró hasta un contenido de sólidos comprendido entre el 10% y el 50% y se añadió un 0,1-5,0% de cloruro de calcio para coagular y precipitar las impurezas coloidales presentes en el extracto. La mayor parte de las impurezas no se pueden eliminar a partir de la solución concentrada utilizando CaCl2. No existe ninguna etapa de desalinización ni de decoloración.

La patente JP 55-162953 se refiere a la preparación de esteviósido mediante la extracción de hojas de Stevia con 10-15 volúmenes de agua a 60-80ºC. El extracto se trató con cal apagada con aireación, y el pH de la suspensión se ajustó aproximadamente a 8,0 mediante la adición de ácido sulfúrico o ácido cítrico. La sal ligeramente soluble resultante se separó por filtración y el filtrado se puso en contacto con una resina de poliamida para eliminar las impurezas. El filtrado se extrajo adicionalmente con n-butanol y la fase orgánica se destiló al vacío para recuperar el esteviósido en forma de cristales blancos. El contenido salino de dicho producto es alto. El procedimiento de purificación mediante la extracción de n-butanol es difícil de aplicar a escala comercial.

La patente JP 55-081567 describe la extracción y purificación de esteviósido. El extracto de hojas de Stevia preparado por extracción con agua o alcohol hidratado se concentró, y se añadieron al concentrado uno o más tipos de sales solubles en agua de Ca, Fe y Al, y un disolvente orgánico soluble en agua, por ejemplo etanol o acetona. El líquido resultante, con un pH de 3 a 7, se hizo pasar a través de una resina de intercambio catiónico fuerte y una resina de intercambio aniónico débil. La solución que se obtuvo se hizo pasar a través del adsorbente específico. Se combinaron las fracciones de esteviósido. Este procedimiento es parecido a los de la tecnología tradicional china, que puede proporcionar un polvo amarillo con un contenido de glucósidos de esteviol únicamente del 85-86%.

La patente JP 55-120770 se refiere a la purificación de una solución de esteviósido. Se extrajeron hojas y tallos de Stevia rebaudiana Bertoni con agua o una solución alcohólica, en la que se incorporó y se disolvió una sal de estaño soluble en agua, por ejemplo, cloruro de estaño (II), sulfato de estaño (II), sulfato de estaño (IV), etc. Se añadió a la solución resultante una sustancia alcalina, por ejemplo, hidróxido de sodio o cal, a fin de ajustar el valor de pH a aproximadamente 5-10. El precipitado que se formó se separó. Este procedimiento no es capaz de proporcionar un extracto sin sales ni otras impurezas de peso molecular bajo.

La patente JP 55-138372 describe la purificación de una solución de esteviósido. El esteviósido se extrajo de las hojas y tallos de Stevia rebaudiana con agua, agua caliente o un alcohol hidratado, y el extracto o su concentrado se mezcló con cal apagada o lechada de cal. A continuación, la mezcla se filtró y se mezcló con una cantidad equimolar de compuesto de hierro soluble en agua, por ejemplo sulfato ferroso, y se agitó para precipitar los iones de hierro en forma de hidróxido muy poco soluble, que se eliminó junto con las sustancias colorantes adsorbidas sobre él. Este procedimiento no es capaz de proporcionar un extracto sin sales ni otras impurezas de peso molecular bajo.

La patente JP 55-039731 se refiere a la extracción de esteviósido. Se extrajo 1 kg de hojas secas de Stevia rebaudiana con entre 3 y 10 volúmenes de agua o alcohol hidratado. El extracto se concentró hasta un contenido de sólidos del 10-50% y se añadió un 0,1-5% de un cloruro metálico, por ejemplo cloruro de calcio, aluminio o hierro. El precipitado de impurezas se eliminó por filtración. Se pueden llevar a cabo, además, procedimientos de purificación

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metanol caliente o etanol caliente. El esteviósido y el rebaudiósido A se cristalizaron simultáneamente en la solución. Tras eliminar completamente el disolvente, los cristales mezclados se calentaron juntos con 3-6 volúmenes de alcohol y se separaron en la parte de solución y la parte sólida por filtración en caliente. El esteviósido se puede obtener a partir de la solución y el rebaudiósido A se puede preparar lavando y secando la parte sólida. Este método puede proporcionar el esteviósido y el rebaudiósido A purificados; sin embargo, la calidad del extracto puede ser baja debido a la ausencia de etapas de desionización y decoloración. El contenido de impurezas de peso molecular bajo puede ser alto.

Las patentes JP 58-212759 y 58-212760 describen la purificación de la sustancia edulcorante de Stevia. Se extrajeron hojas de Stevia rebaudiana Bertoni con agua o un alcohol a un pH de 4. El extracto se trató con hidróxido de calcio y el precipitado que se formó se separó por filtración. Se añadió al filtrado un disolvente orgánico soluble en agua, tal como el metanol, y se eliminó el precipitado. La cantidad de disolvente orgánico soluble en agua fue de entre el 5% y el 50% con respecto al filtrado. El filtrado obtenido se purificó mediante resinas de intercambio iónico o una resina de adsorción. El principal inconveniente es que se utiliza un disolvente peligroso, que puede estar presente en el producto final. Este procedimiento es difícil de aplicar a escala comercial.

La patente JP 58-028246 se refiere a la preparación de esteviósido. Se extrajo hoja cruda de Stevia con agua, agua caliente o una mezcla de agua y alcohol, y a continuación, si era necesario, se concentró el extracto. Se añadió al extracto o el extracto concentrado una mezcla de hidróxido de calcio y cloruro de calcio en una cantidad correspondiente a 0,5-2,0 veces la del contenido de sólidos, preferentemente burbujeando simultáneamente dióxido de carbono gaseoso. Las impurezas se precipitaron en forma de material coloidal, que se separó por filtración. Sin embargo, la calidad del extracto puede ser baja debido al elevado contenido de sales y compuestos de peso molecular bajo.

La patente JP 58-028247 se refiere a un método de purificación de una solución de esteviósido. Se extrajeron hojas crudas de Stevia con agua, agua caliente o una mezcla de agua y alcohol, y se concentró el extracto. Se añadieron al extracto o extracto concentrado hidróxido de calcio y un floculante polimérico de peso molecular elevado soluble en agua, por ejemplo un alto polímero de poliacrilamida, en una cantidad de entre 1 y 2,5 veces la del contenido de sólidos del extracto, a fin de provocar la precipitación de las impurezas, que luego se eliminaron por filtración. Se obtuvo una solución de esteviósido transparente y prácticamente incolora. Sin embargo, la calidad del extracto puede ser baja debido al elevado contenido de sales y compuestos de peso molecular bajo.

La patente JP 59-045848 se refiere a la preparación de un edulcorante de Stevia con un contenido elevado de rebaudiósido A. Las hojas secas de la variedad de Stevia que contiene 1,57 veces más rebaudiósido A que esteviósido se extrajeron con agua o un disolvente que contenía agua. La solución extraída se trató con una resina de intercambio catiónico y una resina de intercambio aniónico. La solución se adsorbió sobre una resina de absorción, se eluyó con un disolvente hidrófilo y la solución se concentró a fin de obtener un edulcorante natural. Este procedimiento es parecido a los de la tecnología tradicional china, que puede proporcionar un polvo amarillo con un contenido de glucósidos de esteviol únicamente de hasta el 85-86%.

La patente JP 62-166861 se refiere a la extracción y purificación del componente edulcorante de las hojas secas de Stevia. Se extrajeron hojas secas de Stevia rebaudiana Bertoni con 7-14 volúmenes de agua a 50-70ºC durante 3-6 horas con agitación, a fin de obtener un extracto líquido de color marrón con un contenido total de sólidos del 2-3% y con un 0,7-0,8% de esteviósido. El extracto se concentró 7-8 veces a aproximadamente 60ºC a presión reducida. El líquido concentrado se trató con un 0,5-2% de CaCl2 para separar las impurezas en forma de precipitado floculento. La solución se trató con un óxido de Al, Mg en una cantidad correspondiente al 15-20% del contenido de sólidos a 40-55ºC con agitación vigorosa. A continuación, el precipitado se eliminó por filtración. El esteviósido se puede purificar adicionalmente en adsorbentes específicos. Sin embargo, este procedimiento es difícil de comercializar; la cantidad de sales utilizadas para la purificación del extracto es elevada y no se lleva a cabo ninguna etapa de desionización ni de decoloración. El contenido de compuestos de peso molecular bajo puede ser alto.

La patente JP 06-007108 se refiere al método para extraer y separar las sustancias dulces de la Stevia rebaudiana Bertoni. Se extrajeron hojas de Stevia rebaudiana Bertoni con un alcohol miscible en agua, tal como el metanol. La solución extraída se mezcló con agua y se hizo pasar a través de membranas de ultrafiltración con una capacidad de corte de 20-150 kDa, y seguidamente a través de membranas de ultrafiltración con una capacidad de corte de 110 kDa. Sin embargo, se utilizan disolventes peligrosos que pueden permanecer en el producto final. Este procedimiento es difícil de aplicar a escala comercial.

La patente JP 52083731 se refiere al aislamiento y purificación de rebaudiósido A y rebaudiósido B mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice. Se lleva a cabo una purificación adicional por cristalización en disolventes orgánicos, tales como metanol o etanol.

La patente JP 55-092400 se refiere a la preparación de esteviósido. Se extrajo una solución acuosa que contiene esteviósido con 1H,1H,5H-octafluoro-1-pentanol. Tras la separación, el disolvente se eliminó por destilación y el residuo se secó. El precipitado se recristalizó en metanol. La pureza del esteviósido fue de más del 95%.

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Las patentes JP 56-121453, JP 56-121454 y JP 56-121455 se refieren a la separación de esteviósido y rebaudiósido A. Una mezcla de esteviósido y rebaudiósido A extraída de hojas de Stevia rebaudiana Bertoni se mezcló con una solución acuosa de metanol al 75% y se mantuvo a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 horas. Los cristales resultantes, con un contenido del 65% de esteviósido y del 25,2% de rebaudiósido A, se separaron por filtración y se secaron. Cuando se aplicó una solución acuosa de etanol al 90%, la mezcla final contenía un 57,4% de esteviósido y un 31,9% de rebaudiósido A. La recristalización adicional en una solución acuosa de etanol al 90% dio lugar a un producto con un mayor contenido de rebaudiósido A. La pureza del producto fue aproximadamente del 80%. El esteviósido se puede llegar a purificar hasta el 86,1% mediante el lavado adicional con agua. Se obtuvieron cristales de esteviósido de tipo β y cristales de rebaudiósido A de tipo α.

La patente JP 57-046998 se refiere a la preparación de esteviósido. Se extrajeron hojas crudas de Stevia rebaudiana con 10-20 volúmenes de agua y el filtrado se trató con hidróxido de calcio en una cantidad correspondiente al 10-30% del peso de las hojas crudas. El pH de la suspensión se ajustó a 4-6 con ácido sulfúrico

o ácido cítrico. Tras la filtración, el extracto se hizo pasar a través de una columna de poliamida para adsorber los glucósidos y eliminar las impurezas. A continuación, el extracto purificado se concentró a presión reducida, se ajustó su pH a 8-9 con amoniaco acuoso y se extrajo con n-butanol para obtener esteviósido crudo, que luego se recristalizó en metanol.

La patente JP 57-086264 se refiere al aislamiento del componente edulcorante principal de Stevia. Se extrajeron los tallos y hojas secos con agua fría, agua caliente, alcohol hidratado, etc. El extracto se coaguló o precipitó con un adsorbente, y el precipitado se eliminó por filtración o centrifugación, hasta obtener un líquido transparente que contenía los componentes edulcorantes. Los componentes se adsorbieron sobre un adsorbente polimérico sintético, se purificaron hasta un 80-90% de pureza, se concentraron, se secaron y se disolvieron en 3-8 volúmenes de metanol caliente o etanol caliente. El esteviósido y el rebaudiósido A se cristalizaron simultáneamente en la solución. Tras eliminar completamente el disolvente, los cristales mezclados se calentaron juntos con 3-6 volúmenes de alcohol y se separaron los sólidos de la solución por filtración en caliente. El esteviósido se puede obtener a partir de la solución y el rebaudiósido A se puede preparar lavando y secando la parte sólida.

Las patentes JP 06-192283 y JP 08-000214 dan a conocer la purificación de rebaudiósido A por filtración en gel en Toyo Perl HW-40. Se obtuvieron rebaudiósido C y dulcósido por HPLC. Este método es útil únicamente a escala de laboratorio.

La patente JP 63173531 da a conocer un método de extracción de glucósidos dulces a partir de Stevia rebaudiana. La primera etapa del procedimiento consistió en extraer una solución líquida de glucósidos dulces de la planta Stevia rebaudiana. En segundo lugar, la solución líquida de glucósidos dulces se hizo pasar a través de una resina porosa apolar y se eluyó con un disolvente orgánico soluble en agua, preferentemente metanol. En tercer lugar, la solución eluida se concentró y se secó, obteniéndose un material pulverulento. Este procedimiento aísla una mezcla de glucósidos dulces, pero no aísla un único glucósido dulce puro, como por ejemplo el rebaudiósido A.

La patente JP 07-143860 da a conocer la purificación de rebaudiósido A por cristalización y recristalización a partir de una solución acuosa de metanol al 10-20%. La pureza del rebaudiósido A fue aproximadamente del 90%.

La patente JP 07-177862 da a conocer una purificación de rebaudiósido A y esteviósido. Se trató el extracto de Stevia purificado con concentraciones bajas de alcohol a fin de obtener cristales con un contenido de aproximadamente el 75% de esteviósido y rebaudiósido A. Los cristales se recristalizaron adicionalmente en agua para obtener el edulcorante ligeramente soluble en agua con una relación de esteviósido con respecto a rebaudiósido A de aproximadamente 1:2 p/p.

La patente JP 2002 262.822 da a conocer un edulcorante extraído de las hojas secas de Stevia y un método de extracción del mismo. Este procedimiento utilizó agua o un disolvente acuoso para extraer los glucósidos de Stevia a partir de las hojas secas. En el producto obtenido, el contenido de rebaudiósido A fue de 2,56 veces la cantidad de esteviósido.

En Kohda y otros, 1976, se llevó a cabo el aislamiento de esteviolbiósido, rebaudiósido A y rebaudiósido B. Se extrajeron las hojas secas con metanol caliente y el filtrado se concentró a sequedad. El residuo se extrajo con nbutanol y, tras secarse, se recristalizó en metanol. El licor madre se sometió a separación cromatográfica sobre gel de sílice utilizando una mezcla de metanol-cloroformo-agua como fase móvil. Se llevó a cabo una purificación adicional por cromatografía en capa fina. Este procedimiento se puede aplicar únicamente a escala de laboratorio para la producción de pequeñas cantidades de los glucósidos dulces mencionados anteriormente.

Los dulcósidos A y B se aislaron e identificaron mediante cristalización en mezcla de metanol y etanol, y se purificaron adicionalmente por cromatografía sobre gel de sílice (Kobayashi y otros, 1977).

Se utilizó una combinación de ultrafiltración, diafiltración, ósmosis inversa y tratamiento de intercambio iónico para la purificación del extracto de Stevia (Fuh y Chiang, 1990). La capacidad de corte de las membranas de ultrafiltración

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era de 25.000 y 100.000 Daltons. Se utilizaron mezclas de resinas de intercambio catiónico y de intercambio aniónico fuertes y débiles como intercambiadores de iones. La recuperación de los glucósidos totales de esteviol fue aproximadamente del 90%; sin embargo, la pureza final del producto fue únicamente del 46%.

En Liu y otros (1991) y Zhang y otros (2000) se describe un método para la purificación de los glucósidos de esteviol por tecnología de membrana. Las hojas secas se colocaron en una columna de vidrio estándar y la extracción se llevó a cabo con agua de ósmosis inversa. El extracto se pretrató con una membrana tubular de cerámica y a continuación con una membrana de ultrafiltración en modo de diafiltración. El permeado se lavó de las impurezas de peso molecular inferior mediante una membrana de nanofiltración en modo de diafiltración y a temperatura elevada. La adición de cal y/u otro agente de floculación a la alimentación de la ultrafiltración mejoró significativamente el flujo. El procedimiento fue capaz de proporcionar un concentrado de edulcorante con una pureza relativamente alta. Sin embargo, no se facilita ningún dato sobre la pureza del extracto y la recuperación de los glucósidos de esteviol. Los valores bajos de pH aplicados para la extracción hizo necesaria la utilización de reactores especiales resistentes a los ácidos. Las bajas temperaturas durante la extracción hicieron aumentar el coste operativo de la producción. Estos dos factores (temperatura y pH bajos) dieron lugar a una gran cantidad de extracto inicial diluido. La dilución del extracto también se produjo durante la microfiltración y la ultrafiltración. Para la purificación final, es necesario un tratamiento de intercambio iónico. Estos factores aumentan sustancialmente el coste de producción y disminuyen el rendimiento del producto final por unidad de tiempo. La inversión inicial también es elevada.

Se utilizó una serie de resinas polares a base de poliestireno con grupos carbonilo para la adsorción de los glucósidos de esteviol y la separación parcial del esteviósido y el rebaudiósido A (Chen y otros, 1998; 1999). La relación de rebaudiósido A con respecto a esteviósido puede aumentar del 0,72 al 2,24.

Se estudió la capacidad de adsorción y la selectividad de un nuevo adsorbente con un grupo piridilo con respecto a los glucósidos de esteviol (Chen y otros, 1999). Se estudiaron con detalle el efecto de la polaridad y la estructura física del sorbente sobre la selectividad. Se aplicaron dos métodos de separación en el enriquecimiento del rebaudiósido A. Dichos métodos fueron la elución selectiva utilizando solución de metanol o etanol como disolvente y la separación cromatográfica dinámica con resina de piridilo de alta selectividad. Los resultados muestran que el método de separación cromatográfica puede enriquecer eficazmente el rebaudiósido A a partir del extracto de Stevia con un contenido elevado de esteviósido. La relación de rebaudiósido con respecto a esteviósido puede aumentar del 0,75 al 3,94. Fue posible llevar a cabo una purificación adicional del rebaudiósido A por cristalización en metanol.

En Moraes y otros (2001) y Montovaneli y otros (2004) se describe un método para la clarificación del extracto de Stevia con zeolitas modificadas. Se modificaron zeolitas sintéticas o naturales por tratamiento con iones de calcio o bario y se puso en contacto un extracto de Stevia sin ningún tratamiento previo con la zeolita modificada. Se alcanzó una clarificación del 70-80% en régimen por lotes y únicamente del 55-60% en régimen continuo. Con el procedimiento de clarificación se pretendía adsorber los pigmentos que hacen que el extracto sea marronoso, no los glucósidos, que son los responsables del sabor dulce. Sin embargo, no se facilita ningún dato sobre el contenido de glucósidos de esteviol en el producto final. Naturalmente, este tipo de tratamiento no puede proporcionar por sí solo un extracto altamente purificado, especialmente debido a los polisacáridos, los metales pesados y las esterebinas, que permanecen en el extracto clarificado. Además, tampoco se facilitan datos sobre la semivida y la capacidad de adsorción del portador, que son muy importantes cuando el procedimiento se lleva a cabo en régimen continuo.

Se diseñaron adsorbentes poliméricos con grupos -N+(CH3)3 y se aplicaron a la purificación de los glucósidos de esteviol y al enriquecimiento del rebaudiósido A (Shi y otros, 2002). En una serie de cinco columnas, el contenido de rebaudiósido A aumentó desde el producto de la primera columna al producto de la quinta columna. Al mismo tiempo, el adsorbente mostró capacidad de decoloración.

En Starratt y otros, 2002, se aisló rebaudiósido F por cromatografía líquida en gel de sílice funcionalizado con un grupo 3-aminopropilo. Las fracciones ricas en rebaudiósido C y rebaudiósido F se combinaron y se separaron por HPLC en una columna de hidratos de carbono Waters con un gradiente lineal de acetonitrilo y agua.

En Yoda y otros, 2003, se describe la preparación de extracto de Stevia por extracción con fluido supercrítico. Se trata de un procedimiento de dos etapas: (i) la extracción en CO2 a 200 bar y 30ºC, y (ii) la extracción con CO2 + agua. Se recuperaron aproximadamente el 72% de los compuestos solubles en CO2 y el compuesto principal fue la austroinulina. El sistema Stevia + CO2 + agua fue capaz de eliminar aproximadamente el 50% del esteviósido original y aproximadamente el 72% del rebaudiósido A. Los principales inconvenientes de este método son la necesidad de presión elevada y un índice de extracción bajo de los compuestos dulces. Además, no se facilita ninguna información sobre el contenido de compuestos secundarios y de glucósidos de esteviol totales en el extracto final. Este procedimiento es difícil de aplicar a escala comercial.

Se utilizó la extracción de líquido a presión con agua o metanol para la extracción de esteviósido de la Stevia rebaudiana Bertoni (Pol y otros, 2007). Se determinó como óptima una temperatura de 110ºC para la extracción del esteviósido de las hojas de Stevia rebaudiana utilizando agua o metanol. El aumento de la temperatura provocó una

13 5

15

25

35

45

55

65

degradación significativa del esteviósido en el medio de los dos disolventes, o una disminución del rendimiento de la extracción en agua. Los dos disolventes dieron lugar a una extracción de esteviósido con una reproducibilidad muy parecida, y los parámetros de extracción propuestos son los mismos para ambos métodos. La utilización de agua representa una alternativa al metanol más respetuosa con el medio ambiente y más económica.

En Kovylyaeva y otros, 2007, se describe un método de preparación y purificación de extracto de Stevia. Este método incluyó la extracción de hojas secas con 14 volúmenes de agua destilada durante 1 hora a temperatura de ebullición, la filtración y la concentración del filtrado hasta el estado de jarabe. Este jarabe se diluyó, se añadió AlCl3·6H2O y se agitó hasta su disolución. La mezcla se agitó y se trató con una solución acuosa de NaOH. El precipitado se filtró y el filtrado se hizo pasar a través de una columna rellena con Al2O3. La columna se eluyó con agua destilada, obteniéndose una solución de color marrón claro. La purificación adicional de esteviósido, rebaudiósido A y rebaudiósido C se llevó a cabo por extracción con n-butanol y cromatografía en columna sobre Al2O3 y gel de sílice. Este método no es capaz de proporcionar un extracto de Stevia de pureza elevada. Se utiliza una gran cantidad de sales para el tratamiento previo. Este procedimiento de purificación es difícil de aplicar a escala comercial.

En Bandna y otros (2009) se describe un procedimiento eficiente de extracción de esteviósido y rebaudiósido A asistida por microondas. Se extrajeron hojas secas y reducidas a polvo de Stevia rebaudiana mediante técnicas de extracción convencionales, por ultrasonidos y asistidas por microondas, utilizando metanol, etanol y agua, solos o en mezclas binarias, como disolventes. Se llevó a cabo una extracción convencional en frío a 25ºC durante 12 h, mientras que la extracción con ultrasonidos se realizó a una temperatura de 35 ± 5ºC durante 30 min. La extracción asistida por microondas se llevó a cabo a una potencia de 80 W durante 1 min a 50ºC. La extracción asistida por microondas produjo un 8,64% y un 2,34% de esteviósido y de rebaudiósido A, respectivamente, mientras que las técnicas convencional y con ultrasonidos produjeron un 6,54% y un 1,20%, y un 4,20 y un 1,98% de esteviósido y rebaudiósido A, respectivamente.

También se alcanzó un aislamiento eficiente de los glucósidos de esteviol utilizando una extracción a presión con agua caliente (Teo y otros, 2009). Puede encontrarse asimismo una exposición de los glucósidos de esteviol en “Steviol-glycosides: New natural sweeteners”, TRAC, TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 1, nº 11, 1 de julio de 1982, páginas 246-248 (Tanaka et al.).

Todos los métodos existentes se refieren al aislamiento y la purificación de uno u otro glucósido de esteviol a partir del extracto inicial, y no indican ninguna vía para el tratamiento posterior de la solución residual o la purificación de los compuestos minoritarios. Por consiguiente, existe la necesidad de encontrar un método eficiente y económico para el retratamiento integral del extracto producido a partir de la planta Stevia rebaudiana Bertoni.

Sin embargo, no existen datos publicados sobre el aislamiento y la purificación comerciales del rebaudiósido D, que posee unas excelentes propiedades organolépticas.

El contenido de rebaudiósido D en el extracto es muy bajo y, debido a ello, su purificación es muy compleja.

Por consiguiente, existe la necesidad de encontrar un método eficiente y económico para la preparación de rebaudiósido D con una pureza elevada, que se puede utilizar como edulcorante en las industrias alimenticia, de bebidas, farmacéutica, cosmética y otras.

Sumario de la invención

No de acuerdo con la presente invención existe un procedimiento para el aislamiento y la purificación de glucósidos dulces individuales de la planta Stevia rebaudiana Bertoni, y más particularmente para el aislamiento y la purificación del rebaudiósido D y su aplicación como edulcorante.

El principal problema técnico que se debe resolver es proporcionar un método muy eficiente de aislamiento y purificación de diferentes glucósidos de esteviol, particularmente el rebaudiósido D, a partir del extracto de Stevia.

Existe un procedimiento para el retratamiento del extracto de Stevia rebaudiana Bertoni mediante el aislamiento y la purificación de los glucósidos dulces individuales altamente purificados, particularmente el rebaudiósido D.

El rebaudiósido D altamente purificado, solo o en combinación con otros edulcorantes y/u otros ingredientes, es útil como edulcorante acalórico en composiciones comestibles y masticables, tales como bebidas, productos de confitería, repostería, galletas, gomas de mascar y similares.

Se han desarrollado el aislamiento y la purificación de rebaudiósido D a partir de extracto de Stevia. En una forma de realización, el método de aislamiento y purificación del rebaudiósido D comprende tratar el extracto de Stevia con un primer alcohol o solución de alcohol y agua a fin de formar una primera mezcla, obtener un primer precipitado, que contiene rebaudiósido A y rebaudiósido D, a partir de la primera mezcla, tratar el primer precipitado con un segundo alcohol o solución de alcohol y agua para formar una segunda mezcla, obtener un segundo

14

imagen7

La presente invención proporciona rebaudiósido D altamente purificado a partir del extracto de Stevia y su posterior utilización.

5 En adelante, el término “altamente purificado” se refiere a una composición de rebaudiósido D que incluye, como mínimo, aproximadamente 91% de rebaudiósido D con respecto al peso en seco.

A continuación se describen con detalle unas formas de realización ejemplificativas de la presente invención, que se ilustran en las figuras 3 a 6.

10 Sin embargo, en la descripción detallada, únicamente se muestran, a título ilustrativo, algunas formas de realización ejemplificativas. Como reconocerán los expertos en la materia, la presente invención puede realizarse de muchas formas diferentes y no debe interpretarse como limitada a las formas de realización que se exponen en la presente memoria.

15 Los glucósidos de diterpeno, incluidas las sustancias de sabor dulce, se encuentran en los tallos, las semillas y las hojas de la planta S. rebaudiana Bertoni, estando presentes en una concentración más elevada en las hojas. Por consiguiente, las hojas son el material de partida preferente para la recuperación de los glucósidos dulces.

20 La purificación del rebaudiósido D se lleva a cabo a partir de extracto comercial de Stevia. El contenido de rebaudiósido D en el extracto puede variar dependiendo de la variedad de Stevia o del procedimiento tecnológico de preparación del extracto.

Se utilizó un extracto de Stevia que contenía un 25,40% de esteviósido, un 59,14% de rebaudiósido A, un 9,71% de

25 rebaudiósido C, un 2,03% de rebaudiósido D, un 0,56% de rebaudiósido B, un 0,68% de rebaudiósido E, un 1,02% de rebaudiósido F, un 0,11% de esteviolbiósido y un 1,35% de dulcósido como material de partida de ejemplo para ilustrar la purificación del rebaudiósido D.

Haciendo referencia a la figura 3, se da a conocer una purificación de una etapa de rebaudiósido A de pureza

30 elevada con un contenido relativamente elevado de rebaudiósido D, según una forma de realización de la presente invención. Se disolvió extracto de Stevia en una primera solución de etanol y agua a 50-70ºC, preferentemente a 55-60ºC, durante aproximadamente 10-30 min, preferentemente 15-20 min, y a continuación a 15-40ºC, preferentemente a 20-22ºC durante aproximadamente 18-48 horas, preferentemente 20-24 horas, con agitación. Cuando la temperatura alcanzó los 22ºC, se añadió un 1-2% (p/v) de rebaudiósido A altamente purificado a la

35 mezcla de reacción como iniciador de la cristalización. La proporción de extracto con respecto a primera solución de etanol y agua dependió del contenido de glucósidos menores y estuvo comprendida dentro del intervalo 1,0:2,51,0:10,0 p/v, preferentemente 1,0:3,0-5,0 p/v.

Durante este tiempo, se formó un primer precipitado, que se separó por filtración o centrifugación.

40 La concentración de etanol en la primera solución de etanol y agua está comprendida entre el 75% y el 99%, preferentemente entre el 82% y el 88%. El contenido de rebaudiósido A y rebaudiósido D en el primer precipitado está comprendida entre el 79% y el 99%, y entre el 0,8 y el 4,0%, respectivamente.

45 La pureza y el rendimiento de rebaudiósido A dependieron de la proporción de extracto con respecto a solución de etanol y agua, y de la concentración de etanol. Los datos para diversas concentraciones de etanol se indican en la tabla 3. La relación extracto:metanol fue de 1:3,0 p/v.

El grado de purificación y la producción de rebaudiósido A para diversos volúmenes de solución de etanol al 88% se 50 indican en la tabla 4.

Tabla 3

Etanol, %

Glucósidos de esteviol, % Rendimiento, %

Est.

RebA RebC RebD RebB RebE RebF Esteb. DulA

75

0,1 98,9 0,2 0,8 0 0 0 0 0 19,2

78

0,1 98,6 0,2 1,0 0,1 0 0 0 0 21,3

80

0,1 98,2 0,2 1,4 0,1 0 0 0 0 23,4

82

0,1 97,8 0,2 1,8 0,1 0 0 0 0 23,7

85

0,1 97,6 0,2 2 0,1 0 0 0 0 24,1

87

0,3 96,7 0,4 2,5 0,1 0 0 0 0 25,6

88

0,4 95,6 0,3 3,5 0,1 0,1 0 0 0 33,0

89

0,8 94,2 0,7 3,5 0,2 0,1 0,2 0 0,3 35,4

16

imagen8

Etanol, %

Relación etanol/sólido, v/p Pureza del producto para diferentes contenidos de rebaudiósido B, % (el contenido de rebaudiósido D fue del 0,4%)

0%

0,4% 0,8% 1,1%

3,0

98,2 97,9 97,6 97,4

3,5

98,5 98,2 97,8 97,6

87,0

2,5 96,3 97,2 96,6 96,4

3,0

97,5 97,6 97,4 97,0

3,5

97,9 97,9 97,6 97,2

88,0

2,5 96,1 95,9 95,5 95,1

3,0

97,3 97,1 96,4 95,8

3,5

97,7 97,5 97,2 96,8

90,0

2,5 94,6 94,1 92,3 90,5

3,0

96,3 95,8 92,8 91,2

3,5

97,3 96,8 93,7 91,9

Tabla 7

Etanol, %

Relación etanol/sólido, v/p Pureza del producto para diferentes contenidos de rebaudiósido D, % (el contenido de rebaudiósido B fue del 0,1%)

0,5%

1,2% 1,7% 2,6%

81,0

2,5 98,7 98,0 97,5 97,1

3,0

98,9 98,3 98,0 97,4

3,5

99,2 98,5 98,2 97,7

83,0

2,5 98,1 97,7 97,3 97,0

3,0

98,5 98,1 97,8 97,4

3,5

98,8 98,4 98,0 97,6

85,0

2,5 97,7 97,5 97,1 96,8

3,0

98,2 97,8 97,6 97,1

3,5

98,5 98,1 97,8 97,2

87,0

2,5 96,3 96,2 95,8 94,2

3,0

97,5 97,3 96,7 96,1

3,5

97,9 97,6 97,4 96,9

88,0

2,5 96,1 95,7 95,2 93,7

3,0

97,3 97,1 96,5 95,6

3,5

97,7 97,4 97,0 96,6

90,0

2,5 94,6 94,2 93,5 93,0

3,0

94,8 94,8 93,9 93,3

3,5

95,7 95,4 94,4 93,5

Tabla 8

Volumen adicional de etanol, p/v con respecto a los sólidos

Rendimiento y pureza de RebA para diferentes concentraciones de etanol (relación etanol/extracto = 1:3,5, p/v)

85%

86% 87% 88%

Rendimiento, %

RebA, % Rendimiento, % RebA, % Rendimiento, % RebA, % Rendimiento, % RebA, %

0

29,5 98,5 30,6 98,3 32,7 97,9 33,3 97,8

0,5

31,4 98,5 31,6 98,2 33,4 97,9 33,8 97,6

0,6

32,3 98,2 32,7 98,2 34,3 97,8 34,7 97,6

0,7

33,5 97,9 33,9 97,7 35,4 97,6 35,9 97,5

0,8

34,1 97,9 35,2 97,7 36,3 97,6 36,7 97,4

0,9

34,3 97,8 35,4 97,6 36,7 97,5 37,4 97,4

1,0

34,5 97,8 35,7 97,5 36,9 97,4 37,7 97,2

Para producir rebaudiósido A de pureza elevada, el procedimiento se puede llevar a cabo a 30-50ºC y sin etapa de enfriamiento. Aunque la pureza del rebaudiósido A fue mayor, se obtuvo un menor rendimiento del producto. La

10 calidad del producto aumentó para temperaturas de lavado más altas. Los resultados obtenidos utilizando 3,5 volúmenes de etanol al 85% para una parte de extracto tras 24 horas, y con y sin etapa de precipitación posterior, se indican en la tabla 9.

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Claims (1)

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