CN111879865B - 甜叶菊糖甙分离鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种甜叶菊糖甙分离鉴定方法，其包括如下步骤：确定采用LC‑MS/MS检测分析参数条件，利用标准品建立标准曲线；提取甜叶菊的糖甙样品制备成供试品溶液，上机测试，根据各标准曲线换算出甜叶菊中9种糖甙的含量。该甜叶菊糖甙分离鉴定方法，前处理简单，能够准定量甜叶菊中9种糖甙的含量，快速灵敏，可靠性好。
Description
技术领域
本发明涉及检测分析技术领域，尤其涉及一种甜叶菊糖甙分离鉴定方法。
背景技术
甜叶菊，菊科斯泰比亚属，多年生草本植物。甜菊糖甙是从甜叶菊的叶和茎中提取出来的高甜度、低热量的天然甜味剂，主要有以下9种：甜菊甙(Stevioside)、瑞鲍迪甙(Rebaudioside A、Rebaudioside B、Rebaudioside C、Rebaudioside D、Rebaudioside E、Rebaudioside F)、杜克甙(Dulcoside A)和甜茶甙(Rubusoside)。
然而，常规方法无法同时实现对上述9种糖甙的快速鉴定分析。
发明内容
基于此，有必要提供一种甜叶菊糖甙分离鉴定方法，能够对甜叶菊中9种糖甙进行快速分离鉴定。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种甜叶菊糖甙分离鉴定方法，包括如下步骤：
确定LC-MS/MS检测分析的参数条件，色谱条件：柱温28℃～32℃，流动相A为含0.008％～0.012％甲酸的水，流动相B为含0.008％～0.012％甲酸的乙腈，采用梯度洗脱方式；质谱条件包括：采用ESI离子源，负离子模式，采用MRM扫描模式；
将糖甙标准品按照所述参数条件上机测试，建立标准曲线，其中：
甜菊甙的定量离子对803.4/641.3，保留时间5.09min；
瑞鲍迪甙A的定量离子对965.4/803.3，保留时间5.04min；
瑞鲍迪甙B的定量离子对803.5/641.3，保留时间5.76min；
瑞鲍迪甙C的定量离子对950/788，保留时间5.3min；
瑞鲍迪甙D的定量离子对1127.5/803.3，保留时间4.41min；
瑞鲍迪甙E的定量离子对965.5/641.5，保留时间4.35min；
瑞鲍迪甙F的定量离子对935.5/773.4，保留时间5.21min；
杜克甙A的定量离子对787.4/625.3，保留时间5.35min；
甜茶甙的定量离子对641.3/479.2，保留时间5.6min；
采用甲醇水溶液提取甜叶菊得提取物溶液，浓缩，再采用甲醇水溶液复溶，过滤，得供试品溶液；
将所述供试品溶液按照所述参数条件上机测试，根据各标准曲线分别对甜叶菊中9种糖甙进行定量。
在其中一个实施例中，所述色谱柱为WatersACQUITY HSS T3柱，进样量2μL。
在其中一个实施例中，采用流速为0.32mL/min～0.38mL/min，所述梯度洗脱程序为：
0min，流动相A与流动相B的体积比为90:10；
10min，流动相A与流动相B的体积比为10:90；
10.1min～11.0min，流动相A与流动相B的体积比为10:90；
11.1min～14.0min，流动相A与流动相B的体积比为90:10。
在其中一个实施例中，所述质谱条件包括：离子源温度350℃，气帘气压力为20psi，辅助加热气Gas1压力为20psi，辅助加热气Gas2压力为0psi，碰撞气为Medium。
具体地，所述LC-MS/MS检测所用的数据采集仪器系统包括超高效液相色谱Shimpack UFLC SHIMADZU CBM30A和串联质谱MS/MS Applied Biosystems6500Quadrupole Trap。
在其中一个实施例中，所述甲醇水溶液为65％-75％甲醇水溶液。
在其中一个实施例中，所述采用甲醇水溶液提取甜叶菊包括如下步骤：
冻干甜叶菊样本，研磨成甜叶菊粉末；
按照重量体积比(20～30):(900-1100)向所述甜叶菊粉末中加入所述甲醇水溶液，涡旋混匀，多次震荡提取，合并提取液。
优选地，所述甜叶菊粉末和所述甲醇水溶液的重量体积比为25:1000。
优选地，所述震荡提取的次数为2-3次，每次震荡提取8-15min。
本发明的有益效果是：
与现有技术相比，本发明甜叶菊糖甙分离鉴定方法通过筛选特定的提取条件和分析参数条件，前处理简单，且能够实现高效定量分析甜叶菊中9中糖甙成分，灵敏度高，可靠性好。
附图说明
图1为实施例1中9种糖甙标准品的XIC重叠图。
图2为实施例1中浓度10ppm的Dulcoside A(简称DA)标准品的XIC图。
图3为实施例3甜菊苷样品检测图。
图4为实施例3甜菊苷样品中Dulcoside A(简称DA)的XIC图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明中LC-MS/MS检测所用的数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(Shimpack UFLC SHIMADZU CBM30A)和串联质谱MS/MS(Applied Biosystems6500Quadrupole Trap)。
实施例1
结合图1和2，本实施例提供一种多种糖甙分离鉴定方法，包括如下步骤：
S1，确定采用LC-MS/MS检测分析的参数条件。
其中，色谱条件如下：
色谱柱：采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3，柱温30℃，洗针液为50％甲醇(超声脱气10min)，进样量2μL。
流动相：流动相A为含0.01％甲酸的水，流动相B为含0.01％甲酸的乙腈。梯度洗脱程序如下表1：
表1梯度洗脱程序表
| 时间(min) | 流速(mL/min) | A(％) | B(％) |
| 0min | 0.35 | 90 | 10 |
| 10min | 0.35 | 10 | 90 |
| 10.1→11.0min | 0.35 | 10 | 90 |
| 11.1→14.0min | 0.35 | 90 | 10 |
表2质谱参数条件
| 离子源(Ion Mode) | ESI- | 气帘气(Curtain Gas) | 20 |
| 雾化器电流(Nebulizer Current) | 3 | 温度(Temperature) | 350 |
| 喷雾气(Ion Source Gas1) | 20 | 辅助加热气(Ion Source Gas2) | 0 |
| 喷撞气(Collision Gas) | Medium | 扫描模式(Scan type) | MRM |
S2，建立标准曲线。
分别配制不同浓度(范围在0.005-10μg/mL)的9种糖甙标准品溶液，按照步骤S1的参数条件上机测试，获取各个浓度标准品的对应定量信号的质谱峰强度数据。以标准品浓度(μg/mL)为横坐标，质谱峰的峰面积(Peak Area)为纵坐标，绘制不同糖甙的标准曲线。
其中，9种糖甙的定量离子对信息如下表3：
表3 9种糖甙的定量离子对信息
| 物质名称 | 母离子 | 子离子 | 保留时间(min) |
| Rebaudioside A(简称RA) | 965.4 | 803.3 | 5.04 |
| Rebaudioside B(简称RB) | 803.5 | 641.3 | 5.76 |
| Rebaudioside C(简称RC) | 950 | 788 | 5.3 |
| Rebaudioside D(简称RD) | 1127.5 | 803.3 | 4.41 |
| Rebaudioside E(简称RE) | 965.5 | 641.5 | 4.35 |
| Rebaudioside F(简称RF) | 935.5 | 773.4 | 5.21 |
| Stevioside(简称St) | 803.4 | 641.3 | 5.09 |
| Rubusoside(简称Rub) | 641.3 | 479.2 | 5.6 |
| Dulcoside A(简称DA) | 787.4 | 625.3 | 5.35 |
9种糖甙的标准曲线见下表4：
表4 9种糖甙的标准曲线汇总表
| 物质名称 | 线性方程 | 相关系数 |
| Rebaudioside A | y＝1.79986e6x+3.44599e4 | r＝0.99911 |
| Rebaudioside B | y＝1.29503e6x-25.01452 | r＝0.99235 |
| Rebaudioside C | y＝1.18293e5x+3445.83081 | r＝0.99910 |
| Rebaudioside D | y＝9.57174e5x+15926.61826 | r＝0.99952 |
| Rebaudioside E | y＝1.05292e6x+8236.16294 | r＝0.99879 |
| Rebaudioside F | y＝1.15278e5x+808.39950 | r＝0.99994 |
| Stevioside | y＝2.09515e6x+9.50057e4 | r＝0.99318 |
| Rubusoside | y＝1.80520e6x+21881.98987 | r＝0.99267 |
| Dulcoside A | y＝2.16823e6x+21454.92230 | r＝0.99441 |
由表4可以看出，采用本实施例测试条件可以同时测试9种糖甙的含量，在定量范围内均具有良好的线性(线性方程的相关系数r>0.99)，可实现准确定量。
实施例2方法学验证
采用实施例1确定的LC-MS/MS检测分析条件对9种糖甙进行方法学验证。
其中，9种糖甙标准品的线性范围及定量限确定结果如下表5所示，回收率结果统计如下表6所示：
表5 9种糖甙的线性范围与定量限测试结果统计表
表6 9种糖甙的回收率测试结果统计表
由表5和表6可以看出，采用本发明糖甙分离鉴定方法的线性范围宽，最低检测浓度低，且在空白样品中加标准品混合液后的回收率在50～130％之间，方法整体可靠性较好。
实施例3甜叶菊样品测试
样品：甜叶菊样品2份，分别命名为SAMPLE-1和SAMPLE-2。
提取液：70％甲醇水溶液。
提取以及制备供试品溶液：将甜叶菊冻干，研磨成粉末，准确称取25mg粉末，向粉末中加入0.5mL提取液，涡旋混匀后，于室温条件振荡提取10min，离心，得第一沉淀和第一上清液。再向第一沉淀中加入0.5mL提取液，再次震荡提取，得第二沉淀和第二上清液。将第一上清液和第二上清液合并，真空浓缩，之后采用70％甲醇水溶液复溶，过滤，得供试品溶液。
按照实施例1中液质联用分析方法参数条件进行分析测试，实际甜菊叶样本中9种糖甙的XIC图如图3所示，其中DA的XIC图如图4所示。
另外，根据实施例1获得的线性方程计算，实际甜叶菊样本中9种糖甙的含量(浓度:μg/mL)如下表7所示：
表7甜叶菊样品中测得9中糖苷的含量
| 待测成分名称 | SAMPLE-1 | SAMPLE-2 |
| Rebaudioside A | 22.990μg/mL | 21.374μg/mL |
| Rebaudioside B | 0.780μg/mL | 0.720μg/mL |
| Rebaudioside C | 17.060μg/mL | 14.794μg/mL |
| Rebaudioside D | 3.942μg/mL | 3.746μg/mL |
| Rebaudioside E | 5.333μg/mL | 5.199μg/mL |
| Rebaudioside F | 2.006μg/mL | 1.807μg/mL |
| Stevioside | 11.102μg/mL | 10.465μg/mL |
| Rubusoside | 0.485μg/mL | 0.399μg/mL |
| Dulcoside A | 4.327μg/mL | 4.138μg/mL |
本发明利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据，根据糖甙保留时间和离子对信息，对每种糖甙在样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确。对样本中糖甙行定性定量分析，每个色谱峰的峰面积(Peak Area)对应代表糖甙的相对含量高低，最终得到样本中9种糖甙的定性和定量分析结果，可靠性好，且快速灵敏。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种甜叶菊糖甙分离鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
确定LC-MS/MS检测分析的参数条件，色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY HSS T3柱，柱温28℃~32℃，流动相A为含0.008%~0.012%甲酸的水，流动相B为含0.008%~0.012%甲酸的乙腈，采用流速为0.32 mL/min ~0.38mL/min的梯度洗脱方式：
0 min，流动相A与流动相B的体积比为90:10；
10min，流动相A与流动相B的体积比为10:90；
10.1 min ~11.0min，流动相A与流动相B的体积比为10:90；
11.1 min ~14.0min，流动相A与流动相B的体积比为90:10；
质谱条件包括：采用ESI离子源，负离子模式，离子源温度350℃，气帘气压力为20psi，辅助加热气Gas1压力为20psi，辅助加热气Gas2压力为0psi，碰撞气为Medium，采用MRM扫描模式；
将糖甙标准品按照所述参数条件上机测试，建立标准曲线，其中：
甜菊甙的定量离子对803.4/641.3，保留时间5.09min；
瑞鲍迪甙A的定量离子对965.4/803.3，保留时间5.04min；
瑞鲍迪甙B的定量离子对803.5/641.3，保留时间5.76min；
瑞鲍迪甙C的定量离子对950/788，保留时间5.3min；
瑞鲍迪甙D的定量离子对1127.5/803.3，保留时间4.41min；
瑞鲍迪甙E的定量离子对965.5/641.5，保留时间4.35min；
瑞鲍迪甙F的定量离子对935.5/773.4，保留时间5.21min；
杜克甙A的定量离子对787.4/625.3，保留时间5.35min；
甜茶甙的定量离子对641.3/479.2，保留时间5.6min；
按照重量体积比(20~30mg）:(900~1100μL)向甜叶菊粉末中加入65%-75%甲醇水溶液，多次震荡提取甜叶菊得提取物溶液，浓缩，再采用甲醇水溶液复溶，过滤，得供试品溶液；
将所述供试品溶液按照所述参数条件上机测试，根据各标准曲线分别对甜叶菊中9种糖甙进行定量。
2.根据权利要求1所述的甜叶菊糖甙分离鉴定方法，其特征在于，所述色谱条件的进样量为2μL。
3.根据权利要求1或2所述的甜叶菊糖甙分离鉴定方法，其特征在于，所述LC-MS/MS检测所用的数据采集仪器系统包括超高效液相色谱Shimpack UFLC SHIMADZU CBM30A和串联质谱MS/MS Applied Biosystems 6500Quadrupole Trap。
4.根据权利要求1或2所述的甜叶菊糖甙分离鉴定方法，其特征在于，采用甲醇水溶液提取甜叶菊包括如下步骤：
冻干甜叶菊样本，研磨成甜叶菊粉末；
按照重量体积比(20~30mg）:(900~1100μL)向所述甜叶菊粉末中加入所述甲醇水溶液，涡旋混匀，多次震荡提取，合并提取液。
5.根据权利要求4所述的甜叶菊糖甙分离鉴定方法，其特征在于，所述甜叶菊粉末和所述甲醇水溶液的重量体积比为25mg:1000μL。
6.根据权利要求4所述的甜叶菊糖甙分离鉴定方法，其特征在于，所述震荡提取的次数为2-3次，每次震荡提取8-15min。
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