ES2250460T3 - Procedimiento para la preparacion de glucosido de antocianidina purificado. - Google Patents
Procedimiento para la preparacion de glucosido de antocianidina purificado.Info
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Abstract
Un procedimiento para la preparación de glucósido de antocianidina purificado, en el cual se deja actuar la ramnosidasa sobre una composición de antocianina que contiene al menos un tipo de rutinosido de antocianidina para convertir el rutinosido de antocianidina en glucósido de antocianidina, el cual está luego aislado y purificado.
Description
Procedimiento para la preparación de glucósido de
antocianidina purificado.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para producir antocianina purificada a partir de la
antocianina derivada del producto natural así como a un
procedimiento para producir antocianina cristalina mediante la
cristalización posterior de la antocianina purificada.
De forma más particular, la presente invención se
refiere a un procedimiento que facilita los pasos posteriores de
purificación y cristalización mediante la conversión enzimática o la
eliminación del rutinosido de la antocianidina o del glucósido de la
antocianidina que componen las antocianinas para disminuir el
rutinosido de la antocianidina o el glucósido de la
antocianidina
El antociano es un término genérico para la
antocianidina, que posee una columna vertebral representada por la
fórmula siguiente (I), en combinación con la antocianina, que es un
glicósido formado por el enlace del sacárido a la antocianidina.
\vskip1.000000\baselineskip
| Compuesto | R^{1} | R^{2} |
| delfinidina | OH | OH |
| cianidina | OH | H |
| malvidina | OCH_{3} | OCH_{3} |
| pelargonidina | H | H |
| peonidina | OCH_{3} | H |
| petunidina | OCH_{3} | OH |
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos de antocianidina, es decir, un
aglicón, incluyen la delfinidina, cianidina, malvidina,
pelargonidina, peonidina y petunidina. La antocianina se denomina
glucósido de antocianidina cuando, por ejemplo, la glucosa está
enlazada a la antocianidina como glicósido. El sacárido encontrado
en la antocianina incluye: un monosacárido como la galactosa y
arabinosa añadidas a la glucosa; y un disacárido como la rutinosa y
la soforosa.
Los antocianos están muy presentes en la
naturaleza, y se utilizan principalmente como pigmento natural para
la alimentación o, debido a sus funcionalidades, se utilizan
extensivamente en Europa para los productos farmacéuticos,
cuasi-medicamentos, cosméticos y similares. Por
ejemplo, se ha descubierto la utilización de los mismos como
cicatrizante, tal como se revela en la Publicación de la Patente
Japonesa Revisada (Kokoku) No. 59-53883, o las
propiedades farmacológicas de los mismos que son valiosas en el
tratamiento de las enfermedades de la sangre periférica mediante la
utilización de la antocianina derivada del arándano, tal como se
revela en la Publicación de la Patente Japonesa Expuesta (Kokai) No.
3-81220. Recientemente, ha llamado la atención en
Japón la funcionalidad de la antocianina para utilizaciones de la
antocianina distintas de como pigmento.
Los presentes inventores han descubierto también
varias eficacias útiles en la antocianina de la grosella negra y
éstas vienen indicadas en la WO 01/01798.
Cuando estas antocianinas con propiedades
farmacológicas son utilizadas como productos farmacéuticos y
similares, se las requiere altamente purificadas. Hasta ahora, sin
embargo, no se ha realizado nunca la producción masiva de
antocianinas altamente purificadas. Además, aunque las antocianinas
altamente purificadas sean preferentemente cristalinas desde el
punto de vista de la estabilidad, higroscopicidad, y similares, del
mismo modo la producción masiva de antocianinas cristalinas tampoco
se ha realizado hasta ahora.
Convencionalmente, las composiciones de
antocianina para los productos farmacéuticos son preparaciones
principalmente derivadas del arándano con un contenido de
antocianina del 25% en peso o menos. Así, al menos varios cientos de
mg de preparación de antocianina tenían que ser administrados por
dosis para que pueda mostrar su efectividad, y el consumo de una
pequeña cantidad de la misma podría no producir ningún efecto
farmacológico en la práctica. En consecuencia, se han esperado
composiciones que contengan antocianina altamente purificada a altos
niveles.
La antocianina altamente purificada no estaba
presente por los siguientes motivos. Por ejemplo, en el caso de la
antocianina derivada del arándano, existen 15 tipos de componentes
de la antocianina, y las propiedades fisioquímicas de estas
sustancias son muy similares entre ellas. Así, los picos respectivos
de flujo de los mismos se superponen con los demás en la
purificación mediante la utilización de una columna preparativa o
algo similar. O, la separación y purificación eran imposibles porque
cada componente se encontraba en una muy pequeña cantidad.
En el caso de la antocianina derivada de la
grosella negra, por ejemplo, se encuentran como antocianinas cuatro
componentes, es decir,
cianidina-3-O-glucósido
(se abrevia a continuación como "C3G"),
cianidina-3-O-rutinosido
(se abrevia a continuación como "C3R"),
delfinidina-3-O-glucósido
(se abrevia a continuación como "D3G"), y
delfinidina-3-O-rutinosido
(se abrevia a continuación como "D3R"). Como con la
antocianina derivada del arándano, debido a unas propiedades
fisioquímicas muy similares entre las cuatro sustancias, incluso las
mezclas de estos cuatro componentes tienen unos picos
cromatográficos muy cercanos. Aunque se realizara la cromatografía
preparativa o la cromatografía de partición centrífuga para obtener
antocianina purificada, la producción masiva de la misma resultaba
imposible debido a una producción extremadamente deteriorada. La
proporción cuantitativa de las antocianinas representativas en la
grosella negra es como sigue: D3G, D3R, C3G y C3R están presentes
respectivamente en un 12,5%, 47,9%, 4,1% y 35,5%. En consecuencia,
la purificación de una gran cantidad de los componentes D3G y C3G,
que están contenidos a bajos niveles, implicaba otra dificultad, y
así se ha hecho esperar un procedimiento para la producción masiva
de antocianina purificada.
Por contraste, se sabe hasta ahora que el
antociano tiene un inconveniente en su estabilidad. Los presentes
inventores han solicitado una patente referente a un procedimiento
para estabilizar las sustancias que contienen antocianina a alto
nivel mediante la adición de ácido fítico, sacáridos, y alcoholes de
azúcar como estabilizadores (PCT/JP00/09204). Sin embargo, cuando se
utiliza gran cantidad de antocianina para elaborar las
preparaciones, no caben estos aditivos. En consecuencia, se
necesitaba unas propiedades físicas más estables y se hicieron
esperar las preparaciones con la utilización de antocianina
cristalina, lo que es físicamente más estable. Así,
convencionalmente, se sintetizó orgánicamente antocianina de gran
pureza para las aplicaciones farmacéuticas a través de muchos pasos
mediante, por ejemplo, un procedimiento para sintetizar el
clorohidrato de delfinidina (clorohidrato de antocianidina de un
aglicón en lugar de glicósido) tal como lo revela la Patente
Japonesa No. 3030509, aunque no se realizara la producción masiva de
la misma a partir de los productos naturales.
El clorohidrato de antocianidina producido por el
método de síntesis es estable en condiciones muy ácidas, sin
embargo, es probable que se degrade en comparación con un glicósido
en regiones poco ácidas a neutras. El rango de aplicaciones era por
lo tanto muy estrecho. En consecuencia, la producción de antocianina
que era más estable en regiones ácidas a neutras como los cristales,
se dejó pendiente, aunque la producción masiva de antocianina
mediante el procedimiento de síntesis orgánica sigue siendo
actualmente inutilizable.
Las características de las antocianinas se
relacionan en el Diccionario de Productos Naturales (editado por
Chapman & Hall, 1994, Londres). Por ejemplo, hasta ahora el
cristal de D3R no figura, y aunque la forma cristalina del
clorohidrato de D3G esté indicada, su punto de fusión no está
descrito. Esto indica que la producción masiva del mismo era
difícil. De forma similar, aunque el punto de fusión y la forma
cristalina del clorohidrato de C3R estén descritos, no existe
ninguna descripción sobre el punto de fusión del clorohidrato de
C3G. Esto indica que la producción masiva del mismo también era
difícil. Hasta ahora, se ha podido producir solamente una muy
pequeña cantidad de antocianina purificada, sin tener en cuenta si
es cristalina o no. Así, no existía sustancialmente ningún estudio
que haya investigado la reactividad de varias enzimas a la
antocianina. Especialmente, no existía ninguna descripción sobre la
reactividad de la ramnosidasa a la antocianina. En consecuencia, se
quedó pendiente un procedimiento para producir masivamente
antocianina altamente purificada a partir de productos naturales sin
utilizar procesos de síntesis complicados. Además, se dejó pendiente
también un procedimiento para producir masivamente sales de
antocianina cristalina mediante la cristalización de la antocianina
purificada.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
un proceso para producir antocianina purificada en el cual un
extremo de ramnosa de rutinosido de antocianidina se desdobla
mediante la utilización de ramnosidasa para convertir el componente
de rutinosido de antocianidina en glucósido de antocianidina,
purificándose y aislándose entonces el componente de glucósido de
antocianidina, o un procedimiento para producir hidrato de sal de
glucósido de antocianidina cristalina mediante la cristalización
posterior de la antocianina purificada.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un procedimiento para producir antocianina purificada en el cual
se desdobla un extremo de glucosa del glucósido de antocianidina
mediante la utilización de \beta-glucosidasa para
degradar y eliminar el extremo, purificándose y aislándose entonces
el componente de rutinosido de antocianidina, o un procedimiento
para producir el hidrato de sal de rutinosido de antocianidina
cristalino mediante la cristalización posterior de la antocianina
purificada.
De forma más específica, el primer aspecto de la
presente invención proporciona un procedimiento para producir
glucósido de antocianidina purificado, en el cual se deja actuar una
ramnosidasa sobre una composición de antocianina que contiene al
menos un tipo de rutinosido de antocianidina, y se somete el
rutinosido de antocianidina a hidrólisis para convertirlo en
glucósido de antocianidina, que se aísla y purifica luego.
El segundo aspecto de la invención proporciona un
procedimiento para producir rutinosido de antocianidina purificado,
en el cual se deja actuar la \beta-glucosidasa
sobre una composición de antocianina que contiene al menos un tipo
de glucósido de antocianidina y rutinosido de antocianidina, y se
somete el glucósido de antocianidina a hidrólisis para reducir el
glucósido de antocianidina, aislándose y purificándose luego el
rutinosido de antocia-
nidina.
nidina.
En los aspectos primero y segundo anteriormente
mencionados, la composición de antocianina incluye un zumo de fruta
obtenido a partir de al menos un elemento seleccionado a partir de
grosella negra, higo, café, plátano, arándano, y similares, y/o un
concentrado de antocianina obtenido a partir de arroz silvestre
(Zizania aquatica Linn.), colocasia, y similares. La
ramnosidasa incluye la hesperidinasa, naringinasa y similares.
Además, la \beta-glucosidasa selectivamente puede
degradar solamente el enlace de \beta-glucósido
del glucósido de antocianidina sin degradar el enlace de
\beta-glucósido del rutinosido de antocianidina, y
los ejemplos específicos del mismo incluyen la
\beta-glucosidasa derivada de la almendra.
Un tercer aspecto de la presente invención
proporciona un procedimiento para producir hidrato de clorohidrato
de
antocianidina-3-O-glucósido
cristalino por medio de los pasos de:
- a)
- dejar la ramnosidasa actuar sobre una composición de antocianina que contiene al menos un tipo de rutinosido de antocianidina y someter el rutinosido de antocianidina a hidrólisis para convertirlo en glucósido de antocianidina;
- b)
- purificar el glucósido de antocianidina para obtener glucósido de antocianidina de una pureza del 99% o más alto; y
- c)
- cristalizar el glucósido de antocianidina mediante la utilización de un disolvente mixto de un sistema de ácido clorhídrico/alcohol.
Un cuarto aspecto de la invención, no de acuerdo
con la presente invención, proporciona un hidrato de clorohidrato de
antocianidina-3-O-glucósido
cristalino según el método de acuerdo con el tercer proceso
descrito.
El quinto aspecto de la presente invención
proporciona un procedimiento para producir hidrato de clorohidrato
de
antocianidina-3-O-rutinosido
cristalino a través de los pasos de:
- a)
- dejar la \beta-glucosidasa actuar sobre una composición de antocianina que contiene al menos un tipo de glucósido de antocianidina y rutinosido de antocianidina, y someter el glucósido de antocianidina a hidrólisis para reducir el glucósido de antocianidina;
- b)
- purificar el rutinosido de antocianidina para obtener rutinosido de antocianidina de una pureza del 99% o más alto; y
- c)
- cristalizar el rutinosido de antocianidina mediante la utilización de un disolvente mixto de un sistema de ácido clorhídrico/alcohol.
Un sexto aspecto de la presente invención (no de
acuerdo con la presente invención) proporciona un hidrato de
clorohidrato de
antocianidina-3-O-rutinosido
cristalino obtenido según el método de acuerdo con la quinta
in-
vención
vención
En los procedimientos tercero y quinto aquí
descritos, la purificación según el paso b) puede llevarse a cabo
por cromatografía de adsorción de intercambio iónico y/o HPLC, y el
disolvente mixto del sistema de ácido clorhídrico / alcohol
utilizado en el paso c) puede estar compuesto de una mezcla de ácido
clorhídrico / metanol
(5%/95% (v/v)).
(5%/95% (v/v)).
Un séptimo aspecto de la presente invención (no
de acuerdo con la presente invención) proporciona un 0,5 hidrato de
clorohidrato de
delfinidina-3-O-glucósido
cristalino que posee las propiedades físicas siguientes:
\newpage
| - Punto de fusión basado en un termoanálisis: 258ºC. | |||
| - Uv\lambda máx(\varepsilon): 517 nm (27500). | |||
| - FAB-MS m/z: M^{+}: 465 | |||
| - Fórmula molecular: C_{21}H_{21}O_{12}Cl \cdot 0,5H_{2}O | |||
| - Análisis elemental: | C | H | Cl |
| - Valores medidos: | 48,00 | 4,50 | 6,80 |
Un octavo aspecto de la presente invención
proporciona un 0,5 hidrato de clorohidrato de
cianidina-3-O-glucósido
cristalino que tiene las propiedades físicas siguientes:
| - Punto de fusión basado en un termoanálisis: 245ºC. | |||
| - Uv\lambda max(\varepsilon): 510 nm (26300). | |||
| - FAB-MS m/z: M^{+}: 449 | |||
| - Fórmula molecular: C_{21}H_{21}O_{11}Cl \cdot 0,5H_{2}O | |||
| - Análisis elemental: | C | H | Cl |
| - Valores medidos: | 48,80 | 4,70 | 6,90 |
Un noveno aspecto de la presente invención
proporciona un 1,5 hidrato de clorohidrato de
delfinidina-3-O-rutinosido
cristalino que tiene las propiedades físicas siguientes:
| - Punto de fusión basado en un termoanálisis: 224ºC. | |||
| - Uv\lambda max(\varepsilon): 520 nm (27800). | |||
| - FAB-MS m/z: M^{+}: 611 | |||
| - Fórmula molecular: C_{27}H_{31}O_{16}Cl \cdot 1,5H_{2}O | |||
| - Análisis elemental: | C | H | Cl |
| - Valores medidos: | 45,80 | 5,30 | 5,20 |
Un décimo aspecto de la presente invención
proporciona un 0,5 hidrato de clorohidrato de
cianidina-3-O-rutinosido
cristalino que tiene las propiedades físicas siguientes:
| - Punto de fusión basado en un termoanálisis: 214-226ºC. | |||
| - Uv\lambda max(\varepsilon): 512 nm (27400). | |||
| - FAB-MS m/z: M^{+}: 595 | |||
| - Fórmula molecular: C_{27}H_{31}O_{15}Cl \cdot 0,5H_{2}O | |||
| - Análisis elemental: | C | H | Cl |
| - Valores medidos: | 50,00 | 5,30 | 5,30 |
El término "antocianina" utilizado aquí se
refiere a un glicósido que ha sido preparado mediante la unión de
los sacáridos a la antocianidina, es decir, un aglicón, y los
ejemplos del mismo incluyen el glucósido, rutinosido, arabinósido y
galactósido a los cuales se han enlazado los sacáridos como la
glucosa, rutinosa, arabinosa y galactosa.
En la presente invención, las composiciones de
antocianina que contienen al menos un tipo de glucósido de
antocianidina y/o rutinosido de antocianidina que se utilizan en la
reacción enzimática pueden ser cualquier sustancia que contenga
antocianina. Los ejemplos de las mismas incluyen el zumo de fruta,
zumo concentrado, bebidas, soluciones de pigmentos, y polvos
comercialmente disponibles que son las materias primas para la
alimentación, productos farmacéuticos o similares. Preferentemente,
el zumo concentrado es el zumo de fruta obtenido a partir de al
menos un elemento seleccionado a partir de la grosella negra, higo,
café, plátano, arándano, y similares, y/o un concentrado de
antocianina que se obtiene a partir del arroz silvestre (Zizania
aquatica Linn.), colocasia, y similares. Los polvos se disuelven
primero en agua, un tampón, o similares para utilizar la solución en
la reacción. Con más preferencia, se utilizan las composiciones que
contienen antocianina a altos niveles las cuales se preparan según
el método indicado en WO 01/01798 por los presentes inventores. Como
se eliminan previamente los ácidos, sacáridos, polifenoles y
similares, se facilita la operación en la etapa de purificación
después de la reacción enzimática.
Los tipos de aglicón de la antocianina utilizados
para el proceso para producir antocianina purificada de acuerdo con
la presente invención no están particularmente limitados. Se
prefieren las antocianinas derivadas de la grosella negra y las
sales de las mismas. Una parte de aglicón de la antocianina derivada
de la grosella negra se compone solamente de delfinidina y
cianidina. En la reacción enzimática, sin embargo, no se considera
que estos dos tipos sean particularmente específicos para la
antocianidina, y pueden aplicarse a un glicósido de otra
antocianidina, por ejemplo, los glicósidos como la malvidina,
pelargonidina, petunidina, y la peonidina representada por la
fórmula (I). Además, el componente de antocianina derivada de la
grosella negra está compuesto de cuatro componentes:
cianidina-3-O-glucósido (C3G), cianidina-3-O-rutinosido (C3R), delfinidina-3-O-glucósido (D3G), y delfinidina-3-O-rutinosido (D3R).
cianidina-3-O-glucósido (C3G), cianidina-3-O-rutinosido (C3R), delfinidina-3-O-glucósido (D3G), y delfinidina-3-O-rutinosido (D3R).
Los tipos de sales que componen la sal de
antocianina cristalina incluyen las sales con ácidos minerales como
el ácido clorhídrico y el ácido sulfúrico y las sales con ácidos
orgánicos (sal de flavinium) como el ácido fosfórico, ácido
trifluoro-acético (TFA), y ácido acético. Desde el
punto de vista de una fácil cristalización, se prefieren las sales
con ácido clorhídrico, TFA y ácido fosfórico.
La ramnosidasa que se utiliza en la presente
invención no está particularmente limitada, y puede tener su origen
en los animales, plantas, microorganismos, y similares siempre que
tenga actividades de \alpha-ramnosidasa en el
extremo de la antocianina como mecanismo de acción. Sin embargo, es
importante que tenga pocas actividades de
\beta-glucosidasa. Además, se sabe que la
antocianina se degrada cuando se deja reposar en regiones neutras a
básicas durante largo período de tiempo, y su degradación se acelera
mediante el calentamiento. En consecuencia, es necesario que el
nivel de actividad sea alto a un pH de 4.0 o por debajo y a 40ºC o
por debajo. Los ejemplos preferidos de lo mismo incluyen la
hesperidinasa o naringinasa, prefiriéndose más la hesperidinasa. La
hesperidinasa incluye las sustancias derivadas del Aspergillus
niger que se producen industrialmente con el propósito de
degradar la hesperidina, que es un componente blanco opaco de las
mandarinas Satsuma. Hasta ahora no se conoce la reactividad de la
hesperidinasa derivada del Aspergillus niger a la
antocianina. La naringinasa incluye también las sustancias derivadas
del Aspergillus niger que se utilizan para mejorar el sabor
mediante la degradación de la naringina, que es un principio amargo
procedente de las naranjas cortadas o del Citrus aurantium
(natsu-mikan). Se debe observar que no se ha
indicado la aplicación de la naringinasa derivada del Aspergillus
niger a la antocianina.
La fuente de la
\beta-glucosidasa que se utiliza en la presente
invención no está particularmente limitada. Debe reaccionar con la
antocianina y tendría que tener una especificidad del substrato para
degradar solamente el enlace de \beta-glucósido
del glucósido de antocianidina sin degradar el enlace de
\beta-glucósido del rutinosido de antocianidina.
De forma específica, la \beta-glucosidasa adecuada
reacciona solamente con la glucosa terminal pero no reacciona con la
glucosa que está presente en el centro de la molécula. Como con la
ramnosidasa, el nivel de actividad tendría que ser alto a un pH de
4.0 o por debajo y a 40ºC o por debajo, y los ejemplos preferidos de
lo mismo incluyen la \beta-glucosidasa derivada
de la almendra. Aunque la \beta-glucosidasa
derivada de la almendra sea una \beta-glucosidasa
representativa, no existe ningún estudio que haya investigado la
reactividad a la antocianina.
Los ejemplos de tratamientos que utilizan la
reacción de la \beta-glucosidasa a la antocianina
incluyen la utilización convencional de la antocianasa, que es un
tipo de \beta-glucosidasa, para la decoloración y
eliminación del sabor amargo en la industria de los zumos de fruta
para el zumo de uva y el néctar de melocotón y similares, y en la
industria vinícola para los vinos y vinos espumosos incluidas los
champañas. Sin embargo, la antocianasa reacciona con y degrada tanto
el glucósido como el rutinosido de la antocianina. Así, no es
adecuada para la producción de antocianina purificada.
Las condiciones de reacción que permiten que
estas enzimas actúen sobre la antocianina no están particularmente
limitadas. Tal como se describe anteriormente, se sabe que la
antocianina se degrada cuando se deja reposar en regiones neutras a
básicas durante largo período de tiempo y su degradación se acelera
con la alta temperatura. Así, se prefiere una región ácida, y
preferentemente, no se somete a reacción a altas temperaturas.
De forma específica, es probable que la reacción
a un pH de 4.0 o por debajo y a 40ºC o por debajo sea más
preferible.
La concentración del substrato en la sustancia
que contiene antocianina que se utiliza en la reacción enzimática no
está particularmente limitada. Cuando la concentración es
extremadamente alta, la viscosidad de la solución de reacción
aumenta y la velocidad de reacción disminuye. Debido al temor de una
reacción inhibitoria por las sustancias en la solución de reacción o
la reacción de transición a un substrato, la concentración del
substrato es preferentemente del 10% (peso/volumen) o por debajo, y
con más preferencia del 5% (peso/volumen) o por debajo. La cantidad
de enzimas añadidas no está particularmente limitada con respecto al
tiempo de reacción.
Después de que el contenido de un substrato en la
sustancia que contiene antocianina, es decir, rutinosido de
antocianidina o glucósido de antocianidina, haya disminuido por la
reacción enzimática mediante la utilización de ramnosidasa o
\beta-glucosidasa, la reacción enzimática puede
finalizar por medio de los métodos comúnmente empleados, y los
ejemplos de los mismos incluyen la elevación de la temperatura por
calentamiento, el ajuste del pH mediante la adición de ácido o
álcali, y la adición de un disolvente orgánico. Tal como se describe
anteriormente, las antocianinas son inestables en las regiones
neutras a básicas y su degradación se acelera por calentamiento.
Así, la reacción enzimática finaliza preferentemente mediante la
disminución del pH con la adición de ácidos fuertes como el ácido
clorhídrico, TFA, y ácido fosfórico o mediante la adición de un
disolvente orgánico como el metanol.
En la presente invención, la purificación después
de la finalización de la reacción enzimática puede llevarse a cabo
mediante la cromatografía en columna así como mediante una
combinación adecuada de otra cromatografía, la adsorción de resina,
la separación de membranas, y similares, si resultara necesario. De
todos los métodos, la cromatografía que utiliza gel de
sílice-ODS es el más preferido. Si es necesario, el
componente de antocianina puede ser adsorbido primero en una resina
de intercambio catiónico o similar y luego ser eluído con el fin de
purificar similarmente él que está
pre-purificado.
El contenido de antocianina aquí está determinado
por la suma de los contenidos de cada uno de los componentes de
antocianina contenidos, que se calculan mediante el coeficiente de
pico de zona de la antocianina por HPLC, como con el descubrimiento
en la PCT/JP 00/09204 y la WO 01/01798.
De forma específica, se analiza primero por HPLC
una muestra de antocianina con un peso conocido y se prepara la
curva de calibración basándose en la zona de picos a 520 nm, para
determinar por este medio el contenido de cada componente de
antocianina. Además, el contenido de cada uno de los componentes se
divide por la zona de picos para determinar el coeficiente de
respuesta, es decir, la zona de mg/pico. Posteriormente, la muestra
que contiene antocianina se somete al análisis por HPLC, el
coeficiente de respuesta que estaba determinado a partir de la
muestra se multiplica por la zona de picos de cada componente para
calcular el contenido de cada componente. Así, la pureza de la
antocianina se determina como un porcentaje en peso (peso/peso)
basándose en la proporción con respecto a la cantidad inyectada. En
consecuencia, la pureza de la antocianina se calcula mediante la
inclusión de una cantidad de sacárido ligado además de una cantidad
de antocianidina, es decir, un aglicón. El nivel de pureza de la
antocianina purificada de acuerdo con la presente invención es del
99% o más alto basándose en el análisis por HPLC.
El proceso de cristalización de acuerdo con la
presente invención se lleva a cabo preferente y principalmente a
partir de un disolvente orgánico, y se utiliza preferentemente el
metanol como disolvente de cristalización. Como las antocianinas se
cristalizan mediante la generación de sales con ácidos, se prefiere
la adición de ácidos en el disolvente de cristalización.
Preferentemente, se añade aproximadamente del 1% al 5%
(volumen/volumen) de ácido clorhídrico, TFA, ácido fosfórico, o
similares.
El D3G cristalino, D3R cristalino, C3G cristalino
y C3R cristalino que se prepararon en el Ejemplo 1 ó 3 a
continuación, fueron sometidos a un termoanálisis, y los resultados
del mismo se facilitan más abajo.
El punto de fusión del D3G es de 258ºC, él del
D3R es de 224ºC, él del C3G es de 245ºC y él del C3R es de 214 a
226ºC. La sal de antocianina cristalina preparada de acuerdo con el
procedimiento de la presente invención es un cristal que tiene una
pureza del 99% o más basándose en la microscopia de polarización, el
análisis elemental, la determinación del punto de fusión, y el
análisis por HPLC, y es una sustancia muy estable sin
higroscopicidad y con un punto de fusión de 200ºC o más.
En el pasado, no se pudo producir antocianina muy
purificada o sal de antocianina cristalina. Con la utilización del
procedimiento de producción de acuerdo con la presente invención,
sin embargo, se ha podido producir a través de la purificación a
partir de productos naturales la antocianina muy purificada y la sal
de antocianina cristalina. Las sales de antocianina cristalina así
producidas no mostraban ninguna higroscopicidad y eran estables.
La presente invención se describirá con más
detalles con respecto a los ejemplos siguientes, los ejemplos de
referencia y los ejemplos comparativos. El alcance técnico de la
presente invención, sin embargo, no está limitado por estos
ejemplos.
Ejemplo de Referencia
1
De acuerdo con el procedimiento tal como se
describe en la WO 01/01798, se prepararon composiciones que
contienen antocianina a alto nivel. De forma específica, se
diluyeron 3 kg de zumo concentrado de grosella negra comercialmente
disponible (pureza de la antocianina por contenido sólido: 2,8%) con
agua para preparar zumo de fruta diluido con una concentración de Bx
10. Se filtró el zumo de fruta diluido con un papel de filtro para
eliminar las materias extrañas. A continuación, se llevó a cabo la
separación por membranas mediante la utilización de un separador de
membranas (NTR-7410, Nitto Denko Co., Ltd.). El
líquido concentrado obtenido por la separación por membranas se
deshidrató por aspersión para obtener una composición en polvo que
contenía antocianina a alto nivel. La pureza de la antocianina de
esta composición era del 14,1% por contenido sólido. Esta
composición mostró higroscopicidad cuando se dejó reposar a
temperatura ambiente.
El polvo obtenido en el Ejemplo de Referencia 1
(40 g) (pureza de la antocianina: 14,1%; proporción de cada
componente de antocianina: 12,5%, 47,9%, 4,1% y 35,5%
respectivamente para el D3G, D3R, C3G, y C3R) se disolvió en 1 litro
de 50 mM de tampón de acetato (pH de 3.5) para preparar una solución
de substrato de antocianina. El contenido calculado de antocianina
en la solución de substrato fue de 5,64 g, y los contenidos de D3G,
D3R, C3G y C3R fueron respectivamente de 0,71 g, 2,70 g, 0,23 g, y
2,00 g.
Aparte, se disolvieron 79,35 g de hesperidinasa
(nombre comercial: Hesperidinase Tanabe 2, Tanabe Seiyaku Co., Ltd.)
en 1 litro de 50 mM de tampón de acetato (pH de 3.5) para preparar
una solución enzimática (que correspondía a la actividad de la
ramnosidasa de 42,5 U/ml).
\global\parskip0.910000\baselineskip
La solución de substrato y la solución enzimática
se calentaron respectivamente a 40ºC y se mezclaron luego para
iniciar la reacción. La reacción se llevó a cabo a 40ºC durante 6
horas, y se añadieron 2 litros de una solución de ácido fosfórico al
3% (peso/volumen) para terminar la reacción. Posteriormente, se
llenó una columna (13 cm (diámetro interior) x 30 cm (longitud)) con
4 litros de resina de intercambio iónico XAD-7 (Rohm
and Haas Company) y la mezcla de reacción (4 litros) pasó por la
misma para que el componente de antocianina pueda adsorberse sobre
la misma. Posteriormente, se dejó pasar por la misma TFA (2 litros)
al 0,1% (peso/volumen) para lavar el componente
no-adsorbido. Después, una solución de metanol
acuoso al 80% (volumen/volumen) que contenía un 0,1% de TFA pasó por
la misma para decantar el componente adsorbido. Esta solución de
metanol se concentró mediante un rotavapor y se convirtió en una
solución acuosa de ácido fosfórico al 3% para llevar la
concentración de contenido sólido al 10% (peso/volumen). Así, se
obtuvo un líquido concentrado.
Este líquido concentrado se detectó mediante la
utilización de una columna (ID de 5,5 x 30 cm, 20 \mum, TOSOH
CORPORATION) en gel de sílice ODS-120T con una
solución acuosa de aceto-nitrilo al 9%
(volumen/volumen) que contenía un 0,1% de TFA a un caudal de 80
ml/min. a una longitud de onda de 520 nm para obtener la fracción de
D3G con un tiempo de retención (R.T.) de 66 a 90 min. y la fracción
de C3G con un R.T. de 158 a 200 min. Estas fracciones tenían un
único pico basándose en el análisis por HPLC, y se pudo obtener de
delfinidina-3-O-glucósido
purificado y
cianidina-3-O-glucósido
purificado con un nivel de pureza del 99% o más.
Las condiciones para el análisis por HPLC para
medir la pureza son como sigue. De forma específica, el análisis se
realizó en las siguientes condiciones de gradiente mediante la
utilización del Hewlett Packard Series 1100 HPLC System (Yokogawa
Analytical Systems Inc.).
Condiciones del gradiente de HPLC:
| Tiempo (min.) | Líquido A (solución acuosa de ácido fosfórico al 0,5%) | Líquido B (metanol) |
| 0 | 80 | 20 |
| 15 | 77 | 23 |
| 20 | 77 | 23 |
| 30 | 50 | 50 |
| 40 | 50 | 50 |
Se utilizó una columna Zorbax
SB-C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 \mum, Hewlett Packard).
La detección se llevó a cabo a un caudal de 1 ml/min. a una longitud
de onda de 520 nm. Los R.T. de la muestra de D3G y C3G fueron
respectivamente de 10,54 min. y 14,60 min.
Parte de la solución de substrato antes de la
reacción enzimática y parte de la solución en la cual se terminó la
reacción enzimática se recogieron y se eliminaron las materias
extrañas a través de un microfiltro con un diámetro de poros de 0,45
\mum para preparar una solución de glucósido de antocianidina. Se
midieron los contenidos de los componentes de antocianina antes de
la reacción y después de la reacción. Los resultados son tal como se
muestran en el Cuadro 1. Los resultados indican que la solución de
substrato se componía solamente de glucósido de antocianidina porque
el rutinosido de antocianidina se degradó y que se generó glucósido
de antocianidina en la solución de substrato. Además, la cantidad de
D3G era 3,36 veces más alta que antes de la reacción, y la cantidad
de C3G era 6,78 veces más alta que antes de la reacción.
CUADRO
1
Cambio en el contenido de
antocianina
| D3G | D3R | C3G | C3R | |
| Antes de la reacción | 0,71 g | 2,70 g | 0,23 g | 2,00 g |
| Después de la reacción | 2,39 g | 0,00 g | 1,56 g | 0,00 g |
La fracción de D3G y la fracción de C3G obtenidas
en el Ejemplo 1 se concentraron mediante la utilización de un
rotavapor, y se añadieron a las mismas 30 ml de heptano, seguido de
la reconcentración hasta la sequedad. Se eliminó el TFA que estaba
incluido durante la operación de separación. El resultado de la
medición del peso mostró que la fracción de D3G obtenida era de 1,51
g y que la fracción de C3G era de 0,98 g.
\global\parskip0.990000\baselineskip
La fracción de D3G y la fracción de C3G se
disolvieron por separado en ácido clorhídrico/metanol (5%/95%), y
luego se dejaron reposar a 5ºC durante 24 horas para realizar la
cristalización. La separación de sólido-líquido se
llevó a cabo mediante la utilización de un embudo Kiriyama y papel
de filtro No. 2 (Whatman), y se realizó un lavado con una pequeña
cantidad de acetona, seguido de un secado para obtener los
precipitados. Se observaron ambos precipitados obtenidos con un
microscopio de polarización, y se estudió la polarización de la luz.
Esto indicaba que se encontraban en forma cristalina. La producción
de clorohidrato de D3G cristalino fue de 1,06 g y la del
clorohidrato de C3G cristalino fue de 0,59 g.
Las estructuras del clorohidrato de D3G
cristalino y del clorohidrato de C3G cristalino obtenidos se
determinaron por NMR. Las estructuras de estos dos tipos de
antocianinas estaban de acuerdo con los datos espectrales que
habían sido indicados ya.
Otras propiedades físicas del clorohidrato de D3G
cristalino y del clorohidrato de C3G cristalino son como sigue:
Clorohidrato de D3G cristalino:
| - Punto de fusión basado en un termoanálisis: 258ºC. | |||
| - Uv\lambda max(\varepsilon): 517 nm (27500). | |||
| - FAB-MS m/z: M^{+}: 465 | |||
| - Fórmula molecular: C_{21}H_{21}O_{12}Cl \cdot 0,5H_{2}O | |||
| - Análisis elemental: | C | H | Cl |
| - Valores medidos: | 48,00 | 4,50 | 6,80 |
| - Valores calculados: | 47,78 | 4,58 | 6,72 |
Clorohidrato de C3G cristalino:
| - Punto de fusión basado en un termoanálisis: 245ºC. | |||
| - Uv\lambda max(\varepsilon): 510 nm (26300). | |||
| - FAB-MS m/z: M^{+}: 449 | |||
| - Fórmula molecular: C_{21}H_{21}O_{11}Cl \cdot 0,5H_{2}O | |||
| - Análisis elemental: | C | H | Cl |
| - Valores medidos: | 48,80 | 4,70 | 6,90 |
| - Valores calculados: | 49,57 | 4,73 | 6,93 |
El polvo (3,42 g) obtenido en el Ejemplo de
Referencia 1 se disolvió en 1 litro de 50 mM de tampón de acetato
(pH 3.5) para preparar una solución de substrato de antocianina.
Por separado, se disolvieron en 1 litro de 50 mM
de tampón de acetato (pH 3.5) 208 g de
\beta-glucosidasa derivada de la almendra (SIGMA)
para preparar una solución enzimática (que correspondía a 500 U/ml).
La solución de substrato (1 litro) se calentó a 40ºC durante 10
minutos para estabilizar la temperatura. A continuación, se añadió 1
litro de solución enzimática y se agitó completamente para iniciar
la reacción. Sesenta minutos más tarde, se añadieron
2 litros de 0,3 N ácido clorhídrico para terminar la reacción.
2 litros de 0,3 N ácido clorhídrico para terminar la reacción.
Posteriormente, 4 litros de la mezcla de
reacción, en la cual la reacción estaba terminada, fueron tratados
mediante la adsorción de una resina de intercambio iónico de la
misma forma que la que se describe en el Ejemplo 1, y se purificó
posteriormente por HPLC mediante una columna de gel de sílice ODS.
Así se obtuvieron una fracción de D3R con un R.T. de 69 a 96 minutos
y una fracción de C3R con un R.T. de 144 a 174 minutos.
Se analizaron estas fracciones en condiciones de
análisis por HPLC tal como se describe en el Ejemplo 1 (los R.T. de
la muestra de D3R y C3R fueron respectivamente de 12,63 minutos y
18,19 minutos). Los resultados mostraron que la fracción de D3R y la
fracción de C3R tenían un único pico. Así, se pudo obtener
delfinidina-3-O-rutinosido
purificado y
cianidina-3-O-rutinosido
purificado que tenían un nivel de pureza del 99% o más.
Los contenidos de antocianina en la solución de
substrato antes de la reacción y aquellos en la solución después de
la reacción que fueron medidos por HPLC vienen indicados en el
Cuadro 2. De acuerdo con el Cuadro 2, sólo se degradó el glucósido
de antocianidina y la mayor parte del rutinosido de antocianidina
permaneció no-degradado. Esto indica que se había
obtenido una solución de reacción que tenía una composición óptima
para la purificación.
\newpage
CUADRO
2
Cambio en el contenido de
antocianina
| D3G | D3R | C3G | C3R | |
| Antes de la reacción | 60,03 mg | 231 mg | 19,8 mg | 171 mg |
| Después de la reacción | 5,6 mg | 207 mg | 0,0 mg | 162 mg |
Se obtuvieron los precipitados a través del
proceso de cristalización como con el Ejemplo 2. Ambos precipitados
obtenidos fueron observados con un microscopio de polarización, y
como resultado, se examinó la polarización de la luz y se descubrió
que se encontraban en forma de cristales.
La producción de clorohidrato de C3R cristalino
fue de 58 mg y la del clorohidrato de D3R cristalino fue de
88 mg.
88 mg.
Las estructuras del clorohidrato de D3R
cristalino y del clorohidrato de C3R cristalino obtenidas se
determinaron por NMR. Las estructuras de estos dos tipos de
antocianinas estaban de acuerdo con los datos espectrales que ya han
sido indicados.
Las propiedades físicas del clorohidrato de D3R
cristalino y del clorohidrato de C3R cristalino son como sigue:
Clorohidrato de D3R cristalino:
| - Punto de fusión basado en un termoanálisis: 224ºC. | |||
| - Uv\lambda max(\varepsilon): 520 nm (27800). | |||
| - FAB-MS m/z: M^{+}: 611 | |||
| - Fórmula molecular: C_{27}H_{31}O_{16}Cl \cdot 1,5H_{2}O | |||
| - Análisis elemental: | C | H | Cl |
| - Valores medidos: | 45,80 | 5,30 | 5,20 |
| - Valores calculados: | 45,86 | 5,38 | 4,98 |
Clorohidrato de C3R cristalino:
| - Punto de fusión basado en un termoanálisis: 214-226ºC. | |||
| - Uv\lambda max(\varepsilon): 512 nm (27400). | |||
| - FAB-MS m/z: M^{+}: 595 | |||
| - Fórmula molecular: C_{27}H_{31}O_{15}Cl \cdot 0,5H_{2}O | |||
| - Análisis elemental: | C | H | Cl |
| - Valores medidos: | 50,00 | 5,30 | 5,30 |
| - Valores calculados: | 49,97 | 5,13 | 5,46 |
Ejemplo Comparativo
1
El polvo (342 mg) obtenido en el Ejemplo de
Referencia 1 fue disuelto en 100 ml de 50 mM de tampón de acetato
(pH 3.5) para preparar una solución de substrato de antocianina.
Por separado, se diluyó hasta 10 veces con un 50
mM de tampón de acetato (PH 3.5), CYTOLASE PCL5 (nombre comercial,
GIST-brocades), que es un tipo de antocianasa
representativa utilizada en la industria de los zumos de fruta, para
obtener una solución enzimática.
La solución de substrato (2 ml) se calentó a 40ºC
durante 10 minutos para estabilizar la temperatura. A continuación,
se añadieron 2 ml de solución enzimática y se agitó completamente
para iniciar la reacción. Quince minutos después, se tomaron
muestras de 200 \mul de una solución de reacción, y se añadieron
200 \mul de 0,3N ácido clorhídrico para terminar la reacción.
Se midieron por HPLC las composiciones de
antocianina antes de la reacción y después de la reacción. Los
contenidos y composiciones de antocianina antes y después de la
reacción vienen indicados en el Cuadro 3 a continuación. El Cuadro 3
muestra que tanto el glucósido de antocianidina como el rutinosido
de antocianidina se degradaron, lo que indica que la composición no
era adecuada para la purificación del glicósido de antocianina.
CUADRO
3
Cambio en el contenido de
antocianina
| D3G | D3R | C3G | C3R | |
| Antes de la reacción | 0,60 mg | 2,31 mg | 0,20 mg | 1,71 mg |
| Después de la reacción | 0,23 mg | 0,09 mg | 0,26 mg | 0,04 mg |
La presente invención permitió la producción de
antocianina altamente purificada y de sal de antocianina cristalina
a través de la purificación a partir de productos naturales. La sal
de antocianina cristalina así producida no mostraba ninguna
higroscopicidad y era estable.
Claims (11)
1. Un procedimiento para la preparación de
glucósido de antocianidina purificado, en el cual se deja actuar la
ramnosidasa sobre una composición de antocianina que contiene al
menos un tipo de rutinosido de antocianidina para convertir el
rutinosido de antocianidina en glucósido de antocianidina, el cual
está luego aislado y purificado.
2. El procedimiento para la preparación de
glucósido de antocianidina purificado de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la ramnosidasa es
hesperidinasa o naringinasa.
3. Un procedimiento para la preparación de
rutinosido de antocianidina purificado, en el cual se deja actuar la
\beta-glucosidasa sobre una composición de
antocianina que contiene al menos un tipo de glucósido de
antocianidina y rutinosido de antocianidina para reducir el
glucósido de antocianidina, aislándose y purificándose luego el
rutinosido de antocianidina.
4. El procedimiento para la preparación de
rutinosido de antocianidina purificado de acuerdo con la
reivindicación 3, caracterizado porque la
\beta-glucosidasa puede degradar selectivamente
sólo el enlace de \beta-glucósido del glucósido de
antocianidina sin degradar el enlace de
\beta-glucósido del rutinosido de
antocianidina.
5. El procedimiento para la preparación de
rutinosido de antocianidina purificado de acuerdo con la
reivindicación 3 ó 4, caracterizado porque la
\beta-glucosidasa deriva de la almendra.
6. Un procedimiento para la preparación de
clorohidrato de
antocianidina-3-O-glucósido
cristalino por medio de los pasos de:
- a)
- dejar la ramnosidasa actuar sobre una composición de antocianina que contiene al menos un tipo de rutinosido de antocianidina y convertir el rutinosido de antocianidina en glucósido de antocianidina;
- b)
- purificar el glucósido de antocianidina para obtener glucósido de antocianidina de una pureza del 99% o más alto; y
- c)
- cristalizar el glucósido de antocianidina mediante la utilización de un disolvente mixto de un sistema de ácido clorhídrico/alcohol.
7. El procedimiento para la preparación de
hidrato de clorohidrato de
antocianidina-3-O-glucósido
cristalino de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado
porque el proceso de purificación según el paso b) en la
reivindicación 6 se lleva a cabo mediante cromatografía de adsorción
de intercambio iónico y/o HPLC.
8. El procedimiento para la preparación de
hidrato de clorohidrato de
antocianidina-3-O-glucósido
cristalino de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7,
caracterizado porque el disolvente mixto del sistema de ácido
clorhídrico/alcohol está compuesto de un 5% (volumen/volumen) de
ácido clorhídrico/un 95% (volumen/volumen) de metanol.
9. Un procedimiento para la preparación de
hidrato de clorohidrato de
antocianidina-3-O-rutinosido
cristalino por medio de los pasos de:
- a)
- dejar la \beta-glucosidasa actuar sobre una composición de antocianina que contiene al menos un tipo de glucósido de antocianidina y rutinosido de antocianidina para reducir el glucósido de antocianidina;
- b)
- purificar el rutinosido de antocianidina para obtener rutinosido de antocianidina de una pureza del 99% o más alto; y
- c)
- cristalizar el rutinosido de antocianidina mediante la utilización de un disolvente mixto de un sistema de ácido clorhídrico/alcohol.
10. El procedimiento para la preparación de
hidrato de clorohidrato de
antocianidina-3-O-rutinosido
cristalino de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado
porque el proceso de purificación según el paso b) en la
reivindicación 9 se lleva a cabo mediante cromatografía de adsorción
de intercambio iónico y/o HPLC.
11. El procedimiento para la preparación de
clorohidrato de
antocianidina-3-O-rutinosido
cristalino de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10,
caracterizado porque el disolvente mixto del sistema de ácido
clorhídrico/alcohol está compuesto de un 5% (volumen/volumen) de
ácido clorhídrico/un 95% (volumen/volumen) de metanol.
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