KR102299521B1 - 구연산 유도체의 부분입체 이성질체의 제조 방법 - Google Patents

구연산 유도체의 부분입체 이성질체의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102299521B1
KR102299521B1 KR1020197030766A KR20197030766A KR102299521B1 KR 102299521 B1 KR102299521 B1 KR 102299521B1 KR 1020197030766 A KR1020197030766 A KR 1020197030766A KR 20197030766 A KR20197030766 A KR 20197030766A KR 102299521 B1 KR102299521 B1 KR 102299521B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
compound
salt
aqueous solution
crystals
solution
Prior art date
Application number
KR1020197030766A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190129965A (ko
Inventor
카츠야 히라이시
히로유키 소마
후미에 짐마
타로 아다치
이페이 야마오카
나오유키 엔도
Original Assignee
가부시기가이샤오오쓰까세이야꾸고오죠오
아다바이오 씨오., 엘티디.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가부시기가이샤오오쓰까세이야꾸고오죠오, 아다바이오 씨오., 엘티디. filed Critical 가부시기가이샤오오쓰까세이야꾸고오죠오
Publication of KR20190129965A publication Critical patent/KR20190129965A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102299521B1 publication Critical patent/KR102299521B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/36—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D207/40—2,5-Pyrrolidine-diones
    • C07D207/416—2,5-Pyrrolidine-diones with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to other ring carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4015—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. piracetam, ethosuximide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/13—Crystalline forms, e.g. polymorphs

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

하기 식으로 표시되는 화합물 A 및 구연산을 포함하는 수용액에 대하여 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 또는 탄산칼슘을 이용함으로써, 상기 수용액 중의 구연산을 제거하고, 그 후 몇가지 공정을 거쳐 결정성 화합물 A를 얻는다. 또한, 고순도의 비결정성 화합물 A는, 화합물 A 및 구연산을 포함하는 수용액에 대하여 탄산칼슘, 황산, 유기 용매 등을 이용하여 용액 중의 구연산 및 결정성 화합물 A를 제거함으로써 얻어진다. 결정성 화합물 A의 입체 구조는 RS 표시법으로 SS형이다. 비결정성 화합물 A의 입체 구조는 RS 표시법으로 SR형이다.
[화학식 1]

Description

구연산 유도체의 부분입체 이성질체의 제조 방법
본 발명은, 간 손상 억제 효과를 갖는 구연산 유도체의 결정, 및 고순도화된 그 비결정성 부분입체 이성질체(비정질 부분입체 이성질체, 아몰퍼스 부분입체 이성질체), 및 그들의 제조 방법에 관한 것이다.
매실(영어명: Japanese apricot, 학명: Prunus mume)은, 장미과 앵두나무아과 벚나무속 살구속에 속하고, 매실 장아찌, 매실주, 매육(梅肉) 진액 등의 매실 가공품이 식용되고 있다. 또한, 매육 진액은, 살균, 피로 회복, 위 보호 작용 등의 효과를 갖고 있어, 건강을 위해 섭취되어 왔다. 그리고, 매육 진액에는 혈류 개선 효과가 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌 1, 2 참조). 상기 혈류 개선 효과는, 매육 진액에 포함되는, 구연산, 사과산 등의 유기산과 당의 가열에 의해 생성되는 무메후랄(Mumefural) 및 그 관련 화합물에 기인하고 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌 3).
매육 진액을 포함하는 건강 식품의 하나로, 미사톨(misatol)(등록상표)이 시판되고 있고, 미사톨은, 자가포식을 유도하는 효과나 바이러스성 간염 환자의 간 손상 억제 효과가 있는 것이 알려져 있다(특허문헌 1, 2).
구연산(IUPAC명: 2-hydroxypropane-1, 2, 3-tricarboxylic acid)의 탄소쇄인 프로판쇄의 1위치의 탄소(또는 3위치의 탄소)와 2위치의 탄소에 결합되어 있는 2개의 카복실기가 특정 아미노산의 아미노기와 이미드 결합을 형성한 화합물, 및 그 이미드 화합물을 가수 분해함으로써 얻어지는 구연산 유래의 프로판쇄의 1위치의 탄소(또는 3위치의 탄소)에 결합되어 있는 카복실기와 아미노산의 아미드 화합물은, 간 손상 억제 효과를 갖는 활성 물질인 것을 알 수 있었다.
본 출원인은, 상기 식견을 바탕으로, 우선 하기 식으로 나타나는 화합물을 포함하는 구연산 유도체 및 그 합성 방법을 제안했다(PCT/JP2016/004789).
[화학식 1]
Figure 112019106388763-pct00001
(식 중, R1은, 카복실기 혹은 수산기를 갖고 있을 수도 있는 C1~C3 알킬기를 나타내고, R2는, 수소 원자를 나타내거나, 또는, R1 및 R2는, 함께 환상 구조를 형성할 수도 있고 C2~C3 알킬렌쇄을 나타낸다.)
그러나, 상기 화학식으로 나타나는 구연산 유도체는, 2개의 비대칭 탄소를 갖기 때문에, 4개의 입체 이성질체가 존재한다. 그러나, 이들의 구조가 유사한 입체 이성질체를 분리하여 취득하려면, 고분리능을 갖는 고가의 칼럼을 여러개 조합하거나 여러 차례 반복할 필요가 있고, 이 수법으로는 칼럼 사이즈에 의존한 소량 분리밖에 달성되지 않아, 고가의 비용을 필요로 하는 것이었다. 이들의 입체 이성질체를, 대량으로 저가로 분리하고, 고순도화하는 기술은 확립되지 않았다.
특허문헌 1: 일본특허공보 4842624호 특허문헌 2: 일본특허공보 5577129호
비특허문헌 1: J. Agric. FoodChem., 1999, 47, 828-31 비특허문헌 2: 유변학 연구회지 1, 65-67, 1998 비특허문헌 3: 유변학 연구회지 3, 81-88, 2000
본 발명의 과제는, 상기 화학식으로 표시되는 구연산 유도체 중, 구연산과 L-아스파르트산의 반응에 의해 얻어지는 하기 식으로 표시되는 구연산 유도체의 부분입체 이성질체 혼합물로부터 결정성 부분입체 이성질체 화합물을, 저가의 수법을 이용하여 대량으로 단리하는 방법, 및 비결정성 부분입체 이성질체 화합물을, 저가의 수법을 이용하여 대량으로 고순도로 정제하는 방법을 제공하는 것에 있다.
[화학식 2]
Figure 112019106388763-pct00002
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 연구와 검토를 거듭한 결과, 특정 공정을 조합함으로써, 상기 식으로 표시되는 화합물의 결정을 얻을 수 있는 것을 발견했다. 또한, 본 발명자들은, 특정 공정을 조합함으로써, 해당 화합물의 비결정성 부분입체 이성질체염을 석출시킬 수 있는 것을 발견했다. 또한, 본 발명자들은, 단결정 X선 회절에 의한 구조 해석에 의해, 상기 식으로 표시되는 화합물의 결정성 부분입체 이성질체의 구조를 결정했다.
본 발명은 이들의 식견을 바탕으로 완성한 것이다.
즉, 본 발명은, 아래에 관한 것이다.
[1] 하기 식(A)로 표시되는 화합물(이하, 화합물 A라고 한다.)의 결정.
[화학식 3]
Figure 112019106388763-pct00003
[2] 입체 구조가 RS 표시법으로 SS형인, [1]에 기재된 결정.
[3] CuKα선을 X선원으로 하는 분말 X선 회절 패턴에 있어서, 회절각(2θ)이, 11.74±0.20°, 29.25±0.20°, 18.36±0.20°, 21.75±0.20°, 및 15.95±0.20°에 피크를 갖는, [1] 또는 [2]에 기재된 결정.
[4] 아래의 (a)~(f)의 공정을 포함하는, 화합물 A의 결정의 제조 방법.
(a) 화합물 A 및/또는 그 염, 및 구연산 및/또는 그 염을 포함하는, pH 5.0~8.5의 수용액을, 음이온 교환 수지를 충전한 칼럼에 통탑하는 공정,
(b) 상기 칼럼에 용출액을 통탑하여, 구연산을 포함하지 않지만, 화합물 A를 포함하는 수용액을 취득하는 공정,
(c) 공정 (b)에 의해 얻어진 수용액으로부터, 용출액을 제거하는 공정,
(d) 용출액을 제거한 수용액을 농축하는 공정,
(e) 농축 잔사에 물을 첨가하여 수용액으로 만들고, 상기 수용액을 농축하여, 화합물 A의 결정을 석출시키는 공정, 및,
(f) 화합물 A의 결정을 취득하는 공정.
[5] 화합물 A의 결정의 입체 구조가 RS 표시법으로 SS형인, [4]에 기재된 제조 방법.
[6] 용출액이, 아세트산암모늄 수용액, 염화나트륨 수용액, 및 포름산암모늄 수용액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용출액인, [4] 또는 [5]에 기재된 제조 방법.
[7] 용출액을 제거하는 방법이, 양이온 교환 수지를 충전한 칼럼을 사용하는 방법인, [4]~[6] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[8] 농축하는 방법이, 동결 건조인, [4]~[7] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[9] 아래의 (a)~(f)의 공정을 포함하는, 화합물 A의 결정의 제조 방법.
(a) 화합물 A 및 구연산을 포함하는, pH 2.0 이하의 수용액에, 탄산칼슘을 첨가하여, 구연산 칼슘을 석출시키는 공정,
(b) 60% 메탄올-수용액으로부터, 구연산 칼슘을 제거하는 공정,
(c) 수용액에 황산을 첨가하여, pH 2.0 이하로 하여 황산칼슘을 석출시키는 공정,
(d) 수용액으로부터, 황산칼슘을 제거하는 공정,
(e) 수용액을 농축하여, 화합물 A의 결정을 석출시키는 공정, 및
(f) 화합물 A의 결정을 취득하는 공정.
[10] 화합물 A의 결정의 입체 구조가 RS 표시법으로 SS형인, [9]에 기재된 제조 방법.
[11] 농축이, 감압 농축인, [9] 또는 [10]에 기재된 제조 방법.
[12] 화합물 A의 결정을 취득한 후, 아래의 (g)~(j)의 공정을 더 포함하는, [9]~[11] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
(g) 수용액에 유기 용매를 첨가하여, 구연산 칼슘을 석출시키는 공정,
(h) 수용액과 유기 용매의 혼합액으로부터, 구연산 칼슘을 제거하는 공정,
(i) 수용액과 유기 용매의 혼합액을 탈수하여, 화합물 A의 결정을 석출시키는 공정, 및, (j) 화합물 A의 결정을 취득하는 공정.
[13] 유기 용매가, 아세톤인, [12]에 기재된 제조 방법.
[14] 아래의 (a)~(l)의 공정을 포함하는, 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체염의 제조 방법.
(a) 화합물 A 및 구연산을 포함하는, pH 2.0 이하의 수용액에, 탄산칼슘을 첨가하여, 구연산 칼슘을 석출시키는 공정,
(b) 수용액으로부터, 구연산 칼슘을 제거하는 공정,
(c) 수용액에 황산을 첨가하여, pH 2.0 이하로 하여 황산칼슘을 석출시키는 공정,
(d) 수용액으로부터, 황산칼슘을 제거하는 공정,
(e) 수용액을 농축하여, 화합물 A의 결정을 석출시키는 공정,
(f) 수용액으로부터, 화합물 A의 결정을 제거하는 공정,
(g) 수용액에 유기 용매를 첨가하여, 화합물 A의 결정 및 구연산 칼슘을 석출시키는 공정,
(h) 수용액과 유기 용매의 혼합액으로부터, 화합물 A의 결정 및 구연산 칼슘을 제거하는 공정,
(i) 수용액과 유기 용매의 혼합액을 탈수하여, 화합물 A의 결정을 석출시키는 공정,
(j) 수용액으로부터, 화합물 A의 결정을 제거하는 공정,
(k) 수용액에, 금속염 또는 아미노산염, 및 알코올을 첨가하여, 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체염을 석출시키는 공정, 및,
(l) 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체염을 취득하는 공정.
[15] 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체염의 입체 구조가 RS 표시법으로 SR형인, [14]에 기재된 제조 방법.
[16] 유기 용매가, 아세톤인, [14]에 기재된 제조 방법.
[17] 금속염이, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 및 칼슘염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 금속염인, [14]~[16] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[18] 아미노산염이, 아르기닌염, 시트룰린염, 오르니틴염, 및 히스티딘염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산염인 [14]~[16] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[19] 알코올이 에탄올 또는 메탄올인, [14]~[18] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[20] 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체 또는 그 염.
[21] 입체 구조가 RS 표시법으로 SR형인, [20]에 기재된 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체 또는 그 염.
[22] 염이, 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체의 금속염 또는 아미노산염인, [20] 또는 [21]에 기재된 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체 또는 그 염.
[23] 금속염이, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 및 칼슘염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 금속염인, [22]에 기재된 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체 또는 그 염.
[24] 아미노산염이, 아르기닌염, 시트룰린염, 오르니틴염, 및 히스티딘염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산염인, [22]에 기재된 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체 또는 그 염.
화합물 A의 결정 및 고순도화된 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체가 얻어짐으로써, 각 물질의 생리 활성, 질환에 대한 작용 기전을 해명하는데 도움이 된다. 또한, 화합물 A의 결정 및 고순도화된 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체는, 이들을 포함하는 부분입체 이성질체 혼합물에 비해 취급하기 쉬우므로, 화합물 A를 유효 성분으로 사용하는 의약의 제조, 혹은 화합물 A를 사용하는 음식품의 제조 등을 할 때에, 매우 유용하다. 또한, 본원에 기재된 방법에 의하면, 일반적인 정제 수단으로 이용되는 고분리능인 칼럼 등에 의한 정제법에 비해, 저가이면서 대량, 단시간에 화합물 A의 결정 및 비결정성 부분입체 이성질체를 분리하고, 취득할 수 있다. 일반적인 부분입체 이성질체 분리 방법으로 이용되는 고분리능 담체를 사용한 칼럼 등에 의한 정제법에서는, 1번의 정제 프로세스로 정제 가능한 양은 사용하는 칼럼 사이즈에 의존하지만, 고가의 고분리능 담체를 필요로 하는 대형 칼럼을 사용하는 대량 정제법은 비용 및 효율의 면에서 용이하지 않다. 본원에 기재된 방법에 의하면, 500 mL의 반응액으로부터, 1번의 정제 프로세스로, 20 g 이상의 고순도의 부분입체 이성질체를 용이하게 분리할 수 있고, 추가로 정제의 규모를 용이하게 확대하는 것이 가능하다.
도 1은 화합물 A 합성 반응액의 HPLC 크로마토그램(160배 희석)을 나타낸다.
도 2는 수용액 중에서 결정화된 화합물 A결정의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 화합물 A의 결정을 분취한 후의 모액(母液) 용액의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 4는 아세톤 중에서 결정화된 화합물 A의 HPLC 크로마토그램(재결정 후)을 나타낸다.
도 5는 pH 3.6에서 석출한 침강물의 HPLC 크로마토그램(비결정 화합물 A Ca염(1))을 나타낸다.
도 6은 pH 6.0에서 석출한 침강물의 HPLC 크로마토그램(비결정 화합물 A Ca염(2))을 나타낸다. 도 6의 피크 2에 있어서 화합물 A의 피크의 왼쪽 어깨 부분에 화합물 A가 가수 분해한 아미드 화합물의 피크가 겹쳐 있다(피크의 왼쪽 어깨가 부풀어 오른 것처럼 보인다). 또한, 피크 3은 구연산이라고 생각되는 피크이다.
도 7은 조(粗)정제한 화합물 A 합성 용액의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 8은 수용액 중에서 결정화된 화합물 A의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다(도 2와 동일한 샘플 유래의 분석 결과이다).
도 9는 아세톤 중에서 결정화된 화합물 A의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다(도 4와 동일한 샘플 유래의 분석 결과이다).
도 10은 pH 3.6에서 석출한 비결정성 화합물 A Ca염의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다(도 5와 동일한 샘플 유래의 분석 결과이다).
도 11은 실시예 7에서의 이온 교환 크로마토그래피에 의한 화합물 A의 결정을 제조하는 방법의 흐름도이다.
도 12는 화합물 A의 결정의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 13은 화합물 A의 결정의 1 H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 14는 화합물 A의 결정을 분취한 후의 모액의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 15는 화합물 A의 결정을 분취한 후의 모액의 1 H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 16은 위에서부터, 검체 1(칼럼 정제에 의해 수용액으로부터 얻은 결정), 검체 2(아세톤 용액으로부터 얻은 결정) 및 검체 3(비결정성 부분입체 이성질체의 Ca염)의 순서로 각각의 물질에 관한 분말 X선 회절 패턴의 다중 플롯에 의한 비교를 나타낸다.
본 발명의 화합물 A의 결정으로는, X선원으로 CuKα를 이용한 분말 X선 회절 패턴에 있어서, 회절각(2θ)이, 11.74±0.20° 바람직하게는 ±0.10°, 29.25±0.20° 바람직하게는 ±0.10°, 18.36±0.20° 바람직하게는 ±0.10°, 21.75±0.20° 바람직하게는 ±0.10°, 및 15.95±0.20° 바람직하게는 ±0.10°에 피크를 갖는 결정을 들 수 있다.
본 발명의 화합물 A의 결정으로는, X선원으로 CuKα를 이용한 분말 X선 회절 패턴에 있어서, 회절각(2θ)이, 상기뿐 아니라 추가로, 24.09±0.20° 바람직하게는 ±0.10°, 19.32±0.20° 바람직하게는 ±0.10°, 19.04±0.20° 바람직하게는 ±0.10°, 26.95±0.20° 바람직하게는 ±0.10°, 및 16.19±0.20° 바람직하게는 ±0.10°에 피크를 갖는 결정을 들 수 있다.
본 발명의 화합물 A의 결정으로는, X선원으로 CuKα를 이용한 분말 X선 회절 패턴에 있어서, 회절각(2θ)이, 상기뿐 아니라 추가로, 26.42±0.20° 바람직하게는 ±0.10°, 16.68±0.20° 바람직하게는 ±0.10°, 17.85±0.20° 바람직하게는 ±0.10°, 21.19±0.20° 바람직하게는 ±0.10°, 및 18.14±0.20° 바람직하게는 ±0.10°에 피크를 갖는 결정을 들 수 있다.
X선원으로 CuKα를 이용한 분말 X선 회절 패턴은, 본 명세서의 실시예 8에 기재된 방법에 의해 취득할 수 있다.
화합물 A에는, 구연산 유래의 프로판쇄의 2위치의 탄소를 비대칭 탄소로 한 부분입체 이성질체가 존재한다. 그리고, 본 발명의 화합물 A는, 아스파르트산 유래의 구조 내에도 비대칭 탄소가 존재하지만, 상기 비대칭 탄소의 입체 배치는, 사용하는 원료의 아스파르트산 또는 아스파라긴에 유래한다. 본 발명의 화합물 A의 결정은, L체의 아스파르트산에 유래한다.
본 발명의 화합물 A의 결정은, 화합물 A의 부분입체 이성질체 중 어느 하나의 결정이지만, NMR에서는, 어느 쪽의 부분입체 이성질체에 해당하는지 분별할 수 없다.
화합물 A의 결정이 어느 부분입체 이성질체인가를 결정하는 방법으로는, 단결정 X선 회절에 의한 구조 해석을 들 수 있다. 구체적으로는, 실시예 9에 기재된 방법을 일례로 들 수 있다. 실시예 9의 해석 결과, 결정성 화합물 A(화합물 A의 결정)는 SS형, RR형의 거울 이성질체인 것이 밝혀졌다. 그리고 합성에 이용했던 것이 모두 L-Asp(S형)인 점에서, 결정성 화합물 A의 입체 배치는 RS 표시법으로 SS형인 것을 알 수 있었다.
[화학식 4]
Figure 112019106388763-pct00004
이 해석의 결과, 결정성 화합물 A는 SS형, RR형의 거울 이성질체인 것이 밝혀졌다. 그리고 합성에 이용했던 것이 모두 L-Asp(S형)인 점에서, 결정성 화합물 A는 SS형인 것을 알 수 있었다. 그리고 이것을 받아, 결정화하지 않는 성질을 갖는 화합물 A가 SR형인 것도 알 수 있었다.
본 발명의 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체 또는 그 염은, 화합물 A의 부분입체 이성질체의 한쪽 중, 아래에 기재된 화합물 A의 결정화 방법에 의해 결정화하지 않는 부분입체 이성질체(이하, 비결정성 부분입체 이성질체라고도 한다.) 또는 그 염이다.
본 발명의 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체 또는 그 염은, 실시예 5에 기재된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 정성 분석에 의해 확인할 수 있고, 또한, 결정성 부분입체 이성질체와 구별할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 화합물 A의 결정의 입체 배치가 RS 표시법으로 SS형인 점에서, 본 발명의 화합물 A의 비정질(비결정성 부분입체 이성질체)의 입체 배치는, 하기에 나타내는 바와 같이, RS 표시법으로 SR형인 것도 알 수 있었다.
[화학식 5]
Figure 112019106388763-pct00005
본 발명의 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체 또는 그 염으로는, 결정성 부분입체 이성질체의 혼입율이, 5% 이하, 바람직하게는 4% 이하, 보다 바람직하게는 3% 이하, 보다 더 바람직하게는 2% 이하, 가장 바람직하게는 1% 이하의 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체 또는 그 염을 들 수 있다.
본 발명의 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체의 염으로는, 금속염 또는 아미노산염을 들 수 있다.
금속염으로는, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 및 칼슘염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 금속염을, 가장 바람직하게는 칼슘염을 들 수 있다.
아미노산염으로는, 아르기닌염, 시트룰린염, 오르니틴염, 및 히스티딘염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산염을 들 수 있다. 해당 아미노산염은, 바람직하게는 L형의 아미노산염이다.
본 발명의 화합물 A의 결정은, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피의 사용 및 탄산칼슘 등의 화합물의 사용에 의한 결정화 중 어느 하나의 방법에 의해 얻을 수 있다.
(이온 교환 칼럼 크로마토그래피에 의한 방법)
아래의 (a)~(f)의 공정에 의해 화합물 A의 결정을 제조한다.
(a) 화합물 A 및/또는 그 염, 및 구연산 및/또는 그 염을 포함하는, pH 5.0~8.5의 수용액을, 음이온 교환 수지를 충전한 칼럼에 통탑(通塔)하는 공정,
(b) 상기 칼럼에 용출액을 통탑하여, 구연산을 포함하지 않지만, 화합물 A를 포함하는 수용액을 취득하는 공정,
(c) 공정 (b)에 의해 얻어진 수용액으로부터, 용출액을 제거하는 공정,
(d) 용출액을 제거한 수용액을 농축하는 공정,
(e) 농축 잔사에 물을 첨가하여 수용액으로 만들고, 상기 수용액을 농축하여, 화합물 A의 결정을 석출시키는 공정, 및,
(f) 화합물 A의 결정을 취득하는 공정.
상기 공정 (a)에서 사용하는 화합물 A 및/또는 그 염, 및 구연산 및/또는 그 염을 포함하는, pH 5.0~8.5의 수용액에서의 화합물 A의 염 및 구연산의 염은 특별히 한정되지 않는다. 화합물 A의 염 및 구연산의 염으로, 예를 들어, 아미노산염, 금속염(나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염, 등)을 들 수 있다. 화합물 A 및/또는 그 염, 및 구연산 및/또는 그 염으로 가장 바람직한 것은, 화합물 A 및 구연산이다.
상기 공정 (a)에서 사용하는 화합물 A 및/또는 그 염, 및 구연산 및/또는 그 염을 포함하는, pH 5.0~8.5의 수용액은, 예를 들어, 다음과 같이 하여 제조한다. 구연산 일수화물과 L-아스파르트산을 가열하 반응시켜, 화합물 A를 생성시킨다. 화합물 A는, 효소 반응법, 발효법 등, 합성법 이외 방법에 의해 제조된 화합물 A일 수도 있다. 반응 종료 후, 반응액을 냉각 방치하여, 산성 조건하에서 메탄올을 첨가한다. 메탄올 용액의 농도는 L-아스파르트산이 석출되는 농도이면 어느 것이어도 되지만, 예를 들어, 60 V/V% 용액이다. 반응액에 포함되는 미반응 구연산 및 L-아스파르트산 중, L-아스파르트산이 석출 침전되므로, 원심 분리 혹은 여과에 의해 고액 분리한다. 고액 분리 후의 수용액은, 화합물 A 및 구연산을 포함한다. 고액 분리 후의 수용액이 산성인 경우에는, 알칼리 수용액, 예를 들어, 암모니아수를 가하여, pH를 조정하는 것이 바람직하다. 상기 수용액의 pH로는, 5.0~8.5, 바람직하게는 6.0~8.0, 가장 바람직하게는 6.5~7.2를 들 수 있다. 이 수용액을 음이온 교환 수지를 충전한 칼럼에 통탑한다.
음이온 교환 수지로는, 화합물 A 및/또는 그 염, 및 구연산 및/또는 그 염을 분리할 수 있는 음이온 교환 수지이면 어느 것이어도 되지만, 예를 들어, TOYOPEARL SuperQ-650 M(150 mm×500 mm, 도소사 제품)을 들 수 있다.
상기 공정 (b)에 있어서 사용하는 용출액으로는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 아세트산암모늄 수용액, 염화나트륨 수용액, 포름산암모늄 수용액으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
용출액의 농도로는, 50 mM~5 M, 바람직하게는, 100 mM~3 M, 보다 바람직하게는 150 mM~2 M, 가장 바람직하게는 200 mM~1.5 M을 들 수 있다. 용출액의 농도를 단계적으로 높여 용출할 수도 있다.
용출 공정의 유속으로는, 10~500 mL/min, 바람직하게는 50~300 mL/min, 가장 바람직하게는 100~200 mL/min의 범위를 들 수 있다.
상기 공정 (b)에 있어서 「구연산을 포함하지 않는다」란, 완전히 구연산을 포함하지 않는 것이 바람직하지만, 화합물 A의 결정화에 있어서 장애가 되지 않는 정도로, 미량의 구연산이 포함되어 있어도 된다.
상기 공정 (c)에 있어서, 용출액을 제거하는 방법으로는, 예를 들어, 양이온 교환 수지를 충전한 칼럼을 사용하는 방법, 전기 투석 등, 바람직하게는 양이온 교환 수지를 충전한 칼럼을 사용하는 방법을 들 수 있다. 그리고, 「용출액을 제거한다」란, 용출액 중의 성분(용질)을 제거하는 것을 의미한다.
양이온 교환 수지로는, 화합물 A와 용출액을 분리할 수 있는 양이온 교환 수지이면 어느 것이어도 되지만, DOWEX 50Wx8(와코케미컬사 제품)을 들 수 있다. 양이온 교환 수지를 충전한 칼럼에 수용액, 예를 들어, 정제수를 송액하여 화합물 A를 포함하지만, 용출액을 포함하지 않는 수용액을 취득한다. 「용출액을 포함하지 않는다」란, 완전히 용출액을 포함하지 않는 것이 바람직하지만, 화합물 A의 결정화에 장애가 되지 않는 정도로 미량의 용출액이 포함되어 있어도 된다.
상기 공정 (d) 및 (e)에 있어서, 수용액을 농축하는 방법으로는, 가열 농축, 감압 농축, 또는 동결 건조를 예시할 수 있고, 가장 바람직하게는, 동결 건조를 들 수 있다.
상기 공정 (d) 및 (e)에 있어서, 수용액을 농축함으로써, 화합물 A의 비결정 및/혹은 결정, 그들의 혼합물, 또는 그들을 포함하는 농축 잔사를 얻을 수 있다. 화합물 A가 비결정인 경우, 비결정을 포함하는 혼합물인 경우, 또는, 그들을 포함하는 농축 잔사인 경우에는, 다시 물을 첨가하여 물혼합물로 만들고, 농축하는 공정을 수행하는 것이 바람직하다. 이 공정을 수행함으로써, 화합물 A의 결정을 석출시킬 수 있다.
상기 공정 (f)에 있어서, 결정을 취득하는 방법으로는, 가압 여과, 흡인 여과, 원심 분리 등을 들 수 있다. 추가로 모액의 부착을 저감시키고, 결정의 품질을 향상시키기 위해, 적절히, 결정을 세정할 수 있다. 세정한 결정은, 감압 건조, 유동층 건조, 통풍 건조 등에 의해 건조시켜, 최종 제품을 얻을 수 있다.
상기 방법에 있어서, 공정 (d)~공정 (e)를 수차례 반복하여 수행하는 것에 의해서도 화합물 A의 결정화를 달성할 수 있다.
(탄산칼슘 등의 화합물 사용에 의한 결정화에 의한 방법)
아래의 (a)~(f)의 공정에 의해 수용액 중에서 화합물 A의 결정을 제조한다.
(a) 화합물 A 및 구연산을 포함하는, pH 2.0 이하의 수용액에, 탄산칼슘을 첨가하여, 구연산 칼슘을 석출시키는 공정,
(b) 수용액으로부터, 구연산 칼슘을 제거하는 공정,
(c) 수용액에 황산을 첨가하여, pH 2.0 이하로 하여 황산칼슘을 석출시키는 공정,
(d) 수용액으로부터, 황산칼슘을 제거하는 공정,
(e) 수용액을 농축하여, 화합물 A의 결정을 석출시키는 공정, 및
(f) 화합물 A의 결정을 취득하는 공정.
상기 공정 (a)에서 사용하는 화합물 A 및 구연산을 포함하는, pH 2.0 이하의 수용액은, 예를 들어, 다음과 같이 하여 제조한다. 구연산 일수화물과 L-아스파르트산을 가열하 반응시켜, 화합물 A를 생성시킨다. 화합물 A는, 효소 반응법, 발효법 등, 합성법 이외 방법에 의해 제조된 화합물 A일 수도 있다. 반응 종료 후, 반응액을 냉각 방치하여, 산성 조건하에서 메탄올을 첨가한다. 메탄올 수용액의 농도는 L-아스파르트산이 석출되는 농도이면 어느 것이어도 되지만, 예를 들어, 60 v/v% 용액이다. 반응액에 포함되는 미반응 구연산 및 L-아스파르트산 중, L-아스파르트산이 석출 침전되므로, 원심 분리에 의해 고액 분리한다. 그리고, 이 공정에서는, 메탄올을 가하는 것이 중요하다. 에탄올은 불가능하다. 이후의 공정에는, 화합물 A 및 구연산을 포함하는 고액 분리 후의 수용액을 이용한다.
본 방법에 의해 화합물 A의 결정을 얻을 때에 어려운 점은, 화합물 A 및 구연산을 포함하는 수용액으로부터 구연산을 산성 조건에서 제외하는 것이다. 화합물 A는, 중성~알칼리성(pH 5 이상)의 수용액 중에서 불안정하기 때문에, 화합물 A의 분해를 억제하기 위해 산성 조건을 유지하는 것은 중요하다. 따라서, 공정 (a)에서 사용하는 화합물 A 및 구연산을 포함하는, pH 2.0 이하의 수용액은, pH가 바람직하게는, 0.6~1.8, 가장 바람직하게는 1.0~1.6인 수용액일 수도 있다. 본 발명자들은, 구연산을 염의 형태로 하여 제거하는 것을 생각해 내, 각종 금속 이온으로 이루어지는 염을 이용하여 시행 착오를 거듭한 결과, 칼슘 이온(Ca2+)으로 구연산을 잘 제거할 수 있는 것을 발견했다. 또한, 본 발명자들은, 칼슘염이라도, 염화칼슘(CaCl2)을 이용했을 경우에는, 산성 조건에서는 구연산을 잘 제거할 수 없고, 탄산칼슘(CaCO3)을 이용했을 경우에는, 산성 조건에서도 구연산을 순조롭게 제거할 수 있는 것도 발견했다. 이것은, 탄산칼슘의 탄산 이온(CO3 2-)이 CO2가 되어, 칼슘 이온의 상대 음이온이 없어지므로, 구연산 이온과 칼슘 이온이 결합하기 쉬워지기 때문이라 생각된다. 따라서, 공정 (a)에 있어서 탄산칼슘을 이용하는 것은 필수 조건이다.
상기 공정 (b)에서의 구연산 칼슘의 제거 및 공정 (d)에서의 황산칼슘의 제거는, 예를 들어, 원심 분리 혹은 여과에 의해 수행할 수 있다.
상기 공정 (c)에 있어서, 황산을 이용하는 이유로는, 화합물 A가 알칼리에 약한 것과 황산칼슘의 용해성이 낮기 때문에 칼슘 이온을 제거하기 쉬운(즉, 탈염이 용이한) 것을 들 수 있다. pH 2.0 이하로 함으로써, 화합물 A의 칼슘염으로 존재하고 있던 칼슘 이온이 화합물 A와 괴리되어, 황산칼슘이 된다. 이 때의 pH로는 1.0~2.0이 좋고, 보다 바람직하게는 1.3~1.8이 좋다. 나트륨염(황산나트륨)이나 칼륨염(황산칼륨)을 이용했을 경우에는 탈염은 어렵다.
상기 공정 (e)에서의 수용액을 농축하는 방법으로, 구체적으로는, 가열 농축, 감압 농축 등을 예시할 수 있지만, 열에 의한 혼입 성분의 변질 혹은 분해를 방지하기 위해서는, 감압 농축에 의한 것이 바람직하다.
상기 공정 (f)에 있어서, 결정을 취득하는 방법으로는, 가압 여과, 흡인 여과, 원심 분리 등을 들 수 있다. 추가로 모액의 부착을 저감시켜, 결정의 품질을 향상시키기 위해, 적절히, 결정을 세정할 수 있다. 세정한 결정은, 감압 건조, 유동층 건조, 통풍 건조 등에 의해 건조시켜, 최종 제품을 얻을 수 있다.
상기 공정 (e)에 있어서 화합물 A의 결정을 석출시킨 후의 수용액(결정 모액) 중에는, 아직 결정성 화합물 A 부분입체 이성질체가 포함되어 있다. 그러므로, 아래의 (g)~(j)의 공정에 의해 추가로 화합물 A의 결정을 얻을 수 있다.
(g) 수용액에 유기 용매를 첨가하여, 구연산 칼슘을 석출시키는 공정,
(h) 수용액과 유기 용매의 혼합액으로부터, 구연산 칼슘을 제거하는 공정,
(i) 수용액과 유기 용매의 혼합액을 탈수하여, 화합물 A의 결정을 석출시키는 공정, 및,
(j) 화합물 A의 결정을 취득하는 공정.
상기 공정 (g)에 있어서 첨가하는 유기 용매로는, 물과 혼화하여, 화합물 A를 일정량 용해할 수 있는 유기 용매가 바람직하고, 구체적으로는, 아세톤 등을 예시할 수 있다.
상기 공정 (h)에서의 구연산 칼슘의 제거는, 예를 들어, 원심 분리 혹은 여과에 의해 수행할 수 있다.
상기 공정 (i)의 화합물 A의 결정을 석출시키는 방법으로는, 화합물을 석출시키는 방법이면 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는, 용매 유거(留去)에 의해 수용액을 농축하고, 다시 용매를 첨가하는 방법을 들 수 있다.
상기 공정 (j)에 있어서, 결정을 취득하는 방법으로는, 가압 여과, 흡인 여과, 원심 분리 등을 들 수 있다. 추가로 모액의 부착을 저감시켜, 결정의 품질을 향상시키기 위해, 적절히, 결정을 세정할 수 있다. 세정한 결정은, 감압 건조, 유동층 건조, 통풍 건조 등에 의해 건조시켜, 최종 제품을 얻을 수 있다.
본 발명의 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체염은, 아래에 기재하는 (a)~(l)의 공정을 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다.
(a) 화합물 A 및 구연산을 포함하는, pH 2.0 이하의 수용액에, 탄산칼슘을 첨가하여, 구연산 칼슘을 석출시키는 공정,
(b) 수용액으로부터, 구연산 칼슘을 제거하는 공정,
(c) 수용액에 황산을 첨가하여, pH 2.0 이하로 하여 황산칼슘을 석출시키는 공정,
(d) 수용액으로부터, 황산칼슘을 제거하는 공정,
(e) 수용액을 농축하여, 화합물 A의 결정을 석출시키는 공정,
(f) 수용액으로부터, 화합물 A의 결정을 제거하는 공정,
(g) 수용액에 유기 용매를 첨가하여, 화합물 A의 결정 및 구연산 칼슘을 석출시키는 공정,
(h) 수용액과 유기 용매의 혼합액으로부터, 화합물 A의 결정 및 구연산 칼슘을 제거하는 공정,
(i) 수용액과 유기 용매의 혼합액을 탈수하여, 화합물 A의 결정을 석출시키는 공정,
(j) 수용액으로부터, 화합물 A의 결정을 제거하는 공정,
(k) 수용액에, 금속염 또는 아미노산염, 및 알코올을 첨가하여, 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체염을 석출시키는 공정, 및,
(l) 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체염을 취득하는 공정.
상기 공정 (a)에서 사용하는 화합물 A 및 구연산을 포함하는, pH 2.0 이하의 수용액은, 예를 들어, 다음과 같이 하여 제조한다. 구연산 일수화물과 L-아스파르트산을 가열하고 반응시켜, 화합물 A를 생성시킨다. 화합물 A는, 효소 반응법, 발효법 등, 합성법 이외의 방법에 의해 제조된 화합물 A일 수도 있다. 반응 종료 후, 반응액을 냉각 방치하여, 산성 조건하에서 메탄올을 첨가한다. 메탄올 수용액의 농도는, L-아스파르트산이 석출되는 농도이면 어느 것이어도 되지만, 예를 들어, 60 v/v% 용액이다. 반응액에 포함되는 미반응 구연산 및 L-아스파르트산 중, L-아스파르트산이 석출 침전되므로, 원심 분리에 의해 고액 분리한다. 그리고, 이 공정에서는, 메탄올을 가하는 것이 중요하다. 에탄올은 불가능하다. 이후의 공정에는, 화합물 A 및 구연산을 포함하는 고액 분리 후의 수용액을 이용한다. 공정 (a)에서 사용하는 화합물 A 및 구연산을 포함하는 pH 2.0 이하의 수용액은, pH가 바람직하게는, 0.6~1.8, 가장 바람직하게는 1.0~1.6인 수용액일 수도 있다.
본 방법에 의해 화합물 A의 결정을 얻을 때에 어려운 점은, 화합물 A 및 구연산을 포함하는 수용액으로부터 구연산을 제외하는 것이다. 본 발명자들은, 구연산을 염의 형태로 하여 제외하는 것을 생각해 내, 각종 금속 이온으로 이루어지는 염을 이용하여 시행 착오를 거듭한 결과, 칼슘 이온(Ca2+)으로 구연산을 잘 제거할 수 있는 것을 발견했다. 그리고, 본 발명자들은, 칼슘염이라도, 염화칼슘(CaCl2)을 이용했을 경우에는, 산성 조건에 있어서 구연산을 잘 제거할 수 없고, 탄산칼슘(CaCO3)을 이용했을 경우에는, 산성 조건에서도 구연산을 순조롭게 제거할 수 있는 것도 발견했다. 이것은, 탄산칼슘의 탄산 이온(CO3 2-)이 CO2가 되어, 칼슘 이온의 상대 음이온이 없어지므로, 구연산 이온과 칼슘 이온이 결합하기 쉬워지기 때문이라 생각된다. 따라서, 공정 (a)에 있어서 탄산칼슘을 이용하는 것은 필수 조건이다.
상기 공정 (b)에서의 구연산 칼슘의 제거 및 공정 (d)에서의 황산칼슘의 제거는, 예를 들어, 원심 분리 혹은 여과에 의해 수행할 수 있다.
상기 공정 (c)에 있어서, 황산을 이용하는 이유로는, 화합물 A가 알칼리에 약하고 황산칼슘의 용해성이 낮기 때문에 칼슘 이온을 제거하기 쉬운(즉, 탈염이 용이한) 것을 들 수 있다. pH 2.0 이하로 함으로써, 화합물 A의 칼슘염으로 존재하고 있던 칼슘 이온이 화합물 A와 괴리되어, 황산칼슘이 된다. 이 때의 pH로는 1.0~2.0이 좋고, 보다 바람직하게는 1.3~1.8이 좋다. 나트륨염(황산나트륨)이나 칼륨염(황산칼륨)을 이용했을 경우에는 탈염은 어렵다.
상기 공정 (e)에서의 수용액을 농축하는 방법으로 구체적으로는, 가열 농축, 감압 농축 등을 예시할 수 있지만, 열에 의한 혼입 성분의 변질 혹은 분해를 방지하기 위해서는, 감압 농축에 의한 것이 바람직하다.
상기 공정 (f)에 있어서, 결정을 제거하는 방법으로는, 가압 여과, 흡인 여과, 원심 분리 등을 들 수 있다.
상기 공정 (g) 및 공정 (h)는, 화합물 A의 부분입체 이성질체염의 고순도화에 필수인 공정이다. 그 이유는, 공정 (f)에 있어서 화합물 A의 결정을 제거한 후의 수용액에는 아직 결정화할 화합물 A가 잔존하고 있기 때문이다.
상기 공정 (g)에 있어서 첨가하는 유기 용매로는, 물과 혼화하여, 화합물 A를 일정량 용해할 수 있는 유기 용매가 바람직하고, 구체적으로는, 아세톤 등을 예시할 수 있다.
상기 공정 (h)에서의 구연산 칼슘의 제거는, 예를 들어, 원심 분리 혹은 여과에 의해 수행할 수 있다.
상기 공정 (i)의 화합물 A의 결정을 석출시키는 방법으로는, 화합물을 석출시키는 방법이면 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는, 용매 유거에 의해 수용액을 농축하고, 다시 용매를 첨가하는 방법을 들 수 있다.
상기 공정 (j)에 있어서, 결정을 제거하는 방법으로는, 예를 들어, 원심 분리, 가압 여과, 및 흡인 여과를 들 수 있다. 상기 공정 (j)의 단계에서, 결정성 화합물 A는 거의 제거되어 있다.
상기 공정 (k)에 있어서 첨가하는 금속염으로는, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 및 칼슘염 등을 들 수 있고, 가장 바람직하게는, 칼슘염(예를 들어, 염화칼슘, 아세트산칼슘)을 이용할 수 있다. 또한, 수용액의 pH는 산성이 바람직하고, 특히 pH 3.6 이하가 가장 바람직하다.
상기 공정 (k)에 있어서 첨가하는 아미노산염으로는, 아르기닌염, 시트룰린염, 오르니틴염, 및 히스티딘염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산염, 예를 들어, L-아르기닌 염산염, L-시트룰린 염산염, L-오르니틴 염산염, 및 L-히스티딘 염산염을 들 수 있다.
상기 공정 (k)에 있어서 첨가하는 알코올로는, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올 등을 들 수 있고, 예를 들어, 에탄올 또는 메탄올을 이용할 수 있다. 화합물 A의 부분입체 이성질체염을 석출시키는 효율은 에탄올이 메탄올보다 좋다.
본 발명에 따른 화합물 A는, 구연산과 L-아스파르트산 및/또는 L-아스파라긴(가장 바람직하게는, L-아스파르트산)을 출발 물질로 하여 합성할 수 있다. 이 경우, 합성된 화합물 A는, 부분입체 이성질체 2종의 혼합물로 이루어진다. 아래의 순서에 의하면, 화합물 A의 결정화 및 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체염의 석출을 연속적으로 수행할 수 있다. 그리고, 아래의 공정에 있어서는, 상기에 기재된 대응하는 공정의 조건을 이용할 수도 있다.
(1) 구연산 일수화물과 L-아스파르트산 및/또는 L-아스파라긴(가장 바람직하게는, L-아스파르트산)을 가열하 반응시켜, 화합물 A를 생성시킨다. 가열 온도와 반응 시간은, 각종 조건을 고려하여 결정할 수 있다(예를 들어, 121℃, 8시간).
(2) 반응 종료 후, 반응액을 냉각 방치하여, 산성 조건하에서 메탄올을 가한다(예를 들어, 60% 메탄올 용액). 반응액에 포함되는 미반응 구연산 및 L-아스파르트산 중, L-아스파르트산이 석출 침전되므로, 원심 분리 혹은 여과에 의해 고액 분리한다. 분리된 L-아스파르트산은 재이용하는 것이 가능하다. 그리고, 이 공정에서는, 메탄올 이외에, 에탄올이나 이소프로판올을 가해서도, L-아스파르트산을 제거할 수 있지만, 이후에 첨가하는 탄산칼슘의 용해성에 있어서 메탄올이 최적이다.
(3) 얻어진 화합물 A 및 구연산을 포함하는 메탄올 용액에 정제수를 가하여 희석하고(예를 들어 2배 희석한다.), 이어서 탄산칼슘 분말(예를 들어, 반응액 1 mL당 228 mg)을 가한다. 이것에 의해, 반응액이 발포되고, 구연산 칼슘이 침전된다. 침전된 구연산 칼슘은, 원심 분리 또는 여과에 의해 고액 분리한다. 구연산 칼슘을 제거한 반응액은, 칼슘 이온을 포함하는 화합물 A의 메탄올 용액이다.
(4) (3)에서 얻어진 반응액을 농축하여 메탄올을 유거하고, 정제수를 가하여 당초의 반응액의 용량으로 만든다. 이것에, 예를 들어 1 M의 황산을 가하여 pH 2.0 이하 pH 1.3 이상으로 하면, 칼슘 이온이 황산칼슘이 되어 침전된다. 침전된 황산칼슘은, 원심 분리 또는 여과에 의해 고액 분리한다. 고액 분리 후의 반응액은, 화합물 A를 포함하는 황산 산성 용액이다.
(5) 이 황산 산성 용액을, 예를 들어 2/5 정도로 농축하면, 화합물 A의 결정(「결정화 화합물 A」라고 칭한다)이 정출(晶出)되므로, 분리하고, 나머지를 결정 모액으로 한다.
(6) 황산 산성의 결정 모액을 농축하고, 아세톤을 가하여 화합물 A의 아세톤 용액(산성)(예를 들어, 80% 아세톤 용액)으로 만들면, 엿형상 침강물이 석출되고, 이후에 결정화된다(구연산 칼슘). 해당 구연산 칼슘을 원심 분리 또는 여과에 의해 고액 분리한다.
(7) 고액 분리 후의 결정 모액을 농축하고, 탈수 처리(아세톤 탈수)를 수행한다. 탈수 처리 후의 결정 모액에 아세톤을 가하고, 용매 중의 아세톤을, 예를 들어 90% 이상으로 하면 화합물 A가 결정화되어 침전한다. 결정화된 화합물 A(「결정화 화합물 A」라고 칭한다)를 원심 분리 또는 여과에 의해 고액 분리한다.
(8) 화합물 A의 아세톤 용액에 정제수를 가하여 아세톤을 유거한다. 아세톤 유거 후의 화합물 A의 수용액에, 염화칼슘 및 수산화칼슘을 가하여, 예를 들어 pH 3.6으로 만들고, 이어서 에탄올(예를 들어, 70% 에탄올 수용액)을 가하면, 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체의 칼슘염이 침전된다. 이 침전물(비결정 화합물 A(Ca염))라 칭한다)을 원심 분리 또는 여과에 의해 고액 분리한다.
상기 공정 (5)에서 얻어지는 결정화 화합물 A(수용액 중 결정) 및 공정 (7)에서 얻어지는 결정화 화합물 A(아세톤 중 결정)는, 각각 아래의 조작을 수행하여 보존한다.
물에 재용해⇒재결정⇒HPLC에 의한 정성 분석으로의 순도 평가⇒건조⇒보존
상기 공정 (8)에서 얻어지는 비결정 화합물 A(Ca염)는, 각각 아래의 조작을 수행하여 보존한다.
물에 재용해⇒농축(침전된 구연산 칼슘을 제거)⇒화합물 A의 수용액에 에탄올(예를 들어, 90 v/v% 에탄올 수용액)을 첨가⇒재침강⇒HPLC에 의한 정성 분석으로의 순도 평가⇒건조⇒보존
얻어진 비결정 화합물 A(Ca염)는, 사용 시에는, 황산 산성으로 하여 칼슘을 제거할 수 있고, HPLC에 의한 정성 및 정량 분석으로 화합물 A로 하여 농도를 평가할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명에 대하여 실시예를 들어 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 조금도 한정되는 것이 아니다.
[실시예 1]
(화합물 A의 합성)
240 g의 구연산(일수화물, 와코준야쿠코교)(1.142 mol)에 물을 가하여 400 mL의 농후한 구연산 용액을 조제하고, 이 용액에 72 g의 L-아스파르트산(와코준야쿠코교)(0.541 mol)을 가하고, 메스 업하여 액량을 600 mL로 했다(구연산 최종 농도: 1.903mol/L, L-아스파르트산 최종 농도: 0.902mol/L). 이 반응액을 내압 유리 용기에 넣어 밀전(密栓)하고, 90℃의 수욕 중에서 가온하고, 첨가한 L-아스파르트산을 가능한 한 용해했다. 그 다음, 가온하여 80℃정도로 한 오토클레이브 내에, 이 내압 용기 내의 반응액을 넣고, 121℃에서 120분간 가열 처리했다. 오토클레이브 내의 온도가 약 80℃까지 냉각되면, 내압 용기 내의 반응액을 꺼내 교반하고, 녹고 남은 L-아스파르트산을 가능한 한 용해했다. 또한, 상기 반응액을 오토클레이브로 121℃, 120분간 가열 처리를 했다. 이 교반과 가열 처리를 반복하여, L-아스파르트산을 용해시키면서, 총 420분의 121℃의 가열 처리를 수행했다(L-아스파르트산은 360분의 가열이 종료된 시점에서 완전 용해했다.). 이 반응액 중에는, 화합물 A가 합성되어 있는 것을 하기 실시예 2에 기재된 HPLC에 의한 정성 분석으로 확인했다(도 1). 도 1은, 화합물 A 합성 반응액의 HPLC 크로마토그램(160배 희석)을 나타낸다. 도 1로부터 명백하듯이, 가열 반응 후의 합성 반응액에는 화합물 A의 피크(RT 26.0)가 출현하고, 구연산(RT 27.7)의 피크의 높이가 감소했다. 그리고, 이후의 해석에 의해, RT26.0의 피크가 화합물 A인 것을 확인했다. 그리고, 합성 원료의 아스파르트산은, 210 nm의 흡광이 거의 보여지지 않으므로, 이 검출계에서는 검지되지 않는다.
[실시예 2]
(화합물 A의 HPLC에 의한 정성 분석의 분리 조건)
합성 반응액 및 그 정제 시료에 존재하는 화합물 A는, 하기의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 정성 분석에 의해, 그 존재를 확인했다. 각종 농도의 화합물 A를 포함하는 용액은, 적절한 농도가 되도록 10 mM 과염소산 수용액(HPLC에 의한 정성 분석의 이동상)으로 희석하고, 멤브레인 필터로 불용물을 제거하여, 희석액을 고속 액체 크로마토그래피로 분석했다. HPLC에 의한 정성 분석의 분리 조건은 아래에 기재한 바와 같았다. 크로마토그램 중의 화합물 A라고 생각되는 목적 성분은, 보유 시간(RT) 25.4~26.0분의 피크이다.
[HPLC에 의한 정성 분석의 분리 조건]
장치: 시마즈세이사쿠쇼 고성능 액체 크로마토그래프 Prominence
칼럼: Shodex RSpak KC-811(300 mm×8.0 mm)을 2개 연결
이동상: 10 mM과염소산 수용액
유속: 0.5 mL/min
칼럼 온도: 30℃
주입량: 20 μL
검출 파장: 210 nm
[실시예 3]
(화합물 A의 정제와 화합물 A의 결정화)
상기의 가열 반응 후의 반응액 600 mL에 대하여, 메탄올(와코준야쿠) 900 mL를 가하여, 60% 메탄올 용액으로 만들면, 반응액 중의 미반응 L-아스파르트산이 서서히 석출되어, 백색 침전으로 침강한다. 그리고, 해당 공정에 있어서 에탄올 용액을 사용했을 경우, 이후의 공정에 있어서 동일한 공정을 채용해도 화합물 A는 결정화되지 않았다. 이 용액을 실온에서 만 하루 정치하여, 가능한 한 L-아스파르트산을 침강시킨 후에, 여과지(Whatman, No. 114)로 여과를 수행하여, 침강물과 화합물 A를 포함하는 반응액(60% 메탄올)을 분리했다. 침강물로 얻어진 L-아스파르트산은, 메탄올을 기화 제거하고, 건조시키면 화합물 A 합성의 합성 원료로 재이용할 수 있다. 여과액으로 얻어진 화합물 A를 포함하는 반응액(60% 메탄올)을 정제수(일본약전(日本藥局方) 정제수)로 2배 희석하여, 30% 메탄올 용액으로 만들었다. 그 용액에, 탄산칼슘(와코준야쿠코교)의 분말 136 g(출발 반응액 1 mL당 228 mg)을 교반하면서 서서히 가해 가면, 용해도가 낮은 구연산 칼슘의 백색 침전이 석출된다. 처음에은 발포(탄산 가스)하면서 탄산칼슘이 용해되지만, 이후에 서서히 용액으로부터 용해도가 낮은 구연산 칼슘이 석출된다. 이 용액을 만 하루 정치하면, 미반응 구연산이 거의 구연산 칼슘으로 침강되어, 농후한 백탁액이 된다. 원심 분리(실온, 1500×g, 30분)에 의해, 이 백탁액을 침강물과 그 상청 용액으로 분리하여, 화합물 A를 포함하는 상청 용액(30% 메탄올을 포함한다)을 회수했다. 회수한 상청 용액을, 증발기(토쿄리카기카이)로 농축하면서 메탄올을 유거하여, 농후한 엿형상 용액으로 만들었다. 농축된 화합물 A를 포함하는 엿형상 용액에 정제수를 가하여 출발 반응액과 동일한 600 mL로 했다. 이 용액에 1 mol/L(2 N) 황산을 서서히 가하여 용액 pH가 1.3~1.6이 되면, 용액 중의 Ca 이온이, 황산칼슘염으로 석출되어, 침강한다. 이 침강물을 여과에 의해 제거하고, 여과액을 회수했다. 이 여과액에는 화합물 A를 포함하여, 황산 산성이다. 이 용액(약 600 mL)을 40℃의 수욕 중에서 가온하면서 증발기로 농축하고, 용량을 약 250 mL(~200 mL)로 했다. 용액을 화합물 A 결정화의 모액으로 하여 실온까지 냉각하고, 유리 벽면을 스패튤라 등으로 문지르면 결정성 화합물 A석출물이 출현되고, 그대로 만 하루 정치하면, 백색의 침강물을 얻을 수 있었다. 이 침강물을 여과에 의해 모액 용액과 분리하고, 소량의 정제수로 세정한 후에 회수하여, 화합물 A결정을 얻었다.
상기 합성 반응액으로부터 일련의 정제, 결정성 화합물 A의 정출의 조작까지를 반복적으로 수행하여, 3 L의 합성 반응액으로부터 화합물 결정을 약 130 g(습중량)을 얻었다. 극소량의 결정(종결정(種結晶)을 남겨 두고, 나머지 결정을 가능한 한 소량의 정제수에 용해하고(40℃의 온욕(溫浴) 중), 이 용액을 증발기로 고도로 농축한 후, 냉각하고, 종결정을 용액에 가하여 다시 결정을 얻었다. 이 결정을 흡인 여과로 분취하고, 건조시켜, 113 g의 결정화된 화합물 A를 얻었다. 얻어진 화합물 A결정의 정밀도를 확인하기 위해, 합성 용액 중의 화합물 A의 확인(도 1)과 동일한 HPLC에 의한 정성 분석으로 평가를 수행했다(도 2). 도 2는, 수용액 중에서 결정화된 화합물 A결정의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 구체적으로는, 가열 반응 후의 합성 반응액으로부터 정제된 화합물 A를 수용액 중에서 결정화하고, 그 결정을 재결정으로 정제한 후, HPLC로 평가했다. 결정화된 화합물 A를 70 mg칭량하고, 정제수 1 mL에 용해했다. 이 용액을 HPLC 분석계의 이동상 용매(10 mM 과염소산 용액)로 160배 희석하고, 분석했다. 화합물 A의 명확한 피크가 보여지고, 불순물이 되는 그 외의 피크는 거의 흔적 정도로 명확하지 않아, 고도로 정제되어 있는 것을 확인했다.
또한, 화합물 A의 비결정은 흡습성이 있고, 농축 고형화해도 흡습하여 점성이 매우 높은(엿형상) 형태로 변화되어, 취급하기 어려운 것이었다. 한편, 화합물 A의 결정은 흡습성이 없는 분체로, 취급하기 쉬웠다.
[실시예 4]
(비결정성 화합물 A의 정제)
상술한 방법으로 화합물 A의 결정을 분취하고, 여과액으로 얻어지는 결정 모액이 된 용액을 사용하여, 결정화하지 않는 화합물 A의 정제 재료로 했다. 이 용액에는, HPLC에 의한 정성 분석으로, 화합물 A가 잔존하고 있는 것을 확인했다(도 3). 도 3은, 화합물 A를 정출한 후, 여과에 의해 결정을 분취한 여과액의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 여과액을 HPLC에 의한 정성 분석의 이동상(10 mM 과염소산 용액)으로 400배 희석하여, 분석했다. 화합물 A의 피크가 메인 피크로 보여지고, 불순물이 되는 다른 성분의 피크도 확인되었다.
3 L의 합성 반응액으로부터 얻은, 결정 모액 용액 약 1 L를 40℃의 수욕 중에서 증발기를 이용하여 농축하고, 약 200 mL의 점도가 높은 농축액을 얻었다. 이 농축액에 약 800 mL의 아세톤(와코준야쿠코교)을 가하여 혼화하면, 백탁하고, 약 1시간 후에는 백탁 성분이 침강하여 엿형상의 액체 석출물이 침강했다. 상청과 엿형상 석출물을 분리했다. 엿형상 석출물로부터는 구연산 칼슘을 포함하는 결정성 석출물이 얻어졌다. 상청은 다시 증발기를 이용하여 농축하여, 점도가 높은 농축 용액으로 만들었다. 이 용매 유거에 의한 농축과 아세톤 용해를 3회 반복하여, 용액 중의 수분을 아세톤으로 치환하는 처리(아세톤에 의한 용액의 탈수)를 수행했다. 이 아세톤 탈수의 과정에서, 수분의 감소와 함께 서서히 백색의 결정성 석출물이 증가했다. 최종적으로 500 mL의 아세톤 용액으로 만들고, 이 용액을 만 하루 정치하면, 백색의 결정성 석출물이 침강했다. 이 침강물과 상청의 아세톤 용액을 여과에 의해 분리했다. 이후의 분석으로, 이 백색의 석출물은, 결정성 화합물 A인 것을 알 수 있었다(도 4). 도 4는, 아세톤 중에서 결정화된 화합물 A를 재결정에 의해 정제한 결정의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 구체적으로는, 여과한 결정을 정제수로 재결정하여 정제하고, 재결정된 결정(약 20 mg)을 정제수(약 0.5 mL)에 용해하고, 이 용액을 HPLC에 의한 정성 분석의 이동상(10 mM과염소산 용액)으로 40배 희석하여, 분석했다. 명확한 화합물 A의 피크가 보여지고, 불순물의 피크는 흔적 정도로 명확하지 않았다. 여기까지의 처리로 결정 모액 용액의 결정성 화합물 A 부분입체 이성질체가 거의 정출되고, 아세톤 용액 중에 용존하고 있는 화합물 A는, 그 대부분이 비결정성인 화합물 A의 부분입체 이성질체가 되었다.
그 다음, 비결정성인 화합물 A의 부분입체 이성질체를 포함하는 아세톤 용액에 정제수 500 mL를 가하여, 증발기로 아세톤을 유거하는 조작을 3회 반복하여, 용액 용매를 물로 변환했다. 이 수용액(용액 용량 약 200 mL)에 염화칼슘 100 g를 가하고, 추가로 수산화칼슘을 가하여 용액 pH를 3.6으로 했다. 이 처리에 의해, 산성 물질인 화합물 A를 칼슘염으로 유도했다. 용액 용량을 300 mL가 되도록 정제수로 메스 업하고, 700 mL의 에탄올을 가하여, 70% 에탄올 용액으로 만들면, 화합물 A의 칼슘염이 백색 침강물로 석출된다. 이 침강물을 원심 분리에 의해 상청 용액과 분리하고, 추가로 침강물을 70% 에탄올로 세정하여 정제하고, 정제 침강물(비결정 화합물 A의 Ca염(1))을 얻었다. 한편, 70% 에탄올로 한 상청 용액을 HPLC에 의한 정성 분석으로 확인하면, 그 용액 중에 화합물 A가 잔존하고 있었으므로, 보다 강하게 화합물 A를 Ca염으로 유도하는 조건으로 용액의 pH를 6.0으로 조정하고, 80% 에탄올 용액으로 침강물을 얻었다. 이 침강물을 80% 에탄올로 세정하여, 정제 침강물로 했다(비결정 화합물 A의 Ca염(2)).
상기 조작에 의해 pH 3.6에서 얻은 정제 침강물과 pH 6.0에서 얻은 정제 침강물을 각각 HPLC에 의한 정성 분석으로 평가했다(도 5, 도 6). 각 침강물(약 10 mg)을 정제수(약 1 mL)에 용해하고, HPLC에 의한 정성 분석의 이동상인 10 mM 과염소산 수용액으로 40배로 희석하여, 분석했다(산성 용매인 10 mM 과염소산 수용액으로 희석됨으로써, 화합물 A의 Ca염은 화합물 A로 변환되어, 화합물 A로 검출된다). 도 5는, pH 3.6에서 석출한 침강물의 HPLC 크로마토그램이며, 도 6은, pH 6.0에서 석출한 침강물의 HPLC 크로마토그램이다. pH 3.6에서 얻은 정제 침강물(비결정 화합물 A의 Ca염(1))의 HPLC 크로마토그램에서는, 불순물의 피크가 보여지지만, 화합물 A의 메인 피크가 강하게 관찰되고, 정제되어 있다. 한편, pH 6.0에서 얻은 정제 침강물(비결정 화합물 A의 Ca염(2))의 HPLC 크로마토그램에서는, 화합물 A의 피크와 함께, 화합물 A의 이미드 구조의 일부가 가수 분해되어 아미드화된 화합물(화합물 A의 피크의 왼쪽 어깨와 겹쳐지는 피크)의 혼입이 보여지고(피크 2), 또한 구연산으로 생각되는 피크(피크 3)가 증가되어 있었다. 따라서, pH 6.0의 알칼리 첨가량에서는 화합물 A의 가수 분해가 진행된 것으로 생각되고, 화합물 A의 Ca염을 석출시키는 조건으로 너무 가혹하다고 생각되었다. pH 3.6에서 석출시킨 화합물 A의 Ca염에서는, 화합물 A의 가수 분해물의 혼입은 매우 미량인 점에서, pH 3.6이 알칼리 조건으로서의 한계라고 생각되었다.
이 에탄올 용액 중에서 석출하는 화합물 A의 Ca염의 침강물은 물에 용해되고, 황산 산성(예를 들어, pH 1.3)으로 함으로써 황산칼슘을 석출시키면, 칼슘분을 제거할 수 있고, 화합물 A의 황산 산성 용액으로 조제가 가능하다. 이 정제의 프로세스로, 3 L의 합성 반응액으로부터, pH 3.6에서 얻은 정제 침강물인 비결정 화합물 A의 Ca염(1)의 건조 고체로 192.7 g을 얻었다.
[실시예 5]
(화합물 A 부분입체 이성질체의 HPLC에 의한 정성 분석)
상기 화합물 A 합성 용액으로부터의 정제 처리에 의해 얻어진 정제물의 화합물 A의 부분입체 이성질체의 존재 비율은, 하기의 칼럼을 이용한 HPLC에 의한 정성 분석에 의해 확인할 수 있다. 각종 농도의 화합물 A를 포함하는 용액은, 적절한 농도가 되도록 0.1% TFA 수용액(98 용량)과 메탄올(2 용량)의 혼합액(HPLC에 의한 정성 분석의 이동상)으로 희석하고, 멤브레인 필터로 불용물을 제거하여, 고속 액체 크로마토그래피에 의해 분석했다. HPLC에 의한 정성 분석의 조건은 아래에 기재한 대로였다. 크로마토그램 중의 화합물 A로 생각되는 목적 성분은, 유지 시간(RT) 3.3~3.7분의 영역에 2개의 인접하는 피크로 검출된다(단, 칼럼 충전제의 열화 등의 영향에 의해 RT는, 약간 바뀌는 경우가 있다). 결정성 화합물 A 부분입체 이성질체는 칼럼에서의 보유 시간이 긴 우측의 피크로 검출되고, 비결정성 화합물 A 부분입체 이성질체는 보유 시간이 짧은 좌측의 피크로 검출된다.
[HPLC에 의한 정성 분석의 분리 조건]
장치: 시마즈세이사쿠쇼 고속 액체 크로마토그래프 Prominence
칼럼: Phenomenex Kinetex F5(100 mm×4.6 mm)
이동상: 0.1% TFA 수용액(98 용량)과 메탄올(2 용량)의 혼합액
유속: 0.8 mL/min
칼럼 온도: 30℃
주입량: 5 μL
검출 파장: 200 nm
[실시예 6]
(화합물 A 함유 샘플의 부분입체 이성질체 분석 결과)
상기의 칼럼을 이용한 HPLC에 의한 정성 분석에 의해, 화합물 A 합성 용액으로부터의 각 정제 샘플에서의 부분입체 이성질체의 존재 상태를 확인했다.
(1) 화합물 A 합성 용액
화합물 A의 합성 용액으로부터 미반응 아스파르트산 및 구연산의 대부분을 제거하여 조정제한 화합물 A 합성 용액 중의 화합물 A 부분입체 이성질체의 존재 상태를 확인했다(도 7). 도 7은, 조정제한 화합물 A 합성 용액의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 화합물 A의 2개의 부분입체 이성질체는, 인접하는 2개의 피크로 검출되고, 그 존재 비율은 거의 균등했다.
(2) 화합물 A 결정
화합물 A의 합성 용액으로부터 정제하고, 수용액 중에서 결정화된 화합물 A 결정을 정제수에 용해하여, 화합물 A 부분입체 이성질체의 존재 상태를 HPLC에 의한 정성 분석으로 평가했다(도 8). 도 8은, 수용액 중에서 결정화된 화합물 A의 HPLC 크로마토그램(도 2와 동일한 샘플 유래의 분석 결과)을 나타낸다. 결정성 화합물 A는, 2개의 화합물 A 부분입체 이성질체가 검출되는 영역 중, 유지 시간이 긴 우측의 피크로 검출되고, 그 존재 비율은 피크 면적비로 99% 이상이었다. 다른 쪽의 부분입체 이성질체의 혼입 비율은 0.36%(피크 면적비로부터 산출)였다.
(3) 아세톤 중에서 결정화된 화합물 A 결정
화합물 A의 합성 용액으로부터 정제하고, 아세톤 중에서 결정화된 화합물 A 결정을 정제수에 용해하여, 화합물 A 부분입체 이성질체의 존재 상태를 HPLC에 의한 정성 분석으로 평가했다(도 9). 도 9는, 아세톤 중에서 결정화된 화합물 A의 HPLC 크로마토그램(도 4와 동일한 샘플 유래의 분석 결과)을 나타낸다. 아세톤 중에서 결정화된 화합물 A 결정도, 수용액 중에서 결정화된 화합물 A와 마찬가지로, 2개의 화합물 A 부분입체 이성질체가 검출되는 영역 중, 유지 시간이 긴 우측의 피크로 검출되었다. 그 존재 비율은 피크 면적비로 98% 이상이었다. 다른 쪽의 부분입체 이성질체의 혼입 비율은 1.36%(피크 면적비로부터 산출)였다.
(4) pH 3.6에서 70% 에탄올에 의해 침강한 비결정 화합물 A의 Ca염(비결정 화합물 A Ca염(1))
화합물 A의 합성 용액으로부터 결정화하는 화합물 A를 정출시킨 후, 용액에 남은 비결정 화합물 A를, pH 3.6의 조건에서 Ca염으로 하고, 70% 에탄올 중에서 석출시킨 침강물의 화합물 A의 부분입체 이성질체의 존재 상태를 HPLC에 의한 정성 분석으로 평가했다(도 10)(도 5의 샘플과 동일한 석출물 샘플). 도 10은, pH 3.6에서 석출한 비결정성 화합물 A Ca염(비결정 화합물 A Ca염(1))의 HPLC 크로마토그램(도 5와 동일한 샘플 유래의 분석 결과)을 나타낸다. 70% 에탄올 중에 석출한 침강물을 정제수에 용해하고, HPLC로 정성 분석을 실시한 결과, 2개의 화합물 A 부분입체 이성질체가 검출되는 영역 중, 유지 시간이 짧은 좌측의 피크로 검출되었다. 이 피크는 결정성 화합물 A피크와는 명백하게 상이한 RT의 피크로 검출되었다. 그 존재 비율은 피크 면적비로 99% 이상이었다. 다른 쪽의 부분입체 이성질체(결정성 화합물 A)의 혼입 비율은 0.45%(피크 면적비로부터 산출)였다.
(해설: 각 크로마토그램에서의 피크는 뒤쪽으로 테일링(피크의 아래쪽이 연장되어 퍼지는 현상)되어 있으므로, 혼입 피크의 피크 높이의 겉보기로부터, 피크 면적비가 작다)
[실시예 7]
(이온 교환 크로마토그래피에 의한 화합물 A의 결정의 제조)
1. 출발 물질의 정제
1-1. 출발 물질의 조제
75 g의 구연산(일수화물)(0.59 mol)에 물을 가하여 83.3 mL의 농후한 구연산 용액을 조제하고, 이 용액에 10 g의 L-아스파라긴(0.111 mol)과 1.5 g의 L-아스파르트산(0.019 mol)을 가하고, 메스 업하여 액량을 100 mL로 했다. 이 반응액을 내압 유리 용기에 넣어 밀전하고, 90℃의 수욕 중에서 가온하여, 첨가한 L-아스파라긴이나 L-아스파르트산을 완전 용해했다. 그 다음, 가온하여 80℃ 정도로 한 오토클레이브 내에, 이 내압 용기 내의 반응액을 넣고, 121℃에서 180분간 가열 처리했다. 반응 후, 상기 반응액을 25℃까지 자연 냉각한 후, 1 L의 비커에 반응액을 꺼내, 빙냉(氷冷)했다.
약 20 g의 수산화나트륨을 83 mL의 정제수에 용해하고, 이 수산화나트륨 수용액을 빙냉하고, 상기 반응액에 서서히 가하여, 반응액을 pH 5.8로 중화했다(중화열로 발열하기 때문에 25℃가 되는 것을 확인하면서 중화했다). 중화 후에 반응액의 용량을 정제수로 200 mL로 했다. 그 다음, 33.3 g의 염화칼슘(이수화물)을 0.33 L의 정제수에 용해하고, 염화칼슘 용액을 조제하고, 그 절반 정도의 양을 상기 반응액에 가하여, 잘 교반하고, 약 16시간 정치했다. 용액에는 백색으로 침강물(구연산 칼슘)이 석출했다. 추가로 염화칼슘 용액을 가하면 백색 침강물이 새로 침강했으므로, 서서히 염화칼슘 용액을 추가하여, 200 mL의 중화된 반응액에, 상기 염화칼슘 용액을 약 333 mL(염화칼슘량으로, 0.23 mol) 가했다. 이 혼합 용액에 정제수를 가하여 전체량을 600 mL로 하고, 그 후에 구연산 칼슘인 백색 침강물을 원심 분리에 의해 제거하고, 상청을 회수했다. 그 다음, 이 상청 430 mL를 증발기(열을 가하고 싶지 않으므로, 탕온은 25℃에서 실시)로 133 mL로 농축했다. 농축한 수용액에 310 mL의 에탄올을 가하여 교반했다. 당분간 정치하면 에탄올을 가한 혼합액은 2층으로 분리되고, 비교적 투명한 상층(에탄올층)과 착색이 보여지고 점성이 있는 하층 용액 50 mL로 나누어졌다. 하층을 분액 회수하고, 정제수로 130 mL 정도로 희석한 후, 증발기(열을 가하고 싶지 않으므로, 탕온은 25℃에서 실시)로 용액 중에 잔존하는 에탄올을 유거하여 55 mL로 했다. 이 용액을 원심 분리하여 상청 45 mL를 얻었다. 이 상청을 동결 건조한 결과 32.67 g이었다. 이것을 출발 물질로 했다.
1-2. 이온 교환 칼럼 크로마토그래피(SuperQ)
상기 방법에 의해 조제한 출발 물질 280 mL(수용액, 고형분 235 g)를 정제수 1 L에 용해하고, 25% 암모니아수 약 13 mL, 정제수 19 L를 순서대로 가하여 pH 및 도전율을 조정하고, 도입 샘플(pH=7.1, 도전율=8.4mS/cm)로 했다. 이것을 이온 교환 칼럼 크로마토그래피(TOYOPEARL SuperQ-650M φ150mm×500 mm)에 제공했다. 이동상과 분취한 각 획분의 자세한 것은 도 11에 나타냈다. 2개의 목적물 획분을 각각 동결 건조하고, 도 11 중의 표 1에 나타낸 것을 얻었다. 2개의 목적물 획분(Fr(fraction) 8-12및 Fr13)의 목적물 추정 함유량은 5.4 g으로 산출되고, 원료 중의 목적물 추정 함유량 64.1 g으로부터의 회수율은 86.4%였다. 그리고, 표 1 중에서의 Lot. No.는 상기 2개의 목적물 획분에 편의적으로 붙인 번호이다.
1-3. 이온 교환 칼럼 크로마토그래피(DOWEX 50W×8), 동결 건조에 의한 아세트산암모늄 제거
Fr8-12(Lot No. 198-012-74-1) 740.2 g을 정제수 약 600 mL에 용해하고, 이온 교환 수지(DOWEX 50 Wx8, H+형, 100-200 mesh)로 배치(batch) 처리 후, 동결 건조했다. 동결 건조품을 다시 정제수 800 mL에 용해하고, 2회로 나누어, 이온 교환 칼럼 크로마토(DOWEX 50 Wx8, H+형, 150 mm×200 mm)에 도입했다. 도입 후는 정제수를 송액하여, 목적물을 포함하는 획분을 회수하고, 동결 건조했다. 건조 잔사에 정제수를 가하여 동결 건조를 수차례 반복하여, 아세트산을 저감시켰다. 이 때, 정제 수 중에서 결정화했기 때문에, 흡인 여과에 의해 결정과 모액을 분리했다. 각각 동결 건조 후, 아래의 것을 얻었다.
화합물 A의 결정: 16.5 g(Lot No. 198-012-078-1 백색 결정, HPLC 크로마토그램=도 12를 참조, 1 H NMR 스펙트럼=도 13을 참조)
화합물 A의 결정을 분취한 후의 모액(화합물 A를 포함한다): 36.1 g(Lot No. 198-012-078-2 유백색 아몰퍼스형, HPLC 크로마토그램=도 14를 참조, 1 H NMR 스펙트럼=도 15를 참조)
2. 통계
출발 물질 280 mL(수용액, 고형분 235 g)로부터 이온 교환 칼럼 크로마토그래피에 의해, 아래의 것을 얻을 수 있었다. 1 H NMR로부터 산출한 아세트산 함유량 및 HPLC 면적값으로부터 산출한 목적물(화합물 A)의 추정 함유량을 표 1에 나타냈다. 이번 정제 프로세스로 얻어진 3로트의 총 목적물 함유량은, 54.2 g으로 산출되고, 출발 물질(목적물 추정 함유량 64.1 g)로부터의 회수율은 84.5%였다.
이상과 같이 이온 교환 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제에 의해, 화합물 A의 수용액으로부터, 결정을 정출할 수 있는 것이 나타났다.
[표 1]
Figure 112019106388763-pct00006
*1 수율은 출발 물질의 고형분 235 g을 출발 원료로 하여 산출했다.
*2 아세트산 함유량은 1 H NMR로부터 산출했다.
*3 목적물 추정 함유량은 이번에 얻어진 화합물 A의 결정의 피크를 표준품으로 하여, HPLC 면적값의 1점 검량선으로부터 산출했다.
*4 「HPLC 순도」는, 화합물 A로서의 순도를 나타낸다.
[실시예 8]
(분말 X선 회절)
아래의 방법에 의해, 본 발명의 화합물 A의 결정 및 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체를 이용하여 분말 X선 회절 측정을 수행했다.
1. 목적
상기 실시예에 있어서 얻어진 본 발명의 화합물 A의 결정 및 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체가 결정질인지, 그렇지 않으면 비결정질(아몰퍼스)인지를 확인한다.
2. 시료
실시예 7에서의 칼럼 정제에 의해 수용액으로부터 얻은 화합물 A의 결정(검체 1), 실시예 4에서의 아세톤 용액으로부터 얻은 화합물 A의 결정(종결정으로 보존한 재결정되지 않은 결정)(검체 2), 및 실시예 4에서의 제조 방법에 의해 얻은 비결정 화합물 A(화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체)의 Ca염(1)(검체 3)을 자료로 이용했다.
3. 분석 방법
3.1. 장치
(주) 리가쿠 제품 RINT-TTRIII형 광각 X선 회절 장치
X선원 ;CuKα 선
관전압-관전류;50kV-300mA
스텝 폭;0.02deg.
측정 속도;5deg. /min
슬릿계;발산-수광-산란
0.5deg. -0.15mm-0.5deg.
회절선 만곡 결정 모노크로미터
3.2. 방법
검체 1~검체 3의 분말을 그대로 측정했다.
4. 결과
도 16은, 검체 1(칼럼 정제에 의해 수용액으로부터 얻은 결정), 검체 2(아세톤 용액으로부터 얻은 결정) 및 검체 3(비결정성 부분입체 이성질체의 Ca염) 각각의 물질에 관한 분말 X선 회절 패턴의 다중 플롯에 의한 비교를 나타낸다. 또한, 검체 1의 분말 X선 회절 피크 리스트를 표 2에, 검체 2의 분말 X선 회절 피크 리스트를 표 3에 나타낸다.
도 16(상단 및 중단) 및 표 2~표 3으로부터 명백하듯이, 검체 1 및 검체 2는, 분말 X선 회절에서의 회절 패턴에 있어서 명확한 피크가 관찰되고, 결정질의 고체인 것이 확인되었다. 또한, 검체 1과 검체 2의 분말 X선 회절에서의 회절 패턴이 일치하고 있는 점에서, 양자는 동일 형상의 결정질인 것도 확인되었다.
한편, 도 16(하단)으로부터 명백하듯이, 비결정성 부분입체 이성질체를 Ca염으로 하여 에탄올을 가하여 고형화함으로써 얻어진 고체인 검체 3은, 분말 X선 회절 패턴에 명확한 피크가 확인되지 않고, 비정질(비결정성: 아몰퍼스)의 고체인 것이 확인되었다.
[표 2]
Figure 112019106388763-pct00007
[표 3]
Figure 112019106388763-pct00008
[실시예 9]
(결정성 화합물 A의 입체 배치의 결정)
아래의 방법에 의해, 단결정 X선 회절에 의한 구조 해석을 위한 화합물 A의 단결정을 제작하고, 해당 단결정을 이용하여 단결정 X선 회절에 의한 구조 해석을 수행했다.
1. 목적
화합물 A는, 실시예 3의 단락 [0048]에 기재된 방법으로 합성하면, L-아스파르트산(S형) 유래의 구조에, 구연산이 이미드 결합하여, 아래에 나타내는 2개의 부분입체 이성질체(SS형와 SR형)가 합성된다. 그 중 한쪽은 결정화되고, 다른쪽은 결정화되지 않는 성질을 갖는다. 이 차이에 의해, 2개의 부분입체 이성질체는 각각 분리·정제가 가능했지만, 지금까지 어느 쪽이 SS형인지, 혹은 SR형인지가 특정되지 않았다. 이 과제를 해결하기 위해, 결정성 화합물 A의 0.2 mm×0.2 mm 정방형 이상의 크기를 갖는 단결정을 제작하여, 단결정 X선 회절에 의한 구조 해석을 수행했다.
[화학식 6]
Figure 112019106388763-pct00009
화합물 A를 실시예 3의 단락[0048]에 기재된 방법으로, 물이나 아세톤 등의 용매 중에서 결정화시켜도, 단결정 X선 회절에 의한 구조 해석을 실시할 수 있는 크기의 단결정은 얻을 수 없다. 그래서, 화합물 A의 단결정을 얻기 위한 용매계나 정출 방법의 검토를 수행하고, 단결정 X선 회절에 의한 구조 해석에 사용 가능한 레벨의 크기의 단결정 제작 방법을 확립하여, 해석을 수행했다.
2. 화합물 A의 단결정 제작의 조건 검토
실시예 3의 단락[0048]에 기재된 방법으로 합성, 정제하여, 수용액 중에서 결정화된 화합물 A의 결정에 대하여, 실시예 3의 단락[0049]에 기재된 재결정에 의해 추가로 정제하여 얻은 화합물 A를 원료로 하여 단결정 X선 회절에 의한 구조 해석을 위한 단결정 제작의 검토를 수행했다.
실시예 3의 단락[0049]에 기재된 재결정과 동일한 조작을 3회 반복하여, 고도로 순수화된 화합물 A의 결정성 분말을 얻었다. 이 결정성 분말 10 g에 100 ml의 정제수(일본약전 정제수)를 가하여, 50℃의 수욕 중에서 가온하여 용해했다. 이 용액을 0.22 μm 포어 사이즈(pore size)의 멤브레인 필터(머크밀리포어(Merck Millipore))를 사용하여 여과하고, 여과액을 회수했다. 이 여과액을 40℃의 수욕 상에서 증발기를 이용하여 농축하고, 50 ml 정도의 용액으로 회수했다. 이 용액은, 농축과 실온에 냉각되는 것에 의해, 과포화 상태가 된다. 이 용액을 가온 상태(40℃)인 채, 아래 표(표 4)에 기재된 용매 비율이 되도록 뚜껑이 달린 시험관에 분주하여, 혼합 용매의 용액을 제작했다. 구체적으로는, 400 μL의 과포화 용액에, 메탄올이나 에탄올, 아세톤 등의 유기 용매를 100 μL 가함으로써, 용매 중의 물의 비율이 80%인 용액으로 만들었다. 마찬가지로 300 μL(물 60%), 200 μL(물 40%), 100 μL(물 20%)의 과포화 용액에, 메탄올이나 에탄올, 아세톤 등의 유기 용매를 200 μL, 300 μL, 400 μL 가하여, 각각 용매 중의 물의 비율이 60%, 40%, 20%가 되는 혼합 용매 용액을 제작했다. 물 100%의 용액은 과포화 용액을 그대로 500 μL 분주했다. 메탄올에탄올, 아세톤 등의 유기 용매 100%의 용액은, 50 mg의 고도로 순수화된 화합물 A의 결정을 시험관에 넣고, 용매 500 μL를 가하여, 40℃로 가온하여 가능한 한 용해했다. 이소프로판올과 물의 혼합 용매계에서는, 이소프로판올의 비율이 40% 이상에서는, 화합물 A의 용해성이 저하되어 급속히 침강물이 많이 석출되었기 때문에, 이소프로판올의 혼합 용매계에서는 40% 이상의 검토는 수행하지 않았다. 결과를 표 4에 나타낸다.
[표 4]
Figure 112019106388763-pct00010
이와 같이 제작한 화합물 A의 각 용액의 시험관의 뚜껑을 닫아 밀폐하고, 실온에서 만 하루 이상 정치하여 과포화 상태로부터 석출하는 화합물 A를 석출시켰다. 각 시험관을 원심 분리(실온, 3000 rpm, 10분)하여, 석출물을 침강시키고, 각 용액의 상청을 다른 청정한 플라스틱제 뚜껑이 달린 시험관에 주의 깊게 옮겨, 각 용액의 포화 용액으로 만들었다. 각 포화 용액의 시험관의 뚜껑을 닫은 상태로, 그 플라스틱제 뚜껑에 주사용 바늘로 핀홀을 뚫고, 실온에서 정치하고, 그 핀홀로부터 천천히 용매가 증발하는 것에 의해 화합물 A의 결정이 석출된다. 석출된 결정의 형상이나 크기, 경시적인 결정의 성장 모습을 관찰하여, 화합물 A의 단결정 제작에는, 물과 아세톤의 혼합 용매계에 의해 결정을 정출시키는 방법이 적절하다는 것을 알 수 있었다. 용매 비율로는 아세톤 비율 40%~80%(물이 60%~20%)가 좋고, 특히 아세톤 비율 60%(물 40%)의 포화 용액을 증발시켜 얻어진 결정이 가장 양호했다. 그 이외의 알코올계의 용매계에서는 다결정화가 일어나기 쉽고, 혹은 결정 성장이 나쁘고, 단결정 X선 회절에 사용 가능한 단결정은 얻을 수 없었다.
3. 화합물 A의 단결정 제작
화합물 A의 단결정 X선 회절에 의한 구조 해석에는, 물-아세톤(40%-60%) 혼합 용매의 포화 용액을 넣은 뚜껑이 달린 시험관의 뚜껑에 핀홀을 뚫고, 실온에서 천천히 용매를 증발시켜 얻어진 결정을 사용했다. 결정은, 정출한 단결정이 충분히 성장할 때까지 수일간 시간을 들여 성장시키는 한편, 단결정끼리가 융합되어 다결정화되기 전에 회수를 수행했다. 결정의 회수 순서로는, 결정을 포함하는 용액을 용액마다 여과지 상에 전도 적하하여, 용액을 여과지에 흡수시키고, 여과지 상에 남은 결정을 금속 니들로 수거하여 회수했다. 회수한 단결정을, 루페 확대경하에서 관찰하고, 단결정 X선 회절에 의한 구조 해석에 사용할 수 있는 크기와 형상을 유지한 단결정을 선발하여, 단결정 X선 회절에 의한 구조 해석에 제공했다.
4. 화합물 A의 단결정 X선 회절에 의한 구조 해석
결정화된 화합물 A가 SS형, SR형 중 어느 것인지, 단결정 X선 회절에 의한 구조 해석을 수행했다. 상술한 단결정 제작 방법에 따라 제작한 단결정으로부터, 결정성이 좋은 각기둥형 결정(0.2mm×0.2mm×0.6 mm)을 채취한 후, 유리 섬유 상에 마운팅하고, 그라파이트 모노크로미터에 의해 단색화한 CuKα선(λ=1.54178Å)을 이용하여, 리가쿠덴키(주) 제품 RASA-7 R형 4축 회절 장치로 측정을 수행했다.
격자 상수는, 50.0＜2θ＜58.8° 범위에서의 25개의 반사로부터 최소 제곱법으로 구했다. ω-2θ주사법에 의해, 회절각 2θ가 136.1° 이하인 반사에 대하여 측정을 수행했다. 전반사 데이터의 측정후, 소멸칙(계통적인 반사 강도의 소멸)으로부터 공간군은 P21/c(＃14)인 것을 알 수 있었다. 측정 데이터를 표 5에, 결정 데이터를 표 6에 정리했다.
[표 5] ＜측정 데이터＞
사용한 회절 장치: 리가쿠덴키(주) 제품 RASA-7 R형
주사 방법: ω-2θ
주사폭: 1.79°+0.30° tanθ
주사 속도(ω): 16.0°／min
데이터 수집 범위: 2θmax136.1°
측정 반사수: 2552
독립적인 반사수: 1902
관측값으로 채용한 기준: I＞3σ(I)
관측값으로 채용한 반사수: 1899
보정: 로런츠 인자 및 편광 인자
소쇠 효과 보정 계수: 4.24060e+001
[표 6]＜결정 데이터＞
분자식: C10H11NO9+H2O
분자량: 289+18
정계(晶系): 단사(單斜)
공간군: P21/c(＃14)
a: 11.685(2)Å
b: 10.262(3)Å
c: 11.129(2)Å
α: 90°
β: 107.46(1)°
γ: 90°
단위포의 체적: 1273.2(4)Å3
사용한 X선과 그 파장: CuKα선(λ=1.54178Å)
단위포 내의 분자수: Z4
밀도의 계산값: 1.603g/cm3
선흡수 계수(CuKα): 12.99m-1
시료 결정의 형태와 치수: 각기둥형 (0.20mm×0.20mm×0.60 mm)
F(000): 640.00
측정 온도: 25℃
5. 화합물 A의 결정 구조 결정
구조 결정은 규격화 구조 인자 E의 절대값이 1.527보다 큰 280개의 반사에 의해 직접법 SIR92를 이용하여 수행했다. 가장 높은 Figure of merit(FOM=1.416)를 부여하는 위상의 조로부터 계산한 Emap와, 푸리에에 의한 구조 확장으로부터 모든 원자 좌표를 구할 수 있었다. 정밀화는 반사 강도 I가 3σ(I)보다 큰 1899개의 반사를 이용하여, 완전 행렬 최소 제곱법으로 수행했다. 전반사의 중률(重率)을 동일하게 하여 계산한 R인자는 0.053으로 수렴했다. 최종의 D 푸리에 도면에서의 전자 밀도의 최대값과 최소값은 0.28 및, -0.25e-／Å3이었다. 원자 산란 인자는“International Tables for X-ray Crystallography”에 기재된 값을 이용하여, 모든 계산은 Rigaku Corporation and Rigaku/MSC의 crystallographic software package인 CrystalStructure를 이용하여 수행했다. 이 해석 데이터를 표 7에 정리했다.
[표 7]＜해석 데이터＞
근사 구조의 결정법: 직설법(SIR92)
사용한 최소 제곱법: 완전 행렬법
온도 인자의 종류: 이방성 온도 인자
수소 원자 취급: 등방성 온도 인자
최종의 R값, wR값: 0.053, 0.043(중률: 1/δ2 (Fo))
최종 D 합성 전자 밀도의 최대값: 0.28e-／Å3
최종 D 합성 전자 밀도의 최소값: -0.25e-／Å3
사용한 프로그램 시스템명: CrystalStructure
이 해석의 결과, 결정성 화합물 A(화합물 A의 결정)는 RS 표시법으로 SS형, RR형의 거울 이성질체인 것이 밝혀졌다. 그리고 합성에 이용했던 것이 모두 L-Asp(S형)인 점에서, 결정성 화합물 A는 SS형인 것을 알 수 있었다. 그리고 이것을 받아, 결정화하지 않는 성질을 갖는 화합물 A가 SR형인 것도 알 수 있었다.
산업상 이용 가능성
화합물 A의 부분입체 이성질체 혼합물은, 간 손상 억제 효과를 갖는 활성 물질인 것을 알고 있지만, 결정성 화합물 A와 비결정성 화합물 A의 생물체 내에서의 생리 작용은 지금까지 알려지지 않았다. 화합물 A에 한정되지 않고, 부분입체 이성질체와 같은 유사한 구조의 유기 화합물을 분리하려면, 일반적으로 고분리능인 칼럼을 사용하여, 고도의 정제 기술을 요하는 프로세스가 요구된다. 또한 이들의 칼럼을 사용한 일반적인 정제 수법으로는, 정제 스케일을 확대하는 것이 어렵고, 대량 공급에는 고가의 비용을 요하는 경우가 많다. 본원은, 화합물 A의 한쪽의 부분입체 이성질체만을 결정화할 수 있는 사실을 확인하고, 그 결정화 기술에 의해 저가로 대량의 부분입체 이성질체의 정제 방법을 확립했다. 또한, 유기 용매를 이용하여 결정성 부분입체 이성질체를 거의 완전하게 결정화함으로써, 비결정성 부분입체 이성질체도 저가로 대량으로 정제하는 수법을 확립했다. 이것에 의해, 화합물 A의 정제한 부분입체 이성질체 공급을 분석 레벨의 스케일로부터, 산업 베이스로 확대할 수 있는 것이 기대된다. 본 발명에 의해, 화합물 A의 결정 및 매우 고순도인 화합물 A의 비결정질 부분입체 이성질체가, 저가로 대량으로 얻어진 것에 의해, 의약품 제조의 분야, 기능성 식품, 건강 식품을 포함하는 식품 제조의 분야 등에 있어서, 화합물 A로부터 효율적인 응용이 기대된다.

Claims (24)

  1. 구연산과 L-아스파르트산의 반응으로부터 생성되며,
    CuKα선을 X선원으로 하는 분말 X선 회절 패턴에 있어서, 회절각(2θ)이, 11.74±0.20°, 29.25±0.20°, 18.36 ±0.20°, 21.75±0.20°, 및 15.95±0.20°에 피크를 갖는,
    하기 식(A)로 표시되는 화합물(이하, 화합물 A라고 한다.)의 결정.
    Figure 112021070450430-pct00011
  2. 제 1항에 있어서,
    입체 구조가 RS 표시법으로 SS형인, 결정.
  3. 아래의 (a)~(f)의 공정을 포함하며, CuKα선을 X선원으로 하는 분말 X선 회절 패턴에 있어서, 회절각(2θ)이, 11.74±0.20°, 29.25±0.20°, 18.36 ±0.20°, 21.75±0.20°, 및 15.95±0.20°에 피크를 갖는, 하기 식 A로 표시되는 화합물 A 결정의 제조 방법.
    Figure 112021070450430-pct00029

    (a) 구연산과 L-아스파르트산의 반응으로부터 생성된 화합물 A 및/또는 그 염, 및 구연산 및 /또는 그 염을 포함하는, pH 5.0~8.5의 수용액을, 음이온 교환 수지를 충전한 칼럼에 통탑하는 공정,
    (b) 상기 칼럼에 용출액을 통탑하여, 구연산을 포함하지 않지만, 화합물 A를 포함하는 수용액을 취득하는 공정,
    (c) 공정 (b)에 의해 얻어진 수용액으로부터, 용출액을 제거하는 공정,
    (d) 용출액을 제거한 수용액을 농축하는 공정,
    (e) 농축 잔사에 물을 첨가하여 수용액으로 만들고, 상기 수용액을 농축하여, 화합물 A의 결정을 석출시키는 공정, 및,
    (f) 화합물 A의 결정을 취득하는 공정.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 화합물 A의 결정의 입체 구조가 RS 표시법으로 SS형인, 제조 방법.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서,
    용출액이, 아세트산암모늄 수용액, 염화나트륨 수용액, 및 포름산암모늄 수용액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용출액인, 제조 방법.
  6. 제 3항 또는 제 4항에 있어서,
    용출액을 제거하는 방법이, 양이온 교환 수지를 충전한 칼럼을 사용하는 방법인, 제조 방법.
  7. 제 3항 또는 제 4항에 있어서,
    농축하는 방법이, 동결 건조인, 제조 방법.
  8. 아래의 (a)~(f)의 공정을 포함하는, CuKα선을 X선원으로 하는 분말 X선 회절 패턴에 있어서, 회절각(2θ)이, 11.74±0.20°, 29.25±0.20°, 18.36 ±0.20°, 21.75±0.20°, 및 15.95±0.20°에 피크를 갖는, 하기 식 A로 표시되는 화합물 A 결정의 제조 방법.
    Figure 112021070450430-pct00030

    (a) 구연산과 L-아스파르트산으로부터 생성된 화합물 A 및 구연산을 포함하는, pH 2.0 이하의 수용액에, 탄산칼슘을 첨가하여, 구연산 칼슘을 석출시키는 공정,
    (b) 수용액으로부터, 구연산 칼슘을 제거하는 공정,
    (c) 수용액에 황산을 첨가하여, pH 2.0 이하로 하여 황산칼슘을 석출시키는 공정,
    (d) 수용액으로부터, 황산칼슘을 제거하는 공정,
    (e) 수용액을 농축하여, 화합물 A의 결정을 석출시키는 공정, 및
    (f) 화합물 A의 결정을 취득하는 공정.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 화합물 A의 결정의 입체 구조가 RS 표시법으로 SS형인, 제조 방법.
  10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서,
    농축이, 감압 농축인, 제조 방법.
  11. 제 8항 또는 제 9항에 있어서,
    화합물 A의 결정을 취득한 후, 아래의 (g)~(j)의 공정을 더 포함하는, 제조 방법.
    (g) 수용액에 유기 용매를 첨가하여, 구연산 칼슘을 석출시키는 공정,
    (h) 수용액과 유기 용매의 혼합액으로부터, 구연산 칼슘을 제거하는 공정,
    (i) 수용액과 유기 용매의 혼합액을 탈수하여, 화합물 A의 결정을 석출시키는 공정, 및,
    (j) 화합물 A의 결정을 취득하는 공정.
  12. 제 11항에 있어서,
    유기 용매가, 아세톤인, 제조 방법.
  13. 아래의 (a)~(l)의 공정을 포함하며, 하기 식 A로 표시되는 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체염의 제조 방법.
    Figure 112021070450430-pct00031

    (a) 구연산과 L-아스파르트산의 반응으로 생성된 화합물 A 및 구연산을 포함하는, pH 2.0 이하의 수용액에, 탄산칼슘을 첨가하여, 구연산 칼슘을 석출시키는 공정,
    (b) 수용액으로부터, 구연산 칼슘을 제거하는 공정,
    (c) 수용액에 황산을 첨가하여, pH 2.0 이하로 하여 황산칼슘을 석출시키는 공정,
    (d) 수용액으로부터, 황산칼슘을 제거하는 공정,
    (e) 수용액을 농축하여, 화합물 A의 결정을 석출시키는 공정,
    (f) 수용액으로부터, 화합물 A의 결정을 제거하는 공정,
    (g) 상기 (f)공정에서 화합물 A의 결정이 제거된 수용액에 유기 용매를 첨가하여, 잔존하는 화합물 A의 결정 및 구연산 칼슘을 석출시키는 공정,
    (h) 수용액과 유기 용매의 혼합액으로부터, 잔존한 화합물 A의 결정 및 구연산 칼슘을 제거하는 공정,
    (i) 상기 (h)공정에서 잔존한 화합물 A의 결정 및 구연산 칼슘이 제거된 수용액과 유기 용매의 혼합액을 탈수하여, 여전히 잔존하는 화합물 A의 결정을 석출시키는 공정,
    (j) 탈수한 수용액과 유기용매의 혼합액으로부터, 잔존한 화합물 A의 결정을 제거하는 공정,
    (k) 수용액에, 금속염 또는 아미노산염, 및 알코올을 첨가하여, 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체염을 석출시키는 공정, 및,
    (l) 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체염을 취득하는 공정.
  14. 제 13항에 있어서,
    화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체염의 입체 구조가 RS 표시법으로 SR 형인, 제조 방법.
  15. 제 13항에 있어서,
    유기 용매가, 아세톤인, 제조 방법.
  16. 제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서 ,
    금속염이, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 및 칼슘염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 금속염인, 제조 방법.
  17. 제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,
    아미노산염이, 아르기닌염, 시트룰린염, 오르니틴염, 및 히 스티딘염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산염인, 제조 방법.
  18. 제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,
    알코올이 에탄올 또는 메탄올인, 제조 방법.
  19. 구연산과 L-아스파르트 산의 반응으로 생성된 하기 식 A로 표시되는 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체 또는 그 염.
    Figure 112021070450430-pct00032
  20. 제 19항에 있어서,
    입체 구조가 RS 표시법으로 SR형인, 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체 또는 그 염.
  21. 제 19항 또는 제 20항에 있어서,
    염이, 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체의 금속염 또는 아미노산염인, 화합물 A의 비결정 성 부분입체 이성질체 또는 그 염.
  22. 제 21항에 있어서,
    금속염이, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 및 칼슘염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 금속염인, 화합물 A 의 비결정성 부분입체 이성질체 또는 그 염.
  23. 제 21항에 있어서,
    아미노산염이, 아르기닌염, 시트룰린염, 오르니틴염, 및 히스티딘염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산염인, 화합물 A의 비결정성 부분입체 이성질체 또는 그 염.
  24. 삭제
KR1020197030766A 2017-04-28 2018-04-23 구연산 유도체의 부분입체 이성질체의 제조 방법 KR102299521B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017089725 2017-04-28
JPJP-P-2017-089725 2017-04-28
PCT/JP2018/016495 WO2018199040A1 (ja) 2017-04-28 2018-04-23 クエン酸誘導体のジアステレオマーの製造方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190129965A KR20190129965A (ko) 2019-11-20
KR102299521B1 true KR102299521B1 (ko) 2021-09-07

Family

ID=63919139

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197030766A KR102299521B1 (ko) 2017-04-28 2018-04-23 구연산 유도체의 부분입체 이성질체의 제조 방법

Country Status (13)

Country Link
US (1) US11155519B2 (ko)
EP (1) EP3617191B9 (ko)
JP (1) JP6826267B2 (ko)
KR (1) KR102299521B1 (ko)
CN (1) CN110546137B (ko)
AU (1) AU2018259992B2 (ko)
CA (1) CA3058886C (ko)
ES (1) ES2969457T3 (ko)
NZ (1) NZ757747A (ko)
PH (1) PH12019550273A1 (ko)
SG (1) SG11201909240SA (ko)
TW (1) TWI678360B (ko)
WO (1) WO2018199040A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3372578A4 (en) * 2015-11-02 2019-11-13 Adabio Co.,Ltd. NOVEL CITRIC ACID DERIVATIVE
FR3091873B1 (fr) * 2019-01-17 2020-12-25 Guerbet Sa Complexe de gadolinium et d’un ligand chelateur derive de pcta diastereoisomeriquement enrichi et procede de preparation et de purification

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015052342A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Dsm Ip Assets B.V. Polymer and composition
WO2016164437A1 (en) 2015-04-06 2016-10-13 The Penn State Research Foundation Luminescent compositions and applications thereof
KR102187785B1 (ko) 2015-11-02 2020-12-07 가부시기가이샤오오쓰까세이야꾸고오죠오 신규 구연산 유도체

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4842624B1 (ko) 1965-09-06 1973-12-13
JP2734265B2 (ja) 1991-12-12 1998-03-30 日本電気株式会社 エレクトレット・コンデンサ・マイクロフォン用増幅回路
JP4842624B2 (ja) 2005-11-25 2011-12-21 Ａｄａ Ｂｉｏ株式会社 オートファジー誘導用飲食品
JP5577129B2 (ja) 2010-03-26 2014-08-20 Ａｄａ Ｂｉｏ株式会社 ウイルス性肝炎患者における肝機能改善剤

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015052342A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Dsm Ip Assets B.V. Polymer and composition
WO2016164437A1 (en) 2015-04-06 2016-10-13 The Penn State Research Foundation Luminescent compositions and applications thereof
KR102187785B1 (ko) 2015-11-02 2020-12-07 가부시기가이샤오오쓰까세이야꾸고오죠오 신규 구연산 유도체

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
논문 Biochimica et biophysica Acta, Vol. 544, pp. 656-666 (1978)
논문 Eur. J. Biochem., Vol. 191, pp. 66-74 (1990)

Also Published As

Publication number Publication date
CN110546137A (zh) 2019-12-06
SG11201909240SA (en) 2019-11-28
AU2018259992B2 (en) 2020-06-18
EP3617191A1 (en) 2020-03-04
EP3617191A4 (en) 2020-12-23
AU2018259992A1 (en) 2019-10-24
KR20190129965A (ko) 2019-11-20
CN110546137B (zh) 2023-10-31
US11155519B2 (en) 2021-10-26
JP6826267B2 (ja) 2021-02-03
JPWO2018199040A1 (ja) 2019-12-26
US20200055821A1 (en) 2020-02-20
TW201841887A (zh) 2018-12-01
CA3058886A1 (en) 2018-11-01
EP3617191B1 (en) 2023-12-20
PH12019550273A1 (en) 2021-01-04
CA3058886C (en) 2021-11-09
WO2018199040A1 (ja) 2018-11-01
NZ757747A (en) 2022-04-29
ES2969457T3 (es) 2024-05-20
TWI678360B (zh) 2019-12-01
EP3617191B9 (en) 2024-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102299521B1 (ko) 구연산 유도체의 부분입체 이성질체의 제조 방법
CN108026091A (zh) 吡咯并喹啉醌钠盐的晶型及其制备方法和用途
WO2017086443A1 (ja) ６'－シアリルラクトースナトリウム塩の結晶およびその製造方法
US10836783B2 (en) Inclusion compound of 3′ ,5′-cyclic diadenylic acid and manufacturing method thereof
Silva et al. Separation of glucose and fructose by freezing crystallization
US20220324786A1 (en) Methods for recovering organic acids or salts or lactones thereof from aqueous solutions using water solvent crystallization and compositions thereof
US10787479B2 (en) Crystalline 3′,5′-cyclic diguanylic acid
KR102700779B1 (ko) 2'-푸코실락토스 결정화 방법 및 관련 조성물
TWI496789B (zh) 表柔比星（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）鹽酸鹽之結晶
JP7144320B2 (ja) ３－ヒドロキシイソ吉草酸アミノ酸塩の結晶及びその製造方法
CN110606863A (zh) 一种n-乙酰神经氨酸二水合物的制备方法
US20240101504A1 (en) Hydroxyalkanoic acid crystal production method and hydroxyalkanoic acid crystal polymorph
CA3177527A1 (en) Compositions and methods for solidified fermented animal feed
TW201908275A (zh) 3－羥基異戊酸胺基酸鹽之結晶及其製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant