CN110546137A - 柠檬酸衍生物的非对映异构体的制造方法 - Google Patents

柠檬酸衍生物的非对映异构体的制造方法 Download PDF

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Abstract

通过对包含下述式表示的化合物A及柠檬酸的水溶液使用离子交换柱色谱或碳酸钙，从而除去上述水溶液中的柠檬酸，之后经历若干工序而得到结晶性化合物A。另外，高纯度的非结晶性化合物A是通过对包含化合物A及柠檬酸的水溶液使用碳酸钙、硫酸、有机溶剂等来除去溶液中的柠檬酸及结晶性化合物A从而得到的。结晶性化合物A的立体结构按照RS表示法为SS体。非结晶性化合物A的立体结构按照RS表示法为SR体。

Description

柠檬酸衍生物的非对映异构体的制造方法
技术领域
本发明涉及具有肝损伤抑制效果的柠檬酸衍生物的晶体、及其高纯度化的非结晶性非对映异构体(非晶质非对映异构体、无定形非对映异构体)、以及它们的制造方法。
背景技术
梅(英文名：Japanese apricot，学名：Prunus mume)属于蔷薇科樱亚科樱属李亚属，梅干、梅酒、梅肉提取物等梅加工品正在被食用。另外，梅肉提取物具有杀菌、疲劳恢复、胃保护作用等效果，人们为了健康而开始摄取。而且，已知梅肉提取物具有改善血液循环的效果(参见非专利文献1、2)。已知上述改善血液循环的效果是由梅肉提取物中包含的梅素(Mumefural)(所述梅素是通过对柠檬酸、苹果酸等有机酸和糖进行加热而生成的)及其相关化合物带来的(非专利文献3)。
作为包含梅肉提取物的健康食品之一，Misatol(注册商标)在市场上有售，已知Misatol具有诱发自噬的效果、抑制病毒性肝炎患者的肝损伤的效果(专利文献1、2)。
获知了下述化合物是具有肝损伤抑制效果的活性物质：键合于柠檬酸(IUPAC名称：2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸)的碳链即丙烷链的1位碳(或3位碳)和2位碳上的两个羧基与特定氨基酸的氨基形成酰亚胺键而得到的化合物；以及，通过将该酰亚胺化合物水解而得到的、键合于来自柠檬酸的丙烷链的1位碳(或3位碳)上的羧基与氨基酸形成的酰胺化合物。
基于上述见解，本申请的发明人之前提出了包含下述式表示的化合物的柠檬酸衍生物及其合成方法(PCT/JP2016/004789)。
[化学式1]
(式中，R1表示可具有羧基或羟基的C1～C3烷基，R2表示氢原子；或者，R1及R2可共同形成环状结构，表示C2～C3亚烷基链。)
然而，上述化学式所示的柠檬酸衍生物具有两个手性碳，因此存在4个立体异构体。其中，为了分离获得这些结构类似的立体异构体，需要组合多根具有高分离性能的昂贵柱或者反复进行多次，该方法仅能够实现依赖于柱尺寸的少量分离，且需要高昂费用。尚未确立将这些立体异构体大量且廉价地分离、使其高纯度化的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利4842624号公报
专利文献2：日本专利5577129号公报
非专利文献
非专利文献1：J.Agric.FoodChem.,1999,47,828-31
非专利文献2：日本血液流变学研究会刊(ヘモレオロジー研究会誌)1，65-67，1998
非专利文献3：日本血液流变学研究会刊3，81-88，2000
发明内容
发明要解决的课题
本发明的课题在于提供下述方法：在上述化学式表示的柠檬酸衍生物中，利用廉价的方法，从由柠檬酸与L-天冬氨酸的反应得到的下述式表示的柠檬酸衍生物的非对映异构体混合物中，大量地分离结晶性非对映异构体化合物；以及，利用廉价的方法将非结晶性非对映异构体化合物大量地纯化为高纯度。
[化学式2]
用于解决课题的手段
为了解决上述课题，本申请的发明人反复进行了研究和探讨，结果发现，通过组合特定的工序，能够得到上述式表示的化合物的晶体。另外，本申请的发明人发现，通过组合特定的工序，能够使该化合物的非结晶性非对映异构体盐析出。另外，本申请的发明人通过基于单晶X射线衍射的结构分析，确定了上述式表示的化合物的结晶性非对映异构体的结构。
本发明是基于上述见解而完成的。
即，本发明涉及以下方案。
[1]下述式(A)表示的化合物(以下称为化合物A。)的晶体。
[化学式3]
[2]如[1]所述的晶体，其立体结构按照RS表示法为SS体。
[3]如[1]或[2]所述的晶体，其中，在以CuKα射线作为X射线源的粉末X射线衍射图案中，于衍射角(2θ)为11.74±0.20°、29.25±0.20°、18.36±0.20°、21.75±0.20°、及15.95±0.20°处具有峰。
[4]化合物A的晶体的制造方法，其包括以下的工序(a)～(f)。
工序(a)，将包含化合物A及/或其盐、以及柠檬酸及/或其盐的pH5.0～8.5的水溶液通入填充有阴离子交换树脂的柱中；
工序(b)，将洗脱液通入该柱中，获得不含柠檬酸但包含化合物A的水溶液；
工序(c)，从由工序(b)得到的水溶液中除去洗脱液；
工序(d)，将除去了洗脱液的水溶液浓缩；
工序(e)，向浓缩残余物中添加水而形成水溶液，将该水溶液浓缩，使化合物A的晶体析出；及
工序(f)，获得化合物A的晶体。
[5]如[4]所述的制造方法，其中，化合物A的晶体的立体结构按照RS表示法为SS体。
[6]如[4]或[5]所述的制造方法，其中，洗脱液为选自由乙酸铵水溶液、氯化钠水溶液、及甲酸铵水溶液组成的组中的洗脱液。
[7]如[4]～[6]中任一项所述的制造方法，其中，除去洗脱液的方法为使用填充有阳离子交换树脂的柱的方法。
[8]如[4]～[7]中任一项所述的制造方法，其中，进行浓缩的方法为冷冻干燥。
[9]化合物A的晶体的制造方法，其包括以下的工序(a)～(f)。
工序(a)，向包含化合物A及柠檬酸的pH2.0以下的水溶液中添加碳酸钙，使柠檬酸钙析出；
工序(b)，从60％甲醇-水溶液中除去柠檬酸钙；
工序(c)，向水溶液中添加硫酸使pH为2.0以下，从而使硫酸钙析出；
工序(d)，从水溶液中除去硫酸钙；
工序(e)，将水溶液浓缩，使化合物A的晶体析出；及
工序(f)，获得化合物A的晶体。
[10]如[9]所述的制造方法，其中，化合物A的晶体的立体结构按照RS表示法为SS体。
[11]如[9]或[10]所述的制造方法，其中，浓缩为减压浓缩。
[12]如[9]～[11]中任一项所述的制造方法，其中，在获得化合物A的晶体后，还包括以下的工序(g)～(j)。
工序(g)，向水溶液中添加有机溶剂，使柠檬酸钙析出；
工序(h)，从水溶液与有机溶剂的混合液中除去柠檬酸钙；
工序(i)，将水溶液与有机溶剂的混合液脱水，使化合物A的晶体析出；及
工序(j)，获得化合物A的晶体。
[13]如[12]所述的制造方法，其中，有机溶剂为丙酮。
[14]化合物A的非结晶性非对映异构体盐的制造方法，其包括以下的工序(a)～(l)。
工序(a)，向包含化合物A及柠檬酸的pH2.0以下的水溶液中添加碳酸钙，使柠檬酸钙析出；
工序(b)，从水溶液中除去柠檬酸钙；
工序(c)，向水溶液中添加硫酸使pH为2.0以下，从而使硫酸钙析出；
工序(d)，从水溶液中除去硫酸钙；
工序(e)，将水溶液浓缩，使化合物A的晶体析出；
工序(f)，从水溶液中除去化合物A的晶体；
工序(g)，向水溶液中添加有机溶剂，使化合物A的晶体及柠檬酸钙析出；
工序(h)，从水溶液与有机溶剂的混合液中除去化合物A的晶体及柠檬酸钙；
工序(i)，将水溶液与有机溶剂的混合液脱水，使化合物A的晶体析出；
工序(j)，从水溶液中除去化合物A的晶体；
工序(k)，向水溶液中添加金属盐或氨基酸盐、以及醇，使化合物A的非结晶性非对映异构体盐析出；及
工序(l)，获得化合物A的非结晶性非对映异构体盐。
[15]如[14]所述的制造方法，其中，化合物A的非结晶性非对映异构体盐的立体结构按照RS表示法为SR体。
[16]如[14]所述的制造方法，其中，有机溶剂为丙酮。
[17]如[14]～[16]中任一项所述的制造方法，其中，金属盐为选自由钠盐、钾盐、镁盐、及钙盐组成的组中的金属盐。
[18]如[14]～[16]中任一项所述的制造方法，其中，氨基酸盐为选自由精氨酸盐、瓜氨酸盐、鸟氨酸盐、及组氨酸盐组成的组中的氨基酸盐。
[19]如[14]～[18]中任一项所述的制造方法，其中，醇为乙醇或甲醇。
[20]化合物A的非结晶性非对映异构体或其盐。
[21]如[20]所述的化合物A的非结晶性非对映异构体或其盐，其中，立体结构按照RS表示法为SR体。
[22]如[20]或[21]所述的化合物A的非结晶性非对映异构体或其盐，其中，盐为化合物A的非结晶性非对映异构体的金属盐或氨基酸盐。
[23]如[22]所述的化合物A的非结晶性非对映异构体或其盐，其中，金属盐为选自由钠盐、钾盐、镁盐、及钙盐组成的组中的金属盐。
[24]如[22]所述的化合物A的非结晶性非对映异构体或其盐，其中，氨基酸盐为选自由精氨酸盐、瓜氨酸盐、鸟氨酸盐、及组氨酸盐组成的组中的氨基酸盐。
发明的效果
通过得到化合物A的晶体及高纯度化的化合物A的非结晶性非对映异构体，有助于弄清各物质的生理活性、对疾病的作用机制。另外，化合物A的晶体及高纯度化的化合物A的非结晶性非对映异构体与包含它们的非对映异构体混合物相比，容易处理，因此在制造使用化合物A作为有效成分的药物、或者制造使用化合物A的饮料食品等时极为有用。另外，根据本申请记载的方法，与基于高分离性能柱等的纯化法(其作为通常的纯化手段而被使用)相比，能够廉价且大量地在短时间内分离并获得化合物A的晶体及非结晶性非对映异构体。就基于使用了高分离性能载体的柱等的纯化法(其作为通常的非对映异构体分离方法而被使用)而言，一次纯化工艺能够纯化的量依赖于所使用的柱尺寸，但从成本及效率的方面考虑，使用需要昂贵的高分离性能载体的大型柱的大量纯化法并不容易。根据本申请记载的方法，能够在一次纯化工艺中从500mL的反应液中容易地分离出20g以上的高纯度非对映异构体，并且能够容易地扩大纯化规模。
附图说明
[图1]示出化合物A合成反应液的HPLC色谱图(稀释160倍)。
[图2]示出在水溶液中结晶化后的化合物A晶体的HPLC色谱图。
[图3]示出分离取得化合物A的晶体后的母液溶液的HPLC色谱图。
[图4]示出在丙酮中结晶化后的化合物A的HPLC色谱图(重结晶后)。
[图5]示出于pH3.6析出的沉淀物的HPLC色谱图(非结晶化合物A的Ca盐(1))。
[图6]示出于pH6.0析出的沉淀物的HPLC色谱图(非结晶化合物A的Ca盐(2))。图6的峰2中，化合物A水解而得到的酰胺化合物的峰与化合物A的峰的左肩部分重叠(看起来峰的左肩鼓起)。另外，峰3为被认为是柠檬酸的峰。
[图7]示出粗纯化后的化合物A合成溶液的HPLC色谱图。
[图8]示出在水溶液中结晶化后的化合物A的HPLC色谱图(为来自与图2相同的样品的分析结果)。
[图9]示出在丙酮中结晶化后的化合物A的HPLC色谱图(为来自与图4相同的样品的分析结果)。
[图10]示出于pH3.6析出的非结晶性化合物A的Ca盐的HPLC色谱图(为来自与图5相同的样品的分析结果)。
[图11]为实施例7中的利用离子交换色谱制造化合物A的晶体的方法的流程图。
[图12]示出化合物A的晶体的HPLC色谱图。
[图13]示出化合物A的晶体的1H-NMR光谱。
[图14]示出分取化合物A的晶体后的母液的HPLC色谱图。
[图15]示出分取化合物A的晶体后的母液的1H-NMR光谱。
[图16]从上方以检体1(通过柱纯化从水溶液中得到的晶体)、检体2(从丙酮溶液中得到的晶体)及检体3(非结晶性非对映异构体的Ca盐)的顺序示出各物质涉及的粉末X射线衍射图案的基于多重绘图的对比。
具体实施方式
作为本发明的化合物A的晶体，可举出下述晶体：在使用CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射图案中，于衍射角(2θ)为11.74±0.20°(优选为±0.10°)、29.25±0.20°(优选为±0.10°)、18.36±0.20°(优选为±0.10°)、21.75±0.20°(优选为±0.10°)、及15.95±0.20°(优选为±0.10°)处具有峰。
作为本发明的化合物A的晶体，可举出下述晶体：在使用CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射图案中，除上述以外，还于衍射角(2θ)为24.09±0.20°(优选为±0.10°)、19.32±0.20°(优选为±0.10°)、19.04±0.20°(优选为±0.10°)、26.95±0.20°(优选为±0.10°)、及16.19±0.20°(优选为±0.10°)处具有峰。
作为本发明的化合物A的晶体，可举出下述晶体：在使用CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射图案中，除上述以外，还于衍射角(2θ)为26.42±0.20°(优选为±0.10°)、16.68±0.20°(优选为±0.10°)、17.85±0.20°(优选为±0.10°)、21.19±0.20°(优选为±0.10°)、及18.14±0.20°(优选为±0.10°)处具有峰。
使用CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射图案可利用本说明书的实施例8中记载的方法获得。
在化合物A中，存在来自柠檬酸的丙烷链的2位碳为手性碳的非对映异构体。需要说明的是，就本发明的化合物A而言，在来自天冬氨酸的结构内也存在手性碳，但该手性碳的立体构型来自作为所使用的原料的天冬氨酸或天冬酰胺。本发明的化合物A的晶体来自L体的天冬氨酸。
本发明的化合物A的晶体为化合物A的非对映异构体中的任一方的晶体，但NMR中无法区分相当于哪一非对映异构体。
作为确定化合物A的晶体为哪一非对映异构体的方法，可举出基于单晶X射线衍射的结构分析。具体而言，可举出实施例9中记载的方法作为一例。实施例9的分析结果表明，结晶性化合物A(化合物A的晶体)为SS体、RR体的对映异构体。而且，由于合成中使用的均为L-Asp(S体)，因此可知结晶性化合物A的立体构型按照RS表示法为SS体。
[化学式4]
该分析结果表明结晶性化合物A为SS体、RR体的对映异构体。而且，由于合成中使用的均为L-Asp(S体)，因此结晶性化合物A为SS体。而且，基于此也可知具有不结晶化的性质的化合物A为SR体。
就本发明的化合物A的非结晶性非对映异构体或其盐而言，其为化合物A的非对映异构体的一方中通过下文记载的化合物A的结晶化的方法而不发生结晶化的非对映异构体(以下，也称为非结晶性的非对映异构体。)或其盐。
本发明的化合物A的非结晶性非对映异构体或其盐可通过实施例5中记载的基于高效液相色谱(HPLC)的定性分析而确认，另外，能够与结晶性的非对映异构体区分开。
如前文所述，本发明的化合物A的晶体的立体构型按照RS表示法为SS体，因此也可知，本发明的化合物A的非晶质(非结晶性非对映异构体)的立体构型如下述所示那样按照RS表示法为SR体。
[化学式5]
作为本发明的化合物A的非结晶性非对映异构体或其盐，可举出结晶性的非对映异构体的混入率为5％以下、优选4％以下、更优选3％以下、进一步优选2％以下、最优选1％以下的化合物A的非结晶性非对映异构体或其盐。
作为本发明的化合物A的非结晶性非对映异构体的盐，可举出金属盐或氨基酸盐。
作为金属盐，可举出选自由钠盐、钾盐、镁盐及钙盐组成的组中的金属盐，最优选可举出钙盐。
作为氨基酸盐，可举出选自由精氨酸盐、瓜氨酸盐、鸟氨酸盐、及组氨酸盐组成的组中的氨基酸盐。该氨基酸盐优选为L体的氨基酸盐。
本发明的化合物A的晶体可以利用下述任一方法而得到：使用离子交换柱色谱而进行结晶化；及使用碳酸钙等化合物而进行结晶化。
(基于离子交换柱色谱的方法)
利用以下的工序(a)～(f)，制造化合物A的晶体。
工序(a)，将包含化合物A及/或其盐、以及柠檬酸及/或其盐的pH5.0～8.5的水溶液通入填充有阴离子交换树脂的柱中；
工序(b)，将洗脱液通入该柱中，获得不含柠檬酸但包含化合物A的水溶液；
工序(c)，从由工序(b)得到的水溶液中除去洗脱液；
工序(d)，将除去了洗脱液的水溶液浓缩；
工序(e)，向浓缩残余物中添加水而形成水溶液，将该水溶液浓缩，使化合物A的晶体析出；及
工序(f)，获得化合物A的晶体。
上述工序(a)中使用的包含化合物A及/或其盐、以及柠檬酸及/或其盐的pH5.0～8.5的水溶液中的化合物A的盐及柠檬酸的盐没有特别限定。作为化合物A的盐及柠檬酸的盐，例如，可举出氨基酸盐、金属盐(钠盐、钾盐、镁盐、钙盐等)。作为化合物A及/或其盐、以及柠檬酸及/或其盐，最优选的是化合物A及柠檬酸。
上述工序(a)中使用的包含化合物A及/或其盐、以及柠檬酸及/或其盐的pH5.0～8.5的水溶液例如以下述方式制造。在加热下，使柠檬酸一水合物与L-天冬氨酸反应，生成化合物A。化合物A也可以为利用酶反应法、发酵法等合成方法以外的方法制造的化合物A。反应结束后，将反应液放置冷却，在酸性条件下加入甲醇。甲醇溶液的浓度只要为可析出L-天冬氨酸的浓度即可，可以为任意浓度，例如，为60V/V％溶液。反应液中包含的未反应的柠檬酸及L-天冬氨酸中的L-天冬氨酸会析出沉淀，因此通过离心分离或过滤来进行固液分离。固液分离后的水溶液包含化合物A及柠檬酸。固液分离后的水溶液为酸性的情况下，优选加入碱水溶液例如氨水来调节pH。作为该水溶液的pH，可举出5.0～8.5，优选可举出6.0～8.0，最优选可举出6.5～7.2。将该水溶液通入填充有阴离子交换树脂的柱中。
作为阴离子交换树脂，只要为能够将化合物A及/或其盐、与柠檬酸及/或其盐分离的阴离子交换树脂即可，可以为任意的阴离子交换树脂，例如，可举出TOYOPEARL SuperQ-650M(150mm×500mm，Tosoh Corporation制)。
作为上述工序(b)中使用的洗脱液，没有特别限制，例如，选自由乙酸铵水溶液、氯化钠水溶液、甲酸铵水溶液组成的组中。
作为洗脱液的浓度，可举出50mM～5M，优选可举出100mM～3M，更优选可举出150mM～2M，最优选可举出200mM～1.5M。可以阶段性地提高洗脱液的浓度来洗脱。
作为洗脱工序的流速，可举出10～500mL/min，优选可举出50～300mL/min，最优选可举出100～200mL/min的范围。
上述工序(b)中，所谓“不含柠檬酸”，优选完全不含柠檬酸，但也可以以不妨碍化合物A的结晶化的程度包含微量的柠檬酸。
上述工序(c)中，作为除去洗脱液的方法，例如，可举出使用填充有阳离子交换树脂的柱的方法、电透析等，优选可举出使用填充有阳离子交换树脂的柱的方法。需要说明的是，所谓“除去洗脱液”，是指除去洗脱液中的成分(溶质)。
作为阳离子交换树脂，只要为能够将化合物A与洗脱液分离的阳离子交换树脂即可，可以为任意的阳离子交换树脂，可举出DOWEX50Wx8(Wako Chemical公司制)。将水溶液例如纯化水送至填充有阳离子交换树脂的柱，获得包含化合物A但不含洗脱液的水溶液。所谓“不含洗脱液”，优选完全不含洗脱液，但也可以以不妨碍化合物A的结晶化的程度包含微量的洗脱液。
上述工序(d)及(e)中，作为将水溶液浓缩的方法，可示例加热浓缩、减压浓缩、或冷冻干燥，最优选可举出冷冻干燥。
上述工序(d)及(e)中，通过将水溶液浓缩，从而能够获得化合物A的非晶体及/或晶体、它们的混合物、或者包含它们的浓缩残余物。在化合物A为非晶体的情况下、包含非晶体的混合物的情况下、或者包含它们的浓缩残余物的情况下，优选再次添加水而形成水混合物，进行浓缩工序。通过进行该工序，能够使化合物A的晶体析出。
上述工序(f)中，作为得到晶体的方法，可举出加压过滤、抽滤、离心分离等。进而，为了降低母液的附着、提高晶体的品质，可以适当地洗涤晶体。洗涤后的晶体可以通过减压干燥、流化床干燥、通风干燥等而使其干燥，得到最终制品。
上述方法中，也可以通过重复进行多次工序(d)～工序(e)来实现化合物A的结晶化。
(基于使用碳酸钙等化合物进行的结晶化的方法)
通过以下的工序(a)～(f)，在水溶液中制造化合物A的晶体。
工序(a)，向包含化合物A及柠檬酸的pH2.0以下的水溶液中添加碳酸钙，使柠檬酸钙析出；
工序(b)，从水溶液中除去柠檬酸钙；
工序(c)，向水溶液中添加硫酸使pH为2.0以下，从而使硫酸钙析出；
工序(d)，从水溶液中除去硫酸钙；
工序(e)，将水溶液浓缩，使化合物A的晶体析出；及
工序(f)，获得化合物A的晶体。
上述工序(a)中使用的包含化合物A及柠檬酸的pH2.0以下的水溶液例如以下述方式制造。在加热下使柠檬酸一水合物与L-天冬氨酸反应，生成化合物A。化合物A也可以为利用酶反应法、发酵法等合成方法以外的方法制造的化合物A。反应结束后，将反应液放置冷却，在酸性条件下加入甲醇。甲醇水溶液的浓度只要为可析出L-天冬氨酸的浓度即可，可以为任意的浓度，例如为60v/v％溶液。反应液中包含的未反应的柠檬酸及L-天冬氨酸中的L-天冬氨酸会析出沉淀，因此通过离心分离来进行固液分离。需要说明的是，该工序中，重要的是加入甲醇。不可使用乙醇。在后续的工序中，使用包含化合物A及柠檬酸的固液分离后的水溶液。
利用该方法得到化合物A的晶体时，困难的地方在于：在酸性条件下将柠檬酸从包含化合物A及柠檬酸的水溶液中除去。化合物A在中性～碱性(pH5以上)的水溶液中不稳定，因此，为了抑制化合物A的分解，维持酸性条件是重要的。因此，工序(a)中使用的包含化合物A及柠檬酸的pH2.0以下的水溶液可以为pH优选0.6～1.8、最优选1.0～1.6的水溶液。本申请的发明人想到了将柠檬酸以盐的形式除去，并使用由各种金属离子形成的盐反复进行了尝试，结果发现，可利用钙离子(Ca2+)将柠檬酸良好地除去。此外，本申请的发明人发现，即使是钙盐，使用氯化钙(CaCl2)的情况下，在酸性条件下无法良好地除去柠檬酸，使用碳酸钙(CaCO3)的情况下，即使是酸性条件，也能够顺利地除去柠檬酸。认为其原因在于，碳酸钙的碳酸根离子(CO3 2-)形成CO2，与钙离子配对的阴离子消失，因此柠檬酸根离子与钙离子容易结合。因此，工序(a)中，使用碳酸钙为必需条件。
上述工序(b)中的柠檬酸钙的除去及工序(d)中的硫酸钙的除去例如可通过离心分离或过滤来进行。
上述工序(c)中，作为使用硫酸的理由，可举出：化合物A不耐受碱；和因硫酸钙的溶解性低而容易除去钙离子(即，容易脱盐)。通过使pH为2.0以下，从而以化合物A的钙盐形式存在的钙离子与化合物A脱离，形成硫酸钙。作为此时的pH，宜为1.0～2.0，更优选宜为1.3～1.8。使用钠盐(硫酸钠)、钾盐(硫酸钾)时难以脱盐。
作为上述工序(e)中的将水溶液浓缩的方法，具体而言，可示例加热浓缩、减压浓缩等，为了防止因热而导致的混入成分的性质改变或分解，优选基于减压浓缩的方法。
上述工序(f)中，作为获得晶体的方法，可举出加压过滤、抽滤、离心分离等。进而，为了降低母液的附着、提高晶体的品质，可以适当地洗涤晶体。洗涤后的晶体可以通过减压干燥、流化床干燥、通风干燥等而使其干燥，得到最终制品。
在上述工序(e)中使化合物A的晶体析出后的水溶液(晶体母液)中，仍含有结晶性化合物A非对映异构体。因此，可以通过以下的工序(g)～(j)而进一步得到化合物A的晶体。
工序(g)，向水溶液中添加有机溶剂，使柠檬酸钙析出；
工序(h)，从水溶液与有机溶剂的混合液中除去柠檬酸钙；
工序(i)，将水溶液与有机溶剂的混合液脱水，使化合物A的晶体析出；及
工序(j)，获得化合物A的晶体。
作为上述工序(g)中添加的有机溶剂，优选能够与水混合、并溶解一定量的化合物A的有机溶剂，具体而言，可示例丙酮等。
上述工序(h)中的柠檬酸钙的除去例如可通过离心分离或过滤来进行。
作为使上述工序(i)的化合物A的晶体析出的方法，只要为使化合物析出的方法即可，可以为任意的方法，优选可举出下述方法：通过蒸馏除去溶剂而将水溶液浓缩，并再次添加溶剂。
上述工序(j)中，作为获得晶体的方法，可举出加压过滤、抽滤、离心分离等。进而，为了降低母液的附着、提高晶体的品质，可以适当地洗涤晶体。洗涤后的晶体可以通过减压干燥、流化床干燥、通风干燥等而使其干燥，得到最终制品。
本发明的化合物A的非结晶性非对映异构体盐可以通过包括以下记载的工序(a)～(l)的方法而得到。
工序(a)，向包含化合物A及柠檬酸的pH2.0以下的水溶液中添加碳酸钙，使柠檬酸钙析出；
工序(b)，从水溶液中除去柠檬酸钙；
工序(c)，向水溶液中添加硫酸使pH为2.0以下，从而使硫酸钙析出；
工序(d)，从水溶液中除去硫酸钙；
工序(e)，将水溶液浓缩，使化合物A的晶体析出；
工序(f)，从水溶液中除去化合物A的晶体；
工序(g)，向水溶液中添加有机溶剂，使化合物A的晶体及柠檬酸钙析出；
工序(h)，从水溶液与有机溶剂的混合液中除去化合物A的晶体及柠檬酸钙；
工序(i)，将水溶液与有机溶剂的混合液脱水，使化合物A的晶体析出；
工序(j)，从水溶液中除去化合物A的晶体；
工序(k)，向水溶液中添加金属盐或氨基酸盐、以及醇，使化合物A的非结晶性非对映异构体盐析出；及
工序(l)，获得化合物A的非结晶性非对映异构体盐。
上述工序(a)中使用的包含化合物A及柠檬酸的pH2.0以下的水溶液例如以下述方式制造。在加热下，使柠檬酸一水合物与L-天冬氨酸反应，生成化合物A。化合物A也可以为利用酶反应法、发酵法等合成方法以外的方法制造的化合物A。反应结束后，将反应液放置冷却，在酸性条件下加入甲醇。甲醇水溶液的浓度只要为可析出L-天冬氨酸的浓度即可，可以为任意的浓度，例如为60v/v％溶液。反应液中包含的未反应的柠檬酸及L-天冬氨酸中的L-天冬氨酸会析出沉淀，因此通过离心分离来进行固液分离。需要说明的是，该工序中，重要的是加入甲醇。不可使用乙醇。在后续的工序中，使用包含化合物A及柠檬酸的固液分离后的水溶液。工序(a)中使用的包含化合物A及柠檬酸的pH2.0以下的水溶液可以为pH优选0.6～1.8、最优选1.0～1.6的水溶液。
利用该方法得到化合物A的晶体时，困难的地方在于：将柠檬酸从包含化合物A及柠檬酸的水溶液中除去。本申请的发明人想到了将柠檬酸以盐的形式除去，并使用由各种金属离子形成的盐反复进行了尝试，结果发现，可利用钙离子(Ca2+)将柠檬酸良好地除去。此外，本申请的发明人发现，即使是钙盐，使用氯化钙(CaCl2)的情况下，在酸性条件下无法良好地除去柠檬酸，使用碳酸钙(CaCO3)的情况下，即使是酸性条件，也能够顺利地除去柠檬酸。认为其原因在于，碳酸钙的碳酸根离子(CO3 2-)形成CO2，与钙离子配对的阴离子消失，因此柠檬酸根离子与钙离子容易结合。因此，工序(a)中，使用碳酸钙为必需条件。
上述工序(b)中的柠檬酸钙的除去及工序(d)中的硫酸钙的除去例如可通过离心分离或过滤来进行。
上述工序(c)中，作为使用硫酸的理由，可举出：化合物A不耐受碱；和因硫酸钙的溶解性低而容易除去钙离子(即，容易脱盐)。通过使pH为2.0以下，从而以化合物A的钙盐形式存在的钙离子与化合物A脱离，形成硫酸钙。作为此时的pH，宜为1.0～2.0，更优选宜为1.3～1.8。使用钠盐(硫酸钠)、钾盐(硫酸钾)时难以脱盐。
作为上述工序(e)中的将水溶液浓缩的方法，具体而言，可示例加热浓缩、减压浓缩等，为了防止因热而导致的混入成分的性质改变或分解，优选基于减压浓缩的方法。
上述工序(f)中，作为除去晶体的方法，可举出加压过滤、抽滤、离心分离等。
上述工序(g)及工序(h)为化合物A的非对映异构体盐的高纯度化所必需的工序。其原因在于，在工序(f)中除去化合物A的晶体后的水溶液中，仍残留结晶化的化合物A。
作为上述工序(g)中添加的有机溶剂，优选能够与水混合、并溶解一定量的化合物A的有机溶剂，具体而言，可示例丙酮等。
上述工序(h)中的柠檬酸钙的除去例如可通过离心分离或过滤来进行。
作为使上述工序(i)的化合物A的晶体析出的方法，只要为使化合物析出的方法即可，可以为任意的方法，优选可举出下述方法：通过蒸馏除去溶剂而将水溶液浓缩，并再次添加溶剂。
上述工序(j)中，作为除去晶体的方法，例如可举出离心分离、加压过滤、及抽滤等。上述工序(j)的阶段中，结晶性化合物A基本上被除去。
作为上述工序(k)中添加的金属盐，可举出钠盐、钾盐、镁盐、及钙盐等，最优选可使用钙盐(作为例子，有氯化钙、乙酸钙)。另外，水溶液的pH优选为酸性，特别地，pH3.6以下是最优选的。
作为上述工序(k)中添加的氨基酸盐，可举出选自由精氨酸盐、瓜氨酸盐、鸟氨酸盐、及组氨酸盐组成的组中的氨基酸盐，例如L-精氨酸盐酸盐、L-瓜氨酸盐酸盐、L-鸟氨酸盐酸盐、及L-组氨酸盐酸盐。
作为上述工序(k)中添加的醇，可举出甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇等，例如，可以使用乙醇或甲醇。就使化合物A的非对映异构体盐析出的效率而言，乙醇较甲醇更好。
就本发明涉及的化合物A而言，可以将柠檬酸和L-天冬氨酸及/或L-天冬酰胺(最优选为L-天冬氨酸)作为起始物质来合成。在该情况下，合成的化合物A包含2种非对映异构体的混合物。根据以下的步骤，能够连续地进行化合物A的结晶化及化合物A的非结晶性非对映异构体盐的析出。需要说明的是，以下的工序中，可以使用上述中记载的相应工序的条件。
(1)在加热下，使柠檬酸一水合物与L-天冬氨酸及/或L-天冬酰胺(最优选为L-天冬氨酸)反应，生成化合物A。加热温度和反应时间可以考虑各种条件而确定(例如，121℃，8小时)。
(2)反应结束后，将反应液放置冷却，在酸性条件下加入甲醇(例如，60％甲醇溶液)。反应液中包含的未反应的柠檬酸及L-天冬氨酸中的L-天冬氨酸会析出沉淀，因此通过离心分离或过滤进行固液分离。经分离的L-天冬氨酸可以再次利用。需要说明的是，该工序中，除甲醇以外，添加乙醇、异丙醇也能够除去L-天冬氨酸，但在之后添加的碳酸钙的溶解性方面，甲醇最佳。
(3)向得到的包含化合物A及柠檬酸的甲醇溶液中加入纯化水进行稀释(例如稀释2倍。)，接着添加碳酸钙粉末(例如，相对于每1mL反应液而言为228mg)。由此，反应液发泡，柠檬酸钙发生沉淀。沉淀的柠檬酸钙通过离心分离或过滤而进行固液分离。除去了柠檬酸钙的反应液为包含钙离子的化合物A的甲醇溶液。
(4)将(3)中得到的反应液浓缩，蒸馏除去甲醇，加入纯化水，使其为最初反应液的容量。向其中加入例如1M的硫酸而使pH为2.0以下且1.3以上时，钙离子形成硫酸钙而沉淀。沉淀的硫酸钙通过离心分离或过滤而进行固液分离。固液分离后的反应液为包含化合物A的硫酸酸性溶液。
(5)将该硫酸酸性溶液浓缩为例如2/5左右时，化合物A的晶体(称为“结晶化化合物A”)析出，因此进行分离，将剩余部分作为晶体母液。
(6)将硫酸酸性的晶体母液浓缩，加入丙酮而形成化合物A的丙酮溶液(酸性)(例如，80％丙酮溶液)时，粘液状沉淀物析出，然后结晶化(柠檬酸钙)。通过离心分离或过滤对该柠檬酸钙进行固液分离。
(7)将固液分离后的晶体母液浓缩，进行脱水处理(丙酮脱水)。向脱水处理后的晶体母液中加入丙酮，溶剂中的丙酮成为例如90％以上时，化合物A结晶化而沉淀。通过离心分离或过滤对结晶化的化合物A(称为“结晶化化合物A”)进行固液分离。
(8)向化合物A的丙酮溶液中加入纯化水，将丙酮蒸馏除去。向蒸馏除去丙酮后的化合物A的水溶液中加入氯化钙及氢氧化钙，使pH为例如3.6，接着加入乙醇(例如，70％乙醇水溶液)时，化合物A的非结晶性非对映异构体的钙盐发生沉淀。通过离心分离或过滤对该沉淀物(称为非结晶化合物A(Ca盐)))进行固液分离。
上述的工序(5)中得到的结晶化化合物A(水溶液中结晶)及工序(7)中得到的结晶化化合物A(丙酮中结晶)分别进行以下的操作来保存。
再溶解于水中重结晶利用基于HPLC的定性分析进行纯度评价干燥保存
上述的工序(8)中得到的非结晶化合物A(Ca盐)分别进行以下的操作来保存。
再溶解于水中浓缩(将沉淀的柠檬酸钙除去)向化合物A的水溶液中添加乙醇(例如，90v/v％乙醇水溶液)再沉淀利用基于HPLC的定性分析进行纯度评价干燥保存
就得到的非结晶化合物A(Ca盐)而言，在使用时可以调节成硫酸酸性而除去钙，可以通过基于HPLC的定性及定量分析以化合物A的形式对浓度进行评价。
实施例
以下，举出实施例来具体地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。
[实施例1]
(化合物A的合成)
向240g的柠檬酸(一水合物，和光纯药工业)(1.142mol)中加入水，制备400mL的浓柠檬酸溶液，向该溶液中加入72g的L-天冬氨酸(和光纯药工业)(0.541mol)，进行定容而使液量为600mL(柠檬酸最终浓度：1.903mol/L，L-天冬氨酸最终浓度：0.902mol/L)。将该反应液放入耐压玻璃容器中并盖严，于90℃的水浴中进行加热，将添加的L-天冬氨酸尽可能溶解。接下来，向加热至80℃左右的高压釜内加入该耐压容器内的反应液，于121℃加热处理120分钟。在高压釜内的温度冷却至约80℃后，取出耐压容器内的反应液，进行搅拌，将未溶的L-天冬氨酸尽可能溶解。进一步将该反应液在高压釜中于121℃加热处理120分钟。重复该搅拌和加热处理，一边使L-天冬氨酸溶解，一边进行合计420分钟的121℃的加热处理。(L-天冬氨酸在360分钟的加热结束的时间点完全溶解。)通过下述的实施例2中记载的基于HPLC的定性分析，确认了在该反应液中合成了化合物A(图1)。图1中示出化合物A合成反应液的HPLC色谱图(稀释160倍)。由图1可知，加热反应后的合成反应液中出现化合物A的峰(RT 26.0)，柠檬酸(RT 27.7)峰的高度降低。需要说明的是，通过之后的分析，确认了RT为26.0的峰是化合物A。需要说明的是，就作为合成原料的天冬氨酸而言，由于基本上观察不到210nm的吸收光，因此该检测系统中未检测到。
[实施例2]
(化合物A的基于HPLC的定性分析的分离条件)
就合成反应液以及其纯化试样中存在的化合物A而言，通过下述的基于高效液相色谱(HPLC)的定性分析而确认了其存在。各种浓度的包含化合物A的溶液以成为适宜浓度的方式用10mM高氯酸水溶液(基于HPLC的定性分析的流动相)进行稀释，用膜滤器将不溶物除去，用高效液相色谱来分析稀释液。基于HPLC的定性分析的分离条件如下文记载。色谱图中的被认为是化合物A的目标成分是保留时间(RT)为25.4～26.0分钟的峰。
[基于HPLC的定性分析的分离条件]
装置：岛津制作所高效液相色谱仪Prominence
柱：将两根Shodex RSpak KC-811(300mm×8.0mm)连结
流动相：10mM高氯酸水溶液
流速：0.5mL/min
柱温：30℃
进样量：20μL
检测波长：210nm
[实施例3]
(化合物A的纯化和化合物A的结晶化)
向上述的加热反应后的反应液600mL中加入甲醇(和光纯药)900mL而形成60％甲醇溶液时，反应液中的未反应的L-天冬氨酸缓缓析出，以白色沉淀形式沉淀。需要说明的是，该工序中使用乙醇溶液的情况下，即使在后续的工序中采用同样的工序，化合物A也不发生结晶化。将该溶液于室温静置一昼夜，使L-天冬氨酸尽可能沉淀，然后用滤纸(Whatman，No.114)进行过滤，将沉淀物与包含化合物A的反应液(60％甲醇)分离。就以沉淀物形成得到的L-天冬氨酸而言，将甲醇气化除去并进行干燥时，能够作为化合物A合成的合成原料而再次利用。用纯化水(日本药典纯化水)将以滤液形式得到的包含化合物A的反应液(60％甲醇)稀释2倍，形成30％甲醇溶液。一边搅拌，一边向该溶液中缓缓加入碳酸钙(和光纯药工业)的粉末136g(相当于每1ml起始反应液而言为228mg)时，溶解度低的柠檬酸钙的白色沉淀析出。最初，在发泡(二氧化碳)的同时碳酸钙溶解，之后溶解度低的柠檬酸钙缓缓地从溶液中析出。将该溶液静置一昼夜时，未反应的柠檬酸基本上以柠檬酸钙的形式沉淀，成为浓白浊液。通过离心分离(室温，1500×g，30分钟)，将该白浊液分离为沉淀物和其上清溶液，将包含化合物A的上清溶液(包含30％甲醇)回收。用蒸发器(东京理科机械)将回收的上清溶液浓缩，同时将甲醇蒸馏除去，形成浓的粘液状溶液。向浓缩的包含化合物A的粘液状溶液中加入纯化水，使其成为与起始反应液相同的600mL。向该溶液中缓缓加入1mol/L(2N)硫酸而使溶液pH成为1.3～1.6时，溶液中的Ca离子以硫酸钙盐的形式析出并沉淀。通过过滤将该沉淀物除去，回收滤液。该滤液中包含化合物A，为硫酸酸性。在40℃的水浴中加热该溶液(约600mL)，同时用蒸发器进行浓缩，使容量为约250mL(～200mL)。将溶液作为化合物A结晶化的母液冷却至室温，用刮勺等摩擦玻璃壁面时，结晶性化合物A析出物出现，在该状态下静置一昼夜时，得到白色的沉淀物。通过过滤将该沉淀物与母液溶液分离，用少量的纯化水洗涤后进行回收，得到化合物A晶体。
从上述的合成反应液起，反复进行一系列的纯化，直至结晶性化合物A析出的操作，从而从3L的合成反应液得到了约130g(湿重)化合物A的晶体。保留极少量的晶体(种晶)，将剩余的晶体溶解于尽可能少量的纯化水(40℃的温浴中)，用蒸发器将该溶液高度地浓缩，然后冷却，将种晶加入至溶液中，再次得到晶体。用抽滤分取该晶体，使其干燥，得到113g的结晶化后的化合物A。为了确认得到的化合物A晶体的纯度，通过与合成溶液中的化合物A的确认(图1)同样的基于HPLC的定性分析进行评价(图2)。图2中示出在水溶液中结晶化后的化合物A晶体的HPLC色谱图。具体而言，将从加热反应后的合成反应液纯化而得到的化合物A在水溶液中结晶化，通过重结晶将该晶体纯化，然后用HPLC进行评价。称量70mg结晶化后的化合物A，将其溶解于1mL纯化水中。用HPLC分析体系的流动相溶剂(10mM高氯酸溶液)将该溶液稀释160倍，并进行分析。观察到了明确的化合物A的峰，作为杂质的其他峰基本上为痕迹程度，不明确，确认了被高度纯化。
另外，化合物A的非晶体具有吸湿性，即使浓缩固化也吸湿，变成粘性非常高的(粘液状)形态，难以处理。另一方面，化合物A的晶体为不具有吸湿性的粉体，容易处理。
[实施例4]
(非结晶性化合物A的纯化)
使用利用上述方法分取化合物A的晶体而以滤液形式得到的成为晶体母液的溶液，作为未发生结晶化的化合物A的纯化材料。通过基于HPLC的定性分析，确认了该溶液中残存有化合物A(图3)。图3中示出析出化合物A后通过过滤将晶体分取而得到的滤液的HPLC色谱图。用基于HPLC的定性分析的流动相(10mM高氯酸溶液)将滤液稀释400倍，并进行分析。化合物A的峰作为主峰被观察到，也确认到了作为杂质的其他成分的峰。
将由3L的合成反应液得到的晶体母液溶液约1L在40℃的水浴中用蒸发器浓缩，得到约200mL的粘度高的浓缩液。向该浓缩液中加入约800mL的丙酮(和光纯药工业)并进行混合时，发生白浊，约1小时后，白浊成分沉淀，粘液状的液体析出物沉淀。将上清液与粘液状析出物分离。从粘液状析出物得到包含柠檬酸钙的结晶性析出物。再次使用蒸发器将上清液浓缩，形成粘度高的浓缩溶液。重复三次该基于溶剂蒸馏除去的浓缩和丙酮溶解，进行将溶液中的水分置换为丙酮的处理(基于丙酮的溶液脱水)。在该丙酮脱水的过程中，水分减少，同时白色的结晶性析出物逐渐增加。最终形成500mL的丙酮溶液，将该溶液静置一昼夜时，白色的结晶性析出物沉淀。通过过滤将该沉淀物与作为上清液的丙酮溶液分离。由之后的分析可知，该白色的析出物为结晶性化合物A(图4)。图4中示出将在丙酮中结晶化后的化合物A通过重结晶进行纯化而得到的晶体的HPLC色谱图。具体而言，用纯化水将过滤得到的晶体进行重结晶而纯化，将重结晶后的晶体(约20mg)溶解于纯化水(约0.5mL)中，用基于HPLC的定性分析的流动相(10mM高氯酸溶液)将该溶液稀释40倍，并进行分析。观察到了明确的化合物A的峰，杂质的峰为痕迹程度，不明确。通过以上处理，晶体母液溶液的结晶性化合物A非对映异构体基本上析出，溶存于丙酮溶液中的化合物A基本上为非结晶性的化合物A的非对映异构体。
接下来，向包含非结晶性的化合物A的非对映异构体的丙酮溶液中加入纯化水500mL，用蒸发器蒸馏除去丙酮，重复该操作三次，将溶液溶剂转变为水。向该水溶液(溶液容量约200mL)中加入氯化钙100g，进而加入氢氧化钙，使溶液pH为3.6。通过该处理，将作为酸性物质的化合物A衍生为钙盐。以溶液容量成为300mL的方式用纯化水进行定容，加入700mL的乙醇而形成70％乙醇溶液时，化合物A的钙盐以白色沉淀物的形式析出。通过离心分离将该沉淀物与上清溶液分离，进一步用70％乙醇将沉淀物洗涤而纯化，得到纯化沉淀物(非结晶化合物A的Ca盐(1))。另一方面，通过基于HPLC的定性分析对形成70％乙醇的上清溶液进行确认时，该溶液中残留有化合物A，因此，作为更强烈地将化合物A衍生为Ca盐的条件，将溶液的pH调节为6.0，形成80％乙醇溶液而得到沉淀物。用80％乙醇洗涤该沉淀物，形成纯化沉淀物(非结晶化合物A的Ca盐(2))。
通过基于HPLC的定性分析，分别对将通过上述操作而于pH3.6得到的纯化沉淀物和于pH6.0得到的纯化沉淀物进行评价(图5、图6)。将各沉淀物(约10mg)溶解于纯化水(约1mL)中，用基于HPLC的定性分析的流动相即10mM高氯酸水溶液稀释40倍，并进行分析(通过用作为酸性溶剂的10mM高氯酸水溶液进行稀释，从而化合物A的Ca盐被转变为化合物A，以化合物A的形式被检测)。图5为于pH3.6析出的沉淀物的HPLC色谱图，图6为于pH6.0析出的沉淀物的HPLC色谱图。于pH3.6得到的纯化沉淀物(非结晶化合物A的Ca盐(1))的HPLC色谱图中，尽管观察到杂质的峰，但化合物A的主峰被强烈地观察到，被纯化。另一方面，于pH6.0得到的纯化沉淀物(非结晶化合物A的Ca盐(2))的HPLC色谱图中，观察到化合物A的峰、以及化合物A的一部分酰亚胺结构水解而酰胺化的化合物(与化合物A的峰的左肩重叠的峰)的混入(峰2)，另外，被认为是柠檬酸的峰(峰3)增加。因此，就pH6.0的碱添加量而言，认为化合物A的水解进行，认为作为使化合物A的Ca盐析出的条件过于严苛。就于pH3.6析出的化合物A的Ca盐而言，化合物A的水解物的混入为极微量，因此pH3.6被认为是碱性条件的极限。
通过将该乙醇溶液中析出的化合物A的Ca盐的沉淀物溶解于水中并使其为硫酸酸性(例如，pH1.3)从而使硫酸钙析出时，能够除去钙成分，能够制备化合物A的硫酸酸性溶液。通过该纯化工艺，从3L的合成反应液中得到了作为于pH3.6得到的纯化沉淀物的、非结晶化合物A的Ca盐(1)的干燥固体192.7g。
[实施例5]
(化合物A非对映异构体的基于HPLC的定性分析)
就通过纯化处理从上述化合物A合成溶液得到的纯化物的化合物A的非对映异构体的存在比率而言，可以通过基于使用了下述柱的HPLC的定性分析而确认。以成为适宜浓度的方式，用0.1％TFA水溶液(98容量)与甲醇(2容量)的混合液(基于HPLC的定性分析的流动相)将各种浓度的包含化合物A的溶液稀释，用膜滤器除去不溶物，利用高效液相色谱进行分析。基于HPLC的定性分析的条件如下文记载。色谱图中的被认为是化合物A的目标成分在保留时间(RT)为3.3～3.7分钟的区域中以两个相邻的峰的形式被检测到(其中，因柱填充剂的劣化等影响，有时RT发生些许变化)。结晶性化合物A非对映异构体作为柱中的保留时间长的右侧峰被检测到，非结晶性化合物A非对映异构体作为保留时间短的左侧峰被检测到。
[基于HPLC的定性分析的分离条件]
装置：岛津制作所高效液相色谱Prominence
柱：Phenomenex Kinetex F5(100mm×4.6mm)
流动相：0.1％TFA水溶液(98容量)与甲醇(2容量)的混合液
流速：0.8mL/min
柱温：30℃
进样量：5μL
检测波长：200nm
[实施例6]
(含有化合物A的样品的非对映异构体分析结果)
通过基于使用了上述柱的HPLC的定性分析，确认了来自化合物A合成溶液的各纯化样品中的非对映异构体的存在状态。
(1)化合物A合成溶液
确认了从化合物A的合成溶液中除去大部分未反应的天冬氨酸及柠檬酸而进行了粗纯化后的化合物A合成溶液中的化合物A非对映异构体的存在状态(图7)。图7中示出粗纯化后的化合物A合成溶液的HPLC色谱图。化合物A的2个非对映异构体以相邻的2个峰的形式被检测到，它们的存在比率基本上均等。
(2)化合物A晶体
将从化合物A的合成溶液进行纯化、并在水溶液中结晶化而得到的化合物A晶体溶解于纯化水中，通过基于HPLC的定性分析，对化合物A非对映异构体的存在状态进行了评价。(图8)。图8中示出在水溶液中结晶化后的化合物A的HPLC色谱图(来自与图2相同的样品的分析结果)。在检测到两个化合物A非对映异构体的区域中，结晶性化合物A作为保留时间长的右侧峰被检测到，其存在比率以峰面积比计为99％以上。另一非对映异构体的混入比率为0.36％(由峰面积比算出)。
(3)在丙酮中结晶化而得到的化合物A晶体
将从化合物A的合成溶液进行纯化、并在丙酮中结晶化而得到的化合物A晶体溶解于纯化水中，通过基于HPLC的定性分析，对化合物A非对映异构体的存在状态进行了评价。(图9)。图9中示出在丙酮中结晶化后的化合物A的HPLC色谱图(来自与图4相同的样品的分析结果)。在丙酮中结晶化而得到的化合物A晶体也与在水溶液中结晶化而得到的化合物A同样，在检测到两个化合物A非对映异构体的区域中，作为保留时间长的右侧峰被检测到。其存在比率以峰面积比计为98％以上。另一非对映异构体的混入比率为1.36％(由峰面积比算出)。
(4)于pH3.6利用70％乙醇进行沉淀而得到的非结晶化合物A的Ca盐(非结晶化合物A的Ca盐(1))
使结晶化的化合物A从化合物A的合成溶液中析出后，将残留于溶液中的非结晶化合物A在pH3.6的条件下形成Ca盐，在70％乙醇中使其析出，通过基于HPLC的定性分析，对析出的沉淀物的化合物A的非对映异构体的存在状态进行了评价。(图10)(与图5的样品相同的析出物样品)。图10中示出于pH3.6析出的非结晶性化合物A的Ca盐(非结晶化合物A的Ca盐(1))的HPLC色谱图(来自与图5相同的样品的分析结果)。将在70％乙醇中析出的沉淀物溶解于纯化水中，利用HPLC实施定性分析，结果，在检测到两个化合物A非对映异构体的区域中，作为保留时间短的左侧峰被检测到。该峰作为RT与结晶性化合物A峰明显不同的峰被检测到。其存在比率以峰面积比计为99％以上。另一非对映异构体(结晶性化合物A)的混入比率为0.45％(由峰面积比算出)。
(附注：由于各色谱图中的峰在后方拖尾(峰的下端延伸而扩展的现象)，因此，与混入峰的峰高度的外观相比，峰面积比小)
[实施例7]
(利用离子交换色谱制造化合物A的晶体)
1.起始物质的纯化
1-1.起始物质的制备
向75g的柠檬酸(一水合物)(0.59mol)中加入水，制备83.3mL的浓柠檬酸溶液，向该溶液中加入10g的L-天冬酰胺(0.111mol)和1.5g的L-天冬氨酸(0.019mol)，进行定容而使液量为100mL。将该反应液放入耐压玻璃容器中并盖严，在90℃的水浴中进行加热，将添加的L-天冬酰胺、L-天冬氨酸完全溶解。接下来，向加热至80℃左右的高压釜内加入该耐压容器内的反应液，于121℃加热处理180分钟。反应后，将上述反应液自然冷却至25℃，然后将反应液取出至1L的烧杯中，用冰冷却。
将约20g的氢氧化钠溶解于83mL的纯化水中，将该氢氧化钠水溶液用冰冷却，缓慢加入至上述的反应液中，将反应液中和至pH5.8(在确认因中和热而发热故而成为25℃的同时进行中和)。中和后，用纯化水使反应液的容量为200mL。接下来，将33.3g的氯化钙(二水合物)溶解于0.33L的纯化水中，制备氯化钙溶液，将其约一半量加入至上述反应液中，均匀搅拌，静置约16小时。溶液中析出白色沉淀物(柠檬酸钙)。进一步加入氯化钙溶液时，会有新的白色沉淀物发生沉淀，因此，缓慢补加氯化钙溶液，在200mL的已中和的反应液中加入约333mL(以氯化钙量计为0.23mol)的上述氯化钙溶液。向该混合溶液中加入纯化水，使总量为600mL，然后通过离心分离将作为柠檬酸钙的白色沉淀物除去，回收上清液。接下来，用蒸发器(因不希望加热，因此于水温25℃的条件下实施)将该上清液430mL浓缩至133mL。向经浓缩的水溶液中加入310mL的乙醇并进行搅拌。静置片刻后，加入了乙醇的混合液分离成2层，分为较透明的上层(乙醇层)、和观察到着色且具有粘性的下层溶液50mL。利用分液将下层回收，用纯化水稀释至130mL左右，然后，用蒸发器(因不希望加热，因此于水温25℃的条件下实施)将溶液中残留的乙醇蒸馏除去，使其为55mL。将该溶液离心分离，得到上清液45mL。对该上清液进行冷冻干燥，结果为32.67g。将其作为起始物质。
1-2.离子交换柱色谱(SuperQ)
将由上述方法制备的起始物质280mL(水溶液，固态成分235g)溶解于纯化水1L中，依次加入25％氨水约13mL、纯化水19L，调节pH及导电率，将其作为导入样品(pH＝7.1，导电率＝8.4mS/cm)。将其供于离子交换柱色谱(TOYOPEARL SuperQ-650M)。流动相和分取的各级分的详细情况示于图11。对两个目标物级分分别进行冷冻干燥，得到图11中的表1所示的物质。两个目标物级分(Fr(级分)8-12及Fr13)的目标物估算含量算出为5.4g，来自原料中的目标物估算含量64.1g的回收率为86.4％。需要说明的是，表1中的批号是方便起见向上述两个目标物级分标注的编号。
1-3.离子交换柱色谱(DOWEX 50W×8)，利用冷冻干燥将乙酸铵除去
将Fr8-12(批号198-012-74-1)740.2g溶解于纯化水约600mL中，用离子交换树脂(DOWEX 50Wx8，H+型，100-200目)进行批处理后，进行冷冻干燥。将冷冻干燥品再次溶解于纯化水800mL中，分2次导入至离子交换柱色谱(DOWEX 50Wx8，H+型，150mm×200mm)中。导入后，送入纯化水，将包含目标物的级分回收，进行冷冻干燥。向干燥残余物中加入纯化水，重复冷冻干燥数次，使乙酸减少。此时，由于在纯化水中进行了结晶化，因此通过抽滤将晶体与母液分离。分别进行冷冻干燥后，得到以下的物质。
化合物A的晶体：16.5g(批号198-012-078-1白色晶体，参见HPLC色谱图＝图12，参见1H NMR光谱＝图13)
分取化合物A的晶体后的母液(包含化合物A)：36.1g(批号198-012-078-2乳白色无定形状，参见HPLC色谱图＝图14，参见1H NMR光谱＝图15)
2.总结
通过离子交换柱色谱，可从起始物质280mL(水溶液，固态成分235g)中得到以下物质。将由1H NMR算出的乙酸含量及由HPLC面积值算出的目标物(化合物A)的估算含量示于表1。由此次纯化工艺得到的3批次的总目标物含量算出为54.2g，来自起始物质(目标物估算含量64.1g)的回收率为84.5％。
上文显示，通过基于离子交换柱色谱的纯化，能够从化合物A的水溶液中析出晶体。
[表1]
＊1收率是以起始物质的固态成分235g作为起始原料而算出的。
＊2乙酸含量由1H NMR算出。
＊3目标物估算含量是将此次得到的化合物A的晶体的峰作为标准品，由HPLC面积值的一点标准曲线算出的。
＊4“HPLC纯度”表示化合物A的纯度。
[实施例8]
(粉末X射线衍射)
利用以下的方法，使用本发明的化合物A的晶体及化合物A的非结晶性非对映异构体，进行粉末X射线衍射测定。
1.目的
确认上述实施例中得到的本发明的化合物A的晶体及化合物A的非结晶性非对映异构体为晶质还是非晶质(无定形)。
2.试样
使用下述物质作为试样：实施例7中的通过柱纯化从水溶液得到的化合物A的晶体(检体1)；实施例4中的从丙酮溶液得到的化合物A的晶体(作为种晶保存的未进行重结晶的种晶)(检体2)；及通过实施例4的制造方法得到的非结晶化合物A(化合物A的非结晶性非对映异构体)的Ca盐(1)(检体3)。
3.分析方法
3.1.装置
(株)Rigaku制RINT-TTRIII型广角X射线衍射装置
X射线源：CuKα射线
管电压-管电流：50kV-300mA
步宽：0.02deg.
测定速度：5deg./min
狭缝体系：发散-受光-散射
0.5deg.-0.15mm-0.5deg.
衍射线弯曲晶体单色仪
3.2.方法
直接测定检体1～检体3的粉末。
4.结果
图16中示出检体1(通过柱纯化从水溶液得到的晶体)、检体2(从丙酮溶液得到的晶体)及检体3(非结晶性非对映异构体的Ca盐)各物质涉及的粉末X射线衍射图案的基于多重绘图的对比。此外，将检体1的粉末X射线衍射峰列表示于表2，将检体2的粉末X射线衍射峰列表示于表3。
由图16(上部及中部)及表2～表3可知，就检体1及检体2而言，在粉末X射线衍射的衍射图案中观察到了明确的峰，确认了为晶质的固体。另外，由于检体1与检体2的粉末X射线衍射的衍射图案一致，因此也确认了两者为同一形状的晶质。
另一方面，由图16(下部)可知，就检体3(其为通过将非结晶性非对映异构体形成Ca盐并加入乙醇而进行固体化从而得到的固体)而言，在粉末X射线衍射图案中未确认到明确的峰，确认了为非晶质(非结晶性：无定形)的固体。
[表2]
衍射角(2θ) 相对强度(％) 衍射角(2θ) 相对强度(％)
11.735 96.8 19.301 75.5
12.938 27.4 21.181 37.0
15.719 19.8 21.759 87.7
15.901 71.9 23.561 21.5
16.180 54.7 24.101 85.0
16.678 42.3 26.400 43.5
17.838 36.4 26.959 70.3
18.119 30.7 28.698 33.7
18.359 88.4 29.261 100
19.042 62.9 36.240 19.1
将相对强度的前20位提取出
[表3]
衍射角(2θ) 相对强度(％) 衍射角(2θ) 相对强度(％)
11.741 100 19.337 65.0
12.938 22.4 21.198 32.8
15.959 81.3 21.742 70.1
16.196 40.4 23.582 23.0
16.682 35.7 24.081 65.1
17.859 37.2 26.441 39.3
18.158 31.6 26.941 54.5
18.359 66.7 29.238 87.0
19.038 55.6 29.644 28.9
19.200 35.3 36.258 20.2
将相对强度的前20位提取出
[实施例9]
(结晶性化合物A的立体构型的确定)
利用以下的方法，制作用于进行基于单晶X射线衍射的结构分析的化合物A的单晶，使用该单晶，进行基于单晶X射线衍射的结构分析。
1.目的
利用实施例3的段落[0048]中记载的方法合成化合物A时，柠檬酸以酰亚胺键键合于来自L-天冬氨酸(S体)的结构，以下所示的两个非对映异构体(SS体和SR体)被合成。其中一者具有结晶化的性质，另一者具有不结晶化的性质。利用该差异，两个非对映异构体能够分别分离·纯化，但目前无法确定哪一者为SS体或SR体。为了解决该课题，制作了具有0.2mm见方以上的大小的结晶性化合物A的单晶，利用单晶X射线衍射进行结构分析。
[化学式6]
(图中的*标记表示手性碳的位置)
即使利用实施例3的段落[0048]中记载的方法使化合物A在水、丙酮等溶剂中结晶化，也无法得到能够实施基于单晶X射线衍射的结构分析这样的大小的单晶。因此，对用于得到化合物A的单晶的溶剂体系、析出方法进行研究，确立了能够用于基于单晶X射线衍射的结构分析的水平的大小的单晶制作方法，并进行分析。
2.对制作化合物A的单晶的条件的研究
针对利用实施例3的段落[0048]中记载的方法进行合成、纯化、并在水溶液中结晶化而得到的化合物A的晶体，利用实施例3的段落[0049]中记载的重结晶进一步进行纯化，将得到的化合物A作为原料，对用于基于单晶X射线衍射的结构分析的单晶的制作进行研究。
将与实施例3的段落[0049]中记载的重结晶同样的操作重复三次，得到已高度纯化的化合物A的结晶性粉末。向该结晶性粉末10g中加入100ml的纯化水(日本药典纯化水)，在50℃的水浴中进行加热而溶解。使用0.22μm孔径的膜滤器(Merck Millipore)，将该溶液过滤，回收滤液。在40℃的水浴上，使用蒸发器浓缩该滤液，作为50ml左右的溶液回收。通过浓缩并冷却至室温，该溶液成为过饱和状态。保持加热状态(40℃)，以成为下表(表4)中记载的溶剂比率的方式，将该溶液注入于带盖试验管中，制作混合溶剂的溶液。具体而言，通过向400μL的过饱和溶液中加入甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂100μL，从而形成溶剂中的水的比率为80％的溶液。同样地，向300μL(水60％)、200μL(水40％)、100μL(水20％)的过饱和溶液中加入甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂200μL、300μL、400μL，从而分别制作了溶剂中的水的比率成为60％、40％、20％的混合溶剂溶液。就水100％的溶液而言，直接注入500μL过饱和溶液。就甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂100％的溶液而言，将50mg的已高度纯化的化合物A的晶体取至试验管中，加入溶剂500μL，于40℃进行加热，尽可能溶解。异丙醇与水的混合溶剂体系中，异丙醇的比率为40％以上时，化合物A的溶解性降低，沉淀物急剧地大量析出，因此在异丙醇的混合溶剂体系中，未进行40％以上的研究。将结果示于表4。
[表4]
将以这样的方式制作的化合物A的各溶液的试验管的盖盖上并密闭，于室温静置一昼夜以上，使要从过饱和状态析出的化合物A析出。对各试验管进行离心分离(室温，3000rpm，10分钟)，使析出物沉淀，将各溶液的上清液小心移动至另一干净的带塑料制盖的试验管中，形成各溶液的饱和溶液。在盖上各饱和溶液的试验管的盖的状态下，用注射用针在该塑料制盖上开针孔，于室温静置，溶剂从该针孔缓慢地蒸发，由此化合物A的晶体析出。对析出的晶体的形状、大小、晶体随时间而生长的状态进行观察，可知在化合物A的单晶制作中利用水与丙酮的混合溶剂体系使晶体析出的方法是合适的。作为溶剂比率，丙酮比率40％～80％(水为60％～20％)是良好的，特别地，使丙酮比率60％(水40％)的饱和溶液蒸发而得到的晶体是最良好的。在除此以外的醇系溶剂体系中，容易发生多晶化，或者晶体生长差，无法得到能够用于单晶X射线衍射的单晶。
3.化合物A的单晶的制作
在化合物A的基于单晶X射线衍射的结构分析中，在装入有水-丙酮(40％-60％)混合溶剂的饱和溶液的带盖试验管的盖上开针孔，于室温使溶剂缓慢地蒸发，使用得到的晶体。晶体经数天的时间生长，直至析出的单晶充分地生长，并且在单晶彼此融合而多晶化之前进行回收。作为晶体的回收步骤，针对各溶液，将包含晶体的溶液倒转滴加于滤纸上，使滤纸吸收溶液，用金属针拾取回收在滤纸上残留的晶体。在高倍放大镜下观察经回收的单晶，选择保持为能够用于基于单晶X射线衍射的结构分析的大小和形状的单晶，供于基于单晶X射线衍射的结构分析。
4.化合物A的基于单晶X射线衍射的结构分析
进行基于单晶X射线衍射的结构分析，来确认结晶化的化合物A为SS体、SR体中的哪一者。从按照上述单晶制作方法制作的单晶中采集结晶性良好的方柱状晶体(0.2mm×0.2mm×0.6mm)，然后配置于玻璃纤维上，使用经石墨单色仪单色化的CuKα射线用理学电机(株)制RASA-7R型四轴衍射装置进行测定。
以最小二乘法从50.0<2θ<58.8°的范围中的25个反射求出晶格常数。利用ω-2θ扫描法，针对衍射角2θ为136.1°以下的反射进行测定。在测定全部反射数据后，由消光规则(系统反射强度的消失)判定空间群为P21/c(#14)。将测定数据归纳于表5，将晶体数据归纳于表6。
[表5]<测定数据>
使用的衍射装置：理学电机(株)制RASA-7R型
扫描方法：ω-2θ
扫描范围：1.79°+0.30°tanθ
扫描速度(ω)：16.0°/min
数据收集范围：2θmax 136.1°
测定反射数：2552
独立的反射数：1902
作为观测值采用的基准：I>3σ(I)
作为观测值采用的反射数：1899
校正：劳伦兹因子及偏光因子
消光效应校正系数：4.24060e+001
[表6]<晶体数据>
分子式：C10H11NO9+H2O
分子量：289+18
晶系：单斜
空间群：P21/c(#14)
a：
b：
c：
α：90°
β：107.46(1)°
γ：90°
单位晶胞的体积：
使用的X射线及其波长：CuKα射线
单位晶胞内的分子数：Z4
密度的计算值：1.603g/cm3
线吸收系数(CuKα)：12.99m-1
试样晶体的形状和尺寸：方柱状(0.20mm×0.20mm×0.60mm)
F(000)：640.00
测定温度：25℃
5.化合物A的晶体结构的确定
结构确定是通过标准化结构因子E的绝对值大于1.527的280个反射并利用直接法SIR92来进行的。能够由提供最高的优值(Figure of merit)(FOM＝1.416)的相位组计算的Emap、和基于傅里叶的结构扩张求出全部的原子坐标。精密化是使用反射强度I大于3σ(I)的1899个反射并利用完全矩阵最小二乘法进行。以使全部反射的加权系数相等而计算的R因子收敛于0.053。最终的D傅里叶图中的电子密度的最大值和最小值为0.28及原子散射因子使用“国际X射线晶体学用表(International Tables for X-ray Crystallography)”中记载的值，所有的计算使用Rigaku Corporation和Rigaku/MSC的作为晶体学软件包(crystallographic software package)的CrystalStructure来进行。将该分析数据归纳于表7。
[表7]<分析数据>
近似结构的确定法：直接说明法(SIR92)
使用的最小二乘法：完全矩阵法
温度因子的种类：各向异性温度因子
氢原子的操作：各向同性温度因子
最终的R值、wR值：0.053，0.043(加权系数：1/σ2(Fo))
最终D合成电子密度的最大值：
最终D合成电子密度的最小值：
使用的程序名：CrystalStructure
由该分析的结果可知，结晶性化合物A(化合物A的晶体)按照RS表示法为SS体、RR体的对映异构体。而且，由于合成中使用的均为L-Asp(S体)，因此可知结晶性化合物A为SS体。而且，基于此也可知具有不结晶化的性质的化合物A为SR体。
产业上的可利用性
就化合物A的非对映异构体混合物而言，尽管知晓其为具有肝损伤抑制效果的活性物质，但迄今为止尚不知晓结晶性化合物A和非结晶性化合物A在生物体内的生理作用。为了分离非对映异构体这样的类似结构的有机化合物(不限于化合物A)，通常使用高分离性能的柱，要求需要高度纯化技术的工艺。此外，就使用了这些柱的通常纯化方法而言，难以扩大纯化规模，为了大量供给，大多需要高昂费用。本申请确认了化合物A的仅一方的非对映异构体能够结晶化的事实，通过该结晶化技术确立了廉价且大量的非对映异构体的纯化方法。另外，通过使用有机溶剂将结晶性的非对映异构体基本上完全结晶化，从而也确立了廉价且大量地纯化非结晶性的非对映异构体的方法。由此，可期待能够将化合物A的纯化的非对映异构体供给从分析水平的规模扩大至产业基础。通过本发明，可廉价且大量地得到化合物A的晶体及极高纯度的化合物A的非晶质非对映异构体，由此可期待化合物A在药品制造领域、包括功能性食品、健康食品在内的食品制造领域等中更有效的应用。

Claims (24)

1.下述式(A)表示的化合物(以下称为化合物A)的晶体，
[化学式1]
2.如权利要求1所述的晶体，其立体结构按照RS表示法为SS体。
3.如权利要求1所述的晶体，其中，在以CuKα射线作为X射线源的粉末X射线衍射图案中，于衍射角(2θ)为11.74±0.20°、29.25±0.20°、18.36±0.20°、21.75±0.20°、及15.95±0.20°处具有峰。
4.化合物A的晶体的制造方法，其包括以下的工序(a)～(f)，
工序(a)，将包含化合物A及/或其盐、以及柠檬酸及/或其盐的pH5.0～8.5的水溶液通入填充有阴离子交换树脂的柱中；
工序(b)，将洗脱液通入所述柱中，获得不含柠檬酸但包含化合物A的水溶液；
工序(c)，从由工序(b)得到的水溶液中除去洗脱液；
工序(d)，将除去了洗脱液的水溶液浓缩；
工序(e)，向浓缩残余物中添加水而形成水溶液，将所述水溶液浓缩，使化合物A的晶体析出；及
工序(f)，获得化合物A的晶体。
5.如权利要求4所述的制造方法，其中，化合物A的晶体的立体结构按照RS表示法为SS体。
6.如权利要求4或5所述的制造方法，其中，洗脱液为选自由乙酸铵水溶液、氯化钠水溶液、及甲酸铵水溶液组成的组中的洗脱液。
7.如权利要求4～6中任一项所述的制造方法，其中，除去洗脱液的方法为使用填充有阳离子交换树脂的柱的方法。
8.如权利要求4～7中任一项所述的制造方法，其中，进行浓缩的方法为冷冻干燥。
9.化合物A的晶体的制造方法，其包括以下的工序(a)～(f)，
工序(a)，向包含化合物A及柠檬酸的pH2.0以下的水溶液中添加碳酸钙，使柠檬酸钙析出；
工序(b)，从水溶液中除去柠檬酸钙；
工序(c)，向水溶液中添加硫酸使pH为2.0以下，从而使硫酸钙析出；
工序(d)，从水溶液中除去硫酸钙；
工序(e)，将水溶液浓缩，使化合物A的晶体析出；及
工序(f)，获得化合物A的晶体。
10.如权利要求9所述的制造方法，其中，化合物A的晶体的立体结构按照RS表示法为SS体。
11.如权利要求9或10所述的制造方法，其中，浓缩为减压浓缩。
12.如权利要求9～11中任一项所述的制造方法，其中，在获得化合物A的晶体后，还包括以下的工序(g)～(j)，
工序(g)，向水溶液中添加有机溶剂，使柠檬酸钙析出；
工序(h)，从水溶液与有机溶剂的混合液中除去柠檬酸钙；
工序(i)，将水溶液与有机溶剂的混合液脱水，使化合物A的晶体析出；及
工序(j)，获得化合物A的晶体。
13.如权利要求12所述的制造方法，其中，有机溶剂为丙酮。
14.化合物A的非结晶性非对映异构体盐的制造方法，其包括以下的工序(a)～(l)，
工序(a)，向包含化合物A及柠檬酸的pH2.0以下的水溶液中添加碳酸钙，使柠檬酸钙析出；
工序(b)，从水溶液中除去柠檬酸钙；
工序(c)，向水溶液中添加硫酸使pH为2.0以下，从而使硫酸钙析出；
工序(d)，从水溶液中除去硫酸钙；
工序(e)，将水溶液浓缩，使化合物A的晶体析出；
工序(f)，从水溶液中除去化合物A的晶体；
工序(g)，向水溶液中添加有机溶剂，使化合物A的晶体及柠檬酸钙析出；
工序(h)，从水溶液与有机溶剂的混合液中除去化合物A的晶体及柠檬酸钙；
工序(i)，将水溶液与有机溶剂的混合液脱水，使化合物A的晶体析出；
工序(j)，从水溶液中除去化合物A的晶体；
工序(k)，向水溶液中添加金属盐或氨基酸盐、以及醇，使化合物A的非结晶性非对映异构体盐析出；及
工序(l)，获得化合物A的非结晶性非对映异构体盐。
15.如权利要求14所述的制造方法，其中，化合物A的非结晶性非对映异构体盐的立体结构按照RS表示法为SR体。
16.如权利要求14所述的制造方法，其中，有机溶剂为丙酮。
17.如权利要求14～16中任一项所述的制造方法，其中，金属盐为选自由钠盐、钾盐、镁盐、及钙盐组成的组中的金属盐。
18.如权利要求14～16中任一项所述的制造方法，其中，氨基酸盐为选自由精氨酸盐、瓜氨酸盐、鸟氨酸盐、及组氨酸盐组成的组中的氨基酸盐。
19.如权利要求14～18中任一项所述的制造方法，其中，醇为乙醇或甲醇。
20.化合物A的非结晶性非对映异构体或其盐。
21.如权利要求20所述的化合物A的非结晶性非对映异构体或其盐，其中，立体结构按照RS表示法为SR体。
22.如权利要求20或21所述的化合物A的非结晶性非对映异构体或其盐，其中，盐为化合物A的非结晶性非对映异构体的金属盐或氨基酸盐。
23.如权利要求22所述的化合物A的非结晶性非对映异构体或其盐，其中，金属盐为选自由钠盐、钾盐、镁盐、及钙盐组成的组中的金属盐。
24.如权利要求22所述的化合物A的非结晶性非对映异构体或其盐，其中，氨基酸盐为选自由精氨酸盐、瓜氨酸盐、鸟氨酸盐、及组氨酸盐组成的组中的氨基酸盐。
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