WO2018199040A1 - クエン酸誘導体のジアステレオマーの製造方法 - Google Patents

クエン酸誘導体のジアステレオマーの製造方法 Download PDF

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salt
aqueous solution
solution
crystal
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勝也 平石
洋之 相馬
史恵 神間
太郎 足立
一平 山岡
直之 遠藤
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株式会社大塚製薬工場
ＡｄａＢｉｏ株式会社
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/36—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D207/40—2,5-Pyrrolidine-diones
    • C07D207/416—2,5-Pyrrolidine-diones with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to other ring carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4015—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. piracetam, ethosuximide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/13—Crystalline forms, e.g. polymorphs

Definitions

  • the present invention relates to a crystal of a citric acid derivative having an effect of suppressing liver damage, a highly purified non-crystalline diastereomer (amorphous diastereomer, amorphous diastereomer), and a production method thereof.
  • Ume (English name: Japanese apricot, scientific name: Prunus mume) belongs to the Rosaceae subfamily, Prunus subsp.
  • Plum meat extract has effects such as sterilization, recovery from fatigue, and protective action of the stomach, and has been taken for health.
  • plum extract has an effect of improving blood flow (see Non-Patent Documents 1 and 2). It is known that the above blood flow improvement effect is caused by Mumefural and related compounds produced by heating organic sugars such as citric acid and malic acid contained in plum extract and sugar. (Non-patent Document 3).
  • Misatol (registered trademark) is commercially available as one of the health foods containing plum extract, and it is known that misatol has an effect of inducing autophagy and an effect of suppressing liver damage in patients with viral hepatitis ( Patent Documents 1 and 2).
  • R 1 represents a C1-C3 alkyl group optionally having a carboxyl group or a hydroxyl group
  • R 2 represents a hydrogen atom
  • R 1 and R 2 together It may form a cyclic structure and represents a C2-C3 alkylene chain.
  • An object of the present invention is to obtain a crystalline diastereomeric compound from a diastereomeric mixture of citric acid derivatives represented by the following formula obtained by reaction of citric acid and L-aspartic acid among citric acid derivatives represented by the above chemical formula Is to provide a method for isolating a non-crystalline diastereomeric compound in a large amount using an inexpensive method, and a method for purifying an amorphous diastereomeric compound in a large amount using a low cost method.
  • the present inventors have found that a crystal of a compound represented by the above formula can be obtained by combining specific steps.
  • the present inventors have found that an amorphous diastereomeric salt of the compound can be precipitated by combining specific steps.
  • the present inventors have determined the structure of the crystalline diastereomer of the compound represented by the above formula by structural analysis by single crystal X-ray diffraction. The present invention has been completed based on these findings.
  • a crystal of a compound represented by the following formula (A) (hereinafter referred to as compound A).
  • a method for producing a crystal of compound A comprising the following steps (a) to (f): (A) passing an aqueous solution of pH 5.0 to 8.5 containing Compound A and / or a salt thereof and citric acid and / or a salt thereof through a column packed with an anion exchange resin; (B) passing the eluent through the column and obtaining an aqueous solution that does not contain citric acid but contains compound A; (C) removing the eluate from the aqueous solution obtained in step (b); (D) a step of concentrating the aqueous solution from which the eluate has been removed, (E) adding water to the concentrated residue to form an aqueous solution, concentrating the aqueous solution to precipitate crystals of compound A, and (F) A step of obtaining a crystal of compound A. [5] The production method according to [4], wherein the three-dimensional structure of the crystal of compound A is an SS form by the RS display method.
  • a method for producing a crystal of compound A comprising the following steps (a) to (f): (A) adding calcium carbonate to an aqueous solution containing compound A and citric acid and having a pH of 2.0 or less to precipitate calcium citrate; (B) removing calcium citrate from a 60% methanol-water solution; (C) adding sulfuric acid to the aqueous solution to precipitate calcium sulfate at pH 2.0 or lower, (D) removing calcium sulfate from the aqueous solution; (E) A step of concentrating the aqueous solution to precipitate crystals of compound A, and (f) a step of obtaining crystals of compound A.
  • a method for producing an amorphous diastereomeric salt of Compound A comprising the following steps (a) to (l): (A) adding calcium carbonate to an aqueous solution containing compound A and citric acid and having a pH of 2.0 or less to precipitate calcium citrate; (B) removing calcium citrate from the aqueous solution; (C) adding sulfuric acid to the aqueous solution to precipitate calcium sulfate at pH 2.0 or lower, (D) removing calcium sulfate from the aqueous solution; (E) a step of concentrating the aqueous solution to precipitate a compound A crystal; (F) removing the crystals of Compound A from the aqueous solution; (G) adding an organic solvent to the aqueous solution to precipitate crystals of compound A and calcium citrate; (H) removing the crystals of Compound A and calcium citrate from a mixed solution of an aqueous solution and an organic solvent; (I) dehydrating a mixed solution of an aqueous
  • the metal salt is a metal salt selected from the group consisting of sodium salts, potassium salts, magnesium salts, and calcium salts.
  • the crystals and non-crystalline diastereomers of Compound A can be separated in a short time, in a large amount and in a short time, compared with a purification method using a high-resolution column used as a general purification means. And can get.
  • a purification method using a column using a high resolution carrier used as a general diastereomeric separation method the amount that can be purified in a single purification process depends on the column size used, but it is an expensive high resolution carrier.
  • the large-scale purification method using a large column that requires a large amount of cost is not easy in terms of cost and efficiency.
  • a high-purity diastereomer of 20 g or more can be easily separated from a 500 mL reaction solution in a single purification process, and the scale of purification can be easily expanded. .
  • 1 shows an HPLC chromatogram (diluted 160 times) of a compound A synthesis reaction solution.
  • crystallization crystallized in aqueous solution is shown.
  • the HPLC chromatogram of the mother liquor solution after fractionating the compound A crystal is shown.
  • 1 shows an HPLC chromatogram (after recrystallization) of Compound A crystallized in acetone.
  • 1 shows an HPLC chromatogram (non-crystalline compound ACa salt (1)) of a precipitate precipitated at pH 3.6.
  • 1 shows an HPLC chromatogram (non-crystalline compound ACa salt (2)) of a precipitate precipitated at pH 6.0.
  • Peak 6 is a peak that appears to be citric acid.
  • 1 shows an HPLC chromatogram of a crudely purified Compound A synthesis solution. The HPLC chromatogram of the compound A crystallized in the aqueous solution is shown (analysis result derived from the same sample as FIG. 2). An HPLC chromatogram of Compound A crystallized in acetone is shown (analysis result derived from the same sample as FIG. 4). The HPLC chromatogram of the amorphous compound ACa salt precipitated at pH 3.6 is shown (analysis result derived from the same sample as FIG. 5).
  • Example 6 is a flowchart of a method for producing a crystal of compound A by ion exchange chromatography in Example 7.
  • the HPLC chromatogram of the compound A crystal is shown. 1 shows the 1 H-NMR spectrum of the compound A crystal.
  • the HPLC chromatogram of the mother liquid after fractionating the compound A crystal is shown. 1 shows the 1 H-NMR spectrum of the mother liquor after fractionating the crystals of compound A. From the top, sample 1 (crystals obtained from aqueous solution by column purification), sample 2 (crystals obtained from acetone solution), and sample 3 (non-crystalline diastereomeric Ca salt) in order of powder X-rays The comparison by the multiple plot of a diffraction pattern is shown.
  • the diffraction angle (2 ⁇ ) is 11.74 ⁇ 0.20 °, preferably ⁇ 0.10 °, 29. 25 ⁇ 0.20 °, preferably ⁇ 0.10 °, 18.36 ⁇ 0.20 °, preferably ⁇ 0.10 °, 21.75 ⁇ 0.20 °, preferably ⁇ 0.10 °, and 15.95 Examples thereof include crystals having a peak at ⁇ 0.20 °, preferably ⁇ 0.10 °.
  • the diffraction angle (2 ⁇ ) is 24.09 ⁇ 0.20 °, preferably ⁇ 0. 10 °, 19.32 ⁇ 0.20 °, preferably ⁇ 0.10 °, 19.04 ⁇ 0.20 °, preferably ⁇ 0.10 °, 26.95 ⁇ 0.20 °, preferably ⁇ 0.10 °
  • the diffraction angle (2 ⁇ ) of the compound A of the present invention is 26.42 ⁇ 0.20 °, preferably ⁇ 0. 10 °, 16.68 ⁇ 0.20 ° preferably ⁇ 0.10 °, 17.85 ⁇ 0.20 ° preferably ⁇ 0.10 °, 21.19 ⁇ 0.20 °, preferably ⁇ 0.10 ° And crystals having a peak at 18.14 ⁇ 0.20 °, preferably ⁇ 0.10 °.
  • a powder X-ray diffraction pattern using CuK ⁇ as an X-ray source can be obtained by the method described in Example 8 of the present specification.
  • Compound A has a diastereomer in which the carbon at the 2-position of the propane chain derived from citric acid is an asymmetric carbon.
  • the compound A of the present invention also has an asymmetric carbon in the structure derived from aspartic acid, but the configuration of the asymmetric carbon is derived from aspartic acid or asparagine as a raw material to be used.
  • the crystals of Compound A of the present invention are derived from L-form aspartic acid.
  • the crystal of the compound A of the present invention is one of the diastereomers of the compound A, but NMR cannot distinguish which diastereomer corresponds to.
  • As a method for determining which diastereomer the compound A crystal is structural analysis by single crystal X-ray diffraction can be mentioned.
  • Example 9 the method described in Example 9 is given as an example.
  • the crystalline Compound A crystal of Compound A
  • RR form enantiomer of SS form
  • RR form enantiomer of SS form
  • L-Asp S form
  • the non-crystalline diastereomer of the compound A of the present invention or a salt thereof is a diastereomer (hereinafter, non-crystallized) of one of the diastereomers of the compound A that is not crystallized by the crystallization method of the compound A described below. Crystalline diastereomer) or a salt thereof.
  • the amorphous diastereomer of the compound A of the present invention or a salt thereof can be confirmed by qualitative analysis by high performance liquid chromatography (HPLC) described in Example 5, and is also distinguished from the crystalline diastereomer. can do.
  • the configuration of the crystal of the compound A of the present invention is an SS form by the RS display method
  • the configuration of the amorphous (non-crystalline diastereomer) of the compound A of the present invention is as follows. As shown in Fig. 5, it was also found that the body was an SR body by the RS display method.
  • the mixing ratio of the crystalline diastereomer is 5% or less, preferably 4% or less, more preferably 3% or less, and further preferably 2 % Or less, most preferably 1% or less of the amorphous diastereomer of Compound A or a salt thereof.
  • the non-crystalline diastereomeric salt of Compound A of the present invention include metal salts and amino acid salts.
  • a metal salt selected from the group consisting of sodium salt, potassium salt, magnesium salt, and calcium salt, most preferably calcium salt can be mentioned.
  • amino acid salts include amino acid salts selected from the group consisting of arginine salts, citrulline salts, ornithine salts, and histidine salts.
  • the amino acid salt is preferably an L-amino acid salt.
  • the crystals of Compound A of the present invention can be obtained by any method of crystallization using ion exchange column chromatography and using a compound such as calcium carbonate.
  • Crystals of compound A are produced by the following steps (a) to (f).
  • the salt of compound A and the salt of citric acid in an aqueous solution of pH 5.0 to 8.5 containing compound A and / or a salt thereof and citric acid and / or a salt thereof used in the step (a) are not particularly limited.
  • Examples of the salt of compound A and the salt of citric acid include amino acid salts and metal salts (sodium salt, potassium salt, magnesium salt, calcium salt, etc.).
  • Compound A and citric acid are most preferred as compound A and / or a salt thereof, and citric acid and / or a salt thereof.
  • An aqueous solution having a pH of 5.0 to 8.5 containing Compound A and / or a salt thereof and citric acid and / or a salt thereof used in the step (a) is produced, for example, as follows. Citric acid monohydrate and L-aspartic acid are reacted with heating to form Compound A.
  • Compound A may be Compound A produced by a method other than the synthesis method, such as an enzyme reaction method or a fermentation method. After completion of the reaction, the reaction solution is allowed to cool and methanol is added under acidic conditions.
  • the concentration of the methanol solution may be any concentration as long as L-aspartic acid is precipitated, but is, for example, a 60 V / V% solution.
  • L-aspartic acid precipitates and precipitates, and is solid-liquid separated by centrifugation or filtration.
  • the aqueous solution after the solid-liquid separation contains compound A and citric acid.
  • an alkaline aqueous solution for example, aqueous ammonia.
  • the pH of the aqueous solution may be 5.0 to 8.5, preferably 6.0 to 8.0, and most preferably 6.5 to 7.2. This aqueous solution is passed through a column packed with an anion exchange resin.
  • the anion exchange resin may be any anion exchange resin that can separate Compound A and / or a salt thereof, and citric acid and / or a salt thereof.
  • TOYOPEARL SuperQ-650M 150 mm ⁇ 500 mm, manufactured by Tosoh Corporation.
  • the eluent used in the step (b) is not particularly limited, and is selected from the group consisting of, for example, an aqueous ammonium acetate solution, an aqueous sodium chloride solution, and an aqueous ammonium formate solution.
  • the concentration of the eluate can be 50 mM to 5 M, preferably 100 mM to 3 M, more preferably 150 mM to 2 M, and most preferably 200 mM to 1.5 M. Elution may be performed by increasing the concentration of the eluate stepwise.
  • the flow rate of the elution step can be in the range of 10 to 500 mL / min, preferably 50 to 300 mL / min, and most preferably 100 to 200 mL / min.
  • “not containing citric acid” is preferably completely free of citric acid, but may contain traces of citric acid to the extent that it does not hinder crystallization of Compound A. Good.
  • step (c) as a method for removing the eluate, for example, a method using a column filled with a cation exchange resin, electrodialysis, etc., preferably a method using a column packed with a cation exchange resin Is mentioned.
  • Removing the eluate means removing a component (solute) in the eluate.
  • any cation exchange resin capable of separating the compound A and the eluate may be used, and examples thereof include DOWEX 50Wx8 (manufactured by Wako Chemical Co., Ltd.).
  • An aqueous solution for example, purified water is fed to a column packed with a cation exchange resin to obtain an aqueous solution containing Compound A but not containing an eluent.
  • the phrase “not containing the eluate” desirably contains no eluate, but may contain a very small amount of eluate to the extent that does not hinder the crystallization of Compound A.
  • examples of the method for concentrating the aqueous solution include heat concentration, concentration under reduced pressure, and freeze-drying, and most preferably freeze-drying.
  • by concentrating the aqueous solution it is possible to obtain an amorphous and / or crystalline compound A, a mixture thereof, or a concentrated residue containing them.
  • Compound A is non-crystalline, a mixture containing non-crystals, or a concentrated residue containing them, it is preferable to add water again to form a water mixture and concentrate. By performing this step, a crystal of compound A can be precipitated.
  • examples of the method for obtaining crystals include pressure filtration, suction filtration, and centrifugal separation. Furthermore, the crystals can be washed as appropriate in order to reduce the adhesion of the mother liquor and improve the quality of the crystals. The washed crystal can be dried by vacuum drying, fluidized bed drying, ventilation drying, or the like to obtain a final product. In the above method, the crystallization of Compound A can also be achieved by repeating the steps (d) to (e) several times.
  • Crystals of compound A are produced in an aqueous solution by the following steps (a) to (f).
  • D removing calcium sulfate from the aqueous solution;
  • E A step of concentrating the aqueous solution to precipitate crystals of compound A, and (f) a step of obtaining crystals of compound A.
  • the aqueous solution containing compound A and citric acid used in the above step (a) and having a pH of 2.0 or lower is produced, for example, as follows. Citric acid monohydrate and L-aspartic acid are reacted with heating to form Compound A.
  • Compound A may be Compound A produced by a method other than the synthesis method, such as an enzyme reaction method or a fermentation method. After completion of the reaction, the reaction solution is allowed to cool and methanol is added under acidic conditions.
  • the concentration of the aqueous methanol solution is not particularly limited as long as L-aspartic acid is precipitated, but is, for example, a 60 v / v% solution.
  • L-aspartic acid precipitates and is separated into solid and liquid by centrifugation. In this step, it is important to add methanol. Ethanol is not possible. In the subsequent steps, an aqueous solution after solid-liquid separation containing Compound A and citric acid is used.
  • the difficulty in obtaining crystals of Compound A by this method is that citric acid is excluded from the aqueous solution containing Compound A and citric acid under acidic conditions. Since Compound A is unstable in a neutral to alkaline (pH 5 or higher) aqueous solution, it is important to maintain acidic conditions in order to suppress decomposition of Compound A. Accordingly, the aqueous solution containing compound A and citric acid used in step (a) having a pH of 2.0 or less is preferably an aqueous solution having a pH of preferably 0.6 to 1.8, most preferably 1.0 to 1.6. It may be.
  • the present inventors have come up with the idea of removing citric acid in the form of a salt, and as a result of repeated trial and error using salts composed of various metal ions, the citric acid is successfully removed with calcium ions (Ca 2+ ). I found that I could do it. Furthermore, the present inventors have been unable to remove citric acid well under acidic conditions when calcium chloride (CaCl 2 ) is used even if it is a calcium salt, and calcium carbonate (CaCO 3 ) is used. It was also found that citric acid can be successfully removed even under acidic conditions.
  • the removal of calcium citrate in step (b) and the removal of calcium sulfate in step (d) can be performed, for example, by centrifugation or filtration.
  • the reason why sulfuric acid is used is that the compound A is weak against alkali and the solubility of calcium sulfate is low, so that calcium ions can be easily removed (that is, desalting is easy). It is done.
  • the pH at this time is preferably 1.0 to 2.0, more preferably 1.3 to 1.8.
  • the method for concentrating the aqueous solution in the step (e) include heat concentration, reduced pressure concentration, etc. In order to prevent alteration or decomposition of mixed components due to heat, it is possible to reduce pressure concentration. It is preferable.
  • examples of the method for obtaining crystals include pressure filtration, suction filtration, and centrifugal separation. Furthermore, the crystals can be washed as appropriate in order to reduce the adhesion of the mother liquor and improve the quality of the crystals. The washed crystal can be dried by vacuum drying, fluidized bed drying, ventilation drying, or the like to obtain a final product.
  • a crystal of compound A can be further obtained by the following steps (g) to (j).
  • the organic solvent to be added in the step (g) is preferably an organic solvent that can be mixed with water and dissolve a certain amount of Compound A, and specifically, acetone and the like can be exemplified.
  • the removal of calcium citrate in the step (h) can be performed, for example, by centrifugation or filtration.
  • the method for precipitating the crystals of compound A in the above step (i) may be any method as long as it is a method for precipitating the compound, but a method of concentrating the aqueous solution by distilling off the solvent and adding the solvent again is preferable. It is done.
  • examples of the method for obtaining crystals include pressure filtration, suction filtration, and centrifugal separation.
  • the crystals can be washed as appropriate in order to reduce the adhesion of the mother liquor and improve the quality of the crystals.
  • the washed crystal can be dried by vacuum drying, fluidized bed drying, ventilation drying, or the like to obtain a final product.
  • the non-crystalline diastereomeric salt of Compound A of the present invention can be obtained by a method including the following steps (a) to (l).
  • D removing calcium sulfate from the aqueous solution;
  • E a step of concentrating the aqueous solution to precipitate a compound A crystal;
  • the aqueous solution containing compound A and citric acid used in the above step (a) and having a pH of 2.0 or lower is produced, for example, as follows. Citric acid monohydrate and L-aspartic acid are reacted with heating to form Compound A.
  • Compound A may be Compound A produced by a method other than the synthesis method, such as an enzyme reaction method or a fermentation method. After completion of the reaction, the reaction solution is allowed to cool and methanol is added under acidic conditions.
  • the concentration of the aqueous methanol solution may be any concentration as long as L-aspartic acid is precipitated, but is, for example, a 60 v / v% solution.
  • L-aspartic acid precipitates and is separated into solid and liquid by centrifugation. In this step, it is important to add methanol. Ethanol is not possible.
  • an aqueous solution after solid-liquid separation containing Compound A and citric acid is used.
  • the aqueous solution having a pH of 2.0 or less containing Compound A and citric acid used in step (a) is preferably an aqueous solution having a pH of 0.6 to 1.8, most preferably 1.0 to 1.6. Also good.
  • the difficulty in obtaining crystals of compound A by this method is to exclude citric acid from the aqueous solution containing compound A and citric acid.
  • the present inventors have come up with the idea of excluding citric acid in the form of a salt, and as a result of repeated trial and error using salts composed of various metal ions, citric acid is successfully removed with calcium ions (Ca 2+ ). I found that I could do it. Furthermore, the present inventors cannot remove citric acid well under acidic conditions when calcium chloride (CaCl 2 ) is used even if it is a calcium salt, and calcium carbonate (CaCO 3 ) is used. It was also found that citric acid can be successfully removed even under acidic conditions.
  • the removal of calcium citrate in step (b) and the removal of calcium sulfate in step (d) can be performed, for example, by centrifugation or filtration.
  • the reason why sulfuric acid is used is that the compound A is weak against alkali and the solubility of calcium sulfate is low, so that calcium ions can be easily removed (that is, desalting is easy). It is done.
  • the pH at this time is preferably 1.0 to 2.0, more preferably 1.3 to 1.8.
  • step (e) Desalination is difficult when sodium salt (sodium sulfate) or potassium salt (potassium sulfate) is used.
  • Specific examples of the method for concentrating the aqueous solution in the step (e) include heat concentration, reduced pressure concentration, etc. In order to prevent alteration or decomposition of mixed components due to heat, it is possible to reduce pressure concentration. It is preferable.
  • examples of the method for removing crystals include pressure filtration, suction filtration, and centrifugal separation.
  • the step (g) and the step (h) are steps essential for increasing the purity of the diastereomeric salt of the compound A.
  • the organic solvent to be added in the step (g) is preferably an organic solvent that can be mixed with water and dissolve a certain amount of Compound A, and specifically, acetone and the like can be exemplified.
  • the removal of calcium citrate in the step (h) can be performed, for example, by centrifugation or filtration.
  • the method for precipitating the crystals of compound A in the above step (i) may be any method as long as it is a method for precipitating the compound, but a method of concentrating the aqueous solution by distilling off the solvent and adding the solvent again is preferable. It is done.
  • examples of the method for removing the crystal include centrifugation, pressure filtration, and suction filtration.
  • the crystalline compound A is almost removed.
  • the metal salt to be added in the step (k) include sodium salt, potassium salt, magnesium salt, calcium salt and the like, and most preferably, calcium salt (for example, calcium chloride, calcium acetate) is used. it can.
  • the pH of the aqueous solution is preferably acidic, and most preferably pH 3.6 or lower.
  • the amino acid salt added in the above step (k) is an amino acid salt selected from the group consisting of arginine salt, citrulline salt, ornithine salt, and histidine salt, such as L-arginine hydrochloride, L-citrulline hydrochloride, L- Mention may be made of ornithine hydrochloride and L-histidine hydrochloride.
  • the alcohol added in the step (k) include methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, and the like. For example, ethanol or methanol can be used.
  • the efficiency of precipitating the diastereomeric salt of Compound A is better for ethanol than for methanol.
  • the compound A according to the present invention can be synthesized using citric acid and L-aspartic acid and / or L-asparagine (most preferably L-aspartic acid) as starting materials.
  • the synthesized compound A consists of a mixture of two diastereomers. According to the following procedure, crystallization of Compound A and precipitation of an amorphous diastereomeric salt of Compound A can be performed continuously. In the following steps, the conditions of the corresponding steps described above may be used.
  • Citric acid monohydrate is reacted with L-aspartic acid and / or L-asparagine (most preferably L-aspartic acid) under heating to produce compound A.
  • the heating temperature and reaction time can be determined in consideration of various conditions (for example, 121 ° C., 8 hours).
  • the reaction solution is allowed to cool and methanol is added under acidic conditions (for example, a 60% methanol solution).
  • acidic conditions for example, a 60% methanol solution.
  • L-aspartic acid precipitates and precipitates, and is solid-liquid separated by centrifugation or filtration. The separated L-aspartic acid can be reused.
  • L-aspartic acid can be removed by adding ethanol or isopropanol in addition to methanol, but methanol is optimal in terms of the solubility of calcium carbonate to be added later.
  • (3) Add purified water to the obtained methanol solution containing Compound A and citric acid to dilute (for example, 2-fold dilution), and then add calcium carbonate powder (for example, 228 mg per mL of the reaction solution). As a result, the reaction solution foams and calcium citrate precipitates. The precipitated calcium citrate is solid-liquid separated by centrifugation or filtration.
  • the reaction solution from which calcium citrate has been removed is a methanol solution of Compound A containing calcium ions.
  • the reaction solution obtained in (3) is concentrated to distill off methanol, and purified water is added to make the volume of the original reaction solution. For example, when 1 M sulfuric acid is added to make the pH 2.0 or lower and pH 1.3 or higher, calcium ions are precipitated as calcium sulfate. The precipitated calcium sulfate is separated into solid and liquid by centrifugation or filtration. The reaction liquid after solid-liquid separation is a sulfuric acid acidic solution containing Compound A.
  • crystals of compound A (referred to as “crystallized compound A”) are crystallized, so that they are separated and the remainder is used as a crystal mother liquor.
  • acetone solution acidic
  • a cocoon-like precipitate is deposited and later crystallized (citric acid) calcium).
  • the calcium citrate is solid-liquid separated by centrifugation or filtration.
  • the crystal mother liquor after solid-liquid separation is concentrated and dehydrated (acetone dehydrated).
  • Crystallized compound A (referred to as “crystallized compound A”) is subjected to solid-liquid separation by centrifugation or filtration.
  • Purified water is added to the acetone solution of compound A, and acetone is distilled off.
  • Calcium chloride and calcium hydroxide are added to the aqueous solution of Compound A after distillation of acetone to adjust the pH to 3.6, for example, and then ethanol (for example, 70% aqueous ethanol solution) is added.
  • the calcium salt precipitates.
  • This precipitate (referred to as non-crystalline compound A (Ca salt)) is subjected to solid-liquid separation by centrifugation or filtration.
  • the crystallized compound A (crystal in aqueous solution) obtained in the step (5) and the crystallized compound A (crystal in acetone) obtained in the step (7) are stored by performing the following operations. Re-dissolve in water ⁇ Recrystallization ⁇ Purity evaluation by qualitative analysis by HPLC ⁇ Dry ⁇ Storage
  • the amorphous compound A (Ca salt) obtained in the above step (8) is stored by performing the following operations. Redissolved in water ⁇ Concentrate (removes precipitated calcium citrate) ⁇ Add ethanol (for example, 90 v / v% ethanol aqueous solution) to Compound A aqueous solution ⁇ Reprecipitation ⁇ Purity evaluation by qualitative analysis by HPLC ⁇ Dry ⁇ Storage In use, the obtained amorphous compound A (Ca salt) can be made acidic with sulfuric acid to remove calcium, and the concentration can be evaluated as compound A by qualitative and quantitative analysis by HPLC.
  • reaction solution in the pressure vessel was placed in an autoclave heated to about 80 ° C., and heat-treated at 121 ° C. for 120 minutes.
  • the reaction solution in the pressure vessel was taken out and stirred to dissolve as much as possible the undissolved L-aspartic acid.
  • the reaction solution was heat-treated at 121 ° C. for 120 minutes in an autoclave. This stirring and heat treatment were repeated, and heat treatment was performed at 121 ° C. for 420 minutes in total while dissolving L-aspartic acid.
  • FIG. 1 shows an HPLC chromatogram (160-fold dilution) of the compound A synthesis reaction solution.
  • RT 26.0 the peak of compound A
  • RT 27.7 the height of the peak of citric acid
  • Example 2 (Separation conditions for qualitative analysis of Compound A by HPLC) The presence of Compound A present in the synthesis reaction solution and the purified sample was confirmed by the following qualitative analysis by high performance liquid chromatography (HPLC). Solutions containing various concentrations of Compound A are diluted with a 10 mM perchloric acid aqueous solution (mobile phase for qualitative analysis by HPLC) to achieve an appropriate concentration, insoluble matter is removed with a membrane filter, and the diluted solution is used at high speed. Analyzed by liquid chromatography. Separation conditions for qualitative analysis by HPLC were as described below. The target component that appears to be Compound A in the chromatogram is a peak with a retention time (RT) of 25.4 to 26.0 minutes.
  • RT retention time
  • Example 3 Purification of Compound A and Crystallization of Compound A
  • 600 mL of methanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added to 600 mL of the reaction solution after the above heating reaction to make a 60% methanol solution
  • unreacted L-aspartic acid in the reaction solution gradually precipitates, resulting in a white precipitate. As it settles.
  • the ethanol solution was used in the said process, even if the same process was employ
  • This solution was allowed to stand overnight at room temperature to precipitate L-aspartic acid as much as possible, followed by filtration with a filter paper (Whatman, No.
  • reaction solution (60% containing the precipitate and compound A). Methanol).
  • L-aspartic acid obtained as a precipitate can be reused as a synthesis raw material for the synthesis of Compound A by evaporating and removing methanol.
  • a reaction solution (60% methanol) containing Compound A obtained as a filtrate was diluted twice with purified water (Japanese Pharmacopoeia purified water) to give a 30% methanol solution.
  • purified water Japanese Pharmacopoeia purified water
  • Purified water was added to the concentrated solution containing the compound A to make 600 mL, the same as the starting reaction solution.
  • 1 mol / L (2N) sulfuric acid is gradually added to this solution to reach a solution pH of 1.3 to 1.6, Ca ions in the solution precipitate as calcium sulfate salts and precipitate. This sediment was removed by filtration, and the filtrate was recovered.
  • This filtrate contains compound A and is acidic with sulfuric acid.
  • This solution (about 600 mL) was concentrated with an evaporator while warming in a 40 ° C. water bath to a volume of about 250 mL ( ⁇ 200 mL).
  • FIG. 2 shows an HPLC chromatogram of Compound A crystals crystallized in an aqueous solution.
  • Compound A purified from the synthesis reaction solution after the heating reaction was crystallized in an aqueous solution, the crystal was purified by recrystallization, and then evaluated by HPLC.
  • 70 mg of crystallized Compound A was weighed and dissolved in 1 mL of purified water. This solution was diluted 160-fold with a mobile phase solvent (10 mM perchloric acid solution) of an HPLC analysis system and analyzed.
  • Example 4 Purification of non-crystalline compound A
  • Compound A crystals were fractionated by the above-described method, and a crystal mother liquor obtained as a filtrate was used as a purified material for compound A that did not crystallize. It was confirmed that Compound A remained in this solution by qualitative analysis by HPLC (FIG. 3).
  • FIG. 3 shows an HPLC chromatogram of a filtrate obtained by crystallizing Compound A and then separating the crystals by filtration. The filtrate was diluted 400-fold with a mobile phase (10 mM perchloric acid solution) for qualitative analysis by HPLC and analyzed. The peak of Compound A was seen as the main peak, and peaks of other components that became impurities were also confirmed.
  • FIG. 4 shows an HPLC chromatogram of a crystal obtained by recrystallization of Compound A crystallized in acetone.
  • the filtered crystals were purified by recrystallization with purified water, the recrystallized crystals (about 20 mg) were dissolved in purified water (about 0.5 mL), and this solution was dissolved in a mobile phase for qualitative analysis by HPLC.
  • the sample was diluted 40 times with (10 mM perchloric acid solution) and analyzed. A clear peak of Compound A was observed, and an impurity peak was trace and not clear.
  • the crystalline Compound A diastereomer in the crystal mother solution is almost crystallized, and the Compound A dissolved in the acetone solution is a diastereomer of Compound A, which is mostly amorphous. It was.
  • the precipitate was separated from the supernatant solution by centrifugation, and the precipitate was further purified by washing with 70% ethanol to obtain a purified precipitate (Ca salt (1) of amorphous compound A).
  • a purified precipitate (Ca salt (1) of amorphous compound A).
  • the pH of the solution was adjusted to 6.0 as a condition for more strongly inducing compound A to Ca salt.
  • a precipitate was obtained as an 80% ethanol solution.
  • the precipitate was washed with 80% ethanol to obtain a purified precipitate (Ca salt (2) of amorphous compound A).
  • the purified precipitate obtained at pH 3.6 and the purified precipitate obtained at pH 6.0 by the above operation were each evaluated by qualitative analysis by HPLC (FIGS. 5 and 6).
  • Each precipitate (about 10 mg) was dissolved in purified water (about 1 mL), diluted 40-fold with a 10 mM aqueous solution of perchloric acid, which is a mobile phase for qualitative analysis by HPLC, and analyzed (10 mM perchloric acid as an acidic solvent).
  • the Ca salt of Compound A is converted to Compound A and detected as Compound A).
  • FIG. 5 is an HPLC chromatogram of a precipitate precipitated at pH 3.6
  • the precipitate of the Ca salt of Compound A that precipitates in this ethanol solution is dissolved in water, and if calcium sulfate is precipitated by acidification with sulfuric acid (for example, pH 1.3), the calcium content can be removed. It can be prepared as a sulfuric acid acidic solution.
  • sulfuric acid for example, pH 1.3
  • 192.7 g was obtained as a dry solid of the Ca salt (1) of amorphous compound A, which was a purified precipitate obtained at pH 3.6, from 3 L of the synthesis reaction solution.
  • Example 5 Quantum analysis of Compound A diastereomer by HPLC
  • the abundance ratio of the diastereomer of compound A in the purified product obtained by the purification treatment from the above compound A synthesis solution can be confirmed by qualitative analysis by HPLC using the following column. Solutions containing various concentrations of Compound A are diluted with a mixture of 0.1% TFA aqueous solution (98 volumes) and methanol (2 volumes) (mobile phase for qualitative analysis by HPLC) to obtain appropriate concentrations, Insoluble matter was removed with a membrane filter and analyzed by high performance liquid chromatography. The conditions for qualitative analysis by HPLC were as described below.
  • the target component that appears to be Compound A in the chromatogram is detected as two adjacent peaks in the retention time (RT) range of 3.3 to 3.7 minutes (however, due to the effects of column packing deterioration, etc.) RT may vary slightly).
  • the crystalline Compound A diastereomer is detected as the right peak with a long retention time on the column, and the non-crystalline Compound A diastereomer is detected as the left peak with a short retention time.
  • Example 6 (Diastereomer analysis result of compound A containing sample) The presence of diastereomers in each purified sample from the compound A synthesis solution was confirmed by qualitative analysis by HPLC using the above column.
  • FIG. 7 shows the HPLC chromatogram of the crudely purified Compound A synthesis solution. The two diastereomers of Compound A are detected as two adjacent peaks, and the abundance ratio is almost equal.
  • FIG. 8 shows an HPLC chromatogram (analysis result derived from the same sample as FIG. 2) of Compound A crystallized in an aqueous solution. Crystalline compound A was detected as a right peak having a long retention time in the region where two compound A diastereomers were detected, and the abundance ratio was 99% or more in terms of peak area ratio. The mixing ratio of the other diastereomer was 0.36% (calculated from the peak area ratio).
  • FIG. 9 shows an HPLC chromatogram (analysis result derived from the same sample as FIG. 4) of Compound A crystallized in acetone.
  • the compound A crystallized in acetone was also detected as a right peak with a long retention time in the region where two compound A diastereomers were detected, like the compound A crystallized in an aqueous solution.
  • the abundance ratio was 98% or more in peak area ratio.
  • the mixing ratio of the other diastereomer was 1.36% (calculated from the peak area ratio).
  • FIG. 10 shows an HPLC chromatogram (analysis result derived from the same sample as in FIG. 5) of the amorphous compound ACa salt (noncrystalline compound ACa salt (1)) precipitated at pH 3.6.
  • a precipitate precipitated in 70% ethanol was dissolved in purified water, and qualitative analysis was performed by HPLC. As a result, two peaks of the compound A diastereomer were detected, and detected as a left peak with a short retention time. It was done. This peak was detected as an RT peak clearly different from the crystalline Compound A peak. The abundance ratio was 99% or more in peak area ratio. The mixing ratio of the other diastereomer (crystalline compound A) was 0.45% (calculated from the peak area ratio).
  • Peaks in each chromatogram are tailing backward (a phenomenon in which the peak tail extends and spreads), so the peak area ratio is smaller than the peak height of the mixed peak)
  • Example 7 (Production of Compound A Crystals by Ion Exchange Chromatography) 1. Purification of starting material 1-1. Preparation of starting material Water was added to 75 g of citric acid (monohydrate) (0.59 mol) to prepare 83.3 mL of concentrated citric acid solution, and 10 g of L-asparagine (0.111 mol) was added to this solution. Then, 1.5 g of L-aspartic acid (0.019 mol) was added, and the volume was adjusted to 100 mL. This reaction solution was put into a pressure-resistant glass container, sealed, and heated in a 90 ° C. water bath to completely dissolve the added L-asparagine and L-aspartic acid.
  • reaction solution in the pressure vessel was placed in an autoclave heated to about 80 ° C. and heat-treated at 121 ° C. for 180 minutes. After the reaction, the reaction solution was naturally cooled to 25 ° C., and then the reaction solution was taken out into a 1 L beaker and cooled on ice.
  • the mixed solution containing ethanol was separated into two layers, and separated into a relatively transparent upper layer (ethanol layer) and 50 mL of a viscous lower layer solution that was colored.
  • the lower layer was separated and recovered, diluted to about 130 mL with purified water, and then the ethanol remaining in the solution was distilled off to 55 mL with an evaporator (because heat was not applied, so the hot water temperature was 25 ° C.).
  • This solution was centrifuged to obtain 45 mL of supernatant. When this supernatant was freeze-dried, it was 32.67 g. This was the starting material.
  • the estimated target content of the two target fractions (Fr (fraction) 8-12 and Fr13) was calculated to be 5.4 g, and the recovery rate from the estimated target content of 64.1 g in the raw material was 86.4. %Met.
  • Example 8 Powder X-ray diffraction measurement was performed by the following method using the crystal of Compound A of the present invention and the non-crystalline diastereomer of Compound A. 1. Objective To confirm whether the crystals of Compound A of the present invention and the amorphous diastereomers of Compound A obtained in the above Examples are crystalline or amorphous (amorphous).
  • Example 2 Sample Crystal of Compound A obtained from an aqueous solution by column purification in Example 7 (Sample 1), Crystal of Compound A obtained from an acetone solution in Example 4 (crystal that has not been recrystallized and stored as a seed crystal) (Sample 2) ), And Ca salt (1) (specimen 3) of amorphous compound A (amorphous diastereomer of compound A) obtained by the production method in Example 4 was used as data.
  • FIG. 16 shows powder X-rays for the substances of specimen 1 (crystals obtained from an aqueous solution by column purification), specimen 2 (crystals obtained from an acetone solution) and specimen 3 (Ca salt of an amorphous diastereomer). The comparison by the multiple plot of a diffraction pattern is shown. Further, Table 2 shows the powder X-ray diffraction peak list of Sample 1, and Table 3 shows the powder X-ray diffraction peak list of Sample 2. As is clear from FIG. 16 (upper and middle stages) and Tables 2 to 3, Samples 1 and 2 have a clear peak in the diffraction pattern in powder X-ray diffraction, confirming that they are crystalline solids. It was done.
  • specimen 3 which is a solid obtained by solidifying an amorphous diastereomer by adding ethanol as a Ca salt has a clear peak in the powder X-ray diffraction pattern. was not confirmed, and it was confirmed to be an amorphous (non-crystalline: amorphous) solid.
  • Example 9 (Determination of the configuration of crystalline Compound A) A single crystal of Compound A for structural analysis by single crystal X-ray diffraction was prepared by the following method, and structural analysis by single crystal X-ray diffraction was performed using the single crystal.
  • the solution was filtered using a 0.22 ⁇ m pore size membrane filter (Merck Millipore), and the filtrate was recovered. This filtrate was concentrated on a water bath at 40 ° C. using an evaporator and recovered as a solution of about 50 ml. This solution becomes supersaturated upon concentration and cooling to room temperature. This solution was dispensed into a test tube with a lid in a heated state (40 ° C.) so as to have a solvent ratio described in the following table (Table 4) to prepare a mixed solvent solution. Specifically, 100 ⁇ L of an organic solvent such as methanol, ethanol, or acetone was added to 400 ⁇ L of a supersaturated solution to obtain a solution having a water ratio of 80%.
  • an organic solvent such as methanol, ethanol, or acetone
  • 200 ⁇ L, 300 ⁇ L, and 400 ⁇ L of an organic solvent such as methanol, ethanol, and acetone are added to 300 ⁇ L (water 60%), 200 ⁇ L (water 40%), and 100 ⁇ L (water 20%) of a supersaturated solution.
  • the mixed solvent solution in which the ratio of water was 60%, 40%, and 20% was prepared.
  • 500 ⁇ L of a supersaturated solution was dispensed as it was.
  • a solution of 100% organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, etc. was dissolved as much as possible by taking 50 mg of highly purified crystals of Compound A in a test tube, adding 500 ⁇ L of solvent, and heating at 40 ° C.
  • test tube lid of each solution of compound A produced in this way was closed and sealed, and the mixture was allowed to stand at room temperature for more than one day to precipitate compound A that precipitated from the supersaturated state.
  • Each examiner is centrifuged (room temperature, 3000 rpm, 10 minutes) to precipitate the precipitate, and the supernatant of each solution is carefully transferred to another clean plastic covered test tube to obtain a saturated solution of each solution. .
  • a pinhole was made in the plastic lid with an injection needle and left at room temperature, and the solvent slowly evaporated from the pinhole. Crystals precipitate.
  • a method of crystallizing crystals with a mixed solvent system of water and acetone is appropriate for preparing a single crystal of Compound A.
  • a solvent ratio an acetone ratio of 40% to 80% (water is 60% to 20%) is good, and in particular, a crystal obtained by evaporating a saturated solution having an acetone ratio of 60% (water 40%) is the best.
  • polycrystallization tends to occur or crystal growth is poor, and a single crystal usable for single-crystal X-ray diffraction was not obtained.
  • the lattice constant was determined by the least square method from 25 reflections in the range of 50.0 ⁇ 2 ⁇ ⁇ 58.8 °.
  • the reflection with a diffraction angle 2 ⁇ of 136.1 ° or less was measured by the ⁇ -2 ⁇ scanning method.
  • the space group was P2 1 / c (# 14) from the extinction rule (the disappearance of systematic reflection intensity).
  • the measured data are summarized in Table 5 and the crystal data are summarized in Table 6.
  • crystalline Compound A (crystal of Compound A) is an enantiomer of SS and RR isomers by the RS display method. Since all L-Asp (S form) was used in the synthesis, it was found that the crystalline compound A was the SS form. As a result, it was also found that Compound A having the property of not crystallizing was SR.
  • the diastereomeric mixture of Compound A has been found to be an active substance having a liver damage-inhibiting effect, but the physiological actions of crystalline Compound A and amorphous Compound A in the organism have not been known so far. It was.
  • a process requiring high purification techniques is generally required using a column with high resolution.
  • a process requiring high purification techniques is generally required using a column with high resolution.
  • the present application confirmed the fact that only one diastereomer of Compound A can be crystallized, and established a method for purifying a large amount of diastereomers at low cost by the crystallization technique.

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Abstract

下記式で示される化合物Ａ及びクエン酸を含む水溶液に対してイオン交換カラムクロマトグラフィーまたは炭酸カルシウムを用いることによって、上記水溶液中のクエン酸を除去し、その後いくつかの工程を経て結晶性化合物Ａを得る。また、高純度の非結晶性化合物Ａは、化合物Ａ及びクエン酸を含む水溶液に対して炭酸カルシウム、硫酸、有機溶媒等を用いて溶液中のクエン酸及び結晶性化合物Ａを除去することによって得られる。結晶性化合物Ａの立体構造はＲＳ表示法でＳＳ体である。非結晶性化合物Ａの立体構造はＲＳ表示法でＳＲ体である。

Description

クエン酸誘導体のジアステレオマーの製造方法
　本発明は、肝障害抑制効果を有するクエン酸誘導体の結晶、及び高純度化されたその非結晶性ジアステレオマー（非晶質ジアステレオマー、アモルファスジアステレオマー）、並びにそれらの製造方法に関する。
　ウメ（英語名：Japanese apricot、学名：Prunus mume）は、バラ科サクラ亜科サクラ属スモモ亜属に属し、梅干、梅酒、梅肉エキス等の梅加工品が食されている。また、梅肉エキスは、殺菌、疲労回復、胃の保護作用等の効果を有しており、健康のために摂取されてきた。そしてまた、梅肉エキスには血流改善効果があることが知られている（非特許文献１、２参照）。上記血流改善効果は、梅肉エキスに含まれる、クエン酸、リンゴ酸等の有機酸と、糖との加熱によって生成されるムメフラール（Mumefural）及びその関連化合物に起因していることが知られている（非特許文献３）。
　梅肉エキスを含む健康食品の一つとしてミサトール（登録商標）が市販されており、ミサトールは、オートファジーを誘導する効果やウイルス性肝炎患者における肝障害抑制効果があることが知られている（特許文献１、２）。
　クエン酸（IUPAC名：2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid）の炭素鎖であるプロパン鎖の１位の炭素（または３位の炭素）と２位の炭素に結合している２つのカルボキシル基が特定のアミノ酸のアミノ基とイミド結合を形成した化合物、及びそのイミド化合物を加水分解することで得られるクエン酸由来のプロパン鎖の１位の炭素（または３位の炭素）に結合しているカルボキシル基とアミノ酸のアミド化合物は、肝障害抑制効果を有する活性物質であることがわかった。
　本出願人は、上記知見に基づき、先に下記式で示される化合物を含むクエン酸誘導体及びその合成方法を提案した（ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／００４７８９）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（式中、Ｒ１は、カルボキシル基若しくは水酸基を有していてもよいＣ１～Ｃ３アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表すか、または、Ｒ１及びＲ２は、一緒になって環状構造を形成してもよくＣ２～Ｃ３アルキレン鎖を表す。）
　しかし、上記化学式で示されるクエン酸誘導体は、２つの不斉炭素を有するため、４つの立体異性体が存在する。しかし、これらの構造が類似している立体異性体を分離して取得するには、高分離能を有する高額なカラムを複数組み合わせたり、複数回繰り返したりする必要があり、この手法ではカラムサイズに依存した少量分離しか達成されず、高額な費用を要するものであった。これらの立体異性体を、大量かつ安価に分離し、高純度化する技術は確立されていない。
特許４８４２６２４号公報 特許５５７７１２９号公報
J. Agric. FoodChem., 1999, 47, 828-31 ヘモレオロジー研究会誌１、65-67, 1998 ヘモレオロジー研究会誌３、81-88, 2000
　本発明の課題は、上記化学式で示されるクエン酸誘導体のうち、クエン酸とＬ－アスパラギン酸との反応によって得られる下記式で示されるクエン酸誘導体のジアステレオマー混合物から結晶性ジアステレオマー化合物を、安価な手法を用いて大量に単離する方法、並びに非結晶性ジアステレオマー化合物を、安価な手法を用いて大量に高純度に精製する方法を提供することにある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　本発明者らは、上記課題を解決するために研究と検討を重ねた結果、特定の工程を組み合わせることによって、上記式で表される化合物の結晶を得ることができることを見いだした。また、本発明者らは、特定の工程を組み合わせることによって、当該化合物の非結晶性ジアステレオマー塩を析出させることができることを見いだした。また、本発明者らは、単結晶Ｘ線回折による構造解析により、上記式で表される化合物の結晶性ジアステレオマーの構造を決定した。
　本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
　すなわち、本発明は、以下に関する。
　［１］下記式（Ａ）で表される化合物（以下、化合物Ａという。）の結晶。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　［２］立体構造がＲＳ表示法でＳＳ体である、［１］に記載の結晶。
　［３］ＣｕＫα線をＸ線源とする粉末Ｘ線回折パターンにおいて、回折角（２θ）が、１１．７４±０．２０°、２９．２５±０．２０°、１８．３６±０．２０°、２１．７５±０．２０°、及び１５．９５±０．２０°、にピークを有する、［１］又は［２］に記載の結晶。
　［４］以下の（ａ）～（ｆ）の工程を含む、化合物Ａの結晶の製造方法。
（ａ）化合物Ａ及／又はその塩、並びにクエン酸及び／又はその塩を含む、ｐＨ５．０～８．５の水溶液を、陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通塔する工程、
（ｂ）該カラムに溶出液を通塔し、クエン酸を含まないが、化合物Ａを含む水溶液を取得する工程、
（ｃ）工程（ｂ）により得られた水溶液から、溶出液を除去する工程、
（ｄ）溶出液を除去した水溶液を濃縮する工程、
（ｅ）濃縮残渣に水を添加して水溶液とし、該水溶液を濃縮して、化合物Ａの結晶を析出させる工程、及び、
（ｆ）化合物Ａの結晶を取得する工程。
　［５］化合物Ａの結晶の立体構造がＲＳ表示法でＳＳ体である、［４］に記載の製造方法。
　［６］溶出液が、酢酸アンモニウム水溶液、塩化ナトリウム水溶液、及びギ酸アンモニウム水溶液からなる群より選ばれる溶出液である、［４］又は［５］に記載の製造方法。
　［７］溶出液を除去する方法が、陽イオン交換樹脂を充填したカラムを使用する方法である、［４］～［６］のいずれかに記載の製造方法。
　［８］濃縮する方法が、凍結乾燥である、［４］～［７］のいずれかに記載の製造方法。
　［９］以下の（ａ）～（ｆ）の工程を含む、化合物Ａの結晶の製造方法。
（ａ）化合物Ａ及びクエン酸を含む、ｐＨ２．０以下の水溶液に、炭酸カルシウムを添加して、クエン酸カルシウムを析出させる工程、
（ｂ）60％メタノール-水溶液から、クエン酸カルシウムを除去する工程、
（ｃ）水溶液に硫酸を添加して、ｐＨ２．０以下として硫酸カルシウムを析出させる工程、
（ｄ）水溶液から、硫酸カルシウムを除去する工程、
（ｅ）水溶液を濃縮して、化合物Ａの結晶を析出させる工程、及び
（ｆ）化合物Ａの結晶を取得する工程。
　［１０］化合物Ａの結晶の立体構造がＲＳ表示法でＳＳ体である、［９］に記載の製造方法。
　［１１］濃縮が、減圧濃縮である、［９］又は［１０］に記載の製造方法。
　［１２］化合物Ａの結晶を取得した後、以下の（ｇ）～（ｊ）の工程をさらに含む、［９］～［１１］のいずれかに記載の製造方法。
（ｇ）水溶液に有機溶媒を添加して、クエン酸カルシウムを析出させる工程、
（ｈ）水溶液と有機溶媒の混合液から、クエン酸カルシウムを除去する工程、
（ｉ）水溶液と有機溶媒の混合液を脱水して、化合物Ａの結晶を析出させる工程、及び、（ｊ）化合物Ａの結晶を取得する工程。
　［１３］有機溶媒が、アセトンである、［１２］に記載の製造方法。
　［１４］以下の、（ａ）～（ｌ）の工程を含む、化合物Ａの非結晶性ジアステレオマー塩の製造方法。
（ａ）化合物Ａ及びクエン酸を含む、ｐＨ２．０以下の水溶液に、炭酸カルシウムを添加して、クエン酸カルシウムを析出させる工程、
（ｂ）水溶液から、クエン酸カルシウムを除去する工程、
（ｃ）水溶液に硫酸を添加して、ｐＨ２．０以下として硫酸カルシウムを析出させる工程、
（ｄ）水溶液から、硫酸カルシウムを除去する工程、
（ｅ）水溶液を濃縮して、化合物Ａの結晶を析出させる工程、
（ｆ）水溶液から、化合物Ａの結晶を除去する工程、
（ｇ）水溶液に有機溶媒を添加して、化合物Ａの結晶及びクエン酸カルシウムを析出させる工程、
（ｈ）水溶液と有機溶媒の混合液から、化合物Ａの結晶及びクエン酸カルシウムを除去する工程、
（ｉ）水溶液と有機溶媒の混合液を脱水して、化合物Ａの結晶を析出させる工程、
（ｊ）水溶液から、化合物Ａの結晶を除去する工程、
（ｋ）水溶液に、金属塩またはアミノ酸塩、及びアルコールを添加して、化合物Ａの非結晶性ジアステレオマー塩を析出させる工程、及び、
（ｌ）化合物Ａの非結晶性ジアステレオマー塩を取得する工程。
　［１５］化合物Ａの非結晶性ジアステレオマー塩の立体構造がＲＳ表示法でＳＲ体である、［１４］に記載の製造方法。
　［１６］有機溶媒が、アセトンである、［１４］に記載の製造方法。
　［１７］金属塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、及びカルシウム塩からなる群より選ばれる金属塩である、［１４］～［１６］のいずれかに記載の製造方法。
　［１８］アミノ酸塩が、アルギニン塩、シトルリン塩、オルニチン塩、及びヒスチジン塩からなる群より選ばれるアミノ酸塩である［１４］～［１６］のいずれかに記載の製造方法。
　［１９］アルコールが、エタノールまたはメタノールである、［１４］～［１８］のいずれかに記載の製造方法。
　［２０］化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーまたはその塩。
　［２１］立体構造がＲＳ表示法でＳＲ体である、［２０］に記載の化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーまたはその塩。
　［２２］塩が、化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーの金属塩またはアミノ酸塩である、［２０］又は［２１］に記載の化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーまたはその塩。
　［２３］金属塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、およびカルシウム塩からなる群より選ばれる金属塩である、［２２］に記載の化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーまたはその塩。
　［２４］アミノ酸塩が、アルギニン塩、シトルリン塩、オルニチン塩、及びヒスチジン塩からなる群より選ばれるアミノ酸塩である、［２２］に記載の化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーまたはその塩。
　化合物Ａの結晶及び高純度化された化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーが得られたことにより、各物質の生理活性、疾患に対する作用機序を解明するのに役立つ。また、化合物Ａの結晶及び高純度化された化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーは、これらを含むジアステレオマー混合物に比べて扱いやすいので、化合物Ａを有効成分として使用する医薬の製造、あるいは化合物Ａを使用する飲食品の製造等に際して極めて有用である。また、本願記載の方法によれば、一般的な精製手段として用いられる高分離能なカラム等による精製法に比べ、安価かつ大量、短時間に化合物Ａの結晶ならびに非結晶性ジアステレオマーを分離し、取得することができる。一般的なジアステレオマー分離方法として用いられる高分離能担体を使用したカラム等による精製法では、一回の精製プロセスで精製できる量は使用するカラムサイズに依存するが、高額な高分離能担体を要する大型カラムを使用する大量精製法はコストおよび効率の面で容易ではない。本願記載の方法によれば、５００ｍＬの反応液から、一回の精製プロセスで、２０ｇ以上の高純度なジアステレオマーが容易に分離でき、さらに精製のスケールを容易に拡大することが可能である。
化合物Ａ合成反応液のＨＰＬＣクロマトグラム（１６０倍希釈）を示す。 水溶液中で結晶化した化合物Ａ結晶のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 化合物Ａの結晶を分取した後の母液溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 アセトン中で結晶化した化合物ＡのＨＰＬＣクロマトグラム（再結晶後）を示す。 ｐＨ３．６で析出した沈降物のＨＰＬＣクロマトグラム（非結晶化合物ＡＣａ塩（１））を示す。 ｐＨ６．０で析出した沈降物のＨＰＬＣクロマトグラム（非結晶化合物ＡＣａ塩（２））を示す。図６のピーク２において化合物Ａのピークの左肩部分に化合物Ａが加水分解したアミド化合物のピークが重なっている（ピークの左肩が膨らんだ様に見える）。また、ピーク３はクエン酸と思われるピークである。 粗精製した化合物Ａ合成溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 水溶液中で結晶化した化合物ＡのＨＰＬＣクロマトグラムを示す（図２と同じサンプル由来の分析結果である）。 アセトン中で結晶化した化合物ＡのＨＰＬＣクロマトグラムを示す（図４と同じサンプル由来の分析結果である）。 ｐＨ３．６で析出した非結晶性化合物ＡＣａ塩のＨＰＬＣクロマトグラムを示す（図５と同じサンプル由来の分析結果である）。 実施例７におけるイオン交換クロマトグラフィーによる化合物Ａの結晶を製造する方法のフローチャートである。 化合物Ａの結晶のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 化合物Ａの結晶の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。 化合物Ａの結晶を分取した後の母液のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 化合物Ａの結晶を分取した後の母液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。 上から、検体１（カラム精製によって水溶液から得た結晶）、検体２（アセトン溶液から得た結晶）及び検体３（非結晶性ジアステレオマーのＣａ塩）の順で各々の物質に関する粉末Ｘ線回折パターンの多重プロットによる比較を示す。
　本発明の化合物Ａの結晶としては、Ｘ線源としてＣｕＫαを用いた粉末Ｘ線回折パターンにおいて、回折角（２θ）が、１１．７４±０．２０°好ましくは±０．１０°、２９．２５±０．２０°好ましくは±０．１０°、１８．３６±０．２０°好ましくは±０．１０°、２１．７５±０．２０°好ましくは±０．１０°、及び１５．９５±０．２０°好ましくは±０．１０°、にピークを有する結晶を挙げることができる。
　本発明の化合物Ａの結晶としては、Ｘ線源としてＣｕＫαを用いた粉末Ｘ線回折パターンにおいて、回折角（２θ）が、上記に加えさらに、２４．０９±０．２０°好ましくは±０．１０°、１９．３２±０．２０°好ましくは±０．１０°、１９．０４±０．２０°好ましくは±０．１０°、２６．９５±０．２０°好ましくは±０．１０°、及び１６．１９±０．２０°好ましくは±０．１０°、にピークを有する結晶を挙げることができる。
　本発明の化合物Ａの結晶としては、Ｘ線源としてＣｕＫαを用いた粉末Ｘ線回折パターンにおいて、回折角（２θ）が、上記に加えさらに、２６．４２±０．２０°好ましくは±０．１０°、１６．６８±０．２０°好ましくは±０．１０°、１７．８５±０．２０°好ましくは±０．１０°、２１．１９±０．２０°好ましくは±０．１０°、及び１８．１４±０．２０°好ましくは±０．１０°、にピークを有する結晶を挙げることができる。
　Ｘ線源としてＣｕＫαを用いた粉末Ｘ線回折パターンは、本明細書の実施例８に記載の方法により取得することができる。
　化合物Ａには、クエン酸由来のプロパン鎖の２位の炭素を不斉炭素としたジアステレオマーが存在する。なお、本発明の化合物Ａは、アスパラギン酸由来の構造内にも不斉炭素が存在するが、該不斉炭素の立体配置は、使用する原料のアスパラギン酸又はアスパラギンに由来する。本発明の化合物Ａの結晶は、Ｌ体のアスパラギン酸に由来する。
　本発明の化合物Ａの結晶は、化合物Ａのジアステレオマーのいずれか一方の結晶であるが、ＮＭＲでは、どちらのジアステレオマーに相当するかを見分けることができない。
　化合物Ａの結晶がいずれのジアステレオマーであるかを決定する方法としては、単結晶Ｘ線回折による構造解析が挙げられる。具体的には、実施例９に記載の方法が一例として挙げられる。実施例９の解析の結果、結晶性の化合物Ａ（化合物Ａの結晶）はＳＳ体、ＲＲ体のエナンチオマーであることが明らかになった。そして合成に用いたのが全てＬ－Ａｓｐ（Ｓ体）であることから、結晶性の化合物Ａの立体配置はＲＳ表示法でＳＳ体であることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　この解析の結果、結晶性の化合物ＡはＳＳ体、ＲＲ体のエナンチオマーであることが明らかになった。そして合成に用いたのが全てＬ－Ａｓｐ（Ｓ体）であることから、結晶性の化合物ＡはＳＳ体であることが分かった。そしてこれを受け、結晶化しない性質を持つ化合物ＡがＳＲ体であることも分かった。
　本発明の化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーまたはその塩は、化合物Ａのジアステレオマーの一方のうち、以下に記載の化合物Ａの結晶化の方法により結晶化しないジアステレオマー（以下、非結晶性のジアステレオマーともいう。）またはその塩である。
　本発明の化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーまたはその塩は、実施例５に記載の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による定性分析により確認することができ、また、結晶性のジアステレオマーと区別することができる。
　前述のように、本発明の化合物Ａの結晶の立体配置がＲＳ表示法でＳＳ体であることから、本発明の化合物Ａの非晶質（非結晶性ジアステレオマー）の立体配置は、下記に示す通り、ＲＳ表示法でＳＲ体であることも分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　本発明の化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーまたはその塩としては、結晶性のジアステレオマーの混入率が、５％以下、好ましくは４％以下、より好ましくは３％以下、さらに好ましくは２％以下、最も好ましくは１％以下の、化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーまたはその塩を挙げることができる。
　本発明の化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーの塩としては、金属塩またはアミノ酸塩を挙げることができる。
　金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、およびカルシウム塩からなる群より選ばれる金属塩を、最も好ましくはカルシウム塩を挙げることができる。
　アミノ酸塩としては、アルギニン塩、シトルリン塩、オルニチン塩、およびヒスチジン塩からなる群より選ばれるアミノ酸塩を挙げることができる。当該アミノ酸塩は、好ましくはＬ体のアミノ酸塩である。
　本発明の化合物Ａの結晶は、イオン交換カラムクロマトグラフィーの使用及び炭酸カルシウム等の化合物の使用による結晶化のいずれかの方法によって得ることができる。
（イオン交換カラムクロマトグラフィーによる方法）
　以下の（ａ）～（ｆ）の工程により化合物Ａの結晶を製造する。
（ａ）化合物Ａ及び／又はその塩、並びにクエン酸及び／又はその塩を含む、ｐＨ５．０～８．５の水溶液を、陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通塔する工程、
（ｂ）該カラムに溶出液を通塔し、クエン酸を含まないが、化合物Ａを含む水溶液を取得する工程、
（ｃ）工程（ｂ）により得られた水溶液から、溶出液を除去する工程、
（ｄ）溶出液を除去した水溶液を濃縮する工程、
（ｅ）濃縮残渣に水を添加して水溶液とし、該水溶液を濃縮して、化合物Ａの結晶を析出させる工程、及び、
（ｆ）化合物Ａの結晶を取得する工程。
　前記工程（ａ）で使用する化合物Ａ及び／又はその塩、並びにクエン酸及び／又はその塩を含む、ｐＨ５．０～８．５の水溶液における化合物Ａの塩及びクエン酸の塩は特に限定されない。化合物Ａの塩及びクエン酸の塩として、例えば、アミノ酸塩、金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、等）が挙げられる。化合物Ａ及び／又はその塩、並びにクエン酸及び／又はその塩として最も好ましいのは、化合物Ａ及びクエン酸である。
　上記工程（ａ）で使用する化合物Ａ及び／又はその塩、並びにクエン酸及び／又はその塩を含む、ｐＨ５．０～８．５の水溶液は、例えば、次のようにして製造する。クエン酸一水和物とＬ－アスパラギン酸を加熱下反応させ、化合物Ａを生成させる。化合物Ａは、酵素反応法、発酵法など、合成法以外の方法により製造された化合物Ａであってもよい。反応終了後、反応液を冷却放置して、酸性条件下でメタノールを加える。メタノール溶液の濃度はＬ－アスパラギン酸が析出する濃度であればいずれでもよいが、例えば、６０V/V％溶液である。反応液に含まれる未反応のクエン酸及びＬ－アスパラギン酸のうち、Ｌ－アスパラギン酸が析出沈殿するので、遠心分離あるいはろ過によって固液分離する。固液分離後の水溶液は、化合物Ａ及びクエン酸を含む。固液分離後の水溶液が酸性である場合には、アルカリ水溶液、例えば、アンモニア水を加えて、ｐＨを調製することが好ましい。該水溶液のｐＨとしては、５．０～８．５、好ましくは６．０～８．０、最も好ましくは６．５～７．２を挙げることができる。この水溶液を陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通塔する。
　陰イオン交換樹脂としては、化合物Ａ及び／又はその塩、並びにクエン酸及び／又はその塩を分離することができる陰イオン交換樹脂であればいずれでもよいが、例えば、TOYOPEARL SuperQ-650M（１５０ｍｍ×５００ｍｍ、東ソ社製）を挙げることができる。
　上記工程（ｂ）において使用する溶出液としては、特に制限はないが、例えば、酢酸アンモニウム水溶液、塩化ナトリウム水溶液、ギ酸アンモニウム水溶液からなる群より選択される。
　溶出液の濃度としては、５０ｍＭ～５Ｍ、好ましくは、１００ｍＭ～３Ｍ、より好ましくは１５０ｍＭ～２Ｍ、最も好ましくは２００ｍＭ～１．５Ｍを挙げることができる。溶出液の濃度を段階的に高めて溶出してもよい。
　溶出工程の流速としては、１０～５００ｍＬ／ｍｉｎ、好ましくは５０～３００ｍＬ／ｍｉｎ、最も好ましくは１００～２００ｍＬ／ｍｉｎの範囲を挙げることができる。
　上記工程（ｂ）において「クエン酸を含まない」とは、完全にクエン酸を含まないことが望ましいが、化合物Ａの結晶化において障害とならない程度に、微量のクエン酸が含まれていてもよい。
　上記工程（ｃ）において、溶出液を除去する方法としては、例えば、陽イオン交換樹脂を充填したカラムを使用する方法、電気透析等が、好ましくは陽イオン交換樹脂を充填したカラムを使用する方法が挙げられる。なお、「溶出液を除去する」とは、溶出液中の成分（溶質）を除去することを意味する。
　陽イオン交換樹脂としては、化合物Ａと溶出液を分離することができる陽イオン交換樹脂であればいずれでもよいが、ＤＯＷＥＸ　５０Ｗｘ８（ワコーケミカル社製）を挙げることができる。陽イオン交換樹脂を充填したカラムに水溶液、例えば、精製水を送液して化合物Ａを含むが、溶出液を含まない水溶液を取得する。「溶出液を含まない」とは、完全に溶出液を含まないことが望ましいが、化合物Ａの結晶化に障害とならない程度に微量の溶出液が含まれていてもよい。
　上記工程（ｄ）および（ｅ）において、水溶液を濃縮する方法としては、加熱濃縮、減圧濃縮、または凍結乾燥を例示することができ、最も好ましくは、凍結乾燥を挙げることができる。
　上記工程（ｄ）および（ｅ）において、水溶液を濃縮することにより、化合物Ａの非結晶及び／もしくは結晶、それらの混合物、またはそれらを含む濃縮残渣を取得することができる。化合物Ａが非結晶である場合、非結晶を含む混合物である場合、または、それらを含む濃縮残渣ある場合には、再度水を添加して水混合物とし、濃縮する工程を行うことが好ましい。この工程を行うことにより、化合物Ａの結晶を析出させることができる。
　上記工程（ｆ）において、結晶を取得する方法としては、加圧濾過、吸引濾過、遠心分離等を挙げることができる。さらに母液の付着を低減し、結晶の品質を向上させるために、適宜、結晶を洗浄することができる。洗浄した結晶は、減圧乾燥、流動層乾燥、通風乾燥等により乾燥させ、最終製品を得ることができる。
　上記方法において、工程（ｄ）～工程（ｅ）を数回繰り返して行うことによっても化合物Ａの結晶化を達成することできる。
（炭酸カルシウム等の化合物の使用による結晶化による方法）
　以下の（ａ）～（ｆ）の工程により水溶液中で化合物Ａの結晶を製造する。
（ａ）化合物Ａ及びクエン酸を含む、ｐＨ２．０以下の水溶液に、炭酸カルシウムを添加して、クエン酸カルシウムを析出させる工程、
（ｂ）水溶液から、クエン酸カルシウムを除去する工程、
（ｃ）水溶液に硫酸を添加して、ｐＨ２．０以下とし硫酸カルシウムを析出させる工程、
（ｄ）水溶液から、硫酸カルシウムを除去する工程、
（ｅ）水溶液を濃縮して、化合物Ａの結晶を析出させる工程、及び
（ｆ）化合物Ａの結晶を取得する工程。
　上記工程（ａ）で使用する化合物Ａ及びクエン酸を含む、ｐＨ２．０以下の水溶液は、例えば、次のようにして製造する。クエン酸一水和物とＬ－アスパラギン酸を加熱下反応させ、化合物Ａを生成させる。化合物Ａは、酵素反応法、発酵法など、合成法以外の方法により製造された化合物Ａであってもよい。反応終了後、反応液を冷却放置して、酸性条件下でメタノールを加える。メタノール水溶液の濃度はＬ－アスパラギン酸が析出する濃度であればいずれでもよいが、例えば、６０v/v％溶液である。反応液に含まれる未反応のクエン酸及びＬ－アスパラギン酸のうち、Ｌ－アスパラギン酸が析出沈殿するので、遠心分離によって固液分離する。なお、この工程では、メタノールを加えることが重要である。エタノールは不可である。以降の工程には、化合物Ａ及びクエン酸を含む固液分離後の水溶液を用いる。
　本方法により化合物Ａの結晶を得るに際して困難な点は、化合物Ａ及びクエン酸を含む水溶液からクエン酸を酸性条件で除外することである。化合物Ａは、中性～アルカリ性（ｐＨ５以上）の水溶液中で不安定であるため、化合物Ａの分解を抑制するために酸性条件を維持することは重要である。したがって、工程（ａ）で使用する化合物Ａ及びクエン酸を含む、ｐＨ２．０以下の水溶液は、ｐＨが好ましくは、０．６～１．８、最も好ましくは１．０～１．６の水溶液であってもよい。本発明者らは、クエン酸を塩の形にして除去することを思いつき、種々の金属イオンからなる塩を用いて試行錯誤を重ねた結果、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）でクエン酸をうまく除去することができることを見いだした。更に、本発明者らは、カルシウム塩であっても、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を用いた場合には、酸性条件ではクエン酸をうまく除去することができず、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を用いた場合には、酸性条件でもクエン酸を首尾よく除去することができることも見いだした。これは、炭酸カルシウムの炭酸イオン（ＣＯ３ ２－）がＣＯ２になって、カルシウムイオンの相手のアニオンがなくなるので、クエン酸イオンとカルシウムイオンが結合しやすくなるためであると考えられる。したがって、工程（ａ）において炭酸カルシウムを用いることは必須の条件である。
　上記工程（ｂ）におけるクエン酸カルシウムの除去及び工程（ｄ）における硫酸カルシウムの除去は、例えば、遠心分離あるいはろ過によって行うことができる。
　上記工程（ｃ）において、硫酸を用いる理由としては、化合物Ａがアルカリに弱いことと硫酸カルシウムの溶解性が低いためにカルシウムイオンを除去しやすい（即ち、脱塩が容易である）ことが挙げられる。ｐＨ２．０以下とすることで、化合物Ａのカルシウム塩として存在していたカルシウムイオンが化合物Ａと乖離して、硫酸カルシウムとなる。このときのｐＨとしては１．０～２．０が良く、より好ましくは１．３～１．８が良い。ナトリウム塩（硫酸ナトリウム）やカリウム塩（硫酸カリウム）を用いた場合には脱塩は難しい。
　上記工程（ｅ）における水溶液を濃縮する方法として、具体的には、加熱濃縮、減圧濃縮等を例示することができるが、熱による混入成分の変質あるいは分解を防止するためには、減圧濃縮によることが好ましい。
　上記工程（ｆ）において、結晶を取得する方法としては、加圧濾過、吸引濾過、遠心分離等を挙げることができる。さらに母液の付着を低減し、結晶の品質を向上させるために、適宜、結晶を洗浄することができる。洗浄した結晶は、減圧乾燥、流動層乾燥、通風乾燥等により乾燥させ、最終製品を得ることができる。
　上記工程（ｅ）において化合物Ａの結晶を析出させた後の水溶液（結晶母液）中には、まだ結晶性の化合物Ａジアステレオマーが含まれている。このため、以下の（ｇ）～（ｊ）の工程によって更に化合物Ａの結晶を得ることができる。
（ｇ）水溶液に有機溶媒を添加して、クエン酸カルシウムを析出させる工程、
（ｈ）水溶液と有機溶媒の混合液から、クエン酸カルシウムを除去する工程、
（ｉ）水溶液と有機溶媒の混合液を脱水して、化合物Ａの結晶を析出させる工程、及び、
（ｊ）化合物Ａの結晶を取得する工程。
　上記工程（ｇ）において添加する有機溶媒としては、水と混和し、化合物Ａを一定量溶解することができる有機溶媒が好ましく、具体的には、アセトン等を例示することができる。
　上記工程（ｈ）におけるクエン酸カルシウムの除去は、例えば、遠心分離あるいはろ過によって行うことができる。
　上記工程（ｉ）の化合物Ａの結晶を析出させる方法としては、化合物を析出させる方法であればいずれでもよいが、好ましくは、溶媒留去により水溶液を濃縮し、再度溶媒を添加する方法が挙げられる。
　上記工程（ｊ）において、結晶を取得する方法としては、加圧濾過、吸引濾過、遠心分離等を挙げることができる。さらに母液の付着を低減し、結晶の品質を向上させるために、適宜、結晶を洗浄することができる。洗浄した結晶は、減圧乾燥、流動層乾燥、通風乾燥等により乾燥させ、最終製品を得ることができる。
　本発明の化合物Ａの非結晶性ジアステレオマー塩は、以下に記す（ａ）～（ｌ）の工程を含む方法によって得ることができる。
（ａ）化合物Ａ及びクエン酸を含む、ｐＨ２．０以下の水溶液に、炭酸カルシウムを添加して、クエン酸カルシウムを析出させる工程、
（ｂ）水溶液から、クエン酸カルシウムを除去する工程、
（ｃ）水溶液に硫酸を添加して、ｐＨ２．０以下として硫酸カルシウムを析出させる工程、
（ｄ）水溶液から、硫酸カルシウムを除去する工程、
（ｅ）水溶液を濃縮して、化合物Ａの結晶を析出させる工程、
（ｆ）水溶液から、化合物Ａの結晶を除去する工程、
（ｇ）水溶液に有機溶媒を添加して、化合物Ａの結晶及びクエン酸カルシウムを析出させる工程、
（ｈ）水溶液と有機溶媒の混合液から、化合物Ａの結晶及びクエン酸カルシウムを除去する工程、
（ｉ）水溶液と有機溶媒の混合液を脱水して、化合物Ａの結晶を析出させる工程、
（ｊ）水溶液から、化合物Ａの結晶を除去する工程、
（ｋ）水溶液に、金属塩またはアミノ酸塩、並びにアルコールを添加して、化合物Ａの非結晶性ジアステレオマー塩を析出させる工程、及び、
（ｌ）化合物Ａの非結晶性ジアステレオマー塩を取得する工程。
　上記工程（ａ）で使用する化合物Ａ及びクエン酸を含む、ｐＨ２．０以下の水溶液は、例えば、次のようにして製造する。クエン酸一水和物とＬ－アスパラギン酸を加熱下反応させ、化合物Ａを生成させる。化合物Ａは、酵素反応法、発酵法など、合成法以外の方法により製造された化合物Ａであってもよい。反応終了後、反応液を冷却放置して、酸性条件下でメタノールを加える。メタノール水溶液の濃度は、Ｌ－アスパラギン酸が析出する濃度であればいずれでもよいが、例えば、６０v/v％溶液である。反応液に含まれる未反応のクエン酸及びＬ－アスパラギン酸のうち、Ｌ－アスパラギン酸が析出沈殿するので、遠心分離によって固液分離する。なお、この工程では、メタノールを加えることが重要である。エタノールは不可である。以降の工程には、化合物Ａ及びクエン酸を含む固液分離後の水溶液を用いる。工程（ａ）で使用する化合物Ａ及びクエン酸を含むｐＨ２．０以下の水溶液は、ｐＨが好ましくは、０．６～１．８、最も好ましくは１．０～１．６の水溶液であってもよい。
　本方法により化合物Ａの結晶を得るに際して困難な点は、化合物Ａ及びクエン酸を含む水溶液からクエン酸を除外することである。本発明者らは、クエン酸を塩の形にして除外することを思いつき、種々の金属イオンからなる塩を用いて試行錯誤を重ねた結果、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）でクエン酸をうまく除去することができることを見いだした。更に、本発明者らは、カルシウム塩であっても、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を用いた場合には、酸性条件においてクエン酸をうまく除去することができず、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を用いた場合には、酸性条件でもクエン酸を首尾よく除去することができることも見いだした。これは、炭酸カルシウムの炭酸イオン（ＣＯ３ ２－）がＣＯ２になって、カルシウムイオンの相手のアニオンがなくなるので、クエン酸イオンとカルシウムイオンが結合しやすくなるためであると考えられる。したがって、工程（ａ）において炭酸カルシウムを用いることは必須の条件である。
　上記工程（ｂ）におけるクエン酸カルシウムの除去及び工程（ｄ）における硫酸カルシウムの除去は、例えば、遠心分離あるいは濾過によって行うことができる。
　上記工程（ｃ）において、硫酸を用いる理由としては、化合物Ａがアルカリに弱いことと硫酸カルシウムの溶解性が低いためにカルシウムイオンを除去しやすい（即ち、脱塩が容易である）ことが挙げられる。ｐＨ２．０以下とすることで、化合物Ａのカルシウム塩として存在していたカルシウムイオンが化合物Ａと乖離して、硫酸カルシウムとなる。このときのｐＨとしては１．０～２．０が良く、より好ましくは１．３～１．８が良い。ナトリウム塩（硫酸ナトリウム）やカリウム塩（硫酸カリウム）を用いた場合には脱塩は難しい。
　上記工程（ｅ）における水溶液を濃縮する方法として、具体的には、加熱濃縮、減圧濃縮等を例示することができるが、熱による混入成分の変質あるいは分解を防止するためには、減圧濃縮によることが好ましい。
　上記工程（ｆ）において、結晶を除去する方法としては、加圧濾過、吸引濾過、遠心分離等を挙げることができる。
　上記工程（ｇ）及び工程（ｈ）は、化合物Ａのジアステレオマー塩の高純度化に必須の工程である。その訳は、工程（ｆ）において化合物Ａの結晶を除去した後の水溶液にはまだ結晶化する化合物Ａが残存しているからである。
　上記工程（ｇ）において添加する有機溶媒としては、水と混和し、化合物Ａを一定量溶解することができる有機溶媒が好ましく、具体的には、アセトン等を例示することができる。
　上記工程（ｈ）におけるクエン酸カルシウムの除去は、例えば、遠心分離あるいはろ過によって行うことができる。
　上記工程（ｉ）の化合物Ａの結晶を析出させる方法としては、化合物を析出させる方法であればいずれでもよいが、好ましくは、溶媒留去により水溶液を濃縮し、再度溶媒を添加する方法が挙げられる。
　上記工程（ｊ）において、結晶を除去する除去する方法としては、例えば、遠心分離、加圧濾過、および吸引濾過を挙げることができる。上記工程（ｊ）の段階で、結晶性の化合物Ａはほとんど除去されている。
　上記工程（ｋ）において添加する金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、およびカルシウム塩等が挙げられ、最も好ましくは、カルシウム塩（例として、塩化カルシウム、酢酸カルシウム）を用いることができる。また、水溶液のｐＨは酸性が好ましく、特にｐＨ３．６以下が最も好ましい。
　上記工程（ｋ）において添加するアミノ酸塩としては、アルギニン塩、シトルリン塩、オルニチン塩、及びヒスチジン塩からなる群より選ばれるアミノ酸塩、例えば、Ｌ－アルギニン塩酸塩、Ｌ－シトルリン塩酸塩、Ｌ－オルニチン塩酸塩、及びＬ－ヒスチジン塩酸塩を挙げることができる。
　上記工程（ｋ）において添加するアルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール等を挙げることができ、例えば、エタノールまたはメタノールを用いることができる。化合物Ａのジアステレオマー塩を析出させる効率は、エタノールの方がメタノールよりも良い。
　本発明に係る化合物Ａは、クエン酸とＬ－アスパラギン酸及び／又はＬ－アスパラギン（最も好ましくは、Ｌ－アスパラギン酸）を出発物質として合成することができる。この場合、合成された化合物Ａは、ジアステレオマー２種の混合物からなる。以下の手順によれば、化合物Ａの結晶化及び化合物Ａの非結晶性ジアステレオマー塩の析出を連続的に行うことができる。なお、以下の工程においては、上記に記載した対応する工程の条件を用いてもよい。
（１）クエン酸一水和物とＬ－アスパラギン酸及び／又はＬ－アスパラギン（最も好ましくは、Ｌ－アスパラギン酸）を加熱下反応させ、化合物Ａを生成させる。加熱温度と反応時間は、種々の条件を考慮して決めることができる（例えば、１２１℃、８時間）。
（２）反応終了後、反応液を冷却放置して、酸性条件下でメタノールを加える（例えば、６０％メタノール溶液）。反応液に含まれる未反応のクエン酸及びＬ－アスパラギン酸のうち、Ｌ－アスパラギン酸が析出沈殿するので、遠心分離あるいはろ過によって固液分離する。分離されたＬ－アスパラギン酸は再利用することが可能である。なお、この工程では、メタノール以外に、エタノールやイソプロパノールを加えても、Ｌ－アスパラギン酸を除去できるが、後に添加する炭酸カルシウムの溶解性においてメタノールが最適である。
（３）得られた化合物Ａ及びクエン酸を含むメタノール溶液に精製水を加えて希釈し（例えば２倍希釈する。）、次いで炭酸カルシウム粉末（例えば、反応液１ｍＬあたりに２２８ｍｇ）を加える。これによって、反応液が発泡し、クエン酸カルシウムが沈殿する。沈澱したクエン酸カルシウムは、遠心分離またはろ過によって固液分離する。クエン酸カルシウムを除去した反応液は、カルシウムイオンを含む化合物Ａのメタノール溶液である。
（４）（３）で得られた反応液を濃縮してメタノールを留去し、精製水を加えて当初の反応液の容量にする。これに、例えば１Ｍの硫酸を加えてｐＨ２．０以下ｐＨ１．３以上とすると、カルシウムイオンが硫酸カルシウムとなって沈殿する。沈澱した硫酸カルシウムは、遠心分離またはろ過によって固液分離する。固液分離後の反応液は、化合物Ａを含む硫酸酸性溶液である。
（５）この硫酸酸性溶液を、例えば２／５程度に濃縮すると、化合物Ａの結晶（「結晶化化合物Ａ」と称する）が晶出するので、分離し、残りを結晶母液とする。
（６）硫酸酸性の結晶母液を濃縮し、アセトンを加えて化合物Ａのアセトン溶液（酸性）（例えば、８０％アセトン溶液）とすると、飴状沈降物が析出し、後に結晶化する（クエン酸カルシウム）。当該クエン酸カルシウムを遠心分離またはろ過によって固液分離する。
（７）固液分離後の結晶母液を濃縮し、脱水処理（アセトン脱水）を行う。脱水処理後の結晶母液にアセトンを加え、溶媒中のアセトンを、例えば９０％以上にすると化合物Ａが結晶化して沈澱する。結晶化した化合物Ａ（「結晶化化合物Ａ」と称する）を遠心分離またはろ過によって固液分離する。
（８）化合物Ａのアセトン溶液に精製水を加えてアセトンを留去する。アセトン留去後の化合物Ａの水溶液に、塩化カルシウム及び水酸化カルシウムを加えて、例えばｐＨ３.６とし、次いでエタノール（例えば、７０％エタノール水溶液）を加えると、化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーのカルシウム塩が沈澱する。この沈殿物（非結晶化合物Ａ（Ｃａ塩））と称する）を遠心分離またはろ過によって固液分離する。
　上記の工程（５）で得られる結晶化化合物Ａ（水溶液中結晶）及び工程（７）で得られる結晶化化合物Ａ（アセトン中結晶）は、各々以下の操作を行って保存する。
水に再溶解⇒再結晶⇒ＨＰＬＣによる定性分析での純度評価⇒乾燥⇒保存
　上記の工程（８）で得られる非結晶化合物Ａ（Ｃａ塩）は、各々以下の操作を行って保存する。
水に再溶解⇒濃縮（沈澱したクエン酸カルシウムを除去）⇒化合物Ａの水溶液にエタノール（例えば、９０v/v％エタノール水溶液）を添加⇒再沈降⇒ＨＰＬＣによる定性分析での純度評価⇒乾燥⇒保存
　得られた非結晶化合物Ａ（Ｃａ塩）は、使用時には、硫酸酸性にしてカルシウムを除去することができ、ＨＰＬＣによる定性および定量分析にて化合物Ａとして濃度を評価することができる。
　以下、本発明について実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。
［実施例１］
（化合物Ａの合成）
　２４０ｇのクエン酸（一水和物、和光純薬工業）（１．１４２ｍｏｌ）に水を加えて４００ｍＬの濃厚なクエン酸溶液を調製し、この溶液に７２ｇのＬ－アスパラギン酸（和光純薬工業）（０．５４１ｍｏｌ）を加え、メスアップして液量を６００ｍＬとした（クエン酸最終濃度：１．９０３ｍｏｌ／Ｌ、Ｌ－アスパラギン酸最終濃度：０．９０２ｍｏｌ／Ｌ）。この反応液を耐圧ガラス容器に入れて密栓し、９０℃の水浴中で加温し、添加したＬ－アスパラギン酸を可能なかぎり溶解した。次に、加温して８０℃程度にしたオートクレーブ内に、この耐圧容器内の反応液を入れ、１２１℃で１２０分間加熱処理した。オートクレーブ内の温度が約８０℃にまで冷却したら、耐圧容器内の反応液を取り出して撹拌し、溶け残ったＬ－アスパラギン酸を可能なかぎり溶解した。さらに、同反応液をオートクレーブで１２１℃、１２０分間加熱処理をした。この撹拌と加熱処理を繰り返し、Ｌ－アスパラギン酸を溶解させながら、合計４２０分の１２１℃の加熱処理を行った。（Ｌ－アスパラギン酸は３６０分の加熱が終了した時点で完全溶解した。）この反応液中には、化合物Ａが合成されていることを下記の実施例２に記載のＨＰＬＣによる定性分析にて確認した（図１）。図１は、化合物Ａ合成反応液のＨＰＬＣクロマトグラム（１６０倍希釈）を示す。図１から明らかな通り、加熱反応後の合成反応液には化合物Ａのピーク（ＲＴ ２６．０）が出現し、クエン酸（ＲＴ ２７．７）のピークの高さが減少した。なお、後の解析により、ＲＴ２６．０のピークが化合物Ａであることを確認した。なお、合成原料のアスパラギン酸は、２１０ｎｍの吸光がほとんど見られないため、この検出系では検知されない。
［実施例２］
（化合物ＡのＨＰＬＣによる定性分析の分離条件）
　合成反応液ならびにその精製試料に存在する化合物Ａは、下記の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による定性分析により、その存在を確認した。様々な濃度の化合物Ａを含む溶液は、適切な濃度となるように１０ｍＭ過塩素酸水溶液（ＨＰＬＣによる定性分析の移動相）で希釈し、メンブレンフィルターで不溶物を除去して、希釈液を高速液体クロマトグラフィーで分析した。ＨＰＬＣによる定性分析の分離条件は以下に記載の通りであった。クロマトグラム中の化合物Ａと思われる目的成分は、保持時間（ＲＴ）２５．４～２６．０分のピークである。
［ＨＰＬＣによる定性分析の分離条件］
装置：島津製作所　高速液体クロマトグラフ　Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＲＳｐａｋ　ＫＣ－８１１（３００ｍｍ×８．０ｍｍ）を２本連結
移動相：１０ｍＭ過塩素酸水溶液
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
注入量：２０μＬ
検出波長：２１０ｎｍ
［実施例３］
（化合物Ａの精製と化合物Ａの結晶化）
　上記の加熱反応後の反応液６００ｍＬに対して、メタノール（和光純薬）９００ｍＬを加えて、６０％メタノール溶液とすると、反応液中の未反応なＬ－アスパラギン酸が徐々に析出し、白色沈殿として沈降する。なお、当該工程においてエタノール溶液を使用した場合、以降の工程において同様の工程を採用しても化合物Ａは結晶化しなかった。この溶液を室温で一昼夜静置して、可能なかぎりＬ－アスパラギン酸を沈降させた後に、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｎｏ．１１４）にてろ過を行い、沈降物と化合物Ａを含む反応液（６０％メタノール）を分離した。沈降物として得られたＬ－アスパラギン酸は、メタノールを気化除去し、乾燥させると化合物Ａ合成の合成原料として再利用できる。ろ液として得られた化合物Ａを含む反応液（６０％メタノール）を精製水（日本薬局方精製水）で２倍希釈して、３０％メタノール溶液とした。その溶液に、炭酸カルシウム（和光純薬工業）の粉末１３６ｇ（出発反応液１ｍＬあたり２２８ｍｇ）を撹拌しながら徐々に加えていくと、溶解度の低いクエン酸カルシウムの白色沈殿が析出する。最初は発泡（炭酸ガス）しながら炭酸カルシウムが溶解するが、後に徐々に溶液から溶解度の低いクエン酸カルシウムが析出する。この溶液を一昼夜静置すると、未反応のクエン酸がほとんどクエン酸カルシウムとして沈降し、濃厚な白濁液となる。遠心分離（室温、１５００×ｇ、３０分）により、この白濁液を沈降物とその上清溶液に分離して、化合物Ａを含む上清溶液（３０％メタノールを含む）を回収した。回収した上清溶液を、エバポレーター（東京理科機械）で濃縮しながらメタノールを留去し、濃厚な飴状溶液とした。濃縮した化合物Ａを含む飴状溶液に精製水を加えて出発反応液とおなじ６００ｍＬとした。この溶液に１ｍｏｌ／Ｌ（２Ｎ）硫酸を徐々に加えて溶液ｐＨが１．３～１．６となると、溶液中のＣａイオンが、硫酸カルシウム塩として析出し、沈降する。この沈降物をろ過により除去し、ろ液を回収した。このろ液には化合物Ａを含み、硫酸酸性である。この溶液（約６００ｍＬ）を４０℃の水浴中で加温しながらエバポレーターで濃縮し、容量を約２５０ｍＬ（～２００ｍＬ）とした。溶液を化合物Ａ結晶化の母液として室温まで冷却し、ガラス壁面をスパーテル等で擦過すると結晶性の化合物Ａ析出物が出現し、そのまま一昼夜静置すると、白色の沈降物が得られた。この沈降物をろ過により母液溶液と分離し、少量の精製水で洗浄した後に回収して、化合物Ａ結晶を得た。
　上記の合成反応液から一連の精製、結晶性化合物Ａの晶出の操作までを繰り返し行い、３Ｌの合成反応液から化合物Ａの結晶を約１３０ｇ（湿重量）を得た。極少量の結晶（種結晶）を取り置き、残りの結晶をなるべく少量の精製水に溶解し（４０℃の温浴中）、この溶液をエバポレーターで高度に濃縮した後、冷却し、種結晶を溶液に加えて再度結晶を得た。この結晶を吸引ろ過で分取し、乾燥させ、１１３ｇの結晶化した化合物Ａを得た。得られた化合物Ａ結晶の精度を確認するため、合成溶液中の化合物Ａの確認（図１）と同様のＨＰＬＣによる定性分析で評価を行った（図２）。図２は、水溶液中で結晶化した化合物Ａ結晶のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。具体的には、加熱反応後の合成反応液から精製した化合物Ａを水溶液中で結晶化し、その結晶を再結晶で精製した後、ＨＰＬＣで評価した。結晶化した化合物Ａを７０ｍｇ秤量し、精製水１ｍＬに溶解した。この溶液をＨＰＬＣ分析系の移動相溶媒（１０ｍＭ過塩素酸溶液）で１６０倍希釈し、分析した。化合物Ａの明確なピークがみられ、不純物となるその他のピークはほとんど痕跡程度で明確ではなく、高度に精製されていることを確認した。
　また、化合物Ａの非結晶は吸湿性があり、濃縮固形化しても吸湿して粘性が非常に高い（飴状）形態に変化し、扱いにくいものであった。一方、化合物Ａの結晶は吸湿性のない紛体であり、取扱いし易かった。
［実施例４］
（非結晶性化合物Ａの精製）
　上述の方法で化合物Ａの結晶を分取し、ろ液として得られる結晶母液となった溶液を使用して、結晶化しない化合物Ａの精製材料とした。この溶液には、ＨＰＬＣによる定性分析で、化合物Ａが残存していることを確認した（図３）。図３は、化合物Ａを晶出した後、ろ過により結晶を分取したろ液のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ろ液をＨＰＬＣによる定性分析の移動相（１０ｍＭ過塩素酸溶液）で４００倍希釈し、分析した。化合物Ａのピークがメインのピークとしてみられ、不純物となる他の成分のピークも確認された。
　３Ｌの合成反応液から得た、結晶母液溶液約１Ｌを４０℃の水浴中でエバポレーターを用いて濃縮し、約２００ｍＬの粘度の高い濃縮液を得た。この濃縮液に約８００ｍＬのアセトン（和光純薬工業）を加えて混和すると、白濁し、約１時間後には白濁成分が沈降して飴状の液体析出物が沈降した。上清と飴状析出物を分離した。飴状析出物からはクエン酸カルシウムを含む結晶性の析出物が得られた。上清は再度エバポレーターを用いて濃縮し、粘度の高い濃縮溶液とした。この溶媒留去による濃縮とアセトン溶解を３回繰り返し、溶液中の水分をアセトンに置換する処理（アセトンによる溶液の脱水）を行った。このアセトン脱水の過程で、水分の減少とともに徐々に白色の結晶性の析出物が増加した。最終的に５００ｍＬのアセトン溶液とし、この溶液を一昼夜静置すると、白色の結晶性の析出物が沈降した。この沈降物と上清のアセトン溶液をろ過によって分離した。後の分析で、この白色の析出物は、結晶性の化合物Ａであることが分かった（図４）。図４は、アセトン中で結晶化した化合物Ａを再結晶により精製した結晶のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。具体的には、ろ過した結晶を精製水で再結晶して精製し、再結晶した結晶（約２０ｍｇ）を精製水（約０．５ｍＬ）に溶解し、この溶液をＨＰＬＣによる定性分析の移動相（１０ｍＭ過塩素酸溶液）で４０倍希釈し、分析した。明確な化合物Ａのピークがみられ、不純物のピークは痕跡程度で明確ではなかった。ここまでの処理で結晶母液溶液の結晶性の化合物Ａジアステレオマーがほとんど晶出し、アセトン溶液中に溶存している化合物Ａは、そのほとんどが非結晶性である化合物Ａのジアステレオマーとなった。
　次に、非結晶性である化合物Ａのジアステレオマーを含むアセトン溶液に精製水５００ｍＬを加えて、エバポレーターでアセトンを留去する操作を３回繰り返し、溶液溶媒を水に変換した。この水溶液（溶液容量約２００ｍＬ）に塩化カルシウム１００ｇを加え、さらに水酸化カルシウムを加えて溶液ｐＨを３．６とした。この処理により、酸性物質である化合物Ａをカルシウム塩に誘導した。溶液容量を３００ｍＬとなるように精製水でメスアップし、７００ｍＬのエタノールを加えて、７０％エタノール溶液とすると、化合物Ａのカルシウム塩が白色沈降物として析出する。この沈降物を遠心分離により上清溶液と分離し、さらに沈降物を７０％エタノールで洗浄して精製し、精製沈降物（非結晶化合物ＡのＣａ塩（１））を得た。一方、７０％エタノールとした上清溶液をＨＰＬＣによる定性分析で確認すると、その溶液中に化合物Ａが残存していたため、より強く化合物ＡをＣａ塩に誘導する条件として溶液のｐＨを６．０に調製し、８０％エタノール溶液として沈降物を得た。この沈降物を８０％エタノールで洗浄し、精製沈降物とした（非結晶化合物ＡのＣａ塩（２））。
　上記の操作によりｐＨ３．６で得た精製沈降物とｐＨ６．０で得た精製沈降物をそれぞれＨＰＬＣによる定性分析で評価した（図５、図６）。各沈降物（約１０ｍｇ）を精製水（約１ｍＬ）に溶解し、ＨＰＬＣによる定性分析の移動相である１０ｍＭ過塩素酸水溶液で４０倍に希釈して、分析した（酸性溶媒である１０ｍＭ過塩素酸水溶液で希釈されることで、化合物ＡのＣａ塩は化合物Ａに変換され、化合物Ａとして検出される）。図５は、ｐＨ３．６で析出した沈降物のＨＰＬＣクロマトグラムであり、図６は、ｐＨ６．０で析出した沈降物のＨＰＬＣクロマトグラムである。ｐＨ３．６で得た精製沈降物（非結晶化合物ＡのＣａ塩（１））のＨＰＬＣクロマトグラムでは、不純物のピークが見られるものの、化合物Ａのメインピークが強く観察され、精製されている。一方、ｐＨ６．０で得た精製沈降物（非結晶化合物ＡのＣａ塩（２））のＨＰＬＣクロマトグラムでは、化合物Ａのピークとともに、化合物Ａのイミド構造の一部が加水分解してアミド化した化合物（化合物Ａのピークの左肩に重なるピーク）の混入がみられ（ピーク２）、またクエン酸と思われるピーク（ピーク３）が増加していた。従って、ｐＨ６．０のアルカリ添加量では化合物Ａの加水分解が進行したものと考えられ、化合物ＡのＣａ塩を析出させる条件として過酷すぎると考えられた。ｐＨ３．６で析出させた化合物ＡのＣａ塩では、化合物Ａの加水分解物の混入はごく微量であることから、ｐＨ３．６がアルカリ条件としての限界であると考えられた。
　このエタノール溶液中で析出する化合物ＡのＣａ塩の沈降物は水に溶解し、硫酸酸性（例えば、ｐＨ１．３）とすることで硫酸カルシウムを析出させれば、カルシウム分を除去でき、化合物Ａの硫酸酸性溶液として調製が可能である。この精製のプロセスで、３Ｌの合成反応液から、ｐＨ３．６で得た精製沈降物である非結晶化合物ＡのＣａ塩（１）の乾燥固体として１９２．７ｇを得た。
［実施例５］
（化合物ＡジアステレオマーのＨＰＬＣによる定性分析）
　上記の化合物Ａ合成溶液からの精製処理によって得られた精製物の化合物Ａのジアステレオマーの存在比率は、下記のカラムを用いたＨＰＬＣによる定性分析により確認することができる。様々な濃度の化合物Ａを含む溶液は、適切な濃度となるように０．１％ＴＦＡ水溶液（９８容量）とメタノール（２容量）の混合液（ＨＰＬＣによる定性分析の移動相）で希釈し、メンブレンフィルターで不溶物を除去して、高速液体クロマトグラフィーにより分析した。ＨＰＬＣによる定性分析の条件は以下に記載の通りであった。クロマトグラム中の化合物Ａと思われる目的成分は、保持時間（ＲＴ）３．３～３．７分の領域に２つの隣接するピークとして検出される（ただし、カラム充填剤の劣化等の影響によりＲＴは、若干変わることがある）。結晶性の化合物Ａジアステレオマーはカラムでの保持時間が長い右側のピークとして検出され、非結晶性の化合物Ａジアステレオマーは保持時間が短い左側のピークとして検出される。
［ＨＰＬＣによる定性分析の分離条件］
装置：島津製作所　高速液体クロマトグラフ　Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ　Ｋｉｎｅｔｅｘ　Ｆ５（１００ｍｍ×４．６ｍｍ）
移動相：０．１％ＴＦＡ水溶液（９８容量）とメタノール（２容量）の混合液
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
注入量：５μＬ
検出波長：２００ｎｍ
［実施例６］
（化合物Ａ含有サンプルのジアステレオマー分析結果）
　上記のカラムを用いたＨＰＬＣによる定性分析により、化合物Ａ合成溶液からの各精製サンプルにおけるジアステレオマーの存在状態を確認した。
（１）化合物Ａ合成溶液
　化合物Ａの合成溶液から未反応のアスパラギン酸およびクエン酸の大部分を除去して粗精製した化合物Ａ合成溶液中の化合物Ａジアステレオマーの存在状態を確認した（図７）。図７は、粗精製した化合物Ａ合成溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。化合物Ａの２つのジアステレオマーは、隣接する２本のピークとして検出され、その存在比率はほぼ均等である。
（２）化合物Ａ結晶
　化合物Ａの合成溶液から精製し、水溶液中で結晶化した化合物Ａ結晶を精製水に溶解し、化合物Ａジアステレオマーの存在状態をＨＰＬＣによる定性分析で評価した。（図８）。図８は、水溶液中で結晶化した化合物ＡのＨＰＬＣクロマトグラム（図２と同じサンプル由来の分析結果）を示す。結晶性の化合物Ａは、２つの化合物Ａジアステレオマーが検出される領域のうち、保持時間が長い右側のピークとして検出され、その存在比率はピーク面積比で９９％以上であった。他方のジアステレオマーの混入比率は０．３６％（ピーク面積比より算出）であった。
（３）アセトン中で結晶化した化合物Ａ結晶
　化合物Ａの合成溶液から精製し、アセトン中で結晶化した化合物Ａ結晶を精製水に溶解し、化合物Ａジアステレオマーの存在状態をＨＰＬＣによる定性分析で評価した。（図９）。図９は、アセトン中で結晶化した化合物ＡのＨＰＬＣクロマトグラム（図４と同じサンプル由来の分析結果）を示す。アセトン中で結晶化した化合物Ａ結晶も、水溶液中で結晶化した化合物Ａと同様に、２つの化合物Ａジアステレオマーが検出される領域のうち、保持時間が長い右側のピークとして検出された。その存在比率はピーク面積比で９８％以上であった。他方のジアステレオマーの混入比率は１．３６％（ピーク面積比より算出）であった。
（４）ｐＨ３．６で７０％エタノールにより沈降した非結晶化合物ＡのＣａ塩（非結晶化合物ＡＣａ塩（１））
　化合物Ａの合成溶液から結晶化する化合物Ａを晶出させた後、溶液に残った非結晶化合物Ａを、ｐＨ３．６の条件でＣａ塩とし、７０％エタノール中で析出させた沈降物の化合物Ａのジアステレオマーの存在状態をＨＰＬＣによる定性分析で評価した。（図１０）（図５のサンプルと同じ析出物サンプル）。図１０は、ｐＨ３．６で析出した非結晶性化合物ＡＣａ塩（非結晶化合物ＡＣａ塩（１））のＨＰＬＣクロマトグラム（図５と同じサンプル由来の分析結果）を示す。７０％エタノール中に析出した沈降物を精製水に溶解し、ＨＰＬＣにて定性分析を実施したところ、２つの化合物Ａジアステレオマーが検出される領域のうち、保持時間が短い左側のピークとして検出された。このピークは結晶性の化合物Ａピークとは明らかに異なるＲＴのピークとして検出された。その存在比率はピーク面積比で９９％以上であった。他方のジアステレオマー（結晶性化合物Ａ）の混入比率は０．４５％（ピーク面積比より算出）であった。
（解説：各クロマトグラムにおけるピークは後方にテーリング（ピークの裾が延びて広がる現象）しているので、混入ピークのピーク高さの見た目より、ピーク面積比が小さい）
［実施例７］
（イオン交換クロマトグラフィーによる化合物Ａの結晶の製造）
１．出発物質の精製
１－１．出発物質の調製
　７５ｇのクエン酸（一水和物）（０．５９ｍｏｌ）に水を加えて８３．３ｍＬの濃厚なクエン酸溶液を調製し、この溶液に１０ｇのＬ－アスパラギン（０．１１１ｍｏｌ）と、１．５ｇのＬ－アスパラギン酸（０．０１９ｍｏｌ）を加え、メスアップして液量を１００ｍＬとした。この反応液を耐圧ガラス容器に入れて密栓し、９０℃の水浴中で加温し、添加したＬ－アスパラギンやＬ－アスパラギン酸を完全溶解した。次に、加温して８０℃程度にしたオートクレーブ内に、この耐圧容器内の反応液を入れ、１２１℃で１８０分間加熱処理した。反応後、上記反応液を２５℃まで自然冷却した後、１Ｌのビーカーに反応液を取り出し、氷冷した。
　約２０ｇの水酸化ナトリウムを８３ｍＬの精製水に溶解し、この水酸化ナトリウム水溶液を氷冷し、上記の反応液に徐々に加えて、反応液をｐＨ５．８に中和した（中和熱で発熱するため２５℃になるのを確認しながら中和した）。中和後に反応液の容量を精製水で２００ｍＬとした。次に、３３．３ｇの塩化カルシウム（二水和物）を０．３３Ｌの精製水に溶解し、塩化カルシウム溶液を調製し、その約半量を上記の反応液に加えて、よく撹拌し、約１６時間静置した。溶液には白色に沈降物（クエン酸カルシウム）が析出した。さらに塩化カルシウム溶液を加えると白色沈降物が新たに沈降したので、徐々に塩化カルシウム溶液を追加して、２００ｍＬの中和した反応液に、上記の塩化カルシウム溶液を約３３３ｍＬ（塩化カルシウム量で、０．２３ｍｏｌ）加えた。この混合溶液に精製水を加えて全量を６００ｍＬとし、その後にクエン酸カルシウムである白色沈降物を遠心分離により除去し、上清を回収した。次に、この上清４３０ｍＬをエバポレーター（熱を加えたくないため、湯温は２５℃で実施）で１３３ｍＬに濃縮した。濃縮した水溶液に３１０ｍＬのエタノールを加えて撹拌した。しばらく静置すると、エタノールを加えた混合液は２層に分離し、比較的透明な上層（エタノール層）と、着色が見られ粘性のある下層溶液５０ｍＬとに分かれた。下層を分液回収し、精製水で１３０ｍＬ程に希釈した後、エバポレーター（熱を加えたくないため、湯温は２５℃で実施）で溶液中に残存するエタノールを留去し５５ｍＬとした。この溶液を遠心分離し上清４５ｍＬを得た。この上清を凍結乾燥したところ３２．６７ｇであった。これを出発物質とした。
１－２．イオン交換カラムクロマトグラフィー（ＳｕｐｅｒＱ）
　上記方法によって調製した出発物質２８０ｍＬ（水溶液、固形分２３５ｇ）を精製水１Ｌに溶解し、２５％アンモニア水約１３ｍＬ、精製水１９Ｌを順に加えてｐＨ及び導電率を調整し、導入サンプル（ｐＨ＝７．１、導電率＝８．４ｍＳ／ｃｍ）とした。これをイオン交換カラムクロマトグラフィー（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＳｕｐｅｒＱ－６５０Ｍ　φ１５０ｍｍ×５００ｍｍ）に供した。移動相と分取した各画分の詳細は図１１に示した。２つの目的物画分をそれぞれ凍結乾燥し、図１１中の表１に示したものを得た。２つの目的物画分（Ｆｒ（フラクション）８－１２及びＦｒ１３）の目的物推定含有量は５．４ｇと算出され、原料中の目的物推定含有量６４．１ｇからの回収率は８６．４％であった。なお、表１中におけるＬｏｔ．Ｎｏ．は前記２つの目的物画分に便宜的に付した番号である。
１－３．イオン交換カラムクロマトグラフィー（ＤＯＷＥＸ　５０Ｗ×８）、凍結乾燥による酢酸アンモニウム除去
　Ｆｒ８－１２（Ｌｏｔ　Ｎｏ．１９８－０１２－７４－１）７４０．２ｇを精製水約６００ｍＬに溶解し、イオン交換樹脂（ＤＯＷＥＸ　５０Ｗｘ８、Ｈ＋型、１００－２００ｍｅｓｈ）でバッチ処理後、凍結乾燥した。凍結乾燥品を再び精製水８００ｍＬに溶解し、２回に分け、イオン交換カラムクロマト（ＤＯＷＥＸ　５０Ｗｘ８、Ｈ＋型、１５０ｍｍ×２００ｍｍ）に導入した。導入後は精製水を送液し、目的物を含む画分を回収し、凍結乾燥した。乾燥残渣に精製水を加えて凍結乾燥を数回繰り返し、酢酸を低減させた。このとき、精製水中で結晶化したため、吸引ろ過により結晶と母液を分離した。それぞれ凍結乾燥後、以下のものを得た。
化合物Ａの結晶：１６．５ｇ（Ｌｏｔ　Ｎｏ．１９８－０１２－０７８－１　白色結晶、ＨＰＬＣクロマトグラム＝図１２を参照、１Ｈ　ＮＭＲスペクトル＝図１３を参照）
化合物Ａの結晶を分取した後の母液（化合物Ａを含む）：３６．１ｇ（Ｌｏｔ　Ｎｏ．１９８－０１２－０７８－２　乳白色アモルファス状、ＨＰＬＣクロマトグラム＝図１４を参照、１Ｈ　ＮＭＲスペクトル＝図１５を参照）
２．まとめ
　出発物質２８０ｍＬ（水溶液、固形分２３５ｇ）からイオン交換カラムクロマトグラフィーにより、以下のものを得ることができた。１Ｈ　ＮＭＲより算出した酢酸含有量及びＨＰＬＣ面積値より算出した目的物（化合物Ａ）の推定含有量を表１に示した。今回の精製プロセスで得られた３ロットの総目的物含有量は、５４．２ｇと算出され、出発物質（目的物推定含有量　６４．１ｇ）からの回収率は８４．５％であった。
　以上の様にイオン交換カラムクロマトグラフィーによる精製によって、化合物Ａの水溶液から、結晶を晶出することができることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
＊１　収率は出発物質の固形分２３５ｇを出発原料として算出した。
＊２　酢酸含有量は１Ｈ　ＮＭＲより算出した。
＊３　目的物推定含有量は今回得られた化合物Ａの結晶のピークを標準品として、ＨＰＬＣ面積値の１点検量線より算出した。
＊４　「ＨＰＬＣ純度」は、化合物Ａとしての純度を表す。
［実施例８］
（粉末Ｘ線回折）
　以下の方法によって、本発明の化合物Ａの結晶及び化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーを用いて粉末Ｘ線回折測定を行った。
１．目的
　上記実施例において得られた本発明の化合物Ａの結晶及び化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーが結晶質であるか、それとも非結晶質（アモルファス）であるかを確認する。
２．試料
　実施例７におけるカラム精製によって水溶液から得た化合物Ａの結晶（検体１）、実施例４におけるアセトン溶液から得た化合物Ａの結晶（種結晶として保存した再結晶していない結晶）（検体２）、及び実施例４における製造方法によって得た非結晶化合物Ａ（化合物Ａの非結晶性ジアステレオマー）のＣａ塩（１）（検体３）を資料として用いた。
３．分析方法
３．１．装置
（株）リガク製　ＲＩＮＴ－ＴＴＲIII型　広角Ｘ線回折装置
Ｘ線源　　　　　　；　ＣｕＫα　線
管電圧－管電流　　；　５０ｋＶ－３００ｍＡ
ステップ幅　　　　；　０．０２ｄｅｇ．
測定速度　　　　　；　５ｄｅｇ．／ｍｉｎ
スリット系　　　　；　発散　－　受光　－　散乱
　　　　　　　　　　　０．５ｄｅｇ．－０．１５ｍｍ－０．５ｄｅｇ．
　　　　　　　　　　　回折線湾曲結晶モノクロメーター
３．２．方法
　検体１～検体３の粉末をそのまま測定した。
４．結果
　図１６は、検体１（カラム精製によって水溶液から得た結晶）、検体２（アセトン溶液から得た結晶）及び検体３（非結晶性ジアステレオマーのＣａ塩）の各々の物質に関する粉末Ｘ線回折パターンの多重プロットによる比較を示す。更に、検体１の粉末Ｘ線回折ピークリストを表２に、検体２の粉末Ｘ線回折ピークリストを表３に示す。
　図１６（上段および中段）及び表２～表３から明らかな通り、検体１及び検体２は、粉末Ｘ線回折における回折パターンおいて明確なピークが観察され、結晶質の固体であることが確認された。また、検体１と検体２の粉末Ｘ線回折における回折パターンが一致していることから、両者は同一形状の結晶質であることも確認された。
　一方、図１６（下段）から明らかな通り、非結晶性ジアステレオマーをＣａ塩としてエタノールを加えて固形化したことにより得られた固体である検体３は、粉末Ｘ線回折パターンに明確なピークが確認されず、非晶質（非結晶性：アモルファス）の固体であることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
［実施例９］
（結晶性化合物Ａの立体配置の決定）
　以下の方法によって、単結晶Ｘ線回折による構造解析のための化合物Ａの単結晶を作製し、当該単結晶を用いて単結晶Ｘ線回折による構造解析を行った。
１．目的
　化合物Ａは、実施例３の段落［００４８］に記載の方法で合成すると、Ｌ－アスパラギン酸（Ｓ体）由来の構造に、クエン酸がイミド結合し、以下に示す２つのジアステレオマー（ＳＳ体とＳＲ体）が合成される。そのうちの一方は結晶化し、他方は結晶化しない性質を有する。この違いにより、２つのジアステレオマーはそれぞれ分離・精製が可能であったが、これまでどちらがＳＳ体であるのか、あるいはＳＲ体であるのかを特定できていなかった。この課題を解決するため、結晶性の化合物Ａの０．２ｍｍ角四方以上の大きさを有する単結晶を作製して、単結晶Ｘ線回折による構造解析を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　化合物Ａを実施例３の段落［００４８］に記載するような方法で、水やアセトンなどの溶媒中で結晶化させても、単結晶Ｘ線回折による構造解析を実施できるような大きさの単結晶は得られない。そこで、化合物Ａの単結晶を得るための溶媒系や晶出方法の検討を行い、単結晶Ｘ線回折による構造解析に使用可能なレベルの大きさの単結晶作製方法を確立して、解析を行った。
２．化合物Ａの単結晶作製の条件検討
　実施例３の段落［００４８］に記載の方法で合成、精製し、水溶液中で結晶化した化合物Ａの結晶について、実施例３の段落［００４９］に記載の再結晶によりさらに精製して得た化合物Ａを原料として、単結晶Ｘ線回折による構造解析のための単結晶作製の検討を行った。
　実施例３の段落［００４９］に記載の再結晶と同様の操作を３回繰り返し、高度に純粋化した化合物Ａの結晶性粉末を得た。この結晶性粉末１０ｇに１００ｍｌの精製水（日本薬局方精製水）を加えて、５０℃の水浴中で加温して溶解した。この溶液を０．２２μｍポアサイズのメンブレンフィルター（メルクミリポア）を使用してろ過し、ろ液を回収した。このろ液を４０℃の水浴上でエバポレーターを用いて濃縮し、５０ｍｌ程の溶液として回収した。この溶液は、濃縮と室温に冷却されることにより、過飽和状態となる。この溶液を加温状態（４０℃）のまま、下表（表４）に記載の溶媒比率となるように蓋つき試験管に分注し、混合溶媒の溶液を作製した。具体的には、４００μＬの過飽和溶液に、メタノールやエタノール、アセトンなどの有機溶媒を１００μＬ加えることで、溶媒中の水の比率が８０％の溶液とした。同様に、３００μＬ（水６０％）、２００μＬ（水４０％）、１００μＬ（水２０％）の過飽和溶液に、メタノールやエタノール、アセトンなどの有機溶媒を２００μＬ、３００μＬ、４００μＬを加えて、それぞれ溶媒中の水の比率が６０％、４０％、２０％となる混合溶媒溶液を作製した。水１００％の溶液は過飽和溶液をそのまま５００μＬ分注した。メタノール、エタノール、アセトンなどの有機溶媒１００％の溶液は、５０ｍｇの高度に純粋化した化合物Ａの結晶を試験管にとり、溶媒５００μＬを加えて、４０℃で加温して可能なかぎり溶解した。イソプロパノールと水の混合溶媒系では、イソプロパノールの比率が４０％以上では、化合物Ａの溶解性が低下し急速に沈降物が多く析出したため、イソプロパノールの混合溶媒系では４０％以上の検討は行わなかった。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　このように作製した化合物Ａの各溶液の試験管の蓋を閉めて密閉し、室温で一昼夜以上静置し過飽和状態から析出する化合物Ａを析出させた。各試験官を遠心分離（室温、３０００ｒｐｍ、１０分）して、析出物を沈降させ、各溶液の上清を別の清浄なプラスチック製蓋つき試験管に注意深く移し、各溶液の飽和溶液とした。各飽和溶液の試験管の蓋を閉めた状態で、そのプラスチック製の蓋に注射用針でピンホールをあけ、室温で静置し、そのピンホールからゆっくりと溶媒が蒸発することで化合物Ａの結晶が析出する。析出した結晶の形状や大きさ、経時的な結晶の成長の様子を観察して、化合物Ａの単結晶作製には、水とアセトンの混合溶媒系により結晶を晶出させる方法が適切であることが分かった。溶媒比率としてはアセトン比率４０％～８０％（水が６０％～２０％）が良く、特にアセトン比率６０％（水４０％）の飽和溶液を蒸発させて得られた結晶が最も良好であった。それ以外のアルコール系の溶媒系では多結晶化が起きやすく、あるいは結晶成長が悪く、単結晶Ｘ線回折に使用可能な単結晶は得られなかった。
３．化合物Ａの単結晶作製
　化合物Ａの単結晶Ｘ線回折による構造解析には、水‐アセトン（４０％‐６０％）混合溶媒の飽和溶液を入れた蓋つき試験管の蓋にピンホールを開けて、室温でゆっくり溶媒を蒸発させて得られた結晶を使用した。結晶は、晶出した単結晶が十分に成長するまで数日間の時間をかけて成長させ、かつ単結晶どうしが融合して多結晶化する前に回収を行った。結晶の回収手順としては、結晶を含む溶液を溶液ごとろ紙上に転倒滴下し、溶液をろ紙に吸収させ、ろ紙上に残った結晶を金属ニードルで拾い集めて回収した。回収した単結晶を、ルーペ拡大鏡下で観察し、単結晶Ｘ線回折による構造解析に使用できる大きさと形状を保持した単結晶を選抜し、単結晶Ｘ線回折による構造解析に供した。
４．化合物Ａの単結晶Ｘ線回折による構造解析
　結晶化した化合物ＡがＳＳ体、ＳＲ体のどちらであるのか、単結晶Ｘ線回折による構造解析を行った。上述の単結晶作製方法に従い作製した単結晶から、結晶性の良い角柱状の結晶（０．２ｍｍ×０．２ｍｍ×０．６ｍｍ）を採取した後、ガラスファイバー上にマウントし、グラファイトモノクロメータにより単色化したＣｕＫα線（λ＝１．５４１７８Å）を用いて、理学電機（株）製ＲＡＳＡ－７Ｒ型四軸回折装置にて測定を行った。
　格子定数は、５０．０＜２θ＜５８．８°の範囲における２５個の反射から最小二乗法で求めた。ω－２θ走査法により、回折角２θが１３６．１°以下の反射について測定を行った。全反射データの測定後、消滅則（系統的な反射強度の消滅）より空間群はＰ２１／ｃ（＃１４）であることが判った。測定データを表５に、結晶データを表６にまとめた。
［表５］　＜測定データ＞
使用した回折装置：理学電機（株）製　ＲＡＳＡ－７Ｒ型
走査方法：ω－２θ
走査幅：１．７９°＋０．３０°ｔａｎθ
走査速度（ω）：１６．０°／ｍｉｎ
データ収集範囲：２θｍａｘ　１３６．１°
測定反射数：２５５２
独立な反射数：１９０２
観測値として採用した基準：Ｉ＞３σ（Ｉ）
観測値として採用した反射数：１８９９
補正：ローレンツ因子及び偏光因子
消衰効果補正係数：４．２４０６０ｅ＋００１
［表６］　＜結晶データ＞
分子式：Ｃ１０Ｈ１１ＮＯ９＋Ｈ２Ｏ
分子量：２８９＋１８
晶系：単斜
空間群：Ｐ２１／ｃ（＃１４）
ａ：１１．６８５（２）Å
ｂ：１０．２６２（３）Å
ｃ：１１．１２９（２）Å
α：９０°
β：１０７．４６（１）°
γ：９０°
単位胞の体積：１２７３．２（４）Å３
使用したＸ線とその波長：ＣｕＫα線（λ＝１．５４１７８Å）
単位胞内の分子数：Ｚ４
密度の計算値：１．６０３ｇ／ｃｍ３
線吸収係数（ＣｕＫα）：１２．９９ｍ－１
試料結晶の形と寸法：角柱状（０．２０ｍｍ×０．２０ｍｍ×０．６０ｍｍ）
Ｆ（０００）：６４０．００
測定温度：２５℃
５．化合物Ａの結晶構造決定
　構造決定は規格化構造因子Ｅの絶対値が１．５２７より大きい２８０個の反射により直接法ＳＩＲ９２を用いて行った。最も高いＦｉｇｕｒｅ　ｏｆ　ｍｅｒｉｔ（ＦＯＭ＝１．４１６）を与える位相の組より計算したＥｍａｐと、フーリエによる構造拡張から全ての原子座標を求めることができた。精密化は反射強度Ｉが３σ（Ｉ）より大きい１８９９個の反射を用い、完全行列最小二乗法で行った。全反射の重率を等しくして計算したＲ因子は０．０５３に収束した。最終のＤフーリエ図における電子密度の最大値と最小値は０．２８及び、－０．２５ｅ－／Å３であった。原子散乱因子は“Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｔａｂｌｅｓ　ｆｏｒ　Ｘ－ｒａｙ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ”に記載された値を用い、全ての計算はＲｉｇａｋｕ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｉｇａｋｕ／ＭＳＣのｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｐａｃｋａｇｅであるＣｒｙｓｔａｌＳｔｒｕｃｔｕｒｅを用いて行った。この解析データを表７にまとめた。
［表７］　＜解析データ＞
近似構造の決定法：直説法（ＳＩＲ９２）
使用した最小二乗法：完全行列法
温度因子の種類：異方性温度因子
水素原子の取扱い：等方性温度因子
最終のＲ値、ｗＲ値：０．０５３，０．０４３（重率：１／σ２（Ｆｏ））
最終Ｄ　合成電子密度の最大値：０．２８ｅ－／Å３
最終Ｄ　合成電子密度の最小値：－０．２５ｅ－／Å３
使用したプログラムシステム名：ＣｒｙｓｔａｌＳｔｒｕｃｔｕｒｅ
　この解析の結果、結晶性の化合物Ａ（化合物Ａの結晶）はＲＳ表示法でＳＳ体、ＲＲ体のエナンチオマーであることが明らかになった。そして合成に用いたのが全てＬ－Ａｓｐ（Ｓ体）であることから、結晶性の化合物ＡはＳＳ体であることが分かった。そしてこれを受け、結晶化しない性質を持つ化合物ＡがＳＲ体であることも分かった。
　化合物Ａのジアステレオマー混合物は、肝障害抑制効果を有する活性物質であることがわかっているが、結晶性の化合物Ａと非結晶性の化合物Ａの生物体内における生理作用はこれまで未知であった。化合物Ａに限らず、ジアステレオマーのような類似した構造の有機化合物を分離するには、一般的に高分離能なカラムを使用して、高度な精製技術を要するプロセスが要求される。さらにこれらのカラムを使用した一般的な精製手法では、精製スケールを拡大することが難しく、大量供給には高額な費用を要することが多い。本願は、化合物Ａの一方のジアステレオマーのみが結晶化できる事実を確認し、その結晶化技術により安価で大量なジアステレオマーの精製方法を確立した。また、有機溶媒を用いて結晶性のジアステレオマーをほぼ完全に結晶化することにより、非結晶性のジアステレオマーも安価かつ大量に精製する手法を確立した。これにより、化合物Ａの精製したジアステレマー供給を分析レベルのスケールから、産業ベースに拡大できることが期待される。本発明により、化合物Ａの結晶及び極めて高純度な化合物Ａの非結晶質ジアステレオマーが、安価かつ大量に得られたことによって、医薬品製造の分野、機能性食品、健康食品を含む食品製造の分野等において、化合物Ａより効率的な応用が期待される。
 
 

Claims (24)

  1. 下記式（Ａ）で表される化合物（以下、化合物Ａという。）の結晶。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  2. 立体構造がＲＳ表示法でＳＳ体である、請求項１に記載の結晶。
  3. ＣｕＫα線をＸ線源とする粉末Ｘ線回折パターンにおいて、回折角（２θ）が、１１．７４±０．２０°、２９．２５±０．２０°、１８．３６±０．２０°、２１．７５±０．２０°、及び１５．９５±０．２０°、にピークを有する、請求項１に記載の結晶。
  4. 以下の（ａ）～（ｆ）の工程を含む、化合物Ａの結晶の製造方法。
    （ａ）化合物Ａ及び／又はその塩、並びにクエン酸及び／又はその塩を含む、ｐＨ５．０～８．５の水溶液を、陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通塔する工程、
    （ｂ）該カラムに溶出液を通塔し、クエン酸を含まないが、化合物Ａを含む水溶液を取得する工程、
    （ｃ）工程（ｂ）により得られた水溶液から、溶出液を除去する工程、
    （ｄ）溶出液を除去した水溶液を濃縮する工程、
    （ｅ）濃縮残渣に水を添加して水溶液とし、該水溶液を濃縮して、化合物Ａの結晶を析出させる工程、及び、
    （ｆ）化合物Ａの結晶を取得する工程。
  5. 化合物Ａの結晶の立体構造がＲＳ表示法でＳＳ体である、請求項４に記載の製造方法。
  6. 溶出液が、酢酸アンモニウム水溶液、塩化ナトリウム水溶液、及びギ酸アンモニウム水溶液からなる群より選ばれる溶出液である、請求項４又は５に記載の製造方法。
  7. 溶出液を除去する方法が、陽イオン交換樹脂を充填したカラムを使用する方法である、請求項４～６のいずれかに記載の製造方法。
  8. 濃縮する方法が、凍結乾燥である、請求項４～７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 以下の（ａ）～（ｆ）の工程を含む、化合物Ａの結晶の製造方法。
    （ａ）化合物Ａ及びクエン酸を含む、ｐＨ２．０以下の水溶液に、炭酸カルシウムを添加して、クエン酸カルシウムを析出させる工程、
    （ｂ）水溶液から、クエン酸カルシウムを除去する工程、
    （ｃ）水溶液に硫酸を添加して、ｐＨ２．０以下として硫酸カルシウムを析出させる工程、
    （ｄ）水溶液から、硫酸カルシウムを除去する工程、
    （ｅ）水溶液を濃縮して、化合物Ａの結晶を析出させる工程、及び
    （ｆ）化合物Ａの結晶を取得する工程。
  10. 化合物Ａの結晶の立体構造がＲＳ表示法でＳＳ体である、請求項９に記載の製造方法。
  11. 濃縮が、減圧濃縮である、請求項９又は１０に記載の製造方法。
  12. 化合物Ａの結晶を取得した後、以下の（ｇ）～（ｊ）の工程をさらに含む、請求項９～１１のいずれかに記載の製造方法。
    （ｇ）水溶液に有機溶媒を添加して、クエン酸カルシウムを析出させる工程、
    （ｈ）水溶液と有機溶媒の混合液から、クエン酸カルシウムを除去する工程、
    （ｉ）水溶液と有機溶媒の混合液を脱水して、化合物Ａの結晶を析出させる工程、及び、（ｊ）化合物Ａの結晶を取得する工程。
  13. 有機溶媒が、アセトンである、請求項１２に記載の製造方法。
  14. 以下の、（ａ）～（ｌ）の工程を含む、化合物Ａの非結晶性ジアステレオマー塩の製造方法。
    （ａ）化合物Ａ及びクエン酸を含む、ｐＨ２．０以下の水溶液に、炭酸カルシウムを添加して、クエン酸カルシウムを析出させる工程、
    （ｂ）水溶液から、クエン酸カルシウムを除去する工程、
    （ｃ）水溶液に硫酸を添加して、ｐＨ２．０以下として硫酸カルシウムを析出させる工程、
    （ｄ）水溶液から、硫酸カルシウムを除去する工程、
    （ｅ）水溶液を濃縮して、化合物Ａの結晶を析出させる工程、
    （ｆ）水溶液から、化合物Ａの結晶を除去する工程、
    （ｇ）水溶液に有機溶媒を添加して、化合物Ａの結晶及びクエン酸カルシウムを析出させる工程、
    （ｈ）水溶液と有機溶媒の混合液から、化合物Ａの結晶及びクエン酸カルシウムを除去する工程、
    （ｉ）水溶液と有機溶媒の混合液を脱水して、化合物Ａの結晶を析出させる工程、
    （ｊ）水溶液から、化合物Ａの結晶を除去する工程、
    （ｋ）水溶液に、金属塩またはアミノ酸塩、並びにアルコールを添加して、化合物Ａの非結晶性ジアステレオマー塩を析出させる工程、及び、
    （ｌ）化合物Ａの非結晶性ジアステレオマー塩を取得する工程。
  15. 化合物Ａの非結晶性ジアステレオマー塩の立体構造がＲＳ表示法でＳＲ体である、請求項１４に記載の製造方法。
  16. 有機溶媒が、アセトンである、請求項１４に記載の製造方法。
  17. 金属塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、及びカルシウム塩からなる群より選ばれる金属塩である、請求項１４～１６のいずれかに記載の製造方法。
  18. アミノ酸塩が、アルギニン塩、シトルリン塩、オルニチン塩、及びヒスチジン塩からなる群より選ばれるアミノ酸塩である、請求項１４～１６のいずれかに記載の製造方法。
  19. アルコールが、エタノールまたはメタノールである、請求項１４～１８のいずれか１項に記載の製造方法。
  20. 化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーまたはその塩。
  21. 立体構造がＲＳ表示法でＳＲ体である、請求項２０に記載の化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーまたはその塩。
  22. 塩が、化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーの金属塩またはアミノ酸塩である、請求項２０又は２１に記載の化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーまたはその塩。
  23. 金属塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、及びカルシウム塩からなる群より選ばれる金属塩である、請求項２２に記載の化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーまたはその塩。
  24. アミノ酸塩が、アルギニン塩、シトルリン塩、オルニチン塩、及びヒスチジン塩からなる群より選ばれるアミノ酸塩である、請求項２２に記載の化合物Ａの非結晶性ジアステレオマーまたはその塩。
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