WO2017077707A1 - 新規なクエン酸誘導体 - Google Patents

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WO2017077707A1
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勝也 平石
史恵 神間
洋之 相馬
太郎 足立
足立　正一
一平 山岡
知博 香川
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ＡｄａＢｉｏ株式会社
株式会社大塚製薬工場
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    • C07C235/12—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
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    • C07D307/18—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D307/20—Oxygen atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to a novel citric acid derivative, and more particularly to a citric acid derivative having an effect of suppressing liver damage.
  • Ume (Prunus mume) belongs to the Rosaceae subfamily, the subfamily of the cherry subfamily, and the processed plum products such as plum dried, plum wine and plum meat extract are eaten.
  • Plum meat extract has effects such as sterilization, recovery from fatigue, and protective action of the stomach, and has been taken for health.
  • plum extract has an effect of improving blood flow (see Non-Patent Documents 1 and 2). It is known that the above blood flow improvement effect is caused by Mumefural and related compounds produced by heating organic sugars such as citric acid and malic acid contained in plum extract and sugar. (Non-patent Document 3).
  • Misatol (registered trademark) is commercially available as one of the health foods containing plum extract, and it is known that misatol has an effect of inducing autophagy and an effect of suppressing liver damage in patients with viral hepatitis ( Patent Documents 1 and 2).
  • An object of the present invention is to provide a compound having an effect of suppressing liver damage.
  • the present invention relates to the following.
  • [1] Compounds represented by formulas (1) and (2). (Wherein R 1 represents a C1-C3 alkylene group optionally having a carboxyl group or a hydroxyl group, R 2 represents a hydrogen atom, or R 1 and R 2 together (It may form a cyclic structure and represents a C2-C3 alkylene chain.)
  • [2] The compound of [1], wherein the compound represented by the formula (1) is represented by the following structure.
  • [3] The compound of [1], wherein the compound represented by the formula (2) is represented by the following structure.
  • [4] A liver disorder inhibitor containing one or more compounds represented by formulas (1) and (2).
  • R 1 represents a C1-C3 alkyl group optionally having a carboxyl group or a hydroxyl group
  • R 2 represents a hydrogen atom, or R 1 and R 2 together (It may form a cyclic structure and represents a C2-C3 alkylene chain.)
  • NASH nonalcoholic steatohepatitis
  • a method for converting a compound of formula (2) comprising heating the compound represented by formula (1) in an aqueous solution to which an alkaline substance that generates hydroxide ions is added.
  • R 1 represents a C1-C3 alkyl group optionally having a carboxyl group or a hydroxyl group
  • R 2 represents a hydrogen atom, or R 1 and R 2 together (It may form a cyclic structure and represents a C2-C3 alkylene chain.)
  • An aqueous solution of pH 6.0 to 12.0 to which an alkaline substance capable of generating hydroxide ions is added to the compound represented by formula (1) is reacted at 80 to 130 ° C.
  • a food comprising one or more compounds represented by formulas (1) and (2). (Wherein R 1 represents a C1-C3 alkyl group optionally having a carboxyl group or a hydroxyl group, R 2 represents a hydrogen atom, or R 1 and R 2 together (It may form a cyclic structure and represents a C2-C3 alkylene chain.) [12] A food additive containing one or more compounds represented by formulas (1) and (2).
  • R 1 represents a C1-C3 alkyl group optionally having a carboxyl group or a hydroxyl group
  • R 2 represents a hydrogen atom
  • R 1 and R 2 together It may form a cyclic structure and represents a C2-C3 alkylene chain.
  • the compounds represented by formulas (1) and (2) have an effect of suppressing liver damage.
  • Compounds I and V can also be extracted, derived and isolated from plum extract.
  • the compound of the present invention is a compound represented by the following formulas (1) and (2).
  • R 1 represents a C1-C3 alkyl group optionally having a carboxyl group or a hydroxyl group
  • R 2 represents a hydrogen atom
  • R 1 and R 2 are cyclic together.
  • a structure may be formed and represents a C2-C3 alkylene chain.
  • the C1-C3 alkyl group in the C1-C3 alkyl group which may have a carboxyl group or a hydroxyl group is a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, specifically, a methyl group , Ethyl group, n-propyl group, and isopropyl group.
  • the C1-C3 alkyl group having a carboxyl group is represented by the following formula.
  • the C1-C3 alkyl group having a carboxyl group is represented by the following formula. (The wavy line represents the bonding position to the adjacent carbon atom.)
  • the C1-C3 alkyl group having a hydroxyl group is represented by the following formula. (The wavy line represents the bonding position to the adjacent carbon atom.)
  • R 1 and R 2 may be combined to form a cyclic structure, in which the hydroxyl group in the C2-C3 alkyl group having a hydroxyl group (R 1 ) is dehydrated and condensed with a carboxyl group having R 2. It is the annular structure of the state.
  • the annular structure is represented by the following formula, for example.
  • Compound I is preferable.
  • the compound represented by Formula (2) can illustrate the compound shown below.
  • compound V is preferable.
  • the compounds of the present invention also include salt forms such as metal salts formed from aluminum, calcium, lithium, magnesium, potassium, sodium, zinc, etc., N, N′-dibenzylethylenediamine, chloro Examples thereof include organic salts generated from procaine, choline, diethanolamine, ethylenediamine, N-methylglucamine, lysine, procaine and the like.
  • salt forms such as metal salts formed from aluminum, calcium, lithium, magnesium, potassium, sodium, zinc, etc., N, N′-dibenzylethylenediamine, chloro
  • the compound of the present invention has a plurality of carboxyl groups, any one or two or more carboxyl groups may be in the form of a salt.
  • the compound represented by the formula (1) has an asymmetric carbon atom, but such a compound includes all possible optical isomers, and these optical isomers can be used in any ratio.
  • an optically active compound may be an enantiomer, a racemate, or a mixture of enantiomers in any ratio, and when two or more asymmetric points exist, it may be a mixture of diastereomers in any ratio.
  • the structure when prepared using a raw material derived from a natural product, the structure has an amino group derived from an L-amino acid in the structure, so that the asymmetric carbon to which the nitrogen atom is bonded has the same configuration as that of the L-amino acid. (A mixture of diastereomers derived from the asymmetric carbon to which the hydroxyl group of citric acid is bonded).
  • the present invention includes all these compounds and mixtures.
  • Hepatopathy inhibitor The compound represented by the following formula (1) and the compound represented by the formula (2) have an effect of reducing blood AST and ALT by administration to rats, and can be used as a hepatic disorder inhibitor. it can.
  • the above measured values of AST and ALT in the blood are indicators that increase depending on the degree of damage to the liver tissue, and range of normal values (reference values) (for example, AST is 12 to 40 IU / L, ALT is 5 to 40 IU / L)
  • a condition deviating from indicates that some disordered condition exists in the liver tissue.
  • the liver disorder suppressant of the present invention has a therapeutic effect for hepatic disorder that heals patients with hepatic disorder and a therapeutic effect that promotes healing by preventing the progression of continuous hepatic disorder in patients with hepatic disorder. It has the effect of suppressing hepatic disorder, which prevents a healthy person from becoming hepatic.
  • liver disorder means various liver dysfunctions, such as acute hepatitis, chronic hepatitis, fatty liver, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, cholestatic liver disorder, liver failure, Examples include alcoholic liver disorder, NASH (Non-alcoholic steatohepatitis; non-alcoholic steatohepatitis), drug-induced liver disorder, and autoimmune liver disorder. (Use as food) Further, the compound represented by the following formula (1) and the compound represented by the formula (2) are effective for treating a liver disorder that heals a patient with hepatic disorder, and the progression of a hepatic disorder sustained by a patient with hepatic disorder.
  • a functional food a food for specified health use, a health food, a food material, and a food additive containing one or more of the compound represented by the formula (1) and the compound represented by (2) Can be mentioned.
  • rice flour, fats and oils, starches, lactose, maltose, vegetable fats and oils powder, cacao butter powder, stearic acid may be added to one or more compounds represented by formula (1) and compounds represented by formula (2)
  • suitable auxiliaries, etc. using conventional means, it is formed into an edible form, for example, paste, drink, soft capsule, seamless capsule, hard capsule, granule, pill, etc.
  • Various foods such as bread such as bread and confectionery bread; jams; biscuits; cookies; confectionery such as rice crackers; cakes; gums; Used by adding to beverages such as yogurt, milk, drinks, soft drinks (tea, coffee, tea, juice, etc.) It may be.
  • the compounding quantity of 1 type, or 2 or more types of the compound represented by Formula (1) and the compound represented by Formula (2) of this invention is suitably set by the kind, state, etc. of the said edible composition.
  • R 1 represents a C1-C3 alkyl group optionally having a carboxyl group or a hydroxyl group
  • R 2 represents a hydrogen atom
  • R 1 and R 2 are cyclic together.
  • a structure may be formed and represents a C2-C3 alkylene chain.
  • R 1 is a C1-C3 alkyl group optionally having a carboxyl group or a hydroxyl group means any of the following (1) to (3).
  • C1-C3 alkyl group in which R 1 has a carboxyl group examples include a C1 alkyl group having a carboxyl group (that is, a methyl group having a carboxyl group) and a C2 alkyl group having a carboxyl group (that is, a carboxyl group).
  • Ethyl group a C3 alkyl group having a carboxyl group (that is, an n-propyl group or an isopropyl group having a carboxyl group), a C1-C2 alkyl group having a carboxyl group, and a C2-C3 alkyl group having a carboxyl group.
  • C1-C3 alkyl group in which R 1 has a hydroxyl group examples include a C1 alkyl group having a hydroxyl group (that is, a methyl group having a hydroxyl group), a C2 alkyl group having a hydroxyl group (that is, an ethyl group having a hydroxyl group), Examples thereof include a C3 alkyl group having a hydroxyl group (that is, an n-propyl group or an isopropyl group having a hydroxyl group), a C1 to C2 alkyl group having a hydroxyl group, and a C2 to C3 alkyl group having a hydroxyl group.
  • the C1-C3 alkyl group in the C1-C3 alkyl group which may have a carboxyl group or a hydroxyl group is a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, specifically, a methyl group , Ethyl group, n-propyl group, and isopropyl group.
  • the C1-C3 alkyl group having a carboxyl group is represented by the following formula.
  • the C1-C3 alkyl group having a hydroxyl group is represented by the following formula. (The wavy line represents the bonding position to the adjacent carbon atom.)
  • examples of the cyclic structure include the same structure as the cyclic structure in formula (1).
  • the liver injury inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as it contains a compound represented by the formula (1) and / or a compound represented by the formula (2). Further, the compound represented by formula (1) and / or the compound represented by formula (2) contained in the liver function improving agent may be provided in an isolated form, but is obtained by extraction. The forms of the fractions containing compounds I and V and the form of the concentrate after the reaction solution obtained by synthesis is concentrated as necessary (crudely purified solution) are also included in the provided forms.
  • the hepatic disorder inhibitor of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier widely used in the field of drug production.
  • this pharmaceutically acceptable carrier includes the following agents: solvent (eg, water, normal saline, buffer, glycerin, organic solvent), emulsifier, suspending agent, disintegrant, binder, Excipients, stabilizers, preservatives, lubricants, absorption delaying agents, liposomes and the like can be mentioned.
  • the hepatopathy inhibitor can be formulated into a dosage form suitable for parenteral administration, topical administration, or oral administration, and the dosage form is not particularly limited, and is a tablet, lozenge, pill, capsule. Injections (eg, sterile aqueous solutions or dispersions), sterile powders, and the like.
  • the effective dose of the hepatic disorder inhibitor of the present invention is such that the amount of one or more compounds represented by formulas (1) and (2) contained in the hepatic disorder inhibitor is 2.5 mg to 32000 mg / day.
  • the range is preferably 3 mg to 600 mg / day (adult).
  • a wild-type ume consisting only of ume DNA is crushed and squeezed, and the resulting squeezed juice is heated and concentrated to obtain a concentrated plum juice.
  • an appropriate amount of water is added to the concentrated liquid, and the mixture is centrifuged to remove precipitates and obtain supernatant 1.
  • calcium chloride was added to remove citric acid, malic acid, pectin, etc. contained in the supernatant.
  • calcium salts such as citric acid, malic acid, and pectin are produced, and the supernatant 2 is obtained by centrifuging and precipitating these calcium salts.
  • a base such as sodium hydroxide or potassium hydroxide is added to the supernatant 2 to adjust the pH to 5.0 to 7.0, and ethanol is added to perform an ethanol precipitation reaction.
  • the mixture containing ethanol is centrifuged, divided into a supernatant (ethanol-soluble fraction) and a precipitate (ethanol-insoluble fraction), an aqueous ethanol solution is added again to the precipitate, and the mixture is centrifuged in the same manner to obtain a precipitate.
  • the polymer component is removed by passing a mixture obtained by adding purified water to the above sediment through a 1 kD to 100 kD ultrafiltration membrane to obtain a filtrate containing a low molecular component.
  • An ethanol aqueous solution is added to the filtrate and centrifuged to obtain a precipitate.
  • Purified water is added to the precipitate to remove insoluble matters such as calcium malate.
  • the solution from which insolubles have been removed is concentrated by an evaporator to obtain a fraction containing compounds I and V.
  • Such a fraction can also be used as it is as a composition containing compounds I and V.
  • the compounds I and V can be obtained by further concentration and appropriately performing known purification treatment such as column chromatography.
  • the compound represented by the formula (1) can be obtained by subjecting citric acid and an amine compound represented by the formula (3) to dehydration condensation reaction.
  • R 1 and R 2 are as defined above.
  • the dehydration condensation reaction between citric acid and the amine compound represented by formula (3) is carried out by heating a mixture of citric acid and the amine compound represented by formula (3) in a water bath at 80 to 100 ° C. After dissolving the amine compound represented by (3), the reaction is carried out at 100 to 130 ° C., preferably 115 to 125 ° C. for 30 minutes to 300 minutes, preferably 120 minutes to 240 minutes. Can be obtained.
  • the mixing ratio of citric acid to the amine compound represented by formula (3) is in the range of 75: 1 to 12:10. For example, the range is 50: 1 to 20:10, 40: 1 to 15: 8, 25: 1 to 10: 5.
  • the concentration referred to here means the molar amount per unit volume (for example, mol / L, mmol / L, mmol / ml, ⁇ mol / L, ⁇ mol / mL).
  • an amine compound represented by the formula (3) having a final concentration of 10 to 120 mg / mL is mixed and added to an aqueous citric acid solution of 250 to 750 mg / mL (1.19 mol / L to 3.57 mol / L).
  • a final concentration of 10 to 20 mg / mL 75 mmol / L to 150 mmol / L is added to an aqueous citric acid solution of 250 to 750 mg / mL (1.19 mol / L to 3.57 mol / L).
  • asparagine is more water-soluble than aspartic acid, it can be dissolved in an aqueous citric acid solution at the start of the reaction at the same concentration.
  • synthesizing cyclic compounds I and II by this reaction they can also be synthesized using asparagine or glutamine in addition to the amine compound represented by formula (3).
  • an autoclave can also be used for this reaction.
  • citric acid (IUPAC name: 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid) acid
  • the carbon chain skeleton of the propane chain, the 1st carbon (or 3rd carbon) and the 2 carboxyl group bonded to the 2nd carbon and an amino group form an imide bond for condensation and cyclization Occurs to form a cyclic imide compound.
  • the 1st and 3rd carbons of citric acid are chemically equivalent carbons, but become stereoisomers with the 2nd carbon as an asymmetric carbon when a bond is formed on any of the carboxyl groups.
  • L-amino acid or D-amino acid is used as the amine compound represented by (3), it becomes a diastereomer.
  • the concentrate may be used as it is.
  • the solvent is represented by the formula (1). It may be used as a compound. Specific methods for the post-treatment include known purification such as extraction treatment and / or crystallization and chromatography.
  • the compound represented by formula (2) is obtained by hydrolyzing a part of the imide bond of the compound represented by (1) synthesized from citric acid and the amine compound represented by formula (3) by the above method. Can be obtained as follows. (In Formula (1) and Formula (2), R 1 and R 2 are as defined above.)
  • the basic condition is pH 6.0 or more, preferably pH 8.6 or more, more preferably pH 9.6 to pH 12.0, and a suitable base to be used is a hydroxide in water. Examples thereof include sodium hydroxide and potassium hydroxide that generate ions.
  • the heat treatment conditions are 90 ° C. to 130 ° C. and 20 minutes to 240 minutes.
  • the time and conditions for the heat treatment can be adjusted as appropriate depending on the concentration of the target product to be decomposed and the pH of the reaction solution. Under the conditions of pH 9.6 to pH 12.0, heating at 121 ° C. for 20 to 60 minutes is possible. Treatment is preferred.
  • an autoclave can also be used for this reaction. Since this ring-opening reaction is a pH-dependent reaction, when the compound represented by formula (1) is synthesized by the above method, the reaction mixture is used as it is, and the pH is adjusted by adding a base. Can continue. Further, even when the compound represented by the formula (1) is purified by the above method, the reaction can be similarly carried out by adjusting the pH by adding a base after dissolving the purified product in water. Moreover, an autoclave can also be used for this reaction.
  • the stereoisomer having the asymmetric center at the 2-position carbon of the propane chain of citric acid is maintained, and the L-amino acid or D-amino acid is represented as the amine compound represented by (3). When is used, it becomes a diastereomer.
  • a compound represented by the following formula (4) which is a structural isomer, is also produced as a side reaction product, but the amount is limited compared to (2). It is.
  • asymmetric carbon is not generated from carbon derived from citric acid.
  • R 1 and R 2 are as defined above.
  • the compound represented by Formula (4) can illustrate the compound shown below.
  • the concentrate may be used as it is.
  • the solvent is represented by the formula (2). It may be used as a compound. Specific methods for the post-treatment include known purification such as extraction treatment and / or crystallization and chromatography.
  • a fraction containing the active ingredient was prepared.
  • 800 mL of water By adding 800 mL of water to 400 g of the concentrated liquid and centrifuging the precipitate, the precipitate was removed and the supernatant 1 was obtained.
  • a sodium hydroxide aqueous solution (40 g / 100 mL) is added to the supernatant 1 little by little, and neutralized so that the liquidity becomes pH 6.8, and then citric acid, malic acid, pectin, etc. contained in the supernatant.
  • Calcium chloride (225 g / 400 mL) was added to obtain a mixture. In the above mixture, calcium salts such as citric acid, malic acid, pectin, etc. are produced.
  • Purified water was added to the above sediment to 400 mL, and this solution was passed through a 1 kD ultrafiltration membrane to remove high molecular components, thereby obtaining a filtrate containing low molecular components. Ethanol was added to the above filtrate to obtain a 60% ethanol solution, which was centrifuged to obtain a precipitate. 250 mL of purified water was added to the precipitate to remove water-insoluble substances such as calcium malate. The solution from which the hardly soluble substances were removed was concentrated by an evaporator to obtain a concentrate containing components that were readily soluble in water. The components contained in this concentrate were analyzed by HPLC. The HPLC chromatogram is shown in FIG. The HPLC analysis conditions in FIG. 2 are the same as the HPLC analysis conditions in FIG. In this concentrate, some of the ume extract-derived contaminants were removed, the composition ratio of the peak (RT21.1 min) derived from the component considered to be the active ingredient increased, and partial purification was performed.
  • FIG. 3 shows a chromatogram of a sample obtained by heat-treating a part of the fraction containing the active ingredient under an alkali-added condition.
  • the active ingredient derived from the plum extract (the ingredient at RT21.1 in FIG. 3) and the ingredient whose active ingredient was changed by alkali heating (RT20 in FIG. 3).
  • .7 minute component (hereinafter, derivative of active component) was further purified by preparative HPLC, and the component was analyzed in an HPLC evaluation system using a column with higher resolution. The analysis results are shown in FIG. As a result of using a high resolution column, the active component (component of RT21.1 in FIG. 3) that was initially observed as one peak was separated into two (peaks A and B in FIG. 4). Further, the derivative of the active substance (component of RT20.7 in FIG.
  • HPLC analysis conditions using a high resolution column are as follows.
  • Equipment Agilent Technologies 1200-type column: Thermo Fisher SCIENTIFIC FLUOPHASE PFP (4.6 ⁇ 100mm, 5 ⁇ m)
  • Mobile phase A: 0.1% formic acid aqueous solution
  • B Acetonitrile
  • a / B 98/2
  • Flow rate 0.8mL / min
  • Column temperature 35 ° C
  • Injection volume 10 ⁇ L Detection wavelength: 200nm 2.
  • reaction solution was naturally cooled to 25 ° C., and then the reaction solution was taken out into a 5 L beaker and cooled on ice.
  • About 120 g of sodium hydroxide was dissolved in 500 mL of purified water, and this aqueous sodium hydroxide solution was ice-cooled and gradually added to the above reaction solution to neutralize the reaction solution to pH 5.8 (with neutralization heat). Neutralizing while confirming that the temperature was 25 ° C. due to heat generation).
  • the volume of the reaction solution was adjusted to 1200 mL with purified water.
  • 200 g of calcium chloride (dihydrate) is dissolved in 2 L of purified water to prepare a calcium chloride solution.
  • NMR analysis system Instrument: Bruker Biospin AVANCE500 (cryo Probe) Measurement nuclide: hydrogen (1 H), carbon (13 C) Measuring solvent: D 2 O Measurement method: 1 H NMR, 13 C NMR, 13 C NMR (DEPT), 1 H- 1 H COZY, HMQC, HMBC
  • This compound I has a diastereomer in which the carbon at the 2-position of the propane chain derived from citric acid (the carbon marked with *) is an asymmetric carbon (the asymmetric carbon is also present in the structure derived from aspartic acid).
  • the diastereomers are I (a) and I (b)
  • the active ingredient (peak B) isolated above is either the diastereomer I (a) or I (b).
  • the NMR analysis data of Compound I shown is one of I (a) and I (b).
  • peak A is a diastereomer of the isolated peak B.
  • peak A is a diastereomer of the isolated peak B.
  • mass analysis by LC-MS and spectrum analysis by NMR were similarly performed on a sample rich in peak A (some contamination of peak B).
  • the results of mass spectrometry showed that the molecular weights of peak A and peak B both coincided with 289, and it was confirmed that the NMR spectrum data also showed a similar spectrum pattern. Therefore, it was confirmed that peak A and peak B purified as active substances are diastereomers having the structure of compound I.
  • the derivative of the active component was confirmed to be a peak composed of three components ([0064]).
  • these three components have the same molecular weight (molecular weight 307), and a structure in which one molecule of water is added to the structure of compound I (molecular weight 289). It was confirmed to be a partial hydrolyzate. Further analysis was performed, and as a result of NMR analysis, the presence of Compound V and Compound IX was confirmed.
  • Compound V includes diasteremers in which the carbon at the 2-position of the propane chain derived from citric acid (carbon marked with *) is an asymmetric carbon, but these cannot be distinguished from NMR and LC-MS data.
  • One of these diastereomers of Compound V is obtained as a hydrolyzate of the diastereomer of Compound I.
  • Compound IX is then produced in small amounts from any hydrolysis of the diastereomers of Compound I. Therefore, it was found that the three components detected by analysis using a high resolution column of the derivative of the active component were the two diastereomeric components of Compound V and Compound IX.
  • L-glutamine was added to the citric acid solution, followed by heat treatment.
  • the amount of L-glutamine added to the citric acid (500 mg / mL) aqueous solution was 70 mg / mL (the solubility limit at 90 ° C.).
  • heating at 121 ° C. for 240 minutes in an autoclave Processed was analyzed by the same HPLC evaluation system. As a result, a product peak having the same retention time as that obtained when L-glutamic acid was used as a raw material was obtained. Therefore, even when L-glutamine is used as a raw material instead of L-glutamic acid, compound II having the same structure can be obtained.
  • L-alanine was added to a citric acid (500 mg / mL) aqueous solution so that the final concentration was 100 mg / mL (the solubility limit amount at 90 ° C.), and heat treatment was performed at 121 ° C. for 240 minutes in an autoclave.
  • a peak derived from a component generated by heating appeared at RT 6.2 minutes (FIG. 10).
  • the molecular weight of the component of RT 6.2 minutes was 245, and this was a compound in which an imide bond was made to the amino group of L-alanine so that citric acid had the same skeleton as compound I. It is shown that.
  • the analysis conditions of the HPLC analysis and LC-MS analysis used for the evaluation are the same as those of Compound II.
  • citric acid showed a clear single peak of Compound I, but malic acid did not show a clear peak. Moreover, even when citric acid and malic acid were mixed and the same experiment was performed, only a synthetic product derived from citric acid (RT: 21.1) was confirmed. From the above, it can be said that the imide formation reaction between an organic acid and an amino acid such as asparagine or aspartic acid occurs selectively only in citric acid.
  • the reaction in which two carboxyls bonded to adjacent carbons form an imide with an amino acid is selected when a compound similar to citric acid such as malic acid or hydroxycitric acid is used as a raw material. Sex is lost.
  • the amino group forming the imide may be an ⁇ -amino group (an ⁇ -amino group bonded to carbon bonded to a carboxyl group), The imide formation reaction is hardly affected by the structure of the side chain, and the selectivity for imide formation is not lost.
  • the administrations (1) and (2) above are dissolved in a solvent composed of oligosaccharides, cyclic oligosaccharides and D-sorbitol, and the final concentration of compounds I and V in the administered solution is 6 mg / mL. It was prepared as follows. It was orally administered for 7 days to 8 weeks old Wistar male rats (Nippon Charles River Co., Ltd.) under free intake of commercial solid feed and drinking water of tap water so that the specific gravity was converted to 6 g / kg as a solution. . The control animals were orally administered with only the solvent not containing (1) and (2) above at 6 g / kg for 7 days.
  • mice Animal experiment procedure For 30 C57BL / 6J mice (Nippon Charles River Co., Ltd.) on the 17th day of pregnancy, as a standard diet, free intake of solid feed (CRF-1, Oriental Yeast Co., Ltd.) In addition, they were reared individually under free drinking water and given birth. The offspring mice were divided into mice that received STZ and mice that did not receive STZ (standard mice). For each mouse administered with STZ, the birth date was set to day 0, and the second day after birth, a syringe for insulin (MyJector, Terumo) was used, and 10 mg / mL (0.1 M) of STZ (manufactured by Sigma) was used.
  • Glutest Neo sensor manufactured by Sanwa Chemical Laboratories
  • the crudely purified compound Group I received 10 mL / kg (body weight) of the crudely purified Compound I solution
  • the solvent group received 10 mL / kg (body weight) of the solvent.
  • Plasma aspartate aminotransferase (AST) concentration and alanine aminotransferase (ALT) concentration were measured by JSCC standardization using Hitachi 7180 automatic analyzer. The measured values were expressed as mean ⁇ standard deviation (Mean ⁇ SD).
  • the compound of the present invention can be used as a liver disorder inhibitor.

Abstract

以下の式（１）および（２）で表される化合物（クエン酸誘導体）は、肝障害抑制効果を有する新規化合物であり、肝障害抑制剤、食品添加剤として使用することができる。 （式中、Ｒ１は、カルボキシル基若しくは水酸基を有していてもよいＣ１～Ｃ３アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表すか、又は、Ｒ１及びＲ２は、一緒になって環状構造を形成してもよく、Ｃ２～Ｃ３アルキレン鎖を表す。）

Description

新規なクエン酸誘導体
　本発明は、新規なクエン酸誘導体に関し、より詳細には、肝障害抑制効果を有するクエン酸誘導体に関する。
　ウメ（Prunus mume）は、バラ科サクラ亜科サクラ属スモモ亜属に属し、梅干、梅酒、梅肉エキス等の梅加工品が食されている。また、梅肉エキスは、殺菌、疲労回復、胃の保護作用等の効果を有しており、健康のために摂取されてきた。そしてまた、梅肉エキスには血流改善効果があることが知られている（非特許文献１、２参照）。上記血流改善効果は、梅肉エキスに含まれる、クエン酸、リンゴ酸等の有機酸と、糖との加熱によって生成されるムメフラール（Mumefural）及びその関連化合物に起因していることが知られている（非特許文献３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　梅肉エキスを含む健康食品の一つとしてミサトール（登録商標）が市販されており、ミサトールは、オートファジーを誘導する効果やウイルス性肝炎患者における肝障害抑制効果があることが知られている（特許文献１、２）。
特許４８４２６２４号公報 特許５５７７１２９号公報
J. Agric. FoodChem., 1999, 47, 828-31 ヘモレオロジー研究会誌１、65-67, 1998 ヘモレオロジー研究会誌３、81-88, 2000
　本発明の課題は、肝障害抑制効果のある化合物を提供することにある。
　クエン酸（IUPAC名：2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid）の炭素鎖であるプロパン鎖の1位の炭素（または３位の炭素）と2位の炭素に結合している２つのカルボキシル基が特定のアミノ酸のアミノ基とイミド結合を形成した化合物、及びそのイミド化合物を加水分解することで得られるクエン酸由来のプロパン鎖の1位の炭素（または３位の炭素）に結合しているカルボキシル基とアミノ酸のアミド化合物は、肝障害抑制効果を有する活性物質であることがわかった。
　すなわち、本発明は以下に関する。
　［１］式（１）および（２）で表される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （式中、Ｒ１は、カルボキシル基若しくは水酸基を有していてもよいＣ１～Ｃ３アルキレン基を表し、Ｒ２は、水素原子を表すか、又は、Ｒ１及びＲ２は、一緒になって環状構造を形成してもよく、Ｃ２～Ｃ３アルキレン鎖を表す。）
　［２］式（１）で表される化合物が、以下の構造で表されることを特徴とする[１]の化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 　［３］式（２）で表される化合物が、以下の構造で表されることを特徴とする［１］の化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　［４］式（１）および（２）で表される１種若しくは２種以上の化合物を含む、肝障害抑制剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、Ｒ１は、カルボキシル基若しくは水酸基を有していてもよいＣ１～Ｃ３アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表すか、又は、Ｒ１及びＲ２は、一緒になって環状構造を形成してもよく、Ｃ２～Ｃ３アルキレン鎖を表す。）
　［５］肝障害が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、［４］記載の肝障害抑制剤。
　［６］クエン酸と式（３）で表されるアミン化合物との混合物を加熱反応させることを特徴とする、式（１）で表される化合物の合成方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、Ｒ１は、カルボキシル基若しくは水酸基を有していてもよいＣ１～Ｃ３アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表すか、又は、Ｒ１及びＲ２は、一緒になって環状構造を形成してもよく、Ｃ２～Ｃ３アルキレン鎖を表す。）
　［７］クエン酸と式（３）で表されるアミン化合物との混合物を、１００～１３０℃で、３０分～３００分間反応させることを特徴とする、［６］に記載の合成方法。
　［８］クエン酸と式（３）で表されるアミン化合物との混合比（クエン酸の濃度：式（３）で表されるアミン化合物の濃度）が７５：１～１２：１０であることを特徴とする、［６］又は［７］に記載の合成方法。
　[９]式（１）で表される化合物を水酸化物イオンが生じるアルカリ性物質を添加した水溶液中で加熱することを特徴とする、式（２）の化合物の変換方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、Ｒ１は、カルボキシル基若しくは水酸基を有していてもよいＣ１～Ｃ３アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表すか、又は、Ｒ１及びＲ２は、一緒になって環状構造を形成してもよく、Ｃ２～Ｃ３アルキレン鎖を表す。）
　[１０] 式（１）で表される化合物を水酸化物イオンが生じるアルカリ性物質を添加したｐH６．０～１２.０の水溶液を、８０～１３０℃で、２０分～２４０分間反応させることを特徴とする、 [９]に記載の変換方法。
　［１１］式（１）および （２）で表される１種若しくは２種以上の化合物を含む、食品。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、Ｒ１は、カルボキシル基若しくは水酸基を有していてもよいＣ１～Ｃ３アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表すか、又は、Ｒ１及びＲ２は、一緒になって環状構造を形成してもよく、Ｃ２～Ｃ３アルキレン鎖を表す。）
　［１２］　式（１）および（２）で表される１種若しくは２種以上の化合物を含む、食品添加剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、Ｒ１は、カルボキシル基若しくは水酸基を有していてもよいＣ１～Ｃ３アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表すか、又は、Ｒ１及びＲ２は、一緒になって環状構造を形成してもよく、Ｃ２～Ｃ３アルキレン鎖を表す。）
　式（１）および（２）で表される化合物は、肝障害抑制効果を有する。また、化合物Ｉ及びＶは、梅肉エキスから抽出、誘導、単離することもできる。
梅肉エキスの水溶性成分のＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。 梅肉エキス由来の生理活性成分を含む精製分画のＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。 梅肉エキス由来の生理活性成分を含む分画をアルカリ条件下で加水処理したサンプルのＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。 梅肉エキス由来の生理活性成分とその加水分解物を高分離能カラムを用いたＨＰＬＣで分析した結果を示す図である。 クエン酸とＬ－アスパラギン酸との反応による化合物Iの生成を示すＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。 クエン酸とＬ－アスパラギン酸から合成された化合物Iをアルカリ条件下で加熱処理したサンプルのＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。 合成した化合物Iとその加水分解物を高分離能カラムを用いたＨＰＬＣで分析した結果を示す図である。 クエン酸とＬ－グルタミン酸との反応による化合物IIの生成を示すＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。 化合物IIIの生成を示すＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。 化合物IVの生成を示すＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。 クエン酸とアスパラギン酸との反応溶液のＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。 リンゴ酸とアスパラギン酸との反応溶液のＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。 ヒドロキシクエン酸とアスパラギン酸及びアスパラギンとの反応溶液のＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。 化合物Ｉ、Ｖ摂取時のラットのＡＬＴ値、ＡＳＴ値の変化を示す図である。図中、それぞれの群において、左側の棒グラフがＡＳＴを示し、右側の棒グラフがＡＬＴを示す。 化合物I摂取時のＮＡＳＨモデルマウスのＡＬＴ値、ＡＳＴ値の変化を示す図である。図中、それぞれの群において、左側の棒グラフがＡＳＴを示し、右側の棒グラフがＡＬＴを示す。
（化合物）
　本発明の化合物は、以下の式（１）および（２）で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　式中、Ｒ１は、カルボキシル基若しくは水酸基を有していてもよいＣ１～Ｃ３アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表すか、又は、Ｒ１及びＲ２は、一緒になって環状構造を形成してもよく、Ｃ２～Ｃ３アルキレン鎖を表す。
　上記カルボキシル基若しくは水酸基を有していてもよいＣ１～Ｃ３アルキル基におけるＣ１～Ｃ３アルキル基は、炭素数１～３の直鎖状又は分岐状のアルキル基であり、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基を挙げることができる。また、カルボキシル基を有するＣ１～Ｃ３アルキル基は、以下の式で表される。
　上記カルボキシル基を有するＣ１～Ｃ３アルキル基は、以下の式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （波線は、隣接する炭素原子への結合位置を表す。）
　上記水酸基を有するＣ１～Ｃ３アルキル基は、以下の式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （波線は、隣接する炭素原子への結合位置を表す。）
　Ｒ１及びＲ２は一緒になって環状構造を形成してもよく、かかる環状構造は、水酸基を有するＣ２～Ｃ３アルキル基（Ｒ１）中の水酸基が、Ｒ２を有するカルボキシル基と脱水縮合した状態の環状構造である。上記環状構造は、例えば、以下の式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　（波線は、隣接する窒素原子への結合位置を表す。）
　式（１）で表される化合物としては、具体的には、以下に示す化合物を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　上記化合物の中でも、好ましくは、化合物Ｉである。
　式（２）で表される化合物は、具体的には、以下に示す化合物を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　上記化合物の中でも、好ましくは、化合物Ｖである。
　本発明の化合物には塩の形態も含まれ、かかる塩としては、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛等から生成された金属塩や、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ－メチルグルカミン、リジン、プロカイン等から生成された有機塩を挙げることができる。本発明の化合物には複数のカルボキシル基があるが、１若しくは２以上のいずれのカルボキシル基が塩の形態になっていてもよい。
　式（１）で表される化合物は不斉炭素原子を有するが、かかる化合物は、考えられ得るすべての光学異性体を含み、それら光学異性体は任意の比で使用することができる。例えば、ある光学活性化合物は、エナンチオマーでもラセミでも任意の割合のエナンチオマーの混合物でもよく、不斉点が２つ以上存在するときは、任意の割合のジアステレオマーの混合物であってもよい。ただし、天然物に由来する原料を用いて作製された場合には、Ｌ－アミノ酸由来のアミノ基を構造内に有するため、窒素原子が結合する不斉炭素はＬ－アミノ酸と同じ立体配置の構造体（クエン酸の水酸基が結合する不斉炭素に由来するジアステレオマーの混合物）が得られる。本発明は、これらのすべての化合物および混合物を包含する。
（肝障害抑制剤）
　以下の式（１）で表される化合物および式（２）で表される化合物には、ラットへの投与により血中ＡＳＴ及びＡＬＴの低減作用がみられ、肝障害抑制剤として使用することができる。上記血中のＡＳＴ及びＡＬＴの測定値は肝組織の障害の程度により上昇する指標であり、正常値（基準値）の範囲（例えばＡＳＴが１２～４０ＩＵ／Ｌ、ＡＬＴが５～４０ＩＵ／Ｌ）を逸脱している状態は、肝組織に何らかの障害性の病態が存在することを示す。本発明の肝障害抑制剤には、肝障害のある患者を治癒する肝障害治療効果や、肝障害のある患者の持続する肝障害の進行を防ぐことにより治癒を促進する治療効果に加え、健康な人が肝障害になることを防いだりする肝障害抑制効果がある。本発明において、肝障害とは種々の肝機能障害を意味し、例えば、急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、胆汁うっ滞性肝障害、肝不全、アルコール性肝障害、ＮＡＳＨ（Non-alcoholic steatohepatitis；非アルコール性脂肪性肝炎）、薬物性肝障害、自己免疫性肝障害等が挙げられる。
（食品としての利用）
　さらに、以下の式（１）で表される化合物および式（２）で表される化合物が肝障害のある患者を治癒する肝障害治療効果や、肝障害のある患者の持続する肝障害の進行を防ぐことにより治癒を促進する治療効果に加え、健康な人が肝障害になることを予防する肝障害抑制効果があることに着目して、食品または食品添加剤として利用することができる。即ち、式（１）で表される化合物式および（２）で表される化合物の１種若しくは２種以上を含有する機能性食品、特定保健用食品、健康食品、食品素材、食品添加剤が挙げられる。
　例えば、式（１）で表される化合物および式（２）で表される化合物の１種若しくは２種以上に、米粉、油脂、澱粉、乳糖、麦芽糖、植物油脂粉末、カカオ脂末、ステアリン酸などの適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、ペースト、ドリンク、ソフトカプセル、シームレスカプセル、ハードカプセル、顆粒、丸剤などに成形して食用に供してもよく、また、種々の食品、例えば、食パン、菓子パン等のパン；ジャム；ビスケット；クッキー；せんべい等の菓子；ケーキ；ガム；インスタントラーメン、インスタントみそ汁、インスタントスープ等のインスタント食品；アイスクリーム製品；ヨーグルト、牛乳、ドリンク剤、清涼飲料（お茶、コーヒー、紅茶、ジュース等）などの飲料に添加して使用してもよい。本発明の式（１）で表される化合物および式（２）で表される化合物の１種若しくは２種以上の配合量は、当該食用組成物の種類や状態等により適宜設定される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　式中、Ｒ１は、カルボキシル基若しくは水酸基を有していてもよいＣ１～Ｃ３アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表すか、又は、Ｒ１及びＲ２は、一緒になって環状構造を形成してもよく、Ｃ２～Ｃ３アルキレン鎖を表す。本発明において、Ｒ１はカルボキシル基若しくは水酸基を有していてもよいＣ１～Ｃ３アルキル基とは次の（１）～（３）のいずれかを意味する。
（１）Ｒ１が置換基を有しないＣ１～Ｃ３アルキル基。
（２）Ｒ１がカルボキシル基を有するＣ１～Ｃ３アルキル基。Ｒ１がカルボキシル基を有するＣ１～Ｃ３アルキル基として、具体的には、カルボキシル基を有するＣ１アルキル基（即ち、カルボキシル基を有するメチル基）、カルボキシル基を有するＣ２アルキル基（即ち、カルボキシル基を有するエチル基）、カルボキシル基を有するＣ３アルキル基（即ち、カルボキシル基を有するｎ－プロピル基若しくはイソプロピル基）、カルボキシル基を有するＣ１～Ｃ２アルキル基、カルボキシル基を有するＣ２～Ｃ３アルキル基が挙げられる。
（３）Ｒ１が水酸基を有するＣ１～Ｃ３アルキル基。Ｒ１が水酸基を有するＣ１～Ｃ３アルキル基として、具体的には、水酸基を有するＣ１アルキル基（即ち、水酸基を有するメチル基）、水酸基を有するＣ２アルキル基（即ち、水酸基を有するエチル基）、水酸基を有するＣ３アルキル基（即ち、水酸基を有するｎ－プロピル基若しくはイソプロピル基）、水酸基を有するＣ１～Ｃ２アルキル基、水酸基を有するＣ２～Ｃ３アルキル基が挙げられる。
　上記カルボキシル基若しくは水酸基を有していてもよいＣ１～Ｃ３アルキル基におけるＣ１～Ｃ３アルキル基は、炭素数１～３の直鎖状又は分岐状のアルキル基であり、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基を挙げることができる。また、カルボキシル基を有するＣ１～Ｃ３アルキル基は、以下の式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 （波線は、隣接する炭素原子への結合位置を表す。）
　水酸基を有するＣ１～Ｃ３アルキル基は、以下の式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 （波線は、隣接する炭素原子への結合位置を表す。）
　Ｒ１及びＲ２が一緒になって環状構造を形成する場合、かかる環状構造は式（１）における環状構造と同様の構造を挙げることができる。
　本発明の肝障害抑制剤は、式（１）で表される化合物及び/又は式（２）で表される化合物を含むものであれば特に制限されない。また、上記肝機能改善剤に含まれる式（１）で表される化合物及び/又は式（２）で表される化合物は、単離された形態で提供されてもよいが、抽出により得られる化合物Ｉ及びＶを含む画分の形態や、合成により得られる反応溶液を必要に応じて濃縮した後の濃縮物の形態（粗精製溶液）も提供の形態に含まれる。
　本発明の肝障害抑制剤は、薬品製造の分野において広く用いられる薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。例えば、この薬学的に許容される担体としては、以下の薬剤：溶媒（例えば、水、通常生理食塩水、緩衝液、グリセリン、有機溶媒）、乳化剤、懸濁化剤、崩壊剤、結合剤、賦形剤、安定化剤、保存剤、滑沢剤、吸収遅延剤、リポソーム等を挙げることができる。また、上記肝障害抑制剤は、非経口投与、局所投与、又は経口投与に適する投薬形態へと処方され得、これらの投薬形態としては、特に制限されず、錠剤、ロゼンジ、丸剤、カプセル剤、注射（例えば、滅菌水溶液又は分散液）、滅菌散剤等を挙ることができる。
　本発明の肝障害抑制剤の有効投与量は、かかる肝障害抑制剤に含まれる式（１）および（２）で表される１種若しくは２種以上の化合物量が２．５ｍｇ～３２０００ｍｇ／日となる範囲で、好ましくは３ｍｇ～６００ｍｇ/日（成人）の範囲である。
（化合物の抽出）
　本発明の式（１）で表される化合物が特に化合物Ｉ及びＶであるとき、梅肉エキスから抽出、誘導、単離することによって得ることができる。具体的には、以下の手順で行うことができる。
　まず、ウメのＤＮＡのみからなる野生種のウメを粉砕・搾汁し、得られた搾汁を加熱濃縮して、梅果汁の濃縮液を得る。次に、上記の濃縮液に水を適量加え、遠心分離することによって、沈降物を除去し、上清１を得る。続いて、上清１に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基を添加することによって中和した後、上記上清に含まれるクエン酸、リンゴ酸、ペクチン等を除くために、塩化カルシウムを添加し、クエン酸、リンゴ酸、ペクチン等のカルシウム塩を生じさせ、これらのカルシウム塩を遠心分離して沈降させることによって、上清２を得る。さらに、上清２に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基を添加することによってｐＨを５．０～７．０に調整し、エタノールを添加してエタノール沈降反応を行う。エタノールを含む混合物を遠心分離し、上清（エタノール溶性画分）と沈降物（エタノール不溶性画分）に分け、沈降物に再びエタノール水溶液を加え、同様に遠心分離し、沈降物を得る。
　上記の沈降物に精製水を加えた混合物を、１ｋＤ～１００ｋＤ限外ろ過膜を通過させることによって高分子成分を除去し、低分子成分を含むろ液を得る。上記ろ液にエタノール水溶液を加え、遠心分離することで沈降物を得、かかる沈降物に精製水を加え、リンゴ酸カルシウム塩といった不溶物を除去する。不溶物を除去した溶液をエバポレーターによって濃縮し、化合物Ｉ及びＶを含む画分を得る。かかる画分は、そのまま化合物Ｉ及びＶを含む組成物として使用することもできる。その後、さらに濃縮、適宜カラムクロマトグラフィー等の公知の精製処理を行うことにより、化合物Ｉ及びＶを得ることができる。
（化合物の合成）
　式（１）で表される化合物は、以下に示すように、クエン酸と式（３）で表されるアミン化合物とを脱水縮合反応することによって得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 （式（１）及び式（３）中、Ｒ１及びＲ２は、前記と同義である。）
　クエン酸と式（３）で表されるアミン化合物との脱水縮合反応は、クエン酸と式（３）で表されるアミン化合物との混合物を８０～１００℃の水浴中での加温により式（３）で表されるアミン化合物を溶解させた後、１００～１３０℃、好ましくは１１５～１２５℃で、３０分～３００分間、好ましくは１２０分～２４０分間反応させることによって、式（１）で表される化合物を得ることができる。
　また、クエン酸と式（３）で表されるアミン化合物との混合比（クエン酸の濃度：式（３）で表されるアミン化合物の濃度）としては、７５：１～１２：１０の範囲のいずれかであればよく、例えば、５０：１～２０：１０、４０：１～１５：８、２５：１～１０：５の範囲が挙げられる。なお、ここでいう濃度とは、単位容積当たりのモル量（例えば、mol／Ｌ、mmol／Ｌ、mmol／ｍｌ、μmol／Ｌ、μmol／ｍＬ）を意味する。一例として、２５０～７５０ｍｇ／ｍＬ（１．１９ｍｏｌ／Ｌ～３．５７ｍｏｌ／Ｌ）のクエン酸水溶液に、最終濃度１０～１２０ｍｇ／ｍＬの式（３）で表されるアミン化合物を混合添加することが挙げられれる。そしてまた、化合物Ｉを合成する場合、２５０～７５０ｍｇ／ｍＬ（１．１９ｍｏｌ／Ｌ～３．５７ｍｏｌ／Ｌ）のクエン酸水溶液に、最終濃度１０～２０ｍｇ／ｍＬ（７５ｍｍｏｌ／Ｌ～１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）相当のアスパラギン酸と最終濃度８０～１２０ｍｇ／ｍＬ（５３３ｍｍｏｌ／Ｌ～８００ｍｍｏｌ／Ｌ）相当のアスパラギンを混合添加することが例示される。クエン酸水溶液に最終濃度１０～１２０ｍｇ／ｍＬ（７５ｍｍｏｌ／Ｌ～８００ｍｍｏｌ／Ｌ）のアスパラギン酸を単独で添加した場合、２０mg／ｍＬ以上のアスパラギン酸は反応開始時において完全には溶解しない。しかし、その混合懸濁液を撹拌しながら反応を行うことで、反応の進行とともに徐々にアスパラギン酸が溶解し、最終的には同様の目的物を得ることができる。アスパラギン酸に比べアスパラギンは水溶性が高いので、同様の濃度で反応開始時においてクエン酸水溶液に溶解できる。
　本反応により環状の化合物ＩやIIを合成する場合、式（３）で表されるアミン化合物以外にアスパラギンやグルタミンを用いても合成することができる。また、本反応にはオートクレーブを用いることもできる。
　クエン酸と式（３）で表されるアミン化合物の加熱反応によって式（１）で表される化合物を合成する方法においては、クエン酸（IUPAC名：2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid）の炭素鎖骨格であるプロパン鎖の1位の炭素（または３位の炭素）と2位の炭素に結合している２つのカルボキシル基とアミノ基がイミド結合を形成して縮合及び環化が起こり、環状イミド化合物となる。クエン酸の１位の炭素と３位の炭素は化学的に等価な炭素であるが、その何れかのカルボキシル基に結合が生じた時点で２位の炭素を不斉炭素とした立体異性体となり、（３）で表されるアミン化合物としてL-アミノ酸またはD-アミノ酸を使用した場合はジアステレオマーとなる。
　上記有機反応で溶媒を用いる場合、得られた反応溶液を必要に応じて濃縮した後、濃縮物をそのまま使用してもよく、適宜な後処理を行った後に、式（１）で表される化合物として用いてもよい。後処理の具体的な方法としては、抽出処理及び／又は晶出、クロマトグラフィー等の公知の精製を挙げることができる。
　式（２）で表される化合物は、上記の方法でクエン酸と式（３）で表されるアミン化合物から合成した（１）で表される化合物のイミド結合の一部を加水分解することによって、以下のように得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 （式（１）及び式（２）中、Ｒ１及びＲ２は、前記と同義である。）
　式（１）で表される環状イミド化合物から、（２）で表されるアミド化合物に変換する方法としては、（１）で表される環状イミド化合物の水溶液を塩基で加熱処理することによって、イミド結合を加水分解により開環し、アミド化合物とすることにより得られる。上記の塩基性条件としては、ｐＨ６．０以上であり、好ましくはｐＨ８．６以上であり、さらに好ましくはｐＨ９．６～ｐＨ１２．０であり、使用する好適な塩基としては、水中で水酸化物イオンを生じさせる、水酸化ナトリウムや、水酸化カリウムを挙げることができる。加熱処理の条件としては９０℃～１３０℃で、２０分～２４０分である。
　加熱処理の時間と条件は、分解させようとする目的物の濃度や反応液のｐＨにより適宜調節することができるが、ｐＨ９．６～ｐＨ１２．０の条件では１２１℃で２０～６０分の加熱処理が好ましい。また、本反応にはオートクレーブを用いることもできる。
　この開環反応はｐＨに依存した反応であるので、上記の方法により式（１）で表される化合物を合成した場合、その反応混合液をそのまま使用し、塩基を加えてｐＨを調節することにより続けて行うことができる。また、上記の方法により式（１）で表される化合物を精製した場合でも、その精製物を水に溶解させた後に塩基を加えてｐＨを調製すれば、同様に反応させることができる。
　また、本反応にはオートクレーブを用いることもできる。
　この反応の開環生成物においても、クエン酸のプロパン鎖の２位の炭素を不斉中心とした立体異性体が維持され、（３）で表されるアミン化合物としてL-アミノ酸またはD-アミノ酸を使用した場合は、ジアステレオマーとなる。また、（２）で表されるアミド化合物とともに、副反応産物としてその構造異性体である以下の式（４）で表される化合物も生成されるが、その量は（２）に比べ限定的である。尚、式（４）で表される化合物ではクエン酸に由来する炭素から不斉炭素は生じない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 （式（４）中、Ｒ１及びＲ２は、前記と同義である。）
　式（４）で表される化合物は、具体的には、以下に示す化合物を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　上記有機反応で溶媒を用いる場合、得られた反応溶液を必要に応じて濃縮した後、濃縮物をそのまま使用してもよく、適宜な後処理を行った後に、式（２）で表される化合物として用いてもよい。後処理の具体的な方法としては、抽出処理及び／又は晶出、クロマトグラフィー等の公知の精製を挙げることができる。
　以下、本発明について実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。
１．活性成分の分離・精製
　まず、梅肉エキスの濃縮液の調製を行った。ウメのＤＮＡのみからなる野生種のウメ（品種：白加賀）を粉砕・搾汁し、得られた搾汁を加熱濃縮して、梅果汁の濃縮液（梅肉エキス）を得た。
　梅肉エキスに含まれる水溶性成分を分析するため、上記の濃縮液1gを39ｇの3mM硫酸水溶液（HPLCの移動相）で希釈（40倍希釈）し、メンブレンフィルターで不溶物を除去して、希釈液を得た。この希釈液の高速液体クロマトグラフィー（HPLC）クロマトグラムを図1に示す。HPLC分析条件は以下の通りであった。クロマトグラム中の活性成分と思われる目的成分は、RT21.1分のピークである。
［HPLC分析系］
装置：日本分光製高速液体クロマトグラフ
カラム：Excelpak CHA-E11（300mm×4.6mm　I.D. Yokogawa analytical system）を2本連結
移動相：3mM硫酸水溶液
流速：0.5mL/min
カラム温度：55℃
注入量：20μL
検出波長：210nm
　次に、活性成分を含む画分の調製を行った。上記の濃縮液４００ｇに水８００ｍＬを加え、遠心分離することによって、沈降物を除去し、上清１を得た。続いて、上清１に水酸化ナトリウム水溶液（４０ｇ／１００ｍＬ）を少量ずつ加え、液性がｐＨ６．８となるように中和した後、上記上清に含まれるクエン酸、リンゴ酸、ペクチン等を除くために塩化カルシウム（２２５ｇ／４００ｍＬ）を添加し、混合物を得た。上記混合物には、クエン酸、リンゴ酸、ペクチン等のカルシウム塩が生じるが、これらの塩を遠心分離することによって沈降させ、上清２を得た。さらに、上清２に水酸化ナトリウム水溶液（４０ｇ／１００ｍＬ）を少量添加することによってｐＨを５．８に調整した（液量として８００ｍＬ）。この溶液４０ｍＬあたりに、６０ｍＬのエタノール（エタノール濃度が６０％となるように）を添加し、エタノール沈降反応を行った。６０％エタノール溶液を含む混合物を遠心分離し、上清（エタノール溶性画分）と沈降物（エタノール不溶性画分）に分け、沈降物に水を加えて４００ｍＬとし、再びエタノール（６００ｍＬ）を加え、同様に遠心分離し、沈降物を得た。
　上記の沈降物に精製水を加えて４００ｍＬとし、この溶液を、１ｋＤ限外ろ過膜を通過させることによって高分子成分を除去し、低分子成分を含むろ液を得た。上記ろ液にエタノールを加え６０％エタノール溶液とし、遠心分離することで沈降物を得、かかる沈降物に精製水２５０ｍＬを加え、リンゴ酸カルシウム塩といった水に難溶な物質を除去した。難溶物を除去した溶液をエバポレーターによって濃縮し、水に易溶性な成分を含む濃縮物を得た。この濃縮物に含まれる成分をHPLCで分析した。HPLCクロマトグラムを図２に示す。図２のHPLC分析条件は、図１のHPLC分析条件と同じである。この濃縮物では一部の梅エキス由来の夾雑物質が除去され、活性成分と思われる成分に由来するピーク（RT21.1分）の構成比が増し、部分的な精製がなされた。
　上記の活性成分を含む画分のHPLCクロマトグラムを拡大して観察した結果、活性成分のピーク（RT21.1分）の左ショルダーに膨らみ（ショルダーピーク）がみられ、僅かに保持時間が短い成分のピークが重なっていることが確認された。このショルダーピークの成分は、活性成分中の主要ピークと保持時間が非常に近接していることから、関連する成分と予測し、液性の変化に伴うピークの挙動を調査した。その結果、液性を中性～アルカリ性に調節し、121℃で、30分の加熱処理を行った結果、HPLCクロマトグラム上において、ショルダーピークの位置に相当するRT20.7分の成分が増加することを確認した。上記の活性成分を含む画分の一部をアルカリ添加条件下で加熱処理したサンプルのクロマトグラムを図３に示す。
　上記の濃縮物（［００５３］）の分画から、梅肉エキスに由来する活性成分(図３のRT21.1分の成分)と、その活性成分がアルカリ加熱によって変化した成分（図３のRT20.7分の成分：以下、活性成分の派生物)について、分取用ＨＰＬＣによってさらに精製を行うとともに、より分離能に優れたカラムを用いたＨＰＬＣ評価系において成分の分析を行った。この分析結果を図４に示す。高分離能カラムを用いた結果、当初1本のピークとして観察されていた活性成分（図３のRT21.1分の成分）は2本（図４のピークAおよびB）に分かれた。また、活性物質の派生物（図３のRT20.7分の成分）は、この高分離能カラムを用いた結果、3成分（図４のピークC、D、E）に分離された。後述する解析で、このピークA及びピークBは分子量が２８９の化合物I、ピークC、D、Eは分子量が307の化合物Ｖおよび化合物IXであることが判明した。
　高分離能カラムを用いたHPLC分析条件は以下のとおりである。
　［HPLC分析系］
装置：Agilent Technologies製　1200型
カラム：Thermo Fisher SCIENTIFIC製　FLUOPHASE PFP (4.6×100mm, 5μm) 
移動相：A：0.1%ギ酸水溶液　B：アセトニトリル　A/B=98/2
流速：0.8mL/min
カラム温度：35℃
注入量：10μL
検出波長：200nm
 
２．化合物Ｉ及び化合物Ｖの合成および構造解析
　化合物Ｉ及び化合物Ｖの合成方法および構造解析のデータを示す。
（化合物Ｉの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　４５０ｇのクエン酸（一水和物）（３．５６ｍｏｌ）に水を加えて５００ｍＬの濃厚なクエン酸溶液を調製し、この溶液に６０ｇのＬ－アスパラギン（最終濃度０．６６７ｍｏｌ/L）と、９ｇのＬ－アスパラギン酸（最終濃度０．１１３ｍｏｌ/L）を加え、メスアップして液量を６００ｍＬとした。この反応液を耐圧ガラス容器に入れて密栓し、９０℃の水浴中で加温し、添加したＬ－アスパラギンやＬ－アスパラギン酸を完全溶解した。次に、加温して８０℃程度にしたオートクレーブ内に、この耐圧容器内の反応液を入れ、１２１℃で１８０分間加熱処理した。
　反応後、上記反応液を２５℃まで自然冷却した後、５Ｌのビーカーに反応液を取り出し、氷冷した。約１２０ｇの水酸化ナトリウムを５００ｍＬの精製水に溶解し、この水酸化ナトリウム水溶液を氷冷し、上記の反応液に徐々に加えて、反応液をｐＨ５．８に中和した（中和熱で発熱するため２５℃になるのを確認しながら中和した）。中和後に反応液の容量を精製水で１２００ｍＬとした。次に、２００ｇの塩化カルシウム（二水和物）を２Ｌの精製水に溶解し、塩化カルシウム溶液を調製し、その約半量を上記の反応液に加えて、よく撹拌し、約１６時間静置した。溶液には白色に沈降物（クエン酸カルシウム）が析出した。さらに塩化カルシウム溶液を加えると白色沈降物が新たに沈降したので、徐々に塩化カルシウム溶液を追加して、１２００ｍＬの中和した反応液に、上記の塩化カルシウム溶液を約２Ｌ（塩化カルシウム量で、１．３６ｍｏｌ）加えた。この混合溶液に精製水を加えて全量を３６００ｍＬとし、その後にクエン酸カルシウムである白色沈降物を遠心分離により除去し、上清を回収した。次に、この上清をエバポレーターで８００ｍＬに濃縮した。濃縮した水溶液に１８６０ｍＬのエタノールを加えて撹拌した。しばらく静置すると、エタノールを加えた混合液は２層に分離し、比較的透明な上層（エタノール層）と、着色が見られ粘性のある下層溶液とに分かれた。下層を分液回収し、精製水で８００ｍＬ程に希釈した後、エバポレーターで溶液中に残存するエタノールを留去した。得られた下層の水溶液（粗精製溶液Ｉ）のＨＰＬＣ分析を行ったところ、ＲＴ　２１．１分にピークが見られたことから、先に梅肉エキスから抽出・分離した活性成分と同じ成分が合成されたことが確認された（図５）。この活性成分は、後述する構造解析により化合物Iであることが判明した。
　合成した活性成分の確認（図５）におけるHPLCによる分析条件は以下のとおりであった。
 
［ＨＰＬＣ分析系］
装置：日本分光製高速液体クロマトグラフ
カラム：Excelpak CHA-E11（３００ｍｍ×４．６ｍｍ　I.D. Yokogawa analytical system）を２本連結
移動相：３ｍＭ硫酸水溶液
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：５５℃
注入量：２０μＬ
検出波長：２１０ｎｍ

（化合物Ｖの合成）
　上記の合成した活性成分を含む粗精製溶液Ｉに水酸化ナトリウムを加えて液性をｐＨ７．６、ｐＨ８．６、ｐＨ９．６に調整した溶液をそれぞれ調製し、１２１℃で、３０分の加熱処理を行った。アルカリ条件下で加熱処理した各溶液を、化合物Ｉの合成検討と同じＨＰＬＣ評価系で分析し、化合物ＩのＲＴ　２１．１分のピークの変化を観察した。その結果、ｐＨ９．６に調整した溶液では、ＲＴ　２１．１分のピークはほぼ消失し、ＲＴ　２０．７分に新たなピークが確認された（図６）。このＲＴ　２０．７分の成分は、先に梅肉エキスから抽出・精製した活性成分をアルカリ添加の条件で加水処理して得られる活性成分の派生物と一致した。後述の解析によりこの活性成分の派生物のピークは、主に化合物Ｖと、少量の化合物IXが含まれることが判明した。化合物IXは、化合物Ｖの構造異性体である。
 
（合成した化合物Iおよび化合物Ｖの単離と構造解析）
　上記の合成方法で作成した粗精製溶液Ｉにアルカリを加えｐＨ６．５で加熱処理（121℃30分）して、活性成分（ＲＴ　２１．１分の成分）および活性成分の派生物（ＲＴ　２０．７分の成分）を含む試料を作成し、高分離能カラムを用いたHPLC分析系で構成成分を確認した。その結果を（図７）に示す。ＲＴ　21.1分の成分は、図７のピークAとピークBの2本のピーク分かれ、これらのピークの保持時間は梅肉エキスから抽出・分離された活性成分に由来する図４のピークAとピークBの保持時間に一致した。ＲＴ　20.7分の成分は、ＲＴ2.9～3.5分に3本のピーク（図７のピークC、D、E)として観察される。これらのHPLCにおけるピークの保持時間は、梅肉エキスから抽出・分離された活性成分の派生物に由来ピーク（図4のピークC、D、E）の保持時間に一致した。これらの結果から、上記の合成方法により得られた活性成分や、その派生物は、梅肉エキスに含まれる成分と同一であることが確認された。
（単離および構造解析）
　上記の高分解能カラムを用いた分析で分離・検出された活性成分（図７のピークAおよびB）および活性成分の派生物（図７のピークC、D、E）について、さらにカラムクロマトグラフィーによる精製を行った。その結果、活性成分の2本のピークのうち１成分（図７のピークB、以下ピークB）を単離することができた。その成分のLC-MS分析系による質量分析、NMRによる構造解析、IRによる官能基の解析をおこなった結果、以下の化合物Ｉとして示される構造であることが分かった。構造解析は、質量分析とNMR解析により化学式と基本骨格を特定し、IRスペクトルによる酸無水物（1800 cm-1付近）の否定とイミドに由来すると思われるスペクトル（1700cm-1付近）の確認により行った。この化合物は、アスパラギン酸のアミノ基とクエン酸の2つのカルボキシル基が縮合して環状イミド化した構造を有する。
　化合物Iの構造解析に用いたNMR、LC-MS、IRの測定条件は以下のとおりである。
［NMR分析系]
装置：Bruker Biospin社製　AVANCE500型（cryo Probe）
測定核種：水素（1H）、炭素（13C）
測定溶媒：D2O
測定方法：1H NMR、13C NMR、13C NMR（DEPT）、1H-1H COSY、HMQC、HMBC
 
［LC-MS分析系］
液体クロマトグラフ部
装置：Agilent Technologies製　1200型
カラム：Thermo Fisher SCIENTIFIC製　FLUOPHASE PFP (4.6×100mm, 5μm) 
移動相：A：0.1%ギ酸水溶液　B：アセトニトリル　A/B=98/2
流速：0.8mL/min
カラム温度：35℃
注入量：10μL
検出波長：200nm
質量分析部
装置：Agilent Technologies製　6140型
測定モード：PositiveモードおよびNegativeモード
測定質量範囲：m/z 50～1350
 
［FT-IR分析系］
装置：Agilent Technologies社製　Cary670
測定方法：顕微ATR法
測定範囲：700cm-1～4000cm-1
分解能：4cm-1
積算回数：64回
クリスタル：ゲルマニウム
[ピークBのデータ］
NMR分析データ
1H NMR（500MHz，D2O）δ=2.89, 2.90, 2.99, 3.19, 3.22, 5.02；
13C NMR（125MHz，D2O）δ= 36.798, 43.990, 44.557, 53.739, 74.963, 176.172, 176.908, 178.084, 179.376, 182.172；
 
質量分析データ
LC-MS m/z：290(M+H)+，288(M-H)-　（RT4.0分）
 
FT-IRデータ
1704.8cm-1 very strong
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 (図中の＊はクエン酸由来の構造中の不斉炭素の位置を示す。また破線は平面より奥に、太線は手前にあることを示す。)
　この化合物Ｉには、クエン酸由来のプロパン鎖の2位の炭素（＊を付記した炭素）を不斉炭素としたジアステレオマーが存在する（アスパラギン酸由来の構造内にも不斉炭素が存在するが、天然植物素材の梅を原料とした場合、ほぼL体のアミノ酸が原料となるのでエナンチオマーはほとんど存在しない）。このジアステレオマーをＩ(a)およびＩ(b)とすると、上記で単離した活性成分（ピークB）はジアステレオマーＩ(a)又はＩ(b)のいずれか一方であり、上記に示した化合物ＩのNMR分析データはＩ(a)又はＩ(b)の一方のデータである。得られた結果から単離したピークBが、どちらのジアステレオマーに相当するかを見分けることはできない。図４並びに図７に示される活性成分に由来する２つのピークのうちピークA（以下　ピークA）が、単離されたピークBのジアステレオマーであることは、分子量が一致していること、ならびにNMRのデータが非常に近接した類似するスペクトルパターンであることにより確認できる。そこで、ピークAが豊富となった（ピークBの若干の混入）試料について、同様にLC-MSによる質量分析、およびNMRによるスペクトル解析を行った。質量分析の結果はピークAとピークBの分子量がともに289で一致していることが示され、NMRのスペクトルデータも近接した同様のスペクトルパターンを示すことが確認された。従って、活性物質として精製したピークAおよびピークBは、化合物Iの構造を有するジアステレオマーであることが確認された。
［ピークAのデータ］
NMR分析データ
1H NMR（500MHz，D2O）δ=2.90, 2.96, 3.05, 3.25, 3.28, 5.15；
13C NMR（125MHz，D2O）δ= 36.129, 43.290, 44.400, 52.779, 75.201, 174.774, 175.865, 177.187, 179.214, 181.755；
 
質量分析データ
LC-MS m/z：290(M+H)+，288(M-H)-　（RT4.0分）
 
FT-IRデータ
1706.9cm-1 very strong
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 （図中の＊はクエン酸由来の構造の不斉炭素の位置を示す）
　上記の活性成分の派生物は、高分離能カラムを用いた分析の結果、3成分から構成されたピークであることが確認できた（［００６４］）。これら３成分についてLC-MSで分析した結果、これら３成分が同一の分子量（分子量307）を有し、化合物Ｉの構造(分子量289)に水分子が1分子付加された構造で、化合物Ｉの部分的な加水分解物であることが確認された。さらに解析を行いNMR解析等の結果、化合物Ｖおよび化合物IXの存在が確認された。
　これらの化合物は、化合物Ｉのイミド環が開環することで生成され、開環の様式によって化合物Ｖと化合物IXの二通りに分かれるが、アルカリ添加の条件下では化合物Ｖが優位に生成される。化合物Ｖにはクエン酸由来のプロパン鎖の2位の炭素（＊を付記した炭素）を不斉炭素としたジアステレマーが存在するが、NMRとLC-MSのデータからこれらを見分けることはできない。これら化合物Ｖのジアステレオマーは、化合物Ｉのジアステレオマーの加水分解物としてそれぞれ一方が得られる。そして、化合物IXは、化合物Ｉのジアステレオマーのいずれの加水分解からも少量生成される。従って、活性成分の派生物の高分離能カラムを用いた分析で検出された３成分は、化合物Ｖのジアステレオマー2成分と、化合物IXであることが分かった。
　以下に化合物ＶのＮＭＲ（ジアステレオマーの一方のデータ）、および化合物Ｖと化合物IXの混合物のＬＣ-ＭＳ（３種を同時測定したが、単一の結果であった）。分析条件は化合物Iの分析と同様である。
[化合物ＶのNMRデータ]
1H NMR（500MHz，D2O）δ= 2.78, 2.88, 2.95, 3.05, 4.75
13C NMR（125MHz，D2O）δ = 38.7, 46.1, 47.3, 52.1, 76.6, 166.5, 174.0, 176.9, 177.3, 179.8
［化合物Ｖおよび化合物IXの混合物のデータ］
LC-MS m/z：308(M+H)+，330(M+Na)+，306(M-H)-　（RT 2.8～3.5分）
（化合物IIの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　５００ｍｇ／ｍＬのクエン酸（一水和物）水溶液に、Ｌ－グルタミン酸を最終濃度が４０ｍｇ／ｍＬ（９０℃における溶解限界量）となるように添加し、９０℃の水浴で完全溶解したのち、オートクレーブで１２１℃、２４０分の加熱処理を行った。加熱処理後には、ＨＰＬＣ評価系で分析した結果、加熱処理後に、HPLCで分析した結果、RT5.8分とRT11.5分に加熱により生成した成分に由来するピークが現れた（図８）。LC-MS分析の結果、RT5.8分の成分（図８のピーク１）の分子量は303となり、L-グルタミン酸のアミノ基に、クエン酸が化合物Ｉと同じ骨格となるようにイミド結合した化合物が合成されたことを示している。また、RT11.5分の成分（図８のピーク２）の分子量は129となり、これはL-グルタミン酸の側鎖と主鎖が脱水縮合して環化したL-グルタミン酸無水物の分子量に一致した。
　上記の化合物IIの合成検討に用いたHPLC分析、およびLC-MS分析の分析条件は以下のとおりであった。
[LC-MS分析系］
液体クロマトグラフ部
装置：Waters製ACQUITY UPLC型
カラム：信和化工製ULTRON PS-80H(4.6×250mm) 
移動相：0.1%ギ酸水溶液
流速：0.25mL/min
カラム温度：55℃
注入量：1μL
質量分析部
装置：Waters製Synapt G2-S型
測定モード：PositiveモードおよびNegativeモード
測定質量範囲：m/z 50～1000
 
［化合物IIの合成反応液のLC-MSデータ］
LC-MS m/z：304(M+H)+，321(M+NH4)+，326(M+Na)+，629(2M+Na)+，302(M-H)-，605(2M-H)-（RT5.8分）
LC-MS m/z：130(M+H)+， 128(M-H)- RT11.5分）
 
　次に同様に、クエン酸溶液にＬ－グルタミンを添加して加熱処理を行った。Ｌ－グルタミンのクエン酸（５００ｍｇ／ｍＬ）水溶液への添加量は、７０ｍｇ／ｍＬ（９０℃における溶解限界量）で、９０℃の水浴で完全溶解したのち、オートクレーブで１２１℃、２４０分の加熱処理を行った。加熱処理後の溶液には、同様のＨＰＬＣ評価系で分析した結果Ｌ－グルタミン酸を原料に用いた場合と同じリテンションタイムの生成物のピークが得られた。従って、Ｌ－グルタミン酸に代えて、Ｌ－グルタミンを原料に用いた場合でも、同じ構造を有する化合物IIが得られる。
（化合物IIIの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　(S)-α-アミノ-γ-ブチロラクトン（別名(L)-ホモセリンラクトン）をクエン酸溶液（500mg/mL）へ、最終濃度が100mg/mL（90℃における溶解限界量）となるように添加し、オートクレーブで121℃、240分の加熱処理を行った。加熱処理後に、HPLCで分析した結果、RT7.9分に加熱により生成した成分に由来するピークが現れた（図9）。LC-MS分析の結果、RT7.9分の成分の分子量は257となり、これは(L)-ホモセリンラクトンのアミノ基に、クエン酸が化合物Ｉと同じ骨格にとなるようにイミド結合した化合物が合成されたことを示している。評価に用いたHPLC分析およびLC-MS分析の分析条件は化合物IIの評価と同一である。
　上記の化合物IIIの合成検討で得られたLC-MS分析のデータを以下に示す。
［化合物IIIのデータ］
LC-MS m/z：258(M+H)+，275(M+NH4)+，280(M+Na)+, 256(M-H)-（RT7.9分）
（化合物IＶの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　L-アラニンを、クエン酸（500mg/mL）水溶液へ、最終濃度が100mg/mL（90℃における溶解限界量）となるように添加し、オートクレーブで121℃、240分の加熱処理を行った。加熱処理後に、HPLCで分析した結果、RT6.2分に加熱により生成した成分に由来するピークが現れた（図１０）。LC-MS分析の結果、RT6.2分の成分の分子量は245となり、これはL-アラニンのアミノ基に、クエン酸が化合物Ｉと同じ骨格にとなるようにイミド結合した化合物が合成されたことを示している。評価に用いたHPLC分析およびLC-MS分析の分析条件は化合物IIの評価と同一である。
　上記の化合物IIIの合成検討で得られたLC-MS分析のデータを以下に示す。
［化合物IＶのデータ］
LC-MS m/z：246(M+H)+，368(M+Na)+，513(2M+Na)+，244(M-H)-，489(2M-H)-（RT6.2分）
（クエン酸とアミノ酸との加熱による合成法が選択的なイミド形成反応であることの確認）
（１）リンゴ酸を使用した反応での比較
　クエン酸（２５０ｍｇ／ｍＬ）とアスパラギン酸（１１．１ｍｇ／ｍＬ）、及び、リンゴ酸（２５０ｍｇ／ｍＬ）とアスパラギン酸（１１．１ｍｇ／ｍＬ）の水溶液をそれぞれ１２１℃で３０分加熱した。反応溶液をＨＰＬＣ分析したところ、クエン酸では明確な化合物Ｉのピークが見られたが（図１１参照）、リンゴ酸では明確なピークが見られなかった（図１２参照）。アスパラギン酸をアスパラギンに変えて同様に行った実験においてもクエン酸ではシングルピークの明確な化合物Ｉのピークが見られるが、リンゴ酸では明確なピークが見られなかった。そしてまた、クエン酸とリンゴ酸を混合して、同様の実験を行った場合でも、クエン酸由来の合成物（ＲＴ：２１．１）しか確認されなかった。以上のことから、有機酸と、アスパラギンやアスパラギン酸等のアミノ酸とのイミド形成反応は、クエン酸のみに選択的に起こるといえる。
（２）ヒドロキシクエン酸を使用した反応での比較
　ヒドロキシクエン酸水溶液（１．１９ｍｏｌ／Ｌ；クエン酸２５０ｍｇ／ｍＬと同じモル濃度）に、アスパラギン酸（１５ｍｇ／ｍＬ）とアスパラギン（１００ｍｇ／ｍＬ）を溶解させ、１２１℃で１８０分加熱した。反応溶液をＨＰＬＣ分析したところ、少なくとも主要な新規反応物として３つの新たなピークが出現した（図１３参照）。ヒドロキシクエン酸とアスパラギンやアスパラギン酸などのアミノ酸が反応した場合、単純に同様のイミド形成反応が行われると２種類のイミド化合物が想定されるが、実際には３種類の主要な新規化合物が形成された。このことから、アスパラギンやアスパラギン酸などのアミノ酸とのイミド形成反応以外（例えばアミド形成反応）の副反応が強く起こったことを示し、ヒドロキシクエン酸では、イミド形成反応が選択的に行われない。
　以上のように隣接する炭素に結合した2つのカルボキシルがアミノ酸とイミドを形成する反応は、リンゴ酸やヒドロキシクエン酸のような部分的にクエン酸に類似する化合物を原料にした場合にはその選択性が失われる。一方、上記の化合物II、化合物III、化合物IVの合成検討に見られるように、イミドを形成するアミノ基がαアミノ基（カルボキシル基の結合した炭素に結合したαアミノ基）であれば良く、その側鎖の構造によってイミド形成反応はほとんど影響をうけることはなく、そのイミド形成の選択性は失われない。
３．生物活性試験
［試験例１］
（動物試験投与物の調製）
（１）化合物Ｉ投与物の調製
　粗精製溶液Ｉ　１００ｍＬに、８Ｎ水酸化ナトリウム水溶液をｐＨメーターで確認しながら少量ずつ滴下し、溶液の液性をｐＨ６．５に調整した。さらに、溶媒で希釈した。
（２）化合物Ｖ投与物の調製
　粗精製溶液Ｉ　１００ｍＬに、８Ｎ水酸化ナトリウム水溶液をｐＨメーターで確認しながら少量ずつ滴下し、溶液の液性をｐＨ８．６に調整した後、１２１℃で３０分加熱し、さらに、溶媒で希釈した（加熱処理後の溶液のｐHは、加水分解反応により酸形成され、ｐHが6.2ほどに変化する）。
（肝機能障害抑制効果に関する試験）
　上記（１）～（２）の投与物をオリゴ糖・環状オリゴ糖・Ｄ－ソルビトールで構成される溶媒に溶解し、投与した溶解液の化合物ＩおよびＶの最終濃度は、６ｍｇ/ｍＬとなるように調製した。市販固形飼料の自由摂餌および水道水の自由飲水下の８週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社）に、上記比重換算し溶解液で６ｇ／ｋｇとなるように７日間経口投与した。対照動物には上記（１）および（２）を含まない溶媒のみを６ｇ／ｋｇ、７日間経口投与した。投与開始７日目にガラクトサミン塩酸塩（和光純薬工業株式会社）を７５０ｍｇ／ｋｇの用量を、対照物、化合物ＩおよびＶのぞれぞれの投与動物に腹腔内投与し、投与開始９日目にペントバルビタール麻酔下（５０ｍｇ／ｋｇ）に開腹し腹部大動脈よりヘパリン加血液を採取した。得られた血液は血漿に分離し、ＡＳＴ、ＡＬＴ値をＪＳＣＣ標準化対応法により測定した。図１４において、結果は平均値＋標準偏差（１群動物数、各２０例）で示した。＊は対照物群との有意差（ｐ＜０．０５）を示すが、１元配置分散分析後にＤｕｎｎｅｔ　ｔｅｓｔにより検定した。
　ラットの血漿中のＡＳＴ値（左）、ＡＬＴ値（右）の変化を示す図を図１４に示す。化合物Ｉ投与物群、化合物Ｖ投与物群において、対照物投与物群と比較して、ＡＳＴ値、ＡＬＴ値が有意に低値であったこと、すなわち、肝障害が治療、抑制されたことがわかった。
［試験例２］
（粗精製化合物ＩのＮＡＳＨに対する評価試験）
（１）粗精製化合物Ｉ溶液の作製
　上記粗精製溶液Ｉ（［００６０］）から、含有する化合物Ｉ濃度が２６ｍｇ/ｍLとなるよう、HPLCクロマトグラムのピーク強度から化合物Ｉの濃度を決定し、粗精製物作製を行った。粗精製化合物Ｉ溶液の溶媒には、オリゴ糖・環状オリゴ糖・Ｄ－ソルビトールで構成される溶媒を使用した。
　最終的な溶液のpHは水酸化ナトリウムを用いてpHを6.0とした。
（２）動物実験手順
　妊娠１７日目のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールズリバー社製）３０匹について、標準食として、ガンマ線照射固型飼料（ＣＲＦ－１、オリエンタル酵母工業社製)の自由摂取、及び蒸留水の自由飲水下に個別飼育を行い、出産させた。産子マウスは、ＳＴＺを投与するマウスと投与しないマウス（標準マウス）に分割した。
　ＳＴＺを投与する各マウスには、出生日を０日として出生後２日目に、インスリン用シリンジ（マイジェクター、テルモ社製）を用いて、ＳＴＺ（シグマ社製）の１０ｍｇ／ｍＬ（０．１Ｍクエン酸バッファーｐＨ４．５）溶液２０μＬを背部皮下投与した。ＳＴＺ投与後は４週齢に達するまで母乳栄養により飼育された。４週齢に達し、ＳＴＺ投与後４週間経過した日に、雌雄の判別を行い、雄性の個体を選択した。この時点を離乳とし、これ以降、高脂肪食（ＨＦＤ３２、日本クレア社製）を給餌し、ＳＴＺ誘発ＮＡＳＨモデルマウス群として飼育を行った。ＳＴＺを投与しなかった標準マウスには、高脂肪食の代わりにＣＲＦ－１を給餌した。また、蒸留水の自由飲水下に飼育を行った。
　５週齢に達した雄性のマウスは、６時間絶食した後、尾静脈を穿刺して静脈血を採取し、簡易血糖測定装置（グルテストＮｅｏセンサー、三和化学研究所製）を使用して血糖値を測定した。また、同日に体重測定も実施した。
　体重及び血糖値に基づいて、統計解析システムEXSAS7.7（ＣＡＣエクシケア社製)を用いてNASHモデルマウスは層別無作為化割付にて群分けされた。上記粗精製化合物Ｉ溶液の投与を行う粗精製化合物Ｉ群と、対照物質のオリゴ糖・環状オリゴ糖・Ｄ－ソルビトールで構成される溶媒の投与を行う溶媒群の2群に分けた。群分け日を投与開始日として、当該日から１４日間連続してそれぞれ午前９時から午前１１時の間に１回と午後５時から午後７時の間に１回ずつ経口胃ゾンデを用いて、粗精製化合物Ｉ群には、１０ｍＬ／ｋｇ（体重）の粗精製化合物Ｉ溶液を、溶媒群には、１０ｍＬ／ｋｇ （体重）の溶媒を投与した。
 
　試験物質の投与試験開始１４日後の剖検日には、ソムノペンチル麻酔下に全ての動物から腹部大静脈より採血を行った。採血後は放血により安楽死させた。得られた血液は直ちにヘパリンが入った遠心チュープに回収し、３０００ｒｐｍにて、１０分間遠心分離して血漿を得た。
　血漿中のアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）濃度とアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）濃度は、日立７１８０型自動分析装置を用いたＪＳＣＣ標準化対応法により測定された。測定値は平均値±標準偏差（Mean±SD）で表示した。
（結果）
　結果を図１５に示す。図１５から明らかなように、溶媒群に比し、粗精製化合物Ｉ群の血漿中AST及びALT濃度はそれぞれ低減した。（unpaired t-test（溶媒群vs粗精製化合物Ｉ群）、*ｐ＜０．０５vs溶媒群、正常群（ｎ＝５）、溶媒群（ｎ＝１９）、粗精製化合物Ｉ群（ｎ＝１５）、AST：p=0.05,　ALT：p < 0.05）
　本発明の化合物を用いた試験では、血中ＡＳＴ及びＡＬＴが低減した。したがって、本発明の化合物は肝障害抑制剤として使用することができる。

Claims (12)

  1. 　式（１）および（２）で表される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
     （式中、Ｒ１は、カルボキシル基若しくは水酸基を有していてもよいＣ１～Ｃ３アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表すか、又は、Ｒ１及びＲ２は、一緒になって環状構造を形成してもよくＣ２～Ｃ３アルキレン鎖を表す。）
  2. 　式（１）で表される化合物が、以下の構造で表されることを特徴とする請求項１記載の化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
  3. 　式（２）で表される化合物が、以下の構造で表されることを特徴とする請求項１記載の化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
  4. 　式（１）および（２）で表される１種若しくは２種以上の化合物を含む、肝障害抑制剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
     （式中、Ｒ１は、カルボキシル基若しくは水酸基を有していてもよいＣ１～Ｃ３アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表すか、又は、Ｒ１及びＲ２は、一緒になって環状構造を形成してもよく、Ｃ２～Ｃ３アルキレン鎖を表す。）
  5. 　肝障害が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項４記載の肝障害抑制剤。
  6. 　クエン酸と式（３）で表されるアミン化合物との混合物を加熱反応させることを特徴とする、式（１）で表される化合物の合成方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
     （式中、Ｒ１は、カルボキシル基若しくは水酸基を有していてもよいＣ１～Ｃ３アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表すか、又は、Ｒ１及びＲ２は、一緒になって環状構造を形成してもよく、Ｃ２～Ｃ３アルキレン鎖を表す。）
  7. 　クエン酸と式（３）で表されるアミン化合物との混合物を、１００～１３０℃で、３０分～３００分間反応させることを特徴とする、請求項６に記載の合成方法。
  8. 　クエン酸と式（３）で表されるアミン化合物との混合比（クエン酸の濃度：式（３）で表されるアミン化合物の濃度）が７５：１～１２：１０であることを特徴とする、請求項６又は７に記載の合成方法。
  9. 　式（１）で表される化合物を水酸化物イオンが生じるアルカリ性物質を添加した水溶液中で加熱することを特徴とする、式（２）の化合物の変換方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
     （式中、Ｒ１は、カルボキシル基若しくは水酸基を有していてもよいＣ１～Ｃ３アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表すか、又は、Ｒ１及びＲ２は、一緒になって環状構造を形成してもよく、Ｃ２～Ｃ３アルキレン鎖を表す。）
  10. 　式（１）で表される化合物を水酸化物イオンが生じるアルカリ性物質を添加したｐH６．０～１２.０の水溶液を、８０～１３０℃で、２０分～２４０分間反応させることを特徴とする、請求項９に記載の変換方法。
  11. 　式（１）および（２）で表される１種若しくは２種以上の化合物を含む、食品。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
     （式中、Ｒ１は、カルボキシル基若しくは水酸基を有していてもよいＣ１～Ｃ３アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表すか、又は、Ｒ１及びＲ２は、一緒になって環状構造を形成してもよく、Ｃ２～Ｃ３アルキレン鎖を表す。）
  12. 　式（１）および（２）で表される１種若しくは２種以上の化合物を含む、食品添加剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
     （式中、Ｒ１は、カルボキシル基若しくは水酸基を有していてもよいＣ１～Ｃ３アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表すか、又は、Ｒ１及びＲ２は、一緒になって環状構造を形成してもよく、Ｃ２～Ｃ３アルキレン鎖を表す。）
     
     
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