KR102187785B1 - 신규 구연산 유도체 - Google Patents

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KR102187785B1
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카츠야 히라이시
후미에 짐마
히로유키 소마
타로 아다치
마사카즈 아다치
이페이 야마오카
토모히로 카가와
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가부시기가이샤오오쓰까세이야꾸고오죠오
아다바이오 씨오., 엘티디.
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Abstract

하기 식(1) 및 (2)로 표시되는 화합물(구연산 유도체)은 간 장애 억제 효과를 갖는 신규 화합물이며, 간 장애 억제제, 식품 첨가제로 사용할 수 있다.
(식 중, R1은 카복실기 또는 수산기를 갖고 있을 수도 있는 C1~C3 알킬기를 나타내고, R2는, 수소 원자를 나타내거나, 또는, R1 및 R2는 함께 고리형 구조를 형성할 수도 있고, C2~C3 알킬렌 사슬을 나타낸다.)
Figure 112018044282665-pct00037

Description

신규 구연산 유도체
본 발명은 신규 구연산 유도체에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 간 장애 억제 효과를 갖는 구연산 유도체에 관한 것이다.
매실(Prunus mume)은 장미과 벚나무아과 벚나무속 자두아속에 속하고, 매실 장아찌, 매실주, 매육(梅肉) 엑기스 등의 매실 가공품이 식용되고 있다. 또한, 매육 엑기스는 살균, 피로 회복, 위 보호 작용 등의 효과를 갖고 있고, 건강을 위해 섭취되어 왔다. 그리고 또한, 매육 엑기스에는 혈류 개선 효과가 있는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1, 2 참조). 상기 혈류 개선 효과는 매육 엑기스에 포함된 구연산, 말산 등의 유기산과 당의 가열에 의해 생성되는 무메후랄(Mumefural) 및 그 관련 화합물에 기인하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 3).
Figure 112018044282665-pct00001
매육 엑기스를 포함하는 건강식품 중 하나로 미사톨(Misatol)(등록상표)이 시판되고 있고, 미사톨은 자가소화작용(Autophagy)을 유도하는 효과나 바이러스성 간염 환자의 간 장애 억제 효과가 있는 것으로 알려져 있다(특허문헌 1, 2).
일본 특허공보 4842624호 일본 특허공보 5577129호
J. Agric. FoodChem., 1999, 47, 828-31 유변학(hemorheology) 연구회지 1, 65-67, 1998 유변학(hemorheology) 연구회지 3, 81-88, 2000
본 발명의 과제는 간 장애 억제 효과가 있는 화합물을 제공하는 것이다.
구연산(IUPAC명:2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid)의 탄소 사슬인 프로판 사슬의 1위치의 탄소(또는 3위치의 탄소)와 2위치의 탄소에 결합되어 있는 2개의 카복실기가 특정 아미노산의 아미노기와 이미드 결합을 형성한 화합물, 및 그 이미드 화합물을 가수분해함으로써 얻어지는 구연산 유래 프로판 사슬의 1위치의 탄소(또는 3위치의 탄소)에 결합되어 있는 카복실기와 아미노산의 아미드 화합물은, 간 장애 억제 효과를 갖는 활성 물질인 것을 알 수 있었다.
즉, 본 발명은 아래에 관한 것이다.
[1] 식(1) 및 (2)로 표시되는 화합물.
Figure 112018044282665-pct00002
(식 중, R1은 카복실기 또는 수산기를 갖고 있을 수도 있는 C1~C3 알킬기를 나타내고, R2는 수소 원자를 나타내거나, 또는 R1 및 R2는 함께 고리형 구조를 형성할 수도 있고, C2~C3 알킬렌 사슬을 나타낸다.)
[2] 식(1)로 표시되는 화합물은 하기 구조로 표시되는 것을 특징으로 하는 [1]의 화합물.
Figure 112018044282665-pct00003
[3] 식(2)로 표시되는 화합물은 하기 구조로 표시되는 것을 특징으로 하는 [1]의 화합물.
Figure 112018044282665-pct00004
[4] 식(1) 및 (2)로 표시되는 1종 또는 2종 이상의 화합물을 포함하는, 간 장애 억제제.
Figure 112018044282665-pct00005
(식 중, R1은 카복실기 또는 수산기를 갖고 있을 수도 있는 C1~C3 알킬기를 나타내고, R2는 수소 원자를 나타내거나, 또는 R1 및 R2는 함께 고리형 구조를 형성할 수도 있고, C2~C3 알킬렌 사슬을 나타낸다.)
[5] 간 장애가, 비알코올성 지방성 간염(NASH)인, [4]에 기재된 간 장애 억제제.
[6] 구연산과 식(3)으로 표시되는 아민 화합물의 혼합물을 가열 반응시키는 것을 특징으로 하는, 식(1)로 표시되는 화합물의 합성 방법.
Figure 112018044282665-pct00006
(식 중, R1은 카복실기 또는 수산기를 갖고 있을 수도 있는 C1~C3 알킬기를 나타내고, R2는 수소 원자를 나타내거나, 또는 R1 및 R2는 함께 고리형 구조를 형성할 수도 있고, C2~C3 알킬렌 사슬을 나타낸다.)
[7] 구연산과 식(3)으로 표시되는 아민 화합물의 혼합물을 100~130℃에서 30분~300분간 반응시키는 것을 특징으로 하는, [6]에 기재된 합성 방법.
[8] 구연산과 식(3)으로 표시되는 아민 화합물의 혼합비(구연산의 농도:식(3)으로 표시되는 아민 화합물의 농도)가 75:1~12:10인 것을 특징으로 하는, [6] 또는 [7]에 기재된 합성 방법.
[9] 식(1)로 표시되는 화합물을 수산화 이온이 발생하는 알칼리성 물질을 첨가한 수용액 중에서 가열하는 것을 특징으로 하는, 식(2)의 화합물의 변환 방법.
Figure 112018044282665-pct00007
(식 중, R1은 카복실기 또는 수산기를 갖고 있을 수도 있는 C1~C3 알킬기를 나타내고, R2는 수소 원자를 나타내거나, 또는 R1 및 R2는 함께 고리형 구조를 형성할도 수 있고, C2~C3 알킬렌 사슬을 나타낸다.)
[10] 식(1)로 표시되는 화합물을 수산화 이온이 발생하는 알칼리성 물질을 첨가한 pH 6.0~12.0의 수용액 중에서 80~130℃에서 20분~240분간 반응시키는 것을 특징으로 하는, [9]에 기재된 변환 방법.
[11] 식(1) 및 (2)로 표시되는 1종 또는 2종 이상의 화합물을 포함하는, 식품.
Figure 112018044282665-pct00008
(식 중, R1은 카복실기 또는 수산기를 갖고 있을 수도 있는 C1~C3 알킬기를 나타내고, R2는 수소 원자를 나타내거나, 또는 R1 및 R2는, 함께 고리형 구조를 형성할 수도 있고, C2~C3 알킬렌 사슬을 나타낸다.)
[12] 식(1) 및 (2)로 표시되는 1종 또는 2종 이상의 화합물을 포함하는, 식품 첨가제.
Figure 112018044282665-pct00009
(식 중, R1은 카복실기 또는 수산기를 갖고 있을 수도 있는 C1~C3 알킬기를 나타내고, R2는 수소 원자를 나타내거나, 또는, R1 및 R2는 함께 고리형 구조를 형성할 수도 있고, C2~C3 알킬렌 사슬을 나타낸다.)
식(1) 및 (2)로 표시되는 화합물은 간 장애 억제 효과를 갖는다. 또한, 화합물 I 및 V는 매육 엑기스로부터 추출, 유도, 분리될 수도 있다.
도 1은 매육 엑기스의 수용성 성분의 HPLC에 의한 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 매육 엑기스 유래 생리 활성 성분을 포함하는 정제 분획(分劃)의 HPLC에 의한 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 매육 엑기스 유래 생리 활성 성분을 포함하는 분획을 알칼리 조건하에서 가수 처리한 샘플의 HPLC에 의한 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 매육 엑기스 유래 생리 활성 성분과 그 가수분해물을 고분리능(高分離能) 칼럼을 이용한 HPLC로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 구연산과 L-아스파르트산의 반응에 의한 화합물 I의 생성을 나타내는 HPLC에 의한 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 구연산과 L-아스파르트산으로부터 합성된 화합물 I을 알칼리 조건하에서 가열 처리한 샘플의 HPLC에 의한 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 합성한 화합물 I과 그 가수분해물을 고분리능 칼럼을 이용한 HPLC로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 구연산과 L-글루탐산의 반응에 의한 화합물 II의 생성을 나타내는 HPLC에 의한 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 화합물 III의 생성을 나타내는 HPLC에 의한 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 화합물 IV의 생성을 나타내는 HPLC에 의한 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 구연산과 아스파르트산의 반응 용액의 HPLC에 의한 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 12는 말산과 아스파르트산의 반응 용액의 HPLC에 의한 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 13은 하이드록시 구연산과 아스파르트산 및 아스파라긴의 반응 용액의 HPLC에 의한 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 14는 화합물 I, V 섭취 시의 랫트의 ALT값, AST값의 변화를 나타내는 도면이다. 도면 중, 각각의 군에 있어서, 좌측의 막대 그래프가 AST를 나타내고, 우측의 막대 그래프가 ALT를 나타낸다.
도 15는 화합물 I 섭취 시의 NASH 모델 마우스의 ALT값, AST값의 변화를 나타내는 도면이다. 도면 중, 각각의 군에 있어서, 좌측의 막대 그래프가 AST를 나타내고, 우측의 막대 그래프가 ALT를 나타낸다.
(화합물)
본 발명의 화합물은 하기 식(1) 및 (2)로 표시되는 화합물이다.
Figure 112018044282665-pct00010
식 중, R1은 카복실기 또는 수산기를 갖고 있을 수도 있는 C1~C3 알킬기를 나타내고, R2는 수소 원자를 나타내거나, 또는 R1 및 R2는 함께 고리형 구조를 형성할 수도 있고, C2~C3 알킬렌 사슬을 나타낸다.
상기 카복실기 또는 수산기를 갖고 있을 수도 있는 C1~C3 알킬기에서의 C1~C3 알킬기는 탄소수 1~3의 직쇄형 또는 분지형의 알킬기이며, 구체적으로 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기를 들 수 있다. 또한, 카복실기를 갖는 C1~C3 알킬기는 하기 식으로 표시된다.
상기 카복실기를 갖는 C1~C3 알킬기는 하기 식으로 표시된다.
Figure 112018044282665-pct00011
(파선(波線)은 인접하는 탄소 원자에 대한 결합 위치를 나타낸다.)
상기 수산기를 갖는 C1~C3 알킬기는 하기 식으로 표시된다.
Figure 112018044282665-pct00012
(파선은 인접하는 탄소 원자에 대한 결합 위치를 나타낸다.)
R1 및 R2는 함께 고리형 구조를 형성할 수도 있고, 이러한 고리형 구조는, 수산기를 갖는 C2~C3 알킬기(R1) 중의 수산기가, R2를 갖는 카복실기와 탈수 축합된 상태의 고리형 구조이다. 상기 고리형 구조는, 예를 들어, 하기 식으로 표시된다.
Figure 112018044282665-pct00013
(파선은, 인접하는 질소 원자에 대한 결합 위치를 나타낸다.)
식(1)로 표시되는 화합물은 구체적으로 하기 화합물로 예시될 수 있다.
Figure 112018044282665-pct00014
상기 화합물 중에서, 화합물 I이 바람직하다.
식(2)로 표시되는 화합물은 구체적으로 하기 화합물로 예시될 수 있다.
Figure 112018044282665-pct00015
상기 화합물 중에서, 화합물 V가 바람직하다.
본 발명의 화합물은 염의 형태도 포함한다. 상기 염의 예로는, 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 아연 등으로부터 형성된 금속염이나, N, N＇-디벤질 에틸렌 디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올 아민, 에틸렌 디아민, N-메틸글루카민, 리신, 프로카인 등으로부터 생성된 유기염을 들 수 있다. 본 발명의 화합물은 복수의 카복실기를 가지고 있지만, 카르복실기 중 어느 하나 또는 둘 이상은 염의 형태일 수 있다.
식(1)로 표시되는 화합물은 비대칭 탄소 원자(asymmetric carbon atom)를 가지고 있지만, 이러한 화합물은 가능한 모든 광학 이성질체를 포함하고, 그들 광학 이성질체는 임의의 비율로 사용할 수 있다. 예를 들어, 어떤 광학 활성 화합물은 거울상 이성질체(enantiomer), 라세미체 또는 임의의 비율의 거울상 이성질체의 혼합물일 수 있고, 비대칭점(不齊点))이 2개 이상 존재할 때에는 임의의 비율의 부분입체 이성질체(Diastereomer)의 혼합물일 수도 있다. 단, 천연물에 유래하는 원료를 이용하여 제조되었을 경우에는, L-아미노산 유래 아미노기를 구조 내에 갖기 때문에, 질소 원자가 결합하는 비대칭 탄소는 L-아미노산과 동일한 입체 배치의 구조체(구연산의 수산기가 결합하는 비대칭 탄소에 유래하는 부분입체 이성질체의 혼합물)를 얻을 수 있다. 본 발명은 이들 모든 화합물 및 혼합물을 포함한다.
(간 장애 억제제)
하기 식(1)로 표시되는 화합물 및 식(2)로 표시되는 화합물은 랫트에 대한 투여에 의해 혈중 AST 및 ALT의 저감 작용이 확인되어, 간 장애 억제제로 사용할 수 있다. 상기 혈중의 AST 및 ALT의 측정값은 간 조직 장애의 정도에 따라 상승하는 지표이며, 정상값(기준값)의 범위(예를 들어 AST가 12~40 IU/L, ALT가 5~40 IU/L)를 벗어난 상태는 간 조직에 어떠한 장애성 병태가 존재하는 것을 나타낸다. 본 발명의 간 장애 억제제에는, 간 장애가 있는 환자를 치유하는 간 장애 치료 효과나, 간 장애가 있는 환자의 지속적인 간 장애의 진행을 막는 것에 의해 치유를 촉진하는 치료 효과뿐 아니라, 건강한 사람이 간 장애가 되는 것을 막는 간 장애 억제 효과가 있다. 본 발명에 있어서, 간 장애란 각종 간 기능 장애를 의미하고, 예를 들어, 급성 간염, 만성 간염, 지방간, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 담즙정체성 간 장애, 간부전, 알코올성 간 장애, NASH(Non-alcoholic steatohepatitis;비알코올성 지방성 간염), 약물성 간 장애, 자기면역성 간 장애 등을 들 수 있다.
(식품으로서의 이용)
또한, 하기 식(1)로 표시되는 화합물 및 식(2)로 표시되는 화합물이 간 장애가 있는 환자를 치유하는 간 장애 치료 효과나, 간 장애가 있는 환자의 지속적인 간 장애의 진행을 막음으로써 치유를 촉진하는 치료 효과뿐 아니라, 건강한 사람이 간 장애가 되는 것을 예방하는 간 장애 억제 효과가 있는 것에 착안하여, 식품 또는 식품 첨가제로 이용할 수 있다. 즉, 식(1)로 표시되는 화합물 및 식(2)로 표시되는 화합물 중 1종 또는 2종 이상을 함유하는 기능성 식품, 특정 보건용 식품, 건강식품, 식품 소재, 식품 첨가제를 들 수 있다.
예를 들어, 식(1)로 표시되는 화합물 및 식(2)로 표시되는 화합물 중 1종 또는 2종 이상으로, 쌀가루, 유지, 전분, 유당, 맥아당, 식물유지 분말, 카카오지 분말, 스테아르산 등의 적당한 조제를 첨가한 후, 관용 수단을 이용하여 식용에 적합한 형태, 예를 들어, 페이스트, 드링크, 소프트 캡슐, 심리스 캡슐, 하드 캡슐, 과립, 환제 등으로 성형하여 식용으로 제공할 수도 있고, 또한, 각종 식품, 예를 들어, 식빵, 과자빵 등의 빵; 잼; 비스킷; 쿠키; 센베이 등의 과자; 케이크; 껌; 인스턴트 라면, 인스턴트 된장국, 인스턴트 스프 등의 인스턴트 식품; 아이스크림 제품; 요구르트, 우유, 드링크제, 청량 음료(차, 커피, 홍차, 쥬스 등) 등의 음료에 첨가하여 사용할 수도 있다. 본 발명의 식(1)로 표시되는 화합물 및 식(2)로 표시되는 화합물 중 1종 또는 2종 이상의 배합량은 해당 식용 조성물의 종류나 상태 등에 따라 적절히 설정된다.
Figure 112018044282665-pct00016
식 중, R1은 카복실기 또는 수산기를 갖고 있을 수도 있는 C1~C3 알킬기를 나타내고, R2는 수소 원자를 나타내거나, 또는 R1 및 R2는 함께 고리형 구조를 형성할 수도 있고, C2~C3 알킬렌 사슬을 나타낸다. 본 발명에 있어서, R1은 카복실기 또는 수산기를 갖고 있을 수도 있는 C1~C3 알킬기로, 다음 (1)~(3) 중 어느 하나를 의미한다.
(1) R1이 치환기를 갖지 않는 C1~C3 알킬기.
(2) R1이 카복실기를 갖는 C1~C3 알킬기. R1이 카복실기를 갖는 C1~C3 알킬기로서, 구체적으로 카복실기를 갖는 C1 알킬기(즉, 카복실기를 갖는 메틸기), 카복실기를 갖는 C2 알킬기(즉, 카복실기를 갖는 에틸기), 카복실기를 갖는 C3 알킬기(즉, 카복실기를 갖는 n-프로필기 혹은 이소프로필기), 카복실기를 갖는 C1~C2 알킬기, 카복실기를 갖는 C2~C3 알킬기를 들 수 있다.
(3) R1이 수산기를 갖는 C1~C3 알킬기. R1이 수산기를 갖는 C1~C3 알킬기로서, 구체적으로 수산기를 갖는 C1 알킬기(즉, 수산기를 갖는 메틸기), 수산기를 갖는 C2 알킬기(즉, 수산기를 갖는 에틸기), 수산기를 갖는 C3 알킬기(즉, 수산기를 갖는 n-프로필기 혹은 이소프로필기), 수산기를 갖는 C1~C2 알킬기, 수산기를 갖는 C2~C3 알킬기를 들 수 있다.
상기 카복실기 또는 수산기를 갖고 있을 수도 있는 C1~C3 알킬기에서의 C1~C3 알킬기는 탄소수 1~3의 직쇄형 또는 분지형의 알킬기이며, 구체적으로, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기를 들 수 있다. 또한, 카복실기를 갖는 C1~C3 알킬기는 하기 식으로 표시된다.
Figure 112018044282665-pct00017
(파선은, 인접하는 탄소 원자에 대한 결합 위치를 나타낸다.)
수산기를 갖는 C1~C3 알킬기는 하기 식으로 표시된다.
Figure 112018044282665-pct00018
(파선은, 인접하는 탄소 원자에 대한 결합 위치를 나타낸다.)
R1 및 R2가 함께 고리형 구조를 형성하는 경우, 이러한 고리형 구조는 식(1)에서의 고리형 구조와 동일한 구조를 들 수 있다.
본 발명의 간 장애 억제제는 식(1)로 표시되는 화합물 및/또는 식(2)로 표시되는 화합물을 포함하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 또한, 상기 간 기능 개선제에 포함되는 식(1)로 표시되는 화합물 및/또는 식(2)로 표시되는 화합물은 단리된 형태로 제공될 수도 있지만, 추출에 의해 얻어지는 화합물 I 및 V를 포함하는 분획의 형태나, 합성에 의해 얻어지는 반응 용액을 필요에 따라 농축한 후의 농축물의 형태(조정제(粗精製) 용액)도 제공 형태에 포함된다.
본 발명의 간 장애 억제제는, 약품 제조 분야에 있어서 널리 이용되는 약학적으로 허용되는 담체를 포함하고 있을 수도 있다. 예를 들어, 이 약학적으로 허용되는 담체로는, 아래의 약제: 용매(예를 들어, 물, 통상 생리 식염수, 완충액, 글리세린, 유기용매), 유화제, 현탁화제, 붕해제, 결합제, 부형제, 안정화제, 보존제, 활택제, 흡수 지연제, 리포솜 등을 들 수 있다. 또한, 상기 간 장애 억제제는, 비경구 투여, 국소 투여, 또는 경구 투여에 적합한 투약 형태로 처방될 수 있고, 이들의 투약 형태로는, 특별히 제한되지 않고, 정제, 로젠지(lozenge), 환제, 캡슐제, 주사(예를 들어, 멸균 수용액 또는 분산액), 멸균 산제 등을 들 수 있다.
본 발명의 간 장애 억제제의 유효 투여량은, 이러한 간 장애 억제제에 포함되는 식(1) 및 (2)로 표시되는 1종 또는 2종 이상의 화합물량이 2.5mg~32000mg/day이 되는 범위이고, 바람직하게는 3mg~600mg/day(성인)의 범위이다.
(화합물의 추출)
본 발명의 식(1)로 표시되는 화합물이 특히 화합물 I 및 V일 때, 매육 엑기스로부터 추출, 유도, 단리함으로써 얻을 수 있다. 구체적으로, 아래의 순서로 수행할 수 있다.
우선, 매실의 DNA만으로 이루어지는 야생종 매실을 분쇄·착즙하고, 얻어진 착즙을 가열 농축하여, 매실과즙 농축액을 얻는다. 그 다음, 상기 농축액에 물을 적당량 첨가하여 원심 분리함으로써, 침강물을 제거하고, 상청액 1을 얻는다. 계속해서, 상청액 1에 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 염기를 첨가함으로써 중화한 후, 상기 상청액에 포함되는 구연산, 말산, 펙틴 등을 제거하기 위해, 염화칼슘을 첨가하여, 구연산, 말산, 펙틴 등의 칼슘염을 발생시키고, 이들 칼슘염을 원심 분리하여 침강시킴으로써, 상청액 2를 얻는다. 또한, 상청액 2에 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 염기를 첨가함으로써 pH를 5.0~7.0으로 조정하고, 에탄올을 첨가하여 에탄올 침강 반응을 수행한다. 에탄올을 포함하는 혼합물을 원심 분리하고, 상청액(에탄올 용성 획분)과 침강물(에탄올 불용성 획분)로 나누어, 침강물에 다시 에탄올 수용액을 첨가하고 동일하게 원심 분리하여, 침강물을 얻는다.
상기 침강물에 정제수를 첨가한 혼합물을, 1kD~100kD 한외 여과막을 통과시킴으로써 고분자 성분을 제거하고, 저분자 성분을 포함하는 여액(濾液)을 얻는다. 상기 여액에 에탄올 수용액을 첨가하고, 원심 분리함으로써 침강물을 얻고, 이러한 침강물에 정제수를 첨가하여, 말산 칼슘염과 같은 불용물을 제거한다. 불용물을 제거한 용액을 증발기(EVAPORATOR)에 의해 농축하고, 화합물 I 및 V를 포함하는 획분을 얻는다. 이러한 획분은 그대로 화합물 I 및 V를 포함하는 조성물로 사용할 수도 있다. 그 후, 추가로 농축, 적절한 컬럼 크로마토그래피 등의 공지된 정제 처리를 수행함으로써, 화합물 I 및 V를 얻을 수 있다.
(화합물의 합성)
식(1)로 표시되는 화합물은, 하기에 나타내는 바와 같이, 구연산과 식(3)으로 표시되는 아민 화합물을 탈수 축합 반응함으로써 얻을 수 있다.
Figure 112018044282665-pct00019
(식(1) 및 식(3) 중, R1 및 R2는 상기와 동일한 의미이다.)
구연산과 식(3)으로 표시되는 아민 화합물의 탈수 축합 반응은, 구연산과 식(3)으로 표시되는 아민 화합물의 혼합물을 80~100℃의 수욕 중에서의 가온에 의해 식(3)으로 표시되는 아민 화합물을 용해시킨 후, 100~130℃, 바람직하게는 115~125℃에서, 30분~300분간, 바람직하게는 120분~240분간 반응시킴으로써, 식(1)로 표시되는 화합물을 얻을 수 있다.
또한, 구연산과 식(3)으로 표시되는 아민 화합물의 혼합비(구연산의 농도:식(3)으로 표시되는 아민 화합물의 농도)로는, 75:1~12:10의 범위 중 어느 하나일 수도 있고, 예를 들어, 50:1~20:10, 40:1~15:8, 25:1~10:5의 범위를 들 수 있다. 그리고, 여기서 말하는 농도란, 단위 용적당 몰량(예를 들어, mol/L, mmol/L, mmol/ml, μmol/L, μmol/mL)을 의미한다. 일례로 250~750mg/mL(1.19mol/L~3.57mol/L)의 구연산 수용액에, 최종 농도 10~120mg/mL의 식(3)으로 표시되는 아민 화합물을 혼합 첨가하는 것을 들 수 있다. 그리고 또한, 화합물 I을 합성하는 경우, 250~750mg/mL(1.19mol/L~3.57mol/L)의 구연산 수용액에, 최종 농도 10~20mg/mL(75mmol/L~150mmol/L)에 해당하는 아스파르트산과 최종 농도 80~120mg/mL(533mmol/L~800mmol/L)에 해당하는 아스파라긴을 혼합 첨가하는 것이 예시된다. 구연산 수용액에 최종 농도 10~120mg/mL(75mmol/L~800mmol/L)의 아스파르트산을 단독으로 첨가했을 경우, 20mg/mL 이상의 아스파르트산은 반응 개시 시에 있어서 완전히는 용해되지 않는다. 그러나, 그 혼합 현탁액을 교반하면서 반응을 수행함으로써, 반응의 진행과 함께 서서히 아스파르트산이 용해되어, 최종적으로는 동일한 목적물을 얻을 수 있다. 아스파르트산에 비해 아스파라긴은 수용성이 높으므로, 동일한 농도로 반응 개시 시에 있어서 구연산 수용액에 용해할 수 있다.
본 반응에 의해 고리형 화합물 I이나 II를 합성할 경우, 식(3)으로 표시되는 아민 화합물 이외에 아스파라긴이나 글루타민을 이용해도 합성할 수 있다. 또한, 본 반응에는 오토클레이브를 이용할 수도 있다.
구연산과 식(3)으로 표시되는 아민 화합물의 가열 반응에 의해 식(1)로 표시되는 화합물을 합성하는 방법에 있어서는, 구연산(IUPAC명:2-hydroxypropane-1, 2,3-tricarboxylic acid)의 탄소 사슬 골격인 프로판 사슬의 1위치의 탄소(또는 3위치의 탄소)와 2위치의 탄소에 결합되어 있는 2개의 카복실기와 아미노기가 이미드 결합을 형성하여 축합 및 고리화가 발생하여, 고리형 이미드 화합물이 된다. 구연산의 1위치의 탄소와 3위치의 탄소는 화학적으로 등가인 탄소이지만, 그 어느 쪽의 카복실기에 결합이 발생한 시점에서 2위치의 탄소를 비대칭 탄소로 한 입체 이성질체가 되고, (3)으로 표시되는 아민 화합물로 L-아미노산 또는 D-아미노산을 사용했을 경우에는 부분입체 이성질체가 된다.
상기 유기 반응에서 용매를 이용하는 경우, 얻어진 반응 용액을 필요에 따라 농축한 후, 농축물을 그대로 사용할 수도 있고, 적절한 후처리를 수행한 후에, 식(1)로 표시되는 화합물로 이용할 수도 있다. 후처리의 구체적인 방법으로는, 추출 처리 및/또는 정출(晶出), 크로마토그래피 등의 공지된 정제를 들 수 있다.
식(2)로 표시되는 화합물은, 상기 방법으로 구연산과 식(3)으로 표시되는 아민 화합물로부터 합성한 (1)로 표시되는 화합물의 이미드 결합의 일부를 가수분해함으로써, 하기와 같이 얻을 수 있다.
Figure 112018044282665-pct00020
(식(1) 및 식(2) 중, R1 및 R2는 상기와 동일한 의미이다.)
식(1)로 표시되는 고리형 이미드 화합물에서 (2)로 표시되는 아미드 화합물로 변환하는 방법으로는, (1)로 표시되는 고리형 이미드 화합물의 수용액을 염기로 가열 처리함으로써 이미드 결합을 가수분해에 의해 개환시켜 아미드 화합물로써 얻어진다. 상기 염기성 조건으로는, pH 6.0 이상이며, 바람직하게는 pH 8.6 이상이며, 더욱 더 바람직하게는 pH 9.6~pH 12.0이며, 사용하는 바람직한 염기로는, 수 중(水中)에서 수산화물 이온을 발생시키는 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 들 수 있다. 가열 처리의 조건으로는 90℃~130℃에서, 20분~240분이다.
가열 처리의 시간과 조건은 분해시키고자 하는 목적물의 농도나 반응액의 pH에 따라 적절히 조절할 수 있지만, pH 9.6~pH 12.0의 조건에서는 121℃에서 20~60분의 가열 처리가 바람직하다. 또한, 본 반응에는 오토클레이브를 이용할 수도 있다.
이 개환 반응은 pH에 의존한 반응이므로, 상기 방법에 의해 식(1)로 표시되는 화합물을 합성하는 경우 그 반응 혼합액을 그대로 사용하고 염기를 첨가하여 pH를 조정함으로써 계속해서 수행할 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 식(1)로 표시되는 화합물을 정제하는 경우에도 그 정제물을 물에 용해시킨 후에 염기를 첨가하여 pH를 조정함으로서 동일하게 반응시킬 수 있다.
또한, 본 반응에는 오토클레이브를 이용할 수도 있다.
이 반응의 개환 생성물에 있어서도, 구연산의 프로판 사슬의 2위치의 탄소를 비대칭 중심으로 한 입체 이성질체가 유지되고, (3)으로 표시되는 아민 화합물로서 L-아미노산 또는 D-아미노산을 사용했을 경우에는 부분입체 이성질체가 된다. 또한, (2)로 표시되는 아미드 화합물과 함께 부반응 산물로 그 구조 이성질체인 하기 식(4)로 표시되는 화합물도 생성되지만, 그 양은 (2)에 비해 한정적이다. 그리고, 식(4)로 표시되는 화합물에서는 구연산에 유래하는 탄소로부터 비대칭 탄소는 발생하지 않는다.
Figure 112018044282665-pct00021
(식(4) 중, R1 및 R2는, 상기와 동일한 의미이다.)
식(4)로 표시되는 화합물은 구체적으로 하기 화합물로 예시할 수 있다.
Figure 112018044282665-pct00022
상기 유기 반응에서 용매를 이용할 경우, 얻어진 반응 용액을 필요에 따라 농축한 후 농축물을 그대로 사용할 수도 있고, 적절한 후처리를 수행한 후에 식(2)로 표시되는 화합물로 이용할 수도 있다. 후처리의 구체적인 방법으로는, 추출 처리 및/또는 정출, 크로마토그래피 등의 공지된 정제를 들 수 있다.
실시예
이하, 본 발명에 대하여 실시예를 들어 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 조금도 한정되는 것은 아니다.
1. 활성 성분의 분리·정제
우선, 매육 엑기스 농축액의 조제를 수행했다. 매실의 DNA만으로 이루어지는 야생종 매실(품종:백가하(白加賀))을 분쇄·착즙하고, 얻어진 착즙을 가열 농축하여, 매실 과즙의 농축액(매육 엑기스)을 얻었다.
매육 엑기스에 포함되는 수용성 성분을 분석하기 위해, 상기 농축액 1g을 39g의 3mM 황산 수용액(HPLC의 이동상)으로 희석(40배 희석)하고, 멤브레인필터(Membrane Filter)로 불용물을 제거하여, 희석액을 얻었다. 이 희석액의 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 크로마토그램을 도 1에 나타낸다. HPLC 분석 조건은 아래와 같았다. 크로마토그램 중의 활성 성분이라고 생각되는 목적 성분은, RT 21.1분의 피크이다.
[HPLC 분석계]
장치:니혼분코 제품 고속 액체 크로마토그래프
칼럼:Excelpak CHA-E11(300mm×4.6mm I.D. Yokogawa analytical system)을 2개 연결
이동상:3mM 황산 수용액
유속:0.5mL/min
칼럼 온도:55℃
주입량:20μL
검출 파장:210nm
그 다음, 활성 성분을 포함하는 획분의 조제를 수행했다. 상기의 농축액 400g에 물 800mL를 첨가하고, 원심 분리함으로써 침강물을 제거하고, 상청액 1을 얻었다. 계속해서, 상청액 1에 수산화나트륨 수용액(40g/100mL)을 소량씩 첨가하여 액성(液性)이 pH 6.8이 되도록 중화한 후, 상기 상청액에 포함되는 구연산, 말산, 펙틴 등을 제거하기 위해 염화칼슘(225g/400mL)을 첨가하여 혼합물을 얻었다. 상기 혼합물에는, 구연산, 말산, 펙틴 등의 칼슘염이 생기지만, 이들 염을 원심 분리함으로써 침강시켜 상청액 2를 얻었다. 또한, 상청액 2에 수산화나트륨 수용액(40g/100mL)을 소량 첨가함으로써 pH를 5.8로 조정했다(액량으로서 800mL). 이 용액 40mL당, 60mL의 에탄올(에탄올 농도가 60%가 되도록)을 첨가하여, 에탄올 침강 반응을 수행했다. 60% 에탄올 용액을 포함하는 혼합물을 원심 분리하고, 상청액(에탄올 용성 획분)과 침강물(에탄올 불용성 획분)로 나누고, 침강물에 물을 첨가하여 400mL로 하고, 다시 에탄올(600mL)을 첨가하고, 동일하게 원심 분리하여, 침강물을 얻었다.
상기 침강물에 정제수를 첨가하여 400mL로 하고, 이 용액을, 1kD 한외 여과막을 통과시킴으로써 고분자 성분을 제거하여, 저분자 성분을 포함하는 여액을 얻었다. 상기 여액에 에탄올을 첨가하여 60%에탄올 용액으로 하고, 원심 분리함으로써 침강물을 얻고, 이러한 침강물에 정제수 250mL를 첨가하여, 말산 칼슘염과 같은 물에 난용성인 물질을 제거했다. 난용물(難溶物)을 제거한 용액을 증발기에 의해 농축하고, 물에 이용성(易溶性)인 성분을 포함하는 농축물을 얻었다. 이 농축물에 포함되는 성분을 HPLC로 분석했다. HPLC 크로마토그램을 도 2에 나타낸다. 도 2의 HPLC 분석 조건은, 도 1의 HPLC 분석 조건과 동일하다. 이 농축물에서는 일부의 매실 엑기스 유래 협잡 물질이 제거되고, 활성 성분이라고 생각되는 성분에 유래하는 피크(RT 21.1분)의 구성비가 늘어나, 부분적인 정제가 이루어졌다.
상기 활성 성분을 포함하는 획분의 HPLC 크로마토그램을 확대하여 관찰한 결과, 활성 성분의 피크(RT 21.1분)의 왼쪽 숄더에 상승(숄더 피크(shoulder peak))이 확인되고, 약간 유지 시간이 짧은 성분의 피크가 겹쳐 있는 것이 확인되었다. 이 숄더 피크의 성분은, 활성 성분 중의 주요 피크와 유지 시간이 매우 근접한 점에서 관련된 성분이라고 예측하여, 액성 변화에 따른 피크의 거동을 조사했다. 그 결과, 액성을 중성~알칼리성으로 조절하고, 121℃에서 30분의 가열 처리를 수행한 결과, HPLC 크로마토그램 상에 있어서 숄더 피크의 위치에 해당하는 RT 20.7분의 성분이 증가하는 것을 확인했다. 상기 활성 성분을 포함하는 획분의 일부를 알칼리 첨가 조건하에서 가열 처리한 샘플의 크로마토그램을 도 3에 나타낸다.
상기 농축물([0053])의 분획으로부터, 매육 엑기스에 유래하는 활성 성분(도 3의 RT 21.1분의 성분)과 그 활성 성분이 알칼리 가열에 의해 변화한 성분(도 3의 RT 20.7분의 성분: 이하, 활성 성분의 파생물)에 대하여, 분취용(分取用) HPLC에 의해 추가로 정제를 수행하는 동시에, 보다 분리능이 뛰어난 칼럼을 이용한 HPLC 평가계(系)에 있어서 성분의 분석을 수행했다. 이 분석 결과를 도 4에 나타낸다. 고분리능 칼럼을 이용한 결과, 당초 1개의 피크로 관찰되었던 활성 성분(도 3의 RT 21.1분의 성분)은 2개(도 4의 피크 A 및 B)로 나뉘어졌다. 또한, 활성 물질의 파생물(도 3의 RT 20.7분의 성분)은 이 고분리능 칼럼을 이용한 결과, 3 성분(도 4의 피크 C, D, E)으로 분리되었다. 후술하는 해석에서, 이 피크 A 및 피크 B는 분자량이 289인 화합물 I, 피크 C, D, E는 분자량이 307인 화합물 V 및 화합물 IX인 것이 판명되었다.
고분리능 칼럼을 이용한 HPLC 분석 조건은 아래와 같다.
[HPLC 분석계]
장치:Agilent Technologies제품 1200형
칼럼:Thermo Fisher SCIENTIFIC제품 FLUOPHASE PFP (4.6×100mm, 5μm)
이동상:A:0.1% 폼산 수용액 B:아세토니트릴 A/B=98/2
유속:0.8mL/min
칼럼 온도:35℃
주입량:10μL
검출 파장:200nm
2. 화합물 I 및 화합물 V의 합성 및 구조 해석
화합물 I 및 화합물 V의 합성 방법 및 구조 해석의 데이터를 나타낸다.
(화합물 I의 합성)
Figure 112018044282665-pct00023
450g의 구연산(일수화물)(3.56mol)에 물을 첨가하여 500mL의 농후한 구연산 용액을 조제하고, 이 용액에 60g의 L-아스파라긴(최종 농도 0.667mol/L)과 9g의 L-아스파르트산(최종 농도 0.113mol/L)을 첨가하고, 메스 업(정량용 기구로 시료를 목적의 용적에 맞추는 작업)하여 액량을 600mL로 했다. 이 반응액을 내압 유리 용기에 넣어 마개를 단단히 막고, 90℃의 수욕 중에서 가온하고, 첨가한 L-아스파라긴이나 L-아스파르트산을 완전 용해했다. 그 후, 가온하여 80℃ 정도로 한 오토클레이브 내에, 이 내압 용기내의 반응액을 넣고, 121℃에서 180분간 가열 처리했다.
반응 후, 상기 반응액을 25℃까지 자연 냉각한 후, 반응액을 5L의 비커에 넣고 얼음으로 냉각시켰다. 약 120g의 수산화나트륨을 500mL의 정제수에 용해하고, 이 수산화나트륨 수용액을 얼음으로 냉각시킨 다음, 상기 반응액에 서서히 첨가하여 반응액을 pH 5.8로 중화시켰다(중화열로 발열하기 때문에 25℃가 되는 것을 확인하면서 중화했다). 중화시킨 후 반응액의 부피를 정제수로 1200mL로 조정했다. 그 다음, 200g의 염화칼슘(이수화물)을 2L의 정제수에 용해하여 염화칼슘 용액을 조제하고, 그 약 절반량을 상기 반응액에 첨가하여 잘 교반하고 약 16시간 정치했다. 용액에는 백색으로 침강물(구연산 칼슘)이 석출되었다. 또한 염화칼슘 용액을 첨가하면 백색 침강물이 새롭게 침강되었으므로, 서서히 염화칼슘 용액을 추가하여, 1200mL의 중화된 반응액에, 상기 염화칼슘 용액을 약 2L(염화칼슘량으로, 1.36mol) 첨가했다. 이 혼합 용액에 정제수를 첨가하여 전체량을 3600mL로 하고, 그 후에 구연산 칼슘인 백색 침강물을 원심 분리에 의해 제거하고, 상청액을 회수했다. 그 다음, 이 상청액을 증발기로 800mL로 농축했다. 농축한 수용액에 1860mL의 에탄올을 첨가하여 교반했다. 당분간 정치하면, 에탄올을 첨가한 혼합액은 2층으로 분리되어, 비교적 투명한 상층(에탄올층)과 착색이 나타나고 점성이 있는 하층 용액으로 나뉘었다. 하층을 분액 회수하고, 정제수로 800mL 정도로 희석한 후, 증발기로 용액 중에 잔존하는 에탄올을 증류했다. 얻어진 하층의 수용액(조정제 용액 I)의 HPLC 분석을 수행한 결과, RT 21.1분에 피크가 나타난 점에서, 먼저 매육 엑기스로부터 추출·분리한 활성 성분과 동일한 성분이 합성된 것이 확인되었다(도 5). 이 활성 성분은, 후술하는 구조 해석에 의해 화합물 I인 것이 판명되었다.
합성한 활성 성분의 확인(도 5)에서의 HPLC에 의한 분석 조건은 아래와 같았다.
[HPLC 분석계]
장치:니혼분코 제품 고속 액체 크로마토그래프
칼럼:Excelpak CHA-E11(300mm×4.6mm I.D. Yokogawa analytical system)을 2개 연결
이동상:3mM 황산 수용액
유속:0.5mL/min
칼럼 온도:55℃
주입량:20μL
검출 파장:210nm
(화합물 V의 합성)
상기 합성한 활성 성분을 포함하는 조정제 용액 I에 수산화나트륨을 첨가하여 액성을 pH 7.6, pH 8.6, pH 9.6으로 조정한 용액을 각각 조제하고, 121℃에서, 30분의 가열 처리를 수행했다. 알칼리 조건하에서 가열 처리한 각 용액을, 화합물 I의 합성 검토와 동일한 HPLC 평가계로 분석하고, 화합물 I의 RT 21.1분의 피크의 변화를 관찰했다. 그 결과, pH 9.6으로 조정한 용액에서는, RT 21.1분의 피크는 거의 소실되고, RT 20.7분에 새로운 피크가 확인되었다(도 6). 이 RT 20.7분의 성분은, 먼저 매육 엑기스로부터 추출·정제한 활성 성분을 알칼리 첨가의 조건으로 가수 처리하여 얻어지는 활성 성분의 파생물과 일치했다. 후술의 해석에 의해 이 활성 성분의 파생물의 피크는, 주로 화합물 V와 소량의 화합물 IX가 포함되는 것이 판명되었다. 화합물 IX는 화합물 V의 구조 이성질체이다.
(합성된 화합물 I 및 화합물 V의 단리와 구조 해석)
상기 합성 방법으로 만든 조정제 용액 I에 알칼리를 첨가하고 pH 6.5에서 가열 처리(121℃ 30분)하여, 활성 성분(RT 21.1분의 성분) 및 활성 성분의 파생물(RT 20.7분의 성분)을 포함하는 시료를 만들고, 고분리능 칼럼을 이용한 HPLC 분석계로 구성 성분을 확인했다. 그 결과를 (도 7)에 나타낸다. RT 21.1분의 성분은 도 7의 피크 A와 피크 B의 2개의 피크로 나뉘고, 이들 피크의 유지 시간은 매육 엑기스로부터 추출·분리된 활성 성분에 유래하는 도 4의 피크 A와 피크 B의 유지 시간과 일치했다. RT 20.7분의 성분은 RT 2.9~3.5분에 3개의 피크(도 7의 피크 C, D, E)로 관찰된다. 이들 HPLC에서의 피크의 유지 시간은 매육 엑기스로부터 추출·분리된 활성 성분의 파생물 유래 피크(도 4의 피크 C, D, E)의 유지 시간과 일치했다. 이들 결과로부터, 상기 합성 방법에 의해 얻어진 활성 성분이나 그 파생물은 매육 엑기스에 포함되는 성분과 동일하다는 것이 확인되었다.
(단리 및 구조 해석)
상기 고분해능 칼럼을 이용한 분석으로 분리·검출된 활성 성분(도 7의 피크 A 및 B) 및 활성 성분의 파생물(도 7의 피크 C, D, E)에 대하여, 추가로 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제를 수행했다. 그 결과, 활성 성분의 2개의 피크 중 1 성분(도 7의 피크 B, 이하 피크 B)을 단리할 수 있었다. 그 성분의 LC-MS분석계에 의한 질량 분석, NMR에 의한 구조 해석, IR에 의한 관능기의 해석을 수행한 결과, 하기의 화합물 I로 나타나는 구조인 것을 알 수 있었다. 구조 해석은 질량 분석과 NMR 해석에 의해 화학식과 기본 골격을 특정하고, IR 스펙트럼에 의한 산무수물(1800cm-1 부근)의 부정과 이미드에 유래한다고 생각되는 스펙트럼(1700cm-1 부근)의 확인에 의해 수행했다. 이 화합물은 아스파르트산의 아미노기와 구연산의 2개의 카복실기가 축합하여 고리형 이미드화한 구조를 갖는다.
화합물 I의 구조 해석에 이용한 NMR, LC-MS, IR의 측정 조건은 아래와 같다.
[NMR 분석계]
장치:Bruker Biospin사 제품 AVANCE500형(cryo Probe)
측정 핵종:수소(1H), 탄소(13C)
측정 용매:D2O
측정 방법:1H NMR, 13C NMR, 13C NMR(DEPT), 1H-1H COSY, HMQC, HMBC
[LC-MS분석계]
액체 크로마토그래프부
장치:Agilent Technologies제품 1200형
칼럼:Thermo Fisher SCIENTIFIC제품 FLUOPHASE PFP (4.6×100mm, 5μm)
이동상:A:0.1% 폼산 수용액 B:아세토니트릴 A/B=98/2
유속:0.8mL/min
칼럼 온도:35℃
주입량:10μL
검출 파장:200nm
질량 분석부
장치:Agilent Technologies제품 6140형
측정 모드:Positive 모드 및 Negative 모드
측정 질량 범위:m/z 50~1350
[FT-IR분석계]
장치:Agilent Technologies사 제품 Cary670
측정 방법:현미ATR법
측정 범위:700cm-1~4000cm-1
분해능:4cm-1
적산 회수:64회
크리스탈:게르마늄
[피크 B의 데이터]
NMR 분석 데이터
1H NMR(500MHz, D2O)δ=2.89, 2.90, 2.99, 3.19, 3.22, 5.02;
13C NMR(125MHz, D2O)δ= 36.798, 43.990, 44.557, 53.739, 74.963, 176.172, 176.908, 178.084, 179.376, 182.172;
질량 분석 데이터
LC-MS m/z:290(M+H)+, 288(M-H)- (RT 4.0분)
FT-IR데이터
1704.8cm-1 very strong
Figure 112018044282665-pct00024
(*는 구연산 유래 구조 중의 비대칭 탄소의 위치를 나타낸다. 또 파선은 평면에서 안쪽으로, 굵은 선은 바로 앞에 있는 것을 나타낸다.)
이 화합물 I에는, 구연산 유래의 프로판 사슬의 2위치의 탄소(*를 부기한 탄소)를 비대칭 탄소로 한 부분입체 이성질체가 존재한다(아스파르트산 유래 구조 내에도 비대칭 탄소가 존재하지만, 천연 식물 소재의 매실을 원료로 하는 경우, 거의 L형의 아미노산이 원료가 되므로 거울상 이성질체는 거의 존재하지 않는다). 이 부분입체 이성질체를 I(a) 및 I(b)로 하면, 상기에서 단리한 활성 성분(피크 B)은 부분입체 이성질체 I(a) 또는 I(b) 중 어느 하나이며, 상기에 나타낸 화합물 I의 NMR 분석 데이터는 I(a) 또는 I(b) 중 하나의 데이터이다. 얻어진 결과로부터 단리한 피크 B가, 어느 쪽의 부분입체 이성질체에 해당할지를 분별할 수 없다. 도 4 및 도 7에 나타나는 활성 성분에 유래하는 2개의 피크 중 피크 A(이하 피크 A)가 단리된 피크 B의 부분입체 이성질체인 것은, 분자량이 일치하고 있는 것 및 NMR의 데이터가 매우 근접한 유사한 스펙트럼 패턴인 것에 의해 확인할 수 있다. 그리하여, 피크 A가 풍부해진(피크 B가 약간 혼입) 시료에 대하여, 동일하게 LC-MS에 의한 질량 분석 및 NMR에 의한 스펙트럼 분석을 수행했다. 질량 분석의 결과는 피크 A와 피크 B의 분자량이 모두 289로 일치하는 것으로 나타나, NMR 스펙트럼 데이터도 근접한 동일한 스펙트럼 패턴을 나타내는 것이 확인되었다. 따라서, 활성 물질로서 정제한 피크 A 및 피크 B는 화합물 I의 구조를 갖는 부분입체 이성질체인 것이 확인되었다.
[피크 A의 데이터]
NMR 분석 데이터
1H NMR(500MHz, D2O)δ=2.90, 2.96, 3.05, 3.25, 3.28, 5.15;
13C NMR(125MHz, D2O)δ= 36.129, 43.290, 44.400, 52.779, 75.201, 174.774, 175.865, 177.187, 179.214, 181.755;
질량 분석 데이터
LC-MS m/z:290(M+H)+, 288(M-H)- (RT 4.0분)
FT-IR데이터
1706.9cm-1 very strong
Figure 112018044282665-pct00025
(*는 구연산 유래 구조의 비대칭 탄소의 위치를 나타낸다)
상기 활성 성분의 파생물은 고분리능 칼럼을 이용한 분석의 결과, 3 성분으로 구성된 피크인 것을 확인할 수 있었다([0064]). 이들 3 성분에 대하여 LC-MS로 분석한 결과, 이들 3 성분이 동일한 분자량(분자량 307)을 갖고, 화합물 I의 구조(분자량 289)에 물 분자가 1분자 부가된 구조로, 화합물 I의 부분적인 가수분해물인 것이 확인되었다. 추가로 분석을 수행하여 NMR 분석 등의 결과, 화합물 V 및 화합물 IX의 존재가 확인되었다.
이들 화합물은, 화합물 I의 이미드 고리가 개환됨으로써 생성되고, 개환의 양식에 따라 화합물 V와 화합물 IX의 2가지로 나뉘지만, 알칼리 첨가의 조건하에서는 화합물 V가 우위에 생성된다. 화합물 V에는 구연산 유래의 프로판 사슬의 2위치의 탄소(*를 부기한 탄소)를 비대칭 탄소로 한 부분입체 이성질체가 존재하지만, NMR과 LC-MS의 데이터로부터 이들을 분별할 수 없다. 이들 화합물 V의 부분입체 이성질체는 화합물 I의 부분입체 이성질체의 가수분해물로서 각각 한쪽이 얻어진다. 그리고, 화합물 IX는 화합물 I의 부분입체 이성질체의 어느 가수분해로부터도 소량 생성된다. 따라서, 활성 성분의 파생물의 고분리능 칼럼을 이용한 분석으로 검출된 3 성분은 화합물 V의 부분입체 이성질체 2 성분과 화합물 IX인 것을 알 수 있었다.
아래에 화합물 V의 NMR(부분입체 이성질체의 한쪽의 데이터), 및 화합물 V와 화합물 IX의 혼합물인 LC-MS(3종을 동시 측정했지만, 단일 결과였다)을 나타내었다. 분석 조건은 화합물 I의 분석과 동일하다.
[화합물 V의 NMR 데이터]
1H NMR(500MHz, D2O)δ= 2.78, 2.88, 2.95, 3.05, 4.75
13C NMR(125MHz, D2O)δ = 38.7, 46.1, 47.3, 52.1, 76.6, 166.5, 174.0, 176.9, 177.3, 179.8
[화합물 V 및 화합물 IX의 혼합물의 데이터]
LC-MS m/z:308(M+H)+, 330(M+Na)+, 306(M-H)- (RT 2.8~3.5분)
(화합물 II의 합성)
Figure 112018044282665-pct00026
500mg/mL의 구연산(일수화물) 수용액에 L-글루탐산을 최종 농도가 40mg/mL(90℃에서의 용해 한계량)가 되도록 첨가하고, 90℃의 수욕에서 완전 용해한 후, 오토클레이브로 121℃, 240분의 가열 처리를 수행했다. 가열 처리 후 HPLC 평가계로 분석한 결과, 가열 처리 후 HPLC로 분석한 결과, RT 5.8분과 RT 11.5분에 가열에 의해 생성된 성분에 유래하는 피크가 나타났다(도 8). LC-MS분석의 결과, RT 5.8분의 성분(도 8의 피크 1)의 분자량은 303이 되고, L-글루탐산의 아미노기에 구연산이 화합물 I과 동일한 골격이 되도록 이미드 결합한 화합물이 합성된 것을 나타내고 있다. 또한, RT 11.5 분의 성분(도 8의 피크 2)의 분자량은 129가 되고, 이는 L-글루탐산의 곁 사슬과 주 사슬이 탈수 축합하여 고리화된 L-글루탐산 무수물의 분자량과 일치했다.
상기 화합물 II의 합성 검토에 이용한 HPLC 분석 및 LC-MS분석의 분석 조건은 아래와 같았다.
[LC-MS분석계]
액체 크로마토그래프부
장치:Waters제품 ACQUITY UPLC형
칼럼:신와카코 제품 ULTRON PS-80H(4.6×250mm)
이동상:0.1% 포름산 수용액
유속:0.25mL/min
칼럼 온도:55℃
주입량:1μL
질량 분석부
장치:Waters제품 Synapt G2-S형
측정 모드:Positive 모드 및 Negative 모드
측정 질량 범위:m/z 50~1000
[화합물 II의 합성 반응액의 LC-MS데이터]
LC-MS m/z:304(M+H)+, 321(M+NH4)+, 326(M+Na)+, 629(2M+Na)+, 302(M-H)-, 605(2M-H)- (RT 5.8분)
LC-MS m/z:130(M+H)+, 128(M-H)- (RT 11.5분)
그 다음 마찬가지로, 구연산 용액에 L-글루타민을 첨가하여 가열 처리를 수행했다. L-글루타민의 구연산(500mg/mL) 수용액에 대한 첨가량은 70mg/mL(90℃에서의 용해 한계량)로, 90℃의 수욕에서 완전 용해한 후, 오토클레이브로 121℃, 240분의 가열 처리를 수행했다. 가열 처리 후의 용액을 동일한 HPLC 평가계로 분석한 결과, L-글루탐산을 원료로 이용한 경우와 동일한 리텐션 타임(retention time)의 생성물의 피크가 얻어졌다. 따라서, L-글루탐산 대신 L-글루타민을 원료로 이용했을 경우에도 동일한 구조를 갖는 화합물 II을 얻을 수 있다.
(화합물 III의 합성)
Figure 112018044282665-pct00027
(S)-α-아미노-γ-부티로락톤(별명 (L)-호모세린락톤)을 구연산 용액(500mg/mL)에 최종 농도가 100mg/mL(90℃에서의 용해 한계량)가 되도록 첨가하고, 오토클레이브로 121℃, 240분의 가열 처리를 수행했다. 가열 처리 후 HPLC로 분석한 결과, RT 7.9분에 가열에 의해 생성된 성분에 유래하는 피크가 나타났다(도 9). LC-MS분석의 결과, RT 7.9분의 성분의 분자량은 257이 되고, 이는 (L)-호모세린락톤의 아미노기에 구연산이 화합물 I과 동일한 골격이 되도록 이미드 결합한 화합물이 합성된 것을 나타내고 있다. 평가에 이용한 HPLC 분석 및 LC-MS 분석의 분석 조건은 화합물 II의 평가와 동일하다.
상기 화합물 III의 합성 검토로 얻어진 LC-MS분석의 데이터를 아래에 나타낸다.
[화합물 III의 데이터]
LC-MS m/z:258(M+H)+, 275(M+NH4)+, 280(M+Na)+, 256(M-H)- (RT 7.9분)
(화합물 IV의 합성)
Figure 112018044282665-pct00028
L-알라닌을 구연산(500mg/mL) 수용액에 최종 농도가 100mg/mL(90℃에서의 용해 한계량)가 되도록 첨가하고, 오토클레이브로 121℃, 240분의 가열 처리를 수행했다. 가열 처리 후 HPLC로 분석한 결과, RT 6.2분에 가열에 의해 생성된 성분에 유래하는 피크가 나타났다(도 10). LC-MS 분석의 결과, RT 6.2분의 성분의 분자량은 245가 되고, 이는 L-알라닌의 아미노기에 구연산이 화합물 I과 동일한 골격이 되도록 이미드 결합한 화합물이 합성된 것을 나타내고 있다. 평가에 이용한 HPLC 분석 및 LC-MS분석의 분석 조건은 화합물 II의 평가와 동일하다.
상기 화합물 III의 합성 검토로 얻어진 LC-MS분석의 데이터를 아래에 나타낸다.
[화합물 IV의 데이터]
LC-MS m/z:246(M+H)+, 368(M+Na)+, 513(2M+Na)+, 244(M-H)-, 489(2M-H)- (RT 6.2분)
(구연산과 아미노산의 가열에 의한 합성법이 선택적인 이미드 형성 반응임을 확인)
(1) 말산을 사용한 반응에서의 비교
구연산(250mg/mL)과 아스파르트산(11.1mg/mL), 및 말산(250mg/mL)과 아스파르트산(11.1mg/mL)의 수용액을 각각 121℃에서 30분 가열했다. 반응 용액을 HPLC 분석한 결과, 구연산에서는 명확한 화합물 I의 피크를 볼 수 있었지만(도 11 참조), 말산에서는 명확한 피크를 볼 수 없었다(도 12 참조). 아스파르트산을 아스파라긴으로 바꾸어 동일하게 수행한 실험에 있어서도 구연산에서는 싱글 피크의 명확한 화합물 I의 피크를 볼 수 있지만, 말산에서는 명확한 피크를 볼 수 없었다. 그리고 또한, 구연산과 말산을 혼합하여 동일한 실험을 수행했을 경우에도, 구연산 유래의 합성물(RT:21.1) 밖에 확인되지 않았다. 이상으로부터, 유기산과 아스파라긴이나 아스파르트산 등의 아미노산의 이미드 형성 반응은 구연산에만 선택적으로 일어난다고 할 수 있다.
(2) 하이드록시 구연산을 사용한 반응에서의 비교
하이드록시 구연산 수용액(1.19mol/L;구연산 250mg/mL와 동일한 몰 농도)에 아스파르트산(15mg/mL)과 아스파라긴(100mg/mL)을 용해시켜 121℃에서 180분 가열했다. 반응 용액을 HPLC 분석한 결과, 적어도 주요한 신규 반응물로 3개의 새로운 피크가 출현했다(도 13 참조). 하이드록시 구연산과 아스파라긴이나 아스파르트산 등의 아미노산이 반응했을 경우 단순히 동일한 이미드 형성 반응이 수행되면 2 종류의 이미드 화합물이 가정되지만, 실제로는 3 종류의 주요한 신규 화합물이 형성되었다. 이 점에서, 아스파라긴이나 아스파르트산 등의 아미노산과의 이미드 형성 반응 이외(예를 들어 아미드 형성 반응)의 부반응이 강하게 일어난 것을 나타내고, 하이드록시 구연산에서는 이미드 형성 반응이 선택적으로 수행되지 않는다.
이상과 같이 인접하는 탄소에 결합한 2개의 카복실이 아미노산과 이미드를 형성하는 반응은 말산이나 하이드록시 구연산과 같은 부분적으로 구연산과 유사한 화합물을 원료로 했을 경우에는 그 선택성이 없어진다. 한편, 상기 화합물 II, 화합물 III, 화합물 IV의 합성 검토에 나타나는 바와 같이, 이미드를 형성하는 아미노기가 α아미노기(카복실기가 결합한 탄소에 결합한α아미노기)일 수도 있고, 그 곁 사슬의 구조에 의해 이미드 형성 반응은 거의 영향을 받는 일이 없어 그 이미드 형성의 선택성은 없어지지 않는다.
3. 생물 활성 시험
[시험예 1]
(동물 시험 투여물의 조제)
(1) 화합물 I 투여물의 조제
조정제 용액 I 100mL에 8N 수산화나트륨 수용액을 pH미터로 확인하면서 소량씩 적하하여 용액의 액성을 pH 6.5로 조정했다. 추가로, 용매로 희석했다.
(2) 화합물 V 투여물의 조제
조정제 용액 I 100mL에 8N 수산화나트륨 수용액을 pH미터로 확인하면서 소량씩 적하하여 용액의 액성을 pH 8.6으로 조정한 후, 121℃에서 30분 가열하고, 추가로 용매로 희석했다(가열 처리 후 용액의 pH는 가수분해 반응에 의해 산이 형성되고, pH가 6.2 정도로 변화한다).
(간 기능 장애 억제 효과에 관한 시험)
상기 (1)~(2)의 투여물을 올리고당·고리형 올리고당·D-솔비톨로 구성되는 용매에 용해시켜 용해액의 화합물 I 및 V의 최종 농도는 6mg/mL가 되도록 조제했다. 시판 고형 사료의 자유 섭이(攝餌) 및 수도물의 자유 음수(飮水)하의 8주령 Wistar계 수컷 랫트(니혼찰스리버가부시키가이샤)에게, 상기 비중 환산하여 용해액으로 6g/kg이 되도록 7일간 경구 투여했다. 대조 동물에게는 상기(1) 및 (2)를 포함하지 않는 용매만을 6g/kg, 7일간 경구 투여했다. 투여 개시 7 일째에 갈락토사민 염산염(와코준야쿠코교가부시키가이샤)을 750mg/kg 용량을, 대조물, 화합물 I 및 V 각각의 투여 동물에게 복강내 투여하고, 투여 개시 9 일째에 펜토바르비탈 마취하(50mg/kg)에 개복하여 복부 대동맥에서 헤파린 가혈액(加血液)을 채취했다. 얻어진 혈액은 혈장으로 분리하고, AST, ALT값를 JSCC 표준화 대응법에 의해 측정했다. 도 14에 있어서, 결과는 평균값+표준 편차(1군 동물수, 각 20예)로 나타냈다. *는 대조물군과의 유의차(p＜0.05)를 나타내지만, 1원 배치 분산 분석 후에 Dunnet test에 의해 검정했다.
랫트의 혈장 중의 AST값(왼쪽), ALT값(오른쪽)의 변화를 나타내는 도면을 도 14에 나타낸다. 화합물 I 투여물군, 화합물 V 투여물군에 있어서, 대조물 투여물군과 비교하여, AST값, ALT값이 유의적으로 낮은 값인 것, 즉, 간 장애가 치료, 억제된 것을 알 수 있었다.
[시험예 2]
(조정제 화합물 I의 NASH에 대한 평가 시험)
(1) 조정제 화합물 I 용액의 제작
상기 조정제 용액 I([0060])로부터 함유하는 화합물 I 농도가 26mg/mL가 되도록 HPLC 크로마토그램의 피크 강도로부터 화합물 I의 농도를 결정하고, 조정제물 제조하였다. 조정제 화합물 I 용액의 용매에는, 올리고당·고리형 올리고당·D-솔비톨로 구성되는 용매를 사용했다.
최종적인 용액의 pH는 수산화나트륨을 이용하여 pH를 6.0으로 했다.
(2) 동물 실험 순서
임신 17 일째의 C57BL/6 J마우스(니혼찰스리버사 제품) 30 마리에 대하여, 표준식으로 감마선 조사 고형 사료(CRF-1, 오리엔탈코보코교사 제품)의 자유 섭취, 및 증류수의 자유 음수하에 개별 사육을 수행하고, 출산시켰다. 갓태어난 마우스는 STZ를 투여하는 마우스와 투여하지 않는 마우스(표준 마우스)로 분할했다.
STZ를 투여하는 각 마우스에는, 출생일을 0일로 하여 출생 후 2 일째에 인슐린용 주사기(마이젝터(Myjector), 데루모사 제품)를 이용하여 STZ(시그마사 제품)의 10mg/mL(0.1M 구연산 완충제 pH 4.5) 용액 20μL를 배부(背部) 피하 투여했다. STZ 투여 후는 4주령에 이를 때까지 모유 영양에 의해 사육되었다. 4주령에 이르러, STZ 투여 후 4주간 경과한 날에 자웅 판별을 수행하여 수컷 개체를 선택했다. 이 시점을 이유(離乳)로 하고, 이 이후 고지방식(HFD32, 니혼구레아사 제품)을 급이(給餌)하고, STZ 유발 NASH 모델 마우스군으로 사육을 수행했다. STZ를 투여하지 않았던 표준 마우스에는, 고지방식 대신 CRF-1을 급이했다. 또한, 증류수의 자유 음수하에 사육을 수행했다.
5주령에 이른 수컷 마우스는 6시간 절식한 후 꼬리정맥에 바늘을 꽂아 정맥혈을 채취하고, 간이 혈당 측정 장치(Glutest Neo 센서, 산와카가쿠겐큐조 제품)를 사용하여 혈당값을 측정했다. 또한, 동일한 날짜에 체중 측정도 실시했다.
체중 및 혈당값에 근거하여, 통계 해석 시스템 EXSAS7.7(CAC 엑시케어(EXICARE)사 제품)을 이용하여 NASH 모델 마우스는 층별 무작위화 할당으로 군 분리되었다. 상기 조정제 화합물 I 용액의 투여를 수행하는 조정제 화합물 I군과, 대조 물질의 올리고당·고리형 올리고당·D-솔비톨로 구성되는 용매의 투여를 수행하는 용매군의 2군으로 나누었다. 군 분리일을 투여 개시일로 하고, 해당일로부터 14일간 연속적으로 각각 오전 9시부터 오전 11시 사이에 1회 및 오후 5시부터 오후 7시 사이에 1회씩 경구 위 존데(SONDE)를 이용하여 조정제 화합물 I군에는 10mL/kg(체중)의 조정제 화합물 I 용액을, 용매군에는 10mL/kg (체중)의 용매를 투여했다.
시험 물질의 투여 시험 개시 14일 후의 부검일에는 솜노펜틸(somnopentyl) 마취하에 모든 동물에서 복부 대정맥으로부터 채혈을 수행했다. 채혈 후에는 방혈(放血)에 의해 안락사시켰다. 얻어진 혈액은 즉시 헤파린이 들어간 원심 튜브에 회수하여 3000rpm으로 10분간 원심 분리해 혈장을 얻었다.
혈장 중의 아스파르트산 아미노기 전이 효소(AST) 농도와 알라닌 아미노기 전이 효소(ALT) 농도는 히타치 7180형 자동 분석 장치를 이용한 JSCC 표준화 대응법에 의해 측정되었다. 측정값은 평균값±표준 편차(Mean±SD)로 표시했다.
(결과)
결과를 도 15에 나타낸다. 도 15로부터 명백하듯이, 용매군에 비해, 조정제 화합물 I군의 혈장 중 AST 및 ALT 농도는 각각 저감되었다. (unpaired t-test(용매군 vs 조정제 화합물 I군), *p＜0.05 vs 용매군, 정상군(n=5), 용매군(n=19), 조정제 화합물 I군(n=15), AST:p=0.05, ALT:p < 0.05)
본 발명의 화합물을 이용한 시험에서, 혈중 AST 및 ALT가 저감되었다. 따라서, 본 발명의 화합물은 간 장애 억제제로 사용할 수 있다.

Claims (12)

  1. 식(1)로 표시되는 화합물.
    Figure 112020062858139-pct00053

    (식 중,
    R1은 카복실기를 갖는 메틸기이고, R2는 수소 원자이거나, 또는
    R1 및 R2가 함께 고리형 구조를 형성하는 경우 상기 고리형 구조는 C2~C3 알킬렌 사슬로 연결된 것이다.)
  2. 제 1항에 있어서,
    식(1)로 표시되는 화합물은 하기 구조로 표시되는 것을 특징으로 하는, 화합물.
    Figure 112020062858139-pct00057
  3. 삭제
  4. 식(1)로 표시되는 1종 또는 2종 이상의 화합물을 포함하는, 급성 간염, 만성 간염, 지방간, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 담즙정체성 간 장애, 간부전, 알코올성 간 장애, 비알코올성 지방성 간염(NASH), 약물성 간 장애 및 자기면역성 간 장애로부터 선택되는 간 기능 장애의 억제제.
    Figure 112020062858139-pct00054

    (식 중,
    R1은 카복실기 또는 수산기를 갖고 있을 수도 있는 C1~C3 알킬기이고, R2는 수소 원자이거나, 또는
    R1 및 R2가 함께 고리형 구조를 형성하는 경우 상기 고리형 구조는 C2~C3 알킬렌 사슬로 연결된 것이다.)
  5. 제 4항에 있어서,
    간 기능 장애가 비알코올성 지방성 간염(NASH)인, 간 기능 장애의 억제제.
  6. 구연산과 식(3)으로 표시되는 아민 화합물의 혼합물을 수용액 중에서 가열 반응시키는 것을 특징으로 하는, 식(1)로 표시되는 화합물의 합성 방법.
    Figure 112020062858139-pct00033

    (식 중,
    R1은 카복실기 또는 수산기를 갖고 있을 수도 있는 C1~C3 알킬기이고, R2는 수소 원자이거나, 또는
    R1 및 R2가 함께 고리형 구조를 형성하는 경우 상기 고리형 구조는 C2~C3 알킬렌 사슬로 연결된 것이다.)
  7. 제 6항에 있어서,
    구연산과 식(3)으로 표시되는 아민 화합물의 혼합물을 100~130℃에서 30분~300분간 반응시키는 것을 특징으로 하는, 합성 방법.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서,
    구연산과 식(3)으로 표시되는 아민 화합물의 혼합비(구연산의 농도:식(3)으로 표시되는 아민 화합물의 농도)가 75:1~12:10인 것을 특징으로 하는, 합성 방법.
  9. 식(1)로 표시되는 화합물을 수산화물 이온이 발생하는 알칼리성 물질을 첨가한 수용액 중에서 가열하는 것을 특징으로 하는, 식(2)의 화합물의 변환 방법.
    Figure 112020062858139-pct00034

    (식 중,
    R1은 카복실기 또는 수산기를 갖고 있을 수도 있는 C1~C3 알킬기이고, R2는 수소 원자이거나, 또는
    R1 및 R2가 함께 고리형 구조를 형성하는 경우 상기 고리형 구조는 C2~C3 알킬렌 사슬로 연결된 것이다.)
  10. 제 9항에 있어서,
    식(1)로 표시되는 화합물을 수산화물 이온이 발생하는 알칼리성 물질을 첨가한 pH 6.0~12.0의 수용액 중에서 80~130℃에서 20분~240분간 반응시키는 것을 특징으로 하는, 변환 방법.
  11. 식(1)로 표시되는 1종 또는 2종 이상의 화합물을 포함하는, 식품.
    Figure 112020062858139-pct00055

    (식 중,
    R1은 카복실기를 갖는 메틸기이고, R2는 수소 원자이거나, 또는
    R1 및 R2가 함께 고리형 구조를 형성하는 경우 상기 고리형 구조는 C2~C3 알킬렌 사슬로 연결된 것이다.)
  12. 식(1)로 표시되는 1종 또는 2종 이상의 화합물을 포함하는, 식품 첨가제.
    Figure 112020062858139-pct00056

    (식 중,
    R1은 카복실기를 갖는 메틸기이고, R2는 수소 원자이거나, 또는
    R1 및 R2가 함께 고리형 구조를 형성하는 경우 상기 고리형 구조는 C2~C3 알킬렌 사슬로 연결된 것이다.)
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