CN110606863A - 一种n-乙酰神经氨酸二水合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种N‑乙酰神经氨酸二水合物的制备方法，所述制备方法为：向N‑乙酰神经氨酸水溶液中加入结晶水合剂，静置结晶，固液分离，得到的固相为所述N‑乙酰神经氨酸二水合物；所述结晶水合剂为乙腈和/或丙酮。本发明所述的制备方法通过结晶水合剂和工艺的配合使N‑乙酰神经氨酸无水物键合上结晶水，得到高纯度、高稳定性的N‑乙酰神经氨酸二水合物，所述N‑乙酰神经氨酸二水合物具有稳定的晶体结构，在60℃高温下稳定保存10天以上，不会有失水现象。本发明提供的N‑乙酰神经氨酸二水合物的制备方法效率高，条件温和，无需使用强酸性腐蚀性试剂，是一种高效、环保的工艺路线。

Description

一种N-乙酰神经氨酸二水合物的制备方法
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种N-乙酰神经氨酸二水合物的制备方法。
背景技术
N-乙酰神经氨酸(N-acetyl neuraminic acid)是唾液酸家族中最常见、占比最多的种类，是一种含有9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖的总称，为天然存在的碳水化合物，于上世纪50年代首次得到分离纯化以及结构的确定。N-乙酰神经氨酸是一种重要的天然营养成分，在人体内由肝脏合成，在燕窝、鹿茸、鸡蛋、奶粉等食品中含量较高。N-乙酰神经氨酸在稳定蛋白质构象、细胞粘附和识别、免疫调节、抗病毒中具有重要功能，特别在大脑和神经系统的产生和发育中发挥着非常重要的作用。
随着N-乙酰神经氨酸的营养价值及药用价值研究的日益成熟，市场上对N-乙酰神经氨酸的需求量也不断上涨，微生物发酵法来源的N-乙酰神经氨酸已被国家卫计委批准为新食品原料；同时，带有结晶水的N-乙酰神经氨酸二水合物具有单晶结构，其化合物纯度更高，更受研究人员和市场的青睐。因此，N-乙酰神经氨酸二水合物的制备技术和产能成为决定N-乙酰神经氨酸应用前景的重要影响因素。
在微生物发酵法制备N-乙酰神经氨酸水合物的工艺中，分离提纯的步骤包括除菌、除蛋白、水解、脱色、脱盐、除杂和浓缩，得到的浓缩液通过约9倍体积的冰醋酸进行结晶、乙醇冲洗，得到产物。
CN109293612A公开了一种通过调节溶液氢离子浓度制备N-乙酰神经氨酸水合物的方法，首先向N-乙酰神经氨酸水溶液中加入酸溶液，调节溶液体系的氢离子浓度，即pH值；然后将得到的混合液低温静置结晶，晶体洗涤并干燥，得到N-乙酰神经氨酸水合物。所述方法获得的N-乙酰神经氨酸水合物纯度不低于99％，可满足其在食品、保健、医药和化妆品等领域的要求，且简单易操作，特别适合于工业化生产N-乙酰神经氨酸水合物。
CN109180749A公开了一种利用过饱和结晶法制备高纯度N-乙酰神经氨酸水合物的方法，通过N-乙酰神经氨酸的过饱和水溶液低温静置结晶的方式得到N-乙酰神经氨酸水合物，产物纯度≥99％，可以满足其在食品、保健、医药等领域的要求。
然而在现有的N-乙酰神经氨酸水合物制备工艺中，冰醋酸结晶法和调节溶液氢离子浓度的方法都会用到大量的挥发性酸性溶液，不仅不利于操作人员的身体健康，而且酸性溶液会对反应设备造成强腐蚀，极大地增加了生产中的设备折旧和损耗成本。过饱和结晶法虽然不使用腐蚀性物质，静置结晶速度慢，制备效率低，不利于大规模的工业化生产。
因此，开发一种效率高、成本低、环境友好的N-乙酰神经氨酸水合物制备方法，获得高纯度、高稳定性的N-乙酰神经氨酸水合物，是本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种N-乙酰神经氨酸二水合物的制备方法，所述制备方法中通过结晶水合剂和工艺的配合使N-乙酰神经氨酸无水物键合上结晶水，得到高纯度、高稳定性的N-乙酰神经氨酸二水合物；所述制备方法避免了酸性腐蚀性试剂的使用，具有效率高、环境友好、成本低的特点。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供N-乙酰神经氨酸二水合物的制备方法，所述制备方法为：向N-乙酰神经氨酸水溶液中加入结晶水合剂，静置结晶，固液分离，得到的固相为所述N-乙酰神经氨酸二水合物；所述结晶水合剂为乙腈和/或丙酮。
本发明提供的N-乙酰神经氨酸二水合物的制备方法中，原料N-乙酰神经氨酸可以为天然提取法、微生物发酵法、酶催化法或化学合成法制备的无水物，本发明不对其来源进行特殊限定。
本发明中所述的结晶水合剂可以为乙腈、丙酮或乙腈和丙酮任意比例的混合物。
优选地，所述N-乙酰神经氨酸水溶液的浓度为50～200g/L，例如55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L、150g/L、160g/L、170g/L、180g/L、190g/L或195g/L，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
作为本发明的优选技术方案，所述N-乙酰神经氨酸水溶液的浓度为50～200g/L，其与结晶水合剂配合可以得到高纯度、高稳定性的N-乙酰神经氨酸二水合物。若N-乙酰神经氨酸水溶液的浓度超出上述优选范围，其浓度过低会导致产物的结晶速度慢、收率低，甚至没有二水合物晶体析出，其浓度过高会导致N-乙酰神经氨酸无水物过饱和而直接析出，无法得到高纯度的二水合物。
优选地，所述N-乙酰神经氨酸水溶液与结晶水合剂的体积比为1:(5～10)，例如1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5或1:9.9等。
作为本发明的优选技术方案，所述N-乙酰神经氨酸水溶液与结晶水合剂的体积比为1:5～1:10时，可以得到高收率、高纯度的二水合物。若结晶水合剂用量少于5倍体积的N-乙酰神经氨酸水溶液，则水合产物的析出速度慢、析出量少，甚至不析出；若结晶水合剂用量大于10倍体积的N-乙酰神经氨酸水溶液，体系中可能析出非水合物。
优选地，所述静置结晶的温度为0～30℃，例如1℃、3℃、5℃、8℃、10℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃或29℃，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，进一步优选为4～25℃。
作为本发明的优选技术方案，所述静置结晶的温度为0～30℃。静置结晶温度超出上述优选范围，若温度过高则会影响水合产物的析出速率，0℃以下结晶会增加额外的设备成本和能耗负担。
优选地，所述静置结晶的时间为12～24h，例如12.5h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或23.5h，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述固液分离的方法为膜分离。
优选地，所述膜分离中膜的孔径为0.22μm。
优选地，所述制备方法还包括后处理步骤。
优选地，所述后处理步骤包括洗涤和干燥。
优选地，所述洗涤的溶剂为75％的乙醇水溶液。
优选地，所述干燥的温度为40～70℃，例如42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃或69℃等。
优选地，所述干燥为真空干燥或常压干燥。
优选地，所述干燥的时间为2～6h，例如2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h或5.5h等。
优选地，所述N-乙酰神经氨酸水溶液为经过脱色的N-乙酰神经氨酸水溶液。
优选地，所述脱色的脱色剂为活性炭。
优选地，以所述N-乙酰神经氨酸水溶液的体积为1L计，所述活性炭的用量为1～3g，例如1.2g、1.4g、1.6g、1.8g、2g、2.2g、2.4g、2.6g、2.8g或2.9g等。
优选地，所述脱色的方法为：将N-乙酰神经氨酸水溶液与活性炭混合，脱色处理，固液分离，得到的液相为经过脱色的N-乙酰神经氨酸水溶液。
优选地，所述脱色处理在搅拌或震荡条件下进行。
优选地，所述脱色处理的温度为25～55℃，例如26℃、28℃、30℃、33℃、35℃、38℃、40℃、42℃、45℃、48℃、50℃、52℃或54℃等。
优选地，所述脱色处理的时间为10～60min，例如12min、15min、18min、20min、23min、25min、28min、30min、33min、35min、37min、40min、45min、50min或55min等。
优选地，所述固液分离的方法为膜分离。
优选地，所述膜分离中膜的孔径为0.22μm。
优选地，所述制备方法具体为：向浓度为50～200g/L的N-乙酰神经氨酸水溶液中加入5～10倍体积的结晶水合剂，0～30℃静置结晶12～24h，固液分离后收集固相，洗涤、干燥，得到所述N-乙酰神经氨酸二水合物；所述结晶水合剂为乙腈和/或丙酮。
另一方面，本发明提供一种如第一方面所述的制备方法得到的N-乙酰神经氨酸二水合物。
另一方面，本发明提供一种如上所述的N-乙酰神经氨酸二水合物在食品、保健品、化妆品或药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的N-乙酰神经氨酸二水合物的制备方法通过结晶水合剂和工艺的配合使N-乙酰神经氨酸无水物键合上结晶水，得到高纯度、高收率、高稳定性的N-乙酰神经氨酸二水合物，纯度达到99.6％以上，收率为78～99％。所述N-乙酰神经氨酸二水合物具有稳定的晶体结构，在60℃高温下稳定存在10天以上，不会有失水现象。本发明提供的N-乙酰神经氨酸二水合物的制备方法效率高，条件温和，无需使用强酸性腐蚀性试剂，是一种高效、环保的工艺路线。
附图说明
图1为实施例1得到的N-乙酰神经氨酸二水合物晶体的热重分析图，其中，a为热重分析曲线，b为微商热重曲线；
图2为实施例1得到的N-乙酰神经氨酸二水合物晶体的多晶X射线衍射图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明以下实施例中，原料N-乙酰神经氨酸(无水物)可通过市场途径获得，可以为天然物提取法、化学合成法、酶催化法或微生物发酵法制备得到的N-乙酰神经氨酸(无水物)，本发明不对其来源进行特殊限定。
实施例1
本实施例提供一种N-乙酰神经氨酸二水合物的制备方法，具体步骤如下：
(1)将5g N-乙酰神经氨酸与100mL纯净水混合，待其完全溶解后，向N-乙酰神经氨酸水溶液中加入0.2g活性炭，在30℃恒温振荡水浴锅中恒温振荡15min脱色，然后用0.22μm的滤膜过滤，收集滤液；
(2)向步骤(1)得到的滤液中加入5倍体积的乙腈，4℃静置结晶12h，然后用0.22μm的滤膜过滤，收集固相；
(3)将步骤(3)得到的固相用75％乙醇水溶液洗涤，然后置于60℃常压烘箱中干燥4h，得到所述N-乙酰神经氨酸二水合物晶体。
实施例2
本实施例提供一种N-乙酰神经氨酸二水合物的制备方法，具体步骤如下：
(1)将10g N-乙酰神经氨酸与100mL纯净水混合，待其完全溶解后用0.22μm的滤膜过滤除杂，收集滤液；
(2)向步骤(1)得到的滤液中加入7倍体积的丙酮，25℃静置结晶24h，然后用0.22μm的滤膜过滤，收集固相；
(3)将步骤(3)得到的固相用75％乙醇水溶液洗涤，然后置于40℃真空烘箱干燥6h，得到所述N-乙酰神经氨酸二水合物晶体。
实施例3
本实施例提供一种N-乙酰神经氨酸二水合物的制备方法，具体步骤如下：
(1)将20g N-乙酰神经氨酸与100mL纯净水混合，待其完全溶解后，向N-乙酰神经氨酸水溶液中加入0.3g活性炭，在40℃恒温振荡水浴锅中恒温振荡30min脱色，然后用0.22μm的滤膜过滤，收集滤液；
(2)向步骤(1)得到的滤液中加入10倍体积的结晶水合剂(乙腈与丙酮的等体积混合物)，10℃静置结晶18h，然后用0.22μm的滤膜过滤，收集固相；
(3)将步骤(3)得到的固相用75％乙醇水溶液洗涤，然后置于50℃真空烘箱中干燥3h，得到所述N-乙酰神经氨酸二水合物晶体。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于，步骤(2)中静置结晶的时间为10h。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于，步骤(2)中静置结晶的温度为35℃。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于，步骤(1)中N-乙酰神经氨酸的质量为3g。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于，步骤(1)中N-乙酰神经氨酸的质量为22g。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于，步骤(2)中加入4倍体积的乙腈。
对比例4
本对比例与实施例1的区别在于，步骤(2)中加入12倍体积的乙腈。
对比例5
本对比例与实施例1的区别在于，步骤(2)中加入5倍体积的乙酸。
对比例6
本对比例与实施例1的区别在于，步骤(2)中加入5倍体积的乙醇。
对比例7
本对比例与实施例1的区别在于，步骤(2)中加入5倍体积的丁酮。
对比例8
本对比例提供一种N-乙酰神经氨酸二水合物的制备方法，具体步骤如下：
(1)将30g N-乙酰神经氨酸与100mL纯净水混合，加热至50℃使其完全溶解，得到浓度为300g/L的过饱和溶液，然后用0.22μm的滤膜热过滤除杂，收集滤液；
(2)将步骤(1)得到的滤液自然冷却后置于4℃静置结晶24h，然后用0.22μm的滤膜过滤，收集固相；
(3)将步骤(3)得到的固相用75％乙醇水溶液洗涤，然后置于40℃真空烘箱干燥6h，得到所述N-乙酰神经氨酸二水合物晶体。
对比例9
本对比例提供一种N-乙酰神经氨酸二水合物的制备方法，具体步骤如下：
(1)将30g N-乙酰神经氨酸与100mL纯净水混合，加热至50℃使其完全溶解，得到浓度为300g/L的溶液，然后用0.22μm的滤膜热过滤除杂，收集滤液；
(2)将步骤(1)得到的滤液中加入浓盐酸，调节体系的pH值(即氢离子浓度)为1.0；
(3)将步骤(2)得到的混合液低温10℃静置结晶，直至晶体析出，析出后静置使晶体熟化12h，纯水洗涤，晶体与纯水的质量比为1:1，60℃干燥，得到所述N-乙酰神经氨酸二水合物。
性能测试：
(1)热重分析
使用热重分析仪(Pyris1 TGA热重分析仪，美国Perkin-Elmer公司)测试产物的热重曲线，实施例1得到的N-乙酰神经氨酸二水合物晶体的热重分析图如图1所示，其中a为热重分析曲线，b为微商热重曲线；从图1中可知，实施例1得到的产物N-乙酰神经氨酸二水合物晶体在129.17℃发生10.24％的热失重，即失去2分子结晶水。
(2)晶体结构分析
使用样品水平型大功率X射线粉末衍射仪(PXRD，TTR-III，日本理学电机公司)测试产物的晶体结构，实施例1得到的N-乙酰神经氨酸二水合物晶体的多晶X射线衍射图如图2所示，从图中可以看出，实施例1得到的水合物在固定角度具有明显的衍射现象，有明显的衍射峰，证明本发明所述制备方法得到的N-乙酰神经氨酸二水合物具有晶体结构。
(3)液相色谱分析
使用液相色谱仪(SHIMADZU LC-15C)测试产物的组分信息，色谱柱型号为AminexHPX-87H，300mm×7.8mm(catalog#125-0140)，检测器为UV检测器。检测波长：210nm；柱温：60℃；流动相：0.005M硫酸；流速：0.60mL/min；进样体积：20μL。
按照上述色谱条件测试实施例1～5、对比例1～9得到的产物中N-乙酰神经氨酸和水的含量，具体数据如表1所示。
表1
表1中，“--”表示该值不存在。对比例2、对比例4和对比例5得到的产物中，N-乙酰神经氨酸含量高于90％、水含量远低于10％，而N-乙酰神经氨酸二水合物中水含量的理论值为10.43％；该结果说明，对比例2、对比例4和对比例5中的产物并非N-乙酰神经氨酸二水合物，故产率和纯度均不存在。
从表1的数据可知，本发明实施例1～3中以乙腈和/或丙酮作为结晶水合剂可以得到纯度99.6％以上、收率为78～99％的N-乙酰神经氨酸二水合物；实施例4中静置结晶的时间低于本发明限定的12～24h，实施例5中静置结晶的温度为高于本发明限定的0～30℃，因此影响了二水合物的结晶析出过程，导致二水合物的产率降低。
如果N-乙酰神经氨酸水溶液的浓度超出本发明限定的50～200g/L，N-乙酰神经氨酸水溶液的浓度过低(对比例1)，则加入结晶水合剂后无法有效析晶，体系中几乎未见晶体析出；N-乙酰神经氨酸水溶液的浓度过高(对比例2)，则会有N-乙酰神经氨酸(无水物)直接过饱和析出，导致最终产物的水含量仅有6.4％，低于N-乙酰神经氨酸二水合物的理论水含量10.43％。
如果N-乙酰神经氨酸水溶液和结晶水合剂的体积比超出本发明限定的1:(5～10)，结晶水合剂的加入量过少(对比例3)会导致体系中水合产物析出困难，几乎未见晶体析出；结晶水合剂的加入量过多(对比例4)，则会使体系中有部分非水合物析出，使最终产物的水含量仅有4.4％，远远低于N-乙酰神经氨酸二水合物的理论水含量10.43％。
如果不使用本发明限定的结晶水合剂(乙腈和/或丙酮)，加入5倍体积的乙酸(对比例5)会使N-乙酰神经氨酸(无水物)直接析出，得到的产物中水含量仅有0.5％；乙醇(对比例6)或丁酮(对比例7)无法起到结晶水合剂的作用，体系中没有晶体析出。
本发明提供的N-乙酰神经氨酸二水合物的制备方法与现有技术中的过饱和结晶法(对比例8)、调节pH结晶法(对比例9)相比，原料利用率更高，二水合物的产率更高，更适宜工业化应用。
(4)稳定性测试
将实施例1～2、对比例9中得到的产物粉碎、置于培养皿内，摊成厚度约4mm的薄层，然后放入药品稳定性试验箱中，设置温度为60℃，于放置后的第5天和第10天检测样品中的N-乙酰神经氨酸和水的含量，检测方法为(3)中的液相色谱法，得到的数据如表2所示。
表2
从表2的数据可知，本发明实施例1～2所述制备方法得到的N-乙酰神经氨酸二水合物在60℃高温下放置10天后N-乙酰神经氨酸含量和水的含量基本未发生变化，证明本发明所述制备方法得到的二水合物具有良好的高温稳定性，可以在60℃高温下稳定存在10天以上而不发生失水；而对比例9中调节pH结晶法得到的N-乙酰神经氨酸二水合物在60℃中放置10天后水含量明显降低，证明其在高温下失水，稳定性欠佳。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的N-乙酰神经氨酸二水合物的制备方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种N-乙酰神经氨酸二水合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：向N-乙酰神经氨酸水溶液中加入结晶水合剂，静置结晶，固液分离，得到的固相为所述N-乙酰神经氨酸二水合物；所述结晶水合剂为乙腈和/或丙酮。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述N-乙酰神经氨酸水溶液的浓度为50～200g/L。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述N-乙酰神经氨酸水溶液与结晶水合剂的体积比为1:(5～10)。
4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述静置结晶的温度为0～30℃，优选为4～25℃；
优选地，所述静置结晶的时间为12～24h。
5.根据权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述固液分离的方法为膜分离；
优选地，所述膜分离中膜的孔径为0.22μm。
6.根据权利要求1～5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括后处理步骤；
优选地，所述后处理步骤包括洗涤和干燥；
优选地，所述洗涤的溶剂为75％的乙醇水溶液；
优选地，所述干燥的温度为40～70℃；
优选地，所述干燥为真空干燥或常压干燥；
优选地，所述干燥的时间为2～6h。
7.根据权利要求1～6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述N-乙酰神经氨酸水溶液为经过脱色的N-乙酰神经氨酸水溶液；
优选地，所述脱色的脱色剂为活性炭；
优选地，以所述N-乙酰神经氨酸水溶液的体积为1L计，所述活性炭的用量为1～3g；
优选地，所述脱色的方法为：将N-乙酰神经氨酸水溶液与活性炭混合，脱色处理，固液分离，得到的液相为经过脱色的N-乙酰神经氨酸水溶液；
优选地，所述脱色处理在搅拌或震荡条件下进行；
优选地，所述脱色处理的温度为25～55℃；
优选地，所述脱色处理的时间为10～60min；
优选地，所述固液分离的方法为膜分离；
优选地，所述膜分离中膜的孔径为0.22μm。
8.根据权利要求1～7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体为：向浓度为50～200g/L的N-乙酰神经氨酸水溶液中加入5～10倍体积的结晶水合剂，0～30℃静置结晶12～24h，固液分离后收集固相，洗涤、干燥，得到所述N-乙酰神经氨酸二水合物；所述结晶水合剂为乙腈和/或丙酮。
9.一种如权利要求1～8任一项所述的制备方法得到的N-乙酰神经氨酸二水合物。
10.一种如权利要求9所述的N-乙酰神经氨酸二水合物在食品、保健品、化妆品或药物中的应用。
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