ES2641289T3 - Cepas bacterianas probióticas y composición simbiótica que las contiene destinada a alimento para lactantes - Google Patents

Cepas bacterianas probióticas y composición simbiótica que las contiene destinada a alimento para lactantes Download PDF

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Abstract

Cepa bacteriana que pertenece a la especie Bifidobacterium breve seleccionada del grupo que consiste en Bifidobacterium breve B2274, depositada por la empresa Probiotical SpA de Novara (Italia) en la Institución depositaria DSMZ el 07/04/2011 y que tiene el número de depósito DSM 24707; Bifidobacterium breve B7840, depositada por la empresa Probiotical SpA de Novara (Italia) en la Institución depositaria DSMZ el 07/04/2011 y que tiene el número de depósito DSM 24708, que tiene una actividad antimicrobiana frente a los patógenos E. coli, Salmonella enteriditis, Clostridium difficile y Campilobacter jejunii.

Description

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DESCRIPCION
Cepas bacterianas probioticas y composicion simbiotica que las contiene destinada a alimento para lactantes
La presente invencion se refiere a una seleccion de cepas probioticas que pertenecen al genera Bifidobacterium y a una composicion simbiotica que las contiene y destinada a alimento para lactantes.
Los lactantes alimentados con una dieta artificial muestran diferencias considerables en la composicion de la microbiota intestinal en comparacion con lactantes amamantados: en particular, puede observarse una reduccion en la concentracion de bifidobacterias a costa de otros microorganismos potencialmente patogenos, tales como Escherichia coli y Clostridium spp. La colonizacion de microorganismos que pertenecen al genero Bifidobacterium tiene lugar en lactantes amamantados en los primeros 4 dfas tras el nacimiento y las bifidobacterias se convierten muy pronto en el grupo microbiano prevalente. Con la alimentacion por formula, por otro lado, se desarrolla una flora mas heterogenea compuesta por coliformes, bacteroides, clostridios y estreptococos. Precisamente por estos motivos, los lactantes alimentados con formula presentan un mayor riesgo de contraer infecciones intestinales.
Ademas, una produccion excesiva de gas intestinal parece ser la causa del denominado “colico”, que afecta a numerosos lactantes durante los primeros meses de vida.
Por tanto, existe la profunda necesidad de poder obtener, en lactantes, el efecto fisiologicamente bifidogenico obtenido a traves de la alimentacion con leche materna. En particular, es deseable ser capaz de garantizar a los lactantes alimentados con formula una flora intestinal de manera que se eviten los colicos.
Se divulgan cepas bacterianas que pertenecen al genero Bifidobacterium y que tienen actividades antimicrobianas en, por ejemplo, Likotrafiti et al. (Microbial ecology in health and disease 2004 16:105-112) y Jeong-Weon et al. (Food Science and Technology 2002 11(1): 89-92).
El solicitante ha proporcionado una respuesta a las necesidades mencionadas anteriormente tras una intensa actividad de investigacion, al final de la cual se identifico una seleccion de cepas bacterianas que pertenecen al genero Bifidobacterium.
La materia de la presente invencion se refiere a una cepa bacteriana que pertenece al genero Bifidobacterium y que tiene las caractensticas divulgadas en la reivindicacion independiente adjunta.
La materia de la presente invencion tambien se refiere a una composicion alimentaria o producto de complemento o composicion farmaceutica que contiene dichas cepas bacterianas, tal como se divulga en la reivindicacion independiente adjunta. Dichas composiciones tienen aplicacion valida para su uso en el tratamiento del colico, la diarrea y los trastornos intestinales, preferiblemente en sujetos en edad pediatrica.
Se ilustraran realizaciones preferidas de la presente invencion en la descripcion detallada que sigue.
Las cepas bacterianas seleccionadas por el solicitante tienen caractensticas probioticas y pueden administrarse a lactantes, puesto que cumplen directrices espedficas (FAO/OMS, 2002) que requieren: una evaluacion de la actividad antimicrobiana hacia bacterias antagonistas, la no toxicidad y no patogenicidad de la cepa, una identificacion taxonomica exacta de la misma, adhesion al epitelio intestinal, resistencia al tracto gastrointestinal (bilis y jugos gastricos), estabilidad genetica, con referencia particular a la transmisibilidad de resistencia a antibioticos, y propiedades tecnologicas y sensoriales deseables cuando se usan en un proceso industrial. Ademas, es de particular importancia el estudio de la citotoxicidad de los probioticos frente a celulas humanas y la verificacion de su capacidad para adherirse a la mucosa intestinal y la capacidad para bloquear la adhesion de los patogenos a las propias celulas intestinales.
El solicitante selecciono las cepas de la presente invencion unicamente tras haber verificado experimentalmente las especificaciones mencionadas anteriormente.
Las cepas bacterianas seleccionadas por el solicitante pertenecen al genero Bifidobacterium y tienen una actividad antimicrobiana frente a E. coli. Ademas, dichas cepas tienen adicionalmente una actividad antimicrobiana frente a Salmonella enteriditis, Clostridium difficile y Campilobacter jejunii.
Las cepas seleccionadas pertenecen a las especies Bifidobacterium breve y Bifidobacterium longum o Bifidobacterium longum subsp. longum. Las cepas seleccionadas por el solicitante son:
(i) Bifidobacterium breve B632, depositada por la empresa Probiotical SpA de Novara (Italia) en la Institucion depositaria DSMZ el 07/04/2011 y que tiene el numero de deposito DSM 24706.
(ii) Bifidobacterium breve B2274, depositada por la empresa Probiotical SpA de Novara (Italia) en la Institucion depositaria DSMZ el 07/04/2011 y que tiene el numero de deposito DSM 24707.
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(iii) Bifidobacterium breve B7840, depositada por la empresa Probiotical SpA de Novara (Italia) en la Institucion depositaria DSMZ el 07/04/2011 y que tiene el numero de deposito DSM 24708.
(iv) Bifidobacterium longum subsp. longum B1975, depositada por la empresa Probiotical SpA de Novara (Italia) en la Institucion depositaria DSMZ el 07/04/2011 y que tiene el numero de deposito DSM 24709.
Todas las cepas anteriores estan disponibles y son accesibles para el publico segun las condiciones establecidas por el Tratado de Budapest.
La composicion alimentaria o producto de complemento o composicion farmaceutica de la presente invencion comprende una mezcla bacteriana que a su vez comprende al menos una cepa bacteriana mencionada anteriormente, para su uso en el tratamiento de colico, diarrea y trastornos intestinales, preferiblemente en sujetos en edad pediatrica. En una realizacion, la mezcla bacteriana comprende o, alternativamente, consiste en las cepas (i) o (ii) o (iii) o (iv). En una realizacion, la mezcla bacteriana comprende o, alternativamente, consiste en las cepas (i) y (ii). En una realizacion, la mezcla bacteriana comprende o, alternativamente, consiste en las cepas (i) y (iii). En una realizacion, la mezcla bacteriana comprende o, alternativamente, consiste en las cepas (i) y (iv). En una realizacion, la mezcla bacteriana comprende o, alternativamente, consiste en las cepas (ii) y (iii). En una realizacion, la mezcla bacteriana comprende o, alternativamente, consiste en las cepas (ii) y (iv). En una realizacion, la mezcla bacteriana comprende o, alternativamente, consiste en las cepas (iii) y (iv). En una realizacion, la mezcla bacteriana comprende o, alternativamente, consiste en las cepas (i) y (ii) y (iii). En una realizacion, la mezcla bacteriana comprende o, alternativamente, consiste en las cepas (i) y (ii) y (iv). En una realizacion, la mezcla bacteriana comprende o,

alternativamente, consiste en las cepas (ii) y (iii) y (iv). En una realizacion, la mezcla bacteriana comprende o,

alternativamente, consiste en las cepas (i) y (iii) y (iv). En una realizacion, la mezcla bacteriana comprende o,

alternativamente, consiste en las cepas (i) y (ii) y (iii) y (iv). Ademas, la materia de la presente invencion se refiere a
una composicion simbiotica que comprende al menos una de las cepas bacterianas probioticas mencionadas anteriormente en asociacion con al menos una fibra prebiotica. Dicha asociacion permite ventajosamente una multiplicacion selectiva de las bacterias beneficiosas existentes que van a obtenerse, induciendo, por tanto, efectos sistemicos y locales ventajosos para el huesped. La composicion simbiotica esta destinada a lactantes.
En particular, varios “oligosacaridos no digeribles” seleccionados del grupo que comprende galacto-oligosacaridos (GOS), fructo-oligosacaridos (FOS) e inulina tienen aplicacion valida como fibras en el contexto de la presente invencion.
Una realizacion preferida se refiere a una composicion que comprende una formula para alimentar lactantes, al menos una cepa bacteriana de la presente invencion y al menos una fibra prebiotica seleccionada de entre las mencionadas anteriormente. Ventajosamente, dicha composicion es capaz de proporcionar al lactante un marcado efecto “bifidogenico” muy similar al de la leche humana.
El objeto de la presente invencion se refiere a una cepa bacteriana que pertenece a la especie Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum o Bifidobacterium longum subsp. longum y que tiene una actividad antimicrobiana frente a los patogenos E. coli, Salmonella enteriditis, Clostridium difficile y Campilobacter jejunii. El patogeno E. coli comprende el biotipo E. coli O157:H7. La cepa que pertenece a la especie Bifidobacterium breve se selecciona del grupo que consiste en Bifidobacterium breve B2274, depositada por la empresa Probiotical SpA de Novara (Italia) en la Institucion depositaria DSMZ el 07/04/2011 y que tiene el numero de deposito DSM 24707 y Bifidobacterium breve B7840, depositada por la empresa Probiotical SpA de Novara (Italia) en la Institucion depositaria DSMZ el 07/04/2011 y que tiene el numero de deposito DSM 24708. La cepa que pertenece a la especie Bifidobacterium
longum es Bifidobacterium longum subsp. longum B1975, depositada por la empresa Probiotical SpA de Novara
(Italia) en la Institucion depositaria DSMZ el 07/04/2011 y que tiene el numero de deposito DSM 24709.
El objeto de la presente invencion se refiere a la cepa Bifidobacterium breve B632, depositada por la empresa
Probiotical SpA de Novara (Italia) en la Institucion depositaria DSMZ el 07/04/2011 y que tiene el numero de
deposito DSM 24706, en asociacion con Bifidobacterium breve BR03, depositada por la empresa Probiotical SpA de Novara (Italia) en la Institucion depositaria DSMZ y que tiene el numero de deposito DSM 16604.
La materia de la presente invencion se refiere a la cepa Bifidobacterium breve BR03, depositada por la empresa Probiotical SpA de Novara (Italia) en la Institucion depositaria DSMZ y que tiene el numero de deposito DSM 16604, en asociacion con Lactobacillus plantarum LP01 depositada por la empresa Mofin Srl de Novara (Italia) en la Institucion depositaria BCCM-LMG el 16/10/2001 y que tiene el numero de deposito LMG P-21021. Ventajosamente, la cepa Lactobacillus plantarum LP01 muestra una gran actividad de inhibicion frente a cepas patogenas, tal como se demuestra en la parte experimental que sigue a continuacion (figuras 1-5).
La presente invencion se refiere a una composicion alimentaria o producto de complemento o dispositivo medico o composicion farmaceutica que comprende una mezcla bacteriana, dicha mezcla bacteriana comprende o, alternativamente, consiste en al menos una cepa bacteriana que pertenece a la especie Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum o Bifidobacterium longum subsp. longum, tal como se describio anteriormente, para su uso
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en el tratamiento de colico, diarrea y trastornos intestinales; preferiblemente en sujetos en edad pediatrica. Dicha mezcla bacteriana comprende o, alternativamente, consiste en las cepas Bifidobacterium breve B632 en asociacion con Bifidobacterium breve BR03 o, alternativamente, Bifidobacterium breve BR03 en asociacion con Lactobacillus plantarum LP01. Dicha composicion alimentaria o producto de complemento o dispositivo medico o composicion farmaceutica comprende una mezcla bacteriana, tal como se describio anteriormente, en la que dicha mezcla bacteriana se anade o se suspende o se dispersa en un aceite vegetal seleccionado de entre aceite de oliva, aceite de mafz, aceite de girasol, aceite de semillas y aceite de palma. Preferiblemente es un aceite de mafz.
La composicion alimentaria o producto de complemento o dispositivo medico o composicion farmaceutica puede estar en forma de una suspension oleosa o granulos, polvo, capsulas, comprimidos y sobres.
El objeto de la presente invencion se refiere a una composicion alimentaria o producto de complemento o dispositivo medico o composicion farmaceutica como composicion simbiotica. Dicha composicion simbiotica comprende al menos una sustancia vegetal seleccionada del grupo que comprende o, alternativamente, que consiste en esteroles o fitoesteroles, estanoles o fitoestanoles, glucomanano, goma konjac y/o al menos una fibra prebiotica seleccionada del grupo que comprende fructo-oligosacaridos -FOS, galacto-oligosacaridos -GOS, xilo-oligosacaridos -XOS, inulina, fibra de alerce o arabinogalactano y/o arroz rojo fermentado y/o betaglucanos de avenas, salvado de avena, cebada, salvado de cebada y/o gel de Aloe arborescens en forma liofilizada. En una realizacion, dicha composicion simbiotica comprende simeticona. En otra realizacion, dicha composicion simbiotica comprende al menos una sustancia vegetal seleccionada del grupo que comprende galacto-oligosacaridos (GOS), fructo-oligosacaridos (FOS) e inulina.
Parte experimental
1. SELECCION DE LAS BIFIDOBACTERIAS
Se estudiaron cuarenta y seis cepas de Bifidobacterium spp.; se aislaron predominantemente de heces de lactante y pertenecen a 5 especies diferentes (B. bifidum, B. breve, B. longum subsp. infantis, B. longum subsp. longum, B. adolescents y B. pseudocatenulatum). Los microorganismos considerados son parte de la coleccion BUSCoB (Coleccion Scardovi de bifidobacterias de la Universidad de Bolonia, Universidad de Bolonia, Italia) presente en el DisTA.
2. SELECCION DE LOS MICROORGANISMOS PATOGENOS OBJETIVO
Se tuvieron en cuenta diversas cepas de Escherichia coli: 1 cepa de E. coli de una coleccion (ATCC 11105), 1 cepa de E. coli aislada de heces durante una infeccion de las vfas urinarias (cepa M85), que habfa demostrado ser un buen microorganismo objetivo en estudios previos, y dos cepas de E. coli aisladas de lactantes afectados por colico (cepa GC6a y GC23a). E. coli es un agente etiologico principal de diarrea aguda en ninos. Ademas, se hizo un examen de una cepa de Salmonella enteriditis, el principal microorganismo responsable de diarreas de origen bacteriano en ninos en Italia (Infante Pina et al., 2008); una cepa de Clostridium difficile, un agente etiologico principal de diarrea aguda en ninos (Infante Pina et al., 2008); y una cepa de Campilobacter jejuni, que es asimismo una causa de diarrea aguda en ninos (Infante Pina et al., 2008).
3. ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS MICROORGANISMOS SELECCIONADOS
Se analizaron los 46 microorganismos para determinar su capacidad para inhibir el crecimiento de E. coli ATCC 11105TM, M85, GC 6a, GC 23a y S. enteriditis M94. Se realizo un examen preliminar para determinar la actividad antimicrobiana usando la “prueba de la gota en agar”, segun el protocolo brevemente resumido en el presente documento.
PRUEBA DE LA GOTA EN AGAR: Se hace uso de un cultivo cultivado durante la noche (o.n., overnight) de cada cepa de Bifidobacterium, que tema una absorbancia a 600 nm (A600) de aproximadamente 0,7-1, correspondiente a una fase exponencial completa. Se usa una placa de TPY-agar; se divide la placa en 4 y se inocula cada cuadrante con 10 r|l del cultivo o.n. de cada cepa. Se incuba la placa 24 h a 37°C en anaerobiosis. Una vez que se ha producido el crecimiento, se cubre la superficie con una capa de 7-8 ml de medio de agar blando para E. coli (NB + 0,7% de agar), inoculado con 100 r|l de un cultivo o.n. de la cepa marcadora. Se incuba la placa en condiciones que permiten el crecimiento de la cepa marcadora. Tras 24-48 horas de incubacion, dependiendo de la cepa marcadora usada, puede observarse la presencia de un halo de inhibicion alrededor del inoculo de cada cepa de Bifidobacterium. Se mide este halo con una regla. Se repite la prueba al menos dos veces. En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos (el promedio de dos experimentos). La tabla 1 muestra los halos de inhibicion producidos por las 5 cepas marcadoras para solo 16 de las 46 cepas sometidas a prueba.
Tabla 1
Cepa
E. coli ATTC 11105 E. coli M85 E. coli GC 6a E. coli GC 23a S. enteriditis M94
B 2274
0,8 0,8 1 1 1,3
5
10
15
20
25
30
B 632
1,2 1,2 0,8 0,9 1,2
B 1975
0,9 0,7 0,7 0,6 1,2
B7840
0,7 0,7 1 0,6 1
B 2091
0,4 0,3 0,6 0,6 0,7
B 2021
0,6 0,6 0,9 0,9 1
B 2150
0,6 0,6 1 0,8 1
B 2195
0,5 0,7 0,9 0,7 1,1
Re 12
0,9 0,6 0,8 0,8 1
B2101
0,9 1 0,9 1 1
B 8452
0,5 0,6 0,1 0,4 0,2
B 2192
0,9 0,7 1 0,7 1,5
B 2055
0,7 0,9 0,3 0,5 0,5
B 7958
0,7 0,7 0,6 0,8 1,1
B 7947
0,7 0,7 0,4 0,3 0,5
B1412
1,2 1,2 1,3 0,9 1
Tal como puede observarse a partir del examen de la tabla 1, este estudio revelo la presencia de cepas con una buena actividad antagonista sobre todo frente a las dos cepas de E. coli aisladas de lactantes con colico y Salmonella enteriditis. Solo se seleccionaron las cepas que presentaron globalmente halos de inhibicion de mayor tamano.
Se valoro entonces la actividad antagonista de las 16 cepas seleccionadas frente a Clostridium difficile M216 y Campilobacter jejuni LMG8841. En la tabla 2 se presentan los resultados obtenidos (el promedio de dos experimentos).
Tabla 2. Tamano de los halos de inhibicion (en cm) producidos por Clostridium difficile M216 y Campilobacter jejuni LMG8841 para las 16 cepas seleccionadas de Bifidobacterium.
Cepa
C. jejuni LMG8841 C. difficile M216
B2091
0,8 0,4
B2274
1 0,5
B2021
1 0,4
B 632
0,8 0,5
B2150
0,8 0,4
B2195
1,2 0,5
B1412
1,1 0,5
Re 12
1,1 0,4
B2101
0,8 0
B1975
0,8 0,5
B8452
0,8 0,4
B2192
1 0,4
B2055
1 0,3
B7958
1,1 0,4
B7947
0,3 0,3
B7840
1,4 0,3
Los resultados obtenidos revelaron una alta actividad inhibidora hacia C. jejuni LMG8846 y una actividad mas debil (aunque claramente presente en la mayona de las cepas) frente a C. difficile M216.
Se realizo entonces una valoracion del poder antimicrobiano del sobrenadante obtenido de cultivos o.n. de los 16 microorganismos seleccionados hacia dos cepas aisladas de lactantes afectados por colico y hacia S. enteriditis. El sobrenadante, que tema un pH comprendido en el intervalo de 5,5-6,2, se llevo a pH 6,5 antes de que se realizara la prueba. Se realizo el ensayo usando dos metodos brevemente descritos en el presente documento: “ensayo de difusion en pocillos” y “prueba de disco en blanco”.
ENSAYO DE DIFUSION EN POCILLOS: Se hace uso de un cultivo cultivado durante la noche (o.n.) de cada cepa de Bifidobacterium, que tema una A600 de aproximadamente 0,7-1, correspondiente una fase exponencial completa. Se centrifuga el cultivo a 10.000 rpm durante 10 minutos; vuelve a centrifugarse el sobrenadante a 14.000 rpm durante 15 minutos y vuelve a centrifugarse inmediatamente. Se lleva entonces a pH 6,5 con NaOH 1 N. Se aplica una capa de agar blando inoculado con 500 r|l de una suspension de E. coli 106 UFC/ml (o de cualquier otra cepa marcadora usada) sobre una placa. Despues de que el agar se haya solidificado, se preparan pocillos con una pipeta Pasteur esteril y se introducen 50-80 r|l de sobrenadante neutralizado de Bifidobacterium spp. en los pocillos. Se incuba la placa o.n. a 37°C en condiciones que permiten el crecimiento de la cepa marcadora (37°C en aerobiosis para E. coli).
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METODO DE DISCO EN BLANCO: Se llevaron a cabo la centrifugacion del cultivo de Bifidobacterium y neutralizacion del sobrenadante como antes. Se hace uso de una placa de agar nutritivo (NA) en el caso de E. coli u otros medios si se usan cepas diferentes. Se inocula la cepa marcadora en la superficie partiendo de una suspension que tiene una concentracion celular de 106 UFC/ml. Se empapa un disco (previamente esterilizado) que tienen un diametro de un cm con 0,1 ml de sobrenadante (tanto neutralizado como no neutralizado) y se deja reposar sobre la placa. Se incuba la placa en condiciones adecuadas para el crecimiento de la cepa marcadora. El efecto inhibidor de los microorganismos sobre los microorganismos marcadores tal como revela la prueba de la gota en agar parece deberse principalmente, pero no unicamente, a la produccion de metabolitos acidos que, al reducir el pH del entorno circundante, provocan una inhibicion de los patogenos. Sin embargo, parece posible la produccion de bacteriocinas.
No obstante, con el fin de caracterizar mejor la actividad antimicrobiana del sobrenadante de los microorganismos usados en este estudio, se realizo una valoracion de la cinetica de crecimiento de algunas cepas marcadoras (E. coli ATCC11105™, S. enteriditis M94, E. coli GC 6a y E. coli GC 23a) en presencia de cantidades conocidas del sobrenadante de cada cepa de Bifidobacterium. Se inoculo la cepa marcadora en el medio de NB (caldo nutritivo) sin adicion (esto representa el control) y en presencia de cantidades conocidas de sobrenadante derivado de un cultivo
o.n. de Bifidobacterium spp. El sobrenadante se uso tanto como tal como despues de la neutralizacion a tres concentraciones diferentes: el 12,5% (v/v), el 25% (v/v) y el 50% (v/v). A intervalos de tiempo definidos, se realizo una medicion de A620 de la cepa marcadora, que indica el crecimiento del microorganismo. Se elimino la concentracion de sobrenadante mas alta tras los primeros intentos, porque impedfa completamente el crecimiento del microorganismo marcador. Los datos obtenidos confirman las conclusiones expuestas anteriormente.
4. DETERMINACION DE LA SENSIBILIDAD O RESISTENCIA DE LAS BIFIDOBACTERIAS SELECCIONADAS A DIFERENTES ANTIBIOTICOS Y DETERMINACION DE LA CONCENTRACION INHIBIDORA MfNIMA (MIC, MINIMAL INHIBITORY CONCENTRATION)
Las pruebas de resistencia o sensibilidad a antibioticos es uno de los estudios basicos para evaluar la posibilidad de usar un microorganismo en pruebas in vivo. Es importante que el microorganismo sea lo mas sensible posible a los antibioticos principales usados en la terapia con el fin de vitar el resigo de transmitir resistencia a antibioticos a otros microorganismos intestinales; por otro lado, a menudo se administran probioticos junto con una terapia con antibioticos y, por tanto, la resistencia a antibioticos se vuelve un requisito fundamental para la coadministracion (Ouba et al, 2008). En este estudio, se tuvieron en cuenta 10 antibioticos usados tradicionalmente para evaluar la resistencia a antibioticos en cepas probioticas (ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina, vancomicina, kanamicina, estreptomicina, trimetoprima, cefuroxima y gentamicina); se sometieron a prueba en un intervalo de concentracion de 2-1024 |ig/ml. Ademas, se determino la MIC de otros tres antibioticos usados frecuentemente en terapia neonatal (amoxicilina, ceftriaxona y claritromicina), sometidos a prueba a las mismas concentraciones. Se evaluo la MIC analizando el crecimiento de las bifidobacterias seleccionadas en presencia de concentraciones crecientes de antibiotico; se evaluo el crecimiento midiendo la A620. Se evaluo la resistencia o sensibilidad a antibioticos usando las directrices publicadas por la Comision Europea (Comision UE, 2002) y la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA, 2005).
Los resultados obtenidos indican que las cepas seleccionadas muestran resistencia a ampicilina, kanamicina y amoxicilina, mientras que, en general, muchas de las cepas sometidas a prueba mostraron ser sensibles a los otros antibioticos tenidos en cuenta.
Los resultados obtenidos permitieron la seleccion de las 4 cepas de Bifidobacterium spp., a las cuales se refiere la presente invencion, puesto que presentan actividad antimicrobiana frente a diferentes cepas de E. coli (bacterias productoras de gases presentes en mayores concentraciones en lactantes que padecen colico que en lactantes que no lo padecen). Ademas, dichas cepas muestran una actividad antimicrobiana interesante frente a bacterias que son con la mayor frecuencia la causa de diarrea de origen bacteriano en lactantes (Salmonella enteriditis, Clostridium difficile y Campilobacter jejunii) asf como resistencia a unicamente un numero limitado de antibioticos. Ninguna de las 4 cepas seleccionadas demostro ser capaz de transferir los genes de la resistencia a antibioticos a bifidobacterias o lactobacilos, incluso en los casos en los que se identificaron los genes mediante PCR en el ADN cromosomico de las bifidobacterias.
5. METODO PARA SOMETER A PRUEBA LA INHIBICION SOBRE PLACAS Bacteria con accion inhibidora
a. La bacteria cuya actividad inhibidora frente a bacterias fecales se pretende verificar se somete a al menos dos trasplantes secuenciales en medio de caldo MRS (tubos de prueba que contienen 15 ml).
i. Si la bacteria pertenece al genero Bifidobacterium, el caldo MRS se complementara con clorhidrato de cistema al 1% (dis. al 5%).
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b. Se centrifuga el cultivo de caldo recien preparado (cultivado 22+/- 2 horas) y se lavan las celulas una vez en agua esteril.
c. Entonces, se centrifugan y resuspenden las celulas en 5 ml de medio de cultivo MRS recien preparado.
2. Bacteria fecal sensible
a. La bacteria que va a someterse a inhibicion se somete a al menos dos trasplantes secuenciales en medio de caldo MacConkey (tubos de prueba que contienen 10 ml).
b. El cultivo de caldo recien preparado se diluye en agua para obtener una densidad optica de 0,600 - 0,700 a una longitud de onda de 600 nm.
c. Se aplican 100 ml de esta suspension bacteriana sobre una placa de agar MacConkey y se distribuyen uniformemente sobre toda la superficie usando una espatula esteril adecuada hasta que el lfquido se haya absorbido completamente.
3. Se coloca un disco de papel de 11 mm de diametro (disco de antibiograma) sobre la superficie de la placa, que se hace que absorba 100 ml de la suspension bacteriana de la cepa que va a someterse a prueba (vease la etapa 1-c).
4. Se incuba la placa en un termostato a 37°C durante 24 horas. Resultados: si la bacteria inhibe, sera visible un halo alrededor del disco que indica que no hay crecimiento. Las dimensiones del halo seran proporcionales a la capacidad de la cepa para producir sustancias con una accion bacteriostatica/bactericida que se extiende a traves del agar.
6. PRUEBAS DE INHIBICION SOBRE PLACAS
Para cada probiotico potencialmente inhibidor, se prepara un cultivo y se incuba durante 24 horas en caldo MRS. Entonces, se lavan las celulas y se resuspenden en medio de cultivo MRS recien preparado. Se extiende uniformemente un cultivo de caldo recien preparado de la bacteria patogena sobre la superficie de placas que contienen el medio con agar, espedfico para las especies patogenas que se pretenden inhibir, en una cantidad de 100 l por placa de la primera dilucion decimal. Las celulas asf tratadas se adsorben sobre un disco de papel, en una cantidad de 100 l por disco. Tras incubacion a 37°C durante 24 horas, se realiza una medicion del halo de inhibicion, representado por el area que se extiende entre el borde del disco y el borde de crecimiento del patogeno sometido a prueba.
Se indican las pruebas de la actividad de inhibicion de los seis probioticos frente a los cinco patogenos y se representan a continuacion. Los resultados se notifican como halos de inhibicion expresados en milfmetros.
6.1 Para Listeria monocytogenes ATCC 19112, los resultados se proporcionan en la figura 1. La figura 1 muestra: Cepas probioticas, mm:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684, 0 mm
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878, 0 mm
3. L. reuteri DSM 17938 (ref. positiva), 0 mm
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021, 5 mm
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01, 2 mm
6. L. pentosus PCB 101, 4 mm
6.2 Para Enterococcus sp. (de heces de lactante), los resultados se proporcionan en la figura 2. La figura 2 muestra (en sentido horario, partiendo de la flecha - parte trasera de la placa):
Cepas probioticas, mm:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878
3. L. reuteri DSM 17938 (ref. positiva)
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5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01
6. L. pentosus PCB 101
La figura 2 muestra (en sentido horario, partiendo de la flecha - interior de la placa):
Cepas probioticas, mm:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878
3. L. reuteri DSM 17938 (ref. positiva)
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01
6. L. pentosus PCB 101
Resultados: Halos de inhibicion expresados en milfmetros Cepas probioticas, mm:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684, 3 mm
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878, 3 mm
3. L. reuteri DSM 17938 (ref. positiva), 3 mm
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021, 5 mm
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01, 4 mm
6. L. pentosus PCB 101, 2 mm
6.3 Para Escherichia coli ATCC 8739, los resultados se proporcionan en la figura 3. La figura 3 muestra (en sentido horario, partiendo de la flecha - parte trasera de la placa):
Cepas probioticas, mm:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878
3. L. reuteri DSM 17938 (ref. positiva)
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01
6. L. pentosus PCB 101
La figura 3 muestra (en sentido horario, partiendo de la flecha - interior de la placa):
Cepas probioticas, mm:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878
3. L. reuteri DSM 17938 (ref. positiva)
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021
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6. L. pentosus PCB 101
Resultados: Halos de inhibicion expresados en miKmetros Cepas probioticas, mm:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684, 0 mm
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878, 1 mm
3. L. reuteri DSM 17938 (ref. positiva), 2 mm
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021, 4 mm
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01, 2 mm
6. L. pentosus PCB 101, 1 mm
6.4 Para Escherichia coli ATCC 35218, los resultados se proporcionan en la figura 4. La figura 4 muestra (en sentido horario, partiendo de la flecha - parte trasera de la placa):
Cepas probioticas, mm:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878
3. L. reuteri DSM 17938 (ref. positiva)
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01
6. L. pentosus PCB 101
La figura 4 muestra (en sentido horario, partiendo de la flecha - interior de la placa):
Cepas probioticas, mm:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878
3. L. reuteri DSM 17938 (ref. positiva)
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01
6. L. pentosus PCB 101
Resultados: Halos de inhibicion expresados en milfmetros Cepas probioticas, mm:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684, 4 mm
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878, 2 mm
3. L. reuteri DSM 17938 (ref. positiva), 5 mm
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021, 5 mm
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5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01, 2 mm
6. L. pentosus PCB 101, 1 mm
6.5 Para Klebsiella sp (de heces de lactante), los resultados se proporcionan en la figura 5. La figura 5 muestra (en sentido horario, partiendo de la flecha - parte trasera de la placa):
Cepas probioticas, mm:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878
3. L. reuteri DSM 17938 (ref. positiva)
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01
6. L. pentosus PCB 101
La figura 5 muestra (en sentido horario, partiendo de la flecha - interior de la placa):
Cepas probioticas, mm:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878
3. L. reuteri DSM 17938 (ref. positiva)
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01
6. L. pentosus PCB 101
Resultados: Halos de inhibicion expresados en milfmetros Cepas probioticas, mm:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684, 0 mm
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878, 2 mm
3. L. reuteri DSM 17938 (ref. positiva), 2 mm
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021, 3 mm
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01, 1 mm
6. L. pentosus PCB 101, 0 mm

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Cepa bacteriana que pertenece a la especie Bifidobacterium breve seleccionada del grupo que consiste en Bifidobacterium breve B2274, depositada por la empresa Probiotical SpA de Novara (Italia) en la Institucion 5 depositaria DSMZ el 07/04/2011 y que tiene el numero de deposito DSM 24707; Bifidobacterium breve
    B7840, depositada por la empresa Probiotical SpA de Novara (Italia) en la Institucion depositaria DSMZ el 07/04/2011 y que tiene el numero de deposito DSM 24708, que tiene una actividad antimicrobiana frente a los patogenos E. coli, Salmonella enteriditis, Clostridium difficile y Campilobacter jejunii.
    10 2. Cepa bacteriana que pertenece a la especie Bifidobacterium longum que es Bifidobacterium longum subsp.
    longum B1975, depositada por la empresa Probiotical SpA de Novara (Italia) en la Institucion depositaria DSMZ el 07/04/2011 y que tiene el numero de deposito DSM 24709 que tiene una actividad antimicrobiana frente a los patogenos E. coli, Salmonella enteriditis, Clostridium difficile y Campilobacter jejunii.
    15 3. Cepa bacteriana segun las reivindicaciones 1 o 2, en la que el patogeno E. coli consiste en el biotipo E. coli
    O157:H7.
  2. 4. Composicion alimentaria o producto de complemento o composicion farmaceutica que comprende una mezcla bacteriana, comprendiendo dicha mezcla bacteriana al menos una cepa bacteriana que pertenece a
    20 la especie Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum o Bifidobacterium longum subsp. longum
    seleccionada del grupo que consiste en Bifidobacterium breve B632, depositada por la empresa Probiotical SpA de Novara (Italia) en la Institucion depositaria DSMZ el 07/04/2011 y que tiene el numero de deposito DSM 24706; Bifidobacterium breve B2274, depositada por la empresa Probiotical SpA de Novara (Italia) en la Institucion depositaria DSMZ el 07/04/2011 y que tiene el numero de deposito DSM 24707;
    25 Bifidobacterium breve B7840, depositada por la empresa Probiotical SpA de Novara (Italia) en la Institucion
    depositaria DSMZ el 07/04/2011 y que tiene el numero de deposito DSM 24708 y Bifidobacterium longum subsp. longum B1975, depositada por la empresa Probiotical SpA de Novara (Italia) en la Institucion depositaria DSMZ el 07/04/2011 y que tiene el numero de deposito DSM 24709, para su uso en el tratamiento de colico, diarrea y trastornos intestinales.
    30
  3. 5. Composicion alimentaria o producto de complemento o composicion farmaceutica segun la reivindicacion 4 para su uso en el tratamiento de colico, diarrea y trastornos intestinales en sujetos en edad pediatrica.
  4. 6. Composicion alimentaria o producto de complemento o composicion farmaceutica que comprende una
    35 mezcla bacteriana para su uso segun las reivindicaciones 4-5, en la que dicha mezcla bacteriana se anade
    o se suspende o se dispersa en un aceite vegetal seleccionado de entre aceite de oliva, aceite de mafz, aceite de girasol, aceite de semillas y aceite de palma; preferiblemente es un aceite de mafz.
  5. 7. Composicion alimentaria o producto de complemento o composicion farmaceutica para su uso segun una
    40 de las reivindicaciones 4-6, en la que dicha composicion alimentaria o producto de complemento o
    composicion farmaceutica es una composicion simbiotica que comprende al menos una sustancia vegetal seleccionada del grupo que comprende o, alternativamente, que consiste en esteroles o fitoesteroles, estanoles o fitoestanoles, glucomanano, goma konjac y/o al menos una fibra prebiotica seleccionada del grupo que comprende fructo-oligosacaridos -FOS, galacto-oligosacaridos -GOS, xilo-oligosacaridos -XOS,
    45 inulina, fibra de alerce o arabinogalactano y/o arroz rojo fermentado y/o betaglucanos de avenas, salvado
    de avena, cebada, salvado de cebada y/o gel de Aloe arborescens en forma liofilizada.
  6. 8. Composicion alimentaria o producto de complemento o composicion farmaceutica para su uso segun una de las reivindicaciones 4-7, en la que dicha composicion alimentaria o producto de complemento o
    50 composicion farmaceutica comprende simeticona.
  7. 9. Composicion alimentaria o producto de complemento o composicion farmaceutica para su uso segun las reivindicaciones 7-8, en la que dicha al menos una sustancia vegetal se selecciona del grupo que comprende galacto-oligosacaridos (GOS), fructo-oligosacaridos (FOS) e inulina.
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