ES2609583T3 - Anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a BLyS - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo humano o humanizado que neutraliza se une a la Proteína Estimuladora de Linfocitos B o un fragmento funcional del mismo, en el que dicho anticuerpo es (a) un anticuerpo humano o humanizado que se une a la Proteína Estimuladora de Linfocitos B, en el que el anticuerpo comprende los restos de aminoácidos 26-35, 50-66, 99-112, 163-173, 189-195 y 228-238 de la SEQ ID NO: 2; (b) un anticuerpo monoclonal humano o humanizado que inhibe competitivamente la unión del anticuerpo producido por la línea celular que tiene el Número de Depósito ATCC PTA-3239 a la Proteína Estimuladora de Linfocitos B; o (c) un anticuerpo monoclonal humano o humanizado que reduce la unión del anticuerpo producido por la línea celular que tiene el Número de Depósito ATCC PTA-3239 a la Proteína Estimuladora de Linfocitos B mediante un aumento dentro de un intervalo en porcentaje seleccionado del grupo que consiste en: (a) del 50 % hasta el 60 %; (b) del 60 % hasta el 70 %; (c) del 70 % hasta el 80 %; (d) del 80 % hasta el 90 %; y (e) del 90 % hasta el 100 %.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a BLyS Introduccion
La presente invencion se refiere a anticuerpos humanos o humanizados y moleculas relacionadas que neutralizan a BLyS (Protema Estimuladora de Linfocitos B). La presente invencion se refiere ademas a composiciones farmaceuticas que comprenden uno o mas anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos de la presente invencion, o moleculas relacionadas de la presente invencion, que se neutralizan a BLyS para su uso en la prevencion, tratamiento o mejona de una enfermedad o trastorno del sistema inmune o cancer. La presente invencion se refiere ademas a una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo humano o humanizado o la molecula relacionada de la presente invencion. La presente invencion se refiere ademas a la molecula de acido nucleico que codifica el anticuerpo o humano o humanizado o la molecula relacionada de la presente invencion y a un vector que comprende la molecula de acido nucleico de la presente invencion. La presente invencion se refiere ademas a una celula hospedadora que comprende la molecula de acido nucleico de la presente invencion y a una lmea celular modificada por ingeniena genetica para expresar el anticuerpo humano o humanizado o la molecula relacionada de la presente invencion. La presente invencion se refiere ademas a un anticuerpo humano o humanizado o la molecula relacionada de la presente invencion que se produce por la celula hospedadora de la presente invencion. La presente invencion se refiere ademas a un procedimiento para producir un anticuerpo humano o humanizado que se une a BLyS, que comprende cultivar la celula hospedadora de la presente invencion en condiciones en las que la molecula de acido nucleico de la presente invencion se expresa.
Antecedentes de la invencion
El estimulador de linfocitos B (BLyS) es un miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral ("TNF", por sus siglas en ingles) que induce la proliferacion y diferenciacion de linfocitos B tanto in vivo como in vitro (Moore y col., Science 285: 260-263 (1999)). BLyS es distinguible de otros factores de crecimiento y diferenciacion de linfocitos B tales como IL-2, IL-4, IL-5, lL-6, IL-7, IL-13, IL-15, CD40L o CD27L (CD70) por su patron de expresion de genes y protemas espedfico de monocitos y su distribucion de receptores y actividad biologica espedficos en linfocitos B. La expresion de BLyS no se detecta en linfocitos citolfticos naturales ("NK", por sus siglas en ingles), linfocitos T o linfocitos B, sino que se restringe a celulas de origen mieloide. La expresion de BLyS en monocitos en reposo esta regulada positivamente por interferon gamma (IFN-gamma). El gen que codifica BLyS se ha mapeado en el cromosoma 13q34.
BLyS se expresa como un polipeptido unido a membrana de tipo II de 285 aminoacidos y un polipeptido soluble de 152 aminoacidos (Moore y col., 1999, anteriormente). La forma unida a membrana de BLyS tiene un dominio transmembrana predicho entre los restos aminoaddicos 47 y 73. El extremo NH2-terminal de la forma soluble de BLyS comienza en la Ala134 de la forma unida a membrana de BLyS. Se ha demostrado que el BLyS recombinante soluble induce la proliferacion in vitro de linfocitos B esplenicos murinos y se une a un receptor de superficie celular en estas celulas (Moore y col., 1999 anteriormente). Se ha demostrado que la administracion de BLyS soluble a ratones da como resultado un aumento en la proporcion de linfocitos B cD45Rmate, Ly6Dbrallante (tambien conocidas como ThB) y un aumento en los niveles de IgM e IgA en suero (Moore y col., 1999, anteriormente). Por lo tanto, BLyS muestra un tropismo de linfocitos B, tanto en su distribucion de receptores como en su actividad biologica.
Basandose en su patron de expresion y en su actividad biologica, se ha sugerido que BLyS esta implicado en el intercambio de senales entre linfocitos B y monocitos o su progenie diferenciada. Los patrones de expresion restringidos de receptor y ligando de BLyS sugieren que BLyS puede funcionar como un regulador de respuestas independientes de linfocitos T de forma analoga a la de CD40 y CD40L en la activacion de antfgeno dependiente de linfocitos T. Como tales, los anticuerpos y moleculas relacionadas que se unen inmunoespedficamente a BLyS pueden encontrar utilidad medica, por ejemplo, en el tratamiento de trastornos de linfocitos B asociados a autoinmunidad, neoplasia o smdromes de inmunodeficiencia.
Mukhopadhyay y col. (J. Biol. Chem. 274:15978-81 (1999)) desvela la identificacion y caracterizacion de una citocina, THANk (BLyS), un homologo de TNF que activa la apoptosis, factor nuclear-KB y quinasa NH2-terminal C- Jun. Dicho documento desvela ademas anticuerpos policlonales anti-THANK/BLyS que inhiben la activacion de NF- kB inducida por THANK.
Sumario de la invencion
La presente invencion se refiere a un anticuerpo humano o humanizado (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente que consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que neutralizan BLyS, o un fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo es
(a) un anticuerpo humano que se une a BLyS en el que el anticuerpo comprende los restos de aminoacidos 2635, 50-66, 99-112, 163-173, 189-195 y 228-238 de la SEQ ID NO: 2;
(b) un anticuerpo monoclonal humano o humanizado que inhibe competitivamente la union del anticuerpo producido por la lmea celular que tiene el Numero de Deposito ATCC PTA-3239 a BLyS; o
(c) un anticuerpo monoclonal humano o humanizado que reduce la union del anticuerpo producido por la lmea
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celular que tiene el Numero de Deposito ATCC PTA-3239 a la Protema Estimuladora de Linfocitos B mediante un aumento dentro de un intervalo en porcentaje seleccionado del grupo que consiste en:
(a) del 50 % hasta el 60 %;
(b) del 60 % hasta el 70 %;
(c) del 70 % hasta el 80 %;
(d) del 80 % hasta el 90 %; y
(e) del 90 % hasta el 100 %.
En particular, los anticuerpos humanos o humanizados de la presente invencion (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente que consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) se unen inmunoespedficamente a un polipeptido o fragmento polipeptidico de BLyS humano (SEQ ID NO: 3228 y/o 3229) o BLyS expresado en monocitos humanos; BLyS murino (SEQ ID NO: 3230 y/o 3231) o BLyS expresado en monocitos murinos; BLyS de rata (bien las formas solubles como se proporcionan en las SEQ ID NO: 3232, 3233, 3234 y/o 3235 o en una forma asociada a membrana, por ejemplo, en la superficie de monocitos de rata); o BLyS de mono (por ejemplo, los polipeptidos de BLyS de mono de las SEQ ID NO: 3236 y/o 3237, la forma soluble de BLyS de mono o BLyS expresado en monocitos de mono), preferentemente BLyS humano.
En una realizacion, el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de la presente invencion tiene una constante de disociacion (KD) seleccionada del grupo que consiste en:
(a) una constante de disociacion (KD) entre 10"7 M y 10"8 M;
(b) una constante de disociacion (kd) entre 10"8 M y 10"9 M;
(c) una constante de disociacion (KD) entre 10"9 M y 10"10 M;
(d) una constante de disociacion (KD) entre 10"10 M y 10"11 M;
(e) una constante de disociacion (KD) entre 10"11 M y 10"12 M; y
(f) una constante de disociacion (KD) entre 10"12 M y 10"13 M.
En una realizacion, el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de la presente invencion se selecciona del grupo que consiste en:
(a) una molecula de inmunoglobulina completa;
(b) un scFv;
(c) un anticuerpo monoclonal;
(d) un anticuerpo quimerico;
(e) un fragmento Fab;
(f) un fragmento Fab';
(g) un F (ab') 2;
(h) un Fv; y
(i) un Fv unido por enlace disulfuro.
En una realizacion, el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de la presente invencion tambien comprende un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un dominio constante de IgM humana;
(b) un dominio constante de IgG1 humana;
(c) un dominio constante de IgG2 humana;
(d) un dominio constante de lgG3 humana;
(e) un dominio constante de lgG4 humana; y
(f) un dominio constante de IgA humana.
En una realizacion, el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de la presente invencion tambien comprende un dominio constante de inmunoglobulina de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un dominio constante kappa de Ig humana;
(b) un dominio constante lambda de Ig humana.
En una realizacion, el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de la presente invencion disminuyen o eliminan la capacidad de BLyS o un fragmento funcional de la misma de unirse a su receptor. En un aspecto espedfico, el receptor es TACI o BCMA. En una realizacion, el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de la presente invencion disminuyen o eliminan la capacidad de BLyS o un fragmento funcional del mismo para estimular la proliferacion de linfocitos B. En una realizacion, el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de la presente invencion disminuyen o eliminan la capacidad de BLyS o un fragmento funcional del mismo para estimular la inmunosecrecion por los linfocitos B.
En una realizacion, el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de la presente invencion se purifican a partir de la lmea celular contenida en el Numero de Deposito ATCC PTA-3239.
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La presente invencion se refiere ademas a una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de la presente invencion.
La presente invencion abarca ademas composiciones para usar en la prevencion, el tratamiento o la mejona de enfermedades o trastornos asociados a una expresion aberrante de BLyS o el receptor de BLyS o una funcion inapropiada de BLyS o receptor de BLyS en un animal, preferentemente un mairnfero, y mas preferentemente un ser humano, comprendiendo dichas composiciones, o alternativamente consistiendo en uno o mas anticuerpos de la presente invencion (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente que consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos de la presente invencion) que se unen inmunoespedficamente a BLyS. La presente invencion abarca ademas el uso de uno o mas anticuerpos de la presente invencion (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente que consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos de la presente invencion) para su uso en la prevencion, tratamiento o mejona de enfermedades o trastornos asociados a una expresion aberrante de BLyS o receptor de BLyS, o una funcion inapropiada de BLyS o receptor de BLyS en un animal, preferentemente un mam^era, y mas preferentemente un ser humano.
La presente invencion se refiere ademas al uso del anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de la presente invencion para la preparacion de una composicion farmaceutica para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o un del sistema inmune. La presente invencion se refiere ademas al anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de la presente invencion para usar tratando, previniendo o mejorando una enfermedad o un trastorno del sistema inmune. En una realizacion, la enfermedad o el trastorno del sistema inmune es una enfermedad o un trastorno autoinmune. En un aspecto espedfico, la enfermedad o trastorno autoinmune se selecciona del grupo que consiste en:
(a) Lupus Eritematoso Sistemico;
(b) Artritis reumatoide;
(c) Esclerosis multiple;
(d) Purpura Trombocitopenico Idiopatico;
(e) Smdrome de Sjoren;
(f) Diabetes; y
(g) Vasculitis.
En otra realizacion, la enfermedad o el trastorno del sistema inmune es SIDA.
La presente invencion se refiere ademas al uso del anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de la presente invencion para la preparacion de una composicion farmaceutica para tratar, prevenir o mejorar el rechazo de injerto o de trasplante. La presente invencion se refiere ademas al anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de la presente invencion para usar tratando, previniendo o mejorando el rechazo de injerto o de trasplante.
La presente invencion se refiere ademas al uso del anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de la presente invencion para la preparacion de una composicion farmaceutica para tratar, prevenir o mejorar el cancer. La presente invencion se refiere ademas al anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de la presente invencion para usar tratando, previniendo o mejorando el cancer. En un aspecto espedfico, el cancer se selecciona del grupo que consiste en:
(a) Macroglobulinemia de Waldenstrom;
(b) Leucemia linfocftica aguda;
(c) leucemia linfocftica cronica;
(d) linfoma no de Hodgkin; y
(e) mieloma multiple.
Las enfermedades y trastornos que pueden prevenirse, tratarse o mejorarse administrando una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invencion tambien incluyen, pero no se limitan a, trastornos inmunes (por ejemplo, lupus, artritis reumatoide, esclerosis multiple, miastenia grave, enfermedad de Hashimoto, purpura trombocitopenico idiopatico, smdrome de Sjoren, Diabetes, Vasculitis y SIDA) o cancer. Las enfermedades y trastornos adicionales que puede imaginarse que se prevengan, traten o mejoren en el contexto de la presente invencion son trastornos inflamatorios (por ejemplo, asma, trastornos alergicos y artritis reumatoide), enfermedades infecciosas (por ejemplo, SIDA), trastornos proliferativos (por ejemplo, leucemia, carcinoma y linfoma) y smdromes de inmunodeficiencia.
Usando la tecnologfa de visualizacion de fagos, los presentes inventores han identificado moleculas de anticuerpo de cadena sencilla ("scFv") que se unen inmunoespedficamente a BLyS, incluyendo scFv que se unen inmunoespedficamente a BLyS soluble, scFv que se unen inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS y scFv que se unen inmunoespedficamente tanto a la forma soluble como a la forma unida a membrana de BLyS. Tambien se describen en el presente documento moleculas que comprenden, o alternativamente que consisten en, fragmentos o variantes de estos scFv (por ejemplo, incluyendo dominios VH, CDR de VH, dominios VL o CDR de VL que tienen una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las mencionadas en la Tabla 1) que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS, a la forma unida a membrana de BLyS y/o tanto a la forma soluble como a la forma unida a membrana de BLyS, asf como las moleculas de acido nucleico que codifican estos scFv y/o moleculas.
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En particular, la presente invencion se refiere a scFV que comprenden, o alternativamente que consisten en, la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 como se hace referencia en la Tabla 1 a continuacion. La presente invencion se refiere ademas a scFV que se unen inmunoespedficamente tanto a la forma unida a membrana como a la forma soluble de BLyS, comprendiendo dichos scFV, o alternativamente que consisten en, una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 como se hace referencia en la Tabla 1 a continuacion.
En una realizacion, el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de la presente invencion (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente que consisten en, fragmentos de anticuerpos o variantes del mismo) que se unen inmunoespedficamente a un polipeptido o fragmento de polipeptido de BLyS que comprende un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos del dominio pesado variable (“VH”) a la que se hace referencia en la Tabla, el 1 Clon ID I006D08, a continuacion o el dominio ligero variable (“VL”) a la que se hace referencia en la Tabla, el 1 Clon ID I006D08. En una realizacion preferida, los anticuerpos o los fragmentos funcionales de los mismos de la presente invencion comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VH contenido en la SEQ ID NO: 2, como se hace referencia en la Tabla 1 a continuacion o un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VL contenido en la SEQ ID NO: 2, como se hace referencia en la Tabla 1 a continuacion.
En una realizacion preferida, los anticuerpos o los fragmentos funcionales de los mismos de la presente invencion comprenden o alternativamente consisten en, un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VH y un VL contenidos en el mismo scFv al que se hace referencia en la Tabla 1, Clon ID I006D08. En otra realizacion preferida, los a los anticuerpos o los fragmentos funcionales de los mismos de la presente invencion comprenden o alternativamente consisten en, el dominio VH y un VL de un unico scFv de SEQ ID NO: 2, como se desvela en la Tabla 1. En una realizacion, el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de la presente invencion comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 95 % identica a los restos de aminoacidos 1-123 y 141-249 de la SEQ ID NO: 2. En una realizacion, el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de la presente invencion comprende os restos de aminoacidos 1-123 y/o 141-249 de la SEQ ID NO: 2.
En otra realizacion, los anticuerpos de la presente invencion (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente, que consisten en, fragmentos de anticuerpos o variantes de los mismos) se unen inmunoespedficamente a un polipeptido o fragmento polipeptfdico de BLyS y comprenden el CDR1, el CDR2 y el CDR3 del dominio VL y el CDR1, el CDR2 y el CDR3 del dominio VH del mismo scFv al que se hace referencia en la Tabla 1, Clon ID I006D08.
En una realizacion, BLyS como se emplea de acuerdo con la presente invencion:
(a) comprende los restos de aminoacidos 1-285 de la SEQ ID NO: 3228;
(b) comprende los restos de aminoacidos 134-285 de la SEQ ID NO: 3228; o
(c) comprende un tnmero de los restos de aminoacidos 134-285 de la SEQ ID NO: 3228.
En una realizacion, la BLyS es un homotnmero. En un aspecto espedfico, el homotnmero de BLyS consiste en la forma madura de BLyS.
La presente invencion tambien proporciona los anticuerpos de la presente invencion (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente que consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que: se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS (por ejemplo, un polipeptido que consiste en los aminoacidos 134 - 285 de la SEQ ID NO: 3228); que se unen inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS (por ejemplo, un polipeptido que consiste en los aminoacidos 1 - 285 de la SEQ ID NO: 3228 o un polipeptido de BLyS expresado en la superficie de monocitos); y/o que se unen inmunoespedficamente tanto a la forma soluble como a la forma unida a membrana de BLyS. En una realizacion preferida, los anticuerpos de la presente invencion se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS y comprenden CDR1 del Vh, CDR2 del VH, CDR3 del VH, CDR1 del VL, CDR2 del VL y CDR3 del VL correspondientes a un scFv, que se une inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS, Clon ID I006D08. En otra realizacion preferida, los anticuerpos de la presente invencion se unen inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS y comprenden CDR1 del VH, CDR2 del VH, CDR3 del VH, CDR1 del VL, CDR2 del VL y CDR3 del VL correspondientes a un scFv, que se une inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS, Clon ID I006D08. En otra realizacion preferida mas, los anticuerpos de la presente invencion se unen inmunoespedficamente a la forma soluble y a la forma unida a membrana de BLyS y comprenden CDR1 del VH, CDR2 del Vh, CDR3 del VH, CDR1 del VL, CdR2 del VL y CDR3 del VL correspondientes a uno o mas scFv, que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble y a la forma unida a membrana de BLyS, Clon ID I006D08.
Un dominio VH de una secuencia de aminoacidos desvelada en el presente documento puede combinarse con un dominio VL de una secuencia de aminoacido desvelada en el presente documento para proporcionar un par VH/VL que represente un sitio de union a antfgeno de un anticuerpo. Similarmente, un dominio VL de una secuencia de aminoacido desvelada en el presente documento puede combinarse con un dominio VH de una secuencia de aminoacido desvelada en el presente documento. Ademas, uno o mas CDR desvelados en el presente documento pueden tomarse de un dominio VH o VL e incorporarse en un marco adecuado como se analiza a continuacion. En una realizacion, el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de la presente invencion (incluyendo moleculas
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que comprenden, o alternativamente que consisten en, fragmentos de anticuerpos o variantes de los mismos (incluyendo derivados)) que comprenden dominios VH, dominios VL y/o CDR descritos en el presente documento, se unen inmunoespedficamente a BLyS (por ejemplo, BLyS soluble y BLyS unido a membrana) y pueden ensayarse de forma rutinaria para la union inmunoespedfica a BLyS usando procedimientos conocidos en la tecnica, tales como, por ejemplo, los inmunoensayos desvelados a continuacion. Los anticuerpos y los fragmentos o las variantes (incluyendo derivados) de anticuerpos de la presente invencion pueden incluir, por ejemplo, una o mas alteraciones de la secuencia de aminoacidos (adicion, delecion, sustitucion y/o insercion de un resto de aminoacido). Estas alteraciones pueden realizarse en una o mas regiones marco y/o uno o mas CDR. Los anticuerpos de la presente invencion (incluyendo fragmentos de anticuerpos, y variantes y derivados de los mismos) pueden fabricarse rutinariamente mediante procedimientos conocidos en la tecnica.
La presente invencion tambien proporciona paneles de anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente que consisten en fragmentos o variantes de anticuerpo) en los que los miembros del panel corresponden a uno, dos, tres, cuatro, cinco, diez, quince, veinte o mas anticuerpos diferentes de la presente invencion (por ejemplo, anticuerpos completos, Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, Fv unidos por enlaces disulfuro (sdFv), anticuerpos antiidiotfpicos (anti-Id) y scFv). La presente invencion proporciona ademas mezclas de anticuerpos, en las que la mezcla corresponde a uno, dos, tres, cuatro, cinco, diez, quince, veinte o mas anticuerpos diferentes de la presente invencion (por ejemplo, anticuerpos completos, Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, Fv unidos por enlaces disulfuro (sdFv), anticuerpos antiidiotfpicos (anti-Id) y scFv)). La presente invencion tambien proporciona composiciones que comprenden, o alternativamente consisten en uno, dos, tres, cuatro, cinco, diez, quince, veinte o mas anticuerpos de la presente invencion (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos). Una composicion de la presente invencion puede comprender, o alternativamente consistir en uno, dos, tres, cuatro, cinco, diez, quince, veinte o mas secuencias de aminoacidos de uno o mas anticuerpos de la presente invencion o fragmentos o variantes de los mismos de la presente invencion. Alternativamente, una composicion de la presente invencion puede comprender, o alternativamente consistir en, moleculas de acido nucleico que codifican uno o mas anticuerpos de la presente invencion.
La presente invencion tambien proporciona protemas de fusion que comprenden un anticuerpo (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) de la presente invencion y un polipeptido heterologo (es decir, un polipeptido no relacionado con un anticuerpo o dominio de anticuerpo). Las moleculas de acido nucleico que codifican estas protemas de fusion tambien se incluyen en la presente invencion. Una composicion de la presente invencion puede comprender, o alternativamente consistir en, una, dos, tres, cuatro, cinco, diez, quince, veinte o mas protemas de fusion de la presente invencion. Alternativamente, una composicion de la presente invencion puede comprender, o alternativamente consistir en moleculas de acido nucleico que codifican una, dos, tres, cuatro, cinco, diez, quince, veinte o mas protemas de fusion de la presente invencion.
La presente invencion tambien proporciona una molecula de acido nucleico, generalmente aislada, que codifica un anticuerpo o fragmentos funcionales del mismo (incluyendo moleculas tales como scFv, que comprenden, o alternativamente consisten en, un fragmento de anticuerpo o variante del mismo) de la presente invencion. La presente invencion tambien se refiere a un vector que comprende la molecula de acido nucleico de la presente invencion. En una realizacion, el vector de la presente invencion tambien comprende una secuencia de nucleotido que regula la expresion del anticuerpo o los fragmentos funcionales del mismo codificada por la molecula de acido nucleico. La presente invencion tambien proporciona una celula hospedadora que comprende la molecula de acido nucleico o el vector de la presente invencion. La presente invencion tambien proporciona una celula hospedadora transformada con una molecula de acido nucleico de la presente invencion y progenie de la misma. La presente invencion se refiere ademas a una lmea celular modificada por ingeniena genetica para expresar el anticuerpo de la presente invencion. La presente invencion tambien proporciona un procedimiento para la produccion de un anticuerpo (incluyendo una molecula que comprende, o alternativamente que consiste en, un fragmento de anticuerpo o variante del mismo) de la presente invencion. En particular, la presente invencion se refiere a un procedimiento para producir un anticuerpo que se une a BLyS, que comprende cultivar la celula hospedadora de la presente invencion en condiciones en las que dicha molecula de acido nucleico de la presente invencion se exprese. En una realizacion, el anticuerpo se produce por la celula hospedadora de la presente invencion. La presente invencion proporciona ademas un procedimiento de expresion de un anticuerpo (incluyendo una molecula que comprende, o alternativamente que consiste en un fragmento de anticuerpo o variante del mismo) de la presente invencion a partir de una molecula de acido nucleico. Estos y otros aspectos de la presente invencion se describen en mas detalle a continuacion.
En realizaciones espedficas, la presente invencion abarca composiciones (por ejemplo, anticuerpos antagonistas anti-BLyS) para su uso en la prevencion, tratamiento o mejona de enfermedades o trastornos asociados a hipergammaglobulinemia (por ejemplo, SIDA, enfermedades autoinmunes y algunos smdromes de inmunodeficiencia), comprendiendo dichas composiciones los anticuerpos o los fragmentos funcionales de los mismos de la presente invencion. En otras realizaciones espedficas, la presente invencion abarca composiciones (por ejemplo, anticuerpos agonistas anti-BLyS) para su uso en la prevencion, tratamiento o mejona de enfermedades o trastornos asociados a hipogammaglobulinemia (por ejemplo, un smdrome de inmunodeficiencia), comprendiendo dichas composiciones los anticuerpos o los fragmentos funcionales de los mismos de la presente
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invencion.
DEFINICIONES
El termino "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a moleculas de inmunoglobulina y porciones inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulina, es decir, moleculas que contienen un sitio de union a antigeno que se une inmunoespedficamente a un antigeno. Como tal, el termino anticuerpo incluye, no solo moleculas de anticuerpo completas, sino tambien fragmentos de anticuerpo, asf como variantes (incluyendo derivados) de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. Los ejemplos de moleculas que se describen mediante el termino "anticuerpo" en el presente documento incluyen, pero no se limitan a: Fv de cadena sencilla (scFv), fragmentos Fab, fragmentos Fab', F(ab')2, Fv unidos por enlaces disulfuro (sdFv), Fv y fragmentos que comprenden, o alternativamente consisten en un dominio VL o VH. La expresion "Fv de cadena sencilla" o "scFv", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipeptido que comprende un dominio VL de anticuerpo unido a un dominio VH de un anticuerpo. Los anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a BLyS pueden tener reactividad cruzada con otros antigenos. Preferentemente, los anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a BLyS no presentan reactividad cruzada con otros antigenos. Los anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a BLyS pueden identificarse, por ejemplo, mediante inmunoensayos u otras tecnicas conocidas por los expertos en la materia, por ejemplo, los inmunoensayos descritos en los Ejemplos a continuacion.
Los anticuerpos de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales, multiespedficos, humanos o quimericos, de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), anticuerpos antiidiotfpicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id contra anticuerpos de la presente invencion) y fragmentos de union a epftopo de cualquiera de los anteriores. Las moleculas de inmunoglobulina de la presente invencion pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgA4 e IgA2) o subclase de molecula de inmunoglobulina.
Un anticuerpo de la presente invencion "que se une a la forma soluble de BLyS" es uno que se une a la forma soluble de 152 aminoacidos de la protema BLyS (aminoacidos 134-285 de la SEQ ID NO: 3228). En realizaciones espedficas de la presente invencion, un anticuerpo de la presente invencion "que se une a la forma soluble de BLyS" no se une tambien a la forma unida a membrana o asociada a membrana de BLyS. Los ensayos que miden la union a la forma soluble de BLyS incluyen, pero no se limitan a, el ensayo de inhibicion de la union a receptor o la captura de BLyS soluble a partir de una solucion, como se describen en los Ejemplos 8 y 9.
Un anticuerpo de la presente invencion "que se une a la forma unida a membrana de BLyS" es uno que se une a la protema BLyS asociada a membrana (no escindida). En realizaciones espedficas de la presente invencion, un anticuerpo de la presente invencion "que se une a la forma unida a membrana de BLyS" no se une tambien a la
forma soluble de BLyS. La union a BLyS marcado con HIS (como se describe en el presente documento) en un
ELISA es un indicador de que un anticuerpo se une a la forma unida a membrana de BLyS, pero no debena confiarse en la misma como prueba de la especificidad por la forma unida a membrana de BLyS. Los ensayos en los que puede confiarse como prueba de la especificidad de un anticuerpo por BLyS unido a membrana incluyen, pero no se limitan a, la union a membranas plasmaticas que expresan BLyS que se describe en el Ejemplo 2. Un
anticuerpo de la presente invencion "que se une tanto a la forma soluble como a la forma unida a membrana de
BLyS" es uno que se une tanto a la forma unida a membrana como a la forma soluble de BLyS.
El termino "variante" como se usa en el presente documento, se refiere a un polipeptido que posee una funcion identica o similar a la de un polipeptido de BLyS, un fragmento de BLyS, un anticuerpo anti- BLyS o fragmento de anticuerpo del mismo, pero que no comprende necesariamente una secuencia de aminoacidos identica o similar a un polipeptido de BLyS, un fragmento de BLyS, un anticuerpo anti-BLyS o fragmento de anticuerpo del mismo, o posee una estructura identica o similar a la de un polipeptido de BLyS, un fragmento de BLyS, un anticuerpo anti- BLyS o fragmento de anticuerpo del mismo. Una variante que tiene un aminoacido similar se refiere a un polipeptido que cumple al menos uno de los siguientes: (a) un polipeptido que comprende, o alternativamente consiste en una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al
menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 %
con la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de BLyS, un fragmento de BLyS, un anticuerpo anti-BLyS o fragmento de anticuerpo del mismo (incluyendo un dominio VH, VHCDR, dominio VL o VLCDR que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las mencionadas en la Tabla 1) descrito en el presente documento; (b) un polipeptido codificado por una secuencia de nucleotidos, cuya secuencia complementaria hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido de BLyS (por ejemplo, la SEQ ID NO: 3228), un fragmento de BLyS, un anticuerpo anti-BLyS o fragmento de anticuerpo del mismo (incluyendo un dominio VH, VHCDR, dominio VL o VLCDR que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las mencionadas en la Tabla 1), descrito en el presente documento, de al menos 5 restos aminoaddicos, al menos 10 restos aminoaddicos, al menos 15 restos aminoaddicos, al menos 20 restos aminoaddicos, al menos 25 restos aminoaddicos, al menos 30 restos aminoaddicos, al menos 40 restos aminoaddicos, al menos 50 restos
aminoaddicos, al menos 60 restos aminoaddicos, al menos 70 restos aminoaddicos, al menos 80 restos
aminoaddicos, al menos 90 restos aminoaddicos, al menos 100 restos aminoaddicos, al menos 125 restos aminoaddicos o al menos 150 restos aminoaddicos; y (c) un polipeptido codificado por una secuencia de
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nucleotidos que tiene una identidad de al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % con la secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido de BLyS, un fragmento de BLyS, un anticuerpo anti-BLyS o un fragmento de anticuerpo del mismo (incluyendo un dominio VH, VHCDR, dominio VL o VLCDR que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las mencionadas en la Tabla 1), descrito en el presente documento. Un polipeptido con una estructura similar a un polipeptido de BLyS, un fragmento de BLyS, un anticuerpo anti-BLyS o fragmento de anticuerpo del mismo, descrito en el presente documento se refiere a un polipeptido que tiene una estructura secundaria, terciaria o cuaternaria similar a la de un polipeptido de BLyS, un fragmento de BLyS, un anticuerpo anti-BLyS o fragmento de anticuerpo del mismo, descrito en el presente documento. La estructura de un polipeptido puede determinarse por procedimientos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo, pero sin limitacion, cristalograffa de rayos X, resonancia magnetica nuclear y microscopfa electronica cristalografica.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoacidos o de dos secuencias de acido nucleico, las secuencias se alinean con el fin de una comparacion optima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoacidos o de acido nucleico para un alineamiento optimo con una segunda secuencia de aminoacidos o de acido nucleico). Los restos aminoaddicos o nucleotidos en posiciones aminoaddicas o posiciones de nucleotidos correspondientes se comparan entonces. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo resto aminoaddico o nucleotido en la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = numero de posiciones superpuestas identicas/numero total de posiciones x 100 %). En una realizacion, las dos secuencias son de la misma longitud.
La determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matematico conocido por los expertos en la materia. Un ejemplo de un algoritmo matematico para comparar dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 87: 2264-2268 (1990), modificado como en Karlin y Altschul Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 90: 5873-5877 (1993). Los programas BLASTn y BLASTx de Altschul, y col. J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) han incorporado dicho algoritmo. Pueden realizarse busquedas en BLAST Nucleotide con el programa BLASTn, puntuacion = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleotidos homologas a moleculas de acido nucleico de la presente invencion. Pueden realizarse busquedas en BLAST Protein con el programa RT ASTx, puntuacion = 50, longitud de palabra = para obtener secuencias de aminoacidos homologas a moleculas proteicas de la presente invencion. Para obtener alineamientos con huecos con fines comparativos, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul y col. Nucleic Acids Res. 25: 33893402 (1997). Alternativamente, puede usarse PSI-BLAST para realizar una busqueda iterativa que detecte relaciones distantes entre moleculas (idem). Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-BLAST pueden usarse los parametros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTx y BLASTn). (Vease
http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).
Otro ejemplo de un algoritmo matematico utilizado para la comparacion de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). El programa ALIGN (version 2.0) que es parte del paquete de software de alineamiento de secuencias GCG ha incorporado dicho algoritmo. Otros algoritmos para analisis de secuencia conocidos en la tecnica incluyen ADVANCE y ADAM, como se describen en Torellis y Robotti Comput. Appl. Biosci., 10: 3-5(1994); y FASTA, descrito en Pearsons y Lipman Proc. Natl. Acad. Sei. 85: 2444-8(1988). Dentro de FASTA, la ktup es una opcion de control que ajusta la sensibilidad y velocidad de la busqueda.
El termino "derivado", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipeptido variante de la presente invencion que comprende, o alternativamente consiste en una secuencia de aminoacidos de un polipeptido de BLyS, un fragmento de BLyS o un anticuerpo de la presente invencion que se une inmunoespedficamente a BLyS, que se ha alterado mediante la introduccion de sustituciones, deleciones o adiciones de restos aminoaddicos. El termino "derivado", como se usa en el presente documento, tambien se refiere a un polipeptido de BLyS, un fragmento de BLyS, un anticuerpo que se une inmunoespedficamente a BLyS, que se ha modificado, por ejemplo, mediante la union covalente de cualquier tipo de molecula al polipeptido. Por ejemplo, pero no a modo de limitacion, un polipeptido de BLyS, un fragmento de BLyS o un anticuerpo anti-BLyS puede modificarse, por ejemplo, por glucosilacion, acetilacion, pegilacion, fosforilacion, amidacion, derivatizacion mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos, escision proteolftica, union a un ligando celular u otra protema, etc. Un derivado de un polipeptido de BLyS, un fragmento de BLyS o un anticuerpo anti-BLyS puede modificarse mediante modificaciones qmmicas usando tecnicas conocidas por los expertos en la materia, incluyendo, pero sin limitacion, escision qmmica espedfica, acetilacion, formilacion, smtesis metabolica de tunicamicina, etc. Ademas, un derivado de un polipeptido de BLyS, un fragmento de BLyS o un anticuerpo anti-BLyS puede contener uno o mas aminoacidos no clasicos. Un derivado polipeptfdico posee una funcion identica o similar a la de un polipeptido de BLyS, un fragmento de BLyS, o un anticuerpo anti-BLyS descrito en el presente documento.
El termino "epttopos" como se usa en el presente documento se refiere a porciones de BLyS que tienen actividad antigenica o inmunogenica en un animal, preferentemente un mairnfero. Un epftopo que tiene actividad inmunogenica es una porcion de BLyS que genera una respuesta de anticuerpos en un animal. Un epftopo que tiene actividad antigenica es una porcion de BLyS a la que se une inmunoespedficamente un anticuerpo segun se
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determina por cualquier procedimiento conocido en la tecnica, por ejemplo, mediante los inmunoensayos descritos en el presente documento. Los epttopos antigenicos no tienen que ser necesariamente inmunogenicos.
El termino "fragmento", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de al menos 5 restos aminoaddicos, al menos 10 restos aminoaddicos, al menos 15 restos aminoaddicos, al menos 20 restos aminoaddicos, al menos 25 restos aminoaddicos, al menos 30 restos aminoaddicos, al menos 35 restos aminoaddicos, al menos 40 restos aminoaddicos, al menos 45 restos
aminoaddicos al menos 50 restos aminoaddicos, al menos 60 restos aminoaddicos, al menos 70 restos
aminoaddicos, al menos 80 restos aminoaddicos, al menos 90 restos aminoaddicos, al menos 100 restos
aminoaddicos, al menos 125 restos aminoaddicos, al menos 150 restos aminoaddicos al menos 175 restos
aminoaddicos, al menos 200 restos aminoaddicos o al menos 250 restos aminoaddicos de la secuencia de aminoacidos de BLyS, o un anticuerpo anti-BLyS (incluyendo moleculas tales como scFv, que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos), que se une inmunoespedficamente a BLyS, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a BLyS y comprende los restos aminoaddicos 1-123 y 141-249 de la SEQ ID NO: 327.
La expresion "protema de fusion", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipeptido que comprende, o alternativamente consiste en, una secuencia de aminoacidos de un anticuerpo anti-BLyS de la presente invencion y una secuencia de aminoacidos de un polipeptido heterologo (es decir, un polipeptido no relacionado con un anticuerpo o dominio de anticuerpo).
La expresion "celula hospedadora", como se usa en el presente documento, se refiere a la celula objeto particular transfectada con una molecula de acido nucleico y a la progenie o progenie potencial de dicha celula. La progenie puede no ser identica a la celula parental transfectada con la molecula de acido nucleico debido a mutaciones o influencias ambientales que puedan producirse en generaciones sucesivas o a la integracion de la molecula de acido nucleico en el genoma de la celula hospedadora.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1. Resultados de ELISA para tres scFv, I006E07, I008D05 y I016F04, que se unen
inmunoespedficamente a membranas de U937 pero que no se unen a ni presentan reactividad cruzada con TNF-alfa o BSA.
Figura 2. Los resultados para tres scFv, I016H07, I001C09 y I018D07, en un ensayo de inhibicion de receptor. Figura 3. Resultados de ELISA para dos scFv (I022D01 y I031F02) que demuestran su capacidad para unirse a BLyS humano y presentar reactividad cruzada con BLyS de raton, pero no unirse a o presentar reactividad cruzada con otros antfgenos de la familia de ligandos del TNF.
Figura 4. Resultados de ELISA para tres scFv (I031F09, I050A12 y I051C04) que se unen a membranas plasmaticas de U937 cuando se usa BLyS o TNF-alfa como competidor.
Figura 5. Analisis cinetico del anticuerpo scFv I003C02. Se muestran una serie de diluciones de I003C02 de 3 nM a 825 nM. Las curvas de asociacion y disociacion se generaron usando un software BIAcore 2000 y BIAevaluation 3.0.
Figura 6. Se muestran las curvas de titulacion tfpicas para dos anticuerpos scFv (I007F11 y I050A07) en la Figura 6. El BLyS no marcado competfa por la union a su receptor con un valor de CI50 de 0,8 nM. Los valores de CI 50 para I007F11 y I050A07 son de 7,9 nM y 17,1 nM, respectivamente. El ensayo se realizo por triplicado y se muestran las barras de los errores tfpicos.
Figura 7. Resultados de ELISA para tres clones de scFv (I074B12, I075F12 y I075A02) que se unen inmunoespedficamente a BLyS inmovilizado pero no a membranas plasmaticas de U937, TNF-alfa o BSA. Como control, tambien se muestra en la Figura 7 un anticuerpo de fago que reconoce el TNF-alfa.
Figura 8. Los resultados para dos scFv (I025B09 y I026C04) en un ensayo de inhibicion de receptor.
Figura 9. Resultados de ELISA para dos clones de scFv (I067F05 y I078D02) que demuestran su capacidad para unirse a BLyS humano inmovilizado y presentar reactivada cruzada con BLyS de raton inmovilizado, pero no para unirse a ni presentar reactividad cruzada con otros antfgenos de la familia de ligandos del TNF.
Como control, tambien se muestra en la Figura 7 un anticuerpo de fago que reconoce el TNF-alfa.
Figura 10. Analisis cinetico del anticuerpo scFv I002A01. Se muestran una serie de diluciones de I002A01 de 3 nM a 1650 nM. Las curvas de asociacion y disociacion se generaron usando un software BIAcore 2000 y BIAevaluation 3.0.
Figura 11. Se muestran las curvas de titulacion tfpicas para dos scFv, I0068C06 y I074B12, en la Figura 11. El BLyS no marcado competfa por la union a su receptor con un valor de constante de inhibicion 50 (CI50) de 0,66 nM. Los valores de CI50 para I0068C06 y I074B12 son de 61 nM y 13 nM, respectivamente. El ensayo se realizo por triplicado y se muestran las barras de los errores tfpicos.
Figura 12. Resultados de ELISA para tres clones (I079C01, I081C10 y 1082A02) que demuestran su capacidad para unirse a BLyS marcado con histidina, membranas plasmaticas de U937, pero no unirse a BLyS biotinilado inmovilizado.
Figura 13. Resultados de ELISA para tres scFv (I079B04, I079F08 y I080B01) que se unen a membranas plasmaticas de U937 cuando se usa BLyS marcado con histidina o BLyS biotinilado como competidor.
Figura 14. Se muestra un ejemplo de la seccion de disociacion de un sensograma tfpico para 8 scFv en la Figura 14. Se incluyo como control un anticuerpo anti-TNFOC que no reconoce el BLyS. De los 8 scFv ejemplificados, el
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I079F06 se identifico para un estudio adicional debido a las cantidades relativamente elevadas de UR unidas a la superficie.
Figura 15. Se muestra un ejemplo tipico de las curvas de union generadas para el anticuerpo scFv I082C03 en la Figura 15. La velocidad de disociacion para este clon se calculo como de 2 x 10-3 s-1. La afinidad de I082C03 se calculo como de 20 nM, asumiendo una actividad de 100 % del scFv.
Figura 16. Resultados de ELISA para tres scFv (I079B04, I079F08 y I080B01) que se unen a membranas plasmaticas de P388 cuando se usa BLyS marcado con histidina o BLyS biotinilado como competidor.
Descripcion detallada de la invencion
En el presente documento se describen anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespedficamente a BLyS o un fragmento o variante de BLyS. En particular, se describen en el presente documento anticuerpos tales como, por ejemplo, Fv de cadena sencilla (scFv) que tienen una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 - 2128, a las que se hace referencia en la Tabla 1. En particular, en el presente documento se describen anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a un polipeptido, un fragmento polipeptfdico o variante, o un epftopo de BLyS humano (SEQ ID NO: 3228 y/o 3229) o BLyS expresado en monocitos humanos; BLyS murino (SEQ ID NO: 3230 y/o 3231) o BLyS expresado en monocitos murinos; BLyS de rata (las formas solubles como se proporcionan en las SEQ ID NO: 3232, 3233, 3234 y/o 3235 o en una forma asociada a membrana, por ejemplo, en la superficie de monocitos de rata); o BLyS de mono (por ejemplo, los polipeptidos de BLyS de mono de la SEQ ID NO: 3236 y/o 3237, la forma soluble de BLyS de mono o BLyS expresado en monocitos de mono) (segun se determina por inmunoensayos conocidos en la tecnica para ensayar la union espedfica de antfgeno-anticuerpo).
La secuencia polipeptfdica mostrada en la SEQ ID NO: 3228 se obtuvo por secuenciacion y traduccion del ADNc del clon HNEDU15 que se deposito el 22 de octubre de 1996 en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20100- 2209, y al que se le asigno el N.° de acceso de la ATCC 97768. El clon depositado esta contenido en el plasmido pBluescript SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA). Los depositos de la ATCC se realizaron conforme a los terminos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del deposito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes.
La secuencia polipeptfdica mostrada en la SEQ ID NO: 3229 se obtuvo por secuenciacion y traduccion del ADNc del clon HDPMC52, que se deposito el 10 de diciembre de 1998 en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo, y al que se le asigno el N.° de acceso de la ATCC 203518. El clon depositado esta contenido en el plasmido pBluescript SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA). Los depositos de la ATCC se realizaron conforme a los terminos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del deposito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes.
Los polipeptidos de BLyS unidos por los anticuerpos descritos en el presente documento pueden estar en monomeros o multfmeros (es decir, dfmeros, tnmeros, tetrameros y multfmeros superiores). Por consiguiente, en el presente documento se describen anticuerpos que se unen a monomeros y multfmeros de los polipeptidos de BLyS de la presente invencion, su preparacion y composiciones (preferentemente composiciones farmaceuticas) que los contienen. Espedficamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a monomeros, dfmeros, tnmeros o tetrameros de BLyS. Adicionalmente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a al menos dfmeros, al menos tnmeros o al menos tetrameros de BLyS.
El BLyS multimerico unido por los anticuerpos descritos en el presente documento puede ser un homomero o heteromero. Un homomero de BLyS se refiere a un multimero que contiene solo polipeptidos de BLyS (incluyendo fragmentos, variantes y protemas de fusion de BLyS, como se describen en el presente documento). Estos homomeros pueden contener polipeptidos de BLyS que tienen secuencias de aminoacidos identicas o diferentes. Espedficamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a un homodfmero de BLyS (por ejemplo, que contiene dos polipeptidos de BLyS que tienen secuencias de aminoacidos identicas o diferentes) o un homotnmero de BLyS (por ejemplo, que contiene tres polipeptidos de BLyS que tienen secuencias de aminoacidos identicas o diferentes). Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a un homotnmeros de BLyS. Ademas, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a un multimero de BLyS homomerico que es al menos un homodfmero, al menos un homotnmero o al menos un homotetramero.
El BLyS heteromerico se refiere a un multfmero que contiene polipeptidos heterologos (es decir, polipeptidos de una protema diferente) ademas de los polipeptidos de BLyS descritos en el presente documento. Espedficamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a un heterodfmero, un heterotnmero o un heterotetramero de BLyS. Ademas, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a un multimero de BLyS heteromerico que es al menos un heterodfmero, al menos un heterotnmero o al menos un heterotetramero. De forma altamente preferible, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a un heterotnmero que comprende tanto polipeptidos de BLyS como polipeptidos de APRIL (SEQ ID NO: 3239; N.° de Acceso GenBank AF046888; Publicacion Internacional PCT Numero WO97/33902; J. Exp. Med. 188(6):1185- 1190) o fragmentos o variantes de los mismos. Tambien de forma altamente preferible, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a un heterotnmero que comprende un polipeptido de BLyS (incluyendo
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fragmentos o variantes) y dos polipeptidos de APRIL (incluyendo fragmentos o variantes). Tambien de forma altamente preferible, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a un heterotnmero que comprende dos polipeptidos de BLyS (incluyendo fragmentos o variantes) y un polipeptido de APRIL (incluyendo fragmentos o variantes). En un aspecto adicional no excluyente, los heteromeros unidos por los anticuerpos que se describen en el presente documento contienen una secuencia o secuencias polipeptfdicas de ligando de CD40 o un fragmento o fragmentos biologicamente activos o una variante o variantes de las mismas.
Particularmente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos de BLyS homomericos, especialmente homotrimericos, en los que los componentes proteicos individuales de los multfmeros consisten en la forma madura de BLyS (por ejemplo, los restos aminoaddicos 134-285 de la SEQ ID NO: 3228 o los restos aminoaddicos 134-266 de la SEQ ID NO: 3229) o fragmentos o variantes de la misma. Espedficamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos de BLyS heteromericos, especialmente heterotrimericos, tales como un heterotnmero que contiene dos polipeptidos de BLyS y un polipeptido de APRIL o un heterotnmero que contiene un polipeptido de BLyS y dos polipeptidos de APRIL, y en los que los componentes proteicos individuales del heteromero de BLyS consisten en la porcion soluble extracelular madura de BLyS (por ejemplo, los restos aminoaddicos 134-285 de la SEQ ID NO: 3228 o los restos aminoaddicos 134-266 de la SEQ ID NO: 3229) o fragmentos o variantes de la misma, o la porcion soluble extracelular madura de APRIL (por ejemplo, los restos aminoaddicos 105-250 de la SEQ ID NO: 3239) o fragmentos o variantes de la misma.
Espedficamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a epftopos conformacionales de una protema monomerica de BLyS. Espedficamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a epftopos conformacionales de una protema multimerica de BLyS, especialmente trimerica. En otros aspectos, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a epftopos conformacionales que surgen de la yuxtaposicion de BLyS con un polipeptido heterologo, como el que podna estar presente cuando BLyS forma heterotnmeros (por ejemplo, con polipeptidos de APRIL (por ejemplo, la SEQ ID NO: 3239) o en protemas de fusion entre BLyS y un polipeptido heterologo.
Los multimetros de BLyS unidos por los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser el resultado de asociaciones hidrofobas, hidrofilas, ionicas y/o covalentes y/o pueden unirse indirectamente, por ejemplo, mediante la formacion de liposomas. Por lo tanto, en un aspecto, se forman multimeros de BLyS, tales como, por ejemplo, homodfmeros u homotnmeros, cuando los polipeptidos que se describen en el presente documento contactan entre sf en solucion. En otro aspecto, se forman heteromultimeros de BLyS, tales como, por ejemplo, heterotnmeros de BLyS o heterotetrameros de BLyS, cuando los polipeptidos que se describen en el presente documento contactan con anticuerpos contra los polipeptidos (incluyendo anticuerpos contra la secuencia polipeptidica heterologa en una protema de fusion que se describe en el presente documento) en solucion. Se forman multimeros de BLyS por asociaciones covalentes con y/o entre los polipeptidos de BLyS que se describen en el presente documento. Dichas asociaciones covalentes pueden implicar uno o mas restos aminoaddicos contenidos en la secuencia polipeptidica (por ejemplo, la enumerada en la SEQ ID NO: 3228 o SEQ ID NO: 3229). En un caso, las asociaciones covalentes son entrecruzamientos entre restos de cistema localizados dentro de las secuencias polipeptidicas que interaccionan en el polipeptido nativo (es decir, de origen natural). En otro caso, las asociaciones covalentes son la consecuencia de una manipulacion qrnmica o recombinante. Alternativamente, dichas asociaciones covalentes pueden implicar uno o mas restos aminoaddicos contenidos en la secuencia polipeptidica heterologa en una protema de fusion de BLyS. En un ejemplo, las asociaciones covalentes son entre la secuencia heterologa contenida en una protema de fusion (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. Numero 5.478.925). En un ejemplo espedfico, las asociaciones covalentes son entre la secuencia heterologa contenida en una protema de fusion de BLyS-Fc. En otro ejemplo espedfico, las asociaciones covalentes de protemas de fusion de la presente invencion son entre una secuencia polipeptidica heterologa de otro miembro ligando/receptor de la familia del TNF que es capaz de formar multimeros asociados covalentemente, tales como, por ejemplo, la osteoprotegerina (vease, por ejemplo, la Publicacion Internacional N.° WO 98/49305). En otro ejemplo espedfico, las asociaciones covalentes de protemas de fusion como se describen en el presente documento son entre una secuencia polipeptidica heterologa de CD40L o un fragmento soluble del mismo. En otro aspecto, dos o mas polipeptidos de BLyS se unen a traves de enlazadores sinteticos (por ejemplo, enlazadores peptidicos, de carbohidrato o poftmeros solubles). Los ejemplos incluyen los enlazadores peptidicos descritos en la Patente de EE.UU. N.° 5.073.627. Pueden producirse protemas que comprenden multiples polipeptidos de BLyS separados por enlazadores peptidicos usando la tecnologfa de ADN recombinante convencional.
En un aspecto, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen inmunoespedficamente a un polipeptido de BLyS que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3228 o que esta codificado por el clon de ADNc contenido en la ATCC N.° 97768, o un polipeptido que comprende una porcion (es decir, un fragmento) de los polipeptidos anteriores. Tambien se describe en el presente documento un anticuerpo que se une a un polipeptido de BLyS aislado que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3229 o la secuencia de aminoacidos codificada por el clon de ADNc contenido en la ATCC N.° 203518, o un anticuerpo que se une a un polipeptido que comprende una porcion (es decir, fragmento) de los polipeptidos anteriores.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento tambien se unen inmunoespedficamente a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3228 codificada por el ADNc contenido en el plasmido que tiene el numero de acceso de la ATCC 97768, o codificada por acidos
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nucleicos que hibridan (por ejemplo, en condiciones de hibridacion rigurosas) con la secuencia de nucleotidos
contenida en el clon depositado. Los anticuerpos de la presente invencion tambien se unen a fragmented de la
secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3228, codificada por el ADNc contenido en el plasmido que tiene el numero de acceso de la ATCC 97768, o codificada por los acidos nucleicos que hibridan (por ejemplo, en condiciones de hibridacion rigurosas) con la secuencia de nucleotidos contenida en el clon depositado.
Adicionalmente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3229, codificada por el ADNc contenido en el plasmido que tiene el numero de acceso de la ATCC 203518, o codificada por acidos
nucleicos que hibridan (por ejemplo, en condiciones de hibridacion rigurosas) con la secuencia de nucleotidos
contenida en el clon depositado. Los anticuerpos que se describen en el presente documento tambien se unen a fragmentos de la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3229, codificada por el ADNc contenido en el plasmido que tiene el numero de acceso de la ATCC 203518, o codificada por acidos nucleicos que hibridan (por ejemplo, en condiciones de hibridacion rigurosas) con la secuencia de nucleotidos contenida en el clon depositado.
Ademas, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos o fragmentos polipeptfdicos que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos contenida en las SEQ ID NO: 3230 a 3237.
Espedficamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen inmunoespedficamente a fragmentos polipeptfdicos, incluyendo polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos contenida en la SEQ ID NO: 3228, codificada por el ADNc contenido en el clon depositado, o codificada por acidos nucleicos que hibridan (por ejemplo, en condiciones de hibridacion rigurosas) con la secuencia de nucleotidos contenida en el clon depositado. Los fragmentos proteicos pueden ser "independientes" o estar comprendidos dentro de un polipeptido de mayor tamano, del que el fragmento constituye una parte o region, mas preferentemente como una sola region continua. Los ejemplos representativos de fragmentos polipeptfdicos que pueden unirse por los anticuerpos de la presente invencion incluyen, por ejemplo, fragmentos que comprenden, o alternativamente consisten en aproximadamente los restos aminoaddicos: 1 a 50, 51 a 100, 101 a 150, 151 a 200, 201 a 250 y/o 251 a 285 de la SEQ ID NO: 3228. Ademas, los fragmentos polipeptfdicos pueden tener una longitud de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 175 o 200 aminoacidos.
Espedficamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a fragmentos polipeptfdicos que comprenden, o alternativamente consisten en los restos aminoaddicos: 1-46, 31-44, 47-72, 73-285, 73-83, 94102, 148-152, 166-181, 185-209, 210-221,226-237, 244-249, 253-265 y/o 277-285 de la SEQ ID NO: 3228.
Un experto en la materia reconocera que las mutaciones dirigidas a regiones de un polipeptido de BLyS de SEQ ID NO: 3228 que incluyen la insercion de diecinueve restos aminoaddicos que no se encuentra en la secuencia polipeptfdica de BLyS de SEQ ID NO: 3229 (es decir, los restos aminoaddicos Val-142 a Lys-160 de la secuencia de SEQ ID NO: 3229) pueden afectar a las actividades biologicas observadas del polipeptido de BLyS. Mas espedficamente, una lista parcial, no limitante y no excluyente de dichos restos de la secuencia polipeptfdica de BLyS a los que pueden dirigirse mutaciones incluye los restos aminoaddicos siguientes de la secuencia polipeptfdica de BLyS, como se muestra en la SEQ ID NO: 3228: V-142; T-143; Q-144; D-145; C-14 6;L-147; Q-148; L-149; 1-150; A-151; D-152; S-153; E-154; T- 155; P-156; T-157; 1-158; Q-159; y K-160. Espedficamente, se contemplan los anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen a polipeptidos de BLyS que tienen una o mas mutaciones en la region de V-142 a K-160 de la SEQ ID NO: 3228.
Los fragmentos polipeptfdicos pueden ser "independientes" o estar comprendidos dentro de un polipeptido mas grande, del que el fragmento constituye una parte o region, mas preferentemente como una sola region continua. Los ejemplos representativos de fragmentos polipeptfdicos que pueden unirse por anticuerpos de la presente invencion incluyen, por ejemplo, fragmentos que comprenden, o alternativamente consisten en aproximadamente los restos aminoaddicos: 1 a 15, 16-30, 31-46, 47-55, 56-72, 73-104, 105-163, 163-188, 186-210 y 210-284 de la secuencia de aminoacidos descrita en la SEQ ID NO: 3228. Los ejemplos representativos adicionales de fragmentos polipeptfdicos que pueden unirse por anticuerpos de la presente invencion incluyen, por ejemplo, fragmentos que comprenden, o alternativamente consisten en aproximadamente los restos aminoaddicos: 1 a 143, 1-150, 47-143, 47-150, 73-143, 73-150, 100-150, 140-145, 142-148, 140-150, 140-200, 140-225 y 140-266 de la secuencia de aminoacidos descrita en la SEQ ID NO: 3229. Ademas, los fragmentos polipeptfdicos que pueden unirse por anticuerpos de la presente invencion pueden tener una longitud de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 175 o 200 aminoacidos. En este contexto, "aproximadamente" se refiere a los intervalos particularmente enumerados y a intervalos mayores o menores por varios, unos pocos, 5, 4, 3, 2 o 1 restos aminoaddicos en cualquiera o ambos extremos amino- y carboxi-terminales.
Tambien se describen en el presente documento anticuerpos que se unen a fragmentos polipeptfdicos que comprenden, o alternativamente consisten en el dominio intracelular predicho de BLyS (por ejemplo, los restos aminoaddicos 1-46 de la SEQ ID NO: 3228), el dominio transmembrana predicho de BLyS (por ejemplo, los restos aminoaddicos 47-72 de la SEQ ID NO: 3228), el dominio extracelular predicho de BLyS (por ejemplo, los restos aminoaddicos 73-285 de la SEQ ID NO: 3228), el dominio extracelular soluble maduro de BLyS (por ejemplo, los restos aminoaddicos 134-285 de la SEQ ID NO: 3228), el dominio conservado de TNF predicho de BLyS (por
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ejemplo, los aminoacidos 191 a 284 de la SEQ ID NO: 3228) y un polipeptido que comprende, o como alternativa consiste en el dominio intracelular predicho fusionado al dominio extracelular predicho de BLyS (los restos aminoaddicos 1-46 fusionados a los restos aminoaddicos 73-285 de la SEQ ID NO: 3228).
Adicionalmente se describen en el presente documento fragmentos polipeptfdicos que comprenden, o alternativamente consisten en el dominio intracelular predicho de BLyS (restos aminoaddicos 1-46 de la SEQ ID NO: 3229), el dominio transmembrana predicho de BLyS (restos aminoaddicos 47-72 de la SEQ ID NO: 3229), el dominio extracelular predicho de BLyS (restos aminoaddicos 73-266 de la SEQ ID NO: 3229), el dominio conservado de TNF predicho de BLyS (aminoacidos 172 a 265 de la SEQ ID NO: 3229) y un polipeptido que comprende, o alternativamente consiste en el dominio intracelular predicho fusionado al dominio extracelular predicho de BLyS (los restos aminoaddicos 1-46 fusionados a los restos aminoaddicos 73-266 de la SEQ ID NO: 3229).
Ciertos aspectos adicionales de la presente memoria descriptiva describen anticuerpos que se unen a fragmentos polipeptfdicos que comprenden, o alternativamente consisten en, las regiones de lamina beta plegada predichas de los polipeptidos de BLyS de las SEQ ID NO: 3228 y SEQ ID NO: 3229. Estos fragmentos polipeptfdicos que comprenden las laminas beta plegadas de BLyS comprenden, o alternativamente consisten en, los restos aminoaddicos Gln-144 a Ala-151, Phe-172 a Lys-173, Ala-177 a Glu-179, Asn-183 a Ile-185, Gly-191 a Lys-204, His-210 a Val-219, Leu-226 a Pro-237, Asn-242 a Ala-251, Gly-256 a Ile-263 y/o Val-276 a Leu-284 de la SEQ ID NO: 3228. En otro aspecto no excluyente, estos fragmentos polipeptfdicos que comprenden las laminas beta plegadas de BLyS comprenden, o alternativamente consisten en los restos aminoaddicos Phe-153 a Lys-154, Ala- 158 a Glu-160, Asn-164 a Ile-166, Gly-172 a Lys-185, His-191 a Val-200, Leu-207 a Pro-218, Asn-223 a Ala-232, Gly-237 a Ile-244 y/o Val-257 a Leu-265 de la SEQ ID NO: 3229.
Una lista parcial no limitante y ejemplar de polipeptidos que pueden unirse por los anticuerpos descritos en el presente documento incluye polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en combinaciones de secuencias de aminoacidos de la presente invencion, incluye, por ejemplo, [Met-1 a Lys-133] fusionado a [Leu-114 a Thr-141] fusionado a [Val-142 a Lys-160] fusionado a [Gly-161 a Gln-198] fusionado a [Val-199 a Ala-248] fusionado a [Gly-249 a Leu-285] de la SEQ ID NO: 3228; o [Met-1 a Lys-113] fusionado a [Val-142 a Lys-160] fusionado a [Gly- 161 a Gln-198] fusionado a [Val-199 a Ala-248] fusionado a [Gly-249 a Leu-285] de la SEQ ID NO: 3228; o [Met-1 a Lys- 113] fusionado a [Leu-114 a Thr-141] fusionado a [Val-142 a Lys-160] fusionado a [Gly-161 a Gln-198] fusionado a [Gly-249 a Leu-285] de la SEQ ID NO: 3228. Otras combinaciones de secuencias de aminoacidos que pueden unirse por los anticuerpos de la presente invencion pueden incluir los fragmentos polipeptfdicos en un orden distinto del enumerado anteriormente (por ejemplo, [Leu-114 a Thr-141] fusionado a [Val-199 a Ala-248] fusionado a [Gly-249 a Leu-285] fusionado a [Val-142 a Lys-160] de (SEQ ID NO: 3228). Otras combinaciones de secuencias de aminoacidos que pueden unirse por los anticuerpos de la presente invencion pueden incluir tambien fragmentos polipeptfdicos heterologos como se describen en el presente documento y/u otros polipeptidos o fragmentos polipeptfdicos descritos en el presente documento (por ejemplo, [Met-1 a Lys-113] fusionado a [Leu-114 a Thr-141] fusionado a [Val-142 a Lys-160] fusionado a [Gly-161 a Gln-198] fusionado a [Gly-249 a Leu-285] de la SEQ ID NO: 3228 fusionado a una etiqueta FLAG; o [Met-1 a Lys- 113] de la SEQ ID NO: 3228 fusionado a [Leu-114 a Thr-141] de la SEQ ID NO: 3228 fusionado a [Glu-135 a Asn-165] de la SEQ ID NO: 39 fusionado a [Val-142 a Lys-160] de la SEQ ID NO: 3228 fusionado a [Gly-161 a Gln-198] de la SEQ ID NO: 3228 fusionado a [Val-199 a Ala- 248] de la SEQ ID NO: 3228 fusionado a [Gly-249 a Leu-285] de la SEQ ID NO: 3228).
Una lista parcial, no limitante, y ejemplar de polipeptidos que pueden unirse por los anticuerpos descritos en el presente documento incluye polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en combinaciones de secuencias de aminoacidos, incluye, por ejemplo, [Met-1 a Lys-113] fusionado a [Leu-114 a Thr-141] fusionado a [Gly-142 a Gln-179] fusionado a [Val-180 a Ala-229] fusionado a [Gly-230 a Leu- 266] de la SEQ ID NO: 3229; [Met-1 a Lys-113] fusionado a [Gly-142 a Gln-179] fusionado a [Val-180 a Ala-229] fusionado a [Gly-230 a Leu- 266] de la SeQ ID NO: 3229; o [Met-1 a Lys-113] fusionado a [Leu-114 a Thr-141] fusionado a [Gly-142 a Gln-179] fusionado a [Gly-230 a Leu- 266] de la SEQ ID NO: 3229. Otras combinaciones de secuencias de aminoacidos que pueden unirse por los anticuerpos descritos en el presente documento pueden incluir los fragmentos polipeptfdicos en un orden distinto del enumerado anteriormente (por ejemplo, [Leu-114 a Thr-141] fusionado a [Val-180 a Ala-229] fusionado a [Gly-230 a Leu- 266] fusionado a [Gly-142 a Gln-179] de la SEQ ID NO: 3229). Otras combinaciones de secuencias de aminoacidos que pueden unirse por los anticuerpos descritos en el presente documento pueden incluir tambien fragmentos polipeptfdicos heterologos como se describen en el presente documento y/u otros polipeptidos o fragmentos polipeptfdicos de la presente invencion (por ejemplo, [Met-1 a Lys-113] fusionado a [Leu- 114 a Thr-141] fusionado a [Gly-142 a Gln-179] fusionado a [Gly-230 a Leu-266] de la SEQ ID NO: 3229 fusionado a una etiqueta FLAG (SEQ ID NO: 3238), o [Met-1 a Lys-113] de la SEQ ID NO: 3229 fusionado a [Leu- 114 a Thr- 141] de la SEQ ID NO: 3229 fusionado a [Glu-135 a Asn-165] de la SEQ ID NO: 39 fusionado a [Gly-142 a Gln-179] de la SEQ ID NO: 3229 fusionado a [Val-180 a Ala-229] de la SEQ ID NO: 3229 fusionado a [Gly-230 a Leu-266] de la SEQ ID NO: 3229.
Adicionalmente, se describen anticuerpos en el presente documento que se unen a fragmentos polipeptfdicos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en, regiones funcionales de polipeptidos de la presente invencion, tales como las regiones alfa, regiones beta, regiones de giros y regiones de enrollamientos de Gamier- Robson, las regiones alfa, regiones beta y regiones de enrollamientos de Chou-Fasman, las regiones hidrofilas y
5
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40
regiones hidrofobas de Kyte-Doolittle, las regiones anfipaticas alfa y beta de Eisenberg, las regiones flexibles de Karplus-Schulz, las regiones formadoras de superficie de Emini y las regiones de Jameson-Wolf de alto mdice antigenico expuestas en las Tablas 9 y 10 y que se describen en el presente documento. Preferentemente, los fragmented polipeptfdicos unidos por los anticuerpos descritos en el presente documento son antigenicos (es decir, contienen cuatro o mas aminoacidos contiguos que tienen un mdice antigenico superior a o igual a 1,5, segun se identifica usando los parametros por defecto del programa de Jameson-Wolf) de un polipeptido de BLyS complete (es decir, de longitud completa) (por ejemplo, SEQ ID NO: 3228 y 3229).
Los datos que representaban los atributos funcionales o estructurales del polipeptido de BLyS de la SEQ ID NO: 3228 (Tabla 9) o del polipeptido de BLyS de la SEQ ID NO: 3229 (Tabla 10), como se han descrito anteriormente, se generaron usando los diversos modulos y algoritmos del DNA*STAR ajustado con los parametros por defecto. La Columna I representa los resultados de un analisis de Gamier-Robson de regiones de helice alfa; la Columna II representa los resultados de un analisis de Chou-Fasman de regiones de helice alfa; la Columna III representa los resultados de un analisis de Garnier-Robson de regiones de lamina beta; la Columna IV representa los resultados de un analisis de Chou-Fasman de regiones de lamina beta; la Columna V representa los resultados de un analisis de Gamier-Robson de regiones de giros; la Columna VI representa los resultados de un analisis de Chou-Fasman de regiones de giros; la Columna VII representa los resultados de un analisis de Garnier-Robson de regiones de enrollamientos; la Columna VIII representa una representacion de la hidrofilidad de Kyte- Doolittle; la Columna IX representa una representacion de la hidrofobicidad de Hopp-Woods; la Columna X representa los resultados de un analisis de Eisenberg de regiones antipaticas alfa; la Columna XI representa los resultados de un analisis de Eisenberg de regiones antipaticas beta; la Columna XII representa los resultados de un analisis de Karplus-Schultz de regiones flexibles; la Columna XIII representa la puntuacion de inicio antigenico de Jameson-Wolf; y la Columna XIV representa la representacion de la probabilidad de superficie de Emini.
Preferentemente, los datos presentados en las columnas VIII, IX XIII y XIV de las Tablas 9 y 10 pueden usarse para determinar regiones del polipeptido de BLyS de la SEQ ID NO: 3228 (Tabla 9) o del polipeptido de BLyS de la SEQ ID NO: 3229 (Tabla 10) que muestran un alto grado de potencial para antigenicidad. Las regiones de alta antigenicidad se determinan a partir de los datos presentados en las columnas VIII, IX, XIII y/o XIV seleccionando los valores que representan regiones del polipeptido que probablemente esten expuestas en la superficie del polipeptido en un entorno en el que pueda producirse el reconocimiento de antfgeno en el procedimiento de inicio de una respuesta inmune.
Las regiones preferidas mencionadas anteriormente expuestas en las Tablas 9 y 10 incluyen, pero sin limitacion, regiones de los tipos mencionados anteriormente identificadas por analisis de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO: : 2. Como se expone en las Tablas 9 y 10, dichas regiones preferidas incluyen regiones alfa, regiones beta, regiones de giros y regiones de enrollamientos de Garnier-Robson, regiones alfa, regiones beta y regiones de giros de Chou-Fasman, regiones hidrofilas de Kyte-Doolittle, regiones anfipaticas alfa y beta de Eisenberg, regiones flexibles de Karplus- Schulz, regiones de Jameson-Wolf de alto mdice antigenico y regiones formadoras de superficie de Emini. Preferentemente, los anticuerpos de la presente invencion se unen a polipeptidos de BLyS o fragmentos polipeptfdicos de BLyS y variantes que comprenden regiones de BLyS que combinan varias caractensticas estructurales, tales como varias (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) de las mismas o diferentes caractensticas de region expuestas anteriormente y en las Tablas 9 y 10.
Tabla 9
Res
Posicion I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Met
1 A 0,73 -0,71 0,95 1,39
Asp
2 A T 1,12 -0,66 * 1,15 1,56
Asp
3 A T 1,62 -1,09 * 1,15 2,12
Ser
4 A T 2,01 -1,51 1,15 4,19
Thr
5 A T 2,40 -2,13 F 1,30 4,35
Glu
6 A A . 2,70 -1,73 * * F 0,90 4,51
Arg
7 A A . 2,81 -1,34 * * F 0,90 4,51
Glu
8 A A . 2,00 -1,73 * * F 0,90 6,12
Gln
9 A A . 1,99 -1,53 * * F 0,90 2,91
Ser
10 A B . 2,00 -1,04 * * F 0,90 2,15
Arg
11 A B . 1,33 -0,66 * * F 0,90 1,66
Leu
12 A B . 0,41 -0,09 * * F 0,45 0,51
Thr
13 A B . 0,46 0,20 * * F -0,15 0,32
Ser
14 A A . 0,50 -0,19 * * 0,30 0,32
Cys
15 A A . 0,91 -0,19 * * 0,30 0,78
Res
Posicion I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Leu
16 A A 0,80 -0,87 * * F 0,90 1,06
Lys
17 A A 1,61 -1,36 * F 0,90 1,37
Lys
18 A A 1,32 -1,74 * F 0,90 4,44
Arg
19 A A 1,67 -1,70 * F 0,90 5,33
Glu
20 A A 1,52 -2,39 * F 0,90 5,33
Glu
21 A A 2,38 -1,70 * F 0,90 2,20
Met
22 A A 2,33 -1,70 * F 0,90 2,24
Lys
23 A A 1,62 -1,70 * * F 0,90 2,24
Leu
24 A A 0,66 -1,13 * * F 0,75 0,69
Lys
25 A A 0,36 -0,49 * F 0,45 0,52
Glu
26 A A B -0,53 -0,71 * * 0,60 0,35
Cys
27 A A B -0,74 -0,03 * * 0,30 0,30
Val
28 A A B -1,00 -0,03 * * 0,30 0,12
Ser
29 A A B -0,08 0,40 * * -0,30 0,11
Ile
30 A B -0,08 0,40 * * -0,30 0,40
Leu
31 B -0,08 -0,17 * 0,45 1,08
Pro
32 B C 0,29 -0,81 * F 1,10 1,39
Arg
33 0,93 -0,81 * F 1,50 2,66
Lys
34 0,93 -1,07 F 1,84 4,98
Glu
35 C 0,97 -1,37 * * F 1,98 4,32
Ser
36 T C 1,89 -1,16 * * F 2,52 1,64
Pro
37 T C 1,80 -1,16 * * F 2,86 1,60
Ser
38 T 1,39 -0,77 * F 3,40 1,24
Val
39 A T 1,39 -0,39 * F 2,36 1,24
Arg
40 A 1,39 -0,77 * * F 2,46 1,60
Ser
41 A 1,34 -1,20 * * F 2,46 2,00
Ser
42 T T 1,60 -1,16 * F 3,06 2,67
Lys
43 T T 1,09 -1,80 * F 3,06 2,72
Asp
44 T T 1,13 -1,11 * * F 3,40 1,67
Gly
45 A T 0,43 -0,81 * * F 2,66 1,03
Lys
46 A A 0,14 -0,70 F 1,77 0,52
Leu
47 A A 0,13 -0,20 * 0,98 0,31
Leu
48 A A -0,72 0,29 * 0,04 0,46
Ala
49 A A -1,53 0,54 * -0,60 0,19
Ala
50 A A -2,00 1,23 -0,60 0,19
Thr
51 A A -2,63 1,23 -0,60 0,19
Leu
52 A A -2,63 1,04 -0,60 0,19
Leu
53 A A -2,63 1,23 -0,60 0,15
Leu
54 A A -2,34 1,41 -0,60 0,09
Ala
55 A A -2,42 1,31 -0,60 0,14
Leu
56 A A -2,78 1,20 -0,60 0,09
Leu
57 A T -2,78 1,09 -0,20 0,06
Ser
58 A T -2,28 1,09 -0,20 0,05
Cys
59 A T -2,32 1,07 -0,20 0,09
Cys
60 A T -2,59 1,03 -0,20 0,08
Leu
61 B B -2,08 0,99 -0,60 0,04
sic
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
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80
81
82
83
84
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92
93
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95
96
97
98
99
I
II III IV V VI VII VIII IX X XI XII
B B . -1,97 0,99
B B . -1,91 1,20
B B . -1,24 1,39
B B . -1,43 1,10
A
B . -1,21 1,26
A
B . -1,49 1,11
A
B . -1,44 0,97
A
B . -0,59 1,27
A
B . -0,63 0,89
A
B . 0,07 0,56 *
A
T -0,50 0,16 *
A
T -1,09 0,20 F
A
T -0,53 0,20 F
A
T -0,76 0,09 * F
A
A
-0,06 0,09 * F
A
A
0,17 -0,31 *
A
A
0,17 -0,24 *
A
A
-0,30 -0,24 *
A
A
-0,30 -0,24 *
A
A
0,17 -0,34 *
A
A
0,72 -0,30 *
A
A
0,99 -0,49 *
A
A
1,21 0,01 *
A
A
1,10 0,01 * *
A
A
1,73 0,01 * *
A
A
0,92 -0,67 *
A
A
1,52 -0,39 *
A
A
0,93 -0,39
A
A
0,93 -0,39 * F
A
T 0,38 -0,46 *
A
T 0,07 -0,46
A
T 0,07 -0,03
A
T -0,14 0,47
A
-0,14 0,21 *
A
0,08 -0,21 F
A
-0,06 -0,21 F
A
-0,28 -0,21 * F
A
A
0,07 -0,03 F
A
A
0,66 -0,46 F
A
A
0,41 -0,96 F
A
A
0,79 -0,89 F
A
A
0,41 -0,46 * F
A
A
-0,49 -0,46 * F
A
A
-0,21 -0,24
A
A
-0,46 -0,44
Res
Posicion I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Ala
107 A A 0,01 0,06 -0,30 0,39
Val
108 A A -0,80 0,49 * -0,60 0,38
Thr
109 A A -0,76 0,67 * -0,60 0,20
Ala
110 A A -1,06 0,24 * * -0,30 0,40
Gly
111 A A -1,54 0,43 * * -0,60 0,38
Leu
112 A A -0,96 0,57 * * -0,60 0,23
Lys
113 A B -0,31 0,09 * * -0,30 0,39
Ile
114 A -0,21 0,01 * -0,30 0,61
Phe
115 A -0,21 0,01 * 0,15 1,15
Glu
116 A C -0,08 -0,17 * F 1,25 0,58
Pro
117 A C 0,39 0,26 * * F 1,10 1,28
Pro
118 C 0,34 -0,00 F 2,20 1,47
Ala
119 T C 0,89 -0,79 * F 3,00 1,47
Pro
120 T C 1,59 -0,36 * F 2,25 0,94
Gly
121 T 1,29 -0,39 * F 2,15 0,98
Glu
122 T 1,20 -0,43 F 2,00 1,30
Gly
123 C 1,41 -0,54 F 1,60 1,12
Asn
124 T C 2,00 -0,57 F 1,50 1,97
Ser
125 T C 1,91 -0,60 * F 1,50 1,82
Ser
126 T C 2,37 -0,21 * F 1,54 2,47
Gln
127 T C 2,37 -0,64 * F 2,18 3,01
Asn
128 C 2,76 -0,64 F 2,32 3,61
Ser
129 T C 2,87 -1,03 F 2,86 5,39
Arg
130 2,58 -1,41 * F 3,40 6,09
Asn
131 2,02 -1,31 * F 3,06 3,83
Lys
132 2,02 -1,07 * F 2,72 2,12
Arg
133 1,68 -1,06 * F 2,18 1,88
Ala
134 C 1,77 -0,63 * F 1,64 1,15
Val
135 C 1,66 -0,60 * F 1,49 0,89
Gln
136 C 1,66 -0,60 * F 1,83 0,79
Gly
137 T C 1,30 -0,60 * F 2,52 1,35
Pro
138 T C 0,33 -0,61 * F 2,86 2,63
Glu
139 . T T 0,61 -0,61 * 3,40 1,13
Glu
140 A T 1,47 -0,53 * 2,66 1,64
Thr
141 A 1,47 -0,56 2,12 1,84
Val
142 A 1,14 -0,99 1,78 1,77
Thr
143 A T 0,54 -0,41 1,19 0,55
Gln
144 A T 0,54 0,27 * 0,25 0,31
Asp
145 A T -0,27 0,19 * 0,25 0,73
Cys
146 A T -0,84 0,23 * 0,10 0,42
Leu
147 A A -0,58 0,43 -0,60 0,17
Gln
148 A A -0,27 0,53 -0,60 0,10
Leu
149 A A -0,57 0,53 * -0,30 0,32
Ile
150 A A -0,57 0,34 0,30 0,52
Ala
151 A C -0,21 -0,34 * 1,40 0,52
Asp
152 . T T 0,39 -0,26 * F 2,45 0,91
Res
Posicion I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Ser
153 T C 0,08 -0,51 F 3,00 2,00
Glu
154 T C -0,00 -0,71 F 2,70 2,86
Thr
155 T C 0,89 -0,53 * F 2,40 1,20
Pro
156 B C 1,52 -0,13 * F 1,56 1,55
Thr
157 B T 1,18 -0,51 * F 1,92 1,79
Ile
158 A B 1,18 -0,09 F 1,08 1,23
Gln
159 T T 0,93 -0,19 F 2,04 1,07
Lys
160 T T 0,93 0,14 * F 1,60 1,16
Gly
161 T T 0,44 0,14 * F 1,44 2,38
Ser
162 T T -0,10 0,24 * F 1,28 1,19
Tyr
163 B T 0,58 0,49 * 0,12 0,44
Thr
164 B B 0,29 0,91 * -0,44 0,69
Phe
165 B B -0,57 1,40 * -0,60 0,54
Val
166 B B -1,03 1,70 -0,60 0,29
Pro
167 B B -1,03 1,63 -0,60 0,16
Trp
168 A B -1,49 1,53 * -0,60 0,25
Leu
169 A B -1,13 1,53 * -0,60 0,29
Leu
170 A B -0,32 0,89 * -0,30 0,38
Ter
171 A 0,19 0,46 * 0,20 0,71
Phe
172 T 0,10 -0,03 * 1,80 0,85
Lys
173 T T -0,20 -0,33 * F 2,60 1,38
Arg
174 T C -0,20 -0,51 F 3,00 1,04
Gly
175 T C 0,61 -0,21 F 2,25 0,99
Ser
176 A T 0,91 -1,00 * F 2,05 0,86
Ala
177 A A 1,66 -1,00 * F 1,35 0,76
Leu
178 A A 1,61 -1,00 F 1,20 1,54
Glu
179 A A 1,50 -1,43 F 0,90 1,98
Glu
180 A A 1,89 -1,41 * F 0,90 3,16
Lys
181 A A 1,30 -1,91 * F 0,90 7,66
Glu
182 A A 1,08 -1,91 F 0,90 3,10
Asn
183 A A 1,03 -1,23 * * F 0,90 1,48
Lys
184 A A 1,08 -0,59 * F 0,75 0,55
Ile
185 A A 1,08 -0,59 * * 0,60 0,63
Leu
186 A A 0,72 -0,59 * * 0,60 0,68
Val
187 A A 0,38 -0,50 * 0,30 0,49
Lys
188 A A 0,13 -0,07 * * F 0,45 0,69
Glu
189 A T -0,61 0,00 * * F 0,40 1,32
Thr
190 T T -0,42 0,10 * F 0,80 1,54
Gly
191 T T -0,50 0,24 * F 0,65 0,67
Tyr
192 T T 0,11 0,93 * * 0,20 0,27
Phe
193 B B -0,28 1,69 -0,60 0,29
Phe
194 B B -0,28 1,63 * -0,60 0,29
Ile
195 B B -0,82 1,60 -0,60 0,32
Tyr
196 B B -1,29 1,49 -0,60 0,28
Gly
197 B T -1,29 1,39 -0,20 0,26
Gln
198 B T -0,90 1,36 -0,20 0,59
Res
Posicion I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Val
199 B C -0,20 1,16 -0,40 0,54
Leu
200 B C 0,73 0,40 -0,10 0,92
Tyr
201 T T 0,67 -0,03 1,25 1,06
Thr
202 T T 0,77 0,06 F 0,80 2,06
Asp
203 T T 0,18 0,17 F 0,80 3,91
Lys
204 A T 0,43 -0,01 F 1,00 2,52
Thr
205 A A 0,90 -0,16 F 0,60 1,73
Tyr
206 A A 1,11 -0,21 0,45 1,03
Ala
207 A A 0,61 0,29 -0,30 0,70
Met
208 A A -0,28 0,97 -0,60 0,40
Gly
209 A A B -0,32 1,17 * -0,60 0,18
His
210 A A B 0,10 0,81 * -0,60 0,31
Leu
211 A A B 0,39 0,31 -0,30 0,61
Ile
212 A A B 1,02 -0,30 0,45 1,22
Gln
213 A A B 0,77 -0,73 * 0,75 1,80
Arg
214 A A B 1,08 -0,59 * F 0,90 1,62
Lys
215 A A B 0,26 -0,77 * * F 0,90 3,14
Lys
216 A A B 0,37 -0,81 * F 0,90 1,35
Val
217 B B 0,91 -0,43 * * 0,30 0,60
His
218 B B 0,91 -0,00 * 0,30 0,29
Val
219 B B 0,80 -0,00 * * 0,30 0,25
Phe
220 B B -0,06 -0,00 * 0,30 0,57
Gly
221 A B -0,40 0,04 * -0,30 0,35
Asp
222 A -0,36 -0,07 * 0,50 0,63
Glu
223 A -1,18 -0,03 * 0,50 0,60
Leu
224 A B -0,63 -0,17 0,30 0,45
Ser
225 A B -0,74 -0,11 0,30 0,39
Leu
226 A B -1,10 0,57 * -0,60 0,18
Val
227 A B -0,99 1,36 * -0,60 0,19
Thr
228 A B -1,66 0,67 * * -0,60 0,28
Leu
229 A B -1,73 0,86 * -0,60 0,18
Phe
230 A B -1,43 0,86 * -0,60 0,17
Arg
231 A B -0,62 0,61 * -0,60 0,21
Cys
232 B T -0,37 0,53 * -0,20 0,41
Ile
233 B T -0,27 0,46 * -0,20 0,46
Gln
234 B T 0,54 0,10 * 0,10 0,37
Asn
235 B C 0,93 0,10 * 0,05 1,19
Met
236 B C 0,01 0,01 * F 0,20 2,44
Pro
237 B C 0,47 0,01 * F 0,44 1,16
Glu
238 T 1,36 0,04 * F 1,08 1,12
Thr
239 C 1,36 0,04 * F 1,12 1,82
Leu
240 C 1,06 -0,17 * F 1,96 1,89
Pro
241 T 0,99 -0,21 F 2,40 1,46
Asn
242 T 0,96 0,36 F 1,41 0,54
Asn
243 T T 0,66 0,63 F 1,22 1,03
Ser
244 T T 0,38 0,33 F 1,13 0,89
Res
Posicion I II III IV V (continuacion) VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Cys
245 T T 0,84 0,40 0,74 0,56
Tyr
246 T T 0,17 0,43 0,20 0,35
Ser
247 A -0,42 0,71 -0,40 0,18
Ala
248 A A -0,38 0,83 -0,60 0,34
Gly
249 A A -0,89 0,26 -0,30 0,43
Ile
250 A A -0,22 0,19 * -0,30 0,27
Ala
251 A A 0,02 -0,20 * 0,30 0,46
Lys
252 A A -0,02 -0,70 0,60 0,80
Leu
253 A A 0,57 -0,70 F 0,90 1,13
Glu
254 A A 0,91 -1,39 F 0,90 1,87
Glu
255 A A 0,99 -1,89 F 0,90 1,62
Gly
256 A A 1,58 -1,20 * F 0,90 1,62
Asp
257 A A 0,72 -1,49 * F 0,90 1,62
Glu
258 A A 0,94 -0,80 * * F 0,75 0,77
Leu
259 A A 0,06 -0,30 * * 0,30 0,79
Gln
260 A A -0,16 -0,04 * 0,30 0,33
Leu
261 A A 0,30 0,39 * -0,30 0,30
Ala
262 A A 0,30 0,39 * -0,30 0,70
Ile
263 A A 0,30 -0,30 * 0,30 0,70
Pro
264 A T 0,52 -0,30 * F 1,00 1,37
Arg
265 A T 0,52 -0,49 * F 1,00 1,37
Glu
266 A T 0,44 -0,59 * * F 1,30 3,38
Asn
267 A T 0,73 -0,59 * * F 1,30 1,53
Ala
268 A -0,63 * * 0,95 1,05
Gln
269 A 0,06 * * -0,10 0,50
Ile
270 A 0,57 0,06 * 0,15 0,52
Ser
271 C 0,57 0,09 * 0,60 0,51
Leu
272 C -0,29 -0,41 * F 1,60 0,49
Asp
273 T T -0,01 -0,17 * F 2,25 0,52
Gly
274 T T -0,71 -0,37 * F 2,50 0,56
Asp
275 T T -0,52 0,03 * F 1,65 0,59
Val
276 A T -0,57 0,13 * F 1,00 0,30
Thr
277 A B -0,34 0,56 * -0,10 0,30
Phe
278 A B -1,16 0,63 * -0,35 0,18
Phe
279 A B -0,77 1,31 * -0,60 0,20
Gly
280 A A -1,58 0,67 * -0,60 0,28
Ala
281 A A -1,53 0,87 * -0,60 0,27
Leu
282 A A -1,61 0,77 * -0,60 0,26 *
Lys
283 A A -1,30 0,41 * -0,60 0,33 *
Leu
284 A A -0,99 0,41 -0,60 0,42
Leu
285 A A -1,03 0,34 * -0,30 0,65 *
Res
Posicion I II III IV V VI Tabla 10 VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Met
1 A 0,73 -0,71 0,95 1,39
Res
Posicion I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Asp
2 A T 1,12 -0,66 * 1,15 1,56
Asp
3 A T 1,62 -1,09 * 1,15 2,12
Ser
4 A T 2,01 -1,51 1,15 4,19
Thr
5 A T 2,40 -2,13 F 1,30 4,35
Glu
6 A A . 2,70 -1,73 * * F 0,90 4,51
Arg
7 A A . 2,81 -1,34 * * F 0,90 4,51
Glu
8 A A . 2,00 -1,73 * * F 0,90 6,12
Gln
9 A A . 1,99 -1,53 * * F 0,90 2,91
Ser
10 A B 2,00 -1,04 * * F 0,90 2,15
Arg
11 A B 1,33 -0,66 * * F 0,90 1,66
Leu
12 A B 0,41 -0,09 * * F 0,45 0,51
Thr
13 A B 0,46 0,20 * * F -0,15 0,32
Ser
14 A A . 0,50 -0,19 * * 0,30 0,32
o •< (/)
15 A A . 0,91 -0,19 * * 0,30 0,78
Leu
16 A A . 0,80 -0,87 * * F 0,90 1,06
Lys
17 A A . 1,61 -1,36 * F 0,90 1,37
Lys
18 A A . 1,32 -1,74 * F 0,90 4,44
Arg
19 A A . 1,67 -1,70 * F 0,90 5,33
Glu
20 A A . 1,52 -2,39 * F 0,90 5,33
Glu
21 A A . 2,38 -1,70 * F 0,90 2,20
Met
22 A A . 2,33 -1,70 * F 0,90 2,24
Lys
23 A A . 1,62 -1,70 * * F 0,90 2,24
Leu
24 A A . 0,66 -1,13 * * F 0,75 0,69
Lys
25 A A . 0,36 -0,49 * F 0,45 0,52
Glu
26 A A . B -0,53 -0,71 * * 0,60 0,35
o •< (/)
27 A A . B -0,74 -0,03 * * 0,30 0,30
Val
28 A A . B -1,00 -0,03 * * 0,30 0,12
Ser
29 A A . B -0,08 0,40 * * -0,30 0,11
Ile
30 A B -0,08 0,40 * * -0,30 0,40
Leu
31 A B -0,08 -0,17 * 0,45 1,08
Pro
32 B C 0,29 -0,81 * F 1,10 1,39
Arg
33 T 0,93 -0,81 * F 1,50 2,66
Lys
34 T 0,93 -1,07 F 1,84 4,98
Glu
35 C 0,97 -1,37 * * F 1,98 4,32
Ser
36 T C 1,89 -1,16 * * F 2,52 1,64
Pro
37 T C 1,80 -1,16 * * F 2,86 1,60
Ser
38 T T 1,39 -0,77 * F 3,40 1,24
Val
39 A T 1,39 -0,39 * F 2,36 1,24
Arg
40 A 1,39 -0,77 * * F 2,46 1,60
Ser
41 A 1,34 -1,20 * * F 2,46 2,00
Ser
42 T T 1,60 -1,16 * F 3,06 2,67
Lys
43 T T 1,09 -1,80 * * F 3,06 2,72
Asp
44 T T 1,13 -1,11 * * F 3,40 1,67
Gly
45 A T 0,43 -0,81 * * F 2,66 1,03
Lys
46 A A . 0,14 -0,70 F 1,77 0,52
Leu
47 A A . 0,13 -0,20 * 0,98 0,31
Res Posicion
I II III IV (continuacion) V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Leu 48
A A . -0,72 0,29 * 0,04 0,46
> Q) CD
A A . -1,53 0,54 * -0,60 0,19
> Q) cn o
A A . -2,00 1,23 -0,60 0,19
Thr 51
A A . -2,63 1,23 -0,60 0,19
Leu 52
A A . -2,63 1,04 -0,60 0,19
Leu 53
A A . -2,63 1,23 -0,60 0,15
Leu 54
A A . -2,34 1,41 -0,60 0,09
> Q) cn cn
A A . -2,42 1,31 -0,60 0,14
Leu 56
A A . -2,78 1,20 -0,60 0,09
Leu 57
A . T . -2,78 1,09 -0,20 0,06
Ser 58
A . T . -2,28 1,09 -0,20 0,05
Cys 59
A . T . -2,32 1,07 -0,20 0,09
Cys 60
A . T . -2,59 1,03 -0,20 0,08
Leu 61
B B . -2,08 0,99 -0,60 0,04
Thr 62
B B . -1,97 0,99 -0,60 0,11
Val 63
B B . -1,91 1,20 -0,60 0,17
Val 64
B B . -1,24 1,39 -0,60 0,33
Ser 65
B B . -1,43 1,10 -0,60 0,40
Phe 66
A B . -1,21 1,26 -0,60 0,40
Tyr 67
A B . -1,49 1,11 -0,60 0,54
Gln 68
A B . -1,44 0,97 -0,60 0,41
< Q)_ O) CD
A B . -0,59 1,27 -0,60 0,39
> Q) -M O
A B . -0,63 0,89 -0,60 0,43
> Q) -M
A B . 0,07 0,56 * -0,60 0,25
Leu 72
A . T . -0,50 0,16 0,10 0,55
Gln 73
A . T . -1,09 0,20 F 0,25 0,45
Gly 74
A . T . -0,53 0,20 F 0,25 0,45
Asp 75
A . T . -0,76 0,09 * F 0,25 0,73
Leu 76
A A . -0,06 0,09 * F -0,15 0,35
> Q) -M -M
A A . 0,17 -0,31 * 0,30 0,69
Ser 78
A A . 0,17 -0,24 * 0,30 0,42
Leu 79
A A . -0,30 -0,24 * 0,30 0,88
Arg 80
A A . -0,30 -0,24 * 0,30 0,72
00 TO <
A A . 0,17 -0,34 * 0,30 0,93
CM 00 3 CD
A A . 0,72 -0,30 * 0,45 1,11
Leu 83
A A . 0,99 -0,49 * 0,30 0,77
G) 3 00 4^
A A . 1,21 0,01 * -0,15 1,04
Gly 85
A A . 1,10 0,01 * * -0,30 0,61
CD 00 CO X
A A . 1,73 0,01 * * -0,15 1,27
His 87
A A . 0,92 -0,67 * 0,75 1,47
00 00 TO <
A A . 1,52 -0,39 * 0,45 1,22
G) c 00 CD
A A . 0,93 -0,39 0,45 1,39
Lys 90
A A . 0,93 -0,39 * F 0,60 1,03
Leu 91
A . T . 0,38 -0,46 * 0,85 1,01
Pro 92
A . T . 0,07 -0,46 0,70 0,59
> 0) CD CO
A . T . 0,07 -0,03 0,70 0,29
Res
Posicion I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Gly
94 A T -0,14 0,47 -0,20 0,36
Ala
95 A -0,14 0,21 * -0,10 0,36
Gly
96 A 0,08 -0,21 F 0,65 0,71
Ala
97 A -0,06 -0,21 F 0,65 0,72
Pro
98 A -0,28 -0,21 * F 0,65 0,71
Lys
99 A A 0,07 -0,03 F 0,45 0,59
Ala
100 A A 0,66 -0,46 F 0,60 1,01
Gly
101 A A 0,41 -0,96 F 0,90 1,13
Leu
102 A A 0,79 -0,89 F 0,75 0,57
Glu
103 A A 0,41 -0,46 * F 0,45 0,88
Glu
104 A A -0,49 -0,46 * F 0,45 0,89
Ala
105 A A -0,21 -0,24 0,30 0,81
Pro
106 A A -0,46 -0,44 0,30 0,67
Ala
107 A A 0,01 0,06 -0,30 0,39
Val
108 A A -0,80 0,49 * * -0,60 0,38
Thr
109 A A -0,76 0,67 * -0,60 0,20
Ala
110 A A -1,06 0,24 * * -0,30 0,40
Gly
111 A A -1,54 0,43 * * -0,60 0,38
Leu
112 A A -0,96 0,57 * -0,60 0,23
Lys
113 A B -0,31 0,09 * -0,30 0,39
Ile
114 A B -0,21 0,01 * -0,30 0,61
Phe
115 A B -0,21 0,01 * 0,15 1,15
Glu
116 A C -0,08 -0,17 * F 1,25 0,58
Pro
117 A C 0,39 0,26 * * F 1,10 1,28
Pro
118 C 0,34 0,00 * F 2,20 1,47
Ala
119 T C 0,89 -0,79 * F 3,00 1,47
Pro
120 T C 1,59 -0,36 * F 2,25 0,94
Gly
121 . T T 1,29 -0,39 * F 2,15 0,98
Glu
122 . T T 1,20 -0,43 F 2,00 1,30
Gly
123 C 1,41 -0,54 F 1,60 1,12
Asn
124 T C 2,00 -0,57 F 1,50 1,97
Ser
125 T C 1,91 -0,60 * F 1,50 1,82
Ser
126 T C 2,37 -0,21 * F 1,54 2,47
Gln
127 T C 2,37 -0,64 * F 2,18 3,01
Asn
128 C 2,76 -0,64 F 2,32 3,61
Ser
129 T C 2,87 -1,03 F 2,86 5,39
Arg
130 . T T 2,58 -1,41 * F 3,40 6,09
Asn
131 . T T 2,02 -1,31 * F 3,06 3,83
Lys
132 . T T 2,02 -1,07 * F 2,72 2,12
Arg
133 . T 1,68 -1,06 * F 2,18 1,88
Ala
134 C 1,77 -0,63 * F 1,64 1,15
Val
135 C 1,66 -0,60 * F 1,15 0,89
Gln
136 C 1,66 -0,60 * F 1,49 0,79
Gly
137 T C 1,30 -0,60 * F 2,18 1,35
Pro
138 T C 0,84 -0,61 * F 2,52 2,63
Glu
139 T C 1,13 -0,83 * F 2,86 1,50
Res
Posicion I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Glu
140 T T 1,74 -0,84 F 3,40 2,03
Thr
141 T 1,43 -0,51 F 2,86 2,06
Gly
142 T T 1,08 -0,46 F 2,42 1,72
Ser
143 T T 0,43 0,33 F 1,33 0,86
Tyr
144 T T 0,22 0,97 0,54 0,44
Thr
145 T T -0,07 0,91 0,20 0,69
Phe
146 B B -0,57 1,40 -0,60 0,54
Val
147 B B -1,03 1,70 -0,60 0,29
Pro
148 B B -1,03 1,63 -0,60 0,16
Trp
149 A B -1,49 1,53 * -0,60 0,25
Leu
150 B -1,13 1,53 * -0,60 0,29
Leu
151 B -0,32 0,89 * -0,30 0,38
Ser
152 0,19 0,46 * 0,20 0,71
Phe
153 0,10 -0,03 * 1,80 0,85
Lys
154 T T -0,20 -0,33 * F 2,60 1,38
Arg
155 T C -0,20 -0,51 F 3,00 1,04
Gly
156 T C 0,61 -0,21 F 2,25 0,99
Ser
157 A T 0,91 -1,00 * F 2,05 0,86
Ala
158 A A 1,66 -1,00 * F 1,35 0,76
Leu
159 A A 1,61 -1,00 F 1,20 1,54
Glu
160 A A 1,50 -1,43 F 0,90 1,98
Glu
161 A A 1,89 -1,41 * F 0,90 3,16
Lys
162 A A 1,30 -1,91 * F 0,90 7,66
Glu
163 A A 1,08 -1,91 F 0,90 3,10
Asn
164 A A 1,03 -1,23 * * F 0,90 1,48
Lys
165 A A 1,08 -0,59 * F 0,75 0,55
Ile
166 A A 1,08 -0,59 * * 0,60 0,63
Leu
167 A A 0,72 -0,59 * * 0,76 0,68
Val
168 A A 0,38 -0,50 * 0,92 0,49
Lys
169 A A 0,13 -0,07 * * F 0,93 0,69
Glu
170 A T -0,61 0,00 * * F 1,64 1,32
Thr
171 T T -0,42 0,10 * F 1,60 1,54
Gly
172 T T -0,50 0,24 * F 1,29 0,67
Tyr
173 T T 0,11 0,93 * * 0,68 0,27
Phe
174 B B -0,28 1,69 -0,28 0,29
Phe
175 B B -0,28 1,63 * -0,44 0,29
Ile
176 B B -0,82 1,60 -0,60 0,32
Tyr
177 B B -1,29 1,49 -0,60 0,28
Gly
178 B T -1,29 1,39 -0,20 0,26
Gln
179 B T -0,90 1,36 -0,20 0,59
Val
180 B C -0,20 1,16 -0,40 0,54
Leu
181 B C 0,73 0,40 -0,10 0,92
Tyr
182 T T 0,67 -0,03 1,25 1,06
Thr
183 T T 0,77 0,06 F 0,80 2,06
Asp
184 T T 0,18 0,17 F 0,80 3,91
Lys
185 A T 0,43 -0,01 F 1,00 2,52
Res
Posicion I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Thr
186 A A 0,90 -0,16 F 0,60 1,73
Tyr
187 A A 1,11 -0,21 0,45 1,03
Ala
188 A A 0,61 0,29 -0,30 0,70
Met
189 A A -0,28 0,97 -0,60 0,40
Gly
190 A A B -0,32 1,17 * -0,60 0,18
His
191 A A B 0,10 0,81 * -0,60 0,31
Leu
192 A A B 0,39 0,31 -0,30 0,61
Ile
193 A A B 1,02 -0,30 0,45 1,22
Gln
194 A A B 0,77 -0,73 * 0,75 1,80
Arg
195 A A B 1,08 -0,59 * * F 0,90 1,62
Lys
196 A A B 0,26 -0,77 * * F 0,90 3,14
Lys
197 A A B 0,37 -0,81 * F 0,90 1,35
Val
198 B B 0,91 -0,43 * 0,30 0,60
His
199 B B 0,91 0,00 * 0,30 0,29
Val
200 B B 0,80 0,00 * 0,30 0,25
Phe
201 B -0,06 0,00 0,30 0,57
Gly
CM O CM A B -0,40 0,04 * -0,30 0,35
Asp
CO O CM A -0,36 -0,07 * 0,50 0,63
Glu
"3- O CM A -1,18 -0,03 * 0,50 0,60
Leu
LO O CM A B -0,63 -0,17 0,30 0,45
Ser
CD O CM A B -0,74 -0,11 0,30 0,39
Leu
207 A B -1,10 0,57 * -0,60 0,18
Val
208 A B -0,99 1,36 * -0,60 0,19
Thr
(J) o CM A B -1,66 0,67 * * -0,60 0,28
Leu
210 A B -1,73 0,86 * -0,60 0,18
Phe
211 A B -1,43 0,86 * -0,60 0,17
Arg
212 A B -0,62 0,61 * -0,60 0,21
o •< (/)
213 B T -0,37 0,53 * -0,20 0,41
Ile
214 B T -0,27 0,46 * -0,20 0,46
Gln
215 B T 0,54 0,10 * 0,10 0,37
Asn
216 B C 0,93 0,10 * 0,05 1,19
Met
217 B C 0,01 0,01 * F 0,20 2,44
Pro
218 B C 0,47 0,01 * F 0,44 1,16
Glu
219 T 1,36 0,04 * F 1,08 1,12
Thr
o CM CM C 1,36 0,04 * F 1,12 1,82
Leu
221 C 1,06 -0,17 * F 1,96 1,89
Pro
CM CM CM T 0,99 -0,21 F 2,40 1,46
Asn
CO CM CM T 0,96 0,36 F 1,41 0,54
Asn
"3 CM CM T T 0,66 0,63 F 1,22 1,03
Ser
LO CM CM T T 0,38 0,33 F 1,13 0,89
o •< (/)
CD CM CM T T 0,84 0,40 0,74 0,56
Tyr
227 T T 0,17 0,43 0,20 0,35
Ser
CO CM CM -0,42 0,71 -0,40 0,18
Ala
229 A A -0,38 0,83 -0,60 0,34
Gly
o CO CM A A -0,89 0,26 -0,30 0,43
Ile
231 A A -0,22 0,19 -0,30 0,27
Res
Posicion i II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Ala
232 A A . 0,02 -0,20 0,30 0,46
Lys
CO CO CM A A . -0,02 -0,70 0,60 0,80
Leu
"3- CO CM A A . 0,57 -0,70 F 0,90 1,13
Glu
235 A A . 0,91 -1,39 F 0,90 1,87
Glu
CD CO CM A A . 0,99 -1,89 F 0,90 1,62
Gly
237 A A . 1,58 -1,20 * F 0,90 1,62
Asp
CO CO CM A A . 0,72 -1,49 * F 0,90 1,62
Glu
239 A A . 0,94 -0,80 * * F 0,75 0,77
Leu
o "3 CM A A . 0,06 -0,30 * * 0,30 0,79
Gln
241 A A . -0,16 -0,04 * 0,30 0,33
Leu
CM "3 CM A A . 0,30 0,39 * -0,30 0,30
Ala
243 A A . 0,30 0,39 * -0,30 0,70
Ile
244 A 0,30 -0,30 * 0,30 0,70
Pro
LO "3 CM A T 0,52 -0,30 * F 1,00 1,37
Arg
CD "3 CM A T 0,52 -0,49 * F 1,00 1,37
Glu
247 A T 0,44 -0,59 * * F 1,30 3,38
Asn
CO "3 CM A T 0,73 -0,59 * * F 1,30 1,53
Ala
249 A 0,81 -0,63 * * 0,95 1,05
Gln
o LO CM A 1,02 0,06 * * -0,10 0,50
Ile
251 A 0,57 0,06 * * 0,15 0,52
Ser
CM lO CM C 0,57 0,09 * 0,60 0,51
Leu
253 C -0,29 -0,41 * F 1,60 0,49
Asp
"3- LO CM T T -0,01 -0,17 * F 2,25 0,52
Gly
LO LO CM T T -0,71 -0,37 * F 2,50 0,56
Asp
CD LO CM T T -0,52 0,03 * F 1,65 0,59
Val
257 A T -0,57 0,13 * F 1,00 0,30
Thr
CO LO CM A B -0,34 0,56 * -0,10 0,30
Phe
259 A B -1,16 0,63 * -0,35 0,18
Phe
o CD CM A B -0,77 1,31 * -0,60 0,20
Gly
261 A A . -1,58 0,67 * -0,60 0,28
Ala
262 A A . -1,53 0,87 * -0,60 0,27
Leu
CO CD CM A A . -1,61 0,77 * -0,60 0,26
Lys
"3- CD CM A A . -1,30 0,41 * -0,60 0,33
Leu
LO CD CM A A . -0,99 0,41 -0,60 0,42
Leu
CD CD CM A A . -1,03 0,34 * -0,30 0,65
La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a un polipeptido que comprende, o alternativamente consiste en, una porcion que lleva un epftopo de un polipeptido descrito en el presente documento. El epftopo de esta porcion polipeptfdica puede ser un epftopo inmunogenico o antigenico de un polipeptido de la 5 presente invencion. Un "epftopo inmunogenico" se define como una parte de una protema que genera una respuesta de anticuerpos cuando la protema completa es el inmunogeno. Por otro lado, una region de una molecula proteica a la que puede unirse un anticuerpo se define como un "epftopo antigenico". El numero de epftopos inmunogenicos de una protema generalmente es inferior al numero de epftopos antigenicos. Vease, por ejemplo, Geysen y col, Proc. Natl. Acad Sei. EE.UU. 81:3998-4002 (1983).
10 En relacion con la seleccion de polipeptidos que llevan un epftopo antigenico (es decir, que contienen una region de una molecula proteica a la que puede unirse un anticuerpo), se sabe bien en esa tecnica que los peptidos sinteticos relativamente cortos que mimetizan parte de un secuencia proteica son capaces de generar rutinariamente un antisuero que reaccione con la protema parcialmente mimetizada. Vease, por ejemplo, Sutcliffe, J. G., Shinnick, T. M., Green, N. y Learner R. A. (1983) "Antibodies that react with predetermined sites on proteins", Science, 219:660-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
666. Los peptidos capaces de generar sueros reactivos con protemas se representan frecuentemente en la secuencia primaria de una protema, pueden caracterizarse por un conjunto de reglas qmmicas simples y no se limitan ni a regiones inmunodominantes de protemas intactas (es decir, a epftopos inmunogenicos) ni a los extremos amino o carboxilo terminales. Por lo tanto, los peptidos y polipeptidos que llevan un epftopo antigenico descritos en el presente documento son utiles para obtener anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que se unen espedficamente a un polipeptido descrito en el presente documento. Vease, por ejemplo, Wilson y col., Cell 37: 767778 (1984) en 777.
Espedficamente, la memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a peptidos y polipeptidos de BLyS que llevan epftopos antigenicos y preferentemente contienen una secuencia de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, mas preferentemente al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50 y, mas preferentemente, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoacidos contenidos dentro de la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de BLyS. Los polipeptidos preferidos que comprenden epftopos inmunogenicos o antigenicos tienen una longitud de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 restos aminoaddicos. Los epftopos antigenicos preferidos no exclusivos adicionales incluyen los epftopos antigenicos descritos en el presente documento, asf como porciones de los mismos.
Los ejemplos no limitantes de polipeptidos o peptidos antigenicos que pueden usarse para generar anticuerpos espedficos de BLyS y que pueden unirse por los anticuerpos de la presente invencion incluyen: un polipeptido que comprende, o alternativamente consiste en, los restos aminoaddicos de aproximadamente Phe-115 a aproximadamente Leu-147 en la SEQ ID NO: 3228; un polipeptido que comprende, o alternativamente consiste en los restos aminoaddicos de aproximadamente lle-150 a aproximadamente Tyr-163 en la SEQ ID NO: 3228; un polipeptido que comprende, o alternativamente consiste en los restos aminoaddicos de aproximadamente Ser-171 a aproximadamente Phe-194 en la SEQ ID NO: 3228; un polipeptido que comprende, o alternativamente consiste en los restos aminoaddicos de aproximadamente Glu-223 a aproximadamente Tyr- 246 en la SEQ ID NO: 3228; y un polipeptido que comprende, o alternativamente consiste en los restos aminoaddicos de aproximadamente Ser-271 a aproximadamente Phe-278 en las Figuras la y IB (SEQ ID NO: 3228). En este contexto, "aproximadamente" significa los intervalos particularmente mencionados y a intervalos mayores o menores por varios, unos pocos, 5, 4, 3, 2 o 1 restos aminoaddicos en cualquiera o ambos extremos amino- y carboxi-terminales. Se ha determinado que estos fragmentos polipeptfdicos llevan epftopos antigenicos del polipeptido de BLyS mediante el analisis del mdice antigenico de Jameson-Wolf, como se describe en la Tabla 9 anterior.
Los ejemplos no limitantes de polipeptidos o peptidos antigenicos que pueden usarse para generar anticuerpos espedficos de BLyS y que pueden unirse por los anticuerpos de la presente invencion incluyen: un polipeptido que comprende, o alternativamente consiste en los restos aminoaddicos de aproximadamente Pro-32 a aproximadamente Leu-47 en la SEQ ID NO: 3229; un polipeptido que comprende, o alternativamente consiste en los restos aminoaddicos de aproximadamente Glu-116 a aproximadamente Ser-143 en la SEQ ID NO: 3229; un polipeptido que comprende, o alternativamente consiste en los restos aminoaddicos de aproximadamente Phe-153 a aproximadamente Tyr-173 en la SEQ ID NO: 3229; un polipeptido que comprende, o alternativamente cosiste en, los restos aminoaddicos de aproximadamente Pro-218 a aproximadamente Tyr- 227 en la SEQ ID NO: 3229; un polipeptido que comprende, o alternativamente consiste en los restos aminoaddicos de aproximadamente Ala-232 a aproximadamente Gln-241 en la SEQ ID NO: 3229; un polipeptido que comprende, o alternativamente consiste en los restos aminoaddicos de aproximadamente lle-244 a aproximadamente Ala-249 en la SEQ ID NO: 3229; y un polipeptido que comprende, o alternativamente consistente en los restos aminoaddicos de aproximadamente Ser- 252 a aproximadamente Val-257 en la SEQ ID NO: 3229. En este contexto, el termino "aproximadamente" se refiere a los intervalos particularmente mencionados y a intervalos mayores o menores por varios, unos pocos, 5, 4, 3, 2 o 1 restos aminoaddicos en cualquiera o ambos extremos amino- y carboxi-terminales. Se ha determinado que estos fragmentos polipeptfdicos llevan epftopos antigenicos del polipeptido de BLyS mediante el analisis del mdice antigenico de Jameson-Wolf, como se describe en la Tabla 10 generada por el componente Protean del programa informatico DNA*STAR (como se ha expuesto anteriormente).
Los peptidos y polipeptidos que llevan epftopos de BLyS pueden producirse por cualquier medio convencional. Vease, por ejemplo, Houghten, R. A. (1985) General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids. Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 82:5131-5135; este procedimiento de "Smtesis Simultanea de Multiples Peptidos (SMPS)” se describe adicionalmente en la Patente de Estados Unidos N.° 4.631.211 para Houghten y col. (1986).
La presente memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en un epftopo del polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3228, o un epftopo de la secuencia polipeptfdica codificada por una secuencia polinucleotfdica contenida en el deposito de la ATCC N.° 97768, o codificada por un polinucleotido que dbrida con una secuencia de ADNc contenida en el deposito de la ATCC N.° 97768 (por ejemplo, en las condiciones de hibridacion descritas en el presente documento).
La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en un epftopo del polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
3229, o un epftopo de la secuencia polipeptfdica codificada por una secuencia polinucleotfdica contenida en el deposito de la ATCC N.° 203518, o codificada por un polinucleotido que tubrida con la secuencia de ADNc contenida en el deposito de la ATCC N.° 203518 (por ejemplo, en las condiciones de hibridacion descritas en el presente documento).
El termino "epftopos", como se usa en el presente documento, se refiere a porciones de un polipeptido que tienen actividad antigenica o inmunogenica en un animal, preferentemente un mairnfero, y mas preferentemente en un ser humano. En un aspecto preferido, se describen en el presente documento anticuerpos que se unen a un polipeptido que comprende un epftopo. Un "epftopo inmunogenico", como se usa en el presente documento, se define como una porcion de una protema que genera una respuesta de anticuerpo en un animal, segun se determina por cualquier procedimiento conocido en la tecnica, por ejemplo, mediante los procedimientos para generar anticuerpos descritos a continuacion. (Vease, por ejemplo, Geysen y col., Proc. Natl. Acad. Sei. Ee.UU. 81:3998-4002 (1983)). La expresion "epftopo antigenico", como se usa en el presente documento, se define como una porcion de una protema en la que un anticuerpo puede unirse inmunoespedficamente a su antigeno, segun se determina por cualquier procedimiento bien conocido en la tecnica, por ejemplo, mediante los inmunoensayos descritos en el presente documento. La union inmunoespedfica excluye la union inespedfica, pero no excluye necesariamente la reactividad cruzada con otros antigenos. Los epftopos antigenicos no tienen que ser necesariamente inmunogenicos.
Los fragmentos polipeptfdicos de BLyS que funcionan como epftopos pueden producirse por cualquier medio convencional. (Vease, por ejemplo, Houghten, Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 82:5131-5135 (1985), descrito adicionalmente en la Patente de EE.UU. N.° 4.631.211).
En la presente invencion, los anticuerpos de la presente invencion se unen a epftopos antigenicos que contienen preferentemente una secuencia de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, mas preferentemente al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50 y, mas preferentemente, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoacidos. Los polipeptidos preferidos que comprenden epftopos inmunogenicos o antigenicos que pueden unirse por anticuerpos de la presente invencion tienen una longitud de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 restos aminoaddicos. Los epftopos antigenicos preferidos no exclusivos adicionales incluyen los epftopos antigenicos descritos en el presente documento, asf como porciones de los mismos. Los epftopos antigenicos son utiles, por ejemplo, para obtener anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que se unen espedficamente al epftopo. Los epftopos antigenicos preferidos incluyen los epftopos antigenicos descritos en el presente documento, asf como cualquier combinacion de dos, tres, cuatro, cinco o mas de estos epftopos antigenicos. Los epftopos antigenicos pueden usarse como las moleculas diana en inmunoensayos. (Vease, por ejemplo, Wilson y col., Cell 37:767 (1984); Sutcliffe y col., Science 219:660-666 (1983)).
De forma similar, pueden usarse epftopos inmunogenicos, por ejemplo, para inducir anticuerpos de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la tecnica. (Vease, por ejemplo, Sutcliffe y col., anteriormente, Wilson y col., anteriormente; Chow y col., Proc. Natl. Acad. Sei. EE.Uu. 82:910-914; y Bittle y col., J. Gen. Virol 66:2347-2354 (1985). Los epftopos inmunogenicos preferidos incluyen los epftopos inmunogenicos descritos en el presente documento, asf como cualquier combinacion de dos, tres, cuatro, cinco o mas de estos epftopos inmunogenicos. Los polipeptidos que comprenden uno o mas epftopos inmunogenicos de BLyS pueden presentarse para generar una respuesta de anticuerpos junto con una protema transportadora, tal como una albumina, a un sistema animal (tal como conejo o raton), o si el polipeptido tiene una longitud suficiente (de al menos aproximadamente 25 aminoacidos), el polipeptido puede presentarse sin un transportador. Sin embargo, los epftopos inmunogenicos que comprenden tan pocos como de 8 a 10 aminoacidos han demostrado ser suficientes para obtener anticuerpos capaces de unirse a, como poco, epftopos lineales en un polipeptido desnaturalizado (por ejemplo, en transferencia Western).
Pueden usarse polipeptidos de BLyS que lleven epftopos para inducir anticuerpos de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la tecnica incluyendo, pero no limitados a, inmunizacion in vivo, inmunizacion in vitro y procedimientos de visualizacion en fago. Vease, por ejemplo, Sutcliffe y col., anteriormente, Wilson y col., anteriormente y Bittle y col., J. Gen Virol. 66:2347-2354 (1985). Si se usa inmunizacion in vivo, los animales pueden inmunizarse con peptido libre; sin embargo, el tftulo de anticuerpo anti-peptido puede reforzarse por acoplamiento del peptido con un transportador macromolecular, tal como hemocianina de lapa californiana (KLH) o toxoide tetanico. Por ejemplo, los peptidos que contienen restos de cistema pueden acoplarse a un transportador usando un enlazador tal como ester de maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), mientras que otros peptidos pueden acoplarse a transportadores usando un agente de union mas general, tal como glutaraldetudo. Los animales tales como conejos, ratas y ratones se inmunizan con peptidos libres o acoplados a transportador, por ejemplo, por inyeccion intraperitoneal y/o intradermica de emulsiones que contienen aproximadamente 100 microgramos de peptido o protema transportadora y adyuvante de Freund o cualquier otro adyuvante conocido por estimular una respuesta inmune. Pueden ser necesarias varias inyecciones de refuerzo, por ejemplo, a intervalos de aproximadamente dos semanas, para proporcionar un tftulo util de anticuerpo anti-peptido que pueda detectarse, por ejemplo, mediante un ensayo de eLisA usando peptido libre adsorbido a una superficie solida. El tftulo de anticuerpos anti-peptido en suero de un animal inmunizado puede aumentarse por seleccion de anticuerpos anti- peptido, por ejemplo, por adsorcion al peptido en un soporte solido y elucion de los anticuerpos seleccionados de
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acuerdo con procedimientos bien conocidos en la tecnica.
Como apreciara un experto en la materia, y como se ha analizado anteriormente, los anticuerpos de la presente invencion pueden unirse a polipeptidos que comprenden un epftopo inmunogenico o antigenico fusionado a otras secuencias polipeptidicas. Por ejemplo, los polipeptidos de BLyS pueden fusionarse con el dominio constante de inmunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM) o porciones de las mismas (CH1, CH2, CH3 o cualquier combinacion de las mismas y porciones de las mismas), o albumina (incluyendo, pero sin limitacion, albumina humana recombinante o fragmentos o variantes de la misma (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 5.876.969, expedida el 2 de marzo de 1999, la Patente EP 0 4l3 622 y la Patente de Estados Unidos N.° 5.766.883, expedida el 16 de junio de 1998), dando como resultado polipeptidos quimericos. Dichas protemas de fusion pueden facilitar la purificacion y pueden aumentar la semivida in vivo. Esto se ha demostrado para protemas quimericas que consisten en los dos primeros dominios del polipeptido CD4 humano y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de mamftero. Vease, por ejemplo, el documento EP 394.827; Traunecker y col., Nature, 331:84-86 (1988). Se ha demostrado una administracion aumentada de un antfgeno a traves de la barrera epitelial al sistema inmune para antfgenos (por ejemplo, insulina) conjugados con un companero de union de FcRn tal como IgG o fragmentos Fc (vease, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 96/22024 y WO 99/04813). Tambien se ha descubierto que las protemas de fusion con IgG que tienen una estructura dimerica unida por enlaces disulfuro debido a los enlaces disulfuro de la porcion de IgG son mas eficaces en la union y neutralizacion de otras moleculas que los polipeptidos monomericos o fragmentos de los mismos en solitario. Vease, por ejemplo, Fountoulakis y col., J. Biochem., 270:3958-3964 (1995). Los acidos nucleicos que codifican los epftopos anteriores tambien pueden recombinarse con un gen de interes como una etiqueta epitopica (por ejemplo, la etiqueta de hemaglutinina ("HA") o etiqueta flag) para contribuir a la deteccion y purificacion del polipeptido expresado. Por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht y col., permite la purificacion sencilla de protemas de fusion no desnaturalizadas expresadas en lmeas celulares humanas (Janknecht y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 88:8972-897). En este sistema, el gen de interes se subclona en un plasmido de recombinacion de Vaccinia, de modo que la fase de lectura abierta del gen se fusiona de forma traducible con una etiqueta amino-terminal que consiste en seis restos de histidina. La etiqueta sirve como dominio de union a matriz para la protema de fusion. Los extractos de celulas infectadas con el virus vacuna recombinante se cargan sobre una columna de Ni2+-acido nitriloacetico- agarosa y las protemas marcadas con histidina pueden eluirse selectivamente con tampones que contienen imidazol.
Los anticuerpos descritos en el presente documento tambien se unen a polipeptidos de BLyS y/o los fragmentos que llevan epftopos de los mimos, que estan fusionados con un antfgeno heterologo (por ejemplo, polipeptido, carbohidrato, fosfoftpido o acido nucleico). En aspectos espedficos, el antfgeno heterologo es un inmunogeno.
En un aspecto mas espedfico, el antfgeno heterologo es la protema gp120 del VIH o un fragmento de la misma.
Los anticuerpos descritos en el presente documento tambien se unen a polipeptidos de BLyS y/o los fragmentos que llevan epftopos de los mimos, que estan fusionados con secuencias polipeptfdicas de otro miembro de la familia de ligandos del TNF (o fragmentos biologicamente activos o variantes de los mismos). En un aspecto espedfico, los anticuerpos de la presente invencion se unen a polipeptidos de BLyS de la presente invencion que estan fusionados con una secuencia polipeptfdica de CD40L. Preferentemente, la secuencia polipeptfdica de CD40L es soluble.
Los anticuerpos descritos en el presente documento tambien se unen a polipeptidos de BLyS mutantes que se han generado por mutagenesis aleatoria de un polinucleotido que codifica el polipeptido de BLyS, mediante PCR propensa a error, insercion de nucleotidos aleatoria u otros procedimientos antes de la recombinacion. Los anticuerpos descritos en el presente documento tambien pueden unirse a uno o mas componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc., de BLyS recombinados con uno o mas componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o mas moleculas heterologas. Preferentemente, las moleculas heterologas son, por ejemplo, TNF-alfa, linfotoxina-alfa (LT-alfa, tambien conocida como TNF-beta), LT-beta (que se encuentra en el heterotnmero complejo LT-alfa2-beta), OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-1BBL, DcR3, OX40L, TNF-gamma (Publicacion Internacional N.° WO 96/14328), (Publicacion Internacional N.° WO 97/33899), AIM-II (Publicacion Internacional N.° WO 97/34911), APRIL (J. Exp. Med 188(6):1185-1190), endoquina-alfa (Publicacion Internacional N.° WO 98/07880), OPG, 0X40 y factor de crecimiento nervioso (NGF), y formas solubles de Fas, CD30, CD27, CD40 y 4-IBB, TR2 (Publicacion Internacional N.° WO 96/34095), Dr3 (Publicacion Internacional N.°WO 97/33904), DR4 (Publicacion Internacional N.°WO 98/32856), TR5 (Publicacion (Internacional N.° WO 98/30693), TR6 (Publicacion Internacional N.° WO 98/30694), TR7 (Publicacion Internacional N.° WO
98/41629), TRANK, TR9 (Publicacion Internacional N.° WO 98/56892), TRlO (Publicacion Internacional N.° WO
98/54202), 312C2 (Publicacion Internacional N.°WO 98/06842), TR12, CAD y v-FLIP. En aspectos adicionales, las moleculas heterologas son cualquier miembro de la familia de TNF.
Los anticuerpos descritos en el presente documento tambien se unen a polipeptidos de BLyS de la presente
invencion (incluyendo fragmentos biologicamente activos o variantes de los mismos), que estan fusionados con
polipeptidos de APRIL solubles (por ejemplo, los restos aminoaddicos 105 a 250 de la SEQ ID NO: 3239) o fragmentos biologicamente activos o variantes de los mismos.
Para mejorar o alterar las caractensticas de polipeptidos de BLyS, puede emplearse la modificacion por ingeniena
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genetica de protemas. La tecnologfa de ADN recombinante conocida por los expertos en la materia puede usarse para crear nuevas protemas mutantes o "mutemas", que incluyen una sola o multiples sustituciones, deleciones, adiciones de aminoacidos o protemas de fusion. Tales polipeptidos modificados pueden mostrar, por ejemplo, una actividad aumentada o una estabilidad aumentada. Ademas, pueden purificarse en mayores rendimientos y muestran una mejor solubilidad que el polipeptido natural correspondiente, al menos en determinadas condiciones de purificacion y almacenamiento. Por ejemplo, para muchas protemas, incluyendo el dominio extracelular o la forma o formas maduras de una protema secretada, se sabe en la tecnica que pueden delecionarse uno o mas aminoacidos del extremo N-terminal o C-terminal sin una perdida sustancial de funcion biologica. Por ejemplo, Ron y col., J. Biol. Chem., 268: 2984-2988 (1993) describieron protemas KGF modificadas que ternan actividad de union a heparina incluso si estaban ausentes 3, 8 o 27 restos aminoaddicos amino-terminales. Por consiguiente, los anticuerpos de la presente invencion pueden unirse a mutantes o variantes de polipeptidos de BLyS generados por modificacion por ingeniena genetica de protemas.
En el presente caso, puesto que la protema descrita en el presente documento es un miembro de la familia de polipeptidos del TNF, deleciones de aminoacidos N-terminales hasta el resto Gly (G) en posicion 191 en la SEQ ID NO: 3228 pueden conservar cierta actividad biologica tal como, por ejemplo, la capacidad para estimular la proliferacion, diferenciacion y/o activacion de linfocitos (por ejemplo, linfocitos B) y la citotoxicidad hacia celulas diana apropiadas. No se esperana que polipeptidos que tengan deleciones N-terminales adicionales que incluyen el resto Gly (G) conservasen actividades biologicas, porque se sabe que este resto en polipeptidos relacionados con el TNF esta al comienzo del dominio conservado necesario para las actividades biologicas. Sin embargo, incluso si la delecion de uno o mas aminoacidos del extremo N-terminal de una protema da como resultado una modificacion o perdida de una o mas funciones biologicas de la protema, todavfa pueden conservarse otras actividades funcionales. Por lo tanto, la capacidad de la protema acortada para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconozcan el dominio extracelular o completo de la protema se conservara generalmente cuando se eliminen menos de la mayona de los restos del dominio extracelular o completo de la protema del extremo N-terminal. Puede determinarse facilmente por procedimientos de rutina descritos en el presente documento y conocidos de otro modo en la tecnica si un polipeptido particular que carece de restos N-terminales de una protema completa conserva dichas actividades inmunologicas.
En consecuencia, la presente memoria descriptiva describe ademas anticuerpos que se unen a polipeptidos que tienen uno o mas restos delecionados del extremo amino-terminal de la secuencia de aminoacidos de BLyS de la SEQ ID NO: 3228, hasta el resto de glicina en posicion 191 (resto Gly-191 del extremo amino-terminal). En particular, la presente memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en, la secuencia de aminoacidos de los restos n1-285 de la SEQ ID NO: 3228, donde n1 es un numero entero en el intervalo de las posiciones aminoaddicas de los restos aminoaddicos 2-190 de la secuencia de aminoacidos en la SEQ ID NO: 3228. Mas en particular, la memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en los restos 2-285, 3-285, 4-285, 5-285, 6-285, 7-285, 8-285, 9-285, 10-285, 11-285, 12-285, 13-285, 14-285, 15-285, 16-285, 17-285, 18-285, 19-285, 20-285, 21-285, 22-285, 23-285, 24-285,
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Ademas, ya que el dominio extracelular predicho de los polipeptidos de BLyS de la presente invencion puede generar por sf mismo actividad biologica, las deleciones de restos aminoaddicos N- y C-terminales de la region extracelular predicha del polipeptido (posiciones que abarcan de Gln-73 a Leu-285 de la SEQ ID NO: 3228) pueden conservar cierta actividad biologica tal como, por ejemplo, la union a ligando, la estimulacion de la proliferacion, diferenciacion y/o activacion de linfocitos (por ejemplo, linfocitos B) y la modulacion de la replicacion celular o la modulacion de actividades de celulas diana. Sin embargo, incluso si la delecion de uno o mas aminoacidos del extremo N-terminal del dominio extracelular predicho de un polipeptido de BLyS da como resultado la modificacion o perdida de una o mas funciones biologicas del polipeptido, todavfa pueden conservarse otras actividades funcionales. De esta manera, la capacidad de los polipeptidos acortados para inducir y/o unirse a anticuerpos que
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reconozcan los dominios extracelulares o maduros o completos de los polipeptidos se conservara generalmente cuando se eliminen menos de la mayona de los restos de los dominios extracelulares o maduros o completos de los polipeptidos del extremo N-terminal. Puede determinarse facilmente por procedimientos de rutina descritos en el presente documento y conocidos de otro modo en la tecnica si un polipeptido particular que carece de restos N- terminales de un polipeptido completo conserva dichas actividades inmunologicas.
En consecuencia, la presente memoria descriptiva describe ademas anticuerpos que se unen a polipeptidos que tienen uno o mas restos delecionados del extremo amino-terminal de la secuencia de aminoacidos de BLyS mostrada en la SEQ ID NO: 3228, hasta el resto de glicina en el numero de posicion 280. En particular, la presente invencion proporciona anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en la secuencia de aminoacidos de los restos n2-285 de la SEQ ID NO: 3228, en el que n2 es un numero entero en el intervalo de las posiciones aminoaddicas de los restos aminoaddicos 73-280 en la SEQ ID NO: 3228, y 73 es la posicion del primer resto del extremo N-terminal del dominio extracelular predicho del polipeptido de BLyS (descrito en la SEQ ID NO: 3228). Mas en particular, la memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en los restos de Q-73 a L-285; G-74 a L-285; D-75 a L-285; L-76 a L-285; A-77 a L-285; S-78 a L-285; L-79 a L-285; R-80 a L-285; A-81 a L-285; E-82 a L-285; L-83 a L-285; Q-84 a L-285; G-85 a L-285; H-86 a L-285; H-87 a L-285; A-88 a L-285; E-89 a L-285; K-90 a L-285; L-91 a L-285; P-92 a L-285; A-93 a L-285; G-94 a L-285; A-95 a L- 285; G-96 a L-285; A-97 a L-285; P-98 a L-285; K-99 a L-285; A-100 a L-285; G-101 a L-285; L-102 a L-285; E-103 a L-285; E-104 a L-285; A-105 a L-285; P-106 a L-285; A-107 a L-285; V-108 a L-285; T-109 a L-285; A-110 a L-285;
G-111 a L-285; L-112 a L-285; K-113 a L-285; 1-114 a L-285; F-115 a L-285; E-116 a L-285; P-117 a L-285; P-118 a
L-285; A-119 a L-285; P-120 a L-285; G-121 a L-285; E-122 a L-285; G-123 a L-285; N-124 a L-285; S-125 a L-285;
S-126 a L-285; Q-127 a L-285; N-128 a L-285; S-129 a L-285; R-130 a L-285; N-131 a L-285; K-132 a L-285; R-133
a L-285; A-134 a L-285; V-135 a L-285; Q-136 a L-285; G-137 a L-285; P-138 a L-285; E-139 a L-285; E-140 a L- 285; T-141 a L-285; V-142 a L-285; T-143 a L-285; Q-144 a L-285; D-145 a L-285; C-146 a L-285; L-147 a L-285; Q- 148 a L-285; L-149 a L-285; I-150 a L-285; A-151 a L-285; D-152 a L-285; S-153 a L-285; E-154 a L-285; T-155 a L- 285; P-156 a L-285; T-157 a L-285; 1-158 a L-285; Q-159 a L-285; K-160 a L-285; G-161 a L-285; S-162 a L-285; Y- 163 a L-285; T-164 a L-285; F-165 a L-285; V-166 a L-285; P-167 a L-285; W-168 a L-285; L-169 a L-285; L-170 a L- 285; S-171 a L-285; F-172 a L-285; K-173 a L-285; R-174 a L-285; G-175 a L-285; S-176 a L-285; A-177 a L-285; L- 178 a L-285; E-179 a L-285; E-180 a L-285; K-181 a L-285; E-182 a L-285; N-183 a L-285; K-184 a L-285; I-185 a L- 285; L-186 a L-285; V-187 a L-285; K-188 a L-285; E-189 a L-285; T-190 a L-285; G-191 a L-285; Y-192 a L-285; F- 193 a L-285; F-194 a L-285; 1-195 a L-285; Y-196 a L-285; G-197 a L-285; Q-198 a L-285; V-199 a L-285; L-200 a L- 285; Y-201 a L-285; T-202 a L-285; D-203 a L-285; K-204 a L-285; T-205 a L-285; Y-206 a L-285; A-207 a L-285; M- 208 a L-285; G-209 a L-285; H-210 a L-285; L-211 a L-285; 1-212 a L-285; Q-213 a L-285; R-214 a L-285; K-215 a L-285; K-216 a L-285; V-217 a L-285; H-218 a L-285; V-219 a L-285; F-220 a L-285; G-221 a L-285; D-222 a L-285; E-223 a L-285; L-224 a L-285; S-225 a L-285; L-226 a L-285; V-227 a L-285; T-228 a L-285; L-229 a L-285; F-230 a L-285; R-231 a L-285; C-232 a L-285; 1-233 a L-285; Q-234 a L-285; N-235 a L-285; M-236 a L-285; P-237 a L-285; E-238 a L-285; T-239 a L-285; L-240 a L-285; P-241 a L-285; N-242 a L-285; N-243 a L-285; S-244 a L-285; C-245 a L-285; Y-246 a L-285; S-247 a L-285; A-248 a L-285; G-249 a L-285; 1-250 a L-285; A-251 a L-285; K-252 a L-285; L-253 a L-285; E-254 a L-285; E-255 a L-285; G-256 a L-285; D-257 a L-285; E-258 a L-285; L-259 a L-285; Q-260 a L-285; L-261 a L-285; A-262 a L-285; 1-263 a L-285; P-264 a L-285; R-265 a L-285; E-266 a L-285; N-267 a L-285; A-268 a L-285; Q-269 a L-285; 1-270 a L-285; S-271 a L-285; L-272 a L-285; D-273 a L-285; G-274 a L-285; D-275 a L-285; V-276 a L-285; T-277 a L-285; F-278 a L-285; F-279 a L-285; y G-280 a L-285 de la SEQ ID NO: 3228. La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia contigua de restos aminoaddicos con una identidad de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con la secuencia de aminoacidos de polipeptidos de BLyS descritos anteriormente.
La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en, un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos con una identidad de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 % y, mas preferentemente, una identidad de al menos un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % con el polipeptido de BLyS que tiene la secuencia de aminoacidos en las posiciones 134-285 de la SEQ ID NO: 3228.
Tambien se describen en el presente documento anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o
alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos con una identidad de al
menos un 90 % con un polipeptido de BLyS que tiene la secuencia de aminoacidos en las posiciones 134-285 de la SEQ ID NO: 3228. Tambien se describen en el presente documento anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos con una identidad de al menos un 95 % con un polipeptido de BLyS que tiene la secuencia de aminoacidos en las posiciones 134-285 de la SEQ ID NO: 3228. Tambien se describen en el presente documento anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos con una identidad de al menos un 96 % con un polipeptido de BLyS que tiene la secuencia de aminoacidos en las posiciones 134-285 de la SEQ ID NO: 3228.
Tambien se describen en el presente documento anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o
alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de al menos un 97 % con un
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polipeptido de BLyS que tiene la secuencia de aminoacidos en las posiciones 134-285 de la SEQ ID NO: 3228. Tambien se describen en el presente documento anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o
alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de al menos un 98 % con un
polipeptido de BLyS que tiene la secuencia de aminoacidos en las posiciones 134-285 de la SEQ ID NO: 3228. Tambien se describen en el presente documento anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o
alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos con una identidad de al
menos un 99 % con un polipeptido de BLyS que tiene la secuencia de aminoacidos en las posiciones 134-285 de la SEQ ID NO: 3228.
En aspectos espedficos, los anticuerpos de la presente invencion se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en uno de los fragmentos polipeptfdicos de BLyS con delecion N-terminal siguientes: los restos aminoaddicos Ala-71 a Leu-285, los restos aminoaddicos Ala-81 a Leu-285, los restos aminoaddicos Leu- 112 a Leu- 285, los restos aminoaddicos Ala-134 a Leu-285, los restos aminoaddicos Leu-147 a Leu-285 y los restos aminoaddicos Gly-161 a Leu-285 de la SEQ ID NO:3228.
De forma similar, se conocen muchos ejemplos de polipeptidos con delecion C-terminal biologicamente funcionales. Por ejemplo, el interferon gamma muestra actividades hasta diez veces mayores por delecion de 8-10 restos aminoaddicos del extremo carboxi-terminal de la protema (Dobeli y col., J. Biotechnology 7: 199-216 (1988). Puesto que la presente protema es un miembro de la familia de polipeptidos del TNF, se espera que deleciones de aminoacidos C-terminales hasta el resto de leucina en posicion 284 conserven la mayor parte, si no toda, de su actividad biologica tal como, por ejemplo, la union a ligando, la capacidad para estimular la proliferacion, diferenciacion y/o activacion de linfocitos (por ejemplo, linfocitos B) y la modulacion de la replicacion celular. Los polipeptidos que tienen deleciones de hasta aproximadamente 10 restos C-terminales adicionales (es decir, hasta el resto de glicina en posicion 274) tambien pueden conservar cierta actividad, tal como la union a receptor, aunque dichos polipeptidos carecenan de una porcion del dominio de TNF conservado que se extiende hasta aproximadamente la Leu-284 de la SEQ ID NO: 3228. Sin embargo, incluso si la delecion de uno o mas aminoacidos del extremo C-terminal de una protema da como resultado la modificacion o perdida de una o mas funciones biologicas de la protema, todavfa pueden conservarse otras actividades funcionales. Por lo tanto, la capacidad de la protema acortada para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconozcan la protema madura o completa se conservara generalmente cuando se eliminen menos de la mayona de los restos de la protema madura o completa del extremo C-terminal. Puede determinarse facilmente por procedimientos de rutina descritos en el presente documento y conocidos de otro modo en la tecnica si un polipeptido particular que carece de restos C-terminales de una protema completa conserva dichas actividades inmunologicas.
Por consiguiente, la presente memoria descriptiva describe ademas anticuerpos que se unen a polipeptidos que tienen uno o mas restos delecionados del extremo carboxi-terminal de la secuencia de aminoacidos del polipeptido de BLyS de la SEQ ID NO: 3228, hasta el resto de glicina en posicion 274 (Gly-274). En particular, la presente memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en la secuencia de aminoacidos de los restos 1-m1 de la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3228, donde m1 es cualquier numero entero en el intervalo de las posiciones aminoaddicas de los restos aminoaddicos 274-284 en la SEQ ID NO: 3228. Mas en particular, la presente invencion proporciona anticuerpos que se unen a polipeptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en los restos 1-274, 1-275, 1-276, 1-277, 1-278, 1-279, 1- 280, 1-281, 1-282, 1-283 y 1-284 de la SEQ ID NO: 3228. La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia contigua de restos aminoaddicos con una identidad de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con la secuencia de aminoacidos de los polipeptidos de BLyS descritos anteriormente.
Tambien se describen anticuerpos que se unen a polipeptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en polipeptidos de BLyS con uno o mas aminoacidos delecionados tanto del extremo amino- como carboxilo-terminal, que pueden describirse en general como que tienen los restos n1-m1 de la SEQ ID NO: 3228, donde n1 y m1 son numeros enteros como se han definido anteriormente. Tambien se describen anticuerpos que se unen a un polipeptido que comprende, o alternativamente consiste en una porcion de la secuencia de aminoacidos de BLyS completa codificada por el clon de ADNc depositado contenido en el N.° de acceso de la ATCC 97768, en el que esta porcion excluye de 1 a 190 aminoacidos del extremo amino-terminal o de 1 a 11 aminoacidos del extremo C-terminal de la secuencia de aminoacidos completa (o cualquier combinacion de estas deleciones N- terminales y C-terminales) codificada por el clon de ADNc en el plasmido depositado.
De forma similar, las deleciones de restos aminoaddicos C-terminales del dominio extracelular predicho de BLyS hasta el resto de leucina en posicion 79 de la SEQ ID NO: 3228 pueden conservar cierta actividad biologica, tal como, por ejemplo, la union a ligando, la estimulacion de la proliferacion, diferenciacion y/o activacion de linfocitos (por ejemplo, linfocitos B) y la modulacion de la replicacion celular o modulacion de las actividades de celulas diana. No se esperana que polipeptidos que tengan deleciones C-terminales adicionales que incluyan la Leu-79 de la SEQ ID NO: 3228 conservasen sus actividades biologicas.
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otras actividades funcionales. Por lo tanto, la capacidad del polipeptido acortado para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconozcan las formas completa, madura o extracelular del polipeptido se conservara generalmente cuando se eliminen menos de la mayona de los restos de las formas completa, madura o extracelular del polipeptido del extremo C-terminal. Puede determinarse facilmente por procedimientos de rutina descritos en el presente documento y conocidos de otro modo en la tecnica si un polipeptido particular que carece de restos C-terminales del dominio extracelular predicho conserva dichas actividades inmunologicas.
Por consiguiente, la presente memoria descriptiva describe ademas anticuerpos que se unen a polipeptidos que tienen uno o mas restos delecionados del extremo carboxi-terminal de la secuencia de aminoacidos del dominio extracelular predicho del polipeptido de BLyS mostrado en la SEQ ID NO: 3228, hasta el resto de leucina en la posicion 79 de la SEQ ID NO: 3228. En particular, la presente memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en la secuencia de aminoacidos de los restos 73-m2 de la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3228, donde m2 es cualquier numero entero en el intervalo de las posiciones aminoaddicas de los restos aminoaddicos 79 a 285 en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3228, y el resto 78 es la posicion del primer resto del extremo C-terminal del dominio extracelular predicho del polipeptido de BLyS (descrito en la SEQ ID NO: 3228). Mas en particular, la memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en los restos Q-73 a Leu-285; Q-73 a Leu-285; Q-73 a L-284; Q- 73 a K-283; Q-73 a L-282; Q-73 a A-281; Q-73 a G-280; Q-73 a F-279; Q-73 a F-278; Q-73 a T-277; Q-73 a V-276; Q-73 a D-275; Q-73 a G-274; Q-73 a D-273; Q-73 a L-272; Q-73 a S-271; Q-73 a 1-270; Q-73 a Q-269; Q-73 a A- 268; Q-73 a N-267; Q-73 a E-266; Q-73 a R-265; Q-73 a P-264; Q-73 a 1-263; Q-73 a A-262; Q-73 a L-261; Q-73 a Q-260; Q-73 a L-259; Q-73 a E-258; Q-73 a D-257; Q-73 a G-256; Q-73 a E-255; Q-73 a E-254; Q-73 a L-253; Q-73 a K-252; Q-73 a A-251; Q-73 a 1-250; Q-73 a G-249; Q-73 a A-248; Q-73 a S-247; Q-73 a Y-246; Q-73 a C-245; Q- 73 a S-244; Q-73 a N-243; Q-73 a N-242; Q-73 a P-241; Q-73 a L-240; Q-73 a T-239; Q-73 a E-238; Q-73 a P-237; Q-73 a M-236; Q-73 a N-235; Q-73 a Q-234; Q-73 a 1-233; Q-73 a C-232; Q-73 a R-231; Q-73 a F-230; Q-73 a L- 229; Q-73 a T-228; Q-73 a V-227; Q-73 a L-226; Q-73 a S-225; Q-73 a L-224; Q-73 a E-223; Q-73 a D-222; Q-73 a G-221; Q-73 a F-220; Q-73 a V-219; Q-73 a H-218; Q-73 a V-217; Q-73 a K-216; Q-73 a K-215; Q-73 a R-214; Q-73 a Q-213; Q-73 a I-212; Q-73 a L-211; Q-73 a H-210; Q-73 a G-209; Q-73 a M-208; Q-73 a A-207; Q-73 a Y-206; Q- 73 a T-205; Q-73 a K-204; Q-73 a D-203; Q-73 a T-202; Q-73 a Y-201; Q-73 a L-200; Q-73 a V-199; Q-73 a Q-198; Q-73 a G-197; Q-73 a Y-196; Q-73 a I-195; Q-73 a F-194; Q-73 a F-193; Q-73 a Y-192; Q-73 a G-191; Q-73 a T-190; Q-73 a E-189; Q-73 a K-188; Q-73 a V-187; Q-73 a L-186; Q-73 a 1-185; Q-73 a K-184; Q-73 a N-183; Q-73 a E- 182; Q-73 a K-181; Q-73 a E-180; Q-73 a E-179; Q-73 a L-178; Q-73 a A-177; Q-73 a S-176; Q-73 a G-175; Q-73 a R-174; Q-73 a K-173; Q-73 a F-172; Q-73 a S-171; Q-73 a L-170; Q-73 a L-169; Q-73 a W-168; Q-73 a P-167; Q-73 a V-166; Q-73 a F-165; Q-73 a T-164; Q-73 a Y-163; Q-73 a S-162; Q-73 a G-161; Q-73 a K-160; Q-73 a Q-159; Q- 73 a 1-158; Q-73 a T-157; Q-73 a P-156; Q-73 a T-155; Q-73 a E-154; Q-73 a S-153; Q-73 a D-152; Q-73 a A-151; Q-73 a 1-150; Q-73 a L-149; Q-73 a Q-148; Q-73 a L-147; Q-73 a C-146; Q-73 a D-145; Q-73 a Q-144; Q-73 a T- 143; Q-73 a V-142; Q-73 a T-141; Q-73 a E-140; Q-73 a E-139; Q-73 a P-138; Q-73 a G-137; Q-73 a Q-136; Q-73 a V-135; Q-73 a A-134; Q-73 a R-133; Q-73 a K-132; Q-73 a N-131; Q-73 a R-130; Q-73 a S-129; Q-73 a N-128; Q-73 a Q-127; Q-73 a S-126; Q-73 a S-125; Q-73 a N-124; Q-73 a G-123; Q-73 a E-122; Q-73 a G-121; Q-73 a P-120; Q- 73 a A-119; Q-73 a P-118; Q-73 a P-117; Q-73 a E-116; Q-73 a F-115; Q-73 a I-114; Q-73 a K-113; Q-73 a L-112; Q- 73 a G-111; Q-73 a A-110; Q-73 a T-109; Q-73 a V-108; Q-73 a A-107; Q-73 a P-106; Q-73 a A-105; Q-73 a E-104; Q-73 a E-103; Q-73 a L-102; Q-73 a G-101; Q-73 a A-100; Q-73 a K-99; Q-73 a P-98; Q-73 a A-97; Q-73 a G-96; Q- 73 a A-95; Q-73 a G-94; Q-73 a A-93; Q-73 a P-92; Q-73 a L-91; Q-73 a K-90; Q-73 a E-89; Q-73 a A-88; Q-73 a H- 87; Q-73 a H-86; Q-73 a G-85; Q-73 a Q-84; Q-73 a L-83; Q-73 a E-82; Q-73 a A-81; Q-73 a R-80; y Q-73 a L-79 de la SEQ ID NO: 3228. La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia contigua de restos aminoaddicos con una identidad de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con la secuencia de aminoacidos de polipeptidos de BLyS descritos anteriormente.
La memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que tienen uno o mas aminoacidos delecionados tanto del extremo amino- como carboxilo-terminal del dominio extracelular predicho de BLyS, que pueden describirse generalmente como que tienen los restos n2-m2 de la SEQ ID NO: 3228, donde n2 y m2 son numeros enteros como se han definido anteriormente.
Los anticuerpos descritos en la presente memoria tambien se unen a polipeptidos que consisten en una porcion del dominio extracelular de la secuencia de aminoacidos de BLyS codificada por el plasmido de ADNc contenido en el deposito que tiene el N.° de acceso de la ATCC 97768, en los que esta porcion excluye de 1 a aproximadamente 206 aminoacidos del extremo amino-terminal del dominio extracelular de la secuencia de aminoacidos codificada por el plasmido de ADNc contenido en el deposito que tiene el N.° de acceso de la ATCC 97768, o de 1 a aproximadamente 206 aminoacidos del extremo carboxi-terminal del dominio extracelular de la secuencia de aminoacidos codificada por el plasmido de ADNc contenido en el deposito que tiene el N.° de acceso de la ATCC 97768, o cualquier combinacion de las deleciones amino- terminales y carboxi-terminales anteriores, del dominio extracelular completo de la secuencia de aminoacidos codificada por el plasmido de ADNc contenido en el deposito que tiene el N.° de acceso de la ATCC 97768.
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actividad biologica) del polipeptido, todav^a pueden conservarse otras funciones o actividades biologicas. Por lo tanto, la capacidad de una mutema de BLyS acortada para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconozcan las formas madura o de longitud completa o el dominio extracelular del polipeptido se conservara generalmente cuando se eliminen menos de la mayona de los restos del dominio extracelular o maduro o de longitud completa del polipeptido del extremo N-terminal. Puede determinarse facilmente por procedimientos de rutina descritos en el presente documento y conocidos de otro modo en la tecnica si un polipeptido particular que carece de restos N- terminales de un polipeptido completo conserva dichas actividades inmunologicas. No es improbable que una mutema de BLyS con un gran numero de restos aminoaddicos N-terminales delecionados pueda conservar ciertas actividades funcionales (por ejemplo, biologicas o inmunogenicas). De hecho, los peptidos compuestos por tan pocos como seis restos aminoaddicos de BLyS pueden producir con frecuencia una respuesta inmune.
Por consiguiente, la presente memoria descriptiva describe ademas anticuerpos que se unen a polipeptidos que tienen uno o mas restos delecionados del extremo amino-terminal de la secuencia de aminoacidos de longitud completa predicha del BLyS mostrada en la SEQ ID NO: 3228, hasta el resto de glicina en la posicion numero 280 de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 3228, y polinucleotidos que codifican dichos polipeptidos. En particular, la presente invencion proporciona anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden la secuencia de aminoacidos de los restos n3-285 de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 3228, donde n3 es un numero entero en el intervalo de las posiciones aminoaddicas de los restos aminoaddicos 1 a 280 de la secuencia de aminoacidos en la SEQ ID NO: 3228.
Mas en particular, la memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o
alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos
seleccionada del grupo que consiste en los restos de
D-2
a L-285 ; D-3 a L-285; S-4 a L-285; T-5 a L- 285; E-6 a L-285; R-7 a L-285; E-8 a L-285; Q-9 a L-285; S-10 a L-
285;
R-11 a L-285; L-12 a L-285; T-13 a L-285; S-14 a L-285; C-15 a L-285; L-16 a L-285; K-17 a L-285; K-18 a L-
285;
R-19 a L-285; E-20 a L-285; E-21 a L-285; M-22 a L-285; K-23 a L-285; L-24 a L-285; K-25 a L-285; E-26 a L-
285;
C-27 a L-285; V-28 a L-285; S-29 a L-285; 1-30 a L-285; L-31 a L-285; P-32 a L-285; R-33 a L-285; K-34 a L-
285;
E-35 a L-285; S-36 a L-285; P-37 a L-285; S-38 a L-285; V-39 a L-285; R-40 a L-285; S-41 a L-285; S-42 a L-
285;
K-43 a L-285; D-44 a L-285; G-45 a L-285 ; K-46 a L-285: ; L-47 a L-285; L-48 a L-285; A-49 a L-285; A-50 a L-
285;
T-51 a L-285; L-52 a L-285; L-53 a L-285; L-54 a L-285; A-55 a L-285; L-56 a L-285; L-57 a L-285; S-58 a L-
285;
C-59 a L-285; C-60 a L-285; L-61 a L-285; T-62 a L-285; V-63 a L-285; V-64 a L-285; S-65 a L-285 F-66 a L-
285;
Y-67 a L-285; Q-68 a L-285; V-69 a L-285; A-70 a L-285; A-71 a L-285; L-72 a L-285; Q-73 a L-285; G-74 a L-
285;
D-75 a L-285; L-76 a L-285; A-77 a L-285; S-78 a L-285; L-79 a L-285; R-80 a L-285; A-81 a L-285; E-82 a L-
285;
L-83 a L-285; Q-84 a L-285; G-85 a L-285; H-86 a L-285; H-87 a L-285; A-88 a L-285: ; E-89 a L-285: ; K-90 a L-
285;
L-91 a L-285; P-92 a L-285; A-93 a L-285; G-94 a L-285; A-95 a L-285; G-96 a L-285; A-97 a L-285 P-98 a L-
285;
K-99 a L-285; A-100 a L-285; G-101 a L-285; L-102 a L-285; E-103 a L- ■285; E-104 a L-285; A-105 a L-285; P-
106
a L-285: ; A-107 ' a L-285; V-108 a L-285; T-109 a L-285; A-1 10 a L-285; G- ■111 a L-285; L-112 ! L .-285; K-113 a L-
285; I-114 a L-285; F-115 a L-285; E-116 a L-285; P-117 a L-285; P-118 a L-285; A-119 a L-285; P-120 a L-285; G- 121 a L-285; E-122 a L-285; G-123 a L-285; N-124 a L-285; S-125 a L-285; S-126 a L-285; Q-127 a L-285; N-128 a L-285; S-129 a L-285; R-130 a L-285; N-131 a L-285; K-132 a L-285; R-133 a L-285; A-134 a L-285; V-135 a L-285; Q-136 a L-285; G-137 a L-285; P-138 a L-285; E-139 a L-285; E-140 a L-285; T-141 a L-285; V-142 a L-285; T-143 a L-285; Q-144 a L-285; D-145 a L-285; C-146 a L-285; L-147 a L-285; Q-148 a L-285; L-149 a L-285; 1-150 a L-285; A-151 a L-285; D-152 a L-285; S-153 a L-285; E-154 a L-285; T-155 a L-285; P-156 a L-285; T-157 a L-285; I-158 a L-285; Q-159 a L-285; K-160 a L-285; G-161 a L-285; S-162 a L-285; Y-163 a L-285; T-164 a L-285; F-165 a L-285; V-166 a L-285; P-167 a L-285; W-168 a L-285; L-169 a L-285; L-170 a L-285; S-171 a L-285; F-172 a L-285; K-173 a L-285; R-174 a L-285; G-175 a L-285; S-176 a L-285; A-177 a L-285; L-178 a L-285; E-179 a L-285; E-180 a L-285; K-181 a L-285; E-182 a L-285; N-183 a L-285; K-184 a L-285; I-185 a L-285; L-186 a L-285; V-187 a L-285; K-188 a L-285; E-189 a L-285; T-190 a L-285; G-191 a L-285; Y-192 a L-285; F-193 a L-285; F-194 a L-285; 1-195 a L-285; Y-196 a L-285; G-197 a L-285; Q-198 a L-285; V-199 a L-285; L-200 a L-285; Y-201 a L-285; T-202 a L-285; D-203 a L-285; K-204 a L-285; T-205 a L-285; Y-206 a L-285; A-207 a L-285; M-208 a L-285; G-209 a L-285; H-210 a L-285; L-211 a L-285; 1-212 a L-285; Q-213 a L-285; R-214 a L-285; K-215 a L-285; K-216 a L-285; V-217 a L-285; H-218 a L-285; V-219 a L-285; F-220 a L-285; G-221 a L-285; D-222 a L-285; E-223 a L-285; L-224 a L-285; S-225 a L-285; L-226 a L-285; V-227 a L-285; T-228 a L-285; L-229 a L-285; F-230 a L-285; R-231 a L-285; C-232 a L-285; 1-233 a L-285; Q-234 a L-285; N-235 a L-285; M-236 a L-285; P-237 a L-285; E-238 a L-285; T-239 a L-285; L-240 a L-285; P-241 a L-285; N-242 a L-285; N-243 a L-285; S-244 a L-285; C-245 a L-285; Y-246 a L-285; S-247 a L-285; A-248 a L-285; G-249 a L-285; 1-250 a L-285; A-251 a L-285; K-252 a L-285; L-253 a L-285; E-254 a L-285; E-255 a L-285; G-256 a L-285; D-257 a L-285; E-258 a L-285; L-259 a L-285; Q-260 a L-285; L-261 a L-285; A-262 a L-285; 1-263 a L-285; P-264 a L-285; R-265 a L-285; E-266 a L-285; N-267 a L-285; A-268 a L-285; Q-269 a L-285; 1-270 a L-285; S-271 a L-285; L-272 a L-285; D-273 a L-285; G-274 a L-285; D-275 a L-285; V-276 a L-285; T-277 a L-285; F-278 a L-285; F-279 a L-285; y G-280 a L-285 de la SEQ ID NO: 3228. La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia contigua de restos aminoaddicos con una identidad de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con la secuencia de aminoacidos de polipeptidos de BLyS descritos anteriormente.
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ejemplo, la actividad biologica) de la protema, todav^a pueden conservarse otras actividades funcionales. Por lo tanto, la capacidad de una mutema de BLyS acortada para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconozcan la forma madura o completa o el dominio extracelular del polipeptido se conservara generalmente cuando se eliminen menos de la mayona de los restos de la forma madura o completa o del dominio extracelular del polipeptido del extremo C- terminal. Puede determinarse facilmente por procedimientos de rutina descritos en el presente documento y conocidos de otro modo en la tecnica si un polipeptido particular que carece de restos C-terminales de un polipeptido completo conserva dichas actividades inmunologicas. No es improbable que una mutema de BLyS con un gran numero de restos aminoaddicos C-terminales delecionados pueda conservar ciertas actividades funcionales (por ejemplo, biologicas o inmunogenicas). De hecho, los peptidos compuestos por tan pocos como seis restos aminoaddicos de BLyS pueden provocar con frecuencia una respuesta inmune.
Por consiguiente, la presente memoria descriptiva describe ademas anticuerpos que se unen a polipeptidos que tienen uno o mas restos delecionados del extremo carboxi-terminal de la secuencia de aminoacidos de BLyS mostrada en la SEQ ID NO: 3228, hasta el resto de acido glutamico en posicion numero 6, y polinucleotidos que codifican dichos polipeptidos. En particular, la presente memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden la secuencia de aminoacidos de los restos 1-m3 de la SEQ ID NO: 3228, donde m3 es un numero entero en el intervalo de las posiciones aminoaddicas de los restos aminoaddicos 6-284 de la secuencia de aminoacidos en la SEQ ID NO: 3228.
Mas en particular, la memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en los restos M-1 a L-284; M-1 a K-283; M-1 a L-282; M-1 a A-281; M-1 a G-280; M-1 a F-279; M-1 a F-278; M-1 a T-277; M-1 a V-276; M-1 a D-275; M-1 a G-274; M-1 a D-273; M-1 a L-272; M-1 a S-271; M-1 a 1-270; M-1 a Q-269; M-1 a A-268; M-1 a N-267; M-1 a E-266; M-1 a R-265; M-1 a P-264; M-1 a 1-263; M-1 a A-262; M-1 a L-261; M-1 a Q-260; M-1 a L-259; M-1 a E-258; M-1 a D-257; M-1 a G-256; M-1 a E-255; M-1 a E-254; M-1 a L-253; M-1 a K-252; M-1 a A-251; M-1 a 1-250; M-1 a G-249; M-1 a A-248; M-1 a S-247; M-1 a Y-246; M-1 a C-245; M-1 a S-244; M-1 a N-243; M-1 a N-242; M-1 a P-241; M-1 a L-240; M-1 a T-239; M-1 a E-238; M-1 a P-237; M-1 a M-236; M-1 a N-235; M-1 a Q-234; M-1 a 1-233; M-1 a C-232; M-1 a R-231; M-1 a F-230; M-1 a L-229; M-1 a T-228; M-1 a V-227; M-1 a L-226; M-1 a S-225; M-1 a L-224; M-1 a E-223; M-1 a D-222; M-1 a G-221; M-1 a F-220; M-1 a V-219; M-1 a H-218; M-1 a V-217; M-1 a K-216; M-1 a K-215; M-1 a R-214; M-1 a Q-213; M-1 a 1-212; M-1 a L-211; M-1 a H-210; M-1 a G-209; M-1 a M-208; M-1 a A-207; M-1 a Y-206; M-1 a T-205; M-1 a K-204; M-1 a D-203; M-1 a T-202; M-1 a Y-201; M-1 a L-200; M-1 a V-199; M-1 a Q-198; M-1 a G-197; M-1 a Y-196; M-1 a I-195; M-1 a F-194; M-1 a F-193; M-1 a Y-192; M-1 a G-191; M-1 a T-190; M-1 a E-189; M-1 a K-188; M-1 a V-187; M-1 a L-186; M-1 a I-185; M-1 a K-184; M-1 a N-183; M-1 a E- 182; M-1 a K-181; M-1 a E-180; M-1 a E-179; M-1 a L-178; M-1 a A-177; M-1 a S-176; M-1 a G-175; M-1 a R-174; M- 1 a K-173; M-1 a F-172; M-1 a S-171; M-1 a L-170; M-1 a L-169; M-1 a W-168; M-1 a P-167; M-1 a V-166; M-1 a F- 165; M-1 a T-164; M-1 a Y-163; M-1 a S-162; M-1 a G-161; M-1 a K-160; M-1 a Q-159; M-1 a 1-158; M-1 a T-157; M- 1 a P-156; M-1 a T-155; M-1 a E-154; M-1 a S-153; M-1 a D-152; M-1 a A-151; M-1 a 1-150; M-1 a L-149; M-1 a Q- 148; M-1 a L-147; M-1 a C-146; M-1 a D-145; M-1 a Q-144; M-1 a T-143; M-1 a V-142; M-1 a T-141; M-1 a E-140; M- 1 a E-139; M-1 a P-138; M-1 a G-137; M-1 a Q-136; M-1 a V-135; M-1 a A-134; M-1 a R-133; M-1 a K-132; M-1 a N- 131; M-1 a R-130; M-1 a S-129; M-1 a N-128; M-1 a Q-127; M-1 a S-126; M-1 a S-125; M-1 a N-124; M-1 a G-123; M-1 a E-122; M-1 a G-121; M-1 a P-120; M-1 a A-119; M-1 a P-118; M-1 a P-117; M-1 a E-116; M-1 a F-115; M-1 a I- 114; M-1 a K-113; M-1 a L-112; M-1 a G-111; M-1 a A-110; M-1 a T-109; M-1 a V-108; M-1 a A-107; M-1 a P-106; M- 1 a A-105; M-1 a E-104; M-1 a E-103; M-1 a L-102; M-1 aG-101; M-1 a A-100; M-1 a K-99; M-1 a P-98; M-1 a A-97; M-1 a G-96; M-1 a A-95; M-1 a G-94; M-1 a A-93; M-1 a P-92; M-1 a L-91; M-1 a K-90; M-1 a E-89; M-1 a A-88; M-1 a H-87; M-1 a H-86; M-1 a G-85; M-1 a Q-84; M-1 a L-83; M-1 a E-82; M-1 a A-81; M-1 a R-80; M-1 a L-79; M-1 a S- 78; M-1 a A-77; M-1 a L-76; M-1 a D-75; M-1 a G-74; M-1 a Q-73; M-1 a L-72; M-1 a A-71; M-1 a A-70; M-1 a V-69; M-1 a Q-68; M-1 a Y-67; M-1 a F-66; M-1 a S-65; M-1 a V-64; M-1 a V-63; M-1 a T-62; M-1 a L-61; M-1 a C-60; M-1 a C-59; M-1 a S-58; M-1 a L-57; M-1 a L-56; M-1 a A-55; M-1 a L-54; M-1 a L-53; M-1 a L-52; M-1 a T-51; M-1 a A- 50; M-1 a A-49; M-1 a L-48; M-1 a L-47; M-1 a K-46; M-1 a G-45; M-1 a D-44; M-1 a K-43; M-1 a S-42; M-1 a S-41; M-1 a R-40; M-1 a V-39; M-1 a S-38; M-1 a P-37; M-1 a S-36; M-1 a E-35; M-1 a K-34; M-1 a R-33; M-1 a P-32; M-1 a L-31; M-1 a 1-30; M-1 a S-29; M-1 a V-28; M-1 a C-27; M-1 a E-26; M-1 a K-25; M-1 a L-24; M-1 a K-23; M-1 a M- 22; M-1 a E-21; M-1 a E-20; M-1 a R-19; M-1 a K-18; M-1 a K-17; M-1 a L-16; M-1 a C-15; M-1 a S-14; M-1 a T-13; M-1 a L-12; M-1 a R-11; M-1 a S-10; M-1 a Q-9; M-1 a E-8; M-1 a R-7; y M-1 a E-6 de la SEQ ID NO: 3228. La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia contigua de restos aminoaddicos con una identidad de al menos un 80%, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con la secuencia de aminoacidos de polipeptidos de BLyS descritos anteriormente.
La memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que tienen uno o mas aminoacidos delecionados de los extremos tanto amino- como carboxilo terminales de un polipeptido de BLyS, que puede describirse generalmente como que tiene los restos n3- m3 de la SEQ ID NO: 3228, donde n3 y m3 son numeros enteros como se han definido anteriormente.
Ademas, puesto que el dominio extracelular predicho del polipeptido de BLyS de la SEQ ID NO: 322 9 puede generar por sf mismo actividad funcional (por ejemplo, actividad biologica), las deleciones de restos aminoaddicos N- y C- terminales de la region extracelular predicha del polipeptido en las posiciones de Gln-73 a Leu-266 de la SEQ ID NO: 3229 pueden conservar cierta actividad funcional, tal como, por ejemplo, la union a ligando, la
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estimulacion de la proliferacion, diferenciacion y/o activacion de linfocitos (por ejemplo, linfocitos B), la modulacion de la replicacion celular, la modulacion de actividades de celulas diana y/o la inmunogenicidad. Sin embargo, incluso si la delecion de uno o mas aminoacidos del extremo N-terminal del dominio extracelular predicho de un polipeptido de BLyS da como resultado la modificacion o perdida de una o mas actividades funcionales del polipeptido, todavfa pueden conservarse otras actividades funcionales. Por lo tanto, la capacidad de los polipeptidos acortados para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconozcan los dominios extracelulares o maduros o completos de los polipeptidos se conservara generalmente cuando se eliminen menos de la mayona de los restos de los dominios extracelulares o maduros o completos de los polipeptidos del extremo N-terminal. Puede determinarse facilmente por procedimientos de rutina descritos en el presente documento y conocidos de otro modo en la tecnica si un polipeptido particular que carece de restos N-terminales de un polipeptido completo conserva dichas actividades inmunologicas.
Por consiguiente, la presente memoria descriptiva describe ademas anticuerpos que se unen a polipeptidos que tienen uno o mas restos delecionados del extremo amino-terminal de la secuencia de aminoacidos de BLyS mostrada en la SEQ ID NO: 3229, hasta el resto de glicina en el numero de posicion 261. En particular, la presente memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden la secuencia de aminoacidos de los restos n4-266 de la SEQ ID NO: 3229, donde n4 es un numero entero en el intervalo de las posiciones aminoaddicas de los restos aminoaddicos 73-261 de la secuencia de aminoacidos en la SEQ ID NO: 3229, y 261 es la posicion del primer resto del extremo N-terminal del polipeptido de BLyS del dominio extracelular predicho (mostrado en la SEQ ID NO: 3229).
Mas en particular, la memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en los restos de Q-73 a L-266; G-74 a L-266; D-75 a L-266; L-76 a L-266; A-77 a L-266; S-78 a L-266; L-79 a L-266; R-80 a L-266; A- 81 a L-266; E-82 a L-266; L-83 a L-266; Q-84 a L-266; G-85 a L-266; H-86 a L-266; H-87 a L-266; A-88 a L-266; E- 89 a L-266; K-90 a L-266; L-91 a L-266; P-92 a L-266; A-93 a L-266; G-94 a L-266; A-95 a L-266; G-96 a L-266; A-97 a L-266; P-98 a L-266; K-99 a L-266; A-100 a L-266; G-101 a L-266; L-102 a L-266; E-103 a L-266; E-104 a L-266; A-105 a L-266; P-106 a L-266; A-107 a L-266; V-108 a L-266; T-109 a L-266; A-110 a L-266; G-111 a L-266; L-112 a L-266; K-113 a L-266; I-114 a L-266; F-115 a L-266; E-116 a L-266; P-117 a L-266; P-118 a L-266; A-119 a L-266; P120 a L-266; G-121 a L-266; E-122 a L-266; G-123 a L-266; N-124 a L-266; S-125 a L-266; S-126 a L-266; Q-127 a L-266; N-128 a L-266; S-129 a L-266; R-130 a L-266; N-131 a L-266; K-132 a L-266; R-133 a L-266; A-134 a L-266; V-135 a L-266; Q-136 a L-266; G-137 a L-266; P-138 a L-266; E-139 a L-266; E-140 a L-266; T-141 a L-266; G-142 a L-266; S-143 a L-266; Y-144 a L-266; T-145 a L-266; F-146 a L-266; V-147 a L-266; P-148 a L-266; W-149 a L- 266; L-150 a L-266; L-151 a L-266; S-152 a L-266; F-153 a L-266; K-154 a L-266; R-155 a L-266; G-156 a L-266; S- 157 a L-266; A-158 a L-266; L-159 a L-266; E-160 a L-266; E-161 a L-266; K-162 a L-266; E-163 a L-266; N-164 a L- 266; K-165 a L-266; 1-166 a L-266; L-167 a L-266; V-168 a L-266; K-169 a L-266; E-170 a L-266; T-171 a L-266; G- 172 a L-266; Y-173 a L-266; F-174 a L-266; F-175 a L-266; 1-176 a L-266; Y-177 a L-266; G-178 a L-266; Q-179 a L- 266; V-180 a L-266; L-181 a L-266; Y-182 a L-266; T-183 a L-266; D-184 a L-266; K-185 a L-266; T-186 a L-266; Y- 187 a L-266; A-188 a L-266; M-189 a L-266; G-190 a L-266; H-191 a L-266; L-192 a L-266; I-193 a L-266; Q-194 a L- 266; R-195 a L-266; K-196 a L-266; K-197 a L-266; V-198 a L-266; H-199 a L-266; V-200 a L-266; F-201 a L-266; G- 202 a L-266; D-203 a L-266; E-204 a L-266; L-205 a L-266; S-206 a L-266; L-207 a L-266; V-208 a L-266; T-209 a L- 266; L-210 a L-266; F-211 a L-266; R-212 a L-266; C-213 a L-266; 1-214 a L-266; Q-215 a L-266; N-216 a L-266; M- 217 a L-266; P-218 a L-266; E-219 a L-266; T-220 a L-266; L-221 a L-266; P-222 a L-266; N-223 a L-266; N-224 a L- 266; S-225 a L-266; C-226 a L-266; Y-227 a L-266; S-228 a L-266; A-229 a L-266; G-230 a L-266; 1-231 a L-266; A- 232 a L-266; K-233 a L-266; L-234 a L-266; E-235 a L-266; E-236 a L-266; G-237 a L-266; D-238 a L-266; E-239 a L-266; L-240 a L-266; Q-241 a L-266; L-242 a L-266; A-243 a L-266; 1-244 a L-266; P-245 a L-266; R-246 a L-266; E-247 a L-266; N-248 a L-266; A-249 a L-266; Q-250 a L-266; 1-251 a L-266; S-252 a L-266; L-253 a L-266; D-254 a L-266; G-255 a L-266; D-256 a L-266; V-257 a L-266; T-258 a L-266; F-259 a L-266; F-260 a L-266; y G-261 a L-266 de la SEQ ID NO: 3229. La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia contigua de restos aminoaddicos con una identidad de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con la secuencia de aminoacidos de polipeptidos de BLyS descritos anteriormente.
De forma similar, las deleciones de restos aminoaddicos C-terminales del dominio extracelular predicho de BLyS hasta el resto de leucina en posicion 79 de la SEQ ID NO: 3229 pueden conservar cierta actividad funcional, tal como, por ejemplo, la union a ligando, la capacidad para estimular la proliferacion, diferenciacion y/o activacion de linfocitos (por ejemplo, linfocitos B), la modulacion de la replicacion celular, la modulacion de actividades de celulas diana y/o la inmunogenicidad. No se esperana que los polipeptidos que tengan deleciones C-terminales adicionales que incluyan la Leu-79 de la SEQ ID NO: 3229 conserven sus actividades biologicas.
Sin embargo, incluso si la delecion de uno o mas aminoacidos del extremo C-terminal de un polipeptido da como resultado la modificacion o perdida de una o mas actividades funcionales (por ejemplo, la actividad biologica) del polipeptido, todavfa pueden conservarse otras actividades funcionales. Por lo tanto, la capacidad del polipeptido acortado para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconozcan las formas completa, madura o extracelular del polipeptido se conservara generalmente cuando se eliminen menos de la mayona de los restos de las formas completa, madura o extracelular del polipeptido del extremo C-terminal. Puede determinarse facilmente por procedimientos de rutina descritos en el presente documento y conocidos de otro modo en la tecnica si un
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polipeptido particular que carece de restos C-terminales del dominio extracelular predicho conserva dichas actividades inmunologicas.
Por consiguiente, la presente memoria descriptiva describe ademas anticuerpos que se unen a polipeptidos que tienen uno o mas restos del extremo carboxi-terminal de la secuencia de aminoacidos del dominio extracelular predicho de BLyS mostrada en la SEQ ID NO: 3229, hasta el resto de leucina en la posicion 79 de la SEQ ID NO: 3229. En particular, la presente invencion proporciona anticuerpos que se unen a polipeptidos que tienen la secuencia de aminoacidos de los restos 73-m4 de la secuencia de aminoacidos de la sEq ID NO: 3229, donde m4 es cualquier numero entero en el intervalo de las posiciones aminoaddicas de los restos aminoaddicos 79-265 de la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3229.
Mas en particular, la memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en los restos de Q-73 a L-265; Q-73 a K-264; Q-73 a L-263; Q-73 a A-262; Q-73 a G-261; Q-73 a F-260; Q-73 a F-259; Q-73 a T-258; Q-73 a V-257; Q-73 a D-256; Q-73 a G-255; Q-73 a D-254; Q-73 a L-253; Q-73 a S-252; Q-73 a 1-251; Q-73 a Q- 250; Q-73 a A-249; Q-73 a N-248; Q-73 a E-247; Q-73 a R-246; Q-73 a P-245; Q-73 a 1-244; Q-73 a A-243; Q-73 a L-242; Q-73 a Q-241; Q-73 a L-240; Q-73 a E-239; Q-73 a D-238; Q-73 a G-237; Q-73 a E-236; Q-73 a E-235; Q-73 a L-234; Q-73 a K-233; Q-73 a A-232; Q-73 a 1-231; Q-73 a G-230; Q-73 a A-229; Q-73 a S-228; Q-73 a Y-227; Q- 73 a C-226; Q-73 a S-225; Q-73 a N-224; Q-73 a N-223; Q-73 a P-222; Q-73 a L-221; Q-73 a T-220; Q-73 a E-219; Q-73 a P-218; Q-73 a M-217; Q-73 a N-216; Q-73 a Q-215; Q-73 a 1-214; Q-73 a C-213; Q-73 a R-212; Q-73 a F- 211; Q-73 a L-210; Q-73 a T-209; Q-73 a V-208; Q-73 a L-207; Q-73 a S-206; Q-73 a L-205; Q-73 a E-204; Q-73 a D-203; Q-73 a G-202; Q-73 a F-201; Q-73 a V-200; Q-73 a H-199; Q-73 a V-198; Q-73 a K-197; Q-73 a K-196; Q-73 a R-195; Q-73 a Q-194; Q-73 a 1-193; Q-73 a L-192; Q-73 a H-191; Q-73 a G-190; Q-73 a Q-7389; Q-73 a A-188; Q- 73 a Y-187; Q-73 a T-186; Q-73 a K-185; Q-73 a D-184; Q-73 a T-183; Q-73 a Y-182; Q-73 a L-181; Q-73 a V-180; Q-73 a Q-179; Q-73 a G-178; Q-73 a Y-177; Q-73 a 1-176; Q-73 a F-175; Q-73 a F-174; Q-73 a Y-173; Q-73 a G- 172; Q-73 a T-171; Q-73 a E-170; Q-73 a K-169; Q-73 a V-168; Q-73 a L-167; Q-73 a 1-166; Q-73 a K-165; Q-73 a N-164; Q-73 a E-163; Q-73 a K-162; Q-73 a E-161; Q-73 a E-160; Q-73 a L-159; Q-73 a A-158; Q-73 a S-157; Q-73 a G-156; Q-73 a R-155; Q-73 a K-154; Q-73 a F-153; Q-73 a S-152; Q-73 a L-151; Q-73 a L-150; Q-73 a W-149; Q- 73 a P-148; Q-73 a V-147; Q-73 a F-146; Q-73 a T-145; Q-73 a Y-144; Q-73 a S-143; Q-73 a G-142; Q-73 a T-141; Q-73 a E-140; Q-73 a E-139; Q-73 a P-138; Q-73 a G-137; Q-73 a Q-136; Q-73 a V-135; Q-73 a A-134; Q-73 a R- 133; Q-73 a K-132; Q-73 a N-131; Q-73 a R-130; Q-73 a S-129; Q-73 a N-128; Q-73 a Q-127; Q-73 a S-126; Q-73 a S-125; Q-73 a N-124; Q-73 a G-123; Q-73 a E-122; Q-73 a G-121; Q-73 a P-120; Q-73 a A-119; Q-73 a P-118; Q-73 a P-117; Q-73 a E-116; Q-73 a F-115; Q-73 a I-114; Q-73 a K-113; Q-73 a L-112; Q-73 a G-111; Q-73 a A-110; Q-73 a T-109; Q-73 a V-108; Q-73 a A-107; Q-73 a P-106; Q-73 a A-105; Q-73 a E-104; Q-73 a E-103; Q-73 a L-102; Q- 73 a G-101; Q-73 a A-100; Q-73 a K-99; Q-73 a P-98; Q-73 a A-97; Q-73 a G-96; Q-73 a A-95; Q-73 a G-94; Q-73 a A-93; Q-73 a P-92; Q-73 a L-91; Q-73 a K-90; Q-73 a E-89; Q-73 a A-88; Q-73 a H-87; Q-73 a H-86; Q-73 a G-85; Q- 73 a Q-84; Q-73 a L-83; Q-73 a E-82; Q-73 a A-81; Q-73 a R-80; Q-73 a L-79; and Q-73 a S-78 de la SEQ ID NO: 3229. La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia contigua de restos aminoaddicos con una identidad de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con la secuencia de aminoacidos de polipeptidos de BLyS descritos anteriormente.
La memoria descriptiva tambien describe polipeptidos que tienen uno o mas aminoacidos delecionados tanto del extremo amino como carboxilo terminal del dominio extracelular predicho de BLyS, que pueden describirse generalmente como que tienen los restos n4-m4 de la SEQ ID NO: 3229, donde n4 y m4 son numeros enteros como se han definido anteriormente.
En otro aspecto, los anticuerpos de la presente invencion se unen a polipeptidos que consisten en una porcion del dominio extracelular de la secuencia de aminoacidos de BLyS codificada por el clon de ADNc contenido en el deposito que tiene el N.° de acceso de la ATCC 203518, en los que esta porcion excluye de 1 a aproximadamente 260 aminoacidos del extremo amino-terminal del dominio extracelular de la secuencia de aminoacidos codificada por el clon de ADNc contenido en el deposito que tiene el N.° de acceso de la ATCC 203518, o de 1 a aproximadamente 187 aminoacidos del extremo carboxi-terminal del dominio extracelular de la secuencia de aminoacidos codificada por el clon de ADNc contenido en el deposito que tiene el N.° de acceso de la ATCC 203518, o cualquier combinacion de las deleciones amino- terminales y carboxi-terminales anteriores, del dominio extracelular completo de la secuencia de aminoacidos codificada por el clon de ADNc contenido en el deposito que tiene el N.° de acceso de la ATCC 203518.
Como se ha mencionado anteriormente, incluso si la delecion de uno o mas aminoacidos del extremo N-terminal de un polipeptido da como resultado la modificacion o perdida de una o mas actividades funcionales (por ejemplo, la actividad biologica) del polipeptido, todavfa pueden conservarse otras actividades funcionales. Por lo tanto, la capacidad de un polipeptido de BLyS acortado para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconozcan las formas madura o de longitud completa o el dominio extracelular del polipeptido se conservara generalmente cuando se eliminen menos de la mayona de los restos del dominio extracelular o forma madura o de longitud completa del polipeptido del extremo N-terminal. Puede determinarse facilmente por procedimientos de rutina descritos en el presente documento y conocidos de otro modo en la tecnica si un polipeptido particular que carece de restos N- terminales de un polipeptido completo conserva dichas actividades inmunologicas. No es improbable que una
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mutema de BLyS con un gran numero de restos aminoaddicos N-terminales delecionados pueda conservar actividades funcionales (por ejemplo, inmunogenicas). De hecho, los peptidos compuestos por tan pocos como seis restos aminoaddicos de BLyS pueden provocar con frecuencia una respuesta inmune.
En consecuencia, la presente memoria descriptiva describe ademas anticuerpos que se unen a polipeptidos que tienen uno o mas restos delecionados del extremo amino-terminal de la secuencia de aminoacidos de longitud completa predicha del polipeptido de BLyS mostrada en la SEQ ID NO: 3229, hasta el resto de glicina en el numero de posicion 261 de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 3229, y polinucleotidos que codifican dichos polipeptidos. En particular, la presente memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden la secuencia de aminoacidos de los restos n5-266 de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 3229, donde n5 es un numero entero en el intervalo de las posiciones aminoaddicas de los restos aminoaddicos I a 261 de la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3229.
Mas en particular, la memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o
alternativamente consisten
en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en los restos de
D-2
a L-266 ; D-3 a L-266; S-4 a L-266; T-5 a L- 266; E-6 a L-266; R-7 a L-266; E-8 a L-266; Q-9 a L-266 S-10 a L-
266;
R-11 a L-266; L-12 a L-266; T-13 a L-266; S-14 a L-266; C-15 a L-266; L-16 a L-266; K-17 a L-266; K-18 a L-
266;
R-19 a L-266; E-20 a L-266; E-21 a L-266; M-22 a L-266; K-23 a L-266; L-24 a L-266 K-25 a L-266 E-26 a L-
266;
C-27 a L-266; V-28 a L-266; S-29 a L-266; 1-30 a L-266; L-31 a L-266; P-32 a L-266; R-33 a L-266; K-34 a L-
266;
E-35 a L-266; S-36 a L-266; P-37 a L-266; S-38 a L-266; V-39 a L-266; R-40 a L-266; S-41 a L-266 S-42 a L-
266;
K-43 a L-266; D-44 a L-266; G-45 a L-266 ; K-46 a L-266: ; L-47 a L-266; L-48 a L-266; A-49 a L-266; A-50 a L-
266;
T-51 a L-266; L-52 a L-266; L-53 a L-266; L-54 a L-266; A-55 a L-266; L-56 a L-266; L-57 a L-266; S-58 a L-
266;
C-59 a L-266; C-60 a L-266; L-61 a L-266; T-62 a L-266; V-63 a L-266; V-64 a L-266; S-65 a L-266 F-66 a L-
266;
Y-67 a L-266; Q-68 a L-266; V-69 a L-266; A-70 a L-266; A-71 a L-266; L-72 a L-266; Q-73 a L-266; G-74 a L-
266;
D-75 a L-266; L-76 a L-266; A-77 a L-266; S-78 a L-266; L-79 a L-266; R-80 a L-266; A-81 a L-266; E-82 a L-
266;
L-83 a L-266; Q-84 a L-266; G-85 a L-266; H-86 a L-266; H-87 a L-266; A-88 a L-266: ; E-89 a L-266 ; K-90 a L-
266;
L-91 a L-266; P-92 a L-266; A-93 a L-266; G-94 a L-266; A-95 a L-266; G-96 a L-266; A-97 a L-266 P-98 a L-
266;
K-99 a L-266; A-100 i a L-266; G-101 a L-266; L-102 a L-266; E-103 a L- ■266; E-104 a L-266 A-105 a L-266; P-
106
a L-266 ; A-107 ' a L-266; V-108 a L-266; T-109 a L-266; A-1 10 a L-266; G- ■111 a L-266; L-112 a L -266; K-113 a L-
266; I-114 a L-266; F-115 a L-266; E-116 a L-266; P-117 a L-266; P-118 a L-266; A-119 a L-266; P-120 a L-266; G- 121 a L-266; E-122 a L-266; G-123 a L-266; N-124 a L-266; S-125 a L-266; S-126 a L-266; Q-127 a L-266; N-128 a L-266; S-129 a L-266; R-130 a L-266; N-131 a L-266; K-132 a L-266; R-133 a L-266; A-134 a L-266; V-135 a L-266; Q-136 a L-266; G-137 a L-266; P-138 a L-266; E-139 a L-266; E-140 a L-266; T-141 a L-266; G-142 a L-266; S-143 a L-266; Y-144 a L-266; T-145 a L-266; F-146 a L-266; V-147 a L-266; P-148 a L-266; W-149 a L-266; L-150 a L- 266; L-151 a L-266; S-152 a L-266; F-153 a L-266; K-154 a L-266; R-155 a L-266; G-156 a L-266; S-157 a L-266; A- 158 a L-266; L-159 a L-266; E-160 a L-266; E-161 a L-266; K-162 a L-266; E-163 a L-266; N-164 a L-266; K-165 a L- 266; I-166 a L-266; L-167 a L-266; V-168 a L-266; K-169 a L-266; E-170 a L-266; T-171 a L-266; G-172 a L-266; Y- 173 a L-266; F-174 a L-266; F-175 a L-266; I-176 a L-266; Y-177 a L-266; G-178 a L-266; Q-179 a L-266; V-180 a L- 266; L-181 a L-266; Y-182 a L-266; T-183 a L-266; D-184 a L-266; K-185 a L-266; T-186 a L-266; Y-187 a L-266; A- 188 a L-266; M-189 a L-266; G-190 a L-266; H-191 a L-266; L-192 a L-266; I-193 a L-266; Q-194 a L-266; R-195 a L- 266; K-196 a L-266; K-197 a L-266; V-198 a L-266; H-199 a L-266; V-200 a L-266; F-201 a L-266; G-202 a L-266; D- 203 a L-266; E-204 a L-266; L-205 a L-266; S-206 a L-266; L-207 a L-266; V-208 a L-266; T-209 a L-266; L-210 a L- 266; F-211 a L-266; R-212 a L-266; C-213 a L-266; 1-214 a L-266; Q-215 a L-266; N-216 a L-266; M-217 a L-266; P218 a L-266; E-219 a L-266; T-220 a L-266; L-221 a L-266; P-222 a L-266; N-223 a L-266; N-224 a L-266; S-225 a L- 266; C-226 a L-266; Y-227 a L-266; S-228 a L-266; A-229 a L-266; G-230 a L-266; 1-231 a L-266; A-232 a L-266; K- 233 a L-266; L-234 a L-266; E-235 a L-266; E-236 a L-266; G-237 a L-266; D-238 a L-266; E-239 a L-266; L-240 a L- 266; Q-241 a L-266; L-242 a L-266; A-243 a L-266; 1-244 a L-266; P-245 a L-266; R-246 a L-266; E-247 a L-266; N- 248 a L-266; A-249 a L-266; Q-250 a L-266; 1-251 a L-266; S-252 a L-266; L-253 a L-266; D-254 a L-266; G-255 a L-266; D-256 a L-266; V-257 a L-266; T-258 a L-266; F-259 a L-266; F-260 a L-266; y G-261 a L-266 de la SEQ ID NO: 3229. La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia contigua de restos aminoaddicos con una identidad de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con la secuencia de aminoacidos de polipeptidos de BLyS descritos anteriormente.
Tambien como se ha mencionado anteriormente, incluso si la delecion de uno o mas aminoacidos del extremo C- terminal de una protema da como resultado la modificacion o perdida de una o mas actividades funcionales (por ejemplo, actividades biologicas) de la protema, todavfa pueden conservarse otras actividades funcionales. Por lo tanto, la capacidad de una mutema de BLyS acortada para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconozcan la forma completa o madura o el dominio extracelular del polipeptido se conservara generalmente cuando se eliminen menos de la mayona de los restos de la forma completa o madura o del dominio extracelular del polipeptido del extremo C- terminal. Puede determinarse facilmente por procedimientos de rutina descritos en el presente documento y conocidos de otro modo en la tecnica si un polipeptido particular que carece de restos C-terminales de un polipeptido completo conserva dichas actividades inmunologicas. No es improbable que una mutema de BLyS con un gran numero de restos aminoaddicos C-terminales delecionados pueda conservar ciertas actividades funcionales (por ejemplo, inmunogenicas). De hecho, los peptidos compuestos por tan pocos como seis restos aminoaddicos de BLyS pueden provocar con frecuencia una respuesta inmune.
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Por consiguiente, la presente memoria descriptiva describe ademas anticuerpos que se unen a polipeptidos que tienen uno o mas restos delecionados del extremo carboxi-terminal de la secuencia de aminoacidos de BLyS mostrada en la SEQ ID NO: 3229, hasta el resto de acido glutamico en el numero de posicion 6, y polinucleotidos que codifican dichos polipeptidos. En particular, la presente invencion proporciona anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden la secuencia de aminoacidos de los restos 1-m5 de la SEQ ID NO: 3229, donde m5 es un numero entero en el intervalo de las posiciones aminoaddicas de los restos aminoaddicos 6 a 265 en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3229.
Mas en particular, la memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en los restos de M-1 a L-265; M-1 a K-264; M-1 a L-263; M-1 a A-262; M-1 a G-261; M-1 a F-260; M-1 a F-259; M-1 a T-258; M-1 a V-257; M-1 a D-256; M-1 a G-255; M-1 a D-254; M-1 a L-253; M-1 a S-252; M-1 a 1-251; M-1 a Q-250; M-1 a A-249; M-1 a N-248; M-1 a E-247; M-1 a R-246; M-1 a P-245; M-1 a I-244; M-1 a A-243; M-1 a L-242; M-1 a Q-241; M-1 a L- 240; M-1 a E-239; M-1 a D-238; M-1 a G-237; M-1 a E-236; M-1 a E-235; M-1 a L-234; M-1 a K-233; M-1 a A-232; M- 1 a I-231; M-1 a G-230; M-1 a A-229; M-1 a S-228; M-1 a Y-227; M-1 a C-226; M-1 a S-225; M-1 a N-224; M-1 a N- 223; M-1 a P-222; M-1 a L-221; M-1 a T-220; M-1 a E-219; M-1 a P-218; M-1 a M-217; M-1 a N-216; M-1 a Q-215; M-1 a 1-214; M-1 a C-213; M-1 a R-212; M-1 a F-211; M-1 a L-210; M-1 a T-209; M-1 a V-208; M-1 a L-207; M-1 a S- 206; M-1 a L-205; M-1 a E-204; M-1 a D-203; M-1 a G-202; M-1 a F-201; M-1 a V-200; M-1 a H-199; M-1 a V-198; M-

1 a K-197; M-1 a K-196; M-1 a R-195; M-1 a Q-194; M-1 a 1-193; M-1 a L-192; M-1 a H-191; M-1 a G-190; M-1 a M-

189; M-1 a A-188; M-1 a Y-187; M-1 a T-186; M-1 a K-185; M-1 a D-184; M-1 a T-183; M-1 a Y-182; M-1 aL-181; M-

1 a V-180; M-1 a Q-179; M-1 a G-178; M-1 a Y-177; M-1 a 1-176; M-1 a F-175; M-1 a F-174; M-1 a Y-173; M-1 a G-
172; M-1 a T-171; M-1 a E-170; M-1 a K-169; M-1 a V-168; M-1 a L-167; M-1 a I-166; M-1 a K-165; M-1 a N-164; M-1 a E-163; M-1 a K-162; M-1 a E-161; M-1 a E-160; M-1 a L-159; M-1 a A-158; M-1 a S-157; M-1 a G-156; M-1 a R- 155; M-1 a K-154; M-1 a F-153; M-1 a S-152; M-1 a L-151; M-1 a L-150; M-1 a W-149; M-1 a P-148; M-1 a V-147; M- 1 a F-146; M-1 a T-145; M-1 a Y-144; M-1 a S-143; M-1 a G-142; M-1 a T-141; M-1 a E-140; M-1 a E-139; M-1 a P138; M-1 a G-137; M-1 a Q-136; M-1 a V-135; M-1 a A-134; M-1 a R-133; M-1 a K-132; M-1 a N-131; M-1 a R-130; M-1 a S-129; M-1 a N-128; M-1 a Q-127; M-1 a S-126; M-1 a S-125; M-1 a N-124; M-1 a G-123; M-1 a E-122; M-1 a G-121; M-1 a P-120; M-1 a A-119; M-1 a P-118; M-1 a P-117; M-1 a E-116; M-1 a F-115; M-1 a 1-114; M-1 a K-113; M-1 a L-112; M-1 a G-111; M-1 a A-110; M-1 a T-109; M-1 a V-108; M-1 a A-107; M-1 a P-106; M-1 a A-105; M-1 a E-104; M-1 a E-103; M-1 a L-102; M-1 a G-101; M-1 a A-100; M-1 a K-99; M-1 a P-98; M-1 a A-97; M-1 a G-96; M-1 a A-95; M-1 a G-94; M-1 a A-93; M-1 a P-92; M-1 a L-91; M-1 a K-90; M-1 a E-89; M-1 a A-88; M-1 a H-87; M-1 a H- 86; M-1 a G-85; M-1 a Q-84; M-1 a L-83; M-1 a E-82; M-1 a A-81; M-1 a R-80; M-1 a L-79; M-1 a S-78; M-1 a A-77; M-1 a L-76; M-1 a D-75; M-1 a G-74; M-1 a Q-73; M-1 a L-72; M-1 a A-71; M-1 a A-70; M-1 a V-69; M-1 a Q-68; M-1 a Y-67; M-1 a F-66; M-1 a S-65; M-1 a V-64; M-1 a V-63; M-1 a T-62; M-1 a L-61; M-1 a C-60; M-1 a C-59; M-1 a S- 58; M-1 a L-57; M-1 a L-56; M-1 a A-55; M-1 a L-54; M-1 a L-53; M-1 a L-52; M-1 a T-51; M-1 a A-50; M-1 a A-49; M- 1 a L-48; M-1 a L-47; M-1 a K-46; M-1 a G-45; M-1 a D-44; M-1 a K-43; M-1 a S-42; M-1 a S-41; M-1 a R-40; M-1 a V-39; M-1 a S-38; M-1 a P-37; M-1 a S-36; M-1 a E-35; M-1 a K-34; M-1 a R-33; M-1 a P-32; M-1 a L-31; M-1 a 1-30; M-1 a S-29; M-1 a V-28; M-1 a C-27; M-1 a E-26; M-1 a K-25; M-1 a L-24; M-1 a K-23; M-1 a M-22; M-1 a E-21; M-1 a E-20; M-1 a R-19; M-1 a K-18; M-1 a K-17; M-1 a L-16; M-1 a C-15; M-1 a S-14; M-1 a T-13; M-1 a L-12; M-1 a R- 11; M-1 a S-10; M-1 a Q-9; M-1 a E-8; M-1 a R-7; y M-1 a E-6 de la SEQ ID NO: 3229. La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia contigua de restos aminoaddicos con una identidad de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con la secuencia de aminoacidos de polipeptidos de BLyS descritos anteriormente.
La memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que tienen uno o mas aminoacidos delecionados tanto del extremo amino como carboxilo terminal de un polipeptido de BLyS, que puede describirse en general que tienen los restos n5-m5 de la SEQ ID NO: 3229, donde n5 y m5 son numeros enteros como se han definido anteriormente.
La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden la secuencia de aminoacidos de los restos 134-m6 de la SEQ ID NO: 3228, donde m6 es un numero entero de 140 a 285, correspondiente a la posicion del resto aminoaddico de la SEQ ID NO: 3228. Por ejemplo, la memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en los restos de A-134 a Leu-285; A-134 a Leu-285; A-134 a L-284; A-134 a K-283; A-134 a L-282; A-134 a A-281; A-134 a G-280; A-134 a F-279; A-134 a F-278; A-134 a T-277; A-134 a V-276; A-134 a D-275; A-134 a G-274; A-134 a D-273; A-134 a L-272; A-134 a S-271; A-134 a 1270; A-134 a Q-269; A-134 a A-268; A-134 a N-267; A-134 a E-266; A-134 a R-265; A-134 a P-264; A-134 a 1-263; A-134 a A-262; A-134 a L-261; A-134 a Q-260; A-134 a L-259; A-134 a E-258; A-134 a D-257; A-134 a G-256; A-134 a E-255; A-134 a E-254; A-134 a L-253; A-134 a K-252; A-134 a A-251; A-134 a I-250; A-134 a G-249; A-134 a A- 248; A-134 a S-247; A-134 a Y-246; A-134 a C-245; A-134 a S-244; A-134 a N-243; A-134 a N-242; A-134 a P-241; A-134 a L-240; A-134 a T-239; A-134 a E-238; A-134 a P-237; A-134 a M-236; A-134 a N-235; A-134 a Q-234; A-134 a 1-233; A-134 a C-232; A-134 a R-231; A-134 a F-230; A-134 a L-229; A-134 a T-228; A-134 a V-227; A-134 a L- 226; A-134 a S-225; A-134 a L-224; A-134 a E-223; A-134 a D-222; A-134 a G-221; A-134 a F-220; A-134 a V-219; A-134 a H-218; A-134 a V-217; A-134 a K-216; A-134 a K-215; A-134 a R-214; A-134 a Q-213; A-134 a 1-212; A-134 a L-211; A-134 a H-210; A-134 a G-209; A-134 a M-208; A-134 a A-207; A-134 a Y-206; A-134 a T-205; A-134 a K-
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204; A-134 a D-203; A-134 a T-202; A-134 a Y-201; A-134 a L-200; A-134 a V-199; A-134 a Q-198; A-134 a G-197; A-134 a Y-196; A-134 a I-195; A-134 a F-194; A-134 a F-193; A-134 a Y-192; A-134 a G-191; A-134 a T-190; A-134 a E-189; A-134 a K-188; A-134 a V-187; A-134 a L-186; A-134 a 1-185; A-134 a K-184; A-134 a N-183; A-134 a E- 182; A-134 a K-181; A-134 a E-180; A-134 a E-179; A-134 a L-178; A-134 a A-177; A-134 a S-176; A-134 a G-175; A-134 a R-174; A-134 a K-173; A-134 a F-172; A-134 a S-171; A-134 a L-170; A-134 a L-169; A-134 a W-168; A-134 a P-167; A-134 a V-166; A-134 a F-165; A-134 a T-164; A-134 a Y-163; A-134 a S-162; A-134 a G-161; A-134 a K- 160; A-134 a Q-159; A-134 a 1-158; A-134 a T-157; A-134 a P-156; A-134 a T-155; A-134 a E-154; A-134 a S-153; A-134 a D-152; A-134 a A-151; A-134 a 1-150; A-134 a L-149; A-134 a Q-148; A-134 a L-147; A-134 a C-146; A-134 a D-145; A-134 a Q-144; A-134 a T-143; A-134 a V-142; A-134 a T-141; y A-134 a E-140 de la SEQ ID NO: 3228. La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia contigua de restos aminoaddicos con una identidad de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con la secuencia de aminoacidos de polipeptidos de BLyS descritos anteriormente.
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden unirse tambien a fragmentos polipeptidicos que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en los restos: M-1 a C-15; D-2 a L-16; D-3 a K-17; S-4 a K-18; T-5 a R-19; E-6 a E-20; R-7 a E-21; E-8 a M-22; Q-9 a K-23; S-10 a L-24; R-11 a K-25; L-12 a E-26; T-13 a C-27; S-14 a V-28; C-15 a S-29; L-16 a 1-30; K-17 a L-31; K-18 a P-32; R-19 a R-33; E-20 a K-34; E-21 a E-35; M-22 a S-36; K-23 a P-37; L-24 a S-38; K-25 a V-39; E-26 a R-40; C- 27 a S-41; V-28 a S-42; S-29 a K-43; 1-30 a D-44; L-31 a G-45; P-32 a K-46; R-33 a L-47; K-34 a L-48; E-35 a A-49; S-36 a A-50; P-37 a T-51; S-38 a L-52; V-39 a L-53; R-40 a L-54; S-41 a A-55; S-42 a L-56; K-43 a L-57; D-44 a S- 58; G-45 a C-59; K-46 a C-60; L-47 a L-61; L-48 a T-62; A-49 a V-63; A-50 a V-64; T-51 a S-65; L-52 a F-66; L-53 a Y-67; L-54 a Q-68; A-55 a V-69; L-56 a A-70; L-57 a A-71; S-58 a L-72; C-59 a Q-73; C-60 a G-74; L-61 a D-75; T-62 a L-76; V-63 a A-77; V-64 a S-78; S-65 a L-79; F-66 a R-80; Y-67 a A-81; Q-68 a E-82; V-69 a L-83; A-70 a Q-84; A- 71 a G-85; L-72 a H-86; Q-73 a H-87; G-74 a A-88; D-75 a E-89; L-76 a K-90; A-77 a L-91; S-78 a P-92; L-79 a A-93; R-80 a G-94; A-81 a A-95; E-82 a G-96; L-83 a A-97; Q-84 a P-98; G-85 a K-99; H-86 a A-100; H-87 a G-101; A-88 a L-102; E-89 a E-103; K-90 a E-104; L-91 a A-105; P-92 a P-106; A-93 a A-107; G-94 a V-108; A-95 a T-109; G-96 a A-110; A-97 a G-111; P-98 a L-112; K-99 a K-113; A-100 a I-114; G-101 a F-115; L-102 a E-116; E-103 a P-117; E- 104 a P-118; A-105 a A-119; P-106 a P-120; A-107 a G-121; V-108 a E-122; T-109 a G-123; A-110 a N-124; G-111 a S-125; L-112 a S-126; K-113 a Q-127; I-114 a N-128; F-115 a S-129; E-116 a R-130; P-117 a N-131; P-118 a K-132; A-119 a R-133; P-120 a A-134; G-121 a V-135; E-122 a Q-136; G-123 a G-137; N-124 a P-138; S-125 a E-139; S- 126 a E-140; Q-127 a T-141; N-128 a V-142; S-129 a T-143; R-130 a Q-144; N-131 a D-145; K-132 a C-146; R-133 a L-147; A-134 a Q-148; V-135 a L-149; Q-136 a 1-150; G-137 a A-151; P-138 a D-152; E-139 a S-153; E-140 a E- 154; T-141 a T-155; V-142 a P-156; T-143 a T-157; Q-144 a 1-158; D-145 a Q-159; C-146 a K-160; L-147 a G-161; Q-148 a S-162; L-149 a Y-163; 1-150 a T-164; A-151 a F-165; D-152 a V-166; S-153 a P-167; E-154 a W-168; T-155 a L-169; P-156 a L-170; T-157 a S-171; 1-158 a F-172; Q-159 a K-173; K-160 a R-174; G-161 a G-175; S-162 a S- 176; Y-163 a A-177; T-164 a L-178; F-165 a E-179; V-166 a E-180; P-167 a K-181; W-168 a E-182; L-169 a N-183; L-170 a K-184; S-171 a 1-185; F-172 a L-186; K-173 a V-187; R-174 a K-188; G-175 a E-189; S-176 a T-190; A-177 a G-191; L-178 a Y-192; E-179 a F-193; E-180 a F-194; K-181 a 1-195; E-182 a Y-196; N-183 a G-197; K-184 a Q- 198; 1-185 a V-199; L-186 a L-200; V-187 a Y-201; K-188 a T-202; E-189 a D-203; T-190 a K-204; G-191 a T-205; Y- 192 a Y-206; F-193 a A-207; F-194 a M-208; I-195 a G-209; Y-196 a H-210; G-197 a L-211; Q-198 a 1-212; V-199 a Q-213; L-200 a R-214; Y-201 a K-215; T-202 a K-216; D-203 a V-217; K-204 a H-218; T-205 a V-219; Y-206 a F- 220; A-207 a G-221; M-208 a D-222; G-209 a E-223; H-210 a L-224; L-211 a S-225; I-212 a L-226; Q-213 a V-227; R-214 a T-228; K-215 a L-229; K-216 a F-230; V-217 a R-231; H-218 a C-232; V-219 a 1-233; F-220 a Q-234; G-221 a N-235; D-222 a M-236; E-223 a P-237; L-224 a E-238; S-225 a T-239; L-226 a L-240; V-227 a P-241; T-228 a N- 242; L-229 a N-243; F-230 a S-244; R-231 a C-245; C-232 a Y-246; 1-233 a S-247; Q-234 a A-248; N-235 a G-249; M-236 a I-250; P-237 a A-251; E-238 a K-252; T-239 a L-253; L-240 a E-254; P-241 a E-255; N-242 a G-256; N-243 a D-257; S-244 a E-258; C-245 a L-259; Y-246 a Q-260; S-247 a L-261; A-248 a A-262; G-249 a I-263; 1-250 a P264; A-251 a R-265; K-252 a E-266; L-253 a N-267; E-254 a A-268; E-255 a Q-269; G-256 a 1-270; D-257 a S-271; E-258 a L-272; L-259 a D-273; Q-260 a G-274; L-261 a D-275; A-262 a V-276; I-263 a T-277; P-264 a F-278; R-265 a F-279; E-266 a G-280; N-267 a A-281; A-268 a L-282; Q-269 a K-283; 1-270 a L-284; y S-271 de la SEQ ID NO: 3228. La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia contigua de restos aminoaddicos con una identidad de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con la secuencia de aminoacidos de polipeptidos de BLyS descritos anteriormente.
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden unirse tambien a fragmentos polipeptfdicos que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en los restos: M-1 a C-15; D-2 a L-16; D-3 a K-17; S-4 a K-18; T-5 a R-19; E-6 a E-20; R-7 a E-21; E-8 a M-22; Q-9 a K-23; S-10 a L-24; R-11 a K-25; L-12 a E-26; T-13 a C-27; S-14 a V-28; C-15 a S-29; L-16 a 1-30; K-17 a L-31; K-18 a P-32; R-19 a R-33; E-20 a K-34; E-21 a E-35; M-22 a S-36; K-23 a P-37; L-24 a S-38; K-25 a V-39; E-26 a R-40; C- 27 a S-41; V-28 a S-42; S-29 a K-43; 1-30 a D-44; L-31 a G-45; P-32 a K-46; R-33 a L-47; K-34 a L-48; E-35 a A-49; S-36 a A-50; P-37 a T-51; S-38 a L-52; V-39 a L-53; R-40 a L-54; S-41 a A-55; S-42 a L-56; K-43 a L-57; D-44 a S- 58; G-45 a C-59; K-46 a C-60; L-47 a L-61; L-48 a T-62; A-49 a V-63; A-50 a V-64; T-51 a S-65; L-52 a F-66; L-53 a Y-67; L-54 a Q-68; A-55 a V-69; L-56 a A-70; L-57 a A-71; S-58 a L-72; C-59 a Q-73; C-60 a G-74; L-61 a D-75; T-62 a L-76; V-63 a A-77; V-64 a S-78; S-65 a L-79; F-66 a R-80; Y-67 a A-81; Q-68 a E-82; V-69 a L-83; A-70 a Q-84; A-
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65
71 a G-85; L-72 a H-86; Q-73 a H-87; G-74 a A-88; D-75 a E-89; L-76 a K-90; A-77 a L-91; S-78 a P-92; L-79 a A-93; R-80 a G-94; A-81 a A-95; E-82 a G-96; L-83 a A-97; Q-84 a P-98; G-85 a K-99; H-86 a A-100; H-87 a G-101; A-88 a L-102; E-89 a E-103; K-90 a E-104; L-91 a A-105; P-92 a P-106; A-93 a A-107; G-94 a V-108; A-95 a T-109; G-96 a A-110; A-97 a G-111; P-98 a L-112; K-99 a K-113; A-100 a 1-114; G-101 a F-115; L-102 a E-116; E-103 a P-117; E- 104 a P-118; A-105 a A-119; P-106 a P-120; A-107 a G-121; V-108 a E-122; T-109 a G-123; A-110 a N-124; G-111 a S-125; L-112 a S-126; K-113 a Q-127; 1-114 a N-128; F-115 a S-129; E-116 a R-130; P-117 a N-131; P-118 a K- 132; A-119 a R-133; P-120 a A-134; G-121 a V-135; E-122 a Q-136; G-123 a G-137; N-124 a P-138; S-125 a E-139; S-126 a E-140; Q-127 a T-141; N-128 a G-142; S-129 a S-143; R-130 a Y-144; N-131 a T-145; K-132 a F-146; R- 133 a V-147; A-134 a P-148; V-135 a W-149; Q-136 a L-150; G-137 a L-151; P-138 a S-152; E-139 a F-153; E-140 a K-154; T-141 a R-155; G-142 a G-156; S-143 a S-157; Y-144 a A-158; T-145 a L-159; F-146 a E-160; V-147 a E- 161; P-148 a K-162; W-149 a E-163; L-150 a N-164; L-151 a K-165; S-152 a 1-166; F-153 a L-167; K-154 a V-168; R-155 a K-169; G-156 a E-170; S-157 a T-171; A-158 a G-172; L-159 a Y-173; E-160 a F-174; E-161 a F-175; K-162 a 1-176; E-163 a Y-177; N-164 a G-178; K-165 a Q-179; I-166 a V-180; L-167 a L-181; V-168 a Y-182; K-169 a T- 183; E-170 a D-184; T-171 a K-185; G-172 a T-186; Y-173 a Y-187; F-174 a A-188; F-175 a M-189; 1-176 a G-190; Y-177 a H-191; G-178 a L-192; Q-179 a 1-193; V-180 a Q-194; L-181 a R-195; Y-182 a K-196; T-183 a K-197; D-184 a V-198; K-185 a H-199; T-186 a V-200; Y-187 a F-201; A-188 a G-202; M-189 a D-203; G-190 a E-204; H-191 a L- 205; L-192 a S-206; I-193 a L-207; Q-194 a V-208; R-195 a T-209; K-196 a L-210; K-197 a F-211; V-198 a R-212; H- 199 a C-213; V-200 a 1-214; F-201 a Q-215; G-202 a N-216; D-203 a M-217; E-204 a P-218; L-205 a E-219; S-206 a T-220; L-207 a L-221; V-208 a P-222; T-209 a N-223; L-210 a N-224; F-211 a S-225; R-212 a C-226; C-213 a Y-227; 1-214 a S-228; Q-215 a A-229; N-216 a G-230; M-217 a I-231; P-218 a A-232; E-219 a K-233; T-220 a L-234; L-221 a E-235; P-222 a E-236; N-223 a G-237; N-224 a D-238; S-225 a E-239; C-226 a L-240; Y-227 a Q-241; S-228 a L- 242; A-229 a A-243; G-230 a I-244; 1-231 a P-245; A-232 a R-246; K-233 a E-247; L-234 a N-248; E-235 a A-249; E- 236 a Q-250; G-237 a 1-251; D-238 a S-252; E-239 a L-253; L-240 a D-254; Q-241 a G-255; L-242 a D-256; A-243 a V-257; 1-244 a T-258; P-245 a F-259; R-246 a F-260; E-247 a G-261; N-248 a A-262; A-249 a L-263; Q-250 a K-264; 1-251 a L-265; y S-252 a L-266 de la SEQ ID NO: 3229. La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia contigua de restos aminoaddicos con una identidad de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con la secuencia de aminoacidos de polipeptidos de BLyS descritos anteriormente.
Los anticuerpos descritos tambien pueden unirse a fragmentos polipeptidicos que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en los restos: M-1 a F-15; D-2 a C- 16; E-3 a S-17; S-4 a E-18; A-5 a K-19; K-6 a G-20; T-7 a E-21; L-8 a D-22; P-9 a M-23; P-10 a K-24; P-11 a V-25; C-12 a G-26; L-13 a Y-27; C-14 a D-28; F-15 a P-29; C-16 a I-30; S-17 a T-31; E-18 a P-32; K-19 a Q-33; G-20 a K- 34; E-21 a E-35; D-22 a E-36; M-23 a G-37; K-24 a A-38; V-25 a W-39; G-26 a F-40; Y-27 a G-41; D-28 a I-42; P-29 a C-43; 1-30 a R-44; T-31 a D-45; P-32 a G-46; Q-33 a R-47; K-34 a L-48; E-35 a L-49; E-36 a A-50; G-37 a A-51; A- 38 a T-52; W-39 a L-53; F-40 a L-54; G-41 a L-55; 1-42 a A-56; C-43 a L-57; R-44 a L-58; D-45 a S-59; G-46 a S-60; R-47 a S-61; L-48 a F-62; L-49 a T-63; A-50 a A-64; A-51 a M-65; T-52 a S-66; L-53 a L-67; L-54 a Y-68; L-55 a Q- 69; A-56 a L-70; L-57 a A-71; L-58 a A-72; S-59 a L-73; S-60 a Q-74; S-61 a A-75; F-62 a D-76; T-63 a L-77; A-64 a M-78; M-65 a N-79; S-66 a L-80; L-67 a R-81; Y-68 a M-82; Q-69 a E-83; L-70 a L-84; A-71 a Q-85; A-72 a S-86; L- 73 a Y-87; Q-74 a R-88; A-75 a G-89; D-76 a S-90; L-77 a A-91; M-78 a T-92; N-79 a P-93; L-80 a A-94; R-81 a A- 95; M-82 a A-96; E-83 a G-97; L-84 a A-98; Q-85 a P-99; S-86 a E-100; Y-87 a L-101; R-88 a T-102; G-89 a A-103; S-90 a G-104; A-91 a V-105; T-92 a K-106; P-93 a L-107; A-94 a L-108; A-95 a T-109; A-96 a P-110; G-97 a A-111; A-98 a A-112; P-99 a P-113; E-100 a R-114; L-101 a P-115; T-102 a H-116; A-103 a N-117; G-104 a S-118; V-105 a S-119; K-106 a R-120; L-107 a G-121; L-108 a H-122; T-109 a R-123; P-110 a N-124; A-111 a R-125; A-112 a R- 126; P-113 a A-127; R-114 a F-128; P-115 a Q-129; H-116 a G-130; N-117 a P-131; S-118 a E-132; S-119 a E-133; R-120 a T-134; G-121 a E-135; H-122 a Q-136; R-123 a D-137; N-124 a V-138; R-125 a D-139; R-126 a L-140; A- 127 a S-141; F-128 a A-142; Q-129 a P-143; G-130 a P-144; P-131 a A-145; E-132 a P-146; E-133 a C-147; T-134 a L-148; E-135 a P-149; Q-136 a G-150; D-137 a C-151; V-138 a R-152; D-139 a H-153; L-140 a S-154; S-141 a Q- 155; A-142 a H-156; P-143 a D-157; P-144 a D-158; A-145 a N-159; P-146 a G-160; C-147 a M-161; L-148 a N-162; P-149 a L-163; G-150 a R-164; C-151 a N-165; R-152 a 1-166; H-153 a 1-167; S-154 a Q-168; Q-155 a D-169; H- 156 a C-170; D-157 a L-171; D-158 a Q-172; N-159 a L-173; G-160 a 1-174; M-161 a A-175; N-162 a D-176; L-163 a S-177; R-164 a D-178; N-165 a T-179; 1-166 a P-180; 1-167 a A-181; Q-168 a L-182; D-169 a E-183; C-170 a E- 184; L-171 a K-185; Q-172 a E-186; L-173 a N-187; I-174 a K-188; A-175 a I-189; D-176 a V-190; S-177 a V-191; D- 178 a R-192; T-179 a Q-193; P-180 a T-194; A-181 a G-195; L-182 a Y-196; E-183 a F-197; E-184 a F-198; K-185 a 1-199; E-186 a Y-200; N-187 a S-201; K-188 a Q-202; I-189 a V-203; V-190 a L-204; V-191 a Y-205; R-192 a T-206; Q-193 a D-207; T-194 a P-208; G-195 a 1-209; Y-196 a F-210; F-197 a A-211; F-198 a M-212; I-199 a G-213; Y-200 a H-214; S-201 a V-215; Q-202 a 1-216; V-203 a Q-217; L-204 a R-218; Y-205 a K-219; T-206 a K-220; D-207 a V- 221; P-208 a H-222; I-209 a V-223; F-210 a F-224; A-211 a G-225; M-212 a D-226; G-213 a E-227; H-214 a L-228; V-215 a S-229; I-216 a L-230; Q-217 a V-231; R-218 a T-232; K-219 a L-233; K-220 a F-234; V-221 a R-235; H-222 a C-236; V-223 a 1-237; F-224 a Q-238; G-225 a N-239; D-226 a M-240; E-227 a P-241; L-228 a K-242; S-229 a T- 243; L-230 a L-244; V-231 a P-245; T-232 a N-246; L-233 a N-247; F-234 a S-248; R-235 a C-249; C-236 a Y-250; 1-237 a S-251; Q-238 a A-252; N-239 a G-253; M-240 a 1-254; P-241 a A-255; K-242 a R-256; T-243 a L-257; L-244 a E-258; P-245 a E-259; N-246 a G-260; N-247 a D-261; S-248 a E-262; C-249 a 1-263; Y-250 a Q-264; S-251 a L- 265; A-252 a A-266; G-253 a 1-267; 1-254 a P-268; A-255 a R-269; R-256 a E-270; L-257 a N-271; E-258 a A-272; E-259 a Q-273; G-260 a 1-274; D-261 a S-275; E-262 a R-276; I-263 a N-277; Q-264 a G-278; L-265 a D-279; A-266
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
a D-280; I-267 a T-281; P-268 a F-282; R-269 a F-283; E-270 a G-284; N-271 a A-285; A-272 a L-286; Q-273 a K- 287; 1-274 a L-288; y S-275 a L-289 de la SEQ ID NO: 38. La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia contigua de restos aminoaddicos con una identidad de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con la secuencia de aminoacidos de polipeptidos de BLyS descritos anteriormente.
Un experto en la materia reconocera que algunas secuencias de aminoacidos de los polipeptidos de BLyS pueden variarse sin un efecto significativo sobre la estructura o funcion del polipeptido. Si se contemplan dichas diferencias en secuencia, debena recordarse que existiran areas cnticas en el polipeptido que determinan la actividad.
Por lo tanto, la memoria descriptiva describe ademas anticuerpos que se unen a variaciones de polipeptidos de BLyS que muestran actividad funcional de polipeptido de BLyS (por ejemplo, actividad biologica) o que incluyen regiones de polipeptido de BLyS, tales como los fragmentos polipeptfdicos descritos en el presente documento. Dichos mutantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones tipo seleccionadas de acuerdo con las regias generales conocidas en la tecnica, para que tengan un escaso efecto sobre la actividad. Por ejemplo, se proporcionan orientaciones en relacion con como realizar sustituciones de aminoacidos fenotipicamente silenciosas en Bowie, J. U. y col., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247:1306-1310 (1990), en el que los autores indican que hay dos estrategias principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoacidos al cambio. El primer procedimiento se basa en el procedimiento de evolucion, en el que las mutaciones se aceptan o rechazan por seleccion natural. La segunda estrategia usa la modificacion por ingeniena genetica para introducir cambios de aminoacidos en posiciones espedficas de un gen clonado y selecciones o exploraciones para identificar secuencias que mantengan su funcionalidad.
Como indican los autores, estos estudios han puesto de manifiesto que las protemas son sorprendentemente tolerantes a sustituciones de aminoacidos. Los autores indican ademas que cambios de aminoacidos seran probablemente permisivos en cierta posicion de la protema. Por ejemplo, los restos aminoaddicos mas enterrados requieren cadenas laterales no polares, mientras que pocas caractensticas de las cadenas laterales superficiales estan conservadas generalmente. Otras sustituciones fenotfpicamente silenciosas de este tipo se describen en Bowie, J. U. y col., anteriormente, y en las referencias citadas en el mismo. Tfpicamente se ven como sustituciones conservativas las sustituciones, de uno por otro, entre los aminoacidos alifaticos Ala, Val, Leu e lie; el intercambio de los restos hidroxilo Ser y Thr, el intercambio de los restos acidos Asp y Glu, la sustitucion entre los restos amida Asn y Gin, el intercambio de los restos basicos Lys y Arg y las sustituciones entre los restos aromaticos Phe, Tyr.
Por lo tanto, los anticuerpos que se describen en la presente memoria pueden unirse a fragmentos, derivados o analogos del polipeptido de la SEQ ID NO: 3228, o del codificado por el plasmido de ADNc depositado, tales como (i) polipeptidos en los que uno o mas de los restos aminoaddicos se sustituyen con un resto aminoaddico conservado o no conservado (preferentemente un resto aminoaddico conservado) y dicho resto aminoaddico sustituido puede o no ser uno codificado por el codigo genetico, o (ii) polipeptidos en los que uno o mas de los restos aminoaddicos incluyen un grupo sustituyente, o (iii) polipeptidos en los que el dominio extracelular del polipeptido se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del polipeptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) polipeptidos en los que los aminoacidos adicionales se fusionan con el dominio extracelular del polipeptido, tales como un peptido de fusion de region Fe de IgG o secuencia lfder o secretora o una secuencia que se emplea para la purificacion del dominio extracelular del polipeptido o una secuencia de proprotema.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden unirse a fragmentos, derivados o analogos del polipeptido de la SEQ ID NO: 3229, o del codificado por el plasmido de ADNc depositado, tales como (i) polipeptidos en los que uno o mas de los restos aminoaddicos se sustituyen con un resto aminoaddico conservado o no conservado (preferentemente un resto aminoaddico conservado) y dicho resto aminoaddico sustituido puede o no ser uno codificado por el codigo genetico, o (ii) polipeptidos en los que uno o mas de los restos aminoaddicos incluyen un grupo sustituyente, o (iii) polipeptidos en los que el dominio extracelular del polipeptido se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del polipeptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) polipeptidos en los que los aminoacidos adicionales se fusionan con el dominio extracelular del polipeptido, tal como un fragmento soluble biologicamente activo de otro miembro de la familia de ligandos del TNF (por ejemplo, el ligando de CD40), un peptido de fusion de region Fe de IgG o secuencia lfder o secretora o una secuencia que se emplea para la purificacion del dominio extracelular del polipeptido o una secuencia de proprotema. Dichos fragmentos, derivados o analogos se consideran dentro del alcance de los expertos en la materia a partir de los contenidos del presente documento.
Por lo tanto, los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden unirse a polipeptidos de BLyS que incluyen una o mas sustituciones, deleciones o adiciones de aminoacidos, a partir de mutaciones naturales o de manipulacion humana. Como se indica, los cambios son preferentemente de una naturaleza menor, tales como sustituciones de aminoacidos conservativas que no afectan significativamente al plegamiento o a la actividad de la protema (vease la Tabla 13).
5
10
15
20
25
30
TABLA 13. Sustituciones de Aminoacidos Conservativas.
Aromatico
Fenilalanina Triptofano Tirosina
Hidrofobo
Leucina
Isoleucina
Valina
Polar
Glutamina
Asparagina
Basico
Arginina Lisina Histidina
Acido
Acido Aspartico Acido Glutamico
Pequeno
Alanina Serina Treonina
Metionina
Glicina
Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden unirse a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de BLyS que tiene una secuencia de aminoacidos que contiene al menos una sustitucion de aminoacido conservativa, pero no mas de 50 sustituciones de aminoacidos conservativas, aun mas preferentemente no mas de 40 sustituciones de aminoacidos conservativas, aun mas preferentemente no mas de 30 sustituciones de aminoacidos conservativas, y aun mas preferentemente no mas de 20 sustituciones de aminoacidos conservativas. En un aspecto, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos que comprenden, o alternativamente consisten en la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de BLyS que tiene una secuencia de aminoacidos que contiene al menos una sustitucion de aminoacido conservativa, pero no mas de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sustitucion de aminoacido conservativa.
Por ejemplo, pueden realizarse cambios dirigidos a nivel de aminoacido de BLyS por sustitucion de un aminoacido particular con una sustitucion conservativa. Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden unirse a secuencias de aminoacidos de BLyS que contengan mutaciones por sustitucion conservativa del polipeptido de la SEQ ID NO: 3228, incluyendo: Ml sustituido con A, G, I, L, S, T o V; D2 sustituido con E, D3 sustituido con E; S4 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; T5 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; E6 sustituido con D; R7 sustituido con H o K; E8 sustituido con D; Q9 sustituido con N; SlO sustituido con A, G, I, L, T, M o V; Rll sustituido con H o K; L12 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; T13 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; S14 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; L16
sustituido con A, G, I, S, T, M o V; K17 sustituido con H o R; K18 sustituido con H o R; R19 sustituido con H o K; E20
sustituido con D; E21 sustituido con D; M22 sustituido con A, G, I, L, S, T o V; K23 sustituido con H o R; L24 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; K25 sustituido con H o R; E26 sustituido con D; V28 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; S29 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; 130 sustituido con A, G, L, S, T, M o V; L31 sustituido con A, G, I, S, T, Mo V; R33 sustituido con H o K; K34 sustituido con H o R; E35 sustituido con D; S36 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; S38 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; V3 9 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; R40 sustituido con H o K; S41 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; S42 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; K43 sustituido con H o R; D44 sustituido con E; G45 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; K46 sustituido con H o R; L47 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; L48

sustituido con A, G, I, S, T, Mo V; A4 9 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; A50 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; T51

sustituido con A, G, I, L, S, M o V; L52 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; L53 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; L54

sustituido con A, G, I, S, T, M o V; A55 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; L56 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; L57

sustituido con A, G, I, S, T, M o V; S58 sustituido con A, G, I, L, T, Mo V; L61 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; T62

sustituido con A, G, I, L, S, M o V; V63 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; V64 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; S65
sustituido con A, G, I, L, T, M o V; F66 sustituido con W o Y; Y67 sustituido con F o W; Q68 sustituido con N; V69
5
10
15
20
25
30
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40
45
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65
sustituido con A, G, I, L, S, T o M; Al 0 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; A71 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; L72 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; Q73 sustituido con N; G74 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; D75 sustituido con E; L76 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; All sustituido con G, I, L, S, T, M o V; S78 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; L79 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; R80 sustituido con H o K; A81 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; E82 sustituido con D; L83 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; Q84 sustituido con N; G85 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; H86 sustituido con K o R; H87 sustituido con K o R; A88 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; E89 sustituido con D; K90 sustituido con H o R; L91 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; A93 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; G94 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; A95 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; G96 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; A97 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; K99 sustituido con H o R; AlOO sustituido con G, I, L, S, T, M o V; GlOl sustituido con A, I, L,
S, T, M o V; L102 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; E103 sustituido con D; E104 sustituido con D; A105 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; A107 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; V108 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; Tl 0 9 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; AllO sustituido con G, I, L, S, T, M o V; Gill sustituido con A, I, L, S, T, M o V; L112 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; K113 sustituido con H o R; 1114 sustituido con A, G, L, S, T, M, o V; F115 sustituido con W o Y; E116 sustituido con D; A119 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; G121 sustituido con A, I, L, S,
T, M o V; E122 sustituido con D; G123 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; N124 sustituido con Q; S125 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; S126 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; Q127 sustituido con N; N128 sustituido con Q; S129 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; R130 sustituido con H o K; N131 sustituido con Q; K132 sustituido con H o R; R133 sustituido con H o K; A134 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; V135 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; Q136 sustituido con N; G137 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; E139 sustituido con D; E140 sustituido con D; T141 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; V142 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; T143 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; Q144 sustituido con N; D145 sustituido con E; L147 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; Q148 sustituido con N; L149 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; 1150 sustituido con A, G, L, S, T, M o V; A151 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; D152 sustituido con E; S153 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; E154 sustituido con D; T155 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; T157 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; 1158 sustituido con A, G, L, S, T, M o V; Q159 sustituido con N; K160 sustituido con H o R; G161 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; S162 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; Y163 sustituido con F o W; T164 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; F165 sustituido con W o Y; V166 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; W 168 sustituido con F o Y; L169 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; L170 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; S171 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; F172 sustituido con W o Y; K173 sustituido con H o R; R174 sustituido con H o K; G175 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; S 176 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; A 177 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; L178 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; E179 sustituido con D; E180 sustituido con D; K181 sustituido con H o R; E182 sustituido con D; N183 sustituido con Q; K184 sustituido con H o R; 1185 sustituido con A, G, L, S, T, M o V; L186 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; V187 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; K188 sustituido con H o R; E189 sustituido con D; T190 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; Gl 91 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; Y192 sustituido con F o W; F193 sustituido con W o Y; F194 sustituido con W o Y; 1195 sustituido con A, G, L, S, T, M o V; Y196 sustituido con F o W; G 197 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; Q 198 sustituido con N; V199 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; L200 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; Y201 sustituido con F o W; T202 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; D203 sustituido con E; K204 sustituido con H o R; T205 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; Y206 sustituido con F o W; A207 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; M208 sustituido con A, G, I, L, S, T o V; G209 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; H210 sustituido con K o R; L211 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; 1212 sustituido con A, G, L, S, T, M o V; Q213 sustituido con N; R214 sustituido con H o K; K215 sustituido con H o R; K216 sustituido con H o R; V217 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; H218 sustituido con K o R; V219 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; F220 sustituido con W o Y; G221 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; D222 sustituido con E; E223 sustituido con D; L224 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; S225 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; L226 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; V227 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; T228 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; L229 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; F230 sustituido con W o Y; R231 sustituido con H o K; 1233 sustituido con A, G, L, S, T, M o V; Q234 sustituido con N; N235 sustituido con Q; M236 sustituido con A, G, I, L, S, To V; E238 sustituido con D; T239 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; L240 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; N242 sustituido con Q; N243 sustituido con Q; S244 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; Y246 sustituido con F o W; S247 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; A248 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; G249 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; 1250 sustituido con A, G, L, S, T, M o V; A251 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; K252 sustituido con H o R; L253 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; E254 sustituido con D; E255 sustituido con D; G256 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; D257 sustituido con E; E258 sustituido con D; L259 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; Q260 sustituido con N; L261 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; A262 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; 1263 sustituido con A, G, L, S, T, M o V; R265 sustituido con H o K; E266 sustituido con D; N267 sustituido con Q; A268 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; Q269 sustituido con N; 1270 sustituido con A, G, L, S, T, M o V; S271 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; L272 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; D273 sustituido con E; G274 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; D275 sustituido con E; V276 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; T277 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; F278 sustituido con W o Y; F279 sustituido con W o Y; G280 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; A281 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; L282 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; K283 sustituido con H o R; L284 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; y/o L285 sustituido con A, G, I, S, T, M o V.
Tambien pueden realizarse cambios dirigidos a nivel de aminoacido de BLyS por sustitucion de un aminoacido particular con una sustitucion conservativa. Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden unirse a secuencias de aminoacidos de BLyS que contienen mutaciones por sustitucion conservativa del polipeptido de la SEQ ID NO: 3229 incluyendo: Ml sustituido con A, G, I, L, S, T o V; D2 sustituido con E; D3 sustituido con E; S4 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; T5 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; E6 sustituido con D; R7 sustituido con H
5
10
15
20
25
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45
50
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65
o K; E8 sustituido con D; Q9 sustituido con N; SlO sustituido con A, G, I, L, T, M o V; Rll sustituido con H o K; L12 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; T13 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; S14 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; L16
sustituido con A, G, I, S, T, M o V; K17 sustituido con H o R; K18 sustituido con H o R; R19 sustituido con H o K; E20
sustituido con D; E21 sustituido con D; M22 sustituido con A, G, I, L, S, T o V; K23 sustituido con H o R; L24 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; K25 sustituido con H o R; E26 sustituido con D; V28 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; S29 sustituido con A, G, I, L, T, M, o V; 130 sustituido con A, G, L, S, T, M o V; L31 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; R33 sustituido con H o K; K34 sustituido con H o R; E35 sustituido con D; S36 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; S38 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; V39 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; R40 sustituido con H o K; S41 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; S42 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; K43 sustituido con H o R; D44 sustituido con E; G45 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; K46 sustituido con H o R; L47 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; L48

sustituido con A, G, I, S, T, M o V; A4 9 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; A50 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; T51

sustituido con A, G, I, L, S, M o V; L52 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; L53 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; L54

sustituido con A, G, I, S, T, M o V; A55 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; L56 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; L57

sustituido con A, G, I, S, T, M o V; S58 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; L61 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; T62

sustituido con A, G, I, L, S, M o V; V63 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; V64 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; S65
sustituido con A, G, I, L, T, M o V; F66 sustituido con W o Y; Y67 sustituido con F o W; Q68 sustituido con N; V69 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; A70 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; A71 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; L72 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; Q73 sustituido con N; G74 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; D75 sustituido con E; L76 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; A77 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; S78 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; L79 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; R80 sustituido con H o K; A81 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; E82 sustituido con D; L83 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; Q84 sustituido con N; G85 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; H86 sustituido con K o R; H87 sustituido con K o R; A88 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; E89 sustituido con D; K90 sustituido con H o R; L91 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; A93 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; G94 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; A95 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; G96 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; A97 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; K99 sustituido con H o R; AlOO sustituido con G, I, L, S, T, M o V; GlOl sustituido con A, I, L,
S, T, M o V; L102 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; E103 sustituido con D; E104 sustituido con D; A105 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; A107 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; V108 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; Tl 0 9 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; AllO sustituido con G, I, L, S, T, M o V; Gill sustituido con A, I, L, S, T, M o V; L112 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; K113 sustituido con H o R; 1114 sustituido con A, G, L, S, T, M o V; F115 sustituido con W o Y; E116 sustituido con D; A119 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; G121 sustituido con A, I, L, S,
T, M o V; E122 sustituido con D; G123 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; N124 sustituido con Q; S125 sustituido con
A, G, I, L, T, M o V; S 126 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; Q127 sustituido con N; N128 sustituido con Q; S129 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; R130 sustituido con H o K; N131 sustituido con Q; K132 sustituido con H o R; R133 sustituido con H o K; A134 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; V 135 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; Q136 sustituido con N; G137 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; E139 sustituido con D; E140 sustituido con D; T141 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; G142 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; S143 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; Y114 sustituido con F o Y; V145 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; F 146 sustituido con W o Y; V 147 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; W149 sustituido con F o Y; L150 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; L151 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; S152 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; F153 sustituido con W o Y; K154 sustituido con H o R; R155 sustituido con H o K; G156 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; S157 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; A 158
sustituido con G, I, L, S, T, M o V; L159 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; E160 sustituido con D; E161 sustituido
con D; K162 sustituido con H o R; E163 sustituido con D; N164 sustituido con Q; K165 sustituido con H o R; 1166 sustituido con A, G, L, S, T, M o V; L167 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; V168 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; K169 sustituido con H o R; E170 sustituido con D; T171 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; G 172 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; Y173 sustituido con F o W; F 174 sustituido con W o Y; F175 sustituido con W o Y; 1176 sustituido con A, G, L, S, T, M o V; Y177 sustituido con F o W; G178 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; Q179 sustituido con N; V 180 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; L181 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; Y182 sustituido con F o W; T183 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; D184 sustituido con E; K185 sustituido con H o R; T186 sustituido con A, G, I, L,
S, M o V; Y187 sustituido con F o W; A188 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; Ml 8 9 sustituido con A, G, I, L, S, T o
V; G190 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; H191 sustituido con K o R; L192 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; 1193 sustituido con A, G, L, S, T, M o V; Q194 sustituido con N; R195 sustituido con H o K; K196 sustituido con H o R; K197 sustituido con H o R; V198 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; H199 sustituido con K o R; V200 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; F201 sustituido con W o Y; G202 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; D203 sustituido con E; E204 sustituido con D; L205 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; S206 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; L207 sustituido con A, G, I, S, T, M, o V; V208 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; T209 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; L210 sustituido con A, G, I, S, T, M, o V; F211 sustituido con W o Y; R212 sustituido con H o K; 1214 sustituido con A, G, L, S, T, M o V; Q215 sustituido con N; N216 sustituido con Q; M217 sustituido con A, G, I, L, S, To V; E219 sustituido con D; T220 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; L221 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; N223 sustituido con Q; N224 sustituido con Q; S225 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; Y227 sustituido con F o W; S228 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; A229 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; G230 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; 1231 sustituido con A, G, L, S, T, M o V; A232 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; K233 sustituido con H o R; L234 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; E235 sustituido con D; E236 sustituido con D; G237 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; D238 sustituido con E; E239 sustituido con D; L240 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; Q241 sustituido con N; L242 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; A243 sustituido con G, I, L, S, T, M, o V; 1244 sustituido con A, G, L, S, T, M o V; R246 sustituido con H o K; E247 sustituido con D; N248 sustituido con Q; A249 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; Q250 sustituido con N; 1251 sustituido con A, G, L, S, T, M o V; S252 sustituido con A, G, I, L, T, M o V; L253
5
10
15
20
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30
35
40
45
50
55
60
sustituido con A, G, I, S, T, M o V; D254 sustituido con E; G255 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; D256 sustituido con E; V257 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; T258 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; F259 sustituido con W o Y; F260 sustituido con W o Y; G261 sustituido con A, I, L, S, T, M o V; A262 sustituido con G, I, L, S, T, M o V; L263 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; K264 sustituido con H o R; L265 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; y/o L266 sustituido con A, G, I, S, T, M o V.
Tambien pueden realizarse cambios dirigidos a nivel de aminoacido de BLyS por sustitucion de un aminoacido particular con una sustitucion conservativa. Los anticuerpos de la presente invencion pueden unirse a secuencias de aminoacidos de BLyS que contengan mutaciones por sustitucion conservativa del polipeptido de una cualquiera de las SEQ ID NO: 3230-3237.
Los aminoacidos de los polipeptidos de BLyS que son esenciales para su funcion pueden identificarse por procedimientos conocidos en la tecnica, tales como mutagenesis dirigida o mutaciones mediante barrido con alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 30 1081-1085 (1989)). El ultimo procedimiento introduce mutaciones de alanina individuales en cada resto de la molecula. Las moleculas mutantes resultantes se ensayan despues para determinar su actividad funcional, tal como la union a ligando y la capacidad para estimular linfocitos (por ejemplo, linfocitos B), como por ejemplo, la proliferacion, diferenciacion y/o activacion. Por consiguiente, los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden unirse a aminoacidos en los polipeptidos de BLyS que son esenciales para su funcion. En aspectos preferidos, los anticuerpos que se describen en la presente invencion se unen a aminoacidos en los polipeptidos de BLyS que son esenciales para su funcion e inhiben la funcion del polipeptido de BLyS. En otros aspectos preferidos, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a aminoacidos en los polipeptidos de BLyS que son esenciales para su funcion y aumentan la funcion del polipeptido de BLyS.
Son de interes especial las sustituciones de aminoacidos cargados con otros aminoacidos cargados o neutros que puedan producir protemas con caractensticas mejoradas altamente deseables, tales como una menor agregacion. La agregacion puede no solo reducir la actividad, sino que tambien puede ser problematica al preparar formulaciones farmaceuticas, debido a que los agregados pueden ser inmunogenicos (Pinekard y col., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins y col., Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland y col., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993).
La memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos que tienen secuencias de aminoacidos que contienen sustituciones no conservativas de la secuencia de aminoacidos proporcionada en la SEQ ID NO: 3228. Por ejemplo, las sustituciones no conservativas de la secuencia proteica de BLyS proporcionada en la SEQ ID NO: 3228 incluyen: Ml sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; D2 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; D3 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; S4 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; T5 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; E6 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; R7 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E8 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; Q9 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L,
S, T, M, V, F, W, Y, P o C; SlO sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Rll sustituido con D, E, A, G, I, L, S,
T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L12 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; T13 sustituido con D, E, H, K, R,
N, Q, F, W, Y, P o C; S14 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; C15 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I,
L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o P; L16 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; K 17 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; Kl8 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; Rl 9 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E20 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N,
Q, F, W, Y, P o C; E21 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; M22 sustituido con D, E, H,
K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; K2 3 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L24 sustituido con D,
E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; K25 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E26 sustituido
con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; C27 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q,
F, W, Y o P; V28 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; S29 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P
o C; 130 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L31 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C, P32 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; R33 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M,
V, N, Q, F, W, Y, P o C; K34 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E35 sustituido con H, K,
R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; S36 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; P37 sustituido
con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; S38 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C;
V39 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; R40 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P
o C; S41 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; S42 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C;
K43 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; D44 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V,
N, Q, F, W, Y, P o C; G45 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; K46 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T,
M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L47 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L48 sustituido con D, E, H, K, R, N,
Q, F, W, Y, P o C; A4 9 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A50 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F,
W, Y, P o C; T51 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L52 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P
o C; L53 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L54 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A55 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L56 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L57 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; S58 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; C59 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o P; C60 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o P; L61 I sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; T62 sustituido con D, E, H, K, R, N,
Q, F, W, Y, P o C; V63 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; V64 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
W, Y, P o C; S65 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; F66 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; Y67 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; Q68 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; V69 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A70 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A71 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L72 sustituido con D, E, H, K, R,
N, Q, F, W, Y, P o C; Q73 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; G74 sustituido con D, E,
H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; D75 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L76 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; All sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; S78 sustituido con D, E,
H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L79 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; R80 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; A81 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; E82 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L83 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Q84 sustituido con
D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; G85 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; H86
sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; H87 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F,
W, Y, P o C; A88 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; E89 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V,
N, Q, F, W, Y, P o C; K90 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L91 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; P92 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; A93 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; G94 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A95 sustituido con D,
E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; G96 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A97 sustituido con D, E, H,
K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; P98 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; K99 sustituido
con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; AlOO sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; GlOl sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; L102 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; E103 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E104 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V,

N, Q, F, W, Y, P o C; A105 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; P106 sustituido con D, E, H, K, R, A, G,
I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; A107 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; V108 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; T109 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; AllO sustituido con D, E, H, K,

R, N, Q, F, W, Y, P o C; Gill sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L112 sustituido con D, E, H, K, R, N,

Q, F, W, Y, Po C; K113 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; 1114 sustituido con D, E, H,
K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; F115 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; E116 sustituido con H,
K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; P117 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W,
Y o C; Pl18 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; Al19 sustituido con D, E, H, K, R, N,
Q, F, W, Y, P o C; P120 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; G121 sustituido con D,
E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; E122 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; G123 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; N124 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; S125 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; S126 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; Q127 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; N128 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L,
S, T, M, V, F, W, Y, P o C; S12 9 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; R130 sustituido con D, E, A, G, I,
L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, Po C; N131 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; K132 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; R133 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, Tom, V, N, Q,
F, W, Y, P o C; A134 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; V135 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; Q136 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; G 137 sustituido con D, E, H, K,
R, N, Q, F, W, Y, Po C; P138 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; E139 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E140 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; T141 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; V 142 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; T143 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Q144 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T,
M, V, F, W, Y, P o C; D145 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; C146 sustituido con D,
E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o P; L147 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; Q148 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; L149 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; 1150 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A151 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; D152 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; S 153 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q,
F, W, Y, P o C; E154 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; T155 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; P156 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; T157 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; 1158 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Q15 9 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; Kl60 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; Gl61 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; S162 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; Y163 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; T164 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; F165 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; V166 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; P167 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; W168 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; L169 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L170 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; S171 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; F172 sustituido con D, E,
H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; K173 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; R174 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; G175 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; S 176 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A177 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L178 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; E17 9 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; El 80 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; K181 sustituido con D, E, A, G,
I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; El82 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; N183 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; K184 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; 1185 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L186 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

W, Y, P o C; V 187 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; K188 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V,

N, Q, F, W, Y, Po C; El 8 9 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; Tl 90 sustituido con D,

E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; G191 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; Y192 sustituido con D, E, H,

K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; F193 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; Fl 94
sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; 1195 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Y196 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; Gl 97 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Q198 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; Vl 99 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L200 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; Y201 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q,
A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; T202 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; D203 sustituido con H, K, R, A, G,
I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; K204 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, Po C; T205
sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Y206 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po
C; A207 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; M208 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C;
G209 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; H210 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W,
Y, P o C; L211 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; 1212 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Q213 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; R214 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; K215 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; K216 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; V217 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; H218 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; V219 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; F22O sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; G22I sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; D222 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E223 sustituido con H, K, R, A, G,

I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L224 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; S225 sustituido con D,

E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L226 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; V227 sustituido con D, E, H,

K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; T228 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L229 sustituido con D, E, H, K, R,

N, Q, F, W, Y, P o C; F230 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P o C; R2 31 sustituido con D, E,

A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; C232 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o P;

1233 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Q234 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F,

W, Y, P o C; N235 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; M236 sustituido con D, E, H, K,
R, N, Q, F, W, Y, P o C; P237 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; E238 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; T239 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L240 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; P2 41 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F,
W, Y o C; N242 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; N243 sustituido con D, E, H, K, R,
A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; S244 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; C245 sustituido con D,
E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o P; Y246 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po
C; S247 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A248 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; G2 4 9 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; 1250 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; A251 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; K252 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L253 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; E254 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V,
N, Q, F, W, Y, P o C; E255 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; G256 sustituido con D,
E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; D257 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E258
sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L259 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P
o C; Q260 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; L261 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q,
F, W, Y, P o C; A262 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; 1263 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W,
Y, P o C; P264 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; R265 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E266 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; N267
sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; A268 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P
o C; Q2 69 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; 1270 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q,
F, W, Y, P o C; S271 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L272 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W,
Y, Po C; D273 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; G274 sustituido con D, E, H, K, R,
N, Q, F, W, Y, Po C; D275 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; V276 sustituido con D,
E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; T277 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; F278 sustituido con D, E, H,
K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; F279 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; G280
sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A281 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L282 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; K283 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L284 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; y/o L285 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento tambien se unen a polipeptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos de BLyS en la que mas de un aminoacido (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 y 50) se sustituye con los aminoacidos sustituidos que se han descrito anteriormente (conservativos o no conservativos).
Los anticuerpos que se describen en el presente documento tambien se unen a polipeptidos de BLyS con sustituciones no conservativas de la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 3229, incluyendo: Ml sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; D2 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; D3 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; S4 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; T5 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; E6 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; R7 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E8 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; Q9 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; SlO sustituido
con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Rll sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L12
sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; T13 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; S 14 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; C15 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W,
Y o P; Ll 6 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; K17 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F,
W, Y, P o C; K18 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; R19 sustituido con D, E, A, G, I, L,
S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E20 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E21
sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; M2 2 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; K23 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L24 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; K25 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E26 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S,

T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; C27 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o P; V28

sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; S29 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; 130

sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L31 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; P32
sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; R33 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; K34 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E35 sustituido con H, K, R,
A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; S36 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; P37 sustituido con
D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; S38 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; V3 9
sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; R40 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; S41 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; S42 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; K43 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, 0, F, W, Y, P o C, D44 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; G45 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; K46 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V,
N, Q, F, W, Y, P o C; L47 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; L48 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F,
W, Y, P o C; A4 9 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A50 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; T51 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L52 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L53 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L54 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; A55 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L56 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L57

sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; S58 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; C59
sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o P; C60 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o P; L61 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; T62 sustituido con D, E, H, K, R, N,

Q, F, W, Y, P o C; V63 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; V64 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F,
W, Y, P o C; S65 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; F66 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L,
S, T, M, V, P o C; Y67 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P o C; Q68 sustituido con D, E, H, K,

R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; V69 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; A70 sustituido con D,

E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A71 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L72 sustituido con D, E, H, K,

R, N, Q, F, W, Y, P o C; Q73 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; G74 sustituido con D,
E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; D75 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L76

sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A77 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; S78

sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; L79 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; R80
sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; A81 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; E82 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L83 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Q84 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; G85 sustituido con D, E, H, K, R, N,
Q, F, W, Y, P o C; H86 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; H87 sustituido con D, E, A, G,
I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; A88 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; E89 sustituido con H, K,
R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, Po C; K90 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L91
sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; P92 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W,
Y o C; A93 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; G94 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A95 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; G96 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A97 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; P98 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W,
Y o C; K99 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, Po C; AlOO sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; GlOl sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; L102 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; E103 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E104 sustituido con H, K, R, A, G, I, L,
S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; A105 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; P106 sustituido con D, E, H,
K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; A107 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; V108 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; T109 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; AllO
sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; GUI sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L112
sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; K113 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o
C; 1114 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; F115 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M,
V, Po C; E116 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; P117 sustituido con D, E, H, K, R,
A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; Pl18 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; A
119 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; P120 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q,
F, W, Y o C; G121 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; E122 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M,
V, N, Q, F, W, Y, P o C; G123 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; N124 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; S125 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; S126 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; Q127 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; N128 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; S12 9 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P
o C; R130 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, Po C; N131 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; K132 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; R133 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; A134 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; V135 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Q136 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; G137 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; P138 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; E139 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E140 sustituido con H, K,
R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; T141 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; G142
sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; S 143 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; Y144 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; T145 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C;

F146 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; V 147 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y,
Po C; P148 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; W149 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; L 150 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; L151 sustituido con D, E,

H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; S152 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; F153 sustituido con D, E, H, K,

R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; K154 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; R155
sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; G 156 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; S157 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A158 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L159 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; E160 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F,
W, Y, P o C; E161 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; Kl62 sustituido con D, E, A, G, I,
L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, Po C; El 63 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; N164 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; K165 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N,
Q, F, W, Y, P o C; 1166 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Ll67 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F,
W, Y, P o C; Vl 68 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; K169 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V,
N, Q, F, W, Y, Po C; E17 0 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; T171 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; G172 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; Y173 sustituido con D, E, H,

K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; F174 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; F175
sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; 1176 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o
C; Y177 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; G 178 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F,
W, Y, P o C; Q179 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; V180 sustituido con D, E, H, K,

R, N, Q, F, W, Y, P o C; L 181 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; Y182 sustituido con D, E, H, K, R, N,

Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; T183 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; D184 sustituido con H, K, R, A,
G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; K185 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, Po C; T186
sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Y187 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; A188 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; M189 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; G 190 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; H191 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y,
P o C; L192 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; 1193 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o
C; Q 194 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; R195 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T,
M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; K196 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; K197 sustituido con
D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; V 198 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; H199
sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; V200 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; F201 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; G202 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; D203 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E204 sustituido con H, K, R, A, G,

I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L205 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; S206 sustituido con D,

E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L207 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; V208 sustituido con D, E, H,

K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; T209 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L210 sustituido con D, E, H, K, R,
N, Q, F, W, Y, P o C; F211 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P o C; R212 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; C213 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o P; 1214 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Q215 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; N216 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; M217 sustituido con D, E, H, K,
R, N, Q, F, W, Y, P o C; P218 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C, E219 sustituido
con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; T220 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L221 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; P222 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; N223 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; N224 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; S225 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; C226 sustituido con D,
E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o P; Y227 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po
C; S228 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A229 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; G230 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; 1231 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; A232 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; K233 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L234 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; E235 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E236 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; G237 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; D238 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E239 sustituido con
H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L240 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Q241
sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; L242 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P
o C; A243 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; 1244 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; P245 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y o C; R2 4 6 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E247 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; N248 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; A249 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Q2
50 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; 1251 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y,
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P o C; S252 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q; F, W, Y, P o C; L253 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; D254 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; G255 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; D256 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; V257 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; T258 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; F259 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; F260 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, Po C; G261 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A262 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L263 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; K264 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L265 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; y/o L266 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C.
Pueden realizarse cambios dirigidos a nivel de aminoacido de BLyS por sustitucion de un aminoacido particular con una sustitucion no conservativa. Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden unirse a secuencias de aminoacidos de BLyS que contienen mutaciones por sustitucion no conservativa del polipeptido de una cualquiera de las SEQ ID NO: 3230-3237.
Los anticuerpos tambien se unen a polipeptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos de BLyS en la que mas de un aminoacido (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 y 50) se sustituye con los aminoacidos sustituidos como se ha descrito anteriormente (conservativos o no conservativos).
La sustitucion de aminoacidos tambien puede cambiar la selectividad de la union de un ligando a receptores de superficie celular. Por ejemplo, Ostade y col., Nature 361:266-268 (1993) describe ciertas mutaciones que dan como resultado la union selectiva de TNF-alfa a solo uno de los dos tipos conocidos de receptores de TNF. Puesto que BLyS es un miembro de la familia de polipeptidos del TNF, mutaciones similares a las del TNF-alfa es probable que tengan efectos similares en polipeptidos de BLyS.
Tambien pueden determinarse sitios que sean cnticos para la union de ligando-receptor por analisis estructural, tal como cristalizacion, resonancia magnetica nuclear o marcaje por fotoafinidad (Smith y col., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) y de Vos y col. Science 255:306-312 (1992)).
Puesto que BLyS es un miembro de la familia de protemas relacionadas con TNF, pueden realizarse mutaciones en secuencias que codifican aminoacidos en el dominio conservado de TNF, por ejemplo, en las posiciones Gly-191 a Leu-284 de la SEQ ID NO: 3228 o en las posiciones Gly-172 a Leu-265 de la SEQ ID NO: 3229, y pueden modular mas que eliminar completamente las actividades funcionales (por ejemplo, las actividades biologicas) de polipeptidos de BLyS o fragmentos o variantes de los mismos. Por consiguiente, los anticuerpos de la presente invencion pueden unirse a polipeptidos de BLyS que tengan mutaciones en el dominio conservado de TNF. Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden unirse a polipeptidos de BLyS que tengan mutaciones en el dominio conservado de TNF y actuen como antagonistas de BLyS. En otros aspectos preferidos, los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden unirse a polipeptidos de BLyS que tengan mutaciones en el dominio conservado de TNF y actuen como agonistas de BLyS.
Puede usarse la tecnologfa de ADN recombinante conocida por los expertos en la materia (vease, por ejemplo, el barajado de ADN anterior) para crear nuevas protemas mutantes o mutemas que incluyan una sola o multiple sustituciones, deleciones, adiciones de aminoacidos o protemas de fusion. Dichos polipeptidos modificados pueden mostrar, por ejemplo, una actividad aumentada o una estabilidad aumentada. Ademas, pueden purificarse en mayores rendimientos y muestran una mejor solubilidad que el polipeptido natural correspondiente, al menos en determinadas condiciones de purificacion y almacenamiento.
Por lo tanto, la memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a derivados de BLyS y analogos que tienen uno o mas restos aminoaddicos delecionados, anadidos o sustituidos para generar polipeptidos de BLyS, por ejemplo, que esten mejor adaptados a la expresion, aumento a escala, etc., en las celulas hospedadoras. Por ejemplo, pueden delecionarse o sustituirse los restos de cistema con otro resto aminoaddico para eliminar puentes disulfuro; pueden alterarse o eliminarse sitios de glucosilacion ligada a N para conseguir, por ejemplo, la expresion de un producto homogeneo que se recupere y purifique mas facilmente a partir de hospedadores de levadura que se sabe que hiperglucosilan sitios ligados a N. Con este fin, una diversidad de sustituciones de aminoacidos en una o ambas de la primera o tercera posicion de aminoacido en una o mas de cualquiera de las secuencias de reconocimiento de glucosilacion en los polipeptidos de BLyS de la presente invencion, y/o una delecion de aminoacido en la segunda posicion de una o mas de cualquiera de dichas secuencias de reconocimiento evitara la glucosilacion del BLyS en la secuencia tripeptfdica modificada (vease, por ejemplo, Miyajimo y col., EMBO J 5(6) : 1193-1197) . A modo de ejemplo no limitante, la mutacion de la serina en la posicion 244 a alanina, individualmente o en combinacion con la mutacion de la asparagina en la posicion 242 a glutamina, suprime la glucosilacion de la forma soluble madura de BLyS (por ejemplo, los aminoacidos 134-285 de la SEQ ID NO: 3228) cuando se expresa en la levadura Pichea pastoris. Un polipeptido de BLyS mutante en el que solo se muta la asparagina en la posicion 242 a glutamina se glucosila todavfa cuando se expresa en Pichea pastoris. En este mutante, el acontecimiento de glucosilacion puede deberse a la activacion o desenmascaramiento de un sitio de glucosilacion ligado a O en la serina 244. Tambien podnan realizarse mutaciones similares que afecten a la glucosilacion en el polipeptido de BLyS de la SEQ ID nO: 3229, es decir, la asparagina 223 a glutamina y/o la serina 224 a alanina de la SeQ ID NO: 3229. Ademas, uno o mas de los restos aminoaddicos de los polipeptidos que se describen en el presente
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documento (por ejemplo, los restos de arginina y lisina) pueden delecionarse o sustituirse con otro resto para eliminar el procesamiento no deseado por proteasas tales como, por ejemplo, furinas o kexinas. Un resultado posible de dicha situacion es que el polipeptido de BLyS de la presente invencion no se escinde y libera de la superficie celular. Por consiguiente, los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden unirse a derivados de BLyS y analogos que tengan uno o mas restos aminoaddicos delecionados, anadidos o sustituidos. Los anticuerpos que se describen en el presente documento tambien se unen a derivados, variantes o analogos de BLyS que son incapaces de escindirse de la superficie celular.
Espedficamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos de BLyS en los que la Lys-132 y/o la Arg-133 de la secuencia de BLyS mostrada en la SEQ ID NO: 3228 se mutan a otro resto aminoaddico, o se delecionan por completo, para impedir o disminuir la liberacion de la forma soluble de BLyS a partir de celulas que expresen BLyS. Mas espedficamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos de BLyS en los que la Lys-132 de la secuencia de BLyS mostrada en la SEQ ID NO: 3228 se muta a Ala-132. Los anticuerpos espedficos que se describen en el presente documento tambien se unen a polipeptidos de BLyS en los que la Arg-l33 de la secuencia de BLyS mostrada en la SEQ ID NO: 3228 se muta a Ala-133. Estas proternas mutadas y/o tienen usos tales como, por ejemplo, terapia genica o terapia ex vivo, para obtener por ingeniena genetica celulas que expresen un polipeptido de BLyS que se retenga en la superficie de las celulas obtenidas por ingeniena genetica.
Espedficamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos de BLyS en los que la Cys-146 de la secuencia de BLyS mostrada en la SEQ ID NO: 3228 se muta a otro resto aminoaddico, o se deleciona por completo, por ejemplo, para contribuir a impedir o disminuir la oligomerizacion del polipeptido de BLyS mutante cuando se expresa en un sistema de expresion. Espedficamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos de BLyS en los que la Cys-146 se sustituye con un resto aminoaddico de serina.
Espedficamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos de BLyS en los que la Cys-232 de la secuencia de BLyS mostrada en la SEQ ID NO: 3228 se muta a otro resto aminoaddico, o se deleciona por completo, por ejemplo, para contribuir a impedir o disminuir la oligomerizacion del polipeptido de BLyS mutante cuando se expresa en un sistema de expresion. Espedficamente, los anticuerpos tambien se unen a polipeptidos de BLyS en los que la Cys-232 se sustituye con un resto aminoaddico de serina. Los polipeptidos que codifican estos polipeptidos tambien se incluyen en la presente invencion.
Espedficamente, los anticuerpos tambien se unen a polipeptidos de BLyS en los que la Cys-245 de la secuencia de BLyS mostrada en la SEQ ID NO: 3228 se muta a otro resto aminoaddico, o se deleciona por completo, por ejemplo, para contribuir a impedir o disminuir la oligomerizacion del polipeptido de BLyS mutante cuando se expresa en un sistema de expresion. Espedficamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento tambien se unen a polipeptidos de BLyS en los que la Cys-245 se sustituye con un resto aminoaddico de serina. Los polipeptidos que codifican estos polipeptidos tambien se describen en el presente documento.
Los polipeptidos que se describen en el presente documento se proporcionan preferentemente en forma aislada, y preferentemente estan sustancialmente purificados. Una version producida recombinantemente de los polipeptidos de BLyS puede purificarse sustancialmente mediante el procedimiento de una etapa descrito en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988).
Los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos de BLyS que incluyen el polipeptido completo codificado por el ADNc depositado (N.° de Deposito de la ATCC 97768) incluyendo los dominios intracelular, transmembrana y extracelular del polipeptido codificado por el ADNc depositado, el polipeptido soluble maduro codificado por el ADNc depositado, el dominio extracelular menos los dominios intracelular y transmembrana de la protema, el polipeptido completo de la SEQ ID NO: 3228, el polipeptido soluble maduro de la SEQ ID NO: 3228, por ejemplo, los aminoacidos 134-285 de la SEQ ID NO: 3228, el dominio extracelular de la SEQ ID NO: 3228, los restos aminoaddicos 73-285 de la SEQ ID NO: 3228 menos los dominios intracelular y transmembrana, asf como los polipeptidos que tienen una similitud de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, mas preferentemente una similitud de al menos un 95 %, y aun mas preferentemente una similitud de al menos un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con los descritos anteriormente. Los polinucleotidos que codifican estos polipeptidos tambien se describen en el presente documento.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos de BLyS que incluyen el polipeptido completo codificado por el ADNc depositado incluyendo los dominios intracelular, transmembrana y extracelular del polipeptido codificado por el ADNc depositado (N.° de Deposito de la ATCC 203518), el polipeptido soluble maduro codificado por el ADNc depositado, el dominio extracelular menos los dominios intracelular y transmembrana de la protema, el polipeptido completo de la SEQ ID NO: 3229, el soluble maduro de la SEQ ID NO: 3229, por ejemplo, los restos aminoaddicos 134-266 de la SEQ ID NO: 3229, el dominio extracelular de la SEQ ID NO: 3229, por ejemplo, los restos aminoaddicos 73-266 de la SEQ ID NO: 3229 menos los dominios intracelular y transmembrana, asf como los polipeptidos que tienen una similitud de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, mas preferentemente una similitud de al menos un 95 %, y aun mas preferentemente una similitud de al menos un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con los descritos anteriormente. Tambien se describen en el presente documento
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polinucleotidos que codifican estos polipeptidos.
Los anticuerpos adicionales que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos incluyendo polipeptidos con una identidad de al menos un 80 %, o al menos un 85 %, mas preferentemente una identidad de al menos un 90 % o un 95 %, aun mas preferentemente una identidad de al menos un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con el polipeptido codificado por el ADNc depositado (N.° de Deposito de la ATCC 97768) o con el polipeptido de la SEQ iD NO: 3228, y tambien incluyen anticuerpos que se unen a porciones de dichos polipeptidos con al menos 30 aminoacidos y mas preferentemente al menos 50 aminoacidos.
Los anticuerpos adicionales que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos incluyendo polipeptidos con una identidad de al menos un 80 %, o con una identidad de al menos un 85 %, mas preferentemente una identidad de al menos un 90 % o un 95 %, aun mas preferentemente una identidad de al menos un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con el polipeptido codificado por el ADNc depositado (N.° de Deposito de la ATCC 203518) o con el polipeptido de la SEQ ID NO: 3229, y tambien incluyen anticuerpos que se unen a porciones de dichos polipeptidos con al menos 30 aminoacidos y, mas preferentemente, al menos 50 aminoacidos. Tambien se describen en el presente documento polinucleotidos que codifican estos polipeptidos.
Por "% de similitud" para dos polipeptidos se entiende una puntuacion de similitud producida por la comparacion de las secuencias de aminoacidos de los dos polipeptidos usando el programa Bestfit (Paquete de Analisis de Secuencias Wisconsin, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711) y los ajustes por defecto para determinar la similitud. Bestfit usa el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2:482-489, 1981) para encontrar el mejor segmento de similitud entre dos secuencias.
Por un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos con una "identidad" de al menos, por ejemplo, un 95 % con una secuencia de aminoacidos de referencia de un polipeptido de BLyS se entiende que la secuencia de aminoacidos del polipeptido es identica a la secuencia de referencia excepto por que la secuencia polipeptfdica puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoacidos por cada 100 aminoacidos de los aminoacidos de referencia del polipeptido de BLyS. En otras palabras, para obtener un polipeptido que tenga una secuencia de aminoacidos con una identidad de al menos un 95 % con una secuencia de aminoacidos de referencia, hasta un 5 % de los restos aminoaddicos en la secuencia de referencia pueden delecionarse o sustituirse con otro aminoacido, o varios aminoacidos hasta un 5 % del total de restos aminoaddicos en la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino- o carboxi- terminales de la secuencia de aminoacidos de referencia, o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre restos en la secuencia de referencia o en uno o mas grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Como materia practica, si cualquier polipeptido particular tiene una identidad de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con, por ejemplo, la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3228, la secuencia de aminoacidos codificada por el clon de ADNc depositado HNEDU15 (N.° de Acceso ATCC 97768), o fragmentos de la misma o, por ejemplo, con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3229, la secuencia de aminoacidos codificada por el clon de ADNc depositado HDPMC52 (N.° de Acceso ATCC 203518), o fragmentos de la misma, puede determinarse de forma convencional usando programas informaticos conocidos tales como el programa Bestfit (Paquete de Analisis de Secuencias Wisconsin, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711). Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular tiene una identidad de, por ejemplo, un 95 % con una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invencion, los parametros se ajustan, por supuesto, de modo que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de aminoacidos de referencia y que se permitan huecos en la homologfa de hasta un 5 % del numero total de restos aminoaddicos en la secuencia de referencia.
En un aspecto especifico descrito y desvelado en el presente documento, la identidad entre una secuencia de referencia (de consulta) (una secuencia de la presente invencion o como se describe en el presente documento) y una secuencia objeto, tambien denominada alineamiento de secuencias global, se determina usando el programa informatico FASTDb basado en el algoritmo de Brutlag y col. (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)). Los parametros preferidos usados en un alineamiento de aminoacidos FASTDB son: Matriz = PAM 0, k-tuple = 2, Penalizacion por Emparejamiento Erroneo = 1, Penalizacion por Union = 20, Longitud del Grupo de Aleatorizacion = 0, Puntuacion de Corte = 1, Tamano de Ventana = longitud de la secuencia, Penalizacion por Hueco = 5, Penalizacion por Tamano de Hueco = 0,05, Tamano de Ventana = 500 o la longitud de la secuencia de aminoacidos objeto, lo que sea mas corto. De acuerdo con este aspecto, si la secuencia objeto es mas corta que la secuencia de consulta debido a deleciones N- o C- terminales, no debido a deleciones internas, se realiza una correccion manual de los resultados para tener en cuenta el hecho de que el programa FASTDB no tiene en cuenta los truncamientos N- y C-terminales de la secuencia objeto cuando se calcula el porcentaje de identidad global. Para las secuencias objeto truncadas en los extremos N- y C- terminales respecto a la secuencia de consulta, el porcentaje de identidad se corrige calculando el numero de restos de la secuencia de consulta que son N- y C-terminales de la secuencia objeto, que no estan emparejados/alineados con un resto objeto correspondiente, como porcentaje del total de bases de la secuencia de consulta. Una determinacion de si un resto esta emparejado/alineado se determina mediante los resultados del
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alineamiento de secuencias FASTDB. Despues, este porcentaje se resta del porcentaje de identidad, calculado mediante el programa FASTDB anterior usando los parametros especificados, para llegar a un resultado de porcentaje de identidad final. Este resultado de porcentaje de identidad final es el que se usa para los fines de este aspecto. Solo se consideran los restos en los extremos N- y C-terminales de la secuencia objeto que no estan emparejados/alineados con la secuencia de consulta con el fin de ajustar manualmente el resultado del porcentaje de identidad. Es decir, solo las posiciones de restos de consulta fuera de los restos N- y C-terminales mas alejados de la secuencia objeto. Por ejemplo, una secuencia objeto de 90 restos aminoaddicos se alinea con una secuencia de consulta de 100 restos para determinar su porcentaje de identidad. La delecion aparece en el extremo N-terminal de la secuencia objeto y, por lo tanto, el alineamiento FASTDB no muestra un emparejamiento/alineamiento de los 10 primeros restos en el extremo N- terminal. Los 10 restos no emparejados representan 10% de la secuencia (numero de restos en los extremos N- y C-terminales no emparejados/numero total de restos en la secuencia de consulta) de modo que se resta 10% del resultado del porcentaje de identidad calculado mediante el programa FASTDB. Si los 90 restos restantes estan perfectamente emparejados el porcentaje de identidad final sena de 90%. En otro ejemplo, una secuencia objeto de 90 restos se compara con una secuencia de consulta de 100 restos. Esta vez las deleciones son deleciones internas de modo que no hay restos en los extremos N- o C-terminales de la secuencia objeto que no estan emparejados/alineados con la de consulta. En este caso, el porcentaje de identidad calculado mediante FASTDB no se corrige manualmente. De nuevo, solo las posiciones de restos fuera de los extremos N- y C-terminales de la secuencia objeto, como se presentan en el alineamiento FASTDB, que no estan emparejados/alineados con la secuencia de consulta se corrigen manualmente. No se realizan otras correcciones manuales para los fines de este aspecto.
Anticuerpos que se unen Inmunoespedficamente a Polipeptidos de BLyS
La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpos o variantes de los mismos) que se unen
inmunoespedficamente a polipeptidos de BLyS, comprendiendo dichos anticuerpos, o alternativamente consistiendo en, todo o una porcion de un dominio variable de cadena ligera y/o pesada de los scFv mencionados en la Tabla 1.
La presente memoria descriptiva tambien describe composiciones para su uso en la deteccion, diagnostico y/o pronostico de enfermedades o trastornos asociados con una expresion aberrante de BLyS o receptor de BLyS, o una funcion inapropiada de BLyS o receptor de BLyS en un animal, preferentemente un mairnfero, y mas preferentemente un ser humano, que comprende usar anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen
inmunoespedficamente a BLyS. Las enfermedades y trastornos que pueden detectarse, diagnosticarse o pronosticarse con los anticuerpos que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, trastornos inmunes (por ejemplo, lupus, artritis reumatoide, esclerosis multiple, miastenia grave, enfermedad de Hashimoto y smdrome de inmunodeficiencia) , trastornos inflamatorios (por ejemplo, asma, trastornos alergicos y artritis reumatoide), enfermedades infecciosas (por ejemplo, SIDA) y trastornos proliferativos (por ejemplo, leucemia, carcinoma y linfoma).
La presente memoria descriptiva describe ademas composiciones para prevenir, tratar o mejorar enfermedades o trastornos asociados con una expresion aberrante de BLyS o receptor de BLyS o una funcion inapropiada de BLyS o receptor de BLyS en un animal, preferentemente un marnffero, y mas preferentemente un ser humano, que comprende administrar a dicho animal una cantidad eficaz de uno o mas anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos), que se unen inmunoespedficamente a BLyS. Las enfermedades y trastornos que pueden prevenirse, tratarse o inhibirse administrando una cantidad eficaz de uno o mas anticuerpos o moleculas que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, trastornos inmunes (por ejemplo, lupus, artritis reumatoide, esclerosis multiple, miastenia grave, enfermedad de Hashimoto y smdrome de inmunodeficiencia), trastornos inflamatorios (por ejemplo, asma, trastornos alergicos y artritis reumatoide), enfermedades infecciosas (por ejemplo, SIDA) y trastornos proliferativos (por ejemplo, leucemia, carcinoma y linfoma).
Anticuerpos Anti-BLyS
Los anticuerpos que se describen en el presente documento se descubrieron, en parte, usando la tecnologfa de presentacion en fago. Las moleculas de anticuerpo de cadena sencilla ("scFv") presentadas en la superficie de partmulas de fago se exploraron para identificar aquellos scFv que se unieran inmunoespedficamente a BLyS, incluyendo la forma unida a membrana y la forma soluble de BLyS. La presente invencion incluye los scFv y porciones de los mismos que se identifico que se uman inmunoespedficamente a BLyS, incluyendo los scFv que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS, los scFv que se unen inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS y los scFv que se unen inmunoespedficamente tanto a la forma soluble como a la forma unida a membrana de BLyS. En particular, la presente memoria descriptiva describe scFv que comprenden, o alternativamente consisten en la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1-2128 mencionadas en la Tabla 1. Preferentemente, los scFv que se describen en el presente documento comprenden, o alternativamente consisten en, la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 834-872, 1563-1595 o 1881-1908. Los scFv incluyen scFv que se unen a BLyS soluble (por ejemplo, scFv que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1563-1880), scFv que se unen a la forma unida a membrana de BLyS
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(por ejemplo, scFv que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1881-2128) y scFv que se unen tanto a la forma soluble como a la forma unida a membrana de BLyS (por ejemplo, scFv que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1-1562) . Tambien se describen en el presente documento moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos o variantes de estos scFv que se unen inmunoespedficamente a BLyS, asf como las moleculas de acido nucleico que codifican estos scFv, moleculas, fragmentos y/o variantes.
La presente memoria descriptiva tambien describe scFv que se unen inmunoespedficamente a BLyS que comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de uno cualquiera de los dominios VH mencionados en la Tabla 1 y/o uno cualquiera de los dominios VL mencionados en la Tabla 1. Los scFv que se describen en el presente documento comprenden la secuencia de aminoacidos de un dominio VH y un dominio VL del mismo scFv mencionado en la Tabla 1. Alternativamente, los scFv que se describen en el presente documento comprenden la secuencia de aminoacidos de un dominio VH y un dominio VL de scFv diferentes mencionados en la Tabla 1. Los scFv que se unen inmunoespedficamente a BLyS tambien pueden comprender un polipeptido que tenga la secuencia de aminoacidos de una, dos, tres o mas de cualquiera de las CDR de VH mencionadas en la Tabla 1 y/o una, dos, tres o mas de cualquiera de las CDR de VL mencionadas en la Tabla 1. En los scFv que se describen en el presente documento comprenden la secuencia de aminoacidos de una CDR de VH y una cDr de VL del mismo scFv mencionado en la Tabla 1. Alternativamente, los scFv que se describen en el presente documento comprenden la secuencia de aminoacidos de una CDR de VH y una CDR de VL de scFv diferentes mencionados en la Tabla 1. Tambien se describen en la presente memoria moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpos o variantes de los scFv mencionados en la Tabla 1 que se unen inmunoespedficamente a BLyS, asf como las moleculas de acido nucleico que codifican estos scFv, moleculas, fragmentos y/o variantes .
(La Tabla 1 puede encontrarse al final de la memoria descriptiva justo antes de las reivindicaciones).
En un aspecto espedfico, un scFv que se describe en la presente memoria que se une inmunoespedficamente a una forma soluble de BLyS comprende, o alternativamente consiste en la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 563 - 1880 mencionadas en la Tabla 1. En otro aspecto espedfico, un scFv que se describe en la presente memoria que se une inmunoespedficamente a una forma soluble de BLyS comprende, o alternativamente consiste en, la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1570 - 1595. Mas preferentemente, un scFv que se une inmunoespedficamente a una forma soluble de BLyS comprende, o alternativamente consiste en la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1563-1569.
Un scFv que se describe en la presente memoria que se une inmunoespedficamente a una forma unida a membrana de BLyS comprende, o alternativamente consiste en la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1881 - 2128 mencionadas en la Tabla 1. Un scFv que se describe en la presente memoria que se une inmunoespedficamente a una forma unida a membrana de BLyS comprende, o alternativamente consiste en la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1886 - 1908. En un aspecto espedfico, un scFv que se describe en la presente memoria que se une inmunoespedficamente a una forma unida a membrana de BLyS tambien comprende, o alternativamente consiste en, la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1881 - 1885.
En un aspecto espedfico, un scFv que se une inmunoespedficamente tanto a la forma soluble como a la forma unida a membrana de BLyS comprende, o alternativamente consiste en la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1 - 1562 mencionadas en la Tabla 1. En otro aspecto espedfico, un scFv que se describe en la presente memoria que se une inmunoespedficamente tanto a la forma soluble como a la forma unida a membrana de BLyS comprende, o como alternativa consiste en, la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 834 - 872. Preferentemente, un scFv que se une inmunoespedficamente tanto a la forma soluble como a la forma unida a membrana de BLyS comprende, o alternativamente consiste en, una cualquiera de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1-46 o 321 - 329. Tambien se incluyen en la presente invencion moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos o variantes de estos scFv que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS y/o a la forma unida a membrana de BLyS, asf como a las moleculas de acido nucleico que codifican estos scFv, moleculas, fragmentos y/o variantes.
En un aspecto espedfico, los scFV que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de uno cualquiera de los dominios VH contenidos en las SEQ ID NO: 1563 - 1880 que se describen en la Tabla 1 y/o uno cualquiera de los dominios VL contenidos en las SEQ ID NO: 1563 - 1880 que se describen en la Tabla 1. Preferentemente, los scFv que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR de VH y una CDR de VL del mismo scFv mencionado en la Tabla 1. Alternativamente, los scFv que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR de VH y una CDR de VL de scFv diferentes mencionados en la Tabla 1. En un aspecto espedfico, los scFv que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una, dos, tres o mas de cualquiera de las cDr de VH de las SEQ ID NO: 1563 - 1880 que se describen en la Tabla 1 y/o una, dos, tres o mas de cualquiera de las CDR de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1563-1880 que se describen en la Tabla 1. Preferentemente, los scFv que se describen en el presente
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documento que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VH y un dominio VL del mismo scFv mencionado en la Tabla 1 . En un aspecto espedfico alternativo, los scFv que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VH y un dominio VL de scFv diferentes mencionados en la Tabla 1. Preferentemente, los scFv que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS pueden comprender un polipeptido que tenga la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las CDR3 de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1563 - 1880 que se describen en la Tabla 1 y/o una cualquiera de las CDR3 de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1563 - 1880 que se describen en la Tabla 1. Preferentemente, los scFv que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR de VH y una CDR de VL del mismo scFv mencionado en la Tabla 1. Alternativamente, los scFv que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR de VH y una CDR de VL de scFv diferentes mencionados en la Tabla 1. Tambien se describen en el presente documento moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos o variantes de estos scFv que se unen inmunoespedficamente a BLyS, preferentemente a la forma soluble de BLyS, asf como las moleculas de acido nucleico que codifican estos scFv, moleculas, fragmentos y/o variantes.
Tambien se describen en el presente documento scFv que se unen inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de uno cualquiera de los dominios VH contenidos en las SEQ ID NO: 1881 - 2128 que se describe en la Tabla 1 y/o uno cualquiera de los dominios VL contenidos en las SEQ ID NO: 1881 - 2128 que se describen en la Tabla 1. Tambien se describen en el presente documento scFv de la presente invencion que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS, que comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR de VH y una CDR de VL del mismo scFv mencionado en la Tabla 1. Tambien se describen en el presente documento scFv de la presente invencion que se unen inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS, que comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VH y un dominio VL de scFv diferentes mencionados en la Tabla 1. Tambien se describen en el presente documento scFv que se unen espedficamente a la forma unida a membrana de BLyS, que comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una, dos, tres o mas de cualquiera de las CDR de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1881 - 2128 que se describen en la Tabla 1 y/o una, dos, tres o mas de cualquiera de las CDR de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1881 - 2128 que se describen en la Tabla 1. Los scFv que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VH y un dominio VL del mismo scFv mencionado en la Tabla 1. Alternativamente, los scFv que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio de VH y un dominio VL de scFv diferentes mencionados en la Tabla 1. Preferentemente, los scFv que se unen inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las CDR3 de VH contenidas en las SEQ Id NO: 1881 - 2128 que se describen en la Tabla 1 y/o una cualquiera de las CDR3 de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1881 - 2128 que se describen en la Tabla 1. Preferentemente, los scFv que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VH y un dominio VL del mismo scFv mencionado en la Tabla 1. Alternativamente, los scFv que se unen inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR de VH y una CDR de VL de scFv diferentes mencionados en la Tabla 1. Tambien se describen en el presente documento moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos o variantes de estos scFv, que se unen inmunoespedficamente a BLyS, preferentemente a la forma unida a membrana de BLyS, asf como las moleculas de acido nucleico que codifican estos scFv, moleculas, fragmentos y o variantes.
En un aspecto espedfico, los scFv que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble y a la forma unida a membrana de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de uno cualquiera de los dominios VH contenidos en las SEQ ID NO: 1 - 1562 que se describen en la Tabla 1 y/o uno cualquiera de los dominios VL contenidos en las SEQ ID NO: 1 - 1562 que se describen en la Tabla 1. Preferentemente, los scFv de la presente invencion que se unen inmunoespedficamente a las formas soluble y unida a membrana de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VH y un dominio VL del mismo scFv mencionado en la Tabla 1. Alternativamente, los scFv que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble y a la forma unida a membrana de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VH y un dominio VL de scFv diferentes mencionados en la Tabla 1. En un aspecto espedfico, los scFv que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble y a la forma unida a membrana de BLyS tambien comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una, dos, tres o mas de cualquiera de las CDR de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1 - 1562 que se describen en la Tabla 1 y/o una, dos, tres o mas de cualquiera de las CDR de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1 - 1562 que se describen en la Tabla 1. Preferentemente, los scFv que se describen en la presente memoria que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble y a la forma unida a membrana de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VH y un dominio VL del mismo scFv mencionado en la Tabla 1. Alternativamente, los scFv que se describen en la presente memoria que se unen inmunoespedficamente a las formas soluble y unida a
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membrana de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VH y un dominio VL de scFv diferentes mencionados en la Tabla 1. Preferentemente, los scFv que se unen inmunoespedficamente a las formas soluble y unida a membrana de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las CDR3 de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1 - 1562 que se describen en la Tabla 1 y/o una cualquiera de las CDR3 de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1 - 1562 que se describen en la Tabla 1. Preferentemente, los scFv que se unen inmunoespedficamente a las formas soluble y unida a membrana de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR de VH y una CDR de VL del mismo scFv mencionado en la Tabla 1. Alternativamente, los scFv que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a las formas soluble y unida a membrana de BLyS comprenden un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR de VH y una CDR de VL de scFv diferentes mencionados en la Tabla 1. Tambien se describen en el presente documento moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos o variantes de estos scFv o moleculas que se unen inmunoespedficamente a BLyS, preferentemente las formas soluble y unida a membrana de BLyS, asf como las moleculas de acido nucleico que codifican estos scFv, moleculas, fragmentos y/o variantes.
La presente memoria descriptiva describe anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespedficamente a un polipeptido o un fragmento polipeptfdico de BLyS. En particular, la memoria descriptiva describe anticuerpos que corresponden a los scFv mencionados en la Tabla 1, dichos scFv pueden "convertirse" de forma rutinaria en moleculas de inmunoglobulina insertando, por ejemplo, las secuencias de nucleotidos que codifican los dominios VH y/o VL del scFv en un vector de expresion que contiene las secuencias de dominio constante y modificado por ingeniena genetica para dirigir la expresion de la molecula de inmunoglobulina, como se describe en mas detalle en el Ejemplo 20, a continuacion.
En particular, la memoria descriptiva proporciona anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos), en la que dichos anticuerpos comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de uno cualquiera de los dominios VH contenidos en las secuencias mencionadas en la Tabla 1. La presente invencion tambien proporciona anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a un polipeptido, o fragmento polipeptfdico de BLyS, en la que dichos anticuerpos comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una, dos, tres o mas de cualquiera de las CDR de VH contenidas en las secuencias mencionadas en la Tabla 1. Tambien se incluyen en la presente invencion moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en estos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos, que se unen inmunoespedficamente a BLyS o un fragmento de BLyS, asf como las moleculas de acido nucleico que codifican estos anticuerpos, moleculas, fragmentos y/o variantes.
La memoria descriptiva tambien describe anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespedficamente a BLyS, que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR de VH mencionada en la Tabla 1. En particular, la presente invencion proporciona anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a BLyS, que comprenden, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la
secuencia de aminoacidos de una CDR1 de VH contenida en las SEQ ID NO: 1 - 46, 321 - 329, 1563 - 1569 o 1881 -
1885 que se describen en la Tabla 1. Tambien se describen en el presente documento anticuerpos que se unen
inmunoespedficamente a BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene la
secuencia de aminoacidos de una CDR2 de VH contenida en las SEQ ID NO: 1 - 46, 321 - 329, 1563 - 1569, 1881 - 1885 que se describen en la Tabla 1. Preferentemente, los anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a BLyS comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR3 de VH contenida en las SEQ ID NO: 1 - 46, 321 - 29, 1563 - 1569 o 1881 - 1885 que se describen en la Tabla 1. Tambien se describen en el presente documento anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a BLyS y comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR1 de VH contenida en las SEQ ID NO: 834 - 872, 1570 - 1595 o 1886 - 1908, que se describen en la Tabla 1; una CDR2 de VH contenida en las SEQ ID NO: 834 - 872, 1570 - 1595 o 1886 - 1908; y/o una CDR3 de VH contenida en las SEQ ID NO: 834 - 872, 1570 - 1595 o 1886 - 1908, que se describen en la Tabla 1. Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento comprenden, o alternativamente consisten en CDR de VH que proceden del mismo scFv que se describe en la Tabla 1. Tambien se incluyen en la presente invencion moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos o variantes de estos anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a BLyS, asf como las moleculas de acido nucleico que codifican estos anticuerpos, moleculas, fragmentos o variantes.
La presente memoria descriptiva describe anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes) que se unen inmunoespedficamente a un polipeptido o fragmento polipeptfdico de BLyS. En particular, la memoria descriptiva describe anticuerpos, en la que dichos anticuerpos comprenden, o alternativamente consisten en un dominio VL que tiene una secuencia de aminoacidos de uno cualquiera de los dominios VL mencionados en la Tabla 1. La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a un polipeptido o fragmento polipeptfdico de BLyS, en la que dichos anticuerpos comprenden, o alternativamente consisten en una CDR de VL que tiene una secuencia de aminoacidos de una, dos, tres o mas de cualquiera de las CDR de VL contenidas en las secuencias mencionadas en
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la Tabla 1. Tambien se describen en el presente documento moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos o variantes de estos anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a BLyS, as^ como las moleculas de acido nucleico que codifican estos anticuerpos, moleculas, fragmentos o variantes.
En un aspecto espedfico, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespedficamente a BLyS comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR de VL mencionada en la Tabla 1. En particular, la memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR1 de VL contenida en las SEQ ID NO: 1 - 46, 321 - 329, 1563 - 1569 o 1881 - 1885 que se describen en la Tabla 1. En un aspecto espedfico, los anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a BLyS comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR2 de VL contenida en las SEQ ID NO: 1 - 46, 321 - 329, 1563 - 1569 o 1881 - 1885, que se describen en la Tabla 1. En otro aspecto espedfico, los anticuerpos comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una cDR3 de VL contenida en las SEQ ID NO: 1 -46, 321 - 329, 1563 - 1569 o 1881 - 1885 descritas en la Tabla 1. En otro aspecto espedfico, los anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a BLyS comprenden, o alternativamente consisten en: un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CdR1 de VL contenida en las SEQ ID NO: 834 - 872, 1570 - 1595 o 1886 - 1908 que se describen en la Tabla 1; una CDR2 de VL de las SEQ ID NO: 834 - 872, 1570 - 1595 o 1886 - 1908 que se describen en la Tabla 1; y una CDR3 de VL contenida en las SEQ ID NO: 834 - 872, 1570 - 1595 o 1886 - 1908 que se describen en la Tabla 1. Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento comprenden, o alternativamente consisten en CDR de VL que proceden del mismo scFv que se describe en la Tabla 1. Tambien se incluyen en la presente invencion moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos o variantes de estos anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a BLyS, asf como las moleculas de acido nucleico que codifican estos anticuerpos, moleculas, fragmentos o variantes.
La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpos o variantes de los mismos) que se unen inmunoespedficamente a un polipeptido o un fragmento polipeptfdico de BLyS, en la que dichos anticuerpos comprenden, o alternativamente consisten en un dominio VH de uno de los scFv mencionados en la Tabla 1 combinado con un dominio VL de uno de los scFv mencionados en la Tabla 1, u otro dominio VL. La presente memoria descriptiva describe ademas anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespedficamente a un polipeptido o a un fragmento polipeptfdico de BLyS, en la que dichos anticuerpos comprenden, o alternativamente consisten en un dominio VL de uno de los scFv mencionados en la Tabla 1 combinado con un dominio VH de uno de los scFv mencionados en la Tabla 1, u otro dominio VH. Preferentemente, los anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a un polipeptido o a un fragmento polipeptfdico de BLyS comprenden, o alternativamente consisten en, un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VH contenido en las SEQ ID NO: 1 - 46, 321 - 329, 834 - 872, 1563 - 1595 o 1881 - 1908 que se describen en la Tabla 1 y un dominio VL contenido en las SEQ ID NO: 1 - 46, 321 - 329, 834 - 872, 1563 - 1595 o 1881 - 1908 que se describen en la Tabla 1. Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento alternativamente consisten en un dominio VH y VL del mismo scFv que se describe en la Tabla 1. Tambien se incluyen en la presente invencion moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos o variantes de estos anticuerpos, que se unen inmunoespedficamente a BLyS, asf como las moleculas de acido nucleico que codifican estos anticuerpos, moleculas, fragmentos o variantes.
La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes) que se unen inmunoespedficamente a un polipeptido o fragmento polipeptfdico de BLyS, en la que dichos anticuerpos comprenden, o alternativamente consisten en una, dos, tres o mas CDR de VH y una, dos, tres o mas CDR de VL, a las que se hace referencia en la Tabla 1. Particularmente, la memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a un polipeptido o fragmento polipeptfdico de BLyS, en la que dichos anticuerpos comprenden, o alternativamente consisten en una CDR1 de VH y una CDR1 de VL, una CDR1 de VH y una CdR2 de VL, una CDR1 de VH y una
CDR3 de VL, una CDR2 de VH y una CDR1 de VL, una CDR2 de VH y una CDR2 de VL, una CDR2 de VH y una
CDR3 de VL, una CDR3 de VH y una CDR1 de VH, una CDR3 de VH y una CDR2 de VL, una CDR3 de VH y una
CDR3 de VL, o cualquier combinacion de las mismas, de las CDR de VH y CDR de VL mencionadas en la Tabla 1.
Preferentemente, una o mas de estas combinaciones son del mismo scFv que se describe en la Tabla 1. Tambien se describen en el presente documento moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos o variantes de estos anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a BLyS, asf como las moleculas de acido nucleico que codifican estos anticuerpos, moleculas, fragmentos o variantes.
Preferentemente, la memoria descriptiva describe anticuerpos en los que la CDRX de VH (donde X = 1, 2 o 3) y la CDRY de VL (donde Y = 1, 2 o 3) son de scFv con la misma especificidad (es decir, de scFv que se unen a BLyS soluble, de scFv que se unen a BLyS unido a membrana o de scFv que se unen tanto a BLyS soluble como unido a membrana. Tambien se describen en el presente documento moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos o variantes de estos anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a BLyS, asf como las moleculas de acido nucleico que codifican estos anticuerpos, moleculas, fragmentos o variantes.
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El termino "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a moleculas de inmunoglobulina y porciones inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulina, es decir, moleculas que contienen un sitio de union a antfgeno que se une inmunoespedficamente a un antfgeno. Como tal, el termino "anticuerpo" incluye no solo moleculas de anticuerpo completas, sino tambien fragmentos de anticuerpo, asf como variantes (incluyendo derivados) de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, anticuerpos monoclonales, multiespedficos, humanos o quimericos, anticuerpos de cadena sencilla, Fv de cadena sencilla (scFv), fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, Fv unidos por enlaces disulfuro (sdFv), anticuerpos antiidiotfpicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id contra anticuerpos de la presente invencion) y fragmentos de union a epftopo de cualquiera de los anteriores. Las moleculas de inmunoglobulina de la presente invencion pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2) o subclase de molecula de inmunoglobulina. Los anticuerpos que se describen en el presente documento tambien incluyen moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una porcion de una secuencia de aminoacidos contenida en las SEQ ID NO: 1 - 46, 321 - 329, 834 - 872, 1563 - 1595 o 1881 - 1908. Preferentemente, un anticuerpo que se describe en el presente documento comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de un dominio VH, cDr de VH, dominio VL o CDR de VL de uno cualquiera de los contenidos en las secuencias mencionadas en la Tabla 1. Los anticuerpos que se describen en el presente documento tambien incluyen moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos o variantes de los anticuerpos anteriores que se unen inmunoespedficamente a BLyS.
Mas preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento son anticuerpos completos o fragmentos de anticuerpo que se unen inmunoespedficamente a BLyS humano. Los fragmentos de anticuerpo de la presente invencion que se unen inmunoespedficamente a BLyS humano incluyen, pero sin limitacion, Fab, Fab' y F(ab')2, fragmentos Fd, Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, Fv unidos por enlaces disulfuro (sdFv), fragmentos que comprenden, o alternativamente consisten en un dominio VL o VH y fragmentos de union a epftopo de cualquiera de los anteriores.
Los fragmentos de anticuerpo de union a BLyS, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla, pueden comprender, o alternativamente consistir en la region o regiones variables en solitario o en corabinacion con la totalidad o una parte de los siguientes: region bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que se une inmunoespedficamente a BLyS, comprendiendo dichos polipeptidos, o alternativamente consistiendo en una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas CDR mencionadas en la Tabla 1, preferentemente un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una CDR3 de VH y/o una CDR3 de VL de las contenidas en las SEQ ID NO: 1 - 46, 321 - 329, 834 - 872, 1563 - 1595 o 1881 - 1908, que se describen en la Tabla 1. Mas preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento comprenden, o alternativamente consisten en una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas CDR del mismo scFv al que se hace referencia en la Tabla 1. Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden ser de cualquier origen animal, incluyendo aves y mairftferos. Preferentemente, los anticuerpos son humanos, murinos (por ejemplo, de raton y rata), de burro, de oveja, de conejo, de cabra, de cobaya, de camello, de caballo o de polio. Mas preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos humanos. Como se usa en el presente documento, el termino de anticuerpos "humanos" incluye anticuerpos que tienen la secuencia de aminoacidos de una inmunoglobulina humana e incluye anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana y xenoratones u otros organismos que se han obtenido por ingeniena genetica para producir anticuerpos humanos. Para una discusion detallada de unas pocas tecnologfas para la produccion de anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y de protocolos para producir dichos anticuerpos, veanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Patente Europea N.° 0 598 877; Patentes de EE.UU. N.° 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771 y 5.939.598; y Lonberg y Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65- 93(1995). Pueden producirse anticuerpos humanos o anticuerpos monoclonales quimericos "humanizados" usando tecnicas descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la tecnica. Por ejemplo, se conocen en la tecnica procedimientos para producir anticuerpos quimericos. Veanse para una revision las referencias siguientes: Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi y col., BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly y col., Patente de Estados Unidos N.° 4.816.567; Taniguchi y col., documento EP 171496; Morrison y col., documento EP 173494; Neuberger y col., documento WO 8601533; Robinson y col., documento WO 8702671; Boulianne y col., Nature 312:643 (1984); Neuberger y col., Nature 314:268 (1985). Ademas, compamas tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) y Genpharm (San Jose, CA) pueden ocuparse de proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antfgeno seleccionado usando una tecnologfa similar a la descrita anteriormente.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden ser monovalentes, bivalentes, trivalentes o multivalentes. Por ejemplo, los scFv monovalentes pueden multimerizarse qmmicamente o por asociacion con otra protema o sustancia. Un scFv que esta fusionado a una etiqueta de hexahistidina o una etiqueta Flag puede multimerizarse usando Ni-NTA agarosa (Qiagen) o usando anticuerpos anti-Flag (Stratagene, Inc.).
Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden ser monoespedficos, biespedficos, triespedficos o de mayor multiespecificidad. Los anticuerpos multiespedficos pueden ser espedficos para diferentes epftopos de un polipeptido de BLyS, o fragmento del mismo, o pueden ser espedficos tanto para un polipeptido de BLyS, o fragmento del mismo, como para un epftopo heterologo, tal como un polipeptido heterologo o material de
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soporte solido. Veanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, y col., J. Immunol. 147:60-69 (1991); las Patentes de EE.UU. N.° 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920; 5.601.819; Kostelny y col., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992).
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) pueden unirse inmunoespedficamente a BLyS murino (por ejemplo, un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de BLyS humano (SEQ ID NO: 3228 y/o 3229) o BLyS expresado en monocitos humanos; BLyS murino (SEQ ID NO: 3230 o 3231) o BLyS expresado en monocitos murinos; BLyS de rata (las formas solubles que se proporcionan en las SEQ ID NO: 3232, 3233, 3234 y/o 3235 o en una forma asociada a membrana, por ejemplo, en la superficie de monocitos de rata); o BLyS de mono (por ejemplo, los polipeptidos de BLyS de mono de las SEQ ID NO: 3236 y/o 3237, la forma soluble de BLyS de mono o BLyS expresado en monocitos de mono) , preferentemente los anticuerpos de la presente invencion se unen inmunoespedficamente a BLyS humano. Preferentemente, los anticuerpos de la presente invencion se unen inmunoespedficamente a BLyS humano y de mono. Tambien preferentemente, los anticuerpos de la presente invencion se unen inmunoespedficamente a BLyS humano y BLyS murino. Mas preferentemente, los anticuerpos de la presente invencion se unen inmunoespedficamente y con mayor afinidad a BLyS humano que a BLyS murino.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento tambien pueden describirse o especificarse en terminos de su reactividad cruzada. Se incluyen los anticuerpos que no se unen a ningun otro analogo, ortologo u homologo de un polipeptido de la presente invencion. Tambien se incluyen en la presente invencion los anticuerpos que se unen a polipeptidos con una identidad de al menos un 95 %, al menos un 90 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 75 %, al menos un 70 %, al menos un 65 %, al menos un 60 %, al menos un 55 % y al menos un 50 % (segun se calcula usando procedimientos conocidos en la tecnica y descritos en el presente documento) con un polipeptido de la presente invencion. En un aspecto espedfico, los anticuerpos que se describen en el presente documento presentan reactividad cruzada con APRIL (SeQ ID NO: 3239; N.° de Acceso GenBank AF046888; J. Exp. Med 188 (6): 1185-1190; Publicacion Internacional PCT WO97/33902). Espedficamente, los anticuerpos que se describen en la presente memoria presentan reactividad cruzada con homologos murinos, de rata y/o conejo de protemas humanas y los epftopos correspondientes de los mismos. Tambien se incluyen en la presente invencion los anticuerpos que no se unen a polipeptidos con una identidad inferior a un 95 %, inferior a un 90 %, inferior a un 85 %, inferior a un 80 %, inferior a un 75 %, inferior a un 70 %, inferior a un 65 %, inferior a un 60 %, inferior a un 55 % e inferior a un 50 % (segun se calcula usando procedimientos conocidos en la tecnica y descritos en el presente documento) con un polipeptido de la presente invencion. Espedficamente, la reactividad cruzada descrita anteriormente es con respecto a cualquier polipeptido inmunogenico o antigenico especifico individual, o una combinacion o combinaciones de 2, 3, 4, 5 o mas de los polipeptidos inmunogenicos y/o antigenicos espedficos descritos en el presente documento. Se describen ademas en el presente documento anticuerpos que se unen a polipeptidos codificados por polinucleotidos que hibridan con un polinucleotido de la presente invencion en condiciones de hibridacion (como se describen en el presente documento).
Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) se unen inmunoespedficamente a BLyS y no presentan reactividad cruzada con ningun otro antfgeno. Mas preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen inmunoespedficamente a BLyS y no presentan reactividad cruzada con TRAIL, APRIL, Endoquina-alfa, TNF- alfa, beta-TNF, Fas-L o LIGHT.
La presente memoria descriptiva tambien describe una molecula de acido nucleico, generalmente aislada, que codifica un anticuerpo de la presente invencion (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos). En un aspecto espedfico, una molecula de acido nucleico que se describe en el presente documento codifica un anticuerpo que comprende, o alternativamente consiste en un dominio VH que tiene una secuencia de aminoacidos de uno cualquiera de los dominios VH mencionados en la Tabla 1. En otro aspecto espedfico, una molecula de acido nucleico que se describe en el presente documento codifica un anticuerpo que comprende, o alternativamente consiste en una CDR1 de VH que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las CDR1 de VH mencionadas en la Tabla 1. En otro aspecto espedfico, una molecula de acido nucleico codifica un anticuerpo que comprende, o alternativamente consiste en una CDR2 de VH que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las CDR2 de VH mencionadas en la Tabla 1. En otro aspecto espedfico, una molecula de acido nucleico que se describe en el presente documento codifica un anticuerpo que comprende, o alternativamente consiste en una CDR3 de VH que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las CDR3 de VH mencionadas en la Tabla 1. Tambien se describen en el presente documento moleculas de acido nucleico que codifican anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a BLyS y comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos o variantes de los dominios VH y/o CDR de VH.
En un aspecto espedfico, una molecula de acido nucleico que se describe en el presente documento codifica un anticuerpo (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que comprende, o alternativamente consiste en un dominio VL que tiene una secuencia de aminoacidos de uno cualquiera de los dominios VL mencionados en la Tabla 1. En otro aspecto espedfico, una molecula de acido nucleico que se describe en el presente documento codifica un anticuerpo que comprende, o
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alternativamente consiste en una CDR1 de VL que tiene la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las CDR1 de VL mencionadas en la Tabla 1. En otro aspecto espedfico, una molecula de acido nucleico que se describe en el presente documento codifica un anticuerpo que comprende, o alternativamente consiste en una CDR2 de VL que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las CDR2 de VL mencionadas en la Tabla 1. En otro aspecto espedfico, una molecula de acido nucleico que se describe en el presente documento codifica un anticuerpo que comprende, o alternativamente consiste en una CDR3 de VL que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las CDR3 de VL mencionadas en la Tabla 1. Tambien se describen en el presente documento acidos nucleicos que codifican anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a BLyS y comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos o variantes de los dominios VL y/o VLCDR.
En un aspecto espedfico, una molecula de acido nucleico que se describe en el presente documento codifica un anticuerpo (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que comprende, o alternativamente consiste en un dominio VH que tiene una secuencia de aminoacidos de uno cualquiera de los dominios VH mencionados en la Tabla 1 y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoacidos de uno cualquiera de los dominios VL mencionados en la Tabla 1. En otro aspecto espedfico, una molecula de acido nucleico que se describe en el presente documento codifica un anticuerpo que comprende, o alternativamente consiste en una CDR1 de VH, una CDR1 de VL, una CDR2 de VH, una CDR2 de Vl, una CDR3 de VH, una CDR3 de VL o cualquier combinacion de las mismas, que tiene una secuencia de aminoacidos mencionada en la Tabla 1. Tambien se describen en el presente documento acidos nucleicos que codifican anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a BLyS y comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos o variantes de los dominios VL y/o VHCDR y/o VLCDR.
La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en variantes (incluyendo derivados) de los dominios VH, CDR de VH, dominios VL y CDR de VL descritos en el presente documento, uniendose dichos anticuerpos inmunoespedficamente a BLyS. Pueden usarse tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia para introducir mutaciones en la secuencia de nucleotidos que codifica una molecula de la presente invencion, incluyendo, por ejemplo, mutagenesis dirigida y mutagenesis mediada por PCR, que dan como resultado sustituciones de aminoacidos. Preferentemente, las variantes (incluyendo derivados) codifican menos de 50 sustituciones de aminoacidos, menos de 40 sustituciones de aminoacidos, menos de 30 sustituciones de aminoacidos, menos de 25 sustituciones de aminoacidos, menos de 20 sustituciones de aminoacidos, menos de 15 sustituciones de aminoacidos, menos de 10 sustituciones de aminoacidos, menos de 5 sustituciones de aminoacidos, menos de 4 sustituciones de aminoacidos, menos de 3 sustituciones de aminoacidos o menos de 2 sustituciones de aminoacidos respecto al dominio VH, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, dominio VL, VLCDR1, VLCDR2 o VLCDR3 de referencia. En aspectos espedficos, las variantes codifican sustituciones de CDR3 de VH. En un aspecto preferido, las variantes tienen sustituciones de aminoacidos conservativas en uno o mas restos aminoaddicos no esenciales predichos. Una "sustitucion de aminoacido conservativa" es una en la que el resto aminoaddico se sustituye con un resto aminoaddico que tiene una cadena lateral con una carga similar. Se han definido en la tecnica familias de restos aminoaddicos que tienen cadenas laterales con cargas similares. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistema), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Alternativamente, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagenesis de saturacion, y los mutantes resultantes pueden explorarse para determinar su actividad biologica para identificar mutantes que conserven la actividad (por ejemplo, la capacidad para unirse a BLyS). Despues de la mutagenesis, la protema codificada puede expresarse de forma rutinaria y la actividad funcional y/o biologica de la protema codificada (por ejemplo, la capacidad para unirse inmunoespedficamente a BLyS) puede determinarse usando tecnicas descritas en el presente documento o por tecnicas de modificacion de forma rutinaria conocidas en la tecnica.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento incluyen derivados (es decir, variantes) que estan modificados, por ejemplo, por union covalente de cualquier tipo de molecula al anticuerpo de modo que la union covalente no afecte a la capacidad del anticuerpo para unirse inmunoespedficamente a BLyS. Por ejemplo, pero no a modo de limitacion, los derivados que se describen en el presente documento incluyen anticuerpos que se han modificado, por ejemplo, por glucosilacion, acetilacion, pegilacion, fosforilacion, amidacion, derivatizacion mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos, escision proteolftica, union a un ligando celular u otra protema, etc. Cualquiera de numerosas modificaciones qmmicas puede llevarse a cabo por tecnicas conocidas incluyendo, pero sin limitacion, escision qmmica espedfica, acetilacion, formilacion, smtesis metabolica de tunicamicina, etc. Ademas, el derivado puede contener uno o mas aminoacidos no clasicos.
Espedficamente, un anticuerpo que se describe en el presente documento (incluyendo una molecula que comprende, o alternativamente consiste en un fragmento de anticuerpo o variante del mismo), que se une inmunoespedficamente a BLyS comprende, o alternativamente consiste en una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de nucleotidos que Idbrida con una secuencia de nucleotidos que es complementaria a la que codifica uno de los dominios VH o VL mencionados en la Tabla 1 en condiciones rigurosas, por ejemplo, hibridacion con ADN unido a filtro en cloruro sodico/citrato sodico (SSC) 6x a aproximadamente 45 °C, seguida de
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uno o mas lavados en SSC 0,2x/SDS 0 % a aproximadamente 50-65 °C, en condiciones altamente rigurosas, por ejemplo, hibridacion con acido nucleico unido a filtro en SSC 6x a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o mas lavados en SSC 0,1x/SDS 0,2 % a aproximadamente 68 °C, o en otras condiciones de hibridacion rigurosas que conocen los expertos en la materia (vease, por ejemplo, Ausubel, F. M. y col., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, en las paginas 6.3.1-6.3.6 y 2.10.3). En otro aspecto, un anticuerpo que se describe en el presente documento que se une inmunoespedficamente a BLyS comprende, o alternativamente consiste en una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de nucleotidos que dbrida con una secuencia de nucleotidos que es complementaria a la que codifica una de las CDR de VH o CDR de VL mencionadas en la Tabla 1 en condiciones rigurosas, por ejemplo, hibridacion en las condiciones que se han descrito anteriormente, o en otras condiciones de hibridacion rigurosas conocidas por los expertos en la materia. En otro aspecto, un anticuerpo que se describe en el presente documento que se une inmunoespedficamente a BLyS comprende, o alternativamente consiste en una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de nucleotidos que dbrida con una secuencia de nucleotidos que es complementaria a la que codifica una de las CDR3 de VH mencionadas en la Tabla 1 en condiciones rigurosas, por ejemplo, hibridacion en las condiciones que se han descrito anteriormente, o en otras condiciones de hibridacion rigurosas conocidas por los expertos en la materia. Tambien se describen en el presente documento moleculas de acido nucleico que codifican estos anticuerpos.
En un aspecto espedfico, un anticuerpo (incluyendo una molecula que comprende, o alternativamente consiste en un fragmento de anticuerpo o variante del mismo) que se une inmunoespedficamente a BLyS comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al
menos un 65 %; al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al
menos un 95 % o al menos un 99 % con uno cualquiera de los dominios VH mencionados en la Tabla 1. Un anticuerpo que se describe en el presente documento que se une inmunoespedficamente a BLyS comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al
menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al
menos un 95 % o al menos un 99 % con una cualquiera de las CDR de VH mencionadas en la Tabla 1. Un anticuerpo que se describe en el presente documento que se une inmunoespedficamente a BLyS comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % con una cualquiera de las CDR3 de VH mencionadas en la Tabla 1. Tambien se describen en el presente documento las moleculas de acido nucleico que codifican estos anticuerpos.
En un aspecto espedfico, un anticuerpo que se describe en el presente documento (incluyendo una molecula que comprende, o alternativamente consiste en un fragmento de anticuerpo o variante del mismo), que se une inmunoespedficamente a BLyS comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80
%, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % con uno cualquiera de los dominios
VL mencionados en la Tabla 1. Un anticuerpo que se describe en el presente documento que se une inmunoespedficamente a BLyS comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80
%, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % con una cualquiera de las CDR de
VL mencionadas en la Tabla 1. En otro aspecto espedfico, un anticuerpo que se describe en el presente documento que se une inmunoespedficamente a BLyS comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % con una cualquiera de las CDR3 de VL mencionadas en la Tabla 1. Tambien se describen en el presente documento moleculas de acido nucleico que codifican estos anticuerpos.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) tambien pueden describirse o especificarse en terminos de su afinidad de union por BLyS, polipeptidos o fragmentos o variantes de polipeptidos de BLyS (por ejemplo, hacia la forma soluble de BLyS y/o la forma unida a membrana de BLyS). Espedficamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos de BLyS, o fragmentos o variantes de los mismos, con una constante de disociacion o Kd inferior a o igual a 5 X 10"2 M, 10"2 M, 5 X 10"3 M, 10"3 M, 5 X 10"4 M, 10"4 M, 5 X 10"5 M o 10"5 M. Mas preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos de BLyS o fragmentos o variantes de los mismos con una constante de disociacion o Kd inferior a o igual a 5 X 10"6 M, 10"6 M, 5 X 10"7 M, 10"7 M, 5 X 10"8 M o 10"8 M. Aun mas preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos de BLyS o fragmentos o variantes de los mismos con una constante de disociacion o Kd inferior a o igual a 5 X 10"9 M, 10"9 M, 5
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X 10-10 M, 10-10 M, 5 X 10-11 M, 10-11 M, 5 X 10-12 M, 10-12 M, 5 X 10-13 M, 10-13 M, 5 X 10-14 M, 10-14 M, 5 X 10-15 M o 10-15. La memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que se unen a polipeptidos de BLyS con una constante de disociacion o Kd que esta dentro de uno cualquiera de los intervalos que estan entre cada uno de los valores individuals enumerados.
Espedficamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos de BLyS o fragmentos o variantes de los mismos con una velocidad de disociacion (koff) inferior a o igual a 5 X 10-2 s-1, 10-2 s 5 X 10-3 s-1 o 10-3 s-1. Mas preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos de BLyS o fragmentos o variantes de los mismos con una velocidad de disociacion (koff) inferior a o igual
a 5 X 10-4 s-1
10-4 s-1, 5 X 10-5 s-1o 10-5 s-1, 5 X 10-6 s-1, 10-6 s-1, 5 X 10-7 s-1 o 10-7 s-1. La memoria descriptiva
describe anticuerpos que se unen a polipeptidos de BLyS con una velocidad de disociacion (koff) que esta dentro de uno cualquiera de los intervalos que estan entre cada uno de los valores individuales enumerados.
En un aspecto especifico, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos de BLyS o fragmentos o variantes de los mismos con una velocidad de asociacion (kon) super10r a o igual a 103 M-1 s-1, 5 X 103 M-1 s-1, 104 M-1 s-1 o 5 X 104 M-1 s-1. Mas preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos de BLyS o fragmentos o variantes de los mismos con una velocidad de asociacion (kon) super10r a o igual a 105 M-1 s-1, 5 X 105 M-1 s-1, 106 M-1 s-1 o 5 X 106 M-1 s-1 o 107 M-1 s-1. La presente invencion incluye anticuerpos que se unen a polipeptidos de BLyS con una velocidad de asociacion (kon) que esta dentro de uno cualquiera de los intervalos que estan entre cada uno de los valores individuales enumerados.
La memoria descriptiva describe anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que tienen una o mas de las mismas caractensticas biologicas que uno o mas de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por "caractensticas biologicas" se entienden las actividades in vitro o in vivo o las propiedades de los anticuerpos, tales como, por ejemplo, la capacidad para unirse a BLyS (por ejemplo, la forma soluble de BLyS, la forma unida a membrana de BLyS, la forma soluble y la forma unida a membrana de BLyS) y/o una region antigenica y/o epitopica de BLyS), la capacidad para bloquear sustancialmente la union de BLyS/receptor de BLyS (por ejemplo, TACI - N.° de acceso GenBank AAC51790 y/o BCMA - N.° de acceso GenBank Np 001183) o la capacidad para bloquear la actividad biologica mediada por BLyS (por ejemplo, la estimulacion de la proliferacion de linfocitos B y la produccion de inmunoglobulina). Opcionalmente, los anticuerpos de la presente invencion se uniran al mismo epftopo que al menos uno de los anticuerpos mencionados espedficamente en el presente documento. Dicha union a epftopo puede determinarse de forma rutinaria usando ensayos conocidos en la tecnica.
La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos), que neutralizan a BLyS o un fragmento del mismo, comprendiendo dichos anticuerpos, o alternativamente consistiendo en una porcion (es decir, un dominio VH, dominio VL, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) de un scFv mencionado en la Tabla 1, mas preferentemente que tiene una secuencia de aminoacidos contenida en las SEQ ID NO: 834- 872, 1570-1595 o 1886-1908 y, aun mas preferentemente, que tiene una secuencia de aminoacidos contenida en las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 1563-1569 o 1881-1885, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante de las mismas. Por anticuerpo que "neutraliza a BLyS o un fragmento del mismo" se entiende un anticuerpo que disminuye o suprime la capacidad de BLyS para unirse a su receptor (por ejemplo, TACI y BCMA) para estimular la proliferacion de linfocitos B, para estimular la secrecion de inmunoglobulina por linfocitos B y/o para estimular la cascada de senalizacion del receptor de BLyS. En un aspecto espedfico, un anticuerpo que neutraliza a BLyS o un fragmento del mismo comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VH contenido en las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 834-872, 1563-1595 o 1881-1908, como describe en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. En otro aspecto espedfico, un anticuerpo que neutraliza a BLyS o un fragmento del mismo comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VL contenido en las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 834-872, 1563-1595 o 1881-1908, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. En otro aspecto espedfico, un anticuerpo que neutraliza a BLyS o un fragmento del mismo comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio CDR de VH en las SEQ ID NO: 146, 321-329, 834-872, 1563-1595 o 1881-1908 que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. Preferentemente, un anticuerpo que neutraliza a BLyS o un fragmento del mismo comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR3 de VH contenida en las SEQ ID NO: 1-46, 321- 329, 834-872, 1563-1595 o 1881-1908 que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. En un aspecto espedfico, un anticuerpo que neutraliza a BLyS o un fragmento del mismo comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio de cDr de VL contenido en las SEQ ID NO: 1- 46, 321-329, 834-872, 1563-1595 o 1881-1908, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. Preferentemente, un anticuerpo que neutraliza a BLyS o un fragmento del mismo tambien comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR3 de VL contenida en las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 834-872, 1563-1595 o 1881-1908 que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. Tambien se describen en el presente documento las moleculas de acido nucleico que codifican estos anticuerpos.
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La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que inhiben (es decir, disminuyen o suprimen) la proliferacion de linfocitos B mediada por BLyS, segun se determina por cualquier procedimiento conocido en la tecnica tal como, por ejemplo, los ensayos descritos en los Ejemplos 21 y 22 a continuacion, comprendiendo dichos anticuerpos, o alternativamente consistiendo en una porcion (por ejemplo, un dominio VH, domino VL, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 834- 872, 1570-595, 1886-1908 y, aun mas preferentemente, que tienen una secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 1563-1569, 18811885 que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. En un aspecto espedfico, un anticuerpo que inhibe la proliferacion de linfocitos B mediada por BLyS comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VH contenido en las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 834-872, 1563-1595 o 1881-1908, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. En otro aspecto espedfico, un anticuerpo que inhibe la proliferacion de linfocitos B mediada por BLyS comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VL contenido en las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 834-872, 1563-1595 o 1881-1908, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. Preferentemente, un anticuerpo que inhibe la proliferacion de linfocitos B mediada por BLyS tambien comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR3 de VH contenida en las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 834-872, 1563-1595 o 1881-1908, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. Preferentemente, un anticuerpo que inhibe la proliferacion de linfocitos B mediada por BLyS comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR3 de VL contenida en las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 834-872, 1563-1595 o 1881- 1908, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. Tambien se describen en el presente documento moleculas de acido nucleico que codifican estos anticuerpos.
La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos), que aumentan la actividad de BLyS o un fragmento del mismo, comprendiendo dichos anticuerpos, o alternativamente consistiendo en, una porcion (es decir, un domino VH, domino VL, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 834-872, 1570-595 o 18861908, y que tiene preferentemente una secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 1563- 1569, 1881-1885, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. Por anticuerpo que "aumenta la actividad de BLyS o un fragmento del mismo" se entiende un anticuerpo que aumenta la capacidad de BLyS para unirse a su receptor (por ejemplo, TACI o BCMA) para estimular la proliferacion de linfocitos B, para estimular la secrecion de inmunoglobulina por linfocitos B y/o para estimular la cascada de senalizacion del receptor de BLyS. En otro aspecto espedfico, un anticuerpo que aumenta la actividad de BLyS o un fragmento del mismo comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VH contenido en las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 834-872, 1563-1595 o 1881- 1908, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. En un aspecto espedfico, un anticuerpo que aumenta la actividad de BLyS o un fragmento del mismo comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VL contenido en las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 834-872, 1563-1595 o 1881-1908, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. En otro aspecto espedfico, un anticuerpo que aumenta la actividad de BLyS o un fragmento del mismo comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un domino CDR de VH contenido en las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 834-872, 1563-1595 o 18811908, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. Preferentemente, un anticuerpo que aumenta la actividad de BLyS o un fragmento del mismo comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR3 de VH contenida en las SEQ ID NO: 1-46, 321- 329, 834-872, 1563-1595 o 1881-1908, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. En otro aspecto espedfico, un anticuerpo que aumenta BLyS o un fragmento del mismo comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio CDR de VL contenido en las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 834-872, 1563-1595 o 1881-1908, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. Preferentemente, un anticuerpo que aumenta la actividad de BLyS o un fragmento del mismo comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR3 de VL contenida en las SEQ ID NO: 1-46, 321- 329, 834-872, 1563-1595 o 1881-1908, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. Tambien se describen en el presente documento moleculas de acido nucleico que codifican estos anticuerpos.
La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que estimulan la proliferacion de linfocitos B mediada por BLyS segun se determina por cualquier procedimiento conocido en la tecnica, tal como, por ejemplo, los ensayos descritos en los Ejemplos 21 y 22 a continuacion, comprendiendo dichos anticuerpos, o alternativamente consistiendo en una porcion (por ejemplo, un dominio VH, domino VL, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 834-872, 1570-1595 o 1886-1908, y aun mas preferentemente que tiene una secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 1563-1569 o 1881-1885 que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. En un aspecto espedfico, un anticuerpo que estimula la proliferacion de linfocitos B mediada por BLyS comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un
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dominio VH contenido en las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 834-872, 1563-1595 o 1881-1908, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. En otro aspecto espedfico, un anticuerpo que estimula la proliferacion de linfocitos B mediada por BLyS comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de un dominio VL contenido en las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 834-872, 1563-1595 o 1881- 1908, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. Preferentemente, un anticuerpo que estimula la proliferacion de linfocitos B mediada por BLyS comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una cDr3 de VH contenida en las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 834-872, 1563-1595 o 1881- 1908, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. Preferentemente, un anticuerpo que estimula la proliferacion de linfocitos B mediada por BLyS comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR3 de VL contenida en las SEQ ID NO: 1-46, 321-329, 834-872, 1563-1595 o 1881- 1908, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. Tambien se describen en el presente documento moleculas de acido nucleico que codifican estos anticuerpos.
La presente memoria descriptiva tambien describe protemas de fusion que comprenden, o alternativamente consisten en un anticuerpo (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se une espedficamente a BLyS y un polipeptido heterologo. Preferentemente, el polipeptido heterologo con el que se fusiona el anticuerpo es util para la funcion de linfocitos B o es util para dirigir el anticuerpo a linfocitos B. Preferentemente, el polipeptido heterologo con el que se fusiona el anticuerpo es util para la funcion de celulas monodticas o es util para dirigir el anticuerpo a un monocito. En un aspecto especifico, el polipeptido heterologo con el que se fusiona el anticuerpo es albumina (incluyendo, pero sin limitacion, albumina serica humana recombinante o fragmentos o variantes de la misma (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 5.876.969, expedida el 2 de marzo de 1999, la Patente EP 0413 622 y la Patente de Estados Unidos N.° 5.766.883, expedida el 16 de junio de 1998). Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) se fusionan con la forma madura de la albumina serica humana (es decir, los aminoacidos 1-585 de la albumina serica humana, como se muestra en las Figuras 1 y 2 de la Patente EP 0 322 094). Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) se fusionan con fragmentos polipeptfdicos que comprenden, o alternativamente consisten en los restos aminoaddicos 1-x de la albumina serica humana, donde x es un numero entero de 1 a 585 y el fragmento de albumina tiene actividad de albumina serica humana. Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) se fusionan con fragmentos polipeptfdicos que comprenden, o alternativamente consisten en los restos aminoaddicos 1-z de la albumina serica humana, donde z es un numero entero de 369 a 419, como se describe en la Patente de Estados Unidos 5.766.883 en el presente documento. Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) pueden fusionarse con el extremo N- o C-terminal de la protema heterologa (por ejemplo, polipeptido Fc de inmunoglobulina o polipeptido de albumina serica humana).
En un aspecto espedfico, una protema de fusion que se describe en el presente documento comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de uno o mas de cualquiera de los dominios VH mencionados en la Tabla 1, o la secuencia de aminoacidos de uno o mas de cualquiera de los dominios VL mencionados en la Tabla 1, o fragmentos o variantes de los mismos, y una secuencia polipeptfdica heterologa. En otro aspecto espedfico, una protema de fusion que se describe en el presente documento comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una, dos, tres o mas de cualquiera de las CDR de VH mencionadas en la Tabla 1, o la secuencia de aminoacidos de una, dos, tres o mas de cualquiera de las CDR de VL mencionadas en la Tabla 1, o fragmentos o variantes de las mismas, y una secuencia polipeptfdica heterologa. Preferentemente, la protema de fusion comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una CDR3 de VH mencionada en la Tabla 1, o un fragmento o variante de la misma, y una secuencia polipeptfdica heterologa, uniendose dicha protema de fusion inmunoespedficamente a BLyS. En otro aspecto espedfico, una protema de fusion comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de al menos un dominio VH mencionado en la Tabla 1 y la secuencia de aminoacidos de al menos un dominio VL mencionado en la Tabla 1, o fragmentos o variantes de las mismas, y una secuencia polipeptfdica heterologa. Preferentemente, los dominios VH y VL de la protema de fusion corresponden al mismo scFv mencionado en la Tabla 1. En otro aspecto espedfico, una protema de fusion comprende, o alternativamente consiste en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una, dos, tres o mas de cualquiera de las CDR de VH mencionadas en la Tabla 1, y la secuencia de aminoacidos de una, dos, tres o mas de cualquiera de las CDR de VL mencionados en la Tabla 1, o fragmentos o variantes de las mismas, y una secuencia polipeptfdica heterologa. Preferentemente, dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas de las CDR de VH o CDR de VL corresponden al mismo scFv mencionado en la Tabla 1. Tambien se describen en el presente documento las moleculas de acido nucleico que codifican estas protemas de fusion.
La presente memoria descriptiva tambien describe anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS; anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS; y anticuerpos que se unen inmunoespedficamente tanto a la forma soluble como a la forma unida a membrana de BLyS.
En un aspecto espedfico, los anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de
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BLyS comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de uno o mas de cualquiera de los dominios VH contenidos en las sEq ID NO: 1563-1880 que se describen en la Tabla 1 y/o la secuencia de aminoacidos de uno o mas de cualquiera de los dominios VL contenidos en las SEQ ID NO: 15631880 que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o fragmentos o variante o variantes (incluyendo derivados) del mismo. Preferentemente, los dominios VH y VL del anticuerpo corresponden al mismo scFv que se describe en la Tabla 1. Los anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS se describe que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una, dos, tres o mas de cualquiera de las CDR de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1563-1880 que se describen en la Tabla 1, y/o la secuencia de aminoacidos de una, dos, tres o mas de cualquiera de las CDR de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1563-1880 que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o fragmentos o variante o variantes del mismo. Preferentemente, dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas de las CDR de VH y VL del anticuerpo corresponden al mismo scFv que se describe en la Tabla 1. Preferentemente, los anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS se describe que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR3 de VH contenidas en las SEQ ID NO: 15631880 que se describen en la Tabla 1, y/o la secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR3 de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1563-1880 que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o fragmentos o variante o variantes del mismo. Preferentemente, la CDR3 de VH y la CDR3 de VL del anticuerpo corresponden al mismo scFv, que se describe en la Tabla 1. Tambien se describen en el presente documento las moleculas de acido nucleico que codifican estos anticuerpos.
Los anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS tambien se describe en el presente documento que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de uno o mas de cualquiera de los dominios VH contenidos en las SEQ ID NO: 18812128 que se describen en la Tabla 1, y/o la secuencia de aminoacidos de uno o mas de cualquiera de los dominios VL contenidos en las SEQ ID NO: 1881-2128, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. Preferentemente, los dominios VH y VL del anticuerpo corresponden al mismo scFv que se describe en la Tabla 1. Los anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS tambien se describe en el presente documento que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una, dos, tres o mas de cualquiera de las CDR de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1881-2128 que se describen en la Tabla 1, y/o la secuencia de aminoacidos de una, dos, tres o mas de cualquiera de las CDR de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1881-2128, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o fragmentos o variante o variantes del mismo. Preferentemente, dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas de las CDR de VL y VH del anticuerpo corresponden al mismo scFv que se describe en la Tabla 1. Preferentemente, los anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS se describe en la presente memoria que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR3 de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1881-2128 que se describen en la Tabla 1, y/o la secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR3 de VL contenidas en las SEQ ID NO: 18812128 que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o fragmentos o variante o variantes del mismo. Preferentemente, la CDR3 de VH y CDR3 de VL del anticuerpo corresponden al mismo scFv que se describe en la Tabla 1. Tambien se describen en la presente memoria moleculas de acido nucleico que codifican estos anticuerpos.
En otro aspecto espedfico, los anticuerpos (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble y a la forma unida a membrana de BLyS comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de uno o mas de cualquiera de los dominios VH contenidos en las SEQ ID NO: 1-1562 que se describen en la Tabla 1, y/o la secuencia de aminoacidos de uno o mas de cualquiera de los dominios VL contenidos en las SEQ ID NO: 1-1562 que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. Preferentemente, los dominios VH y VL del anticuerpo corresponden al mismo scFv que se describe en la Tabla 1. En un aspecto espedfico, los anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble y a la forma unida a membrana de BLyS comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una, dos, tres o mas de cualquiera de las CDR de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1-1562 que se describen en la Tabla 1, y/o la secuencia de aminoacidos de una, dos, tres o mas de cualquiera de las CDR de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1-1562 que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o fragmentos o variante o variantes del mismo. Preferentemente, dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas de las CDR de VH y VL del anticuerpo corresponden al mismo scFv que se describe en la Tabla 1. En un aspecto preferido, los anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble y a la forma unida a membrana de BLyS se proporciona que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR3 de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1-1562 descritas en la Tabla 1, y/o la secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR3 de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1-1562 descritas en la Tabla 1, o un fragmento o fragmentos o variante o variantes del mismo. Preferentemente, la CDR3 de VH y CDR3 de VL del anticuerpo corresponden al mismo scFv como se describe en la Tabla 1.
La presente memoria descriptiva tambien describe mezclas de anticuerpos (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespedficamente a BLyS, en la que la mezcla tiene al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos
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diferentes que se describen en el presente documento. En particular, la memoria descriptiva describe mezclas de diferentes anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS, a la forma unida a membrana de BLyS y/o tanto a la forma unida a membrana como a la forma soluble de BLyS. En aspectos espedficos, se describen en el presente documento mezclas de al menos 2, preferentemente al menos 4, al menos 6, al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 anticuerpos diferentes que se unen inmunoespedficamente a BLyS, en las que al menos 1, al menos 2, al menos 4, al menos 6 o al menos 10 anticuerpos de la mezcla son un anticuerpo que se describe en el presente documento. Espedficamente, cada anticuerpo de la mezcla es un anticuerpo que se describe en el presente documento.
La presente memoria descriptiva tambien describe paneles de anticuerpos (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespedficamente a BLyS, en la que el panel tiene al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos diferentes de la presente invencion. En particular, la presente invencion proporciona paneles de anticuerpos diferentes que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS, a la forma unida a membrana de BLyS y/o tanto a la forma unida a membrana como a la forma soluble de BLyS. Espedficamente, se describen en el presente documento paneles de anticuerpos que tienen diferentes afinidades por BLyS, diferentes especificidades por BLyS o diferentes velocidades de disociacion. La memoria descriptiva describe paneles de al menos 10, preferentemente al menos 25, al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 400, al menos 450, al menos 500, al menos 550, al menos 600, al menos 650, al menos 700, al menos 750, al menos 800, al menos 850, al menos 900, al menos 950 o al menos 1000 anticuerpos. Los paneles de anticuerpos pueden usarse, por ejemplo, en placas de 96 pocillos para ensayos tales como ELlSA.
La presente memoria descriptiva describe ademas composiciones que comprenden uno o mas anticuerpos (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes que se describen en el presente documento). En un aspecto especifico, una composicion que se describe en el presente documento comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de uno o mas de cualquiera de los dominios VH contenidos en las SEQ iD NO: 1563-1880 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo. En otro aspecto espedfico, una composicion comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR1 de VH contenidas en las sEq ID NO: 1563-1880 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo. En un aspecto espedfico, una composicion que se describe en el presente documento comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR2 de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1563-1880 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo. Preferentemente, una composicion que se describe en el presente documento comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR3 de VH contenidas en las sEq ID NO: 1563-1880 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo.
La presente memoria descriptiva describe ademas composiciones que comprenden uno o mas anticuerpos (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de la presente invencion). En un aspecto espedfico, una composicion que se describe en el presente documento comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de uno o mas de cualquiera de los dominios VH contenidos en las SEQ iD NO: 1881-2128 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo. En otro aspecto espedfico, una composicion comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR1 de VH contenidas en las SEQ iD NO: 1881-2128 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo. Una composicion que se describe en el presente documento comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR2 de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1881-2128 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo. Preferentemente, una composicion que se describe en el presente documento comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR3 de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1881-2128 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo.
La presente memoria descriptiva describe ademas composiciones que comprenden uno o mas anticuerpos (incluyendo scFv o moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de la presente invencion). En un aspecto espedfico, una composicion comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de uno o mas de cualquiera de los dominios VH contenidos en las SEQ ID NO: 1-1562 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo. En otro aspecto espedfico, una composicion que se describe en el presente documento comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR1 de VH contenidas en las sEq ID NO: 1-1562 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo.
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En otro aspecto espedfico, una composicion que se describe en el presente documento comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR2 de VH contenidas en las SEQ iD NO: 1-1562 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo. Preferentemente, una composicion de la presente invencion comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR3 de VH contenidas en las sEq ID NO: 1-1562 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo.
La memoria descriptiva tambien describe composiciones que comprenden uno o mas anticuerpos (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes que se describen en el presente documento) que se enumeran a continuacion. En otro aspecto especifico, una composicion comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de uno o mas de cualquiera de los dominios VL contenidos en las SEQ ID NO: : 1563-1880 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo. En otro aspecto espedfico, una composicion que se describe en el presente documento comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1563-1880 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo. En otro aspecto espedfico, una composicion que se describe en el presente documento comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR2 de VL contenidas en las SEQ iD NO: 1563-1880 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo. Preferentemente, una composicion que se describe en el presente documento comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR3 de VL contenidas en las SEQ Id NO: 15631880 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo.
La presente memoria descriptiva tambien describe composiciones que comprenden uno o mas anticuerpos (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de la presente invencion) que se enumeran a continuacion. En otro aspecto espedfico, una composicion que se describe en el presente documento comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de uno o mas de cualquiera de los dominios VL contenidos en las SEQ ID NO: 1881-2128 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo. En otro aspecto espedfico, una composicion que se describe en el presente documento comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR1 de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1881-2128 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo. En otro aspecto espedfico, una composicion comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR2 de VL de las SEQ ID NO: 1881-2128 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo. Preferentemente, una composicion que se describe en el presente documento comprende una, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR3 de VL contenidas en las sEq ID NO: 1881-2128 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo.
La memoria descriptiva tambien describe composiciones que comprenden uno o mas anticuerpos (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de la presente invencion) que se enumeran a continuacion. En otro aspecto espedfico, una composicion comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de uno o mas de cualquiera de los dominios VL contenidos en las SEQ iD NO: 11562 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo. En otro aspecto espedfico, una composicion que se describe en el presente documento comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR1 de VL contenidas en las sEq ID NO: 1-1562 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo. En otro aspecto espedfico, una composicion que se describe en el presente documento comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR2 de VL de las SEQ ID NO: 1-1562 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo. Preferentemente, una composicion que se describe en el presente documento comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una o mas de cualquiera de las CDR3 de VL contenidas en las sEq ID NO: 1-1562 que se describen en la Tabla 1, o una variante del mismo.
Preferentemente, una composicion que se describe en el presente documento comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de uno o mas de cualquiera de los dominios VH descritos en la Tabla 1, o una variante del mismo, y una secuencia de aminoacidos de uno o mas de cualquiera de los dominios VL descritos en la Tabla 1, o una variante del mismo, en el que los dominios VH y VL son de scFv con la misma especificidad (es decir, de scFv que se unen a BLyS soluble (SEQ ID NO: 1563-1880), de scFv que se unen a BLyS unido a membrana (SEQ ID No:
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1881-2128) o de scFv que se unen tanto a BLyS soluble como unido a membrana (SEQ ID NO: 1-1562). Tambien se describen en el presente documento anticuerpos en los que la CDRX de VH (donde X = I, 2 o 3) y la CDRY de VL (donde Y = I, 2 o 3) son de scFv con la misma especificidad (es decir, de scFv que se unen a BLyS soluble (SEQ ID NO: 1563-1880), de scFv que se unen a BLyS unido a membrana (SEQ ID NO: 1881-2128) o de scFv que se unen tanto a BLyS soluble como unido a membrana (SEQ ID NO: 1-1562) . Una composicion que se describe en el presente documento comprende una o mas protemas de fusion.
Como se analiza en mas detalle a continuacion, una composicion que se describe en el presente documento puede usarse en solitario o en combinacion con otras composiciones. Los anticuerpos (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de la presente invencion) pueden ademas fusionarse recombinantemente con un polipeptido heterologo en los extremos N- o C-terminales, o conjugarse qmmicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) con polipeptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden fusionarse recombinantemente o conjugarse con moleculas utiles como marcadores en ensayos de deteccion y moleculas efectoras tales como polipeptidos heterologos, farmacos, radionuclidos o toxinas. Veanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; la Patente de EE.UU. N.° 5.314.995 y el documento EP 396.387.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de la presente invencion) pueden usarse, por ejemplo, pero sin limitacion, para purificar y detectar BLyS y para dirigir los polipeptidos que se describen en el presente documento a celulas que expresen BLyS unido a membrana o receptor de BLyS, incluyendo procedimientos de diagnostico y terapeuticos tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos tienen utilidad en inmunoensayos para medir de forma cualitativa y cuantitativa los niveles de BLyS en muestras biologicas. Vease, por ejemplo, Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a Ed. 1988).
Procedimientos de Produccion de Anticuerpos
Los anticuerpos que se describen en la presente memoria (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes que se describen en la presente memoria) pueden producirse por cualquier procedimiento conocido en la tecnica para la smtesis de anticuerpos, en particular por smtesis qmmica o, preferentemente, por tecnicas de expresion recombinantes.
Los Fv de cadena sencilla descritos en la Tabla 1 se generaron usando procedimientos de presentacion en fago conocidos en la tecnica. Ademas, pueden generarse otros scFv que se unan inmunoespedficamente a BLyS usando procedimientos de presentacion en fago conocidos en la tecnica. En los procedimientos de presentacion en fago, se presentan dominios de anticuerpo funcionales en la superficie de partmulas de fago que llevan las secuencias polinucleotfdicas que los codifican. En particular, las secuencias de ADN que codifican los dominios VH y VL se amplifican a partir de genotecas de ADNc animal (por ejemplo, genotecas de ADNc humano o murino de tejidos linfoides) o genotecas de ADNc sintetico. El ADN que codifica los dominios VH y VL se une entre sf por un enlazador de scFv mediante PCR y se clona en un vector fagemido (por ejemplo, pCANTAB 6 o pComb 3 hSs). El vector se usa en la electroporacion de E. coli Y las E. coli se infectan con fago auxiliar. El fago usado en estos procedimientos es tfpicamente un fago filamentoso, incluyendo fd y M13, y los dominios VH y VL se fusionan habitualmente de forma recombinante con el gen III o gen VIII de fago. El fago que expresa un dominio de union a antfgeno que se une a un antfgeno de interes (es decir, BLyS o un fragmento del mismo) puede seleccionarse o identificarse con antfgeno, por ejemplo, usando antfgeno marcado o antfgeno unido o capturado en una superficie solida o perla. Los ejemplos de procedimientos de presentacion en fago que pueden usarse para generar los anticuerpos que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, los descritos en Brinkman y col., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames y col., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough y col., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic y col., Gene 187 9-18 (1997); Burton y col. , Advances in Immunology 57:191- 280(1994); memoria descriptiva PCT N.° PCT/GB91/01 134; publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; W097/13844; y Patentes de Estados Unidos N.° 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108 .
Como se ha descrito en las referencias anteriores, despues de la seleccion del fago, las regiones codificantes de anticuerpo del fago pueden aislarse y usarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de union a antfgeno deseado, y expresarse en cualquier hospedador deseado, incluyendo celulas de mairnfero, celulas de insecto, celulas vegetales, levaduras y bacterias, por ejemplo, como se describe a continuacion. Tambien pueden emplearse tecnicas para producir de forma recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 usando procedimientos conocidos en la tecnica tales como los descritos en la publicacion PCT WO 92/22324; Mullinax y col., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); Sawai y col., AJRl 34:26-34 (1995); y Better y col., Science 240:1041-1043 (1988).
Para generar anticuerpos completos pueden usarse cebadores de PCR que incluyen secuencias de nucleotidos de VH o VL, un sitio de restriccion y una secuencia flanqueante para proteger el sitio de restriccion para amplificar las secuencias de VH o VL en clones de scFv. Utilizando tecnicas de clonacion conocidas por los expertos en la
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materia, los dominios VH amplificados por PCR pueden clonarse en vectores que expresen una region constante de VH, por ejemplo, la region constante gamma 4 humana, y los dominios VL amplificados por PCR pueden clonarse en vectores que expresen una region constante de VL, por ejemplo, regiones constantes kappa o lambda humanas. Preferentemente, los vectores para expresar los dominios VH o VL comprenden un promotor adecuado para dirigir la expresion de las cadenas pesada y ligera en el sistema de expresion seleccionado, una senal de secrecion, un sitio de clonacion para el dominio variable de inmunoglobulina, dominios constantes de inmunoglobulina y un marcador de seleccion tal como neomicina. Los dominios VH y VL tambien pueden clonarse en un vector que exprese las regiones constantes necesarias. Los vectores de conversion de la cadena pesada y vectores de conversion de la cadena ligera se utilizan despues para cotransfectar lmeas celulares, para generar lmeas celulares estables o transitorias que expresen anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, IgG usando tecnicas conocidas por los expertos en la materia.
Las lmeas celulares que expresan anticuerpos que comprenden los dominios VH y VL de scFv de la presente invencion se han depositado en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo ("ATCC") en las fechas enumeradas en la Tabla 2 y se les ha dado los Numeros de Deposito de la ATCC identificados en la Tabla 2. La ATCC se localiza en 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, Estados Unidos. El deposito de la ATCC se ha realizado conforme a los terminos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del deposito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes.
Lmea Celular
scFv Correspondiente SEQ ID NO: Numero de Deposito de la ATCC Fecha de Deposito en la ATCC
NS0-B11-15
1050B11-15 24 PTA-3238 27 marzo 2001
NSO-anti- BLyS-6D08-18
1006D08 2 PTA-3239 27 marzo 2001
NSO-anti-BLyS 16A0 1-60
1116A01 327 PTA-3240 27 marzo 2001
IO26C04K
1026C04-K 1563 PTA-3241 27 marzo 2001
IO50A12
1050A12 12 PTA-3242 27 marzo 2001
IO50-B11
1050B11 9 PTA-3243 27 marzo 2001
Por consiguiente, la memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que comprenden los dominios VH y VL de scFv que se describen en el presente documento.
Preferentemente, un anticuerpo que se describe en la presente memoria es el anticuerpo expresado por la lmea celular NS0-B11-15.
Preferentemente, un anticuerpo que se describe en la presente memoria es el anticuerpo expresado por la lmea celular NSO-anti-BLyS- 6D08-18.
Preferentemente, un anticuerpo que se describe en la presente memoria es el anticuerpo expresado por la lmea celular NSO-anti-BLyS- 116A01-60.
Preferentemente, un anticuerpo que se describe en la presente memoria es el anticuerpo expresado por la lmea celular IO26C04K.
Preferentemente, un anticuerpo que se describe en la presente memoria es el anticuerpo expresado por la lmea celular IO50A12.
Preferentemente, un anticuerpo que se describe en la presente memoria es el anticuerpo expresado por la lmea celular NSO-Bll.
La memoria descriptiva tambien describe anticuerpos que inhiben competitivamente la union de un anticuerpo que comprende un fragmento (por ejemplo, dominio VH, domino VL, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, cDr1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) o variante de un scFv mencionado en la Tabla 1 a un polipeptido de BLyS. Preferentemente, la memoria descriptiva describe anticuerpos que reducen la union de un anticuerpo que comprende un fragmento (por ejemplo, dominio VH, domino vL, CdR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) o variante de un scFv mencionado en la Tabla 1 a un polipeptido de BLyS entre 1% y 10% en un ensayo de inhibicion competitiva. Preferentemente, la memoria descriptiva describe anticuerpos que reducen la union de un anticuerpo que comprende un fragmento (por ejemplo, dominio VH, domino VL, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CdR1 de vL, CDR2 de VL o CDR3 de Vl) o variante de un scFv mencionado en la Tabla 1 a un polipeptido de BLyS entre 1% y 10% en un ensayo de inhibicion competitiva.
Preferentemente, la memoria descriptiva describe anticuerpos que reducen la union de un anticuerpo que comprende un fragmento (por ejemplo, dominio VH, domino vL, CdR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) o variante de un scFv mencionado en la Tabla 1 a un polipeptido de BLyS al menos
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10% y hasta 20% en un ensayo de inhibicion competitiva.
Preferentemente, la memoria descriptiva describe anticuerpos que reducen la union de un anticuerpo que comprende un fragmento (por ejemplo, dominio VH, domino vL, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) o variante de un scFv mencionado en la Tabla 1 a un polipeptido de BLyS al menos 20% y hasta 30% en un ensayo de inhibicion competitiva.
Preferentemente, la memoria descriptiva describe anticuerpos que reducen la union de un anticuerpo que comprende un fragmento (por ejemplo, dominio VH, domino vL, CdRi de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) o variante de un scFv mencionado en la Tabla 1 a un polipeptido de BLyS al menos 30% y hasta 40% en un ensayo de inhibicion competitiva.
Preferentemente, la memoria descriptiva describe anticuerpos que reducen la union de un anticuerpo que comprende un fragmento (por ejemplo, dominio VH, domino vL, CdRi de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) o variante de un scFv mencionado en la Tabla 1 a un polipeptido de BLyS al menos 40% y hasta 50% en un ensayo de inhibicion competitiva.
Preferentemente, la memoria descriptiva describe anticuerpos que reducen la union de un anticuerpo que comprende un fragmento (por ejemplo, dominio VH, domino vL, CdR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) o variante de un scFv mencionado en la Tabla 1 a un polipeptido de BLyS al menos 50% y hasta 60% en un ensayo de inhibicion competitiva.
Preferentemente, la memoria descriptiva describe anticuerpos que reducen la union de un anticuerpo que comprende un fragmento (por ejemplo, dominio VH, domino vL, CdR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) o variante de un scFv mencionado en la Tabla 1 a un polipeptido de BLyS al menos 60% y hasta 70% en un ensayo de inhibicion competitiva.
Preferentemente, la memoria descriptiva describe anticuerpos que reducen la union de un anticuerpo que comprende un fragmento (por ejemplo, dominio VH, domino vL, CdR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) o variante de un scFv mencionado en la Tabla 1 a un polipeptido de BLyS al menos 70% y hasta 80% en un ensayo de inhibicion competitiva.
Preferentemente, la memoria descriptiva describe anticuerpos que reducen la union de un anticuerpo que comprende un fragmento (por ejemplo, dominio VH, domino vL, CdR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) o variante de un scFv mencionado en la Tabla 1 a un polipeptido de BLyS al menos 80% y hasta 90% en un ensayo de inhibicion competitiva.
Preferentemente, la memoria descriptiva describe anticuerpos que reducen la union de un anticuerpo que comprende un fragmento (por ejemplo, dominio VH, domino vL, CdR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) o variante de un scFv mencionado en la Tabla 1 a un polipeptido de BLyS al menos 90% y hasta 100% en un ensayo de inhibicion competitiva.
Preferentemente, la memoria descriptiva describe anticuerpos que inhiben competitivamente la union del anticuerpo producido por la lmea celular que tiene el numero de deposito de la ATCC PTA-3238 a un polipeptido de BLyS.
Preferentemente, la memoria descriptiva describe anticuerpos que inhiben competitivamente la union del anticuerpo producido por la lmea celular que tiene el numero de deposito de la ATCC PTA-3239 a un polipeptido de BLyS.
Preferentemente, la memoria descriptiva describe anticuerpos que inhiben competitivamente la union del anticuerpo producido por la lmea celular que tiene el numero de deposito de la ATCC PTA-3240 a un polipeptido de BLyS.
Preferentemente, la memoria descriptiva describe anticuerpos que inhiben competitivamente la union del anticuerpo producido por la lmea celular que tiene el numero de deposito de la ATCC PTA-3241 1 a un polipeptido de BLyS.
Preferentemente, la memoria descriptiva describe anticuerpos que inhiben competitivamente la union del anticuerpo producido por la lmea celular que tiene el numero de deposito de la ATCC PTA-3242 a un polipeptido de BLyS.
Preferentemente, la memoria descriptiva describe anticuerpos que inhiben competitivamente la union del anticuerpo producido por la lmea celular que tiene el numero de deposito de la ATCC PTA-3243 a un polipeptido de BLyS.
Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de anticuerpos en seres humanos y ensayos de deteccion in vitro, puede ser preferible usar anticuerpos humanos o quimericos. Son particularmente deseables anticuerpos completamente humanos para el tratamiento terapeutico de pacientes humanos. Veanse tambien, las Patentes de Estados Unidos N.° 4.444.887 y 4.716.111; y las publicaciones PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, W098/16654, WO 96/34096, wO 96/33735 y 91 wO/10741. Espedficamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento comprenden uno o mas dominios VH y VL correspondientes a los scFv humanos de la presente invencion y regiones flanqueantes de otras moleculas de inmunoglobulina, preferentemente una molecula de inmunoglobulina humana. Espedficamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento comprenden una o mas CDR correspondientes a los scFv humanos de la presente invencion y regiones
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flanqueantes de otra molecula de inmunoglobulina, preferentemente una molecula de inmunoglobulina humana. En otro aspecto espedfico, un anticuerpo que se describe en el presente documento comprende una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas CDR de VL o CDR de VH correspondientes a uno o mas de los scFv humanos mencionados en la Tabla 1, o fragmentos o variantes de los mismos, y regiones flanqueantes (y, opcionalmente CDR no derivadas de los scFv de la Tabla 1) de una molecula de inmunoglobulina humana. En un aspecto preferido, un anticuerpo que se describe en la presente memoria comprende una CDR3 VH, CDR3 de VL o ambas, correspondientes al mismo scFv, o scFv diferentes mencionados en la Tabla 1, o fragmentos o variantes de los mismos, y regiones flanqueantes de una inmunoglobulina humana.
Un anticuerpo quimerico es una molecula en la que diferentes porciones del anticuerpo proceden de diferentes moleculas de inmunoglobulina tales como anticuerpos que tienen una region variable derivada de un anticuerpo humano y una region constante de inmunoglobulina no humana. Se conocen en la tecnica procedimientos para producir anticuerpos quimericos. Vease, por ejemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi y col., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies y col., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); Patentes de Estados Unidos N.° 5.807,715; 4.816.567 y 4.816.397. Pueden producirse anticuerpos quimericos que comprenden una o mas CDR de especie humana y regiones flanqueantes de una molecula de inmunoglobulina no humana (por ejemplo, regiones flanqueantes de una molecula de inmunoglobulina canina o felina) usando una diversidad de procedimientos conocidos en la tecnica incluyendo, por ejemplo, injerto de CDR (documento EP 239.400; Publicacion PCT WO 91/09967; Patentes de Estados Unidos N.° 5.225.539; 5.530.101; y 5.585.089), revestimiento o remodelacion superficial (documentos EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka y col., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska y col., PNAS 91:969-973 (1994)), y barajado de cadenas (Patente de Estados Unidos N.° 5.565.332) . Preferentemente, los anticuerpos quimericos comprenden una CDR3 humana que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las CDR3 de VH o CDR3 de VL mencionadas en la Tabla 1, o una variante de la misma, y regiones flanqueantes no humanas o regiones flanqueantes humanas diferentes de aquellas regiones flanqueantes en el scFv correspondiente descrito en la Tabla 1. Con frecuencia, los restos de region flanqueante en las regiones flanqueantes se sustituiran con el resto correspondiente del anticuerpo donador de CDR para alterar, preferentemente mejorar, la union a antfgeno. Estas sustituciones de regiones flanqueantes se identifican por procedimientos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, por modelado de las interacciones de la CDR y los restos de region flanqueante para identificar restos de region flanqueante importantes para la union a antfgeno y comparacion de secuencias para identificar restos de region flanqueante poco habituales en posiciones particulares. (Vease, por ejemplo, Queen y col., Patente de Estados Unidos N.°: 5.585.089; Riechmann y col., Nature 332:323 (1988)).
Ademas, los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden utilizarse a su vez para generar anticuerpos antiidiotipo que "mimetizan" polipeptidos de BLyS usando tecnicas bien conocidas por los expertos en la materia. (Vease, por ejemplo, Greenspan y Bona, FASEB J. 7(5):437-444 (1993); y Nissinoff, J. Immunol. 147(8):2429-2438 (1991)). Por ejemplo, los anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen a BLyS y que inhiben competitivamente la union de BLyS a su receptor (segun se determina por ensayos bien conocidos en la tecnica tales como, por ejemplo, los descritos a continuacion) pueden usarse para generar antiidiotipos que "mimeticen" un dominio de union a receptor/ligando de BLyS y, como consecuencia, se unan a y neutralicen receptores de BLyS (por ejemplo, TACI, BCMA y TR20). Dichos antiidiotipos neutralizantes (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes, tales como fragmentos Fab de dichos antiidiotipos) pueden usarse en regfmenes terapeuticos para neutralizar a BLyS. Por ejemplo, dichos anticuerpos antiidiotfpicos pueden usarse para unirse a ligandos/receptores de BLyS y de este modo bloquear la actividad biologica mediada por BLyS. Alternativamente, los antiidiotipos que "mimetizan" un dominio de union a BLyS pueden unirse a un receptor o receptores de BLyS e inducir la senalizacion mediada por receptor de BLyS (por ejemplo, la activacion de factor nuclear de celulas T activadas (NF-AT), factor nuclear kappa B (NF-kappa B) y/o AP-1). Dichos antiidiotipos agonistas (incluyendo fragmentos Fab agonistas de estos antiidiotipos) pueden usarse en regfmenes terapeuticos para inducir o potenciar la senalizacion mediada por receptor de BLyS. Por ejemplo, dichos anticuerpos antiidiotfpicos pueden usarse para unirse a ligandos/receptores de BLyS y de este modo estimular la actividad biologica mediada por BLyS (por ejemplo, la proliferacion de linfocitos B y/o la produccion de inmunoglobulina).
Una vez que una molecula de anticuerpo que se describe en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) se ha sintetizado qmmicamente o expresado de forma recombinante puede purificarse por cualquier procedimiento conocido en la tecnica para la purificacion de una molecula de inmunoglobulina, o mas en general, una molecula proteica tal como, por ejemplo, por cromatograffa (por ejemplo, de intercambio ionico, de afinidad, particularmente por afinidad por el antfgeno especifico despues de protema A, y cromatograffa en columna de exclusion molecular), centrifugacion, solubilidad diferencial, o por cualquier otra tecnica convencional para la purificacion de protemas. Ademas, los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden fusionarse a secuencias polipeptfdicas heterologas descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la tecnica para facilitar su purificacion.
Polinucleotidos que Codifican un Anticuerpo
La memoria descriptiva describe polinucleotidos que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo de la presente invencion (incluyendo moleculas que comprenden, o
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alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos). La memoria descriptiva tambien describe polinucleotidos que hibridan en condiciones de alta rigurosidad o, alternativamente, en condiciones de hibridacion intermedias o de menor rigurosidad, por ejemplo, como se han definido anteriormente, con polinucleotidos complementarios a acidos nucleicos que tienen una secuencia de polinucleotidica que codifica uno como se describe en la presente invencion, o un fragmento o variante del mismo.
Los polinucleotidos pueden obtenerse, y la secuencia de nucleotidos de los polinucleotidos puede determinarse, por cualquier procedimiento conocido en la tecnica. Puesto que se conocen las secuencias de aminoacidos de los anticuerpos scFv y dominios VH, dominios VL y CDR de los mismos (como se describen en la Tabla 1), pueden determinarse las secuencias de nucleotidos que codifican estos anticuerpos usando procedimientos bien conocidos en la tecnica, es decir, los codones de nucleotidos que se sabe que codifican los aminoacidos particulares se ensamblan de un modo tal para generar un acido nucleico que codifica el anticuerpo de la presente invencion. Dicho polinucleotido que codifica el anticuerpo puede ensamblarse a partir de oligonucleotidos sintetizados qmmicamente (por ejemplo, como se describe en Kutmeier y col., BioTechniques 17:242 (1994)) que, en resumen, implica la smtesis de oligonucleotidos solapantes que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, hibridacion y ligacion de esos oligonucleotidos, y despues amplificacion de los oligonucleotidos ligados por PCR.
Alternativamente, un polinucleotido que codifica un anticuerpo (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) puede generarse a partir de un acido nucleico de una fuente adecuada. Si un clon que contiene un acido nucleico que codifica un anticuerpo particular no esta disponible, pero se conoce la secuencia de la molecula de anticuerpo, un acido nucleico que codifica la inmunoglobulina puede sintetizarse qmmicamente u obtenerse de una fuente adecuada (por ejemplo, una genoteca de ADNc de anticuerpo, o una genoteca de ADNc generada a partir de, o acido nucleico, preferentemente ARN poli A+, aislado de cualquier tejido o celula que exprese el anticuerpo, tal como celulas de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo de la presente invencion) por amplificacion por PCR usando cebadores sinteticos que pueden hibridar en los extremos 3' y 5' de la secuencia, o por clonacion usando una sonda oligonucleotfdica espedfica para la secuencia genica particular para identificar, por ejemplo, un clon de ADNc de una genoteca de ADNc que codifique el anticuerpo. Los acidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden clonarse despues en vectores de clonacion replicables usando cualquier procedimiento bien conocido en la tecnica.
Una vez que se determina la secuencia de nucleotidos del anticuerpo (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos), la secuencia de nucleotidos del anticuerpo puede manipularse usando procedimientos bien conocidos en la tecnica para la manipulacion de secuencias de nucleotidos, por ejemplo, tecnicas de ADN recombinante, mutagenesis dirigida, PCR, etc. (veanse, por ejemplo, las tecnicas descritas en Sambrook y col., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY y Ausubel y col., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY), para generar anticuerpos que tengan una secuencia de aminoacidos diferente, por ejemplo, para crear sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoacidos.
Espedficamente, uno o mas de los dominios VH y VL mencionados en la Tabla 1, o fragmentos o variantes de los mismos, se inserta dentro de regiones flanqueantes usando procedimientos de ADN recombinante conocidos en la tecnica. Espedficamente, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas de las CDR mencionadas en la Tabla 1, o fragmentos o variantes de las mismas, se insertan dentro de regiones flanqueantes usando procedimientos de ADN recombinante conocidos en la tecnica. Las regiones flanqueantes pueden ser de origen natural o regiones flanqueantes de consenso y, preferentemente, regiones flanqueantes humanas (vease, por ejemplo, Chothia y col., J. Mol. Biol. 278: 457- 479 (1998) para una lista de regiones flanqueantes humanas). Preferentemente, los polinucleotidos generados por la combinacion de las regiones flanqueantes y CDR codifican un anticuerpo (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se une espedficamente a BLyS. Preferentemente, como se ha analizado anteriormente, pueden generarse polinucleotidos que codifiquen variantes de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que tengan una o mas sustituciones de aminoacidos dentro de las regiones flanqueantes y, preferentemente, las sustituciones de aminoacidos mejoran la union del anticuerpo a su antfgeno. Ademas, dichos procedimientos pueden usarse para generar sustituciones o deleciones de aminoacidos de uno o mas restos de cistema de la region variable que participan en un enlace disulfuro intracatenario para generar moleculas de anticuerpo, o fragmentos de anticuerpo o variantes, que carecen de uno o mas enlaces disulfuro intracatenarios. Otras alteraciones en el polinucleotido se incluyen en la presente invencion y estan dentro de la especialidad en la materia.
Expresion Recombinante de un Anticuerpo
La expresion recombinante de un anticuerpo que se describe en el presente documento (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos (por ejemplo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo de la presente invencion o una porcion de la misma o un anticuerpo de cadena sencilla de la presente invencion)) requiere la construccion de un vector o vectores de expresion que contengan un polinucleotido que codifique el anticuerpo. Una vez que se ha obtenido un polinucleotido que codifica una molecula de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo completo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo o porcion del mismo (que contiene preferentemente, pero no necesariamente, el dominio variable de la cadena ligera o pesada)) de la presente invencion, el vector o vectores para la produccion de la
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molecula de anticuerpo pueden producirse por tecnolog^a de ADN recombinante usando procedimientos bien conocidos en la tecnica. Por lo tanto, se describen en el presente documento procedimientos para preparar una protema por expresion de un polinucleotido que contiene una secuencia de nucleotidos codificante de anticuerpo. Pueden usarse procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la materia para construir vectores de expresion que contengan secuencias codificantes de anticuerpo y senales de control de la transcripcion y de la traduccion apropiadas. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, tecnicas de ADN recombinante in vitro, tecnicas sinteticas y recombinacion genetica in vivo. La memoria descriptiva describe por lo tanto vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica una molecula de anticuerpo que se describe en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo completo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, un dominio variable de cadena ligera o pesada de un anticuerpo, o una porcion del mismo, o una CDR de cadena ligera o pesada, un Fv de cadena sencilla, o fragmentos o variantes de los mismos) unida operativamente a un promotor. Dichos vectores pueden incluir la secuencia de nucleotidos que codifica la region constante de la molecula de anticuerpo (vease, por ejemplo, la Publicacion PCT WO 86/05807; Publicacion PCT WO 89/01036; y Patente de Estados Unidos N.° 5.122.464) y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en dicho vector para la expresion de la cadena pesada completa, la cadena ligera completa o las cadenas tanto pesada como ligera completas.
El vector o vectores de expresion se transfieren a una celula hospedadora por tecnicas convencionales, y las celulas transfectadas se cultivan despues por tecnicas convencionales para producir un anticuerpo que se describe en el presente documento. Por lo tanto, la memoria descriptiva describe celulas hospedadoras que contienen un polinucleotido o polinucleotidos que codifican un anticuerpo que se describe en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo completo, una cadena pesada o ligera del mismo, o una porcion del mismo, o un anticuerpo de cadena sencilla como se describe en el presente documento, o un fragmento o variante del mismo) unido operativamente a un promotor heterologo. Preferentemente, para la expresion de moleculas de anticuerpo completas, los vectores que codifican las cadenas tanto pesada como ligera pueden coexpresarse en la celula hospedadora para la expresion de la molecula de inmunoglobulina completa, como se detalla a continuacion.
Pueden utilizarse una diversidad de sistemas de vector de expresion-hospedador para expresar las moleculas de anticuerpo que se describen en el presente documento. Dichos sistemas de expresion- hospedador representan vehmulos mediante los que pueden producirse y posteriormente purificarse las secuencias codificantes de interes, pero tambien representan celulas que pueden expresar, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleotidos apropiadas, una molecula de anticuerpo de la presente invencion in situ. Estas incluyen, pero sin limitacion, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresion de ADN de bacteriofago, ADN plasirndico o aDn cosmfdico recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresion en levaduras recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas celulares de insecto infectados con vectores de expresion de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de celulas vegetales infectadas con vectores de expresion de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, tMv) o transformadas con vectores de expresion plasmfdicos recombinantes (por ejemplo, plasmido Ti) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; o sistemas celulares de marnffero (por ejemplo, celulas cOs, CHO, BHK, 293, 3T3) que albergan construcciones de expresion recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de celulas de mamffero (por ejemplo, promotor de metalotionema) o de virus de mamfferos (por ejemplo, el promotor tardm de adenovirus; el promotor 7.5K de virus vaccinia). Preferentemente, para la expresion de una molecula de anticuerpo recombinante se usan linfocitos Bacterianas tales como Escherichia coli y, mas preferentemente, celulas eucariotas, especialmente para la expresion de una molecula de anticuerpo recombinante completa. Por ejemplo, las celulas de mai^ero tales como las celulas de ovario de hamster chino (CHO), junto con un vector tal como el elemento promotor del gen temprano intermedio principal de citomegalovirus humano, es un sistema de expresion eficaz para anticuerpos (Foecking y col., Gene 45: 101 (1986); Cockett y col., Bio/Technology 8: 2 (1990)).
En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse ventajosamente varios vectores de expresion dependiendo del uso deseado para la molecula de anticuerpo que se exprese. Por ejemplo, cuando debe producirse una gran cantidad de dicha protema para la generacion de composiciones farmaceuticas de una molecula de anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresion de altos niveles de productos de protemas de fusion que se purifiquen facilmente. Dichos vectores incluyen, pero sin limitacion, el vector de expresion en E. coli pUR278 (Ruther y col., EMBO I. 2:1791 (1983)), en el que la secuencia codificante de anticuerpo puede ligarse individualmente en el vector en fase de lectura con la region codificante de lac Z, de modo que se produce una protema de fusion; vectores pIN (Inouye e Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); y similares. Tambien pueden usarse vectores pGEX para expresar polipeptidos extranos como protemas de fusion con glutation 5-transferasa (GST). En general, dichas protemas de fusion son solubles y pueden purificarse facilmente a partir de celulas lisadas por adsorcion y union a una matriz de perlas de glutation-agarosa, seguida de elucion en presencia de glutation libre. Los vectores pGEX estan disenados para incluir sitios de escision por proteasa de factor Xa o trombina, de modo que el producto genico diana clonado pueda liberarse del resto GST.
En un sistema de insecto, puede usarse el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes extranos. El virus crece en celulas de Spodoptera frugiperda. Las secuencias codificantes de anticuerpo pueden clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la
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poliedrina) del virus y ponerse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de poliedrina).
En celulas hospedadoras de mairnfero, pueden utilizarse varios sistemas de expresion basados en virus. En los casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresion, la secuencia codificante de anticuerpo de interes puede ligarse a un complejo de control de la transcripcion/traduccion de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardm y la secuencia lfder tripartita. Este gen quimerico puede insertarse despues en el genoma de adenovirus por recombinacion in vitro o in vivo. La insercion en una region no esencial del genoma viral (por ejemplo, region El o E3) dara como resultado un virus recombinante que sea viable y capaz de expresar la molecula de anticuerpo en hospedadores infectados (por ejemplo, vease Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sei. Estados Unidos 8 1:355-359 (1984)). Tambien pueden ser necesarias senales de inicio espedficas para una traduccion eficaz de las secuencias codificantes de anticuerpo insertadas. Estas senales incluyen el codon de inicio ATG y secuencias adyacentes. Ademas, el codon de inicio debe estar en fase de lectura con la fase de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traduccion del inserto de interes. Estas senales de control de la traduccion y codones de inicio exogenos pueden ser de una diversidad de ongenes, tanto naturales como sinteticos. La eficacia de la expresion puede aumentarse por inclusion de elementos potenciadores de la transcripcion, terminadores de la transcripcion, etc. apropiados (vease, por ejemplo, Bittner y col., Methods in Enzymol. 153:51-544(1987)).
Ademas, puede seleccionarse una cepa de celula hospedadora que module la expresion de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto genico de la forma espedfica deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, glucosilacion) y procesamiento (por ejemplo, escision) de productos proteicos puede ser importante para la funcion de la protema. Diferentes celulas hospedadoras tienen mecanismos caractensticos y espedficos para el procesamiento postraduccional y la modificacion de protemas y productos genicos. Pueden seleccionarse lmeas celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificacion y el procesamiento correctos de la protema extrana expresada. Con este fin, pueden usarse celulas hospedadoras eucariotas que posean la maquinaria celular para un procesamiento apropiado del transcrito primario, glucosilacion y fosforilacion del producto genico. Dichas celulas hospedadoras de mairnfero incluyen, pero sin limitacion CHO, VERY, BHK, Heia, COS, NSO, MDCK, 293, 3T3, W138 y, en particular, lmeas celulares de cancer de mama tales como, por ejemplo, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, y lmeas celulares de glandula mamaria normal, tales como, por ejemplo, CRL7030 y HsS78Bst.
Para la produccion de alto rendimiento a largo plazo de protemas recombinantes, se prefiere una expresion estable. Por ejemplo, pueden obtenerse por ingeniena genetica lmeas celulares que expresen de forma estable el anticuerpo. Mas que usar vectores de expresion que contengan ongenes de replicacion virales, las celulas hospedadoras pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de la expresion apropiados (por ejemplo, secuencias promotoras, potenciadoras, terminadores de la transcripcion, sitios de poliadenilacion, etc.) y un marcador de seleccion. Despues de la introduccion del ADN extrano, puede dejarse que las celulas modificadas por ingeniena genetica crezcan durante 1-2 dfas en un medio enriquecido y despues se cambian a un medio selectivo. El marcador de seleccion en el plasmido recombinante confiere resistencia a la seleccion y permite a las celulas integrar de forma estable el plasmido en sus cromosomas y crecer para formar focos, que a su vez pueden clonarse y expandirse en lmeas celulares. Este procedimiento puede usarse ventajosamente para obtener por ingeniena genetica lmeas celulares que expresen la molecula de anticuerpo. Dichas lmeas celulares obtenidas por ingeniena genetica pueden ser particularmente utiles en la exploracion y evaluacion de composiciones que interaccionen directa o indirectamente con la molecula de anticuerpo.
Pueden usarse varios sistemas de seleccion incluyendo, pero sin limitacion, los genes de timidina quinasa del virus herpes simple (Wigler y col., Cell 11: 223 (1977)), de hipoxantinoguanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 48: 2O2 (1992)) y de adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y col., Cell 22: 8 17 (1980)) que pueden emplearse en celulas tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Ademas, puede usarse la resistencia a antimetabolitos como base de la seleccion para los genes siguientes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler y col., Natl. Acad. Sei. EE.UU. 77: 357 (1980); O'Hare y col., Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 78:1527 (1981)); gpt, que confiere resistencia a acido micofenolico (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 78:2072 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglucosido G-418 (Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu y Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); TIB TECH 11(5): 155-2 15 (May, 1993)); e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre y col., Gene 30: 147 (1984)). Los procedimientos comunmente conocidos en la tecnica de la tecnologfa del ADN recombinante pueden aplicarse rutinariamente para seleccionar el clon recombinante deseado, y dichos procedimientos se describen, por ejemplo, en Ausubel y col. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en los Capftulos 12 y 13, Dracopoli y col. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin y col., J. Mol. Biol. 150:1 (1981).
Los niveles de expresion de una molecula de anticuerpo pueden aumentarse por amplificacion del vector (para una revision, vease Bebbington y Hentschei, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema vector que expresa un anticuerpo es amplificable, un aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la celula hospedadora aumentara el numero de copias del gen marcador. Puesto que la region amplificada esta
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asociada con la secuencia codificante del anticuerpo, la produccion del anticuerpo tambien aumentara (Crouse y col., Mol. Cell. Biol. 3: 257 (1983)).
La celula hospedadora puede cotransfectarse con dos vectores de expresion que se describen en el presente documento, codificando el primer vector un polipeptido derivado de una cadena pesada y codificando el segundo vector un polipeptido derivado de una cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores de seleccion identicos que permitan una expresion equivalente de polipeptidos de cadena ligera y pesada. Alternativamente, puede usarse un solo vector que codifique y sea capaz de expresar ambos polipeptidos de cadena ligera y pesada. En tales situaciones, la cadena ligera se coloca preferentemente antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre toxica (Proudfoot, Nature 322: 52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 77: 2 197 (1980)). Las secuencias codificantes para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprender ADNc o ADN genomico.
Una vez que una molecula de anticuerpo que se describe en el presente documento se ha producido por expresion recombinante, puede purificarse por cualquier procedimiento conocido en la tecnica para la purificacion de una molecula de inmunoglobulina o, mas en general, para la purificacion de una protema, por ejemplo, por cromatograffa (por ejemplo, de intercambio ionico, de afinidad, particularmente por afinidad por el antfgeno espedfico despues de protema A, y cromatograffa en columna de exclusion molecular), centrifugacion, solubilidad diferencial o por cualquier otra tecnica convencional para la purificacion de protemas. Ademas, los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden fusionarse a secuencias polipeptfdicas heterologas descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la tecnica por facilitar la purificacion.
Caracterizacion de Anticuerpos
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) pueden caracterizarse en una diversidad de formas. En particular, los anticuerpos y moleculas relacionadas que se describen en el presente documento pueden ensayarse para determinar la capacidad de unirse inmunoespedficamente a BLyS o un fragmento de BLyS (por ejemplo, la forma soluble o a la forma unida a membrana de BLyS) usando tecnicas descritas en el presente documento o procedimientos de modificacion de forma rutinaria conocidos en la tecnica. El BLyS, o fragmentos de BLyS, que puede unirse inmunoespedficamente por las composiciones de la presente invencion incluye, pero sin limitacion, BLyS humano (SEQ ID NO: 3228 y/o 3229) o BLyS expresado en monocitos humanos; BLyS murino (SEQ ID NO: 3230 y/o 3221) o BLyS expresado en monocitos murinos; BLyS de rata (las formas solubles que se proporcionan en las SEQ ID NO: 3232, 3233, 3234 y/o 3235 o en una forma asociada a membrana, por ejemplo, en la superficie de monocitos de rata); o BLyS de mono (por ejemplo, los polipeptidos de BLyS de mono de las SEQ ID No: 3236 y/o 3237, la forma soluble de BLyS de mono o BLyS expresado en monocitos de mono) o fragmentos del mismo. Preferentemente, las composiciones de la presente invencion se unen a BLyS humano (SEQ ID NO: 3228 y/o 3229) o fragmentos del mismo. Los ensayos para determinar la capacidad de los anticuerpos que se describen en el presente documento para unirse inmunoespedficamente a BLyS o a un fragmento de BLyS pueden realizarse en solucion (por ejemplo, Houghten, Bio/Techniques 13: 412- 421 (1992)), en perlas (por ejemplo, Lam, Nature 354: 82-84 (1991)), en microplacas (por ejemplo, Fodor, Nature 364: 555-556 (1993)), en bacterias (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 5.223.409), en esporas (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N.° 5.571.698; 5.403.484 y 5.223.409), en plasmidos (por ejemplo, Cull y col., Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 89: 1865-1869 (1992)) o en fagos (por ejemplo, Scott y Smith, Science 249: 386-390 (1990); Devlin, Science 249: 404- 406 (1990); Cwirla y col., Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 87:6378-6382 (1990); y Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310 (1991)). Los anticuerpos que se ha identificado que se unen inmunoespedficamente a BLyS o a un fragmento de BLyS pueden ensayarse despues para determinar su especificidad y afinidad por BLyS o un fragmento de BLyS, usando tecnicas de modificacion de forma rutinaria descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la tecnica.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden ensayarse para determinar su union inmunoespedfica a BLyS y su reactividad cruzada con otros antfgenos por cualquier procedimiento conocido en la tecnica. En particular, la capacidad de un anticuerpo para unirse inmunoespedficamente a la forma soluble o a la forma unida a membrana de BLyS, y la especificidad del anticuerpo, fragmento o variante por un polipeptido de BLyS de una especie particular (por ejemplo, murino, de mono o humano, preferentemente humano) pueden determinarse usando tecnicas de modificacion de forma rutinaria descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la tecnica.
Los inmunoensayos que pueden usarse para analizar la union inmunoespedfica y la reactividad cruzada incluyen, pero sin limitacion, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos usando tecnicas tales como transferencias de Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos tipo "sandwich", ensayos de inmunoprecipitacion, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina por difusion en gel, ensayos de inmunodifusion, ensayos de aglutinacion, ensayos de fijacion del complemento, ensayos inmunorradiometricos, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de protema A, por nombrar algunos. Dichos ensayos son rutinarios y bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Ausubel y col, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York). Se describen brevemente inmunoensayos ejemplares a continuacion (pero sin pretender que sea a modo de limitacion).
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Los protocolos de inmunoprecipitacion comprenden generalmente lisar una poblacion de celulas en un tampon de lisis tal como tampon RIPA (NP-40 o Triton X-100 1%, desoxicolato sodico 1%, SDS 0,1%, NaCI 0,15 M, fosfato sodico 0,01 M a pH 7,2, Trasylol 1%) complementado con protema fosfatasa y/o inhibidores de proteasas (por ejemplo, EDTA, pMsF, aprotinina, vanadato sodico), anadir el anticuerpo de interes al lisado celular, incubar durante un penodo de tiempo (por ejemplo, de 1 a 4 horas) a 40°C, anadir perlas de protema A y/o protema G sefarosa al lisado celular, incubar durante aproximadamente una hora o mas a 40°C, lavar las perlas en tampon de lisis y resuspender las perlas en SDS/tampon de muestras. La capacidad del anticuerpo de interes para inmunoprecipitar un antigeno particular puede evaluarse, por ejemplo, mediante analisis de transferencia de Western. Un experto en la materia estana familiarizado con los parametros que pueden modificarse para aumentar la union del anticuerpo a un antigeno y disminuir el fondo (por ejemplo, preaclaramiento del lisado celular con perlas de sefarosa). Para una discusion adicional respecto a los protocolos de inmunoprecipitacion vease, por ejemplo, Ausubel y col, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York en 10.16.1.
El analisis de transferencia de Western comprende generalmente preparar muestras de protema, la electroforesis de las muestras de protema en un gel de poliacrilamida (por ejemplo, SDS-PAGE 8%-20% dependiendo del peso del molecular del antigeno) , transferir la muestra de protema del gel de poliacrilamida a una membrana tal como de nitrocelulosa, PVDF o nylon, bloquear la membrana en solucion de bloqueo (por ejemplo, PBS con BSA o leche desnatada 3%), lavar la membrana en tampon de lavado (por ejemplo, PBS-Tween 20), bloquear la membrana con anticuerpo primario (el anticuerpo de interes) diluido en tampon de bloqueo, lavar la membrana en tampon de lavado, bloquear la membrana con un anticuerpo secundario (que reconozca el anticuerpo primario, por ejemplo, un anticuerpo anti-humano) conjugado con un sustrato enzimatico (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante o fosfatasa alcalina) o moleculas radiactivas (por ejemplo, 32P o 121I) diluido en tampon de bloqueo, lavar la membrana en tampon de lavado y detectar la presencia del antigeno. Un experto en la materia estana familiarizado con los parametros que pueden modificarse para aumentar la senal detectada y para reducir la interferencia del fondo. Para una discusion adicional respecto a los protocolos de transferencia de Western vease, por ejemplo, Ausubel y col, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York en 10.8.1 .
Los ELISA comprenden preparar un antigeno, revestir el pocillo de una placa de microtitulacion de 96 pocillos con el antigeno, eliminar por lavado el antigeno que no se haya unido a los pocillos, anadir al anticuerpo de interes conjugado con un compuesto detectable, tal como un sustrato enzimatico (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante o fosfatasa alcalina) a los pocillos e incubar durante un penodo de tiempo, eliminar por lavado los anticuerpos no unidos o los anticuerpos unidos inespedficamente y detectar la presencia de los anticuerpos unidos espedficamente al antfgeno que reviste el pocillo. En los ELISA, el anticuerpo de interes no tiene que estar conjugado con un compuesto detectable; en su lugar, puede anadirse al pocillo un segundo anticuerpo (que reconozca al anticuerpo de interes) conjugado con un compuesto detectable. Ademas, en lugar de revestir el pocillo con el antfgeno, el anticuerpo puede revestirse en el pocillo. En este caso, la molecula detectable podna ser el antfgeno conjugado con un compuesto detectable, tal como un sustrato enzimatico (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante o fosfatasa alcalina). Un experto en la materia estana familiarizado con los parametros que pueden modificarse para aumentar la senal detectada, asf como otras variaciones de los ELISA conocidas en la tecnica. Para una discusion adicional respecto a los ELISA vease, por ejemplo, Ausubel y col, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York en 11.2.1.
La afinidad de union de un anticuerpo (incluyendo un scFv u otra molecula que comprende, o alternativamente consiste en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) a un antfgeno y la velocidad de disociacion de una interaccion de antfgeno-anticuerpo pueden determinarse mediante ensayos de union competitiva. Un ejemplo de un ensayo de union competitiva es un radioinmunoensayo que comprende la incubacion de antfgeno marcado (por ejemplo, 3H o 125I) con el anticuerpo de interes en presencia de cantidades crecientes de anticuerpo no marcado, y la deteccion del anticuerpo unido al antfgeno marcado. La afinidad del anticuerpo que se describe en el presente documento por BLyS y las velocidades de disociacion de la union pueden determinarse a partir de los datos mediante un analisis de la representacion de Scatchard. La competicion con un segundo anticuerpo tambien puede determinarse usando radioinmunoensayos. En este caso, el BLyS se incuba con un anticuerpo que se describe en el presente documento conjugado con un compuesto marcado (por ejemplo, 3H o 125I) en presencia de cantidades crecientes de un segundo anticuerpo anti -BLyS no marcado.
Preferentemente, se usa el analisis cinetico BIAcore para determinar las velocidades de asociacion y disociacion de la union de anticuerpos (incluyendo un scFv u otra molecula que comprende, o alternativamente consiste en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) a BLyS, o fragmentos de BLyS. El analisis cinetico BIAcore comprende analizar la union y disociacion de BLyS de microplacas con anticuerpos inmovilizados en su superficie, como se describe en detalle en los Ejemplos 6, 12, 17 y 18 a continuacion.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) tambien pueden ensayarse para determinar su capacidad para inhibir, aumentar o no alterar significativamente la union de BLyS a un receptor de BLyS (por ejemplo, TACI y BCMA) usando tecnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, celulas que expresan un receptor para BLyS (por ejemplo, las lmeas tumorales de linfocitos B IM9, REH, celulas ARH-77, Namalwa y RPMI-8226, asf como linfocitos B CD20+ perifericas) pueden ponerse en contacto con BLyS en presencia o ausencia de un anticuerpo, y puede medirse la capacidad del anticuerpo para inhibir, aumentar o no
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alterar significativamente la union de BLyS a las celulas. La union de BLyS a las celulas puede medirse, por ejemplo, mediante citometna de flujo o un ensayo de centelleo. El BLyS o el anticuerpo pueden marcarse con un compuesto detectable tal como un marcador radiactivo (por ejemplo 32P, 35S y 125I) o un marcador fluorescente (por ejemplo, isotiocianato de fluorescema, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldetndo y fluorescamina) para permitir la deteccion de una interaccion entre BLyS y un receptor de BLyS y/o BLyS y un anticuerpo que se describe en el presente documento. Alternativamente, la capacidad de los anticuerpos que se describen en el presente documento para inhibir, aumentar o no alterar significativamente la union de BLyS a un receptor de BLyS puede determinarse en ensayos sin celulas. Por ejemplo, BLyS nativo o recombinante (por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 134-285 de la SEQ ID NO: 3228) o un fragmento del mismo puede ponerse en contacto con un anticuerpo, y puede determinarse la capacidad del anticuerpo para inhibir, aumentar o no alterar significativamente la union de BLyS a un receptor de BLyS. Preferentemente, el anticuerpo se inmoviliza en un soporte solido y BLyS, o un fragmento de BLyS, se marca con un compuesto detectable. Alternativamente, BLyS, o un fragmento de BLyS, se inmoviliza en un soporte solido y el anticuerpo se marca con un compuesto detectable. El BLyS puede estar parcialmente o completamente purificado (por ejemplo, parcialmente o completamente libre de otros polipeptidos) o ser parte de un lisado celular. Ademas, el polipeptido de BLyS puede ser una protema de fusion que comprende BLyS o una porcion biologicamente activa del mismo y un dominio tal como un Fc de inmunoglobulina o glutation-S-transferasa. Por ejemplo, los restos aminoaddicos 1-154 de TACI (numero de acceso de GenBank AAC51790) o 1- 48 de BCMA (numero de acceso de GenBank NP 001183) pueden fusionarse a la region Fe de una molecula de IgG y usarse en un ensayo sin celulas para determinar la capacidad de los anticuerpos de la presente invencion para inhibir, aumentar o no alterar significativamente la union de BLyS a un receptor de BLyS. Alternativamente, el BLyS puede biotinilarse usando tecnicas bien conocidas por los expertos en la materia (por ejemplo, kit de biotinilacion, Pierce Chemicals; Rockford, IL).
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo scFv u otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) tambien pueden ensayarse para determinar su capacidad para inhibir, estimular o no alterar significativamente la proliferacion de linfocitos B inducida por BLyS, usando tecnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, la proliferacion de linfocitos B puede ensayarse mediante ensayos de incorporacion de 3H-timidina y recuentos de celulas con azul tripan (vease, por ejemplo, Moore y col., Science 285: 260- 263 (1999)). Ademas, los anticuerpos que se describen en el presente documento, o fragmentos o variantes de los mismos, pueden ensayarse para determinar su capacidad para bloquear, estimular o no alterar significativamente la activacion inducida por BLyS de moleculas de senalizacion celular y factores de transcripcion tales como el modulador de calcio y el ligando de ciclofilina ("CAML"), calcineurina, factor nuclear de factor de transcripcion de celulas T activadas ("NF- AT"), factor nuclear kappa B ("NF-kappa B") y AP-I usando tecnicas conocidas por los expertos en la materia (vease, por ejemplo, von Bulow y Bram, Science 278: 138-141(1997)) . Por ejemplo, la actividad de NF- AT puede determinarse por ensayos de desplazamiento de la electromovilidad en gel, por deteccion de la expresion de una protema que se sepa que esta regulada por NF-AT (por ejemplo, expresion de IL- 2), por deteccion de la induccion de un gen indicador (por ejemplo, un elemento regulador de NF-AT unido operativamente a un acido nucleico que codifica un marcador detectable tal como luciferasa, beta- galactosidasa o cloranfenicol acetiltransferasa (CAT)) o por deteccion de una respuesta celular (por ejemplo, diferenciacion celular o proliferacion celular).
Los anticuerpos que se describen en el presente documento, o fragmentos o variantes de los mismos, tambien pueden ensayarse para determinar su capacidad para neutralizar, aumentar o no alterar significativamente la actividad de BLyS. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos pueden ensayarse de forma rutinaria para determinar su capacidad para inhibir la union de BLyS a celulas que expresan el receptor de BLyS (vease el Ejemplo 3 a continuacion).
Seleccion y Exploracion de Anticuerpos que se Unen Inmunoespecificamente a BLyS Soluble
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) pueden explorarse en una diversidad ensayos para identificar aquellos anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS. En un ensayo particular, los anticuerpos que se unen a la forma soluble biotinilada de BLyS en solucion se capturan sobre perlas magneticas revestidas con estreptavidina. Este ensayo puede aplicarse relativamente para identificar anticuerpos que se describen en el presente documento que neutralizan y/o se unen a BLyS. Ademas, los anticuerpos pueden ensayarse en ensayos de neutralizacion descritos en el presente documento o conocidos de otro modo en la tecnica (vease el Ejemplo 3 a continuacion). Por ejemplo, los anticuerpos pueden ensayarse para determinar su capacidad para inhibir la union de BLyS soluble (por ejemplo, BLyS biotinilado) a celulas IM9. En este ensayo, el BLyS soluble marcado (por ejemplo, BLyS biotinilado) se incuba con anticuerpos anti-BLyS candidatos para permitir la formacion de complejos de BLyS-anticuerpo anti-BLyS. Despues de la incubacion, una almuota de la muestra de BLyS-anticuerpo anti-BLyS se anade a celulas IM9. La union de BLyS soluble puede determinarse usando procedimientos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la union de BLyS biotinilado a celulas IM9 puede detectarse usando un fluonmetro despues de la adicion de estreptavidina-delfia. Se detecta el BLyS biotinilado que, si no esta unido por anticuerpos que neutralizan a BLyS, se une a las celulas. Por lo tanto, un anticuerpo que disminuye la cantidad de bio- BLyS que se une a celulas IM9 (respecto a una muestra de control en la que BLyS se ha preincubado con un anticuerpo irrelevante o sin anticuerpo en absoluto) se identifica como uno que se une a y neutraliza la forma soluble de BLyS. En otro ensayo, los anticuerpos se exploran usando ELISA para determinar
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aquellos anticuerpos que se unen a BLyS soluble biotinilado pero no se unen a BLyS unido a membrana tal como, por ejemplo, BLyS en membranas de celulas U937 (veanse los Ejemplos 2 y 9 a continuacion). En estos ensayos, el BLyS soluble (por ejemplo, BLyS biotinilado) y el BLyS unido a membrana (por ejemplo, en membranas de U937) se incuban en muestras separadas con los mismos anticuerpos, y aquellos anticuerpos que se unen al BLyS soluble (BLyS biotinilado) pero no a BLyS unido a membrana (por ejemplo, en membranas de U937) se capturan y se identifican.
Los anticuerpos que se describen en la presente memoria (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) pueden ensayarse para identificar aquellos anticuerpos que no muestren reactividad cruzada con APRIL, endoquina-alfa, VEGI, TRAIL, TNF- alfa, TNF-beta, Fas-L, LIGHT y PBS (vease el Ejemplo 4 a continuacion). Los anticuerpos tambien pueden ensayarse para determinar su afinidad por BLyS usando, por ejemplo, un analisis de BIAcore (veanse los Ejemplos 6, 12, 17 y 18 a continuacion). Los anticuerpos tambien pueden ensayarse para determinar su capacidad para estimular, inhibir o no alterar la produccion de inmunoglobulina y/o la proliferacion de linfocitos B inducidas por BLyS usando tecnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, linfocitos B humanas, BLyS y anticuerpos pueden incubarse juntos en placas de 96 pocillos y puede medirse la incorporacion de 3H-timidina usando un contador de centelleo.
Seleccion y Exploracion de Anticuerpos que se Unen Inmunoespecificamente a BLyS Unido a Membrana
Los anticuerpos que se describen en la presente memoria (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) pueden explorarse en una diversidad de ensayos para identificar aquellos anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS. En un ensayo particular, los anticuerpos que se unen a BLyS en membranas de U937 o BLyS marcado con histidina inmovilizado se capturan. Otras lmeas celulares que expresan BLyS que podnan ser utiles para ensayar la union de anticuerpo a la forma unida a membrana de BLyS incluyen las celulas K-562, HL-60 y THP- I. En otro ensayo, los anticuerpos se exploran usando ELISA para determinar aquellos anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo o variantes) que se unen a BLyS en membranas de U937 o a BLyS marcado con histidina. En este ensayo, los anticuerpos se anaden a placas de 96 pocillos revestidas con membranas de U937 o BLyS marcado con histidina, y aquellos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo o variantes que se unen a las membranas de U937 o a BLyS marcado con histidina se capturan. En otro ensayo, los anticuerpos se exploran usando ELISA para determinar aquellos anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que no se unen a BLyS biotinilado (BLyS soluble) pero se unen a BLyS unido a membrana, tal como, por ejemplo, el de membranas de celulas U937 (vease el Ejemplo 2 a continuacion). En estos ensayos, se incuba BLyS soluble (por ejemplo, BLyS biotinilado) y BLyS unido a membrana (por ejemplo, en membranas de U937) en muestras separadas con los mismos anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo o variantes), y aquellos anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo o variantes) que no se unen al BLyS soluble (BLyS biotinilado) pero se unen al BLyS unido a membrana (por ejemplo, en membranas de U937) se capturan y se identifican. En otros ensayos, los anticuerpos se exploran usando ELISA para determinar cuales de los anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo o variantes) que se unen a BLyS marcado con histidina o membranas de celulas U937 no muestran reactividad cruzada con APRIL, endoquina-alfa, VEGI, TRAIL, TNF-alfa, TNF-beta, Fas-L, LIGHT y PBS (vease el Ejemplo 4 a continuacion). Tambien pueden usarse ELISA para determinar cuales de los anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo o variantes) que se unen a BLyS marcado con histidina o membranas de celulas U937 se unen a BLyS en presencia de TNF-alfa (vease el Ejemplo 4 a continuacion). Tambien pueden ensayarse anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos que se unen inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS para determinar su afinidad por BLyS marcado con histidina, usando un analisis de BIAcore de alto rendimiento (vease el Ejemplo 14 a continuacion).
Ademas, los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden explorarse frente a celulas modificadas por ingeniena genetica para que expresen una forma "no escindible" de BLyS, para determinar su especificidad por la forma unida a membrana de BLyS. Las mutaciones en BLyS que pueden conseguir este resultado incluyen, pero sin limitacion, la mutacion o delecion de los restos aminoaddicos Lys-132 y/o Arg-133 de la secuencia de BLyS mostrada en la SEQ ID NO: 3228. Una mutagenesis tfpica podna incluir la mutacion de uno o ambos restos de Lys- 132 o Arg-133 a restos de alanina. Las celulas que expresan dicha forma "no escindible" de BLyS proporcionan un reactivo importante para usar en el ensayo de la capacidad de anticuerpos para unirse a la forma de unida a membrana de BLyS.
Seleccion y Exploracion de Anticuerpos que se Unen Inmunoespecificamente a BLyS Soluble y BLyS unido a Membrana
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes) pueden explorarse en una diversidad de ensayos para identificar aquellos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo o variantes que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble y a la forma unida a membrana de BLyS. En un ensayo particular, los anticuerpos que se unen a BLyS inmovilizado se capturan. En otro ensayo, los anticuerpos se exploran usando ELISA para aquellos anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo o variantes) que inhiben la union de BLyS soluble (por ejemplo, bio-BLyS soluble) a celulas IM-9 como se ha descrito anteriormente. En otros ensayos, los anticuerpos se exploran usando ELISA para aquellos anticuerpos que se unen a membranas de celulas U937. Ademas, pueden
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realizarse ensayos de ELISA adicionales usando procedimientos conocidos en la tecnica para determinar que anticuerpos no muestran reactividad cruzada con APRIL, endoquina-alfa, VEGI, TRAIL, TNF-alfa, TNF-beta, Fas-L, LIGHT y PBS, o aquellos anticuerpos que se unen a BLyS en presencia de TNF-alfa (vease el Ejemplo 4 a continuacion). Los anticuerpos pueden ensayarse en ensayos de neutralizacion usando tecnicas descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la tecnica. Los anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a las formas soluble y unida a membrana de BLyS tambien pueden ensayarse para determinar su afinidad por BLyS usando un analisis de BIAcore de alto rendimiento.
Conjugados de Anticuerpos
La presente memoria descriptiva describe anticuerpos (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) fusionados recombinantemente o conjugados qmmicamente (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) con un polipeptido heterologo (o porcion del mismo, preferentemente con al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoacidos del polipeptido ) para generar protemas de fusion. La fusion no tiene que ser necesariamente directa, sino que puede producirse a traves de secuencias enlazadoras. Por ejemplo, los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden usarse para dirigir polipeptidos heterologos a tipos celulares particulares (por ejemplo, celulas del linaje monocftico y linfocitos B) in vitro o in vivo, por fusion o conjugacion de los polipeptidos heterologos con anticuerpos que se describen en el presente documento que son espedficos para antfgenos de superficie celular particulares (por ejemplo, BLyS unido a membrana en celulas de linaje monocftico), o que se unen a antfgenos que se unen a receptores de superficie celular particulares (por ejemplo, TACI y/o BCMA localizados en linfocitos B). Los anticuerpos fusionados o conjugados con polipeptidos heterologos tambien pueden usarse en inmunoensayos in vitro y procedimientos de purificacion que usan procedimientos conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Harbor y col., anteriormente, y publicacion PCT WO 93/21232; documento EP 439.095; Naramura y col., Immunol. Lett. 3 9:91 - 99 (1994); Patente de Estados Unidos 5.474.981; Gillies y col., PNAS 89:1428-1432 (1992); Fell y col., J. Immunol. 146:2446-2452 (1991).
En un aspecto espedfico, una protema de fusion comprende un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de uno cualquiera de los dominios VH mencionados en la Tabla 1, y un polipeptido heterologo. En otro aspecto espedfico, una protema de fusion comprende un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las CDR1 de VH mencionadas en la Tabla 1, y un polipeptido heterologo. En otro aspecto espedfico, una protema de fusion comprende un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las CDR2 de VH mencionadas en la Tabla 1, y un polipeptido heterologo. Preferentemente, una protema de fusion comprende un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las CDR3 de VH mencionadas en la Tabla 1 (es decir, SEQ ID NO: 2129-3227), y un polipeptido heterologo.
En otro aspecto espedfico, una protema de fusion comprende un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de uno cualquiera de los dominios VL mencionados en la Tabla 1, y un polipeptido heterologo. En otro aspecto espedfico, una protema de fusion comprende un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las CDR1 de VL mencionadas en la Tabla 1, y un polipeptido heterologo. En otro aspecto espedfico, una protema de fusion comprende un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las CDR2 de VL mencionadas en la Tabla 1, y un polipeptido heterologo. Preferentemente, una protema de fusion comprende un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las CDR3 de VL mencionadas en la Tabla 1, y un polipeptido heterologo.
En otro aspecto espedfico, una protema de fusion comprende un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de uno cualquiera de los dominios VH mencionados en la Tabla 1 y uno o mas dominios VL mencionados en la Tabla 1, y un polipeptido heterologo. En otro aspecto especifico, una protema de fusion comprende un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las CDR de VH mencionadas en la Tabla 1 y una cualquiera de las CDR de VL mencionadas en la Tabla 1, y un polipeptido heterologo.
La presente memoria descriptiva describe ademas composiciones que comprenden, o alternativamente consisten en polipeptidos heterologos fusionados o conjugados con fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, los polipeptidos heterologos pueden fusionarse o conjugarse con un fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmento F(ab)2 o una porcion de los mismos. Se conocen en la tecnica procedimientos para fusionar o conjugar polipeptidos con porciones de anticuerpo. Veanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.336.603; 5.622.929; 5.359.046; 5.349.053; 5.447.851; 5.112.946; EP 307.434; EP 367.166; publicaciones PCT WO 96/04388; WO 91/06570; Ashkenazi y col., Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 88: 10535-10539 (1991); Zheng y col., J. Immunol. 154:5590-5600 (1995); y Vil y col., Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU 89:11337-11341 (1992).
Las protemas de fusion adicionales que se describen en el presente documento pueden generarse por medio de las tecnicas de barajado de genes, barajado de motivos, barajado de exones y/o barajado de codones (denominadas en conjunto "barajado de ADN"). El barajado de ADN puede emplearse para modular las actividades de anticuerpos (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos), pudiendo usarse dichos procedimientos para generar anticuerpos con una actividad alterada (por ejemplo, anticuerpos con mayores afinidades y menores velocidades de disociacion). Veanse, en
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general, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721; 5.834.252 y 5.837.458, y Patten y col., Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33 (1997); Harayama, Trends Biotechnol. 16(2):76-82 (1998); Hansson, y col., J. Mol. Biol. 287:265-76 (1999); y Lorenzo y Blasco, Biotechniques 24(2):308-13 (1998). Los polinucleotidos que codifican anticuerpos que se describen en el presente documento pueden alterarse sometiendose a mutagenesis aleatoria mediante PCR propensa a error, insercion de nucleotidos aleatoria u otros procedimientos antes de la recombinacion. Una o mas porciones de un polinucleotido que codifica un anticuerpo, uniendose dichas porciones inmunoespedficamente a BLyS, pueden recombinarse con uno o mas componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o mas moleculas heterologas.
Ademas, los anticuerpos de la presente invencion (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) pueden fusionarse con secuencias marcadoras, tales como polipeptidos, para facilitar la purificacion. Preferentemente, la secuencia de aminoacidos marcadora es un polipeptido de hexa-histidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otras, muchas de las cuales estan disponibles en el mercado. Como se describe en Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificacion conveniente de la protema de fusion. Otras etiquetas peptfdicas utiles para la purificacion incluyen, pero sin limitacion, la etiqueta de hemaglutinina "HA", que corresponde a un epftopo derivado de la protema hemaglutinina de influenza (Wilson y col., Cell 37:767 (1984)) y la etiqueta "flag" (DYKDDDDK, (SEQ ID NO: 3238) Stratagene, La Jolla, CA).
La presente memoria descriptiva describe ademas anticuerpos (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) conjugados con un agente de diagnostico o terapeutico. Los anticuerpos pueden usarse de forma diagnostica para, por ejemplo, controlar o pronosticar el desarrollo o la progresion de un tumor como parte de un procedimiento de ensayo clmico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un regimen de tratamiento dado. La deteccion puede facilitarse por acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen, pero sin limitacion, diversas enzimas, grupos prosteticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales emisores de positrones usando diversas tomograffas por emision de positrones, e iones metalicos paramagneticos no radiactivos. La sustancia detectable puede acoplarse o conjugarse directamente con el anticuerpo, o indirectamente a traves de un intermedio (tal como, por ejemplo, un enlazador conocido en la tecnica) usando procedimientos conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 4.741.900 para iones metalicos que pueden conjugarse con anticuerpos para su uso como diagnostico de acuerdo con la presente memoria descriptiva. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen, pero sin limitacion, peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, beta- galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prosteticos adecuados incluyen, pero sin limitacion, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen, pero sin limitacion, umbeliferona, fluorescema, isotiocianato de fluorescema, rodamina, diclorotriazinilamina fluorescema, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye, pero sin limitacion, luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen, pero sin limitacion, luciferasa, luciferina y aequorina; y los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen, pero sin limitacion, yodo (131I, 125I, 123I, 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115mIn, 113mIn, 112In, 111In) y tecnecio
("Tc, 99mTc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga) , paladio (103Pd) , molibdeno (99Mo) , xenon (133Xe) , fluor (18F) , 153Sm,
90\/ 470rt 186n« 188n« 142n.. 105DU 97Dll 68^ 57qq 65^ 850l. 32r
77Lu, 159Gd, 149Pm
169Yb, 51Cr, 54Mn
175Yb, 166Ho,
^Se^Sny"1 17Tin
Y, 4'Sc, l86Re, looRe, l42Pr, l05Rh, 9'Ru , 68Ge
85Sr, 32P, 153Gd,
Ademas, un anticuerpo que se describe en el presente documento (incluyendo un scFv u otra molecula que comprende, o alternativamente consiste en fragmentos de anticuerpos o variantes de los mismos) puede conjugarse con un resto terapeutico tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostatico o citocida, un agente terapeutico o un ion metalico radiactivo, por ejemplo, emisores de alfa tales como, por ejemplo, 213Bi. En aspectos espedficos, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a quelantes macrodclicos utiles para conjugar iones radiometalicos incluyendo, pero sin limitacion, 111In, 177Lu, 90Y, 166Ho y 153Sm, con polipeptidos. Preferentemente, el ion radiometalico asociado con los quelantes macrodclicos unidos a anticuerpos de la presente invencion es 111In. Preferentemente, el ion radiometalico asociado con los quelantes macrodclicos unidos a anticuerpos de la presente invencion es 90Y. Espedficamente, el quelante macrodclico es acido 1,4,7, IO- tetraazaciclododecano- N, N',N",N" '-tetraacetico (DOTA). Espedficamente, el DOTA se une al anticuerpo de la presente invencion mediante una molecula enlazadora. Los ejemplos de moleculas enlazadoras utiles para conjugar el DOTA con un polipeptido se conocen comunmente en la tecnica —vease, por ejemplo, DeNardo y col., Clin Cancer Res. 4(10): 2483-90, 1998; Peterson y col., Bioconjug. Chem. 10(4):553-7, 1999; y Zimmerman y col, Nucl. Med. Biol. 26(8): 943-50,1999.
Una citotoxina o agente citotoxico incluye cualquier agente que es perjudicial para celulas, e incluye moleculas tales como toxinas moleculares pequenas y toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas. Los ejemplos incluyen, pero sin limitacion paclitaxol, citochalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, epoxido (VP- 16), tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracino diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- deshidrotestosterona, glucocorticoides, procama, tetracama, lidocama, propranolol, timidina quinasa, endonucleasa, ARNasa y puromicina y fragmentos, variantes u homologos de las mismas. Los agentes terapeuticos incluyen, pero sin limitacion, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil
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decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiamina de platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (antiguamente daunomicina) y doxorubicina), antibioticos (por ejemplo, dactinomicina (antiguamente actinomicina) , bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)) y agentes antimitoticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina), improsulfan, piposulfan, benzodopa, carbocuona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida trimetilolmelamina, clornafazina, ciclofosfamida, estramustina, ifosfamida, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo, clorozotocina, fotemustina, nimustina, ranimustina, aclacinomisinas, azaserina, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, tiamiprina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5- FU, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona, aminoglutetimida, mitotano, trilostano, acido frolmico, aceglatona, glucosido de aldofosfamida, acido aminolevulmico, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, dernecolcina, diazicuona, elfornitina, acetato de eliptinio, etoglucido, nitrato de galio, hidroxiurea, lentinan, lonidamina, mitoguazona, mopidamol, nitracrina, pentostatina, fenamet, pirarubicina, acido podofil inico, 2-etilhidrazida, procarbazina, PSKO, razoxano, sizofiran, espirogermanio, acido tenuazonico, triazicuona, 2,2',2"-triclorotrietilamina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromano, gacitosina, arabinosido ("Ara-C"), taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOI/', Bristol-Miers Squibb Oncology, Princeton, NJ) doxetaxel (TAXOTERE'', Rh6ne-Poulenc Rorer, Antony, Francia), gemcitabina, ifosfamida, vinorelbina, navelbina, novantrona, teniposido, aminopterina, xeloda, ibandronato, CPT-11, inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000, difluorometilmitina (DM-FO), acido retinoico, esperamicinas, capecitabina y sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Tambien se incluyen en esta definicion agentes antihormonales que actuan regulando o inhibiendo la accion hormonal en tumores, tales como antiestrogenos que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)- imidazoles inhibidores de la aromatosa, 4 hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY 117018, onapristona, toremifeno (Fareston), y antiandrogenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina y sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Los procedimientos conocidos en la tecnica pueden aplicarse a anticuerpos marcadores que se describen en el presente documento. Dichas tecnicas incluyen, pero sin limitacion, el uso de agentes de conjugacion bifuncionales (veanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.756.065; 5.714.631; 5.696.239; 5.652.361; 5.505.931; 5.489.425; 5.435.990; 5.428.139; 5.342.604; 5.274.119; 4.994.560; y 5.808.003) y reacciones de acoplamiento directo (por ejemplo, reaccion de Bolton-Hunter y Cloramina-T).
Los anticuerpos que se describen en el presente documento que son conjugados pueden usarse para modificar una respuesta biologica dada, y el agente terapeutico o resto farmacologico no debe interpretarse como limitado a los agentes qmmicos terapeuticos clasicos. Por ejemplo, el resto farmacologico puede ser una protema o polipeptido que posea una actividad biologica deseada. Dichas protemas pueden incluir, pero sin limitacion, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, toxina alfa, exotoxina de Pseudomonas o toxina de difteria, saporina, momordina, gelonina, protema antiviral del ombu, alfa- sarcina y toxina colerica; una protema tal como factor de necrosis tumoral, interferon alfa, interferon beta, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminogeno tisular, un agente apoptotico, por ejemplo, TNF-alfa, TNF- beta, AIM I (vease la Publicacion Internacional N.° WO 97/33899), AIM II (vease la Publicacion Internacional N.° WO 97/34911), Ligando Fas (Takahashi y col., Int. Immunol., 6: 1567-1574 (1994)), VEGl (vease la Publicacion Internacional N.° WO 99/23105), un agente trombotico y un agente antiangiogenico, por ejemplo, angiostatina o endostatina; o modificadores de la respuesta biologica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 (IL- I), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL- 6), factor estimulante de colonias de granulocitos- macrofagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G- CSF) u otros factores de crecimiento.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) tambien pueden unirse a soportes solidos, que son particularmente utiles para inmunoensayos o para la purificacion del antfgeno diana. Dichos soportes solidos incluyen, pero sin limitacion, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno.
Se conocen bien tecnicas para conjugar un resto terapeutico con anticuerpos, vease, por ejemplo, Arnon y col., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld y col. (eds.), pags. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y col., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson y col. (eds.), pags. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y col. (eds.), pags. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin y col. (eds.), pags. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe y col., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62: 119-58 (1982).
Alternativamente, un anticuerpo que se describe en la presente memoria puede conjugarse con un segundo
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anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo, como se describe por Segal en la Patente de Estados Unidos N.° 4.676.980.
Un anticuerpo que se describe en el presente documento (incluyendo un scFv y otra molecula que comprende, o alternativamente consiste en un fragmento de anticuerpo o variante del mismo) con o sin un resto terapeutico conjugado con el mismo, administrado en solitario o en combinacion con un factor o factores citotoxicos y/o una citocina o citocinas, puede usarse como producto terapeutico.
Uso de Anticuerpos para Mapeo de Epftopos
La presente memoria descriptiva describe anticuerpos (incluyendo scFv y otras moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo variantes de los mismos) que pueden usarse para identificar epftopos de BLyS. En particular, los anticuerpos de la presente invencion pueden usarse para identificar epftopos de BLyS humano (SEQ ID NO: 3228 y/o 3229) o BLyS expresado en monocitos humanos; BLyS murino (sEq ID NO: 3230 y/o 3231) o BLyS expresado en monocitos murinos; BLyS de rata (las formas solubles que se proporcionan en las sEq ID NO: 3232, 3233, 3234 y/o 3235 o en una forma asociada a membrana, por ejemplo, en la superficie de monocitos de rata); o BLyS de mono (por ejemplo, los polipeptidos de BLyS de mono de las SEQ ID NO: 3236 y/o 3237, la forma soluble de BLyS de mono, o BLyS expresado en monocitos de mono) usando tecnicas descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la tecnica. Los fragmentos que funcionan como epftopos pueden producirse por cualquier medio convencional (vease, por ejemplo, Houghten, Proc. Natl. Acad. Sei. EE.Uu. 82: 5131-5135 (l985), descrito adicionalmente en la Patente de Estados Unidos N.° 4.631.211).
Usos Diagnosticos de Anticuerpos
Los anticuerpos marcados que se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen espedficamente a BLyS puede usarse con fines de diagnostico para detectar, diagnosticar, pronosticar o controlar enfermedades y/o trastornos asociados con la expresion y/o actividad aberrante de BLyS o receptor de BLyS. La memoria descriptiva describe la deteccion de la expresion aberrante de BLyS, que comprende: (a) ensayar la expresion de BLyS en una muestra biologica de un individuo usando uno o mas anticuerpos que se describen en el presente documento, que se unen inmunoespedficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patron de BLyS, por ejemplo, en muestras biologicas normales, por lo que un aumento o disminucion en el nivel ensayado de BLyS en comparacion con el nivel patron de BLyS es indicativo de una expresion aberrante.
Por "muestra biologica" se entiende cualquier fluido y/o celula obtenida de un individuo, fluido corporal, tejido corporal, celula corporal, lrnea celular, cultivo de tejido u otra fuente que pueda contener protema o ARNm de BLyS. Los fluidos corporales incluyen, pero sin limitacion, sueros, plasma, orina, ftquido sinovial, ftquido espinal, saliva y moco. Las muestras de tejido pueden tomarse de practicamente cualquier tejido del cuerpo. Las muestras de tejido tambien pueden obtenerse de material de autopsia. Se conocen bien en la tecnica procedimientos para obtener biopsias de tejido y fluidos corporales de mairftferos. Cuando la muestra biologica va a incluir a ARNm, una biopsia de tejido es la fuente preferida.
La memoria descriptiva tambien describe la deteccion de la expresion aberrante de receptor de BLyS, que comprende (a) ensayar la expresion de receptor de BLyS en una muestra biologica de un individuo usando uno o mas anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, que se unen inmunoespedficamente solo a BLyS soluble, pero que no inhiben la union de BLyS/receptor de BLyS. Dicho anticuerpo, a modo de ejemplo que no debe interpretarse como limitante, sena uno que fuera capaz de capturar un BLyS biotinilado a partir de una solucion (vease el Ejemplo 8), pero que no impedina la union de BLyS a celulas IM-9 (vease el Ejemplo 3); y (b) comparar el nivel de receptor de BLyS con un nivel patron de receptor de BLyS, por ejemplo, en muestras de celulas o tejidos normales, por lo que un aumento o disminucion en el nivel ensayado de receptor de BLyS en comparacion con el nivel patron de receptor de BLyS es indicativo de una expresion aberrante.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen espedficamente a BLyS pueden usarse con fines de diagnostico para detectar, diagnosticar, pronosticar o controlar enfermedades autoinmunes y/o inmunodeficiencias, y/o enfermedades o afecciones asociadas con las mismas. La memoria descriptiva describe la deteccion de una expresion aberrante de BLyS, que comprende: (a) ensayar la expresion de BLyS en una muestra biologica de un individuo usando uno o mas anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patron de BLyS, por ejemplo, en muestras biologicas normales, por lo que un aumento o disminucion en el nivel ensayado de BLyS en comparacion con el nivel patron de BLyS es indicativo de un trastorno o enfermedad autoinmune y/o de una inmunodeficiencia. Espedficamente, un aumento en el nivel ensayado de BLyS es indicativo de una enfermedad o trastorno autoinmune. Tambien espedficamente, una disminucion en el nivel ensayado de BLyS es indicativa de una inmunodeficiencia.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen espedficamente a
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BLyS, pero que no inhiben la union de BLyS/receptor de BLyS, pueden usarse con fines de diagnostico para detectar, diagnosticar, pronosticar o controlar enfermedades autoinmunes y/o inmunodeficiencias, y/o enfermedades o afecciones asociadas con las mismas. La memoria descriptiva describe la deteccion de una expresion aberrante de receptor de BLyS que comprende: (a) ensayar la expresion de receptor de BLyS en una muestra biologica de un individuo usando uno o mas anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de receptor de BLyS con un nivel patron de receptor de BLyS, por ejemplo, en muestras biologicas normales, por lo que un aumento o disminucion en el nivel ensayado de receptor de BLyS en comparacion con el nivel patron de receptor de BLyS es indicativo de una enfermedad o trastorno autoinmune y/o una inmunodeficiencia. Espedficamente, un aumento en el nivel ensayado de receptor de BLyS es indicativo de una enfermedad o trastorno autoinmune. Tambien espedficamente, una disminucion en el nivel ensayado de receptor de BLyS es indicativa de una inmunodeficiencia.
Los trastornos, enfermedades o afecciones autoinmunes que pueden detectarse, diagnosticarse, pronosticarse o controlarse usando los anticuerpos que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, anemia hemolftica autoinmune, trombocitopenia neonatal autoinmune, purpura trombocitopenica idiopatica, neutropenia autoinmune, autoinmunocitopenia, anemia hemolftica, smdrome antifosfolipfdico, dermatitis, enteropatia sensible a gluten, encefalomielitis alergica, miocarditis, policondritis recidivante, cardiopatia reumatica, glomerulonefritis (por ejemplo, nefropatia por IgA), Esclerosis Multiple, Neuritis, Uveftis Oftalmia, poli endocrinopatias, Purpura (por ejemplo, purpura de Henloch- Scoenlein) , Enfermedad de Reiter, Smdrome del Hombre Rfgido, Inflamacion Pulmonar Autoinmune, miocarditis, glomerulonefritis por IgA, enfermedad por depositos densos, cardiopatia reumatica, Smdrome de Guillain-Barre, diabetes melitus (por ejemplo, diabetes melitus Tipo I o diabetes melitus insulinodependiente), diabetes de inicio juvenil y enfermedad ocular inflamatoria autoinmune, tiroiditis autoinmune, hipotiroidismo (es decir, tiroiditis de Hashimoto), lupus eritematoso sistemico, lupus discoideo, smdrome de Goodpasture, Penfigo, autoinmunidades contra receptores tales como, por ejemplo, (a) Enfermedad de Graves, (b) Miastenia Grave y (c) resistencia a la insulina, anemia hemolftica autoinmune, purpura trombocitopenica autoinmune, artritis reumatoide, esclerodermia con anticuerpos anti- colageno, enfermedad del tejido conectivo mixto, polimiositis/dermatomiositis, anemia perniciosa (enfermedad de Addison) , enfermedad de Addison idiopatica, infertilidad, glomerulonefritis tal como glomerulonefritis primaria y nefropatia por IgA, penfigoide ampuloso, smdrome de Sjogren, diabetes melitus y resistencia a farmacos adrenergicos (incluyendo resistencia a farmacos adrenergicos con asma o fibrosis qmstica), hepatitis cronica activa, cirrosis biliar primaria, otra insuficiencia de glandulas endocrinas, vitiligo, vasculitis, post-IM, smdrome de cardiotoirfta, urticaria, dermatitis atopica, asma, miopatias inflamatorias y otros trastornos inflamatorios, granulomatosos, degenerativos y atroficos, y otros trastornos tales como enfermedades inflamatorias de la piel, incluyendo psoriasis y esclerosis, respuestas asociadas con enfermedad inflamatoria del intestino (tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), smdrome de dificultad respiratoria (incluyendo smdrome de dificultad respiratoria del adulto, ARDS), meningitis, encefalitis, colitis, afecciones alergicas tales como eccema y otras afecciones que implican infiltracion de celulas T y respuestas inflamatorias cronicas, aterosclerosis, deficiencia de adhesion leucocitaria, smdrome de Reynaud, y respuestas inmunes asociadas con la hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T que se encuentra tipicamente en la tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis y enfermedades que implican diapedesis leucocitaria, trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC), smdrome de lesion multiorganica, enfermedades mediadas por complejos de antigeno- anticuerpo, enfermedad anti-membrana basal glomerular, smdrome miastenico de Lambert-Eaton, enfermedad de Beheet, artritis de celulas gigantes, nefritis por inmunocomplejos, nefropatia por IgA, poli neuropatias por IgM o trombocitopenia autoinmune, etc.
Espedficamente, la presente memoria descriptiva describe procedimientos y composiciones para detectar, diagnosticar y/o pronosticar enfermedades o trastornos asociados con hipergammaglobulinemia (por ejemplo, SIDA, enfermedades autoinmunes y algunas inmunodeficiencias). Tambien espedficamente, la presente memoria descriptiva describe procedimientos y composiciones para detectar, diagnosticar y/o pronosticar enfermedades o trastornos asociados con hipogammaglobulinemia (por ejemplo, una inmunodeficiencia).
Las inmunodeficiencias que pueden detectarse, diagnosticarse, pronosticarse o controlarse usando los anticuerpos de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, inmunodeficiencia combinada grave (SCID)-ligada a X, SCID- autosomica, deficiencia de adenosina desaminasa (deficiencia de ADA), agammaglobulinemia ligada a X (XLA), enfermedad de Bruton, agammaglobulinemia congenita, agammaglobulinemia infantil ligada a X, agammaglobulinemia adquirida, agammaglobulinemia de inicio en adultos, agammaglobulinemia de inicio tardm, disgammaglobulinemia, hipogammaglobulinemia, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, hipogammaglobulinemia no especificada, agammaglobulinemia, inmunodeficiencia variable comun (CVID) (adquirida), smdrome de Wiskott-Aldrich (WAS), inmunodeficiencia ligada a X con Itiper-IgM, inmunodeficiencia no ligada a X con dper-IgM, deficiencia selectiva de IgA, deficiencia de subclase IgG (con o sin deficiencia de IgA), deficiencia de anticuerpos con Ig normales o elevadas, inmunodeficiencia con timoma, deleciones de cadenas pesadas de Ig, deficiencia de cadena kappa, trastorno linfoproliferativo de linfocitos B (BLPD), inmunodeficiencia selectiva de IgM, agammaglobulinemia recesiva (tipo suizo), disgenesia reticular, neutropenia neonatal, leucopenia congenita grave, alinfoplasia-aplasia o displasia timica con inmunodeficiencia, ataxia-telangiectasia, enanismo de miembros cortos, smdrome linfoproliferativo ligado a X (XLP), smdrome de Nezelof- inmunodeficiencia combinada con Ig, deficiencia de purina nucleosido fosforilasa (PNP), deficiencia de MHC Clase II (Smdrome del Linfocito Desnudo) e inmunodeficiencia combinada grave.
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Se han observado niveles elevados de BLyS soluble en el suero de pacientes con Lupus Eritematoso Sistemico (SLE). Al comparar los sueros de 150 pacientes con SLE con los de 38 individuos de control se descubrio que la mayona de los pacientes con SLE teman mas de 5 ng/ml de BLyS en suero, mas de 30% de los pacientes con SLE teman niveles superiores a 10 ng/ml, y aproximadamente 10% de los pacientes con SLE teman niveles de BLyS en suero superiores a 20 ng/ml. Por el contrario, la mayona de los controles normales teman niveles de BLyS inferiores a 5 ng/ml, y menos de 10% teman niveles superiores a 10 ng/ml. Los niveles elevados de protema BLyS en suero estan presentes en forma soluble y tienen actividad biologica, segun se ensayo por la capacidad para estimular linfocitos B tratadas con anti-IgM in vitro. Tambien se descubrio que los pacientes con SLE con mas de 15 ng/ml de BLyS en suero teman niveles elevados de anticuerpos anti-ADNbc en comparacion tanto con los controles normales como con los pacientes con SLE con menos de 5 ng/ml de BLyS en suero (datos no publicados).
Ademas, el suero de dos subgrupos de pacientes que eran positivos para anticuerpos antinucleares (ANA+) pero que no cumplfan los requisitos formales del Colegio Americano de Reumatologfa (ACR) para su clasificacion en SLE se analizo para determinar los niveles de BLyS. El primer subgrupo de sueros eran sueros ANA+ que veman de pacientes que no presentaban impresion clmica de SLE. Este grupo tema niveles de BLyS solo ligeramente elevados (~9 ng/ml de BLyS). El segundo subgrupo, sin embargo, que tema sueros ANA+ de pacientes que presentaban la impresion clmica de SLE, teman niveles de BLyS significativamente aumentados (~ 15 ng/ml). Estos resultados sugieren que un nivel elevado de BLyS precede al cumplimiento formal de los criterios de la ACR. Los criterios de la ACR se describen en Tan, E. M., y col, Arthritis and Rheumatism 25:1271-1277 (1982).
Por lo tanto, espedficamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen espedficamente a BLyS pueden usarse con fines de diagnostico para detectar, diagnosticar, pronosticar o controlar el Lupus Eritematoso Sistemico o afecciones asociadas con el mismo. La memoria descriptiva describe la deteccion de la expresion aberrante de BLyS que comprende: (a) ensayar la expresion de BLyS en una muestra biologica de un individuo usando uno o mas anticuerpos que se describen en el presente documento, que se unen inmunoespedficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patron de BLyS, por ejemplo, en muestras biologicas normales, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparacion con el nivel patron de BLyS es indicativo de SLE.
Tambien espedficamente, los anticuerpos que se describen en la presente memoria que se unen espedficamente a BLyS pueden usarse con fines de diagnostico para detectar, diagnosticar, pronosticar o controlar una nefropatfa por IgA o afecciones asociadas con la misma. La memoria descriptiva describe la deteccion de la expresion aberrante de BLyS que comprende: (a) ensayar la expresion de BLyS en una muestra biologica de un individuo usando uno o mas anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patron de BLyS, por ejemplo, en muestras biologicas normales, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparacion con el nivel patron de BLyS es indicativo de nefropatfa por IgA.
En otros aspectos espedficos de la presente memoria descriptiva, los anticuerpos que se describen en el presente
documento que se unen espedficamente a BLyS pueden usarse con fines de diagnostico para detectar,
diagnosticar, pronosticar o controlar el Smdrome de Sjogren o afecciones asociadas con el mismo. la presente
invencion proporciona la deteccion de la expresion aberrante de BLyS, que comprende: (a) ensayar la expresion de BLyS en una muestra biologica de un individuo usando uno o mas anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patron de BLyS, por ejemplo, en muestras biologicas normales, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparacion con el nivel patron de BLyS es indicativo del Smdrome de Sjogren.
En otros aspectos espedficos de la presente memoria descriptiva, los anticuerpos que se describen en el presente
documento que se unen espedficamente a BLyS pueden usarse con fines de diagnostico para detectar,
diagnosticar, pronosticar o controlar una infeccion por VIH o afecciones asociadas con la misma (por ejemplo, SIDA). La memoria descriptiva describe la deteccion de la expresion aberrante de BLyS, que comprende: (a) ensayar la expresion de BLyS en una muestra biologica de un individuo usando uno o mas anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patron de BLyS, por ejemplo, en muestras biologicas normales, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparacion con el nivel patron de BLyS es indicativo de infeccion por VIH.
En otros aspectos espedficos de la presente memoria descriptiva, los anticuerpos que se describen en el presente
documento que se unen espedficamente a BLyS pueden usarse con fines de diagnostico para detectar,
diagnosticar, pronosticar o controlar la miastenia grave o afecciones asociadas con la misma. La memoria descriptiva describe la deteccion de la expresion aberrante de BLyS, que comprende: (a) ensayar la expresion de BLyS en una muestra biologica de un individuo usando uno o mas anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patron de BLyS, por ejemplo, en muestras biologicas normales, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparacion con el nivel patron de BLyS es indicativo de miastenia grave.
En otros aspectos espedficos de la presente memoria descriptiva, los anticuerpos que se describen en el presente
documento que se unen espedficamente a BLyS pueden usarse con fines de diagnostico para detectar,
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diagnosticar, pronosticar o controlar la purpura trombocitopenica idiopatica (ITP) o afecciones asociadas con la misma. La memoria descriptiva describe la deteccion de la expresion aberrante de BLyS, que comprende: (a) ensayar la expresion de BLyS en una muestra biologica de un individuo usando uno o mas anticuerpos de la presente invencion que se unen inmunoespedficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patron de BLyS, por ejemplo, en muestras biologicas normales, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparacion con el nivel patron de BLyS es indicativo de purpura trombocitopenica idiopatica (ITP).
En otros aspectos espedficos de la presente memoria descriptiva, los anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen espedficamente a BLyS pueden usarse con fines de diagnostico para detectar, diagnosticar, pronosticar o controlar la anemia hemolftica o afecciones asociadas con la misma. La memoria descriptiva describe la deteccion de la expresion aberrante de BLyS, que comprende: (a) ensayar la expresion de BLyS en una muestra biologica de un individuo usando uno o mas anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patron de BLyS, por ejemplo, en muestras biologicas normales, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparacion con el nivel patron de BLyS es indicativo de anemia hemolftica.
En otros aspectos espedficos de la presente memoria descriptiva, los anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen espedficamente a BLyS pueden usarse con fines de diagnostico para detectar, diagnosticar, pronosticar o controlar la tiroiditis o afecciones asociadas con la misma. La memoria descriptiva describe la deteccion de la expresion aberrante de BLyS, que comprende: (a) ensayar la expresion de BLyS en una muestra biologica de un individuo usando uno o mas anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patron de BLyS, por ejemplo, en muestras biologicas normales, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparacion con el nivel patron de BLyS es indicativo de tiroiditis.
En otros aspectos espedficos de la presente memoria descriptiva, los anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen espedficamente a BLyS pueden usarse con fines de diagnostico para detectar, diagnosticar, pronosticar o controlar el smdrome de Goodpasture o afecciones asociadas con el mismo. La memoria descriptiva describe la deteccion de la expresion aberrante de BLyS, que comprende: (a) ensayar la expresion de BLyS en una muestra biologica de un individuo usando uno o mas anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patron de BLyS, por ejemplo, en muestras biologicas normales, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparacion con el nivel patron de BLyS es indicativo de smdrome de Goodpasture.
En otros aspectos espedficos de la presente memoria descriptiva, los anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen espedficamente a BLyS pueden usarse con fines de diagnostico para detectar, diagnosticar, pronosticar o controlar la esclerosis multiple o afecciones asociadas con la misma. La memoria descriptiva describe la deteccion de la expresion aberrante de BLyS, que comprende: (a) ensayar la expresion de BLyS en una muestra biologica de un individuo usando uno o mas anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patron de BLyS, por ejemplo, en muestras biologicas normales, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparacion con el nivel patron de BLyS es indicativo de esclerosis multiple.
En aspectos adicionales de la presente memoria descriptiva, los anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen espedficamente a BLyS pueden usarse con fines de diagnostico para detectar,
diagnosticar, pronosticar o controlar la artritis reumatoide. La memoria descriptiva describe la deteccion de la expresion aberrante de BLyS, que comprende: (a) ensayar la expresion de BLyS en una muestra biologica (por
ejemplo, suero y ftquido sinovial) de un individuo usando uno o mas anticuerpos que se describen en la presente de
memoria que se unen inmunoespedficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patron de BLyS, por ejemplo, en muestras biologicas normales, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparacion con el nivel patron de BLyS es indicativo de artritis reumatoide.
En aspectos adicionales de la presente memoria descriptiva, los anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen espedficamente a BLyS pueden usarse con fines de diagnostico para detectar,
diagnosticar, pronosticar o controlar una enfermedad reumatologica de base inmune, (por ejemplo, SLE, artritis reumatoide, smdrome de CREST (una variante de esclerodermia caracterizada por calcinosis, fenomeno de Raynaud, trastornos de la motilidad esofagica, esclerodactilia y telangiectasia), espondiloartropatfa seronegativa (SpA) polimiositis/dermatomiositis, poli angeftis microscopica, artritis asociada a hepatitis C, arteritis de Takayasu y trastorno del tejido conectivo no diferenciado). La memoria descriptiva describe la deteccion de la expresion aberrante de BLyS, que comprende: (a) ensayar la expresion de BLyS en una muestra biologica (por ejemplo, suero y ftquido sinovial) de un individuo usando uno o mas anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patron de BLyS, por ejemplo en muestras biologicas normales, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparacion con el nivel patron de BLyS es indicativo del control de una enfermedad reumatologica de base inmune.
Se ha observado que los niveles sericos de BLyS se correlacionan inversamente con la proteinuria en el intervalo nefrotico (>3 g de proteinuria en una recogida de orina de 24 horas) usando una muestra de 71 pacientes con SLE
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(p=0,019). La proteinuria se determino a 71 pacientes con SLE dentro del plazo de un mes desde una flebotoirna para la determinacion de BLyS en suero. El BLyS en suero se clasifico como bajo, normal o elevado basandose en los percentiles de 5° a 95° para controles normales. La proteinuria en el intervalo nefrotico estaba inversamente correlacionada con los niveles de Neutroquina-alfa en suero. Por lo tanto, en aspectos espedficos, los niveles sericos de BLyS (determinados usando uno o mas anticuerpos que se describen en el presente documento) en individuos diagnosticados con una enfermedad reumatologica de base inmune (por ejemplo, SLE, artritis reumatoide, smdrome de CREST (una variante de esclerodermia caracterizada por calcinosis, fenomeno de Raynaud, trastornos de la motilidad esofagica, esclerodactilia y telangiectasia) , espondiloartropatfa seronegativa (SpA), polimiositis/dermatomiositis, poli angettis microscopica, artritis asociada a hepatitis C, arteritis de Takayasu y trastorno del tejido conectivo no diferenciado) pueden usarse para determinar, diagnosticar, pronosticar o controlar la gravedad de ciertos aspectos o smtomas de la enfermedad, tales como la proteinuria en el intervalo nefrotico.
En otros aspectos espedficos de la presente memoria descriptiva, los anticuerpos que se describen en el presente documento se usan para diagnosticar, pronosticar, tratar o prevenir afecciones asociadas con CVID, incluyendo, pero sin limitacion, afecciones asociadas con infecciones agudas y recurrentes (por ejemplo, neumoma, bronquitis, sinusitis, otitis media, septicemia, meningitis, artritis septica y osteomielitis) , enfermedad pulmonar cronica, autoinmunidad, enfermedad granulomatosa, linfoma, canceres (por ejemplo, canceres de mama, estomago, colon, boca, prostata, pulmon, vagina, ovario, piel y celulas formadoras de melanina (es decir, melanoma), enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y proctitis ulcerosa), malabsorcion, enfermedad de Hodgkin y macroglobulinemia de Waldenstrom.
La memoria descriptiva describe un ensayo de diagnostico para diagnosticar o pronosticar una enfermedad o trastorno, que comprende: (a) ensayar para determinar el nivel de BLyS en una muestra biologica de un individuo usando uno o mas anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel de BLyS patron, por ejemplo, en una muestra biologica de un paciente sin la enfermedad o trastorno, por lo que un aumento o disminucion en el nivel ensayado de BLyS en comparacion con el nivel patron de BLyS es indicativo de una enfermedad o trastorno particular. Con respecto al cancer, la presencia de una cantidad relativamente alta de BLyS en tejido biopsiado de un individuo puede indicar una predisposicion para el desarrollo de la enfermedad o puede proporcionar un medio para detectar la enfermedad antes de la aparicion de los smtomas clmicos reales. Un diagnostico mas definitivo de este tipo puede permitir a los profesionales sanitarios emplear antes medidas preventivas o un tratamiento agresivo, evitando de este modo el desarrollo o la progresion adicional del cancer.
En aspectos espedficos de la presente memoria descriptiva, la presencia de una cantidad relativamente alta de BLyS unido a membrana en una muestra biologica es indicativa de leucemias o linfomas relacionados con celulas monodticas, tales como, por ejemplo, leucemia mielogena aguda, y/o de la gravedad de los mismos.
En otros aspectos espedficos de la presente memoria descriptiva, la presencia de una cantidad relativamente alta de receptor de BLyS en una muestra biologica (segun se determina usando anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen a BLyS soluble, pero que no inhiben la union de BLyS/receptor de BLyS) es indicativa de leucemias o linfomas relacionados con linfocitos B (por ejemplo, leucemia linfocftica cronica, mieloma multiple, linfoma no Hodgkin y enfermedad de Hodgkin) y/o de la gravedad de los mismos.
En aspectos espedficos de la presente memoria descriptiva, la memoria descriptiva describe un ensayo de diagnostico para diagnosticar o pronosticar el Lupus Eritematoso Sistemico, que comprende: (a) ensayar para determinar el nivel de BLyS en una muestra biologica de un individuo usando uno o mas anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patron de BLyS, por ejemplo, en una muestra biologica de un paciente sin Lupus Eritematoso Sistemico, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparacion con el nivel patron de BLyS es indicativo de Lupus Eritematoso Sistemico.
En aspectos espedficos, la memoria descriptiva describe un ensayo de diagnostico para diagnosticar o pronosticar una artritis reumatoide, que comprende: (a) ensayar para determinar el nivel de BLyS en una muestra biologica de un individuo usando uno o mas anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patron de BLyS, por ejemplo, en una muestra biologica de un paciente con artritis reumatoide, por lo que un aumento o disminucion en el nivel ensayado de BLyS en comparacion con el nivel patron de BLyS es indicativo de artritis reumatoide.
La memoria descriptiva describe un ensayo de diagnostico para diagnosticar o pronosticar una enfermedad o trastorno, que comprende: (a) ensayar para determinar el nivel de receptor de BLyS en celulas o en una muestra tisular de un individuo usando uno o mas anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespedficamente solo a BLyS soluble, pero que no neutralizan la union de BLyS/receptor de BLyS; y (b) comparar el nivel de receptor de BLyS con un nivel patron de receptor de BLyS, por ejemplo, en una muestra tisular de un paciente sin la enfermedad o trastorno, por lo que un aumento o disminucion en el nivel ensayado de receptor de BLyS en comparacion con el nivel patron de receptor de BLyS es indicativo de una enfermedad o trastorno particular. Con respecto al cancer, la presencia de una cantidad relativamente alta de receptor de BLyS en tejido biopsiado de un individuo puede indicar una predisposicion para el desarrollo de la enfermedad, o puede
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proporcionar un medio para detectar la enfermedad antes de la aparicion de los smtomas clmicos reales. Un diagnostico mas definitivo de este tipo puede permitir a los profesionales sanitarios emplear antes medidas preventivas o un tratamiento agresivo, evitando este modo el desarrollo o una progresion adicional del cancer.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) pueden usarse para los ensayar niveles de protemas en una muestra biologica usando procedimientos inmunohistologicos clasicos, que se describen en el presente documento o que conocen los expertos en la materia (por ejemplo, vease Jalkanen, y col., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, y col., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros procedimientos basados en anticuerpos utiles para detectar la expresion genica de protemas incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Se conocen en la tecnica marcadores de ensayos de anticuerpos adecuados e incluyen marcadores enzimaticos, tales como glucosa oxidasa, fosfata
J ' J 121 123 125 13^ 14
alcalina y peroxidasa de rabano picante; radioisotopos tales como yodo ( I, I, I, I), carbono ( C), azufre
/35ow.;t;„ ,3U, ■ /111,„ 112,„ 113m,„ l15m,„, t____99m-,-, . ™
(35S), tritio (3H), indio ('
1 In "2In, In ll5mIn), tecnecio , molibdeno ("Mo), xenon (133Xe), fluor (18F)1 153Sm, 177Lu, 159Gd 142Pr, 105Rh y 97Ru; marcadores luminiscentes tales como luminol fluorescema y rodamina, y biotina.
Tc, 99mTc), talio (201Ti), galio " 149Pm, 140La 175^ 16
Yb, 166HO
Ga 6'Ga), paladio ('
Pd),
Y, 4'SC, l86Re, l88Re, y marcadores fluorescentes tales como
Un aspecto de la memoria descriptiva es la deteccion y diagnostico de una enfermedad o trastorno asociado con una expresion aberrante de BLyS o receptor de BLyS en un animal, preferentemente un mairnfero y, mas preferentemente, un ser humano. En un aspecto de la presente memoria descriptiva, el diagnostico comprende: a) administrar (por ejemplo, por via parenteral, subcutanea o intraperitoneal) a un sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo marcado de la presente invencion como se describe el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se une inmunoespedficamente a BLyS; b) esperar un intervalo de tiempo despues de la administracion para permitir que el anticuerpo marcado se concentre preferentemente en sitios en el sujeto en los que se exprese BLyS (y para que se elimine hasta el nivel de fondo la molecula marcada no unida); c) determinar el nivel de fondo; y d) detectar el anticuerpo marcado en el sujeto, de modo que la deteccion de anticuerpo marcado o fragmento del mismo por encima del nivel de fondo y por encima o por debajo del nivel observado en una persona sin la enfermedad o trastorno indica que el sujeto tiene una enfermedad o trastorno particular asociado con una expresion aberrante de BLyS o receptor de BLyS. El nivel de fondo puede determinarse por diversos procedimientos, incluyendo comparar la cantidad de molecula marcada detectada con un valor patron previamente determinado para un sistema particular.
Se entendera en la tecnica que el tamano del sujeto y el sistema de formacion de imagenes usado determinaran la cantidad de resto de formacion de imagenes necesario para producir imagenes de diagnostico. En el caso de un resto radioisotopico, para un sujeto humano, la cantidad de radiactividad inyectada variara normalmente de aproximadamente 5 a 20 milicurios de "Tc. El anticuerpo marcado se acumulara despues preferentemente en la localizacion de celulas que contenga la protema espedfica. La formacion de imagenes de tumores in vivo se describe en S.W. Burchiel y col., "Immunopharmacokinetics of Antibodies and Their Fragments". (Capftulo 13 en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel y B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982).
Dependiendo de varias variables, incluyendo el tipo de marcador usado y el modo de administracion, el intervalo de tiempo despues de la administracion para permitir que la molecula marcada se concentre preferentemente en sitios en el sujeto y que la molecula marcada no unida se elimine hasta el nivel de fondo es de 6 a 48 horas o de 6 a 24 horas o de 6 a 12 horas. En otro aspecto, el intervalo de tiempo despues de la administracion es de 5 a 20 dfas o de 5 a 10 dfas.
El control de la enfermedad o trastorno puede llevarse a cabo repitiendo el procedimiento para diagnosticar la enfermedad o trastorno, por ejemplo, un mes despues del diagnostico inicial, seis meses despues del diagnostico inicial, un ano despues del diagnostico inicial, etc.
La presencia de la molecula marcada puede detectarse en el paciente usando procedimientos conocidos en la tecnica para la exploracion in vivo. Estos procedimientos dependen del tipo de marcador usado. Los expertos en la materia seran capaces de determinar el procedimiento apropiado para detectar un marcador particular. Los procedimientos y dispositivos que pueden usarse en los procedimientos de diagnostico de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, tomograffa computarizada (CT), exploracion de todo el cuerpo tal como una tomograffa por emision de positrones (PET), formacion de imagenes de resonancia magnetica (MRI) y sonograffa.
Espedficamente, la molecula se marca con un radioisotopo y se detecta en el paciente usando un instrumento quirurgico sensible a radiacion (Thurston y col., Patente de Estados Unidos N.° 5.441.050). En otro aspecto espedfico, la molecula se marca con un compuesto fluorescente y se detecta en el paciente usando un instrumento de exploracion sensible a fluorescencia. En otro aspecto espedfico, la molecula se marca con un metal emisor de positrones y se detecta en el paciente usando tomograffa por emision de positrones. En otro aspecto espedfico, la molecula se marca con un marcador paramagnetico y se detecta en un paciente usando formacion de imagenes de resonancia magnetica (MRI).
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Inmunofenotipado
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) pueden utilizarse para el inmunofenotipado de lmeas celulares y muestras biologicas por su expresion de BLyS o por su expresion de receptor de BLyS. Pueden utilizarse diversas tecnicas que usan anticuerpos, fragmentos o variantes que se describen en el presente documento para explorar poblaciones celulares (es decir, celulas inmunes, particularmente celulas monodticas o linfocitos B) que expresan BLyS o receptor de BLyS, e incluyen separacion magnetica usando perlas magneticas revestidas de anticuerpo, "seleccion" con anticuerpo unido a una matriz solida (es decir, placa) y citometna de flujo (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5.985.660; y Morrison y col., Cell, 96:737-49 (1999)).
Estas tecnicas permiten la exploracion de poblaciones particulares de celulas, como las que podnan encontrarse en tumores malignos hematologicos (es decir, enfermedad minima residual (MRD) en pacientes con leucemia aguda) y "celulas extranas" en trasplantes para prevenir la enfermedad de injerto contra huesped (GVHD). Alternativamente, estas tecnicas permiten la exploracion de celulas madre y progenitoras hematopoyeticas capaces de experimentar proliferacion y/o diferenciacion, como podnan encontrarse en sangre de cordon umbilical humano.
En un aspecto espedfico, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) se usan para identificar celulas de origen monodtico o linfocitos B.
Usos Terapeuticos de Anticuerpos
La presente memoria descriptiva describe ademas terapias basadas en anticuerpos que implican administrar anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) a un animal, preferentemente un mairnfero, y mas preferentemente un paciente humano, para tratar una o mas de las enfermedades, trastornos o afecciones descritos. Los compuestos terapeuticos que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, anticuerpos que se describen en el presente documento y acidos nucleicos que codifican anticuerpos (y anticuerpos antiidiotfpicos) que se describen en el presente documento. Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en el tratamiento, mejona o prevencion de enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con una expresion y/o actividad aberrante de BLyS o receptor de BLyS incluyendo, pero sin limitacion, una o mas de cualquiera de las enfermedades, trastornos o afecciones descritas en el presente documento. El uso en el tratamiento y/o la prevencion de enfermedades, trastornos o afecciones asociados con una expresion y/o actividad aberrante de BLyS o una expresion y/o actividad aberrante de receptor de BLyS incluyen, pero sin limitacion, aliviar los smtomas asociados con esas enfermedades, trastornos o afecciones. Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden proporcionarse en composiciones farmaceuticamente aceptables como se conocen en la tecnica o como se describen en el presente documento.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpos o variantes de los mismos) que funcionan como agonistas o antagonistas de BLyS, preferentemente de la transduccion de senales inducida por BLyS, pueden ser para usarse en la administracion a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con una expresion aberrante de BLyS, con la ausencia de funcion de BLyS, con una expresion aberrante de receptor de BLyS o la ausencia de funcion de receptor de BLyS. Por ejemplo, los anticuerpos que se describen en el presente documento que alteran la interaccion entre BLyS y su receptor pueden ser para usarse en la administracion a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con una expresion aberrante de BLyS, una funcion excesiva de BLyS, una expresion aberrante de receptor de BLyS o una funcion excesiva de receptor de BLyS. Los anticuerpos que se describen en la presente memoria que no impiden la union de BLyS a su receptor pero que inhiben o regulan negativamente la transduccion de senales inducida por BLyS pueden ser para usarse en la administracion a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con una expresion aberrante de BLyS, con una funcion excesiva de BLyS, una expresion aberrante de receptor de BLyS o una funcion excesiva de receptor de BLyS. En particular, los anticuerpos que se describen en la presente invencion que impiden la transduccion de senales inducida por BLyS por reconocimiento especifico del BLyS no unido, del BLyS unido a receptor o del BLyS tanto unido a receptor como no unido, pueden ser para usarse en la administracion a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con una expresion aberrante de BLyS, una funcion excesiva de BLyS, una expresion aberrante de receptor de BLyS o una funcion excesiva de receptor de BLyS. La capacidad de un anticuerpo que se describe en el presente documento para inhibir o regular negativamente la transduccion de senales inducida por BLyS puede determinarse mediante tecnicas descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la tecnica. Por ejemplo, la activacion de receptor inducida por BLyS y la activacion de moleculas de senalizacion pueden determinarse por deteccion de la fosforilacion (por ejemplo, tirosina o serina/treonina) del receptor o una molecula de senalizacion por inmunoprecipitacion, seguida de analisis por transferencia de Western (por ejemplo, como se describe en el presente documento).
Espedficamente, un anticuerpo que se describe en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que inhibe o regula
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negativamente la actividad de BLyS al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 45%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 35%, al menos 30%, al menos 25%, al menos 20% o al menos 10% respecto a la actividad de BLyS en ausencia del anticuerpo, es para usarse en la administracion a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con una expresion aberrante de BLyS, una funcion excesiva de BLyS, una expresion aberrante de receptor de BLyS o una funcion excesiva de receptor de BLyS. En otro aspecto especifico, una combinacion de anticuerpos, una combinacion de fragmentos de anticuerpo, una combinacion de variantes de anticuerpo o una combinacion de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y/o variantes que inhiben o regulan negativamente la actividad de BLyS al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 60%, al menos 55%, al menos 50%, al menos 45%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 35%, al menos 30%, al menos 25%, al menos 20% o al menos 10% respecto a la actividad de BLyS en ausencia de dichos anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y/o variantes de anticuerpo, es para usarse en la administracion a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con una expresion aberrante de BLyS, una funcion excesiva de BLyS, una expresion aberrante de receptor de BLyS o una funcion excesiva de receptor de BLyS.
Ademas, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que activan la transduccion de senales inducida por BLyS, son para usarse en la administracion a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con una expresion aberrante de BLyS, con la ausencia de funcion de BLyS, una expresion aberrante de receptor de BLyS o la ausencia de funcion de receptor de BLyS. Estos anticuerpos pueden potenciar o activar todas o un subconjunto de las actividades biologicas de la activacion de receptor mediada por BLyS, por ejemplo, induciendo la multimerizacion de BLyS y/o la multimerizacion del receptor. Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden administrarse formando o no previamente complejos con BLyS. Espedficamente, un anticuerpo que se describe en el presente documento que aumenta la actividad de BLyS al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % respecto a la actividad de BLyS en ausencia del anticuerpo es para usarse en la administracion a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con una expresion aberrante de BLyS, la ausencia de funcion de BLyS, una expresion aberrante de receptor de BLyS o la ausencia de funcion de receptor de BLyS. En otro aspecto espedfico, una combinacion de anticuerpos, una combinacion de fragmentos de anticuerpo, una combinacion de variantes de anticuerpo o una combinacion de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y/o variantes de anticuerpo que aumentan la actividad de BLyS al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % respecto a la actividad de BLyS en ausencia de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo y/o variantes de anticuerpo, es para usarse en la administracion a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con una expresion aberrante de BLyS o la ausencia de funcion de BLyS o una expresion aberrante de receptor de BLyS o la ausencia de funcion de receptor de BLyS.
Uno o mas anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespedficamente a BLyS pueden ser para uso local o sistemico en el cuerpo como producto terapeutico. Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) tambien pueden utilizarse ventajosamente en combinacion con otros anticuerpos monoclonales o quimericos, o con linfocinas o factores de crecimiento hematopoyetico (tales como, por ejemplo, IL-2, IL-3 e IL-7), por ejemplo, que sirven para aumentar el numero o la actividad de celulas efectoras que interaccionan con los anticuerpos.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) pueden usarse en la administracion en solitario o en combinacion con otros tipos de tratamientos (por ejemplo, terapia de radiacion, quimioterapia, terapia hormonal, inmunoterapia, agentes antitumorales, agentes antiangiogenesis y
antiinflamatorios). Generalmente, se prefiere la administracion de productos de un origen de especie o reactividad de especie (en el caso de anticuerpos) que sea la misma especie que la del paciente. Por lo tanto, preferentemente, los anticuerpos humanos, fragmentos o variantes (por ejemplo, derivados), o acidos nucleicos, son para usarse en la administracion a un paciente humano para terapia o profilaxis.
Se prefiere usar anticuerpos neutralizantes y/o inhibidores in vivo de alta afinidad y/o potentes como se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespedficamente a BLyS, o polinucleotidos que codifican anticuerpos que se unen, para tanto inmunoensayos dirigidos contra como terapia, dichos anticuerpos tendran preferentemente afinidad por BLyS y/o fragmentos de BLyS. Las afinidades de union preferidas incluyen aquellas con una constante de disociacion o Kd inferior a o igual a 5 X 10"2 M, 10"2 M, 5 X 10"3 M, 10"3 M, 5 X 10"4 M, 10"4, 5 X
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10 M o 10 M. Mas preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipeptidos de BLyS o fragmentos o variantes de los mismos con una constante de disociacion o Kd inferior a o igual a 5 X 10"6 M, 10- M, 5 X 10"7 M, 10"7 M, 5 X 10"8 M o 10"8 M. Aun mas preferentemente, los anticuerpos que se
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describen en el presente documento se unen a polipeptidos de BLyS o fragmentos o variantes de los mismos con una constante de disociacion o Kd inferior a o igual a 5 X 10-9 M, 10-9 M, 5 X 10-10 M, 10-10 M, 5 X 10-11 M, 10-11 M, 5 X 10-12 M, 10-12 M, 5 X 10-13 M, 10-13 M, 5 X 10-14 M, 10-14 M, 5 X una constante de disociacion o Kd que esta dentro de uno cualquiera de los intervalos que estan entre cada uno de los valores enumerados individuales.
Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento neutralizan la actividad de BLyS. En otro aspecto preferido de la memoria descriptiva, los anticuerpos inhiben la proliferacion de linfocitos B.
Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) inhiben o reducen la union de la forma soluble de BLyS a un receptor de BLyS. En otro aspecto especifico, los anticuerpos que se describen en el presente documento, preferentemente, inhiben o reducen la proliferacion de linfocitos B inducida por la forma soluble de BLyS. En otro aspecto espedfico, los anticuerpos que se describen en el presente documento, preferentemente, inhiben o reducen la produccion de inmunoglobulina inducida por la forma soluble de BLyS.
En un aspecto espedfico, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) preferentemente inhiben o reducen la union de BLyS unido a membrana a un receptor de BLyS. En otro aspecto espedfico, los anticuerpos que se describen en el presente documento preferentemente inhiben o reducen la proliferacion de linfocitos B inducida por la forma unida a membrana de BLyS. Tambien preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento inducen o reducen la produccion de inmunoglobulina inducida por la forma unida a membrana de BLyS.
Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moleculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) inhiben o reducen la union de las formas tanto soluble como unida a membrana de BLyS a un receptor de BLyS. Tambien preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento inhiben o reducen la proliferacion de linfocitos B inducida por cualquiera o ambas formas de BLyS. Tambien preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento inhiben o reducen la produccion de inmunoglobulina inducida por cualquiera o ambas formas de BLyS.
La memoria descriptiva tambien describe conjugados de anticuerpos que se describen en el presente documento para su uso en la administracion a celulas diana, tales como, por ejemplo, celulas monodticas que expresan la forma unida a membrana de BLyS, o linfocitos B que expresan un receptor de BLyS.
La memoria descriptiva tambien describe anticuerpos y conjugados de anticuerpos que se describen en el presente documento para su uso en la administracion espedfica a celulas por administracion de moleculas que se describen en el presente documento que estan asociadas con polipeptidos heterologos o acidos nucleicos. En un ejemplo, la memoria descriptiva describe una protema terapeutica para su uso en la administracion a la celula diana. En otro ejemplo, la memoria descriptiva describe un acido nucleico monocatenario (por ejemplo, antisentido o ribozimas) o acido nucleico bicatenario (por ejemplo, ADN que puede integrarse en el genoma de la celula o replicarse episomalmente y que puede transcribirse) para su uso en la administracion a la celula diana.
La memoria descriptiva tambien describe anticuerpos o conjugados de anticuerpos que se describen en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos conjugados con radioisotopos, toxinas o profarmacos citotoxicos) para su uso en la destruccion espedfica de celulas (por ejemplo, la destruccion de celulas tumorales). Espedficamente, los anticuerpos o conjugados de anticuerpo que se describen en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos conjugados con radioisotopos, toxinas o profarmacos citotoxicos) que se unen inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS para su uso en la destruccion espedfica de celulas de linaje monodtico (por ejemplo, leucemias o linfomas relacionados con celulas monodticas, tales como, por ejemplo, leucemia mielogena aguda). La memoria descriptiva tambien describe espedficamente anticuerpos o conjugados de anticuerpo que se describen en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos conjugados con radioisotopos, toxinas o profarmacos citotoxicos) que se unen a BLyS soluble pero que no inhiben la union de BLyS a un receptor de BLyS en linfocitos B, para su uso en la destruccion espedfica de celulas de linaje celular B (por ejemplo, leucemias o linfomas relacionados con linfocitos B (por ejemplo, leucemia linfocftica cronica, mieloma multiple, linfoma no Hodgkin y enfermedad de Hodgkin).
En otro aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpo y variantes) promueven o potencian la proliferacion de linfocitos B inducida por la forma soluble de BLyS. En otro aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpo y variantes) promueven o potencian la proliferacion de linfocitos B inducida por la forma soluble o unida a membrana de APRIL. En otro aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpo y variantes) aumentan o potencian la produccion de inmunoglobulina inducida por la forma soluble de BLyS. En otro aspecto preferido, los anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpo y variantes) aumentan o potencian la produccion de inmunoglobulina inducida por la forma soluble o unida a membrana de APRIL. En otro aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento
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(incluyendo fragmentos de anticuerpo y variantes) aumentan o potencian la produccion de inmunoglobulina en respuesta a inmunogenos dependientes de celulas T. En otro aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpo y variantes y anticuerpos anti-anticuerpo) aumentan o potencian la produccion de inmunoglobulina en respuesta a inmunogenos independientes de celulas T.
En otro aspecto, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas son para usarse en la administracion a un animal para tratar, prevenir o mejorar trastornos inmunes. Los trastornos inmunes incluyen, pero sin limitacion, trastornos autoinmunes (por ejemplo, artritis, rechazo de injerto, tiroiditis de Hashimoto, diabetes insulinodependiente, lupus, purpura trombocitopenica idiopatica, lupus eritematoso sistemico y esclerosis multiple), deficiencia selectiva de IgA, ataxia-telangiectasia, inmunodeficiencia variable comun (CVID), agammaglobulinemia ligada a X, inmunodeficiencia combinada grave (SCID), smdrome de Wiskott-Aldrich, smdrome hipereosinofftico idiopatico, reaccion leucemoide monolftica, leucocitosis monolftica, leucopenia monolftica, monocitopenia, monocitosis y rechazo de trasplantes o injertos .
Como se analiza en el presente documento, los anticuerpos y composiciones de anticuerpos que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico o pronostico de diversos trastornos relacionados con el sistema inmune y/o afecciones asociadas con estos trastornos, en mamfteros, preferentemente seres humanos. Muchos trastornos autoinmunes son el resultado de un reconocimiento inapropiado de material propio y extrano por celulas inmunes. Este reconocimiento inapropiado da como resultado una respuesta inmune que conduce a la destruccion del tejido del hospedador. Por lo tanto, la administracion de un anticuerpo y composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento que pueden inhibir una respuesta inmune, particularmente la proliferacion de linfocitos B y/o la produccion de inmunoglobulinas, puede ser una terapia eficaz en el tratamiento y/o prevencion de trastornos autoinmunes. Por lo tanto, en aspectos preferidos, los anticuerpos y composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico y/o pronostico de un trastorno autoinmune, o una afeccion o afecciones asociadas con dicho trastorno.
Los trastornos autoinmunes y afecciones asociadas con estos trastornos que pueden tratarse, prevenirse, mejorarse, diagnosticarse y/o pronosticarse con las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, anemia hemolftica autoinmune, trombocitopenia neonatal autoinmune, purpura trombocitopenica idiopatica, neutropenia autoinmune, autoinmunocitopenia, anemia hemolftica, smdrome antifosfolipfdico, dermatitis, enteropafta sensible a gluten, encefalomielitis alergica, miocarditis, policondritis recidivante, cardiopatfa reumatica, glomerulonefritis (por ejemplo, nefropatfa por IgA), Esclerosis Multiple, Neuritis, Uveftis Oftalmia, Poli endocrinopatfas, Purpura (por ejemplo, purpura de Henloch-Scoenlein), Enfermedad de Reiter, Smdrome del Hombre Rfgido, Inflamacion Pulmonar Autoinmune, miocarditis, glomerulonefritis por IgA, enfermedad por deposited densos, cardiopatfa reumatica, Smdrome de Guillain-Barre, diabetes melitus insulinodependiente y enfermedad ocular inflamatoria autoinmune.
Los trastornos autoinmunes adicionales y afecciones asociadas con estos trastornos que pueden tratarse, prevenirse, mejorarse, diagnosticarse y/o pronosticarse con las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, tiroiditis autoinmune, hipotiroidismo (es decir, tiroiditis de Hashimoto) (con frecuencia caracterizado, por ejemplo, por citotoxicidad tiroidea humoral y mediada por celulas), lupus eritematoso sistemico (con frecuencia caracterizado, por ejemplo, por inmunocomplejos generados localmente y circulantes), lupus discoideo, smdrome de Goodpasture (con frecuencia caracterizado, por ejemplo, por anticuerpos anti-membrana basal), Penfigo (con frecuencia caracterizado, por ejemplo, por anticuerpos acantolfticos epidermicos), autoinmunidades contra receptores tales como, por ejemplo, (a) Enfermedad de Graves (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por anticuerpos contra el receptor de TSH), (b) Miastenia Grave (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por anticuerpos contra el receptor de acetilcolina) y (c) resistencia a la insulina (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por anticuerpos contra el receptor de insulina) , anemia hemolftica autoinmune (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por fagocitosis de globulos rojos sensibilizados por anticuerpos), purpura trombocitopenica autoinmune (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por fagocitosis de plaquetas sensibilizadas por anticuerpos).
Los trastornos autoinmunes adicionales y afecciones asociadas con estos trastornos que pueden tratarse, prevenirse, mejorarse, diagnosticarse y/o pronosticarse con las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, artritis reumatoide (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por inmunocomplejos en articulaciones), esclerodermia con anticuerpos anti-colageno (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por anticuerpos nucleolares y otros anticuerpos nucleares), enfermedad del tejido conectivo mixto (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por anticuerpos contra anftgenos nucleares extrateles (por ejemplo, ribonucleoprotema)), polimiositis/dermatomiositis (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por ANA contra no histonas), anemia perniciosa (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por anticuerpos anti-celulas parietales, microsomas y factor intrmseco), enfermedad de Addison idiopatica (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por citotoxicidad suprarrenal humoral y mediada por celulas), infertilidad (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por anticuerpos anti- espermatozoides) , glomerulonefritis (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por inmunocomplejos o anticuerpos contra la membrana basal glomerular) , tal como glomerulonefritis primaria y nefropatfa por IgA, penfigoide ampolloso (con frecuencia caracterizado, por ejemplo, por IgG y complemento en la membrana basal), smdrome de Sjogren (con frecuencia caracterizado, por ejemplo, por multiples anticuerpos
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tisulares y/o un ANA contra no histonas espedfico (SS-B)), diabetes melitus (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por anticuerpos contra celulas de los islotes humorales y mediados por celulas) y resistencia a farmacos adrenergicos (incluyendo resistencia a farmacos adrenergicos con asma o fibrosis qmstica) (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por anticuerpos contra el receptor beta- adrenergico), hepatitis cronica activa (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por anticuerpos contra el musculo liso), cirrosis biliar primaria (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por anticuerpos mitocondriales), otra insuficiencia de glandulas endocrinas (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por anticuerpos tisulares espedficos en algunos casos), vitiligo (con frecuencia caracterizado, por ejemplo, por anticuerpos contra melanocitos), vasculitis (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por Ig y complemento en las paredes de los vasos y/o bajo nivel de complemento en suero), post-IM (con frecuencia caracterizado, por ejemplo, por anticuerpos miocardiales), smdrome de cardiotomfa (con frecuencia caracterizado, por ejemplo, por anticuerpos miocardiales), urticaria (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por anticuerpos IgG e IgM contra IgE), dermatitis atopica (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por anticuerpos IgG e IgM contra IgE), asma (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por anticuerpos IgG e IgM contra IgE), miopatfas inflamatorias y muchos otros trastornos inflamatorios, granulomatosos, degenerativos y atroficos.
En un aspecto preferido, las composiciones terapeuticas y farmaceuticas son para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico o pronostico de un miembro del grupo: anemia hemolttica autoinmune, como glomerulonefritis primaria, glomerulonefritis por IgA, smdrome de Goodpasture, trombocitopenia idiopatica, Esclerosis Multiple, Miastenia Grave, Penfigo, polimiositis/dermatomiositis, policondritis recidivante, artritis reumatoide, smdrome de Sjogren, lupus eritematoso sistemico, uveitis, vasculitis y cirrosis biliar primaria.
En otro aspecto preferido, las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico o pronostico de una enfermedad reumatologica de base inmune, tal como, por ejemplo, SLE, artritis reumatoide, smdrome de CREST (una variante de esclerodermia caracterizada por calcinosis, fenomeno de Raynaud, trastornos de la motilidad esofagica, esclerodactilia y telangiectasia) , espondiloartropatia seronegativa (SpA), polimiositis/dermatomiositis, poliangeitis microscopica, artritis asociada a hepatitis C, arteritis de Takayasu y trastorno del tejido conectivo no diferenciado.
En un aspecto preferido especifico, las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico o pronostico de la artritis reumatoide y/o de afecciones medicas asociadas con la misma.
Por ejemplo, un anticuerpo o anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento de pacientes con diagnostico clmico de artritis reumatoide (RA). El paciente tratado preferentemente no tendra un tumor maligno de linfocitos B. Ademas, el paciente se trata opcionalmente ademas con uno o mas de cualquiera de los agentes empleados para tratar la RA, tales como salicilato; farmacos antiinflamatorios no esteroideos, tales como indometacina, fenilbutazona, derivados del acido fenilacetico (por ejemplo, ibuprofeno y fenoprofeno), acidos naftaleno aceticos (naproxeno), acido pirrolalcanoico (tometina), acidos indolaceticos (sulindaco), acido antranilico halogenado (meclofenamato sodico), piroxicam, zomepiraco y diflunisal; antimalaricos tales como cloroquina; sales de oro; penicilamina; o agentes inmunosupresores tales como metotrexato o corticosteroides, en dosificaciones conocidas para dichos farmacos o dosificaciones reducidas. Sin embargo, preferentemente, el paciente se trata solamente con un anticuerpo o anticuerpos. Los anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion al paciente con RA de acuerdo con un programa de dosificacion que se describe a continuacion, que puede determinarse facilmente por un experto en la materia. La respuesta primaria se determina por el mdice de Paulus (Paulus y col. Athritis Rheum. 33:477-484 (1990)), es decir, mejora de la rigidez matutina, numero de articulaciones dolorosas e inflamadas, sedimentacion eritrocitaria (ESR), y al menos una mejora de 2 puntos en una escala de 5 puntos de gravedad de enfermedad evaluada por el paciente y por el medico. La administracion de un anticuerpo o anticuerpos que se describen en el presente documento aliviara uno o mas de los smtomas de RA en el paciente tratado como se ha descrito anteriormente.
En un aspecto preferido espedfico, las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico o pronostico de lupus y/o de afecciones medicas asociadas con el mismo. Las afecciones asociadas con lupus que pueden tratarse, prevenirse, mejorarse, pronosticarse y/o diagnosticarse con los anticuerpos y composiciones de anticuerpos que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, trastornos hematologicos (por ejemplo, anemia hemolftica, leucopenia, linfopenia y trombocitopenia), trastornos inmunologicos (por ejemplo, anticuerpos anti-ADN y anticuerpos anti-Sm), sarpullidos, fotosensibilidad, ulceras orales, artritis, fiebre, fatiga, perdida de peso, serositis (por ejemplo, pleuritis (pleuresfa) ) , trastornos renales (por ejemplo, nefritis), trastornos neurologicos (por ejemplo, ataques, neuropatfa periferica, trastornos relacionados con el SNC), trastornos gastrointestinales, fenomeno de Raynaud y pericarditis. En un aspecto preferido, las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico o pronostico de trastornos renales asociados con lupus eritematoso sistemico. En un aspecto mas preferido, las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico o pronostico de la nefritis asociada con lupus eritematoso sistemico. En otro aspecto mas preferido, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion a un animal para tratar, prevenir o mejorar el lupus o la nefritis glomerular.
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En un aspecto especftico adicional, los anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, inhibicion, pronostico, diagnostico o prevencion de la anemia hemolftica. Por ejemplo, los pacientes diagnosticados con anemia hemolftica autoinmune (AIHA), por ejemplo, crioglobulinemia o anemia positiva a Coombs, se tratan con un anticuerpo o anticuerpos que se describen en el presente documento. La AIHa es una anemia hemolftica adquirida debida a autoanticuerpos que reaccionan con los globulos rojos del paciente. El paciente tratado preferentemente no tendra un tumor maligno de linfocitos B. Pueden combinarse terapias adyuvantes adicionales (tales como glucocorticoides, prednisona, azatioprina, ciclofosfamida, plaquetas cargadas con alcaloides de la vinca o Danazol) con la terapia de anticuerpos, pero preferentemente el paciente se trata con un anticuerpo o anticuerpos que se describen en el presente documento como agente unico durante todo el transcurso de la terapia. Los anticuerpos son para usarse en la administracion al paciente con anemia hemolftica de acuerdo con un programa de dosificacion que se describe a continuacion, que puede determinarse facilmente por un experto en la materia. El mdice de respuesta global se determina basandose en una mejora en los recuentos sangurneos, una disminucion de la necesidad de transfusiones, una mejora en los niveles de hemoglobina y/o una disminucion en las pruebas de hemolisis, segun se determina por parametros qmmicos convencionales. La administracion de un anticuerpo o anticuerpos que se describen en el presente documento mejorara uno o mas de cualquiera de los smtomas de anemia hemolftica en el paciente tratado como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, el paciente tratado como se ha descrito anteriormente mostrara un aumento en la hemoglobina y una mejora en los parametros qmmicos de hemolisis, o la vuelta a la normalidad segun se mide por la bilirrubina y/o la deshidrogenasa lactica en suero.
En otro aspecto preferido espedfico, las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico o pronostico del smdrome de Sjogren y/o de afecciones medicas asociadas con el mismo.
En otro aspecto preferido espedfico, las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico o pronostico de la infeccion por VIH y/o de afecciones medicas asociadas con la misma (por ejemplo, SIDA).
En otro aspecto preferido espedfico, las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico o pronostico de la miastenia grave y/o de afecciones medicas asociadas con la misma.
En otro aspecto preferido espedfico, las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico o pronostico de la nefropatfa por IgA y/o de afecciones medicas asociadas con la misma.
En otro aspecto preferido espedfico, las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico o pronostico de la anemia hemolftica y/o de afecciones medicas asociadas con la misma.
En otro aspecto preferido espedfico, las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico o pronostico de la tiroiditis y/o de afecciones medicas asociadas con la misma.
En otro aspecto preferido espedfico, las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico o pronostico del smdrome de Goodpasture y/o de afecciones medicas asociadas con el mismo.
En otro aspecto preferido espedfico, las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico o pronostico de la esclerosis multiple y/o de afecciones medicas asociadas con la misma.
En otro aspecto preferido espedfico, las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico o pronostico de la leucemia iinfocftica cronica (CLL) y/o de afecciones medicas asociadas con la misma.
En otro aspecto preferido espedfico, las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico o pronostico del mieloma multiple y/o de afecciones medicas asociadas con el mismo.
En otro aspecto preferido espedfico, las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico o pronostico del linfoma no Hodgkin y/o de afecciones medicas asociadas con el mismo.
En otro aspecto preferido espedfico, las composiciones terapeuticas y farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico o pronostico de la enfermedad de Hodgkin y/o de afecciones medicas asociadas con la misma.
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En otro aspecto espedfico, los anticuerpos que se describen en el presente documento se usan en el tratamiento, inhibicion, pronostico, diagnostico o prevencion de la purpura trombocitopenica inmune del adulto. La purpura trombocitopenica inmune (ITP) del adulto es un trastorno hematologico relativamente poco frecuente que constituye la mas comun de las citopenias inmunomediadas. La enfermedad se presenta tipicamente con una trombocitopenia grave que puede estar asociada con una hemorragia aguda en presencia de un nivel de megacariocitos de normal ha aumentado en la medula osea. La mayona de los pacientes con ITP tienen un anticuerpo IgG dirigido contra antigenos diana en la superficie externa de la membrana plaquetaria, dando como resultado un secuestro de las plaquetas en el bazo y una destruccion reticuloendotelial acelerada de las plaquetas (Bussell, J.B. Hematol. Oncol. Clin. North Am. (4): 179 (1990)). Varias intervenciones terapeuticas han demostrado ser eficaces en el tratamiento de la ITP. Los esteroides se consideran generalmente terapia de primera lmea, despues de la cual la mayona de los pacientes son candidatos para inmunoglobulina intravenosa (IVIG), esplenectoirna u otras terapias medicas incluyendo vincristina o agentes inmunosupresores/citotoxicos. Hasta 80% de los pacientes con iTp responden inicialmente a un ciclo de esteroides, pero muchos menos tienen remisiones completas y duraderas. La esplenectomfa se ha recomendado como terapia de segunda lmea convencional para el fracaso de los esteroides, y conduce a una remision prolongada en casi 60% de los casos, aunque puede dar como resultado una inmunidad reducida a infecciones. La esplenectomfa es un procedimiento quirurgico mayor que estar asociado con una morbilidad (15%) y mortalidad (2%) importantes. La IVIG tambien se ha usado como terapia medica de segunda lmea, aunque solo una pequena proporcion de los pacientes adultos con ITP consiguen una remision. Opciones terapeuticas que interfiriesen con la produccion de anticuerpos por linfocitos B activadas sin las morbilidades asociadas que aparecen con los corticosteroides y/o con la esplenectomfa proporcionanan una estrategia de tratamiento importante para una proporcion de pacientes con ITP. Los pacientes con diagnostico clmico de ITS se van a tratar con un anticuerpo o anticuerpos que se describen en el presente documento, opcionalmente en combinacion con terapia con esteroides. Los pacientes a tratar no tendran un tumor maligno de linfocitos B. Los anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion al paciente con RA de acuerdo con un programa de dosificacion que se describe a continuacion, que puede determinarse facilmente por un experto en la materia. El mdice de respuesta global del paciente se determina basandose en el recuento de plaquetas determinado en dos ocasiones consecutivas separadas por dos semanas despues de los tratamientos que se han descrito anteriormente. Vease George y col. "Idiopathic Thrombocytopenic Purpura: A Practice Guideline Developed by Explicit Methods for The American Society of Hematology", Blood 88:3-40 (1996).
En otro aspecto, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion a un animal, para tratar, prevenir o mejorar una reaccion alergica mediada por IgE o una reaccion alergica mediada por histamina. Los ejemplos de reacciones alergicas incluyen, pero sin limitacion, asma, rinitis, eccema, urticaria cronica y dermatitis atopica. En otro aspecto, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion a un animal para tratar, prevenir o mejorar la anafilaxia, la hipersensibilidad a una molecula antigenica o a la incompatibilidad de grupo sangumeo. En otro aspecto, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion a un animal para tratar, prevenir o mejorar o modular una inflamacion o un trastorno inflamatorio. Los ejemplos de trastornos inflamatorios agudos y cronicos que van a tratarse, prevenirse o mejorarse con las composiciones terapeuticas y farmaceuticas de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, prostatitis cronica, prostatitis granulomatosa y malacoplaquia, inflamacion asociada con infeccion (por ejemplo, choque septico, septicemia o smdrome de respuesta inflamatoria sistemica (SIRS)), lesion por isquemia-reperfusion, letalidad de endotoxinas, artritis, rechazo hiperagudo mediado por el complemento, nefritis, lesion pulmonar inducida por citocinas o quimiocinas, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedades pulmonares inflamatorias agudas y cronicas, infeccion bacteriana, psoriasis, septicemia, malaria cerebral, artritis, gastroenteritis y nefritis glomerular.
En otro aspecto, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion a un animal para tratar, prevenir o mejorar la isquemia y la arterioesclerosis. Los ejemplos de dichos trastornos incluyen, pero sin limitacion, los danos por reperfusion (por ejemplo, en el corazon y/o cerebro) e hipertrofia cardfaca.
Las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento tambien pueden ser para usarse en la administracion para modular la coagulacion sangumea y para tratar o prevenir trastornos de la coagulacion sangumea, tales como, por ejemplo, trombosis mediada por anticuerpos (es decir, smdrome de anticuerpos antifosfolfpidos (APS)). Por ejemplo, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en la inhibicion de la proliferacion y diferenciacion de celulas implicadas en la produccion de anticuerpos anti-cardiolipina. Estas composiciones pueden ser para usarse en el tratamiento, prevencion, mejona, diagnostico y/o pronostico de acontecimientos relacionados con trombosis incluyendo, pero sin limitacion, ictus (e ictus recurrente) , ataque cardfaco, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, infarto de miocardio, arteriopatfa coronaria (por ejemplo, arteriopatfa coronaria mediada por anticuerpos), trombosis, reoclusion de injerto despues de cirugfa cardiovascular (por ejemplo, injertos de derivacion arterial coronaria), perdida fetal recurrente y acontecimientos tromboembolicos cardiovasculares recurrentes.
Las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento tambien pueden ser para usarse en la administracion para tratar, prevenir o mejorar el rechazo de organos o la enfermedad de injerto contra huesped (GVHD) y/o afecciones asociadas con los mismos. El rechazo de organos se produce por la
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destruccion por celulas inmunes del hospedador del tejido trasplantado por medio de una respuesta inmune. De forma similar, tambien esta implicada una respuesta inmune en la GVHD pero, en este caso, las celulas inmunes trasplantadas extranas destruyen los tejidos del hospedador. La administracion de anticuerpos que se describen en el presente documento, que inhiben una respuesta inmune, puede ser una terapia eficaz en la prevencion del rechazo de organos o de la GVHD.
En otro aspecto, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno, o enfermedades asociadas con un aumento de la apoptosis incluyendo, pero sin limitacion, SIDA, trastornos neurodegenerativos (tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrofica, retinitis pigmentosa, degeneracion cerebelar), smdromes mielodisplasicos (tales como anemia aplasica), lesion isquemica (tal como la causada por infarto de miocardio, ictus y lesion por reperfusion), hepatopatfa inducida por toxinas (tal como la causada por alcohol), choque septico, caquexia y anorexia. En otro aspecto, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion a un animal para tratar, prevenir o mejorar una insuficiencia de la medula osea, por ejemplo, la anemia aplasica y el smdrome mielodisplasico.
En otro aspecto, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion a un animal para tratar, prevenir o mejorar el crecimiento, la progresion y/o las metastasis de tumores malignos y trastornos proliferativos asociados con una supervivencia celular aumentada o con la inhibicion de la apoptosis. Los ejemplos de dichos trastornos incluyen, pero sin limitacion, leucemia (por ejemplo, leucemia aguda tal como leucemia linfocftica aguda y leucemia mielocftica aguda), neoplasias, tumores (por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomisarcoma, carcinoma de colon, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de prostata, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de linfocitos Basales, adenocarcinoma, carcinoma de glandulas sudonparas, carcinoma de glandulas sebaceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma de conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cancer cervical, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar microcftico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y
retinoblastoma), enfermedad de las cadenas pesadas, metastasis o cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por un crecimiento celular descontrolado.
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento o la prevencion de un trastorno caracterizado por hipergammaglobulinemia (por ejemplo, SIDA, enfermedades autoinmunes y algunas inmunodeficiencias).
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento o la prevencion de un trastorno caracterizado por una produccion deficiente de inmunoglobulinas sericas, infecciones recurrentes y/o una disfuncion del sistema inmune. Ademas, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en el tratamiento o la prevencion de infecciones de las articulaciones, huesos, piel y/o glandulas parotfdeas, infecciones de la sangre (por ejemplo, septicemia, meningitis, artritis septica y/u osteomielitis), enfermedades autoinmunes (por ejemplo, las descritas en el presente documento), trastornos inflamatorios y tumores malignos, y/o cualquier enfermedad o trastorno o afeccion asociada con estas infecciones, enfermedades, trastornos y/o tumores malignos incluyendo, pero sin limitacion, CVID, otras inmunodeficiencias primarias, enfermedad por VIH, CLL, bronquitis recurrente, sinusitis, otitis media, conjuntivitis, neumoma, hepatitis, meningitis, herpes zoster (por ejemplo, herpes zoster grave) y/o Pneumocistis carnii.
Las composiciones terapeuticas o farmaceuticas pueden ser para usarse en el diagnostico, pronostico, tratamiento o prevencion de una o mas de las enfermedades o trastornos siguientes, o afecciones asociadas con los mismos: inmunodeficiencias primarias, trombocitopenia mediada por el sistema inmune, smdrome de Kawasaki, trasplante de medula osea (por ejemplo, trasplante de medula osea reciente en adultos o ninos), leucemia linfocftica cronica de linfocitos B, infeccion por VIH (por ejemplo, infeccion por VIH pediatrica o del adulto), poli neuropatfa desmielinizante inflamatoria cronica y purpura post-transfusion.
Ademas, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en el diagnostico, pronostico, tratamiento o prevencion de una o mas de las enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con los mismos siguientes, smdrome de Guillain-Barre, anemia (por ejemplo, anemia asociada con parvovirus BI 9, pacientes con mieloma multiple estable que presenten alto riesgo de infeccion (por ejemplo, infeccion recurrente), anemia hemolftica autoinmune (por ejemplo, anemia hemolftica autoinmune tipo caliente), trombocitopenia (por ejemplo, trombocitopenia neonatal) y neutropenia mediada por el sistema inmune, trasplante (por ejemplo, receptores negativos para citomegalovirus (CMV) de organos positivos para CMV), hipogammaglobulinemia (por ejemplo, neonatos hipogammaglobulinemicos con factores de riesgo para infeccion o morbilidad), epilepsia (por ejemplo, epilepsia intratable), smdromes vasculfticos sistemicos, miastenia grave (por
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ejemplo, descompensacion en la miastenia grave), dermatomiositis y polimiositis.
Los aspectos preferidos adicionales de la memoria descriptiva incluyen, pero sin limitacion, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento para su uso en las aplicaciones siguientes:
La administracion a un animal (por ejemplo, raton, rata, conejo, hamster, cobaya, cerdos, microcerdos, polios, camelidos, cabras, caballos, vacas, ovejas, perros, gatos, primates no humanos y seres humanos, mas preferentemente seres humanos) para reforzar el sistema inmune para producir cantidades aumentadas de uno o mas anticuerpos (por ejemplo, IgG, IgA, IgM e IgE), para inducir una produccion de anticuerpos de mayor afinidad (por ejemplo, IgG, IgA, IgM e IgE) y/o para aumentar una respuesta inmune. En un aspecto especifico no excluyente, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento van a administrarse para reforzar el sistema inmune para producir cantidades aumentadas de IgG. En otro aspecto especifico no excluyente, los anticuerpos que se describen en el presente documento van a administrarse para reforzar el sistema inmune para producir cantidades aumentadas de IgA. En otro aspecto especifico no excluyente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se administran para reforzar el sistema inmune para producir cantidades aumentadas de IgM.
La administracion a un animal (incluyendo, pero sin limitacion, los enumerados anteriormente, e incluyendo tambien animales transgenicos) incapaz de producir moleculas de anticuerpo endogenas funcionales o que tiene un sistema inmune endogeno comprometido de otro modo, pero que es capaz de producir moleculas de inmunoglobulina humanas por medio de un sistema inmune de otro animal reconstituido o parcialmente reconstituido (veanse, por ejemplo, las Memorias descriptivas PCT publicadas N.° W098/24893, WO/9634096, WO/9633735 y WO/9110741).
En un aspecto especifico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como adyuvante vacunal que aumente el grado de reaccion inmune contra un antfgeno especifico. En un aspecto especifico, la vacuna es un anticuerpo descrito en el presente documento. En otro aspecto especifico, el adyuvante vacunal es un polinucleotido descrito en el presente documento (por ejemplo, un adyuvante vacunal genetico de polinucleotido de anticuerpo). Como se analiza en el presente documento, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en la administracion usando procedimientos conocidos en la tecnica, incluyendo, pero sin limitacion, la administracion liposomal, la administracion por vectores recombinantes, la inyeccion de ADN desnudo y la administracion con pistola de genes.
En un aspecto especifico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como adyuvante para potenciar las respuestas inmunes espedficas de tumor.
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como adyuvante para potenciar las respuestas inmunes antivirales. Las respuestas inmunes antivirales que pueden potenciarse usando las composiciones de la presente invencion como adyuvante incluyen, pero sin limitacion, virus y enfermedades asociadas con virus o smtomas descritos en el presente documento o conocidos de otro modo en la tecnica. En aspectos espedficos, las composiciones que se describen en el presente documento son para usarse como adyuvante para potenciar una respuesta inmune contra un virus, enfermedad o smtoma seleccionado del grupo que consiste en: SIDA, meningitis, dengue, EBV y hepatitis (por ejemplo, hepatitis B). En otro aspecto espedfico, las composiciones que se describen en el presente documento son para usarse como adyuvante para potenciar una respuesta inmune contra un virus, enfermedad o smtoma seleccionado del grupo que consiste en: VIH/SIDA, virus respiratorio sincitial, dengue, Rotavirus, encefalitis japonesa B, influenza AyB, parainfluenza, sarampion, citomegalovirus, rabia, Junin, Chinkungunya, fiebre del Valle del Rift, herpes simple y fiebre amarilla. En otro aspecto espedfico, las composiciones que se describen en el presente documento son para usarse como adyuvante para potenciar una respuesta inmune contra el antfgeno gpl20 del VIH.
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como adyuvante para potenciar respuestas inmunes antibacterianas o antifungicas. Las respuestas inmunes antibacterianas o antifungicas que pueden potenciarse usando las composiciones que se describen en el presente documento como adyuvante incluyen bacterias u hongos y enfermedades o smtomas asociados con bacterias u hongos descritos en el presente documento o conocidos de otro modo en la tecnica. En un aspecto espedfico, las composiciones que se describen en el presente documento son para usarse como adyuvante para potenciar una respuesta inmune contra una bacteria u hongo, enfermedad o smtoma seleccionado del grupo que consiste en: tetanos, difteria, botulismo y meningitis tipo B. En otro aspecto espedfico, las composiciones que se describen en el presente documento son para usarse como adyuvante para potenciar una respuesta inmune contra una bacteria u hongo, enfermedad o smtoma seleccionado del grupo que consiste en: Vibrio cholerae, Mycobacterium leprae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, estreptococos del Grupo B, Shigella spp., Escherichia coli enterotoxigenica, E. coli enterohemorragica, Borrelia burgdorferi y Plasmodium (malaria).
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en la presente memoria son para usarse como adyuvante para potenciar respuestas inmunes antiparasitarias. Las respuestas inmunes antiparasitarias que pueden potenciarse usando las composiciones de la presente invencion como adyuvante
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incluyen parasitos y enfermedades o smtomas asociados con parasitos descritos en la presente memoria o conocidos de otro modo en la tecnica. En aspectos espedficos, las composiciones que se describen en la presente memoria son para usarse como adyuvante para potenciar una respuesta inmune contra un parasito. En otro aspecto espedfico, las composiciones que se describen en la presente memoria son para usarse como adyuvante para potenciar una respuesta inmune contra Plasmodium (malaria).
En un aspecto espedfico, las composiciones que se describen en la presente memoria pueden ser para usarse en la administracion a pacientes como adyuvantes vacunales. En un aspecto espedfico adicional, las composiciones pueden ser para usarse en la administracion como adyuvantes vacunales a pacientes que padecen una inmunodeficiencia. En un aspecto espedfico adicional, las composiciones que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en la administracion como adyuvantes vacunales a pacientes que padecen VIH.
En un aspecto espedfico, las composiciones que se describen en el presente documento pueden ser para usarse para aumentar o potenciar las respuestas de anticuerpos espedficos de antigeno contra vacunas convencionales y experimentales. En un aspecto espedfico, las composiciones que se describen en el presente documento pueden ser para usarse para potenciar la seroconversion en pacientes tratados con vacunas convencionales y experimentales. En otra realizacion espedfica, pueden usarse composiciones de la presente invencion para aumentar el repertorio de anticuerpos que reconocen epttopos unicos en respuesta a una vacunacion convencional y experimental.
En un aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpo y variantes, y anticuerpos anti-anticuerpo) aumentan o potencian las respuestas de anticuerpos espedficos de antigenos contra vacunas convencionales y experimentales por regulacion de la union de la forma soluble de BLyS a un receptor de BLyS (por ejemplo, BCMA y TACI). En otro aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpo y variantes, y anticuerpos anti- anticuerpo) aumentan o potencian las respuestas de anticuerpos espedficos de antfgenos contra vacunas convencionales y experimentales por regulacion de la union de la forma soluble de APRIL a un receptor de APRIL (por ejemplo, BCMA y TACI).
En un aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpos y variantes, y anticuerpos anti-anticuerpo) aumentan o potencian la seroconversion en pacientes tratados con vacunas convencionales y experimentales por regulacion de la union de la forma soluble de BLyS a receptor de BLyS (por ejemplo, BCMA y TACI). En otro aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpos y variantes, y anticuerpos anti-anticuerpo) aumentan o potencian la seroconversion en pacientes tratados con vacunas convencionales y experimentales por regulacion de la union de la forma soluble de APRIL a un receptor de APRIL (por ejemplo, BCMA y TACI).
En un aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpos y variantes, y anticuerpos anti-anticuerpo) aumentan o potencian el repertorio de anticuerpos que reconocen epttopos unicos en respuesta a una vacunacion convencional y experimental por regulacion de la union de la forma soluble de BLyS a un receptor de BLyS (por ejemplo, BCMA y TACI). En otro aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpo y variantes, y anticuerpos anti-anticuerpo) aumentan o potencian el repertorio de anticuerpos que reconocen epttopos unicos en respuesta a una vacunacion convencional y experimental por regulacion de la union de la forma soluble de APRIL a un receptor de APRIL (por ejemplo, BCMA y TACI).
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como estimulante de la sensibilidad de linfocitos B a patogenos.
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como agente que eleve el estado inmune de un individuo antes de que reciba terapias inmunosupresoras.
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como agente para inducir anticuerpos de mayor afinidad.
En un aspecto especifico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como agente para aumentar las concentraciones de inmunoglobulinas sericas.
En un aspecto especifico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como agente para acelerar la recuperacion de individuos inmunocomprometidos.
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como agente para reforzar la inmunosensibilidad entre poblaciones envejecidas.
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como potenciador del sistema inmune antes de, durante o despues de un trasplante de medula osea y/o de otros trasplantes (por ejemplo, trasplantes de organos alogenicos o xenogenicos). Con respecto
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al trasplante, las composiciones de la presente invencion pueden administrarse antes de, al mismo tiempo que y/o despues del trasplante. En un aspecto espedfico, las composiciones que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion despues del trasplante, antes del comienzo de la recuperacion de las poblaciones de celulas T. En otro aspecto espedfico, las composiciones que se describen en el presente documento son para usarse para administrarse en primer lugar despues del trasplante, despues del comienzo de la recuperacion de las poblaciones de celulas T, pero antes de la recuperacion completa de las poblaciones de linfocitos B.
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como agente para reforzar la inmunosensibilidad entre individuos inmunodeficientes para linfocitos B, tales como, por ejemplo, un individuo que se ha sometido a una esplenectoirna parcial o completa. Las inmunodeficiencias de linfocitos B que pueden mejorarse o tratarse por administracion de los anticuerpos y/o composiciones de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, inmunodeficiencia combinada grave (SCID) ligada a X, SCID-autosomica, deficiencia de adenosina desaminasa (deficiencia de ADA) agammaglobulinemia ligada a X (XLA), enfermedad de Bruton, agammaglobulinemia congenita, agammaglobulinemia infantil ligada a X, agammaglobulinemia adquirida, agammaglobulinemia de inicio en el adulto, agammaglobulinemia de inicio tardm, disgammaglobulinemia, hipogammaglobulinemia, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, hipogammaglobulinemia no especificada, agammaglobulinemia, inmunodeficiencia variable comun (CVID) (adquirida), smdrome de Wiskott-Aldrich (WAS), inmunodeficiencia ligada a X con dper-IgM, inmunodeficiencia no ligada a X con hiper- IgM, deficiencia selectiva de IgA, deficiencia de subclase IgG (con o sin deficiencia de IgA), deficiencia de anticuerpos con Ig normales o elevadas, inmunodeficiencia con timoma, deleciones de cadenas pesadas de Ig, deficiencia de cadena kappa, trastorno linfoproliferativo de linfocitos B (BLPD), inmunodeficiencia selectiva de IgM, agammaglobulinemia recesiva (tipo suizo), disgenesia reticular, neutropenia neonatal, leucopenia congenita grave, alinfoplasia-aplasia o displasia tfmica con inmunodeficiencia, ataxia-telangiectasia, enanismo de miembros cortos, smdrome linfoproliferativo ligado a X (XLP), smdrome de Nezelof-inmunodeficiencia combinada con Ig, deficiencia de purina nucleosido fosforilasa (PNP), deficiencia de MHC Clase II (Smdrome del Linfocito Desnudo) e inmunodeficiencia combinada grave.
En un aspecto especifico, los anticuerpos y/o composiciones que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion para tratar o mejorar una deficiencia selectiva de IgA.
En otro aspecto especifico, los anticuerpos y/o composiciones que se describen en el presente documento se administran para tratar o mejorar la ataxia-telangiectasia.
En otro aspecto especifico, los anticuerpos y/o composiciones que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion para tratar o mejorar la inmunodeficiencia variable comun.
En otro aspecto especifico, los anticuerpos y/o composiciones que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion para tratar o mejorar la agammaglobulinemia ligada a X.
En otro aspecto especifico, los anticuerpos y/o composiciones que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion para tratar o mejorar la inmunodeficiencia combinada grave (SCID).
En otro aspecto especifico, los anticuerpos y/o composiciones que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion para tratar o mejorar el smdrome de Wiskott-Aldrich.
En otro aspecto especifico, los anticuerpos y/o composiciones que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion para tratar o mejorar la deficiencia de Ig ligada a X con dper-IgM.
Como agente para reforzar la inmunosensibilidad entre individuos que tienen una perdida adquirida de funcion de linfocitos B. Las afecciones que dan como resultado una perdida adquirida de funcion de linfocitos B que pueden mejorarse o tratarse por administracion de anticuerpos y/o composiciones que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, la infeccion por VIH, SIDA, trasplante de medula osea y leucemia linfodtica cronica (CLL) de linfocitos B.
En un aspecto especifico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como agente para reforzar la inmunosensibilidad entre individuos que tienen una inmunodeficiencia temporal. Las afecciones que dan como resultado una inmunodeficiencia temporal que pueden mejorarse o tratarse por administracion de anticuerpos y/o composiciones que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, la recuperacion de infecciones virales (por ejemplo, influenza), afecciones asociadas con malnutricion, recuperacion de mononucleosis infecciosa o afecciones asociadas con estres, recuperacion de sarampion, recuperacion de una transfusion sangumea y recuperacion de una cirugfa.
En un aspecto especifico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como regulador de la presentacion de antfgenos por monocitos, celulas dendnticas, celulas T y/o linfocitos B. En un aspecto especifico, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos potencian la presentacion de antfgenos o antagonizan la presentacion de antfgenos in vitro o in vivo. Ademas, en aspectos relacionados, esta potenciacion o antagonizacion de la presentacion de antfgenos puede ser util en el tratamiento
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antitumoral o para modular el sistema immune.
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen em el presente documento son para usarse como mediador de respuestas inmunes de la mucosa. La expresion de BLyS en monocitos, la expresion de receptor de BLyS en linfocitos By el grado de reaccion de linfocitos B contra BLyS sugieren que puede estar implicado en el intercambio de senales entre linfocitos B y monocitos o su progenie diferenciada. Esta actividad es de muchas maneras analoga a la senalizacion de CD40-CD 154 entre linfocitos B y celulas T. Los anticuerpos y composiciones anti-BLyS que se describen en el presente documento pueden ser por lo tanto buenos reguladores de las respuestas inmunes independientes de celulas T contra patogenos ambientales. En particular, las poblaciones de linfocitos B no convencionales (CD5+), que estan asociadas con sitios de la mucosa y responsables de mucha de la inmunidad innata en seres humanos, pueden responder a anticuerpos o composiciones que se describen en el presente documento, potenciando o inhibiendo por lo tanto el estado inmune de un individuo.
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas de la presente invencion son para usarse como agente para dirigir el sistema inmune de un individuo hacia el desarrollo de una respuesta humoral (es decir, TH2), en vez de una respuesta celular THl.
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como medio para inducir la proliferacion de tumores y de este modo hacerlos mas susceptibles a agentes antineoplasicos. Por ejemplo, el mieloma multiple es una enfermedad que se divide lentamente y, por lo tanto, es resistente a practicamente todos los regfmenes antineoplasicos. Si se forzase a estas celulas a proliferar mas rapidamente, su perfil de susceptibilidad cambiaria probablemente.
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como protema de union espedfica de celulas monocfticas a la que pueden unirse activadores o inhibidores espedficos del crecimiento celular. El resultado sena centrar la actividad de dichos activadores o inhibidores sobre poblaciones de linfocitos B normales, enfermas o neoplasicas.
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como protema de union espedfica de linfocitos B a la que pueden unirse activadores o inhibidores espedficos del crecimiento celular. El resultado sena centrar la actividad de dichos activadores o inhibidores sobre poblaciones de linfocitos B normales, enfermas o neoplasicas.
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como medio de deteccion de celulas monocfticas en virtud de su especificidad. Esta aplicacion puede requerir el marcaje de la protema con biotina u otros agentes (por ejemplo, como se describe en el presente documento) para proporcionar un medio de deteccion.
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como medio de deteccion de celulas de linaje B en virtud de su especificidad. Esta aplicacion puede requerir el marcaje de la protema con biotina u otros agentes (por ejemplo, como se describe en el presente documento) para proporcionar un medio de deteccion.
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como estimulante de la produccion de linfocitos B en patologfas tales como el SIDA, el trastorno linfocftico cronico y/o la inmunodeficiencia variable comun.
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como parte de un dispositivo de seleccion de monocitos cuya funcion es aislar monocitos a partir de una mezcla heterogenea de tipos celulares. Los anticuerpos de la presente invencion podnan estar acoplados a un soporte solido con el que despues se uninan espedficamente los monocitos. Las celulas no unidas se eliminanan por lavado y las celulas unidas se eluinan posteriormente. Un uso no limitante de esta seleccion seria permitir la purga de celulas tumorales, por ejemplo, de medula osea o sangre periferica antes de un trasplante.
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como parte de un dispositivo de seleccion de linfocitos B cuya funcion es aislar linfocitos B a partir de una mezcla heterogenea de tipos celulares. Los anticuerpos de la presente invencion (que no inhiben la interaccion de BLyS/receptor de BLyS) que se unen a BLyS soluble podnan estar acoplados a un soporte solido con el que despues se uninan espedficamente las linfocitos B. Las celulas no unidas se eliminanan por lavado y las celulas unidas se eluinan posteriormente. Un uso no limitante de esta seleccion seria permitir la purga de celulas tumorales, por ejemplo, de medula osea o sangre periferica antes de un trasplante.
En un aspecto espedfico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como terapia para la generacion y/o regeneracion de tejidos linfoides despues de una cirugfa, traumatismo o defecto genetico.
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En un aspecto especifico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como terapia basada en genes para trastornos heredados geneticamente que dan como resultado una inmunoincompetencia tal como la observada entre pacientes con SCID.
En un aspecto especifico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como antfgeno para la generacion de anticuerpos para inhibir o potenciar respuestas mediadas por BLyS.
En un aspecto especifico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente
documento son para usarse como medio de activacion de monocitos/macrofagos para defenderse frente a
enfermedades parasitarias que afectan a los monocitos tales como Leishmania.
En un aspecto especifico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse como pretratamiento de muestras de medula osea antes de un trasplante. Dicho tratamiento aumentana la representacion de linfocitos B y por lo tanto acelerana la recuperacion.
En un aspecto especifico, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente
documento son para usarse como medio de regulacion de citocinas secretadas que se generan por BLyS y/o
receptor de BLyS.
Los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en la modulacion de las concentraciones de IgE in vitro o in vivo.
Ademas, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en el tratamiento, prevencion y/o diagnostico de reacciones alergicas mediadas por IgE. Dichas reacciones alergicas incluyen, pero sin limitacion, asma, rinitis y eccema.
En un aspecto especifico, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar una deficiencia selectiva de IgA.
En otro aspecto especifico, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en la presente memoria son para usarse en la administracion para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar la ataxia-telangiectasia.
En otro aspecto especifico, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar la inmunodeficiencia variable comun.
En otro aspecto especifico, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar la agammaglobulinemia ligada a X.
En otro aspecto especifico, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar la inmunodeficiencia combinada grave (SCID).
En otro aspecto especifico, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar el smdrome de Wiskott-Aldrich.
En otro aspecto especifico, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar la deficiencia de Ig ligada a X con hnper-IgM. En una realizacion espedfica, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos de la presente invencion se administran para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar la deficiencia de Ig ligada a X con hnper-IgM.
En otro aspecto especifico, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion para tratar, prevenir y/o diagnosticar la leucemia mielogena cronica, leucemia mielogena aguda, leucemia, leucemia histiodtica, leucemia monodtica (por ejemplo, leucemia monodtica aguda), reticulosis leucemica, leucemia monodtica Tipo Schilling y/o otras leucemias derivadas de monocitos y/o celulas y/o tejidos monodticos.
En otro aspecto especifico, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar la reaccion leucemoide monodtica como se observa, por ejemplo, con la tuberculosis.
En otro aspecto espedfico, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar la leucocitosis monoctica, leucopenia monoctica, monocitopenia y/o monocitosis.
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En un aspecto espedfico, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, deteccion y/o diagnostico de trastornos y/o enfermedades de monocitos, y/o afecciones asociadas con las mismas.
En un aspecto espedfico, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion, deteccion y/o diagnostico de trastornos y/o enfermedades de linfocitos B primarios, y/o afecciones asociadas con las mismas. En una realizacion, dichos trastornos, enfermedades y/o afecciones de linfocitos B primarios se caracterizan por una perdida completa o parcial de la inmunidad humoral. Los trastornos, enfermedades y/o afecciones de linfocitos B primarios asociadas con los mismos que se caracterizan por una perdida completa o parcial de la inmunidad humoral y que pueden prevenirse, tratarse, detectarse y/o diagnosticarse con composiciones que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, agammaglobulinemia ligada a X (XLA), enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave (SCID) y deficiencia selectiva de IgA.
En un aspecto preferido, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion y/o diagnostico de enfermedades o trastornos que afectan a o afecciones asociadas con una o mas de cualquiera de las diversas membranas mucosas del cuerpo. Dichas enfermedades o trastornos incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, mucositis, mucoclasia, mucocolitis, leishmaniosis mucocutanea (tal como, por ejemplo, leishmaniosis americana, leishmaniosis nasofarmgea y leishmaniosis del Nuevo Mundo), smdrome de ganglios linfaticos mucocutaneos (por ejemplo, enfermedad de Kawasaki), mucoenteritis, carcinoma mucoepidermoide, tumor mucoepidermoide, displasia mucoepitelial, adenocarcinoma mucoide, degeneracion mucoide, degeneracion mixoide; degeneracion mixomatosa; mixomatosis; degeneracion mucoide de la media (por ejemplo, necrosis qrnstica de la media), mucolipidosis (incluyendo, por ejemplo, mucolipidosis I, mucolipidosis II, mucolipidosis III y mucolipidosis IV), trastornos de la mucolisis, enteritis mucomembranosa, mucoenteritis, mucopolisacaridosis (tal como, por ejemplo, mucopolisacaridosis tipo I (es decir, smdrome de Hurler), mucopolisacaridosis tipo IS (es decir, smdrome de Scheie o mucopolisacaridosis tipo V) , mucopolisacaridosis tipo II (es decir, smdrome de Hunter), mucopolisacaridosis tipo III (es decir, smdrome de Sanfilippo), mucopolisacaridosis tipo IV (es decir, smdrome de Morquio), mucopolisacaridosis tipo VI (es decir, smdrome de Maroteaux-Lamy), mucopolisacaridosis tipo VII (es decir, mucopolisacaridosis debida a deficiencia de beta-glucuronidasa) y mucosulfatidosis), mucopolisacariduria, conjuntivitis mucopurulenta, mucopus, mucormicosis (es decir, zigomicosis), enfermedad de las mucosas (es decir, diarrea viral bovina), colitis mucosa (tal como, por ejemplo, mucocolitis y colitis mixomembranosa) y mucoviscidosis (tal como, por ejemplo, fibrosis qrnstica, fibrosis qrnstica del pancreas, smdrome de Clarke-Hadfield, enfermedad fibroquistica del pancreas, mucoviscidosis y viscidosis). En un aspecto altamente preferido, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en la presente memoria son para usarse en el tratamiento, prevencion y/o diagnostico de la mucositis, especialmente asociada con quimioterapia.
En un aspecto preferido, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion y/o diagnostico de enfermedades o trastornos que afectan a, o afecciones asociadas con sinusitis.
Una afeccion, enfermedad o smtoma adicional que puede tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse mediante polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en el presente documento es la osteomielitis.
Una afeccion, enfermedad o smtoma adicional que puede tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse mediante polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en el presente documento es la endocarditis.
Todas las aplicaciones descritas anteriormente pueden ser aplicables a medicina veterinaria.
Los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en la presente memoria pueden ser para usarse en el tratamiento, prevencion y/o diagnostico de enfermedades y trastornos del sistema pulmonar (por ejemplo, de los bronquios tales como, por ejemplo, infecciones bronquiales y sinopulmonares y afecciones asociadas con dichas enfermedades y trastornos y otras enfermedades y trastornos respiratorios. En aspectos espedficos, dichas enfermedades y trastornos incluyen, pero sin limitacion, adenoma bronquial, asma bronquial, neumoma (tal como, por ejemplo, neumoma bronquial, bronconeumoma y bronconeumoma tuberculosa), enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), polipos bronquiales, bronquiectasia (tal como, por ejemplo, bronquiectasia seca, bronquiectasia cilmdrica y bronquiectasia sacular), adenocarcinoma bronquiolar, carcinoma bronquiolar, bronquiolitis (tal como, por ejemplo, bronquiolitis exudativa, bronquiolitis fibrosa obliterante y bronquiolitis proliferativa), carcinoma bronquioloalveolar, asma bronqrntica, bronquitis (tal como, por ejemplo, bronquitis asmatica, bronquitis de Castellani, bronquitis cronica, bronquitis pseudomembranosa, bronquitis fibrinosa, bronquitis hemorragica, bronquitis aviar infecciosa, bronquitis obliterante, bronquitis plastica, bronquitis pseudomembranosa, bronquitis putrida y bronquitis verminosa), granulomatosis broncocentrica, broncoedema, fistula broncoesofagica, carcinoma broncogenico, quiste broncogenico, broncolitiasis, broncomalacia, broncomicosis (tal como, por ejemplo, aspergilosis broncopulmonar), espiroquetosis broncopulmonar, bronquitis hemorragica, broncorrea, broncoespasmo, broncostaxia, broncoestenosis, respiracion de Biot, respiracion bronquial, respiracion de Kussmaul, respiracion de Kussmaul-Klen, acidosis respiratoria, alcalosis respiratoria, smdrome de dificultad respiratoria neonatal, insuficiencia respiratoria, escleroma respiratorio, virus respiratorio sincitial y similares.
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En un aspecto espedfico, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion y/o diagnostico de la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC).
En otro aspecto, los polipeptidos o polinucleotidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevencion y/o diagnostico de fibrosis y afecciones asociadas con fibrosis, incluyendo, pero sin limitacion, fibrosis qrnstica (incluyendo fibrosis tales como fibrosis qrnstica del pancreas, smdrome de Clarke-Hadfield, enfermedad fibroqmstica del pancreas, mucoviscidosis y viscidosis), fibrosis endomiocardica, fibrosis retroperitoneal idiopatica, fibrosis leptomenmgea, fibrosis mediastinica, fibrosis subepidermica nodular, fibrosis pericentral, fibrosis perimuscular, fibrosis periportal, fibrosis de sustitucion, fibrosis subadventicia y fibrosis periportal de Symmers.
En otro aspecto, las composiciones terapeuticas o farmaceuticas que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion a un animal para tratar, prevenir o mejorar enfermedades infecciosas. Las enfermedades infecciosas incluyen enfermedades asociadas con levaduras, hongos, infecciones vmcas y bacterianas. Los virus causantes de infecciones vmcas que pueden tratarse o prevenirse de acuerdo con esta invencion incluyen, pero sin limitacion, retrovirus (por ejemplo, virus linfotrofico de celulas T humano (HTLV) tipos I y II y virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)), herpesvirus (por ejemplo, virus herpes simple (HSV) tipos I y II, virus Epstein-Barr, HHV6-HHV8 y citomegalovirus), arenavirus (por ejemplo, virus de la fiebre de Lassa), paramixovirus (por ejemplo, virus morbilivirus, virus respiratorio sincitial humano, paperas y pneumovirus), adenovirus, bunyavirus (por ejemplo, hantavirus), Coronavirus, filovirus (por ejemplo, virus del Ebola), flavivirus (por ejemplo, virus de la hepatitis C (HCV), virus de la fiebre amarilla y virus de la encefalitis japonesa), hepadnavirus (por ejemplo, virus de la hepatitis B (HBV)), ortomiovirus (por ejemplo, virus de la influenza A, B y C) , papovavirus (por ejemplo, papilomavirus) , picornavirus (por ejemplo, rinovirus, enterovirus y virus de la hepatitis A), poxvirus, reovirus (por ejemplo, rotavirus), togavirus (por ejemplo, virus de la rubeola), rabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia). Los patogenos microbianos causantes de infecciones bacterianas incluyen, pero sin limitacion, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrhoea, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, Klebsiella rhinoscleromotis, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Campylobacter jejuni, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugumushi, Chlamydia spp. y Helicobacter pylori.
Terapia Genica
En un aspecto espedfico, los acidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican anticuerpos o derivados funcionales de los mismos son para usarse en la administracion para tratar, inhibir o prevenir una enfermedad o trastorno asociado con una expresion y/o actividad aberrante de BLyS y/o su receptor, por medio de terapia genica. La terapia genica se refiere a la terapia realizada mediante la administracion a un sujeto de un acido nucleico expresado o que puede expresarse. En esta realizacion de la memoria descriptiva, los acidos nucleicos producen su protema codificada que media un efecto terapeutico.
Cualquiera de los procedimientos para terapia genica disponibles en la tecnica puede usarse de acuerdo con la presente memoria descriptiva. Los procedimientos ejemplares se describen a continuacion.
Para revisiones generales de los procedimientos de terapia genica vease Goldspiel y col., Clinical Pharmacy 12: 488-505 (1993); Wu y Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 (1993); Mulligan, Science 260: 926-932 (1993); y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); May, TIBTECH I 1(5): 155-215 (1993). Se describen procedimientos comunmente conocidos en la tecnica de la tecnologfa del ADN recombinante que pueden usarse en Ausubel y col. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).
En un aspecto preferido, una composicion de la memoria descriptiva comprende, o alternativamente consiste en acidos nucleicos que codifican un anticuerpo, siendo dichos acidos nucleicos parte de un vector de expresion que expresa el anticuerpo o fragmentos o protemas quimericas o cadenas pesadas o ligeras del mismo en un hospedador adecuado. En particular, dichos acidos nucleicos tienen promotores, preferentemente promotores heterologos, unidos operativamente a la region codificante de anticuerpo, siendo dicho promotor inducible o constitutivo y, opcionalmente, espedfico de tejido. En otro aspecto particular, se usan moleculas de acido nucleico en las que las secuencias codificantes de anticuerpo y cualquier otra secuencia deseada esta flanqueada por regiones que promueven la recombinacion homologa en un sitio deseado del genoma, proporcionando de este modo la expresion intracromosomica de los acidos nucleicos codificantes de anticuerpos (Koller y Smithies, Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 86: 8932- 8935 (1989); Zijlstra y col., Nature 342:435-438 (1989). En aspectos espedficos, la
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molecula de anticuerpo expresada es un scFv; alternativamente, las secuencias de acido nucleico incluyen secuencias que codifican las cadenas tanto pesada como ligera, o fragmentos o variantes de las mismas, de un anticuerpo.
La administracion de los acidos nucleicos a un paciente puede ser directa, en cuyo caso el paciente se expone directamente al acido nucleico o a vectores que llevan el acido nucleico, o indirecta, en cuyo caso las celulas se transforman primero con los acidos nucleicos in vitro, y despues se trasplantan en el paciente. Estas dos estrategias se conocen, respectivamente, como terapia genica in vivo o ex vivo.
En un aspecto espedfico, las secuencias de acido nucleico son para usarse en la administracion directamente in vivo, donde se expresan para producir el producto codificado. Esto puede lograrse por cualquiera de numerosos procedimientos conocidos en la tecnica, por ejemplo, construyendolos como parte de un vector de expresion de acido nucleico apropiado y administrandolos de modo que se hagan intracelulares, por ejemplo, por infeccion usando vectores retrovirales defectuosos o atenuados u otros vectores virales (vease la Patente de Estados Unidos N.° 4.980.286) o por inyeccion directa de ADN desnudo, o mediante el uso de bombardeo de micropartfculas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont), o revestimiento con lfpidos o receptores de superficie celular o agentes de transfeccion, encapsulacion en liposomas, micropartfculas o microcapsulas, o por administracion de los mismos en union a un peptido que se sabe que se introduce en el nucleo, por administracion de los mismos en union a un ligando sometido a endocitosis mediada por receptor (vease, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol, Chem. 262: 44294432 (1987)) (que puede usarse para dirigirse a tipos celulares que expresan espedficamente los receptores), etc. En otro aspecto, pueden formarse complejos de acido nucleico-ligando en los que el ligando comprende un peptido viral fusogenico para alterar los endosomas, permitiendo que el acido nucleico evite la degradacion lisosomal. En otro aspecto mas, el acido nucleico puede dirigirse in vivo para la captacion y expresion espedfica por celulas, por direccionamiento a un receptor espedfico (vease, por ejemplo, las Publicaciones PCT WO 92/06 180; WO 92/22635; W092/203 16; W093/14188, WO 93/20221). Alternativamente, el acido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la celula hospedadora para su expresion, por recombinacion homologa (Koller y Smithies, Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 86: 8932-8935 (1989); Zijlstra y col., Nature 342:435-438 (1989)).
En un aspecto espedfico, se van a usar vectores virales que contienen secuencias de acido nucleico que codifican un anticuerpo que se describe en el presente documento, o fragmentos o variantes del mismo. Por ejemplo, puede usarse un vector retroviral (vease Miller y col., Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993)). Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para el empaquetamiento correcto del genoma viral y la integracion en el ADN de la celula hospedadora. Las secuencias de acido nucleico que codifican el anticuerpo a usar en la terapia genica se clonan en uno o mas vectores que facilitan la administracion del gen a un paciente. Puede encontrarse mas detalles acerca de los vectores retrovirales en Boesen y col., Biotherapy 6: 29 1-302 (1994), que describe el uso de un vector retroviral para administrar el gen mdr 1 a celulas madre hematopoyeticas para hacer a las celulas madre mas resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en terapia genica son: Clowes y col., J. Clin. Invest. 93: 644-651 (1994); Klein y col., Blood 83: 1467-1473 (1994); Salmons y Gunzberg, Human Gene Therapy 4: 129-141 (1993); y Grossman y Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110- 114 (1993).
Los adenovirus son otros vectores virales que pueden usarse en la terapia genica. Los adenovirus son vehfculos especialmente atractivos para administrar genes a epitelios respiratorios. Los adenovirus infectan de forma natural los epitelios respiratorios, donde causan una enfermedad leve. Otras dianas para sistemas de administracion basados en adenovirus son el Idgado, el sistema nervioso central, las celulas endoteliales y el musculo. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar celulas que no esten en division. Kozarsky y Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503 (1993) presentan una revision de la terapia genica basada en adenovirus. Bout y col., Human Gene Therapy 5: 3-10 (1994) demostraron el uso de vectores de adenovirus para transferir genes a los epitelios respiratorios de monos Rhesus. Otros ejemplos del uso de adenovirus en terapia genica pueden encontrarse en Rosenfeld y col., Science 252: 431-434 (1991); Rosenfeld y col., Cell 68: 143-155 (1992); Mastrangeli y col., J. Clin. Invest. 91: 225-234 (1993); Publicacion PcT W094/12649; y Wang, y col., Gene Therapy 2: 775-783 (1995). Preferentemente, se usan vectores de adenovirus.
Tambien se han propuesto virus adenoasociados (AAV) para su uso en terapia genica (Walsh y col., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); Patente de Estados Unidos N.° 5.436.146).
Otra estrategia para terapia genica implica transferir un gen a celulas en un cultivo de tejido por procedimientos tales como electroporacion, lipofeccion, transfeccion mediada por fosfato calcico o infeccion vmca. Habitualmente, el procedimiento de transferencia incluye la transferencia de un marcador de seleccion a las celulas. Las celulas se ponen despues en seleccion para aislar aquellas celulas que hayan captado y esten expresando el gen transferido. Esas celulas se administran despues a un paciente.
En este aspecto, el acido nucleico se va a introducir en una celula antes de la administracion in vivo de la celula recombinante resultante. Dicha introduccion puede llevarse a cabo por cualquier procedimiento conocido en la tecnica incluyendo, pero sin limitacion, transfeccion, electroporacion, microinyeccion, infeccion con un vector viral o de bacteriofago que contiene las secuencias de acido nucleico, fusion celular, transferencia genica mediada por cromosomas, transferencia genica mediada por microcelulas, fusion de esferoplastos, etc. Se conocen en la tecnica
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numerosos procedimientos para la introduccion de genes extranos en celulas (vease, por ejemplo, Loeffler y Behr, Meth. Enzymol. 217: 599-618 (1993); Cohen y col., Meth. Enzymol. 217: 618-644 (1993); Clin. Pharma. Ther. 29: 6992m (1985)) y pueden usarse de acuerdo con la presente invencion, con tal de que no se alteren las funciones fisiologicas y de desarrollo necesarias de las celulas receptoras. La tecnica debena proporcionar la transferencia estable del acido nucleico a la celula, de modo que el acido nucleico pueda expresarse por la celula y, preferentemente, pueda heredarse y expresarse por su progenie celular.
Las celulas recombinantes resultantes pueden administrate a un paciente por diversos procedimientos conocidos en la tecnica. Las celulas sangumeas recombinantes (por ejemplo, celulas madre o progenitoras hematopoyeticas) se administran preferentemente por via intravenosa. La cantidad de celulas prevista para usar depende del efecto deseado, del estado del paciente, etc. y puede determinarse por un experto en la materia.
Las celulas en las que puede introducirse un acido nucleico con fines de terapia genica incluyen cualquier tipo celular disponible deseado e incluyen, pero sin limitacion, celulas epiteliales, celulas endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, celulas musculares, hepatocitos; celulas sangumeas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrofagos, neutrofilos, eosinofilos, megacariocitos, granulocitos; diversas celulas madre o progenitoras, en particular celulas madre o progenitoras hematopoyeticas, por ejemplo, como se obtienen de medula osea, sangre de cordon umbilical, sangre periferica, Idgado fetal, etc.
En un aspecto preferido, la celula a usar para terapia genica es autologa respecto al paciente.
En un aspecto en el que se van a usar celulas recombinantes en terapia genica, las secuencias de acido nucleico que codifican un anticuerpo o fragmento del mismo se introducen en las celulas de modo que puedan expresarse por las celulas o su progenie, y las celulas recombinantes se administran despues in vivo para su efecto terapeutico. En un aspecto espedfico, se van a usar celulas madre o progenitoras. Cualquier celula madre y/o progenitora que puede aislarse y mantenerse in vitro puede usarse potencialmente de acuerdo con este aspecto (vease, por ejemplo, la Publicacion PcT WO 94/08598; Stemple y Anderson, Cell 7 I: 973-985 (1992); Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A: 229 (1980); y Pittelkow y Scott, Mayo Clinic Proc. 61: 771 (1986)).
En un aspecto espedfico, el acido nucleico a introducir con fines de terapia genica comprende un promotor inducible unido operativamente a la region codificante, de modo que la expresion del acido nucleico puede controlarse por control de la presencia o ausencia del inductor de la transcripcion apropiado.
Demostracion de la Utilidad Terapeutica o Profilactica de una Composicion
Los compuestos que se describen en el presente documento se ensayan preferentemente in vitro y despues in vivo para la actividad terapeutica o profilactica deseada, antes de su uso en seres humanos. Por ejemplo, los ensayos in vitro que pueden usarse para determinar si esta indicada la administracion de un anticuerpo o composicion espedfica que se describe en el presente documento incluyen ensayos de cultivos celulares in vitro, en los que se cultiva una muestra de tejido de paciente en cultivo, y se expone a o se le administra de otro modo un anticuerpo o composicion que se describe en el presente documento, y se observa el efecto de dicho anticuerpo o composicion de la presente invencion sobre la muestra de tejido. En diversos aspectos espedficos, pueden llevarse a cabo ensayos in vitro con celulas representativas de tipos celulares implicados en un trastorno de un paciente para determinar si un anticuerpo o composicion que se describe en el presente documento tiene un efecto deseado sobre dichos tipos celulares. Preferentemente, los anticuerpos o composiciones que se describen en el presente documento tambien se ensayan en ensayos in vitro y sistemas de modelos animales antes de su administracion a seres humanos.
Los anticuerpos o composiciones que se describen en el presente documento para su uso en terapia pueden ensayarse para determinar su toxicidad en sistemas de modelos animales adecuados incluyendo, pero sin limitacion, ratas, ratones, polios, vacas, monos y conejos. Para el ensayo in vivo de la toxicidad de un anticuerpo o composicion puede usarse cualquier sistema de modelo animal conocido en la tecnica.
La eficacia en el tratamiento o prevencion de una infeccion vmca puede demostrarse detectando la capacidad de un anticuerpo o composicion que se describe en el presente documento para inhibir la replicacion del virus, para inhibir la transmision o evitar el establecimiento del propio virus en su hospedador, o para prevenir, mejorar o aliviar los smtomas de progresion de una enfermedad. El tratamiento se considera terapeutico si, por ejemplo, existe una reduccion en la carga viral, una mejona de uno o mas smtomas o una disminucion en la mortalidad y/o morbilidad despues de la administracion de un anticuerpo o composicion de la presente invencion.
Los anticuerpos o composiciones que se describen en el presente documento pueden ensayarse para determinar la capacidad para inducir la expresion de citocinas tales como IFN-y por contacto de celulas, preferentemente celulas humanas, con un anticuerpo o composicion de la presente invencion o un anticuerpo de control o composicion de control, y determinacion de la capacidad del anticuerpo o composicion de la presente invencion para inducir una o mas citocinas. Pueden usarse tecnicas conocidas por los expertos en la materia para medir el nivel de expresion de citocinas. Por ejemplo, el nivel de expresion de citocinas puede medirse analizando el nivel de ARN de citocinas, por ejemplo, mediante RT-PCR y analisis de transferencia Northern, y analizando el nivel de citocinas mediante, por ejemplo, inmunoprecipitacion seguida de analisis de transferencia de Western y ELISA. En un aspecto preferido, un
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compuesto que se describe en el presente documento se ensaya para determinar su capacidad para inducir la expresion de IFN-y.
Los anticuerpos o composiciones que se describen en el presente documento pueden ensayarse para determinar su capacidad para modular la actividad biologica de celulas inmunes por contacto de las celulas inmunes, preferentemente celulas inmunes humanas (por ejemplo, celulas T, linfocitos B y celulas asesinas naturales) con un anticuerpo o composicion que se describe en el presente documento o un compuesto de control, y determinacion de la capacidad del anticuerpo o composicion que se describe en el presente documento para modular (es decir, aumentar o disminuir) la actividad biologica de celulas inmunes. La capacidad de un anticuerpo o composicion que se describe en el presente documento para modular la actividad biologica de celulas inmunes puede evaluarse detectando la expresion de antigenos, detectando la proliferacion de celulas inmunes (es decir, la proliferacion de linfocitos B), detectando la activacion de moleculas de senalizacion, detectando la funcion efectora de celulas inmunes o detectando la diferenciacion de celulas inmunes. Pueden usarse tecnicas conocidas por los expertos en la materia para medir estas actividades. Por ejemplo, la proliferacion celular puede ensayarse mediante ensayos de incorporacion de 3H- timidina y recuentos de celulas con azul tripan. La expresion de antigeno puede ensayarse, por ejemplo, mediante inmunoensayos incluyendo, pero sin limitacion, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos usando tecnicas tales como transferencias de Western, radioinmunensayos inmunohistoquimicos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos tipo "sandwich", ensayos de inmunoprecipitacion, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina por difusion en gel, ensayos de inmunodifusion, ensayos de aglutinacion, ensayos de fijacion del complemento, ensayos inmunorradiometricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de protema A y analisis de FACS. La activacion de moleculas de senalizacion puede ensayarse, por ejemplo, mediante ensayos de quinasa y ensayos de desplazamiento electroforetico (EMSA). En un aspecto preferido, se mide la capacidad de un anticuerpo o composicion que se describe en el presente documento para inducir la proliferacion de linfocitos B. En otro aspecto preferido, se mide la capacidad de un anticuerpo o composicion que se describe en el presente documento para modular la expresion de inmunoglobulina.
Los anticuerpos o composiciones que se describen en el presente documento pueden ensayarse para determinar su capacidad para reducir la formacion de tumores en ensayos in vitro, ex vivo e in vivo. Los anticuerpos o composiciones que se describen en la presente memoria tambien pueden ensayarse para determinar su capacidad para inhibir la replicacion viral o reducir la carga viral en ensayos in vitro e in vivo. Los anticuerpos o composiciones que se describen en la presente memoria tambien pueden ensayarse para determinar su capacidad para reducir la cantidad de bacterias en ensayos in vitro e in vivo conocidos por los expertos en la materia. Los anticuerpos o composiciones que se describen en la presente memoria tambien pueden ensayarse para determinar su capacidad para aliviar uno o mas smtomas asociados con cancer, un trastorno inmune (por ejemplo, una enfermedad inflamatoria), un trastorno neurologico o una enfermedad infecciosa. Los anticuerpos o composiciones que se describen en el presente documento tambien pueden ensayarse para determinar su capacidad para disminuir el curso temporal de la enfermedad infecciosa. Ademas, los anticuerpos o composiciones que se describen en el presente documento pueden ensayarse para determinar su capacidad para aumentar el penodo de supervivencia de animales que padecen una enfermedad o trastorno, incluyendo cancer, un trastorno inmune o una enfermedad infecciosa. Pueden usarse tecnicas conocidas por los expertos en la materia para analizar la funcion de los anticuerpos o composiciones de la presente invencion in vivo.
Composiciones Terapeuticas/Profilacticas y Administracion
La memoria descriptiva describe una cantidad eficaz de anticuerpo (o fragmento o variante del mismo) o composicion farmaceutica que se describe en el presente documento, preferentemente un anticuerpo que se describe en el presente documento, para su uso en el tratamiento, inhibicion o profilaxis por administracion a un sujeto. En un aspecto preferido, un anticuerpo o fragmento o variante del mismo esta sustancialmente purificado (es decir, sustancialmente libre de sustancias que limiten su efecto o produzcan efectos secundarios no deseados). El sujeto es preferentemente un animal, incluyendo, pero sin limitacion, animales tales como vacas, cerdos, caballos, polios, gatos, perros, etc., y es preferentemente un mairnfero, y mas preferentemente un ser humano.
Las formulaciones y procedimientos de administracion que pueden emplearse cuando el compuesto comprende un acido nucleico o una inmunoglobulina se han descrito anteriormente; pueden seleccionarse formulaciones y vfas de administracion apropiadas adicionales de entre las descritas a continuacion en el presente documento.
Se conocen diversos sistemas de administracion y pueden usarse para administrar un anticuerpo o fragmento o variante del mismo que se describe en el presente documento, por ejemplo, encapsulacion en liposomas, micropartfculas, microcapsulas, celulas recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, endocitosis mediada por receptor (vease, por ejemplo Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)), construccion de un acido nucleico como parte de un vector retroviral o de otro tipo, etc. Los procedimientos de introduccion incluyen, pero sin limitacion, las vfas intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutanea, intranasal, epidural y oral. Las composiciones pueden administrarse por cualquier via conveniente, por ejemplo por infusion o inyeccion en embolada, por absorcion a traves de revestimientos epiteliales o mucocutaneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biologicamente activos. La administracion puede ser local o sistemica. Ademas, puede ser deseable introducir las
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composiciones farmaceuticas de la presente invencion en el sistema nervioso central por cualquier via adecuada, incluyendo la inyeccion interventricular e intratecal; la inyeccion interventricular puede facilitarse mediante un cateter interventricular, por ejemplo, unido a un deposito, tal como un deposito Ommaya. Tambien puede emplearse la administracion pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador y la formulacion con un agente aerosolizante.
En un aspecto especifico, puede ser deseable usar las composiciones farmaceuticas que se describen en el presente documento para su administracion local en el area que necesite tratamiento; esto puede conseguirse mediante, por ejemplo, y no a modo de limitacion, infusion local durante una cirugfa, aplicacion topica, por ejemplo, junto con un vendaje de heridas despues de una cirugfa, mediante inyeccion, por medio de un cateter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante, siendo dicho implante un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas de Silastic o fibras. Preferentemente, cuando se administra una protema, incluyendo un anticuerpo de la presente invencion, debe tenerse cuidado de usar materiales a los que no se absorba la protema.
En otro aspecto, la composicion puede administrarse en una vesmula, en particular un liposoma (vease Langer, Science 249: 1527- 1533 (1990); Treat y col., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez- Berestein y Fidler (eds-), Liss, Nueva York, pags. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibidem., pags. 317-327; vease en general ibid).
En otro aspecto mas, la composicion se va administrar en un sistema de liberacion controlada. En un aspecto, puede usarse una bomba (vease Langer, anteriormente; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 20 1 (1987); Buchwald y col., Surgery 88: 5O7 (1980); Saudek y col., N. Engl. J. Med. 321: 574 (1989)). En otro aspecto, pueden usarse materiales polimericos (vease Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), cRc Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, J., Macromol. Sei. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 (1983); vease tambien Levy et al., Science 228: 190 (1985); During y col., Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard y col., J. Neurosurg. 7 1: 105 (1989)). En otra realizacion mas, un sistema de liberacion controlada puede ponerse en las cercadas de la diana terapeutica, es decir, el cerebro, requiriendo de este modo solo una fraccion de la dosis sistemica (vease, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, anteriormente, vol. 2, pags. 115-138 (1984)).
Otros sistemas de liberacion controlada se analizan en la revision por Langer (Science 249: 1527-1533 (1990)).
En un aspecto espedfico en el que la composicion que se describe en el presente documento es un acido nucleico que codifica una protema, el acido nucleico puede ser para usarse en la administracion in vivo para promover la expresion de su protema codificada, por construccion del mismo como parte de un vector de expresion de acido nucleico apropiado y administracion del mismo de modo que se haga intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral (vease la Patente de Estados Unidos N.° 4.980.286) o mediante inyeccion directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartmulas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont) o revestimiento con lfpidos o receptores de superficie celular o agentes de transfeccion, o por administracion del mismo en union a un peptido tipo caja homeotica (homeobox) que se sabe que se introduce en el nucleo (vease, por ejemplo, Joliot y col., Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 88: 1864-1868 (1991)), etc. Alternativamente, un acido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la celula hospedadora para su expresion mediante recombinacion homologa.
La presente memoria descriptiva tambien describe composiciones farmaceuticas. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento del mismo, y un vedculo farmaceuticamente aceptable. En un aspecto espedfico, la expresion "farmaceuticamente aceptable" significa autorizada por una agencia reguladora del Gobierno Federal o estatal, o enumerada en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea reconocida en general para su uso en animales, y mas particularmente en seres humanos. El termino "vedculo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vedculo con el que se administra el producto terapeutico. Dichos vedculos farmaceuticos pueden ser lfquidos esteriles tales como agua y aceites, incluyendo los de origen de petroleo, animal, vegetal o sintetico, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y similares. El agua es un vedculo preferido cuando la composicion farmaceutica se administra por via intravenosa. Tambien pueden emplearse soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vedculos lfquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmaceuticos adecuados incluyen almidon, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sflice, estearato sodico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sodico, leche en polvo desnatada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composicion, si se desea, tambien puede contener cantidades minoritarias de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pfldoras, capsulas, polvos, formulaciones de liberacion sostenida y similares. La composicion puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y vedculos tradicionales tales como trigliceridos. La formulacion oral puede incluir vedculos convencionales tales como calidades farmaceuticas de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Se describen ejemplos de vedculos farmaceuticos adecuados en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Dichas composiciones contendran una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo o
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fragmento del mismo, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehnculo para proporcionar la forma de administracion apropiada al paciente. La formulacion debena adaptarse al modo de administracion.
En un aspecto preferido, la composicion se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composicion farmaceutica adaptada para su administracion intravenosa a seres humanos. Tfpicamente, las composiciones para administracion intravenosa son soluciones en tampon acuoso isotonico esteril. Cuando es necesario, la composicion tambien puede incluir un agente solubilizaste y un anestesico local tal como lignocama para paliar el dolor en el sitio de la inyeccion. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o mezclados juntos en forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, como un polvo seco liofilizado o un concentrado sin agua en un recipiente sellado hermeticamente, tal como una ampolla o sobrecito que indique la cantidad de agente activo. Cuando la composicion va a administrarse por infusion, puede dispensarse con un frasco de infusion que contiene solucion salina o agua de calidad farmaceutica esteril. Cuando la composicion se administra por inyeccion, puede proporcionarse una ampolla de agua esteril para inyeccion o solucion salina de modo que los ingredientes puedan mezclarse antes de su administracion.
Las composiciones que se describen en el presente documento pueden formularse como formas neutras o formas de sal. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las formadas con aniones tales como los derivados de los acidos clorhndrico, fosforico, acetico, oxalico, tartarico, etc. y las formadas con cationes tales como los derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidroxidos ferricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaina, etc.
La cantidad de la composicion que se describe en el presente documento que sera eficaz en el tratamiento, inhibicion y prevencion de una enfermedad o trastorno asociado con una expresion y/o actividad aberrante de un polipeptido de la presente invencion puede determinarse mediante tecnicas clmicas convencionales. Ademas, pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro para contribuir a identificar intervalos de dosificacion optimos. La dosis exacta a emplear en la formulacion tambien dependera de la via de administracion y de la gravedad de la enfermedad o trastorno, y debena decidirse de acuerdo con el juicio del medico y con las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de ensayo de modelos animales o in vitro.
Para anticuerpos, la dosificacion administrada a un paciente es tfpicamente de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. Preferentemente, la dosificacion administrada a un paciente es de entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg del peso corporal del paciente, mas preferentemente, de 1 mg/kg y 10 mg/kg del peso corporal del paciente. Generalmente, los anticuerpos humanos tienen una semivida mas prolongada dentro del cuerpo humano que los anticuerpos de otras especies debido a la respuesta inmune contra los polipeptidos extranos. Por lo tanto, con frecuencia son posibles menores dosificaciones de anticuerpos humanos y una administracion menos frecuente. Ademas, la dosificacion y la frecuencia de administracion de composiciones terapeuticas o farmaceuticas de la presente invencion pueden reducirse aumentando la captacion y penetracion tisular (por ejemplo, en el cerebro) de los anticuerpos mediante modificaciones tales como, por ejemplo, lipidacion.
Los anticuerpos y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en la administracion en solitario o en combinacion con otros adyuvantes. Los adyuvantes que pueden administrarse con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, alumbre, alumbre mas desoxicolato (InmunoAg), MTP-PE (Biocine Corp.), QS21 (Genentech, Inc.), BCG y MPL. En un aspecto especifico, los anticuerpos y composiciones de anticuerpos que se describen en el presente documento se administran en combinacion con alumbre. En otro aspecto especifico, los anticuerpos y composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion en combinacion con QS-21. Los adyuvantes adicionales que pueden ser para usarse en la administracion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, monofosforil lfpido inmunomodulador, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, sales de aluminio, MF-59 y tecnologfa adyuvante virosomal. Las vacunas que pueden ser para usarse en la administracion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, vacunas dirigidas hacia la proteccion frente a MMR (sarampion, paperas, rubeola), polio, varicela, tetanos/difteria, hepatitis A, hepatitis B, Haemophilus influenzae B, tos ferina, neumoma, influenza, Enfermedad de Lyme, rotavirus, colera, fiebre amarilla, encefalitis japonesa, poliomielitis, rabia, fiebre tifoidea y pertusis y/o PNEUMOVAX-23™. Las combinaciones pueden ser para usarse en la administracion de forma concomitante, por ejemplo, como una mezcla, por separado pero simultaneamente o de forma concurrente; o de forma secuencial. Esto incluye presentaciones en las que los agentes combinados se administran juntos como una mezcla terapeutica y tambien procedimientos en los que los agentes combinados se administran por separado pero simultaneamente, por ejemplo, a traves de vfas intravenosas separadas en el mismo individuo. La administracion "en combinacion" incluye ademas la administracion separada de uno de los compuestos o agentes administrado primero, seguida del segundo.
En otro aspecto especifico, los anticuerpos y las composiciones de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en combinacion con PNEUMOVAX-23™ para tratar, prevenir y/o diagnosticar una infeccion y/o cualquier enfermedad, trastorno y/o afeccion asociada con la misma. En un aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en combinacion con
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PNEUMOVAX-23™ para tratar, prevenir y/o diagnosticar cualquier infeccion bacteriana Gram positiva y/o cualquier enfermedad, trastorno y/o afeccion asociada con la misma. En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en combinacion con PNEUMOVAX-23™ para tratar, prevenir y/o diagnosticar una infeccion y/o cualquier enfermedad, trastorno y/o afeccion asociada con uno o mas miembros del genero Enterococcus y/o del genero Streptococcus. En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en cualquier combinacion con PNEUMOVAX- 23™ para tratar, prevenir y/o diagnosticar una infeccion y/o cualquier enfermedad, trastorno y/o afeccion asociada con uno o mas miembros de los estreptococos del Grupo B. En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en combinacion con PNEUMOVAX-23™ para tratar, prevenir y/o diagnosticar una infeccion y/o cualquier enfermedad, trastorno y/o afeccion asociada con Streptococcus pneumoniae.
El anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en la administracion en solitario o en combinacion con otros agentes terapeuticos incluyendo, pero sin limitacion, agentes quimioterapicos, antibioticos, antivirales, antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, agentes inmunoterapicos
convencionales y citocinas. Las combinaciones pueden ser para usarse en la administracion de forma concomitante, por ejemplo, como una mezcla, por separado pero simultaneamente o de forma concurrente; o de forma secuencial. Esto incluye presentaciones en las que los agentes combinados se administran juntos como un mezcla terapeutica y tambien procedimientos en los que los agentes combinados son para usarse en la administracion por separado pero simultaneamente, por ejemplo, a traves de vfas intravenosas separadas en el mismo individuo. La administracion "en combinacion" incluye ademas la administracion separada de uno de los compuestos o agentes administrados en primer lugar, seguida del segundo.
En un aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion en combinacion con otros miembros de la familia de TNF. Moleculas de TNF, relacionadas con TNF o de tipo TNF que pueden administrarse con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, formas solubles de TNF-alfa, linfotoxina-alfa (LT-alfa, tambien conocido como TNF-beta), LT-beta (que se encuentra en el heterotnmero complejo LT-alfa2-beta). OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-1BBL, DcR3, OX40L, TNF-gamma (Publicacion Internacional N.°WO 96/14328), TRAIL, AIM-II (Publicacion Internacional N.°WO 97/34911), APRIL (J. Exp. Med. 188(6): 1185-1190 (1998)), endoquina-alfa (Publicacion Internacional N.° WO 98/07880), Neutroquina- alfa (Publicacion de Memoria descriptiva Internacional N.° WO 98/18921), 0PG, 0X40 y factor de crecimiento nervioso (NGF) y formas solubles de Fas, CD30, CD27, CD40 y 4-IBB, TR2 (Publicacion Internacional N.° WO 96/34095), Dr3 (Publicacion Internacional N.° WO 97/33904), DR4 (Publicacion Internacional N.° WO 98/32856), TR5 (Publicacion Internacional N.° WO 98/30693), TR6 (Publicacion Internacional N.° WO 98/30694), TR7 (Publicacion Internacional N.° WO 98/41629), TRANK, TR9 (Publicacion Internacional N.° WO 98/56892), 312C2 (Publicacion Internacional N.° WO 98/06842) y TR12, y formas solubles de CD154, CD70 y CD153.
En un aspecto preferido, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo son para usarse en la administracion en combinacion con ligando de CD40 (CD40L), una forma soluble de CD40L (por ejemplo, AVREND™), fragmentos biologicamente activos, variantes o derivados de CD40L, anticuerpos anti-CD40L (por ejemplo, anticuerpos agonistas o antagonistas) y/o anticuerpos anti-CD40 (por ejemplo, anticuerpos agonistas o antagonistas).
En un aspecto adicional, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion en solitario o en combinacion con un agente o agentes antiangiogenicos. Los agentes antiangiogenicos que pueden administrarse con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, Angiostatina (Entremed, Rockville, mD), Troponina-I (Boston Life Sciences, Boston, MA) , anti-factor invasivo, acido retinoico y derivados del mismo, paclitaxel (Taxol), Suramina, Inhibidor Tisular de Metaloproteinasa-1, Inhibidor Tisular de Metaloproteinasa- 2, VEGl, lnhibidor del Activador de Plasminogeno-1, lnhibidor del Activador de Plasminogeno-2 y diversas formas de los metales de transicion mas ligeros de "grupo d".
Los metales de transicion mas ligeros de "grupo d" incluyen, por ejemplo, especies de vanadio, molibdeno, tungsteno, titanio, niobio y tantalo. Dichas especies de metales de transicion pueden formar complejos de metales de transicion. Dichos complejos de las especies de metales de transicion mencionadas anteriormente incluyen complejos oxo de metales de transicion.
Los ejemplos representativos de complejos de vanadio incluyen complejos de oxo vanadio tales como complejos de vanadato y vanadilo. Los complejos de vanadato adecuados incluyen complejos de metavanadato y ortovanadato tales como, por ejemplo, metavanadato de amonio, metavanadato sodico y ortovanadato sodico. Los complejos de vanadilo adecuados incluyen, por ejemplo, acetilacetonato de vanadilo y sulfato de vanadilo, incluyendo hidratos de sulfato de vanadilo tales como sulfato de vanadilo mono- y trihidrato.
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tungstato adecuados incluyen tungstato de amonio, tungstato de calcio, tungstato de sodio dihidrato y acido tungstico. Los oxidos de tungsteno adecuados incluyen oxido de tungsteno (IV) y oxido de tungsteno (Vl). Los complejos de oxo molibdeno adecuados incluyen molibdato, oxido de molibdeno y complejos de molibdenilo. Los complejos de molibdato adecuados incluyen molibdato de amonio y sus hidratos, molibdato sodico y sus hidratos y molibdato de potasio y sus hidratos. Los oxidos de molibdeno adecuados incluyen oxido de molibdeno (VI), oxido de molibdeno (VI) y acido molfodico. Los complejos de molibdenilo adecuados incluyen, por ejemplo, acetilacetonato de molibdenilo. Otros complejos de tungsteno y molibdeno adecuados incluyen derivados hidroxo derivados de, por ejemplo, glicerol, acido tartarico y azucares.
Una amplia diversidad de otros factores antiangiogenicos pueden utilizarse tambien dentro del contexto de la presente memoria descriptiva. Los ejemplos representativos incluyen, pero sin limitacion, factor plaquetario 4; sulfato de protamina; derivados de quitina sulfatada (preparada a partir de caparazones de cangrejo de las nieves), (Murata y col., Cancer Res. 51: 22-26,1991); Complejo de Polisacarido Sulfatado-Peptidoglicano (SP-PG) (la funcion de este compuesto puede potenciarse en presencia de esteroides tales como estrogeno y citrato de tamoxifeno); estaurosporina; moduladores del metabolismo de la matriz, incluyendo, por ejemplo, analogos de prolina, cishidroxiprolina, d, L-3,4-deshidroprolina, Tiaprolina, alfa,alfa-dipiridilo, fumarato de aminopropionitrilo; 4-propil-5-(4- piridinil)- 2(3H)-oxazolona; Metotrexato; Mitoxantrona; Heparina; Interferones; 2 Macroglobulina-serica; ChlMP-3 (Pavloff y col., J. Bio. Chem. 267: 17321-17326, 1992); Quimostatina (Tomkinson y col., Biochem J. 286: 475480,1992); TetradecasuIfato de Ciclodextrina; Eponemicina; Camptotecina; Fumagilina (Ingber y col., Nature 348: 555-557, 1990); Tiomalato Sodico de Oro ("GST"; Matsubara y Ziff, J. Clin. Invest. 79: 1440-1446, 1987); anticolagenasa-serica; alfa2-antiplasmina (Holmes y col., J. Biol. Chem. 262 (4): 1659-1664, 1987); Bisantreno (National Cancer Institute); Lobenzarit disodico (acido N-(2)-carboxifenil-4- cloroantromIico disodico o "CCA"; (Takeuchi y col., Agents Actions 36: 312-316,1992); e inhibidores de la metaloproteinasa tales como BB94.
Los factores antiangiogenicos adicionales que tambien pueden utilizarse dentro del contexto de la presente invencion incluyen Talidomida (Celgene, Warren, NJ); esteroide angiostatico; AGM-1470 (H. Brem y J. Folkman J Pediatr. Surg. 28: 445-51 (1993)); un antagonista de integrina alfa v beta 3 (C. Storgard y col., J Clin. Invest. 103: 4754 (1999)); carboxinaminoimidazol; Carboxiamidotriazol (CAI) (National Cancer Institute, Bethesda, MD); Conbretastatina A-4 (CA4P) (OXiGENE, Boston, MA); Escualamina (Magainin Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA); TNP-470, (Tap Pharmaceuticals, Deerfield, IL); ZD-OlOl AstraZeneca (Londres, UK); APRA (CT2584); Benefina, Birostatina-I (SC339555); CGP-41251 (PKC 412); CM101; Dexrazoxano (ICRFl87); DMXAA; Endostatina; Flavopridiol; Genesteina; GTE; ImmTher; Iressa (ZD1839); Octreotida (Somatostatina); Panretina; Penacilamina; Photopoint; PI- 88; Prinomastat (AG-3340) Purlytin; Suradista (FCE26644); Tamoxifeno (Nolvadex); Tazaroteno; Tetratiomolibdato; Xeloda (Capecitabina); y 5- Fluorouracilo.
Los agentes antiangiogenicos que pueden ser para usarse en la administracion en combinacion con los compuestos que se describen en el presente documento pueden funcionar a traves de una diversidad de mecanismos incluyendo, pero sin limitacion, inhibiendo la proteolisis de la matriz extracelular, bloqueando la funcion de moleculas de adhesion de celulas endoteliales a la matriz extracelular, antagonizando la funcion de los inductores de la angiogenesis, tales como factores de crecimiento, e inhibiendo los receptores de integrina expresados en celulas endoteliales en proliferacion. Los ejemplos de inhibidores antiangiogenicos que interfieren con la proteolisis de la matriz extracelular y que pueden ser para usarse en la administracion en combinacion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, AG- 3340 (Agouron, La Jolla, CA), BAY-12-9566 (Bayer, West Haven , CT), BMS- 275291 (Bristol Myers Squibb, Princeton, NJ) , CGS-27032A (Novartis, East Hanover, NJ) , Marimastat (British Biotech, Oxford, Reino Unido) y Metastat (Aeterna, St-Foy, Quebec). Los ejemplos de inhibidores antiangiogenicos que actuan bloqueando la funcion de las moleculas de adhesion de celulas endoteliales a la matriz extracelular y que pueden ser para usarse en la administracion en combinacion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, EMD-121974 (Merck KcgaA Darmstadt, Alemania) y Vitaxina (Ixsys, La Jolla, CA/Medimmune, Gaithersburg, MD). Los ejemplos de agentes antiangiogenicos que actuan antagonizando o inhibiendo directamente los inductores de la angiogenesis y que pueden ser para usarse en la administracion en combinacion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, Angiozyme (Ribozyme, Boulder, GO), anticuerpo anti-VEGF (Genentech, S. San Francisco, CA), PTK-787/ZK-225846 (Novartis, Basel, Suiza), SU-IOl (Sugen, S. San Francisco, CA), SU-5416 (Sugen/Pharmacia Upjohn, Bridgewater, NJ) y SU-6668 (Sugen). Otros agentes antiangiogenicos actuan inhibiendo directamente la angiogenesis. Los ejemplos de inhibidores directos de la angiogenesis que pueden ser para usarse en la administracion en combinacion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, IM-862 (Cytran, Kirkland, WA), Interferon-alfa, IL-12 (Roche, Nutley, NJ) y polisulfato de pentosan (Georgetown University, Washington, DC).
En aspectos particulares, el uso de un anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento en combinacion con agentes antiangiogenicos se contempla para el tratamiento, prevencion y/o mejona de una enfermedad autoinmune, tal como, por ejemplo, una enfermedad autoinmune descrita en el presente documento.
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mejona de la artritis. En un aspecto mas particular, el uso del anticuerpo y de las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento en combinacion con agentes antiangiogenicos se contempla para el tratamiento, prevencion y/o mejona de la artritis reumatoide.
En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion en combinacion con un anticoagulante. Los anticoagulantes que pueden ser para usarse en la administracion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en la presente memoria incluyen, pero sin limitacion, heparina, warfarina y aspirina. En un aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion en combinacion con heparina y/o warfarina. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion en combinacion con warfarina. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion en combinacion con warfarina y aspirina. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en la presente memoria son para usarse en la administracion en combinacion con heparina. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion en combinacion con heparina y aspirina.
En otra realizacion, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion en combinacion con un agente que suprima la produccion de anticuerpos anti- cardiolipina. En aspectos espedficos, los polinucleotidos que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion en combinacion con un agente que bloquee y/o reduzca la capacidad de anticuerpos anti-cardiolipina para unirse a la protema plasmatica de union a fosfolfpidos beta 2-glicoprotema I (b2GPI).
En ciertos aspectos, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en la administracion en combinacion con agentes antirretrovirales, inhibidores nucleosfdicos de la transcriptasa inversa, inhibidores no nucleosfdicos de la transcriptasa inversa y/o inhibidores de proteasa. Los inhibidores nucleosfdicos de la transcriptasa inversa que pueden ser para usarse en la administracion en combinacion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, RETROVIR™ (zidowdina/AZT/), VIDEX™ (didanosina/ddl), HIVID™ (zalcitabina/ddC), ZERIT™ (stawdina/d4T), EPI- VIR™ (lamivudina/3TC) y cOmBIVIR™ (zidovudina/lamivudina). Los inhibidores no nucleosfdicos de la transcriptasa inversa que pueden ser para usarse en la administracion en combinacion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, VIRAMUNE™ (nevirapina), RESCRIPTOR™ (delavirdina) y SUSTIVA™ (efavirenz). Los inhibidores de proteasas que pueden ser para usarse en la administracion en combinacion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, CRIXIVAN™ (indinavir), NORVIR™ (ritonavir), INVIRASE™ (saquinavir) y VIRACEPT™ (nelfinavir). En un aspecto espedfico, los agentes antirretrovirales, inhibidores nucleosfdicos de la transcriptasa inversa, inhibidores no nucleosfdicos de la transcriptasa inversa y/o inhibidores de proteasa pueden ser para usarse en cualquier combinacion con un anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento para tratar, prevenir y/o diagnosticar el SIDA y/o para tratar, prevenir y/o diagnosticar una infeccion por VIH.
En otros aspectos, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en la administracion en combinacion con agentes anti-infecciones oportunistas. Los agentes anti-oportunistas que pueden ser para usarse en la administracion en combinacion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE™, DAPSONE™, PENTAMIDINE™, ATOVAQUONE™, ISONIAZID™, RIFAMPIN™, PYRAZINAMIDE™, ETHAMBUTOL™, RIFABUTIN™, CLARITHROMYCIN™, AZITHROMYCIN™, GANCICLOVIR™, FOSCARNET™, CIDOFOVIR™, FLUCONAZOLE™, ITRACONAZOLE™, KETOCONAZOLE™, ACYCLOVIR™, FAMCICOLVIR™, PYRIMETHAMINE™, LEUCOVORIN™, NEUPOGEN™ (filgrastim/G-CSF) y LEUKINE™ (sargramostim/GM-CSF). En un aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se usan en cualquier combinacion con TRIMETHOPRIM- SULFAMETHOXAZOLE™, DAPSONE™, PENTAMIDINE™ y/o ATOVAQUONE™ para tratar profilacticamente, prevenir y/o diagnosticar una infeccion de neumoma oportunista por Pneumocystis carinii. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en cualquier combinacion con ISONIAZID™, RIFAMPIN™, PYRAZINAMIDE™ y/o ETHAMBUTOL™ para tratar profilacticamente, prevenir y/o diagnosticar una infeccion oportunista por complejo de Mycobacterium avium. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en cualquier combinacion con RIFABUTIN™, CLARITHROMYCIN™ y/o AZITHROMYCIN™ para tratar profilacticamente, prevenir y/o diagnosticar una infeccion oportunista por Mycobacterium tuberculosis. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en cualquier combinacion con GANCICLOVIR™, FOSCARNET™ y/o CIDOFOVIR™ para tratar profilacticamente, prevenir y/o diagnosticar una infeccion oportunista por citomegalovirus. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en cualquier combinacion con FLUCONAZOLE™, ITRACONAZOLE™ y/o KETOCONAZOLE™ para tratar profilacticamente, prevenir y/o diagnosticar una infeccion fungica oportunista. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento
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son para usarse en cualquier combinacion con ACYCLOVIR™ y/o FAMCICOLVIR™ para tratar profilacticamente, prevenir y/o diagnosticar una infeccion oportunista por virus herpes simple tipo I y/o tipo II. En otro aspecto espedfico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en la presente memoria son para usarse en cualquier combinacion con PYRIMETHAMINE™ y/o LEUCOVORIN™ para tratar profilacticamente, prevenir y/o diagnosticar una infeccion oportunista por Toxoplasma gondii. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en cualquier combinacion con LEUCOVORIN™ y/o NEUPOGEN™ para tratar profilacticamente, prevenir y/o diagnosticar una infeccion bacteriana oportunista.
En un aspecto adicional, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con un agente antiviral. Los agentes antivirales que pueden
administrarse con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento
incluyen, pero sin limitacion, aciclovir, ribavirina, amantadina y remantidina.
En un aspecto adicional, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con un agente antibiotico. Los agentes antibioticos que pueden
administrarse con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento
incluyen, pero sin limitacion, amoxicilina, aminoglucosidos, beta- lactamicos (glucopeptidos), beta-lactamasas, clindamicina, cloranfenicol, cefalosporinas, ciprofloxacina, ciprofloxacina, eritromicina, fluoroquinolonas, macrolidos, metronidazol, penicilinas, quinolonas, rifampina, estreptomicina, sulfonamida, tetraciclinas, trimetoprim, trimetoprim- sulfamtoxazol y vancomicina.
Los agentes inmunosupresores inespedficos convencionales que pueden administrarse en combinacion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, esteroides, ciclosporina, analogos de ciclosporina, ciclofosfamida, ciclofosfamida IV, metilprednisolona, prednisolona, azatioprina, FK-506, 15-desoxiespergualina y otros agentes inmunosupresores que actuan suprimiendo la funcion de celulas T respondedoras.
En aspectos espedficos, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con inmunosupresores. Las preparaciones de inmunosupresores que pueden administrarse con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, ORTHOCLONE™ (0KT3), SANDIMMUNE™/NEORAL™/SANGDYA™ (ciclosporina), PROGRAF™ (tacrolimus), CELLCEPT™ (micofenolato), azatioprina, glucorticosteroides y RAPAMUNE™ (sirolimus). En un aspecto especifico, los inmunosupresores pueden ser para usarse en la prevencion del rechazo de organos o trasplante de medula osea.
En un aspecto preferido, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con terapia de esteroides. Los esteroides que pueden ser para usarse en la administracion en combinacion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, corticosteroides orales, prednisona y metilprednisolona (por ejemplo, metilprednisolona IV). En un aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con prednisona. En un aspecto especifico adicional, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con prednisona y un agente inmunosupresor. Los agentes inmunosupresores que pueden ser para usarse en la administracion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento y prednisona son los descritos en el presente documento e incluyen, pero sin limitacion, azatioprina, ciclofosfamida y ciclofosfamida IV. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se administran en combinacion con metilprednisolona. En un aspecto especifico adicional, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con metilprednisolona y un agente inmunosupresor. Los agentes inmunosupresores que pueden ser para usarse en la administracion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento y metilprednisolona son los descritos en el presente documento e incluyen, pero sin limitacion, azatioprina, cilofosfamida y ciclofosfamida IV.
En un aspecto preferido, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con un antimalarico. Los antimalaricos que pueden ser para usarse en la administracion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, hidroxicloroquina, cloroquina y/o quinacrina.
En un aspecto preferido, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con un AINE.
En un aspecto no excluyente, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con uno, dos, tres, cuatro, cinco, diez o mas de los farmacos siguientes: NRD-101 (Hoechst Marion Roussel), diclofenaco (Dimethaid), oxaprozina potasica (Monsanto) , mecasermina (Chiron), T-614 (Toyama), pemetrexed disodico (Eli Lilly), atreleuton (Abbott), valdecoxib (Monsanto), eltenaco (Byk Gulden), campath, AGM-l470 (Takeda), CDP-571 (Celltech Chiroscience), CM-IOl (CarboMed), ML-
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3000 (Merckle), CB-2431 (KS Biomedix), CBF-BS2 (KS Biomedix), terapia genica con IL-IRa (Valentis), JTE-522 (Japan Tobacco), paclitaxel (Angiotech), DW-166HC (Dong Wha), mesilato de darbufelona (Warner-Lambert), receptor de TNF soluble I (synergen; Amgen), IPR-6001 (Institute for Pharmaceutical Research), trocade (Hoffman- La Roche), EF-5 (Scotia Pharmaceuticals), BIIL-284 (BoehringerIngelheim), BIIF-1149 (Boe-hringer Ingelheim), LeukoVax (Inflammatics), MK-663 (Merck), ST-1482 (Sigma-Tau) y propionato de butixocort (WarnerLambert).
En un aspecto preferido, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas de los farmacos siguientes: metotrexato, sulfasalazina, aurotiomalato sodico, auranofina, ciclosporina, penicilamina, azatioprina, un farmaco antimalarico (por ejemplo, que se describe en el presente documento), ciclofosfamida, clorambucilo, oro, ENBREL™ (Etanercept), anticuerpo anti-TNF, LJP 394 (La Jolla Pharmaceutical Company, San Diego, California) y prednisolona.
En un aspecto mas preferido, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en la presente memoria se van a administrar en combinacion con un antimalarico, metotrexato, anticuerpo anti-TNF, ENBREL™ y/o sulfasalazina. En un aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en la presente memoria se van a administrar en combinacion con metotrexato. En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en la presente memoria se van a administrar en combinacion con un anticuerpo anti- TNF. En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en la presente memoria se van a administrar en combinacion con metotrexato y anticuerpo anti-TNF. En otro aspecto, el anticuerpo y las
composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con
suitasalazina. En otro aspecto espedfico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con metotrexato, anticuerpo anti-TNF y sulfasalazina. En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con ENBREL™. En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con ENBREL™ y metotrexato. En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con ENBREL™, metotrexato y sulfasalazina. En otro aspecto, el anticuerpo y las
composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con
ENBREL™, metotrexato y sulfasalazina. En otro aspecto, uno o mas antimalaricos se combinan con una de las combinaciones enumeradas anteriormente. En un aspecto espedfico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con un antimalarico (por ejemplo, hidroxicloroquina), ENBREL™, metotrexato y sulfasalazina. En otro aspecto espedfico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con un antimalarico (por ejemplo, hidroxicloroquina), sulfasalazina, anticuerpo anti-TNF y metotrexato.
En un aspecto adicional, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en solitario o en combinacion con una o mas preparaciones de inmunoglobulina intravenosa. Las preparaciones de inmunoglobulina intravenosa que pueden ser para usarse en la administracion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, GAMMAR™, IVEEGAM™, SANDOGLOBULIN™, GAMMAGARD S/ID™ y GAMIMUNE™. En un aspecto espedfico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con preparaciones de inmunoglobulina intravenosa en una terapia de trasplante (por ejemplo, trasplante de medula osea).
El ligando de CD40 (CD40L), una forma soluble de CD40L (por ejemplo, AVREND™), o fragmentos biologicamente activos, variantes o derivados de CD40L, anticuerpos anti-CD40L (por ejemplo, anticuerpos agonistas o antagonistas) y/o anticuerpos anti-CD40 (por ejemplo, anticuerpos agonistas o antagonistas).
En un aspecto adicional, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en solitario o en combinacion con un agente antiinflamatorio. Los agentes antiinflamatorios que pueden administrarse con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, glucocorticoides y los antiinflamatorios no esteroideos, derivados del acido aminoarilcarboxilico, derivados del acido arilacetico, derivados del acido arilbutirico, acidos arilcarboxflicos, derivados del acido arilpropionico, pirazoles, pirazolonas, derivados del acido salidlico, tiazinocarboxamidas, acido e-acetamidocaproico, S-adenosilmetionina, acido 3-amino-4-hidroxibutmco, amixetrina, bendazaco, bencidamina, bucolome, difenpiramida, ditazol, emorfazona, guaiazuleno, nabumetona, nimesulida, orgoteina, oxaceprol, paranilina, perisoxal, pifoxime, proquazona, proxazol y tenidap.
En otro aspecto, las composiciones que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con un agente quimioterapeutico. Los agentes quimioterapicos que pueden ser para usarse en la administracion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, derivados de antibioticos (por ejemplo, doxorubicina, bleomicina, daunorubicina y dactinomicina); antiestrogenos (por ejemplo, tamoxifeno); antimetabolitos (por ejemplo, fluorouracilo, 5- FU, metotrexato, floxuridina, interferon alfa-2b, acido glutamico, plicamicina, mercaptopurina y 6-tioguanina); agentes citotoxicos (por ejemplo, carmustina, BCNU, lomustina, CCNU, arabinosido de citosina, ciclofosfamida, estramustina, hidroxiurea, procarbazina, mitomicina, busulfan, cisplatino y sulfato de vincristina); hormonas (por ejemplo,
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medroxiprogesterona, fosfato sodico de estramustina, etinil estradiol, estradiol, acetato de megestrol, metiltestosterona, difosfato de dietilestilbestrol, clorotrianiseno y testolactona); derivados de mostaza nitrogenada (por ejemplo, mefaleno, clorambucilo, mecloretamina (mostaza nitrogenada) y tiotepa); esteroides y combinaciones (por ejemplo, fosfato sodico de betametasona) ; y otros (por ejemplo, dicarbazina, asparaginasa, mitotano, sulfato de vincristina, sulfato de vinblastina y etoposido).
En un aspecto espedfico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisona) o cualquier combinacion de los componentes de CHOP. En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con rituximab. En un aspecto adicional, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar con rituximab y CHOP, o rituximab y cualquier combinacion de los componentes de CHOP.
En un aspecto adicional, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con citocinas. Las citocinas que pueden ser para usarse en la administracion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, GM-CSF, G-CSF, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL10, IL12, IL13, IL15, anti-CD40, CD40L, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, TNF- alfa y TNF-beta. En aspectos preferidos, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar con BLyS (por ejemplo, los aminoacidos 134-285 de la SEQ ID NO: 3228). En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en la administracion con cualquier interleucina incluyendo, pero sin limitacion, IL-lalfa, IL-lbeta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL- 18, IL-19, IL-20, IL-21 e IL-22. En aspectos preferidos, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con IL4 e ILlO.
En un aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con una o mas quimiocinas. En aspectos espedficos, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con una quimiocina a (CxC) seleccionada del grupo que consiste en protema inducible de interferon gamma 10 (yiP-10), interleucina 8 (IL-8), factor plaquetario 4 (PF4), protema activadora de neutrofilos (NAP-2), GRO-OC, GRO-U, ©EOY, peptido activador de neutrofilos (ENA-78), protema quimioatrayente de granulocitos 2 (GCP-2) y factor derivado de celulas estromales 1 (SDF-1, o factor estimulador de celulas pre-B (PBSF)); y/o una
quimiocina U(CC) seleccionada del grupo que consiste en: RANTES (expresado y secretado por linfocitos T normales y regulado por activacion), protema inflamatoria de macrofagos 1 alfa (MIP-Ia), protema inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP-lU) , protema quimiotactica de monocitos I (MCP-I), protema quimiotactica de monocitos 2 (MCP-2), protema quimiotactica de monocitos 3 (MCP-3), protema quimiotactica de monocitos 4 (MCP-4) protema inflamatoria de macrofagos I gamma (MIP-1y) , protema inflamatoria de macrofagos 3 alfa (MIP-3a) , protema inflamatoria de macrofagos 3 beta (M1P-3p), protema inflamatoria de macrofagos 4 (MIP-4/DC-CK-1/PARC), eotaxina, Exodus y 1-309; y/o la quimiocina J(C) Iinfotactina.
En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar con quimiocina beta 8, quimiocina beta 1 y/o protema inflamatoria de macrofagos 4. En un aspecto preferido, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar con quimiocina beta 8.
En un aspecto adicional, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con un antagonista de IL-4. Los antagonistas de IL-4 que pueden ser para usarse en la administracion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion: polipeptidos de receptor de IL-4 soluble, formas multimericas de polipeptidos de receptor de IL-4 soluble; anticuerpos anti-receptor de IL-4 que se unen al receptor de IL-4 sin transducir la senal biologica generada por IL-4, anticuerpos anti-IL4 que bloquean la union de IL-4 a uno o mas receptores de IL-4 y mutemas de IL-4 que se unen a receptores de IL-4 pero no transducen la senal biologica generada por IL-4. Preferentemente, los anticuerpos empleados de acuerdo con este procedimiento son anticuerpos monoclonales (incluyendo fragmentos de anticuerpo tales como, por ejemplo, los descritos en el presente documento).
La memoria descriptiva tambien describe combinar los polinucleotidos y/o polipeptidos que se describen en el presente documento (y/o agonistas o antagonistas de los mismos) con otras terapias hematopoyeticas propuestas o convencionales. Por lo tanto, por ejemplo, los polinucleotidos y/o polipeptidos que se describen en el presente documento (y/o agonistas o antagonistas de los mismos) pueden combinarse con compuestos que muestran por separado efectos estimulantes eritropoyeticos, tales como eritropoyetina, testosterona, estimuladores de celulas progenitoras, factor de crecimiento tipo insulina, prostaglandinas, serotonina, AMP dclico, prolactina y triyodotizonina. Tambien se describen combinaciones del anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento con compuestos que generalmente se van a usar para tratar la anemia aplasica, tales como, por ejemplo, metenoleno, estanozolol y nandrolona; para tratar la anemia por deficiencia de
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hierro tales como, por ejemplo, preparaciones de hierro; para tratar la anemia maligna, tales como, por ejemplo, vitamina B12 y/o acido folico; y para tratar la anemia hemolftica, tales como, por ejemplo, esteroides adrenocorticales, por ejemplo, corticoides. Veanse, por ejemplo, Resegotti y col., Panminerva Medica, 23: 243-248 (1981); Kurtz, FEBS Letters, 14a: 105-108 (1982); McGonigle y col., Kidney Int., 25: 437-444 (1984); y Pavlovic-Kantera, Expt. Hematol., 8 (sup. 8) 283-291 (1980).
Los compuestos que potencian los efectos de o muestran sinergia con la eritropoyetina tambien son utiles como adyuvantes en el presente documento e incluyen, pero sin limitacion, agonistas adrenergicos, hormonas tiroideas, androgenos, factores eritropoyeticos hepaticos, eritrotropinas y eritrogeninas, veanse, por ejemplo, Dunn, "Current Concepts in Erythropoiesis", John Wiley and Sons (Chichester, England, 1983); Kalmani, Kidney Int., 22: 383-391 (1982); Shahidi, New Eng. J. Med., 289: 72-80 (1973); Urabe y col., J. Exp. Med., 149: 1314- 1325 (1979); Billat y col., Expt. Hematol., 10: 133-140 (1982); Naughton y col., Acta Haemat, 69: 171-179 (1983); Cognote y col. en el resumen 364, Proceedings 7th Inti. Cong, of Endocrinology (Quebec City, Quebec, 1-7 de julio de 1984); y Rothman y col., 1982, J. Surg. Oncol., 20: 105-108(1982). Los procedimientos para estimular la hematopoyesis comprenden administrar una cantidad hematopoyeticamente eficaz (es decir una cantidad que logre la formacion de celulas sangumeas) de una composicion farmaceutica que contiene polinucleotidos y/o polipeptidos que se describen en el presente documento (y/o agonistas o antagonistas de los mismos) a un paciente. Los polinucleotidos y/o polipeptidos que se describen en el presente documento y/o agonistas o antagonistas de los mismos se van a administrar al paciente por cualquier tecnica adecuada, incluyendo, pero sin limitacion, tecnicas parenteral, sublingual, topica, intrapulmonar e intranasal y aquellas tecnicas analizadas adicionalmente en el presente documento. La composicion farmaceutica contiene opcionalmente uno o mas miembros del grupo que consiste en eritropoyetina, testosterona, estimuladores de celulas progenitoras, factor de crecimiento tipo insulina, prostaglandinas, serotonina, AMP dclico, prolactina, triyodotizonina, metenoleno, estanozolol y nandrolona, preparaciones de hierro, vitamina B12, acido folico y/o esteroides adrenocorticales.
En aspecto adicional, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con factores de crecimiento hematopoyeticos. Los factores de crecimiento hematopoyeticos que pueden ser para usarse en la administracion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, LEUKINE™ (SARGRAMOS-TIM™) y NEUPOGEN™ (FILGRASTIM™).
En un aspecto adicional, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinacion con factores de crecimiento de fibroblastos. Los factores de crecimiento de fibroblastos que pueden ser para usarse en la administracion con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, FGF-I, FGF-2, FGF-3, FGF- 4, FGF-5, FGF- 6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-IO, FGF-II, FGF-12, FGF-13, FGF-14 y FGF- 15.
Ademas, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en la administracion en solitario o en combinacion con otros regfmenes terapeuticos, incluyendo, pero sin limitacion, terapia de radiacion. Dicha terapia combinatoria puede administrarse secuencialmente y/o de forma concomitante.
Kits
La memoria descriptiva tambien describe un paquete farmaceutico o kit que comprende uno o mas recipientes rellenos con uno o mas de los ingredientes de las composiciones farmaceuticas que se describen en el presente documento. Opcionalmente asociado con dicho recipiente o recipientes puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricacion, uso o venta de productos farmaceuticos o biologicos, reflejando dicho aviso la autorizacion por la agencia de fabricacion, uso o venta para su administracion a seres humanos.
La presente memoria descriptiva describe kits que pueden usarse en los procedimientos y usos anteriores. En un aspecto, un kit comprende un anticuerpo que se describe en el presente documento, preferentemente un anticuerpo purificado en uno o mas recipientes. En un aspecto alternativo, un kit comprende un fragmento de anticuerpo que se une inmunoespedficamente a BLyS. En un aspecto especifico, los kits que se describen en el presente documento contienen un polipeptido de BLyS sustancialmente aislado como control. Preferentemente, los kits que se describen en el presente documento comprenden ademas un anticuerpo de control que no reacciona con BLyS. En otro aspecto especifico, los kits que se describen en el presente documento contienen un medio para detectar la union de un anticuerpo a BLyS (por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con un sustrato detectable tal como un compuesto fluorescente, un sustrato enzimatico, un compuesto radiactivo o un compuesto luminiscente, o un segundo anticuerpo que reconoce el primer anticuerpo puede conjugarse con un sustrato detectable). En aspectos espedficos, el kit puede incluir un BLyS producido de forma recombinante o sintetizado qmmicamente. El BLyS proporcionado en el kit tambien puede estar unido a un soporte solido. En un aspecto mas especifico, el medio de deteccion del kit descrito anteriormente incluye un soporte solido al que esta unido BLyS. Dicho kit tambien puede incluir un anticuerpo anti-humano marcado con indicador no unido. En este aspecto, la union del anticuerpo a BLyS puede detectarse por union de dicho anticuerpo marcado con indicador.
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En un aspecto adicional, la memoria descriptiva describe un kit de diagnostico para su uso en la exploracion de suero que contiene antfgenos del polipeptido que se describe en el presente documento. El kit de diagnostico incluye un anticuerpo sustancialmente aislado espedficamente inmunorreactivo con BLyS y medios para detectar la union de BLyS al anticuerpo. En un aspecto, el anticuerpo se une a un soporte solido. En un aspecto espedfico, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. Los medios de deteccion del kit pueden incluir un segundo anticuerpo monoclonal marcado. Alternativamente, o ademas, los medios de deteccion pueden incluir un antigeno de competicion marcado.
En una configuracion de diagnostico, el suero de ensayo se hace reaccionar con un reactivo en fase solida que tiene un BLyS unido a superficie obtenido por los procedimientos de la presente invencion. Despues de que BLyS se una a un anticuerpo espedfico, los componentes del suero no unidos se eliminan por lavado, se anade anticuerpo anti- humano marcado con indicador, se elimina el anticuerpo anti-humano no unido por lavado y se hace reaccionar un reactivo con anticuerpo anti- humano marcado con indicador para unir el indicador al reactivo en proporcion a la cantidad de anticuerpo anti-BLyS unido en el soporte solido. Tfpicamente, el indicador es una enzima que se detecta por incubacion de la fase solida en presencia de un sustrato fluorometrico, luminiscente o colorimetrico adecuado.
El reactivo de superficie solida en el ensayo anterior se prepara por tecnicas conocidas para unir un material proteico a un material de soporte solido, tal como perlas polimericas, varillas, placas de 96 pocillos o material de filtro. Estos procedimientos de union incluyen generalmente la adsorcion inespedfica de la protema al soporte o la union covalente de la protema, tfpicamente a traves de un grupo amino libre, a un grupo qmmicamente reactivo en el soporte solido, tal como un grupo carboxilo, hidroxilo o aldeddo activado. Alternativamente, las placas revestidas con estreptavidina pueden usarse junto con un antigeno o antigenos biotinilados.
Por lo tanto, la memoria descriptiva describe un sistema de ensayo o kit para llevar a cabo este procedimiento de diagnostico. El kit generalmente incluye un soporte con BLyS recombinante unido a superficie y un anticuerpo anti- humano marcado con indicador para detectar el anticuerpo anti-BLyS unido a superficie.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un Fv de cadena sencilla (scFv) que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un Fv de cadena sencilla (scFv) que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 46, 321 a 329, 1563 a 1595 y 1881 a 1908.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un Fv de cadena sencilla (scFv) que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1563 a 1880.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un Fv de cadena sencilla (scFv) que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1881 a 2128.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un Fv de cadena sencilla (scFv) que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: la 1562.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se unen inmunoespedficamente a BLyS.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 46, 321 a 329, 1563 a 1595 y1881 a 1908.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1881 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1563 a 1880, y en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a BLyS.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 46, 321 a 329, 1563 a 1595 y1881 a 1908.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que
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comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1881 a 2128, y en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a la forma unida de membrana de BLyS.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1563 a 1880, y en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a BLyS y que tambien comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a BLyS y, que tambien comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, y en la que dicho dominio VL y dicho dominio VH proceden del mismo scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: : 1 a 2128.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 2129 a 3227, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a BLyS.
En aspectos espedficos, el anticuerpo o fragmento del mismo que se describe en el presente documento es una molecula de inmunoglobulina completa.
En aspectos espedficos, el anticuerpo o fragmento del mismo que se describe en el presente documento es un fragmento Fab.
En aspectos espedficos, el anticuerpo o fragmento del mismo que se describe en el presente documento es un fragmento Fv.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe una protema quimerica que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo de la presente invencion unido covalentemente a un polipeptido heterologo.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe una composicion que comprende dos o mas tipos de anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, uniendose cada uno de dichos tipos inmunoespedficamente a BLyS, y comprendiendo cada uno de dichos tipos de anticuerpo o fragmento del mismo un dominio VH de un scFv diferente que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe una composicion que comprende dos o mas tipos de anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, uniendose cada uno de dichos tipos inmunoespedficamente a BLyS y comprendiendo cada uno de dichos tipos de anticuerpo o fragmento del mismo un dominio Vl de un scFv diferente que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe una composicion que comprende dos o mas tipos de anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, uniendose cada uno de dichos tipos inmunoespedficamente a BLyS y comprendiendo cada uno de dichos tipos de anticuerpo o fragmento del mismo un dominio Vl de un scFv diferente que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, y en la que cada tipo de anticuerpo o fragmento del mismo comprende ademas un dominio VH de un scFv diferente que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID No: 1 a 2128.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe una composicion que comprende dos o mas tipos de anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, uniendose cada uno de dichos tipos inmunoespedficamente a BLyS y comprendiendo cada uno de dichos tipos de anticuerpo o fragmento del mismo una CDR3 de VH que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 3129 a 3227.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un panel de dos o mas tipos de anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, uniendose cada uno de dichos tipos inmunoespedficamente a BLyS, y comprendiendo cada uno de dichos tipos de anticuerpo o fragmento del mismo un domino VH de un scFv diferente que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un panel de dos o mas tipos de anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, uniendose cada uno de dichos tipos inmunoespedficamente a BLyS, y comprendiendo cada uno de dichos tipos de anticuerpo o fragmento del mismo un domino VL de un scFv diferente que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128.
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En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un panel de dos o mas tipos de anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, uniendose cada uno de dichos tipos inmunoespedficamente a BLyS, y comprendiendo cada uno de dichos tipos de anticuerpo o fragmento del mismo un domino VL de un scFv diferente que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, y en la que cada tipo de anticuerpo o fragmento comprende ademas un dominio VH de un scFv diferente que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un panel de dos o mas anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, uniendose cada uno de dichos tipos inmunoespedficamente a BLyS y comprendiendo cada uno de dichos tipos de anticuerpo o fragmento del mismo una CDR3 de VH de un scFv diferente que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 2129 a 3227.
En aspectos espedficos, los anticuerpos o fragmentos de los mismos del panel de anticuerpos que se describe en el presente documento estan cada uno en un pocillo de una placa de 96 pocillos.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a BLyS.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: la 46, 321 a 329, 1563 a 1595 y 1881 a 1908, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a BLyS.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1881 a 1908, en la que el anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1563 a 1569, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS. La presente memoria descriptiva tambien describe vectores que comprenden la molecula de acido nucleico aislada descrita anteriormente, incluyendo vectores que comprenden una secuencia de nucleotidos que regula la expresion del anticuerpo o fragmento del mismo codificado por la molecula de acido nucleico descrita anteriormente. Ademas, la presente memoria descriptiva tambien describe celulas hospedadoras, incluyendo celulas hospedadoras de mairnfero, que comprenden la molecula de acido nucleico descrita anteriormente que esta unida operativamente a un promotor heterologo, asf como celulas hospedadoras, incluyendo celulas hospedadoras de mamffero, que comprenden los vectores descritos anteriormente. Ademas, la presente memoria descriptiva tambien describe un procedimiento para producir un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende cultivar las celulas hospedadoras descritas anteriormente en condiciones en las que se exprese la molecula de acido nucleico.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a BLyS. La presente memoria descriptiva tambien describe vectores que comprenden la molecula de acido nucleico aislada descrita anteriormente, incluyendo vectores que comprenden una secuencia de nucleotidos que regula la expresion del anticuerpo o fragmento del mismo codificado por la molecula de acido nucleico descrita anteriormente. Ademas, la presente memoria descriptiva tambien describe celulas hospedadoras, incluyendo celulas hospedadoras de mamffero, que comprenden la molecula de acido nucleico descrita anteriormente que esta unida operativamente a un promotor heterologo, asf como celulas hospedadoras, incluyendo celulas hospedadoras de mamffero, que comprenden los vectores descritos anteriormente. Ademas, la presente memoria descriptiva tambien describe un procedimiento para producir un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende cultivar las celulas hospedadoras descritas anteriormente en condiciones en las que se exprese la molecula de acido nucleico.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 46, 321 a 329, 1563 a 1595 y 1881 a 1908, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a BLyS. La presente memoria descriptiva tambien describe vectores que comprenden la molecula de acido nucleico aislada descrita anteriormente, incluyendo vectores que comprenden una secuencia de nucleotidos que regula la expresion del anticuerpo o fragmento del mismo codificado por la molecula de acido nucleico descrita anteriormente. Ademas, la presente memoria descriptiva tambien describe celulas hospedadoras, incluyendo celulas hospedadoras de mamffero, que comprenden la molecula de acido nucleico descrita anteriormente que esta unida operativamente a
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un promotor heterologo, asf como celulas hospedadoras, incluyendo celulas hospedadoras de mai^ero, que comprenden los vectores descritos anteriormente. Ademas, la presente memoria descriptiva tambien describe un procedimiento para producir un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende cultivar las celulas hospedadoras descritas anteriormente en condiciones en las que se exprese la molecula de acido nucleico.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1881 a 2128, en la que el anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a la forma unida a membrana de BLyS. La presente memoria descriptiva tambien describe vectores que comprenden la molecula de acido nucleico aislada descrita anteriormente, incluyendo vectores que comprenden una secuencia de nucleotidos que regula la expresion del anticuerpo o fragmento del mismo codificado por la molecula de acido nucleico descrita anteriormente. Ademas, la presente memoria descriptiva tambien describe celulas hospedadoras, incluyendo celulas hospedadoras de mairnfero, que comprenden la molecula de acido nucleico descrita anteriormente que esta unida operativamente a un promotor heterologo, asf como celulas hospedadoras, incluyendo celulas hospedadoras de mamffero, que comprenden los vectores descritos anteriormente. Ademas, la presente memoria descriptiva tambien describe un procedimiento para producir un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende cultivar las celulas hospedadoras descritas anteriormente en condiciones en las que se exprese la molecula de acido nucleico.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1563 a 1880, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a la forma soluble de BLyS. La presente memoria descriptiva tambien describe vectores que comprenden la molecula de acido nucleico aislada descrita anteriormente, incluyendo vectores que comprenden una secuencia de nucleotidos que regule la expresion del anticuerpo o fragmento del mismo codificado por la molecula de acido nucleico descrita anteriormente. Ademas, la presente memoria descriptiva tambien describe celulas hospedadoras, incluyendo celulas hospedadoras de mamffero, que comprenden la molecula de acido nucleico descrita anteriormente, que esta unida operativamente a un promotor heterologo, asf como celulas hospedadoras, incluyendo celulas hospedadoras de mamffero, que comprenden los vectores descritos anteriormente. Ademas, la presente memoria descriptiva tambien describe un procedimiento para producir un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende cultivar las celulas hospedadoras descritas anteriormente en condiciones en las que se exprese la molecula de acido nucleico.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: : 1 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a BLyS, y que tambien comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128. La presente memoria descriptiva tambien describe vectores que comprenden la molecula de acido nucleico aislada descrita anteriormente, incluyendo vectores que comprenden una secuencia de nucleotidos que regule la expresion del anticuerpo o fragmento del mismo codificado por la molecula de acido nucleico descrita anteriormente. Ademas, la presente memoria descriptiva tambien describe celulas hospedadoras, incluyendo celulas hospedadoras de mai^ero, que comprenden la molecula de acido nucleico descrita anteriormente que esta unida operativamente a un promotor heterologo, asf como hospedadores incluyendo celulas hospedadoras de marnffero, que comprenden los vectores descritos anteriormente. Ademas, la presente memoria descriptiva tambien describe un procedimiento para producir un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende cultivar las celulas hospedadoras descritas anteriormente en condiciones en las que se exprese la molecula de acido nucleico.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe una molecula de acido nucleico aislada que comprende un secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: I a 212 8, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a BLyS, y que tambien comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128 y en la que dicho dominio VL y dicho dominio VH proceden del mismo scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128. La presente memoria descriptiva tambien describe vectores que comprenden la molecula de acido nucleico aislada descrita anteriormente, incluyendo vectores que comprenden una secuencia de nucleotidos que regula la expresion del anticuerpo o fragmento del mismo codificado por la molecula de acido nucleico descrita anteriormente. Ademas, la presente memoria descriptiva tambien describe celulas hospedadoras, incluyendo celulas hospedadoras de mamffero, que comprenden la molecula de acido nucleico descrita anteriormente que esta unida operativamente a un promotor heterologo, asf como celulas hospedadoras, incluyendo celulas hospedadoras de mamffero que comprenden los vectores descritos anteriormente. Ademas, la presente memoria descriptiva tambien describe un procedimiento para producir un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende cultivar las celulas hospedadoras descritas anteriormente en condiciones en las que se exprese la molecula de acido nucleico.
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CDR3 de VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 2129 a 3227, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a BLyS. La presente memoria descriptiva tambien describe vectores que comprenden la molecula de acido nucleico aislada descrita anteriormente, incluyendo vectores que comprenden una secuencia de nucleotidos que regula la expresion del anticuerpo o fragmento del mismo codificado por la molecula de acido nucleico descrita anteriormente. Ademas, la presente memoria descriptiva tambien describe celulas hospedadoras, incluyendo celulas hospedadoras de mairnfero, que comprenden la molecula de acido nucleico descrita anteriormente que esta unida operativamente a un promotor heterologo, asf como celulas hospedadoras, incluyendo celulas hospedadoras de mamffero, que comprenden los vectores descritos anteriormente. Ademas, la presente memoria descriptiva tambien describe un procedimiento para producir un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende cultivar las celulas hospedadoras descritas anteriormente en condiciones en las que se exprese la molecula de acido nucleico.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que se une inmunoespedficamente a BLyS, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento del mismo una secuencia de aminoacidos de un dominio VH codificado por una secuencia de nucleotidos que dbrida en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que se une inmunoespedficamente a BLyS, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento del mismo una secuencia de aminoacidos de un dominio VL codificado por una secuencia de nucleotidos que dbrida en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que se une inmunoespedficamente a BLyS, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento del mismo una secuencia de aminoacidos de un dominio VH codificado por una secuencia de nucleotidos que hfbrida en condiciones altamente rigurosas con una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que se une inmunoespedficamente a BLyS, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento del mismo una secuencia de aminoacidos de un dominio VL codificado por una secuencia de nucleotidos que hfbrida en condiciones altamente rigurosas con una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que se une inmunoespedficamente a BLyS, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento del mismo una secuencia de aminoacidos de una CDR codificada por una secuencia de nucleotidos que hfbrida en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleotidos que codifica una CDR de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que se une inmunoespedficamente a BLyS, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento del mismo una secuencia de aminoacidos de una CDR codificada por una secuencia de nucleotidos que hfbrida en condiciones altamente rigurosas con una secuencia de nucleotidos que codifica una CDR de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que se une inmunoespedficamente a BLyS, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento del mismo una secuencia de aminoacidos de una CDR3 de VH codificada por una secuencia de nucleotidos que hfbrida en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleotidos que codifica una CDR3 de VH que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 2129 a 3227.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que se une inmunoespedficamente a BLyS, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento del mismo una secuencia de aminoacidos de una CDR3 de VH codificada por una secuencia de nucleotidos que hfbrida en condiciones altamente rigurosas con una secuencia de nucleotidos que codifica una CDR3 de VH que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 2129 a 3227.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para la deteccion de una expresion aberrante de BLyS, que comprende:
ensayar el nivel de expresion de BLyS en celulas o una muestra tisular de un individuo usando uno o mas anticuerpos, o fragmentos o variantes de los mismos, que se unen inmunoespedficamente a BLyS; y comparar el nivel de BLyS ensayado en las celulas o una muestra tisular con un nivel patron de BLyS o un nivel de BLyS en celulas o una muestra tisular de un individuo sin una expresion aberrante de BLyS, en el que un aumento o disminucion en el nivel ensayado de BLyS o nivel en celulas o una muestra tisular de un individuo sin expresion
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aberrante de BLyS en comparacion con el nivel patron de BLyS es indicativo de una expresion aberrante.
En aspectos espedficos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo marcado o fragmento del mismo que se une inmunoespedficamente a BLyS para su uso en un procedimiento para diagnosticar una enfermedad o trastorno asociado con una expresion o actividad aberrante de BLyS, que comprende:
administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo marcado o fragmento del mismo que se une inmunoespedficamente a BLyS; esperar durante un intervalo de tiempo despues de la administradora para permitir que el anticuerpo marcado o fragmento del mismo se concentre preferentemente en sitios en el sujeto en los que se exprese BLyS; determinar el nivel de fondo; y detectar el anticuerpo marcado o fragmento del mismo en el sujeto, de modo que la deteccion de anticuerpo marcado o fragmento del mismo por encima del nivel de fondo indica que el sujeto tiene una enfermedad o trastorno particular asociado con una expresion aberrante de BLyS.
En aspectos espedficos, el anticuerpo o fragmento del mismo utilizado en los dos procedimientos descritos inmediatamente antes comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128.
En aspectos espedficos, el anticuerpo o fragmento del mismo utilizado en los dos procedimientos descritos inmediatamente antes comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128.
En aspectos espedficos, el anticuerpo o fragmento del mismo utilizado en los dos procedimientos descritos inmediatamente antes comprende una CDR3 de VH que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 2129 a 3227.
En aspectos espedficos, el anticuerpo o fragmento del mismo utilizado en los dos procedimientos descritos inmediatamente antes se conjuga con un agente de diagnostico.
En aspectos espedficos, el anticuerpo o fragmento del mismo utilizado en los dos procedimientos descritos inmediatamente antes se conjuga con un agente de diagnostico en el que el agente de diagnostico es peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa.
En aspectos espedficos, el anticuerpo o fragmento del mismo utilizado en los dos procedimientos descritos inmediatamente antes se conjuga con un agente de diagnostico en el que el agente de diagnostico es fluorescema, isotiocianato de fluorescema, rodamina, fluorescema de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina.
En aspectos espedficos, el anticuerpo o fragmento del mismo utilizado en los dos procedimientos descritos
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inmediatamente antes se conjuga con un agente de diagnostico, en el que el agente de diagnostico es I, I, In, 90Y o "Tc.
En aspectos espedficos, el anticuerpo o fragmento del mismo utilizado en los dos procedimientos descritos inmediatamente antes se conjuga con un agente de diagnostico, en el que el agente de diagnostico es Iuciferasa, luciferina o aequorina. La presente memoria descriptiva tambien describe lo siguiente:
Una composicion farmaceutica que comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a BLyS y un vedculo farmaceuticamente aceptable.
Una composicion farmaceutica que comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende un dominio Vl de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a BLyS y un vedculo farmaceuticamente aceptable.
Una composicion farmaceutica que comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende un dominio Vl de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a BLyS, y que tambien comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128 y un vedculo farmaceuticamente aceptable.
Una composicion farmaceutica que comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 2129 a 3227, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a BLyS y un vedculo farmaceuticamente aceptable.
Una composicion farmaceutica que comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende un dominio Vl de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a BLyS, y que tambien comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: : 1 a 2128 y un vedculo
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farmaceuticamente aceptable, en una cantidad eficaz para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad o trastorno para su uso en un procedimiento de tratamiento, prevencion o mejona de una enfermedad o trastorno asociado con una expresion o actividad aberrante de BLyS, siendo dicha composicion para administrarse a un animal que lo necesite. Este procedimiento puede usarse para tratar un trastorno infeccioso, cancer y/o enfermedad autoinmune tal como lupus 0 nefritis glomerular.
Una composicion farmaceutica que comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a BLyS y un vedculo farmaceuticamente aceptable en una cantidad eficaz para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad o trastorno para su uso en un procedimiento de tratamiento, prevencion o mejona de una enfermedad o trastorno asociado con una expresion o actividad aberrante de BLyS, siendo dicha composicion para administrarse a un animal que lo necesite. Esta composicion puede ser para usarse en el tratamiento de un trastorno infeccioso, cancer y/o enfermedad autoinmune tal como lupus o nefritis glomerular.
Una composicion farmaceutica que comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende un dominio Vl de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a BLyS, y que tambien comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: : 1 a 2128 y un vedculo farmaceuticamente aceptable en una cantidad eficaz para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad o trastorno para su uso en un procedimiento de tratamiento, prevencion o mejona de una enfermedad o trastorno asociado con una expresion o actividad aberrante de BLyS, siendo dicha composicion para administrarse a un animal que lo necesite. Esta composicion puede ser para usarse en el tratamiento de un trastorno infeccioso, cancer y/o enfermedad autoinmune tal como lupus o nefritis glomerular.
Una composicion farmaceutica que comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende una secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 2129 a 3227, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespedficamente a BLyS y un vedculo farmaceuticamente aceptable en una cantidad eficaz para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad o trastorno para su uso en un procedimiento de tratamiento, prevencion o mejona de una enfermedad o trastorno asociado con una expresion o actividad aberrante de BLyS, siendo dicha composicion para administrarse a un animal que lo necesite. Esta composicion puede ser para usarse en el tratamiento de un trastorno infeccioso, cancer y/o una enfermedad autoinmune, tal como lupus o nefritis glomerular.
Esta composicion puede ser para usarse en el tratamiento de un trastorno infeccioso, cancer y/o enfermedad autoinmune tal como lupus o nefritis glomerular.
Ejemplos
Abreviaturas
Tris-HCl 0,2 M, EDTA 0,5 mM, sacarosa 0,5 M (TES)
Clorhidrato de l-etil-3-[3-dimetilminopropil]carbodiimida (EDC) 2TY complementado con ampicilina 100 pg/ml y glucosa 2% (2TYAG) 2TY complementado con ampicilina 100 pg/ml y kanamicina 50 pg/ml (2TYAK) 3,3',5,5'-Tetrametil Bencidina (TmB)
Concentracion inhibitoria de 50% (CI50)
PBS 6x que contiene solucion de bloqueo Marvel 18% (MPBS 6x) Absorbancia (A)
Albumina de suero bovino (BSA)
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
Suero fetal de ternera (FCS)
Variable de cadena pesada (Vh)
Solucion salina tamponada con Hepes (HBS)
Peroxidasa de rabano picante (HRP)
Cromatograffa de Afinidad de Metal Inmovilizado (IMAC)
Isopropil p-D-tiogalactopiranosido (IPTG)
Variable de cadena ligera (Vl)
Multiplicidad de infeccion (MOI)
Acido N-[2-hidroxietil]piperazin-N'-[2-etanosulfonico] (Hepes) Nanomolar (nM)
N-Hidroxisuccinimida (NHS)
PBS que contiene Marvel 3% (MPBS)
Solucion Salina Tamponada con Fosfato (PBS)
Solucion Salina Tamponada con Fosfato + Tween 20 0,1% (v/v)
(PBST)
Picomolar (pM)
Fragmento variable de cadena sencilla (scFv)
Factor de Necrosis Tumoral-alfa (TNF-Ot)
Factor de Necrosis Tumoral-beta (TNF-13)
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Ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL)
Definiciones:
En la seccion siguiente, la expresion "BLyS inmovilizado" se refiere a una forma soluble de BLyS o a BLyS biotinilado revestido en una placa de ensayo de plastico (por ejemplo, una placa de 96 pocillos), pero no se refiere a BLyS marcado con histidina revestido en una placa de ensayo de plastico; el "BLyS biotinilado" es una forma soluble de BLyS excepto cuando se usa para revestir una placa de ELISA, en cuyo caso sena "BLyS inmovilizado". Las formas unidas a membrana de BLyS incluyen, pero sin limitacion, membranas plasmaticas de U937 y P388.
Ejemplo 1: Los Anticuerpos se Unen Inmunoespecificamente a BLyS Soluble y Unido a Membrana
Se exploro una biblioteca de fago en un ensayo para identificar aquellos fagos que presentan scFv que se unen inmunoespedficamente a las formas soluble y unida a membrana de BLyS. Los fagos que presentan scFv que se unen a BLyS inmovilizado se identificaron despues de seleccion sobre BLyS inmovilizado y evaluacion mediante ELISA para determinar su union a BLyS inmovilizado. El BLyS que se inmovilizo en placas para estos ensayos se purifico a partir de sobrenadantes de celulas Sf9 infectadas con una construccion de expresion de baculovirus que se describe en Moore y col., Science 285: 260-263.
Cada uno de los scFv identificados se secuencio despues. Se aislaron ciertas secuencias multiples veces, de modo que se genero un panel (panel 1) que contema un miembro de cada secuencia unica, y se caracterizaron adicionalmente para determinar su capacidad para unirse inmunoespedficamente a las formas soluble y unida a membrana de BLyS.
Las secuencias de aminoacidos derivadas de estos scFv se muestran en la Tabla 1 anterior. Los segmentos Vh y Vi individuales de los scFv se alinearon con las secuencias de lmea germinal humana conocidas en V-BASE (Tomlinson y col,
www.mrc-cpe.cam.ac.uk) y se identifico la lmea germinal mas proxima.
Ejemplo 2: Especificidad de scFv por BLyS y BLyS Unido a Membrana
La especificidad de cada uno de los scFv tanto por BLyS como por BLyS unido a membrana se determino mediante ELISA de fago. El BLyS se inmovilizo sobre plastico como una forma soluble purificada de la protema o como una forma unida a membrana presente en preparaciones de membrana plasmatica de la lmea celular tipo macrofago humano U937.
Mantenimiento de Celulas U937
Las celulas U937 son una lmea celular de linfoma histiodtico tipo monocito humano que se sabe que expresa BLyS en sus membranas plasmaticas. Se mantuvieron en RPMI-1640 complementado con L-glutamina 4 mM, FCS 10 %, penicilina 10 U, estreptomicina 100 g/ml (todos los reactivos de Sigma). Despues las celulas se congelaron a partir de reservas congeladas y se usaron para la preparacion de membrana plasmatica o se dividieron 1:5, despues de 2 dfas en cultivo cuando la densidad celular alcanza I x IOfVml.
Preparacion de Membranas Plasmaticas de U937
Para preparar membranas plasmaticas, se recogieron I x 10 celulas U937 a partir de su medio de cultivo por centrifugacion a 1000 rpm a 4 °C durante 5 minutos en una centnfuga de sobremesa. Las celulas se resuspendieron en 40 ml de Tris 12 mM, pH 7,5, sacarosa 250 mM y se pusieron en hielo. Despues, las celulas se lisaron usando un homogeneizador electrico manual (Labortechnik IKA Ultra-Turrax) durante cuatro rafagas de un minuto. Para comprobar que se habfa producido la lisis celular, se anadieron 10 |jl de lisado celular a 10 |jl de azul Tripan y el lisado celular se examino bajo un microscopio. Despues de confirmar la lisis, el homogeneizado se centnfugo a 270 x g durante 10 minutos a 4°C para sedimentar la fraccion nuclear y se conservo el sobrenadante. El sobrenadante se centnfugo a 8000 x g, 10 min, 4°C para sedimentar las fracciones mitocondrial y lisosomica y se conservo el sobrenadante. Despues, el sobrenadante se centnfugo a 100000 X g 60 min, 4°C para sedimentar la fraccion enriquecida en membrana plasmatica. El sobrenadante se desecho y el sedimento de membrana plasmatica se resuspendio en 1 ml de PBS y se almaceno a - 70°C. La concentracion de protema de la fraccion de membrana plasmatica se determino usando un kit de cuantificacion de protema (Biorad). Los rendimientos tfpicos estaban entre 5 y 10 mg de membranas plasmaticas.
ELISA de fago
Para determinar la especificidad de cada uno de los scFv unicos, se realizo un ELISA de fago para cada scFv frente a BLyS humano, membranas plasmaticas de U937, TNFa (R&D Systems, Minneapolis, MN), BSA y pocillo no revestido. Se inocularon colonias de E. coli individuales que conteman un fagemido que representaba uno de los scFv unicos del panel 1 en placas de 96 pocillos que conteman 100 jl de medio 2TYAG por pocillo. Las placas se incubaron a 37°C durante 4 horas en agitacion. Se anadio el fago auxiliar M13K07 a cada pocillo a una mOi de 10 y las placas se incubaron durante 1 hora adicional a 37 °C. Las placas se centrifugaron en una centnfuga de sobremesa a 2000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se retiro y los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 jl de 2TYAk y se incubaron a 30°C durante una noche en agitacion. Al dfa siguiente, las placas se
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centrifugaron a 2000 rpm durante 10 min y los 100 |jl del sobrenadante que contema fago de cada pocillo se transfirieron cuidadosamente a una placa de 96 pocillos recien preparada. Se anadieron veinte jl de MPBS 6x a cada pocillo y se incubaron a temperature ambiente durante 1 hora para prebloquear el fago antes del ELISA.
Se revistieron placas flexibles de 96 pocillos (Falcon) durante una noche a 4°C con BLyS humano (1 jg/ml) en PBS, membranas plasmaticas de U937 (10 jg/ml) en PBS, TNFa (1 jg/ml) en PBS, BSA (1 jg/ml) en PbS o PBS. Despues del revestimiento, las soluciones se eliminaron de los pocillos y las placas se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en MPBS. Las placas se lavaron 3 veces con PBS y despues se anadieron 50 jl de fago prebloqueado a cada pocillo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora y despues se lavaron con 3 cambios de PBST, seguidos de 3 cambios de PBS. A cada pocillo, se anadieron 50 jl de un conjugado antigen VIII-HRP (Pharmacia) a una dilucion de 1 a 5000 en MPBS y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada placa se lavo tres veces con PBST, seguidas de tres veces con PBS. Despues se anadieron 50 jl de un polfmero anti-raton marcado con HRP (DAKO EnVision) diluido 1/50 en MPBS 3% y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Cada placa se lavo despues tres veces con PBST, seguidas de tres veces con PBS. Despues se anadieron cincuenta jl de sustrato TMB a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos o hasta el desarrollo del color. La reaccion se interrumpio por adicion de 25 jl de H2SO4 0,5 M. La senal generada se midio por lectura de la absorbancia a 450 nm (A450) usando un lector de placas de microtitulacion (Bio-Rad 3550).
Los resultados para 3 clones (I006E07, 1008D05 y I016F04) se muestran en la Figura I. Los 3 scFv reconocen BLyS inmovilizado y membranas plasmaticas de U937 pero no reconocen TNFa, BSA ni pocillos sin revestir (solamente PBS). Estos resultados indican que estos scFv reconocen espedficamente BLyS inmovilizado y BLyS unido a membrana.
Ejemplo 3: Inhibicion en un Ensayo de Union a Receptor In Vitro Mediante ScFv de Fago
Todos los scFv de fago unicos en el panel 1 se evaluaron para determinar su capacidad para inhibir la union de BLyS soluble a su receptor afm en celulas IM9.
Biotinilacion de BLyS
Se dializaron cien jg de BLyS humano o de raton durante una noche a 4°C contra bicarbonato sodico (carbonato de hidrogeno sodico) 50 nM pH 8,5 usando un casete Slide-OC-Lyzer (Pierce). Al dfa siguiente, se disolvio NHS-biotina (Pierce) en DMSO a 13,3 mg/ml. Despues, esto se anadio al BLyS a una proporcion molar de biotina:BLyS de 20:1, se mezclo y se incubo en hielo durante 2 horas. El BLyS biotinilado se dializo despues de nuevo en PBS esteril (Sigma) usando un casete Slide-A-Lyzer durante una noche a 4°C. La actividad biologica del BLyS biotinilado se confirmo usando el ensayo de inhibicion de la union a receptor (vease a continuacion).
Mantenimiento de celulas IM9
Las celulas IM9 son una lmea celular de linfocitos B humanos. Se mantuvieron en RPMI-1640 complementado con L-glutamina 4 mM, FCS 10%, penicilina 10 U, estreptomicina 100 g/ml (todos los reactivos de Sigma). Las celulas se descongelan a partir de una reserva congelada y pueden usarse en ensayos despues de 5 dfas en cultivo cuando alcanzan una densidad de 4-8 x 105/ml.
Ensayo de inhibicion de la union a receptor
Se inocularon colonias de E. coli individuales que conternan un fagemido que representaba uno de los scFv unicos del panel 1 en placas de 96 pocillos que conternan 100 jl de medio 2TYAG por pocillo. Las placas se incubaron a 37°C durante 4 horas en agitacion. Se anadio fago auxiliar M13K07 a cada pocillo a una MOI de 10 y las placas se incubaron durante 1 hora adicional a 37°C. Las placas se centrifugaron en una centnfuga de sobremesa a 2000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se retiro y los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 jl de 2TYAK y se incubaron a 30°C durante una noche en agitacion. Al dfa siguiente, las placas se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 min y los 100 jl del sobrenadante que contema fago de cada pocillo se transfirieron cuidadosamente a una placa de 96 pocillos recien preparada. El fago se diluyo I en 2 en MPBS antes del uso.
Se revistieron placas de 96 pocillos de fondo plano (Costar) con 100 jl por pocillo de una dilucion 1:10 de poli-L- lisina (Sigma) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Despues, las placas se lavaron dos veces con agua, se dejaron secar al aire y se pusieron a 4°C durante una noche. Despues se anadieron a cada pocillo cien jl de celulas IM9 (a IOfVml en medio de cultivo RPMI-1640). Despues, las placas se centrifugaron a 3200 rpm durante 5 min para sedimentar las celulas. Los medios se aspiraron cuidadosamente y se anadieron 200 jl de MPBS a cada pocillo. Despues, las placas se dejaron en bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente.
A una placa de 96 pocillos separada se anadieron 10 jl de BLyS biotinilado (a 162,5 ng/ml) en MPBS a cada pocillo para dar una concentracion final de 25 ng/ml. Se anadieron cincuenta y cinco jl de cada sobrenadante de fago apropiado a cada pocillo y el volumen final en cada pocillo era de 65 jl. Despues, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos.
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Las placas revestidas con IM9 se lavaron dos veces en PBS, se secaron golpeandolas suavemente y se anadieron 50 pl de estreptavidina-Delfia (Wallac) a cada pocillo a una dilucion 1:1000 en el tampon de ensayo del fabricante. Despues, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora y se lavaron seis veces en solucion de lavado Delfia (Wallac). Despues de secar las placas golpeandolas suavemente, se anadieron 100 pl por pocillo de solucion de potenciacion Delfia (Wallac). Las placas se golpearon suavemente para fomentar la formacion de micelas, se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos y se leyo la fluorescencia en una estacion de trabajo Wallac 1420 a 6520 nM.
Los resultados para 3 scFv de fago (1001C09, 1018D07 y I016H07) que inhibfan la union de BLyS biotinilado se muestran en la Figura 2. Tambien se muestra la union maxima de BLyS biotinilado a su receptor (bio-BLyS solamente), la senal de fondo en ausencia de BLyS biotinilado (no bio-BLyS) y los resultados con un anticuerpo de fago irrelevante (es decir, que no reconoce el BLyS). Los 3 scFv de fago inhibfan la union de BLyS biotinilado a su receptor en celulas IM9, identificando estos scFv como scFv que se unen a la forma soluble de BLyS. Estos scFv tambien se unen a membranas de U937, por lo tanto, tambien se unen a la forma unida a membrana de BLyS.
Se seleccionaron para un estudio adicional cuarenta y ocho de los scFv del panel 1 que demostraron la mayor inhibicion como partfculas de fago en este ensayo. Estos 48 scFv se enumeran en la Tabla 3.
Tabla 3. ScFv que Inhiben la Union de BLyS Biotinilado a su Receptor
Anticuerpo
Anticuerpo
Anticuerpo
Anticuerpo
Anticuerpo
I008C02
I029D07 I008C03 I008C12 I028A06
I022E02
I061E07 I007H08 I061H01 I031C03
I018C02
I006D07 I008A11 I006D08 I031F02
I008B01
I017DI0 I061D02 I026E03 I031F09
I016F04
I007B03 I008A09 I027A07 I031G11
I016E05
I018C10 I007F11 I016H07 I050A07
I018H08
I001C09 I037E07 I021B05 I050A12
I018H09
I018D07 I037E12 I031G10 I050B11
I029F11 I016F02 I031G08 I051C04
I022D01 I031C07 I003F12
I012A06
Ejemplo 4: Especificidad de Anticuerpos Anti-BLyS
La especificidad de los 48 scFv enumerados en la Tabla 3 por BLyS humano y murino se determino usando ELISA de fago.
ELISA de Fago
Para determinar la especificidad de los 48 scFv, se realizo un ELISA de fago contra BLyS humano y de raton y un panel de antfgenos humanos relacionados y no relacionados: ligando Fas, TRAIL, TNFa, TNFI3 y PBS. Los antfgenos ligando Fas, TRAIL, TNFa y TNFI3 se obtuvieron en R&D Systems, Minneapolis, MN. Se inocularon colonias de E. coli individuales que conteman fagemido en 5 ml de 2YTAG y se incubaron a 37°C durante 4 horas en agitacion. Se anadio fago auxiliar M13K07 (Pharmacia) a cada tubo a una MOI de 10 y se incubo durante 30 minutos a 37°C durante 1 hora, los primeros 30 minutos estatico y los ultimos 30 minutos con agitacion suave. Las celulas se sedimentaron por centrifugacion a 3.500 rpm durante 10 minutos y se desecho el sobrenadante. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 5 ml de 2TYAK y se incubaron a 30°C durante una noche con agitacion. Al dfa siguiente, las celulas se sedimentaron por centrifugacion a 3.500 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante que contema fago (5 ml) se transfirio cuidadosamente a un tubo recien preparado, se anadio 1 ml de 6MPBS y el tubo se inoculo a temperatura ambiente durante 1 hora para prebloquear el fago antes del ELISA.
Todos los antfgenos se revistieron a 1 pg/ml. Se realizo ELISA esencialmente como se describe en el Ejemplo 2. Siendo la unica excepcion a esto la deteccion de anticuerpo de fago que se une a BLyS de raton, en la que se omitio la etapa que implicaba la incubacion con el polfmero anti-raton marcado con HRP. La union a BLyS de raton se detecto con TMB como en el Ejemplo de Seccion 2.
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I031F02, se muestran en la Figura 3. Estos dos scFv reconocen espedficamente a BLyS humano y de raton pero no a ningun otro antigeno relacionado o no relacionado ensayado.
Ejemplo 5: Especificidad por la Forma Unida a Membrana de BLyS
La especificidad de 48 scFv por BLyS unido a membrana se determino mediante el ELISA de fago descrito en el Ejemplo 2. BLyS se inmovilizo sobre plastico como una forma unida a membrana presente en preparaciones de membranas plasmaticas de la lmea celular tipo macrofago humano U937. Se sabe que esta lmea celular expresa la forma unida a membrana de BLyS humano.
Para demostrar que esta union es espedfica para BLyS unido a membrana, se desarrollo un ELISA de competicion para determinar si podfa competirse con la senal de ELISA para un anticuerpo individual en U937 por preincubacion con BLyS o TNFa. Se esperana que un anticuerpo anti-BLyS que tambien reconoce el BLyS unido a membrana demostrase una reduccion de senal con BLyS libre pero no con TNFa libre.
ELISA de Competicion
Se inocularon colonias de E. coli individuales que conteman fagemido para cada uno de los 48 scFv enumerados en la Tabla 3 en 5 ml de 2YTAG y se incubaron a 37°C durante 4 horas en agitacion. Se anadio fago auxiliar M13K07 (Pharmacia) a cada tubo a una MOl de 10 y se incubo durante 30 minutos a 37°C durante 1 hora, los primeros 30 minutos estaticos y los ultimos 30 minutos con agitacion suave. Las celulas se sedimentaron por centrifugacion a 3.500 rpm durante 10 minutos y se desecho el sobrenadante. Se resuspendieron los sedimentos celulares en 5 ml de 2TYAK y se incubaron a 30°C durante una noche con agitacion. Al dfa siguiente, las celulas se sedimentaron por centrifugacion a 3.500 rpm durante 10 minutos. Los sobrenadantes que conteman fago (5 ml) se transfirieron cuidadosamente a un tubo reden preparado.
Para cada uno de los 48 scFv enumerados en la Tabla 3, se pipetearon dos almuotas de 20 pl de MPBS 6x en pocillos separados de una placa de 96 pocillos (Greiner). La primera almuota se complemento con BLyS a una concentracion final de 0,5 pg/ml. La segunda almuota se complemento con TNF-OC a una concentracion final de 0,5 pg/ml. Cada experimento se realizo por triplicado. Despues se anadieron 100 pl de cada sobrenadante de fago a cada almuota y se mezclaron pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Los fagos se incubaron (± antfgeno de competicion) a temperatura ambiente durante 1 hora.
Se revistieron placas flexibles de 96 pocillos (Falcon) durante una noche a 4°C con 50 pl de membranas plasmaticas de U937 10 pg/ml. Despues del revestimiento, las placas se lavaron 3 veces con PBS y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con 200 pl de MPBS. Las placas se lavaron 3 veces con pBs y se anadieron 50 pl de fago (± antfgeno de competicion) a cada pocillo apropiado. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora y despues se lavaron con 3 cambios de PBST, seguidos de 3 cambios de PBS. A cada pocillo se anadieron 50 pl de un conjugado de raton anti-gen VIII-HRP (Pharmacia) a una dilucion 1:5000 en MPBS y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada placa se lavo tres veces con PBST, seguidas de tres veces con PBS. Despues, se anadieron 50 pl de un polfmero anti-raton marcado con HRP (DAKO EnVision) diluido 1:50 en MPBS 3% y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Despues, cada placa se lavo tres veces con PBST, seguidas de tres veces con PBS. Despues se anadieron cincuenta pl de sustrato TMB a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante de 30 a 60 minutos o hasta el desarrollo del color. La reaccion se interrumpio por adicion de 25 pl de H2SO4 0,5 M. La senal generada se midio por lectura de la absorbancia a 450 nm (A450) usando un lector de placas de microtitulacion (Bio-Rad 3550).
Los 48 ScFv se unen a preparaciones de membrana plasmatica de U937. Podfa competirse con esta senal por preincubacion del anticuerpo de fago con BLyS, pero no por preincubacion con TNF-OC. Esto indica que los 48 scFv reconocen espedficamente el BLyS unido a membrana, asf como el BLyS soluble. Los resultados tfpicos se ejemplifican mediante los scFv I031F09, I050A12 y I051C04 y se muestra en la Figura 4. Los 3 scFv demuestran union a membranas plasmaticas de U937. Se competfa espedficamente con esta union con BLyS, pero no se competfa con TNF-OC, demostrando un reconocimiento espedfico del BLyS unido a membrana.
Ejemplo 6: Determinaciones de la Velocidad de Disociacion de scFv
Todas las determinaciones de velocidad de disociacion se realizaron en maquinas BIAcore 2000, usando el Software de Control BIAcore 2000 y se evaluaron usando el software BIAevaluation 3.0.
Preparacion de una Superficie de BLyS de Baja Densidad
Se preparo una superficie de 500 UR para estudios cineticos con scFv purificados. Se preparo una superficie de BLyS de baja densidad (500 UR de BLyS acoplado) en una celda de flujo 2 por acoplamiento con amina a una micro placa CM5. Se inserto una nueva microplaca CM5 en el BIAcore y se inicio un sensograma con tampon HBS a una caudal de 5 pl/min. Las soluciones de acoplamiento NHS y EDC (BIAcore) se mezclaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se inyectaron 30 pl sobre la superficie de CM5. Despues, se inyectaron cincuenta pl de BLyS a 1 pg/ml en tampon acetato sodico 10 mM, pH4, seguidos de 30 pl de solucion de etanolamina-HCI (BIAcore). Despues el caudal se ajusto a 20 pl/min y se inyectaron 10 pl de clorhidrato de guanidina 4 M en HBS sobre la
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superficie. Esto separa el BLyS no unido covalentemente de la superficie.
Medicion de la cinetica de la velocidad de disociacion de scFv en las superficies de baja densidad
La microplaca que contema la superficie de BLyS de baja densidad se inserto en el BIAcore. Se prepararon una serie de diluciones de scFv purificados en HBS, tipicamente de 50 pg/ml duplicando las diluciones hasta 1,5 pg/ml. La serie de diluciones se inyecto despues secuencialmente sobre la superficie de BLyS de baja densidad (y el control en blanco) usando el programa siguiente:
PRINCIPAL
CELDA DE FLUJO 1,2,3,4
APROG
genab rldl abl
APROG
genab rld2 ab2
APROG
genab rld3 ab3
APROG
genab rld4 ab4
APROG
genab rld5 ab5
APROG
genab rld6 ab 6
ADJUNTAR CONTINUO FIN
DEFINIR APROG PARAM %
FLUJO
KINYECTAR
INYECTAR
guanidina
genab
Abpos % Abld 20
% Abpos 200 80
rlc6 IOletapa de regeneracion de clorhidrato de
EXTRALIMPIO
FIN
Se eliminaron los scFv unidos por inyeccion de 10 pl de GuHCI 4 M en HBS sobre la superficie entre muestras de scFv.
Las curvas de union para scFv individuales se analizaron usando el software BIAevaluation para determinar las velocidades de disociacion de anticuerpo. El analisis cinetico para un anticuerpo scFv tfpico, I003C02, se muestra en la Figura 5. El I003C02 tiene una Koff = 6 X 10-3 s-1.
Ejemplo 7: Inhibicion en un Ensayo de Union a Receptor In Vitro por Anticuerpos scFv
Los 48 scFv enumerados en la Tabla 3 se purificaron y se evaluaron para determinar su capacidad para inhibir la union de BLyS a su receptor en celulas IM9.
Purificacion de scFv
Para determinar la potencia inhibitoria de scFv anti-BLyS, los scFv se prepararon primero por IMAC. Se inoculo 2TYAG (5 ml) con una sola colonia y se cultivo durante una noche a 30°C en agitacion. Este cultivo de una noche se uso despues para inocular 500 ml de 2TY que contema ampicilina 100 pg/ml y glucosa 0,1 %, y se cultivo a 30 °C en agitacion hasta que se obtuvo una A60O de 1,0. Se anadio IPTG a 1 mM y el cultivo se dejo crecer durante 3,5 horas adicionales a 30 °C.
Las celulas se recogieron por centrifugacion a 5.000 rpm y se resuspendieron en 10 ml de TES. Se anadieron 15 ml adicionales de una dilucion 1:5 (en agua) de TES y la suspension celular se incubo en una rueda giratoria a 4°C durante 30 minutos. Esto causa choque osmotico y produce un extracto periplasmico que contiene el scFv. Las celulas residuales y los residuos se sedimentaron por centrifugacion a 9.000 rpm durante 20 minutos a 4°C. El sobrenadante se transfirio a un nuevo tubo y se anadieron 50 pl de MgCh I M. Despues, se anadieron dos ml de una Ni-NTA agarosa (Qiagen), prelavada con tampon (fosfato sodico 50 mM, pH 8, NaCl 300 mM) junto con un comprimido inhibidor de proteasas (Boehringer Mannheim) al extracto periplasmico. La preparacion se incubo, haciendola girar durante una noche a 4°C. El Ni-NTA se sedimento por centrifugacion a 2.000 rpm durante 5 minutos y se aspiro el sobrenadante. Las perlas de agarosa se lavaron 3 veces con 50 ml de tampon de lavado, centrifugando para recoger la agarosa entre cada lavado. Se anadieron diez ml de tampon de lavado despues del lavado final y la suspension se cargo en una columna Polyprep (BioRad). Se anadieron dos ml de tampon de elucion (NaPi (fosfato sodico) 50 mM, pH 8, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM) a la agarosa drenada y se recogio el eluido. Se
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cambio el tampon del scFv purificado por IMAC a PBS mediante el uso de una columna Nap 5 (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se leyo la A280 y se determino la concentracion de protema usando un coeficiente de extincion molar de protema 1 mg/ml = A2801/4. El scFv purificado se almaceno en almuotas de 500 jl a -70°C.
Ensayo de Inhibicion de la Union a Receptor
Se revistieron placas de 96 pocillos de fondo plano (Costar) con 100 jl por pocillo de una dilucion 1:10 de poli-L- lisina (Sigma) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Despues, las placas se lavaron dos veces con agua, se dejaron secar al aire y se pusieron a 4°C durante una noche. Despues, se anadieron a cada pocillo cien jl de celulas IM9 (a loVml en RPMI-1640). Despues, las placas se centrifugaron a 3200 rpm durante 5 min para sedimentar las celulas. Los medios se aspiraron cuidadosamente y se anadieron 200 jl de MPBS a cada pocillo. Despues las placas se dejaron en bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente.
A una placa de 96 pocillos separada, se anadieron scFv de ensayo de titulacion en MPBS por triplicado en un intervalo de concentracion de 10 jg/ml a 0,001 jg/ml. El volumen final de scFv de ensayo en cada pocillo era de 55 jl. La competicion con BLyS no marcado tambien se incluyo en cada ensayo como control. El BLyS no marcado, en MPBS, se titulo tipicamente por triplicado sobre un intervalo de concentracion de 1 jg/ml a 0,001 jg/ml. Se anadieron 10 jl de BLyS biotinilado (a 162,5 ng/ml) en MPBS a cada pocillo para dar una concentracion final de 25 ng/ml. Despues, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Las placas revestidas con IM9 se lavaron dos veces en PBS, se secaron golpeandolas suavemente y se anadieron inmediatamente 50 jl de la mezcla de scFv/BLyS biotinilado y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron tres veces en PBST y tres veces en PBS, se secaron golpeandolas suavemente y se anadieron 50 jl por pocillo de estreptavidina-Delfia (Wallac) a una dilucion 1:1000 en el tampon de ensayo del fabricante. Despues las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora y se lavaron seis veces en solucion de lavado Delfia (Wallac). Despues de secar las placas golpeandolas suavemente, se anadieron 100 jl por pocillo de solucion de potenciacion Delfia (Wallac). Las placas se golpearon suavemente para fomentar la formacion de Micelas, se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos y se leyo la fluorescencia en una estacion de trabajo Wallac 1420 a 6520 nM.
Las curvas de titulacion tfpicas para dos anticuerpos scFv, 1007F11 y 1050A07, se muestran en la Figura 6. El BLyS no marcado competfa por la union a su receptor con un valor de CI50 de 0,8 nM. Los valores de CI50 para I007F11 y I050A07 eran de 7,9 nM y 17,1 nM, respectivamente. El ensayo se realizo por triplicado y se muestran las barras del error tfpico. Los 9 scFv que demostraron la mayor inhibicion como scFv se enumeran en la Tabla 4. Estos datos tambien confirman que estos 9 scFv reconocen la forma soluble de BLyS.
Tabla 4: 9 ScFv que demostraron la mayor potencia en el ensayo de inhibicion de la union a receptor de BLyS
Anticuerpo ScFv
I017D10
I022D01
I008A11
I006D08
I031F02
I050A12
I050B11
I051C04
I003F12S
Ejemplo 8: Anticuerpos que reconocen una forma soluble de BLyS
Se exploro una biblioteca de fago en un ensayo para identificar aquellos fagos que presentaban scFv que se unen inmunoespedficamente a la forma soluble pero no a la forma unida a membrana de BLyS.
Se exploro una biblioteca de fago para determinar la capacidad para unirse a BLyS biotinilado. Los fagos se expusieron a BLyS biotinilado, y se permitio un intervalo de tiempo para unirse al BLyS biotinilado. Despues, se aislaron los fagos que se uman a bio-BLyS por captura sobre perlas magneticas revestidas con estreptavidina.
Los fagos identificados en la exploracion anterior (captura de Bio-BLyS a partir de la solucion) se exploraron despues mediante ELISA para determinar su capacidad para unirse a BLyS inmovilizado. Despues, el scFv expresado por fago que se urna a BLyS inmovilizado se clono y se secuencio. De nuevo, se identificaron varias secuencias multiples veces, de modo que despues se caracterizo adicionalmente un panel (panel 2) que consistfa
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Las secuencias de aminoacidos derivadas de estos scFv se muestran en la Tabla 1 anterior. Los segmentos Vh y Vi individuals de los scFv se alinearon con las secuencias de lmea germinal humana conocidas en V-BASE (Tomlinson y col.,
www.mrc-cpe.cam.ac.uk) y se identifico la lmea germinal mas proxima.
Ejemplo 9: Especificidad por BLyS Soluble
Los scFv se aislaron a partir de una biblioteca de fagos basandose en su capacidad para unirse a una forma soluble de BLyS. En resumen, se preincubaron fagos con BLyS biotinilado en solucion. Los fagos que se uman a este BLyS biotinilado se aislaron despues usando perlas magneticas revestidas con estreptavidina.
La especificidad de cada uno de los scFv unicos por BLyS y por la forma unida a membrana de BLyS se determino mediante ELISA de fago. El BLyS se inmovilizo sobre plastico como una forma soluble purificada de la protema o como una forma unida a membrana presente en preparaciones de membrana plasmatica de la lmea celular tipo macrofago humano U937. El mantenimiento de celulas U937 y las preparaciones de membrana plasmatica se realizaron como se detalla en el Ejemplo 2.
ELISA de Fago
Para determinar la especificidad de cada uno de los scFv, se realizo un ELISA de fago para cada anticuerpo contra BLyS humano, membranas plasmaticas de U937, TNFa, BSA y pocillo no revestido. Las condiciones del revestimiento de antfgeno eran las descritas en el Ejemplo 2, aparte del BLyS humano. El BLyS se biotinilo primero (como se describe en el Ejemplo 3) y se revistio a 1 pg/ml sobre placas revestidas con estreptavidina (Reacti-Bind, Pierce) durante 30 min a temperatura ambiente. Despues las placas se lavaron, se bloquearon y se realizo el ELISA de fago como se detalla en el Ejemplo 2.
Los resultados para 3 clones (1074B12, I075F12 y I075A02) que se unen a la forma soluble pero no a la forma unida a membrana de BLyS se muestran en la Figura 7. Como control se muestra tambien en la Figura 7 un anticuerpo de fago que reconoce el TNFa. Hay una pequena senal de fondo inespedfica en las membranas plasmaticas de U937 que es evidente tanto con los scFv anti-BLyS como con el control anti-TNFa. Los 3 scFv anti-BLyS reconocen el BLyS pero no membranas plasmaticas de U937, TNFa, BSA o un pocillo no revestido (solamente PBS). Esto indica que los scFv no se unen a la forma unida a membrana de BLyS. Ademas, el hecho de que estos scFv se aislaron basandose en su capacidad para unirse a BLyS biotinilado soluble indica que se unen a la forma soluble de BLyS. Se proporciona una confirmacion adicional de la especificidad de estos scFv por BLyS en el Ejemplo 10.
Ejemplo 10: Inhibicion de un ensayo de union a receptor in vitro por scFv de fago
Todos los scFv de fago unicos del panel 2 se evaluaron para determinar su capacidad para inhibir la union de BLyS a su receptor afm en celulas IM9. La biotinilizacion de BLyS, el mantenimiento de celulas IM9 y el ensayo de inhibicion de la union a receptor se realizaron como se describe en el Ejemplo 3.
Los resultados para dos scFv de fago, I0025B09 y I026C04 se muestran en la Figura 8. Tambien se muestra la union maxima de BLyS biotinilado a su receptor (bio-BLyS solamente), la senal de fondo en ausencia de BLyS biotinilado (sin bio-BLyS) y los resultados con un anticuerpo de fago irrelevante (es decir, que no reconoce el BLyS). Ambos scFv de fago inhibfan la union de BLyS biotinilado a su receptor en celulas IM9. Se identificaron 33 de los scFv unicos del panel 2 para un estudio adicional. Estos 33 scFv demostraron la mayor inhibicion como partmulas de fago en este ensayo y se enumeran en la Tabla 5.
Tabla 5: Identificacion de 33 scFv de fago contra BLyS libre que demuestran la inhibicion mas significativa de la union de BLyS biotinilado a su receptor
Anticuerpo
Anticuerpo
Anticuerpo
Anticuerpo
I026C04
I074B12 I073F04 I065D04
I003C06
I075A02 I078D08 I068C08
I025B09
I068B08 I078D02 I068F03
I027B12
I068B04 I075G01 I069B07
I025B06
I068C06 I071B03
103OAlO
I075F12 I072B09
Anticuerpo
Anticuerpo
Anticuerpo
Anticuerpo
I002A01R
I065D08 I078H08
I002A01K
I065F08 I064C04
I026C04R
I067B10 I064C07
I026C04K
I067F05
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La especificidad de los 33 scFv (enumerados en la Tabla 5) por BLyS murino y humano inmovilizado se determino usando ELISA de fago.
ELISA de fago
Para determinar la especificidad de los 33 scFv se realizo una ELISA de fago como se describe en el Ejemplo 4 contra BLyS humano y de raton y un panel de antigenos humanos relacionados: TRAIL, LIGHT, TNFa, TNFI3 y pocillo no revestido (solamente PBS).
Los resultados tipicos para dos scFv, I067F05 y I078D02 se muestran en la Figura 9. Tambien se muestra un anticuerpo de control que reconoce espedficamente el TNFa. Ambos scFv anti-BLyS reconocen espedficamente BLyS de raton y humano inmovilizado pero no cualquier otro antigeno ensayado.
Los 33 scFv son espedficos para BLyS humano. 14/33 muestran reactividad cruzada con BLyS de raton pero no con ningun otro antigeno relacionado o no relacionado ensayado.
Ejemplo 12: Determinaciones de la velocidad de disociacion de scFv
Las determinaciones de la velocidad de disociacion, la preparacion de una superficie de BLyS de baja densidad y las mediciones cineticas fueron como se detalla en el Ejemplo 6.
Las curvas de union para scFv individuales se analizaron usando el software BIAevaluation para determinar las velocidades de disociacion de anticuerpo. El analisis cinetico para un anticuerpo scFv tfpico, I002A01, se muestra en la Figura 10. El I002A01 tiene una Kf = 9 X 10-4 s-1.
Ejemplo 13: Inhibicion en un ensayo de union a receptor in vitro por anticuerpos scFv
Los 33 scFv identificados en la Tabla 5 se prepararon como scFv purificados y se evaluaron para determinar su capacidad para inhibir la union de BLyS a su receptor en celulas IM9. Los scFv se purificaron y se analizaron en el ensayo de inhibicion de la union a receptor como se describe en el Ejemplo 6.1.8.
Las curvas de titulacion tfpicas para dos scFv, 10068C06 y I074B12, se muestran en la Figura 11. El BLyS no marcado competfa por la union a su receptor con un valor de constante inhibitoria 50 (CI50) de 0,66 nM. Los valores de CI 50 para I0068C06 y I074B12 son de 61 nM y 13 nM, respectivamente. El ensayo se realizo por triplicado y se muestran las barras del error tfpico. Los 7 scFv que demostraron la mayor inhibicion como scFv se enumeran en la Tabla 6.
Tabla 6: Identificacion de 7 scFv contra BLyS libre que demuestran la mayor inhibicion significativa de la union de BLyS biotinilado a su receptor como scFv purificados
imagen1
Ejemplo 14: ScFv que reconocen el BLyS unido a membrana
Se exploro una biblioteca de fago en un ensayo para identificar aquellos fagos que presentaban scFv que se unen inmunoespedficamemte a la forma unida a membrana pero no a la forma soluble de BLyS.
Como punto de partida, una biblioteca de fagos que expresaban anticuerpos scFv se selecciono sobre BLyS marcado con HIS inmovilizado. Los fagos aislados por seleccion se exploraron despues para determinar la capacidad para unirse a BLyS marcado con HIS. El BLyS marcado con HIS se obtuvo por expresion de los aminoacidos 71-285 de la SEQ ID NO: 3228 usando el vector pQE9 (Qiagen Inc., Valencia, cA) en E. coli y purificando la protema expresada. Estos clones de fago identificados mediante esta exploracion se secuenciaron despues. Despues de la secuenciacion, se genero un panel (panel 3) de fagos que expresaban cada uno un scFv unico que se urna a BLyS marcado con HIS y se caracterizaron adicionalmente.
Las secuencias de aminoacidos derivadas de los scFv unicos del panel 3 se muestran en la Tabla 1 anterior. Los
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segmentos Vh y Vi individuales de los scFv se alinearon con las secuencias de lmea germinal humana conocidas en V-BASE (Tomlinson y col,
www.mrc-cpe.cam.ac.uk) y se identifico la lmea germinal mas proxima.
Ejemplo 15: Reconocimiento de BLyS unido a membrana
La especificidad de cada uno de los scFv unicos por tanto la forma unida a de membrana de BLyS como por la forma soluble de BLyS se determino mediante ELISA de fago.
El BLyS se inmovilizo sobre plastico directamente como una forma soluble purificada de la protema, o se biotinilo y revistio sobre una placa con estreptavidina como en el Ejemplo 9. La union a BLyS marcado con HIS se uso como exploracion primaria para scFv que se uninan a la forma unida a membrana de BLyS (vease a continuacion). La forma unida a membrana de BLyS se presento como preparaciones de membrana plasmatica de la lmea celular tipo macrofago humano U937 o la lmea celular murina P388.
Se han generado anticuerpos monoclonales de raton contra BLyS marcado con His de acuerdo con procedimientos convencionales. La caracterizacion de estos anticuerpos monoclonales de raton puso de manifiesto que reconodan espedficamente tanto el BLyS marcado con His como la forma unida a membrana de BLyS en celulas U937, pero no el BLyS soluble. Por lo tanto, el reconocimiento espedfico de BLyS marcado con HIS se uso con prueba de confirmacion para el reconocimiento de la forma unida a membrana de BLyS por anticuerpos scFv y de fago.
ELISA de Fago
Para determinar la especificidad de cada uno de los scFv, se realizo un ELISA de fago para cada anticuerpo contra BLyS humano marcado con His, membranas plasmaticas de U937, TNFa, BSA y un pocillo no revestido. Las condiciones del revestimiento de antfgeno eran las descritas en 2, aparte del BLyS humano. El BLyS se biotinilo primero (como se describe en el Ejemplo 3) y se revistio a 1 pg/ml sobre placas revestidas con estreptavidina (Reacti-Bind, Pierce) durante 30 min a temperatura ambiente. Despues, las placas se lavaron, se bloquearon y se realizo el ELISA de fago como se detalla en el Ejemplo 2.
Los resultados para 3 clones, I079C01, 1081C10 y I082A02, y un anticuerpo de fago de control que reconoce el TNFa se muestran en la Figura 12. Los 3 scFv reconocen membranas plasmaticas de U937 (U937) y BLyS marcado con His (HIS-BLyS) pero no BLyS biotinilado (bio-BLyS) ni un pocillo no revestido (PBS). Esto indica que los scFv reconocen la forma unida a membrana de BLyS.
Ejemplo 16: Especificidad por BLyS unido a membrana
La especificidad de los scFv por solo la forma unida a membrana de BLyS, y no por la forma soluble, se confirmo usando un ELISA de competicion. Este ensayo evalua la capacidad de scFv de fago de ensayo para unirse a la forma unida a membrana de BLyS en membranas plasmaticas de U937 en presencia de diferentes formas de BLyS de competicion. El BLyS de competicion era la forma marcada con His de BLyS o la forma soluble de BLyS. Se esperana que se compitiese con los scFv espedficos por el BLyS unido a membrana por preincubacion con BLyS marcado con His pero no por preincubacion con BLyS soluble.
El mantenimiento de celulas U397 y las preparaciones de membrana plasmatica se realizaron como se detalla en el Ejemplo 2.
ELISA de competicion
Se revistieron membranas plasmaticas de U937 (50 pl por pocillo) a 10 pg/ml en PBS sobre placas de 96 pocillos Falcon durante una noche a 4 °C.
Se inocularon colonias de E. coli individuales que conteman un fagemido que representaba uno de los scFv unicos del panel 3 en tubos de 50 ml (Falcon) que conteman 5 ml de medio 2TYAG. Los tubos se incubaron a 37°C durante 4 horas en agitacion. Se anadio fago auxiliar M13K07 a cada tubo a una MOI de 10 y los tubos se incubaron durante 1 hora adicional a 37°C. Los tubos se centrifugaron en una centnfuga de sobremesa a 3500 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se retiro y los sedimentos celulares se resuspendieron en 5 ml de 2TYAK y se incubaron a 30°C durante una noche en agitacion. Al dfa siguiente, los tubos se centrifugaron a 3500 rpm durante 10 min y el sobrenadante que contema fago se transfirio cuidadosamente a un tubo recien preparado.
Para cada anticuerpo de fago de ensayo, se transfirieron 3 almuotas de 20 pl de marvel 18%/PBS 6x a pocillos separados de una placa de 96 pocillos. La primera almuota se complemento con BLyS marcado con His a una concentracion final de 60 pg/ml. La segunda almuota se complemento con BLyS soluble a una concentracion final de 60 pg/ml. La tercera almuota no se complemento con ningun antfgeno de competicion. Despues, se anadieron cien pl de sobrenadante de fago a cada almuota y se dejaron en bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hora.
Las placas revestidas con antfgeno se lavaron una vez con PBS antes de la adicion de 200 pl/pocillo de marvel 3%/PBS. Estas placas se dejaron en bloqueo a 37°C durante 1 hora y despues se lavaron una vez con PBS. Se anadieron muestras por duplicado de 50 pl de fago prebloqueado (anteriormente) a las placas revestidas con antfgeno y se dejaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron 3x con PBS/Tween 20 0, 1%,
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despues 3x con PBS. Se anadieron cincuenta pl/pocillo de anticuerpo de raton anti-M13-HRP (Pharmacia) a 1/5000 en Marvel 3%/PBS y se dejaron 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con PBS/Tween 20 0, 1%, despues 3 veces con PBS. Se anadieron cincuenta pl/pocillo de polfmero Envision anti-raton marcado con HRP (DAKO) a 1/50 en marvel 3%/PBS y se dejaron 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con PBS/Tween 20 0,1%, despues 3 veces con PBS. A continuacion, se anadieron 50 pl/pocillo de TMB (Sigma) y se dejo que las placas se desarrollaran durante 30 a 60 minutos. Cuando se habfa desarrollado suficiente color, se anadieron 25 pl/pocillo de H2SO4 0,5 M para interrumpir la reaccion. Las placas se leyeron a 450 nm en un lector de placas de microtitulacion (Bio-Rad 3550).
Los resultados para 3 clones, I079B04, I079F08 y I080B01, y un anticuerpo de fago de control que reconoce TNFa se muestran en la Figura 13. Los 3 scFv reconocen membranas plasmaticas de U937 (U937).
Se competfa con esta union hasta los niveles de fondo (es decir, comparable a la senal observada con el anticuerpo de fago anti-TNFa) en presencia de BLyS marcado con His (HIS-BLyS) pero no BLyS biotinilado (bio-BLyS). Esto confirma que los scFv reconocen espedficamente la forma unida a membrana pero no la forma soluble de BLyS.
Ejemplo 17: Exploracion de BIAcore de alto rendimiento para identificar scFv de alta afinidad
Esta es una exploracion de 96 pocillos en la que las muestras de ensayo (scFv) proceden de 1 ml de extractos periplasmicos de clones que expresan anticuerpos individuales. Despues, los scFv potencialmente de mayor afinidad se identifican principalmente como aquellos que proporcionan un gran numero de UR totales unidas a una superficie de HIS-BLyS en BIAcore. Este procedimiento de clasificacion asume rendimientos aproximadamente equivalentes de scFv a partir de caracterizacion. Puesto que este no siempre es el caso, tambien pueden identificarse algunos scFv que simplemente expresen mayores niveles de scFv. Estos pueden discriminarse de los de mayor afinidad mediante una caracterizacion adicional de los scFv (vease el Ejemplo 18).
Preparacion de ScFv a partir de Cultivos de E. coli de 1 ml
Se inocularon colonias de E. coli individuales que conteman un fagemido que representaba uno de los scFv unicos del panel 3 en placas de 96 pocillos que conteman 100 pl de medio 2TYAG por pocillo. Se reservaron ocho pocillos en cada placa para muestras de control positivo y negativo. La placa se cultivo durante una noche a 30°C con agitacion a 120 rpm.
Al dfa siguiente, se anadio 1 ml de 2TYAG + sacarosa 345 mM a cada pocillo de una placa de 96 pocillos profundos autoclavada (Beckman). Se resuspendieron veinte pl de cada cultivo de una noche y se transfirieron al pocillo apropiado de la placa de pocillos profundos. La placa se cultivo durante aproximadamente 3,5 horas a 30°C con agitacion a 250 rpm (o hasta la D06oo = 0,6). Se anadieron 50 pl de IPTG I M a 5 ml de 2TY y se anadio 10 pl de esto a cada pocillo. La placa se cultivo durante una noche a 30°C con agitacion a 250 rpm.
Las placas se mantuvieron a 4 °C durante el resto del procedimiento. La placa de una noche (anterior) se centnfugo a 3500 rpm durante 10 minutos a 4°C para sedimentar las celulas. El sobrenadante se decanto y cada sedimento se resuspendio en 100 pl de TES (Tris hCi 0,2 M pH 8,0, EDTA 0,5 mM, sacarosa 0,5 M) y se transfirio a una placa de 96 pocillos recien preparada. Esta placa se incubo en hielo durante 30 minutos y despues se centnfugo durante 10 minutos a 3500 rpm a 4°C para sedimentar el residuo celular. Durante la centrifugacion, se anadieron 15 pl de coctel de inhibidores de proteasas recien preparado (Roche, 1 comprimido disuelto en 1,5 ml de agua) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos recien preparada. Los sobrenadantes de la placa centrifugada se transfirieron despues a la placa que contema los inhibidores de proteasas. La placa se centrifugo a 3500 rpm durante 10 minutos a 4 °C y el sobrenadante se transfirio a una placa de 96 pocillos adicional. Esta etapa se repitio al menos una vez mas o hasta que no habfa indicios de residuos celulares despues de la centrifugacion. Por ultimo, la placa se cubrio con papel de aluminio para evitar la evaporacion de las muestras durante el procesamiento en BIAcore.
Generacion de una superficie de HIS-BLyS de alta densidad
Todos los analisis de Biacore se realizaron en maquinas Biacore 2000 usando el software de control Biacore 2000 y se evaluaron usando el software BIAevaluation 3.0. Se preparo una superficie de BLyS marcado con His de alta densidad (>1000 UR de HIS-BLyS acoplado) en una celda de flujo 2 por acoplamiento con amina a una microplaca CM5. Se inserto una nueva microplaca CM5 en el BIAcore y se inicio un sensograma sobre la celda de flujo 2 con tampon HBS a un caudal de 5 pl/min. La solucion de NHS y EDC se mezclo 1:1 antes de inyectar 30 pl sobre la superficie de CM5. Se inyectaron cincuenta pl de HIS-BLyS (a 10 pg/ml en tampon acetato sodico, pH 4) y se dejo que se acoplaran a la superficie. Despues se inyectaron treinta pl de solucion de etanolamina-HCl para bloquear los esteres de NHS libres. Antes de usar la microplaca, se inyectaron 10 pl de clorhidrato de guanidina 4 M en HBS sobre la superficie para separar el BLyS no unido covalentemente de la superficie. Tambien se preparo una superficie en blanco (sin HIS-BLyS) sobre la celda de flujo 1 de modo que pueden restarse los efectos de la union inespedfica de las curvas de union a HIS-BLyS.
5
10
15
20
25
30
35
40
Analisis de BIAcore
La placa de 96 pocillos que contema scFv periplasmicos se fijo en el interior del BIAcore. Se pusieron 2 ml de clorhidrato de guanidina 4 M en HBS en una gradilla en el interior del BIAcore para la regeneracion de la superficie de HIS-BLyS entre muestras. El sensograma se proceso sobre las celdas de flujo 1 y 2 a un caudal de 20 pl/minuto. Se proceso el procedimiento siguiente:
PRINCIPAL
CELDA DE FLUJO 1, 2, 3, 4 ETAPA de ciclo de BUCLE APROG iny %pos BUCLE FINAL ADJUNTAR CONTINUAR FIN
DEFINIR ciclo de BUCLE LPARAM %pos
Rial
rlbl
ricl
ridl
riel
rifl etc. (todos los pocillos enumerados hasta r1h12)
FIN
DEFINIR APROG iny PARAM %pos FLUJO20
KINYECTAR %pos 35 30 !inyeccion
de scfv INYECCION RAPIdA r2f3 10 !regeneracion
EXTRALIMPIO
FIN
Cuando el procesamiento habfa terminado, se restaron los datos del sensograma para la celda de flujo 1 de los datos para la celda de flujo 2 para cada muestra usando el software BIAevaluation. Los clones se compararon entre si principalmente por el cambio de UR global a medida que el scFv se disocia de la superficie. Ademas se identificaron unos pocos scFv que teman velocidades de disociacion potencialmente mas lentas. Un ejemplo de la seccion de disociacion de un sensograma tfpico para 8 scFv se muestra en la Figura 14. Un anticuerpo anti-TNFOC que no reconoce el BLyS se incluyo como control. De los 8 scFv ejemplificados, el 1079F06 se identifico para un estudio adicional debido a las cantidades relativamente elevadas de Ur unidas a la superficie.
Los scFv se identificaron principalmente si demostraban un cambio de UR de mas de 1200, tambien se identificaron unos pocos que teman velocidades de disociacion potencialmente mas lentas que las tfpicas. Se seleccionaron un total de 28 clones basandose en estos criterios y se enumeran en la Tabla 7.
Tabla 7: Identificacion de 28 anticuerpos contra BLyS unido a membrana que demuestran los cambios de UR
mas significativos mediante BIAcore
Anticuerpo
Anticuerpo
I079C01
I084C04
I082H08
I080E05
I079E02
I083B12
I079B05
I082G01
I079F06
I082G02
I079F08
I082C03
I079F11
I082A05
I079B12
I082D07
I080B01
I082B08
I080G09
I084A01
I099D03
I084B02
Anticuerpo
Anticuerpo
I080D03
I080A08
I080A03
I084C11
I083G03
I080G07
5
10
15
20
25
30
Ejemplo 18: Determinaciones de la Afinidad de scFv
Se determino la afinidad (Kd) de los 28 scFv usando el BIAcore.
Superficie de HIS-BLyS de Baja Densidad para Estudios Cineticos
Se usaron superficies con 500 UR para estudios cineticos de la union de scFv purificado a HIS-BLyS. El procedimiento para preparar estas superficies era identico al procedimiento descrito en el Ejemplo 17, solo que se inyectaron volumenes mas pequenos de HIS-BLyS.
Medicion de la cinetica de union de scFv
La microplaca que contema la superficie de HIS-BLyS de baja densidad se inserto en el BIAcore. Una serie de diluciones para cada uno de los 28 scFv purificados (preparados como en el Ejemplo 6) se diluyeron en HBS (comenzando tipicamente con 50 pg/ml de scFv y duplicando la dilucion hasta 1,5 pg/ml). La serie de diluciones se inyecto despues secuencialmente sobre el control en blanco (celda de flujo I) y la superficie de HIS-BLyS de baja densidad (celda de flujo 2) usando el programa siguiente:
PRINCIPAL
CELDA DE FLUJO 1, 2, 3, 4
ADJUNTAR CONTINUAR FIN
APROG
genab rldl abl
APROG
genab rld2 ab2
APROG
genab rld3 ab3
APROG
genab rld4 ab4
APROG
genab rld5 ab5
APROG
genab rld6 ab6
DEFINIR APROG
genab
PARAM
%Abpos %Abld
FLUJO
20
K-INYECTAR
% Abpos 200 80
INYECTAR
r2f310
EXTRALIMPIO
FIN
Se eliminaron los scFv unidos por inyeccion de 10 pl de clorhidrato de guanidina 4 M en HBS (localizacion r2f3 en el programa anterior) sobre la superficie entre muestras. Las curvas de union para scFv individuales se analizaron usando el software BIAevaluation para determinar las velocidades de asociacion y disociacion de anticuerpos.
Un ejemplo tfpico de las curvas de union generadas para el anticuerpo scFv I082C03 se muestra en la Figura 15. La velocidad de disociacion para este clon se calculo como 2 x IO-3 s_1. La afinidad de I082C03 se calculo como 20 nM asumiendo una actividad de 100% del scFv. Los 5 scFv con las mayores afinidades como scFv se proporcionan en la Tabla 8.
Tabla 8: Identificacion de 5 anticuerpos contra BLyS unido a membrana que tienen las mayores afinidades
como scFv
Anticuerpo
Afinidad (Kd)
I079F11
5 nM
I079E02
10 nM
I082G02
6 nM
I082H08
1 nM
I099D03
4 nM
Ejemplo 19: Reconocimiento de BLyS unido a membrana de raton
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
unirse a la forma unida a membrana de BLyS en las membranas plasmaticas de la lmea celular murina P388, en presencia de diferentes formas de BLyS humano de competicion. El BLyS de competicion se presentaba como la forma marcada con His de BLyS o BLyS soluble. Los scFv que reconocen el BLyS unido a membrana de raton danan una senal de ELISA en las membranas plasmaticas de P388 con la que se competina por preincubacion con BLyS marcado con HIS pero no por preincubacion con BLyS soluble.
Mantenimiento de celulas P388.D1 y preparacion de membranas plasmaticas
Las celulas P388.D1 son una lmea celular de tipo monocito- macrofago de raton. Se cultivaron en medio L-15 complementado con L- glutamina 2 mM, CS 10%, penicilina 10 U, estreptomicina 100 g/ml (todos los reactivos de Sigma). Las celulas se dividieron 1:4 cada 3-4 dfas para mantener una densidad celular de 2-8 x IO5 por ml. Se descongelo una almuota fresca de celulas del nitrogeno lfquido cada 6 semanas. Se prepararon fracciones de membrana plasmatica como se describe en el Ejemplo 2.
ELISA de Competicion
Se revistieron membranas plasmaticas de P388 (50 pl por pocillo) a 10 pg/ml en PBS sobre placas de 96 pocillos Falcon durante una noche a 4°C. El procedimiento es esencialmente por lo demas como se describe en el Ejemplo 16.
Los resultados para 3 clones, I079E02, I082H08 y I099D03, se muestran en la Figura 16. Los 3 scFv reconocen membranas plasmaticas de P388. Se competfa con esta union en presencia de BLyS marcado con HIS (HIS-BLyS) pero no en presencia de BLyS biotinilado (bio-BLyS). Esto confirma que estos scFv tambien reconocen la forma unida a membrana pero no la forma soluble de BLyS de raton.
Ejemplo 20: Conversion de scFv a formato de IgGI
El dominio VH y los dominios VL de scFv que los inventores deseaban convertir en moleculas de IgG se clonaron en vectores que conteman las secuencias de nucleotidos de las regiones constantes de cadena pesada (IgGl humana) o cadena ligera (kappa humana o lambda humana) apropiadas, de modo que pudiera expresarse una molecula de cadena pesada o ligera completa a partir de estos vectores cuando se usasen para transfectar una celula hospedadora apropiada. Ademas, cuando ambas cadenas pesada y ligera clonadas se expresan en una lmea celular (a partir de uno cualquiera o de los dos vectores), pueden ensamblarse en una molecula de anticuerpo funcional completa que se secreta al medio de cultivo celular. Se conocen bien en la tecnica procedimientos para convertir scFv en moleculas de anticuerpo convencionales.
Generacion de lrneas celulares NSO que expresan anticuerpos anti-BLyS (IgGl)
Los plasmidos que conteman las cadenas pesadas y ligeras se linealizaron por separado usando la enzima de restriccion Pvu I. Los ADN linealizados se purificaron por extraccion con fenolcloroformo seguida de precipitacion con etanol y despues se resuspendieron en H2O. Las celulas NSO (107) de un cultivo en crecimiento se sometieron a electroporacion (0,25 kV y 975 pT) en PBS con 12,5 pg de ADN plasmfdico de cadena pesada linealizado y 37,5 pg de ADN de cadena ligera linealizado. Las celulas se lavaron en 20 ml de medio no selectivo (FCS 10% en DMEM complementado con glutamina 6 mM, aminoacidos y penicilina/estreptomicina) y despues se transfirieron a 12,5 ml de medio en un matraz T75 cm2 y se incubaron durante una noche a 37°C, CO2 5%/aire. El dfa despues de la transfeccion, las celulas se resuspendieron en medio selectivo que contema geneticina 1 mg/ml y se dispensaron en 5 x placas de 96 pocillos a 200 pl/pocillo. Despues de 18 dfas a 37°C (CO2 5%/aire) los sobrenadantes de colonias se exploraron mediante un ELISA que detecta la IgG humana ensamblada para identificar las colonias que expresan IgG. Aproximadamente veinte colonias positivas se expandieron y se adaptaron al cultivo en medio selectivo sin suero. Se prepararon matraces T25 cm2 por duplicado. Las celulas de un matraz se congelaron como reserva y las celulas en el segundo matraz se cultivaron hasta la saturacion. La productividad de las celulas saturadas se evaluo mediante ELISA. Las lrneas celulares de mayor produccion se seleccionaron despues para la produccion de anticuerpo a gran escala.
El procedimiento anterior se ejemplifica para las construcciones de anticuerpo anti-BLyS I006D08. Despues de la electroporacion y de la seleccion de celulas NSO, se exploraron los sobrenadantes de noventa y tres pocillos que conteman cada uno una sola colonia mediante ELISA para detectar el anticuerpo IgGl ensamblado. Se identifico que veintisiete de los sobrenadantes conteman IgG. Las colonias de 24 de los pocillos positivos se transfirieron a 1 ml de medio selectivo en una placa de 24 pocillos y se dejaron crecer durante 2 dfas. Los cultivos de celulas de 1 ml se anadieron despues a 4 ml de medio selectivo que contema suero reducido (FCS 0,5%) en un matraz T25 cm2. Cuando los cultivos alcanzaron la confluencia, se diluyo 1 ml de celulas en 4 ml de medio selectivo sin suero en un matraz T25 cm2. Al alcanzarse la confluencia, este regimen de subcultivo se repitio de nuevo. Por ultimo, 1 ml de celulas del cultivo que contema FCS 0,1% se diluyo con 9 ml de medio selectivo sin suero y se dividio en 2 x T25 cm2 para formar los cultivos saturado y de reserva. Los cultivos de reserva se congelaron y se almacenaron en nitrogeno lfquido una vez que los cultivos eran confluentes. El cultivo de saturacion se dejo crecer hasta que la viabilidad del cultivo era <10%. Veintitres de las 24 colonias originariamente expandidas se adaptaron con exito al crecimiento en medio sin suero. La productividad de estas lrneas celulares adaptadas sin suero variaba de 0,3 a 17 pg/ml por cuantificacion mediante ELISA de los cultivos sin suero de 5 ml saturados. La lmea celular 1006D08-32
produda 17 |jg/ml.
Produccion de IgG a gran escala
Las lmeas celulares de mayor produccion se revivieron a partir de reservas congeladas y despues se expandieron hasta 400 ml en medio selectivo sin suero en frascos rotatorios de 2 litros. Las celulas se cultivaron a 37°C y se 5 hicieron girar a 4 rpm, reequilibrandose el espacio de cabeza con CO2 5%/aire cada 2-3 dfas. Por ultimo, el cultivo se expandio hasta un volumen de 4 litros por adicion de medio sin suero sin seleccion (400 ml por frasco rotatorio de 2 litros). Despues los cultivos se dejaron crecer hasta la saturacion.
Este procedimiento se ejemplifica por la produccion de anticuerpo I006D08 a partir de la lmea celular I006D08-32. La reserva congelada de I006D08-32 se revivio en un T25 cm2 que contema 5 ml de medio sin suero que contema 10 geneticina 1 mg/ml y se cultivo a 37°C en una incubadora de CO2 5%/aire. Despues de dos dfas de crecimiento, el cultivo se diluyo con 7,5 ml de medio recien preparado y se transfirio a un matraz T75 cm2. Despues de tres dfas adicionales en la incubadora, las celulas se transfirieron a 130 ml de medio selectivo y se transfirieron a un frasco rotatorio de 2 litros. Despues de tres dfas de crecimiento, las celulas se diluyeron con 500 ml de medio selectivo y se dividieron en 2x frascos rotatorios de 2 litros. Despues de otros 2 dfas, se anadieron 100 ml de medio selectivo 15 recien preparado a cada frasco rotatorio. Por ultimo, al dfa siguiente, el cultivo se expandio hasta un volumen total de 4 litros con medio no selectivo y se dividio en IOx frascos rotatorios de 2 litros. Despues de tres dfas, el medio se complemento con glutamina 6 mM. Las celulas se cultivaron durante 17 dfas a partir del subcultivo final en un volumen de 4 litros. Las celulas crecieron hasta 3 x IO6 celulas/ml antes de que la viabilidad disminuyera hasta <0,2 x IO6 celulas/ml. A esta baja viabilidad, se recogieron los sobrenadantes de cultivo. El analisis de ELISA indicaba 20 que el sobrenadante de cultivo contema 33 jg/ml de IgG. Por lo tanto, el cultivo de 4 litros contema 132 mg de IgG.
Purificacion de IgG
La purificacion de la IgG a partir del caldo de fermentacion se realiza usando una combinacion de tecnicas convencionales comunmente usadas para la produccion de anticuerpos. Tfpicamente, el cultivo recogido se aclara para eliminar las celulas y los residuos celulares antes de comenzar con el programa de purificacion. Esto se 25 conseguina normalmente usando centrifugacion o filtracion de lo recogido. Despues del aclarado, el anticuerpo
tfpicamente se capturana y se purificana significativamente usando cromatograffa de afinidad en Protema A Sepharose. El anticuerpo se une a Protema A Sepharose a pH basico y, despues del lavado de la matriz, se eluye por reduccion del pH. Despues se consigue una purificacion adicional del anticuerpo por filtracion en gel. Ademas de eliminar los componentes con pesos moleculares diferentes a los del anticuerpo, esta etapa tambien puede usarse 30 para cambiar el tampon al tampon de formulacion final deseado.
Purificacion de IgGl de I006D08
El cultivo recogido se aclaro por filtracion secuencial a traves de filtros de 0,5 jni y 0,22 jni. El cultivo recogido aclarado se aplico despues a una columna de Protema A recombinante Sepharose equilibrada a pH 8,0 y se lavo con el tampon de equilibrado. El anticuerpo I006D08 se eluyo de la Protema A Sepharose por aplicacion de un 35 tampon a pH 3,5. El eluido que contema anticuerpo recogido se neutralizo despues a pH 7,4 por adicion de tampon a pH 8,0. El eluido neutralizado se concentro por ultrafiltracion usando una membrana de punto de corte de 30 KDa. El material concentrado se purifico despues mediante filtracion en gel Sephacryl S300HR usando solucion salina tamponada con fosfato como fase movil. La fraccion de IgGl monomerica final de la columna de filtracion en gel se concentro despues a la concentracion de formulacion deseada por ultrafiltracion usando una membrana de punto de 40 corte de 30 KDa. El producto final se filtro a traves de un filtro de 0,22 jni.
Ejemplo 21: Neutralizacion por anticuerpo de la proNferacion de esplenocitos murinos segun se mide por incorporacion de 3HdT
Para determinar si un anticuerpo inhida la proliferacion de linfocitos B mediada por BLyS se realizo un ensayo de proliferacion de esplenocitos. En resumen, se aislaron esplenocitos murinos lavando abundantemente el bazo con 45 medio completo usando una aguja de 25 g y 10 ml de medio completo (RPMI 1640 con FBS 10% que contema penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 jg/ml, glutamina 4 mM, 13-mercaptoetanol 5 X IO-5 M). Las celulas se pasaron a traves de un filtro de nylon de 100 micrometros para eliminar los agregados de celulas. La suspension celular se trato despues con Ficol a 400 x g durante 25 minutos a temperatura ambiente (un tubo conico de 15 ml/bazo; 3 ml de Ficol, 10 ml de suspension celular/bazo; Ficol 1083 de Sigma). Las celulas recuperadas se lavaron 50 3 veces en medio completo y se contaron. Despues, las celulas recuperadas se diluyeron a una concentracion de 3
X IOfVml en medio completo que contema una concentracion 3X de SAC (3X = dilucion 1:33.333 de solucion madre) (Staph, aureus cepa Cowan; Calbiochem).
Para cada anticuerpo, 50 microlitros de diluciones de anticuerpo a concentraciones de 30 jg/ml, 3,0 jg/ml y 0,3 jg/ml se dividieron en almuotas en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos por triplicado. Tambien se 55 usaron controles positivos adecuados, tales como, por ejemplo, anticuerpo monoclonal 15C10. Se uso medio que no contema anticuerpo (y controles de isotipo humano (adquiridos en el mercado) cuando era necesario) como controles negativos.
5
10
15
20
25
30
La protema BLyS se diluyo en medio completo a concentraciones de 300 ng/ml, 90 ng/ml y 30 ng/ml. Despues, se anadieron 50 microlitros de cada una de las diluciones de BLyS a la serie de diluciones de anticuerpo en las placas. La placa que contema el anticuerpo y las diluciones de BLyS se incubo despues durante 30 minutos a 37°C, CO2 5%, despues de lo cual se anadieron 50 microlitros de la suspension celular de esplenocitos que contema SAC a todos los pocillos. Las placas se incubaron despues durante 72 horas (37°C, CO2 5%).
Despues de 72 horas, cada pocillo se complemento con 50 pl de medio completo que contema 0,5 pl de 3H-timidina (6,7 Ci/mM; Amersham) y las celulas se incubaron durante 20-24 horas adicionales a (37°C, CO2 5%). Despues de la incubacion, las celulas se recogieron usando un Recolector de Celulas Tomtec y los filtros se contaron en un contador de centelleo TopCount (Packard).
Ejemplo 22: Ensayo de proliferacion de linfocitos B humanas para exploracion in vitro de moleculas antagonistas de BLyS
El bioensayo para evaluar los efectos de supuestos antagonistas de BLyS se realizo por triplicado en un formato de 96 pocillos mezclando volumenes equivalentes de BLyS, celulas respondedoras y supuesto antagonista, cada uno de los cuales se prepara como solucion madre de reactivo 3X.
Se purificaron linfocitos B a partir de amygdala humana por MACS (reduccion anti-CD3), se lavaron y se resuspendieron en medio completo (CM) (RPMI 1640 con FBS 10% que contema penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 glutamina 4 mM, beta-mercaptoetanol 5 x IOE-5 M) a una concentracion de 3 x 10e6 celulas/ml. Se anadio Staphylococcus aureus, Cowan I (SAC, CalBiochem) a las celulas a una concentracion 3X (3X = dilucion 1:33.333 de solucion madre).
Mientras tanto, se prepararon ocho diluciones en serie (3 veces) de antagonista potencial en CM de modo que los antagonistas diluidos estaban a 3X las concentraciones finales a ensayar en el ensayo. Los anticuerpos se ensayaron de forma rutinaria partiendo de una concentracion final de 10 pg/ml y disminuyendo hasta aproximadamente 1,5 ng/ml.
Se preparo rBLyS humano en CM a una concentracion 3X (3X = 300 ng/ml, 30 ng/ml y 3 ng/ml) en CM. Los inhibidores potenciales se ensayaron de forma rutinaria a varias concentraciones de BLyS para evitar falsos negativos debidos a una inesperadamente baja afinidad o concentracion de antagonista.
Se anadieron cincuenta microlitros de antagonista diluido y 50 pl de BLyS diluido a la serie de diluciones del supuesto antagonista.
Despues, las celulas se incubaron durante 72 horas (37 °C, CO2 5%) en una camara totalmente humidificada. Despues de 72 h, las celulas se complementaron con 0,5 pCi/pocillo de 3H-timidina (6,7 Ci/mmol) y se incubaron durante 24 horas adicionales. Las placas se recogieron usando un Recolector de Celulas Tomtec y los filtros se contaron en un contador de centelleo TopCount (Packard).

Claims (38)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    1. Un anticuerpo humano o humanizado que neutraliza se une a la Protema Estimuladora de Linfocitos B o un fragmento funcional del mismo, en el que dicho anticuerpo es
    (a) un anticuerpo humano o humanizado que se une a la Protema Estimuladora de Linfocitos B, en el que el anticuerpo comprende los restos de aminoacidos 26-35, 50-66, 99-112, 163-173, 189-195 y 228-238 de la SEQ ID NO: 2;
    (b) un anticuerpo monoclonal humano o humanizado que inhibe competitivamente la union del anticuerpo producido por la lmea celular que tiene el Numero de Deposito ATCC pTA-3239 a la Protema Estimuladora de Linfocitos B; o
    (c) un anticuerpo monoclonal humano o humanizado que reduce la union del anticuerpo producido por la lmea celular que tiene el Numero de Deposito ATCC PTA-3239 a la Protema Estimuladora de Linfocitos B mediante un aumento dentro de un intervalo en porcentaje seleccionado del grupo que consiste en:
    (a) del 50 % hasta el 60 %;
    (b) del 60 % hasta el 70 %;
    (c) del 70 % hasta el 80 %;
    (d) del 80 % hasta el 90 %; y
    (e) del 90 % hasta el 100 %.
  2. 2. El anticuerpo de la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 95 % identica a los restos de aminoacido 1-123 y 141-249 de la SeQ ID NO:2.
  3. 3. El anticuerpo de la reivindicacion 1 o 2, en el que el anticuerpo comprende los restos de aminoacido 1-123 de la SEQ ID NO:2.
  4. 4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo comprende los restos de aminoacido 141-249 de la SEQ ID NO:2.
  5. 5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo comprende los restos de aminoacido 1-123 y 141-249 de la SEQ ID NO:2.
  6. 6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que se purifica a partir de la lmea celular contenida en el Numero de Deposito ATCC PTA-3239.
  7. 7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo se une a la forma soluble de la Protema Estimuladora de Linfocitos B.
  8. 8. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la Protema Estimuladora de Linfocitos B:
    (a) comprende los restos de aminoacidos 1-285 de la SEQ ID NO: 3228;
    (b) comprende los restos de aminoacidos 134-285 de la SEQ ID NO: 3228; o
    (c) comprende un trimero de los restos de aminoacidos 134-285 de la SEQ ID NO: 3228.
  9. 9. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la Protema Estimuladora de Linfocitos B es un homotnmero.
  10. 10. El anticuerpo de la reivindicacion 9, en el que el homotnmero de la Protema Estimuladora de Linfocitos B consiste en la forma madura de la Protema Estimuladora de Linfocitos B.
  11. 11. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, en el que el anticuerpo tiene una constante de disociacion (KD) seleccionada del grupo que consistente en:
    (a) una constante de disociacion (KD) entre 10-7 M y 10-8 M;
    (b) una constante de disociacion (KD) entre 10-8 M y 10-9 M;
    (c) una constante de disociacion (KD) entre 10-9 M y 10'1° M;
    (d) una constante de disociacion (KD) entre 10-10 M y 10-11 M;
    (e) una constante de disociacion (KD) entre 10-11 M y 10-12 M; y
    (f) una constante de disociacion (KD) entre 10-12 M y 10-13 M.
  12. 12. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:
    (a) una molecula de inmunoglobulina completa;
    (b) un scFv;
    (c) un anticuerpo monoclonal;
    (d) un anticuerpo quimerico;
    (e) un fragmento Fab;
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    (f) un fragmento Fab';
    (g) un F (ab') 2;
    (h) un Fv; y
    (i) un Fv unido por enlace disulfuro.
  13. 13. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que tambien comprende un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en:
    (a) un dominio constante de IgM humana;
    (b) un dominio constante de IgG1 humana;
    (c) un dominio constante de IgG2 humana;
    (d) un dominio constante de lgG3 humana;
    (e) un dominio constante de lgG4 humana; y
    (f) un dominio constante de IgA humana.
  14. 14. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que tambien comprende un dominio constante de inmunoglobulina de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en:
    (a) un dominio constante kappa de Ig humana;
    (b) un dominio constante lambda de Ig humana.
  15. 15. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que disminuye o suprime la capacidad de la Protema Estimuladora de Linfocitos B o un fragmento funcional de la misma para unirse a su receptor.
  16. 16. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que disminuye o suprime la capacidad de la Protema Estimuladora de Linfocitos B o un fragmento funcional de la misma para estimular la proliferacion de linfocitos B.
  17. 17. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que disminuye o suprime la capacidad de la Protema Estimuladora de Linfocitos B o un fragmento funcional de la misma para estimular la secrecion de inmunoglobulina por los linfocitos B.
  18. 18. El anticuerpo de la reivindicacion 15, en el que el receptor es TACI o BCMA.
  19. 19. Una molecula de acido nucleico que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.
  20. 20. Un vector que comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 19.
  21. 21. El vector de la reivindicacion 20 que tambien comprende una secuencia de nucleotidos que regula la expresion del anticuerpo codificado por la molecula de acido nucleico.
  22. 22. Una celula hospedadora que comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 19 o el vector de la reivindicacion 20 o 21.
  23. 23. Un procedimiento de produccion de un anticuerpo que se une a la Protema Estimuladora de Linfocitos B, que comprende cultivar la celula hospedadora de la reivindicacion 22 en condiciones en las que se expresa dicha molecula de acido nucleico.
  24. 24. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que el anticuerpo se produce por la celula hospedadora de la reivindicacion 22.
  25. 25. Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1a 18 y 24.
  26. 26. Una lmea celular modificada por ingeniena genetica para que exprese el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 24.
  27. 27. Uso del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 24 para la preparacion de una composicion farmaceutica para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno del sistema inmune.
  28. 28. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 24 para su uso en el tratamiento, prevencion o mejona de una enfermedad o trastorno del sistema inmune.
  29. 29. El uso de la reivindicacion 27 o el anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicacion 28, en el que la enfermedad o trastorno del sistema inmune es una enfermedad o trastorno autoinmune.
  30. 30. El uso o el anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicacion 29, en el que la enfermedad o trastorno del sistema inmune es una enfermedad o trastorno autoinmune seleccionado del grupo que consiste en:
    (a) Lupus Eritematoso Sistemico;
    (b) Artritis Reumatoide;
    (c) Esclerosis Multiple;
    (d) Purpura Trombocitopenica Idiopatica;
    (e) Smdrome de Sjogren;
    5 (f) Diabetes; y
    (g) Vasculitis.
  31. 31. El uso de la reivindicacion 27 o el anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicacion 28, en el que la enfermedad o el trastorno del sistema inmune es SlDA.
  32. 32. Uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 24 para la preparacion de una composicion farmaceutica 10 para tratar, prevenir o aliviar el rechazo de injerto o de trasplante.
  33. 33. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 24 para su uso en el tratamiento, la prevencion o la mejora del rechazo de injerto o de trasplante.
  34. 34. Uso del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 24 para la preparacion de una composicion farmaceutica para tratar, prevenir o mejorar el cancer.
    15 35. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 24 para su uso en el tratamiento, prevencion o
    mejora del cancer.
  35. 36. El uso de la reivindicacion 34 o del anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicacion 35, en el que el cancer se selecciona del grupo que consiste en:
    (a) macroglobulinemia de Waldenstrom;
    20 (b) leucemia linfocftica aguda;
    (c) leucemia linfocftica cronica;
    (d) linfoma no Hodgkin; y
    (e) mieloma multiple.
    D06EG7 B08D05 D16F04
    J2
    CD
    Absorbancia (450 nM)
    O KS
    O Uyi i—' tyi ki ^
    imagen1
    I
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    □ □ ffil [3
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    > CO
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    &T s
    Vi
    14000
    imagen2
    FIG. 2
    Inhibition de la union de BLyS biotinilada a su receptor por anticuerpos de fago
    bio-BLyS solo Sin bio-BLyS J016H07 1QO1C09 I01BD&7 irrelevante
    Absorbancia (450 nM)
    3,5
    imagen3
    3
  36. 2.5 2
    1.5 1
    0,5
    imagen4
    0 BLyS
    1 BLyS Murina
    □ TNF alfa
    □ TNF beta ■ TRAIL El FasL
    S3 PBS
    I022D01
    1031F02
    FIG. 3
    OD 450 jiM
    Anticuerpo unido a membranas plasmaticas U937
    imagen5
    □ Competicion con BLyS
    IS Competicion con TNFa
    1031F09 I050AI2
    I051C04
    FIG. 4
    Tiempo
    Respuesta
    imagen6
    13 OJ
    CO
    ro
    CJl
    o
    CZ:
    FIG. 5
    272
    FIG. 6
    imagen7
    iBLyS VI007F11 *I050A07 5 Irrelevante
    ro
    co
    imagen8
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    5 T
    B75F12
    D75A02
    D74B12 anii-TNF alpha
    □ INF alfa DBS A ■ PBS
    FIG. 7
    Dio-BLyS solo Sin bio-BLyS bzsidd jozaco4 . Irrelevgnte
    imagen9
    2
    ro
    cn
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    I
    1.3
    1,6
    1.4
    1,2
    1
    0,3
    0,6.
    0,4
    0,2
    imagen11
    mmm
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    'Va
    E BLyS humana I B TNF alfa
    □ LIGERA
    □ TRAIL
    B TFN beta 0 BLyS de raton m PBS
    1067F05 ID78D02 anti-TNF alfa
    FIG. 9
    Tiempo
    era
    8
    CP
    Q
    ro
    CP
    o
    era
    era
    era
    C
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    8
    era
    Respuesta
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    imagen12
    ?o
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    CD
    O
    O
    FIG. 10
    277
    FIG. 11
    Scfvs para BLyS soluble solamente
    imagen13
    ® Irrelevante
    * I068C06
    ♦ I074B12
    • BLyS
    Log IM
    (mnost) QO
    3
  37. 2.5 2
    1.5 1
    0,5
    0
    imagen14
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    MIS
    Ml
    BHB-BLjS SJ (J937
    □ Bio-BLyS
    □ PBS
    D79C01 1081C10
    1082A02
    anti-TNF alfa
    FIG. 12
    ro
    CD
    imagen15
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    o 0 6
    tn
    ~"r
    U79B04
    D79F08
    1080B01
    anti-TNF alfa
    Antiqeno
    competitivo
    □ IRS TBlyS 1 BLyS O Ninguno
    FIG. 13
    Respuesta (RU)
    FIG. 14
    imagen16
    -----JU79A06
    -----JD79B06
    -----IU79C06
    -----I0-79D06
    -----K179E06
    -----1079F06
    -----K)79G-Q$
    -----I079HOG
    -----Ac anti-TNF
    2jOQ
    130
    160
    140
    1.30
    100
    SO'
    60
    40
    20
    O'
    FIG, 15
    Sensograma I082C03
    imagen17
    Concentracion
    deSCFV
    —- 50ug/ini | —25ug/ml 13ug/ml
    — 6ijgfmt —3ug/ml
    — 1,5ug/ini
    OD (450nm)
    ELISA de Competicion P388
    1,4
    1,2
    1
    0,8
  38. 0.6
    0,4
    0,2
    imagen18
    HhHm
    jssassife'
    'mmm
    Its p;t
    4W> ^
    Antigeno
    competitive
    iHis-BLyS IBLyS □ Ninguno
    D79E02
    I082R08
    1J99D03
    FIG. 16
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