ES2605014T3 - Agentes de unión a CD33 - Google Patents

Abstract

Un agente de unión a CD33 que se une al CD33 humano, siendo el agente de unión a CD33 un anticuerpo o un derivado de un anticuerpo, definido por unirse específicamente a un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos FFHPIPYYDKNSPVHGYW (SeqID No: 141) de CD33 humano.

Description

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Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino-y/o carboxilo-terminales que varían en longitud desde un resto a polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de uno solo o de múltiples restos aminoacídicos. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un resto metionilo N-terminal, o el anticuerpo condensado con un polipéptido citotóxico.

Otro tipo de anticuerpo es un variante de sustitución de aminoácidos de un anticuerpo. Estos variantes tienen al menos un resto aminoácido en la molécula del anticuerpo reemplazado por un resto diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones en la región de marco.

Unas modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo pueden conseguirse mediante la selección de sustituciones que difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento (a) de la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo, como una lámina o conformación helicoidal, (b) de la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) del volumen de la cadena lateral. Los restos naturales se dividen en grupos basándose en propiedades comunes de las cadenas laterales:

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hidrófoba: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

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hidrófila neutra: cys, ser, thr;

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ácida: asp, glu;

(4)

básica: asn, gln, his, lys, arg;

(5)

restos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6)

aromática: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas incluirán cambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

Resulta deseable modificar el anticuerpo con respecto a la función efectora, por ejemplo para potenciar la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. En particular, la actividad ADCC puede potenciarse introduciendo mutaciones de aminoácidos en la región constante del anticuerpo (Lazar et al., PNAS, 103, 11, 4005-4010, 2006). Esto puede lograrse introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo; véase, por ejemplo, la solicitud de patente de EEUU publicada nº 2006-0160996. Como alternativa, o además, puede introducirse uno o más restos cisteína en la región Fc, permitiendo con ello la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede tener una mejor capacidad de internalización y/o una mayor CDC y ADCC (véase, por ejemplo, Caron et al., 1992, J. Exp. Med., 176:1191-1195; y Shopes, 1992, J. Immunol., 148:2918-2922.) Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral potenciada pueden también prepararse usando conectores cruzados heterobifuncionales, tal como se describe en Wolff et al., 1993, Cancer Research 53:2560-2565. Como alternativa, un anticuerpo puede modificarse para tener regiones Fc duales y, con ello, puede tener unas capacidades mejoradas de lisis del complemento y de ADCC (véase, por ejemplo, Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230).

En la técnica se ha sugerido una diversidad de modificaciones de la región Fc, tanto en la bibliografía científica como en documentos de patentes, por ejemplo, en los documentos EP 0307434, WO 9304173, WO 9734631, WO 9744362, WO 9805787, WO 9943713, WO 9951642, WO 9958572, WO 02060919, WO 03074679, WO 2004016750, WO 2004029207, WO 2004063351, WO 2004074455, WO 2004035752, WO 2004099249, WO 2005077981, WO 2005092925, WO 2006019447, WO 2006031994, WO 2006047350, WO 2006053301, WO 2006088494 y WO 2007041635.

En realizaciones preferidas, los anticuerpos de la invención son variantes de Fc con sustituciones de aminoácidos en las posiciones 332 y/o 239 y/o 236. En realizaciones preferidas, los anticuerpos de la invención tienen mutaciones en el dominio Fc seleccionadas del grupo de:

i) una única sustitución en la posición 332, preferiblemente I332E;

ii) una combinación de sustituciones en las posiciones 239 y 332, preferiblemente S239D/I332E;

iii) una combinación de sustituciones en las posiciones 236 y 332, preferiblemente G236A/I332E;

iv) una combinación de sustituciones en las posiciones 236, 239 y 332, preferiblemente G236A/S239D/I332E;

En este contexto, resulta particulamente preferido introducir mutaciones en el dominio Fc en una o más posiciones seleccionadas de los aminoácidos en las posiciones 332 y/o 239 y/o 236, según el índice de numeración de EU de Kabat. Se prefieren en particular las sustituciones en las posiciones 239 y 332, en especial S239D/I332E.

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Los variantes de Fc en los anticuerpos de la presente invención se definen según las modificaciones de los aminoácidos que los componen. Así, por ejemplo, I332E es un variante de Fc con la sustitución I332E con relación al polipéptido de Fc de origen. De forma similar, S239D/I332E define un variante de Fc con las sustituciones S239D y I332E, y S239D/I332E/G236A define un variante de Fc con las sustituciones S239D, I332E, y G236A con relación al polipéptido de Fc de origen.

Para aumentar la semivida sérica del anticuerpo se puede incorporar un epitopo de unión al receptor de reciclaje en el anticuerpo (en especial un fragmento de anticuerpo), según se describe, por ejemplo, en la patente de EEUU nº

5.739.277. Tal como se emplea en la presente, la expresión "epítopo de unión al receptor de reciclaje" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de aumentar la semivida sérica in vivo de la molécula de IgG.

Los anticuerpos pueden estar glicosilados en posiciones conservadas en sus regiones constantes (véase, por ejemplo, Jefferis y Lund, 1997, Chem. Immunol., 65:111-128; Wright y Morrison, 1997, TibTECH, 15:26-32). Las cadenas laterales de oligosacáridos de las inmunoglobulinas pueden afectar a la función de la proteína (véase, por ejemplo, Boyd et al., 1996, MoI. Immunol., 32:1311 -1318; Wittwe y Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180), y a la interacción intramolecular entre porciones de la glicoproteína que puede afectar a la conformación y a la superficie tridimensional presentada de la glicoproteína (véase, por ejemplo, Jefferis y Lund, supra; Wyss y Wagner, 1996, Current Opin. Biotech., 7:409-416). Los oligosacáridos también puede actuar para dirigir una glicoproteína concreta a ciertas moléculas basándose en sus estructuras de reconocimiento específicas. Por ejemplo, se ha indicado que en una IgG galactosilada, el resto oligosacárido 'se voltea' hacia fuera del espacio inter-CH2, y los restos Nacetilglucosamina terminales quedan disponibles para unirse a la proteína de unión a manosa (véase, por ejemplo, Malhotra et al., 1995, Nature Med., 1 :237-243). La eliminación mediante una glicopeptidasa de los oligosacáridos de CAMPATH-1H (un anticuerpo monoclonal IgG1 murino humanizado recombinante que reconoce el antígeno CDw52 de los linfocitos humanos) producida en células de ovario de hámster chino (CHO) produce una reducción completa de la lisis mediada por el complemento (CMCL o CDC) (Boyd et al., 1996, MoI. Immunol., 32:131, 1-1318), mientras que la eliminación selectiva de los restos ácido siálico utilizando neuraminidasa no produce pérdida de CMCL. También se ha indicado que la glicosilación de anticuerpos afecta a la ADCC. En particular, se ha indicado que las células CHO con expresión regulada por tetraciclina de β(1.4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una glicosiltransferasa que cataliza la formación de GIcNAc bisectado, tienen una mejor actividad ADCC (véase, por ejemplo, Umana et al., 1999, Nature Biotech., 17:176-180).

La glicosilación de los anticuerpos generalmente es una N-glicosilación o una O-glicosilación. La N-glicosilación se refiere a la unión del resto carbohidrato a la cadena lateral de un resto asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto carbohidrato a la cadena lateral de la asparagina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La O-glicosilación se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, de modo más habitual serina o treonina, aunque también puede usarse 5hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

Los variantes de glicosilación de los anticuerpos son variantes en los que el patrón de glicosilación del anticuerpo está alterado. La alteración significa delecionar uno o más restos carbohidrato del anticuerpo, añadir uno o más restos carbohidrato al anticuerpo, cambiar la composición de la glicosilación (es decir, el patrón de glicosilación), el grado de la glicosilación, o similares.

La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra de modo conveniente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para los sitios de N-glicosilación). La alteración también puede realizarse mediante la adición o la sustitución de uno o más restos serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de O-glicosilación). De manera similar, la eliminación de sitios de glicosilación puede lograrse mediante la alteración de aminoácidos dentro de los sitios de glicosilación nativos del anticuerpo.

La secuencia de aminoácidos se altera habitualmente alterando la secuencia del ácido nucleico subyacente. Estos métodos incluyen, aunque no se limitan al aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos naturales) o la preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), una mutagénesis de PCR, o una mutagénesis de módulos de un variante preparado anteriormente o una versión no variante del anticuerpo.

La glicosilación (incluyendo el patrón de glicosilación) de los anticuerpos también puede alterarse sin alterar la secuencia de aminoácidos o la secuencia de nucleótidos subyacente. La glicosilación depende en gran medida de la célula hospedante utilizada para expresar el anticuerpo. Puesto que el tipo de célula utilizado para la expresión de glicoproteínas recombinantes, por ejemplo anticuerpos, como producto terapéutico potencial en muy pocas ocasiones es la célula nativa, pueden esperarse variaciones significativas en el patrón de glicosilación de los anticuerpos (véase, por ejemplo, Hse el al., 1997, Biol. Chem., 272:9062-9070.) Además de la elección de las células hospedantes, otros factores que afectan a la glicosilación durante la producción recombinante de anticuerpos incluyen el modo de crecimiento, la formulación del medio, la densidad del cultivo, la oxigenación, el pH, los

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programas de purificación, y similares. Se han propuestos diversos métodos para alterar el patrón de glicosilación que se obtiene en un organismo hospedante concreto, que incluyen introducir o sobreexpresar ciertas enzimas implicadas en la producción de oligosacáridos (véanse, por ejemplo, las patentes de EEUU nº 5.047.335; 5.510.261; y 5.278.299). La glicosilación, o ciertos tipos de glicosilación, puede eliminarse de forma enzimática de la glicoproteína, por ejemplo utilizando una endoglicosidasa H (Endo H). Además, la célula hospedante recombinante puede modificarse genéticamente, por ejemplo, hacer que sea defectuosa para procesar ciertos tipos de polisacáridos. Estas técnicas y otras similares son muy conocidas en la técnica.

La estructura de glicosilación de los anticuerpos puede analizarse con facilidad mediante técnicas convencionales de análisis de carbohidratos, incluyendo una cromatografía de lectina, RMN, espectrometría de masas, HPLC, GPC, análisis de la composición de monosacáridos, digestión enzimática secuencial, y HPAEC-PAD, que emplea una cromatografía de intercambio aniónico a pH alto para separar oligosacáridos basándose en la carga. También se conocen métodos para liberar los oligosacáridos para objetivos analíticos e incluyen, sin limitación, un tratamiento enzimático (realizado de modo habitual empleando péptido-N-glicosidasa F/endo-β-galactosidasa), la eliminación utilizando un entorno alcalino severo para liberar principalmente estructuras O-enlazadas, y métodos químicos que emplean la hidrazina anhidra para liberar los oligosacáridos N-y O-enlazados.

Los anticuerpos también pueden tener modificaciones (por ejemplo, sustituciones, deleciones o adiciones) en restos aminoácidos que interaccionan con receptores Fc. En particular, los anticuerpos pueden tener modificaciones en los restos aminoácidos identificados por su implicación en la interacción entre el dominio anti-Fc y el receptor FcRn (véase, por ejemplo, la publicación internacional nº WO 97/34631).

En su aspecto más amplio, la presente invención se refiere a agentes de unión a CD33 que se unen al CD33 humano, y que se definen porque:

a) tienen una región variable de cadena pesada que comprende CDR1, CDR2 y CDR3, y una región variable de cadena ligera que comprende CDR4, CDR5 y CDR6, en los que CDR1 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:1-14, CDR2 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:15-28, CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:29-42, CDR4 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:43-56, CDR5 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:57-70, CDR6 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:71-84, o

b) reconocen un epitopo dentro de la secuencia de aminoácidos FFHPIPYYDKNSPVHGYW (SEQ ID NO:141) del CD33 humano.

La presente invención proporciona además agentes de unión a CD33, en los que la cinética de internalización de los agentes de unión a CD33 es tal que al menos 30% de la cantidad inicial del anticuerpo permanece sobre la superficie celular de células HL60 a las 4 horas después de la incubación.

Se ha descubierto que los agentes de unión a CD33 según la presente invención se unen a un epitopo diferente que el del lintuzumab (véase el ejemplo 4 en la presente). Ambos epitopos (SEQ ID NO:141 y SEQ ID NO:142) no se solapan. Se cree que los diferentes epitopos sobre el dominio extracelular del CD33, que son reconocidos por los agentes de unión a CD33 según la presente invención y por el lintuzumab, son la razón del distinto comportamiento de internalización y actuación de ADCC de los agentes de unión a CD33 según la presente invención y el lintuzumab (cf. los ejemplos 2 y 3 en la presente).

En una realización preferida, al menos 40% de la cantidad inicial de los agentes de unión a CD33 permanecen sobre la superficie celular a las 4 horas después de la incubación.

En una realización preferida, la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:85-98, y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:99-112.

En una realización preferida, el agente de unión a CD33 tiene una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:113-126, y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:127-140.

En una realización preferida, el agente de unión a CD33 tiene una afinidad por el CD33 humano y por el CD33 del macaco cangrejero con una KD igual o menor que 10 nM.

En una realización preferida en la presente, el agente de unión a CD33 está humanizado.

En una realización preferida en la presente, el agente de unión a CD33 es totalmente humano.

En una realización preferida, el agente de unión a CD33 comprende también una función efectora.

En una realización preferida, la función efectora está mediada por un dominio Fc.

En una realización preferida, el agente de unión a CD33 comprende una o más mutaciones en el dominio Fc que

modulan la función del dominio Fc.

En una realización preferida, la modulación de la función del dominio Fc es un aumento de la ADCC en al menos 10%, preferiblemente 50% o 100%. Los agentes de unión a CD33 particularmente preferidos según la presente invención se listan en la tabla 1: Tabla 1

nº

Clon nº ID SEQ ID CDR1 SEQ ID CDR2 SEQ ID CDR3 SEQ ID CDR4 SEQ ID CDR5 SEQ ID CDR6 SEQ ID VH SEQ ID VL SEQ ID cadena pesada SEQ ID cadena ligera

1

280-03-08 1 15 29 43 57 71 85 99 113 127

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280-21-09 2 16 30 44 58 72 86 100 114 128

3

280-29-12 3 17 31 45 59 73 87 101 115 129

4

280-31-01 4 18 32 46 60 74 88 102 116 130

5

280-3101(mut) 5 19 33 47 61 75 89 103 117 131

6

280-34-02 6 20 34 48 62 76 90 104 118 132

7

280-50-01 7 21 35 49 63 77 91 105 119 133

8

280-5001(mut) 8 22 36 50 64 78 92 106 120 134

9

280-61-07 9 23 37 51 65 79 93 107 121 135

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283-03-03 10 24 38 52 66 80 94 108 122 136

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283-05-01 11 25 39 53 67 81 95 109 123 137

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283-07-03 12 26 40 54 68 82 96 110 124 138

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283-11-03 13 27 41 55 69 83 97 111 125 139

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283-14-01 14 28 42 56 70 84 98 112 126 140

Tratamiento del cáncer

Varias publicaciones han descrito al CD33 como marcador de la superficie celular principalmente sobre células AML

10 y CML que se expresa sobre las células malignas del 70% al 100% de los pacientes (Scheinberg et al., 1989; Hauswirt et al., 2007; Plesa et al., 2007; Webber et al., 2008). El CD33 se expresa sobre células blásticas mieloides malignas, que representan la mayoría de las células malignas en la sangre periférica y en la médula ósea de pacientes con leucemia, y sobre células precursores leucémicas, un número relativamente pequeño de células menos diferenciadas en la médula ósea que se caracterizan por su capacidad para la autorrenovación y el

15 mantenimiento de la jerarquía clonal leucémica. La viabilidad clínica del transporte dirigido al CD33 utilizando anticuerpos se ha demostrado con Mylotarg® (gemtuzumab ozogamizina), un conjugado de anticuerpocalicheamicina que ha sido aprobado para el tratamiento de pacientes con AML en recaída no elegible para otras opciones de tratamiento. Una estrategia alternativa dirigida al CD33 es el desarrollo del lintuzumab (SGN-33, HuM195), un anticuerpo monoclonal IgG1 humanizado que ha demostrado señales tempranas de eficacia en

20 ensayos clínicos de fase I (Raza et al., 2009). Tomados conjuntamente, existe una abundancia de datos preclínicos y clínicos que subrayan la importancia y la viabilidad del transporte dirigido a CD33 para el tratamiento de la AML y otras malignidades positivas a CD33.

La leucemia mieloide aguda (AML) es una malignidad del linaje mieloide de los leucocitos. Esta neoplasia hematológica es una enfermedad de la sangre y de la médula ósea que si se deja sin tratar generalmente resulta 25 fatal en semanas a meses. Hay una frecuencia estimalda de 30000 casos de AML en EEUU y de 47000 en la Unión Europea (datos de frecuencia de 10 años confirmados por Mattson-Jack, 2010). La AML es la forma más frecuente de leucemia aguda en adultos (aproximadamente 90%), y comprende aproximadamente 33% de los nuevos casos

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de leucemia. La edad media de los pacientes diagnosticados con AML es de 67 años. La AML es responsable de aproximadamente 1,2% de las muertes por cáncer en EEUU.

La AML provoca síntomas no específicos, tales como pérdida de peso, fatiga, fiebre, y sudores nocturnos. La AML se diagnostica mediante ensayos sanguíneos, estudio de la médula ósea, y ensayos de laboratorio para determinar el subtipo de AML y para determinar las decisiones de tratamiento.

La terapia para la AML depende en gran medida de la edad y el estado de actuación del paciente. Los pacientes que pueden tolerar una quimioterapia de inducción intensiva (y la posterior consolidación y mantenimiento) se tratarán intensamente con una combinación de fármacos citotóxicos. Es probable que estos pacientes logren una respuesta completa de aproximadamente 75%. En esta población de pacientes, el objetivo terapéutico es la curación. Aún así, se produce una recaída de la AML en aproximadamente la mitad de los pacientes en el año después de haber logrado una respuesta completa. Las proporciones de curación a largo plazo están en el radio del 30%.

Sin embargo, una edad avanzada en el momento del diagnóstico o la existencia de comorbilidades no permite la administración de la terapia de inducción intensiva, lo cual conduce a un objetivo de tratamiento paliativo. Por tanto, las proporciones de remisión disminuyen significativamente en pacientes más ancianos con AML. La mediana de la supervivencia en pacientes más ancianos con AML es menor que 6 meses.

En un aspecto, los agentes de unión a CD33 son útiles para tratar el cáncer, tal como retrasando el avance de un cáncer y/o reduciendo la caquexia asociada al cáncer, o previniendo o retrasando la recurrencia de una malignidad hematológica (por ejemplo, leucemia) en un mamífero, preferiblemente un paciente humano. El agente de unión a CD33 puede administrarse por sí solo o coadministrarse con otro agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente de unión a CD33 se coadministra con un producto quimioterapéutico según las normas asistenciales. El agente de unión a CD33 puede administrarse en forma no conjugada (es decir, no conjugado con una citotoxina) o como un conjugado.

En esta subsección, un "paciente" es un ser humano u otro mamífero que está sometiéndose a un tratamiento o que se le ha diagnosticado cáncer.

En algunas realizaciones, los agentes de unión a CD33 son útiles para retrasar el avance de un cáncer y/o para reducir la caquexia asociada a cáncer en un paciente, mediante la administración al paciente que lo necesite una dosificación eficaz del agente de unión a CD33. Sin querer limitarse a un mecanismo concreto, el agente de unión a CD33 se une a células efectoras o accesorias de los linajes mieloides o monocíticos (por ejemplo, monocitos, macrófagos, células dendríticas, y neutrófilos), inhibiendo o reduciendo con ello la producción de diversas citoquinas, quimioquinas y factores del crecimiento desde las células efectoras o accesorias y/o las células tumorales. Estas citoquinas, quimioquinas y factores del crecimiento, que pueden estimular el crecimiento y la proliferación de células tumorales y/o contribuir a la caquexia del cáncer, incluyen, pero no se limitan a interleuquina-1β (IL-1β), factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), interleuquina-6 (IL-6), interleuquina-8 (IL-8), interferón-γ (IFN-γ), factor del credimiento endotelial vascular (VEGF), factor inhibidor de leucemia (LlF), proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1), RANTES, interleuquina-10 (IL-10), interleuquina-12 (IL-12), metaloproteinasa de matriz 2 (MMP2), IP-10 y/o proteína inflamatoria de macrófagos 1α (MIP1α). Los agentes de unión a CD33 también pueden reducir la migración de macrófagos al sitio de las células tumorales.

En algunas realizaciones, la administración de una dosificación eficaz de un agente de unión a CD33 a un paciente reduce los niveles de al menos una citoquina, quimioquina o factor del crecimiento, pudiendo dicha citoquina, quimioquina o factor del crecimiento estimular el crecimiento y la proliferación de las células tumorales, estimular la migración de células efectoras no malignas, tales como macrófagos asociados a tumores (TAMS), hacia la vecindad del sitio del tumor y/o contribuir a la caquexia del cáncer. En realizaciones específicas, la citoquina, la quimioquina o el factor del crecimiento es, por ejemplo, interleuquin-1β (IL-1β), factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), interleuquina6 (IL-6), interleuquina-8 (IL-8), interferón-γ (IFN-γ), factor del crecimiento endotelial vascular (VEGF), factori inhibidor de leucemia (LIF), proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1), RANTES, interleuquina-10 (IL-10), interleuquina-12 (IL-12), metaloproteinasa de matriz 2 (MMP2), IP-10 y/o proteína inflamatoria de macrófagos 1α (MIP1α).

En otra realización, se proporciona un método para retrasar el avance de un cáncer mediante la administración a un paciente de un régimen eficaz de un agente de unión a CD33 que puede unirse de modo específico a CD33. Como resultado de la administración del agente de unión a CD33 se retrasa el avance del cáncer, tal como reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células tumorales, disminuyendo la metástasis, reduciendo el nivel de al menos una citoquina, quimioquina o factor del crecimiento, reduciendo la células efectoras no malignas en la vecindad de las células tumorales, o similares.

En otra realización, se proporciona un método para retrasar la carga tumoral en un paciente mediante la administración al paciente de un régimen eficaz de un agente de unión a CD33 que puede unirse de modo específico a CD33. Como resultado de la administración del agente de unión a CD33, la carga tumoral en el paciente se detiene o se reduce, tal como reduciendo el tamaño o la masa del tumor, reduciendo el nivel de al menos una citoquina, quimioquina o factor del crecimiento, reduciendo las células efectoras no malignas en la vecindad de las

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células tumorales, inhibiendo la migración de macrófagos en la vecindad de las células tumorales, reduciendo el número de células efectoras no malignas (por ejemplo, TAMS o macrófagos) en el tumor, o similares.

En otra realización, se proporciona un método para reducir la carga tumoral o para retrasar el avance de un cáncer en un paciente mediante la administración al paciente de un régimen eficaz de un agente de unión a CD33 que puede unirse de modo específico a CD33. Como resultado de la administración del agente de unión a CD33, la carga tumoral en el paciente se detiene o se reduce, tal como reclutando células efectoras inmunológicas, como células NK o macrófagos o monocitos, que pueden destruir las células tumorales mediante mecanismos de mediación inmunológica.

La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) es un mecanismo mediado por células efectoras inmunológicas que puede contribuir a la actividad antitumoral de anticuerpos monoclonales (Weiner G.J., Monoclonal antibody mechanisms of action in cancer, Immunol Res., 2007, 39(1-3):271-278). La importancia de la ADCC para una eficacia antitumoral ha sido demostrada en modelos preclínicos, por ejemplo, en modelos tumorales de ratón (por ejemplo, Clynes R.A., Towers T.L., Presta L.G., Ravetch J.V., Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets, Nat. Med., abril de 2000, 6(4):443-446). Los datos de ensayos clínicos apoyan la importancia de la ADCC para una eficacia clínica de anticuerpos terapéuticos (por ejemplo, Weng W.K., Levy R., Two immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms independently predict response to rituximab in patients with follicular lymphoma, J. Clin. Oncol., 1 de noviembre de 2003, 21(21):3940-3947, Epub 15 de septiembre de 2003). Las interacciones de los anticuerpos monoclonales con los receptores de Fc sobre células inmunológicas contribuyen a la ADCC. El Fc de los anticuerpos puede modificarse para que muestre una afinidad potenciada por los receptores de Fc (por ejemplo, Presta L.G., Engineering of therapeutic antibodies to minimize immunogenicity and optimize function, Adv. Drug Deliv. Rev., 7 de agosto de 2006, 58(5-6):640-656, Epub 23 de mayo de 2006). Esta afinidad potenciada por los receptores de Fc produce una mayor actividad ADCC que puede conducir a una mayor eficacia antitumoral en pacientes.

En las diversas realizaciones descritas en esta sección, el agente de unión a CD33 puede utilizarse para tratar un cáncer positivo a CD33 (es decir, un cáncer que comprende células del cáncer que sobreexpresan el CD33 sobre su superficie celular, o que expresan el CD33 a niveles considerados aceptables para la terapia con anticuerpos CD33). El agente de unión a CD33 también puede utilizarse para tratar un cáncer que no sobreexpresa el CD33 sobre las células efectoras no malignas, con relación al tejido normal del mismo tipo. El cáncer puede ser, por ejemplo, una malignidad no hematológica o una malignidad hematológica. En ejemplos específicos, la malignidad hematológica puede ser positiva a CD33, y puede ser, por ejemplo leucemia linfoide aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia mielomonocítica crónica, una leucemia eritrocítica, leucemia megacarioblástica aguda, linfoma histiocítico, un sarcoma mieloide, un trastorno proliferativo de células cebadas, o el síndrome mielodisplásico (MDS). En algunas realizaciones, la malignidad hematológica es una malignidad positiva a CD33, tal como leucemia mieloide aguda o síndrome mielodisplásico (MDS).

En las diversas realizaciones descritas en esta sección, el agente de unión a CD33 puede ser un anticuerpo anti-CD33 no conjugado. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo totalmente humano, humanizado o quimérico, tal como un anticuerpo M 195 quimérico o humanizado. El anticuerpo también puede ser otro anticuerpo, tal como un anticuerpo que compite con el anticuerpo M 195 por la unión específica a CD33. El anticuerpo también puede unirse al mismo epitopo que el anticuerpo M 195 o a un epitopo diferente.

En otras realizaciones, el agente de unión a CD33 puede unirse (es decir, conjugarse) con una citotoxina. La citotoxina puede ser, por ejemplo, una toxina peptídica, tal como saporina, ricina, clorotoxina, exotoxina de Pseudomonas, endotoxina de Pseudomonas o toxina de la difteria. La citotoxina también puede ser una toxina química (es decir, con una base no peptídica), tal como calicheamicina, doxorrubicina, una camptotecina, daunorrubicina, u otros agentes de unión al ADN. La citotoxina también puede ser una auristatina, un maitansinoide, una dolastatina, u otros agentes bloqueantes de microtúbulos.

Un agente de unión a CD33 que es un anticuerpo anti-CD33 puede administrarse al paciente por vía intravenosa o subcutánea, a una dosis de 0,1 mg/kg o menor, a aproximadamente 25 mg/kg, preferiblemente de 1,0 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Un agente de unión a CD33 que es un fragmento de un anticuerpo anti-CD33 u otra proteína de unión a CD33 puede administrarse en una dosificación equivalente a una dosis de 0,1 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de 1,0 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg del anticuerpo intacto. El agente de unión a CD33 puede administrarse por vía intravenosa o subcutánea al paciente según un programa que sea, por ejemplo, diario, semanal, bisemanal, trisemanal (es decir, cada tres semanas) o mensual, o una combinación de éstos, al paciente. El agente de unión a CD33 puede administrarse durante un periodo de al menos un mes, al menos dos meses, al menos tres meses, al menos cuatro meses, al menos cinco meses, al menos seis meses, o más, según sea necesario. En algunas realizaciones, a la fase de tratamiento (supra) con el agente de unión a CD33 le sigue una fase de mantenimiento, en la que se administran dosis del agente de unión a CD33 con menos frecuencia que durante la fase de tratamiento. Por ejemplo, pueden administrarse dosis de mantenimiento semanales, bisemanales, trisemanales o mensuales, durante un periodo de 1-6 meses. Las dosificaciones en la fase de mantenimiento pueden ser iguales que las dosificaciones en la fase de tratamiento.

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Composiciones farmacéuticas y métodos de administración

Los agentes de unión a CD33 puede estar en cualquier forma que permita administrar la composición a un paciente. Por ejemplo, la composición puede estar en forma de un sólido o de un líquido. El modo preferido de aplicación es parenteral, por infusión o inyección (intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intradérmica), pero también pueden ser aplicables otros modos de aplicación, tales como por inhalación, transdérmico, intranasal, bucal, oral e intratumoral. La administración parenteral incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intraestemal, o técnicas de infusión. En un aspecto, las composiciones se administran por vía parenteral. En otro aspecto, los compuestos se administran por vía intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para permitir que un compuesto esté biodisponible tras la administración de la composición a un paciente. Las composiciones pueden tomar la forma de una o más unidades de dosificación, en las que, por ejemplo, un recipiente de un compuesto en forma de aerosol puede albergar una pluralidad de unidades de dosificación.

Los materiales utilizados para preparar las composiciones farmacéuticas pueden ser no tóxicos en las cantidades empleadas. Será evidente para los expertos en la técnica que la dosificación óptima del ingrediente o ingredientes activos en la composición farmacéutica dependerá de una diversidad de factores. Los factores pertinentes incluyen, sin limitación, el tipo de paciente (por ejemplo, un ser humano), la forma concreta del compuesto, el modo de administración, y la composición empleada.

El vehículo o portador farmacéuticamente aceptable puede estar en partículas, de forma que las composición están, por ejemplo, en forma de polvo. El vehículo o vehículos pueden ser líquidos, y las composiciones pueden ser, por ejemplo, un líquido inyectable. La composición puede estar en forma de un líquido, por ejemplo, para la inyección parenteral. En una composición para la administración mediante inyección, también puede incluirse uno o más tensioactivos, conservantes, agentes humectantes, agentes dispersantes, agentes suspensores, tampones, estabilizantes y agentes isotónicos.

Las composiciones líquidas, tanto si son disoluciones, suspensiones u otra forma parecida, también pueden incluir uno o más de los siguientes: diluyentes estériles, tales como agua para inyección, disolución salina, preferiblemente disolución salina fisiológica, disolución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites no volátiles, tales como mono-o diglicéridos sintéticos que pueden actuar como disolvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, ciclodextrina, propilenglicol u otros disolventes; estabilizantes, tales como aminoácidos; tensioactivos, tales como polisorbatos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metilparabeno; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminatetraacético; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. Una composición parenteral puede estar dentro de una ampolla, una jeringa desechable o un vial de múltiples dosis fabricado de vidrio, plástico u otro material. Un ejemplo de adyuvante es la disolución salina fisiológica. Una composición inyectable es preferiblemente estéril.

Los agentes de unión a CD33 también pueden secarse (liofilizarse, secarse por pulverización, secarse por pulverización-congelación, secarse con gases supercríticos o casi supercríticos, secarse al vacío, secarse al aire), precipitarse o cristalizarse, o atraparse en microcápsulas que se preparan, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial utilizando, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o gelatina y poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de transporte de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, nanopartículas y nanocápsulas), en macroemulsiones, o precipitarse o inmovilizarse sobre vehículos o superficies, por ejemplo mediante la tecnnología de pcmc ("protein coated microcrystals", microcristales revestidos con proteína). Estas técnicas se describen en Remington, . The Science and Practice of Pharmacy, 21ª edición, Hendrickson R. ed.

La cantidad de la composición que es eficaz para el tratamiento de un trastorno o una afección concretos dependerá de la naturaleza del trastorno o de la afección, y puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales. Además, opcionalmente pueden emplearse ensayos in vitro o in vivo para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa que se empleará en las composiciones dependerá también de la vía de administración, y de la gravedad de la enfermedad o del trastorno, y deberá decidirse según el criterio del médico y de las circunstancias de cada paciente.

Las composiciones comprenden una cantidad eficaz de un fármaco o fármacos, o agente o agentes, de tal forma que se obtenga una dosificación adecuada. Generalmente, esta cantidad es al menos aproximadamente 0,01% de un fármaco o agente en peso de la composición. Cuando se prevé una administración oral, esta cantidad puede variar en un intervalo de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 80% en peso de la composición. En un aspecto, las composiciones orales pueden comprender de aproximadamente 4% a aproximadamente 50% del compuesto en peso de la composición. En otro aspecto, las presentes composiciones se prepararn de modo que una unidad de dosificación parenteral contenga de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 2% en peso del compuesto.

Para la administración intravenosa, la composición puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente

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delecionar) el resto o los restos cisteína de la región variable que participan en un enlace disulfuro intracaternario, por un resto aminoácido que no contenga un grupo sulfhidrilo. Estas modificaciones pueden realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica para la introducción de mutaciones o deleciones específicas en una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, pero sin limitarse a la mutagénesis química y la mutagénesis dirigida al sitio in vitro (véase, por ejemplo, Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem., 253:6551).

Además, se han desarrollado técnicas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (véase, por ejemplo, Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454). Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, tales como aquellas que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de una inmunoglobulina humana, por ejemplo, anticuerpos humanizados.

Cuando se ha obtenido una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo, el vector para la producción del anticuerpo puede producirse mediante la tecnología del ADN recombinante utilizando técnicas conocidas en la técnica. Pueden utilizarse los métodos conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contengan las secuencias codificadoras del anticuerpo y las señales de control de la transcripción y de la traducción adecuadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; y Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª ed., Cold Spring Harbor Publish., Cold Spring Harbor, N.Y.), y Ausubel et al. (eds., 1993-2006, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).

Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de un anticuerpo, o la secuencia de nucleótidos de un anticuerpo, puede transferirse a una célula hospedante mediante técnicas convencionales (por ejemplo, electroporación, transacción liposómica, precipitación con fosfato de calcio o transducción), y las células resultantes entonces se cultivan mediante técnicas convencionales para producir el anticuerpo. En realizaciones específicas, la expresión del anticuerpo se regula mediante un promotor constitutivo, inducible o específico de tejido.

Las células hospedantes utilizadas para expresar el anticuerpo recombinante pueden ser células bacterianas, tales como Escherichia coli, o preferiblemente células eucariotas, en especial para la expresión de moléculas de inmunoglobulina recombinantes. En particular, las células de mamífero, tales como las células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector que contenga el elemento promotor génico temprano intermedio principal del citomegalovirus humano, son un sistema de expresión eficaz para las inmunoglobulinas (véase, por ejemplo, Foecking et al., 1986, Gene, 45:101; Cockett el al., 1990, BioTechnology, 8:2). La línea de células CHO puede ser, por ejemplo, DG44 o CHO-S. En otro ejemplo, un anticuerpo puede expresarse utilizando el sistema CHEF (véase, por ejemplo, la patente de EEUU nº 5.888.809).

Puede utilizarse una diversidad de otros sistemas de vectores de expresión-hospedante para expresar anticuerpos. Estos sistemas de expresión-hospedante representan vehículos mediante los cuales las secuencias codificadoras del anticuerpo pueden producirse y posteriormente purificarse, pero también representan células que, cuando se transforman o se transfectan con las secuencias de nucleótidos codificadoras apropiadas, expresan una molécula de anticuerpo de inmunoglobulina in situ. Estas incluyen, pero no se limitan a microorganismos, tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, de ADN plasmídico o de ADN cosmídico que contienen secuencias codificadoras de inmunoglobulinas; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces pichia) transformadas con vectores de expresión de levaduras recombinantes que contiene secuencias codificadoras del anticuerpo; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias codificadoras de inmunoglobulinas; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y virus del mosaico del tabaco (TMV)), o transformadas con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, el plásmido Ti) que contiene secuencias codificadoras de anticuerpos; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, CHO-S, BH, 293, 293T o 3T3) que albergan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, el promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor del virus de vaccinia 7.5K).

En sistemas bacterianos, una serie de vectores de expresión puede seleccionarse de modo ventajoso dependiendo del uso previsto para el anticuerpo que se está expresando. Por ejemplo, cuando una gran cantidad de dicha proteína se quiere producir, pueden resultar deseables vectores que dirijan la expresión de niveles altos de productos de proteínas de fusión que puedan purificarse con facilidad. Estos vectores incluyen, pero no se limitan al vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J., 2:1791-94), en el que la secuencia codificadora del anticuerpo puede acoplarse de modo individual al vector dentro de marco con la región codificadora de lac Z, de modo que se produce una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye y Inouye, 1985, Nucleic Acids Res., 13:3101-3109; Van Heeke y Schuster, 1989, J. Biol. Chem., 24:5503-5509); y similares. Los vectores pGEX también pueden utilizarse para expresar polipéptidos extraños en forma de proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse con facilidad a partir de células lisadas mediante adsorción y unión a una matriz de esferas de glutatión-agarosa, seguido de una elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para que incluyan sitios de ruptura de proteasas de

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283-07-03 0,3 2,1

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283-11-03 0,3 0,6

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283-14-01 3,2 2,3

Ejemplo 2: Cinética de internalización

La internalización del anticuerpo se refiere a la reducción de la cantidad de complejos de anticuerpo/antígeno sobre la superficie celular de la célula diana después de la incubación con anticuerpo. Los ensayos de internalización se 5 realizaron con la línea celular HL60 que expresa el CD33. Las células se incubaron con una cantidad fija de un agente de unión a CD33 (10 µg/ml de los anticuerpos monoclonales totalmente humanos listados en la tabla 1 como nº 1-14) durante periodos definidos de tiempo (0 h, 1 h, 4 h, 24 h) a 37 °C para permitir la internalización del complejo de anticuerpo/antígeno. En los momentos del tiempo indicados se añadió ácido a la mezcla de incubación para evitar posteriores internalizaciones. Después se añadió una cantidad fija de agente de unión a CD33 para

10 saturar todos los sitios de antígeno de CD33 sobre la superficie celular. La cantidad total de agente de unión a CD33 unida a la superficie celular se determinó mediante un análisis de FACS utilizando un anticuerpo secundario anti-IgG humana conjugado con FITC. El momento del tiempo de 0 h se usó para determinar el nivel inicial de complejo de antígeno/anticuerpo de sobre la superficie, y se definió como 100%. Los resultados se listan en la tabla 3 y se ilustran en las figuras 1-3.

15 Tabla 3

nº

Clon nº ID Complejo de antígeno/anticuerpo de CD33 que permanecesobre la superficie celular después de 4 h de incubación con anticuerpo (%)

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280-03-08 49

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280-21-09 41

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280-29-12 49

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280-31-01 44

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283-03-03 45

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283-05-01 51

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283-07-03 48

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Se incluye el lintuzumab como anticuerpo de referencia. Los complejos de lintuzumab/CD33 se internalizan con rapidez tras la unión del lintuzumab, lo cual está de acuerdo con los datos publicados. Después de un periodo de incubación de 4 h sólo quedó aproximadamente 20% de la cantidad inicial de los complejos de CD33/lintuzumab sobre la superficie celular. Se pudo demostrar que, de manera inesperada, la internalización de los 14 agentes de unión a CD33 según la presente invención fue frenada comparado con el lintuzumab.

Ejemplo 3: Actividad ADCC

La velocidad de internalización frenada se traduce en una mayor actividad ADCC in vitro. Para evaluar el efecto de la internalización frenada sobre la actividad ADCC de los agentes de unión a CD33 (los anticuerpos monoclonales totalmente humanos listados en la tabla 1 como nº 1-14), se incubaron células diana (HL60) con un agente de unión a CD33 durante 0, 1, 4 y 24 h. Posteriormente se realizó un ensayo de ADCC con PBMC estimuladas con IL-2 como células efectoras, y células HL60 revestidas con anticuerpos como células diana. Para todos los experimentos, se empleó una concentración de mAb de 30 µg/ml. El cocultivo de las células efectoras con las células diana en presencia del agente de unión a CD33 se realizó por cuadruplicado o por triplicado en placas de microvaloración de fondo redondo de 96 pocillos en un volumen final de 200 µl de medio de ensayo por pocillo que consiste en suero humano al 10% y BSA al 1% en RPMI en una proporción 1:1. En primer lugar se cultivaron las células efectoras (células PBMC recién aisladas en 100 µl de suero humano al 10% en RPMI por pocillo), seguido de las células diana y una disolución del agente de unión a CD33 (diluida en 50 µl de BSA al 1% en RPMI). Como control, se cultivaron células efectoras en medio de ensayo solo (control de células efectoras), y las células diana se cultivaron en medio de ensayo solo (lisis espontánea) o en medio de ensayo suplementado con Triton X-100 al 1% (lisis máxima). El cocultivo se incubó a 37 °C en un incubador de CO2 húmedo durante 3 horas. Al final de la incubación, las células se retiraron del medio de cultivo mediante centrifugación (200 x g, es decir, 1000 rpm; 10 min) a temperatura ambiente. Los sobrenadantes exentos de células (100 µl/pocillo) se trasladaron a los correspondientes pocillos de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Para determinar la actividad LDH en estos sobrenadantes se añadieron 100 µl de mezcla de reacción (250 µl de catalizador recién mezclado con 11,25 ml de disolución de tinte) a cada pocillo y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Entonces se mide la absorbancia como se describe a continuación.

Se empleó un kit de detección de citotoxicidad (LDH; Roche 11 644 793 001) para medir la actividad ADCC. La detección de la citotoxicidad se basa en la medición de la actividad de la enzima LDH liberada de las células con la membrana plasmática dañada. La LDH liberada hacia los sobrenadantes del cultivo reduce la sal tetrazolio del kit para formar formazano. El máximo de absorción del tinte de formazano se mide a 490 nm frente a una longitud de onda de referencia de 650 nm en un lector de placas de ELISA. Para determinar el porcentaje de citotoxicidad mediada por células, se calculó la absorbancia media de los cultivos realizados por cuadruplicado o por triplicado, y se restó el fondo. Estos valores corregidos se sustituyeron en la siguiente ecuación para calcular la ADCC (%):

(mezcla de células efectoras/diana-control de células efectoras-liberación espontánea) dividido entre (liberación máxima-liberación espontánea)

La actividad ADCC en el momento 0 h (no se preincuba el anticuerpo con las células diana) se define como 100% de actividad ADCC. La actividad ADCC para diversos momentos del tiempo de preincubación del anticuerpo se calculó con relación al momento 0 h y se muestra como citotoxicidad relativa (%).

La internalización frenada de los agentes de unión a CD33, comparado con el lintuzumab, produjo una mayor actividad ADCC comparado con el lintuzumab. En conclusión, una internalización frenada conduce al aumento de la actividad ADCC. La internalización de los agentes de unión a CD33 descritos se correlaciona inversamente con la actividad ADCC de los agentes de unión a CD33, que es indicativo de las ventajas con respecto a la actividad clínica de dichos agentes de unión a CD33. Los resultados se ilustran en la figura 4 para la cinética de internalización en este experimento, y en la figura 5 para la actividad ADCC.

Ejemplo 4: Cartografiado de epitopos

El epitopo de unión de los agentes de unión a CD33 descritos en la presente, con relación al epitopo del lintuzumab, se determinó mediante una espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno (HXMS).

Este método determina la susceptibilidad de los hidrógenos del esqueleto de amida de la proteína de CD33 para intercambiarse con D2O. Los experimentos se realizaron con la proteína de CD33 recombinante sola, y con la proteína de CD33 con agente de unión a CD33/lintuzumab añadidos (denominado en lo sucesivo en este ejemplo “anticuerpo/anticuerpos”). Así se identifican las regiones de la proteína de CD33 que muestran una protección significativa frente al intercambio debido a la unión del anticuerpo. La resolución del método se determina mediante los péptidos producidos mediante la digestión con pepsina, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos resultante puede ser más grande que el epitopo real del anticuerpo. Estos péptidos derivados de CD33 se identificaron mediante otros experimientos de control con muestras no intercambiadas que emplean las tecnologías de masas y

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de HPLC MS/MS precisas convencionales.

Para la muestra de proteína + anticuerpo, la proteína de CD33 y el anticuerpo se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente. La proporción molar final de anticuerpo/CD33 fue de 2:1. Utilizando un sistema de robot LEAP (la placa de intercambio se mantiene a 25 ºC, la placa de muestra/extinción se mantiene a 4 ºC), se añadieron 8 ul de muestra a 80 µl de tampón de intercambio (NaH2PO4 10 mM en D2O, pH = 7, o NaH2PO4 10 mM en H2O, pH = 7), se mezcló y se dejó que intercambiase durante diversos tiempos (15, 60, 120, 240, y 600 segundos) a 25 ºC. Entonces se transladaron 80 ul de esta disolución a 80 µl de tampón de extinción (urea 1 M, TCEP-HCl 0,1 M) a 4 ºC y se mezcló. Entonces se trasladaron 90 µl de esta disolución a 10 µl de pepsina (4 mg/ml) a 4 ºC y se mezcló. Después de 2 minutos se inyectaron 60 µl de esta disolución sobre un cartucho de trampa Michrom C18. El cartucho se lavó con H2O + TFA al 0,1% durante 2 minutos a 100 µl/min. Entonces se puso en marcha una válvula y el cartucho eluyó sobre una columna Phenomenex Jupiter C5, 1,0 x 50 mm, 5 µm, 300 A. La fase móvil A fue agua/acetonitrilo/TFA (99/0,95/0,05) y la fase móvil B fue acetonitrilo/agua/TFA (95/4,95/0,05). El caudal fue de 100 µl/min. El gradiente fue: 0 minutos (B al 0%), 6 minutos (B al 40%), 7 minutos (B al 40%), 8 minutos (B al 90%), 10 minutos (B al 90%), 11 minutos (B al 0%). El sistema LEAP preenfría la fase móvil hasta 4 ºC y también mantiene la columna de trampa y la columna analitica a 4 ºC. Para los experimentos de MS (empleados para cuantificar el intercambio con el tampón de D2O), se empleó un métedo de un único barrido de 300-2000 durante 14 minutos a una resolución de 60.000. Para los experimentos de MS/MS (empleados para identificar péptidos con el tampón de intercambio de H2O), se empleó un método con 7 barridos durante 14 minutos. El primer barrido fue un barrido de gama completa de 300-2000 con una resolución de 30.000. Los posteriores barridos fueron barridos CID de los 6 iones más intensos del barrido nº 1. El ancho de aislamiento fue de 1,5 amu, la energía de colisión fue de 35 V, y el tiempo de activación fue de 30 mseg. Los péptidos de pepsina se identificaron utilizando los datos de fragmentación y el programa Proteome Discoverer (Thermo). Los péptidos identificados se analizaron utilizando un programa interno que calcula la masa media para los péptidos intercambiados.

Todos los agentes de unión a CD33 protegían el mismo fragmento de péptido con la secuencia de aminoácidos FFHPIPYYDKNSPVHGYW (SEQ ID NO:141) (tabla 4). La secuencia de CD33 protegida por los agentes de unión a CD33 descritos en la presente es diferente y no se solapa con la secuencia peptídica del CD33 protegido por la unión del lintuzumab (MDPNFWLQVQE, SEQ ID NO:142). En la formación de modelos de silicio, que emplea la estructura cristalina de SIGLEC-5, un miembro de la familia SIGLEC homólogo a CD33, se revelaron los epitopos de unión de todos los anticuerpos en el dominio proximal de la proteína, en los que el epitopo de unión del lintuzumab es diferente de los de los agentes de unión a CD33 descritos en la presente. En conclusión, los agentes de unión a CD33 descritos en esta solicitud de patente se unen a un epitopo diferente que el lintuzumab.

Tabla 4

un

Clon nº ID Epitopo de CD33

1

280-03-08 FFHPIPYYDKNSPVHGYW

2

280-21-09 FFHPIPYYDKNSPVHGYW

3

280-29-12 FFHPIPYYDKNSPVHGYW

4

280-31-01 FFHPIPYYDKNSPVHGYW

5

280-31-01(mut) FFHPIPYYDKNSPVHGYW

6

280-34-02 FFHPIPYYDKNSPVHGYW

7

280-50-01 FFHPIPYYDKNSPVHGYW

8

280-50-01(mut) FFHPIPYYDKNSPVHGYW

9

280-61-07 FFHPIPYYDKNSPVHGYW

10

283-03-03 FFHPIPYYDKNSPVHGYW

11

283-05-01 FFHPIPYYDKNSPVHGYW

12

283-07-03 FFHPIPYYDKNSPVHGYW

13

283-11-03 FFHPIPYYDKNSPVHGYW

14

283-14-01 FFHPIPYYDKNSPVHGYW

15

lintuzumab MDPNFWLQVQE

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2

   imagen3

   imagen4