KR101864597B1 - Cd33 결합제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 골수세포 고갈에 기초한 면역치료에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 이러한 요법, 예를 들어 골수세포 악성종양 및 골수이형성 증후군(MDS)의 치료에서 사용하기 위한 CD33 결합제에 관한 것이다.

Description

CD33 결합제{CD33 BINDING AGENTS}
본 발명은 골수세포 고갈에 기초한 면역치료에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 이러한 요법, 예를 들어 골수세포 악성종양 및 골수이형성 증후군(MDS)의 치료에서 사용하기 위한 CD33 결합제에 관한 것이다.
1980년대 초에, CD33이 골수성 백혈병의 마커로 확인되었다(Andrews et al., Blood 62, 24-132, 1983). CD33은 골수성 백혈병 세포를 포함한 골수세포에서 특이적으로 발현된 세포 표면 항원이다. 이것은 siglec(시알산 결합 Ig 관련 렉틴 (lectin))류 중 가장 작은 것이다. CD33은 조기 다분화 조혈전구세포와 골수단구성 전구체에서 발현된다. 이것은 다능성 조혈줄기세포에는 존재하지 않는다(Andrews et al., Journal of Experimental Medicine 169, 1721-1731, 1989). 이것은 성숙 과립구에서 하향조절되지만 대식세포, 단핵구 및 수지상세포에서는 유지된다(Andrews et al., Blood 62, 24-132, 1983). 골수단구성세포 이외에 CD33은 또한 인간 비만세포와 혈액 호염구에서 발현되는 것으로 확인되었다(Valent et al., Blood 15; 73(7): 1778-85, 1989).
CD33에 대한 모노클론 항체는 급성 골수성 백혈병(AML)에서 자기이식용 골수의 치료 타겟팅 및 생체외 정화뿐만 아니라 백혈병의 진단에 사용된다(Duzkale et al., Biol Blood Marrow Transplant. 9(6):364-72, 2003). 치료 타겟팅에서의 초기 노력은 리신(ricin) 독소와 컨쥬게이트된 항-CD33 항체를 사용한 면역독소의 개발에 집중되었다. 항체 결합시 CD33은 급속하게 내재화(internalization)(Audran et al., J Immunol Methods. 188(1): 147-54, 1995)되기 때문에 면역독소 방법은 자명하다.
CD33은 67 KD 막통관 당단백질이다. CD33의 시알산 결합 세포외 도메인은 세포-세포 부착과 관련되어 있다. 세포내 면역수용체 티로신 함유 저해 모티프(ITIM)는 세포에 저해 시그널을 제공하여 증식과 세포 생존에 영향을 미친다. CD33의 실질적인 시그널링 경로는 거의 알려져 있지 않지만 ITIM과 ITIM 유사 모티브와 티로신 포스파타제의 보충과 관련된 것으로 추정된다(von Gunten et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1143 : 61-82, 2008). 마우스의 CD33 오쏘로그(orthologue)가 규명되었지만 인간 CD33에 대한 그의 작용적 객관성은 의문이다(Brinkman-Van der Linden et al., Mol Cell Biol., 23(12): 4199-206, 2003). 정상 백혈구와 악성 백혈구에서 인간 CD33의 작용적 역할은 여전히 알려지지 않았다.
몇 종의 간행물은 시험 환자의 70-100%에 의해 발현된 프라이머리 AML 및 CML 세포에 대한 안정한 세포 표면마커로서 CD33을 기술하고 있다(Plesa et al., Cancer 112(3), 572-80, 2007; Hauswirt et al., Eur J Clin Invest. Jan 73-82, 2007; Scheinberg et al., 백혈병 Vol. 3, 440-445, 1989). CD33은 백혈병 환자의 말초혈액과 골수에서 대다수의 악성 세포를 나타내는 악성 골수성 아세포와, 자기재생 능력과 백혈병 클론 위계의 유지를 특징으로 하는 골수 내의 상대적으로 적은 수의 미분화 세포인 백혈병 줄기세포에서 발현된다. 백혈병 줄기세포의 고갈은 종양이 없는 지속적 생존을 위한 중요 메카니즘으로 생각된다. 칼리키아마이신 (chaliceamicin) 독소에 컨쥬게이트된 인간화 IgG4 항체인 CD33 타겟팅 면역독소 Mylotarg®는 그의 독소 페이로드(payload)를 CD33 포지티브 AML 세포에 전달하여 AML 환자의 치료에 사용된다(Amadori et al., Cancer Treat Rev. 34(l):49-60, 2008). "네이키드(naked)" CD33 특이적 인간화 모노클론 항체인 린투주맵 (Lintuzumab)(SGN-33, HuM195)은 제1상 투약 점증 시험에서의 효능에 대한 초기 임상 증상으로 AML과 MDS의 치료에 대한 제2상 임상시험에서 평가되었고 허용가능한 부작용이 보고되었다(Raza et al. Abstract #983, 14th EHA Congress, June 4-7, 2009).
CD33 특이적 HuM195로 AML 세포주를 타겟팅하여 생체 외에서 IL-8, MCP-1 및 RANTES 같은 염증성 사이토카인의 TNF-α 유도성 분비를 감소시킨다 (Sutherland et al., Mabs 1:5, 481-490, 2009). AML 치료요법에서 이러한 효과의 연관성은 알려지지 않았으나 종양 미세환경의 사이토카인 환경을 조절하므로써 항체의 치료효능에 기여할 수 있다. 또한, 항체는 생체 외에서 AML 세포주의 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 항체 의존성 세포 매개 식세포작용(ADCP)을 유발한다 (Sutherland et al., Mabs 1:5, 481-490, 2009). ADCC는 혈액학적 악성종양에서 항체의 항종양 활성의 결정적 메카니즘인 것으로 생각된다. CD20-특이적 모노클론 항체 리툭시맵(Rituximab)을 사용한 임상시험 결과는 항체 치료에 대한 반응과 관련하여 B-세포 악성종양의 치료에 대한 이펙터(effector) 세포 매개 메카니즘의 중요성을 입증하였다(Weng and Levy, J Clin Oncol. 21 (21): 3940-7, 2003).
결론적으로, CD33 항원은 골수단구성 계통의 정상 세포에서 발현되고 골수성 백혈병의 종양 세포에서 주로 발현되는 것으로 나타났다. CD33에 대한 항체(린투주맵)를 사용한 제1상 시험에서, 효능의 첫 번째 신호가 심각한 부작용 없이 관찰되었다. 그러나, 린투주맵의 임상개발은 화학요법과 병용한 제2상 임상의 결과가 효능에서 예상한 개선을 얻지 못함에 따라 중단되었다. 따라서, 개선된 CD33-타겟팅 치료 양식의 개발이 분명히 필요하다.
종래 기술의 관점에서 골수세포 악성종양 및 MDS, 특히 급성 골수성 백혈병에 대한 보다 개선된 치료요법을 제공하는 것이 필요하다.
특히, 암, 구체적으로 AML을 치료하기 위한 CD33에 대한 더욱 개선된 길항성 결합제를 제공하는 것이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은,
a) CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 CDR4, CDR5 및 CDR6를 포함하는 경쇄 가변영역을 가지거나(여기에서, CDR1은 서열번호: 1-14에서 선택된 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호: 14-28에서 선택된 아미노산 서열을 가지고, CDR3는 서열번호: 29-42에서 선택된 아미노산 서열을 가지고, CDR4는 서열번호: 43-56에서 선택된 아미노산 서열을 가지고, CDR5는 서열번호: 57-70에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, CDR6는 서열번호: 71-84에서 선택된 아미노산 서열을 가진다),
b) 인간 CD33의 아미노산 서열 FFHPIPYYDKNSPVHGYW(서열번호: 141) 내의 에피토프를 인식하는 것으로 정의되는, 인간 CD33에 결합하는 신규한 CD33 결합제를 제공한다.
본 발명은 또한 CD33 결합제의 내재화 키네틱스(kinetics)가 적어도 30%, 바람직하게 40%의 항체 초기량이 인큐베이션 4시간 후에 HL60 세포의 세포 표면에 남아있는 CD33 결합제를 제공한다.
본 발명은 또한 중쇄 가변영역이 서열번호: 85-98에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변영역이 서열번호: 99-112에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CD33 결합제를 제공한다.
본 발명은 또한 중쇄가 서열번호: 113-126에서 선택된 아미노산 서열을 갖고 경쇄가 서열번호: 127-140에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 CD33 결합제를 제공한다.
본 발명은 또한 ADCC를 증가시키는 Fc 도메인에 돌연변이를 갖는 CD33 결합제를 제공한다.
더욱 바람직한 구체예는 이하의 명세서와 특허청구범위에 요약하였다.
본 발명에 따른 CD33 결합제는 인간 CD33에 대하여 높은 친화도를 가지며 또한 유리한 내재화 키네틱스를 가지는 것이 확인되었으며, 이것은 타겟 세포의 표면에서 CD33과 결합할 때 CD33 결합제의 장기적 존재를 특징으로 하고, 이에 따라 유리한 ADCC 활성으로 해석된다.
본 발명자들은 또한 본 발명에 따른 CD33 결합제가 린투주맵과 비교하여 CD33의 세포외 도메인의 상이한 에피토프에 결합하는 것을 발견하였다. 특정 이론에 제약되지 않고도 이것은 본 발명에 따른 CD33 결합제와 린투주맵의 상이한 내재화 키네틱스가 이유인 것으로 생각된다.
도 1-3은 HL60 세포 상의 린투주맵과 비교하여 본 발명에 따른 예시적인 CD33 결합제의 내재화를 나타낸 것이다.
도 4는 린투주맵과 비교하여 본 발명에 따른 2개의 예시적인 항체의 HL60 세포에서의 내재화율을 나타낸 것이다.
도 5는 린투주맵과 비교하여 본 발명에 따른 2개의 예시적인 항체의 HL60 세포에서의 ADCC 성능을 나타낸 것이다.
CD33 결합제
여기에서 사용된 "결합제"란 용어는 타겟 항원에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 펩티드를 의미한다. 결합제는, 예를 들어 항체, 이러한 항체의 유도체 또는 타겟 항원에 특이적으로 결합하는 기타 제제일 수 있다. 결합제는 또한 Fv 영역 또는 그의 일부(예를 들어, 타겟 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 VH 또는 VL 또는 CDR(들))를 포함하는 단백질일 수 있다. 여기에서 바람직한 구체예에 있어서 결합체는 항체이다.
여기에서 사용된 "CD33 결합제"란 용어는 CD33, 전형적으로 인간 CD33의 세포외 도메인의 일부에 특이적으로 결합하는 결합제를 지칭한다.
여기에서 사용된 "항체"란 용어는 (a) 면역글로불린 폴리펩티드와 면역글로불린 폴리펩티드의 면역적으로 활성인 부분(즉, 특이적 타겟 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합부위를 함유하는, 면역글로불린류의 폴리펩티드, 또는 그의 단편), 또는 (b) 이러한 면역글로불린 폴리펩티드 또는 타겟 항원에 면역특이적으로 결합하는 단편의 보존적으로 치환된 유도체를 지칭한다. 항체들은 일반적으로, 예를 들어 Harlow and Lane, Antibodies : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)에 기술되어 있다. "항체"란 용어는 온전한 모노클론 항체, 폴리클론 항체, 단일특이성 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 목적하는 생물학적 활성(예를 들어, 항원 결합)을 나타내는 항체 단편을 지칭한다. 항체는 어떠한 형태 또는 종류(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, 및 IgA) 또는 아종(예를 들어, IgG1, lgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2)도 가능하며, 바람직하게 IgG 종류, 더욱 바람직하게 IgG1일 수 있다.
"온전한" 항체는 항체 종류에 적절한 경쇄 불변 도메인과 중쇄 불변 도메인뿐만 아니라 항원 결합 가변영역을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 자연적 서열 불변 도메인(예를 들어, 사람의 자연적 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.
"항체 단편"은 항원 결합 또는 가변영역 또는 그의 일부를 포함한, 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, VH 및 VL 항원 결합 단편, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 단일사슬 항체, scFv, scFv-Fc, SMTP, 및 항체 단편에서 형성된 다중특이성 항체를 포함한다.
"중쇄 가변영역" 또는 "VH"는 CDR1, CDR2 및 CDR3와 주변 프레임워크 영역을 포함하는 중쇄의 일부를 의미한다.
"경쇄 가변영역" 또는 "VL"은 CDR4, CDR5 및 CDR6과 주변 프레임워크 영역을 포함하는 경쇄의 일부를 의미한다.
"CDR"은 중쇄 및 경쇄의 초가변영역을 의미하며, 이것은 항체 또는 항체 단편의 상보성 / 결합 특이성을 결정한다. 본 원에서 CDR의 순서는 단지 숫자적인 것일 뿐이다.
여기에서 "에피토프"는 항체 또는 항체 단편에 의해 인식되는 항원의 일부를 의미한다. 특히 이 용어는 항체가 인식할 수 있는 CD33 부분을 지칭한다.
여기에서 사용된 "mAb(s)"는 모노클론 항체를 지칭한다.
항체는 항체의 Fc 영역(자연적 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하는 하나 이상의 "이펙터 작용"을 가질 수 있다. 항체 이펙터 작용의 예는 CIq 결합; 보체의존성(complement dependent) 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC); 식세포장용; 세포 표면 수용체의 하향조절(예를 들어, B 세포 수용체; BCR) 등을 포함한다.
"단일사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 이 도메인들은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 전형적으로 scFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 대하여는, Plueckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore, eds., Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) 참조.
관심있는 항원(즉, 타겟 항원)에 "선택적"이거나, 그와 "결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는" 항체 같은 결합제는 결합제가 항원을 발현하는 세포를 타겟팅하는데 유용한 만큼의 충분한 친화도로 항원과 결합할 수 있는 것이다. 전형적으로, 결합제는 적어도 약 1x1O7 M-1의 친화도로 결합하며 사전결정된 항원 또는 밀접하게 연관된 항원 이외의 비특이적 항원(예를 들어, BSA, 카제인)에 결합하는 친화도보다 적어도 2배 더 높은 친화도로 사전결정된 항원과 결합한다.
여기서 사용된 "항체 유도체"는 이종 분자의 공유 결합, 예를 들어 이종 폴리펩티드의 결합, 또는 글라이코실화, 탈글라이코실화, 아세틸화 또는 인산화 또는 항체와 정상적으로 결합되지 않은 다른 변성에 의해 개질된, 위에서 정의된 바와 같은 항체를 지칭한다. 일부 구체예에서, 이종 분자는 치료제가 아니다. 일부 구체예에서, 이종 분자는 그 자체로 세포정지(cytostatic) 효과 또는 세포독성 효과를 나타내지 않는다.
여기에서 사용된 모든 용어와 방법에 대한 보다 종합적인 참고문헌은 Sambrook at al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (January 15, 2001)이다.
CD33 결합제는 제공된 타겟 세포 개체군과 연관된 수용체, CD33에 특이적으로 결합한다. CD33은 조혈계통의 세포에서 발현되는 시알로부착(sialoadhesion)류 의 하나로, 골수 전구체, 단핵구, 대식세포, 수지상세포 및 비만세포를 포함한다. CD33은 또한 급성 골수성 백혈병과 골수성이형성(myeloplastic) 증후군을 포함하는 골수증식성 또는 비만세포 증식성 질환과 연관된 종양세포 및 백혈병 줄기세포에서 발현된다. CD33을 타겟팅하는 항체와 그의 용도는 일반적으로 기술되고 있다(예를 들어, Pierelli et al., 1993, Br . J. Haematol . 84:24-30; Matutes et al., 1985, Hemaiol. Oncol . 3 : 179-186; Taussig et al., 2005, Blood 106:4086-4092; Florian et al., 2006, Leuk . & Lymph. 47:207-222 참조).
일부 구체예에서, CD33 결합제는 항체(예를 들어, 모노클론 항체)이다. 유용한 모노클론 항체는 CD33에 대한 항체의 동종 개체군(예를 들어, 인간 CD33의 세포외 도메인)일 수 있다. 모노클론 항체(mAb)는 당분야에서 알려진 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 이것은, 비제한적으로 Koehler와 Milstein (1975, Nature 256:495-497)이 원래 기술한 하이브리도마 기술, 인간 B 세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)을 포함한다. 이러한 항체들은 IgG, IgM, IgE, IgA 및 IgD와 이들의 서브클래스를 포함하는 면역글로불린 분류일 수 있다. 모노클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 생체 외 또는 생체 내에서 배양할 수 있다.
유용한 모노클론 항체는 제한적인 것은 아니나, 인간 모노클론 항체, 인간화된 모노클론 항체, 키메릭 모노클론 항체 및 작용적으로 활성인 이들의 항체 단편을 포함한다.
유용한 CD33 항체들은 당분야에서 알려진 다양한 메카니즘, 예를 들어 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)에 의해 치료효과를 얻을 수 있는 항체를 포함한다. 예를 들어, 항체는 NK 세포, 단핵구, 및 대식세포 같은 면역 이펙터 세포와 상호작용하여 ADCC를 매개할 수 있다.
키메릭 및 인간화된 모노클론 항체 같은 재조합 항체는 인간 및 비인간 부분을 모두 포함하며, 이것은 표준 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조할 수 있다. (예를 들어, Cabilly et al., 미국특허 제4,816,567호; 및 Boss et al., 미국특허 제 4,816,397호 참조; 이 특허들은 모두 여기에 참조로 그 전체가 포함되었다). "인간화된 항체"는 비인간 종에서 유래한 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)과 인간 면역글로불린 분자에서 유래한 프레임워크 영역을 가지는 비인간 종의 항체 분자이다 (예를 들어, 여기에 참조로 그 전체가 포함된, Queen, 미국특허 제 5,585,089호 참조). 이러한 키메릭 및 인간화된 모노클론 항체는, 예를 들어 하기한 문헌에 기술된 방법을 사용하여 당분야에서 알려진 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다: 국제특허공개 WO 87/02671; 유럽 특허공개 제0184187호; 유럽 특허공개 제0171496호; 유럽 특허공개 제0173494호; 국제특허공개 WO 86/01533; 미국특허 제 4,816,567호; 유럽 특허공개 제012023호; Berter et al., 1988, Science 240: 1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad Set. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Cancer. Res. 47:999-1005; Wood et al. 1985, Nature 314:446-449; Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; 미국특허 제5,225,539호; Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al., 1988, Science 239:1534; 및 Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060(각각의 문헌은 여기에 참조로 그 전체 내용이 포함되었다).
인간 모노클론 항체는 당분야에 알려진 다양한 기술들에 의해 제조할 수 있다(예를 들어, Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72-79; Olsson at al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16; 및 미국특허 제5,939,598호와 제5,770,429호 참조).
완전 인간 항체(fully human antibody)는 내생성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 없지만 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 있는 형질전환 마우스에 의해 제조할 수 있다. 형질전환 마우스는 선택된 항원, 예를 들어 CD33 폴리펩티드 전체 또는 일부를 사용하여 일반적 방법으로 면역화된다. 항원에 대한 모노클론 항체는 일반적인 하이브리도마 기술을 사용하여 얻어질 수 있다. 형질전환 마우스에 의해 보유된 인간 면역글로불린 전이유전자는 B 세포 분화에서 재배열된 다음, 클래스 변환(class switching)과 체세포 돌연변이가 일어난다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여, 치료학적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 제조할 수 있다. 인간 항체를 제조하는 이 기술의 개요에 대하여는, 예를 들어, Lonberg and Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93을 참조한다. 인간 항체 및 인간 모노클론 항체를 제조하는 기술과 이러한 항체를 제조하는 전략에 대한 상세한 언급은, 예를 들어 미국특허 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,569,825호; 제5,661,016호; 및 제5,545,806호를 참조한다. 기타 인간 항체들은, 예를 들어 Medarex (Princeton, NJ, 미국)로부터 상업적으로 입수할 수 있으며, 이것은 마우스를 면역화하여 얻어진다.
선택된 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체는 또한 "가이드된 선택"이라고 지칭되는 기술을 사용하여 생성할 수 있다. 이 방법에서, 선택된 비인간 모노클론 항체, 예를 들어 마우스 항체는 동일한 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체의 선택을 가이드하기 위해 사용된다(예를 들어, Jespers et al., 1994, Biotechnology 12:899-903 참조). 인간 항체는 또한, 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 선행기술에서 알려진 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다(예를 들어, Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol 227:381; Marks et al., 1991, J Mol Biol 222:581; Quan and Carter, 2002, The rise of monoclonal antibodies as therapeutics, In Anti-IgE and Allergic Disease, Jardieu and Fick Jr., eds., Marcel Dekker, New York, NY, Chapter 20, pp. 427-469 참조).
유용한 항체 단편은, 비제한적으로 F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fab 단편, Fvs, 단일사슬 항체(SCAs) (예를 들어, 미국특허 제4,946,778호: Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; 및 Ward et al., 1989, Nature 334: 544-54에 기술), scFv, scFv-Fc, FvdsFv, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, SMIPs(예를 들어, 미국 특허출원 공개 제2005-0238646호 참조) 및 하나 이상의 CDR을 포함하고 항체와 동일한 특이성을 갖는 다른 분자들을 포함한다.
다른 구체예에서, 항체는 또다른 단백질에 결합된, 항체 또는 작용적으로 활성인 그의 단편의 융합 단백질이다. 예를 들어, 항체 또는 항체 단편은 공유결합(예를 들어, 펩티드 결합)에 의해 항체 또는 항체 단편이 아닌 다른 단백질(또는 그의 일부, 전형적으로 단백질의 적어도 10, 20 또는 50 아미노산 부분)의 아미노산 서열과 N-터미널 또는 C-터미널에서 융합될 수 있다, 일부 구체예에서, 항체 또는 그의 단편은 가변 도메인 또는 불변 도메인의 C-터미널에서 다른 단백질에 공유결합될 수 있다.
항체는, 예를 들어 공유결합이 항체의 항원 결합 면역특이성을 유지되도록 하는 한, 어떤 형태의 분자의 공유결합에 의해서도 변성될 수 있다. 예를 들어, 항체의 유도체는, 예를 들어, 글라이코실화, 탈글라이코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 탈현실화(derealization), 단백질 분해성 절단, 또다른 단백질과의 결합 등에 의해 추가 변성된 것일 수 있다. 다양한 임의의 화학적 변성이 공지된 방법, 예를 들어 및 비제한적으로 특이성 화학적 절단, 아세틸레이션, 포밀화, 투니카마이신(tunicamycin) 존재 하의 대사성 합성 등에 의해 수행될 수 있다. 또한, 유도체는 하나 이상의 비정상 아미노산을 함유할 수 있다.
특정 구체예에서, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다.(예를 들어, 미국 특허공개 제2006-0003412호 및 제2006-0008882호 참조). 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체 핵산에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변성은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내에서 잔기의 결실 및/또는 잔기 내로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및/또는 치환을 조합하여 최종 구조물에 도달할 수 있으나, 단 최종 구조물은 목적하는 특징을 포함한다. 아미노산 변화는 또한 항체의 번역후 과정을 변경할 수 있으며, 예를 들어 글라이코실화 부위의 수 또는 위치를 변경할 수 있다.
돌연변이에 선호되는 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역의 동정에 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989, Science 244: 1081-1085)가 기술한 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이"라 불린다. 여기에서, 잔기 또는 타겟 잔기의 기를 동정하고(예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu), 아미노산과 항원의 상호작용에 영향을 주는 중성 또는 음전하 아미노산(전형적으로 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체한다. 이후, 치환에 대해 작용 민감성을 나타내는 아미노산 위치는 추가 또는 다른 변이체를 치환 부위에 또는 치환 부위에 대해 도입하여 정제한다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하는 부위가 미리 결정되면, 돌연변이 자체의 성질은 사전 결정하지 않아도 된다. 예를 들어, 주어진 부위에서의 돌연변이 성능을 분석하기 위해 알라닌 스캐닝 또는 랜덤 돌연변이화를 타겟 코돈 또는 영역에서 수행하고 발현된 항체 변이체를 목적 활성에 대해 선별한다.
아미노산 서열 삽입은 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입뿐만 아니라 길이가 하나의 잔기 내지 백 개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및/또는 카복실-터미널 융합을 포함할 수 있다. 터미널 삽입물의 예는 N-터미널 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다.
항체의 또다른 형태는 항체의 아미노산 치환 변이체이다. 이러한 변이체는 상이한 잔기로 대체된 항체 분자 내에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖는다. 치환성 돌연변이화에 대한 최대 관심 부위는 초가변영역을 포함하지만 프레임워크 영역 변성 또한 고려된다.
항체의 생물학적 특성의 실질적 변성은,
(a) 치환 구역 내 폴리펩티드 백본의 구조, 예를 들어, 시트 또는 헬릭스 입체구조(conformation), (b) 타겟 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 규모를 유지하는 그의 효과가 상당히 다른 치환을 선택하여 이루어질 수 있다. 자연적으로 발생하는 잔기는 통상의 측쇄 특성에 기초한 그룹들로 나누어진다:
(1) 소수성: 노르루신(norleucine), met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 연기성: asn, gin, his, lys, arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비보존성 치환은 이 분류들 중 하나의 멤버를 다른 분류로 교환하는 것을 수반한다.
이펙터 작용과 관련하여 항체를, 예를 들어 항체에서, 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 항의존성 세포 식세포작용(ADCP) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 강화하도록 변성하는 것이 바람직하다. 특히, ADCC 활성은 항체의 불변영역에 아미노산 돌연변이를 도입하여 강화될 수 있다(Lazar et al., PNAS 103, 11, 4005-4010, 2006). 이것은 항체의 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입하여 얻어질 수 있다(예를 들어, 미국 특허출원 공개 제2006-0160996호 참조). 선택적으로 또는 추가적으로, 시스테인 잔기는 Fc 영역에 도입되어 이 영역에서 사슬내 디설파이드 결합을 형성할 수 있다. 이렇게 생성된 호모다이머(homodimer) 항체는 개선된 내재화능 및/또는 증가된 CDC 및 ADCC를 가질 수 있다. (예를 들어, Caron et al., 1992, J Exp. Med 176: 1191-1195; and Shopes, 1992, J. Immunol. 148:2918-2922 참조) 강화된 항종양 활성을 갖는 호모다이머 항체는 또한 Wolff et al., 1993, Cancer Research 53:2560-2565에 기술된 헤테로이작용성 (hetero-bifunctional) 가교제를 사용하여 제조할 수 있다. 선택적으로, 항체를 조작하여 이중 Fc 영역을 가지고, 그에 따라 향상된 보체 용균 및 ADCC능을 가질 수 있다(예를 들어, Stevenson et al. 1989, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 참조).
Fc 영역의 다양한 변성들이 당분야에서 과학 문헌과 특허 문헌들에서 제안되었으며, 예를 들면 다음과 같다: EP 0307434, WO 9304173, WO 9734631, WO 9744362, WO 9805787, WO 9943713, WO 9951642, WO 9958572, WO 02060919, WO 03074679, WO 2004016750, WO 2004029207, WO 2004063351, WO 2004074455, WO 2004035752, WO 2004099249, WO 2005077981, WO 2005092925, WO 2006019447, WO 2006031994, WO 2006047350, WO 2006053301, WO 2006088494 및 WO 2007041635.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 332 및/또는 239 및/또는 236 위치에 아미노산 치환을 갖는 Fc 변이체이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 하기 군에서 선택된 Fc 도메인 내에 돌연변이를 가진다:
i) 332 위치, 바람직하게 I332E 위치에서의 단일 치환;
ii) 239 및 332 위치, 바람직하게 S239D/I332E 위치에서의 치환 조합;
iii) 236 및 332 위치, 바람직하게 G236A/I332E 위치에서의 치환 조합;
iv) 236, 239 및 332 위치, 바람직하게 G236A/S239D/I332E 위치에서의 치환 조합.
본 내용에서 Fc 도메인 내 돌연변이를 Kabat EU 넘버링 인덱스에 따른 332 및/또는 239 및/또는 236 위치의 아미노산에서 선택된 하나 이상의 위치에 도입하는 것이 특히 바람직하다. 239 및 332 위치, 특히 S239D/I332E 위치에서의 치환이 특히 바람직하다.
본 발명의 항체에서 Fc 변이체는 이들을 구성하는 아미노산 변성에 따라 정의된다. 따라서, 예를 들어 I332E는 1세대(parent) Fc 폴리펩티드에 대하여 I332E 치환을 갖는 Fc 변이체이다. 마찬가지로, S239D/I332E는 S239D 및 I332E 치환을 갖는 Fc 변이체를 나타내며, S239D/I332E/G236A는 1세대 Fc 폴리펩티드에 대하여 S239D, I332E, 및 G236A 치환을 갖는 Fc 변이체를 나타낸다.
항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위하여, 예를 들어 미국특허 제5,739,277호에 기술된 항체(특히, 항체 단편)에 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 통합시킬 수 있다. 여기서 사용된 "샐비지 수용체 결합 에피토프"란 용어는 IgG 분자(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 생체 내 혈청 반감기 증가를 담당하는 IgG 분자의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.
항체는 그들의 불변영역 내의 보존된 위치에서 글라이코실화될 수 있다(예를 들어, Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32 참조). 면역글로불린의 올리고사카라이드 측쇄는 단백질의 작용(예를 들어, Boyd et al., 1996, MoI Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180 참조), 및 당단백질의 형태와 드러난 3차원 표면에 영향을 줄 수 있는 당단백질 부분들 간의 분자내 상호작용(예를 들어, Jefferis and Lund, supra; Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416 참조)에 영향을 미칠 수 있다. 올리고사카라이드는 또한 제공된 당단백질을 특이적 인지 구조에 기초한 특정 분자에 대해 타겟이 되게 할 수 있다. 예를 들어, 갈락토실레이트화된 IgG에서 인터(inter)-CH2 공간 및 터미널 N-아세틸글루코사민 잔기 외부의 올리고사카라이드 일부 '플립(flips)'이 만노스 결합 단백질을 결합하기 위해 이용될 수 있는 것으로 보고되었다(예를 들어, Malhotra et al. 1995, Nature Med. 1:237-243 참조). 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서 제조된 CAMPATH-1H(인간 림프구의 CDw52 항원을 인식하는 재조합 인간화 마우스 모노클론 IgG1 항체)에서 올리고사카라이드를 글라이코펩티다제로 제거하여 보체 매개 용균(CMCL 또는 CDC)의 완전한 감소를 얻지만(Boyd et al., 1996, MoI Immunol. 32: 131, 1-1318), 뉴라미니다제(neuraminidase)를 사용한 시알산 잔기의 선택적 제거는 CMCL의 상실이 일어나지 않았다. 항체의 글라이코실화는 또한 ADCC에 영향을 주는 것으로 보고되었다. 특히, 양분 GIcNAc의 형성을 촉매하는 글라이코실트랜스퍼라제, β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII)의 테트라사이클린 조절성 발현을 갖는 CHO 세포가 개선된 ADCC 활성을 가지는 것으로 보고되었다 (예를 들어, Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17: 176-180 참조).
항체의 글라이코실화는 전형적으로 N-결합되거나 O-결합된다. N-결합된다는 것은 탄수화물 부분이 아스파라긴 잔기의 측쇄에 결합되는 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기에서, X는 프롤린을 제외한 아미노산이다)은 탄수화물 부분과 아스파라긴 측쇄의 효소적 결합을 위한 인지 서열(recognition sequence)이다. 따라서, 폴리펩티드 내에서 이러한 트리펩티드 서열들 중 하나의 존재는 잠재적인 글라이코실화 부위를 만든다. O-결합된 글라이코실화란 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 사용될 수도 있으나 하이드록시아미노산, 통상적으로 세린 또는 트레오닌에 당(sugar) N-아세일갈라시오사민(aceylgalaciosamine), 갈락토스 또는 자일로스 중 하나의 결합을 지칭한다.
항체의 글라이코실화 변이체는 항체의 글라이코실화 패턴이 변경된 변이체이다. 변경이란 항체에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 부분의 결실, 항체에 하나 이상의 탄수화물 부분의 첨가, 글라이코실화 조성(즉, 글라이코실화 패턴)의 변화, 글라이코실화 정도 등을 의미한다.
글라이코실화 부위를 항체에 첨가하는 것은 아미노산 서열이 하나 이상의 상기한 (N-결합된 글라이코실화 부위의)트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경하여 편리하게 이루어진다. 변경은 또한 (O-결합된 글라이코실화 부위에 대한)원래 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 첨가 또는 이것에 의한 치환으로 가능할 수 있다. 마찬가지로, 글라이코실화 부위의 제거는 항체의 자연적 글라이코실화 부위 내에서 아미노산 변경으로 이루어질 수 있다.
아미노산 서열은 일반적으로 기본적(underlying) 핵산 서열을 변경하여 변성된다. 이러한 방법은 (자연적으로 발생한 아미노산 서열 변이체의 경우)자연적 공급원으로부터의 단리 또는 올리고뉴클레오티드 매개(또는 부위 특이적) 돌연변이, PCR 돌연변이, 또는 항체의 초기에 제조된 변이체 또는 비변이체 버젼의 카셋트 돌연변이에 의한 제조를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
항체의 (글라이코실화 패턴을 포함한)글라이코실화는 또한 아미노산 서열 또는 기본적인 뉴클레오티드 서열을 변경하지 않고 변경될 수 있다. 글라이코실화는 항체를 발현하기 위해 사용된 숙주 세포에 따라 크게 달라진다. 재조합 당단백질의 발현에 사용된 세포 타입, 예를 들어 잠재적인 치료제로서 항체는 거의 원래 세포(native cell)가 아니므로 항체의 글라이코실화 패턴에서 상당한 변이를 기대할 수 있다. (예를 들어, Hse et al., 1997, Biol. Chem. 272:9062-9070 참조.) 숙주 세포의 선택 이외에도, 항체의 재조합 생산 동안 글라이코실화에 영향을 주는 인자는 성장 모드, 배지 배합, 배양 밀도, 산소처리(oxygenation), pH, 정제방법 등이다. 특정한 숙주 유기체에서 얻어진 글라이코실화 패턴을 변경하기 위해 다양한 방법들이 제안되었으며, 예를 들어 올리고사카라이드 제조에 관련된 특정 효소 도입 또는 과발현이다(예를 들어, 미국특허 제5,047,335호; 제5,510,261호; 및 제5,278,299호 참조). 글라이코실화, 또는 특정 형태의 글라이코실화는, 예를 들어 엔도글라이코시다제(endoglycosidase) H(Endo H)를 사용하여 당단백질로부터 효소적으로 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주세포를 유전자 조작하여, 예를 들어 특정 타입의 폴리사카라이드의 처리에 결함을 만들 수 있다. 이 방법 및 유사한 방법은 당분야에 공지되어 있다.
항체의 글라이코실화 구조는, 예를 들어 렉틴(lectin) 크로마토그래피, NMR, 질량 분광분석법, HPLC, GPC, 모노사카라이드 조성 분석, 서열 효소 분해 및, 고pH 음이온 교환크로마토그래피를 사용하여 전하에 따라 올리고사카라이드를 분리하는 HPAEC-PAD 같은 탄수화물 분석의 일반적 기술로 용이하게 분석할 수 있다. 분석 목적을 위한 올리고사카라이드를 유리하는 방법 또한 알려져 있으며, 예를 들어 효소처리(통상적으로 펩티드-N-글리코시다제 F/endo-β-갈락토시다제를 사용하여 수행), 주로 O-결합된 구조를 유리하기 위해 강알칼리 환경을 사용하는 제거, 및 N-결합 및 O-결합 올리고사카라이드를 모두 유리하기 위해 무수 하이드라진을 사용하는 화학적 방법이 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
항체는 또한 Fc 수용체와 상호작용하는 아미노산 잔기 내에서 변성(예를 들어, 치환, 결실 또는 첨가)을 가질 수 있다. 특히, 항체는 항-Fc 도메인과 FcRn 수용체 간의 상호작용에 관련된 것으로 확인된 아미노산 잔기 내에 변성을 가질 수 있다(예를 들어, 국제 특허출원 공개 WO 97/34631 참조).
가장 넓은 측면에서, 본 발명은 인간 CD33에 결합하며 다음과 같이 정의되는 CD33 결합제에 관한 것이다:
a) CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 CDR4, CDR5 및 CDR6를 포함하는 경쇄 가변영역(여기에서 CDR1은 서열번호: 1-14에서 선택된 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호: 15-28에서 선택된 아미노산 서열을 가지고, CDR3는 서열번호:29-42에서 선택된 아미노산 서열을 가지고, CDR4는 서열번호:43-56에서 선택된 아미노산 서열을 가지고, CDR5는 서열번호:57-70에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, CDR6는 서열번호: 71-84에서 선택된 아미노산 서열을 가진다)을 가지거나,
b) 인간 CD33의 아미노산 서열 FFHPIPYYDKNSPVHGYW (서열번호: 141) 내 에피토프 인식.
본 발명은 또한 CD33 결합제의 내재화 키네틱스가 적어도 30%의 항체 초기량이 4시간 인큐베이션한 후 HL60 세포의 세포 표면에 남아있게 하는 CD33 결합제를 제공한다.
본 발명에 따른 CD33 결합제는 린투주맵과는 상이한 에피토프에 결합하는 것을 발견하였다(본 발명의 실시예 4 참조). 두 에피토프(서열번호: 141 및 서열번호: 142)는 중첩되지 않는다. 본 발명에 따른 CD33 결합제와 린투주맵에 의해 인식되는 CD33의 세포외 도메인 상의 상이한 에피토프들은 본 발명에 따른 CD33 결합제와 린투주맵의 상이한 내재화 양태와 ADCC 작용 때문인 것으로 생각된다(본 발명의 실시예 2 및 3 참조).
바람직한 구체예에서, 적어도 40%의 CD33 결합제 초기량이 인큐베이션 후 4시간일 때 세포 표면에 남아있다.
바람직한 구체예에서, 중쇄 가변영역은 서열번호: 85-98에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변영역은 서열번호: 99-112에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구체예에서, CD33 결합제는 서열번호: 113-126에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄와 서열번호: 127-140에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 가진다.
바람직한 구체예에서, CD33 결합제는 인간 CD33 및 사이노몰구스 (cynomolgus) CD33 둘다에 대하여 10 nM 이하의 KD로 친화성을 가진다.
바람직한 구체예에서, CD33 결합제는 인간화된다.
바람직한 구체예에서, CD33 결합제는 완전 인간이다.
바람직한 구체예에서, CD33 결합제는 추가로 이펙터 작용을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 이펙터 작용은 Fc 도메인에 의해 매개된다.
바람직한 구체예에서, CD33 결합제는 Fc 도메인의 작용을 조절하는 Fc 도메인에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
바람직한 구체예에서, Fc 도메인 작용의 조절은 적어도 10%, 바람직하게 50% 또는 100%까지의 ADCC 증가이다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 CD33 결합제를 표 1에 기재하였다:
Figure 112013036710634-pct00001

암의 치료
몇몇의 간행물에서는 1차 AML 및 CML 세포 상의 세포 표면 마커로서 70% 내지 100% 환자들의 악성 세포에서 발현된 CD33을 기술하였다(Scheinberg et al., 1989; Hauswirt et al., 2007; Plesa et al., 2007; Webber et al., 2008). CD33은 백혈병 환자의 말초혈액 및 골수에서 대부분의 악성 세포를 나타내는 악성 골수성 아세포 및, 백혈병 클론 위계의 자기재생과 유지에 대한 능력을 특징으로 하는, 골수 내의 비교적 적은 수의 덜 분화된 세포인 백혈병 줄기세포에서 발현된다. 항체를 사용한 CD33 타겟팅의 임상적 가능성은 다른 치료방법을 적용할 수 없는 재발 AML 환자의 치료에 대해 인증된 항체-칼리케아마이신(calicheamycin) 컨쥬게이트인 Mylotarg®(Gemtuzumab ozogamizin)에 의해 입증되었다. CD33에 대한 대안적 접근은 1상 임상시험에서 효능의 조기 징후를 나타낸 인간화 IgG1 모노클론 항체인 린투주맵(SGN-33, HuM195)의 개발이다(Raza et al., 2009). 모두 합하여 AML 및 기타 CD33-포지티브 악성종양의 치료를 목표로 하는 CD33의 관련성과 실현가능성을 보이는, 임상전 및 임상 데이터가 풍부하다.
급성 골수성 백혈병(AML)은 백혈구의 골수 계열의 악성종양이다. 이 혈액학적 신생물형성은 혈액 및 골수 질환으로, 치료하지 않으면 일반적으로 수 주 내지 수 개월 내에 치명적이 된다. 미국에서는 30000 케이스, 그리고 유럽연합에서는 47000 케이스의 AML의 유병률이 추산되고 있다(10년간 유병률 데이터, Mattson-Jack(2010) 확인). AML은 가장 흔한 형태의 성인 급성 백혈병(약 90%)이며, 약 33%의 새로운 백혈병 케이스를 포함한다. AML로 진단된 환자의 중간 연령은 67세이다. AML은 미국 내 암 사망률 중 약 1.2%를 차지한다.
AML은 체중 감소, 피로, 열 및 도한 같은 비특이적 증상을 유발한다. AML은 혈액 시험, 골수 실험 및 실험실 시험으로 진단하여 AML 서브타입을 측정하고 치료방법을 결정한다.
AML의 치료요법은 환자의 연령과 신체활력도에 크게 좌우된다. 집중 유도(및 후속 강화와 유지) 화학요법을 견딜 수 있는 환자는 세포독성 약물의 병용으로 강력하게 치료된다. 이 환자들은 약 75%의 완전반응을 얻을 가능성이 있다. 이러한 환자 개체군에서 치료적 목표는 치유이다. 그럼에도, AML은 완전반응을 얻은 후 1년 이내에 약 절반의 환자에게서 재발한다. 장기적 치유율은 30% 범위 내이다.
그러나, 동시이환율(co-morbidity)의 진단 또는 존재시 고령은 완화치료 목표를 유발하는 집중 유도 요법을 투여할 수 없다. 따라서, 고령의 AML 환자에서 완화율은 상당히 떨어진다. 고령의 AML 환자의 중간 생존율은 6개월 미만이다.
일 측면에서, CD33 결합제는 포유동물, 바람직하게 사람 환자에서 암의 진전을 지연하거나/하고 암과 연관된 악액질을 감소시키거나, 혈액학적 악성종양(예를 들어, 백혈병)의 재발을 방지 또는 지연하는 등의 암 치료에 유용하다. CD33 결합제는 단독으로 투여하거나 다른 치료제와 동시 투여할 수 있다. 일부 구체예에서, CD33 결합제는 치료 화학요법제의 표준물과 동시 투여된다. CD33 결합제는 비컨쥬게이트 형태(즉, 세포독소와 컨쥬게이트되지 않은) 또는 컨쥬게이트물로서 투여할 수 있다.
본 명세서에서, "환자"란 암을 치료 중이거나 암이 있는 것으로 진단된 사람 또는 기타 포유동물이다.
일부 구체예에서, CD33 결합제는 암의 진전 지연 및/또는 암과 연관된 악액질의 감소가 필요한 환자에게 유효량의 CD33 결합제를 투여하여 환자에서 암의 진전을 지연하거나/하고 암과 연관된 악액질을 감소시키는데 유용하다. 특정한 메카니즘에 제약되지 않고도, CD33 결합제는 골수성 또는 단핵세포 계열(예를 들어, 단핵구, 대식세포, 수지상세포, 및 호중구)의 이펙터 또는 보조세포에 결합하여 이펙터 또는 보조세포 및/또는 종양세포로부터의 다양한 사이토카인, 케모카인(chemokine) 및 성장인자의 생성을 저해하거나 감소시킨다. 종양세포의 성장과 증식을 촉진하고 암 악액질에 기여할 수 있는 이러한 사이토카인, 케모카인 및 성장인자는 비제한적으로, 인터루킨-1β(IL-1β), 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 인터페론-γ(IFN-γ), 혈관내피성장인자(VEGF), 백혈병 저해인자 (L1F), 단핵구 화학유인물질 단백질-1(MCP-1), RANTES, 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨-12(IL-12), 기질 금속단백분해효소(metalloproteinase) 2(MMP2), IP-10 및/또는 대식세포 염증 단백질 1α(MIP1α)를 포함한다. CD33 결합제는 또한 종양세포의 부위로의 대식세포의 이동을 감소시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 환자에게 유효량의 CD33 결합제를 투여하여 사이토카인, 케모카인 또는 성장인자 중 적어도 하나의 농도를 저하시키며, 여기에서 사이토카인, 케모카인 또는 성장인자는 종양세포의 성장과 증식을 촉진하고 비악성 이펙터 세포, 예를 들어 종양관련 대식세포(TAMS)의 종양부위 부근으로의 이동을 촉진하거나/하고 암 악액질에 기여할 수 있다. 특이적 구체예에서, 사이토카인, 케모카인 또는 성장인자는, 예를 들어 인터루킨-1β(IL-1β), 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 인터페론-γ(IFN-γ), 혈관내피성장인자 (VEGF), 백혈병 저해인자 (LIF), 단핵구 화학유인물질 단백질-1(MCP-1), RANTES, 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨-12(IL-12), 기질 금속단백분해효소 2 (MMP2), IP- 10 및/또는 대식세포 염증 단백질 1α(MIP1α)이다.
다른 구체예에서는 CD33에 특이적으로 결합할 수 있는 CD33 결합제의 효과적 섭식량(regimen)을 환자에게 투여하여 암의 진전을 지연하는 방법을 제공한다. CD33 결합제의 투여 결과, 종양세포의 성장 또는 증식을 감소시키고, 전이를 줄이고, 사이토카인, 케모카인 또는 성장인자 중 적어도 하나의 농도를 저하시키고 종양세포의 부근에서 비악성 이펙터 세포를 감소시키는 등에 의해 암의 진전을 지연한다.
다른 구체예에서는 CD33에 특이적으로 결합할 수 있는 CD33 결합제의 효과적 섭식량을 환자에게 투여하여 환자의 종양 총량(tumor burden)을 감소시키는 방법을 제공한다. CD33 결합제의 투여 결과, 종양의 크기 또는 중량을 감소시키고, 사이토카인, 케모카인 또는 성장인자 중 적어도 하나의 농도를 저하시키고, 종양세포의 부근에서 비악성 이펙터 세포를 저하시키고, 종양세포의 부근에서 대식세포의 이동을 저해하고, 종양에서 비악성 이펙터 세포(예를 들어, TAMS 또는 대식세포)의 수를 줄이는 등에 의해 환자의 종양 총량을 억제하거나 저하시킨다.
다른 구체예에서는 CD33에 특이적으로 결합할 수 있는 CD33 결합제의 효과적 섭식량을 환자에게 투여하여 환자의 종양 총량을 감소시키거나 암의 진전을 지연하는 방법을 제공한다. CD33 결합제의 투여 결과, 면역 매개 메카니즘에 의해 종양세포를 파괴할 수 있는, NK 세포 또는 대식세포 또는 단핵구 같은 면역 이펙터 세포를 동원하는 등으로 환자의 종양 총량을 억제하거나 저하시킨다.
항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)은 모노클론 항체의 항종양 활성에 기여할 수 있는 면역 이펙터 세포 매개성 메카니즘이다(Weiner GJ. Monoclonal antibody mechanisms of action in cancer. Immunol Res. 2007,39(1-3):271-8). 항종양 효능에 대한 ADCC의 타당성은 사전임상 모델, 예를 들어 마우스 종양 모델에서 입증되었다(예를 들어, Clynes RA, Towers TL, Presta LG, Ravetch JV.Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets. Nat Med. 2000 Apr;6(4):443-6). 임상시험 데이터는 치료학적 항체의 임상 효능에 대한 ADCC의 타당성을 뒷받침한다(예를 들어, Weng WK, Levy R Two immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms independently predict response to rituximab in patients with follicular lymphoma. J Clin Oncol. 2003 Nov l;21(21):3940-7. Epub 2003 Sep 15). 면역 세포 상에서 모노클론 항체와 Fc 수용체의 상호작용은 ADCC에 기여한다. 항체의 Fc는 Fc 수용체에 대한 강화된 친화도를 나타내기 위해 변성될 수 있다(예를 들어, Presta LG Engineering of therapeutic antibodies to minimize immunogenicity and optimize function. Adv Drug Deliv Rev. 2006 Aug 7;58(5-6):640-56. Epub 2006 May 23). Fc 수용체에 대한 이렇게 강화된 친화도는 ADCC 활성을 증가하여 환자에서 증가된 항종양 효능을 유발할 수 있다.
본 명세서에 기술된 다양한 구체예에서, CD33 결합제는 CD33 포지티브 암(즉, 그의 세포 표면에서 CD33을 과발현하거나, CD33 항체를 사용한 치료요법에 허용가능한 것으로 생각되는 수준으로 CD33를 발현하는 암세포를 포함하는 암)을 치료하기 위해 사용될 수 있다. CD33 결합제는 또한 같은 종류의 정상 조직과 관련하여 비악성 이펙터 세포에서 CD33을 과발현하지 않는 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 암은, 예를 들어 비혈액 악성종양 또는 혈액 악성종양일 수 있다. 특정 실시예에서, 혈액 악성종양은 CD33-포지티브일 수 있으며, 예를 들어 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수단구성 백혈병, 적혈구(erythrocytic) 백혈병, 급성 거핵아구성(megakaryoblastic) 백혈병, 조직구 림프종, 골수성 육종, 비만세포 증식성 장애 또는 골수이형성 증후군(MDS)일 수 있다. 일부 구체예에서, 혈액 악성종양은 CD33-포지티브 악성종양, 예를 들어 급성 골수성 백혈병 또는 골수이형성(myelodysplastic) 증후군(MDS)일 수 있다.
본 명세서에 기술된 다양한 구체예에서, CD33 결합제는 컨쥬게이트되지 않은 항CD33 항체일 수 있다. 예를 들어, 항체는 완전 인간, 인간화 또는 키메릭 항체일 수 있으며, 예를 들어 키메릭 또는 인간화 M 195 항체이다. 항체는 또한 CD33에 대한 특이적 결합에서 M 195 항체와 경쟁하는 항체 같은 다른 항체일 수 있다. 항체는 또한 M 195 항체와 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.
다른 구체예에서, CD33 결합제는 세포독소에 결합(즉, 컨쥬게이트)될 수 있다. 세포독소는, 예를 들어 사포린(saporin), 리신(ricin), 클로로톡신 (chlorotoxin), 녹농균(pseudomonas) 외독소, 녹농균 내독소 또는 디프테리아 독소 같은 펩티드 독소일 수 있다. 세포독소는 또한 화학적(즉, 비펩티드계) 독소, 예를 들어 칼리키아마이신, 독소루비신, 캄토테신(camptothecin), 다우노루비신(daunorubicin), 또는 기타 DNA 결합제일 수 있다. 세포독소는 또한 아우리스타틴(auristatin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 돌라스타틴(dolastatin), 또는 기타 미세소관 차단제일 수 있다.
항CD33 항체인 CD33 결합제는 환자에게 정맥 내로 또는 피하로 0.1 mg/kg 이하 내지 약 25 mg/kg, 바람직하게 1.0 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 투약으로 투여할 수 있다. 항CD33 항체 단편인 CD33 결합제 또는 다른 CD33 결합 단백질은 온전한 항체 0.1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg. 1.0 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 투약에 상당하는 용량으로 투여될 수 있다. CD33 결합제는, 예를 들어 매일, 매주, 격주, 격3주(즉, 3주 마다) 또는 매월, 또는 이를 혼합한 스케쥴로 환자에게 정맥 내로 또는 피하로 투여될 수 있다. CD33 결합제는 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 또는 필요하다면 그 이상의 기간 동안 투여할 수 있다. 일부 구체예에서, CD33 결합제의 (상기한)치료기간 후에는 유지기간이 이어지며, 여기에서 CD33 결합제의 투약은 치료기간보다 낮은 빈도로 투여된다. 예를 들어, 유지 투약은 1-6 개월의 기간 동안 매주, 격주, 격3주 또는 매월 투여할 수 있다. 유지기간의 용량은 치료기간의 용량과 동일할 수 있다.
완화기 혈액 악성종양의 치료
다른 측면에서는 혈액 악성종양(예를 들어, 백혈병)의 완화기에 있는 환자에게 유효량의 CD33 결합제를 투여하여 환자에게서 혈액 악성종양의 재발을 예방 또는 지연하는 방법을 제공하여 잠재하는 혈액 악성종양의 재발을 예방 또는 지연한다. CD33 결합제는 혈액 악성종양(즉, 백혈병 세포) 및/또는 비악성 이펙터 세포의 표면에서 CD33에 특이적으로 결합한다.
본 명세서에서, "환자"란 전형적으로 혈액 악성종양의 치료를 받고 있거나 혈액 악성종양으로 진단된 사람이다. 일부 구체예에서, 혈액 악성종양은 CD33-포지티브 혈액 악성종양이다. 혈액 악성종양은 백혈병(예를 들어, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수단구성 백혈병, 모발세포 백혈병)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 관련된 혈액 장애는 골수이형성 증후군(MDS), 골수섬유증, 골수증식성 질환(예를 들어, 진성적혈구증가증(PV, PCV 또는 PRV), 본태성 혈소판증가증(ET)), 및 경쇄 질환으로 인한 아밀로이드를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
"CD33-포지티브 혈액 악성종양"이란 용어는 악성 세포의 표면에서 CD33의 발현을 특징으로 하는 혈액 악성종양을 지칭한다. CD33-포지티브 혈액 악성종양은 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수단구성 백혈병, 혈소판 백혈병, 골수이형성 증후군, 골수증식성 장애, 불응성 빈혈, 전백혈병 증후군, 림프성 백혈병, 또는 미분화 백혈병을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
일부 구체예에서, 본 방법은 CD33-포지티브 혈액 악성종양의 완화기에 있는 환자에게 CD33 결합제의 유효 섭식량을 투여하는 것을 포함하여 혈액 악성종양의 재발을 예방하거나 지연한다. 일부 구체예에서, 환자는 혈액 악성종양의 검출가능한 세포가 결핍되어 있다. 여기에서 사용된, "검출가능한 세포의 결핍"은 표준 진단 또는 예후 방법으로 측정된다. AML의 완화기에 있는 환자는 전형적으로 비정상적 임상 특징의 해소, <5%의 아세포의 골수 내 정상 혈구수치 및 정상 조혈작용 회복, >1.000-1,500의 호중구 수치, >100,000의 혈소판 수치, 및 백혈병 클론의 소멸을 나타낸다. (예를 들어, The Merck Manual, Sec. 11, Ch. 138 (17th ed. 1997): Estey, 2001, Cancer 92(5): 1059-1073 참조)
CD33 결합제는, 예를 들어 CD33에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있고, 혈액 악성종양은 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수단구성 백혈병, 티모이드(thymoid) 백혈병, 골수이형성 증후군, 골수증식성 장애, 불응성 빈혈, 전백혈병 증후군, 림프성 백혈병, 또는 미분화 백혈병일 수 있다.
일부 구체예에서, 혈액 악성종양의 완화기에 있는 환자는 골수이식이 시술되지 않는다. 다른 구체예에서, 혈액 악성종양의 완화기에 있는 환자는 골수이식이 시술된다. 골수이식은 자가 골수이식 또는 동종 골수이식일 수 있다.
하기한 암 종류가 본 발명에 따른 항체로 치료하는데 특히 적합하다:
혈액매개 암(Blood-borne cancer), 예를 들어 및 비제한적으로 급성 림프구성 백혈병 "ALL", 급성 림프구성 B-세포 백혈병, 급성 림프구성 T-세포 백혈병, 급성 골수아구 백혈병 "AML", 급성 전골수구 백혈병 "APL", 급성 단모세포성 백혈병, 급성 적백혈병성 백혈병, 급성 거핵아구 백혈병, 급성 골수단구성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 급성 미분화 백혈병, 만성 골수성 백혈병 "CML", 만성 림프구성 백혈병 "CLL", 모발세포 백혈병, 다발성 골수종.
CD33 결합제로 치료하는데 적합한 급성 및 만성 백혈병은 다음을 포함한다: 림프구성, 골수성, 림프성, 골수세포 백혈병 및 혈소판 백혈병. 또한 골수이형성증, 골수증식 장애, 불응성 빈혈, 전백혈병 증후군, 림프성 백혈병, 또는 미분화 백혈병을 CD33 결합제로 치료할 수 있다.
다른 활성물질과의 병용
치료될 장애에 따라, 본 발명의 CD33 결합제는 그 자체로 또는, 특히 DNA 손상제, DNA 탈메틸화제 또는 튜불린(tubulin) 결합제 또는 암 세포 내에서 혈관신생, 신호전달경로 또는 유사분열 체크포인트를 저해하거나 면역조절 작용(IMID)을 갖는 치료적으로 활성인 화합물에서 선택된 하나 이상의 추가 치료제와 병용하여 사용할 수 있다.
추가 치료제는 CD33 결합제와, 임의로 동일한 약학적 제제의 성분으로서 동시에 또는 그의 투여 전후에 투여될 수 있다.
특정 구체예에서, 추가 치료제는 제한적인 것은 아니나, 다음의 군에서 선택된 하나 이상의 저해제일 수 있다: EGFR류, VEGFR류, VEGF, IGF-1R, 인슐린 수용체, 오로라(Aurora)A, 오로라B, PLK 및 PI3 키나제, FGFR, PDGFR, Raf, KSP 또는 PDK1의 저해제.
추가 치료제의 다른 예는 CDK, Akt, Src, Bcr-Ab1, cKit, cMet/HGF, Her2, Her3, c-Myc, Flt3, HSP90의 저해제, 헤지호그(hedgehog) 길항제, JAK/STAT, Mek, mTor, NFkappaB, 프로테아좀(proteasome), Rho의 저해제, Wnt 시그널링 또는 Notch 시그널링의 저해제 또는 유비퀴틴화(ubiquitination) 경로 저해제이다.
추가 치료제의 다른 예는 DNA 폴리머라제의 저해제, 토포아이소머라제 II 저해제, 멀티티로신 키나제 저해제, CXCR4 길항제, IL3RA 저해제, RAR 길항제, KIR 저해제, 면역치료 백신, TUB 저해제, Hsp70 인듀서(inducer), IAP류 저해제, DNA 메틸트랜스퍼라제 저해제, TNF 저해제, ErbB1 수용체 티로신 키나제 저해제, 멀티키나제 저해제, JAK2 저해제, RR 저해제, 세포자연사 인듀서, HGPRTase 저해제, 히스타민 H2 수용체 길항제 및 CD25 수용체 길항제이다.
오로라 저해제의 예는 비제한적으로, PHA-739358, AZD-1152, AT-9283, CYC-116, R-763, VX-667, MLN-8045, PF-3814735, SNS-314, VX-689, GSK-1070916, TTP-607, PHA-680626, MLN-8237, BI847325 및 ENMD-2076이다.
PLK 저해제의 예는 GSK-461364, BI2536 및 BI6727이다.
raf 저해제의 예는 BAY-73-4506 (또한 VEGFR 저해제), PLX-4032, RAF-265 (또한 VEGFR 저해제), 소라페닙(sorafenib)(또한 VEGFR 저해제), XL-281, 네바바(Nevavar) (또한 VEGFR의 저해제) 및 PLX4032이다.
KSP 저해제의 예는 이스피네시브(ispinesib), ARRY-520, AZD-4877, CK-1122697, GSK-246053A, GSK-923295, MK-0731, SB-743921, LY-2523355, EMD-534085이다.
src 및/또는 bcr-abl 저해제의 예는 다사티닙(dasatinib), AZD-0530, 보수티닙(bosutinib), XL-228 (또한 IGF-1R 저해제), 닐로티닙(nilotinib)(또한 PDGFR 및 cKit 저해제), 이마티닙(또한 cKit 저해제), NS-187, KX2-391, AP-24534 (또한 EGFR, FGFR, Tie2, Flt3의 저해제), KM-80 및 LS-104 (또한 Flt3, Jak2의 저해제)이다.
PDK1 저해제의 예는 AR-12이다.
Rho 저해제의 예는 BA-210이다.
PI3 키나제 저해제의 예는 PX-866, PX-867, BEZ-235(또한 mTor 저해제), XL-147, 및 XL-765 (또한 mTor 저해제), BGT-226, CDC-0941이다.
cMet 또는 HGF의 저해제 예는 XL-184 (또한 VEGFR, cKit, Flt3의 저해제), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (또한 VEGFR의 저해제), MGCD-265 (또한 VEGFR, Ron, Tie2의 저해제), SU-11274, PHA-665752, AMG-102, AV-299, ARQ-197, MetMAb, CGEN-241, BMS-777607, JNJ-38877605, PF-4217903, SGX-126, CEP-17940, AMG-458, INCB-028060, 및 E-7050이다.
c-Myc 저해제의 예는 CX-3543이다.
Flt3 저해제의 예는 AC-220 (cKit 및 PDGFR의 저해제), KW-2449, LS-104 (또한 bcr-abl 및 Jak2의 저해제), MC-2002, SB-1317, 레스타우르티닙(lestaurtinib) (또한 VEGFR, PDGFR, PKC의 저해제), TG-101348 (또한 JAK2의 저해제), XL-999 (또한 cKit, FGFR, PDGFR 및 VEGFR의 저해제), 수니티닙(또한 PDGFR, VEGFR 및 cKit의 저해제), 및 탄두티닙(또한 PDGFR, 및 cKit의 저해제)이다.
HSP90 저해제의 예는, 타네스피마이신(tanespimycin), 알베스피마이신(alvespimycin), IPI-504, STA-9090, MEDI-561, AUY-922, CNF-2024, 및 SNX-5422이다.
JAK/STAT 저해제의 예는 CYT-997(또한 튜불린과 상호작용), TG-101348 (또한 Flt3의 저해제), 및 XL-019이다.
Mek 저해제의 예는 ARRY-142886, AS-703026, PD-325901, AZD-8330, ARRY-704, RDEA-119, 및 XL-518이다.
mTor 저해제의 예는 템시롤리무스(temsirolimus), 데포롤리무스(또한 VEGF 저해제로서 작용), 에버롤리무스(또한 VEGF 저해제), XL-765 (또한 PI3 키나제 저해제), 및 BEZ-235 (또한 PI3 키나제 저해제)이다.
Akt 저해제의 예는 페리포신(perifosine), GSK-690693, RX-0201, 및 트리시리빈(triciribine)이다.
cKit 저해제의 예는 마시티닙(masitinib), OSI-930 (또한 VEGFR 저해제로서 작용), AC-220(또한 Flt3 및 PDGFR의 저해제), 탄두티닙(또한 Flt3 및 PDGFR의 저해제), 악시티닙(axitinib)(또한 VEGFR 및 PDGFR의 저해제), 수니티닙(또한 Flt3, PDGFR, VEGFR의 저해제), 및 XL-820 (또한 VEGFR- 및 PDGFR 저해제로서 작용), 이마티닙(또한 bcr-abl 저해제), 닐로티닙(또한 bcr-abl 및 PDGFR의 저해제)이다.
헤지호그 길항제의 예는 IPI-609, CUR-61414, GDC-0449, IPI-926, 및 XL-139이다.
CDK 저해제의 예는 셀리시클립(seliciclib), AT-7519, P-276, ZK-CDK(또한 VEGFR2 및 PDGFR 저해), PD-332991, R-547, SNS-032, PHA-690509, PHA-848125, 및 SCH-727965이다.
프로테아좀 저해제의 예는 보르테조밉(bortezomib), 카필조밉(carfilzomib), 및 NPI-0052 (또한 NFkappaB의 저해제)이다.
프로테아좀 저해제/NFkappaB 경로 저해제의 예는 보르테조밉, 카필조밉, NPI-0052, CEP-18770, MLN-2238, PR-047, PR-957, AVE-8680, 및 SPC-839이다.
유비퀴틴화 경로 저해제의 예는 HBX-41108이다.
탈메틸화제의 예는 5-아자시티딘 및 데시타빈이다.
혈관신생 저해제(anti-angiogenic agent)의 예는 FGFR, PDGFR 및 VEGF(R)의 저해제와, 탈리도마이드이고, 이러한 제제는 비제한적으로, 베바시주맵, 모테사닙(motesanib), CDP-791, SU-14813, 텔라티닙(telatinib), KRN-951, ZK-CDK (또한 CDK의 저해제), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiD, 탈리도마이드, CC-4047, 레날리도마이드, ENMD-0995, IMC-D11, Ki-23057, 브리바닙, 세디라닙, 1B3, CP-868596, IMC-3G3, R-1530 (또한 Flt3의 저해제), 수니티닙(또한 cKit 및 Flt3의 저해제), 악시티닙(또한 cKit의 저해제), 레스타우르티닙(또한 Flt3 및 PKC의 저해제), 바탈라닙(vatalanib), 탄두티닙(또한 Flt3 및 cKit의 저해제), 파조파닙(pazopanib), PF-337210, 아플리버셉트(aflibercept), E-7080, CHIR-258, 소라페닙 토실레이트(또한 Raf의 저해제), 반데타닙, CP-547632, OSI-930, AEE-788(또한 EGFR 및 Her2의 저해제), BAY-57-9352 (또한 Raf의 저해제), BAY-73-4506 (또한 Raf의 저해제), XL-880 (또한 cMet의 저해제), XL-647 (또한 EGFR 및 EphB4의 저해제), XL-820(또한 cKit의 저해제), 닐로티닙(또한 cKit 및 brc-abl의 저해제), CYT-116, PTC-299, BMS-584622, CEP-11981, 도비티닙(dovitinib), CY-2401401, ENMD-2976 및 BIBF1120에서 선택된다.
추가 치료제는 또한 EGFR 저해제에서 선택할 수 있으며, 이것은 소분자 EGFR 저해제 또는 항-EGFR 항체일 수 있다. 항-EGFR 항체의 예는, 비제한적으로 세툭시맵, 파니투무맵, 니모투주맵(nimotuzumab), 잘루투무맵(zalutumumab)이고; 소분자 EGFR 저해제의 예는 게피티닙, 에를로티닙, 반데타닙(또한 VEGFR의 저해제) 및 아파티닙(또한 Her2의 저해제)이다. EGFR 조절제의 다른 예는 EGF 융합 독소이다.
본 발명의 CD33 결합제와의 병용에 유용한 다른 EGFR 및/또는 Her2 저해제는 라파티닙, 트라스투주맵, 페르투주맵, XL-647, 네라티닙(neratinib), BMS-599626 ARRY-334543, AV-412, mAB-806, BMS-690514, JNJ-26483327, AEE-788 (또한 VEGFR의 저해제), AZD-8931, ARRY-380 ARRY-333786, IMC-11F8, Zemab, TAK-285, AZD-4769, 및 아파티닙(Her2 및 EGFR의 이중 저해제)이다.
본 발명의 CD33 결합제와의 병용에 유용한 DNA 폴리머라제 저해제는 Ara-C/시타라빈, Clolar/ 클로파라빈이다.
본 발명의 CD33 결합제와의 병용에 유용한 DNA 메틸트랜스퍼라제 저해제는 Vidaza/아자시티딘(azacitidine)이다.
본 발명의 CD33 결합제와의 병용에 유용한 세포자연사 인듀서는 Trisenox/삼산화비소이다.
본 발명의 CD33 결합제와의 병용에 유용한 토포아이소머라제 II 저해제는 이다루비신(idarubicin), 다우노루비신(daunorubicin) 및 미톡산트론(mitoxantrone)이다.
본 발명의 CD33 결합제와의 병용에 유용한 RAR 길항제는 Vesanoid/트레티노인(tretinoin)이다.
본 발명의 CD33 결합제와의 병용에 유용한 HGPRTase 저해제는 Mercapto/머캡토퓨린이다.
본 발명의 CD33 결합제와의 병용에 유용한 히스타민 H2 수용체 길항제는 Ceplene/히스타민 디하이드로클로라이드이다.
본 발명의 CD33 결합제와의 병용에 유용한 CD25 수용체 작용물질은 IL-2이다.
추가 약물은 또한 IGF-IR과 인슐린 수용체 경로를 목표로 하는 제제에서 선택할 수 있다. 이러한 제제는 IGF-IR에 결합하는 항체(예를 들어 CP-751871, AMG-479, IMC-A12, MK-0646, AVE-1642, R-1507, BIIB-022, SCH-717454, rhu Mab IGFR 및 IGF1-R의 키나제 도메인을 목표로 하는 신규한 화학물질(예를 들어, OSI-906 또는 BMS-554417, XL-228, BMS-754807)을 포함한다.
본 발명의 CD33 결합제를 사용하는 치료요법에서 유리하게 병용할 수 있는 기타 제제는 CD20을 타겟으로 하는 분자, 예를 들어 CD20 특이적 항체, 예를 들어 리툭시맵, LY-2469298, 오크렐리주맵(ocrelizumab), MEDI-552, IMMU-106, GA-101(=R7159), XmAb-0367, 오파투무맵(ofatumumab), 방사능표지된 CD20 항체, 예를 들어 토시투무맵 및 이브리투모맵(ibritumomab) 티욱세탄(tiuxetan) 또는 기타 CD20 선택성 단백질, 예를 들어 SMIP Tru015, PRO-131921, FBT-A05, 벨투주맵, R-7159이다.
CD33 결합제는 백혈구에서 발현된 다른 표면항원의 저해제, 특히 항체 또는 항체 유사 분자, 예를 들어 항-CD2(시플리주맵), 항-CD4(자놀리무맵), 항-CD19(MT-103, MDX-1342, SAR-3419, XmAb-5574), 항-CD22(에프라투주맵), 항-CD23(루밀릭시맵), 항-CD30(이라투무맵), 항-CD32B(MGA-321), 항-CD38(HuMax-CD38), 항-CD40 (SGN40), 항-CD52 (알렘투주맵), 항-CD80 (갈릭시맵)과 병용할 수 있다.
CD33 결합제와 병용될 다른 약물은 면역독소(immunotoxin), 예를 들어 BL-22(항-CD22 면역독소), 이노투주맵 오조가마이신(항-CD23 항체-칼리키아마이신 컨쥬게이트), RFT5.dgA (항-CD25 리신 독소 A-사슬), SGN-35(항-CD30-아우리스타틴 E 컨쥬게이트), 및 겜투주맵 오조가마이신(항-CD33 칼리키아마이신 컨쥬게이트), MDX -1411(항-CD70 컨쥬게이트), 또는 90Y-에프라투주맵 같은 방사능표지된 항체(항-CD22 방사성면역컨쥬게이트)이다.
또한, CD33 결합제는 면역조절제, 제제, 예를 들어 세포자연사를 유도하거나 시그널 전달 경로를 변성하는 항체, 예를 들어 TRAIL 수용체 조절제 마파투무맵(TRAIL-1 수용체 작용물질), 렉사투무맵(lexatumumab)(TRAIL-2 수용체 작용물질), 티가투주맵, Apomab, AMG-951 및 AMG-655; 항-HLA-DR 항체(예: 1D09C3), 항-CD74, 파골세포분화인자 리간드 저해제(예: 데노수맵(denosumab)), BAFF 길항제(예: AMG-623a) 또는 Toll-유사 수용체의 작용물질(예를 들어 TLR-4 or TLR-9)과 병용할 수 있다.
본 발명의 CD33 결합제와 병용하여 사용될 수 있는 다른 약물은 비제한적으로, 호르몬, 호르몬 유사물질 및 항호르몬제(예를 들어, 타목시펜(tamoxifen), 토레미펜(toremifene), 랄록시펜(raloxifene), 풀베스트란트(fulvestrant), 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide), 비칼루타미드(bicalutamide), 시프로테론 아세테이트(cyproterone acetate), 피나스테라이드(finasteride), 부세렐린 아세테이트, 플루드로코르틴손(fludrocortinsone), 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 메드록시프로게스테론(medroxyprogesterone), 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 디에틸스틸베스트롤, 테스토스테론 프로피오네이트, 플루옥시메스테론/등가물, 옥트레오티드(octreotide), 아족시펜(arzoxifene), 파시레오티드(pasireotide), 바프레오티드(vapreotide), 아드레노코르티코스테로이드/길항제, 프레드니손, 덱사메타손, 아이노글루테티미드), 아로마타제(aromatase) 저해제(예를 들어, 아나스트로졸 (anastrozole), 레트로졸(letrozole), 리아로졸(liarozole), 엑세메스탄(exemestane), 아타메스탄(atamestane), 포메스탄(formestane)), LHRH 작용제 및 길항제(예를 들어, 고세렐린 아세테이트 (goserelin acetate), 루프롤라이드(leuprolide), 아바렐릭스(abarelix), 세트로렐릭스(cetrorelix), 데스로렐린(deslorelin), 히스트렐린(histrelin), 트립토렐린 (triptorelin)), 항대사물질(antimetabolites)(예를 들어, 메토트렉세이트, 트리메트렉세이트, 페메트렉세드(pemetrexed)와 같은 항폴린산제(antifolate), 5-플루오로우라실, 플루오로데옥시유리딘, 카페시타빈(capecitabine), 데시타빈(decitabine), 넬라라빈(nelarabine), 5-아자시티딘 및 겜시타빈(gemcitabine) 같은 피리미딘 유사물질, 머캡토퓨린(mercaptopurine), 티오구아닌(thioguanine), 아자티오프린, 클라드리빈(cladribine) 및 펜토스타틴(pentostatin) 같은 퓨린 및 아데노신 유사물질, 시타라빈(cytarabine), 플루다라빈(fludarabine), 클로파라빈); 항종양 항생제(예를 들어, 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신, 에피루비신(epirubicin) 및 이다루비신(idarubicin) 같은 안트라사이클린, 미토마이신-C(mitomycin-C), 블레오마이신(bleomycin) 닥티노마이신 (dactinomycin), 플리카마이신 (plicamycin), 스플리카마이신 (splicamycin), 악티노마이신 D, 미톡산트론(mitoxantrone), 미톡산트론이다루비신, 픽산트론(pixantrone), 스트렙토조신(streptozocin), 아피디콜린); 플래티넘 유도체(예를 들어, 시스플라틴(cisplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 카보플라틴(carboplatin), 로바플라틴(lobaplatin), 사트라플라틴(satraplatin)); 알킬화제(예를 들어, 에스트라무스틴(estramustine), 세무스틴, 메클로레타민 (meclorethamine), 멜팔란(melphalan), 클로람부실(chlorambucil), 부술판(busulphan), 다카바진(dacarbazine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 히드록시우레아, 테모졸로미디(temozolomide), 카무스틴(carmustine) 및 로무스틴(lomustine) 같은 니트로소우레아, 티오테파(thiotepa)); 항유사분열제(antimitotic agents) (예를 들어, 빈블라스틴 (vinblastine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 빈플루닌(vinflunine) 및 빈크리스틴(vincristine) 같은 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids); 및 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel) 및 이들 제제, 라로탁셀(larotaxel) 같은 탁산(taxane); 시모탁셀(simotaxel), 및 익사베필론(ixabepilone) 같은 에포틸론(epothilone), 파투필론(patupilone), ZK-EPO); 토포아이소머라제 저해제(예를 들어, 에토포시드 및 에토포포스(etopophos) 같은 에피포도필로톡신(epipodo-phyllotoxin), 테니포시드(teniposide), 암사크린(amsacrine), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 바녹산트론(banoxantrone), 캄토테신(camptothecin)) 및 레티노산 유도체 같은 다양한 화학요법제, 아미포스틴(amifostine), 아나그렐리드(anagrelide), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨-2, 프로카바진(procarbazine), N-메틸히드라진, 미토탄(mitotane), 및 포르피머(porfimer), 벡사로텐(bexarotene), 셀레콕시브, 에틸렌민(ethylenemine)/메틸-멜라민, 트리에티엔멜라민(thri-ethyienemelamine), 트리에틸렌 티오포스포아미드, 헥사메틸멜라민, 및 효소 L-아스파라기나제, L-아르기나제 및 메트로니다졸, 미소니다졸, 데스메틸미소니다졸, 피모니다졸, 에타니다졸(etanidazole), 니모라졸(nimorazole), RSU 1069, E09, RB 6145, SR4233, 니코틴아미드, 5-브로모데오자이유리딘(5-bromodeozyuridine), 5-요오도데옥시유리딘, 브로모데옥시사이티딘, 에리트로하이드록시노닐-아데닌, 안트라센디온, GRN-163L(경쟁적 텔로머라제(telomerase) 템플레이트 길항제), SDX-101 (PPAR 작용물질), 탈라보스태트(talabostat)(DPP 저해제), 포로데신(forodesine) (PNP 저해제), 아타시셉트(atacicept)(TNF류 BLyS 및 APRIL을 타겟으로 하는 가용성 수용체), TNF-알파 중화제(Enbrel, Humira, Remicade), XL-844 (CHK1/2 저해제), VNP-40101M(DNA 알킬화제), SPC-2996(안티센스 bcl2 저해제), 오바토클락스(obatoclax)(bcl2 저해제), 엔자스타우린(enzastaurin)(PKC 베타 조절제), 보리니스태트(vorinistat)(HDAC 저해제), 로미뎁신(romidepsin)(HDAC 저해제), AT-101(Bcl-2/Bcl-xL 저해제), 플리티뎁신(plitidepsin)(다중-활성 뎁시펩티드), SL-11047(폴리아민 대사 조절제)에서 선택된다.
본 발명의 CD33 결합제는 또한 다른 요법, 예를 들어 수술, 줄기세포 이식, 방사능요법, 내분비선 요법, 생물학적 반응 변성제, 발열요법 및 한냉요법, 및 부작용 약화제(예를 들어, 구토방지제), G-CSF, GM-CSF, 광감작제, 예를 들어 헤마토포르피린 유도체, 포토프린(Photofrin), 벤조포르피린 유도체, Npe6, 틴 에티오포르피린, 페오보라이드(pheoboride)-a 박테리오클로로필-a, 나프탈로시아닌, 프탈로시아닌, 아연 프탈로시아닌과 조합하여 사용할 수 있다.
약학 조성물과 투여방법
CD33 결합제는 조성물이 환자에게 투여될 수 있는 어떠한 형태도 가능하다. 예를 들어, 조성물은 고체 또는 액체 형태일 수 있다. 바람직한 적용 방식은 주입 또는 주사(정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 피내(intradermal))에 의한 비경구 적용이지만, 다른 적용 방식, 예컨대 흡입, 경피, 비강내, 구강, 경구 및 종양내 방식도 적용할 수 있다. 비경구 투여는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흠골내 (intrastemal) 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 일 측면에서, 조성물은 비경구적으로 투여된다. 또다른 측면에서 조성물은 정맥 내로 투여된다.
약학 조성물은 환자에게 투여시 화합물을 생체이용가능하도록 제제화될 수 있다. 조성물은 하나 이상의 용량 단위의 형태를 가질 수 있으며, 이 경우에는, 예를 들어 에어로졸 형태의 화합물 컨테이너가 복수의 용량 단위를 가질 수 있다.
약학 조성물을 제조하는데 사용된 물질은 사용된 양 내에서 비독성일 수 있다. 약학 조성물의 활성성분의 최적 용량이 다양한 인자들에 따라 달라진다는 것은 당업자들에게 자명할 것이다. 관련 인자는 비제한적으로, 환자 형태(예를 들어, 인간), 화합물의 특정 형태, 투여방법, 및 적용된 조성물을 포함한다.
약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클은 미립자일 수 있으며, 그 결과 조성물이, 예를 들어 분말 형태가 된다. 담체는 액체일 수 있으며, 조성물은, 예를 들어 주사용액이 된다. 조성물은 액체 형태일 수 있으며, 예를 들어 비경구 주사용이다. 주사 투여용 조성물에 있어서, 하나 이상의 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 및 등장제도 포함할 수 있다.
액체 조성물은, 용액, 현탁액 또는 다른 유사 형태와 상관없이, 또한 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수, 바람직하게 생리식염수, 링거 용액, 등장성 염화나트륨, 불휘발성유(fixed oils), 예컨대 용매 또는 현탁매질로서 작용할 수 있는 합성 모노- 또는 디-글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 사이클로덱스트린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 용매; 안정화제, 예컨대 아미노산; 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트; 항균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 산화방지제, 예컨대 아스코브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아셀산; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및 장력조절제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. 비경구 조성물은 앰플, 1회용 시린지 또는 유리, 플라스틱 또는 기타 물질로 제조된 다회복약 바이알에 담을 수 있다. 생리식염수는 예시적인 보조제이다. 주사가능한 조성물은 바람직하게 멸균성이다.
CD33 결합제는 또한 건조되거나(동결건조, 분무건조, 분무동결건조, 근 또는 초임계(near or supercritical) 가스에 의한 건조, 진공건조, 공기건조), 침전 또는 결정화되거나, 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 방법 또는, 예를 들어 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 및 폴리-(메틸메타실레이트) 각각을 사용한 계면 중합으로 제조된 마이크로캡슐, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어(microsphere), 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐), 마이크로에멀젼에 포집하거나, 담체 또는 표면상에, 예를 들어 pcmc 방법(단백질 코팅 미세결정)으로 침전 또는 고정시킬 수 있다. 이러한 방법들은 문헌 (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st edition, Hendrickson R. Ed)에 기술되어 있다.
특정한 장애 또는 상태의 치료에 유효한 조성물의 양은 장애 또는 상태의 성질에 따라 달라지며, 표준 임상기술에 의해 결정할 수 있다. 또한, 생체 외 또는 생체 내 에세이를 임의로 적용하여 최적 용량 범위를 확인할 수 있다. 조성물에 적용될 정확한 투약은 또한 투여경로, 및 질환 또는 장애의 심각성에 따라 달라지며, 의사의 판단과 각 환자의 환경에 따라 결정되어야 한다.
조성물은 적합한 용량이 얻어지도록 약물(들) 또는 제제(들)의 유효량을 포함한다. 전형적으로, 이 양은 조성물의 중량으로 적어도 약 0.01%의 약물 또는 제제이다. 경구 투여를 위해서, 이 양은 조성물의 중량으로 약 0.1%에서 약 80%까지의 범위로 변화될 수 있다. 일 측면에서, 경구 조성물은 조성물의 중량으로 약 4% 내지 약 50%의 화합물을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 본 조성물은 비경구 용량 단위가 약 0.01 중량% 내지 약 2 중량%의 화합물을 포함하도록 제조된다.
정맥내 투여를 위해, 조성물은 환자의 체중 1 kg 당 약 1 내지 약 50 mg의 약물 또는 제제를 포함할 수 있다. 일 측면에서, 조성물은 환자의 체중 1 kg 당 약 1, 1.5 또는 2.5 내지 약 50 mg의 약물 또는 제제를 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 투여된 양은 체중 1 kg 당 약 1, 1.5 또는 2.5 내지 약 25 mg 범위의 약물 또는 제제일 것이다.
일부 구체예에서, 환자에게 투여된 용량은 환자 체중 kg 당 0.1 mg 미만 내지 약 50 mg이다. (mg/mm2으로 환산하기 위하여, 1.8 m2의 BSA와 80 kg의 체중이 사용될 수 있다.)
여기에서 언급된 CD33 결합제는 정맥 내 또는 피하로 환자에게 스케쥴에 따라, 즉, 예를 들어 환자에게 매일, 매주, 격주마다, 3주마다 또는 매달 투여할 수 있다. 예를 들어, CD33 결합제는 매주, 2 내지 10주, 전형적으로 3-6 주의 기간 동안 투여할 수 있다. 일부 구체예에서, CD33 결합제의 투약용량은 투약 주기 동안 항체의 혈청 농도를 적어도 5 μg/ml 또는 적어도 10 μg/ml로 유지한다. CD33 결합제는, 예를 들어 1-8, 또는 그 이상 주기로 투여할 수 있다. 일부 구체예에서, CD33 결합제는 대상에게 만성적으로 투여된다.
예를 들어, 본 발명은 0.1 mg/kg 내지 50 mg/kg, 예를 들어 약 1.5-8 또는 2.5-8 mg/kg의 본 발명에 따른 항-CD33 항체를 매주 투여하여 골수성 백혈병 같은 암을 치료하는 방법을 포함한다. 이 치료는 일반적으로 약 1-3 개월, 전형적으로 약 2 개월 동안 지속할 수 있다. 일부 구체예에서, 투약 스케쥴은 모구(blast)의 감소가 나타날 때까지 유지된다. 예를 들어, 투약을 약 6 개월까지 계속할 수 있다. 치료는, 예를 들어 격주 투여(또는 매달 2회)를 포함하여 감소된 투약 스케쥴을 수반할 수 있다. 이러한 투약 스케쥴은 모구의 감소 및/또는 완화를 유지하기 위해 1, 2, 3, 4, 5, 6 개월 또는 그 이상 유지할 수 있다.
일부 구체예에서, 예방제를 CD33 결합제와 함께 투여하여 침출 반응을 최소화할 수 있다. 적합한 예방제는, 예를 들어 메틸 프레드니솔론, 디페닐드라민 (diphenyldramine), 아세트아미노펜 또는 기타 적합한 제제를 포함한다. 예방제는 CD33 결합제와 거의 동시에 또는 이전에 투여할 수 있다.
약물(들) 또는 제제(들) 또는 조성물은 편리한 경로, 예를 들어 주입 또는 정맥 주사(bolus injection)에 의해, 상피 또는 점액피부 내벽(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있다. 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하다. 예를 들어, 리포좀, 극미립자, 마이크로캡슐, 캡슐 등에 캡슐화하는 다양한 전달 시스템이 공지되어 있으며, 이를 화합물 투여에 사용할 수 있다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 약물 또는 제제 또는 조성물을 환자에게 투여한다.
약물 또는 제제에 적절하다면, 하나 이상의 약물 또는 제제 또는 조성물을 치료가 필요한 영역에 국부적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은, 예를 들어 및 비제한적으로 수술시 국부 주입; 국소 적용, 예를 들어 수술 후 상처 드레싱과 결합; 카테터, 좌약, 또는 임플란트에 의한 주사로 이루어질 수 있으며, 임플란트는 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질, 예를 들어 시알라스틱(sialastic) 멤브레인 같은 멤브레인, 또는 섬유로 된 것이다. 일 구체예에서, 암, 종양 또는 신생물 또는 예비신생물 조직의 부위(또는 이전 부위)에 직접 주사로 투여할 수 있다.
약물(들) 또는 제제(들) 또는 조성물은 펌프 또는 다양한 폴리머 물질 같은 제어된 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 또다른 구체예에서, 제어된 방출 시스템은 약물(들) 또는 제제(들) 또는 조성물의 타겟에 근접하여 위치할 수 있으며, 따라서 전신 투여량의 일부만을 필요로 한다(예를 들어, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138, 1984 참조). Langer (1990, Science 249: 1527-1533)의 리뷰에서 언급된 기타 제어된 방출 시스템을 사용할 수 있다.
약물 또는 제제에 적절하다면, 약물 또는 제제는 일반적 과정에 따라 동물, 특히 인간에게 정맥 내 투여용으로 적합화된 약학 조성물로 제제화된다. 전형적으로, 정맥 내 투여용 담체 또는 비히클은 멸균된 등장성 수성 완충액이다. 필요한 경우에 조성물은 또한 가용화제를 포함할 수 있다. 정맥 내 투여를 위한 조성물은 임의로 주사 부위의 통증을 완화하는 리그노카인(lignocaine) 같은 국부 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 예를 들어 활성제의 양을 표시하는 앰플 또는 사세(sachette)와 같은 밀폐된 컨테이너에서 동결건조된 산제 또는 무수 농축물로서, 단위 용량 형태로 개별적으로 또는 함께 혼합되어 공급된다. 약물 또는 제제가 주입에 의해 투여되는 경우, 이것은 제약 등급의 멸균수 또는 멸균 염수를 함유하는 주입 병을 이용하여 분배될 수 있다. 약물 또는 제제가 주사에 의해 투여되는 경우, 멸균 주사용수 또는 염수의 앰플이 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.
치료제 조성물은 또한 허용된 용량 형태에 따라, 예를 들어 정제, 로젠지(lozenge), 수성 또는 유성 현탁액, 그래뉼, 산제, 에멀젼, 캡슐, 시럽, 또는 엘릭서의 형태로 투여될 수 있다. 경구투여 조성물은 하나 이상의 임의의 제제, 예를 들어 감미제, 예컨대 프럭토스, 아스파탐 또는 사카린; 풍미제, 예컨대 페퍼민트, 윈터그린유 또는 체리; 착색제; 보존제를 함유하여 약학적으로 먹을 수 있는 제제를 제공할 수 있다. 또한, 정제 또는 알약(pill) 형태일 경우, 조성물은 위장관에서 붕해 및 흡수를 지연하여 연장된 기간 동안 지속적 작용을 제공하도록 코팅될 수 있다. 삼투활성 작동(driving) 화합물을 에워싼 선택투과성 멤브레인은 또한 경구투여 약물 또는 제제에 적합하다. 이러한 후기 플랫폼에서 캡슐을 둘러싼 환경으로부터의 유동체는 작동 화합물에 의해 흡수되고, 이것이 팽창하여 공극을 통과한 제제 또는 제제 조성물을 대체한다. 이러한 전달 플랫폼은 즉시 방출 배합물의 스파이크 특성과는 대조적으로 기본적으로 0차의 전달 특성을 제공할 수 있다. 또한, 글리세롤 모노스테아레이트 또는 글리세롤 스테아레이트 같은 시간지연물질을 사용할 수 있다.
조성물은 고체 또는 액체 용량 단위의 물리적 형태를 개질하는 다양한 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 활성성분 주위에 코팅 외피를 형성하는 물질을 포함할 수 있다. 코팅 외피를 형성하는 물질은 전형적으로 불활성이고, 예를 들어 당, 쉘락 및 기타 장용성 코팅제에서 선택할 수 있다. 선택적으로 활성성분은 젤라틴 캡슐에 담을 수 있다.
조성물은 이를 필요로 하는 환자에게 주치의가 결정한 빈도 또는 기간 동안 투여할 수 있다. 조성물은 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 10일, 14일, 21일, 28일, 1개월, 2개월, 또는 그 이상의 기간 동안 투여할 수 있다. 조성물은 1일에서 2개월 이상의 기간 동안 투여될 수 있다.
항체 제조
항체의 제조에는 항체의 합성에 유용한 어떠한 방법도 사용할 수 있으며, 특히 예를 들어, 재조합 발현 또는 화학 합성이 있다.
항체 또는, 그의 단편 또는 유도체의 재조합 발현은 전형적으로 항체를 코딩하는 핵산의 구조를 포함한다. 항체의 뉴클레오티드 서열이 알려져 있으면, 항체 또는 그의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립할 수 있으며(예를 들어, Kutmeier at al, 1994, BioTechniques 17: 242에 기술됨), 이것은 항체를 코딩하는 서열의 일부를 함유하는 오버래핑 올리고뉴클레오티드의 합성, 이러한 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 결찰, 및 예를 들어 PCR에 의한 결찰된 올리고뉴클레오티드의 증폭을 포함한다.
선택적으로, 항체 또는 그의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 적합한 공급원으로부터 생성할 수 있다. 특정한 항체를 코딩하는 핵산을 함유하는 클론을 입수할 수 없으나 항체의 서열이 공지된 경우, 항체를 코딩하는 핵산은 적합한 공급원(예를 들어, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 면역 글로불린을 발현하는 조직 또는 세포에서 생성된 cDNA 라이브러리)으로부터, 예를 들어 서열의 3' 및 5' 말단에 하이브리드할 수 있는 합성 프라이머를 사용하는 PCR 증폭 또는 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 클로닝에 의해 얻어질 수 있다.
특정 항원을 특이적으로 인식하는 항체를 상업적으로 입수할 수 없을 경우(또는 이러한 면역글로불린을 코딩하는 핵산을 클로닝하는 cDNA 라이브러리의 공급원을 입수할 수 없는 경우), 특정 항원에 특이적인 항체는 선행 기술에서 알려진 방법, 예를 들어 환자, 또는 래빗 또는 마우스 같은 적합한 동물 모델을 면역하여 폴리클론 항체를 생성하거나, 더욱 바람직하게 문헌[Kohler and Milstein (1975, Nature 256:495-497), 또는 Kozbor et al.(1983, Immunology Today 4:72), 또는 Cole et al.(1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)]에 기술된 바와 같이 모노클로날 항체를 생성하여 제조할 수 있다. 선택적으로, 적어도 항체의 Fab 부분을 코딩하는 클론은 특이적 항원을 결합하는 Fab 단편의 클론에 대한 Fab 발현 라이브러리(예를 들어, Huse et al., 1989, Science 246, 1275-1281에 기술)를 스크리닝하거나, 항체 라이브러리(예를 들어, Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937 참조)를 스크리닝하여 얻어질 수 있다.
일단 적어도 항체의 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열이 얻어지면, 이것을 항체의 불변영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터에 도입할 수 있다(예를 들어, 국제 특허출원 공개 WO 86/05807; WO 89/01036; 및 미국 특허 제5,122,464호 참조). 완전한 항체 분자의 발현이 가능한 완전한 경쇄 또는 중쇄를 함유하는 벡터를 입수할 수 있다. 이후, 항체를 코딩하는 핵산을 사용하여 사슬 내 디설파이드 결합에 참여하는 하나 이상의 가변영역 시스테인 잔기를 설프하이드릴기를 함유하지 않는 아미노산 잔기로 치환(또는 결실)하는데 필요한 뉴클레오티드 치환(들) 또는 결실(들)을 도입할 수 있다. 이러한 변성은 뉴클레오티드 서열에 특이적 돌연변이 또는 결실의 도입에 대해 선행기술에서 알려진 방법으로 수행될 수 있으며, 이 방법은, 예를 들어 화학적 돌연변이화와 생체외 부위 특이적 돌연변이(예를 들어, Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551 참조)이며, 이에 제한되지는 않는다.
또한, "키메릭 항체"의 제조를 위한 기술들이 개발되고 있다(예를 들어, Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454 참조). 키메릭 항체란 상이한 부분들이 상이한 동물종에서 유도된 분자이며, 예컨대 마우스 모노클로날 항체에서 유도된 가변영역과 인간 면역글로불린 불변영역을 갖는 것들로, 예를 들어, 인간화된 항체이다.
항체를 코딩하는 핵산 서열이 얻어지면, 항체 생산을 위한 벡터를 선행기술에서 알려진 방법을 사용하는 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다. 당업자들에게 알려진 방법을 사용하여 항체 코딩 서열과 적절한 전사 및 번역 조절 시그널을 함유하는 발현벡터를 구성할 수 있다. 이 방법들은, 예를 들어 생체외 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 예를 들어, 하기 문헌에 기술된 방법들 참조: Sambrook 등(1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; 및 Sambrook et al., 2001; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Publish., Cold Spring Harbor, N.Y.) 및 Ausubel 등(eds., 1993-2006, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.).
항체의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터 또는 항체의 뉴클레오티드 서열을 숙주세포에 일반적 기술(예를 들어, 전기천공법, 리포좀 트랜잭션(transaction), 인산칼슘 침전 또는 형질도입)에 의해 전이시킬 수 있고, 얻어진 세포는 이후 일반적 기술에 의해 배양하여 항체를 제조한다. 특이적 구체예에서, 항체의 발현은 구성적, 유도가능한 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
재조합 항체를 발현하기 위해 사용된 숙주세포는 박테리아 세포, 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 또는 바람직하게, 특히 재조합 면역글로불린 분자의 발현을 위한 진핵세포일 수 있다. 특히, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO) 같은 포유동물 세포는, 인간 사이토메갈로바이러스에서 유래한 주요 중간체 조기 유전자 프로모터 성분을 함유하는 벡터와 함께 면역글로불린의 효과적인 발현 시스템이다(예를 들어, Foecking et al., 1986, Gene 45: 101; Cockett et al., 1990, BioTechnology 8:2 참조). CHO 세포주는, 예를 들어 DG44 또는 CHO-S일 수 있다. 다른 예에서, 항체는 CHEF 시스템을 사용하여 발현될 수 있다. (예를 들어, 미국특허 제5,888,809호 참조.)
다양한 다른 숙주 발현 벡터 시스템을 사용하여 항체를 발현할 수 있다. 이러한 숙주 발현 시스템은 항체의 코딩 서열을 제조하고 이어서 정제할 수 있는 비히클일뿐만 아니라 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 형질감염될 때 원위치에서 항체 면역글로불린 분자를 발현할 수 있는 세포이다. 이것은, 비제한적으로 면역글로불린 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아(예를 들어, E. coli와 B. subtilis) 같은 미생물; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, Saccharomyces pichia); 면역글로불린 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현벡터(예를 들어, 바큘로바이러스(baculovirus))로 감염된 곤충세포 시스템; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 및 담배 모자이크 바이러스(TMV))로 감염되거나 재조합 플라스미드 발현벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 후기(late) 프로모터; 백시니아(vaccinia) 바이러스 7.5K 프로모터)에서 유도된 프로모터를 함유하는 재조합 발현 구조물을 갖는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, CHO-S, BH, 293, 293T 또는 3T3 세포)을 포함한다.
박테리아 시스템에서, 수많은 발현벡터들은 발현되는 항체에 대하여 의도된 용도에 따라 유리하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 다량의 이러한 단백질이 제조되어야 하는 경우, 용이하게 정제되는 높은 농도의 융합 단백질 생성물의 발현을 선택하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터들은 비제한적으로, 융합 단백질을 제조하기 위해 항체 코딩 서열이 lac Z 코딩영역을 갖는 프레임 내에서 벡터에 개별적으로 결찰될 수 있는 E. coli 발현벡터 pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791-94); pIN 벡터 (Inouye and Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke and Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509) 등을 포함한다. pGEX 벡터들은 또한 융합 단백질인 외래 폴리펩티드를 글루타티오닌 S-트랜스퍼라제(GST)로 발현하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질은 가용성이고, 흡착 및 매트릭스 글루타티오닌 아가로스 비드(beads)에 결합 후의 자유 글루타티오닌의 존재 하에서 용출하여 용균된 세포에서 쉽게 정제할 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 Xa 인자 프로테아제 분해 부위를 포함하도록 설계되어 클론된 타겟 유전자 생성물이 GST 잔기에서 방출될 수 있다.
곤충계에서, 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스(polyhedrosis) 바이러스(AcNPV) 또는 노랑초파리(Drosophila melanogaster)에서의 유사 바이러스를 벡터로 사용하여 외래 유전자를 발현할 수 있다. 바이러스는 스포도피에라 프루기펜타(Spodopiera frugipenta) 세포에서 생육한다. 항체를 코딩하는 서열은 바이러스의 비필수 영역(예를 들어, 폴리헤드린(polyhedrin) 유전자)에 개별적으로 클론되어 AcNPV 프로모터(예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 조절 하에 놓일 수 있다.
포유동물 숙주세포에서는 다양한 바이러스 기반 발현 시스템을 사용할 수 있다. 아데노바이러스가 발현벡터로 사용되는 경우에 주목되는 항체 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예를 들어 후기 프로모터 및 삼련(tripartite) 리더 서열에 결찰될 수 있다. 이후, 키메릭 유전자는 아데노바이러스 게놈 내에 생체외 또는 생체내 재조합에 의해 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 영역(예를 들어, E1 또는 E3 영역)내 삽입 결과, 살아있으며 감염된 숙주 내에서 면역글로불린 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 얻는다. (예를 들어, Logan and Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :355-359 참조). 특이적 개시 시그널은 또한 삽입된 항체 코딩 서열의 효과적인 번역에 필요할 수 있다. 이러한 시그널은 ATG 개시코돈과 인접 서열을 포함한다. 또한, 개시코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하는 목적하는 코딩 서열의 리딩 프레임에 작동적으로 연결된다. 이러한 외인성 번역 조절 시그널과 개시코돈은 자연적인 것과 합성의 다양한 기원을 가질 수 있다. 발현효율은 적절한 전사 인핸서 성분, 전사 터미네이터 등을 포함하여 강화될 수 있다. (예를 들어, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544 참조).
또한, 숙주세포 균주를 선택하여 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 유전자 생성물을 목적하는 특이적 형태로 변성 및 처리할 수 있다. 단백질 생성물에 대한 이러한 변성(예를 들어, 글라이코실화) 및 처리(예를 들어, 분해)는 단백질의 작용에 중요한 것일 수 있다. 상이한 숙주세포는 단백질과 유전자 생성물의 번역 후 처리와 변성에 있어서 특징적이고 특이적인 메카니즘을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주계를 선택하므로써 발현된 외래 단백질의 정확한 변성과 처리가 보장될 수 있다. 이를 위하여, 유전자 생성물의 1차 전사, 글라이코실화 및 인산화의 적절한 처리에 대한 세포 장치를 갖는 진핵 숙주세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유동물 숙주세포는, 비제한적으로 CHO (예를 들어, DG44 또는 CHO-S), VERY, BH, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, CRL7030 및 Hs578Bst를 포함한다.
재조합 단백질의 장기, 고수율 생산을 위하여, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항체를 안정하게 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 복제에 대한 바이러스 기원을 함유하는 발현벡터를 사용하는 것보다 숙주세포를 적절한 발현 조절 성분(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 터미네이터, 폴리아데닐레이션 부위, 등)에 의해 조절된 DNA와 선택가능한 마커로 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA를 도입한 후, 조작된 세포를 1-2일 동안 강화배지에서 생육한 다음, 선택배지로 옮길 수 있다. 재조합 플라스미드 내의 선택가능한 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고 세포가 플라스미드를 그의 염색체에 안정하게 통합하여 생육될 수 있게 하여, 결과적으로 클론되어 세포주로 확장될 수 있는 군집(foci)을 형성한다. 이 방법은 항체를 발현하는 세포주를 조작하기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 이처럼 조작된 세포주들은 특히 항체와 직·간접적으로 상호작용하는 종양 항원의 스크리닝과 평가에 유용할 수 있다.
다양한 선택 시스템을 사용할 수 있다. 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(예를 들어, Wigler 등, 1977, 세포 11:223 참조), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(예를 들어, Szybalska and Szybalski, 1992, Proc. Natl Acad. Sci. USA 48:202 참조), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(예를 들어, Lowy et al., 1980, 세포 22:817 참조) 유전자를 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포 각각에 적용할 수 있다. 또한, 항대사물질 저항성을 다음 유전자들에 대한 선택 기준으로 사용할 수 있다: 메토트렉세이트(methotrexate)에 대한 저항성을 제공하는 DHFR(예를 들어, Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad Sci. USA 77:3567-70; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527-31 참조); 마이코페놀산에 대한 저항성을 제공하는 gpt(예를 들어, Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072-76 참조); 아미노글리코시드 G-418에 대한 저항성을 제공하는 neo(예를 들어, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Arm. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; 및 May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215 참조) 및 하이그로마이신(hygromycin)에 대한 내성을 제공하는 hygro(예를 들어, Santerre et al., 1984, Gene 30:147-50 참조). 사용할 수 있는 재조합 DNA 방법에 대해 선행 기술에서 일반적으로 알려진 방법이 Ausubel 등(eds., 1993-2006, Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression. A laboratory Manual, Stockton Press, NY; and in Chapters 12 and 13)과 Dracopoli 등(eds., 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY; and Colberre-Garapin et al., 1981, 7. MoI. Biol. 150:1-14)에 기술되어 있다.
항체의 발현농도는 벡터 증폭으로 증가될 수 있다(리뷰를 위해 Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3., Academic Press, New York, 1987 참조). 항체를 발현하는 벡터 시스템에서 마커가 증폭가능하다면, 숙주세포의 배양액 내에 존재하는 저해제 농도의 증가는 마커 유전자의 복제수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체의 뉴클레오티드 서열과 연결되어 있으므로, 항체 생산 또한 증가할 것이다(예를 들어, Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257-66 참조).
숙주세포는, 중쇄 유도 폴리펩티드를 코딩하는 제1 벡터와 경쇄 유도 폴리펩티드를 코딩하는 제2 벡터, 2개 발현벡터로 동시 형질감염될 수 있다. 이 두 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동등한 발현을 가능하게 하는 동일하거나 상이한 선택성 마커를 함유할 수 있다. 선택적으로, 단일 벡터를 사용하여 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 모두를 코딩할 수 있다. 이 상황에서 과도한 독성 자유 중쇄를 방지하기 위해 경쇄는 전형적으로 중쇄 앞에 위치한다(예를 들어, Proudfoot, 1986, Nature 322:562-65; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197-9 참조). 중쇄 및 경쇄의 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
일단 항체가 재조합 발현되면 이것은 항체 정제에 적합한 방법, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 이후 특이적 항원에 대한 친화성, 및 크기별 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 분별 용해도, 또는 단백질의 정제를 위한 다른 표준방법에 의해 정제할 수 있다.
본 발명에 따른 모노클론 항체를 제조하기 위해 사용된 모든 단계들에 대한 포괄적 참고문헌은 Yokoyama 등, "Production of Monoclonal Antibodies", Current Protocols in Immunology, Unit 2.5, 2006이다.
실시예
실시예 1 : CD33 에 대한 친화성
CD33 결합제는 인간 및 사이노몰구스(cynomolgus) CD33 모두에 대한 KD를 세포주 HL60 및 HEK293-사이노몰구스 CD33 각각에 대하여 10 nM 이하의 친화도로 가진다.
인간 및 사이노몰구스 CD33에 대한 14개의 CD33 결합제(표 1에서 No. 1-14로 각각 나열된 완전 인간 모노클론 항체)를 Brockhoff 등 (Cytometry. 1994 Sep l;17(l):75-83)에 기술된 FACS Scatchard 분석에 의해 CD33 발현 세포(AML-유도 HL60 세포주, 재조합 HEK293-사이노몰구스CD33 세포주)에서 측정하였다. 요약하면, CD33 결합제의 희석물을 96 웰 플레이트에서 제1 웰(80 μl)의 100-400 nM로 출발하여 제조한 다음, 11 희석단계(1:2, 40 + 40 μl)를 수행하였다. 50 μl의 CD33 결합제 희석물을 FACS 튜브에 첨가하고 150 μl 세포(0,8xl06/ml=1,2xl05 세포/튜브)를 각 FACS 튜브에 첨가하였다. 세포를 서서히 혼합하여 1시간 동안 빙냉 하에서 인큐베이션하였다. 이후, 50 μl의 FITC 컨쥬게이트 2차 항체(농도 15 μg/ml; 마우스 mAb 항-인간 IgG)를 첨가하고 혼합하여 30분 동안 빙냉 하에서 혼합하였다. 0.02% 산을 함유하는 4 ml PBS ph7.2를 이후에 첨가하여 세포를 펠릿화하고, 300 μl PBS pH 7.2에 재현탁하여 FACS 분석을 BD FACS Canto를 사용하여 수행하였다. 모든 실험단계들은 젖은 얼음 상에서 수행되었으며, 모든 CD33 결합제 희석물은 PBS/ 0,5% BSA + 0.02% 산으로 제조되었다. FACS 보정은 Quantum FITC MESF (Premix) Beads (Bangs Laboratories)를 사용하여 수행하였다. 모든 샘플은 동일한 FACS 파라미터를 사용하여 측정하였다. 결합된 IgG 대 자유 IgG의 비율은 상이한 CD33 결합제 농도에서의 MFI 값으로부터 계산하였으며 Scatchard 블롯으로 나타내었다. 회귀선을 얻어진 데이터 포인트로부터 얻었으며, 이 선의 기울기는 결합상수의 네가티브값에 해당한다. 결과를 표 2에 기재하였다.
Figure 112013036710634-pct00002

실시예 2 내재화 키네틱스
항체의 내재화란 항체와 인큐베이션한 후 타겟 세포의 세포 표면상에서 항체/항원 복합체 양의 감소를 지칭한다. 내재화 시험은 CD33 발현 HL60 세포주로 수행되었다. 세포를 정해진 양의 CD33 결합제(표 1에서 No. 1-14로 기재된 완전 인간 모노클론 항체 10 μg/ml)와 정해진 시간(0h, 1h, 4h, 24h) 동안 37 ℃에서 인큐베이션하여 항체/항원 복합체를 내재화하였다. 표시된 시점에 산을 인큐베이션 혼합물에 첨가하여 추가 내재화를 방지하였다. 이후, 정해진 양의 CD33 결합제를 첨가하여 모든 CD33 항원 부위를 세포 표면에서 포화하였다. 세포 표면에 결합된 CD33 결합제의 총량을 FACS 분석에 의해 FITC 컨쥬게이트 항-인간 IgG 2차 항체를 사용하여 측정하였다. 시점 0h를 사용하여 표면에서 CD33 항체/항원 복합체의 초기농도를 결정하고 100%로 정의하였다. 결과를 표 3에 기재하고, 도 1-3에 나타내었다.
Figure 112013036710634-pct00003
린투주맵을 레퍼런스 항체로서 포함하였다. 린투주맵/CD33 복합체는 린투주맵의 결합 시 급속하게 내재화되었으며, 이것은 공개된 자료에 따르는 것이다. 4시간 인큐베이션 후에 단지 약 20%의 CD33/린투주맵 복합체 초기량만이 세포 표면에 남았다. 이것은 본 발명에 따른 14개 CD33 결합제 모두의 내재화가 예상 외로 린투주맵과 비교하여 감속되었음을 나타내는 것이다.
실시예 3 : ADCC 활성
감속된 내재화 속도는 증가된 생체외 ADCC 활성으로 해석된다. 감속된 내재화의 CD33 결합제(표 1에서 No. 1-14로 기재된 완전 인간 모노클론 항체)의 ADCC 활성에 대한 효과를 평가하기 위해 타겟 세포(HL60)를 CD33 결합제와 0, 1, 4 및 24h 동안 인큐베이션하였다. 이어서 ADCC 에세이를 이펙터 세포인 IL-2 자극된 PBMC와 타겟 세포인 항체 코팅된 HL60 세포로 수행하였다. 모든 시험에서 30 μg /ml의 mAB 농도가 사용되었다. CD33 결합제 존재 하에서 이펙터 세포와 타겟 세포의 동시배양을 96 웰 둥근바닥 마이크로적정 플레이트에서 10% 인간 혈청과 RPMI 중의 1% BSA를 1 : 1 비율로 포함하는 웰 당 200 μl의 에세이 배지의 최종부피로 4회 또는 3회 수행하였다. 먼저 이펙터 세포(웰 당 RPMI의 10% 인간 혈청 100 μl 중의 새로 단리된 PBMC 세포)를 도말하고, 타겟 세포와 CD33 결합제 용액(RPMI 중의 1% BSA 50 μl로 희석)을 도말하였다. 대조용으로, 이펙터 세포를 에세이 배지만으로 배양하고(이펙터 세포 대조군), 타겟 세포는 에세이 배지만(자발적 용균) 또는 1% Triton X-100으로 보충된 에세이 배지(최대 용균)에서 배양하였다. 동시 배양물을 37 ℃에서 습한 CO2 인큐베이터에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 말기에 세포를 실온에서 배양배지로부터 원심분리(200 x g, 즉, 1000 rpm; 10 분)하여 제거하였다. 세포가 없는 상징액(100 μl/웰)을 96 웰 편평바닥 플레이트의 상응하는 웰에 옮겼다. 이 상징액들의 LDH 활성을 측정하기 위해 100 μl 반응 혼합물(250 μl 촉매와 11.25 ml 염료 용액을 새로 혼합)을 각 웰에 첨가하여 실온의 암소에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 흡광도를 하기한 바와 같이 측정하였다.
세포독성 검출 키트(LDH; Roche 11 644 793 001)를 사용하여 ADCC 활성을 측정하였다. 세포독성의 검출은 플라즈마 멤브레인 손상 세포에서 방출된 LDH 효소 활성의 측정을 기준으로 한다. 배양 상징액에 방출된 LDH는 테트라졸리움 염을 키트에서 포르마잔(formazan)으로 감소시킨다. 포르마잔 염료의 최대 흡수는 ELISA 플레이트 리더에서 650 nm의 레퍼런스 파장에 대해 490 nm에서 측정되었다. 세포 매개 세포독성 퍼센트를 측정하기 위하여 4회 또는 3회 반복의 평균 흡광도를 계산하고 백그라운드를 제하였다. 이러한 정정된 값을 다음 식으로 치환하여 ADCC (%)를 계산하였다:
(이펙터/타겟 세포 혼합물-이펙터 세포 대조군-자발적 방출) / (최대 방출-자발적 방출)
시점 Oh(타겟 세포의 사전 인큐베이션 항체 없음)에서의 ADCC 활성을 100% ADCC 활성으로 정의하였다. 사전 인큐베이션 항체의 다양한 시점에서의 ADCC 활성을 시점 0h에 대하여 계산하여 상대적 세포독성(%)으로 나타내었다.
린투주맵과 비교한 CD33 결합제의 감속된 내재화는 린투주맵과 비교하여 증가된 ADCC 활성을 나타내었다. 결론적으로, 감속된 내재화가 ADCC 활성의 증가를 유발하였다. 기술된 CD33 결합제의 내재화는 CD33 결합제의 ADCC 활성과 역으로 상관되며, 이것은 이러한 CD33 결합제의 임상적 활성과 관련하여 이점을 나타낸다. 결과들을 도 4에 이 실험의 내재화 키네틱스에 대해 나타내었고 도 5에 ADCC 활성을 나타내었다.
실시예 4: 에피토프 맵핑
린투주맵의 에피토프와 관련하여 여기에 기술된 CD33 결합제의 결합 에피토프를 수소 교환 질량 분광광도계(HXMS)로 측정하였다.
이 방법에서는 D20로 교환하는 CD33 단백질의 아미드 골격 수소의 감수성을 측정한다. 이 실험은 재조합 CD33 단백질 단독 및 첨가된 CD33 결합제 / 린투주맵 (이후 본 실시예에서 "항체 / 항체들"이라 함)을 갖는 CD33 단백질로 실시하였다. 따라서, 항체의 결합으로 인한 교환으로부터 상당한 차단을 나타내는 CD33 단백질의 영역을 확인하였다. 이 방법의 해법(resolution)은 펩신으로의 소화에 의해 생산된 펩티드로 결정되며, 예를 들어 얻어진 아미노산 서열이 항체의 실질적인 에피토프보다 더 클 수 있다. 이러한 CD33 유도 펩티드들을 추가의 대조 실험에 의해 정확한 표준 질량과 HPLC MS/MS 기술을 적용하는 교환되지 않은 샘플로 확인하였다.
단백질 + 항체 샘플에 있어서, CD33 단백질과 항체를 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 항체/CD33의 최종 몰비는 2:1이었다. LEAP 로봇 시스템(교환 플레이트 25 ℃로 유지, 샘플/퀀치(quench) 플레이트 4 ℃로 유지)을 사용하여 8 μl의 샘플을 80 μl의 교환 완충액(1O mM NaH2P04의 D20 용액, pH=7 또는 1O mM NaH2P04의 H20 용액, pH=7)에 첨가하고 혼합한 다음, 25 ℃에서 다양한 시간(15, 60, 120, 240, 및 600 초) 동안 교환하였다. 이후, 80 μl의 이 용액을 4 ℃에서 80 μl의 퀀칭 완충액(1M 우레아, 0.1M TCEP-HCl)에 첨가하여 혼합하였다. 이후, 90 μl의 이 용액을 4 ℃에서 10 μl의 펩신(4 mg/ml)에 첨가하고 혼합하였다. 2분 후에 이 용액 60 μl를 Michrom C18 트랩 카트리지에 주사하였다. 카트리지를 H20 + 0.1% TFA로 2분 동안 100 μl/분의 속도로 세척하였다. 이후, 밸브를 전환하여 카트리지를 Phenomenex Jupiter C5 컬럼, 1.0 x 50 mm, 5 μm, 300A 상에 용출하였다. 이동상 A는 물/아세토니트릴/TFA (99/0.95/0.05)이었고, 이동상 B는 아세토니트릴/물/TFA (95/4.95/0.05)이었다. 유속은 100 μl/분이었다. 그래디언트는 다음과 같다: 0 분(0% B), 6 분(40% B), 7 분(40% B), 8 분(90% B), 10 분(90% B), 11 분 (0% B). LEAP 시스템으로 이동상을 4 ℃로 예냉하고, 또한 트랩 컬럼과 분석 컬럼을 4 ℃로 유지하였다. MS 실험(D20 완충액으로의 교환을 정량하기 위해 사용)에서는, 14분 동안 300-2000에서의 단일 스캔방법을 해상도 60,000으로 사용하였다. MS/MS 실험(H2O 교환 완충액을 갖는 ID 펩티드에 대해 사용)에서는, 7 스캔으로의 방법을 14분 동안 사용하였다. 제1 스캔은 해상도 30,000에서 300-2000의 전체 범위 스캔이다. 다음 스캔은 스캔 #1으로부터의 6 최강 이온에 대한 CID 스캔이다. 단리 폭은 1.5 amu이고, 충돌 에너지는 35 V였으며, 활성화 시간은 30 msec였다. 펩신 펩티드를 단편화 데이터와 Proteome Discoverer 프로그램(Thermo)을 사용하여 확인하였다. 확인된 펩티드를 교환 펩티드에 대한 평균 질량을 계산하는 사내 프로그램을 사용하여 분석하였다.
모든 CD33 결합제가 동일한 펩티드 단편을 아미노산 서열 FFHPIPYYDKNSPVHGYW (서열번호: 141) (표 4)로 보호하였다. 여기에 기술된 CD33 결합제로 보호된 CD33의 서열은 린투주맵(MDPNFWLQVQE, 서열번호: 142)의 결합으로 보호된 CD33의 펩티드 서열과 상이하고 중첩되지 않는다. SIGLEC-5의 결정구조를 사용하는 실리코(silico) 모델링에서, CD33과 상동인 SIGLEC류 멤버는 단백질의 근접 도메인에서 모든 항체의 결합 에피토프를 나타내며, 여기에서 린투주맵의 결합 에피토프는 여기에 기술된 CD33 결합제의 그것과는 다르다. 결론적으로 본 출원에 기술된 CD33 결합제는 린투주맵과는 다른 에피토프에 결합한다.
Figure 112013036710634-pct00004
SEQUENCE LISTING <110> BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH <120> CD33 binding agents <130> 12-0321-PCT <160> 142 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 1 Asn Trp Ala Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 2 Asn Trp Ala Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 3 His Trp Leu Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 4 Asn Trp Ala Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 5 Asn Trp Ala Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 6 Asn Trp Ala Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 7 Asn Trp Ala Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 8 Asn Trp Ala Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 9 Asn Trp Ala Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 10 Glu Gly Gly Val Asp Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 11 Glu Gly Gly Val Asp Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 12 Glu Gly Gly Val Asp Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 13 Glu Gly Gly Val Asp Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 14 Glu Gly Gly Val Asp Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 15 Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Val Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 16 Arg Ile Ile Pro Ile Ile Asn Ile Ala Ser Tyr Ala Gln Asn Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial 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<211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 24 Arg Ile Ile Pro Ile Leu Asp Met Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 25 Arg Ile Ile Pro Ile Ile Gly Ile Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 26 Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Met Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 27 Arg Ile Ile Pro Ile Ile Gly Ile Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 28 Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 29 Asp Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 30 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 31 Ser Tyr Ala 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Claims (35)

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    로부터 선택된 CD33 결합제.
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    서열번호: 94의 중쇄 가변영역과 서열번호: 108의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체,
    서열번호: 95의 중쇄 가변영역과 서열번호: 109의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체,
    서열번호: 96의 중쇄 가변영역과 서열번호: 110의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체,
    서열번호: 97의 중쇄 가변영역과 서열번호: 111의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체,
    서열번호: 98의 중쇄 가변영역과 서열번호: 112의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체
    로부터 선택된 CD33 결합제.
  3. 서열번호: 113의 중쇄와 서열번호: 127의 경쇄를 포함하는 항체,
    서열번호: 114의 중쇄와 서열번호: 128의 경쇄를 포함하는 항체,
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    서열번호: 124의 중쇄와 서열번호: 138의 경쇄를 포함하는 항체,
    서열번호: 125의 중쇄와 서열번호: 139의 경쇄를 포함하는 항체,
    서열번호: 126의 중쇄와 서열번호: 140의 경쇄를 포함하는 항체
    로부터 선택된 CD33 결합제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션 4시간 후 CD33 결합제의 초기량의 적어도 30%가 HL60 세포의 세포 표면에 남아있는 내재화 키네틱스(kinetics)를 나타내는 것을 특징으로 하는 CD33 결합제.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션 4시간 후 CD33 결합제의 초기량의 적어도 40%가 HL60 세포의 세포 표면에 남아있는 내재화 키네틱스(kinetics)를 나타내는 것을 특징으로 하는 CD33 결합제.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CD33 및 사이노몰구스(cynomolgus) CD33 양자 모두에 대해 10 nM 이하의 KD의 친화도를 가지는 것을 특징으로 하는 CD33 결합제.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 것임을 특징으로 하는 CD33 결합제.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 완전한 인간(fully human) 항체임을 특징으로 하는 CD33 결합제.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 작용을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 CD33 결합제.
  10. 제9항에 있어서, 이펙터 작용이 Fc 도메인에 의해 매개되는 것임을 특징으로 하는 CD33 결합제.
  11. 제10항에 있어서, Fc 도메인의 작용을 조절하는 하나 이상의 돌연변이를 Fc 도메인에 포함하는 것을 특징으로 하는 CD33 결합제.
  12. 제11항에 있어서, Fc 도메인의 작용의 조절이 적어도 10%의 ADCC 증가인 것을 특징으로 하는 CD33 결합제.
  13. 제11항에 있어서, Fc 도메인 내의 돌연변이가 Kabat EU 넘버링 인덱스에 따라 332 및/또는 239 및/또는 236 위치의 아미노산 중에서 선택되는 하나 이상의 위치에 존재하는 것을 특징으로 하는 CD33 결합제.
  14. 제11항에 있어서, Fc 도메인 내의 돌연변이가 위치 239 및 332에서의 치환의 조합인 것을 특징으로 하는 CD33 결합제.
  15. 제14항에 있어서, Fc 도메인 내의 돌연변이가 S239D 및 I332E 돌연변이의 조합인 것인 특징으로 하는 CD33 결합제
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 CD33 결합제의 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역을 코딩하는 영역을 포함하는 DNA 분자.
  17. 제16항의 DNA 분자를 함유하는 발현벡터.
  18. 제16항의 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 CD33 결합제의 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역을 코딩하는 영역을 포함하는 DNA 분자를 함유하는 하나 이상의 발현 벡터를 숙주 세포에 형질감염시키고(transfecting);
    상기 숙주 세포를 배양하고; 및
    항체 분자를 회수 및 정제하는 단계를 포함하는,
    제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 CD33 결합제를 제조하는 방법.
  20. 활성 성분으로 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 CD33 결합제를 포함하는, 골수세포 악성종양 또는 골수이형성 증후군(MDS) 치료용 약학 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  22. 제20항에 있어서, CD33을 표면에 발현하는 세포를 고갈(depleting)시키는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  23. 제20항에 있어서, 골수세포 악성종양이 급성 골수성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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