ES2428767T3 - Composiciones y procedimientos para aumentar la mineralización ósea - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido deesclerostina que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 46, donde dicho anticuerpo ofragmento se une a la secuencia de SEC ID Nº: 98.

Description

Composiciones y procedimientos para aumentar la mineralización ósea
5 Campo técnico
La presente invención se refiere generalmente a productos farmacéuticos y, más específicamente, a composiciones adecuadas para aumentar el contenido mineral del hueso. Tales composiciones pueden utilizarse para tratar una amplia variedad de afecciones que incluyen, por ejemplo, osteopenia, osteoporosis, fracturas y otros trastornos en los que la baja densidad mineral ósea es un distintivo de la enfermedad.
Antecedentes de la invención
Durante la vida de un individuo se producen dos o tres fases distintas de cambios en la masa ósea (véase Riggs,
15 West J. Med. 154:63-77, 1991). La primera fase se produce en tanto hombres como mujeres, y se dirige a alcanzar una masa ósea pico. Esta primera fase se logra mediante el crecimiento lineal de las placas de crecimiento endocondrales y el crecimiento radial debido a una tasa de aposición perióstica. La segunda fase empieza a aproximadamente la edad de 30 para hueso trabecular (huesos planos tales como las vértebras y pelvis) y aproximadamente la edad de 40 para hueso cortical (por ejemplo, huesos largos encontrados en las extremidades) y continúa a mayor edad. Esta fase se caracteriza por pérdida lenta de hueso, y se produce en tanto hombres como mujeres. En mujeres también se produce una tercera fase de pérdida de hueso, lo más probablemente debido a deficiencias de estrógenos posmenopáusicas. Durante esta fase sola, las mujeres pueden perder un 10% adicional de masa ósea del hueso cortical y el 25% del compartimento trabecular (véase Riggs, arriba).
25 La pérdida de contenido mineral óseo puede producirse por una amplia variedad de afecciones, y puede producir problemas médicos significativos. Por ejemplo, la osteoporosis es una enfermedad debilitante en seres humanos caracterizada por una disminución sustancial en la masa ósea esquelética y densidad mineral, deterioro estructural del hueso que incluye degradación de la microarquitectura ósea y aumentos correspondientes en la fragilidad y susceptibilidad del hueso a fractura en individuos aquejados. La osteoporosis en seres humanos va precedida de osteopenia clínica (densidad mineral ósea que es mayor que una desviación estándar pero inferior a 2,5 desviaciones estándar por debajo del valor medio para hueso adulto joven), una afección encontrada en aproximadamente 25 millones de personas en los Estados Unidos. Otros 7-8 millones de pacientes en los Estados Unidos han sido diagnosticados con osteoporosis clínica (definida como contenido mineral óseo superior a 2,5 desviaciones estándar por debajo del hueso adulto joven maduro). La osteoporosis es una de las enfermedades más
35 caras para el sistema sanitario, que cuesta decenas de billones de dólares anualmente en los Estados Unidos. Además de los costes relacionados con el cuidado sanitario, el cuidado residencial a largo plazo y los días de trabajo perdidos se añaden a los costes financieros y sociales de esta enfermedad. En el mundo, aproximadamente 75 millones de personas están en riesgo de osteoporosis.
La frecuencia de la osteoporosis en la población humana aumenta con la edad, y entre caucásicos es predominante en mujeres (que comprende el 80% del conjunto de pacientes con osteoporosis en los Estados Unidos). El aumento de la fragilidad y susceptibilidad a fractura del hueso esquelético en el anciano se agrava por el mayor riesgo de caídas accidentales en esta población. Más de 1,5 millones de fracturas de huesos relacionadas con la osteoporosis se informan en los Estados Unidos cada año. Caderas, muñecas y vertebras fracturadas están entre las lesiones
45 más comunes asociadas a la osteoporosis. Las fracturas de cadera en particular son extremadamente molestas y caras para el paciente, y para mujeres se correlacionan con altas tasas de mortalidad y morbilidad.
Aunque la osteoporosis se ha definido como un aumento en el riesgo de fractura debido a masa ósea reducida, ninguno de los tratamientos presentemente disponibles para trastornos esqueléticos puede aumentar sustancialmente la densidad ósea de adultos. Hay una fuerte percepción entre todos los médicos de que se necesitan fármacos que puedan aumentar la densidad ósea en adultos, particularmente en los huesos de la muñeca, columna espinal y cadera que están en riesgo en osteopenia y osteoporosis.
Las actuales estrategias para la prevención de la osteoporosis pueden ofrecer algún beneficio a los individuos, pero
55 no pueden garantizar la resolución de la enfermedad. Estas estrategias incluyen actividad física moderada (particularmente en actividades que llevan peso) con el inicio de edad avanzada, que incluyen calcio adecuado en la dieta, y evitar el consumo de productos que contienen alcohol o tabaco. Para pacientes que presentan osteopenia u osteoporosis clínica, todos los presentes fármacos terapéuticos y estrategias están dirigidos a reducir adicionalmente la pérdida de masa ósea, inhibiendo el procedimiento de absorción ósea, un componente natural del procedimiento de remodelación ósea que se produce constitutivamente.
Por ejemplo, el estrógeno está siendo ahora recetado para retardar la pérdida ósea. Sin embargo, hay alguna controversia con si hay o no algún beneficio a largo plazo para pacientes y si hay o no algún efecto en absoluto sobre pacientes de más de 75 años de edad. Además, se cree que el uso de estrógeno aumenta el riesgo de cáncer
65 de mama y de endometrio.
También se han sugerido altas dosis de calcio dietético, con o sin vitamina D, para mujeres posmenopáusicas. Sin embargo, altas dosis de calcio pueden tener frecuentemente efectos secundarios gastrointestinales desagradables, y los niveles de calcio en suero y urinario deben monitorizarse continuamente (véase Khosla y Rigss, Mayo Clin. Proc. 70:978-982, 1995).
5 Otros terapéuticos que se han sugerido incluyen calcitonina, bisfosfonatos, esteroides anabólicos y fluoruro de sodio. Sin embargo, tales terapéuticos tienen efectos secundarios no deseables (por ejemplo, la calcitonina y los esteroides pueden producir náuseas y provocar un reacción inmunitaria, los bisfosfonatos y el fluoruro de sodio pueden inhibir la reparación de fracturas, aún cuando la densidad ósea aumente modestamente) que pueden prevenir su uso (véase Khosla y Rigss, arriba).
El documento WO 01/92308 se refiere a polipéptidos de nudo de cisteína: moléculas cloaked-2 y usos de los mismos. Los documentos US 6.495.736 y WO 00/32773 se refieren a mineralización ósea creciente.
15 Ninguna estrategia terapéutica puesta actualmente en práctica implica un fármaco que estimule o potencie el crecimiento de nueva masa ósea. La presente invención proporciona composiciones que pueden utilizarse para aumentar la mineralización ósea, y así pueden utilizarse para tratar una amplia variedad de afecciones en las que se desea aumentar la masa ósea. Además, la presente invención proporciona otras ventajas relacionadas.
Resumen de la invención
La invención proporciona un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido de esclerostina que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 46, donde dicho anticuerpo o fragmento se une a la secuencia de SEC ID Nº: 98. Dentro de diversas realizaciones, el
25 anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, de origen humano o murino). Dentro de otras realizaciones, el anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo que retiene las características de unión de un anticuerpo completo (por ejemplo, un fragmento F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab o Fv, o incluso una CDR). También se proporcionan hibridomas y otras células que pueden producir o expresar los anticuerpos anteriormente mencionados.
Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden usarse en procedimientos para aumentar el contenido mineral óseo en un animal de sangre caliente.
Las moléculas de anticuerpo pueden proporcionarse como una composición, y pueden comprender además un
35 inhibidor de la resorción ósea. Ejemplos representativos de tales inhibidores incluyen calcitonina, estrógeno, un bisfosfonato, un factor de crecimiento que tiene actividad antiresortiva y tamoxifeno.
Ejemplos representativos de moléculas de anticuerpo que pueden utilizarse en los contextos terapéuticos anteriormente mencionados incluyen anticuerpos humanizados. Tales moléculas pueden usarse, dependiendo de su selección, para antagonizar la señalización o unión del miembro de la familia de proteínas de unión a TGF-beta, esclerostina (SOST), como se describe en el presente documento.
Las moléculas de anticuerpo anteriormente descritas pueden utilizarse en afecciones tales como osteoporosis, osteomalacia, enfermedad periodontal, hipovitaminosis C, enfermedad de Cushing, fractura ósea y afecciones
45 debidas a la inmovilización de extremidades y el uso de esteroides.
En ciertas realizaciones particulares de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, que es un anticuerpo monoclonal de ratón, humano, rata o hámster. La invención también proporciona una célula de hibridoma o una célula huésped que puede producir el anticuerpo monoclonal. En otras realizaciones de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. La invención proporciona además una célula huésped que produce el anticuerpo humanizado
o quimérico. En ciertas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno del anticuerpo es un fragmento F(ab')2, Fab', Fab, Fd o Fv. La invención también proporciona un anticuerpo que es un anticuerpo monocatenario y proporciona una célula huésped que puede expresar el anticuerpo monocatenario. En otra realización, la invención proporciona
55 una composición que comprende tales anticuerpos y un vehículo fisiológicamente aceptable.
Estos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes tras la referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos adjuntos. Además, documentos que incluyen diversas referencias expuestas en el presente documento describen en más detalle ciertos procedimientos o composiciones (por ejemplo, plásmidos, etc.).
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una ilustración esquemática que compara la secuencia de aminoácidos de Dan humana; Gremlin humana; Cerberus humana y Beer humana. Las flechas indican el esqueleto de cisteína.
65 La Figura 2 resume los resultados obtenidos de evaluar una variedad de tejidos humanos para la expresión de un gen de proteína de unión a TGF-beta, específicamente el gen Beer humano. Se usó un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa por transcripción inversa semicuantitativa (RT-PCR) para amplificar una parte del gen del ADNc de la primera hebra sintetizado a partir de ARN total (descrito en más detalle en el Ejemplo 2A). Las Figuras 3A-3D resumen los resultados obtenidos de la hibridación in situ de ARN de secciones de embrión
5 de ratón usando una sonda de ARNc que es complementaria al transcrito de Beer de ratón (descrito en más detalle en el Ejemplo 2B). El panel 3A es una sección transversal de embrión de 10,5 dpc. El panel 3B es una sección sagital de embrión de 12,5 dpc y los paneles 3C y 3D son secciones sagitales de embriones de 15,5 dpc. Las Figuras 4A-4C ilustran, por análisis de transferencia Western, la especificidad de tres anticuerpos policlonales diferentes para sus antígenos respectivos (descrito en más detalle en el Ejemplo 4). La Figura 4A muestra reactividad específica de un anticuerpo anti-Beer h. por antígeno de Beer h., pero no Dan h. o Gremlin
h. La Figura 4B muestra la reactividad de un anticuerpo anti-Gremlin h. por antígeno de Gremlin h., pero no Beer h. o Dan h. La Figura 4C muestra la reactividad de un anticuerpo anti-Dan h. por Dan h., pero no Beer h. o Gremlin h.
15 La Figura 5 ilustra, por análisis de transferencia Western, la selectividad de la proteína de unión a TGF-beta, Beer, por BMP-5 y BMP-6, pero no BMP-4 (descrito en más detalle en el Ejemplo 5). La Figura 6 demuestra que la interacción iónica entre la proteína de unión a TGF-beta, Beer, y BMP-5 tiene una constante de disociación en el intervalo de 15-30 nM. La Figura 7 presenta un alineamiento de la región que contiene el nudo de cisteína característico de un polipéptido de SOST (esclerostina) y sus homólogos más relacionados. Tres enlaces disulfuro que forman el nudo de cisteína se ilustran como una línea continua. Un enlace disulfuro adicional, mostrado por una línea de puntos, es único para esta familia, que conecta dos puntas de horquilla ! en la estructura 3D. Los polipéptidos representados son SOST: esclerostina (SEC ID Nº: 126); CGHB: gonadotropina coriónica humana ! (SEC ID Nº: 127); FSHB: subunidad beta de la hormona estimulante del folículo (SEC ID Nº: 128); TSHB: precursor de
25 la cadena beta de tirotropina (SEC ID Nº: 129); VWF: factor de Von Willebrand (SEC ID Nº: 130); MUC2: precursor de mucina 2 humana (SEC ID Nº: 131); CER1: Cerberus 1 (homólogo de Xenopus laevis) (SEC ID Nº: 132); DRM: Gremlin (SEC ID Nº: 133); DAN: (SEC ID Nº: 134); CTGF: precursor de factor de crecimiento de tejido conjuntivo (SEC ID Nº: 135); NOV: NovH (homólogo de la proteína del gen expresado en exceso de nefroblastoma) (SEC ID Nº: 136); CYR6: (SEC ID Nº: 137). La Figura 8 ilustra un modelo 3D de la región Core de SOST (SOST_Core). La Figura 9 presenta un modelo 3D de la región Core del homodímero de SOST. Las Figuras 10A y 10B proporcionan un alineamiento de secuencias de aminoácidos de Noggin de cinco animales diferentes: ser humano (NOGG_HUMANO (SEC ID Nº: 138); pollo (NOGG_POLLO, SEC ID Nº: 139); rana africana de uñas (NOGG_XENLA, SEC ID Nº: 140); NOGG_FUGRU, SEC ID Nº: 141); y pez cebra
35 (NOGG_CEBRA, SEC ID Nº: 142); y SOST de ser humano (SOST_HUMANO, SEC ID Nº: 46), rata (SOST_RATA, SEC ID Nº: 65) y ratón (SOST_Ratón, SEC ID Nº: 143). La Figura 11 ilustra la estructura del complejo Noggin/BMP-7. El homodímero de BMP se muestra en la parte inferior de la figura en modo de superficie. El homodímero de Noggin se muestra en la parte superior del dímero de BMP en modo animación. Los círculos explican resumidamente la región de unión del extremo N, la región Core y el ligador entre las regiones del extremo N y Core. La Figura 12 representa un modelo 3D del posible fragmento de unión a BMP localizado en la región del extremo N de SOST. El dímero de ABMP se muestra en modo superficial, y el posible fragmento de unión a BMP se muestra en modo de varillas. Se observa un residuo de fenilalanina que se ajusta en un bolsillo hidrófobo sobre la superficie de BMP.
Descripción detallada de la invención
DEFINICIONES
Antes de exponer la invención en detalle puede ser útil para un entendimiento de la misma exponer definiciones de ciertos términos y enumerar y definir las abreviaturas que se usarán en lo sucesivo.
“Molécula” debe entenderse que incluye proteínas o péptidos (por ejemplo, anticuerpos, componentes de unión recombinantes, péptidos con una afinidad de unión deseada), ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN, moléculas 55 de ácidos nucleicos quiméricas y análogos de ácido nucleico tales como PNA); y compuestos orgánicos o inorgánicos.
“TGF-beta” debe entenderse que incluye cualquier miembro conocido o novedoso de la superfamilia de TGF-beta, que también incluye proteínas morfogénicas óseas (BMP).
“Receptor de TGF-beta” debe entenderse que se refiere al receptor específico para un miembro particular de la superfamilia de TGF-beta (incluyendo proteínas morfogénicas óseas (BMP)).
“Proteína de unión a TGF-beta” debe entenderse que se refiere a una proteína con afinidad de unión específica por 65 un miembro o subconjunto particular de miembros de la superfamilia de TGF-beta (incluyendo proteínas morfogénicas óseas (BMP)). Ejemplos específicos de proteínas de unión a TGF-beta incluyen proteínas codificadas
por las SEC ID nº 1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 y 101.
Inhibir la “unión de la proteína de unión a TGF-beta a la familia de TGF-beta de proteínas y proteínas morfogénicas óseas (BMP)” debe entenderse que se refiere a moléculas que permiten la activación de TGF-beta o proteínas
5 morfogénicas óseas (BMP), o permiten la unión de miembros de la familia de TGF-beta que incluyen proteínas morfogénicas óseas (BMP) a sus receptores respectivos, eliminando o previniendo la unión de TGF-beta a proteína de unión de TGF. Tal inhibición puede llevarse a cabo, por ejemplo, por moléculas que inhiben la unión de la proteína de unión a TGF-beta a miembros específicos de la superfamilia de TGF-beta.
10 “Vector” se refiere a un ensamblaje que puede dirigir la expresión de la proteína deseada. El vector debe incluir elementos promotores de la transcripción que están operativamente ligados al (a los) gen(es) de interés. El vector puede estar compuesto de ácidos desoxirribonucleicos (“ADN”), ácidos ribonucleicos (“ARN”), o una combinación de los dos (por ejemplo, un ADN-ARN quimérico). Opcionalmente, el vector puede incluir una secuencia de poliadenilación, uno o más sitios de restricción, además de uno o más marcadores de selección tales como
15 neomicina fosfotransferasa o higromicina fosfotransferasa. Adicionalmente, dependiendo de la célula huésped elegida y el vector empleado, en los vectores descritos en el presente documento también pueden incorporarse otros elementos genéticos tales como un origen de replicación, sitios de restricción de ácido nucleico adicionales, potenciadores, secuencias que confieren inducibilidad de la transcripción, y marcadores de selección.
20 Una “molécula de ácido nucleico aislada” es una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica una proteína que se une a TGF que se ha separado del ADN genómico de una célula eucariota es una molécula de ADN aislada. Otro ejemplo de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico químicamente sintetizada que no está integrada en el genoma de un organismo. La molécula de ácido nucleico aislada puede ser ADN genómico, ADNc,
25 ARN, o estar compuesta al menos en parte de análogos de ácido nucleico.
Un “polipéptido aislado” es un polipéptido que está esencialmente libre de componentes celulares contaminantes tales como un hidrato de carbono, lípido u otras impurezas proteináceas asociadas al polipéptido en la naturaleza. Preferentemente, tales polipéptidos aislados son al menos aproximadamente el 90% puros, más preferentemente al 30 menos aproximadamente el 95% puros, y lo más preferentemente al menos aproximadamente el 99% puros. Dentro de ciertas realizaciones, una preparación de proteínas particular contiene un polipéptido aislado si aparece nominalmente como una única banda en gel de SDS-PAGE con tinción con azul de Coomassie. El término “aislado” cuando se refiere a moléculas orgánicas (por ejemplo, moléculas pequeñas orgánicas) significa que los compuestos son más del 90% puros utilizando procedimientos que son muy conocidos en la técnica (por ejemplo, RMN, punto de
35 fusión).
“Esclerosteosis” es un término que se aplicó por Hansen (1967) (Hansen, H. G., Sklerosteose. En: Opitz, H.; Schmid, F., Handbuch der Kinderheilkunde. Berlin: Springer (pub.) 61967. Pág. 351-355) a un trastorno similar a la hiperostosis cortical generalizada de van Buchem, pero que posiblemente se diferencia en el aspecto de los cambios
40 óseos y en presencia de sindactilia cutánea asimétrica de los dedos índice y corazón en muchos casos. La mandíbula tiene un aspecto anormalmente cuadrado en esta afección.
“Anticuerpos humanizados” son proteínas recombinantes en las que regiones determinantes de la complementariedad murinas o de otros animales no humanos de anticuerpos monoclonales se han transferido de
45 cadenas variables pesadas y ligeras de la inmunoglobulina murina o de otro animal no humano a un dominio variable humano.
Como se usa en el presente documento, un “fragmento de anticuerpo” es una parte de un anticuerpo tal como F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab y similares. Independientemente de la estructura, un fragmento de anticuerpo se une con el
50 mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monoclonal anti-proteína de unión a TGF-beta se une a un epítope de proteína de unión a TGF-beta.
El término fragmento de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno también incluye cualquier proteína sintética o genéticamente manipulada que actúe de anticuerpo uniéndose a un antígeno específico para formar un complejo.
55 Por ejemplo, fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos aislados que consisten en la región variable de la cadena ligera, fragmentos “Fv” que consisten en las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras, moléculas de polipéptido de cadenas individuales recombinantes en las que regiones variables ligeras y pesadas están conectadas por un péptido ligador (“proteínas sFv”), y unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable.
60 Una “marca detectable” es una molécula o átomo que puede conjugarse con un resto de polipéptido tal como un resto de anticuerpo o un resto de ácido nucleico para producir una molécula útil para diagnóstico. Ejemplos de marcas detectables incluyen quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iones paramagnéticos, enzimas, y otros restos de marcador.
65 Como se usa en el presente documento, un “inmunoconjugado” es una molécula que comprende un anticuerpo antiproteína de unión a TGF-beta, o un fragmento de anticuerpo, y una marca detectable o una molécula efectora. Preferentemente, un inmunoconjugado tiene aproximadamente la misma capacidad, o solo capacidad ligeramente reducida, para unirse a proteína de unión a TGF-beta después de la conjugación que antes de la conjugación.
5 Abreviaturas: TGF-beta -“Factor de crecimiento beta transformante”; TGF-bBP -“Proteína de unión a factor de crecimiento beta transformante” (una TGF-bBP representativa se designa “Beer h.”); BMP -“proteína morfogénica ósea”; PCR -“reacción en cadena de la polimerasa”; RT-PCR-PCR. Procedimiento en el que el ARN se transcribe primero en ADN usando transcriptasa inversa (RT); ADNc -cualquier ADN preparado copiando una secuencia de ARN en forma de ADN.
Producción de anticuerpos para proteínas de unión a TGF-beta
La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a esclerostina como se describe en el
15 presente documento en detalle. Los anticuerpos para proteína de unión a TGF-beta pueden obtenerse, por ejemplo, usando el producto de un vector de expresión como antígeno. Los anticuerpos que se unen específicamente a esclerostina también pueden prepararse usando péptidos derivados de la secuencia de polipéptidos de esclerostina de SEC ID Nº: 46. Otras secuencias de polipéptidos de esclerostina proporcionadas en el presente documento son SEC ID Nº: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 65. Anticuerpos anti-proteína de unión a TGF-beta particularmente útiles “se unen específicamente” con proteína de unión a TGF-beta de SEC ID Nº 46, pero no con otras proteínas de unión a TGF-beta tales como Dan, Cerberus, SCGF o Gremlin. Los anticuerpos de la presente invención (incluyendo fragmentos y derivados de los mismos) pueden ser policlonales o, especialmente, monoclonales. El anticuerpo puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina y puede ser, por ejemplo, un anticuerpo IgG, (incluyendo isotipos de IgG, que para anticuerpos humanos se conocen en la técnica como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4); IgE; IgM; o
25 IgA. Un anticuerpo puede obtenerse de aves de corral o mamíferos, preferentemente, por ejemplo, de murino, rata, humano u otro primate.
Los anticuerpos policlonales para proteína de unión a TGF-beta recombinante pueden prepararse usando procedimientos muy conocidos para aquellos expertos en la materia (véanse, por ejemplo, Green y col., “Production of Polyclonal Antisera”, en Immunochemical Protocols (Manson, ed.), páginas 1-5 (Humana Press 1992); Williams y col., “Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies”, en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª edición, Glover y col. (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995)). Aunque los anticuerpos policlonales se producen normalmente en animales tales como ratas, ratones, conejos, cabras u ovejas, un anticuerpo anti-proteína de unión a TGF-beta de la presente invención también puede derivarse
35 de un anticuerpo de primate subhumano. Técnicas generales para producir anticuerpos diagnósticamente y terapéuticamente útiles en babuinos pueden encontrarse, por ejemplo, en Goldenberg y col., publicación de patente internacional nº WO 91/11465 (1991), y en Losman y col., Int. J. Cancer 46:310, 1990.
El anticuerpo debe comprender al menos un dominio de la región variable. El dominio de la región variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una secuencia de aminoácidos hipervariable responsable de la unión a antígeno incorporada en una secuencia de la región estructural. En términos generales, el dominio de la región variable (V) puede ser cualquier disposición adecuada de dominios variables de la cadena pesada (VH) y/o ligera (VL) de inmunoglobulina. Así, por ejemplo, el dominio de la región V puede ser monomérico y ser un dominio VH o VL en el que éstos pueden unirse independientemente a antígeno con
45 afinidad aceptable. Alternativamente, el dominio de la región V puede ser dimérico y contener VH-VH, VH-VL o VL-VL, dímeros en los que las cadenas de VH y VL están no covalentemente asociadas (abreviadas en lo sucesivo Fv). Si se desea, sin embargo, las cadenas pueden acoplarse covalentemente tanto directamente, por ejemplo, mediante un enlace disulfuro entre los dos dominios variables, como mediante un ligador, por ejemplo, un ligador de péptido, para formar una dominio monocatenario (abreviado en lo sucesivo scFv).
El dominio de la región variable puede ser cualquier dominio variable que se produzca naturalmente o una versión manipulada del mismo. Por versión manipulada se indica un dominio de la región variable que ha sido creado usando técnicas de manipulación de ADN recombinante. Tales versiones manipuladas incluyen aquellas creadas, por ejemplo, a partir de regiones variables de anticuerpos naturales por inserciones, deleciones o cambios en o a las
55 secuencias de aminoácidos de los anticuerpos naturales. Ejemplos particulares de este tipo incluyen aquellos dominios de la región variable manipulados que contienen al menos un CDR y opcionalmente uno o más aminoácidos de la región estructural de un anticuerpo y el resto del dominio de la región variable de un segundo anticuerpo.
El dominio de la región variable puede unirse covalentemente en un aminoácido del extremo C a al menos otro dominio de anticuerpo o un fragmento del mismo. Así, por ejemplo, si un dominio VH está presente en el dominio de la región variable, éste puede ligarse a un dominio CH1 de inmunoglobulina o un fragmento del mismo. Similarmente un dominio VL puede ligarse a un dominio CK o un fragmento del mismo. De esta forma, por ejemplo, el anticuerpo puede ser un fragmento Fab donde el dominio de unión a antígeno contiene asociados dominios VH y VL 65 covalentemente ligados en sus extremos C a un dominio CH1 y CK, respectivamente. El dominio CH1 puede extenderse con aminoácidos adicionales, por ejemplo, para proporcionar un dominio de la región bisagra como se
encuentra en un fragmento Fab', o para proporcionar dominios adicionales tales como los dominios CH2 y CH3 de anticuerpos.
Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica una única región determinante de la
5 complementariedad (CDR). Los péptidos de CDR (“unidades de reconocimiento mínimo”) pueden obtenerse construyendo genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes se preparan, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable a partir de células productoras de ARN de anticuerpo (véanse, por ejemplo, Larrick y col., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies”, en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter y col. (eds.), página 166 (Cambridge Universidad Press 1995); y Ward y col., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies”, en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch y col., (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).
Los anticuerpos para su uso en la invención pueden en general ser monoclonales (preparados por inmunización
15 convencional y procedimientos de fusión de células) o, en el caso de fragmentos, derivarse de los mismos usando cualquier técnica química convencional adecuada tal como técnicas de reducción o de escisión enzimática y/o digestión, por ejemplo, mediante tratamiento con pepsina. Más específicamente, los anticuerpos anti-proteína de unión a TGF-beta monoclonales pueden generarse utilizando una variedad de técnicas. Anticuerpos monoclonales de roedor para antígenos específicos pueden obtenerse mediante procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia (véanse, por ejemplo, Kohler y col., Nature 256:495, 1975; y Coligan y col. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) [“Coligan”]; Picksley y col., “Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli”, en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª edición, Glover y col. (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)).
25 Brevemente, los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse inyectando ratones con una composición que comprende un producto génico de proteína de unión a TGF-beta, verificando la presencia de la producción de anticuerpos tomando una muestra de suero, extirpando el bazo para obtener linfocitos B, fusionando los linfocitos B con células de mieloma para producir hibridomas, clonando los hibridomas, seleccionando clones positivos que producen anticuerpos para el antígeno, cultivando los clones que producen anticuerpos para el antígeno y aislando los anticuerpos de los cultivos de hibridomas.
Además, un anticuerpo anti-proteína de unión a TGF-beta de la presente invención puede derivarse de un anticuerpo monoclonal humano. Los anticuerpos monoclonales humanos se obtienen de ratones transgénicos que han sido manipulados para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a exposición antigénica. En esta
35 técnica, elementos del sitio de la cadena pesada y ligera humana se introducen en cepas de ratones derivadas de líneas de citoblastos embrionarios que contienen alteraciones elegidas como diana de los sitios endógenos de la cadena pesada y la cadena ligera. Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos para antígenos humanos, y los ratones pueden usarse para producir hibridomas secretores de anticuerpos humanos. Procedimientos para obtener anticuerpos humanos a partir de ratones transgénicos se describen, por ejemplo, por Green y col., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg y col., Nature 368:856, 1994; y Taylor y col., Int. Immun. 6:579, 1994.
Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse de cultivos de hibridomas mediante una variedad de técnicas bien establecidas. Tales técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con proteína A
45 Sepharose, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico (véanse, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y páginas 2.9.1-2.9.3; Baines y col., “Purification of Immunoglobulin G (IgG)”, en Methods in Molecular Biology, vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)).
Para usos particulares puede desearse preparar fragmentos de anticuerpos anti-proteína de unión a TGF-beta. Tales fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse, por ejemplo, por hidrólisis proteolítica del anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse por digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos mediante procedimientos convencionales. Como ilustración, pueden producirse fragmentos de anticuerpos por escisión enzimática de un anticuerpo con pepsina para proporcionar un fragmento 5 S indicado F(ab')2. Este fragmento puede escindirse adicionalmente usando un agente reductor de tiol para producir fragmentos
55 monovalentes 3.5S Fab'. Opcionalmente, la reacción de escisión puede realizarse usando un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo que resultan de la escisión de enlaces disulfuro. Como alternativa, una escisión enzimática usando pepsina produce dos fragmentos monovalentes Fab y un fragmento Fc directamente. Estos procedimientos se describen, por ejemplo, por Goldenberg, patente de EE.UU. nº 4.331.647, Nisonoff y col., Arch Biochem. Biophys. 89:230, 1960, Porter, Biochem. J. 73:119, 1959, Edelman y col., en Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967) y por Coligan en las páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10.-2.10.4.
También pueden usarse otros procedimientos de escisión de anticuerpos, tales como separación de cadenas pesadas para formar fragmentos de cadenas ligeras-pesadas monovalentes, posterior escisión de fragmentos u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, mientras que los fragmentos se unan al antígeno que es
65 reconocido por el anticuerpo intacto.
-
Alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo recombinante o manipulado obtenido por el uso de técnicas de ADN recombinante que implican la manipulación y re-expresión de ADN que codifica regiones variables y/o constantes de anticuerpos. Tal ADN es conocido y/o está fácilmente disponible de bibliotecas de ADN que incluyen, por ejemplo, bibliotecas de fago-anticuerpo (véase Chiswell, D J y McCafferty, J. Tibtech. 10 80-84 (1992))
5 o si se desea pueden sintetizarse. Pueden usarse procedimientos de biología molecular y/o química convencionales para secuenciar y manipular el ADN, por ejemplo, para introducir codones para crear residuos de cisteína, para modificar, añadir o delecionar otros aminoácidos o dominios según se desee.
Uno o más vectores de expresión replicables que contienen el ADN que codifica una región variable y/o constante pueden prepararse y usarse para transformar una línea celular apropiada, por ejemplo, una línea de células de mieloma no productora, tal como una línea de NSO de ratón o una bacteriana tal como E. coli, en la que se producirá la producción del anticuerpo. Con el fin de obtener transcripción y traducción eficiente, la secuencia de ADN en cada vector debe incluir secuencias reguladoras apropiadas, particularmente una secuencia promotora y conductora operativamente ligadas a una secuencia de dominio variable. Procedimientos particulares para producir 15 anticuerpos de esta forma son generalmente muy conocidos y rutinariamente usados. Por ejemplo, procedimientos de biología molecular básica se describen por Maniatis y col. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989); puede realizarse secuenciación de ADN como se describe en Sanger y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463, (1977)) y el manual de secuenciación de Amersham International plc; puede llevarse a cabo mutagénesis dirigida a sitio según el procedimiento de Kramer y col. (Nucleic Acids Res. 12, 9441, (1984)); el manual de Anglian Biotechnology; Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985); Kunkel y col., Methods in Enzymol. 154:367-82 (1987). Adicionalmente, numerosas publicaciones detallan técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos por manipulación de ADN, creación de vectores de expresión y transformación de células apropiadas, por ejemplo, como se revisa por Mountain A y Adair, J R en Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Capítulo 1, 1992, Intercept, Andover, RU) y en la memoria descriptiva de
25 patente internacional WO 91/09967.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo según la invención puede tener una o más moléculas efectoras o indicadoras unidas al mismo y la invención se extiende a tales proteínas modificadas. Una molécula indicadora puede ser un resto o marca detectable tal como una enzima, agente citotóxico u otra molécula indicadora, que incluye un colorante, radionúclido, grupo luminiscente, grupo fluorescente, o biotina, o similares. La inmunoglobulina específica para proteína de unión a TGF-beta o fragmento de la misma puede radiomarcarse para aplicaciones de diagnóstico
o terapéuticas. Técnicas para radiomarcar anticuerpos se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, Adams 1998 In Vivo 12:11-21; Hiltunen 1993 Acta Oncol. 32:831-9. Aplicaciones terapéuticas se describen en mayor detalle más adelante y pueden incluir el uso del anticuerpo específico para proteína de unión a TGF-beta (o fragmento del
35 mismo) conjuntamente con otros agentes terapéuticos. Las moléculas efectoras o indicadoras pueden unirse al anticuerpo mediante cualquier cadena lateral de aminoácidos disponible, aminoácido terminal o, si está presente, grupo funcional de hidrato de carbono localizado en el anticuerpo, a condición de que la unión o el procedimiento de unión no afecten adversamente las propiedades de unión y la utilidad de la molécula. Grupos funcionales particulares incluyen, por ejemplo, cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo, carboxilo o aldehído libre. La unión del anticuerpo y la(s) molécula(s) efectora(s) y/o indicadora(s) puede lograrse mediante tales grupos y un grupo funcional apropiado en las moléculas efectoras o indicadoras. El enlace puede ser directo o indirecto mediante grupos espaciadores o de puente.
Moléculas efectoras incluyen, por ejemplo, agentes antineoplásicos, toxinas tales como toxinas enzimáticamente
45 activas de origen bacteriano (tales como exotoxina A de P. aeruginosa) o vegetal y fragmentos de las mismas (por ejemplo, ricina y fragmentos de la misma; gelonina vegetal, briodina de Bryonia dioica, o similares. Véanse, por ejemplo, Thrush y col., 1996 Annu. Rev. Immunol. 14:49-71; Frankel y col., 1996 Cancer Res. 56:926-32); proteínas biológicamente activas, por ejemplo enzimas; ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos tales como ADN, ARN y fragmentos de los mismos; polímeros que se producen naturalmente y sintéticos (por ejemplo, polisacáridos y polímeros de polialquileno tales como poli(etilenglicol) y derivados de los mismos); radionúclidos, particularmente radioyoduro; y metales quelados. Grupos indicadores adecuados incluyen metales quelados, compuestos fluorescentes, o compuestos que pueden detectarse por RMN o espectroscopía de ESR. Grupos efectores particularmente útiles son caliqueamicina y derivados de la misma (véanse, por ejemplo, las memorias descriptivas de patente sudafricana nº 85/8794, 88/8127 y 90/2839).
55 Numerosas otras toxinas, que incluyen agentes quimioterapéuticos, agentes antimitóticos, antibióticos, inductores de apoptosis (o “apoptógenos”, véase, por ejemplo, Green y Reed, 1998, Science 281:1309-1312), o similares, son conocidos para aquellos familiarizados con la materia, y está previsto que los ejemplos proporcionados en el presente documento sean ilustrativos sin limitar el alcance y espíritu de la invención. Agentes antineoplásicos particulares incluyen agentes citotóxicos y citostáticos, por ejemplo, agentes alquilantes tales como mostazas de nitrógeno (por ejemplo, clorambucilo, melfalan, mecloretamina, ciclofosfamida o mostaza de uracilo) y derivados de los mismos, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, busulfano o cisplatino; antimetabolitos tales como metrotrexato, fluorouracilo, floxuridina, citarabina, mercaptopurina, tioguanina, ácido fluoroacético o ácido fluorocítrico, antibióticos tales como bleomicinas (por ejemplo, sulfato de bleomicina), doxorubicina, daunorubicina,
65 mitomicinas (por ejemplo, mitomicina C), actinomicinas (por ejemplo, -dactinomicina), plicamicina, caliquemicina y derivados de los mismos, o esperamicina y derivados de la misma; inhibidores mitóticos tales como etopósido, vincristina o vinblastina y derivados de los mismos; alcaloides tales como elipticina; polioles tales como taxicina-I o taxicina-II; hormonas tales como andrógenos (por ejemplo, dromostanolona o testolactona), progestinas (por ejemplo, acetato de megestrol o acetato de medroxiprogesterona), estrógenos (por ejemplo, difosfato de dimetilestilbestrol, fosfato de poliestradiol o fosfato de estramustina) o antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifeno);
5 antraquinonas tales como mitoxantrona, ureas tales como hidroxiurea; hidracinas tales como procarbazina; o imidazoles tales como dacarbazina.
Metales quelados incluyen quelatos de metales di-o tripositivos que tienen un número de coordinación de 2 a 8, ambos incluidos. Ejemplos particulares de tales metales incluyen tecnecio (Tc), renio (Re), cobalto (Co), cobre (Cu),
10 oro (Au), plata (Ag), plomo (Pb), bismuto (Bi), indio (In), galio (Ga), itrio (Y), terbio (Tb), gadolinio (Gd) y escandio (Sc). En general, el metal es preferentemente un radionúclido. Radionúclidos particulares incluyen 99mTc, 186Re,188Re, 58Co, 60Co, 67Cu, 195Au, 199Au, 110Ag, 203Pb, 206Bi, 207Bi, 111In, 67Ga, 68Ga, 88Y, 90Y, 160Tb, 153Gd y 47Sc.
El metal quelado puede ser, por ejemplo, uno de los tipos anteriores de metales quelados con cualquier agente
15 quelante polidentado adecuado, por ejemplo, poliaminas acíclicas o cíclicas, poliéteres (por ejemplo, éteres corona y derivados de los mismos); poliamidas; porfirinas; y derivados carbocíclicos. En general, el tipo de agente quelante dependerá del metal en uso. Sin embargo, un grupo particularmente útil de agentes quelantes en conjugados según la invención comprende poliaminas acíclicas y cíclicas, especialmente ácidos poliaminocarboxílicos, por ejemplo, ácido dietilentriaminapentaacético y derivados del mismo, y aminas macrocíclicas tales como derivados de tri-aza y
20 tetra-aza cíclicos (por ejemplo, como se describen en la memoria descriptiva de patente internacional WO 92/22583), y poliamidas, especialmente desferrioxamina y derivados de la misma.
Si un grupo tiol en el anticuerpo se usa como punto de unión, esto puede lograrse mediante reacción con un grupo reactivo con tiol presente en la molécula efectora o indicadora. Ejemplos de tales grupos incluyen un ácido o éster á
25 halocarboxílico, tal como yodoacetamida, una imida, tal como maleimida, una vinilsulfona, o un disulfuro. Estos y otros procedimientos de enlace adecuados se describen más generalmente y más particularmente en las memorias descriptivas de patente internacional WO 93/06231, WO 92/22583, WO 90/091195 y WO 89/01476.
La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de esclerostina y usos
30 para tales anticuerpos como se ha descrito anteriormente. La presente divulgación también proporciona inmunógenos del polipéptido de esclerostina que pueden usarse para la generación y análisis de estos anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser útiles para bloquear o alterar la unión de un polipéptido de esclerostina, que es una proteína de unión a TGF-beta, a un ligando, particularmente a proteína morfogénica ósea, y también pueden bloquear o alterar la unión del polipéptido de esclerostina con uno o varios de otros ligandos.
35 Los anticuerpos de la presente invención son útiles para aumentar el contenido mineral y densidad mineral del hueso, mejorando así numerosas afecciones que producen la pérdida de contenido mineral óseo que incluyen, por ejemplo, enfermedad, predisposición genética, accidentes que producen la falta de uso de hueso (por ejemplo, debido a fractura), terapéuticos que efectúan la resorción ósea o que destruyen células formadoras de hueso, y
40 envejecimiento normal.
Como se indica anteriormente, son particularmente útiles anticuerpos anti-proteína de unión a TGF-beta que “se unen específicamente” a proteína de unión a TGF-beta de SEC ID Nº: 46, pero no a otras proteínas de unión a TGFbeta tales como Dan, Cerberus, SCGF o Gremlin. Dentro del contexto de la presente invención, se entiende que los 45 anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, inmunoglobulinas injertadas en CDR quiméricas monocatenarias y fragmentos de anticuerpos de las mismas (por ejemplo, Fab, Fd, Fab' y F(ab')2, regiones variables Fv, o regiones determinantes de la complementariedad). Se entiende que los anticuerpos son
M-1
específicos contra la proteína de unión a TGF-beta si se unen con una Ka superior a o igual a 107 , preferentemente superior a o igual a 108 M-1, y no se unen a otras proteínas de unión a TGF-beta, o se unen con una
M-1
50 Ka inferior a o igual a 106 . La afinidad de un anticuerpo por su antígeno relacionado también se expresa comúnmente como una constante de disociación KD, y un anticuerpo anti-SOST se une específicamente a un miembro de la familia de TGF-beta si se une con una KD inferior a o igual a aproximadamente 10-5 M, más preferentemente inferior a o igual a aproximadamente 10-6 M, todavía más preferentemente inferior a o igual a 10-7 M, y todavía más preferentemente inferior a o igual a 10-8 M. La afinidad de un anticuerpo monoclonal o componente
55 de unión, además de la inhibición de la unión, puede determinarse fácilmente por un experto habitual en la materia (véase Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51:660-672, 1949). La afinidad también puede determinarse por resonancia de plasmones superficiales (SPR; BIAcore, Biosensor, Piscataway, N.J.). Para resonancia de plasmones superficiales, las moléculas diana se inmovilizan sobre una fase sólida y se exponen a ligandos en una fase móvil que fluye a lo largo de una celda de flujo. Si se produce la unión del ligando a la diana inmovilizada, cambia el índice
60 de refracción local, conduciendo a un cambio en el ángulo de SPR, que puede monitorizarse en tiempo real detectando cambios en la intensidad de la luz reflejada. Las tasas de cambio de la señal de SPR pueden analizarse para dar constantes de velocidad aparentes para las fases de asociación y disociación de la reacción de unión. La relación de estos valores da la constante de equilibrio aparente (afinidad) (véase, por ejemplo, Wolff y col., Cancer Res. 53:2560-65 (1993)).
65 Un anticuerpo según la presente invención puede pertenecen a cualquier clase de inmunoglobulinas, por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD o IgA, y puede ser uno cualquiera de los isotipos diferentes que puede comprender una clase (tal como IgG1 IgG2, IgG3, y IgG4 de la clase de IgG humana). Puede obtenerse a partir de o derivarse de un animal, por ejemplo, fow1 (por ejemplo, pollo) y mamíferos, que incluyen, pero no se limitan a, un ratón, rata, hámster,
5 conejo u otro roedor, una vaca, caballo, oveja, cabra, camello, ser humano u otro primate.
Procedimientos muy conocidos en la técnica pueden usarse para generar anticuerpos, anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales que son específicos para la proteína de unión a TGF-beta SOST. Los anticuerpos también pueden producirse como inmunoglobulinas genéticamente manipuladas (Ig) o fragmentos de Ig diseñados para tener propiedades deseables. Por ejemplo, a modo de ilustración y no limitación, los anticuerpos pueden incluir una IgG recombinante que es una proteína de fusión quimérica que tiene al menos un dominio de la región variable
(V) de una primera especie de mamífero y al menos un dominio de la región constante de una segunda especie de mamífero distinta. Lo más comúnmente, un anticuerpo quimérico tiene secuencias de la región variable murina y secuencias de la región constante humana. Una inmunoglobulina quimérica murina/humana tal puede “humanizarse”
15 injertando las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) derivadas de un anticuerpo murino, que confieren especificidad de unión por un antígeno, en regiones estructurales de la región V derivada de ser humano y regiones constantes derivadas de ser humano. Los fragmentos de estas moléculas pueden generarse por digestión proteolítica u, opcionalmente, por digestión proteolítica seguido de reducción suave de enlaces disulfuro y alquilación. Alternativamente, tales fragmentos también pueden generarse por técnicas de manipulación genética recombinante.
Ciertos anticuerpos preferidos son aquellos anticuerpos que inhiben o bloquean una actividad de proteína de unión a TGF-beta dentro de un ensayo in vitro, como se describe en el presente documento. Las propiedades de unión de un anticuerpo a proteína de unión a TGF-beta pueden evaluarse generalmente usando procedimientos de
25 inmunodetección que incluyen, por ejemplo, un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), inmunoprecipitación, inmunotransferencia, inmunoelectroforesis en contracorriente, radioinmunoensayos, ensayos de transferencia puntual, ensayos de inhibición o competición, y similares, que pueden realizarse fácilmente por aquellos expertos habituales en la materia (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.376.110 y 4.486.530; Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)).
Un inmunogén puede comprender células que expresan una proteína de unión a TGF-beta, polipéptidos de unión a TGF-beta purificados o parcialmente purificados, o variantes o fragmentos (es decir, péptidos) de los mismos, o péptidos derivados de una proteína de unión a TGF-beta. Tales péptidos pueden generarse por escisión proteolítica de un polipéptido mayor, por metodologías moleculares recombinantes, o pueden sintetizarse químicamente. Por 35 ejemplo, en el presente documento se proporcionan secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas de unión a TGF-beta, de forma que aquellos expertos en la materia pueden preparar rutinariamente proteínas de unión a TGF-beta para su uso como inmunógenos. Los péptidos pueden sintetizarse químicamente mediante procedimientos como se describen en el presente documento y conocidos en la técnica. Alternativamente, pueden generarse péptidos por escisión proteolítica de una proteína de unión a TGF-beta, y aislarse péptidos individuales mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cualquier número de procedimientos de cromatografía de líquidos u otra separación. Péptidos útiles como inmunógenos normalmente pueden tener una secuencia de aminoácidos de al menos 4 ó 5 aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácidos de proteína de unión a TGF-beta tales como aquellas descritas en el presente documento, y preferentemente tienen al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 19 ó 20 aminoácidos
45 consecutivos de una proteína de unión a TGF-beta. Ciertas otros inmunógenos de péptido preferidos comprenden al menos 6, pero no más de 12 o más aminoácidos consecutivos, de una secuencia de proteínas de unión a TGF-beta, y otros inmunógenos de péptidos preferidos comprenden al menos 21, pero no más de 50 aminoácidos consecutivos de un polipéptido de SOST. Otros inmunógenos de péptido preferidos comprenden 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 4150, o cualquier número entero completo de aminoácidos entre y que incluye 21 y 100 aminoácidos consecutivos, y entre 100 y 190 aminoácidos consecutivos de una secuencia de proteínas de unión a TGF-beta.
Como se desvela en el presente documento, los anticuerpos policlonales pueden generarse fácilmente por un experto habitual en la materia a partir de una variedad de animales de sangre caliente tales como caballos, vacas, diversas aves de corral, conejos, ratones, ovejas, cabras, babuinos o ratas. Normalmente, la proteína de unión a 55 TGF-beta o único péptido de la misma de 13-20 aminoácidos como se describe en el presente documento (preferentemente conjugado con hemocianina de lapa californiana por reticulación con glutaraldehído) se usa para inmunizar el animal mediante inyecciones intraperitoneales, intramusculares, intraoculares, intradérmicas o subcutáneas, junto con un adyuvante tal como adyuvante completo o incompleto de Freund, o el sistema de adyuvantes Ribi (Corixa Corporation, Seattle, WA). Véase entonces, por ejemplo, Harlow y col., arriba. En general, después de la primera inyección, los animales reciben una o más inmunizaciones de refuerzo según un programa preferido que puede variar según, entre otros, el antígeno, el adyuvante (si lo hay) y/o las especies de animales particulares. La respuesta inmunitaria puede monitorizarse sangrando periódicamente el animal y preparando y analizando sueros de un inmunoensayo, tal como un ELISA o ensayo de difusión de Ouchterlony, o similares, para determinar el título específico para anticuerpo. Antisueros policlonales particularmente preferidos darán una señal 65 detectable en uno de estos ensayos, tales como un ELISA, que es preferentemente al menos tres veces superior al ruido. Una vez el título del animal ha alcanzado una meseta en términos de su reactividad a la proteína, cantidades
más grandes de antisueros puede obtenerse fácilmente tanto por sangrados semanales como desangrando el animal. Anticuerpos policlonales que se unen específicamente a la proteína o péptido de unión a TGF-beta pueden entonces purificarse a partir de tales antisueros, por ejemplo, por cromatografía de afinidad usando proteína A.
5 Alternativamente, la cromatografía de afinidad puede realizarse donde la proteína o péptido de unión a TGF-beta o un anticuerpo específico para una región constante de Ig de la especie de animal inmunizado particular se inmoviliza sobre un soporte sólido adecuado.
Anticuerpos para su uso en la invención incluyen anticuerpos monoclonales que se preparan por inmunización convencional y procedimientos de fusión de células como se describen en el presente documento y se conocen en la materia. Los anticuerpos monoclonales pueden generarse fácilmente usando técnicas convencionales (véanse, por ejemplo, Kohler y col., Nature 256:495, 1975; Coligan y col. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1:2,5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) [“Coligan”]; las patentes de EE.UU. nº RE 32.011, 4.902.614, 4.543.439 y 4.411.993; véanse también Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, 15 Kennett, McKearn y Bechtol (eds.), 1980, y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Picksley y col., “Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in
E. coli”, en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª edición, Glover y col. (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)). Los fragmentos de anticuerpos pueden derivarse de los mismos usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica u, opcionalmente, por digestión proteolítica (por ejemplo, usando papaína o pepsina) seguido de reducción suave de enlaces disulfuro y alquilación. Alternativamente, tales fragmentos también pueden generarse por técnicas de ingeniería genética recombinantes.
Brevemente, dentro de una realización, un animal objeto tal como una rata o ratón o hámster se inmuniza con proteína de unión a TGF-beta o una parte de una región de la misma, que incluye péptidos dentro de una región,
25 como se ha descrito en el presente documento. La proteína puede mezclarse con un adyuvante tal como adyuvante completo o incompleto de Freund o adyuvante de Ribi con el fin de aumentar la respuesta inmunitaria resultante. Entre una y tres semanas después de la inmunización inicial, el animal puede volver a inmunizarse con otra inmunización de refuerzo, y probarse para reactividad a la proteína usando ensayos descritos en el presente documento. Una vez el animal ha alcanzado una meseta en su reactividad a la proteína inyectada, se sacrifica y se recogen los órganos que contienen grandes números de linfocitos B tales como el bazo y los ganglios linfáticos. Las suspensiones de bazo y/o ganglio linfático recogidas de células se fusionan con una célula de mieloma adecuada que es sensible al fármaco con el fin de crear un “hibridoma” que secreta anticuerpo monoclonal. Líneas de mieloma adecuadas incluyen, por ejemplo, NS-0, SP20, NS-1 (ATCC nº TIB 18) y P3X63 -Ag 8.653 (ATCC nº CRL 1580).
35 Las células linfoides (por ejemplo, bazo) y las células de mieloma pueden combinarse durante algunos minutos con un agente promotor de la fusión de membranas, tal como polietilenglicol o un detergente no iónico, y luego se siembran a baja densidad sobre un medio selectivo que soporta el crecimiento de células de hibridoma, pero no células de mieloma sin fusionar. Tras la fusión, las células pueden disponerse en placas de cultivo que contienen un medio adecuado, tal como RPMI 1640 o DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco) (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas), además de componentes adicionales tales como suero bovino fetal (SBF, es decir, de Hyclone, Logan, Utah, o JRH Biosciences). Adicionalmente, el medio debe contener un reactivo que permita selectivamente el crecimiento de células del bazo y de mieloma fusionadas tales como HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). Después de aproximadamente siete días, las células fusionadas resultantes o hibridomas pueden cribarse con el fin de determinar la presencia de anticuerpos que son reactivos con
45 proteína de unión a TGF-beta (dependiendo del antígeno usado) y que bloquean, alteran o inhiben la unión de proteína de unión a TGF-beta a un miembro de la familia de TGF-beta. Se prefieren hibridomas que producen anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a esclerostina o una variante de los mismos.
Puede utilizarse una amplia variedad de ensayos para determinar la presencia de anticuerpos que son reactivos contra las proteínas de la presente invención que incluyen, por ejemplo, inmunoelectroforesis en contracorriente, radioinmunoensayos, radioinmunoprecipitaciones, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), ensayos de transferencia puntual, transferencias Western, inmunoprecipitación, ensayos de inhibición o competición y ensayos de tipo sándwich (véanse las patentes de EE.UU. nº 4.376.110 y 4.486.530; véase también Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Los hibridomas se clonan, por ejemplo,
55 por clonación por dilución limitada o por aislamiento en placas de agar blando, y se vuelven a ensayar. Así pueden aislarse anticuerpos productores de hibridomas reactivos contra la proteína deseada.
Los anticuerpos monoclonales de los cultivos de hibridomas pueden aislarse de los sobrenadantes de cultivos de hibridomas. Un procedimiento alternativo para la producción de un anticuerpo monoclonal murino es inyectar las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón singeneico, por ejemplo, un ratón que ha sido tratado (por ejemplo, sensibilizado con pristano) para promover la formación de fluido ascítico que contiene el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse mediante una variedad de técnicas bien establecidas. Tales técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con proteína A-Sepharose, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico (véanse, por ejemplo, Coligan en las 65 páginas 2.7.1-2.7.12 y las páginas 2.9.1-2.9.3; Baines y col., “Purification of Immunoglobulin G (IgG)” en Methods in Molecular Biology, vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Los anticuerpos monoclonales pueden
purificarse por cromatografía de afinidad usando un ligando apropiado seleccionado basándose en propiedades particulares del anticuerpo (por ejemplo, isotipo de cadena pesada o ligera, especificidad de unión, etc.). Ejemplos de un ligando adecuado, inmovilizado sobre un soporte sólido, incluyen proteína A, proteína G, un anticuerpo antiregión constante (cadena ligera o cadena pesada), un anticuerpo antiidiotípico y una proteína de unión a TGF-beta,
5 o fragmento o variante del mismo.
Además, un anticuerpo anti-proteína de unión a TGF-beta de la presente invención puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse por cualquier número de técnicas con las que aquellos expertos habituales en la materia estarán familiarizados. Tales procedimientos incluyen, pero no se limitan a, transformación con el virus de Epstein-Barr (EBV) de glóbulos sanguíneos periféricos humanos (por ejemplo, que contienen linfocitos B), inmunización in vitro de linfocitos B humanos, fusión de células del bazo de ratones transgénicos inmunizados que llevan genes de inmunoglobulina humanos insertados, aislamiento de bibliotecas de fagos de regiones V de inmunoglobulina humana, u otros procedimientos como se conocen en la técnica y basándose en la divulgación en el presente documento. Por ejemplo, pueden obtenerse anticuerpos 15 monoclonales humanos de ratones transgénicos que han sido manipulados para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a exposición antigénica. Los procedimientos para obtener anticuerpos humanos de ratones transgénicos se describen, por ejemplo, por Green y col., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg y col., Nature 368:856, 1994; Taylor y col., Int. Immun. 6:579, 1994; patente de EE.UU. nº 5.877.397; Bruggemann y col., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58; Jakobovits y col., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:525-35. En esta técnica, elementos del sitio de la cadena pesada y ligera humana se introducen en cepas de ratones derivadas de líneas de citoblastos embrionarios que contienen alteraciones elegidas como diana de los sitios endógenos de la cadena pesada y cadena ligera (véase también Bruggemann y col., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997)). Por ejemplo, transgenes de la inmunoglobulina humana pueden ser construcciones de mini-gen, o trans-sitios sobre cromosomas de levadura artificial, que experimentan transposición de ADN específica para linfocitos B e hipermutación en el tejido linfoide de
25 ratón. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden obtenerse inmunizando los ratones transgénicos, que pueden luego producir anticuerpos humanos específicos para el antígeno. Las células linfoides de los ratones transgénicos inmunizados pueden usarse para producir hibridomas secretores de anticuerpos humanos según los procedimientos descritos en el presente documento. Los sueros policlonales que contienen anticuerpos humanos también pueden obtenerse a partir de la sangre de los animales inmunizados.
Otro procedimiento para generar anticuerpos monoclonales específicos para proteína de unión a TGF-beta humana incluye inmortalizar glóbulos sanguíneos periféricos humanos por transformación de EBV. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.464.456. Una línea de linfocitos B inmortalizada tal (o línea celular linfoblastoide) que produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a una proteína de unión a TGF-beta (o una variante
35 o fragmento de la misma) puede identificarse por procedimientos de inmunodetección como se proporcionan en el presente documento, por ejemplo, un ELISA, y luego aislarse por técnicas de clonación convencionales. La estabilidad de la línea celular linfoblastoide que produce un anticuerpo anti-proteína de unión a TGF-beta puede mejorarse fusionando la línea celular transformada con un mieloma murino para producir una línea celular híbrida de ratón-humano según procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Glasky y col., Hybridoma 8:377-89 (1989)). Todavía otro procedimiento para generar anticuerpos monoclonales humanos es inmunización in vitro, que incluye sensibilizar linfocitos B esplénicos humanos con antígeno, seguido de fusión de linfocitos B sensibilizados con un componente de fusión heterohíbrido. Véase, por ejemplo, Boerner y col., 1991 J. Immunol. 147:86-95.
En ciertas realizaciones se selecciona un linfocito B que está produciendo un anticuerpo anti-SOST y las regiones
45 variables de la cadena ligera y cadena pesada se clonan a partir del linfocito B según técnicas de biología molecular conocidas en la técnica (documento WO 92/02551; patente de EE.UU. 5.627.052; Babcook y col., Proc. Natl. A cad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)) y descritas en el presente documento. Preferentemente, los linfocitos B de un animal inmunizado se aíslan del bazo, ganglio linfático o muestra de sangre periférica seleccionando una célula que está produciendo un anticuerpo que se une específicamente a SOST. Los linfocitos B también pueden aislarse de seres humanos, por ejemplo, de una muestra de sangre periférica. Procedimientos para detectar linfocitos B individuales que están produciendo un anticuerpo con la especificidad deseada son muy conocidos en la técnica, por ejemplo, por formación de placas, citometría activada por fluorescencia, estimulación in vitro, seguida de detección de anticuerpo específico, y similares. Procedimientos para la selección de linfocitos B productores de anticuerpos específicos incluyen, por ejemplo, preparar una suspensión de una sola célula de células de linfocitos B en agar
55 blando que contiene SOST o un fragmento de péptido de la misma. La unión del anticuerpo específico producida por el linfocito B al antígeno produce la formación de un complejo, que puede ser visible como inmunoprecipitado. Después de seleccionar los linfocitos B que producen el anticuerpo específico, los genes de anticuerpos específicos pueden clonarse aislando y amplificando ADN o ARNm según procedimientos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento.
Para usos particulares pueden desearse fragmentos de anticuerpos anti-proteína de unión a TGF-beta. Los fragmentos de anticuerpos, F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc, Fd, retienen el sitio de unión a antígeno del anticuerpo completo y, por tanto, se unen al mismo epítope. Estos fragmentos de unión a antígeno derivados de un anticuerpo pueden obtenerse, por ejemplo, por hidrólisis proteolítica del anticuerpo, por ejemplo, digestión con pepsina o 65 papaína de anticuerpos completos según procedimientos convencionales. Como ilustración, los fragmentos de anticuerpos pueden producirse por escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S indicado F(ab')2. Este fragmento puede escindirse adicionalmente usando un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes 3.5S Fab'. Opcionalmente, la reacción de escisión puede realizarse usando un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo que resultan de la escisión de enlaces disulfuro. Como alternativa, una escisión enzimática usando papaína produce dos fragmentos monovalentes Fab y un fragmento Fc directamente. 5 Estos procedimientos se describen, por ejemplo, por Goldenberg, patente de EE.UU. nº 4.331.647, Nisonoff y col., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman y col., en Methods in Enzymology
1:422 (Academic Press 1967); y por Coligan en las páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10.-2.10.4. También pueden usarse otros procedimientos para escindir anticuerpos, tales como separar cadenas pesadas para formar fragmentos de la cadena ligera-pesada monovalentes (Fd), escindir adicionalmente fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, mientras que los fragmentos se unan al antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.
Un fragmento de anticuerpo también puede ser cualquier proteína sintética o genéticamente manipulada que actúa de anticuerpo porque se une a un antígeno específico para formar un complejo. Por ejemplo, fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos aislados que consisten en la región variable de la cadena ligera, fragmentos “Fv” 15 que consisten en las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras, moléculas de polipéptidos monocatenarias recombinantes en las que las regiones variables ligeras y pesadas están conectadas por un ligador de péptidos (proteínas scFv) y unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable. El anticuerpo de la presente invención comprende preferentemente al menos un dominio de la región variable. El dominio de la región variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una secuencia de aminoácidos hipervariable responsable de la unión a antígeno y que es adyacente a o está en marco con una o más secuencias de la región estructural. En términos generales, el dominio de la región variable (V) puede ser cualquier disposición adecuada de dominios variables de la cadena pesada (VH) y/o ligera (VL) de inmunoglobulina. Así, por ejemplo, el dominio de la región V puede ser monomérico y ser un dominio VH o VL, que puede unir independientemente antígeno con afinidad
25 aceptable. Alternativamente, el dominio de la región V puede ser dimérico y contener dímeros VH-VH, VH-VL o VL-VL. Preferentemente, el dímero de la región V comprende al menos una cadena VH y al menos una VL que no están covalentemente asociadas (denominado en lo sucesivo Fv). Si se desea, las cadenas pueden acoplarse covalentemente tanto directamente, por ejemplo, mediante un enlace disulfuro entre los dos dominios variables, como mediante un ligador, por ejemplo, un ligador de péptidos, para formar un Fv monocatenario (scFv).
El dominio de la región variable puede ser cualquier dominio variable que se produzca naturalmente o una versión modificada del mismo. Por versión manipulada se indica un dominio de la región variable que ha sido creado usando técnicas de manipulación de ADN recombinante. Tales versiones manipuladas incluyen aquellas creadas, por ejemplo, a partir de una región variable de anticuerpo específico por inserciones, deleciones o cambios en o a las
35 secuencias de aminoácidos del anticuerpo específico. Ejemplos particulares incluyen dominios de la región variable manipulados que contienen al menos una CDR y opcionalmente uno o más aminoácidos de la región estructural de un primer anticuerpo y el resto del dominio de la región variable de un segundo anticuerpo.
El dominio de la región variable puede unirse covalentemente en un aminoácido del extremo C a al menos otro dominio de anticuerpo o un fragmento del mismo. Así, por ejemplo, un dominio VH que está presente en el dominio de la región variable puede ligarse a un dominio CH1 de inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. Similarmente, un dominio VL puede ligarse a un dominio CK o un fragmento del mismo. De esta forma, por ejemplo, el anticuerpo puede ser un fragmento Fab donde el dominio de unión a antígeno contiene asociados dominios VH y VL covalentemente ligados en su extremo C a un dominio CH1 y CK, respectivamente. El dominio CH1 puede extenderse
45 con aminoácidos adicionales, por ejemplo, para proporcionar una región bisagra o una parte de un dominio de la región bisagra como se encuentra en un fragmento Fab', o para proporcionar adicionalmente dominios, tales como dominios CH2 y CH3 de anticuerpo.
Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que comprende una única región determinante de la complementariedad (CDR). Los péptidos de CDR (“unidades de reconocimiento mínimo”) pueden obtenerse construyendo polinucleótidos que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Tales polinucleótidos se preparan, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable usando ARNm de células productoras de anticuerpo como molde (véanse, por ejemplo, Larrick y col., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies”, en
55 Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter y col. (eds.), página 166 (Cambridge University Press 1995); y Ward y col., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies”, en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch y col., (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).
Alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo recombinante o manipulado obtenido por el uso de técnicas de ADN recombinante que implican la manipulación y re-expresión de ADN que codifica regiones variables y/o constantes de anticuerpos. Tal ADN es conocido y/o está fácilmente disponible de bibliotecas de ADN que incluyen, por ejemplo, bibliotecas de fago-anticuerpo (véase Chiswell y McCafferty, Tibtech. 10:80-84 (1992)) o si se desea puede sintetizarse. Pueden usarse procedimientos de biología molecular y/o química convencionales para secuenciar y manipular el ADN, por ejemplo, para introducir codones para crear residuos de cisteína, o para
65 modificar, añadir o delecionar otros aminoácidos o dominios según se desee.
Según la presente invención también pueden generarse anticuerpos quiméricos, específicos para una proteína de unión a TGF-beta, y que incluyen anticuerpos humanizados. Un anticuerpo quimérico tiene al menos un dominio de la región constante derivado de una primera especie de mamífero y al menos un dominio de la región variable derivado de una segunda especie de mamífero distinta (véase, por ejemplo, Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 5 USA, 81:6851-55 (1984)). En realizaciones preferidas, un anticuerpo quimérico puede construirse clonando la secuencia de polinucleótidos que codifica al menos un dominio de la región variable derivado de un anticuerpo monoclonal no humano, tal como la región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino, de rata o de hámster, en un vector que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una región constante humana (véanse, por ejemplo, Shin y col., Methods Enzymol. 178:459-76 (1989); Walls y col., Nucleic Acids Res. 21:2921-29 (1993)). A modo de ejemplo, la secuencia de polinucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo monoclonal murino puede insertarse en un vector que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de la región constante de la cadena ligera kappa humana. En un vector separado, la secuencia de polinucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal puede clonarse en marco con secuencias que codifican una región constante de IgG humana, por ejemplo, la región
15 constante de IgG1 humana. La región constante humana particular seleccionada puede depender de las funciones efectoras deseadas para el anticuerpo particular (por ejemplo, fijación del complemento, unión a un receptor de Fc particular, etc.). Preferentemente, los vectores construidos se transfectarán en células eucariotas para la expresión estable del anticuerpo quimérico. Otro procedimiento conocido en la técnica para generar anticuerpos quiméricos es recombinación de homólogos (por ejemplo, patente de EE.UU. nº 5.482.856).
Un anticuerpo quimérico no humano/humano puede manipularse adicionalmente genéticamente para crear un anticuerpo “humanizado”. Un anticuerpo humanizado tal puede comprender una pluralidad de CDR derivadas de una inmunoglobulina de una especie de mamífero no humano, al menos una región estructural variable humana y al menos una región constante de inmunoglobulina humana. Estrategias útiles para diseñar anticuerpos humanizados 25 pueden incluir, por ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, identificación de regiones estructurales variables humanas que son lo más homólogas con las regiones estructurales no humanas del anticuerpo quimérico. Sin desear ceñirse a teoría alguna, una estrategia tal puede aumentar la probabilidad de que el anticuerpo humanizado retenga la afinidad de unión específica por una proteína de unión a TGF-beta, que en algunas realizaciones preferidas puede ser sustancialmente la misma afinidad por una proteína de unión a TGF-beta o variante o fragmento de la misma, y en ciertas otras realizaciones preferidas puede ser una afinidad mayor por la proteína de unión a TGF-beta. Véanse, por ejemplo, Jones y col., 1986 Nature 321:522-25; Riechmann y col., 1988 Nature 332:323-27. Por tanto, el diseño de un anticuerpo humanizado tal puede incluir determinar conformaciones de bucle de CDR y determinantes estructurales de las regiones variables no humanas, por ejemplo, por modelado informático, y luego comparar los bucles de CDR y determinantes con estructuras de bucle de CDR humanas y 35 determinantes. Véanse, por ejemplo, Padlan y col., 1995 FASEB 9:133-39; Chothia y col., 1989 Nature, 342:377
383. El modelado informático también puede usarse para comparar moldes estructurales humanos seleccionados por homología de secuencias con las regiones variables no humanas. Véanse, por ejemplo, Bajorath y col., 1995 Ther. Immunol. 2:95-103; documento EP-0578515-A3. Si la humanización de las CRD no humanas produce una disminución en la afinidad de unión, el modelado informático puede ayudar en la identificación de residuos de aminoácidos específicos que podrían cambiarse por técnicas de mutagénesis dirigidas a sitio u otras para restaurar parcialmente, completamente o supra-óptimamente (es decir, aumentar a un nivel superior al del anticuerpo no humanizado) la afinidad. Aquellos expertos habituales en la materia están familiarizados con estas técnicas, y apreciarán fácilmente numerosas variaciones y modificaciones a tales estrategias de diseño.
45 Un procedimiento tal para preparar un anticuerpo humanizado se llama inactivación. Como se usa en el presente documento, los términos “FR inactivadas” y “FR recombinantemente inactivadas” se refieren a la sustitución selectiva de residuos de FR de, por ejemplo, una región V de la cadena pesada o ligera de roedor, con residuos de FR humanos con el fin de proporcionar una molécula xenogeneica que comprende un sitio de unión a antígeno que retiene sustancialmente toda la estructura de plegamiento de polipéptidos de FR nativa. Las técnicas de inactivación se basan en el entendimiento de que las características de unión del ligando de un sitio de unión a antígeno se determinan principalmente por la estructura y disposición relativa de los conjuntos de CDR de cadena pesada y ligera dentro de la superficie de unión a antígeno. Davies y col., Ann. Rev. Biochem. 59:439-73, 1990. Así, la especificidad de unión a antígeno puede preservarse en un anticuerpo humanizado solo donde las estructuras de CDR, su interacción entre sí y su interacción con el resto de los dominios de la región V se mantengan
55 cuidadosamente. Usando técnicas de inactivación, residuos de FR exteriores (por ejemplo, accesibles a disolventes) que son fácilmente encontrados por el sistema inmunitario se sustituyen selectivamente con residuos humanos para proporcionar una molécula híbrida que comprende tanto una superficie inactivada débilmente inmunogénica como sustancialmente no inmunogénica.
El procedimiento de inactivación hace uso de los datos de secuencia disponibles para dominios variables de anticuerpos humanos compilados por Kabat y col. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ª ed., (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1987), actualizaciones de la base de datos de Kabat y otras bases de datos de EE.UU. y extrajeras accesibles (tanto de ácido nucleico como proteína). Las accesibilidades al disolvente de aminoácidos de la región V pueden deducirse de la estructura tridimensional 65 conocida para fragmentos de anticuerpos humanos y murinos. Inicialmente, las FR de los dominios variables de una molécula de anticuerpo de interés se comparan con secuencias de FR correspondientes de dominios variables
humanos obtenidos de las fuentes anteriormente identificadas. Entonces, las regiones V humanas más homólogas se comparan residuo a residuo con aminoácidos murinos correspondientes. Los residuos en la FR murina que se diferencian del homólogo humano se sustituyen con los residuos presentes en el resto humano usando técnicas recombinantes muy conocidas en la técnica. El cambio de residuos solo se lleva a cabo con restos que están al
5 menos parcialmente expuestos (accesibles al disolvente), y se tiene cuidado en la sustitución de residuos de aminoácidos que puedan tener un efecto significativo sobre la estructura terciaria de dominios de la región V, tales como prolina, glicina y aminoácidos cargados.
De este modo, los sitios de unión a antígeno “inactivados” resultantes se diseñan así para retener los residuos de CDR de roedor, los residuos sustancialmente adyacentes a las CDR, los residuos identificados como enterrados o principalmente enterrados (inaccesibles al disolvente), los residuos que se cree que participan en contactos no covalentes (por ejemplo, electrostáticos e hidrófobos) entre dominios de la cadena pesada y ligera, y los residuos de regiones estructurales conservadas de las FR que se cree que influyen en las estructuras terciarias “canónigas” de los bucles de CDR. Entonces, estos criterios de diseño se usan para preparar secuencias de nucleótidos
15 recombinantes que combinan las CDR de tanto la cadena pesada como ligera de un sitio de unión a antígeno en FR que parecen humanas que pueden usarse para transfectar células de mamífero para la expresión de anticuerpos humanos recombinantes que presentan la especificidad por antígenos de la molécula de anticuerpo de roedor.
Un procedimiento adicional para seleccionar anticuerpos que se unen específicamente a una proteína de unión a TGF-beta o variante o fragmento de la misma es por expresión en fago. Véanse, por ejemplo, Winter y col., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55; Burton y col., 1994 Adv. Immunol. 57:191-280. Pueden crearse bibliotecas combinatorias de genes de regiones variables de inmunoglobulina humanas o murinas en vectores de fago que pueden cribarse para seleccionar fragmentos de Ig (Fab, Fv, sFv, o multímeros de los mismos) que se unen específicamente a proteína de unión a TGF-beta o variante o fragmento de la misma. Véanse, por ejemplo, la 25 patente de EE.UU. nº 5.223.409; William D. Huse y col., “Generation of a Large Combinational Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda”, Science 246:1275-1281, diciembre de 1989; véanse también L. Sastry y col., “Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-5732, agosto de 1989; véanse también Michelle Alting-Mees y col., “Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas”, Strategies in Molecular Biology 3:1-9, enero de 1990; Kang y col., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66; Hoogenboom y col., 1992 J. Molec. Biol. 227:381-388; Schlebusch y col., 1997 Hybridoma 16:47-52 y referencias citadas en su interior). Un sistema comercial está disponible de Stratagene (La Jolla, California) que permite la producción de anticuerpos mediante técnicas recombinantes. Brevemente, se aísla ARNm de una población de linfocitos B y se utiliza para crear bibliotecas de expresión de 35 ADNc de inmunoglobulina de la cadena pesada y ligera en los vectores ∀ImmunoZap(H) y ∀ImmunoZap(L). Placas positivas pueden convertirse posteriormente en un plásmido no lítico que permite la expresión de alto nivel de fragmentos de anticuerpo monoclonal de E. coli. Alternativamente, una biblioteca que contiene una pluralidad de secuencias de polinucleótidos que codifica fragmentos de la región variable de Ig puede insertarse en el genoma de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o una variante del mismo, en marco con la secuencia que codifica una proteína de la envoltura de fago. Una proteína de fusión puede ser una fusión de la proteína de la envoltura con el dominio de la región variable de la cadena ligera y/o con el dominio de la región variable de la cadena pesada. Según ciertas realizaciones, fragmentos Fab de inmunoglobulina también pueden expresarse en una partícula de fago (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.698.426). Estos vectores pueden cribarse individualmente o coexpresarse para formar fragmentos Fab o anticuerpos (véase Huse y col., arriba; véase también Sastry y col.,
45 arriba).
Similarmente, porciones o fragmentos, tales como fragmentos Fab y Fv, de anticuerpos también pueden construirse utilizando digestión enzimática convencional o técnicas de ADN recombinante para incorporar las regiones variables de un gen que codifica un anticuerpo que se une específicamente. Dentro de una realización, los genes que codifican la región variable de un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de interés se amplifican usando cebadores de nucleótidos para la región variable. Estos cebadores pueden sintetizarse por un experto habitual en la materia, o pueden comprarse de fuentes comercialmente disponibles. Stratagene (La Jolla, California) comercializa cebadores para regiones variables de ratón y humanas que incluyen, entre otros, cebadores para regiones VHa, VHb, VHc, VHd, CHl, VL y CL. Estos cebadores pueden utilizarse para amplificar regiones variables de la cadena pesada o
55 ligera, que pueden entonces insertarse en vectores tales como ImmunoZAP™ H o ImmunoZAP™ L (Stratagene), respectivamente. Estos vectores pueden entonces introducirse en E. coli, levadura o sistemas basados en mamífero para la expresión. Utilizando estas técnicas pueden producirse grandes cantidades de una proteína monocatenaria que contienen una fusión de los dominios VH y VL (véase Bird y col., Science 242:423-426, 1988). Además, tales técnicas pueden utilizarse para cambiar un “anticuerpo murino” a un anticuerpo “humano” sin alterar la especificidad de unión del anticuerpo.
En ciertas realizaciones particulares de la invención también pueden usarse bibliotecas de fagos combinatorias para humanización de regiones variables no humanas. Véanse, por ejemplo, Rosok y col., 1996 J. Biol. Chem. 271:22611-18; Rader y col., 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8910-15. Una biblioteca de fagos puede cribarse 65 para seleccionar un fragmento de la región variable de Ig de interés por procedimientos de inmunodetección conocidos en la técnica y descritos en el presente documento, y la secuencia de ADN del gen de inmunoglobulina
insertado en el fago así seleccionado puede determinarse por técnicas convencionales. Véase, Sambrook y col., 2001 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. La secuencia codificante de Ig seleccionada puede entonces clonarse en otro vector adecuado para la expresión del fragmento de Ig u, opcionalmente, puede clonarse en un vector que contiene regiones constantes de Ig, para la expresión de cadenas
5 de inmunoglobulina completas.
En ciertas otras realizaciones, la invención contempla anticuerpos específicos para SOST que son fragmentos multímeros de anticuerpos. Metodologías útiles se describen generalmente, por ejemplo, en Hayden y col. 1997, Curr Opin. Immunol. 9:201-12; Coloma y col., 1997 Nat. Biotechnol. 15:159-63). Por ejemplo, pueden crearse fragmentos multímeros de anticuerpos por técnicas de fago para formar minianticuerpos (patente de EE.UU. nº 5 910 573) o diacuerpos (Holliger y col., 1997, Cancer Immunol. Immunother. 45:128-130).
En ciertas realizaciones de la invención, un anticuerpo específico para SOST puede ser un anticuerpo que se expresa como una proteína intracelular. Tales anticuerpos intracelulares también se denominan intracuerpos y 15 pueden comprender un fragmento Fab, o preferentemente comprenden un fragmento scFv (véase, por ejemplo, Lecerf y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:4764-49 (2001). Las regiones estructurales que flanquean las regiones CDR pueden modificarse para mejorar los niveles de expresión y solubilidad de un intracuerpo en un entorno reductor intracelular (véase, por ejemplo, Worn y col., J. Biol. Chem. 275:2795-803 (2000)). Un intracuerpo puede dirigirse a una localización celular particular u orgánulo, por ejemplo, construyendo un vector que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica las regiones variables de un intracuerpo que puede fusionarse operativamente con una secuencia de polinucleótidos que codifica un antígeno diana particular dentro de la célula (véanse, por ejemplo, Graus-Porta y col., Mol. Cell Biol. 15:1182-91 (1995); Lener y col., Eur. J. Biochem. 267:1196205 (2000)). Un intracuerpo puede introducirse en una célula mediante una variedad de técnicas disponibles para el experto que incluyen mediante un vector de terapia génica, o una mezcla de lípidos (por ejemplo, Provectin™
25 fabricado por Imgenex Corporation, San Diego, CA), o según procedimientos de internalización fotoquímica.
La introducción de mutaciones de aminoácidos en una molécula de inmunoglobulina específica para una proteína de unión a TGF-beta puede ser útil para aumentar la especificidad o afinidad por proteína de unión a TGF-beta o para alterar una función efectora. Inmunoglobulinas con mayor afinidad por proteína de unión a TGF-beta pueden generarse por mutagénesis dirigida a sitio de residuos particulares. El modelado molecular tridimensional asistido por ordenador puede emplearse para identificar los residuos de aminoácidos que van a cambiarse, con el fin de mejorar la afinidad por la proteína de unión a TGF-beta. Véase, por ejemplo, Mountain y col., 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10: 1-142. Alternativamente, pueden generarse bibliotecas combinatorias de CDR en fago M13 y cribarse para fragmentos de inmunoglobulina con afinidad mejorada. Véanse, por ejemplo, Glaser y col., 1992, J. 35 Immunol. 149:3903-3913; Barbas y col., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3809-13; patente de EE.UU nº
5.792.456.
También pueden alterarse las funciones efectoras por mutagénesis dirigida a sitio. Véanse, por ejemplo, Duncan y col., 1988 Nature 332:563-64; Morgan y col., 1995 Immunology 86:319-24; Eghtedarzedeh-Kondri y col., 1997 Biotechiques 23:830-34. Por ejemplo, la mutación del sitio de glucosilación sobre la porción de Fc de la inmunoglobulina puede alterar la capacidad de la inmunoglobulina para fijar el complemento. Véase, por ejemplo, Wright y col., 1997 Trends Biotechnol. 15:26-32. Otras mutaciones en los dominios de la región constante pueden alterar la capacidad de la inmunoglobulina para fijar el complemento, o para efectuar citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. Véanse, por ejemplo, Duncan y col., 1988 Nature 332:563-64; Morgan y col., 1995
45 Immunology 86:319-24; Sensel y col., 1997 Mol. Immunol. 34:1019-29.
Según ciertas realizaciones, regiones variables de la cadena pesada y cadena ligera no humanas, humanas o humanizadas de cualquiera de las moléculas de Ig descritas en el presente documento pueden construirse como fragmentos de polipéptidos monocatenarios Fv (scFv) (anticuerpos monocatenarios). Véanse, por ejemplo, Bird y col., 1988 Science 242:423-426; Huston y col., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883. Pueden generarse proteínas de fusión de scFv multifuncionales enlazando una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido scFv en marco con al menos una secuencia de polinucleótidos que codifica cualquiera de una variedad de proteínas efectoras conocidas. Estos procedimientos se conocen en la técnica y se desvelan, por ejemplo, en el documento EPB1-0318554, patente de EE.UU. nº 5.132.405, patente de EE.UU. nº 5.091.513 y patente de EE.UU. nº
55 5.476.786. Proteínas efectoras a modo de ejemplo pueden incluir secuencias de la región constante de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Hollenbaugh y col., 1995 J. Immunol. Methods 188:1-7. Otros ejemplos de proteínas efectoras son enzimas. Como ejemplo no limitante, una enzima tal puede proporcionar una actividad biológica para fines terapéuticos (véase, por ejemplo, Siemers y col., 1997 Bioconjug. Chem. 8:510-19), o puede proporcionar una actividad detectable, tal como conversión catalizada por peroxidasa de rábano picante de distintos sustratos muy conocidos en un producto detectable, para usos de diagnóstico. Todavía otros ejemplos de proteínas de fusión de scFv incluyen fusiones de Ig-toxina, o inmunotoxinas, donde el polipéptido de scFv está enlazado con una toxina.
scFv o cualquier fragmento de anticuerpo descrito en el presente documento puede fusionarse, en ciertas
65 realizaciones, con dominios de péptido o de polipéptido que permiten la detección de la unión específica entre la proteína de fusión y el antígeno (por ejemplo, una proteína de unión a TGF-beta). Por ejemplo, el dominio de polipéptidos de fusión puede ser un polipéptido de marca de afinidad para detectar la unión de la proteína de fusión de scFv a una proteína de unión a TGF-beta por cualquiera de una variedad de técnicas con las que aquellos expertos en la materia estarán familiarizados. Ejemplos de una marca de péptido incluyen avidina, estreptavidina o His (por ejemplo, polihistidina). Técnicas de detección también pueden incluir, por ejemplo, unión de una proteína de
5 fusión de avidina o estreptavidina a biotina o a una secuencia mimética de biotina (véase, por ejemplo, Luo y col., 1998 J. Biotechnol. 65:225 y referencias citadas en su interior), modificación covalente directa de una proteína de fusión con un resto detectable (por ejemplo, un resto de marcado), unión no covalente de la proteína de fusión con una molécula indicadora marcada específica, modificación enzimática de un sustrato detectable por una proteína de fusión que incluye una parte que tiene actividad enzimática, o inmovilización (covalente o no covalente) de la proteína de fusión sobre un soporte de fase sólida. Otros polipéptidos de afinidad útiles para la construcción de proteínas de fusión de scFv pueden incluir proteínas de fusión de estreptavidina, como se desvela, por ejemplo, en los documentos WO 89/03422, U.S. 5.489.528, U.S. 5.672.691, WO 93/24631, U.S. 5.168.049, U.S. 5.272.254; proteínas de fusión de avidina (véase, por ejemplo, el documento EP 511.747); una enzima tal como glutatión-Stransferasa; y polipéptido de proteína A de Staphylococcus aureus.
15 Los polinucleótidos que codifican un anticuerpo o fragmento del mismo que se unen específicamente a una proteína de unión a TGF-beta, como se describe en el presente documento, pueden propagarse y expresarse según cualquiera de una variedad de procedimientos muy conocidos para escisión, ligación, transformación y transfección de ácido nucleico usando cualquier número de vectores de expresión conocidos. Así, en ciertas realizaciones, la expresión de un fragmento de anticuerpo puede preferirse en un huésped procariota tal como Escherichia coli (véase, por ejemplo, Pluckthun y col., 1989 Methods Enzymol. 178:497-515). En ciertas otras realizaciones, la expresión del anticuerpo o un fragmento del mismo puede preferirse en una célula huésped eucariota, que incluye levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y Pichia pastoris), células animales (incluyendo células de mamífero) o células vegetales. Ejemplos de células animales adecuadas incluyen, pero no se
25 limitan a, células de mieloma (tal como una línea de NSO de ratón), COS, CHO o de hibridoma. Ejemplos de células vegetales incluyen células de tabaco, maíz, soja y arroz.
Una vez se han obtenido anticuerpos adecuados, pueden aislarse o purificarse por muchas técnicas muy conocidas para aquellos expertos habituales en la materia (véase Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Técnicas adecuadas incluyen columnas de afinidad de péptido o proteína (incluyendo uso de anticuerpos anti-región constante unidos a la matriz de la columna), HPLC o RP-HPLC, purificación sobre columnas de proteína A o proteína G, o cualquier combinación de estas técnicas.
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS
35 La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención y un vehículo fisiológicamente aceptable. Generalmente, tales vehículos deben ser no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Generalmente, la preparación de tales composiciones implica combinar el agente terapéutico con tampones, antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos), proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono que incluyen glucosa, maltosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutatión y otros estabilizadores y excipientes. Solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina de suero no específica son diluyentes apropiados a modo de ejemplo.
45 Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden prepararse para administración mediante una variedad de vías diferentes. En general, el tipo de vehículo se selecciona basándose en el modo de administración. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para cualquier modo apropiado de administración, que incluye, por ejemplo, administración tópica, oral, nasal, intratecal, rectal, vaginal, sublingual o parenteral, que incluye inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal, intracavernosa, intrameatal o intrauretral. Una composición farmacéutica (por ejemplo, para administración por vía oral o administración por inyección) puede estar en forma de un líquido (por ejemplo, un elixir, jarabe, disolución, emulsión o suspensión). Una composición farmacéutica líquida puede incluir, por ejemplo, uno o más de los siguientes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, preferentemente solución salina fisiológica, disolución de Ringer, cloruro sódico
55 isotónico, aceites no volátiles que pueden servir de disolvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos; antioxidantes; agentes quelantes; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. Una preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringuillas desechables o viales de múltiples dosis hechos de vidrio o plástico. Se prefiere el uso de solución salina fisiológica, y una composición farmacéutica inyectable es preferentemente estéril.
Las composiciones descritas en el presente documento pueden formularse para liberación sostenida (es decir, una formulación tal como una cápsula o esponja que efectúa una liberación lenta del compuesto tras la administración). Tales composiciones pueden prepararse generalmente usando tecnología muy conocida y administrarse por, por
65 ejemplo, implantación oral, rectal o subcutánea, o por implantación en el sitio diana deseado. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener un agente dispersado en una matriz de vehículo y/o contenido dentro de un recipiente rodeado por una membrana que controla la tasa. Vehículos para su uso dentro de tales formulaciones son biocompatibles, y también pueden ser biodegradables; preferentemente, la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación de componente activo. La cantidad de compuesto activo contenido dentro de una formulación de liberación sostenida depende del sitio de implantación, la tasa y duración esperada de la
5 liberación y la naturaleza de la afección que va a tratarse o prevenirse. Vehículos útiles ilustrativos a este respecto incluyen micropartículas de poli(lactida-co-glicolida), poliacrilato, látex, almidón, celulosa, dextrano y similares. Otros vehículos de liberación retardada ilustrativos incluyen biovectores supramoleculares, que comprenden un núcleo hidrófilo no líquido (por ejemplo, un polisacárido u oligosacárido reticulado) y, opcionalmente, una capa externa que comprende un compuesto anfifílico, tal como un fosfolípido (véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.151.254 y las solicitudes PCT WO 94/20078, WO/94/23701 y WO 96/06638).
En otra realización ilustrativa, microesferas biodegradables (por ejemplo, polilactato-poliglicolato) se emplean como vehículos para las composiciones de la presente invención. Microesferas biodegradables adecuadas se desvelan, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 4.897.268; 5.075.109; 5.928.647; 5.811.128; 5.820.883; 5.853.763;
15 5.814.344, 5.407.609 y 5.942.252. Sistemas de vehículo para proteínas Core de hepatitis B modificadas, tal como se describen en el documento WO/99 40934, y referencias citadas en su interior, también serán útiles para muchas aplicaciones. Otro sistema de vehículo/administración ilustrativo emplea un vehículo que comprende complejos de partícula-proteína tales como aquellos descritos en la patente de EE.UU. nº 5.928.647, que pueden inducir respuestas de linfocitos T citotóxicos restringidos a la clase I en un huésped.
En otra realización ilustrativa, las partículas de núcleo de fosfato de calcio se emplean como vehículos o como matrices de liberación controlada para las composiciones de la presente invención. Partículas de fosfato de calcio a modo de ejemplo se desvelan, por ejemplo, en la solicitud de patente publicada nº WO/0046147.
25 El desarrollo de pautas de dosificación y de tratamiento adecuadas para usar las composiciones particulares descritas en el presente documento en una variedad de pautas de tratamiento que incluyen, por ejemplo, administración y formulación oral, parenteral, intravenosa, intranasal e intramuscular, es muy conocido en la técnica, algunas de las cuales se tratan brevemente más adelante para fines generales de ilustración.
En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas desveladas en el presente documento pueden administrarse por administración por vía oral a un animal. Como tales, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o pueden encerrarse en cápsula de gelatina de vaina dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente con la comida de la dieta.
35 En ciertas circunstancias será deseable administrar las composiciones farmacéuticas desveladas en el presente documento parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, o incluso intraperitonealmente. Tales enfoques son muy conocidos para el experto, algunos de los cuales se describen adicionalmente, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.543.158; la patente de EE.UU. nº 5.641.515 y la patente de EE.UU. nº 5.399.363. En ciertas realizaciones, disoluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua adecuadamente mezcladas con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones generalmente contendrán un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.
45 Formas farmacéuticas ilustrativas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles (por ejemplo, véase la patente de EE.UU. nº 5.466.468). En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que exista fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y/o por el uso de
55 tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede facilitarse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse por el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
En una realización, para administración parenteral en una disolución acuosa, la disolución debe estar adecuadamente tamponada, si fuera necesaria, y el diluyente líquido convertirse primero en isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, un medio acuoso estéril
65 que puede emplearse será conocido para aquellos expertos en la materia en vista de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 ml de disolución de NaCl isotónica y tanto añadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis como inyectarse en el sitio de infusión propuesto (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15ª ed., pág. 1035-1038 y 1570-1580). Alguna variación en la dosificación se producirá necesariamente dependiendo de la afección del sujeto que está tratándose. Además, para administración humana, las preparaciones cumplirán por supuesto preferentemente la esterilidad, pirogenicidad y los patrones de seguridad y
5 pureza generales según se requiera por la Oficina de la FDA de patrones biológicos.
En otra realización de la invención, las composiciones desveladas en el presente documento pueden formularse en una forma neutra o de sal. Sales farmacéuticamente aceptables ilustrativas incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o tales ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y tales bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las disoluciones se administrarán de un modo compatible con la formulación de dosificación y en cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz.
15 Los vehículos pueden comprender además todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción, tampones, disoluciones de vehículo, suspensiones, coloides y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas es muy conocido en la técnica. Excepto en tanto que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, su uso en las composiciones terapéuticas se contempla. Principios activos suplementarios también pueden incorporarse en las composiciones. El término “farmacéuticamente aceptable” se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen una reacción alérgica o inadecuada similar cuando se administran a un ser humano.
25 En ciertas realizaciones, liposomas, nanocápsulas, micropartículas, partículas de lípidos, vesículas y similares se usan para la introducción de las composiciones de la presente invención en células huésped/organismos adecuados. En particular, las composiciones de la presente invención pueden formularse para la administración tanto encapsulada en una partícula de lípido, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera como una nanopartícula o similares. Alternativamente, las composiciones de la presente invención pueden unirse, tanto covalentemente como no covalentemente, a la superficie de tales vehículos de excipiente.
La formación y uso de preparaciones de liposoma y similares a liposoma como posibles vehículos de fármaco se conoce generalmente para aquellos expertos en la materia (véanse, por ejemplo, Lasic, Trends Biotechnol. 16(7):307-21, 1998; Takakura, Nippon Rinsho 56(3):691-95, 1998; Chandran y col., Indian J. Exp. Biol. 35(8):801-09, 35 1997; Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 12(2-3):233-61, 1995; patente de EE.UU. nº 5.567.434; patente de EE.UU. nº 5.552.157; patente de EE.UU. nº 5.565.213; patente de EE.UU. nº 5.738.868 y patente de EE.UU. nº
5.795.587.
Los liposomas se han usado satisfactoriamente con varios tipos de células que son normalmente difíciles de transfectar por otros procedimientos, que incluyen suspensiones de linfocitos T, cultivos de hepatocitos primarios y células PC 12 (Renneisen y col., J. Biol. Chem. 265(27):16337-42, 1990; Muller y col., DNA Cell Biol. 9(3):221-29, 1990). Además, los liposomas están libres de limitaciones de longitud de ADN que son típicas de sistemas de administración basados en virus. Los liposomas se han usado eficazmente para introducir genes, diversos fármacos, agentes radioterapéuticos, enzimas, virus, factores de transcripción, efectores alostéricos y similares, en una
45 variedad de líneas de células cultivadas y animales. Además, el uso de liposomas no parece estar asociado a respuestas autoinmunitarias o citotoxicidad inaceptable después de la administración sistémica.
En ciertas realizaciones, los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de bicapa concéntrica multilaminar (también se llaman vesículas multilaminares (MLV)).
Alternativamente, en otras realizaciones, la invención proporciona formulaciones de nanocápsula farmacéuticamente aceptables de las composiciones de la presente invención. Las nanocápsulas pueden atrapar generalmente compuestos en una forma estable y reproducible (véase, por ejemplo, Quintanar-Guerrero y col., Drug Dev. Ind.
55 Pharm. 24(12):1113-28, 1998). Para evitar efectos secundarios debido a sobrecarga polimérica intracelular, tales partículas ultrafinas (de tamaño aproximadamente 0,1 μm) pueden diseñarse usando polímeros capaces de degradarse in vivo. Tales partículas pueden prepararse como se describe, por ejemplo, por Couvreur y col., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5(1):1-20, 1988; zur Muhlen y col., Eur. J. Pharm. Biopharm. 45(2):149-55, 1998; Zambaux y col., J. Controlled Release 50(1-3):31-40, 1998; y la patente de EE.UU. nº 5.145.684.
Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden disponerse dentro de recipientes, junto con material de envasado que proporciona instrucciones referentes al uso de tales composiciones farmacéuticas. Generalmente, tales instrucciones incluirán una expresión tangible que describe la concentración de reactivo, además de dentro de ciertas realizaciones, cantidades relativas de componentes o diluyentes de excipientes (por
65 ejemplo, agua, solución salina o PBS) que pueden ser necesarias para reconstituir la composición farmacéutica.
TRATAMIENTO La presente invención también proporciona aumentar el contenido mineral y la densidad mineral de hueso. Brevemente, numerosas condiciones producen la pérdida de contenido mineral óseo que incluyen, por ejemplo, enfermedad, predisposición genética, accidentes que producen la falta de uso de hueso (por ejemplo, debido a fractura), terapéuticos que efectúan la resorción ósea, o que destruyen células formadoras de hueso y
5 envejecimiento normal. Mediante el uso de las moléculas descritas en el presente documento que inhiben la proteína de unión a TGF-beta que se une a un miembro de la familia de TGF-beta, tales afecciones pueden tratarse o prevenirse. Como se utiliza en el presente documento, debe entenderse que el contenido mineral óseo se ha aumentado si el contenido mineral óseo se ha aumentado de un modo estadísticamente significativo (por ejemplo, más de la mitad de la desviación estándar), en un sitio seleccionado.
Una amplia variedad de afecciones que producen pérdida de contenido mineral óseo pueden tratarse con las moléculas descritas en el presente documento. Pacientes con tales afecciones pueden identificarse mediante diagnóstico clínico utilizando técnicas muy conocidas (véase, por ejemplo, Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, Inc.). Ejemplos representativos de enfermedades que pueden tratarse incluyeron displasias, donde hay
15 crecimiento o desarrollo anormal de hueso. Ejemplos representativos de tales afecciones incluyen acondroplasia, disostosis cleidocraneal, encondromatosis, displasia fibrosa, enfermedad de Gaucher, raquitismo hipofosfatémico, síndrome de Marfan, exostosis múltiple hereditaria, neurofibromatosis, osteogénesis imperfecta, osteopetrosis o osteopoiquilosis, lesiones escleróticas, fracturas, enfermedad periodontal, pseudoartrosis y osteomielitis piogénica.
Otras afecciones que pueden tratarse o prevenirse incluyen una amplia variedad de causas de osteopenia (es decir, una afección que produce más de una desviación estándar del contenido o densidad mineral óseo inferior al contenido mineral esquelético pico en la juventud). Ejemplos representativos de tales afecciones incluyen estados anémicos, afecciones producidas por esteroides, afecciones producidas por heparina, trastornos de la médula ósea, hipovitaminosis C, desnutrición, deficiencia de calcio, osteoporosis idiopática, osteopenia u osteoporosis congénita,
25 alcoholismo, enfermedad hepática crónica, senilidad, estado posmenopáusico, oligomenorrea, amenorrea, embarazo, diabetes mellitus, hipertiroidismo, enfermedad de Cushing, acromegalia, hipogonadismo, inmovilización o inactividad, síndrome de distrofia simpática refleja, osteoporosis regional transitoria y osteomalacia.
Ejemplos de animales de sangre caliente que pueden tratarse incluyen tanto vertebrados como mamíferos, que incluyen, por ejemplo, seres humanos, caballos, vacas, cerdos, ovejas, perros, gatos, ratas y ratones.
La determinación del elevado contenido mineral óseo puede determinarse directamente mediante el uso de rayos X (por ejemplo, absorciometría de rayos X de doble energía o “DEXA”) o por inferencia mediante marcadores de renovación ósea (tales como fosfatasa alcalina específica para osteoblastos, osteocalcina, propéptido de
35 procolágeno C' tipo 1 (PICP) y fosfatasa alcalina total; véase Comier, C., Curr. Opin. in Rheu. 7:243, 1995), o por marcadores de resorción ósea (piridinolina, desoxipiridinolina, N-telopéptido, hidroxiprolina urinaria, fosfatasas ácidas resistentes a tartrato en plasma y galactosil hidroxilisina; véase Comier, arriba). La cantidad de masa ósea también puede calcularse a partir de los pesos corporales o por otros procedimientos conocidos en la técnica (véase Guinness-Hey, Metab. Bone Dis. and Relat. Res. 5:177-181, 1984).
Como será evidente para un experto en la materia, la cantidad y frecuencia de administración dependerá, por supuesto, de factores tales como la naturaleza y gravedad de la indicación que está tratándose, la respuesta deseada, la condición del paciente, etc. Normalmente, las composiciones pueden administrarse mediante una variedad de técnicas, como se observa anteriormente.
45 Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
Ejemplos
EJEMPLO 1
MAPAS DE ESCLEROSTEOSIS PARA EL BRAZO LARGO DEL CROMOSOMA 17 HUMANO
El mapeo genético de los responsables del defecto de esclerosteosis en seres humanos localizó el gen responsable
55 de este trastorno en la región del cromosoma 17 humano que codifica un novedoso miembro de la familia de proteína de unión a TGF-beta. En esclerosteosis, el hueso esquelético muestra un aumento sustancial en la densidad mineral con respecto a la de individuos sin afectar. El hueso en la cabeza también muestra sobrecrecimiento. Los pacientes con esclerosteosis están generalmente sanos, aunque pueden presentar grados variables de sindactilia al nacer y grados variables de compresión craneal y compresión nerviosa en el cráneo.
El análisis de enlace del defecto génico asociado a esclerosteosis se realizó aplicando el procedimiento de mapeo de homocigosidad a muestras de ADN recogido de 24 familias africanas sudafricanos en las que se produjo la enfermedad (Sheffield y col., 1994, Human Molecular Genetics 3:1331-1335. “Identification of a Bardet-Biedl syndrome locus on chromosome 3 and evaluation of an efficient approach to homozygosity mapping”). La población 65 africana de Sudáfrica es genéticamente homogénea; la población es descendiente de un pequeño número de fundadores que colonizaron el área hace varios siglos, y se ha aislado por barreras geográficas y sociales desde la
fundación. La esclerosteosis es rara en todas las partes en el mundo fuera de la comunidad africana, que sugiere que una mutación en el gen estaba presente en la población fundadora y desde entonces ha aumentado en número junto con el aumento en la población. El uso de mapeo de homocigosidad se basa en la suposición de que es probable que los marcadores de mapeo de ADN adyacentes a una mutación recesiva sean homocigóticos en
5 individuos afectados de familias consanguíneas y poblaciones aisladas.
Un conjunto de 371 marcadores de microsatélite (Research Genetics, conjunto 6) de los cromosomas autosómicos se seleccionó para tipar conjuntos de ADN de muestras de pacientes con esclerosteosis. Las muestras de ADN para este análisis procedieron de 29 pacientes con esclerosteosis en 24 familias, 59 miembros de la familia sin afectar y un conjunto de individuos de control sin parentesco de la misma población. Los conjuntos consistieron en 4-6 individuos, tanto individuos afectados, individuos afectados de familias consanguíneas, padres y hermanos sin afectar, como controles sin parentesco. En los conjuntos de individuos sin parentesco y en la mayoría de los conjuntos con individuos afectados o miembros de la familia, el análisis de los marcadores mostró varios tamaños de alelo para cada marcador. Un marcador, D17S1299, mostró una indicación de homocigosidad: una banda en varios
15 de los conjuntos de individuos afectados.
Las 24 familias con esclerosteosis se tiparon con un total de 19 marcadores en la región de D17S1299 (en 17q12q21). Se mostró que los individuos afectados de cada familia eran homocigóticos en esta región, y 25 de los 29 individuos eran homocigóticos para un haplotipo de núcleo; cada uno tuvo los mismos alelos entre D17S1787 y D17S930. Los otros cuatro individuos tuvieron un cromosoma que coincidió con este haplotipo y un segundo que no. En resumen, los datos sugirieron convincentemente que esta región de 3 megabases contuvo la mutación de la esclerosteosis. El análisis de secuencias de la mayoría de los exones en esta región de 3 megabases identificó una mutación terminadora en la novedosa secuencia codificante de proteínas de unión a TGF-beta (la mutación C>T en la posición 117 de SEC ID Nº 1 produce un codón de terminación). Se mostró que esta mutación era única para
25 pacientes con esclerosteosis y portadores de descendientes africanos. La identidad del gen se confirmó adicionalmente identificando una mutación en su intrón (la mutación A>T en la posición +3 del intrón) que produce procesamiento de ARNm inapropiado en un único paciente sin parentesco con esclerosteosis diagnosticada.
EJEMPLO 2
ESPECIFICIDAD POR TEJIDO DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE PROTEÍNA DE UNIÓN A TGF-BETA
A. Expresión del gen Beer humano por RT-PCR:
35 Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de las siguientes muestras de ARN total usando un kit comercialmente disponible (“Superscript Preamplification System for First-Strand cDNA Synthesis”, Life Technologies, Rockville, MD): cerebro humano, hígado humano, bazo humano, timo humano, placenta humana, músculo esquelético humano, tiroides humana, pituitaria humana, osteoblasto humano (NHOst de Clonetics Corp., San Diego, CA), línea celular de osteosarcoma humano (Saos-2, ATCC nº HTB-85), hueso humano, médula ósea humana, cartílago humano, hueso de mono vervet, Saccharomyces cerevisiae y monocitos de sangre periférica humana. Todas las muestras de ARN se compraron de una fuente comercial (Clontech, Palo Alto, CA), excepto los siguientes que se prepararon internamente: osteoblasto humano, línea celular de osteosarcoma humano, hueso humano, cartílago humano y hueso de mono vervet. Estas muestras de ARN internas se prepararon usando un kit comercialmente disponible (“TRI Reagent”, Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH).
45 Se realizó PCR en estas muestras, y adicionalmente en una muestra genómica humana como control. El cebador de oligonucleótidos de Beer de sentido directo tuvo la secuencia 5'-CCGGAGCTGGAGAACAACAAG-3' (SEC ID Nº: 19). El cebador de oligonucleótidos de Beer de sentido inverso tuvo la secuencia 5'-GCACTGGCCGGAGCACACC-3' (SEC ID Nº: 20). Además, la PCR se realizó usando cebadores para el gen beta-actina humano, como control. El cebador de oligonucleótidos de beta-actina de sentido directo tuvo la secuencia 5'-AGGCCAACCGCGAGAAGATGACC-3' (SEC ID Nº: 21). El cebador de oligonucleótidos de beta-actina de sentido inverso tuvo la secuencia 5'-GAAGTCCAGGGCGACGTAGCA-3' (SEC ID Nº: 22). La PCR se realizó usando condiciones convencionales en reacciones de 25 ul, con una temperatura de hibridación de 61 grados Celsius. Se realizaron treinta y dos ciclos de PCR con los cebadores de Beer y se realizaron veinticuatro ciclos con los
55 cebadores de beta-actina.
Tras la amplificación, 12 ul de cada reacción se analizaron por electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio. Véase la Figura 2A.
B. Hibridación in situ de ARN de secciones de embrión de ratón:
El ADNc de Beer de ratón de longitud completa (SEC ID Nº 11) se clonó en el vector pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) en la dirección no codificante y codificante usando el protocolo del fabricante. Se sintetizaron transcritos codificantes y no codificantes de ARNc marcado con 35S-alfa-GTP usando reactivos de transcripción in vitro
65 suministrados por Ambion, Inc (Austin, TX). La hibridación in situ se realizó según los protocolos de Lyons y col. (J. Cell Biol. 111:2427-2436, 1990).
La sonda de ARNc de Beer de ratón detectó un mensajero específico expresado en el tubo neural, yemas de extremidades, vasos sanguíneos y cartílagos osificantes de embriones de ratón en desarrollo. El panel A en la Figura 3 muestra la expresión en la cresta ectodérmica apical (aer) de la yema (1) de extremidades, vasos sanguíneos (bv) y el tubo neural (nt). El panel B muestra la expresión en el 4º ventrículo del cerebro (4). El panel C
5 muestra la expresión en las vertebras cervicales (cv) de mandíbula (ma), hueso occipital (oc), paladar (pa) y un vaso sanguíneo (bv). El panel D muestra la expresión en las costillas (r) y una válvula del corazón (va). El panel A es una sección transversal de embrión de 10,5 dpc. El panel B es una sección sagital de embrión de 12,5 dpc y los paneles C y D son secciones sagitales de embriones de 15,5 dpc.
ba= arco branquial, h= corazón, te= telencéfalo (prosencéfalo), b= cerebro, f= masa frontonasal, g= intestino, h= corazón, j= mandíbula, li= hígado, lu= pulmón, ot= vesícula ótica, ao=, sc= médula espinal, skm= músculo esquelético, ns= seno nasal, th= timo, to= lengua, fl= extremidad anterior, di= diafragma
EJEMPLO 3
15 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNA BEER RECOMBINANTE
A. Expresión en células COS-1:
La secuencia de ADN que codifica la proteína Beer humana de longitud completa se amplificó usando los siguientes cebadores con oligonucleótidos de PCR: El cebador de oligonucleótidos de 5' tuvo la secuencia 5'-AAGCTTGGTACCATGCAGCTCCCAC-3' (SEC ID Nº: 23) y contuvo un sitio de enzima de restricción HindIII (en negrita) seguido de 19 nucleótidos del gen Beer empezando 6 pares de bases antes del supuesto codón de iniciación del extremo amino (ATG). El cebador de oligonucleótidos de 3' tuvo la secuencia 5'25 AAGCTTCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTAGGCGTTCTCCAGCT-3' (SEC ID Nº: 24) y contuvo un sitio de enzima de restricción HindIII (en negrita) seguido de un codón de terminación del complemento inverso (CTA), seguido del complemento inverso del epítope FLAG (subrayado, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) flanqueado por el complemento inverso de nucleótidos que codifica los 5 aminoácidos del extremo carboxi de Beer. El producto de PCR se clonó por TA (“Original TA Cloning Kit”, Invitrogen, Carlsbad, CA) y los clones individuales se cribaron por secuenciación de ADN. Un clon de secuencia verificada se digirió entonces por HindIII y se purificó sobre 1,5% de gel de agarosa usando reactivos comercialmente disponibles (“QIAquick Gel Extraction Kit”, Qiagen Inc., Valencia, CA). Este fragmento se ligó entonces al plásmido pcDNA3.1 tratado con fosfatasa digerido con HindIII (Invitrogen, Carlsbad, CA) con T4 ADN ligasa. Se transformaron DH10B de E. coli y se sembraron en LB, 100 μg/ml de placas de ampicilina. Las colonias que llevan el recombinante deseado en la orientación apropiada se identificaron por un
35 cribado basado en PCR usando un cebador de 5' correspondiente al promotor/sitio de cebado de T7 en pcDNA3.1 y un cebador de 3' con la secuencia 5'-GCACTGGCCGGAGCACACC-3' (SEC ID Nº: 25) que se corresponde con el complemento inverso de la secuencia de BEER inversa. La secuencia del fragmento clonado se confirmó por secuenciación de ADN.
Se usaron células COS-1 (ATCC nº CRL-1650) para la transfección. 50 μg del plásmido de expresión pADNc-Beer-Flag se transfectaron usando un kit comercialmente disponible siguiendo los protocolos suministrados por el fabricante (“DEAE-Dextran Transfection Kit”, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). El medio final tras la transfección fue DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) que contenía 0,1% de suero bovino fetal. Después de 4 días en cultivo, el medio se eliminó. La expresión de BEER recombinante se analizó por SDS-PAGE y transferencia Western
45 usando anticuerpo monoclonal anti-FLAG® M2 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO). La purificación de la proteína BEER recombinante se realizó usando una columna de afinidad anti-FLAG M2 (“Mammalian Transient Expression System”, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO). El perfil de la columna se analizó por SDS-PAGE y transferencia Western usando anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2.
B. Expresión en células de insecto SF9:
La secuencia del gen Beer humano se amplificó usando PCR con condiciones convencionales y los siguientes cebadores:
55 Cebador de sentido directo: 5'-GTCGTCGGATCCATGGGGTGGCAGGCGTTCAAGAATGAT-3' (SEC ID Nº: 26) Cebador de sentido contrario: 5'-GTCGTCAAGCTTCTACTTGTCATCGTCCTTGTAGTCGTAGGCGTTCTCCAGCTCGGC-3' (SEC ID Nº: 27)
El ADNc resultante contuvo la región codificante de Beer con dos modificaciones. La señal de secreción del extremo N se eliminó y una marca de epítope FLAG (Sigma) se fusionó en marco con el extremo C del inserto. Se añadieron los sitios de clonación BamHI y HindIII y el gen se subclonó en vector pMelBac (Invitrogen) para la transferencia a un vector de expresión baculoviral usando procedimientos convencionales.
Se prepararon baculovirus recombinantes que expresan proteína Beer usando el kit de transfección Bac-N-Blue 65 (Invitrogen) y se purificaron según las instrucciones del fabricante.
Células SF9 (Invitrogen) se mantuvieron en medio TNM_FH (Invitrogen) que contenía 10% de suero bovino fetal. Para la expresión de proteínas, cultivos de SF9 en matraces con agitación centrífuga se infectaron a una MOI superior a 10. Diariamente se tomaron muestras del medio y células durante cinco días, y la expresión de Beer se monitorizó por transferencia Western usando un anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 (Sigma) o un antisuero
5 policlonal de conejo anti-Beer.
Después de cinco días, las células SF9 infectadas con baculovirus se recogieron por centrifugación y la proteína asociada a células se extrajo del sedimento de células usando un tampón de extracción de alto contenido de sales (NaCl 1,5 M, Tris 50 mM a pH 7,5). El extracto (20 ml por 300 ml de cultivo) se clarificó por centrifugación, se dializó tres veces contra cuatro litros de solución salina tamponada con Tris (NaCl 150 mM, Tris 50 mM a pH 7,5) y se clarificó de nuevo por centrifugación. Esta fracción de alto contenido de sales se aplicó a heparina Hitrap (Pharmacia; volumen de lecho de 5 ml), se lavó ampliamente con solución salina tamponada con HEPES (HEPES 25 mM a 7,5, NaCl 150 mM) y las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente de NaCl 150 mM a NaCl 1200 mM. La elución de Beer se observó a aproximadamente NaCl 800 mM. Las fracciones que contenían Beer se
15 complementaron con 10% de glicerol y DTT 1 mM y se congelaron a -80 ºC.
EJEMPLO 4
PREPARACIÓN Y PRUEBA DE ANTICUERPOS POLICLONALES PARA BEER, GREMLIN Y DAN
A. Preparación de antígeno:
Las secuencias de ADN de Beer humana, Gremlin humana y Dan humana se amplificaron usando procedimientos de PCR convencionales con los siguiente cebadores de oligonucleótidos:
25 Beer h. Sentido: 5' -GACTTGGATCCCAGGGGTGGCAGGCGTIC-3' (SEC ID Nº: 28) Antisentido: 5' -AGCATAAGCTICTAGTAGGCGTTCTCCAG-3' (SEC ID Nº: 29) Gremlin h. Sentido: 5' -GACTTGGATCCGAAGGGAAAAAGAAAGGG-3' (SEC ID Nº: 30) Antisentido: 5' -AGCATAAGCTTTTAATCCAAATCGATGGA-3' (SEC ID Nº: 31) Dan h. Sentido: 5' -ACTACGAGCTCGGCCCCACCACCCATCAACAAG-3' (SEC ID Nº: 32) Antisentido: 5' -ACTTAGAAGCTTTCAGTCCTCAGCCCCCTCTTCC-3' (SEC ID Nº: 33)
35 En cada caso, los cebadores enumerados amplificaron la región codificante entera menos la secuencia señal de la secreción. Éstos incluyen sitios de restricción para subclonar en el vector de expresión bacteriano pQE-30 (Qiagen Inc., Valencia, CA) en sitios BamHI/HindIII para Beer y Gremlin, y sitios SacI/HindIII para Dan. pQE30 contiene una secuencia codificante para una marca de 6x His en el extremo 5' de la región de clonación. Las construcciones completadas se transformaron en la cepa de E. coli M-15/pRep (Qiagen Inc) y los clones individuales se verificaron por secuenciación. La expresión de proteínas en M-15/pRep y purificación (marca de afinidad 6xHis que se une a Ni-NTA acoplada a Sepharose) se realizaron como se describe por el fabricante (Qiagen, The QIAexpresionist).
La proteína Beer derivada de E. coli se recuperó en cantidad significativa usando solubilización en guanidina 6 M y
45 se dializó a 2-4 M para prevenir la precipitación durante el almacenamiento. La proteína Gremlin y Dan se recuperaron en mayor cantidad con solubilización en guanidina 6 M y una concentración de guanidina pospurificación de 0,5 M.
B. Producción y prueba de anticuerpos policlonales:
Se produjeron anticuerpos policlonales para cada uno de los tres antígenos en huéspedes de conejo y de pollo usando protocolos convencionales (R & R Antibody, Stanwood, WA; protocolo convencional para la inmunización de conejo y recuperación de antisueros; Short Protocols in Molecular Biology. 2ª edición. 1992. 11.37-11.41. Contributors Helen M. Cooper y Yvonne Paterson; se generaron antisueros de pollo con Strategic Biosolutions,
55 Ramona, CA).
Los antisueros de conejo y la fracción de IgY de óvulo de pollo se cribaron para actividad mediante transferencia Western. Cada uno de los tres antígenos se separó por PAGE y se transfirió a nitrocelulosa de 0,45 um (Novex, San Diego, CA). La membrana se cortó en tiras, conteniendo cada tira aproximadamente 75 ng de antígeno. Las tiras se bloquearon en 3% de Blotting Grade Block (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y se lavaron 3 veces en 1X solución salina tamponada con Tris (TBS)/0,02% de tampón TWEEN. El anticuerpo primario (sangrados de preinmunización, antisueros de conejo o IgY de óvulo de pollo en diluciones que oscilan de 1:100 a 1:10.000 en tampón de bloqueo) se incubó con las tiras durante una hora con agitación por balanceo suave. Una segunda serie de tres lavados 1X TBS/0,02% de TWEEN fue seguida de incubación de una hora con el anticuerpo secundario
65 (anti-conejo de burro conjugado con peroxidasa, Amersham Life Science, Piscataway, NJ; o anti-pollo de burro conjugado con peroxidasa, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Se realizó un ciclo final de 3X lavados de 1X TBS/0,02% de TWEEN y las tiras se revelaron con sustrato de transferencia Western Lumi-Light (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania).
C. Prueba de reactividad cruzada de anticuerpos:
5 Tras el protocolo descrito en la sección previa, tiras de nitrocelulosa de Beer, Gremlin o Dan se incubaron con diluciones (1:5000 y 1:10.000) de sus antisueros de conejo respectivos o IgY de óvulo de pollo, además de con antisueros o IgY de óvulo de pollo (diluciones 1:1000 y 1:5000) preparadas para los dos antígenos restantes. Los elevados niveles de anticuerpos no coincidentes se realizaron para detectar la unión de baja afinidad por aquellos anticuerpos que pueden observarse solo a elevada concentración. El protocolo y duración del revelado es el mismo que para los tres eventos de unión usando el protocolo descrito anteriormente. No se observó reactividad cruzada de antígeno para ninguno de los antígenos probados.
EJEMPLO 5
15 INTERACCIÓN DE BEER CON PROTEÍNAS DE LA SUPERFAMILIA DE TGF-BETA
La interacción de Beer con proteínas de diferentes brazos filogenéticos de la superfamilia de TGF-! se estudió usando procedimientos de inmunoprecipitación. Se obtuvieron TGF!-1, TGF!-2, TGF!-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 y GDNF purificados de fuentes comerciales (R&D Systems; Mineápolis, MN). Un protocolo representativo es del siguiente modo. Beer parcialmente purificada se dializó en solución salina tamponada con HEPES (HEPES 25 mM 7,5, NaCl 150 mM). Las inmunoprecipitaciones se hicieron en 300 ul de tampón IP (NaCl 150 mM, Tris 25 mM a pH 7,5, EDTA 1 mM, !-mercaptoetanol 1,4 mM, 0,5% de Triton X 100 y 10% de glicerol). Se aplicaron 30 ng de proteína BMP-5 humana recombinante (R&D Systems) a 15 ul de matriz de afinidad por FLAG (Sigma; St Louis MO) en presencia y ausencia de 500 ng de Beer marcada con el epítope FLAG. Las proteínas se incubaron durante 4 horas
25 a 4 ºC y luego las proteínas asociadas a la matriz de afinidad se lavaron 5 veces en tampón IP (1 ml por lavado). Las proteínas unidas se eluyeron de la matriz de afinidad en 60 microlitros de 1X tampón de muestra de SDS-PAGE. Las proteínas se resolvieron por SDS-PAGE y BMP-5 asociada a Beer se detectó por transferencia Western usando antisuero anti-BMP-5 (Research Diagnostics, Inc) (véase la Figura 5).
Ensayo de unión a ligando de BEER:
Se añade proteína FLAG-Beer (20 ng) a 100 ul de PBS/0,2% de BSA y se adsorbe en cada pocillo de la placa de microtitulación de 96 pocillos previamente recubierta con anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma; St Louis MO) y se bloquea con 10% de BSA en PBS. Esto se realiza a temperatura ambiente durante 60 minutos. Esta disolución de
35 proteína se elimina y los pocillos se lavan para eliminar la proteína sin unir. Se añade BMP-5 a cada pocillo en concentraciones que oscilan de 10 pM a 500 nM en PBS/0,2% de BSA y se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. La disolución de unión se elimina y la placa se lava tres veces con volúmenes de 200 ul de PBS/0,2% de BSA. Entonces, los niveles de BMP-5 se detectan usando antisuero para BMP-5 mediante ELISA (F.M. Ausubel y col. (1998) Current Protocols in Mol Biol. Vol 2 11.2.1-11.2.22). La unión específica se calcula restando la unión no específica de la unión total y se analiza por el programa LIGAND (Munson y Podbard, Anal. Biochem., 107, pág. 220-239, (1980).
En una variación de este procedimiento, Beer se manipula y se expresa como una proteína de fusión de Fc humana. Asimismo, el ligando BMP se manipula y se expresa como fusión de Fc de ratón. Estas proteínas se incuban juntas
45 y el ensayo se realiza como se describe por Mellor y col. usando detección por fluorescencia resuelta en el tiempo homogénea (G.W. Mellor y col., J of Biomol Screening, 3(2) 91-99,1998).
EJEMPLO 6
ENSAYO DE CRIBADO PARA LA INHIBICIÓN DE LA UNIÓN DE PROTEÍNA DE UNIÓN A TGF-BETA A MIEMBROS DE LA FAMILIA DE TGF-BETA
El ensayo descrito anteriormente se repite con dos excepciones. Primera, la concentración de BMP se mantiene fija a la Kd previamente determinada. Segunda, un conjunto de candidatos a antagonista se añade a una concentración 55 fija (20 uM en el caso de los conjuntos de moléculas orgánicas pequeñas y 1 uM en estudios de anticuerpo). Estas moléculas candidatas (antagonistas) de unión a proteína de unión a TGF-beta incluyen compuestos orgánicos derivados de conjuntos comerciales o internos que representan diversas estructuras químicas. Estos compuestos se preparan como disoluciones madre en DMSO y se añaden a los pocillos de ensayo a ≤ 1% del volumen final bajo lascondiciones de ensayo convencionales. Éstos se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente con BMP y Beer, la disolución se elimina y la BMP unida se cuantifica como se ha descrito. Agentes que inhiben el 40% de la unión deBMP observada en ausencia del compuesto o anticuerpo se consideran antagonistas de esta interacción. Éstos se evalúan adicionalmente como posibles inhibidores basándose en estudios de valoración para determinar sus constantes de inhibición y su influencia sobre la afinidad de unión de proteínas de unión a TGF-beta. También pueden realizarse ensayos de control de especificidad comparable para establecer el perfil de selectividad para el
65 antagonista identificado mediante estudios usando ensayos dependientes de la acción del ligando BMP (por ejemplo, estudio de competencia de BMP/receptor de BMP).
EJEMPLO 7
INHIBICIÓN DE LA LOCALIZACIÓN DE LA PROTEÍNA QUE SE UNE A TGF-BETA EN MATRIZ ÓSEA
5 La evaluación de la inhibición de la localización en matriz ósea (hidroxiapatita) se realiza usando modificaciones al procedimiento de Nicolas (Nicolas, V. Calcif Tissue Int 57:206, 1995). Brevemente, se prepara proteína de unión a TGF-beta marcada con 125I como se describe por Nicolas (arriba). Se añade hidroxiapatita a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos equipada con una membrana de filtración de polipropileno (Polyfiltroninc, Weymouth MA). La proteína de unión a TGF-beta se añade a 0,2% de albúmina en tampón PBS. Los pocillos que contienen matriz se lavan 3 veces con este tampón. La proteína de unión a TGF-beta adsorbida se eluye usando NaOH 0,3 M y se cuantifica.
La identificación de inhibidores se realiza mediante incubación de proteína de unión a TGF-beta con moléculas de prueba y aplicando la mezcla a la matriz como se ha descrito anteriormente. La matriz se lava 3 veces con 0,2% de
15 albúmina en tampón PBS. La proteína de unión a TGF-beta adsorbida se eluye usando NaOH 0,3 M y se cuantifica. Agentes que inhiben el 40% de la unión de proteína de unión a TGF-beta observada en ausencia de compuesto o anticuerpo se consideran inhibidores de la localización ósea. Estos inhibidores se caracterizan adicionalmente por estudios de respuesta a dosis para determinar sus constantes de inhibición y su influencia sobre la afinidad de unión a proteína de unión a TGF-beta.
EJEMPLO 8
CONSTRUCCIÓN DE MUTANTE DE PROTEÍNA DE UNIÓN A TGF-BETA
25 A. Mutagénesis:
Un ADNc de proteína de unión a TGF-beta de longitud completa en pBluescript SK sirve de molde para mutagénesis. Brevemente, cebadores apropiados (véase la discusión proporcionada anteriormente) se utilizan para generar el fragmento de ADN por reacción en cadena de la polimerasa usando ADN polimerasa Vent (New England Biolabs, Beverly, MA). La reacción en cadena de la polimerasa se ejecuta durante 23 ciclos en tampones proporcionados por el fabricante usando una temperatura de hibridación de 57 ºC. El producto se expone entonces a dos enzimas de restricción y, después del aislamiento usando electroforesis en gel de agarosa, se liga de nuevo a pRBP4-503 del que se había eliminado la secuencia de apareamiento por digestión enzimática. La integridad del mutante se verifica por secuenciación de ADN.
B. Expresión y aislamiento de células de mamífero de proteína de unión a TGF-beta mutante:
Los ADNc de proteína de unión a TGF-beta mutante se transfieren al vector de expresión de mamífero pcDNA3.1 descrito en el Ejemplo 3. Después de verificar la secuencia, las construcciones resultantes se transfectan en células COS-1, y la proteína secretada se purifica como se describe en el EJEMPLO 3.
EJEMPLO 9
MODELOS ANIMALES -I
45 GENERACIÓN DE RATONES TRANSGÉNICOS QUE EXPRESAN EN EXCESO EL GEN BEER
El clon de BAC de ∼200 kilobases (kb) 15G5, aislado de la biblioteca de ADN genómico de ratón CITB (distribuida por Research Genetics, Huntsville, AL), se usó para determinar la secuencia completa del gen Beer de ratón y sus regiones flanqueantes de 5' y 3'. Un fragmento SalI de 41 kb, que contiene el cuerpo del gen entero, más ∼17 kb de secuencia flanqueante de 5' y ∼20 kb de secuencia flanqueante de 3', se subclonó en el sitio BamHI del vector de cósmido SuperCosI (Stratagene, La Jolla, CA) y se propagó en la cepa de E. coli DH10B. Entonces, a partir de esta construcción de cósmido, un fragmento de restricción MluI -AviII de 35 kb (SEC Nº 6), que incluye el gen Beer de ratón entero, además de 17 kb y 14 kb de secuencia flanqueante de 5' y 3', respectivamente, se purificó en gel 55 usando medios convencionales y se usó para microinyección de cigotos de ratón (DNX Transgenics; patente de EE.UU. nº 4.873.191). Se obtuvieron animales fundadores en los que el fragmento de ADN clonado se integró al azar en el genoma a una frecuencia del 5-30% de crías nacidas viva. La presencia del transgén se determinó realizando análisis de transferencia Southern de ADN genómico extraído de una pequeña cantidad de tejido de ratón, tal como la punta de la cola. El ADN se extrajo usando el siguiente protocolo: se digirió tejido durante la noche a 55 ºC en un tampón de lisis que contenía NaCl 200 mM, Tris 100 mM a pH 8,5, EDTA 5 mM, 0,2% de SDS y 0,5 mg/ml de proteinasa K. Al día siguiente, el ADN se extrajo una vez con fenol/cloroformo (50:50), una vez con cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) y se precipitó con etanol. Tras la resuspensión en TE (Tris 10 mM a pH 7,5, EDTA 1 mM), 8-10 ug de cada muestra de ADN se digirieron con una endonucleasa de restricción, tal como EcoRI, se sometieron a electroforesis en gel y se transfirieron a una membrana de nailon cargada tal como HyBondN+ 65 (Amersham, Arlington Heights, IL). Entonces, el filtro resultante se hibridó con un fragmento de ADN radiactivamente marcado que se deriva del sitio del gen Beer de ratón, y puede reconocer tanto un fragmento del sitio del gen
endógeno como un fragmento de un tamaño diferente que se deriva del transgén. Los animales fundadores se reprodujeron dando ratones no transgénicos normales para generar números suficientes de progenie transgénica y no transgénica en la que determinar los efectos de la expresión en exceso del gen Beer. Para estos estudios, animales a diversas edades (por ejemplo, 1 día, 3 semanas, 6 semanas, 4 meses) se someten a varios ensayos
5 diferentes diseñados para determinar formación esquelética macroscópica, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, actividad de osteoclastos y osteoblastos, grado de osificación endocondral, formación de cartílago, etc. La actividad transcripcional del transgén puede determinarse extrayendo ARN de diversos tejidos, y usando un ensayo de RT-PCR que se aprovecha de polimorfismos de un solo nucleótido entre la cepa de ratón de la que se deriva el transgén (129Sv/J) y la cepa de ratones usada para la microinyección de ADN [(C57BL5/J x SJL/J)F2].
MODELOS ANIMALES -II
ALTERACIÓN DEL GEN BEER DE RATÓN POR RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA
15 Pueden usarse recombinación homóloga en células madre embrionarias (ES) para inactivar el gen Beer de ratón endógeno y posteriormente generar animales que llevan la mutación de pérdida de función. Un gen indicador, tal como el gen !-galactosidasa de E. coli, se manipuló en el vector que elige diana de manera que su expresión estuviera controlada por el promotor del gen Beer endógeno y señal de iniciación de la traducción. De esta forma, los patrones especiales y temporales de la expresión del gen Beer pueden determinarse en animales que llevan un alelo elegido como diana.
El vector que elige diana se construyó clonando primero el promotor de fosfoglicerato cinasa (PGK) de selección de fármaco accionado por el casete del gen de resistencia a neomicina (neo) de pGT-N29 (New England Biolabs, Beverly, MA) en el vector de clonación pSP72 (Promega, Madson, WI). Se usó PCR para flanquear el casete de
25 PGKneo con sitios P1 loxP de bacteriófago, que son sitios de reconocimiento para la Cre recombinasa de P1 (Hoess y col., PNAS USA, 79:3398, 1982). Esto permite la posterior eliminación del marcador de resistencia a neo en células ES elegidas como diana o animales derivados de células ES (patente de EE.UU. 4.959.317). Los cebadores de PCR comprendieron la secuencia de loxP de 34 nucleótidos (ntd), 15-25 ntd complementarios a los extremos 5' y 3' del casete de PGKneo, además de sitios de reconocimiento de enzima de restricción (BamHI en el cebador de sentido directo y EcoRI en el cebador de sentido contrario) para clonar en pSP72. La secuencia del cebador de sentido directo fue 5'-AATCTGGATCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTGCAG GATTCGAGGGCCCCT-3' (SEC ID Nº: 34); la secuencia del cebador de sentido contrario fue 5'-AATCTGAATTCCACCGGTGTTAATTAAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATAGATCTAGAGTCAGC TTCTGA-3' (SEC ID Nº: 35).
35 La siguiente etapa fue clonar un fragmento XhoI-HindIII de 3,6 kb, que contiene el gen !-galactosidasa de E. coli y la señal de poliadenilación SV40 de pSV! (Clontech, Palo Alto, CA), en el plásmido pSP72-PGKneo. El “brazo corto” de homología del sitio del gen Beer de ratón se generó amplificando un fragmento de 2,4 kb del clon de BAC 15G5. El extremo 3' del fragmento coincidió con el sitio de iniciación de la traducción del gen Beer, y el cebador de sentido contrario usado en la PCR también incluyó 30 ntd complementarios al extremo 5' del gen !-galactosidasa de manera que su región codificante pudiera fusionarse en marco con el sitio de iniciación de Beer. El enfoque tomado para introducir el “brazo corto” en el plásmido pSP72-!gal-PGKneo fue linealizar el plásmido en un sitio en la dirección 5' del gen !-gal y luego co-transformar este fragmento con el producto de PCR de “brazo corto” y seleccionar plásmidos en los que el producto de PCR se integró por recombinación homóloga. El cebador de sentido directo
45 para la amplificación del “brazo corto” incluyó 30 ntd complementarios al vector pSP72 para permitir este evento de recombinación. La secuencia del cebador de sentido directo fue 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGAGCAGCTGAAGCTTAAC CACATGGTGGCTCACAACCAT-3' (SEC ID Nº: 36) y la secuencia del cebador de sentido contrario fue 5'-AACGACGGCCAGTGAATCCGTAATCATGGTCATGCTGCCAGGTGGAG GAGGGCA-3' (SEC ID Nº: 37).
El “brazo largo” del sitio del gen Beer se generó amplificando un fragmento de 6,1 kb del clon de BAC 15G5 con cebadores que también introducen los sitios de enzimas de restricción de corte raro SgrAI, FseI, AscI y PacI. Específicamente, la secuencia del cebador de sentido directo fue 5'-ATTACCACCGGTGACACCCGCTTCCTGACAG-3' (SEC ID Nº: 38); la secuencia del cebador de sentido contrario
55 fue 5'-ATTACTTAATTAAACATGGCGCGCCATATGGCCGGCCCCTAATTGCGGCGCATCGTTAATT-3' (SEC ID Nº: 39). El producto de PCR resultante se clonó en el vector TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) como etapa intermedia.
La construcción que elige como diana el gen Beer de ratón también incluyó un segundo marcador de selección, el gen timidina cinasa del virus I del herpes simple (HSVTK) bajo el control del elemento de repetición del extremo largo del virus del sarcoma de Rous (RSV LTR). La expresión de este gen hace que las células de mamífero sean sensibles (e inviables) a ganciclovir; es, por tanto, una forma conveniente para seleccionar contra células resistentes a neomicina en las que la construcción se ha integrado por un evento no homólogo (patente de EE.UU. 5.464.764). El casete de RSVLTR-HSVTK se amplificó a partir de pPS1337 usando cebadores que permiten la posterior clonación en los sitios FseI y AscI del plásmido del vector TA de “brazo largo”. Para esta PCR, la secuencia del
65 cebador de sentido directo fue 5'-ATTACGGCCGGCCGCAAAGGAATTCAAGATCTGA-3' (SEC ID Nº: 40); la secuencia del cebador de sentido contrario fue 5'-ATTACGGCGCGCCCCTCACAGGCCGCACCCAGCT-3' (SEC ID Nº: 41).
La etapa final en la construcción del vector que elige diana implicó la clonación del fragmento SgrAI-AscI de 8,8 kb
5 que contiene el “brazo largo” y el gen RSVLTR-HSVTK en los sitios SgrAI y AscI del plásmido pSP72-“brazo corto”!gal-PGKneo. Este vector que elige diana se linealizó por digestión con tanto AscI como PacI antes de la electroporación en células ES.
EJEMPLO 10
INACTIVACIÓN DE BEER MEDIADA POR ANTISENTIDO
Se preparan oligonucleótidos antisentido de 17 nucleótidos en un formato de solapamiento, de tal forma que el extremo 5' del primer oligonucleótido se solape con AUG que inicia la traducción del transcrito de Beer y los 15 extremos 5' de oligonucleótidos sucesivos se produzcan en incrementos de 5 nucleótidos que se mueven en la dirección 5' (hasta 50 nucleótidos alejados), con respecto a AUG de Beer. Se diseñan y preparan oligonucleótidos de control correspondientes usando composición de bases equivalente, pero se redistribuyen en la secuencia para inhibir cualquier hibridación significativa con el ARNm codificante. La administración de reactivos al sistema celular de prueba se realiza mediante administración de lípidos catiónicos (P.L. Felgner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987). 2 ug de oligonucleótido antisentido se añaden a 100 ul de medio de suero reducido (medio de suero reducido Opti-MEM I; Life Technologies, Gaithersburg MD) y éste se mezcla con reactivo Lipofectin (6 ul) (Life Technologies, Gaithersburg MD) en los 100 ul de medio de suero reducido. Éstos se mezclan, se deja que se complejen durante 30 minutos a temperatura ambiente y la mezcla se añade a las células MC3T3E21 o KS483 previamente sembradas. Estas células se cultivan y se recupera el ARNm. El ARNm de Beer se monitoriza usando 25 RT-PCR conjuntamente con cebadores específicos para Beer. Además, se recogen pocillos experimentales separados y los niveles de proteína se caracterizan por procedimientos de transferencia Western descritos en el Ejemplo 4. Las células se recogen, se resuspenden en tampón de lisis (Tris 50 mM a pH 7,5, NaCl 20 mM, EDTA 1 mM, 1% de SDS) y se recoge la proteína soluble. Este material se aplica al 10-20% de gradiente en SDS-PAGE desnaturalizante. Las proteínas separadas se transfieren a nitrocelulosa y la transferencia Western se realizó como antes usando los reactivos de anticuerpo descritos. En paralelo, los oligonucleótidos de control se añaden a cultivos idénticos y se repiten las operaciones experimentales. La disminución en los niveles de ARNm de Beer o proteína se consideran significativos si el tratamiento con el oligonucleótido antisentido produce un cambio del 50% en cualquier caso en comparación con el oligonucleótido de control negativo de control. Esta metodología permite la inactivación de genes selectiva y posterior caracterización de fenotipos de los nódulos mineralizados en el modelo de cultivo de
35 tejido.
EJEMPLO 11
MODELADO DE LA REGIÓN CORE DE ESCLEROSTINA
Las técnicas de reconocimiento de homología (por ejemplo, PSI-BLAST (Altschul y col., Nucleic Acids Res. 25:3389402 (19997)); FUGUE (Shi y col., J. Mol. Biol. 310:243-57 (2001)) sugirieron que la región Core de SOST (SOST_Core) adopta un pliegue de nudo de cisteína. FUGUE es un procedimiento sensible para detectar homología entre secuencias y estructuras. La gonadotropina coriónica humana ! (hCG-!), para la que se conoce una estructura
45 3D experimentalmente determinada, se identificó por FUGUE (Shi y col., arriba) en el homólogo más relacionado de SOST_Core. Por tanto, hCG-! se usó como molde estructural para construir modelos 3D para SOST_Core.
Un alineamiento de SOST_Core y sus homólogos relacionados se muestra en la Figura 7. Entre los homólogos mostrados en el alineamiento, solo hCG-! (CGHB) tuvo estructura 3D conocida. La identidad de secuencias entre SOST_Core y hCG-! fue aproximadamente del 25%. Ocho residuos de CYS se conservaron en toda la familia, enfatizando la similitud estructural global entre SOST_Core y hCG-!. Tres pares de cisteínas (1-5, 3-7, 4-8) formaron enlaces disulfuro (mostrados con líneas continuas en la Figura 7) en una configuración de “nudo”, que fue característica del pliegue del nudo de cisteína. Un enlace disulfuro adicional (2-6), mostrado como una línea discontinua en la Figura 7, fue único para esta familia y distinguió la familia de proteínas de otras familias de nudos
55 de cisteína (por ejemplo, TGF-!, BMP).
SOST_Core se modeló usando la entrada de PDB (Berman y col., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 58(Pt 6 Pt1):899-907 (2002)) 1HCN, la estructura 3D de hCG-! (Wu y col., Structure 2:545-58 (1994)), como molde estructural. Los modelos se calcularon con MODELER (Sali & Blundell, J. Mol. Biol. 234:779-815 (1993)). Una imagen del mejor modelo se muestra en la Figura 8.
La mayoría de las proteínas del nudo de cisteína forman dímeros debido a la falta de núcleo hidrófobo en un monómero (Scheufler y col., arriba; Schlunegger y Grutter, J. Mol. Biol. 231:445-58 (1993)); Wu y col., arriba). SOST probablemente sigue la misma regla y forma un homodímero para aumentar su estabilidad. La construcción de un 65 modelo para la región SOST_Core dimerizada presentó varios retos debido a que (1) la similitud de secuencias entre
SOST_Core y hCG-! era baja (25%); (2) en lugar de un homodímero, hCG-! formó un heterodímero con hCG-#; y
(3) se han observado varias conformaciones relativas diferentes de monómeros en proteínas de nudo de cisteína dimerizadas de diferentes familias (por ejemplo, PDGF, TGF-!, neurotrofina, IL-17F, gonadotropina), que sugirieron que la conformación del dímero de SOST podría desviarse significativamente de la conformación del heterodímero
5 de hCG-#/!. En la construcción del modelo, hCG-# se sustituyó con hCG-! de la estructura del heterodímero (1HCN) usando técnicas de superposición de estructuras combinadas con ajuste manual, y luego se construyó un modelo de homodímero SOST_Core según la pseudoestructura de homodímero hCG-!. El modelo final se muestra en la Figura 9.
10 EJEMPLO 12
MODELADO DE LA INTERACCIÓN SOST-BMP
Este ejemplo describe el modelado de proteínas de sitios de unión a receptor de tipo I y tipo II sobre BMP que 15 participan en la interacción entre BMP y SOST.
Los estudios de competencia demostraron que SOST compitió con tanto receptores de tipo I como de tipo II para unirse a BMP. En un ensayo de competencia basado en ELISA, BMP-6 interaccionó selectivamente con la superficie recubierta de esclerostina (300 ng/pocillo) con alta afinidad (KD = 3,4 nM). Cantidades crecientes de receptor IA de 20 BMP (construcción de fusión de FC) compitieron con esclerostina para unirse a BMP-6 (11 nM) (CI50 = 114 nM). Un exceso molar de 10 veces del receptor de BMP fue suficiente para reducir la unión de esclerostina a BMP-6 aproximadamente el 50%. Esta competencia también se observó con una proteína de fusión de receptor II de BMP -Fc (CI50 = 36 nM) y DAN (CI50 = 43 nM). La especificidad del ensayo se mostró por falta de competencia para unirse a BMP-6 entre esclerostina y una proteína de fusión de rActivina R1B-FC, un miembro de la familia de receptores de
25 TGF-! que no se unió a BMP.
Se han mapeado los sitios de unión a receptor de tipo I y tipo II sobre un polipéptido de BMP y se separaron espacialmente (Scheufler y col., arriba; Innis y col., arriba; Nickel y col., arriba; Hart y col. arriba). Noggin, otro antagonista de BMP que se une a BMP con alta afinidad, pone en contacto BMP en los sitos de unión a receptor de
30 tanto tipo I como tipo II mediante la porción del extremo N de Noggin (Groppe y col., arriba). Las dos hebras ! en la región Core próxima al extremo C también ponen en contacto BMP en el sitio de unión a receptor de tipo II.
Un alineamiento manualmente ajustado de Noggin y SOST indicó que los dos polipéptidos compartieron similitud de secuencias entre las porciones del extremo N de las proteínas y entre las regiones Core. Un alineamiento de 35 secuencias de aminoácidos se presenta en la Figura 10. Los residuos de cisteína que forman el nudo de cys característico se conservaron entre Noggin y SOST. La identidad de secuencias global fue del 24%, y la identidad de secuencias dentro de la región de unión del extremo N (posiciones de alineamiento 1-45) fue del 33%. Se informó que dos residuos en la región de unión del extremo N de Noggin, concretamente Leu (L) en la posición de alineamiento 21 y Glu (E) en la posición 23, desempeñaban funciones importantes en la unión de BMP (Groppe y
40 col., arriba). Ambos residuos también se conservaron en SOST. La similitud de secuencias dentro de la región Core (posiciones de alineamiento 131-228) fue aproximadamente del 20%, pero el andamiaje del nudo de cys mantuvo y conservó un número suficiente de residuos clave, soportando la homología entre Noggin y SOST.
La estructura de Noggin también se comparó con SOST para entender cómo se dimerizan dos monómeros de
45 SOST. Como se muestra en la Figura 11, la estructura de Noggin sugirió que el ligador entre la región del extremo N y la región Core no solo desempeñó una función en conectar entre las dos regiones, sino que también formó parte de la superficie de separación por dimerización entre dos monómeros Noggin. Un diferencia importante entre Noggin y SOST fue que el ligador entre la región del extremo N y la región Core fue mucho más corto en SOST.
50 La región del extremo C de SOST puede desempeñar una función en la dimerización de SOST. La secuencia de Noggin terminó con la región Core, mientras que SOST tuvo una región del extremo C adicional. En la estructura de Noggin, un enlace disulfuro conectó los extremos C de dos monómeros de Noggin. Así, la región del extremo C de SOST empezó próxima a la superficie de separación de dos monómeros y podría contribuir a la dimerización. Además, la predicción de la estructura secundaria mostró que algunas porciones de la región del extremo C de
55 SOST tuvieron una tendencia a formar hélices. Esta región en SOST puede ser responsable de la actividad de dimerización, posiblemente mediante el empaquetamiento hélice-hélice, que imitó la función del ligador más largo en Noggin. Otra diferencia entre la estructura de Noggin y SOST fue la inserción del aminoácido en la región Core de SOST en posiciones de alineamiento 169-185 (véase la Figura 10). Esta inserción extendió una horquilla !, que señalaba hacia la superficie de separación de la dimerización en la estructura de Noggin (mostrada en la Figura 11
60 como una región de bucle en el centro de los monómeros y por encima del residuo de Cys del extremo C). Esta horquilla ! alargada también podría contribuir a una dimerización de SOST.
EJEMPLO 13
65 DISEÑO Y PREPARACIÓN DE INMUNÓGENOS DE PÉPTIDOS SOST Este ejemplo describe el diseño de inmunógenos de péptidos SOST que se usan para inmunizar animales y generar anticuerpos que bloquean interacciones entre BMP y SOST y previene la formación de dímeros de monómeros de SOST.
5 Fragmentos de unión a BMP
La similitud global entre SOST y Noggin y la similitud entre las regiones del extremo N de los dos polipéptidos sugiere que SOST puede interaccionar con BMP de un modo similar a Noggin. Es decir, la región del extremo N de SOST puede interaccionar con tanto sitios de unión a receptor tipo I como tipo II sobre BMP, y una parte de la región Core (posiciones de alineamiento de aminoácidos 190-220 en la Figura 10) puede interaccionar con el sitio de unión a receptor de tipo II de forma que anticuerpos específicos para estas regiones de SOST puedan bloquear o alterar la unión de BMP a SOST.
Las secuencias de aminoácidos de estos fragmentos de polipéptidos de SOST para SOST de rata y humana se 15 proporcionan del siguiente modo.
SOST_N_Ligador: La región del extremo N (incluye el ligador corto que conecta con la región Core)
SOST_Core_Unión: Porción de la región Core que es probable que se ponga en contacto con BMP en su sitio de unión a receptor tipo II (extendido ligeramente en ambos extremos para incluir los anclajes del
25 residuo de CYS): Humana: CIPDRYRAQRVQLLCPGGEAPRARKVRLVASC (SEC ID Nº: 94) Rata: CIPDRYRAQRVQLLCPGGAAPRSRKVRLVASC (SEC ID Nº: 95)
Fragmentos de dimerización de SOST
Es probable que la región del extremo C de SOST participe en la formación de homodímeros de SOST (véase el Ejemplo 12). La horquilla ! alargada también puede desempeñar una función en la formación de homodímeros. Anticuerpos que se unen específicamente a tales regiones pueden prevenir o alterar la dimerización de monómeros de SOST, que pueden a su vez interferir con interacción entre SOST y BMP. Los fragmentos de polipéptidos en
35 SOST de rata y humana correspondientes a estas regiones son del siguiente modo.
SOST_C: la región del extremo C
SOST_Core_Dímero: Porción de la región Core que es probable que participe en la dimerización de SOST (ligeramente extendida en ambos extremos para incluir los anclajes del residuo de Cys): 45 Humana: CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEC ID Nº: 98) Rata: CGPARLLPNAIGRVKWWRPNGPDFRC (SEC ID Nº: 99)
Fragmento de unión a BMP en el extremo N de SOST
La región de unión del extremo N clave de SOST (posiciones de alineamiento 1-35 en la Figura 10) se modeló basándose en la estructura compleja de Noggin/BMP-7 (entrada del banco de datos de proteínas nº: 1M4U) y el alineamiento de secuencias de aminoácidos (véase la Figura 10) para identificar residuos de aminoácidos del extremo N de SOST que probablemente interaccionan con BMP. El modelo de SOST se presenta en la Figura 12. En el modelo comparativo, fenilalanina (Phe, F) en la posición de alineamiento 8 (véase la flecha y el texto adjunto) 55 en la secuencia de SOST se proyecta en un bolsillo hidrófobo sobre la superficie del dímero de BMP. La misma característica de “botón en ojal” se ha observado en la estructura compleja de BMP y receptor de tipo I (Nickel y col., arriba), ajustándose Phe85 del receptor en el mismo bolsillo, que es una característica clave en el reconocimiento de receptores tipo I de ligando para miembros de la superfamilia de TGF-! (incluyendo, por ejemplo, familia de TGF-!, familia de BMP y similares). Según el modelo, también se conserva un giro dirigido a prolina (Pro), que permite que
el fragmento de unión del extremo N se pliegue a lo largo de la superficie del dímero de BMP, desplazándose del sitio de unión de receptor tipo I al sitio de unión de receptor tipo II sobre los otros lados del complejo. También se conserva otro giro dirigido a Pro próximo al extremo carboxi del fragmento de unión, que luego se conecta con la región del ligador. Amplios contactos entre SOST y BMP son evidentes en la Figura 12. 5 Inmunógenos de péptido
Se diseñaron péptidos para englobar la región del extremo N de SOST predicha que hacía contacto con proteínas BMP. Las secuencias de péptidos se presentan a continuación. Para inmunizar animales, las secuencias de
10 péptidos se diseñaron para el solapamiento, y se añadió una cisteína adicional al extremo C para facilitar la reticulación con KLH. Los péptidos se usaron entonces para inmunización. Las secuencias de péptidos de los inmunógenos son del siguiente modo.
SOST humana: 15 QGWQAFKNDATEIIPELGEY (SEC ID Nº: 47) TEIIPELGEYPEPPPELENN (SEC ID Nº: 48) PBPPPBLBNNKTMNRABNGG (SEC ID Nº: 49) KTMNRAENGGRPPHHPFETK (SEC ID Nº: 50) 20 RPPHHPFETKDVSEYS (SEC ID Nº: 51)
Péptidos de SOST humana con Cys adicional:
QGWQAFKNDATEIIPELGEY-C (SEC ID Nº: 52)
25 TEIIPELGEYPEPPPELENN-C (SEC ID Nº: 53) PEPPPELENNKTMNRAENGG-C (SEC ID Nº: 54) KTMNRAENGGRPPHHPFETK-C (SEC ID Nº: 55) RPPHHPFETKDVSEYS-C (SEC ID Nº: 56)
30 SOST de rata:
QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPP (SEC ID Nº: 57) PEPPQELENNQTMNRAENGG (SEC ID Nº: 58) ENGGRPPBBPYDTKDVSEYS (SEC ID Nº: 59)
35 TEIIPGLREYPEPPQELENN (SEC ID Nº: 60)
Péptidos de SOST de rata con Cys adicional:
QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPP-C (SEC ID Nº: 61)
40 PEPPQELENNQTMNRAENGG-C (SEC ID Nº: 62) ENGGRPPHHPYDTKDVSEYS-C (SEC ID Nº: 63) TEIIPGLREYPEPPQELENN-C (SEC ID Nº: 64)
Se diseñaron los siguientes péptidos para contener la porción de aminoácido de la región Core que se predijo que
45 hizo contacto con proteínas BMP. La cisteína se añadió en el extremo C de cada péptido para conjugación con KLH, y los péptidos conjugados se usaron para inmunización. En el péptido del extremo N Core de enlace, una cisteína interna se cambió con una serina para evitar la doble conjugación con KLH.
Para SOST humana: 50 Secuencia de aminoácidos sin residuos de Cys añadidos: Enlace_Core_extremo N_Péptido: IPDRYRAQRVQLLCPGGEAP (SEC ID Nº: 66) Enlace_Core_extrC_Péptido: QLLCPGGEAPRARIKVRLVAS (SEC ID Nº: 67) Enlace_Core_extremo N_Péptido: IPDRYRAQRVQLLCPGGEAP-C (SEC ID Nº: 68) 55 Enlace_Core_extrC_Péptido: QLLCPGGEAPRARKVRLVAS-C (SEC ID Nº: 69)
Para SOST de rata:
Secuencia de aminoácidos sin residuos de Cys añadidos o sustituidos:
60 Enlace_Core_extremo N_Péptido: IPDRYRAQRVQLLSPGG (SEC ID Nº: 70) Enlace_Core_extrC_Péptido: PGGAAPRSRKVRLVAS (SEC ID Nº: 71) Inmunógenos de péptido con Cys añadida y sustituida: Enlace_Core_extremo N_Péptido: IPDRYRAQRVQLLSPGG-C (SEC ID Nº: 72) Enlace_Core_extrC_Péptido: PGGAAPRSRKVRLVAS-C (SEC ID Nº: 73)
65 Dos regiones dentro de SOST que posiblemente interaccionan para formar homodímeros de SOST incluyen los aminoácidos con la región Core de SOST que no están presentes en Noggin. Péptidos SOST humanos diseñados para contener esta secuencia tuvo un Cys del extremo C o extremo N que se conjugó con KLH. Para el péptido de SOST de rata, una cisteína se añadió al extremo carboxi de la secuencia (SEC ID Nº: 76). Los péptidos conjugados
5 con KLH se usaron para inmunización.
Para SOST humana:
CGPARLLPNAIGRGKWWRPS (SEC ID Nº: 74)
IGRGKWWRPSGPDFRC (SEC ID Nº: 75)
Para SOST de rata:
PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEC ID Nº: 76)
15 Péptido de SOST de rata con cisteína añadida PNAIGRVKWWRPNGPDFR-C (SEC ID Nº: 77)
La segunda región dentro de SOST que posiblemente interacciona para formar homodímeros de SOST incluye la región del extremo C. Se diseñaron inmunógenos de péptido que incluyeran secuencias de aminoácidos dentro de esta región (véase más adelante). Para conjugación con KLH, un residuo de cisteína se añadió al extremo C, y los péptidos conjugados se usaron para inmunización.
Para SOST humana:
25 KRLTRFHNQS ELKDFGTEAA (SEC ID Nº: 78) ELKDFGTEAA RPQKGRKPRP (SEC ID Nº: 79) RPQKGRKPRP RARSAKANQA (SEC ID Nº: 80) RARSAKANQA ELENAY (SEC ID Nº: 81)
Inmunógenos de péptido con Cys añadida en el extremo C:
KRLTRFHNQS ELKDFGTEAA-C (SEC ID Nº: 82) ELKDFGTEAA RPQKGRKPRP-C (SEC ID Nº: 83) RPQKGRKPRP RARSAKANQA-C (SEC ID Nº: 84)
35 RARSAKANQA ELENAY-C (SEC ID Nº: 85)
Para SOST de rata:
KRLTRFHNQSELKDFGPETARPQ (SEC ID Nº: 86) KGRKPRPRARGAKANQAELENAY (SEC ID Nº: 87) SELKDFGPETARPQKGRKPRPRAR (SEC ID Nº: 88)
Inmunógenos de péptido con Cys añadida en el extremo C:
45 KRLTRFHNQSELKDFGPETARPQ-C (SEC ID Nº: 89) KGRKPRPRARGAKANQAELENAY-C (SEC ID Nº: 90) SELKDFGPETARPQKGRKPRPRAR-C (SEC ID Nº: 91)
EJEMPLO 14
ENSAYO PARA DETECTAR LA UNIÓN DE ANTICUERPOS PARA UNA PROTEÍNA DE UNIÓN A TGF-BETA
Este ejemplo describe un ensayo para detectar la unión de un ligando, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo, a esclerostina.
55 Se preparó una proteína de fusión FLAG®-esclerostina según protocolos proporcionados por el fabricante (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y como se describe en la patente de EE.UU. nº 6.395.511. Cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos se recubre con anticuerpo monoclonal anti-FLAG® (Sigma Aldrich) y luego se bloquea con 10% de BSA en PBS. La proteína de fusión (20 ng) se añade a 100 μl de PBS/0,2% de BSA y se adsorbe sobre la placa de 96 pocillos durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se elimina esta disolución de proteína y los pocillos se lavan para eliminar proteína de fusión sin unir. Una BMP, por ejemplo, BMP-4, BMP-5, BMP-6 o BMP-7, se diluye en PBS/0,2% de BSA y se añade a cada pocillo a concentraciones que oscilan de 10 pM a 500 nM. Después de una incubación durante 2 horas a temperatura ambiente, la disolución de unión se elimina y la placa se lava tres veces con volúmenes de 200 μl de PBS/0,2% de BSA. La unión de BMP a esclerostina se detecta usando
65 antisuero policlonal o anticuerpo monoclonal específico para BMP y un reactivo de segunda etapa conjugado con enzima apropiado según técnicas de ELISA convencionales (véase, por ejemplo, Ausubel y col., Current Protocols in Mol Biol. Vol 2 11.2.1-11.2.22 (1998)). La unión específica se calcula restando la unión no específica de la unión total y se analiza usando el programa LIGAND (Munson y Podbard, Anal. Biochem. 107:220-39 (1980)).
La unión de esclerostina a BMP también se detecta por detección por fluorescencia resuelta en el tiempo
5 homogénea (Mellor y col., J Biomol. Screening, 3:91-99 (1998)). Una secuencia de polinucleótidos que codifica esclerostina está operativamente ligada a una región constante de inmunoglobulina humana en una construcción de ácidos nucleicos recombinantes y se expresa como una proteína de fusión de Fc humana-esclerostina según procedimientos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. Similarmente, un ligando de BMP se manipula y se expresa como un proteína de fusión de BMP-Fc de ratón. Estas dos proteínas de fusión se incuban juntas y el ensayo se realiza como se describe por Mellor y col.
EJEMPLO 15
ENSAYO DE CRIBADO PARA ANTICUERPOS QUE INHIBEN LA UNIÓN DE MIEMBROS DE LA FAMILIA DE TGF15 BETA A PROTEÍNA DE UNIÓN A TGF-BETA
Este ejemplo describe un procedimiento para detectar un anticuerpo que inhibe la unión de un miembro de la familia de TGF-beta a esclerostina. Se realiza un ELISA esencialmente como se describe en el Ejemplo 14, excepto que la concentración de BMP se mantiene fija a su Kd (determinada, por ejemplo, por análisis BIAcore). Además, un anticuerpo o una biblioteca o conjunto de anticuerpos se añaden a los pocillos a una concentración de 1 μM. Los anticuerpos se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente con BMP y esclerostina, la disolución se elimina y BMP unida se cuantifica como se ha descrito (véase el Ejemplo 14). Los anticuerpos que inhiben el 40% de unión de BMP observada en ausencia de anticuerpo se consideran antagonistas de esta interacción. Estos anticuerpos se evalúan adicionalmente como posibles inhibidores realizando estudios de valoración para determinar sus constantes
25 de inhibición y su efecto sobre la afinidad de unión a proteína de unión a TGF-beta. También pueden realizarse ensayos de control de especificidad comparables para establecer el perfil de selectividad para el antagonista identificado usando ensayos dependientes de la acción del ligando de BMP (por ejemplo, un estudio de competencia de BMP/receptor de BMP).
EJEMPLO 16
INHIBICIÓN DE LA LOCALIZACIÓN DE PROTEÍNA DE UNIÓN A TGF-BETA EN MATRIZ ÓSEA
La evaluación de la inhibición de la localización en matriz ósea (hidroxiapatita) se realiza usando modificaciones al
35 procedimiento de Nicolas (Nicolas, V. Calcif Tissue Int. 57:206-12 (1995)). Brevemente, se prepara proteína de unión a TGF-beta marcada con 125I como se describe por Nicolas (arriba). Se añade hidroxiapatita a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos equipada con una membrana de filtración de polipropileno (Polyfiltroninc, Weymouth MA). Entonces, la proteína de unión a TGF-beta diluida en 0,2% de albúmina en tampón PBS se añade a los pocillos. Los pocillos que contienen matriz se lavan 3 veces con 0,2% de albúmina en tampón PBS. La proteína de unión a TGF-beta adsorbida se eluye usando NaOH 0,3 M y luego se cuantifica.
Un anticuerpo que inhibe o altera la unión de la proteína de unión a TGF-beta esclerostina a hidroxiapatita se identifica incubando la proteína de unión a TGF-beta con el anticuerpo y aplicando la mezcla a la matriz como se ha descrito anteriormente. La matriz se lava 3 veces con 0,2% de albúmina en tampón PBS. La esclerostina adsorbida
45 se eluye con NaOH 0,3 M y luego se cuantifica. Un anticuerpo que inhibe el nivel de unión de esclerostina a hidroxiapatita al menos el 40% en comparación con el nivel de unión observado en ausencia de anticuerpo se considera un inhibidor de la localización ósea. Un anticuerpo tal se caracteriza adicionalmente en estudios de respuesta a dosis para determinar su constante de inhibición y su efecto sobre la afinidad de unión de proteína de unión a TGF-beta.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Brunkow, Mary E. Galas, David J. Kovacevich, Brian Mulligan, John T. Paeper, Bryan W. Van Ness,
Jeffrey Winkler, David G. 55
<120> COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS PARA AUMENTAR LA MINERALIZACIÓN ÓSEA
<130> 60117-136
<140>
<141>
<150> US 10/463.190
<151> 65
<160> 143
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
<210> 1
<211> 2301
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 213
<212> PRT
<213> Homo sapiens 15
<400> 2
<210> 3
<211> 2301
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 3 <210> 4
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 2301
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 5
<210> 6
<211> 213
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6 <210> 7
<211> 2301
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 7 <210> 8
<211> 213
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
10 <210> 9
<211> 642
<212> ADN
<213> Cercopithecus pygerythrus
15 <400> 9
20 <210> 10
<211> 213
<212> PRT
<213> Cercopithecus pygerythrus
25 <400> 10
<210> 11
<211> 638
<212> ADN
<213> Mus musculus
<400> 11
<210> 12
<211> 211
<212>
PRT 15 <213> Mus musculus
<400> 12
<210> 13
<211> 674
<212> ADN
<213> Rattus norvegicus
<400> 13
<210> 14
<211> 213
<212>
PRT 15 <213> Rattus norvegicus
<400> 14
<210> 15
<211> 532
<212> ADN
<213> Bos torus
<400> 15
<210> 16
<211> 176
<212>
PRT 15 <213> Bos torus
10 10
<400> 16
<210> 17
<211> 35828 5 <212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc_feature 10 <222> (1)..(35828)
<223> n = A,T,C o G
<400> 17
<210> 18
<211> 9301
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 18
<210> 19
<211> 21 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador para PCR 10
<400> 19 ccggagctgg agaacaacaa g 21
<210> 20 15 <211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador para PCR
5
<400> 20 gcactggccg gagcacacc <210> 21 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial 19
<220> <223> Cebador para PCR
15
<400> 21 aggccaaccg cgagaagatg acc 23
<210> 22 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial
25
<220> <223> Cebador para PCR
<400> 22 gaagtccagg gcgacgtagc a
21
<210> 23 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial
35
<220> <223> Cebador para PCR
<400> 23 aagcttggta ccatgcagct cccac
25
45
<210> 24 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador para PCR
<400> 24 aagcttctac ttgtcatcgt cgtccttgta gtcgtaggcg ttctccagct
50
55
<210> 25 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador para PCR
<400> 25 gcactggccg gagcacacc
19
65
<210> 26 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador para PCR
5
<400> 26 gtcgtcggat ccatggggtg gcaggcgttc aagaatgat 39
10
<210> 27 <211> 57 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador para PCR
15
<400> 27 gtcgtcaagc ttctacttgt catcgtcctt gtagtcgtag gcgttctcca gctcggc 57
20
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25
<220> <223> Cebador para PCR <400> 28 gacttggatc ccaggggtgg caggcgttc 29
30
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35
<220> <223> Cebador para PCR
<400> 29 agcataagct tctagtaggc gttctccag
29
40
<210> 30 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial
45
<220> <223> Cebador para PCR
50 55
<400> 30 gacttggatc cgaagggaaa aagaaaggg <210> 31 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador para PCR 29
60
<400> 31 agcataagct tttaatccaa atcgatgga 29
65
<210> 32 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador para PCR
<400> 32 5 actacgagct cggccccacc acccatcaac aag 33
<210> 33
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador para PCR
15 <400> 33 acttagaagc tttcagtcct cagccccctc ttcc 34
<210> 34
<211> 66
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador para PCR 25
<400> 34
<210> 35
<211> 82
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador para PCR
<400> 35
<210> 36
<211> 62
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador para PCR
<400> 36
<210> 37
<211> 54
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador para PCR
<400> 37 aacgacggcc agtgaatccg taatcatggt catgctgcca ggtggaggag ggca 54
5
<210> 38 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador para PCR
10
<400> 38 attaccaccg gtgacacccg cttcctgaca g 31
15
<210> 39 <211> 61 <212> ADN <213> Secuencia artificial
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20
<400> 39
25
<210> 40 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial
30
<220> <223> Cebador para PCR <400> 40 attacggccg gccgcaaagg aattcaagat ctga 34
35
<210> 41 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial
40
<220> <223> Cebador para PCR
<400> 41 attacggcgc gcccctcaca ggccgcaccc agct
34
45
<210> 42 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens
50
<400> 42
<210> 43
<211> 267
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<211> 180
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
<210> 45
<211> 642 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(639)
<400> 45
<210> 46
<211> 190
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
<210> 47
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens 15
<400> 47
<210> 48
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
10 <210> 49
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
15 <400> 49
<210> 50 20 <211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50 25
<210> 51
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
<210> 52
<211> 21
<212> PRT 40 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido de SOST humano con cisteína adicional añadida
45 <400> 52 <210> 53
<211> 21
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido de SOST humano con cisteína adicional añadida
<400> 53
<210> 54
<211> 21
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido de SOST humano con cisteína adicional añadida
<400> 54
<210> 55 25 <211> 21
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido de SOST humano con cisteína adicional añadida
<400> 55
35 210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido de SOST humano con cisteína adicional añadida
<400> 56 45
<210> 57
<211> 24
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 57
5 <210> 58
<211> 20
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
10 <400> 58
<210> 59 15 <211> 20
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 59 20
<210> 60
<211> 20
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 60
<210> 61
<211> 25
<212> PRT 35 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido de SOST de rata con cisteína adicional añadida
40 <400> 61
<210> 62
<211> 21
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido de SOST de rata con cisteína adicional añadida
<400> 62
<210> 63
<211> 21
<212> PRT 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido de SOST de rata con cisteína adicional añadida
15 <400> 63
<210> 64 20 <211> 21
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 25 <223> Fragmento de péptido de SOST de rata con cisteína adicional añadida
<400> 64
<210> 65
<211> 190
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus 35
<400> 65
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<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<210> 67
<211> 20
<212> PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 67
<210> 68
<211> 21
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 25
<220>
<223> Fragmento de péptido de SOST humano con cisteína adicional añadida
<400> 68 <210> 69
<211> 21
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido de SOST humano con cisteína adicional añadida
<400> 69
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
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<211> 16
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 71
<210> 72
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido de SOST de rata con cisteína adicional añadida
<400> 72
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido de SOST de rata con cisteína adicional añadida
<400> 73
<210> 74
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 74
<210> 75
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
15 <400> 75
<210> 76
<211> 18
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 76
<210> 77
<211> 19
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido de SOST de rata con cisteína adicional añadida
<400> 77
<210> 78
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
45 <400> 78
<210> 79
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
<210> 80
<211> 20
<212> PRT 10 <213> Homo sapiens
<400> 80
15 <210> 81
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
20 <400> 81
<210> 82 25 <211> 21
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 30 <223> Fragmento de péptido de SOST humano con cisteína adicional añadida
<400> 82
<210> 83
<211> 21
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 40
<220>
<223> Fragmento de péptido de SOST humano con cisteína adicional añadida
<400> 83 45
<210> 84
<211> 21
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 5
<220>
<223> Fragmento de péptido de SOST humano con cisteína adicional añadida
<400> 84 10
<210> 85
<211> 17 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido de SOST humano con cisteína adicional añadida 20
<400> 85
25 <210> 86
<211> 23
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
30 <400> 86
<210> 87 35 <211> 23
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 87
<210> 88
<211> 24
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 88
<210> 89
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
15 <220>
<223> Fragmento de péptido de SOST de rata con cisteína adicional añadida
<400> 89
<210> 90
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido de SOST de rata con cisteína adicional añadida
<400> 90
<210> 91
<211> 25
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido de SOST de rata con cisteína adicional añadida
<400> 91
45 <210> 92
<211> 56
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 92
<210> 93
<211> 56
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 93
<210> 94
<211> 32
<212> PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 94
<210> 95
<211> 32
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus 25
<400> 95
30 <210> 96
<211> 44
<212> PRT
<213> Homo sapiens
35 <400> 96
<210> 97
<211> 44
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 97
<210> 98
<211> 26
<212> PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 98
<210> 99
<211> 26
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus 25
<400> 99
<210> 100 30 <211> 570
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 100 35
<210> 101
<211> 570
<212> ADN
<213> Rattus norvegicus
<400> 101
10 <210> 102
<211> 532
<212> PRT
<213> Homo sapiens
15 <400> 102
<210> 103
<211> 502
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 103
<210> 104
<211> 502
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 104
<210> 105
<211> 532
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 105
<210> 106
<211> 532
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 106
<210> 107
<211> 532
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 107
<210> 108
<211> 502
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108 <210> 109
<211> 502
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 109
<210> 110
<211> 532
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 110
<210> 111
<211> 530
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 111 <210> 112
<211> 530
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 112 <210> 113
<211> 1038
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 113
<210> 114
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 114
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<211> 1038
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 115
<210> 116
<211> 2932
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 116 <210> 117
<211> 1575
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 117
<210> 118
<211> 2032
<212>
ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 118
<210> 119
<211> 3167
<212> ADN
<213> Rattus sp.
<400> 119
<210> 120
<211> 3167
<212> ADN
<213> Rattus norvegicus
<400> 120
<210> 121
<211> 3003
<212> ADN
<213> Rattus norvegicus
<400> 121
<210> 122
<211> 2063
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 122
<210> 123
<211> 1964
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 123
<210> 124
<211> 3611
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 124
<210> 125
<211> 3871
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 125
<210> 126
<211> 88
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 126
<210> 127
<211> 82
<212>
PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 127
<210> 128
<211> 82
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 128
<210> 129
<211> 84
<212>
PRT 15 <213> Homo sapiens
10 10
<400> 129
<210> 130
<211> 83
<212> PRT
<213> Homo sapiens 25
<400> 130
<210> 131
<211> 80
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 131
<210> 132
<211> 80
<212> PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 132
<210> 133
<211> 85
<212> PRT
<213> Homo sapiens 25
<400> 133
<210> 134
<211> 86
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 134
<210> 135
<211> 70
<212> PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 135
<210> 136
<211> 70
<212> PRT
<213> Homo sapiens 25
<400> 136
<210> 137
<211> 70
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 137
<210> 138
<211> 205
<212> PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 138
<210> 139
<211> 197
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<400> 139
10 <210> 140
<211> 196
<212> PRT
<213> Xenopus laevis
15 <400> 140
<210> 141
<211> 195
<212> PRT
<213> Takifugu rubripes
<400> 141
<210> 142
<211> 196
<212> PRT 15 <213> Danio rerio
<400> 142
<210> 143
<211> 188
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 143

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido de esclerostina que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 46, donde dicho anticuerpo o fragmento se une a la secuencia de SEC ID Nº: 98.
  2. 2.
    El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo o fragmento se une a la secuencia de SEC ID Nº: 74.
  3. 3.
    El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo o fragmento se une a la secuencia de SEC ID Nº: 75.
  4. 4.
    El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 que se une específicamente a al menos cuatro aminoácidos consecutivos de SEC ID Nº: 46.
  5. 5.
    El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es policlonal o monoclonal.
  6. 6.
    El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es humano, humanizado o quimérico.
  7. 7.
    El fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que está seleccionado de F(ab')2, Fab, Fab', Fd, y Fv.
  8. 8.
    Una célula huésped que produce o expresa el anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
  9. 9.
    La célula huésped de la reivindicación 8, que es una célula de hibridoma.
  10. 10.
    Un polinucleótido que codifica el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
  11. 11.
    Uso de la célula huésped de la reivindicación 8 o 9 para producir o expresar dicho anticuerpo o fragmento.
  12. 12.
    Una composición que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un vehículo fisiológicamente aceptable.
  13. 13.
    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en un procedimiento de aumentar el contenido mineral óseo y/o densidad mineral ósea en un animal de sangre caliente
    o ser humano.
  14. 14.
    El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 13 para su uso en el tratamiento de osteopenia, osteoporosis, una fractura, acondroplasia, disostosis cleidocraneal, encondromatosis, displasia fibrosa, enfermedad de Gaucher, raquitismo hipofosfatémico, síndrome de Marfan, exostosis múltiple hereditaria, neurofibromatosis, osteogénesis imperfecta, osteopetrosis, osteopoiquilosis, lesiones escleróticas, enfermedad periodontal, pseudoartrosis y osteomielitis piogénica.
  15. 15.
    El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para el uso de la reivindicación 14, donde la osteopenia es producida por un estado anémico, esteroides, heparina, un trastorno de la médula ósea, hipovitaminosis C, desnutrición, deficiencia de calcio, osteoporosis idiopática, osteopenia u osteoporosis congénita, alcoholismo, enfermedad hepática crónica, senilidad, estado posmenopáusico, oligomenorrea, amenorrea, embarazo, diabetes mellitus, hipertiroidismo, enfermedad de Cushing, acromegalia, hipogonadismo, inmovilización o inactividad, síndrome de distrofia simpática refleja, osteoporosis regional transitoria y osteomalacia.
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