PT1638999E - Composições e métodos para aumentar a mineralização óssea - Google Patents

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PT1638999E PT47765524T PT04776552T PT1638999E PT 1638999 E PT1638999 E PT 1638999E PT 47765524 T PT47765524 T PT 47765524T PT 04776552 T PT04776552 T PT 04776552T PT 1638999 E PT1638999 E PT 1638999E
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Jeffrey Van Ness
David G Winkler
Mary E Brunkow
David J Galas
John T Mulligan
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Description

ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Composições e métodos para aumentar a mineralização óssea"
CAMPO TÉCNICO 0 presente invento refere-se na generalidade a produtos farmacêuticos e, mais especificamente, a composições adequadas para aumentar o teor mineral dos ossos. Tais composições podem ser utilizadas para tratar uma vasta gama de doenças, incluindo por exemplo, osteopenia, osteoporose, fracturas e outras doenças nas quais a baixa densidade mineral óssea é uma marca típica da doença.
ANTECEDENTES DO INVENTO
Ocorrem duas ou três fases distintas de alterações da massa óssea durante a vida de um indivíduo (consultar Riggs, West J. Med. 154:63-11, 1991). A primeira fase ocorre tanto em homens como em mulheres e prossegue até atingir um máximo de massa óssea. Esta primeira fase é conseguida através de crescimento linear das placas de crescimento endocôndrico e crescimento radial devido a uma taxa de aposição periosteal. A segunda fase tem início por volta dos 30 anos para osso trabecular (ossos planos tais como vértebras e pélvis) e por volta dos 40 anos para osso cortical (e.g., ossos longos localizados nos membros) e continua na idade avançada. Esta fase é caracterizada por perda óssea lenta e ocorre tanto em homens como em mulheres. Em mulheres ocorre também uma terceira fase de perda óssea, mais provavelmente devida a deficiências de estrogénio na pós-menopausa. Durante esta fase apenas, as mulheres podem perder adicionalmente 10% da massa óssea do osso cortical e 25% do compartimento trabecular (consultar Riggs, supra). A perda de teor mineral ósseo pode ser causada por uma vasta gama de condições e pode resultar em problemas médicos significativos. Por exemplo, a osteoporose é uma doença debilitante em humanos caracterizada por diminuições acentuadas na massa óssea e densidade mineral do esqueleto, deterioração estrutural do osso incluindo degradação da 2 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ microarquitectura óssea e aumento correspondente da fragilidade óssea e susceptibilidade a fractura nos indivíduos atingidos. A osteoporose em humanos é precedida por osteopenia clinica (densidade mineral óssea que é menor do que o valor médio para osso adulto jovem mais do que um desvio padrão mas menos do que 2,5 vezes o desvio padrão), uma condição encontrada em aproximadamente 25 milhões de pessoas nos Estados Unidos. Outros 7-8 milhões de doentes nos Estados Unidos foram diagnosticados com osteoporose clínica (definida como teor mineral ósseo inferior ao de osso adulto jovem maturo mais do que 2,5 vezes o desvio padrão). A osteoporose é uma das doenças mais caras para o sistema de saúde, com custos anuais de dezenas de milhares de milhões de dólares nos Estados Unidos. Além dos custos relacionados com os cuidados de saúde, os cuidados residenciais a longo prazo e os dias de trabalho perdidos adicionam-se aos custos financeiros e sociais desta doença. Aproximadamente 75 milhões de pessoas no mundo estão em risco de osteoporose. A frequência de osteoporose na população humana aumenta com a idade e entre os caucasianos é predominante nas mulheres (que constituem 80% do conjunto de doentes com osteoporose nos Estados Unidos). O aumento da fragilidade e susceptibilidade a fractura do osso esquelético nos idosos é agravada pelo maior risco de quedas acidentais nesta população. Nos Estados Unidos registam-se mais de 1,5 milhões de fracturas ósseas relacionadas com osteoporose por ano. A fractura de anca, pulsos e vértebras são as lesões mais frequentemente associadas a osteoporose. Em particular, as fracturas da anca são extremamente desconfortáveis e caras para o doente e para as mulheres estão relacionadas com elevadas taxas de mortalidade e morbilidade.
Embora a osteoporose tenha sido definida como um aumento do risco de fractura devido a diminuição da massa óssea, nenhum dos tratamentos disponíveis actualmente para doenças do esqueleto consegue aumentar substancialmente a densidade óssea de adultos. Existe uma forte percepção entre os médicos que são necessários fármacos que possam aumentar a densidade óssea em adultos, em particular nos ossos dos pulsos, coluna espinal e anca que estão em risco de osteopenia e osteoporose. 3 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
As estratégias actuais para a prevenção de osteoporose podem proporcionar alguns benefícios a indivíduos mas não conseguem assegurar a resolução da doença. Estas estratégias incluem moderar a actividade física (em particular em actividades de levantamento de pesos) com o início da idade avançada, incluir cálcio adeguado na dieta e evitar o consumo de produtos contendo álcool ou tabaco. Para doentes gue apresentam osteopenia ou osteoporose clínicas, todos os fármacos e estratégias terapêuticas actuais são dirigidos à redução de perda adicional da massa óssea por inibição do processo de absorção óssea, um componente natural do processo de remodelação do osso gue ocorre constitutivamente.
Por exemplo, actualmente receita-se estrogénio para retardar a perda óssea. No entanto, existe alguma controvérsia sobre os benefícios a longo prazo para os doentes e se existe qualquer efeito em doentes com mais de 75 anos de idade. Além disso, pensa-se que a utilização de estrogénio aumenta o risco de cancro da mama e do endométrio.
Também foram sugeridas doses elevadas de cálcio na dieta, com ou sem vitamina D, para mulheres na pós-menopausa. No entanto, as doses elevadas de cálcio podem frequentemente ter efeitos secundários gastrointestinais desagradáveis e devem monitorizar-se continuamente os níveis de cálcio no soro e na urina (consultar Khosla e Rigss, Mayo Clin. Proc. 70:978-982, 1995).
Outras terapias que foram sugeridas incluem calcitonina, bisfosfonatos, esteróides anabólicos e fluoreto de sódio. No entanto, tais terapias têm efeitos secundários indesejáveis (e.g., a calcitonina e os esteróides podem causar náusea e provocar uma reacção imunitária, os bisfosfonatos e fluoreto de sódio podem inibir a reparação de fracturas, embora a densidade óssea aumente moderadamente) que podem evitar a sua utilização (consultar Khosla e Rigss, supra). WO 01/92308 refere-se a polipéptidos com nó de cistina: moléculas cloaked-2 e suas utilizações. US 6 495 736 e WO 00/32773 referem-se a aumento da mineralização óssea. 4 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
Nenhuma das estratégias terapêuticas actualmente praticadas envolve um fármaco que estimule ou aumente o crescimento de nova massa óssea. 0 presente invento proporciona composições que podem ser utilizadas para aumentar a mineralização óssea e assim podem ser utilizadas para tratar uma vasta gama de condições em que se pretende aumentar a massa óssea. Adicionalmente, o presente invento proporciona outras vantagens relacionadas.
SUMÁRIO DO INVENTO 0 invento proporciona um anticorpo, ou seu fragmento de ligação de antigénio, que se liga especificamente a um polipéptido esclerostina compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 46, em que o referido anticorpo ou fragmento se liga à sequência de SEQ ID NO: 98. Em várias concretizações, o anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal (e.g., de origem humana ou murina). Em concretizações adicionais, o anticorpo é um fragmento de um anticorpo que retém as caracteristicas de ligação de um anticorpo completo (e.g., um fragmento F(ab')2f F(ab)2, Fab', Fab ou Fv ou mesmo uma CDR) . Também se proporcionam hibridomas e outras células que são capazes de produzir ou expressar os anticorpos supracitados.
Os anticorpos e seus fragmentos de ligação de antigénio podem ser utilizados em métodos para aumentar o teor mineral ósseo num animal de sangue quente.
As moléculas de anticorpo podem ser proporcionadas como uma composição e podem compreender adicionalmente um inibidor de reabsorção óssea. Os exemplos representativos de tais inibidores incluem calcitonina, estrogénio, um bisfosfonato, um factor de crescimento com actividade anti-reabsorção e tamoxifeno.
Os exemplos representativos de moléculas de anticorpo que podem ser utilizadas nos contextos terapêuticos supramencionados incluem anticorpos humanizados. Tais moléculas, dependendo da sua selecção, podem ser utilizadas para antagonizar a sinalização ou ligação à proteína 5 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ esclerostina (SOST), um membro da família das proteínas de ligação a TGF-beta, tal como aqui descrito.
As moléculas de anticorpo descritas anteriormente podem ser utilizadas em doenças tais como osteoporose, osteomalacia, doença periodontal, escorbuto, doença de Cushing, fractura de osso e condições devidas a imobilização dos membros e utilização de esteróides.
Em determinadas concretizações específicas do invento, o anticorpo é um anticorpo policlonal. Noutras concretizações, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, que é um anticorpo monoclonal de ratinho, humano, de rato ou de hamster. 0 invento também proporciona uma célula de hibridoma ou uma célula hospedeira que é capaz de produzir o anticorpo monoclonal. Noutras concretizações do invento, o anticorpo é um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico. 0 invento proporciona adicionalmente uma célula hospedeira que produz o anticorpo humanizado ou quimérico. Em determinadas concretizações o fragmento de ligação de antigénio do anticorpo é um fragmento F(ab')2, Fab', Fab, Fd ou Fv. 0 invento também proporciona um anticorpo que é um anticorpo em cadeia simples e proporciona uma célula hospedeira que é capaz de expressar o anticorpo em cadeia simples. Noutra concretização, o invento proporciona uma composição compreendendo tais anticorpos e um transportador fisiologicamente aceitável.
Estes e outros aspectos do presente invento tornar-se-ão evidentes por referência à seguinte descrição detalhada e esquemas em anexo. Além disso, os documentos incluindo várias referências aqui apresentados descrevem mais detalhadamente determinados procedimentos ou composições (e.g., plasmídeos, etc.).
DESCRIÇÃO SUCINTA DOS ESQUEMAS A figura 1 é uma ilustração esquemática comparando a sequência de aminoácidos de Dan humana; Gremlin humana; Cerberus humana e Beer humana. As setas indicam o esqueleto de cisteína. 6 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ A figura 2 sumariza os resultados obtidos do rastreio de vários tecidos humanos para a expressão de um gene de proteína de ligação de TGF-beta, especificamente, o gene Beer humano. Utilizou-se um procedimento de transcrição reversa- reacção de polimerização em cadeia (RT-PCR) semiquantitativo para amplificar uma parte do gene de ADNc de primeira cadeia sintetizado a partir de ARN total (descrito mais detalhadamente no EXEMPLO 2A).
As figuras 3A-3D sumarizam os resultados obtidos de hibridação de ARN in situ de secções de embrião de ratinho, utilizando uma sonda de ARNc que é complementar ao produto de transcrição de Beer de ratinho (descrita mais detalhadamente no EXEMPLO 2B) . 0 painel 3A é uma secção transversal de embrião 10.5 dpc. O painel 3B é uma secção sagital do embrião 12.5 dpc e os painéis 3C e 3D são secções sagitais de embriões 15.5 dpc.
As figuras 4A-4C ilustram, por análise de transferência "western", a especificidade de três anticorpos policlonais diferentes para os seus antigénios respectivos (descritos mais detalhadamente no EXEMPLO 4). A figura 4A apresenta a reactividade específica de um anticorpo anti-H. Beer para antigénio H. Beer, mas não H. Dan ou H. Gremlin. A figura 4B apresenta reactividade de um anticorpo anti-H. Gremlin para antigénio H. Gremlin, mas não H. Beer ou H. Dan. A figura 4C apresenta reactividade de um anticorpo anti-H. Dan para H. Dan, mas não H. Beer ou H. Gremlin. A figura 5 ilustra, por análise de transferência "western", a selectividade da proteína de ligação de TGF-beta, Beer, para BMP-5 e BMP-6, mas não BMP-4 (descrita mais detalhadamente no EXEMPLO 5). A figura 6 demonstra que a interacção iónica entre a proteina de ligação de TGF-beta, Beer, e BMP-5 tem uma constante de dissociação na gama de 15-30 nM. A figura 7 apresenta um alinhamento da região contendo o nó de cistina característico de um polipéptido SOST (esclerostina) e os seus homólogos mais próximos. As três ligações dissulfureto que formam o nó de cistina encontram-se 7 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ representadas como linhas contínuas. Uma ligação dissulfureto extra, apresentada como uma linha a pontilhado, é única a esta família, que liga duas pontas de gancho de cabelo β na estrutura 3D. Os polipéptidos apresentados são SOST: esclerostina (SEQ ID NO:126); CGHB: gonadotropina coriónica β humana (SEQ ID NO:127); FSHB: subunidade beta de hormona folículo-estimulante (SEQ ID NO:128); TSHB: precursor de cadeia beta de tirotropina (SEQ ID NO:129); VWF: factor de Von Willebrand (SEQ ID NO:130); MUC2: precursor de mucina 2 humana (SEQ ID N0:131); CER1: Cerberus 1 (homólogo de Xenopus laevis) (SEQ ID NO: 132); DRM: gremlin (SEQ ID NO: 133); DAN: (SEQ ID NO:134); CTGF: precursor de factor de crescimento de tecido conjunctivo (SEQ ID NO:135); NOV: NovH (homólogo de proteína de gene sobrexpresso de nefroblastoma) (SEQ ID NO:136); CYR6: (SEQ ID NO:137). A figura 8 ilustra um modelo 3D da região de núcleo de SOST (SOST_Core). A figura 9 apresenta um modelo 3D da região de núcleo de homodímero SOST.
As figuras 10A e 10B proporcionam um alinhamento de sequências de aminoácidos de Noggin de cinco animais diferentes: humana (NOGG_HUMAN (SEQ ID NO:138); galinha (NOGG_CHICK, SEQ ID NO:139); Xenopus laevis (NOGG_XENLA, SEQ ID NO:140); NOGG_FUGRU, SEQ ID NO:141); e peixe zebra (NOGG_ZEBRA, SEQ ID NO:142); e SOST de humano (SOST_HUMAN, SEQ ID NO: 46), rato (SOST_RAT, SEQ ID NO: 65) e ratinho (SOST_Mouse, SEQ ID NO:143). A figura 11 ilustra a estrutura do complexo Noggin/BMP-7. O homodímero BMP apresenta-se na parte inferior da figura em modo de superfície. O homodímero Noggin apresenta-se no topo do dímero BMP no modo de esquema. Os círculos circundam a região de ligação N-terminal, a região de núcleo e o ligante entre as regiões N-terminal e de núcleo. A figura 12 representa um modelo 3D do fragmento de ligação de BMP potencial localizado na região N-terminal de SOST. Apresenta-se um dímero BMP no modo de superfície e o fragmento de ligação de BMP potencial no modo de pauzinho. 8 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
Salienta-se um resíduo de fenilalanina que se adequa a um bolso hidrofóbico na superfície BMP.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO
DEFINIÇÕES
Antes de apresentar o invento detalhadamente, pode ser útil para a sua compreensão apresentar definições de determinados termos e listar e definir as abreviaturas que serão aqui utilizadas doravante.
Deve entender-se que "molécula" inclui proteínas ou péptidos (e.g., anticorpos, parceiros de ligação recombinantes, péptidos com uma afinidade de ligação pretendida), ácidos nucleicos (e.g., ADN, ARN, moléculas de ácido nucleico quiméricas e análogos de ácido nucleico tais como PNA); e compostos orgânicos ou inorgânicos.
Deve entender-se que "TGF-beta" inclui qualquer membro conhecido ou novo da superfamília TGF-beta, que também inclui proteínas morfogénicas ósseas (BMP).
Deve entender-se que "receptor de TGF-beta" refere-se ao receptor específico para um membro particular da superfamília TGF-beta (incluindo proteínas morfogénicas ósseas (BMP)).
Deve entender-se que "proteína de ligação de TGF-beta" refere-se a uma proteína com afinidade de ligação específica para um membro particular ou subconjunto de membros da superfamília TGF-beta (incluindo proteínas morfogénicas ósseas (BMP)). Os exemplos específicos de proteínas de ligação de TGF-beta incluem as proteínas codificadas por sequência ID N° 1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 e 101.
Deve entender-se que a inibição da "ligação da proteína de ligação de TGF-beta à família de proteínas TGF-beta e proteínas morfogénicas ósseas (BMP)" se refere a moléculas que permitem a activação de TGF-beta ou proteínas morfogénicas ósseas (BMP), ou permitem a ligação de membros da família TGF- beta incluindo proteínas morfogénicas ósseas (BMP) aos seus receptores respectivos, por remoção ou prevenção de ligação de 9 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ TGF-beta à proteína de ligação de TGF. Tal inibição pode ser conseguida, por exemplo, por moléculas que inibem a ligação da proteína de ligação de TGF-beta a membros específicos da superfamília TGF-beta. "Vector" refere-se a um conjunto que é capaz de dirigir a expressão da proteína pretendida. 0 vector deve incluir elementos de promotor de transcrição que estão ligados operacionalmente ao(s) gene(s) de interesse. 0 vector pode ser composto por ácidos desoxirribonucleicos ("ADN"), ácidos ribonucleicos ("ARN") ou uma combinação dos dois (e.g., uma quimera ADN-ARN). Opcionalmente, o vector pode incluir uma sequência de poliadenilação, um ou mais locais de restrição, bem como um ou mais marcadores seleccionáveis, tal como neomicina fosfotransferase ou higromicina fosfotransferase. Adicionalmente, dependendo da célula hospedeira seleccionada e do vector utilizado, podem também incorporar-se nos vectores aqui descritos outros elementos genéticos tais como uma origem de replicação, locais de restrição de ácido nucleico adicionais, facilitadores, sequências que conferem indutibilidade de transcrição e marcadores seleccionáveis.
Uma "molécula de ácido nucleico isolada" é uma molécula de ácido nucleico que não está integrada no ADN genómico de um organismo. Por exemplo, uma molécula de ADN que codifica uma proteína de ligação de TGF que foi separada do ADN genómico de uma célula eucariótica é uma molécula de ADN isolada. Outro exemplo de uma molécula de ácido nucleico isolada é uma molécula de ácido nucleico sintetizada quimicamente que não está integrada no genoma de um organismo. A molécula de ácido nucleico isolada pode ser ADN genómico, ADNc, ARN ou composta pelo menos em parte por análogos de ácido nucleico.
Um "polipéptido isolado" é um polipéptido que está essencialmente isento de componentes celulares contaminantes, tais como hidratos de carbono, lípidos ou outras impurezas proteáceas associadas com o polipéptido na natureza. De preferência, tais polipéptidos isolados são pelo menos cerca de 90% puros, com maior preferência pelo menos cerca de 95% puros e com a maior preferência pelo menos cerca de 99% puros. Em determinadas concretizações, uma determinada preparação de proteína contém um polipéptido isolado caso apareça 10 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ nominalmente como uma única banda num gel de SDS-PAGE com coloração com azul de Coomassie. A expressão "isolado" quando se refere a moléculas orgânicas (e.g., moléculas orgânicas pequenas) significa que os compostos são mais do que 90% puros utilizando métodos que são bem conhecidos na especialidade (e.g., RMN, ponto de fusão). "Esclerosteose" é uma expressão que foi aplicada por Hansen (1967) (Hansen, H. G., Sklerosteose. em: Opitz, H.; Schmid, F., Handbuch der Kinderheilkunde. Berlin: Springer (pub.) 61967. p. 351-355) a uma doença semelhante a hiperostose cortical generalizada de van Buchem, mas possivelmente diferindo na aparência radiológica das alterações ósseas e na presença de sindactilia cutânea assimétrica do dedo indicador e médio em muitos casos. O maxilar tem uma aparência invulgarmente quadrada nesta doença. "Anticorpos humanizados" são proteínas recombinantes nas quais regiões determinantes de complementaridade de anticorpos monoclonais murinos ou de outros animais não humanos foram transferidas de cadeias pesada e leve variáveis da imunoglobulina murina ou de outro animal não humano para um domínio variável humano.
Tal como aqui utilizado, um "fragmento de anticorpo" é uma parte de um anticorpo tal como F(ab')2/ F(ab)2, Fab', Fab e semelhantes. Independentemente da estrutura, um fragmento de anticorpo liga-se ao mesmo antigénio que é reconhecido pelo anticorpo intacto. Por exemplo, um fragmento de anticorpo monoclonal anti-proteína de ligação de TGF-beta liga-se a um epítopo de proteína de ligação de TGF-beta. A expressão fragmento de anticorpo ou fragmento de ligação de antigénio também inclui qualquer proteína concebida racionalmente sintética ou geneticamente que actua como um anticorpo por ligação a um antigénio específico formando um complexo. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo incluem fragmentos isolados que consistem da região variável de cadeia leve, fragmentos "Fv" que consistem das regiões variáveis das cadeias pesada e leve, moléculas de polipéptido de cadeia simples recombinantes nas quais as regiões variáveis leve e pesada estão ligadas por um ligante peptídico ("proteína sFv") 11 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ e unidades de reconhecimento mínimas que consistem de resíduos de aminoácidos que mimetizam a região hipervariável.
Um "marcador detectável" é uma molécula ou átomo que pode ser conjugado a uma parte de polipéptido, tal como uma parte de anticorpo ou uma parte de ácido nucleico, para produzir uma molécula útil para diagnóstico. Os exemplos de marcadores detectáveis incluem agentes quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iões paramagnéticos, enzimas e outras partes marcadoras.
Tal como aqui utilizado, um "imunoconjugado" é uma molécula compreendendo um anticorpo anti-proteína de ligação de TGF-beta ou um fragmento de anticorpo e um marcador detectável ou uma molécula efectora. De preferência, um imunoconjugado após conjugação tem aproximadamente a mesma capacidade de ligar proteína de ligação de TGF-beta, ou uma capacidade apenas ligeiramente menor, do que antes de conjugação.
Abreviaturas: TGF-beta - "Factor beta de crescimento por transformação"; TGF-bBP - "proteína de ligação de factor beta de crescimento por transformação" (uma TGF-bBP representativa denomina-se "H. Beer") ; BMP - "proteína morfogénica óssea"; PCR- "reacção de polimerização em cadeia"; RT-PCR - Processo de PCR no qual primeiramente se transcreve ARN para ADN utilizando transcriptase reversa (RT); ADNc - qualquer ADN preparado por cópia de uma sequência de ARN para a forma de ADN.
Produção de anticorpos para proteínas de ligaçao de TGF- beta 0 presente invento proporciona anticorpos que se ligam especificamente a esclerostina, tal como aqui descrito detalhadamente. Podem obter-se anticorpos para proteína de ligação a TGF-beta, por exemplo, utilizando o produto de um vector de expressão como um antigénio. Podem também preparar-se anticorpos que se ligam especificamente a esclerostina por utilização de péptidos derivados da sequência de polipéptido esclerostina de SEQ ID NO: 46. Outras sequências de polipéptido esclerostina aqui apresentadas são SEQ ID NO: 2, 12 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 65. São particularmente úteis anticorpos anti-proteina de ligação a TGF-beta que se "ligam especificamente" a proteina de ligação a TGF-beta de sequência ID No 46 mas não a outras proteínas de ligação a TGF-beta tais como Dan, Cerberus, SCGF ou Gremlin. Os anticorpos do presente invento (incluindo seus fragmentos e derivados) podem ser policlonais ou, especialmente, monoclonais. O anticorpo pode pertencer a qualquer classe de imunoglobulina e pode ser por exemplo uma IgG, (incluindo isotipos de IgG, que para anticorpos humanos são conhecidos na especialidade como anticorpo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4); IgE; IgM; ou IgA. Um anticorpo pode ser obtido de aves de capoeira ou de mamíferos, de preferência por exemplo de um murino, rato, humano ou outro primata.
Podem preparar-se anticorpos policlonais para proteína de ligação a TGF-beta recombinante utilizando métodos bem conhecidos dos peritos na especialidade (consultar, por exemplo, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera" em Immunochemical Protocols (Manson, ed.), páginas 1-5 (Humana Press 1992); Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies" em DNA Cloning 2: Expression Systems, 2a edição, Glover et al. (ed.), página 15 (Oxford University Press 1995)). Embora tipicamente os anticorpos policlonais sejam desenvolvidos em animais tais como ratos, ratinhos, coelhos, cabras ou ovelhas, também se pode derivar um anticorpo anti-proteina de ligação a TGF-beta do presente invento a partir de um anticorpo de primata sub-humano. Podem encontrar-se técnicas gerais para desenvolver anticorpos úteis em diagnóstico e em terapia em babuínos, por exemplo, em Goldenberg et al., publicação de patente internacional No. WO 91/11465 (1991) e em Losman et al., Int. J. Câncer 46:310, 1990 . O anticorpo deve compreender pelo menos um domínio de região variável. O domínio de região variável pode ter qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e em geral compreenderá pelo menos uma sequência de aminoácidos hipervariável responsável pela ligação de antigénio inserida numa sequência de esqueleto. Em termos gerais, o domínio de região variável (V) pode ser qualquer arranjo adequado de 13 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ domínios variáveis de cadeia pesada (VH) e/ou leve (VL) de imunoglobulina. Assim por exemplo o domínio de região V pode ser monomérico e ser um domínio VH ou VL em que estes são capazes de ligar independentemente antigénio com afinidade aceitável. Alternativamente, o domínio de região V pode ser dimérico e conter dímeros VH-VH, VH-VL ou VL-VL nos quais as cadeias VH e VL estão associadas não covalentemente (doravante abreviadas como Fv) . No entanto, quando pretendido, as cadeias podem estar acopladas covalentemente quer directamente, por exemplo através de uma ligação dissulfureto entre os dois domínios variáveis, ou através de um ligante, por exemplo um ligante peptídico, para formar um domínio em cadeia simples (doravante abreviado como scFv) . 0 domínio de região variável pode ser qualquer domínio variável de ocorrência natural ou uma sua versão concebida racionalmente. Versão concebida racionalmente significa um dominio de região variável que foi criado utilizando técnicas de engenharia de ADN recombinante. Tais versões concebidas racionalmente incluem as criadas por exemplo a partir de regiões variáveis de anticorpo natural por inserções, deleções ou alterações nas sequências de aminoácidos dos anticorpos naturais. Os exemplos específicos deste tipo incluem os domínios de região variável concebidos racionalmente contendo pelo menos uma CDR e opcionalmente um ou mais aminoácidos de esqueleto de um anticorpo e o restante do domínio de região variável de um segundo anticorpo. 0 domínio de região variável pode estar ligado covalentemente por um aminoácido C-terminal a pelo menos um outro domínio de anticorpo ou um seu fragmento. Assim, por exemplo quando está presente um dominio VH no dominio de região variável, este pode ser ligado a um domínio CH1 de imunoglobulina ou um seu fragmento. Similarmente, um domínio VL pode estar ligado a um domínio CK ou um seu fragmento.
Desta forma, por exemplo, o anticorpo pode ser um fragmento Fab em que o domínio de ligação de antigénio contém domínios VH e VL associados ligados covalentemente aos seus terminais C a um dominio CHI e CK, respectivamente. 0 dominio CHI pode ser estendido com mais aminoácidos, por exemplo para proporcionar um domínio de região de dobra tal como encontrado num 14 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ fragmento Fab' ou para proporcionar domínios adicionais, tais como domínios de anticorpo CH2 e CH3.
Outra forma de um fragmento de anticorpo é um péptido que codifica para uma única região determinante de complementaridade (CDR). Os péptidos CDR ("unidades de reconhecimento mínimas") podem ser obtidos por construção de genes que codificam a CDR de um anticorpo de interesse. Tais genes são preparados, por exemplo, por utilização da reacção de polimerização em cadeia para sintetizar a região variável a partir de ARN de células que produzem anticorpo (consultar, por exemplo, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies" em Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinicai Application, Ritter et al. (ed.), página 166 (Cambridge University Press 1995); e Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" em Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Birch et al., (ed.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)) .
Em geral, os anticorpos para utilização no invento podem ser monoclonais (preparados por procedimentos convencionais de imunização e fusão celular) ou no caso de fragmentos, derivados destes por quaisquer técnicas químicas padrão adequadas tal como redução ou clivagem enzimática e/ou digestão, por exemplo por tratamento com pepsina. Mais especificamente podem gerar-se anticorpos monoclonais anti-proteína de ligação a TGF-beta utilizando uma variedade de técnicas. Podem obter-se anticorpos monoclonais de roedor para antigénios específicos por métodos conhecidos dos peritos na especialidade (consultar, por exemplo, Kohler et al., Nature 256:495, 1975; e Coligan et al. (ed.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan"]; Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli" em DNA Cloning 2: Expression Systems, 2a edição, Glover et al. (ed.), página 93 (Oxford University Press 1995)).
Sucintamente, os anticorpos monoclonais podem ser obtidos por injecção de ratinhos com uma composição compreendendo um produto génico de proteína de ligação a TGF-beta, verificando 15 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ a presença de produção de anticorpo por remoção de uma amostra de soro, remoção do baço para obter linfócitos B, fundindo os linfócitos B com células de mieloma para produzir hibridomas, clonando os hibridomas, seleccionando clones positivos para produzir anticorpos para o antigénio, cultivando os clones para produzir anticorpos para o antigénio e isolando os anticorpos das culturas de hibridoma.
Além disso, um anticorpo anti-proteina de ligação a TGF-beta do presente invento pode ser derivado de um anticorpo monoclonal humano. Os anticorpos monoclonais humanos são obtidos a partir de ratinhos transgénicos que foram modificados racionalmente para produzir anticorpos humanos específicos em resposta a provocação antigénica. Nesta técnica, introduzem-se elementos de locais de cadeia pesada e leve humanas em estirpes de ratinhos derivadas de linhas celulares estaminais embrionárias que contêm rupturas alvo dos locais de cadeia pesada e cadeia leve endógenos. Os ratinhos transgénicos podem sintetizar anticorpos humanos específicos para antigénios humanos e os ratinhos podem ser utilizados para produzir hibridomas que excretam anticorpo humano. Os métodos para obter anticorpos humanos a partir de ratinhos transgénicos são descritos, por exemplo, por Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg et al., Nature 368:856, 1994; e Taylor et al., Int. Immun. 6:519, 1994.
Os anticorpos monoclonais podem ser isolados e purificados de culturas de hibridoma através de uma variedade de técnicas bem estabelecidas. Tais técnicas de isolamento incluem cromatografia de afinidade com proteína A Sepharose, cromatografia de exclusão de tamanho e cromatografia de permuta iónica (consultar, por exemplo, Coligan nas páginas 2.7.1-2.7.12 e páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)" em Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)) .
Para determinadas utilizações, pode ser desejável preparar fragmentos de anticorpos anti-proteina de ligação a TGF-beta. Tais fragmentos de anticorpo podem ser obtidos, por exemplo, por hidrólise proteolítica do anticorpo. Os fragmentos de anticorpo podem ser obtidos por digestão com pepsina ou 16 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ papaína de anticorpos completos por métodos convencionais. A titulo ilustrativo, os fragmentos de anticorpo podem produzir-se por clivagem enzimática de anticorpos com pepsina para proporcionar um fragmento 5S denominado F(ab')2· Este fragmento pode ser clivado adicionalmente utilizando um agente redutor de tiol para produzir fragmentos monovalentes 3.5S Fab'. Opcionalmente, a reacção de clivagem pode ser efectuada utilizando um grupo bloqueador para os grupos sulfidrilo que resultam da clivagem das ligações dissulfureto. Alternativamente, uma clivagem enzimática utilizando pepsina produz dois fragmentos Fab monovalentes e um fragmento Fc directamente. Estes métodos são descritos, por exemplo, por Goldenberg, patente U.S. N° 4 331 647, Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230, 1960, Porter, Biochem. J. 73:119, 1959, Edelman et al., em Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967) e por Coligan nas páginas 2.8.1-2.8.10 e 2.10.-2.10.4.
Também podem ser utilizados outros métodos para clivar anticorpos, tal como separação das cadeias pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadeia leve-pesada, clivagem adicional de fragmentos ou outras técnicas enzimáticas, químicas ou genéticas, desde que os fragmentos se liguem ao antigénio que é reconhecido pelo anticorpo intacto.
Alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo recombinante ou concebido racionalmente obtido por utilização de técnicas de ADN recombinante envolvendo a manipulação e re-expressão de ADN que codifica regiões variáveis e/ou constantes de anticorpo. Tal ADN é conhecido e/ou encontra-se facilmente disponível a partir de bibliotecas de ADN incluindo por exemplo bibliotecas de fago-anticorpo (consultar Chiswell, D J e McCafferty, J. Tibtech. 1_0 80-84 (1992)) ou quando se pretender pode ser sintetizado. Podem utilizar-se procedimentos de biologia molecular e/ou químicos padrão para sequenciar e manipular o ADN, por exemplo, para introduzir codões para criar resíduos de cisteína, para modificar, adicionar ou deletar outros aminoácidos ou domínios como pretendido.
Podem preparar-se um ou mais vectores de expressão replicáveis contendo o ADN que codifica uma região variável 17 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ e/ou constante e utilizarem-se para transformar uma linha celular adequada, e.g. uma linha celular de mieloma não produtora, tal como uma linha NSO de ratinho ou uma bacteriana, tal como E.coli, em que ocorrerá produção do anticorpo. De modo a obter transcrição e tradução eficazes, a sequência de ADN em cada vector deve incluir sequências de regulação adequadas, particularmente uma sequência de promotor e lider ligadas operacionalmente a uma sequência de domínio variável. São geralmente bem conhecidos métodos específicos para produzir anticorpos desta forma e podem ser utilizados rotineiramente. Por exemplo, descrevem-se procedimentos básicos de biologia molecular em Maniatis et al (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989); a sequenciação de ADN pode ser efectuada tal como descrito em Sanger et al (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7_4: 5463, (1977)) e o manual de sequenciação de Amersham International plc; pode efectuar-se mutagénese dirigida ao local de acordo com o método de Kramer et al. (Nucleic Acids Res. 1_2, 9441, (1984)); o manual de Anglian Biotechnology Ltd; Kunkel Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-92 (1985); Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154:367-82 (1987). Adicionalmente, muitas publicações descrevem detalhadamente técnicas adequadas para a preparação de anticorpos por manipulação de ADN, criação de vectores de expressão e transformação de células adequadas, por exemplo tal como revisto por Mountain A e Adair, J R em Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, Μ P, 1_0, Capítulo 1, 1992, Intercept, Andover, UK) e em fascículo de patente internacional N° WO 91/09967.
Em determinadas concretizações, o anticorpo de acordo com o invento pode ter uma ou mais moléculas efectoras ou repórter ligadas a si e o invento estende-se a tais proteínas modificadas. Uma molécula repórter pode ser uma parte detectável ou marcador tal como uma enzima, um agente citotóxico ou outra molécula repórter, incluindo um corante, radionuclídeo, grupo luminescente, grupo fluorescente ou biotina ou semelhantes. A imunoglobulina ou seu fragmento específico de proteína de ligação a TGF-beta pode ser marcada radioquimicamente para aplicações em diagnóstico ou terapêuticas. São conhecidas na especialidade técnicas para marcar radioquimicamente anticorpos. Consultar, e.g., Adams 1998 In Vivo 12:11-21; Hiltunen 1993 Acta Oncol. 32:831-9. As 18 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ aplicações terapêuticas são descritas mais detalhadamente em seguida e podem incluir a utilização de anticorpo (ou seu fragmento) específico para proteína de ligação a TGF-beta em conjunção com outros agentes terapêuticos. As moléculas efectoras ou repórter podem ser ligadas ao anticorpo através de qualquer cadeia lateral de aminoácido disponível, aminoácido terminal ou, quando presentes, grupos funcionais de hidrato de carbono localizados no anticorpo, desde que a ligação ou o processo de ligação não prejudique as propriedades de ligação e a utilidade da molécula. Os grupos funcionais específicos incluem, por exemplo, qualquer grupo amino, imino, tiol, hidroxilo, carboxilo ou aldeído livre. A ligação do anticorpo e da(s) molécula(s) efectora(s) e/ou repórter pode ser conseguida através de tais grupos e de um grupo funcional adequado nas moléculas efectoras ou repórter. A ligação pode ser directa ou indirecta através de grupos de espaçamento ou em ponte.
As moléculas efectoras incluem, por exemplo, agentes antineoplásicos, toxinas (tais como toxinas activas enzimaticamente de origem bacteriana (tal como exotoxina A de P. aeruginosa) ou vegetal e seus fragmentos (e.g. ricina e seus fragmentos; gelonina vegetal, briodina de Bryonia dioica ou semelhantes. Consultar, e.g., Thrush et al., 1996 Annu. Rev. Immunol. 14:49-71; Frankel et al., 1996 Câncer Res. 56:926-32); proteínas activas biologicamente, por exemplo enzimas; ácidos nucleicos e seus fragmentos tais como ADN, ARN e seus fragmentos; polímeros de ocorrência natural e sintéticos (e.g., polissacarídeo e polímeros de polialcileno tal como poli(etilenoglicol) e seus derivados); radionuclídeos, particularmente iodeto radioactivo; e metais quelatados. Os grupos repórter adequados incluem metais quelatados, compostos fluorescentes ou compostos que podem ser detectados por espectroscopia de RMN ou ESR. São grupos efectores particularmente úteis caliqueamicina e seus derivados (consultar, por exemplo, fascículos de patentes da África do Sul N° 85/8794, 88/8127 e 90/2839). São conhecidas na especialidade muitas outras toxinas, incluindo agentes quimioterapêuticos, agentes anti-mitóticos, antibióticos, indutores de apoptose (ou "apoptogénios", consultar, e.g., Green e Reed, 1998, Science 281:1309-1312), 19 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ ou semelhantes e pretende-se que os exemplos aqui apresentados sejam apenas ilustrativos sem limitar o âmbito e espirito do invento. Os agentes antineoplásicos específicos incluem agentes citotóxicos e citostáticos, por exemplo agentes alquilantes, tais como mostardas de azoto (e.g., clorambucil, melfalan, mecloretamina, ciclofosfamida ou mostarda de uracilo) e seus derivados, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida, bussulfano ou cisplatina; anti-metabolitos, tais como metotrexato, fluorouracilo, floxuridina, citarabina, mercaptopurina, tioguanina, ácido fluoroacético ou ácido fluorocitrico, antibióticos, tais como bleomicinas (e.g., sulfato de bleomicina), doxorrubicina, daunorrubicina, mitomicinas (e.g., mitomicina C) , actinomicinas (e.g., dactinomicina) plicamicina, caliqueamicina e seus derivados, ou esperamicina e seus derivados; inibidores mitóticos, tais como etoposídeo, vincristina ou vinblastina e seus derivados; alcaloides, tais como elipticina; polióis tais como taxicina-I ou taxicina-II; hormonas, tais como androgénios (e.g., dromostanolona ou testolactona), progestinas (e.g., acetato de megestrol ou acetato de medroxiprogesterona), estrogénios (e.g., difosfato de dimetilestilbestrol, fosfato de poliestradiol ou fosfato de estramustina) ou anti-estrogénios (e.g., tamoxifeno); antraquinonas, tal como mitoxantrona, ureias, tal como hidroxiureia; hidrazinas, tal como procarbazina; ou imidazóis, tal como dacarbazina.
Os metais quelatados incluem quelatos de metais dipositivos ou tripositivos com um número de coordenação de 2 a 8, inclusive. Os exemplos específicos de tais metais incluem tecnécio (Tc), rénio (Re), cobalto (Co), cobre (Cu), ouro (Au), prata (Ag), chumbo (Pb), bismuto (Bi), índio (In), gálio (Ga), ítrio (Y) , térbio (Tb), gadolínio (Gd) e escândio (Sc). Em geral o metal é de preferência um radionuclídeo. Os radionuclídeos específicos incluem 99mTc, 186Re, 188Re, 58Co, 60
Co, 67Cu, 195 68
Ga, °°Y, 90Y,
Au, 160 199 -j 110-,
Au, Ag, Tb, i53Gd e 47Sc. 203
Pb, 206
Bi, 207
Bi, 111
In, 67
Ga, e seus O metal quelatado pode ser por exemplo um dos tipos de metais anteriores quelatado com qualquer agente quelante polidentado adequado, por exemplo poliaminas acíclicas ou cíclicas, poliéteres, (e.g., éteres em coroa 20 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ derivados); poliamidas; porfirinas; e derivados carbociclicos. Em geral, o tipo de agente quelante dependerá do metal utilizado. No entanto, um grupo particularmente útil de agentes quelantes em conjugados de acordo com o invento compreende poliaminas aciclicas e cíclicas, especialmente ácidos poliaminocarboxílicos, por exemplo ácido dietilenotriaminapentacético e seus derivados e aminas macrocíclicas, tais como derivados tri-aza e tetra-aza cíclicos (por exemplo, tal como descrito no fascículo de patente internacional N° WO 92/22583) e poliamidas, especialmente desferrioxamina e seus derivados.
Quando se utiliza um grupo tiol no anticorpo como ponto de ligação, tal pode ser conseguido através de reacção com um grupo tiol reactivo presente na molécula efectora ou repórter. Os exemplos de tais grupos incluem um ácido ou éster á-halocarboxílico, tal como iodoacetamida, uma imida, tal como maleimida, uma vinilsulfona ou um dissulfureto. Estes e outros procedimentos de ligação adequados são descritos geral e mais especificamente nos fascículos de patentes internacionais N° WO 93/06231, WO 92/22583, WO 90/091195 e WO 89/01476. O presente invento proporciona anticorpos que se ligam especificamente a um polipéptido esclerostina e utilizações para tais anticorpos, tal como descritas anteriormente. A presente divulgação também proporciona imunogénios de polipéptido esclerostina que podem ser utilizados para gerar e analisar estes anticorpos. Os anticorpos podem ser úteis para bloquear ou impedir a ligação de um polipéptido esclerostina, que é uma proteína de ligação a TGF-beta, a um ligando, em particular uma proteína morfogénica óssea e pode também bloquear ou impedir a ligação do polipéptido esclerostina a um ou mais outros ligandos.
Os anticorpos do presente invento são úteis para aumentar o teor mineral e a densidade mineral óssea, melhorando assim numerosas condições que resultam em perda de teor mineral ósseo, incluindo por exemplo, doença, predisposição genética, acidentes que resultam em perda da utilização de osso (e.g., devido a fractura), terapias que afectam a reabsorção de osso ou que matam as células de formação de osso e envelhecimento normal. 21 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
Tal como indicado anteriormente, são particularmente úteis os anticorpos anti-proteína de ligação a TGF-beta que se "ligam especificamente" a proteína de ligação a TGF-beta de SEQ ID NO: 46, mas não a outras proteínas de ligação a TGF-beta, tais como Dan, Cerberus, SCGF ou Gremlin. No contexto do presente invento, entende-se que anticorpos incluem anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, imunoglobulinas em cadeia simples, quiméricas ou enxertadas em CDR e seus fragmentos de anticorpo (e.g., Fab, Fd, Fab' e F(ab')2, regiões variáveis Fv ou regiões determinantes de complementaridade). Entende-se que os anticorpos são específicos contra proteína de ligação a TGF-beta caso se liguem com uma Ka maior ou igual a 107 M-1, de preferência maior ou igual a 108 M_1 e não se liguem a outras proteínas de ligação a TGF-beta ou se liguem com uma Ka menor ou igual a ΙΟ6 1ΝΓ1. A afinidade de um anticorpo para o seu antigénio parceiro é usualmente expressa como uma constante de dissociação KD e um anticorpo anti-SOST liga-se especificamente a um membro da família TGF-beta caso se ligue com uma KD menor ou igual a cerca de 1CT5 M, com maior preferência menor ou igual a cerca de 10“6 M, ainda com maior preferência menor ou igual a 10~7 M e ainda com maior preferência menor ou igual a ΙΟ-8 Μ. A afinidade de um anticorpo monoclonal ou parceiro de ligação, bem como a inibição de ligação pode ser facilmente determinada por um perito na espacialidade (consultar Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sei. 51:660-672, 1949). A afinidade pode também ser determinada por ressonância plasmónica de superfície (SPR; BIAcore, Biosensor, Piscataway, N.J.). Para ressonância plasmónica de superfície, as moléculas alvo são imobilizadas numa fase sólida e expostas a ligandos numa fase móvel ao longo de uma célula de fluxo. Caso ocorra ligação do ligando ao alvo imobilizado, o índice de refraeção local muda, levando a uma alteração do ângulo de SPR, que pode ser monitorizada em tempo real por detecção de alterações na intensidade de luz reflectida. As velocidades de alteração do sinal de SPR podem ser analisadas para obter constantes de velocidade aparentes para as fases de associação e dissociação da reacção de ligação. A razão destes valores dá a constante de equilíbrio aparente (afinidade) (consultar, e.g., Wolff et al., Câncer Res. 53:2560-65 (1993)) . 22 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
Um anticorpo de acordo com o presente invento pode pertencer a qualquer classe de imunoqlobulina, por exemplo IgG, IgE, IgM, IgD ou IgA e pode ser de qualquer um dos diferentes isotipos que podem constituir uma classe (tal como IgGl IgG2, IgG3 e IgG4 da classe de IgG humana) . Pode ser obtido ou derivado de um animal, por exemplo, ave de capoeira (e.g., galinha) e mamíferos, que incluem ratinho, rato, hamster, coelho ou outro roedor, uma vaca, cavalo, ovelha, cabra, camelo, humano ou outro primata, não se lhes limitando.
Podem ser utilizados métodos bem conhecidos na especialidade para gerar anticorpos, anti-soros policlonais ou anticorpos monoclonais que são específicos para a proteína de ligação a TGF-beta SOST. Os anticorpos também podem ser produzidos como imunoglobulinas (Ig) ou fragmentos de Ig modificados por engenharia genética concebidos para apresentarem propriedades desejáveis. Por exemplo, a título ilustrativo e sem limitação, os anticorpos podem incluir uma IgG recombinante que é uma proteína de fusão quimérica com pelo menos um domínio de região variável (V) de uma primeira espécie de mamífero e pelo menos um domínio de região constante de uma segunda espécie de mamífero diferente. Mais usualmente, um anticorpo quimérico tem sequências de região variável murinas e sequências de região constante humanas. Tal imunoglobulina quimérica murina/humana pode ser "humanizada" por enxerto de regiões determinantes de complementaridade (CDR) derivadas de um anticorpo murino, que conferem especificidade de ligação para um antigénio, em regiões de esqueleto da região V derivadas de humano e regiões constantes derivadas de humano. Os fragmentos destas moléculas podem ser gerados por digestão proteolítica ou, opcionalmente, por digestão proteolítica seguida por redução suave das ligações dissulfureto e alquilação. Alternativamente, tais fragmentos também podem ser gerados por técnicas de engenharia genética recombinante.
Determinados anticorpos preferidos são os anticorpos que inibem ou bloqueiam uma actividade da proteína de ligação a TGF-beta num ensaio in vitro, tal como aqui descrito. As propriedades de ligação de um anticorpo a uma proteína de ligação a TGF-beta podem em geral ser avaliadas utilizando métodos de imunodetecção incluindo, por exemplo, um ensaio de 23 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ imuno-adsorção ligada a enzima (ELISA), imunoprecipitação, imuno-transferência, imuno-electroforese em contracorrente, radio-imuno-ensaios, ensaios de transferência "dot", ensaios de inibição ou competição e semelhantes, que podem ser facilmente efectuados por um perito na especialidade (consultar, e.g., patentes U.S. N° 4 376 110 e 4 486 530; Harlow et al. , Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)).
Um imunogénio pode ser constituído por células que expressam uma proteína de ligação a TGF-beta, polipéptidos de ligação a TGF-beta purificados ou parcialmente purificados ou suas variantes ou fragmentos (i.e., péptidos) ou péptidos derivados de uma proteína de ligação a TGF-beta. Tais péptidos podem ser gerados por clivagem proteolítica de um polipéptido maior, por metodologias moleculares recombinantes ou podem ser sintetizados quimicamente. Por exemplo, proporcionam-se aqui as sequências de ácido nucleico que codificam proteínas de ligação a TGF-beta, de modo que os peritos na especialidade podem preparar rotineiramente proteínas de ligação a TGF-beta para utilizar como imunogénios. Os péptidos podem ser sintetizados quimicamente por métodos tais como aqui descritos e conhecidos na especialidade. Alternativamente, os péptidos podem ser gerados por clivagem proteolítica de uma proteína de ligação a TGF-beta e os péptidos individuais isolados por métodos conhecidos na especialidade tal como electroforese em gel de poliacrilamida ou qualquer de vários métodos de cromatografia líquida ou outros métodos de separação. Os péptidos úteis como imunogénios tipicamente podem ter uma sequência de aminoácidos com pelo menos 4 ou 5 aminoácidos consecutivos de uma sequência de aminoácidos de proteína de ligação a TGF-beta tal como as aqui descritas e preferentemente têm pelo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 19 ou 20 aminoácidos consecutivos de uma proteína de ligação a TGF-beta. Determinados outros péptidos imunogénios preferidos compreendem pelo menos 6 mas não mais de 12 ou mais aminoácidos consecutivos de uma sequência de proteína de ligação a TGF-beta e outros péptidos imunogénios preferidos compreendem pelo menos 21 mas não mais de 50 aminoácidos consecutivos de um polipéptido SOST. Outros péptidos imunogénios preferidos compreendem 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-50 ou qualquer número inteiro de aminoácidos entre 21 e 24 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ 100, inclusive, consecutivos e entre 100 e 190 aminoácidos consecutivos de uma sequência de proteína de ligação a TGF-beta .
Tal como aqui divulgado, os anticorpos policlonais podem ser facilmente gerados por um perito na especialidade a partir de uma variedade de animais de sangue quente, tais como cavalos, vacas, várias aves de capoeira, coelhos, ratinhos, ovelhas, cabras, babuínos ou ratos. Tipicamente utiliza-se a proteína de ligação a TGF-beta ou seu péptido único de 13-20 aminoácidos tal como aqui descrito (de preferência conjugado a hemocianina de lapa gigante por reticulação com glutaraldeído) para imunizar o animal através de injecções intraperitoneais, intramusculares, intra-oculares, intradérmicas ou subcutâneas, conjuntamente com um adjuvante tal como adjuvante completo ou incompleto de Freund ou o sistema de adjuvante de Ribi (Corixa Corporation, Seattle, WA) . Consultar também, e.g., Harlow et al., supra. Em geral, após a primeira injecção os animais recebem uma ou mais imunizações de reforço de acordo com um calendário preferido que pode variar de acordo, entre outros, o antigénio, o adjuvante (caso exista) e/ou a espécie animal específica. A resposta imunitária pode ser monitorizada por sangramento periódico do animal e preparando e analisando soros num imuno-ensaio, tal como uma ELISA ou um ensaio de difusão Ouchterlony ou semelhantes para determinar o título de anticorpo específico. Os anti-soros policlonais particularmente preferidos darão um sinal detectável num destes ensaios, tal como uma ELISA, que de preferência é pelo menos três vezes maior do que a linha de base. Uma vez que o título do animal tenha atingido um patamar em termos da sua reactividade com a proteína, podem obter-se quantidades maiores de anti-soro facilmente por sangramentos semanais ou por exsanguinação do animal.
Os anticorpos policlonais que se ligam especificamente à proteína ou péptido de ligação a TGF-beta podem então ser purificados de tais anti-soros, por exemplo, por cromatografia de afinidade utilizando proteína A. Alternativamente, pode efectuar-se cromatografia de afinidade em que a proteína ou péptido de ligação a TGF-beta ou um anticorpo específico para uma região constante de Ig da espécie específica de animal imunizado é imobilizado num suporte sólido adequado. 25 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
Os anticorpos para utilização no invento incluem anticorpos monoclonais que são preparados por imunização convencional e procedimentos de fusão celular tal como aqui descritos e conhecidos na especialidade. Os anticorpos monoclonais podem ser gerados facilmente utilizando técnicas convencionais (consultar, e.g., Kohler et al., Nature 256:495, 1975; Coligan et al. (ed.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan"]; patentes U.S. N° RE 32 011, 4 902 614, 4 543 439 e 4 411 993; consular também Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn e Bechtol (ed.), 1980 e Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e Lane (ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli" em DNA Cloning 2: Expression Systems, 2a edição, Glover et al. (ed.), página 93 (Oxford University Press 1995)). A partir destes podem derivar-se fragmentos de anticorpo utilizando qualquer técnica padrão adequada tal como digestão proteolítica ou, opcionalmente, por digestão proteolitica (por exemplo, utilizando papaina ou pepsina) seguido por redução suave das ligações dissulfureto e alquilação. Alternativamente, tais fragmentos podem também ser gerados por técnicas de engenharia genética recombinante.
Sucintamente, numa concretização imuniza-se um indivíduo animal, tal como um rato ou ratinho ou hamster, com proteína de ligação a TGF-beta ou uma parte de uma sua região, incluindo péptidos no interior da uma região, tal como aqui descrito. A proteína pode ser misturada com um adjuvante, tal como adjuvante completo ou incompleto de Freund ou adjuvante de Ribi de modo a aumentar a resposta imunitária resultante. Entre uma e três semanas após a imunização inicial o animal pode ser re-imunizado com outra imunização de reforço e ensaiado para reactividade com a proteína utilizando ensaios aqui descritos. Uma vez que o animal tenha atingido um patamar na sua reactividade à proteína injectada, ele é sacrificado e recolhem-se os órgãos que contêm elevados números de células B, tais como o baço e os gânglios linfáticos. Fundem-se as suspensões de células de baço e/ou gânglios linfáticos recolhidos com uma célula de mieloma adequada que é sensibilizada a fármaco de modo a criar um "hibridoma" que 26 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ excreta anticorpo monoclonal. As linhas de mieloma adequadas incluem, por exemplo, NS-0, SP20, NS-1 (ATCC N° TIB 18) e P3X63 - Ag 8.653 (ATCC N° CRL 1580).
As células linfóides (e.g., baço) e as células de mieloma podem ser combinadas durante alguns minutos com um agente de promoção de fusão membranar, tal como polietilenoglicol ou um detergente não iónico e seguidamente plaqueadas a baixa densidade num meio selectivo que suporta o crescimento de células de hibridoma mas não de células de mieloma não fundidas. Após a fusão, as células podem ser colocadas em placas de cultura contendo um meio adequado, tal como RPMI 1640 ou DMEM (Meio Eagles modificado da Dulbecco) (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas) , bem como ingredientes adicionais, tal como soro bovino fetal (FBS, i.e., de Hyclone, Logan, Utah, ou JRH Biosciences). Adicionalmente, o meio deve conter um reagente que permite selectivamente o crescimento de células de baço e de mieloma fundidas tal como HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) . Após cerca de sete dias, as células fundidas ou hibridomas resultantes podem ser rastreados de modo a determinar a presença de anticorpos que são reactivos com proteína de ligação a TGF-beta (dependendo do antigénio utilizado) e que bloqueiam, impedem ou inibem a ligação de proteína de ligação a TGF-beta a um membro da família TGF-beta. São preferidos os hibridomas que produzem anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a esclerostina ou uma sua variante.
Pode utilizar-se uma vasta variedade de ensaios para determinar a presença de anticorpos que são reactivos contra as proteínas do presente invento, incluindo por exemplo imuno-electroforese em contracorrente, radio-imuno-ensaios, radio-imunoprecipitações, ensaio de imuno-absorção enzimática (ELISA), ensaios de transferência "dot", transferências "western", imunoprecipitação, ensaios de inibição ou competição e ensaios em sanduíche (consultar patentes U.S. N° 4 376 110 e 4 486 530; consultar também Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e Lane (ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Os hibridomas são clonados, por exemplo, por clonagem de diluição limitativa ou por isolamento em placa de ágar-ágar macio e reensaiados. Assim, pode isolar- 27 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ se um hibridoma que produz anticorpos reactivos contra a proteína pretendida.
Os anticorpos monoclonais das culturas de hibridoma podem ser isolados de sobrenadantes de culturas de hibridoma. Um método alternativo para a produção de um anticorpo monoclonal murino é injectar as células de hibridoma na cavidade peritoneal de um ratinho singenésico, por exemplo, um ratinho que foi tratado (e.g., iniciado com pristano) para promover a formação de fluido de ascites contendo o anticorpo monoclonal. Os anticorpos monoclonais podem ser isolados e purificados por uma variedade de técnicas bem estabelecidas. Tais técnicas de isolamento incluem cromatografia de afinidade com proteína A Sepharose, cromatografia de exclusão de tamanho e cromatografia de permuta iónica (consultar, por exemplo, Coligan nas páginas 2.7.1-2.7.12 e páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)" em Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Os anticorpos monoclonais podem ser purificados por cromatografia de afinidade utilizando um ligando adequado seleccionado com base nas propriedades específicas do anticorpo (e.g., isotipo de cadeia pesada ou leve, especificidade de ligação, etc.). Os exemplos de um ligando adequado, imobilizado num suporte sólido, incluem proteína A, proteína G, um anticorpo anti-região constante (cadeia leve ou cadeia pesada), um anticorpo anti-idiotipo e uma proteína de ligação a TGF-beta ou seu fragmento ou variante.
Adicionalmente, um anticorpo anti-proteína de ligação a TGF-beta do presente invento pode ser um anticorpo monoclonal humano. Os anticorpos monoclonais humanos podem ser gerados por qualquer de várias técnicas conhecidas dos peritos na especialidade. Tais métodos incluem transformação de células de sangue periférico humano (e.g., contendo linfócitos B) com vírus de Epstein Barr, imunização in vitro de células B humanas, fusão de células de baço de ratinhos transgénicos imunizados contendo inseridos genes de imunoglobulina humana, isolamento de bibliotecas de fagos da região de imunoglobulina V humana, não se lhes limitando, ou outros procedimentos conhecidos na especialidade e baseados na presente divulgação. Por exemplo, podem obter-se anticorpos monoclonais humanos de ratinhos transgénicos que foram modificados racionalmente para 28 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ produzir anticorpos humanos especificos em resposta a provocação antigénica. Descrevem-se métodos para obter anticorpos humanos a partir de ratinhos transgénicos, por exemplo, em Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg et al., Nature 368:856, 1994; Taylor et al., Int. Immun. 6:579, 1994; patente U.S. N° 5 877 397; Bruggemann et al., 19 9 7 Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58; Jakobovits et al., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sei. 764:525-35. Nesta técnica, introduzem-se elementos de locais de cadeia pesada e leve humana em estirpes de ratinhos derivados de linhas celulares estaminais embrionárias que contêm rupturas dirigidas a locais de cadeia pesada e leve endógenos. (Consultar também Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997)). Por exemplo, os transgenes de imunoglobulina humana podem ser construções de mini-gene ou trans-locais em cromossomas artificiais de levedura, que sofrem rearranjo de ADN especifico de células B e hipermutação no tecido linfóide de ratinho. Os anticorpos monoclonais humanos podem ser obtidos por imunização de ratinhos transgénicos, que podem então produzir anticorpos humanos especificos para o antigénio. As células linfóides do ratinho transgénico imunizado podem ser utilizadas para produzir hibridomas que excretam anticorpo humano de acordo com os métodos aqui descritos. Também se podem obter soros policlonais contendo anticorpos humanos a partir de sangue dos animais imunizados.
Outro método para gerar anticorpos monoclonais especificos para proteína de ligação a TGF-beta humana inclui imortalizar células de sangue periférico humanas por transformação com EBV. Consultar, e.g., patente U.S. N° 4 464 456. Tal linha de células B imortalizada (ou linha de células linfoblastóides) que produzem um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a uma proteína de ligação a TGF-beta (ou uma sua variante ou fragmento) pode ser identificada por métodos de imunodetecção tal como aqui proporcionados, por exemplo, uma ELISA, e seguidamente isolados por técnicas de clonagem padrão. A estabilidade da linha de células linfoblastóides que produzem um anticorpo anti-proteína de ligação a TGF-beta pode ser melhorada por fusão da linha celular transformada com um mieloma murino para produzir uma linha de células híbridas ratinho-humano de acordo com métodos conhecidos na especialidade (consultar, e.g., Glasky et al., Hybridoma 29 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ 8:377-89 (1989)). Ainda outro método para gerar anticorpos monoclonais humanos é a imunização in vitro que inclui iniciar células B do baço com antigénio, seguido por fusão das células B iniciadas com um parceiro de fusão hetero-hibrido. Consultar, e.g., Boerner et al., 1991 J. Immunol. 147:86-95.
Em determinadas concretizações, selecciona-se uma célula B que produz um anticorpo anti-SOST e clonam-se as regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada da célula B de acordo com técnicas de biologia molecular conhecidas na especialidade (WO 92/02551; patente US 5 627 052; Babcook et al., Proc. Natl. A cad. Sei. USA 93:7843-48 (1996)) e aqui descritas. De preferência, isolam-se células B de um animal imunizado de uma amostra de baço, gânglios linfáticos ou sangue periférico, seleccionando uma célula que produz um anticorpo que se liga especificamente a SOST. As células B também podem ser isoladas de humanos, por exemplo, de uma amostra de sangue periférico. Os métodos para detectar células B únicas que produzem um anticorpo com a especificidade pretendida são bem conhecidos na especialidade, por exemplo, por formação de placas, separação celular activada por fluorescência, estimulação in vitro seguida por detecção de anticorpo especifico e semelhantes. Os métodos para selecção das células B que produzem anticorpo especifico incluem, por exemplo, preparação de uma suspensão de células únicas de células B em ágar-ágar macio que contém SOST ou um seu fragmento peptídico. A ligação do anticorpo especifico produzido pela célula B ao antigénio resulta na formação de um complexo, que pode ser visível como um imunoprecipitado. Após selecção das células B que produzem o anticorpo específico, podem clonar-se os genes de anticorpo específico por isolamento e amplificação de ADN ou ARNm de acordo com métodos conhecidos na especialidade e aqui descritos.
Para utilizações específicas, podem pretender-se fragmentos de anticorpos anti-proteína de ligação a TGF-beta. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2/- Fab, Fab', Fv, Fc, Fd, mantêm o local de ligação de antigénio do anticorpo completo e portanto ligam-se ao mesmo epítopo. Estes fragmentos de ligação de antigénio derivados de um anticorpo podem ser obtidos, por exemplo, por hidrólise proteolítica do anticorpo, por exemplo, digestão com pepsina ou papaína de anticorpos 30 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ completos de acordo com métodos convencionais. Como exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por clivagem enzimática de anticorpos com pepsina para obter um fragmento 5S denominado F(ab')2· Este fragmento pode ser clivado adicionalmente utilizando um agente redutor de tiol para produzir fragmentos monovalentes 3.5S Fab'. Opcionalmente, a reacção de clivagem pode ser efectuada utilizando um grupo de bloqueamento para os grupos sulfidrilo que resultam da clivagem de ligações dissulfureto. Alternativamente, uma clivagem enzimática utilizando papaína produz dois fragmentos Fab monovalentes e um fragmento Fc directamente. Estes métodos são descritos, por exemplo, por Goldenberg, patente U.S. N° 4 331 647, Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al., em Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967); e por Coligan nas páginas 2.8.1-2.8.10 e 2.10.-2.10.4. Também se podem utilizar outros métodos para clivar anticorpos, tal como separar as cadeias pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadeia leve-pesada (Fd), clivagem adicional de fragmentos, ou outras técnicas enzimáticas, químicas ou genéticas, desde que os fragmentos se liguem ao antigénio que é reconhecido pelo anticorpo intacto.
Um fragmento de anticorpo pode também ser qualquer proteína sintética ou modificada por engenharia genética que actua como um anticorpo porque se liga a um antigénio específico para formar um complexo. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo incluem fragmentos isolados que consistem da região variável de cadeia leve, fragmentos "Fv" que consistem das regiões variáveis das cadeias pesada e leve, moléculas de polipéptido único recombinantes nas quais as regiões variáveis leve e pesada estão ligadas por um ligante peptídico (proteínas scFv) e unidades de reconhecimento mínimas que consistem dos resíduos de aminoácidos que mimetizam a região hipervariável. O anticorpo do presente invento compreende de preferência pelo menos um domínio de região variável. O domínio de região variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e compreenderá geralmente pelo menos uma sequência de aminoácidos hipervariável responsável pela ligação de antigénio e que está adjacente ou em quadro com uma ou mais sequências de esqueleto. Em termos gerais, o domínio de região variável (V) pode estar em qualquer arranjo adequado 31 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ de domínios variáveis de cadeia pesada (VH) e/ou leve (VL) de imunoglobulina. Assim, por exemplo, o domínio de região V pode ser monomérico e ser um domínio VH ou VL, que é capaz de ligar antigénio independentemente com afinidade aceitável. Alternativamente, o domínio da região V pode ser dimérico e conter dímeros VH-VH, VH-VL ou VL-VL. De preferência, o dímero da região V compreende pelo menos uma cadeia VH e pelo menos uma cadeia VL que estão associadas não covalentemente (doravante aqui denominada como Fv) . Caso se pretenda, as cadeias podem ser acopladas covalentemente quer directamente, por exemplo através de uma ligação dissulfureto entre os dois domínios variáveis, ou através de um ligante, por exemplo um ligante peptídico, para formar um Fv de cadeia simples (scFv). 0 domínio de região variável pode ser qualquer domínio variável de ocorrência natural ou uma sua versão concebida racionalmente. Versão concebida racionalmente significa um domínio de região variável que foi criado utilizando técnicas de engenharia de ADN recombinantes. Tais versões concebidas racionalmente incluem as criadas, por exemplo, a partir de uma região variável de anticorpo específico por inserções, deleções ou alterações nas sequências de aminoácidos do anticorpo específico. Os exemplos específicos incluem domínios de região variável concebidos racionalmente contendo pelo menos uma CDR e opcionalmente um ou mais aminoácidos de esqueleto de um primeiro anticorpo e o restante domínio da região variável de um segundo anticorpo. 0 domínio da região variável pode ser ligado covalentemente por um aminoácido C-terminal a pelo menos um outro domínio de anticorpo ou um seu fragmento. Assim, por exemplo, um domínio VH que se encontra presente no domínio da região variável pode estar ligado a um domínio CH1 de imunoglobulina ou um seu fragmento. Similarmente, um domínio VL pode estar ligado a um domínio CK ou um seu fragmento. Desta forma, por exemplo, o anticorpo pode ser um fragmento Fab em que o domínio de ligação de antigénio contém domínios VH e VL associados ligados covalentemente aos seus terminais C de um domínio CHI e CK, respectivamente. 0 domínio CHI pode ser estendido com aminoácidos adicionais, por exemplo para proporcionar uma região de dobra ou uma parte de um domínio de região de dobra, tal como verificado num fragmento Fab', ou 32 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ para proporcionar domínios adicionais, tais como domínios CH2 e CH3 de anticorpo.
Outra forma de um fragmento de anticorpo é um péptido consistindo de uma única região determinante de complementaridade (CDR). Os péptidos CDR ("unidades de reconhecimento mínimas") podem ser obtidos por construção de polinucleótidos que codificam a CDR de um anticorpo de interesse. Tais polinucleótidos são preparados, por exemplo, por utilização da reacção de polimerização em cadeia para sintetizar a região variável utilizando ARNm de células produtoras de anticorpo como um molde (consultar, por exemplo, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies" em Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinicai Application, Ritter et al. (ed.), página 166 (Cambridge University Press 1995); e Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" em Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Birch et al., (ed.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).
Alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo recombinante ou concebido racionalmente obtido pela utilização de técnicas de ADN recombinante envolvendo a manipulação e re-expressão de ADN que codifica regiões variáveis e/ou constantes de anticorpo. Tal ADN é conhecido e/ou encontra-se facilmente disponível de bibliotecas de ADN, incluindo por exemplo bibliotecas de fago-anticorpo (consultar Chiswell e McCafferty, Tibtech. 10:80-84 (1992)) ou caso se pretenda pode ser sintetizado. Também se podem utilizar procedimentos de biologia molecular e/ou química padrão para sequenciar e manipular o ADN, por exemplo, para introduzir codões para criar resíduos de cisteína ou para modificar, adicionar ou deletar outros aminoácidos ou domínios, como pretendido.
Podem também ser gerados de acordo com o presente invento anticorpos quiméricos, específicos para a proteína de ligação a TGF-beta e que incluem anticorpos humanizados. Um anticorpo quimérico tem pelo menos um dominio de região constante derivado de uma primeira espécie de mamífero e pelo menos um domínio de região variável de uma segunda espécie distinta de mamífero (consultar, e.g., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. 33 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
Sei. USA, 81:6851-55 (1984)). Em concretizações preferidas, pode construir-se um anticorpo quimérico por clonagem da sequência de polinucleótidos que codifica pelo menos um domínio de região variável derivado de um anticorpo monoclonal não humano, tal como a região variável derivada de um anticorpo monoclonal de um murino, rato ou hamster, num vector contendo uma sequência de nucleótidos que codifica pelo menos uma região constante humana (consultar, e.g., Shin et al., Methods Enzymol. 178 : 459-76 (1989); Walls et al., Nucleic Acids Res. 21:2921-29 (1993)). Como exemplo, a sequência de polinucleótidos que codifica a região variável da cadeia leve de um anticorpo monoclonal murino pode ser inserida num vector contendo uma sequência de nucleótidos que codifica a sequência da região constante de cadeia leve kapa humana. Num vector independente, a sequência de polinucleótidos que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal pode ser clonada em quadro com sequências que codificam uma região constante de IgG humana, por exemplo, a região constante de IgG humana. A região constante humana específica seleccionada pode depender das funções efectoras pretendidas para o anticorpo específico (e.g., fixação de complemento, ligação de um receptor Fc específico, etc.). De preferência, os vectores construídos serão transfectados para células eucarióticas para expressão estável do anticorpo guimérico. Outro método conhecido na especialidade para gerar anticorpos quiméricos é recombinação homóloga (e.g., patente U.S. N° 5 482 856).
Um anticorpo quimérico não humano/humano pode ser modificado por engenharia genética adicionalmente para criar um anticorpo "humanizado". Tal anticorpo humanizado pode compreender várias CDR derivadas de uma imunoglobulina de uma espécie de mamífero não humano, pelo menos uma região de esqueleto variável humana e pelo menos uma região constante de imunoglobulina humana. As estratégias úteis para conceber anticorpos humanizados podem incluir, por exemplo a título ilustrativo e não se lhe limitando, a identificação de regiões de esqueleto variáveis humanas que são as mais homólogas com regiões de esqueleto não humanas do anticorpo quimérico. Sem nos pretendermos limitar pela teoria, tal estratégia pode aumentar a probabilidade do anticorpo humanizado reter a afinidade de ligação específica para uma proteína de ligação a TGF-beta, que em algumas concretizações preferidas podem ter 34 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ substancialmente a mesma afinidade para uma proteína de ligação a TGF-beta ou sua variante ou fragmento e em determinadas outras concretizações preferidas pode ter uma afinidade maior para proteína de ligação a TGF-beta. Consultar, e.g., Jones et al., 1986 Nature 321:522-25; Riechmann et al., 1988 Nature 332:323-27. A concepção de tal anticorpo humanizado pode assim incluir determinar conformações de ansas de CDR e determinantes estruturais das regiões variáveis não humanas, por exemplo, por modelação em computador, e seguidamente comparar as ansas da CDR e dos determinantes com estruturas conhecidas de ansa e determinantes de CDR humana. Consultar, e.g., Padlan et al., 1995 FASEB 9:133-39; Chothia et al., 1989 Nature, 342:377-383. A modelação em computador pode também ser utilizada para comparar moldes estruturais humanos seleccionados por homologia de sequência com as regiões variáveis não humanas. Consultar, e.g., Bajorath et al., 1995 Ther. Immunol. 2:95-103; EP-0578515-A3. Caso a humanização das CDR não humanas resulte numa diminuição da afinidade de ligação, a modelação em computador pode auxiliar na identificação de resíduos de aminoácidos específicos que possam ser alterados por técnicas de mutagénese dirigida ao local ou outras para restaurar a afinidade parcial, completa ou supra-optimamente (i.e., aumentar a um nível superior ao do anticorpo não humanizado). Os peritos na especialidade conhecem bem estas técnicas e considerarão facilmente numerosas variações e modificações de tais estratégias de concepção.
Um tal método para preparar um anticorpo humanizado denomina-se hiper-quimerização ("veneering"). Tal como aqui utilizadas, as expressões "FR hiper-quimerizadas" e "FR hiper-quimerizadas recombinantemente" referem-se à substituição selectiva de resíduos FR, e.g., de uma região V de cadeia pesada ou leve de roedor, por resíduos FR humanos de modo a obter uma molécula xenogenésica compreendendo um local de ligação de antigénio que mantém substancialmente toda a estrutura de enrolamento do polipéptido FR nativo. As técnicas de hiper-quimerização baseiam-se na compreensão que as caracteristicas de ligação de ligando de um local de ligação de antigénio são principalmente determinadas pela estrutura e disposição relativa dos conjuntos de CDR de cadeia pesada e leve na superfície de ligação a antigénio. Davies et al., Ann. 35 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
Rev. Biochem. 59:439-73, 1990. Assim, a especificidade de ligação de antigénio pode ser preservada num anticorpo humanizado apenas quando as estruturas das CDR, a sua interacção entre si e a sua interacção com o resto do domínio da região V são mantidas cuidadosamente. Através da utilização de técnicas de hiper-quimerização, os resíduos FR do exterior (e.g., acessíveis ao solvente) que são facilmente encontrados pelo sistema imunitário são substituídos selectivamente por resíduos humanos para obter uma molécula híbrida que compreende uma superfície hiper-quimerizada fracamente imunogénica ou substancialmente não imunogénica. O processo de hiper-quimerização utiliza os dados de sequência disponíveis para domínios variáveis de anticorpo humano compilados por Kabat et al., em Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a ed., (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1987), actualizações à base de dados de Kabat e outras bases de dados de U.S. e estrangeiras (tanto de ácido nucleico, como de proteína). A acessibilidade ao solvente dos aminoácidos da região V pode ser deduzida da estrutura tridimensional conhecida para fragmentos de anticorpos humanos e murinos. Inicialmente comparam-se as FR dos domínios variáveis de uma molécula de anticorpo de interesse com as sequências FR correspondentes de domínios variáveis humanos obtidas das fontes identificadas anteriormente. Comparam-se então as regiões V humanas mais homólogas, resíduo a resíduo, com os aminoácidos murinos correspondentes. Os resíduos na FR murina que diferem do parceiro humano são substituídos pelos resíduos presentes na parte humana utilizando técnicas recombinantes bem conhecidas na especialidade. A troca de resíduos é apenas efectuada com partes que estão pelo menos parcialmente expostas (acessíveis a solvente) e toma-se cuidado na substituição de resíduos de aminoácidos que possam ter um efeito significativo na estrutura terciária dos domínios da região V, tais como prolina, glicina e aminoácidos carregados.
Desta forma, os locais de ligação de antigénio "hiper-quimerizados" resultantes são então concebidos para manter os resíduos de CDR de roedor, os resíduos substancialmente adjacentes às CDR, os resíduos identificados como interiores ou substancialmente interiores (inacessíveis ao solvente), os 36 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ resíduos que se pensa que participam em contactos não covalentes (e.g., electrostáticos e hidrofóbicos) entre domínios de cadeia pesada e leve e os resíduos de regiões estruturais conservadas das FR que se pensa que influenciam as estruturas terciárias "canónicas" das ansas CDR. Estes critérios de concepção são então utilizados para preparar sequências de nucleótidos recombinantes que combinam as CDR tanto da cadeia pesada, como leve de um local de ligação de antigénio para FR aparentemente humanas que podem ser utilizadas para transfectar células de mamífero para a expressão de anticorpos humanos recombinantes que apresentam a especificidade de antigénio da molécula de anticorpo de roedor.
Um método adicional para seleccionar anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína de ligação a TGF-beta ou sua variante ou fragmento é por disposição de fagos. Consultar, e.g., Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55; Burton et al., 1994 Adv. Immunol. 57:191-280. Podem criar-se bibliotecas combinatoriais de genes da região variável de imunoglobulina humana ou murina em vectores de fagos que podem ser rastreadas para seleccionar fragmentos Ig (Fab, Fv, sFv ou seus multímeros) que se ligam especificamente a proteína de ligação a TGF-beta ou sua variante ou fragmento. Consultar, e.g., patente U.S. N° 5 223 409; William D. Huse et al., "Generation of a Large Combinational Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda" Science 246:1215-1281, Dezembro de 1989; consultar também L. Sastry et al., "Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library" Proc. Natl. Acad. Sei. USA 55:5728-5732, Agosto de 1989; consultar também Michelle Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas" Strategies in Molecular Biology 3:1-9, Janeiro de 1990; Kang et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:4363-66; Hoogenboom et al., 1992 J. Molec. Biol. 227:381-388; Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16:47-52 e referências aí citadas). Encontra-se disponível um sistema comercial de Stratagene (La Jolla, Califórnia) que permite a produção de anticorpos através de técnicas recombinantes. Sucintamente, isola-se ARNm de uma população de células B e utiliza-se para 37 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ criar bibliotecas de expressão de ADNc de imunoglobulina de cadeia pesada e leve nos vectores ÀlmmunoZap(H) e ÀlmmunoZap(L). Podem subsequentemente converter-se as placas positivas a plasmideo não litico que permite elevados níveis de expressão de fragmentos de anticorpo monoclonal de E. coli. Alternativamente, pode inserir-se uma biblioteca contende muitas sequências de polinucleótidos que codificam fragmentos da região variável de Ig no genoma de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou uma sua variante, em quadro de leitura com a sequência que codifica uma proteína de invólucro de fago. Uma proteína de fusão pode ser uma fusão de uma proteína de invólucro com o domínio da região variável de cadeia leve e/ou com o domínio da região variável de cadeia pesada. De acordo com determinadas concretizações, os fragmentos Fab de imunoglobulina podem também ser apresentados numa partícula de fago (consultar, e.g., patente U.S. N° 5 698 426). Estes vectores podem ser rastreados individualmente ou co-expressos para formar fragmentos Fab ou anticorpos (consultar Huse et al., supra; consultar também Sastry et al., supra).
Similarmente podem também construir-se partes ou fragmentos, tais como fragmentos Fab e Fv, de anticorpos utilizando digestão enzimática convencional ou técnicas de ADN recombinante para incorporar as regiões variáveis de um gene que codifica um anticorpo que se liga especif icamente. Nessa concretização, os genes que codificam a região variável de um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal de interesse são amplificados utilizando iniciadores de nucleótidos para a região variável. Estes iniciadores podem ser sintetizados por um perito na especialidade ou podem ser comprados a fontes disponíveis comercialmente. Stratagene (La Jolla, Califórnia) vende iniciadores para regiões variáveis de ratinho e de humano incluindo, entre outros, iniciadores para as regiões VHa, VHb, VHc ^ VHd, CHi, Vl e CL. Estes iniciadores podem ser utilizados para amplificar regiões variáveis de cadeia pesada ou leve, que podem então ser inseridos em vectores tais como ImmunoZAP™ H ou ImmunoZAP™ L (Stratagene), respectivamente. Estes vectores podem então ser introduzidos em E. coli, levedura ou sistemas baseados em mamíferos para expressão. Utilizando estas técnicas, podem produzir-se grandes quantidades de uma proteína em cadeia única contendo uma fusão 38 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ de domínios VH e VL (consultar Bird et al., Science 242:423-426, 1988). Adicionalmente, tais técnicas podem ser utilizadas para alterar um anticorpo "murino" para um anticorpo "humano", sem alterar a especificidade de ligação do anticorpo.
Em determinadas concretizações específicas do invento, podem também utilizar-se bibliotecas de fagos combinatoriais para humanização de regiões variáveis não humanas. Consultar, e.g.; Rosok et al., 1996 J. Biol. Chem. 271:22611-18; Rader et al., 1998 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:8910-15. Pode rastrear-se uma biblioteca de fagos para seleccionar um fragmento de região variável de Ig de interesse por métodos de imunodetecção conhecidos na especialidade e agui descritos e pode determinar-se por técnicas padrão a seguência de ADN do gene de imunoglobulina inserido no fago seleccionado de tal forma. Consultar, Sambrook et al., 2001 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. A sequência de codificação de Ig seleccionada pode então ser clonada para outro vector adequado para expressão do fragmento Ig ou opcionalmente pode ser clonado num vector contendo regiões constantes de Ig para expressão de cadeias de imunoglobulina completas.
Em determinadas outras concretizações, o invento contempla anticorpos específicos para SOST que são fragmentos de anticorpo multiméricos. Descrevem-se geralmente metodologias úteis em, por exemplo Hayden et al. 1997, Curr Opin. Immunol. 9:201-12; Coloma et al., 1997 Nat. Biotechnol. 15:159-63). Por exemplo, podem criar-se fragmentos de anticorpo multiméricos por técnicas de fago para formar mini-anticorpos (patente U.S. N° 5 910 573) ou diacorpos (Holliger et al., 1997, Câncer Immunol. Immunother. 45:128-130).
Em determinadas concretizações do invento, um anticorpo específico para SOST pode ser um anticorpo que é expresso como uma proteína intracelular. Tais anticorpos intracelulares são também denominados intracorpos e podem compreender um fragmento Fab ou de preferência compreendem um fragmento scFv (consultar, e.g., Lecerf et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98:4764-49 (2001). As regiões de esqueleto que flanqueiam as regiões CDR podem ser modificadas para melhorar os níveis de expressão e a solubilidade de um intracorpo num ambiente 39 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ redutor intracelular (consultar, e.g., Worn et al., J. Biol. Chem. 275:2795-803 (2000). Um intracorpo pode ser dirigido a uma determinada localização celular ou organelo, por exemplo por construção de um vector que compreende uma sequência de polinucleótidos que codifica as regiões variáveis de um intracorpo que podem estar fundidas operacionalmente com um sequência de polinucleótidos que codifica um determinado antigénio alvo dentro da célula (consultar, e.g., Graus-Porta et al., Mol. Cell Biol. 15:1182-91 (1995); Lener et al., Eur. J. Biochem. 267:1196-205 (2000)). Um intracorpo pode ser introduzido numa célula por várias técnicas disponíveis ao perito na especialidade incluindo através de um vector de terapia génica ou uma mistura lipídica (e.g., Provectin™ fabricado por Imgenex Corporation, San Diego, CA) ou de acordo com métodos de internalização fotoquímicos. A introdução de mutações de aminoácidos numa molécula de imunoglobulina específica para uma proteína de ligação a TGF-beta pode ser útil para aumentar a especificidade ou afinidade para proteína de ligação a TGF-beta ou para alterar uma função efectora. Podem gerar-se imunoglobulinas com maior afinidade para proteína de ligação a TGF-beta por mutagénese dirigida ao local de resíduos específicos. Pode utilizar-se modelação molecular tridimensional assistida por computador para identificar os resíduos de aminoácidos a alterar, de modo a melhorar a afinidade para a proteína de ligação a TGF-beta. Consultar, e.g., Mountain et al., 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10: 1-142. Alternativamente podem gerar-se bibliotecas combinatoriais de CDR em fago Ml3 e rastrearem-se para fragmentos de imunoglobulina com afinidade melhorada. Consultar, e.g., Glaser et al., 1992, J. Immunol. 149:3903-3913; Barbas et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:3809-13; patente U.S. N° 5 792 456.
As funções efectoras também podem ser alteradas por mutagénese dirigida ao local. Consultar, e.g., Duncan et al., 1988 Nature 332:563-64; Morgan et al., 1995 Immunology 86:319-24; Eghtedarzedeh-Kondri et al., 1997 Biotechniques 23:830-34. Por exemplo, a mutação do local de glicosilação na parte Fc da imunoglobulina pode alterar a capacidade da imunoglobulina fixar complemento. Consultar, e.g., Wright et al., 1997 Trends Biotechnol. 15:26-32. Outras mutações nos domínios de região 40 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ constante podem alterar a capacidade da imunoglobulina para fixar complemento ou para efectuar citotoxicidade celular dependente de anticorpo. Consultar, e.g., Duncan et al., 1988 Nature 332:563-64; Morgan et al., 1995 Immunology 86:319-24; Sensel et al., 1997 Mol. Immunol. 34:1019-29.
De acordo com determinadas concretizações, podem construir-se regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve não humana, humana ou humanizada de qualquer das moléculas de Ig aqui descritas como fragmentos polipeptidicos em cadeia simples Fv (scFv, anticorpos em cadeia simples). Consultar, e.g., Bird et al., 1988 Science 242:423-426; Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883. Podem gerar-se proteínas de fusão scFv multi-funcionais por ligação de uma sequência de polinucleótido que codifica um polipéptido scFv em quadro com pelo menos uma sequência de polinucleótido que codifica qualquer de várias proteínas efectoras conhecidas. Estes métodos são conhecidos na especialidade e são divulgados, por exemplo, em EP-B1-0318554, patente U.S. N° 5 132 405, patente U.S. N° 5 091 513 e patente U.S. N° 5 476 786. A título de exemplo, as proteínas efectoras podem incluir sequências da região constante de imunoglobulina. Consultar, e.g., Hollenbaugh et al., 1995 J. Immunol. Methods 188:1-7. Outros exemplos de proteínas efectoras são enzimas. Como exemplo não limitativo, tal enzima pode proporcionar uma actividade biológica para objectivos terapêuticos (consultar, e.g., Siemers et al., 1997 Bioconjug. Chem. 8:510-19) ou pode proporcionar uma actividade detectável, tal como a conversão catalisada por peroxidase de rábano de qualquer de muitos substratos bem conhecidos para um produto detectável, para utilizações em diagnóstico. Ainda outros exemplos de proteínas de fusão scFv incluem fusões Ig-toxina ou imunotoxinas, em que o polipéptido scFv está ligado a uma toxina. O scFv ou qualquer fragmento de anticorpo aqui descrito pode, em determinadas concretizações, ser fundido a domínios de péptido ou polipéptido que permitem a detecção de ligações específicas entre a proteína de fusão e antigénio (e.g., uma proteína de ligação a TGF-beta). Por exemplo, o domínio do polipéptido de fusão pode ser um polipéptido marcador de afinidade para detectar a ligação da proteína de fusão scFv a uma proteína de ligação a TGF-beta por qualquer de várias 41 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ técnicas que são familiares aos peritos na especialidade. Os exemplos de um marcador peptídico incluem avidina, estreptavidina ou His (e.g., poli-histidina). As técnicas de detecção podem também incluir, por exemplo, ligação de uma proteína de fusão de avidina ou estreptavidina a biotina ou a uma sequência mimética de biotina (consultar, e.g., Luo et al., 1998 J. Biotechnol. 65:225 e referências aí citadas), modificação covalente directa de uma proteína de fusão com uma parte detectável (e.g., uma parte de marcação), ligação não covalente da proteína de fusão a uma molécula repórter marcada especifica, modificação enzimática de um substrato detectável por uma proteína de fusão que inclui uma parte com actividade enzimática ou imobilização (covalente ou não covalente) da proteína de fusão num suporte em fase sólida. Outros polipéptidos de afinidade úteis para construção de proteínas de fusão scFv podem incluir proteínas de fusão com estreptavidina, tal como divulgado, por exemplo, em WO 89/03422, U.S. 5 489 528, U.S. 5 672 691, WO 93/24631, U.S. 5 168 049, U.S. 5 272 254; proteínas de fusão com avidina (consultar, e.g., EP 511,747); uma enzima tal como glutationa-S-transferase; e polipéptido de proteína A de Staphylococcus aureus.
Os polinucleótidos que codificam um anticorpo ou seu fragmento que se ligam especificamente a uma proteína de ligação a TGF-beta, tal como aqui descrito, podem ser propagados e expressos de acordo com qualquer de vários procedimentos bem conhecidos para excisão, ligação, transformação e transfecção de ácido nucleico utilizando qualquer de vários vectores de expressão conhecidos. Assim, em determinadas concretizações, pode ser preferida a expressão de um fragmento de anticorpo num hospedeiro procariótico, tal como Escherichia coli (consultar, e.g., Pluckthun et al., 1989 Methods Enzymol. 178:497-515). Em determinadas outras concretizações, a expressão do anticorpo ou um seu fragmento pode ser preferida numa célula hospedeira eucariótica, incluindo levedura (e.g., Saccharomyces cerevlsiae, Schizosaccharomyces pombe e Pichia pastoris), células animais (incluindo células de mamífero) ou células vegetais. Os exemplos de células animais adequadas incluem células de mieloma (tal como uma linha NSO de ratinho) , COS, CHO ou 42 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ hibridoma, não se lhes limitando. Os exemplos de células vegetais incluem células de tabaco, milho, soja e arroz.
Uma vez obtidos anticorpos adequados, estes podem ser isolados ou purificados por muitas técnicas bem conhecidas dos peritos na especialidade (consultar Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e Lane (ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). As técnicas adequadas incluem colunas de afinidade de péptido ou proteína (incluindo a utilização de anticorpos anti-região constante ligados à matriz da coluna), HPLC ou RP-HPLC, purificação em colunas de proteina A ou proteína G ou qualquer combinação destas técnicas.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS 0 presente invento também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação de antigénio do invento e um transportador fisiologicamente aceitável. Em geral, tais transportadores devem ser não tóxicos para os recebedores nas dosagens e concentrações utilizadas. Usualmente a preparação de tais composições implica a combinação do agente terapêutico com tampões, antioxidantes tais como ácido ascórbico, polipéptidos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos) , proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono incluindo glicose, maltose, sacarose ou dextrinas, agentes quelantes tal como EDTA, glutationa e outros estabilizantes e excipientes. O soro fisiológico tamponado neutro ou soro fisiológico misturado com albumina de soro não específica são exemplos de diluentes adequados.
As composições farmacêuticas do presente invento podem ser preparadas para administração por uma variedade de vias diferentes. Em geral, o tipo de transportador é seleccionado com base no modo de administração. As composições farmacêuticas podem ser formuladas para qualquer modo de administração adequado, incluindo, por exemplo, administração tópica, oral, nasal, intratecal, rectal, vaginal, sublingual ou parentérica, incluindo injecção ou infusão subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-esterno, intracavernosa, intrameática ou intra-uretral. Uma composição farmacêutica (e.g., para administração oral ou entrega por injecção) pode 43 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ estar na forma de um líquido (e.g., um elixir, xarope, solução, emulsão ou suspensão). Uma composição farmacêutica líquida pode incluir, por exemplo, um ou mais dos seguintes: diluentes estéreis tal como água para injecção, solução salina, de preferência soro fisiológico, solução de Ringer, cloreto de sódio isotónico, óleos fixos que podem servir como solvente ou meio de suspensão, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes; agentes antibacterianos; anti-oxidantes; agentes quelantes; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade tal como cloreto de sódio ou dextrose. Uma preparação parentérica pode estar incluída em ampolas, seringas descartáveis ou frasquinhos de dose múltipla feitos de vidro ou plástico. É preferida a utilização de soro fisiológico e uma composição farmacêutica injectável é de preferência estéril.
As composições aqui descritas podem ser formuladas para libertação controlada (i.e., uma formulação tal como uma cápsula ou esponja que efectua libertação lenta de um composto após administração). Tais composições podem ser geralmente preparadas utilizando tecnologia bem conhecida e administradas, por exemplo, por implante oral, rectal ou subcutâneo ou por implante no local alvo pretendido. As formulações de libertação controlada podem conter um agente disperso numa matriz transportadora e/ou contido num reservatório rodeado por uma membrana de velocidade controlada. Os transportadores para utilização em tais formulações são biocompatíveis e podem também ser biodegradáveis; de preferência a formulação proporciona um nível relativamente constante de libertação do componente activo. A quantidade de componente activo no interior de uma formulação de libertação controlada depende do local de implante, da velocidade e duração esperada da libertação e da natureza da doença a ser tratada ou evitada. Os exemplos de transportadores úteis a este respeito incluem micropartículas de poli(lactídeo-co-glicolídeo) , poliacrilato, látex, amido, celulose, dextrano e semelhantes. Outros exemplos de transportadores de libertação controlada incluem biovectores supramoleculares, que compreendem um núcleo hidrofílico não líquido (e.g., um polissacárido ou oligossacárido reticulado) e opcionalmente uma camada externa compreendendo um composto anfifílico, tal como um fosfolípido (consultar e.g., patente 44 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ U.S. Ν° 5 151 254 e pedidos PCT WO 94/20078, WO/94/23701 e WO 96/06638).
Noutra concretização ilustrativa, utilizam-se microesferas biodegradáveis (e.g., polilactato poliglicolato) como transportadores para as composições deste invento. Divulgam-se microesferas biodegradáveis em, por exemplo, patente U.S. N° 4 897 268; 5 075 109; 5 928 647; 5 811 128; 5 820 883; 5 853 763; 5 814 344, 5 407 609 e 5 942 252. Os sistemas de transportador de proteína de núcleo de hepatite B modificado, tais como descritos em WO/99 40934 e referências ai citadas, serão também úteis para muitas aplicações. Outro exemplo de sistema de transportador/entrega utiliza um transportador compreendendo complexos particulados-proteína, tais como os descritos em patente U.S. N° 5 928 647, que são capazes de induzir respostas de linfócitos T citotóxicos restritos a classe I num hospedeiro.
Noutra concretização ilustrativa, utilizam-se partículas de núcleo de fosfato de cálcio como transportadores ou como matrizes de libertação controlada para as composições deste invento. Divulgam-se exemplos de partículas de fosfato de cálcio, por exemplo, em pedido de patente publicado N° WO/0046147. O desenvolvimento de regimes de dosagem e tratamento adequados para utilização das composições específicas aqui descritas numa variedade de regimes de tratamento incluindo e.g., administração e formulação oral, parentérica, intravenosa, intranasal e intramuscular é bem conhecido na especialidade, alguns dos quais são discutidos sucintamente em seguida para objectivos gerais de ilustração.
Em determinadas aplicações, as composições farmacêuticas aqui divulgadas podem ser entregues por administração oral a um animal. Como tal, estas composições podem ser formuladas com um diluente inerte ou com um transportador edível assimilável ou podem ser incluídas em cápsula de gelatina de camada dura ou mole ou podem ser comprimidas em pastilhas ou podem ser incorporados directamente na comida da dieta. 45 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
Em determinadas circunstâncias será desejável entregar as composições farmacêuticas aqui divulgadas parentérica, intravenosa, intramuscular ou mesmo intraperitonealmente. Tais abordagens são bem conhecidas dos peritos na especialidade, algumas são descritas adicionalmente em, por exemplo, patente U.S. N° 5 543 158; patente U.S. N° 5 641 515 e patente U.S. N° 5 399 363. Em determinadas concretizações, podem preparar-se soluções de compostos activos como base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis em água, misturados adequadamente com um tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulose. As dispersões podem também ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos e suas misturas e em óleos. Em condições normais de armazenamento e utilização, estas preparações conterão geralmente um conservante para evitar o crescimento de microrganismos.
Os exemplos de formas farmacêuticas adequadas para uso injectável incluem soluções aquosas ou dispersões estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injectáveis estéreis (por exemplo, consultar patente U.S. N° 5 466 468). Em todos os casos a forma deve ser estéril e deve ser fluida para que possa ser facilmente manuseada por seringa. Deve ser estável em condições de fabrico e armazenamento e deve ser conservada contra a contaminação por microrganismos, tais como bactérias e fungos. 0 transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (e.g., glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e semelhantes), suas misturas adequadas e/ou óleos vegetais. Pode-se manter uma fluidez adequada, por exemplo, pela utilização de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula adequado no caso de dispersão e/ou pela utilização de tensioactivos. A prevenção da acção de microrganismos pode ser facilitada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser conseguida pela utilização nas composições de agentes de atraso de absorção, por exemplo, mono-estearato de alumínio e gelatina. 46 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
Numa concretização, para administração parentérica numa solução aquosa, a solução deve ser tamponada adequadamente caso necessário e o diluente liquido deve ser previamente tornado isotónico com soro ou glicose suficientes. Estas soluções especificas são especialmente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. A este respeito, um meio aquoso estéril que pode ser utilizado será conhecido dos peritos na especialidade à luz da presente divulgação. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 ml de solução de NaCl isotónica e quer adicionada a 1000 ml de fluido de hipodermóclise, quer injectada no local proposto de infusão, (consultar por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a ed., p. 1035-1038 e 1570-1580). Alguma variação da dosagem ocorrerá necessariamente dependendo da condição do indivíduo a ser tratado. Além disso, para administração a humanos, as preparações terão obviamente de preferência a esterilidade, pirogenicidade e os padrões gerais de segurança e pureza requeridos pelo gabinete de padrões biológicos da FDA.
Noutra concretização do invento, as composições aqui divulgadas podem ser formuladas numa forma neutra ou de sal. Os exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico e semelhantes. Os sais formados com o grupo carboxilo livre também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou férrico e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e semelhantes. Após formulação, as soluções serão administradas de uma forma compatível com a formulação de dosagem e numa quantidade terapeuticamente eficaz.
Os transportadores podem compreender adicionalmente qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, veículos, revestimentos, diluentes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de atraso de absorção, tampões, soluções transportadoras, suspensões, colóides e semelhantes. A utilização de tais meios e agentes para 47 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ substâncias farmaceuticamente activas é bem conhecida na especialidade. Excepto se qualquer meio ou agente convencional for incompatível como o ingrediente activo, a sua utilização nas composições farmacêuticas é abrangida. Também se podem incorporar ingredientes activos suplementares nas composições. A frase "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades moleculares e composições que não produzem uma reacção alérgica ou igualmente indesejável quando administradas a um humano.
Em determinadas concretizações, utilizam-se lipossomas, nanocápsulas, micropartículas, partículas lipídicas, vesículas e semelhantes para a introdução das composições do presente invento em células/organismos hospedeiros adequados. Em particular, as composições do presente invento podem ser formuladas para entrega encapsuladas numa partícula de lípido, um lipossoma, uma vesícula, uma nano-esfera ou uma nanoparticula ou semelhantes. Alternativamente, as composições do presente invento podem ser ligadas, covalente ou não covalentemente, à superfície de tais veículos de transporte. A formação e utilização de lipossomas e de preparações do tipo lipossoma como transportadores de fármacos potenciais é conhecida na generalidade dos peritos na especialidade (consultar por exemplo, Lasic, Trends Biotechnol. 16(7):307-21, 1998; Takakura, Nippon Rinsho 56(3):691-95, 1998; Chandran et al., Indian J. Exp. Biol. 3 5 (8):801-09, 1997; Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 12(2-3):233-61, 1995; patente U.S. N° 5 567 434; patente U.S. N° 5 552 157; patente U.S. N° 5 565 213; patente U.S. N° 5 738 868 e patente U.S. N° 5 795 587.
Utilizaram-se com sucesso lipossomas com vários tipos celulares que são normalmente difíceis de transfectar por outros procedimentos, incluindo suspensões de células T, culturas de hepatócitos primários e células PC 12 (Renneisen et al., J. Biol. Chem. 265(27) :16337-42, 1990; Muller et al., DNA Cell Biol. 9(3):221-29, 1990). Adicionalmente, os lipossomas estão isentos de restrições de tamanho de ADN que são típicas de sistemas de entrega baseados em vírus. Os lipossomas têm sido utilizados eficazmente para introduzir genes, vários fármacos, agentes radioterapêuticos, enzimas, 48 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ vírus, factores de transcrição, efectores alostéricos e semelhantes, em várias linhas celulares cultivadas e animais. Adicionalmente, a utilização de lipossomas não parece estar associada a respostas auto-imunes ou toxicidade inaceitável após entrega sistémica.
Em determinadas concretizações, formam-se lipossomas a partir de fosfolípidos dispersos num meio aquoso e formam espontaneamente vesículas em bicamada concêntricas multilamelares (também denominadas vesículas multilamelares (MLV).
Alternativamente, noutras concretizações, o invento proporciona formulações em nanocápsula aceitáveis farmaceuticamente das composições do presente invento. As nanocápsulas podem geralmente encapsular compostos de uma forma estável e reprodutível (consultar, por exemplo, Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev. Ind. Pharm. 24{12):1113-28, 1998). Para evitar efeitos secundários devidos a sobrecarga polimérica intracelular, tais partículas ultrafinas (com tamanho de cerca de 0,1 pm) podem ser concebidas utilizando polímeros capazes de serem degradados in vivo. Tais partículas podem ser preparadas tal como descrito, por exemplo, em Couvreur et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5(1):1-20, 1988; zur Muhlen et al., Eur. J. Pharm.
Biopharm. 45(2):149-55, 1998; Zambaux et al., J. Controlled
Release 50(1-3):31-40, 1998; e patente U.S. N° 5 145 684.
Adicionalmente, as composições farmacêuticas do presente invento podem ser colocadas em recipientes, conjuntamente com material de embalagem que proporciona instruções relativas à utilização de tais composições farmacêuticas. Em geral, tais instruções incluirão uma expressão clara que descreve a concentração de reagente, bem como, em algumas concretizações, as quantidades relativas de ingredientes de excipiente ou diluentes (e.g., água, soro fisiológico ou PBS) que podem ser necessárias para reconstituir a composição farmacêutica.
TRATAMENTO O presente invento também proporciona aumento do teor mineral e densidade mineral óssea. Sucintamente, muitas 49 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ condições resultam na perda de teor mineral ósseo, incluindo por exemplo, doença, predisposição genética, acidentes que resultam na perda da utilização de osso (e.g., devido a fractura), terapias que afectam a reabsorção do osso ou que matam as células formadoras de osso e envelhecimento normal. Através da utilização das moléculas aqui descrita, que inibem a ligação de proteína de ligação a TGF-beta a um membro da família TGF-beta, tais condições podem ser tratadas ou evitadas. Tal como aqui utilizado, deve entender-se que o teor mineral ósseo aumentou caso o teor mineral ósseo tenha aumentado de uma forma estatisticamente significativa (e.g., maior do que metade do desvio padrão), num local seleccionado.
Uma vasta gama de condições que resultam na perda de teor mineral ósseo pode ser tratada com as moléculas aqui descritas. Os doentes com tais condições podem ser identificados através de diagnóstico clínico utilizando técnicas bem conhecidas (consultar, e.g., Harrison's Principies of Internai Medicine, McGraw-Hill, Inc.). Os exemplos representativos de doenças que podem ser tratadas incluem displasias, em que existe crescimento ou desenvolvimento anómalo do osso. Os exemplos representativos de tais condições incluem acondroplasia, disostose cleidocraniana, encondromatose, displasia fibrosa, doença de Gaucher, raquitismo hipofosfatémico, síndrome de Marfan, exotoses hereditárias múltiplas, neurofibromatose, osteogénese imperfeita, osteopetrose, osteopoiquilose, lesões escleróticas, fracturas, doença periodontal, pseudo-artrose e osteomielite piogénica.
Outras condições que podem ser tratadas ou evitadas incluem uma vasta gama de causas de osteopenia (i.e., uma condição que causa um teor ou densidade mineral óssea inferior ao teor mineral no esqueleto na juventude de pico inferior a mais do que um desvio padrão). Os exemplos representativos de tais condições incluem estados de anemia, condições causadas por esteróides, condições causadas por heparina, doenças da medula óssea, escorbuto, subnutrição, deficiência de cálcio, osteoporose idiopática, osteopenia ou osteoporose congénitas, alcoolismo, doença hepática crónica, senilidade, estado de pós-menopausa, oligomenorreia, amenorreia, gravidez, diabetes mellitus, hipertiroidismo, doença de Cushing, acromegalia, 50 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ hipogonadismo, imobilização ou falta de uso, sindrome de distrofia simpático-reflexa, osteoporose regional transitória e osteomalacia.
Os exemplos de animais de sangue quente que podem ser tratados incluem tanto vertebrados, como mamíferos, incluindo por exemplo humanos, cavalos, vacas, porcos, ovelhas, cães, gatos, ratos e ratinhos. A determinação do aumento de teor mineral ósseo pode ser determinada directamente através da utilização de raios X (e.g., absorptometria de raios X duo-energética ou "DEXA") ou por inferência através de marcadores de remodelação óssea (tal como fosfatase alcalina específica de osteoblasto, osteocalcina, propéptido C' pró-colagénio de tipo 1 (PICP) e fosfatase alcalina total; consultar Comier, C., Curr. Opin. in Rheu. 7:243, 1995) ou por marcadores de reabsorção óssea (piridinolina, desoxipriridinolina, N-telopéptido, hidroxiprolina urinária, fosfatases ácidas resistentes a tartrato de plasma e galactosil-hidroxilisina; consultar Comier, supra). A quantidade de massa óssea também pode ser calculada a partir do peso corporal ou por outros métodos conhecidos na especialidade (consultar Guinness-Hey, Metab. Bone Dis. and Relat. Res. 5:177-181, 1984).
Tal como será evidente para o perito na especialidade, a quantidade e frequência de administração dependerá obviamente de factores tais como a natureza e gravidade da indicação a ser tratada, da resposta pretendida, da condição do doente e outros. Tipicamente, as composições podem ser administradas por várias técnicas, tal como mencionado anteriormente.
Os seguintes exemplos apresentam-se a título ilustrativo e não são limitativos. 51 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ EXEMPLOS EXEMPLO 1
MAPAS DE ESCLEROSTEOSE DO BRAÇO LONGO DE CROMOSSOMA 17 HUMANO O mapeamento genético do defeito responsável por esclerosteose em humanos localizou o gene responsável por esta doença na região do cromossoma 17 humano que codifica um novo membro da família de proteína de ligação a TGF-beta. Em esclerosteose, o osso esquelético apresenta um aumento substancial da densidade mineral relativamente ao de indivíduos que não sofrem da doença. 0 osso da cabeça também apresenta sobre-crescimento. Os doentes de esclerosteose são geralmente saudáveis embora possam apresentar graus variáveis de sindactilia quando nascem e graus variáveis de compressão craniana e compressão de nervos no crânio. A análise de ligação do defeito génico associado a esclerosteose foi efectuada por aplicação do método de mapeamento de homozigotia a amostras de ADN recolhidas de 24 famílias de africâneres sul-africanos nos quais ocorria a doença. (Sheffield et al., 1994, Human Molecular Genetics 3:1331-1335. "Identification of a Bardet-Biedl syndrome locus on chromosome 3 and evaluation of an efficient approach to homozygosity mapping"). A população africâner na África do Sul é geneticamente homogénea; a população descende de um pequeno número de fundadores que colonizaram a área há vários séculos atrás e esteve isolada por barreiras geográficas e sociais desde a sua fundação. A esclerosteose é rara em todo o mundo fora da comunidade africâner, o que sugere a presença de uma mutação no gene na população fundadora e desde então aumento em número conjuntamente com o aumento da população. A utilização de mapeamento de homozigotia baseia-se na premissa que os marcadores de mapeamento de ADN adjacentes a uma mutação recessiva são provavelmente homozigóticos em indivíduos afectados de famílias consanguíneas e populações isoladas.
Seleccionou-se um conjunto de 371 marcadores de microssatélite (Research Genetics, conjunto 6) dos cromossomas 52 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ autossómicos para conjuntos de tipos de ADN de amostras de doentes de esclerosteose. As amostras de ADN para esta análise provieram de 29 doentes de esclerosteose em 24 famílias, 59 membros da família não afectados e um conjunto de indivíduos de controlo não relacionados da mesma população. Os conjuntos consistiram de 4-6 indivíduos de entre indivíduos afectados, indivíduos afectados de famílias consanguíneas, pais e irmãos não afectados ou controlos não relacionados. Nos conjuntos de indivíduos não relacionados e na maioria dos conjuntos com indivíduos ou membros da família afectados, a análise dos marcadores apresentou vários tamanhos de alelos para cada marcador. Um marcador, D17S1299, mostrou uma indicação de homozigotia: uma banda em vários dos conjuntos de indivíduos afectados.
Tiparam-se todas as 24 famílias de esclerosteose com um total de 19 marcadores na região de D17S1299 (em 17ql2-q21). Provou-se que os indivíduos afectados de cada família eram homozigóticos nesta região e 25 dos 29 indivíduos eram homozigóticos para um haplotipo nuclear; cada um deles apresentava os mesmos alelos entre D17S1787 e D17S930. Os outros quatro indivíduos tinham um cromossoma que correspondia a este haplotipo e um segundo que não correspondia. Em resumo, os dados sugeriram de forma contundente que esta região de 3 megabases continha uma mutação de esclerosteose. A análise de sequência da maioria dos exões nesta região de 3 megabases identificou uma mutação sem sentido numa sequência de codificação de uma nova proteína de ligação a TGF-beta (a mutação C>T na posição 117 da sequência ID N° 1 resulta num codão de terminação). Demonstrou-se que esta mutação era única nos doentes com esclerosteose e portadores com ascendência africâner. A identidade do gene foi confirmada adicionalmente pela identificação de uma mutação no seu intrão (mutação A>T na posição +3 do intrão) resultante no processamento inadequado de ARNm num único doente não relacionado com diagnóstico de esclerosteose. 53 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ EXEMPLO 2
ESPECIFICIDADE DE TECIDOS DA EXPRESSÃO GENICA DA PROTEÍNA
DE LIGAÇÃO A TGF-BETA A. Expressão génica de Beer humano por RT-PCR:
Preparou-se a primeira cadeia de ADNc a partir das seguintes amostras de ARN total utilizando um kit disponível comercialmente ("Superscript Preamplification System for First-Strand cDNA Synthesis", Life Technologies, Rockville, MD) : cérebro humano, fígado humano, baço humano, timo humano, placenta humana, músculo esquelético humano, tiróide humana, pituitária humana, osteoblastos humanos (NHOst de Clonetics Corp., San Diego, CA), linha celular de osteossarcoma humano (Saos-2, n° ATCC HTB-85), osso humano, medula óssea humana, cartilagem humana, osso de macaco do Velho Mundo, saccharomyces cerevisiae e monócitos de sangue periférico humano. Todas as amostras de ARN foram adquiridas de uma fonte comercial (Clontech, Paio Alto, CA) com excepção das seguintes que foram preparadas no nosso laboratório: osteoblastos humanos, linha celular de osteossarcoma humano, osso humano, cartilagem humana e osso de macaco do Velho Mundo. Estas amostras de ARN foram preparadas no nosso laboratório utilizando um kit disponível comercialmente ("TRI Reagent", Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH).
Efectuou-se PCR nestas amostras e adicionalmente numa amostra genómica humana como controlo. 0 iniciador de oligonucleótido Beer em sentido tinha a sequência 5'- CCGGAGCTGGAGAACAACAAG-3' (SEQ ID N0:19). 0 iniciador de oligonucleótido Beer em anti-sentido tinha a sequência 5'-GCACTGGCCGGAGCACACC-3' (SEQ ID NO:20). Além disso efectuou-se PCR usando iniciadores para o gene de beta-actina humana como controlo. 0 iniciador de oligonucleótido de beta-actina em sentido tinha a sequência 5'-AGGCCAACCGCGAGAAGATGA CC -3' (SEQ ID NO:21). 0 iniciador de oligonucleótido de beta-actina em anti-sentido tinha a sequência 5'-GAAGTCCAGGGCGACGTAGCA-3' (SEQ ID NO:22). Efectuou-se PCR utilizando condições padrão em reacções de 25 ul, com uma temperatura de hibridação de 61 graus Celsius. Efectuaram-se trinta e dois ciclos de PCR com 54 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ os iniciadores Beer e efectuaram-se vinte e quatro ciclos com os iniciadores de beta-actina.
Após amplificação, analisaram-se 12 ul de cada reacção por electroforese em gel de agarose e coloração com brometo de etidio. Consultar a figura 2A. B. Hibridação de ARN in-situ em secções de embrião de ratinho:
Clonou-se o ADNc Beer de ratinho completo (Sequência ID N° 11) no vector pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) nas direcções sentido e anti-sentido utilizando o protocolo do fabricante. Sintetizaram-se os produtos de transcrição de ARNc em sentido e em anti-sentido marcados com 35S-alfa-GTP utilizando reagentes de transcrição in-vitro fornecidos por Ambion, Inc (Austin, TX) . Efectuou-se hibridação in-situ de acordo com os protocolos de Lyons et al. (J. Cell Biol. 111:2427-2436, 1990) . A sonda de ARNc Beer de ratinho detectou uma mensagem especifica expressa no tubo neural, botões do membro, vasos sanguíneos e cartilagens de ossificação de embriões de ratinho em desenvolvimento. O painel A da figura 3 apresenta expressão na cristã ectodérmica apical (aer) do botão (1), dos vasos sanguíneos (bv) e do tubo neural (nt) do membro. O painel B apresenta expressão no 4o ventrículo do cérebro (4). O painel C apresenta expressão na mandíbula (ma) vértebras cervicais (cv) , osso occipital (oc) , palato (pa) e um vaso sanguíneo (bv) . O painel D apresenta expressão nas costelas (r) e numa válvula cardíaca (va). O painel A é uma secção transversal de um embrião 10.5 dpc. O painel B é uma secção sagital de um embrião 12.5 dpc e os painéis C e D são secções sagitais de embriões 15.5 dpc. ba=arco branquial, h=coração, te=telencéfalo (cérebro anterior), b=cérebro, f=massa frontonasal, g=intestino, h=coração, j=maxilar, li=fígado, lu=pulmão, ot=vesícula óptica, ao=, sc=medula espinal, skm=músculo esquelético, ns=seios nasais, th=timo, to=língua, fl=membro anterior, di=diafragma 55 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ EXEMPLO 3
EXPRESSÃO Ε PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA BEER RECOMBINANTE A. Expressão em células COS-1:
Amplificou-se a sequência de ADN que codifica a proteína Beer humana completa utilizando os seguintes oligonucleótidos iniciadores de PCR: o oligonucleótido iniciador 5' tinha a sequência 5'-AAGCTTGGTACCATGCAGCTCCCAC-3' (SEQ ID NO:23) e continha um local de restrição enzimática HindIII (em negrito) seguido por 19 nucleótidos do gene Beer que se inicia 6 pares de bases antes do presumível codão de iniciação do terminal amino (ATG). 0 oligonucleótido iniciador 3' tinha a sequência 5'-AAGCTTCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTAGGCGTTCTCCAGCT-3' (SEQ ID NO:24) e continha um local de restrição enzimático HindIII (em negrito) seguido de um codão de terminação complementar reverso (CTA) seguido pelo complementar reverso do epítopo FLAG (sublinhado, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) flanqueado pelo complementar reverso dos nucleótidos que codificam os 5 aminoácidos do terminal carboxilo de Beer. Clonou-se o produto de PCR com TA ("Original TA Cloning Kit", Invitrogen, Carlsbad, CA) e rastrearam-se os clones individuais por sequenciação de ADN. Digeriu-se então um clone com sequência verificada com HindIII e purificou-se num gel de agarose a 1,5% utilizando reagentes disponíveis comercialmente ("QIAquick Gel Extraction Kit", Qiagen Inc., Valência, CA). Ligou-se então este fragmento ao plasmídeo pcDNA3.1 digerido com HindIII e tratado com fosfatase (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando T4 ADN ligase. Transformaram-se E. coli DH10B e plaquearam-se em LB, placas com ampicilina a 100 pg/ml. Identificaram-se colónias com o produto recombinante pretendido na orientação adequada através de um rastreio baseado em PCR, usando um iniciador 5' correspondente ao local de promotor T7/iniciação em pcDNA3.1 e um iniciador 3' com a sequência 5' -GCACTGGCCGGAGCACACC-3' (SEQ ID NO:25) que corresponde ao complementar reverso da sequência BEER interna. Confirmou-se a sequência do fragmento clonado por sequenciação de ADN.
Utilizaram-se células COS-1 (ATCC n° CRL-1650) para transfecção. Transfectaram-se 50 pg do plasmídeo de expressão 56 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ pcDNA-Beer-Flag utilizando um kit disponível comercialmente seguindo protocolos fornecidos pelo fabricante ("DEAE-Dextran Transfection Kit", Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). 0 meio final após transfecção foi DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) contendo soro fetal bovino a 0,1%. Após 4 dias em cultura removeu-se o meio. Analisou-se a expressão de BEER recombinante por SDS-PAGE e transferência "Western" usando anticorpo monoclonal anti-FLAG® M2 (Sigma-Aldrich Co. , St. Louis, MO). Efectuou-se a purificação de proteína BEER recombinante usando uma coluna de afinidade anti-FLAG M2 ("Mammalian Transient Expression System", Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO). Analisou-se o perfil da coluna por SDS-PAGE e transferência "Western" usando anticorpo monoclonal anti-FLAG M2 . B. Expressão em células de insecto SF9:
Amplificou-se a sequência génica de Beer humana usando PCR com condições padrão e os seguintes iniciadores:
Iniciador em sentido: 5'- GTCGTCGGATCCATGGGGTGGCAGGCGTTCAAGAATGAT-3' (SEQ ID NO:26)
Iniciador em anti-sentido: 5'- GTCGTCAAGCTTCTACTTGTCATCGTCCTTGTAGTCGTAGGCGTTCTCCAGCTCGGC-3' (SEQ ID NO:27) O ADNc resultante continha a região de codificação de Beer com duas modificações. Removeu-se o sinal de excreção N-terminal e fundiu-se um marcador de epítopo FLAG (Sigma) em quadro de leitura com a extremidade C-terminal da inserção. Adicionaram-se locais de clonagem BamHl e HindIII e subclonou-se o gene num vector pMelBac (Invitrogen) para transferência num vector de expressão de baculovírus usando métodos padrão.
Produziram-se baculovírus recombinantes que expressam a proteína Beer usando o kit de transfecção Bac-N-Blue (Invitrogen) e purificaram-se de acordo com as instruções dos fabricantes.
Mantiveram-se células SF9 (Invitrogen) em meio TNM_FH (Invitrogen) contendo soro fetal de vitelo a 10%. Para 57 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ expressão de proteína, infectaram-se culturas de SF9 em frascos de rotação a uma MOI superior a 10 Retiram-se diariamente durante cinco dias amostras dos meios e das células e seguiu-se a expressão de Beer por transferência "western" usando um anticorpo monoclonal anti-FLAG M2 (Sigma) ou um anti-soro policlonal de coelho anti-Beer.
Após cinco dias recolheram-se as células SF9 infectadas com baculovírus por centrifugação e extraiu-se a proteína associada a células a partir do sedimento celular usando um tampão de extracção com sal elevado (NaCl 1,5 M, Tris 50 mM pH 7,5) . Clarificou-se o extracto (20 ml por 300 ml de cultura) por centrifugação, dialisou-se três vezes contra quatro litros de solução salina tamponada com Tris (NaCl 150 mM, Tris 50 mM pH 7,5) e clarificou-se novamente por centrifugação. Aplicou-se esta fracção com sal elevado a heparina Hitrap (Pharmacia; 5 ml de volume de leito), lavou-se extensivamente com solução salina tamponada com HEPES (HEPES 25 mM 7,5, NaCl 150 mM) e eluíram-se as proteínas com um gradiente de NaCl 150 mM a NaCl 1200 mM. Observou-se eluição de Beer a NaCl aproximadamente 800 mM. Suplementaram-se as fracções contendo Beer com glicerol a 10% DTT 1 mM e congelou-se a - 80 graus C. EXEMPLO 4 PREPARAÇÃO E ENSAIO DE ANTICORPOS POLICLONAIS CONTRA BEER,
GREMLIN E DAN A. Preparação de antigénio:
Amplificaram-se as sequências de ADN de Beer humana, Gremlin humana e Dan humana usando métodos de PCR padrão com os seguintes oligonucleótidos iniciadores: H. Beer
Sentido: 5' -GACTTGGATCCCAGGGGTGGCAGGCGTIC- 3' (SEQ ID NO:28)
Anti-sentido 5' -AGCATAAGCTICTAGTAGGCGTTCTCCAG- 3' (SEQ ID NO:29) 58 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ Η. Gremlin
Sentido: 5' -GACTTGGATCCGAAGGGAAAAAGAAAGGG- 3' (SEQ ID NO :30)
Anti-sentido: 5' -AGCATAAGCTTTTAATCCAAATCGATGGA- 3' (SEQ ID NO:31) H. Dan
Sentido: 5' -ACTACGAGCTCGGCCCCACCACCCATCAACAAG- 3' (SEQ ID NO:32)
Anti-sentido: 5' -ACTTAGAAGCTTTCAGTCCTCAGCCCCCTCTTCC-3' (SEQ ID NO:33)
Em cada caso os iniciadores listados amplificaram a região de codificação completa sem a sequência de sinalização de excreção. Estes incluem locais de restrição para subclonagem num vector de expressão bacteriano pQE-30 (Qiagen Inc., Valência, CA) nos locais BamHI/HindIII para Beer e Gremlin e locais SacI/HindIII para Dan. O pQE30 contém uma sequência de codificação para um marcador 6x His na extremidade 5' da região de clonagem. Transformaram-se as construções completas em E. coli estirpe Μ-15/pRep (Qiagen Inc) e verificaram-se os clones individuais por sequenciação. Efectuou-se expressão de proteína em Μ-15/pRep e purificação (ligação de cauda de afinidade 6xHis a Ni-NTA acoplado com Sepharose) tal como descrito pelo fabricante (Qiagen, The QIAexpressionist).
Recuperou-se a proteína Beer derivada de E. coli em quantidade significativa usando solubilização em guanidina 6M e dialisou-se a 2-4M para evitar precipitação durante o armazenamento. Recuperaram-se as proteínas Gremlin e Dan em quantidades mais elevadas com solubilização em guanidina 6M e uma concentração de guanidina após purificação de 0,5M. B. Produção e ensaio de anticorpos policlonais:
Produziram-se anticorpos policlonais contra cada um destes três antigénios em hospedeiros de coelho e de galinha usando protocolos padrão (R & R Antibody, Stanwood, WA; protocolo padrão para imunização de coelhos e recuperação de anti-soros; Short Protocols in Molecular Biology. 2a edição. 1992. 11.37- 11.41. Contribuidores Helen M. Cooper e Yvonne Paterson; 59 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ geraram-se anti-soros de galinha com Strategic Biosolutions, Ramona, CA).
Rastrearam-se os anti-soros de coelho e a fracção Igy de ovo de galinha para actividade usando transferência "Western". Separou-se cada um dos três antigénios por PAGE e transferiu-se para nitrocelulose 0,45um (Novex, San Diego, CA). Cortou-se a membrana em tiras contendo cada tira aproximadamente 75 ng de antigénio. Bloquearam-se as tiras com bloqueador de grau transferência a 3% (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) e lavou-se 3 vezes em tampão salino de Tris (TBS) 1X/TWEEN a 0,02%. Incubou-se o anticorpo primário (sangramentos de pré-imunização, anti-soros de coelho ou IgY de ovo de galinha a diluições na gama 1:100 a 1:10 000 em tampão de bloqueamento) com as tiras durante uma hora com agitação suave. A uma segunda série de três lavagens em TBS 1X/TWEEN a 0,02%, seguiu-se uma hora de incubação com o anticorpo secundário (de burro anti-coelho conjugado com peroxidase, Amersham Life Science, Piscataway, NJ; ou de burro anti-galinha conjugado com peroxidase, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) . Efectuou-se um ciclo final de 3X lavagens em TBS 1X/TWEEN a 0,02% e revelaram-se as tiras com substrato de transferência "Western" Lumi-Light (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemanha). C. Ensaio de reactividade cruzada de anticorpo:
Após o protocolo descrito na secção anterior incubaram-se tiras de nitrocelulose com Beer, Gremlin ou Dan com diluições dos seus respectivos anti-soros de coelho ou IgY de ovo de galinha (1:5000 e 1:10 000) assim como com anti-soros de coelho ou IgY de ovo de galinha (diluições 1:1000 e 1:5000) contra os dois antigénios remanescentes. Efectuaram-se os niveis mais elevados de anticorpos não correspondentes para detectar ligação de baixa afinidade por esses anticorpos que pode ser observada apenas a concentrações mais elevadas. O protocolo e a duração da revelação é o mesmo para todos os três eventos de ligação usando o protocolo descrito anteriormente. Não se observou reactividade cruzada de antigénio para qualquer dos antigénios ensaiados. 60 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ EXEMPLO 5 INTERACÇÃO DE BEER COM AS PROTEÍNAS DA SUPERFAMÍLIA TGF-
BETA
Estudou-se a interacção de Beer com proteínas de diferentes ramos filogenéticos da superfamília TGF-β usando métodos de imunoprecipitação. Obtiveram-se TGFp-l, ΤΟΕβ-2, ΤΟΕβ-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 e GDNF purificadas de fontes comerciais (R&D systems; Minneapolis, MN) . Segue-se um protocolo representativo. Dialisou-se Beer parcialmente purificada em tampão salino de HEPES (HEPES 25 mM 7,5, NaCl 150 mM) . Efectuou-se imunoprecipitação em 300 ul de tampão IP (NaCl 150 mM, Tris 25 mM pH 7,5, EDTA lmM, β-mercaptoetanol 1,4 mM, triton X 100 a 0,5% e glicerol a 10%). Aplicaram-se 30 ng proteína BMP-5 humana recombinante (R&D systems) a 15 ul de matriz de afinidade FLAG (Sigma; St Louis MO) na presença e ausência de 500 ng de Beer com marcador de epítopo FLAG. Incubaram-se as proteínas durante 4 horas a 4o C e seguidamente lavaram-se as proteínas associadas à matriz de afinidade 5 vezes em tampão IP (1 ml por lavagem). Eluíram-se as proteínas ligadas à matriz de afinidade em 60 microlitros de tampão de amostra SDS PAGE IX. Resolveram-se as proteínas por SDS PAGE e detectou-se BMP-5 associada a Beer por transferência "Western" usando anti-soro anti-BMP-5 (Research Diagnostics, Inc) (consultar a figura 5).
Ensaio de ligação de ligando BEER:
Adicionou-se proteína FLAG-Beer (20 ng) a 100 ul de PBS/BSA a 0,2% e adsorveu-se a cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços previamente revestida com anticorpo monoclonal anti-FLAG (Sigma; St Louis MO) e bloqueou-se com BSA a 10% em PBS. Tal é efectuado à temperatura ambiente durante 60 minutos. Remove-se esta solução de proteína e lavam-se os poços para remover proteína não ligada. Adicionou-se BMP-5 a cada poço em concentrações na gama de 10 pM a 500 nM em PBS/BSA a 0,2% e incubou-se durante 2 horas à temperatura ambiente. Remove-se a solução de ligação e lava-se a placa três vezes com volumes de 200 ul de PBS/BSA a 0,2%. Detectam-se então os níveis de BMP-5 usando anti-soro BMP-5 através de ELISA (F.M. Ausubel et al (1998) Current Protocols 61 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ in Mol Biol. Vol 2 11.2.1-11.2.22). Calculou-se a ligação específica por subtracção da ligação não específica da ligação total e analisou-se pelo programa LIGAND (Munson e Podbard, Anal. Biochem., 107, p220-239, (1980).
Numa variação deste método, concebe-se racionalmente e expressa-se Beer como uma proteína de fusão com Fc humana. De igual modo concebe-se racionalmente e expressa-se o ligando BMP como uma fusão com Fc de ratinho. Incubam-se estas proteínas conjuntamente e efectua-se o ensaio tal como descrito por Mellor et al usando detecção por fluorescência resolvida no tempo homogénea (G.W. Mellor et al., J of Biomol Screening, 3(2) 91-99,1998). EXEMPLO 6
ENSAIO DE RASTREIO PARA INIBIÇÃO DA LIGAÇÃO DA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE TGF-BETA AOS MEMBROS DA FAMÍLIA TGF-BETA O ensaio anteriormente descrito é replicado com duas excepções. Primeiramente fixa-se a concentração de BMP a uma Kd previamente determinada. Em segundo lugar, adiciona-se uma colecção de candidatos a antagonistas a uma concentração fixa (20 uM no caso de colecções de moléculas orgânicas pequenas e 1 uM para estudos com anticorpos). Estas moléculas candidatas (antagonistas) para ligação à proteína de ligação de TGF-beta incluem compostos orgânicos derivados de colecções comerciais ou internas representando várias estruturas químicas. Estes compostos são preparados como soluções-mãe em DMSO e adicionam-se aos poços de ensaio a ^ 1% do volume final nas condições de ensaio padrão. Incubam-se estes durante 2 horas à temperatura ambiente com BMP e Beer, remove-se a solução e quantifica-se o BMP ligado tal como descrito. Os agentes que inibem 40% da ligação observada a BMP na ausência de composto ou anticorpo são considerados antagonistas desta interacção. Estes são analisados adicionalmente como inibidores potenciais com base em estudos de titulação para determinar as suas constantes de inibição e a sua influência na afinidade de ligação à proteína de ligação de TGF-beta. Podem também efectuar-se ensaios de controlo de especificidade comparáveis para estabelecer o perfil de selectividade para o antagonista identificado através de estudos utilizando ensaios dependentes 62 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ da acçao do ligando BMP (e.g. estudo de competição de BMP/receptor de BMP). EXEMPLO 7
INIBIÇÃO DA LOCALIZAÇÃO DA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE TGF-BETA
NA MATRIZ DO OSSO
Efectua-se inibição da localização na matriz óssea (hidroxiapatite) usando modificações ao método de Nicolas (Nicolas, V. Calcif Tissue Int 57:206, 1995). Sucintamente prepara-se proteína de ligação a TGF-beta marcada com 125I tal como descrito por Nicolas (supra). Adiciona-se hidroxiapatite a cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços equipada com uma membrana de filtração de polipropileno (Polyfiltroninc, Weymouth MA). Adiciona-se proteína de ligação a TGF-beta a albumina a 0,2% em tampão PBS. Lavam-se os poços contendo matriz 3 vezes com este tampão. Elui-se a proteína de ligação a TGF-beta adsorvida usando NaOH 0,3M e quantifica-se.
Efectua-se identificação do inibidor por incubação da proteína de ligação a TGF-beta com moléculas de ensaio e aplicação da mistura à matriz tal como anteriormente descrito. Lava-se a matriz 3 vezes com albumina a 0,2% em tampão PBS. Elui-se a proteína de ligação a TGF-beta adsorvida usando NaOH 0,3 M e quantifica-se. Os agentes que inibem 40% da ligação de proteína de ligação a TGF-beta observada na ausência do composto ou anticorpo consideram-se inibidores com localização óssea. Estes inibidores são caracterizados adicionalmente através de estudos de dose-resposta para determinar as suas constantes de inibição e a sua influência na afinidade de ligação da proteína de ligação a TGF-beta. EXEMPLO 8
CONSTRUÇÃO DE UM MUTANTE DA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO A TGF-BETA A. Mutagénese:
Um ADNc de uma proteína de ligação a TGF-beta completa em pBluescript SK serve como molde para mutagénese. Sucintamente utilizam-se iniciadores adequados (consultar a discussão 63 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ apresentada anteriormente) para gerar o fragmento de ADN por reacção de polimerização em cadeia usando polimerase de ADN Vent (New England Biolabs, Beverly, MA). Corre-se a reacção de polimerização em cadeia durante 23 ciclos em tampões proporcionados pelo fabricante usando uma temperatura de hibridação de 57 °C. Expõe-se então o produto a duas enzimas de restrição e após isolamento usando electroforese em gel de agarose, liga-se de volta a pRBP4-503 do qual se removeu a sequência correspondente por digestão enzimática. Verifica-se a integridade do mutante por sequenciação de ADN. B. Expressão em células de mamífero e isolamento da proteína de ligação a TGF-beta mutante:
Transferiram-se os ADNc da proteína de ligação a TGF-beta mutante para o vector de expressão de mamífero pcDNA3.1 descrito no EXEMPLO 3. Após verificação da sequência, transfectam-se as construções resultantes para células COS-1 e purificou-se a proteína excretada tal como descrito no EXEMPLO 3.
EXEMPLO 9 MODELOS ANIMAIS-I
GERAÇÃO DE RATINHOS TRANSGÉNICOS QUE SOBREXPRESSAM 0 GENE
BEER
Utilizou-se o clone BAC 15G5 com -200 quilobases (kb) isolado da biblioteca de ADN genómico de ratinho CITB (distribuída por Research Genetics, Huntsville, AL) para determinar a sequência completa do gene Beer de ratinho e as suas regiões f lanqueadoras a 5' e a 3'. Sub-clonou-se um fragmento Sall de 41 kb contendo o corpo completo do gene, mais -17 kb da sequência flanqueadora a 5' e -20 kb da sequência flanqueadora a 3' no local BamHI do vector de cosmídeo SuperCosI (Stratagene, La Jolla, CA) e propagou-se em E. coli estirpe DH10B. Desta construção de cosmídeo purificou-se por gel usando meios convencionais, um fragmento de restrição de 35 kb MluI - Avill (Sequência N° 6), incluindo o gene Beer de ratinho completo, assim como 17 kb e 14 kb das regiões flanqueadoras a 5' e 3', respectivamente e usou-se 64 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ para micro-injecção de zigotos de ratinho (DNX Transgenics; patente U.S. n° 4 873 191) . Obtiveram-se animais fundadores nos quais o fragmento de ADN clonado foi integrado aleatoriamente no genoma a uma frequência de 5-30% de nados-vivos. Avaliou-se a presença do transgene por análise de transferência "Southern" do ADN genómico extraido de uma pequena quantidade de tecido de ratinho tal como da ponta da cauda. Extraiu-se o ADN usando o seguinte protocolo: digeriu-se o tecido durante a noite a 55 °C num tampão de lise contendo NaCl 200 mM, Tris 100 mM pH 8,5, EDTA 5 mM, SDS a 0,2% e Proteinase K a 0,5 mg/ml. No dia seguinte extraiu-se o ADN uma vez com fenol/clorofórmio (50:50), uma vez com clorofórmio/álcool isoamilico (24:1) e precipitou-se com etanol. Após ressuspensão em TE (Tris 10 mM pH7,5, EDTA 1 mM) digeriu-se 8-10 ug de cada amostra de ADN com uma endonuclease de restrição, tal como EcoRI, submeteu-se a electroforese em gel e transferiu-se para uma membrana de nylon carregada tal como HyBondN+ (Amersham, Arlington Heights, IL) . Hibridou-se então o filtro resultante com um fragmento de ADN marcado radioactivamente derivado do local do gene Beer de ratinho e que é capaz de reconhecer tanto um fragmento do local do gene endógeno como um fragmento com tamanho diferente derivado do transgene. Os animais fundadores procriaram com ratinhos normais não transgénicos para gerar números suficientes de descendência transgénica e não transgénica para determinar os efeitos da sobrexpressão do gene Beer. Para estes estudos, submetem-se animais de diferentes idades (por exemplo, 1 dia, 3 semanas, 6 semanas, 4 meses) a vários ensaios diferentes concebidos para avaliar formação geral do esqueleto, densidade mineral óssea, teor mineral ósseo, actividade osteoclástica e osteoblástica, extensão da ossificação endocôndrica, formação de cartilagem, etc. Pode determinar-se a actividade de transcrição do transgene por extracção do ARN de diferentes tecidos e utilização de um ensaio de RT-PCR que aproveita os polimorfismos de nucleótido único entre a estirpe de ratinhos da qual o transgene é derivado (129Sv/J) e a estirpe de ratinhos usada para micro-injecção de ADN [ (C57BL5/J x SJL/J)F2] . 65 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
MODELOS ANIMAIS - II
INTERRUPÇÃO DO GENE BEER DE RATINHO POR RECOMBINAÇÃO
HOMÓLOGA
Pode utilizar-se a recombinação homóloga em células estaminais embrionárias (ES) para inactivar o gene Beer endógeno de ratinho e gerar subsequentemente animais apresentando uma mutação de perda de função. Concebeu-se racionalmente um gene repórter tal como o gene β-galactosidase de E. coli, no vector de direcção ao alvo de modo a controlar a sua expressão pelo promotor do gene Beer endógeno e pelo sinal de iniciação de tradução. Deste modo podem determinar-se os padrões espacial e temporal de expressão do gene Beer em animais apresentando uma alelo de alvo.
Construiu-se o vector de direcção ao alvo primeiramente por clonagem da cassete dirigida pelo gene de resistência à neomicina (neo) dirigido pelo promotor seleccionável por fármacos fosfoglicerato quinase (PGK) de pGT-N29 (New England Biolabs, Beverly, MA) no vector de clonagem pSP72 (Promega, Madson, WI). Usou-se PCR para flanquear a cassete PGKneo com locais loxP de bacteriófago Pl, que são locais de reconhecimento para a recombinase Cre de Pl (Hoess et al., PNAS USA, 79:3398, 1982). Tal permite a remoção subsequente do marcador de resistência neo em células ES marcadas ou em animais derivados de células ES (patente U.S. 4 959 317). Os iniciadores de PCR foram constituídos pela sequência loxP de 34 nucleótidos (ntd), 15-25 ntd complementares às extremidades 5' e 3' da cassete PGKneo, assim como locais de reconhecimento de enzimas de restrição (BamHI no iniciador em sentido e EcoRI no iniciador anti-sentido) para clonagem em pSP72. A sequência do iniciador em sentido foi 5'- AATCTGGATCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTGCAGGATTCGAGGGC CCCT-3' (SEQ ID NO:34); e a sequência do iniciador anti- sentido foi 5'-AATCTGAATTCCACCGGTGTTAATTAAATAACTTCGTATAATGTATG CTATACGAAGTTATAGATCTAGAGTCAGCTTCTGA-3' (SEQ ID NO:35). A próxima etapa foi a clonagem de um fragmento Xhol-
HindlII de 3,6 kb, contendo o gene β-galactosidase de E. coli e o sinal de poliadenilação SV40 de pSvp (Clontech, Paio Alto, CA) no plasmídeo pSP72-PGKneo. Gerou-se o "braço curto" de 66 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ homologia do local do gene Beer de ratinho por amplificação de um fragmento de 2,4 kb do clone BAC 15G5. A extremidade 3' do fragmento coincidiu com o local de iniciação de tradução do gene Beer e o iniciador anti-sentido usado na PCR também incluiu 30 ntd complementares à extremidade 5' do gene β-galactosidase de modo a que a sua região de codificação pudesse ser fundida em quadro de leitura com o local de iniciação Beer. A abordagem utilizada para introduzir o "braço curto" no plasmídeo pSP72-pgal-PGKneo foi a de linearizar o plasmideo num local a montante do gene β-gal e seguidamente co-transformar este fragmento com o produto de PCR do "braço curto" e seleccionar plasmídeos nos quais o produto de PCR foi integrado por recombinação homóloga. O iniciador em sentido para amplificação do "braço curto" incluiu 30 ntd complementares ao vector pSP72 para permitir este evento de recombinação. A sequência do iniciador em sentido foi 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGAGCAGCTGAAGCTTAACCACATGGTGGCTCACAACCAT -3' (SEQ ID NO:36) e a sequência do iniciador em anti-sentido foi 5'-AACGACGGCCAGTGAATCCGTAATCATGGTCATGCTGCCAGGTGGAGGAGGGCA-3' (SEQ ID NO:37).
Gerou-se o "braço longo" do local do gene Beer por amplificação de um fragmento de 6,1 kb a partir do clone BAC 15G5 com iniciadores que também introduzem os locais raros para enzima de restrição SgrAI, Fsel, Asei e Pacl. Especificamente a sequência do iniciador em sentido foi 5'-ATTACCACCGGTGACACCCGCTTCCTGACAG-3' (SEQ ID NO:38); a sequência do iniciador em anti-sentido foi 5'-ATTACTTAATTAAACATGGCGCGCCATATGGCCGGCCCCTAATTGCGGCGCATCGTTAATT-3' (SEQ ID NO: 39) . Clonou-se o produto de PCR resultante no vector TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) como uma etapa intermédia. A construção de direcção ao alvo do gene Beer de ratinho também incluiu um segundo marcador seleccionável, o gene da timidina quinase do vírus I de herpes simplex (HSVTK) sob controlo do elemento repetitivo terminal longo do vírus do sarcoma de rous (RSV LTR) . A expressão deste gene torna as células de mamífero sensíveis (e inviáveis) a ganciclovir; é assim uma forma conveniente de seleccionar contra células resistentes a neomicina nas quais a construção se integrou através de um evento não homólogo (patente U.S. 5 464 764). 67 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
Amplificou-se a cassete RSVLTR-HSVTK a partir de pPS1337 usando iniciadores que permitiram clonagem subsequente nos locais Fsel e Asei do plasmídeo vector TA de "braço longo". Para esta PCR a sequência do iniciador em sentido foi 5'-ATTACGGCCGGCCGCAAAGGAATTCAAGATCTGA-3' (SEQ ID NO:40); a sequência do iniciador em anti-sentido foi 5'-ATTACGGCGCGCCCCTCACAGGCCGCACCCAGCT-3' (SEQ ID NO:41). A etapa final na construção do vector de direcção ao alvo envolveu a clonagem do fragmento SgrAI-AscI de 8,8 kb contendo o "braço longo" e o gene RSVLTR-HSVTK nos locais SgrAI e Asei do plasmideo pSP72-"braço curto"-Pgal-PGKneo. Este vector de direcção ao alvo foi linearizado por digestão com Asei ou PacI antes de electroporação para células ES. EXEMPLO 10
INACTIVAÇÃO DE BEER MEDIADA POR ANTI-SENTIDO
Preparam-se oligonucleótidos em anti-sentido com 17 nucleótidos num formato em sobreposição, de modo a que a extremidade 5' do primeiro oligonucleótido se sobreponha ao AUG de iniciação de tradução do produto de transcrição Beer e as extremidades 5' dos oligonucleótidos sucessivos ocorrem em incrementos de 5 nucleótidos deslocando-se no sentido 5' (até a 50 nucleótidos de distância) relativamente à AUG de Beer. Concebem-se e preparam-se oligonucleótidos de controlo correspondentes usando composições de bases equivalentes mas com sequência redistribuída para inibir qualquer hibridação significativa com o ARNm codificante. A entrega de reagentes ao sistema celular de ensaio é efectuada através de entrega de lípidos catiónicos (P.L. Felgner, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (94:7413, 1987). Adicionam-se 2 ug de oligonucleót ido em anti- sentido a 100 ul de meio sérico reduzido (meio sérico reduzido Opti-MEM I; Life Technologies, Gaithersburg MD) e este é misturado com reagente de Lipofectina (6 ul) (Life Technologies, Gaithersburg MD) nos 100 ul de meio sérico reduzido. Estes são misturados, deixam-se complexar durante 30 minutos à temperatura ambiente e adiciona-se a mistura a células MC3T3E21 ou KS483 previamente inoculadas. Cultivam-se estas células e recupera-se o ARNm. Monitoriza-se o ARNm de Beer usando RT-PCR conjuntamente com iniciadores específicos 68 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ de Beer. Além disso, recolhem-se poços experimentais separados e caracterizam-se os níveis de proteína através de métodos de transferência "Western" descritos no exemplo 4. Recolhem-se as células, ressuspendem-se em tampão de lise (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 20 mM, EDTA 1 mM, SDS a 1%) e recolheu-se a proteína solúvel. Aplica-se este material a SDS PAGE com gradiente desnaturante de 10-20%. Transferem-se as proteínas separadas para nitrocelulose e efectua-se a transferência "Western" tal como anteriormente descrito usando os reagentes de anticorpo descritos. Paralelamente adicionam-se oligonucleótidos de controlo a culturas idênticas e repetem-se as operações experimentais. A diminuição dos níveis de ARNm ou proteína Beer é considerada significativa se o tratamento com o oligonucleótido anti-sentido resultar numa alteração de 50% em cada situação comparativamente com o oligonucleótido de controlo aleatório. Esta metodologia permite inactivação selectiva de genes e subsequente caracterização fenotípica dos nódulos mineralizados no modelo de cultura de tecidos. EXEMPLO 11
MODELAÇÃO DA REGIÃO NUCLEAR DA ESCLEROSTINA
As técnicas de reconhecimento de homologia (e.g., PSI-BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997)); FUGUE (Shi et al., J. Mol. Biol. 310:243-57 (2001)) sugeriram que a região nuclear de SOST (SOST_Core) adopta um enrolamento de nó de cistina. FUGUE é um método sensível para detectar homologia entre sequências e estruturas. Identificou-se por FUGUE (Shi et al., supra) a gonadotropina coriónica β humana (hCG-β) para a qual se conhece uma estrutura tridimensional determinada experimentalmente, como o homólogo mais próximo de SOST_Core. Assim, usou-se hCG-β como o molde estrutural para construir modelos tridimensionais para SOST_Core.
Apresenta-se na figura 7 um alinhamento de SOST_Core e dos seus homólogos próximos. Entre os homólogos apresentados no alinhamento apenas hCG-β (CGHB) tinha estrutura tridimensional conhecida. A identidade de sequência entre SOST_Core e hCG-β foi de aproximadamente 25%. Oito resíduos de CYS estavam conservados ao longo de toda a família, reforçando a 69 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ semelhança estrutural global entre SOST_Core e hCG-β. Três pares de cistinas (1-5, 3-7, 4-8) formaram ligações dissulfureto (apresentados com linhas a cheio na figura 7) numa configuração em "nó", que é caracteristica do enrolamento em nó de cistina. Uma ligação dissulfureto extra (2-6), apresentada como uma linha a tracejado na figura 7, foi única desta família e distinguiu a família de proteínas de outras famílias de nó de cistina (e.g., TGF-β, BMP).
Modelou-se SOST_Core usando PDB (Berman et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 58(Pt 6 Ptl) :899-907 (2002)) entrada 1HCN, usando-se a estrutura tridimensional de hCG-β (Wu et al., Structure 2:545-58 (1994)) como o molde estrutural. Calcularam-se modelos com MODELER (Sali & Blundell, J. Mol. Biol. 234:779-815 (1993)). Apresenta-se na figura 8 uma imagem do melhor modelo. A maioria das proteínas de nó de cistina formam dímeros devido à ausência de núcleo hidrofóbico num monómero (Scheufler et al., supra; Schlunegger e Grutter, J. Mol. Biol. 231:445-58 (1993)); Wu et al., supra). A SOST segue provavelmente a mesma regra e forma um homodímero para aumentar a sua estabilidade. A construção de um modelo para a região SOST_Core dimerizada apresentou vários desafios porque (1) a semelhança de sequência entre SOST_Core e hCG-β foi baixa (25%); (2) em vez de um homodímero hCG-β formou um heterodímero com hCG-α; e (3) observaram-se várias conformações de monómeros relativas diferentes em proteínas de nó de cistina dimerizadas de diferentes famílias (e.g., PDGF, TGF-β, neurotrofina, IL-17F, gonadotrofina), o que sugeriu que a conformação em dímero de SOST poderia desviar-se significativamente da conformação em heterodímero hCG-α/β. N construção do modelo substituiu-se hCG-α com hCG-β da estrutura em heterodímero (1HCN) usando técnicas de sobreposição de estrutura combinadas com ajuste manual e seguidamente construiu-se um modelo de homodímero SOST_Core de acordo com a estrutura de homodímero de pseudo hCG-β. Apresenta-se o modelo final na figura 9. 70 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ EXEMPLO 12
MODELAÇÃO DA INTERACÇÃO SOST-BMP
Este exemplo descreve a modelação de proteína dos locais de ligação de receptor de tipo I e tipo II em BMP que estão envolvidos na interacção entre BMP e SOST.
Os estudos de competição demonstraram que SOST competia tanto com os receptores do tipo I como com os receptores do tipo II relativamente à ligação a BMP. Num ensaio de competição baseado em ELISA, BMP-6 interagiu selectivamente com a superfície revestida com esclerostina (300 ng/poço) com elevada afinidade (KD = 3,4 nM). Quantidades crescentes do receptor de BMP IA (construção de fusão FC) competiram com esclerostina relativamente à ligação a BMP-6 (11 nM) (IC5o = 114nM) . Um excesso molar de 10 vezes do receptor BMP foi suficiente para reduzir a ligação de esclerostina a BMP-6 em aproximadamente 50%. Esta competição foi também observada com uma proteína de fusão receptor BMP II-FC (IC50 = 36nM) e DAN (IC50 = 43nM). Comprovou-se a especificidade do ensaio por ausência de competição relativamente a ligação a BMP-6 entre esclerostina e uma proteína de fusão rActivina R1B-FC, um membro da família de receptores TGF-β que não ligou BMP.
Os locais de ligação de receptor do tipo I e do tipo II num polipéptido BMP foram mapeados e foram separados espacialmente (Scheufler et al., supra; Innis et al., supra; Nickel et al., supra; Hart et al. supra). Noggin, outro antagonista de BMP que se liga a BMP com elevada afinidade, contacta com ambos os locais de ligação de receptor BMP do tipo I e do tipo II através da parte N-terminal de Noggin (Groppe et al., supra). As duas cadeias β na região nuclear perto do C-terminal também estão em contacto com BMP no local de ligação de receptor do tipo II.
Um alinhamento afinado manualmente de Noggin e SOST indicou que os dois polipéptidos partilhavam semelhança de sequência entre as partes N-terminal das proteínas e entre as regiões de núcleo. Apresenta-se na figura 10 um alinhamento de sequência de aminoácidos. Os resíduos de cisterna que formam o nó de cistina característico estavam conservados entre Noggin 71 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ e SOST. A identidade global de sequência foi de 24% e a identidade de sequência no interior da região de ligação N-terminal (posições de alinhamento 1-45) foi de 33%. Relatou-se que dois residuos na região de ligação N-terminal de Noggin, nomeadamente Leu (L) na posição de alinhamento 21 e Glu (E) na posição 23, desempenham papéis importantes na ligação de BMP (Groppe et al., supra). Ambos os residuos estavam também conservados em SOST. A semelhança de sequência no interior da região de núcleo (posições de alinhamento 131-228) foi cerca de 20%, mas o esqueleto de nó de cistinas foi mantido e um número suficiente de residuos chave foi conservado, apoiando a homologia entre Noggin e SOST.
Comparou-se a estrutura Noggin com SOST também para compreender como se efectua a dimerização de dois monómeros SOST. Tal como apresentado na figura 11, a estrutura Noggin sugeriu que o ligante entre a região N-terminal e a região nuclear desempenhou não apenas um papel de ligação de ambas as regiões, como também fez parte da interface de dimerização entre os dois monómeros Noggin. Uma diferença principal entre Noggin e SOST foi que o ligante entre a região N-terminal e a região nuclear foi muito mais curto em SOST. A região C-terminal de SOST pode desempenhar um papel na dimerização de SOST. A sequência de Noggin finalizou com a região de núcleo enquanto SOST tinha uma região C-terminal extra. Na estrutura Noggin uma ligação dissulfureto ligava os C-terminais dos dois monómeros de Noggin. Assim, a região C-terminal de SOST iniciou-se perto da interface dos dois monómeros e poderia contribuir para a dimerização. Além disso, a previsão da estrutura secundária mostrou que algumas partes da região C-terminal de SOST tinham uma tendência para formar hélices. Esta região em SOST pode ser responsável pela actividade de dimerização, possivelmente através do empacotamento hélice-hélice, que mimetizou a função do ligante mais longo em Noggin. Outra diferença entre a estrutura de Noggin e SOST foi a inserção de aminoácidos na região nuclear de SOST nas posições de alinhamento 169-185 (consultar figura 10). Esta inserção estendeu uma estrutura em gancho de cabelo-β, que apontava na direcção da interface de dimerização na estrutura de Noggin (apresentado na figura 11 como uma região de ansa no meio dos monómeros e por cima do residuo Cys C- 72 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ terminal). Esta estrutura em gancho de cabelo-β alongada poderia também contribuir para a dimerização de SOST. EXEMPLO 13
CONCEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE PÉPTIDOS IMUNOGÉNICOS DE SOST
Este exemplo descreve a concepção de péptidos imunogénicos SOST que são usados para imunizar animais e gerar anticorpos que bloqueiam interacções entre BMP e SOST e evitam a formação de dimeros de monómeros SOST.
Fragmentos de ligação de BMP A semelhança global entre SOST e Noggin e a semelhança entre as regiões N-terminal dos dois polipéptidos sugere que SOST pode interagir com BMP de um modo semelhante a Noggin. Ou seja, a região N-terminal de SOST pode interagir com os locais de ligação de receptor tanto do tipo I como do tipo II em BMP e uma parte da região nuclear (posições de alinhamento de aminoácido 190-220 na figura 10) pode interagir com o local de ligação de receptor do tipo II de modo a que anticorpos específicos para estas regiões SOST possam bloquear ou impedir a ligação de BMP a SOST.
As sequências de aminoácidos destes fragmentos de polipéptido SOST para SOST de rato e humana são seguidamente proporcionados. SOST_N_Linker: Região N-terminal (inclui o ligante curto que liga à região nuclear)
Humano· QGWQAFKNDATEIEPELGEYPEPPPELENNKTMNRAE NGGRPPHHPFETKDVSEYS (SEQ E> NO:92)
Rato: QGWQAílQTOATCIIPGLREYPEPPQELENNQTMNRAEN GGRPPIIHPYDTKDVSEYS (SEQ Π) NO:93) SOST_Core_Bind: Parte da região nuclear que está possivelmente em contacto com BMP no seu local de ligação de receptor de tipo II (estendendo-se ligeiramente em ambos os terminais para incluir as âncoras de resíduos CYS):
Humano: CIPDRYRAQRVQLLCPGGEAPRARKVRLVASC (SEQ ID NO:94) 73 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
Rato: CIPDRYRAQRVQLLCPGGAAPRSRKVRLVASC (SEQ ID NO:95) Fragmentos de dimerização de SOST A região C-terminal de SOST está provavelmente envolvida na formação de homodímeros SOST (consultar exemplo 12) . 0 ganho de cabelo-β alongado pode também desempenhar um papel na formação do homodimero. Os anticorpos que se ligam especificamente a tais regiões podem evitar ou prejudicar a dimerização de monómeros SOST, o que por sua vez pode interferir com a interacção entre SOST e BMP. Os fragmentos de polipéptido SOST em ratos e humanos correspondentes a estas regiões são como se segue. SOST_C: a região C-terminal
Humano: LTREEtNQSELKDFQTEAARPQKGRKPRPRAKSAKANQA ELENAY (SEQ ID NO:96)
Rato: LTRFHNQSELKDFGPETARPQKGRKPRPRARGAKANQAE LENAY (SEQ ID NO:97) SOST_Core_Dimer: Parte da região nuclear que está provavelmente envolvida na dimerização de SOST (estendendo-se ligeiramente em ambos os terminais para incluir as âncoras de resíduos CYS):
Humano: CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID NO:98)
Rato: CGPARLLPNAIGRVKWWRPNGPDFRC (SEQ ID NO:99)
Fragmento de ligação de BMP no N-terminal de SOST
A região chave N-terminal para ligação de SOST (posições de alinhamento 1-35 na figura 10) foi modelada com base na estrutura do complexo Noggin/BMP-7 (entrada do Protein Data Bank n°: 1M4U) e no alinhamento da sequência de aminoácidos (consultar figura 10) para identificar os resíduos de aminoácido do N-terminal de SOST que possivelmente interagem com BMP. Apresenta-se na figura 12 o modelo de SOST. No modelo comparativo, a fenilalanina (Phe, F) na posição de alinhamento 8 (consultar seta e texto que a acompanha) na sequência SOST 74 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ projecta-se no bolso hidrofóbico à superfície do dímero BMP. Esta mesma característica tipo "maçaneta na cavidade" foi observada na estrutura de complexo de BMP e de receptor do tipo I (Nickel et al., supra), na qual Phe85 do receptor encaixa no mesmo bolso, que é uma característica chave para reconhecimento de ligando-receptor do tipo I para os membros da superfamília TGF-β (incluindo, por exemplo, família TGF-β, família BMP e semelhantes) . De acordo com este modelo, está também conservada uma volta causada por prolina (Pro), o que permite que o fragmento de ligação do N-terminal se entrelace ao longo da superfície do dímero BMP, deslocando-se entre o local de ligação de receptor do tipo I para o local de ligação de receptor do tipo II no outro lado do complexo. Está também conservada outra volta causada por Pro perto da extremidade carboxilo do fragmento de ligação, que está então em contacto com a região de ligante. São evidentes na figura 12 contactos extensos entre SOST e BMP. Péptidos imunogénicos
Conceberam-se péptidos para abranger a região N-terminal de SOST que se prevê estar em contacto com proteínas BMP. Apresentam-se abaixo as sequências peptídicas. Para imunizar animais, conceberam-se as sequências peptídicas para se sobreporem e adicionou-se uma cisteína adicional à extremidade C-terminal para facilitar reticulação a KLH. Usaram-se então os péptidos para imunização. As sequências peptídicas dos imunogénios são como se segue. SOST humana: (SEQ ID NO:47) (SEQ ID NO:48) (SEQ ID NO:49) (SEQ ID NO:50)
QGWQAFKNDATEIIPELGEY TEIIPELGEYPEPPPELENN PBPPPBLBNNKTMNRABNGG KTMNRAENGGRPPHHPFETK RPPHHPFETKDVSEYS (SEQ ID NO:51) 75 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ Péptidos SOST humanos com Cys adicional: QGWQAFKNDATEIIPELGEY-C (SEQ ID NO:52) TEIIPELGEYPEPPPELENN-C (SEQ ID NO:53) PEPPPELENNKTMNRAENGG-C (SEQ ID NO:54) KTMNRAENGGRPPHHPFETK-C (SEQ ID NO:55) RPPHHPFETKDVSEYS-C (SEQ ID NO:56) SOST de rato: QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPP (SEQ ID NO:57) PEPPQELENNQTMNRAENGG (SEQ ID NO:58) ENGGRPPBBPYDTKDVSEYS (SEQ ID NO:59) TEIIPGLREYPEPPQELENN (SEQ ID NO:60) Péptidos SOST de rato com Cys adicional: QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPP-C (SEQ ID NO:61) PEPPQELENNQTMNRAENGG-C (SEQ ID NO:62) ENGGRPPHHPYDTKDVSEYS-C (SEQ ID NO:63) TEIIPGLREYPEPPQELENN-C (SEQ ID NO:64)
Conceberam-se os seguintes péptidos para conter a parte de aminoácidos da região nuclear que se prevê estar em contacto com proteínas BMP. Adicionaram-se cisteínas à extremidade C-terminal de cada péptido para conjugação com KLH e utilizaram-se os péptidos conjugados para imunização. No péptido N-terminal do núcleo de acoplamento alterou-se uma cisteína interna para uma serina de modo a evitar conjugação dupla a KLH. 76 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
Para SOST humana:
Sequência de aminoácidos sem adição de resíduos de Cys:
Docking_Core_N-terminal_Peptide: IPDRYRAQRVQLLCPGGEAP (SEQ ID NO:66)
Docking_Core_Cterm_Peptide: QLLCPGGEAPRARIKVRLVAS (SEQ ID NO:67)
Docking_Core_N-terminal_Peptide: IPDRYRAQRVQLLCPGGEAP-C (SEQ ID NO:68)
Docking_Core_Cterm_Peptide: QLLCPGGEAPRARKVRLVAS-C (SEQ ID NO:69)
Para SOST de rato:
Sequência de aminoácidos sem resíduos de Cys adicionados ou substituídos:
Docking_Core_N-terminal_Peptide: IPDRYRAQRVQLLSPGG (SEQ ID NO:70)
Docking_Core_Cterm__Peptide: PGGAAPRSRKVRLVAS (SEQ ID NO:71) Péptidos imunogénicos com Cys adicionada e substituída:
Docking_Core_N-terminal_Peptide: IPDRYRAQRVQLLSPGG-C (SEQ ID NO:72)
Docking_Core_Cterm_Peptide: PGGAAPRSRKVRLVAS-C (SEQ ID NO:73)
Duas regiões no interior de SOST que interagem potencialmente para formar homodímeros SOST incluem os aminoácidos com a região de núcleo SOST que não estão presentes em Noggin. Os péptidos SOST humanos concebidos para conter esta sequência tinham uma Cys C-terminal ou N-terminal que foi conjugada com KLH. Para o péptido SOST de rato, 77 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ adicionou-se uma cisteina ao carboxilo terminal da sequência (SEQ ID NO:76). Usaram-se os péptidos conjugados com KLH para imunização.
Para SOST humana: CGPARLLPNAIGRGKWWRPS (SEQ ID NO:74) IGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID NO:75)
Para SOST de rato: PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO:76) Péptido SOSt de rato com adição de cisteina PNAIGRVKWWRPNGPDFR-C (SEQ ID NO:77) A segunda região no interior de SOST que interage potencialmente para formar homodimeros SOST inclui a região C-terminal. Conceberam-se péptidos imunogénicos para incluir sequências de aminoácido no interior desta região (consultar seguidamente). Para conjugação a KLH, adicionou-se um resíduo de cisteina à extremidade C-terminal e usaram-se os péptidos conjugados para imunização.
Para SOST humana: KRLTRFHNQS ELKDFGTEAA (SEQ ID NO:78) ELKDFGTEAA RPQKGRKPRP (SEQ ID NO:79) RPQKGRKPRP RARSAKANQA (SEQ ID NO:80) RARSAKANQA ELENAY (SBQ ID NO:81) Péptidos imunogénicos com Cys adicionada aos C-terminais: KRLTRFHNQS ELKDFGTEAA-C (SEQ ID NO:82) 78 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ ELKDFGTEAA RPQKGRKPRP-C (SEQ ID ΝΟ:83) RPQKGRKPRP RARSAKANQA-C (SEQ ID ΝΟ:84) RARSAKANQA ELENAY-C (SEQ ID ΝΟ:85)
Para SOST de rato: KRLTRFHNQSELKDFGPETARPQ (SEQ ID NO:86) KGRKPRPRARGAKANQAELENAY (SEQ ID NO:87) SELKDFGPETARPQKGRKPRPRAR (SEQ ID NO:88) Péptidos imunogénicos com Cys adicionada aos C-terminais: KRLTRFHNQSELKDFGPETARPQ-C (SEQ ID NO:89) KGRKPRPRARGAKANQAELENAY-C (SEQ ID NO:90) SELKDFGPETARPQKGRKPRPRAR-C (SEQ ID NO:91) EXEMPLO 14
ENSAIO PARA DETECTAR LIGAÇÃO DE ANTICORPOS A UMA PROTEÍNA
DE LIGAÇÃO A TGF-BETA
Este exemplo descreve um ensaio para detectar ligação de um ligando, por exemplo, um anticorpo ou um seu fragmento de anticorpo, à esclerostina.
Preparou-se uma proteína de fusão FLAG®-esclerostina de acordo com protocolos proporcionados pelo fabricante (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) e tal como descrito na patente U.S. n° 6 395 511. Reveste-se cada poço de uma placa de microtitulação com 96 poços com anticorpo monoclonal anti-FLAG® (Sigma Aldrich) e seguidamente bloqueia-se com BSA a 10% em PBS. Adiciona-se a proteína de fusão (20 ng) a 100 μΐ de PBS/BSA a 79 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ 0,2% e adsorve-se na placa de 96 poços durante 60 minutos à temperatura ambiente. Remove-se esta solução de proteína e lavam-se os poços para remover proteína de fusão não ligada. Dilui-se uma BMP, por exemplo, BMP-4, BMP-5, BMP-6 ou BMP-7 em PBS/BSA a 0,2% e adiciona-se a cada poço a concentrações na gama de 10 pM a 500 nM. Após incubação durante 2 horas à temperatura ambiente, remove-se a solução de ligação e lava-se a placa três vezes com volumes de 200 μΐ of PBS/BSA a 0,2%. Detecta-se a ligação da BMP a esclerostina usando anti-soro policlonal ou anticorpo monoclonal específico para a BMP e um reagente de segunda etapa conjugado a enzima apropriado de acordo com técnicas ELISA padrão (consultar, e.g., Ausubel et al., Current Protocols in Mol Biol. Vol 2 11.2.1-11.2.22 (1998)). Calcula-se a ligação específica por subtracção da ligação não específica da ligação total e analisa-se usando o programa LIGAND (Munson e Podbard, Anal. Biochem. 107:220-39 (1980)). A ligação de esclerostina a uma BMP é também detectada por detecção por fluorescência resolvida no tempo homogénea (Mellor et al., J Biomol. Screening, 3:91-99 (1998)). Uma sequência de polinucleótidos que codifica esclerostina é ligada operacionalmente a uma região constante de imunoglobulina humana numa construção de ácido nucleico recombinante e expressa-se como uma proteína de fusão Fc humana-esclerostina de acordo com métodos conhecidos na especialidade e aqui descritos. De igual modo, um ligando BMP é concebido racionalmente e expresso como uma proteína de fusão BMP-Fc de ratinho. Incubam-se conjuntamente estas duas proteínas de fusão e efectua-se o ensaio tal como descrito por Mellor et al. EXEMPLO 15
ENSAIO DE RASTREIO PARA ANTICORPOS QUE INIBEM A LIGAÇÃO DE MEMBROS DA FAMÍLIA TGF-BETA À PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE TGF-BETA
Este exemplo descreve um método para detectar um anticorpo que inibe a ligação de um membro da família TGF-beta a esclerostina. Efectua-se um ELISA essencialmente como descrito no exemplo 14 com excepção da concentração de BMP ser mantida constante ao seu Kd (determinado, por exemplo, por análise 80 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ BIAcore). Além disso, adiciona-se um anticorpo ou uma biblioteca ou colecção de anticorpos aos poços a uma concentração de 1 μΜ. Incubam-se anticorpos durante 2 horas à temperatura ambiente e com a BMP e esclerostina, remove-se a solução e quantifica-se a BMP ligada tal como descrito (consultar exemplo 14). Os anticorpos que inibem 40% da ligação de BMP observada na ausência de anticorpo são considerados antagonistas desta interacção. Estes anticorpos são adicionalmente avaliados como inibidores potenciais pela realização de estudos de titulação para determinar as suas constantes de inibição e o seu efeito na afinidade de ligação da proteína de ligação a TGF-beta. Podem também efectuar-se ensaios de controlo de especificidade comparável para estabelecer o perfil de selectividade para o antagonista identificado usando ensaios dependentes da acção do ligando BMP (e.g., um estudo de competição de BMP/receptor de BMP). EXEMPLO 16
INIBIÇÃO DA LOCALIZAÇÃO DA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO A TGF-BETA
NA MATRIZ ÓSSEA
Efectua-se a avaliação da inibição da localização na matriz óssea (hidroxiapatite) usando modificações ao método de Nicolas (Calcif. Tissue Int. 57:206-12 (1995)). Sucintamente prepara-se proteína de ligaçao a TGF-beta marcada com I tal como descrito por Nicolas (supra). Adiciona-se hidroxiapatite a cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços equipada com uma membrana de filtração de polipropileno (Polyfiltroninc, Weymouth MA). Adiciona-se proteína de ligação a TGF-beta a albumina a 0,2% em tampão PBS. Lavam-se os poços contendo matriz 3 vezes com tampão de albumina a 0,2% em PBS. Elui-se a proteína de ligação a TGF-beta adsorvida usando NaOH 0,3M e seguidamente quantifica-se.
Identifica-se um anticorpo que inibe ou afecta a ligação da proteína de ligação a TGF-beta esclerostina a hidroxiapatite por incubação da proteína de ligação a TGF-beta com o anticorpo e aplicação da mistura à matriz tal como descrito anteriormente. Lava-se a matriz 3 vezes com albumina a 0,2% em tampão PBS. Elui-se a esclerostina adsorvida com NaOH 0,3M e seguidamente quantifica-se. Um anticorpo que inibe 81 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ ο nível de ligação de esclerostina à hidroxiapatite em pelo menos 40% comparativamente com o nível de ligação observado na ausência de anticorpo considera-se como um inibidor de localização óssea. Tal anticorpo é caracterizado adicionalmente em estudos de dose-resposta para determinar a sua constante de inibição e o seu efeito na afinidade da ligação da proteína de ligação a TGF-beta.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Brunkow, Mary E.
Galas, David J.
Kovacevich, Brian Mulligan, John T.
Paeper, Bryan W.
Van Ness, Jeffrey Winkler, David G.
<120> COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA AUMENTAR A MINERALIZAÇÃO ÓSSEA <130> 60117-136 <140> <141> 2004-06-15 <150> US 10/463 190 <151> 2003-06-16 <160> 143 <170> FastSEQ para Windows Versão 3.0 <210> 1 <211> 2301 <212> ADN <213> Homo sapien 82 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <400> 1 agagcctgtg ctactggaag gcggcgtgcc ctcctctggc tggtaccatg cagctcccac 60 tggccctgtg tctcgtctgc ctgctggtac acacagcctt ccgtgtagtg gagggccagg 120 ggtggcaggc gttcaagaat gatgccacgg aaatcatccc cgagctcgga gagtaccccg 180 agcctccacc ggagctggag aacaacaaga ccatgaaccg ggcggagaac ggagggcggc 240 ctccccacca cccctttgag -accaaagacg tgtccgagta cagctgccgc gagctgcact 300 tcacccgcta cgtgaccgat gggccgtgcc gcagcgccaa gccggtcacc gagctggtgt 360 gctccggcca gtgcggcccg gcgcgcctgc tgcccaacgc catcggccgc ggcaagtggt 420 ggcgacctag tgggcccgac ttccgctgca tccccgaccg ctaccgcgcg cagcgcgtgc 480 agctgctgtg tcccggtggt gaggcgccgc gcgcgcgcaa ggtgcgcctg gtggcctcgt 540 gcaagtgcaa gcgcctcacc cgcttccaca accagtcgga gctcaaggac ttcgggaccg 600 aggccgctcg gccgcagaag ggccggaagc cgcggccccg cgcccggagc gccaaagcca 660 accaggccga gctggagaac gcctactaga gcccgcccgc gcccctcccc accggcgggc 720 gccccggocc tgaacccgcg ccccacattt ctgtcctctg cgcgtggttt gattgtttat 780 atttcattgt aaatgcctgc aacccagggc agggggctga gaccttccag gccctgagga 840 atcccgggcg ccggcaaggc ccccctcagc ccgccagctg aggggtccca cggggcaggg 900 gagggaattg agagtcacag acactgagcc acgcagcccc gcctotgggg ccgcctacot 960 ttgctggtcc cacttcagag gaggcagaaa tggaagcatt ttcaccgccc tggggtttta 1020
agggagcggt gtgggagtgg gaaagtccag ggactggtta agaaagttgg ataagattcc ÍOBO cccttgcacc tcgctgcoca tcagaaagcc tgaggcgtgc ccagagcaca agactggggg 1140 caactgtaga tgtggtttot agtcctggct ctgccaotaa cttgctgtgt aaccttgaac 1200 tacacaattc tccttcggga cctcaatttc cactttgtaa aatgagggtg gaggtgggaa 1260 taggatctcg aggagactat tggcatatga ttccaaggac tccagtgcct tttgaatggg 1320 cagaggtgag agagagagag agaaagagag agaatgaatg cagttgcatt gattcagtgc 1380 caaggtcact tccagaattc agagttgtga tgctctcttc tgacagccaa agatgaaaaa 1440 <210> 2 <211> 213
<212> PRT <213> Homo sapien <400> 2
Met Gin Leu Pro Leu Ala Leu Cys Leu Vai Cys Leu Leu Vai His Thr 15 10 15
Ala Phe Arg Vai Vai Glu Gly Gin Gly Trp Gin Ala Phe Lys Asn Asp 20 25 30
Ala Thr Glu Ile Ile Pro Glu Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro 35 40 45
Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg 50 55 60
Pro Pro His His Pro Phe Glu Thr Lys Asp Vai Ser Glu Tyr Ser Cys 65 70 75 80
Arg Glu Leu His Phe Thr Arg Tyr Vai Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser 85 90 95
Ala Lys Pro Vai Thr Glu Leu Vai Cys Ser Gly Gin Cys Gly Pro Ala 100 105 110
Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro Ser 115 120 125
Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gin Arg Vai 130 135 140
Gin Leu Leu Cys Pro Gly Gly Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Vai Arg 145 150 155 160
Leu Vai Ala Ser Cys Lys Cys Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gin 165 170 175
Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly Thr Glu Ala Ala Arg Pro Gin Lys Gly 180 185 190
Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala Arg Ser Ala Lys Ala Asn Gin Ala Glu 195 200 205
Leu Glu Asn Ala Tyr 210 <210> 3 <211> 2301 <212> ADN <213> Homo sapien 83 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <40 0> 3 agagcctgtg ctactggaag gtggcgtgcc ctcctctggo tggtaccatg cagctcccac 60 tggccetgtg tctcgtctgc ctgctggtac acacagcctt ccgtgtagtg gagggctagg 120 ggtggcaggc gttcaagaat gatgccacgg aaatcatccc cgagctcgga gagtaccccg 180 agcctccacc ggagctggag aacaacaaga ccatgaaccg ggcggagaac ggagggcggc 240 ctccccacca cccctttgag accaaagacg tgtccgagta cagctgccgc gagctgcact 300 tcacccgcta cgtgaccgat gggccgtgcc gcagcgccaa gccggtcacc gagctggtgt 360 gctccggcca gtgcggcccg gcgcgcctgc tgcccaacgc catcggccgc ggcaagtggt 420 ggcgacctag tgggcccgac ttccgctgca tccccgaccg ctaccgcgcg cagcgcgtgc 480 agctgctgtg tcccggtggt gaggcgccgc gcgcgcgcaa ggtgcgcctg gtggcctcgt 540 gcaagtgcaa gcgcctcacc cgcttccaca accagtcgga gctcaaggac ttcgggaccg 600 aggccgctcg gccgcagaag ggccggaagc cgcggccccg cgcccggagc gccaaagcca 660 accaggccga gctggagaac gcctactaga gcccgcccgc gcccctcccc accggcgggc 720 gccccggccc tgaacccgcg ccccacattt ctgtcotctg cgcgtggttt gattgtttat 780 atttcattgt aaatgcctgc aacccagggc agggggctga gaccttccag gccctgagga 840 atcccgggcg ccggcaaggc ccccctoagc ccgccagctg aggggtccca cggggcaggg 900 gagggaattg agagtcacag acactgagcc acgcagcccc gcctctgggg ccgcctacct 960 ttgctggtcc cacttcagag gaggcagaaa tggaagcatt ttcaccgccc tggggtttta 1020 agggagcggt gtgggagtgg gaaagtccag ggactggtta agaaagttgg ataagattcc 1080 cccttgcacc tcgctgccca tcagaaagcc tgaggcgtgc ccagagcaca agactggggg 1140 caaotgtaga tgtggtttct agtcctggct ctgccactaa cttgctgtgt aaccttgaac 1200 tacacaattc tccttcggga cctcaatttc cactttgtaa aatgagggtg gaggtgggaa 1260 taggatctcg aggagactat tggcatatga ttccaaggac tccagtgcct tttgaatggg 1320 cagaggtgag agagagagag agaaagagag agaatgaatg cagttgcatt gattcagtgc 1380 caaggtcact tccagaattc agagttgtga tgctctcttc tgacagccaa agatgaaaaa 1440 caaacagaaa aaaaaaagta aagagtctat ttatggctga catatttacg gctgacaaac 1500 tcctggaaga agctatgctg cttcccagcc tggcttcccc ggatgtttgg ctacctccac 1560 ccctccatct caaagaaata acatcatcca ttggggtaga aaaggagagg gtccgagggt 1620 ggtgggaggg atagaaatca catccgcccc aacttcccaa agagcagcat ccctcccccg 1680 acccatagcc atgttttaaa gtcaccttoc gaagagaagt gaaaggttca aggacactgg 1740 ccttgcaggc ccgagggagc agccatcaca aactcacaga ccagcacatc ccttttgaga 1800 caccgccttc tgcccaccac tcacggacac atttctgcct agaaaacagc ttcttactgc 1860 tcttacatgt gatggcatat cttacactaa aagaatatta ttgggggaaa aactacaagt 1920 gctgtacata tgctgagaaa ctgcagagca taatagctgc cacccaaaaa tctttttgaa 1980 aatcatttcc agacaacctc ttactttctg tgtagttttt aattgttaaa aaaaaaaagt 2040 tttaaacaga agcacatgac atatgaaagc ctgcaggact ggtcgttttt ttggcaattc 2100 ttccacgtgg gacttgtcca caagaatgaa agbagtggtt tttaaagagc Caagttacat 2160 atttattttc tcacttaagt tatttatgca aaagtttttc ttgtagagaa tgacaatgtt 2220 aatattgctt tatgaattaa cagtctgttc ttccagagtc cagagacatt gttaataaag 2280 acaatgaatc atgaccgaaa g 2301 <210> 4 <211> 23
<212> PRT <213> Homo sapien <400> 4
Met Gin Leu Pro Leu Ala Leu Cys Leu Vai Cys Leu Leu Vai His Thr 15 10 15
Ala Phe Arg Vai Vai Glu Gly 20 <210> 5 <211> 2301 <212> ADN <213> Homo sapien 84 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ < 4 Ο Ο > 5 agagcctgtg ctactggaag gtggcgtgcc ctcctctggc tggtaccatg cagctcccac 60 tggccctgtg tctcatctgc ctgctggtac acacagcctt ccgtgtagtg gagggccagg 120 ggtggcaggc gttcaagaat gatgccacgg aaatcatccg cgagctcgga gagtaccccg 180 agcctccacc ggagctggag aacaacaaga ccatgaaccg ggcggagaac ggagggcggc 240 ctccccacca cccctttgag accaaagacg tgtccgagta cagctgccgc gagctgcact 300 tcacccgcta cgtgaccgat gggccgtgcc gcagcgccaa gccggtcacc gagctggtgt 360 gctccggcca gtgcggcccg gcgcgcctgc tgcccaacgc catcggccgc ggcaagtggt 420 ggcgacctag tgggcccgac ttccgctgca tccccgaccg ctaccgcgcg cagcgcgtgc 480 agctgctgcg tcccggtggt gaggcgccgc gcgcgcgcaa ggtgcgccCg gtggcctcgt 540 gcaagtgcaa gcgcctcacc cgcttccaca accagtcgga gctcaaggac ttcgggaccg 600 aggccgctcg gccgcagaag ggccggaagc cgcggccccg cgcccggagc gccaaagcca 660 accaggccga gctggagaac gcctactaga gcccgcccgc gcccctcccc accggcgggc 720 gccccggccc tgaacccgcg ccccacattt ctgtcctctg cgcgtggttt gattgtttat 780 atttcattgt aaatgcctgc aacocagggc agggggctga gaccttccag gccctgagga 840 atcccgggcg ccggcaaggc ccccctcagc ccgccagctg aggggtccca cggggcaggg 900 gagggaattg agagtcacag acactgagoc acgcagcccc gcctctgggg ccgcctacct 960 ttgctggtcc cacttcagag gaggcagaaa tggaagcatt ttcaccgccc tggggtttta 1020 agggagcggt gtgggagtgg gaaagtccag ggactggtta agaaagttgg ataagattcc 1080 cccttgcacc tcgctgccca tcagaaagcc tgaggcgtgc ccagagcaca agactggggg 1140 caactgtaga tgtggtttct agtcctggct ctgccactaa cttgctgtgt aaccttgaac 1200 tacacaaCtc tccttcggga cctcaattto cactttgtaa aatgagggtg gaggtgggaa 1260 taggatctcg aggagactat tggcatatga ttccaaggac tccagtgcct tttgaatggg 1320 cagaggtgag agagagagag agaaagagag agaatgaatg cagttgcatt gattcagtgc 1380 caaggtcact tccagaattc agagttgtga tgctctcttc tgacagccaa agatgaaaaa 1440 caaacagaaa aaaaaaagta aagagtctat ttatggctga catatttacg gctgacaaac 1500 tcctggaaga agctatgctg cttcccagcc tggcttcccc ggatgtttgg ctacctccac 1560 ccctccatct caaagaaata acatcatcca ttggggtaga aaaggagagg gtccgagggt 1620 ggtgggaggg atagaaatca catccgcccc aacttcccaa agagcagcat ccctcccccg 1680 acccatagcc atgttttaaa gtcaccttcc gaagagaagt gaaaggttca aggacactgg 1740 cottgcaggc ccgagggagc agccatcaca aactcacaga ccagcacatc ccttttgaga 1800 caccgccttc tgcccaccac tcacggacac atttetgcct agaaaacage ttcttactgc 1860 tcttacatgt gatggcatat cttacactaa aagaatatta ttgggggaaa aactacaagt 1920 gctgtacata tgctgagaaa ctgcagagca taatagctgc cacccaaaaa tctttttgaa 1980 aatcatttcc agacaacctc ttactttctg tgtagttttt aattgttaaa aaaaaaaagt 2040 tttaaacaga agcacatgac atatgaaagc ctgcaggact ggtcgttttt ttggcaattc 2100 ttccacgtgg gacttgtcca caagaatgaa agtagtggtt tttaaagagt taagttacat 2160 atttattttc tcacttaagt tatttatgca aaagtttttc ttgtagagaa tgacaatgtt 2220 aatattgctt tatgaattaa cagtctgttc ttccagagtc cagagacatt gttaataaag 2280 acaatgaatc atgaccgaaa g 2301 <210> 6 <211> 213
<212> PRT <213> Homo sapien <400> 6
Met Gin Leu Paro Leu Ala Leu Cys Leu Ile Cys Leu Leu Vai His Thr 15 10 15
Ala Phe Arg Vai Vai Glu Gly Gin Gly Trp Gin Ala Phe Lys Asn Asp 20 25 30
Ala Thr Glu Ile Ile Arg Glu Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro 35 40 45
Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg 50 55 60
Pro Pro His His Pro Phe Glu Thr Lys Asp Vai Ser Glu Tyr Ser Cys 65 70 75 80
Arg Glu Leu His Phe Thr Arg Tyr Vai Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser 85 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
Ala Lys Pro Vai Thr Glu Leu Vai Cys Ser Gly Gin Cys Gly Pro Ala 100 105 110
Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro Ser 115 120 125
Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gin Arg Vai 130 135 140
Gin Leu Leu Cys Pro Gly Gly Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Vai Arg 145 150 155 160
Leu Vai Ala Ser Cys Lys Cys Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gin 165 170 175
Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly Thr Glu Ala Ala Arg Pro Gin Lys Gly 180 185 190
Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala Arg Ser Ala Lys Ala Asn Gin Ala Glu 195 200 205
Leu Glu Asn Ala Tyr 210 <210> 7 <211> 2301 <212> ADN <213> Homo sapien <400> 7 agagcctgtg ctactggaag gtggcgtgcc ctcctctggc tggtaccatg cagctcccac 60 tggccctgtg tctcgtctgc ctgctggtac acacagcctt ccgtgtagtg gagggcoagg 120 ggtggcaggc gttcaagaat gatgccacgg aaatcatccg cgagctcgga gagtaccccg 180 agcctcoacc ggagctggag aacaacaaga ceatgaaccg ggcggagaac ggagggcggc 240 ctccccaoca occctttgag accaaagacg tgtccgagta cagctgccgc gagctgcact 300 tcacccgcta cgtgaccgat gggccgtgcc gcagcgccaa gccggtcacc gagctggtgt 360 gctccggcca gtgcggcccg gcgcgcctgc tgcccaacgc catcggccgc ggcaagtggt 420 ggcgacctag tgggcccgao ttccgctgca tccccgaccg ctaccgcgcg cagcgcgtgc 480 agotgctgtg tcccggtggt gaggcgccgc gcgcgcgcaa ggtgcgcctg gtggcctcgt 540 gcaagtgcaa gcgcctcacc cgcttccaca accagtcgga gctcaaggac ttcgggaccg 600 aggccgctcg gccgcagaag ggccggaagc cgcggccccg cgcccggagc gccaaagcca 660 acoaggccga gctggagaac gcctactaga gcccgcccgc gcccctcccc accggcgggc 720 gccccggccc tgaacccgcg ccccacattt ctgtcctctg cgcgtggttt gattgtttat 780 atttcattgt aaatgcctgc aacccagggc agggggctga gaccttccag gccctgagga 840 atcccgggcg ccggcaaggc ccccctcagc ccgccagctg aggggtccca cggggcaggg 900 gagggaattg agagtcacag acactgagcc acgcagcccc gcctctgggg ccgcctacct 960 ttgctggtcc cacttcagag gaggcagaaa tggaagcatt ttcaccgccc tggggtttta 1020 agggagcggt gtgggagtgg gaaagtccag ggactggtta agaaagttgg ataagattcc 1080 cccttgcacc tcgctgccca tcagaaagcc tgaggcgtgc ccagagcaca agactggggg 1140 caactgtaga tgtggtttct agtcctggct ctgccactaa cttgctgtgt aaccttgaac 1200 tacacaattc tccttcggga cctcaatttc cactttgtaa aatgagggtg gaggtgggaa 1260 taggatctcg aggagactat Cggcatatga ttccaaggac tccagtgcct tttgaatggg 1320 cagaggtgag agagagagag agaaagagag agaatgaatg cagttgcatt gattcagtgc 1380 caaggtcact tccagaattc agagttgtga tgctctcttc tgacagccaa agatgaaaaa 1440 caaacagaaa aaaaaaagta aagagtctat ttatggctga catatttacg gctgacaaac 1500 tcctggaaga agctatgctg cttcccagcc tggcttcccc ggatgtttgg ctacctccac 1560 ccctccatct caaagaaata acatcatcca ttggggtaga aaaggagagg gtccgagggt 1620 ggtgggaggg atagaaatca catccgcccc aacttcccaa agagcagcat ccctcccccg 1680 acccatagcc atgttttaaa gteaccttcc gaagagaagt gaaaggttca aggacactgg 1740 ccttgcaggc ccgagggagc agccatcaca aactcacaga ccagcacatc ccttttgaga 1800 caccgccttc tgcccaccac tcacggacac atttctgcct agaaaacagc ttcttactgc 1860 tcttacatgt gatggcatat cttacactaa aagaatatta ttgggggaaa aactacaagt 1920 gctgtacata tgctgagaaa ctgcagagca taatagctgc caccoaaaaa tctttttgaa 1980 aatcatttcc agacaacctc ttactttctg tgtagttttt aattgttaaa aaaaaaaagt 2040 tttaaacaga agcacatgac atatgaaagc ctgcaggact ggtcgttttt ttggcaattc 2100 ttccacgtgg gacttgtcca caagaatgaa agtagtggtt tttaaagagt taagttacat 2160 atttattttc tcacttaagt tatttatgca aaagtttttc ttgtagagaa tgacaatgtt 2220 aatattgctt tatgaattaa cagtctgttc ttccagagtc cagagacatt gttaataaag 2280 acaatgaatc atgaccgaaa g 2301 <210> 8 <211> 213 86 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
<212> PRT <213> Homo sapien <400> 8
Met Gin Leu Pro Leu Ala Leu Cys Leu Vai Cys Leu Leu Val His Thr 1 5 10 15 Ala Phe Arg Vai Vai Glu Gly Gin Gly Trp Gin Ala Phe Lys Asn Asp 20 25 30 Ala Thr Glu Ile Ile Arg Glu Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro 35 40 45 Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg 50 55 60 Pro Pro His His Pro Phe Glu Thr Lys Asp Val Ser Glu Tyr Ser Cys 65 70 75 80 Arg Glu Leu His Phe Thr Arg Tyr Vai Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser 85 90 95 Ala Lys Pro Vai Thr Glu Leu Vai Cys Ser Gly Gin Cys Gly Pro Ala 100 105 110 Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro Ser 115 120 125 Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gin Arg Val 130 135 140 Gin Leu Leu Cys Pro Gly Gly Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Val Arg 145 150 155 160 Leu Vai Ala Ser Cys Lys Cys Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gin 165 170 175 Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly Thr Glu Ala Ala Arg Pro Gin Lys Gly 180 185 190 Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala Arg Ser Ala Lys Ala Asn Gin Ala Glu 195 200 205 Leu Glu Asn Ala Tyr 210
<210> 9 <211> 642 <212> ADN <213> Cercopithecus pygerythrus < 4 0 0 > 9 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 642 atgcagctcc cactggccct gtgtcttgtc tgcctgctgg tacacgoagc cttccgtgta gtggagggcc aggggtggca ggccttcaag aatgatgcca cggaaatcat ccccgagctc ggagagtacc ccgagcctcc accggagctg gagaacaaca agaccatgaa ccgggcggag aatggagggc ggcctcccca ccaccccttt gagaccaaag acgtgtccga gtacagctgc cgagagctgc acttcacccg ctacgtgacc gatgggccgt gccgcagcgc caagccagtc accgagttgg tgtgctccgg ocagtgcgge ccggcacgcc tgctgcccaa cgccatcggc cgcggcaagt ggtggcgccc gagtgggccc gacttccgct gcatccccga ccgctaccgc gcgcagcgtg tgcagctgct gtgtcccggt ggtgccgcgc cgcgcgcgcg caaggtgcgc ctggtggcct cgtgcaagtg caagcgcctc acccgcttcc acaaccagtc ggagctcaag gacttcggtc ccgaggccgc tcggccgcag aagggccgga agccgcggcc ccgcgcccgg ggggccaaag ccaatcaggc cgagctggag aacgcctact ag
<210> 10 <211> 213 <212> PRT <213> Cercopithecus pygerythrus 87 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <400> Met Gin 10 Leu Pro Leu Ala Leu Cys Leu Vai Cys Leu Leu Vai His Ala 1 Ala Phe Arg Vai 5 Vai Glu Gly Gin Gly 10 Trp Gin Ala Phe Lys 15 Asn Asp Ala Thr Glu 20 Ile Ile Pro Glu Leu 25 Gly Glu Tyr Pro Glu 3Ò Pro Pro Pro Glu Leu 35 Glu Asn Asn Lys Thr 40 Met Asn Arg Ala Glu 45 Asn Gly Gly Arg Pro 50 Pro His His Pro Phe 55 Glu Thr Lys Asp Vai 60 Ser Glu Tyr Ser Cys 65 Arg Glu Leu His Phe 70 Thr Arg Tyr Vai Thr 75 Asp Gly Pro Cys Arg 80 Ser Ala Lys Pro Vai 85 Thr Glu Leu Vai Cys 90 Ser Gly Gin Cys Gly 95 Pro Ala Arg Leu Leu 100 Pro Asn Ala Ile Gly 105 Arg Gly Lys Trp Trp 110 Arg Pro Ser Gly Pro 115 Asp Phe Arg Cys Ile 120 Pro Asp Arg Tyr Arg 125 Ala Gin Arg Val Gin 13 0 Leu Leu Cys Pro Gly 135 Gly Ala Ala Pro Arg 140 Ala Arg Lys Vai Arg 145 Leu Vai Ala Ser Cys 150 Lys Cys Lys Arg Leu 155 Thr Arg Phe His Asn 160 Gin Ser Glu Leu Lys 165 Asp Phe Gly Pro Glu 170 Ala Ala Arg Pro Gin 175 Lys Gly Arg Lys Pro 180 Arg Pro Arg Ala Arg 185 Gly Ala Lys Ala Asn 190 Gin Ala Glu Leu Glu 210 195 Asn Ala Tyr 200 205
<210> 11 <211> 638 <212> ADN <213> Mus musculus <40 0> 11 atgcagccct cactagcccc gtgccCcatc tgcctacttg tgcacgctgc cttctgtgct 60 gtggagggcc aggggtggca agccttcagg aatgatgcca cagaggtcat cccagggctt 120 ggagagtacc ccgagcctcc tcctgagaac aaccagacca tgaaccgggc ggagaatgga 180 ggcagacctc cccaccatcc ctatgacgcc aaaggtgtgt ccgagtacag ctgccgcgag 240 ctgcactaca cccgcttcct gacagacggc ccatgccgca gcgccaagcc ggtcaccgag 300 ttggtgtgct ccggccagtg cggccccgcg cggctgctgc ccaacgccat cgggcgcgtg 360 aagtggtggc gcccgaacgg accggatttc cgctgcatcc cggatcgcta ccgcgcgcag 420 cgggtgcagc tgctgtgccc cgggggcgcg gcgccgcgct cgcgcaaggt gcgtctggtg 480 gcctcgtgca agtgcaagcg cctcacccgc ttccacaacc agtcggagct caaggacttc 540 gggccggaga ccgcgcggcc gcagaagggt cgcaagccgc ggcccggcgc ccggggagcc 600 aaagccaacc aggcggagct ggagaacgcc tactagag 638
<210> 12 <211> 211 <212> PRT <213> Mus musculus 88 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <400> 12
Met 1 Gin Pro Ser Leu 5 Ala Pro Cys Leu Ile 10 Cys Leu Leu Vai His 15 Ala Ala Phe Cys Ala 20 Vai Glu Gly Gin Gly 25 Trp Gin Ala Phe Arg 30 Asn Asp Ala Thr Glu 35 Vai Ile Pro Gly Leu 40 Gly Glu Tyr Pro Glu 45 Pro Pro Pro Glu Asn 50 Asn Gin Thr Met Asn 55 Arg Ala Glu Asn Gly 60 Gly Arg Pro Pro His 65 His Pro Tyr Asp Ala 70 Lys Asp Vai Ser Glu 75 Tyr Ser Cys Arg Glu 80 Leu His Tyr Thr Arg 85 Phe Leu Thr Asp Gly 90 Pro Cys Arg Ser Ala 95 Lys Pro Vai Thr Glu 100 Leu Vai Cys Ser Gly 105 Gin Cys Gly Pro Ala 110 Arg Leu Leu Pro Asn 115 Ala Ile Gly Arg Vai 120 Lys Trp Trp Arg Pro 125 Asn Gly Pro Asp Phe 130 Arg Cys Ile Pro Asp 135 Arg Tyr Arg Ala Gin 140 Arg Vai Gin Leu Leu. 145 Cys Pro Gly Gly Ala 150 Ala Pro Arg Ser Arg 155 Lys Vai Arg Leu Vai 160 Ala Ser Cys Lys Cys 165 Lys Arg Leu Thr Arg 170 Phe His Asn Gin Ser 175 Glu Leu Lys Asp Phe 180 Gly Pro Glu Thr Ala 185 Arg Pro Gin Lys Gly 190 Arg Lys Pro Asn Arg 1 Ala 210 Pro 195 Tyr Gly Ala Arg Gly Ala 200 Lys Ala Asn Gin Ala 205 Glu Leu Glu
<210> 13 <211> 674 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <40 0> 13 gaggaccgag tgcccttcct cctgcctgct tgtacatgca agaatgatgc cacagaaatc tagagaacaa ccagaccatg atgacaccaa agacgtgtcc ccgacggccc gtgccgcagt gccccgcgcg gctgctgccc ccgacttccg ctgcatcccg gcggcgcggc gccgcgctcg tcacccgctt ccacaaccag agaagggtcg caagccgcgg agaacgccta ctag ccttctggca ccatgcagct gccttcgttg ctgtggagag atcccgggac tcagagagta aaccgggccg agaacggagg gagtacagct gccgcgagct gccaagccgg tcaccgagtt aacgccatcg ggcgcgtgaa gatcgctacc gcgcgcagcg cgcaaggtgc gtctggtggc tcggagctca aggacttcgg ccccgcgccc ggggagccaa ctcactagcc ccttgccttg ccaggggtgg caagccttca cccagagcct cctcaggaac cagacccccc caccatcctt gcactacacc cgcttcgtga ggtgtgctcg ggccagtgcg gtggtggcgc ccgaacggac ggtgcagctg ctgtgccccg ctcgtgcaag tgcaagcgcc acctgagacc gcgcggccgc agccaaccag gcggagctgg 60 120 180 240 300 360 420 480 54 0 600 660 674
<210> 14 <211> 213 <212> PRT <213> Rattus norvegicus 89 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <40 0> 14
Met 1 Gin Leu Ser Leu 5 Ala Pro Cys Leu Ala 10 Cys Leu Leu Val His 15 Ala Ala Phe Vai Ala 20 Vai Glu Ser Gin Gly 25 Trp Gin Ala Phe Lys 30 Asn Asp Ala Thr Glu 35 Ile Ile Pro Gly Leu 40 Arg Glu Tyr Pro Glu 45 Pro Pro Gin Glu Leu 50 Glu Asn Asn Gin Thr 55 Met Asn Arg Ala Glu 60 Asn Gly Gly Arg Pro 65 Pro Hls Hls Pro Tyr 70 Asp Thr Lys Asp Val 75 Ser Glu Tyr Ser Cys 80 Arg Glu Leu His Tyr 85 Thr Arg Phe Vai Thr 90 Asp Gly Pro Cys Arg 95 Ser Ala Lys Pro Vai 100 Thr Glu Leu Vai Cys 105 Ser Gly Gin Cys Gly 110 Pro Ala Arg Leu Leu 115 Pro Asn Ala Ile Gly 120 Arg Val Lys Trp Trp 125 Arg Pro Asn Gly Pro 130 Asp Phe Arg Cys Ile 135 Pro Asp Arg Tyr Arg 140 Ala Gin Arg Val Gin 145 Leu Leu Cys Pro Gly 150 Gly Ala Ala Pro Arg 155 Ser Arg Lys Val Arg 160 Leu Vai Ala Ser Cys 165 Lys Cys Lys Arg Leu 170 Thr Arg Phe His Asn 175 Gin Ser Glu Leu Lys 180 Asp Phe Gly Pro Glu 185 Thr Ala Arg Pro Gin 190 Lys Gly Arg Leu Lys Glu 210 Pro 195 Asn Arg Ala Pro Tyr Arg Ala Arg 200 Gly Ala Lys Ala Asn 205 Gin Ala Glu <210> 15 <211> 532 <212> ADN <213> Bos torus <400> 15 agaatgatgc cacagaaatc atccccgagc tgaacaacaa gaccatgaac cgggcggaga agaccaaaga egcctccgag tacagctgcc atgggccgtg ecgcagcgcc aagceggtca cggcgcgcct gctgcccaac gccatcggcc acttccgctg catccccgac cgctacogcg gcgcggcgcc gcgcgcgcgc aaggtgcgcc ctcgottcca caaccagtcc gagctcaagg cgggccggaa gctgcggccc cgcgcccggg tgggcgagta ccccgagcct ctgccagagc aoggagggag acctccccac cacccctttg gggagctgca cttcacccgc tacgtgaccg ccgagctggt gtgctcgggc cagtgcggcc gcggcaagtg gtggcgccca agcgggcccg cgoagcgggt gcagctgttg tgtcctggcg tggtggcctc gtgcaagtgc aagcgcctca acttcgggcc cgaggccgcg cggccgcaaa gcaccaaagc cagccgggcc ga 60 120 180 240 300 360 420 480 532 <210> 16 <211> 176 <212> PRT <213> Bos torus <40 0> 16
Asn Asp Ala Thr Glu Ile Ile Pro Glu Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro 1 5 10 15
Leu Pro Glu Leu Asrx Asn Lys Thr Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly 20 25 30 90 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
Arg Pro Pro His His Pro Phe Glu Thr Lys Asp Ala Ser Glu Tyr Ser 35 40 45
Cys Arg Glu Leu His Phe Thr Arg Tyr Vai Thr Asp Gly Pro Cys Arg 50 55 eo
Ser Ala Lys Pro Vai Thr Glu Leu Vai Cys Ser Gly Gin Cys Gly Pro 65 70 75 80
Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro 85 90 95
Ser Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gin Arg 100 105 110
Vai Gin Leu Leu Cys Pro Gly Gly Ala Ala Pro Arg Ala Arg Lys Vai 115 120 125
Arg Leu Vai Ala Ser Cys Lys Cys Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn 130 135 140
Gin Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly Pro Glu Ala Ala Arg Pro Gin Thr 145 150 155 160
Gly Arg Lys Leu Arg Pro Arg Ala Arg Gly Thr Lys Ala Ser Arg Ala 165 170 175
<210> 17 <211> 35828 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> outra_característica <222> (1)..(35828)
<223> n = A,T,C ou G <400> 17 cgcgttttgg tgagcagcaa tattgcgctt cgatgagcot tggcgttgag attgatacct 60 ctgctgoaca aaaggcaatc gaccgagctg gaocagcgca ttcgtgaoac cgtctccttc 120 gaacttattc gcaatggagt gtcattcatc aaggacngcc tgatcgcaaa tggtgctato 180 cacgcagcgg caatcgaaaa ccctcagccg gtgaccaata tctacaacat cagccttggt 240 atcctgcgtg atgagccagc gcagaacaag gtaaccgtca gtgccgataa gttcaaagtt 300 aaacctggtg ttgataccaa cattgaaaog ttgatcgaaa acgcgctgaa aaaogctgct 360 gaatgtgcgg cgctggatgt cacaaagcaa atggcagoag acaagaaagc gatggatgaa 420 ctggcttcct atgtccgcac ggccatcatg atggaatgtt tccccggtgg tgttatctgg 480 cagoagtgcc gtcgatagta tgcaattgat aattattatc atttgcgggt octttccggc 540 gatccgoctt gttacggggc ggcgacctcg cgggttttcg ctatttatga aaattttccg 600 gtttaaggcg tttccgttct tcttcgtcat aacttaatgt ttttatttaa aataccctct 660 gaaaagaaag gaaacgacag gtgctgaaag cgagcttttt ggcctctgtc gtttccttto 720 tctgtttttg tccgtggaát gaacaatgga agtcaacaaa aagcagagct tatcgatgat 780 aagcggtcaa acatgagaat tcgcggccgc ataatacgac tcactatagg gatcgacgcc 840 tactccccgc gcatgaagog gaggagctgg actccgcatg cccagagacg ccccccaacc 900 cccaaagtgc ctgacctcag cctctaccag ctctggcttg ggcttgggcg gggtcaaggc 960 taccacgttc tcttaacagg tggctgggct gtctcttggc cgcgcgtcat gtgacagctg 1020 cotagttctg cagtgaggtc accgtggaat gtctgccttc gttgccatgg caacgggatg 1080 aogttacaat ctgggtgtgg agcttttcct gtccgtgtca ggaaatocaa ataccctaaa 1140 ataccctaga agaggaagta gctgagccaa ggctttcctg gcttctccag ataaagtttg 1200 acttagatgg aaaaaaacaa aatgataaag aeccgagcea tctgaaaatt cctcctaate 1260 gcaccactag gaaatgtgta tattattgag ctcgtatgtg ttcttatttt aaaaagaaaa 1320 ctttagtcat gttattaata agaatttctc agcagtggga gagaaccaat attaacacca 1380 agataaaagt tggcatgatc cacattgcag gaagatccac gttgggtttt catgaatgtg 1440 aagaccccat ttattaaagt cctaagctct gtttttgcac actaggaagc gatggccggg 1500 atggctgagg ggctgtaagg atctttcaat gtcttacatg tgtgtttcct gtcctgcacc 1560 taggacctgc tgcctagcct gcagcagagc cagaggggtt tcacatgatt agtctcagac 1620 91 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ acttgggggc aggttgcatg tactgcatcg cttatttcca tacggagcac ctactatgtg 1680 tcaaacacca tatggtgttc actcttcaga acggtggtgg tcatcatggt gcatttgctg 1740 acggttggat tggtggtaga gagctgagat atatggacgc actcttcagc attctgtcaa 1800 cgtggctgtg cattcttgct cctgagcaag tggctaaaca gactcacagg gtcagcctcc 1860 agctcagtcg ctgcatagtc ttagggaacc tctcccagtc ctccctacct caactatcca 1920 agaagccagg gggcttggcg gtctcaggag cctgcttgct gggggacagg ttgttgagtt 1980 ttatctgcag taggttgcct aggcatagtg tcaggactga tggctgcctt ggagaacaca 2040 tcctttgccc tctatgcaaa tctgaccttg acatgggggc gctgctcagc tgggaggatc 2100 aactgcatac ctaaagccaa gcctaaagct tcttcgtcca cctgaaactc ctggaccaag 2160 gggcttccgg cacatoctct caggccagtg agggagtctg tgtgagctgo actttccaat 2220 ctcagggcgt gagaggcaga gggaggtggg ggcagagcct tgcagctctt tcctcccatc 2280 tggacagcgc tctggctcag cagcccatat gagcacaggc acatccccac cccaccccca 2340 cctttcctgt cctgcagaat ttaggctctg ttcacggggg gggggggggg ggggcagtcc 2400 tatectctct taggtagaca ggactctgca ggagacactg ctttgtaaga tactgcagtt 2460 taaatttgga tgttgtgagg ggaaagcgaa gggcctcttt 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ΕΡ 1 638 999/PT acccaaggca gtatgatggt accagtgggg tcccacatga ggctcctgag cagatgcaag ttagttcccc gggtttgtag caggtggcac acagcagaaa atcacgcacg agaaatgacc cacatgctgt aggagcatgc ttggaaagcc tgcaggggtg gttgtgcccc ctgggatttt tagacaggac agatagagca ccaacccaat accagctcaa tgtggtagca cgaaaggccc tcacccttgc gcaagcagcc gagggggttg acctgccctt ctccactcct ttaggaagga ctaaactgga gagaagtgga ttgaggccag gccacgtagt acagatgtgg acagagctcc atctcactgc ggtttggaaa tcacgcatcc cgcttcctga ggccagtgcg ccgaacggac ctgtgccccg tgcaagcgcc gcgcggccgc gcggagctgg attcgttttc tggagttccc gggtggggtt gtgggatggg ttaaagggaa ctactcottc tggccactga atagggaccg agagaggaga gctgtttgtt tcaaatctgc gggtggaggc ccagagaatc aagtgatatg ccaccacatg ataaagtcac gcaaccctag cttgcccagg gtggcatgtg cacttgccct ctgtggaggc gaactagcag ttgctggtca ccctcctgtc aatgcagtca ccaaaactag agtaaattaa cccccccccc ttttttcctt ccacacatgg tgtccaagag ctccttcccc ggtacacaga aaagctatag tctactcgcc gggagccaga cagccctgcc gacgcgccgc ctaccccgct ttctccatct ccagagccag agagtgtttg gatgggcgct 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aggcagaaat ggaagcattt tcaccgccct ggggttttaa gggagcggtg tgggagtggg 3960 aaagtccagg gactggttaa gaaagttgga taagattccc ccttgcacct cgctgcccat 4020 cagaaagcct gaggcgtgcc cagagcacaa gactgggggc aactgtagat gtggtttcta 4080 gtcctggctc tgccactaac ttgctgtgta accttgaact acacaattct ccttcgggac 4140 ctcaatttcc actttgtaaa atgagggtgg aggtgggaat aggatctcga ggagactatt 4200 ggcatatgat tccaaggact ccagtgcctt ttgaatgggc agaggtgaga gagagagaga 4260 gaaagagaga gaatgaatgc agttgcattg attcagtgcc aaggtcactt ccagaattca 4320 gagttgtgat gctctcttct gacagccaaa gatgaaaaac aaacagaaaa aaaaaagtaa 4380 agagtctatt tatggctgac atatttacgg ccgacaaact cctggaagaa gctatgctgc 4440 ttcccagcct ggcttccccg gatgtttggc tacctccacc cctccatctc aaagaaataa 4500 catcatccat tggggtagaa aaggagaggg tccgagggtg gtgggaggga tagaaatcac 4560 atccgcccca acttcccaaa gagcagcatc cctcccccga cccatagcca tgttttaaag 4620 tcaccttccg aagagaagtg aaaggttcaa ggacactggc cttgcaggcc cgagggagca 4680 gccatcacaa actcacagac cagcacatcc cttttgagac accgccttct gcccaccact 4740 cacggacàca tttctgccta gaaaacagct tcttactgct cttacatgtg atggcatatc 4800 ttacactaaa agaatattat tgggggaaaa actacaagtg ctgtacatat gctgagaaac 4860 tgcagagcat aatagctgcc acccaaaaat ctttttgaaa atcatttcca gacaacctct 4920 tactttctgt gtagttttta atfcgttaaaa aaaaaaagtt ttaaacagaa gcacatgaca 4980 tatgaaagcc tgcaggactg gtcgtttttt tggcaattct tccacgtggg acttgtccac 5040 aagaatgaaa gtagtggttt ttaaagagtt aagttacata tttattttct cacttaagtt 5100 atttatgcaa aagtttttct tgtagagaat gacaatgtta atattgcttt atgaattaac 5160 agtctgttct tccagagtcc agagacattg ttaataaaga caatgaatca tgaccgaaag 5220 gatgtggtct cattttgtca accacacatg acgtcatttc tgtcaaagtt gacacccttc 5280 tcttggtcac tagagctoca accttggaca cacctttgac tgctctctgg tggcccttgt 5340 ggcaattatg tcttcctttg aaaagtcatg tttatccctt cctttccaaa cccagaccgc 5400 atttcttcac ccagggcatg gtaataacct cagccttgta tccttttagc agcctcccct 5460 ccatgctggc ttccaaaatg ctgttctcat tgtatcactc ccctgctcaa aagccttcca 5520 tagctccccc ttgcocagga tcaagtgcag tttccctatc tgacatggga ggccttctct 5580 gcttgactcc cacctcccac tccaccaagc ttcctactga ctccaaatgg tcatgcagat 5640 ccotgottcc ttagtttgcc atccacactt agoaocccca ataactaatc ctctttcttt 5700 aggattcaca ttacttgtca tctcttcccc taaccttcca gagatgttcc aatctcccat 5760 gatccotctc tcctctgagg ttccagcccc ttttgtctac accactactt tggttcctaa 5820 ttctgttttc oatttgacag tcattcatgg aggaccagcc tggccaagtc ctgcttagta 5880 ctggcataga caacacaaag ccaagtacaa ttcaggacca gctcacagga aacttcatct 5940 tcttcgaagt gtggatttga tgcctcctgg gtagaaatgt aggatcttca aaagtgggcc 6000 agcctcctgc acttctctca aagtctcgec tcoecaaggt gtottaatag tgctggatge 6060 tagctgagtt agcatcttca gatgaagagt aacoctaaag ttactcttca gttgccotaa 6120 ggtgggatgg tcaactggaa agctttaaat taagtccagc ctaccttggg ggaacccacc 6180 cccacaaaga aagctgaggt ccctcctgat gacttgtcag tttaactacc aataacccac 6240 ttgaattaat catcatcatc aagtctttga taggtgtgag tgggtatcag tggcoggtco 6300 cttcctgggg ctccagcccc cgaggaggcc tcagtgagcc cctgcagaaa atccatgcat 6360 103 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ catgagtgtc tcagggccca gaatatgaga gcaggtagga aacagagaca tcttccatcc 6420 ctgagaggca gtgcggtcca gtgggtgggg acacgggctc tgggtcaggt ttgtgttgtt 6480 tgtttgtttg ttttgagaca gagtctcgct ctattgccca ggctggagtg cagtgtcaca 6540 atctcggctt actgcaactt ctgccttccc ggattcaagt gattctcctg cctcagcctc 6600 cagagtagct gggattacag gcgcgtgcca ccacgcctgg ctaatttttg tatttttgat 6660 agagacgggg tttcaccatg ttggccaggc tagtctcgaa ctcttgacct caagtgatct 6720 gcctgcctcg gcctcccaaa gtgctgggat tacaggcgtg agccaccaca cccagcccca 6780 ggttggtgtt tgaatctgag gagactgaag caccaagggg ttaaatgttt tgcccacagc 6840 catacttggg ctcagttcct tgccctaccc ctcacttgag ctgcttagaa cctggtgggc 6900 acatgggcaa taaccaggtc acactgtttt gtaccaagtg ttatgggaat ccaagatagg 6960 agtaatttgc tctgtggagg ggatgaggga tagtggttag ggaaagcttc acaaagtggg 7020 tgttgcttag agattttcca ggtggagaag ggggcttcta ggcagaaggc atagcccaag 7080 caaagactgc aagtgcatgg ctgctcatgg gtagaagaga atccaccatt cctcaacatg 7140 taccgagtcc ttgccatgtg caaggcaaca tgggggtacc aggaattcca agcaatgtcc 7200 aaacctaggg tctgctttct gggacctgaa gatacaggat ggatcagccc aggctgcaat 7260 cccattacca cgagggggaa aaaaacctga aggctaaatt gtaggtcggg ttagaggtta 7320 tttatggaaa gttatattct acctacatgg ggtctataag cctggcgcca atcagaaaag 7380 gaacaaacaa cagacctagc tgggaggggc agcattttgt tgtagggggc ggggcacatg 7440 ttctgggggt acagccagac tcagggcttg tattaatagt ctgagagtaa gacagacaga 7500 gggatagaag gaaataggtc cctttctctc tctctctctc tctctctctc actctctctc 7560 tctctcacac acacacacag acacacacac acgctctgta ggggtctact tatgctccaa 7620 gtacaaatca ggccacattt acacaaggag gtaaaggaaa agaacgttgg aggagccaca 7680 ggaccccaaa attccctgtt ttccttgaat caggcaggac ttacgcagct gggagggtgg 7740 agagcctgca gaagccacct gcgagtaagc caagttcaga gtcacagaca ccaaaagctg 7800 gtgccatgtc ccacacccgc ccacctccca cctgctcctt gacacagccc tgtgctccac 7860 aacccggctc ccagatcatt gattatagct ctggggcctg caccgtcctt cctgccacat 7920 ccccacccca ttcttggaac ctgccctctg tcttctccct tgtccaaggg caggcaaggg 7980 ctcagctatt gggcagcttt gaccaacagc tgaggctcct tttgtggctg gagatgcagg 8040 aggcagggga atattcctct tagtcaatgc gaccatgtgc ctggtttgcc cagggtggtc 8100 tcgtttacac ctgtaggcca agcgtaatta ttaacagctc ccacttctac tctaaaaaat 8160 gacccaatct gggcagtaaa ttatatggtg cccatgctat taagagctgc aacttgctgg 8220 gcgtggtggc tcacacctgt aaCcccagta ctttgggacg tcaaggcggg tggatcacct 8280 gaggtcacga gttagagaot ggcctggcca gcatggcaaa accccatctt tactaaaaat 8340 acaaaaatta gcaaggcatg gtggcatgca cctgtaatcc caggtactcg ggaggctgag 8400 acaggagaat ggcttgaacc caggaggcag aggttgcagt gagccaagat tgtgccactg 8460 ccctccagcc ctggcaacag agcaagactt catctcaaaa gaaaaaggat actgtcaatc 8520 actgcaggaa gaacccaggt aatgaatgag gagaagagag gggctgagtc accatagtgg 8580 cagcaccgac tootgcagga aaggcgagac actgggtcat gggtactgaa gggtgccctg 8640 aatgacgttc tgctttagag accgaacctg agccctgaaa gtgcatgcct gttcatgggt 8700 gagagactaa attcatcatt ccttggcagg tactgaatcc tttcttacgg ctgccctcca 8760 atgcccaatt tccctacaat tgtctggggt gcctaagctt ctgcccacca agagggccag 8820 agctggcagc gagcagotgc aggtaggaga gataggtacc cataagggag gtgggaaaga 8880 gagatggaag gagaggggtg cagagcacac acctcccctg cctgacaact tcctgagggc 8940 tggtcatgoo agcagattta aggcggaggc aggggagatg gggcgggaga ggaagtgaaa 9000 aaggagaggg tggggatgga gaggaagaga gggtgatcat tcattcattc cattgctact 9060 gactggatgc cagotgtgag ccaggcacca ccctagctct gggcatgtgg ttgtaatctt 9120 ggagcctcat ggagotcaoa gggagtgctg gcaaggagat ggataatgga cggataacaa 9180 ataaacattt agtacaatgt ccgggaatgg aaagttctcg aaagaaaaat aaagctggtg 9240 agcatataga cagccctgaa ggcggccagg ccaggcattt ctgaggaggt ggcatttgag 9300 C 9301
<210> 19 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador para PCR <400> 19 ccggagctgg agaacaacaa g 21
<210> 20 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial 104 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <220> <223> Iniciador para PCR <400> 20 gcactggccg gagcacacc 19 <210> 21 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador para PCR <400> 21 aggccaaccg cgagaagatg acc 23 <210> 22 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador para PCR <400> 22 gaagtccagg gcgacgtagc a 21 <210> 23 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador para PCR <400> 23 aagcttggta ccatgcagct cccac 25
<210> 24 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>
<223> Iniciador para PCR 105 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <400> 24 aagcttctac ttgtcatcgt cgtccttgta gtcgtaggcg ttctccagct 50 <210> 25 <211> 19 <212> ADN <213> <220> Sequência Artificial <223> Iniciador para PCR <400> 25 gcactggccg gagcacacc 19 <210> 26 <211> 39 <212> ADN <213> <220> Sequência Artificial <223> Iniciador para PCR <400> 26 gtcgtcggat ccatggggtg gcaggcgttc aagaatgat 39 <210> 27 <211> 57 <212> ADN <213> <220> Sequência Artificial <223> Iniciador para PCR <400> 27 gtcgtcaagc ttctacttgt catcgtcctt gtagtcgtag gcgttctcca gctcggc 57
<210> 28 <211> 29 <212> ADN <213> <220> Sequência Artificial <223> Iniciador para PCR <400> 28 gacttggatc ccaggggtgg caggcgttc 29 106 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <210> 29 <211> 29 <212> ADN <213> <220> Sequência Artificial <223> Iniciador para PCR <400> 29 agcataagct tctagtaggc gttctccag 29 <210> 30 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador para PCR <400> 30 gacttggatc cgaagggaaa aagaaaggg 29
<210> 31 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador para PCR <400> 31 agcataagct tttaatccaa atcgatgga <210> 32 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador para PCR 29 107 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <400> 32 actacgagct cggccccacc acccatcaac aag 33 <210> 33 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador para PCR <400> 33 acttagaagc tttcagtcct cagccccctc ttcc 34 <210> 34 <211> 66 <212> ADN <213> <220> Sequência Artificial <223> Iniciador para PCR <400> 34 aatctggatc cataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatctgca ggattcgagg 60 gcccct 66 <210> 35 <211> 82 <212> ADN <213> Sequência <220> <223> Iniciador <400> 35
Artificial para PCR aatctgaatt ccaccggtgt taattaaata acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta 60 tagatctaga gtcagcttct ga 82
<210> 36 <211> 62 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>
<223> Iniciador para PCR 108 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <400> 36 atttaggtga cactatagaa ctcgagcagc tgaagcttaa ccacatggtg gctcacaacc 60 at 62 <210> 37 <211> 54 <212> ADN <213> <220> Sequência Artificial <223> Iniciador para PCR <400> 37 aacgacggcc agtgaatccg taatcatggt catgctgcca ggtggaggag ggca 54 <210> 38 <211> 31 <212> ADN <213> <220> Sequência Artificial <223> Iniciador para PCR <400> 38 attaccaccg gtgacacccg cttcctgaca g 31 <210> 39 <211> 61 <212> ADN <213> <220> Sequência Artificial <223> Iniciador para PCR <400> 39 attacttaat taaacatggc gcgocatatg gccggcccct aattgcggcg catcgttaat 60 t 61 <210> 40 <211> 34
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220>
<223> Iniciador para PCR 109 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <400> 40 attacggccg gccgcaaagg aattcaagat ctga 34
<210> 41 <211> 34 <212> ADN <213> <220> Sequência Artificial <223> Iniciador para PCR <400> 41 attacggcgc gcccctcaca ggccgcaccc <210> 42 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> Met Ser 42 Arg Thr Ala Tyr Thr Vai Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly 1 Thr Leu Leu Pro 5 Ala Ala Glu Gly Lys 10 Lys Lys Gly Ser Gin 15 Gly Ala Ile Pro Pro 20 Pro Asp Lys Ala Gin 25 His Asn Asp Ser Glu 30 Gin Thr Gin Ser Pro 35 Gin Gin Pro Gly Ser 40 Arg Asn Arg Gly Arg 45 Gly Gin Gly Arg Gly 50 Thr Ala Met Pro Gly 55 Glu Glu Vai Leu 60 Glu Ser Ser Gin Glu Ala 65 Leu His Vai Thr Glu 70 Arg Lys Tyr Leu Lys 75 Arg Asp Trp Cys 80 Lys Thr Gin Pro Leu Lys 85 Gin Thr Ile His Glu 90 Glu Gly Cys Asn Ser 95 Arg Thr Ile Ile Asn 100 Arg Phe Cys Tyr Gly 105 Gin Cys Asn Ser Phe 110 Tyr Ile Pro Arg His 115 Ile Arg Lys Glu Glu 120 Gly Ser Phe Gin Ser 125 Cys Ser Phe Cys Lys 130 Pro Lys Lys Phe Thr 135 Thr Met Met Vai 140 Thr Leu Asn Cys Pro Glu 145 Leu Gin Pro Pro Thr 150 Lys Lys Lys Arg Vai 155 Thr Arg Vai Lys 160 Gin Cys Arg Cys Ile Ser 180 165 Ile Asp Leu Asp 170 175
<210> 43 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens 110 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <400> 43
Met His Leu Leu Leu Phe Gin Leu Leu Val Leu Leu Pro Leu Gly Lys 1 5 10 15 Thr Thr Arg His Gin Asp •Gly Arg Gin Asn Gin Ser Ser Leu Ser Pro 20 25 30 Val Leu Leu Pro Arg Asn Gin Arg Glu Leu Pro Thr Gly Asn His Glu 35 40 45 Glu Ala Glu Glu Lys Pro Asp Leu Phe Val Ala Val Pro His Leu Val 50 55 60 Ala Thr Ser Pro Ala Gly Glu Gly Gin Arg Gin Arg Glu Lys Met Leu 65 70 75 80 Ser Arg Phe Gly Arg Phe Trp Lys Lys Pro Glu Arg Glu Met His Pro 85 90 95 Ser Arg Asp Ser Asp Ser Glu Pro Phe Pro Pro Gly Thr Gin Ser Leu 100 105 110 Ile Gin Pro Ile Asp Gly Met Lys Met Glu Lys Ser Pro Leu Arg Glu 115 120 125 Glu Ala Lys Lys Phe Trp His His Phe Met Phe Arg Lys Thr Pro Ala 130 135 140 Ser Gin Gly Val Ile Leu Pro Ile Lys Ser His Glu Val His Trp Glu 145 150 155 160 Thr Cys Arg Thr Val Pro Phe Ser Gin Thr Ile Thr His Glu Gly Cys 165 170 175 Glu Lys Val Val Val Gin Asn Asn Leu Cys Phe Gly Lys Cys Gly Ser 180 185 190 Val His Phe Pro Gly Ala Ala Gin His Ser His Thr Ser Cys Ser His 195 200 205 Cys Leu1 Pro Ala Lys Phe Thr Thr Met His Leu Pro Leu Asn Cys Thr 210 215 220 Glu Leu Ser Ser Val Ile Lys Val Val Met Leu Val Glu Glu Cys Gin 225 230 235 240 Cys Lys Val Lys Thr Glu His Glu Asp Gly His Ile Leu His Ala Gly 245 250 255 Ser Gin Asp Ser Phe Ile Pro Gly Val Ser Ala 260 265 <210> 44 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Met 1 Leu Arg Val Leu 5 Val Gly Ala Val Leu 10 Pro Ala Met Leu Leu Ala 15 Ala Pro Pro Pro 20 Ile Asn Lys Leu Ala 25 Leu Phe Pro Asp Lys 30 Ser Ala Trp Cys Glu 35 Ala Lys Asn Ile Thr 40 Gin Ile Val Gly His 45 Ser Gly Cys Glu Ala 50 Lys Ser Ile Gin Asn 55 Arg Ala Cys Leu Gly 60 Gin Cys Phe Ser Tyr 65 Ser Val Pro Asn Thr 70 Phe Pro Gin Ser Thr 75 Glu Ser Leu Val His 80 Cys Asp Ser Cys Met 85 Pro Ala Gin Ser Met 90 Trp Glu Ile Val Thr Leu 95 Glu Cys Pro Gly 100 His Glu Glu Val Pro 105 Arg Val Asp Lys Leu 110 Val Glu Lys Ile Leu 115 His Cys Ser Cys Gin 120 Ala Cys Gly Lys Glu 125 Pro Ser His Glu Gly Leu 130 Ser Val Tyr Val 135 Gin Gly Glu Asp Gly 140 Pro Gly Ser Gin Pro 145 Gly Thr His Pro His 150 Pro His Pro His Pro 155 His Pro Gly Gly Gin 160 Thr Pro Glu Pro Glu Asp Pro Pro Gly Ala Pro His Thr Glu Glu Glu 165 170 175
Gly Ala Glu Asp 180 111 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
<210> 45 <211> 642 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(639) <400> 45 atg Met 1 cag Gin ctc Leu cca Pro ctg Leu 5 gcc Ala ctg Leu tgt Cys ctc Leu gtc Val 10 tgc Cys ctg Leu ctg Leu gta Val cac His 15 aca Thr 48 gcc Ala ttc Phe cgt gta Arg Vai 20 gtg Vai gag ggc Glu Gly cag ggg Gin Gly 25 tgg Trp cag Gin gcg Ala ttc Phe aag Lys 30 aat Asn gat Asp 96 gcc Ala acg Thr gaa Glu 35 ate Ile ate Ile ccc Pro gag Glu ctc gga Leu Gly 40 gag Glu tac Tyr ccc Pro gag Glu 45 cct Pro cca Pro ccg Pro 144 gag Glu ctg Leu 50 gag Glu aac Asn aac Asn aag Lys acc Thr 55 atg Met aac Asn cgg Arg gcg Ala gag Glu 60 aac Asn gga Gly ggg Gly cgg Arg 192 cct Pro 65 ccc Pro cac His cac His ccc Pro ttt Phe 70 gag Glu acc Thr aaa Lys gac Asp gtg Val 75 tcc Ser gag Glu tac Tyr age Ser tgc Cys 80 240 cg c Arg gag Glu ctg Leu cac His ttc Phe 85 acc cgc Thr Arg tac Tyr gtg Val acc Thr 90 gat Asp ggg Gly ccg Pro tgc Cys cgc Arg 95 age Ser 288 gcc Ala aag Lys ccg gtc Pro Vai 100 acc Thr gag Glu ctg Leu gtg Val tgc Cys 105 tcc Ser ggc Gly cag Gin tgc Cys ggc Gly 110 ccg Pro gcg Ala 336 cgc Arg ctg Leu ctg ccc Leu Pro 115 aac Asn gcc Ala ate Ile ggc cgc Gly Arg 120 ggc Gly aag Lys tgg Trp tgg Trp 125 cga Arg cct Pro agt Ser 384 ggg Gly ccc Pro gac Asp ttc Phe cgc Arg tgc Cys ate Ile ccc gac Pro Asp cgc Arg tac Tyr cgc Arg gcg Ala cag Gin cgc Arg gtg val 432 130 135 14 0 cag Gin 145 ctg Leu ctg tgt Leu Cys ccc Pro ggt ggt Gly Gly ISO gag gcg Glu Ala ccg Pro cgc Arg 155 gcg Ala cgc Arg aag Lys gtg Val cgc Arg 160 480 ctg Leu gtg Vai gcc Ala tcg Ser tgc Cys 165 aag Lys tgc Cys aag Lys cgc Arg ctc Leu 170 acc Thr cgc Arg ttc Phe cac His aac Asn 175 cag Gin 528 tcg Ser gag Glu ctc Leu aag Lys 180 gac Asp ttc ggg Phe Gly acc Thr gag Glu 185 gcc Ala gct Ala cgg Arg ccg Pro cag Gin 190 aag Lys ggc Gly 576 cgg Arg aag Lys ccg Pro 195 cgg Arg ccc Pro cgc gcc Arg Ala cgg Arg 200 age Ser gcc Ala aaa Lys gcc Ala aac Asn 205 cag Gin gcc Ala gag Glu 624 ctg Leu gag Glu 210 aac Asn gcc Ala tac Tyr tag 642 <210> 46 112 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
<211> 190 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46
Gin Gly Trp Gin Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu Ile Ile Pro Glu 1 5 10 15 Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr 20 25 30 Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro Hls His Pro Phe Glu 35 40 45 Thr Lys Asp Vai Ser Glu Tyr Ser Cys Arg Glu Leu His Phe Thr Arg 50 55 60 Tyr Vai Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser Ala Lys Pro Val Thr Glu Leu 65 70 75 80 Vai Cys Ser Gly Gin Cys Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile 85 90 95 Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro Ser Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile 100 105 110 Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gin Arg Vai Gin Leu Leu Cys Pro Gly Gly 115 120 125 Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Vai Arg Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys 130 135 14 0 Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gin Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly 145 150 155 160 Thr Glu Ala Ala Arg Pro Gin Lys Gly Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala 165 170 175 Arg Ser Ala Lys Ala Asn. Gin Ala Glu Leu Glu Asn Ala Tyr 180 185 190
<210> 47 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47
Gin Gly Trp Gin Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu Ile Ile Pro Glu 15 10 15
Leu Gly Glu Tyr 20
<210> 48 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48
Thr Glu Ile Ile Pro Glu Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro Glu 15 10 15
Leu Glu Asn Asn 20 49 20 <210> <211> 113 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49
Pro Glu Pro Pro Pro Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr Met Asn Arg Ala 15 10 15
Glu Asn Gly Gly 20
<210> 50 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50
Lys Thr Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro His His Pro 15 10 15
Phe Glu Thr Lys 20
<210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51
Arg Pro pro His His Pro Phe Glu Thr Lys Asp Vai Ser Glu Tyr Ser 15 10 15
<210> 52 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de péptido SOST humano com adição de cisteina adicional <400> 52
Gin Gly Trp Gin Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu Ile Ile Pro Glu 15 10 15
Leu Gly Glu Tyr Cys 20 <210> 53 <211> 21 114 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de péptido SOST humano com adição de cisteina adicional <400> 53
Thr Glu Ile Ile Pro Glu Leu Glv Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro Glu 15 10 15
Leu Glu Asn Asn Cys 20
<210> 54 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de péptido SOST humano com adição de cisteina adicional <400> 54
Pro Glu Pro Pro Pro Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr Met Asn Arg Ala 15 10 15
Glu Asn Gly Gly Cys 20
<210> 55 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de péptido SOST humano com adição de cisteina adicional <400> 55
Lys Thr Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro His His Pro 15 io 15
Phe Glu Thr Lys Cys 20
<210> 56 <211> 17 <212> PRT 115 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de péptido SOST humano com adição de cisteína adicional <400> 56
Arg Pro Pro His His Pro Phe Glu Thr Lys Asp Vai Ser Glu Tyr Ser 15 10 15
Cys
<210> 57 <211> 24 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 57
Gin Gly Trp Gin Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu Ile lie Pro Gly 15 10 15
Leu Arg Glu Tyr Pro Glu Pro Pro 20
<210> 58 <211> 20 <212> PRT <213> Rattus morvegicus <400> 58
Pro Glu Pro Pro Gin Glu Leu Glu Asn Asn Gin Thr Met Asn Arg Ala 15 10 15
Glu Asn Gly Gly 20
<210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 59
Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro His His Pro Tyr Asp Thr Lys Asp Vai 1 5 10 15
Ser Glu Tyr Ser 20 <210> 60 116 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
<211> 20 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 60
Thr Glu Ile Ile Pro Gly Leu Arg Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Gin Glu 15 io 15
Leu Glu Asn Asn 20
<210> 61 <211> 25 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de péptido SOST de rato com adição de cisteina adicional <400> 61
Gin Gly Trp Gin Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu Ile Ile Pro Gly 15 10 15
Leu Arg Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Cys 20 25
<210> 62 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de péptido SOST de rato com adição de cisteina adicional <400> 62
Pro Glu Pro Pro Gin Glu Leu Glu Asn Asn Gin Thr Met Asn Arg Ala 15 10 15
Glu Asn Gly Gly Cys 20
<210> 63 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> 117 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <223> Fragmento de péptido SOST de rato com adiçao de cisterna adicional <400> 63
Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro His His Pro Tyr Asp Thr Lys Αερ Vai 15 10 15
Ser Glu Tyr Ser Cys 20
<210> 64 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de péptido SOST de rato com adição de cisteina adicional <400> 64
Thr Glu xle Ile Pro Gly Leu Arg Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Gin Glu 15 10 15
Leu Glu Asn Asn Cys 20
<210> 65 <211> 190 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 65
Gin Gly Trp Gin Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu Ile Ile Pro Gly 1 5 10 15 Leu Arg Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Gin Glu Leu Glu Asn Asn Gin Thr 20 25 30 Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro His His Pro Tyr Asp 1 35 40 45 Thr Lys Asp Vai Ser Glu Tyr Ser Cys Arg Glu Leu His Tyr Thr Arg 50 55 60 Phe Vai Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser Ala Lys Pro Vai Thr Glu Leu 65 70 75 80 Vai Cys Ser Gly Gin Cys Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile 85 90 95 Gly Arg Vai Lys Trp Trp Arg Pro Asn Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile 100 105 110 Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gin Arg Vai Gin Leu Leu Cys Pro Gly Gly 115 120 125 Ala Ala Pro Arg Ser Arg Lys Vai Arg Leu Vai Ala Ser Cys Lys Cys 130 135 140 Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gin Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly 145 150 155 160 Pro Glu Thr Ala Arg Pro Gin Lys Gly Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala 165 170 175 Arg Gly Ala Lys Ala Asn Gin Ala Glu Leu Glu Asn Ala Tyr 180 185 190 118 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
<210> 66 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66
Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gin Arg Vai Gin Leu Leu Cys Pro Gly 15 10 15
Gly Glu Ala Pro 20
<210> 67 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67
Gin Leu Leu Cys Pro Gly Gly Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Vai Arg 15 10 15
Leu Vai Ala Ser 20
<210> 68 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de péptido SOST humano com adição de cisteina adicional <400> 68
Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gin 1 5 Gly Glu Ala Pro Cys 20
Arg Vai Gin Leu Leu Cys Pro Gly 10 15
<210> 69 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de péptido SOST humano com adição de cisteina adicional 119 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <400> 69
Gin Leu Leu Cys Pro Gly Gly Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Vai Arg 15 io 15
Leu Vai Ala Ser Cys 20
<210> 70 <211> 17 <212> PRT <213> Rattus Norvegicus <400> 70
Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gin Arg Vai Gin Leu Leu Cys Pro Gly 15 io is
Gly
<210> 71 <211> 16 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 71
Pro Gly Gly Ala Ala Pro Arg Ser Arg Lys Vai Arg Leu Vai Ala Ser 15 io 15
<210> 72 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de péptido SOST de rato com adição de cisteina adicional <400> 72
Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gin Arg Vai Gin Leu Leu Ser Pro Gly 1 5 io 15
Gly Cys
<210> 73 <211> 17 <212> PRT 120 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de péptido SOST de rato com adição de cisteina adicional
<400> 73 Pro Gly Gly Alá Ala Pro Arg Ser 1 5 Cys <210> 74 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Cys Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro 1 5 Trp Arg Pro Ser 20 <210> 75 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Ile Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg 1 5 <210> 76 <211> 18 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 76 Pro Asn Ala Ile Gly Arg Vai Lys 1 5 Phe Arg <210> 77 <211> 19 <212> PRT
Arg Lys Vai Arg Leu Vai Ala Ser 10 15
Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp 10 15
Pro Ser Gly Pro Asp Phe Arg Cys 10 15
Trp Trp Arg Pro Asn Gly Pro Asp 10 15 121 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de péptido SOST de rato com adição de cisteina adicional <400> 77
Thr Glu Ala Ala 20 <210> 79 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79
Pro Asn Ala Ile Gly Arg Vai Lys Trp Trp Arg Pro Asn Gly Pro Asp 15 10 15 Phe Arg Cys <210> 78 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gin Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly 15 10 15
Glu Leu Lys Asp Phe Gly Thr Glu Ala Ala Arg Pro Gin Lys Gly Arg 15 10 15
Lyg Pro Arg Pro 20
<210> 80 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80
Arg Pro Gin Lys Gly Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala Arg Ser Ala Lys 15 10 15
Ala Asn Gin Ala 20 <210> 81 122 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
<211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81
Arg Ala Arg Ser Ala Lys Ala Asn Gin Ala Glu Leu Glu Asn Ala Tyr 15 10 15
<210> 82 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de péptido SOST humano com adição de cisteina adicional <400> 82
Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gin Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly 15 10 15
Thr Glu Ala Ala Cys 20
<210> 83 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de péptido SOST humano com adição de cisteina adicional <400> 83
Glu Leu Lys Asp Phe Gly Thr Glu Ala Ala Arg Pro Gin Lys Gly Arg 15 10 15
Lys Pro Arg Pro Cys 20
<210> 84 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de péptido SOST humano com adição de cisteina adicional 123 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <400> 84
Arg Pro Gin Lys Gly Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala Arg Ser Ala Lys 15 10 15
Ala Asn Gin Ala Cys 20
<210> 85 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de péptido SOST humano com adição de cisteina adicional <400> 85
Arg Ala Arg Ser Ala Lys Ala Asn Gin Ala Glu Leu Glu Asn Ala Tyr 15 10 15
Cys
<210> 86 <211> 23 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 86
Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gin Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly 15 10 15
Pro Glu Thr Ala Arg Pro Gin 20
<210> 87 <211> 23 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 87
Lys Gly Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala Arg Gly Ala Lys Ala Asn Gin 15 10 15
Ala Glu Leu Glu Asn Ala Tyr 20 <210> 124 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
<211> 24 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 88
Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly Pro Glu Thr Ala Arg Pro Gin Lys Gly 1 5 -io 15
Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala Arg 20
<210> 89 <211> 24 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de péptido SOST de rato com adição de cisteina adicional <400> 89
Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gin Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly 15 10 15
Pro Glu Thr Ala Arg Pro Gin Cys 20
<210> 90 <211> 24 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de péptido SOST de rato com adição de cisteina adicional <400> 90
Lys Gly Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala Arg Gly Ala Lys Ala Asn Gin 15 10 15
Ala Glu Leu Glu Asn Ala Tyr Cys 20
<210> 91 <211> 25 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> 125 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <223> Fragmento de péptido SOST de rato com adição de cisterna adicional <400> 91
Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly Pro Glu Thr Ala Arg Pro Gin Lye Gly 15 10 15
Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala Arg Cys 20 25
<210> 92 <211> 56 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92
Gin Gly Trp Gin Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu Ile Ile Pro Glu 1 5 10 15 Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr 20 25 30 Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro His His Pro Phe Glu 35 40 45 Thr Lys Asp Vai Ser Glu Tyr Ser 50 55
<210> 93 <211> 56 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 93
Gin Gly Trp Gin Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu Ile Ile Pro Gly .1.5 10 15
Leu Arg Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Gin Glu Leu Glu Asn Asn Gin Thr 20 25 30
Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro His His Pro Tyr Asp 35 40 45
Thr Lys Asp Vai Ser Glu Tyr Ser 50 55
<210> 94 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens 126 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <40 0> 94 Cys Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gin Arg Val Gin Leu Leu Cys Pro 1 ( Ala 5 10 15 Gly Gly Glu Pro Arg Ala Arg Lys Vai Arg Leu Val Ala Ser Cys 20 25 30 <210> 95 <211> 32 <212> PRT <213> Rattuí 3 norvegi CUS <400> 95 Cys Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gin Arg Val Gin Leu Leu Cys Pro 1 Ala 5 10 15 Gly Gly Ala Pro Arg Ser Arg Lys Val Arg Leu Val Ala Ser Cys 20 25 30 <210> 96 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Leu Thr Arg Phe HiS Asn Gin Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly Thr Glu 1 5 10 15 Ala Ala Arg Pro Gin Lys Gly Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala Arg Ser 20 25 30 Ala Lys Ala Asn Gin Ala Glu Leu Glu Asn Ala Tyr 35 40 <210> 97 <211> 44 <212> PRT <213> Rattus norvegi CUS <400> 97 Leu Thr Arg Phe His Asn Gin Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly Pro Glu 1 5 10 15 Thr Ala Arg Pro Gin Lys Gly Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala Arg Gly 20 25 30 Ala Lys Ala Asn Gin Ala Glu Leu Glu Asn Ala Tyr 35
<210> 98 <211> 26 <212> PRT 40 127 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <213> Homo sapiens <400> 98
Cys Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp 15 10 15
Trp Arg Pro Ser Gly Pro Asp Phe Arg Cys 20 25
<210> 99 <211> 26 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 99
Cys Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Vai Lys Trp 15 10 15
Trp Arg Pro Asn Gly Pro Asp Phe Arg Cys 20 25
<210> 100 <211> 570 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 100 caggggtggc aggcgttcaa gaatgatgcc acggaaatca tccccgagct cggagagtac cccgagcctc caccggagct ggagaacaac aagaccatga accgggcgga gaacggaggg cggcctcccc accaccccct tgagaccaaa gacgtgtccg agtacagctg ccgcgagctg caçttcaccc gctacgtgac cgatgggccg tgcçgcagcg ccaagccggt caccgagctg gtgtgctccg gccagtgcgg cccggcgcgc ctgctgccca acgccatcgg ccgcggcaag tggtggcgac ctagtgggoc cgacttocgc tgcatccccg accgctaccg cgcgcagcgc gtgcagctgc tgtgtcccgg tggtgaggeg ccgcgcgcgc geaaggtgcg cctggtggcc tcgtgcaagt gcaagcgcct cacccgcttc cacaaccagt cggagctcaa ggacttcggg accgaggccg ctcggccgca gaagggccgg aagccgcggc cccgcgcccg gagcgcoaaa gccaaccagg cogagctgga gaacgcctac
<210> 101 <211> 570 <212> ADN <213> Rattus norvegicus 128 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <400> 101 caggggtggc aagccttcaa ccagagcctc ctcaggaact agaccccccc accatcctta cactacaccc gcttcgtgac gtgtgctcgg gccagtgcgg tggtggcgcc cgaacggacc gtgcagctgc tgtgccccgg tcgtgcaagt gcaagcgcct cctgagaccg cgcggccgca gccaaccagg cggagctgga gaatgatgcc acagaaatca agagaacaac cagaccatga tgacaccaaa gacgtgtccg cgacggcccg tgccgcagtg ccccgcgcgg ctgctgccca cgacttccgc tgcatcocgg cggcgcggcg ccgcgctcgc cacccgcttc cacaaccagt gaagggtcgc aagccgcggc gaacgcctac tcccgggact cagagagtac 60 accgggccga gaacggaggc 120 agtacagctg ccgcgagctg 180 ccaagccggt caccgagttg 240 acgccatcgg gcgcgtgaag 300 atcgctaccg cgcgcagcgg 360 gcaaggtgcg tctggtggcc 420 cggagctcaa ggacttcgga 480 cccgcgcccg gggagccaaa 540 570
<210> 102 <211> 532 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102
Met 1 Thr Gin Leu Tyr 5 Ile Tyr Ile Arg Leu 10 Leu Gly Ala Tyr Leu 15 Phe Ile Ile Ser Arg 20 Vai Gin Gly Gin Asn 25 Leu Asp Ser Met Leu 30 His Gly Thr Gly Met 35 Lys Ser Asp Ser Asp 40 Gin Lys Lys Ser Glu 45 Asn Gly Vai Thr Leu 50 Ala Pro Glu Asp Thr 55 Leu Pro Phe Leu Lys 60 Cys Tyr Cys Ser Gly 65 His Cys Pro Asp Asp 70 Ala Ile Asn Asn Thr 75 Cys Ile Thr Asn Gly 80 His Cys Phe Ala Ile 85 Ile Glu Glu Asp Asp 90 Gin Gly Glu Thr Thr 95 Leu Ala Ser Gly Cys 100 Met Lys Tyr Glu Gly 105 Ser Asp Phe Gin Cys 110 Lys Asp Ser Pro Lys 115 Ala Gin Leu Arg Arg 120 Thr Ile Glu Cys Cys 125 Arg Thr Asn 129 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
Leu Cys 130 Asn Gin Tyr Leu Gin 135 Pro Thr Leu Prp Pro 140 Vai Vai Ile Gly Pro 145 Phe Phe Asp Gly Ser 150 Ile Arg Trp Leu Vai 155 Leu Leu Ile Ser Met 160 Ala Vai Cys Ile Ile 165 Ala Met Ile Ile Phe 170 Ser Ser Cys Phe Cys 175 Tyr Lys HÍS Tyr Cys 180 Lys Ser Ile Ser Ser 185 Arg Arg Arg Tyr Asn 190 Arg Asp Leu Glu Gin 195 Asp Glu Ala Phe Ile 200 Pro Vai Gly Glu Ser 2 05 Leu Lys Asp Leu Ile 210 Asp Gin Ser Gin Ser 215 Ser Gly Ser Gly Ser 220 Gly Leu Pro Leu Leu 225 Vai Gin Arg Thr Ile 230 Ala Lys Gin Ile Gin 23 S Met Vai Arg Gin Vai 240 Gly Lys Gly Arg Tyr 245 Gly Glu Vai Trp Met 250 Gly Lys Trp Arg Gly 255 Glu Lys Vai Ala Vai 260 Lys Vai Phe Phe Thr 265 Thr Glu Glu Ala Ser 270 Trp Phe Arg Glu Thr 275 Glu Ile Tyr Gin Thr 280 Vai Leu Met Arg His 2 85 Glu Asn Ile Leu Gly 290 Phe Ile Ala Ala Asp 295 Ile Lys Gly Thr Gly 300 Ser Trp Thr Gin Leu 305 Tyr Leu Ile Thr Asp 310 Tyr His Glu Asn Gly 315 Ser Leu Tyr Asp Phe 320 Leu Lys Cys Ala Thr 325 Leu Asp Thr Arg Ala 330 Leu Leu Lys Leu Ala 335 Tyr Ser Ala Ala Cys 340 Gly Leu Cys His Leu 345 His Thr Glu Ile Tyr 350 Gly Thr Gin Gly Lys 355 Pro Ala Ile Ala His 360 Arg Asp Leu Lys Ser 365 Lys Asn Ile Leu Ile 370 Lys Lys Asn Gly Ser 3 75 Cys Cys Ile Ala Asp 380 Leu Gly Leu Ala Vai 385 Lys Phe Asn Ser Asp 390 Thr Asn Glu Vai Asp 395 Vai Pro Leu Asn Thr 400 Arg Vai Gly Thr Lys 405 Arg Tyr Met Ala Pro 410 Glu Vai Leu Asp Glu 415 Ser Leu Asn Lys Asn 420 His Phe Gin Pro Tyr 425 Ile Met Ala Asp Ile 430 Tyr Ser Phe Gly Leu 435 Ile Ile Trp Glu Met 440 Ala Arg Arg Cys Ile 445 Thr Gly Gly lie Vai 450 Glu Glu Tyr Gin Leu 455 Pro Tyr Tyr Asn Met 460 Vai Pro Ser Asp Pro 465 Ser Tyr Glu Asp Met 470 Arg Glu Vai Vai Cys 475 Vai Lys Arg Leu Arg 480 Pro Ile Vai Ser Asn 485 Arg Trp Asn Ser Asp 490 Glu Cys Leu Arg Ala 495 Vai Leu Lys Leu Met 500 Ser Glu Cys Trp Ala 505 His Asn Pro Ala Ser 510 Arg Leu Thr Asp Ala Vai 530 Leu 515 Lys Arg Ile Ile Lys Lys Thr 520 Leu Ala Lys Met Vai 525 Glu Ser Gin
<210> 103 <211> 502 <212> PRT <213> Homo sapiens 130 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <400> 103
Met 1 Leu Leu Arg Ser 5 Ala Gly Lys Leu Asn 10 Val Gly Thr Lys Lys 15 Glu Asp Gly Glu Ser 20 Thr Ala Pro Thr Pro 25 Arg Pro Lys Val Leu 30 Arg Cys Lys Cys His 35 His His Cys Pro Glu 40 Asp Ser Val Asn Asn 45 Ile Cys Ser Thr Asp 50 Gly Tyr Cys Phe Thr 55 Met Ile Glu Glu Asp 60 Asp Ser Gly Leu Pro 55 Vai Vai Thr Ser Gly 70 Cys Leu Gly Leu Glu 75 Gly Ser Asp Phe Gin 80 Cys Arg Asp Thr Pro 85 Ile Pro His Gin Arg 90 Arg Ser Ile Glu Cys 95 Cys Thr Glu Arg Asn 100 Glu Cys Asn Lys Asp 105 Leu His Pro Thr Leu 110 Pro Pro Leu Lys Asn 115 Arg Asp Phe Val Asp 120 Gly Pro Ile His His 125 Arg Ala Leu Leu Ile 130 Ser Vai Thr Val Cys 135 Ser Leu Leu Leu Val 140 Leu Ile Ile Leu Phe 145 Cys Tyr Phe Arg Tyr 150 Lys Arg Gin Glu Thr 155 Arg Pro Arg Tyr Ser 160 Ile Gly Leu Glu Gin 165 Asp Glu Thr Tyr Ile 170 Pro Pro Gly Glu Ser 175 Leu Arg Asp Leu Ile 180 Glu Gin Ser Gin Ser 185 Ser Gly Ser Gly Ser 190 Gly Leu Pro Leu Leu 195 Vai Gin Arg Thr Ile 200 Ala Lys Gin Ile Gin 205 Met Val Lys Gin Ile 210 Gly Lys Gly Arg Tyr 215 Gly Glu Val Trp Met 220 Gly Lys Trp Arg Gly 225 Glu Lys Vai Ala Val 230 Lys Val Phe Phe Thr 235 Thr Glu Glu Ala Ser 240 Trp Phe Arg Glu Thr 245 Glu Ile Tyr Gin Thr 250 Val Leu Met Arg His 255 Glu Asn Ile Leu Gly 260 Phe Ile Ala Ala Asp 265 Ile Lys Gly Thr Gly 270 Ser Trp Thr Gin Leu 275 Tyr Leu Ile Thr Asp 280 Tyr His Glu Asn Gly 285 Ser Leu Tyr Asp Tyr 290 Leu Lys Ser Thr Thr 295 Leu Asp Ala Lys Ser 300 Met Leu Lys Leu Ala 305 Tyr Ser Ser Val Ser 310 Gly Leu Cys His Leu 315 His Thr Glu Ile Phe 320 Ser Thr Gin Gly Lys 325 Pro Ala Ile Ala His 330 Arg Asp Leu Lys Ser 335 Lys Asn Ile Leu Val 340 Lys Lys Asn Gly Thr 345 Cys Cys Ile Ala Asp 350 Leu Gly Leu Ala Vai 355 Lys Phe Ile Ser Asp 360 Thr Asn Glu Val Asp 365 Ile Pro Pro Asn Thr 370 Arg Val Gly Thr Lys 375 Arg Tyr Met Pro Pro 380 Glu Val Leu Asp Glu 385 Ser Leu Asn Arg Asn 390 His Phe Gin Ser Tyr 395 Ile Met Ala Asp Met 400 Tyr Ser Phe Gly Leu 405 Ile Leu Trp Glu Val 410 Ala Arg Arg Cys Val 415 Ser Gly Gly Ile Val 420 Glu Glu Tyr Gin Leu 425 Pro Tyr His Asp Leu 430 Val Pro Ser Asp Pro 435 Ser Tyr Glu Asp Met 440 Arg Glu Ile Val cys 445 Ile Lys Lys Leu Arg 450 Pro Ser Phe Pro Asn 455 Arg Trp Ser Ser Asp 460 Glu Cys Leu Arg Gin 465 Met Gly Lys Leu Met 470 Thr Glu Cys Trp Ala 475 His Asn Pro Ala Ser 480 Arg Ser Leu Gin Thr Asp Ala Ile 500 Leu 485 Lys Arg Leu Val Lys Lys Thr 4 90 Leu Ala Lys Met Ser 495 Glu
<210> 104 <211> 502 <212> PRT <213> Homo sapiens 131 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <400> 104
Met 1 Leu Leu Arg Ser 5 Ala Gly Lys Leu Asn 10 Vai Gly Thr Lys Lys 15 Glu Αερ Gly Glu Ser 20 Thr Ala Pro Thr Pro 25 Arg Pro Lys Vai Leu 30 Arg Cys Lys Cys His 35 His His Cys Pro Glu Asp 40 Ser Vai Asn Asn 45 Ile Cys Ser Thr Asp 50 Gly Tyr Cys Phe Thr 55 Met Ile Glu Glu Asp Asp 60 Ser Gly Leu Pro 65 Vai Vai Thr Ser Gly 70 Cys Leu Gly Leu Glu 75 Gly Ser Asp Phe Gin 80 Cys Arg Asp Thr Pro 85 Ile Pro His Gin Arg 90 Arg Ser Ile Glu Cys 95 Cys Thr Glu Arg Asn 100 Glu Cys Asn Lys Asp 105 Leu His Pro Thr Leu 110 Pro Pro Leu Lys Asn 115 Arg Asp Phe Vai Asp Gly 120 Pro Ile His His 125 Arg Ala Leu Leu Ile 13 0 Ser Vai Thr Vai Cys 135 Ser Leu Leu Leu Vai Leu 140 Ile Ile Leu Phe 145 Cys Tyr Phe Arg Tyr 150 Lys Arg Gin Glu Thr 155 Arg Pro Arg Tyr Ser 160 lie Gly Leu Glu Gin 165 Asp Glu Thr Tyr Ile 170 Pro Pro Gly Glu Ser 175 Leu Arg Asp Leu Ile 180 Glu Gin Ser Gin Ser 185 Ser Gly Ser Gly Ser 190 Gly Leu Pro Leu Leu 195 Vai Gin Arg Thr Ile Ala 200 Lys Gin Ile Gin 205 Met val Lys Gin Ile 210 Gly Lys Gly Arg Tyr 215 Gly Glu Vai Trp Met Gly 220 Lys Trp Arg Gly 225 Glu Lys Vai Ala Vai 230 Lys Vai Phe Phe Thr 235 Thr Glu Glu Ala Ser 240 Trp Phe Arg Glu Thr 245 Glu Ile Tyr Gin Thr 250 Vai Leu Met Arg His 255 Glu Asn Ile Leu Gly 260 Phe Ile Ala Ala Asp 265 Ile Lys Gly Thr Gly 270 ser Trp Thr Gin Leu 275 Tyr Leu Ile Thr Asp Tyr 280 His Glu Asn Gly 285 Ser Leu Tyr Asp Tyr 290 Leu Lys Ser Thr Thr 295 Leu Asp Ala Lys Ser Met 300 Leu Lys Leu Ala 305 Tyr Ser Ser Vai Ser 310 Gly Leu Cys His Leu 315 His Thr Glu Ile Phe 320 Ser Thr Gin Gly Lys 325 Pro Ala Ile Ala His 330 Arg Asp Leu Lys Ser 335 Lys Asn Ile Leu Vai 340 Lys Lys Asn Gly Thr 345 Cys Cys Ile Ala Asp 350 Leu Gly Leu Ala Vai 355 Lys Phe Ile Ser Asp Thr 360 Asn Glu Vai Asp 365 Ile Pro Pro Asn Thr 370 Arg Vai Gly Thr Lys Arg Tyr Met 375 Pro Pro Glu 380 Vai Leu Asp Glu 385 Ser Leu Asn Arg Asn 390 His Phe Gin Ser Tyr 395 Ile Met Ala Asp Met 400 Tyr Ser Phe Gly Leu 405 Ile Leu Trp Glu Vai 410 Ala Arg Arg Cys Val 415 Ser Gly Gly Ile Vai 420 Glu Glu Tyr Gin Leu 425 Pro Tyr His Asp Leu 430 Val Pro Ser Asp Pro 435 Ser Tyr Glu Asp Met Arg 440 Glu Ile Vai Cys 445 Ile Lys Lys Leu Arg 450 Pro Ser Phe Pro Asn Arg Trp 455 Ser Ser Asp Glu Cys 460 Leu Arg Gin 465 Met Gly Lys Leu Met 470 Thr Glu Cys Trp Ala 475 His Asn Pro Ala Ser 480 Arg Ser Leu Gin Thr Asp Ala Ile 500 Leu 485 Lys Arg Leu Vai Lys Lys Thr 490 Leu Ala Lys Met Ser 495 Glu <210> 105 <211> 532 <212> PRT <213> Rattus sp. 132 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <40 0> 105
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Arg Leu 10 Leu Gly Ala Cys Leu 15 Phe Asn 25 Leu Asp Ser Met Leu 30 His Gly Gin Lys Lys Pro Glu 45 Asn Gly Val Pro Phe Leu Lys 60 Cys Tyr Cys Ser Asn Asn Thr 75 Cys Ile Thr Asn Gly 80 Asp Asp 90 Gin Gly Glu Thr Thr 95 Leu Gly 105 Ser Asp Phe Gin Cys 110 Lys Asp Thr Ile Glu Cys Cys 125 Arg Thr Asn Thr Leu Pro Pro 140 Val Val Ile Gly Trp Leu Ala 155 Val Leu Ile Ser Met 160 Val Phe 170 Ser Ser Cys Phe Cys 175 Tyr Ser 185 Arg Gly Arg Tyr Asn 190 Arg Asp
Leu Glu Gin 195 Asp Glu Ala Phe Ile 200 Leu Ile 210 Asp Gin Ser Gin Ser 215 Ser Leu 225 Vai Gin Arg Thr Ile Ala 230 Lys Gly Lys Gly Arg Tyr 245 Gly Glu Val Lys Vai Ala Val 260 Lys Val Phe Phe Arg Glu Thr 275 Glu Ile Tyr Gin Thr 280 Leu Gly 290 Phe Ile Ala Ala Asp 295 Ile Leu 305 Tyr Leu Ile Thr Asp Tyr 310 His Leu Lys Cys Ala Thr 325 Leu Asp Thr Ser Ala Ala Cys 340 Gly Leu Cys His Gin Gly Lys 355 Pro Ala Ile Ala His 360 Leu Ile 370 Lys Lys Asn Gly Ser 375 Cys Vai 385 Lys Phe Asn Ser Asp Thr 390 Asn Arg Vai Gly Thr Arg 405 Arg Tyr Met Leu Ser Lys Asn 420 His Phe Gin Pro Phe oiy Leu 435 Ile Ile Trp Glu Met 440 Ile Val 450 Glu Glu Tyr Gin Leu 455 Pro Pro 465 Ser Tyr Glu Asp Met Arg 470 Glu Pro Ile Val Ser Asn 485 Arg Trp Asn Leu Lys Leu Met 500 Ser Glu Cys Trp Thr Asp Ala Val 53 0 Leu 515 Lys Arg Ile Ile Lys Lys Thr 520
Pro Val Gly Glu Ser 205 Leu Lys Asp Gly Ser Gly Ser 220 Gly Leu Pro Leu Gin Ile Gin 235 Met Val Arg Gin Val 240 Trp Met 250 Gly Lys Trp Arg Gly 255 Glu Thr 265 Thr Glu Glu Ala Ser 270 Trp Phe Val Leu Met Arg His 285 Glu Asn Ile Lys Gly Thr Gly 300 Ser Trp Thr Gin Glu Asn Gly 315 Ser Leu Tyr Asp Phe 320 Arg Ala 330 Leu Leu Lys Leu Ala 335 Tyr Leu 345 His Thr Glu Ile Tyr 350 Gly Thr Arg Asp Leu Lys Ser 365 Lys Asn Ile Cys Ile Ala Asp 380 Leu Gly Leu Ala Glu Val Asp 395 Ile Pro Leu Asn Thr 400 Ala Pro 410 Glu Val Leu Asp Glu 415 Ser Tyr 425 Ile Met Ala Asp Ile 430 Tyr Ser Ala Arg Arg Cys Ile 445 Thr Gly Gly Tyr Tyr Asn Met 460 Val Pro Ser Asp Val Val Cys 475 Val Lys Arg Leu Arg 480 Ser Asp 490 Glu Cys Leu Arg Ala 495 Val Ala 505 His Asn Pro Ala Ser 510 Arg Leu Leu Ala Lys Met Val 525 Glu Ser Gin
<210> 106 <211> 532 <212> PRT 133 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <213> Rattus norvegicus <40 0> 106
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Leu Asn 10 Val Gly Thr Lys Lys 15 Glu Pro 25 Arg Pro Lys Val Leu 30 Arg Cys Asp Ser Val Asn Asn 45 Ile Cys Ser Ile Glu Glu Asp 60 Asp Ser Gly Leu Gly Leu Glu 75 Gly Ser Asp Phe Gin 80 Gin Arg 90 Arg Ser Ile Glu Cys 95 Cys Asp 105 Leu His Pro Thr Leu 110 Pro Pro Gly Pro Ile His His 125 Arg Ala Leu Leu Leu Leu Val 140 Leu Ile Ile Leu Gin Glu ,Thr 155 Arg Pro Arg Tyr Ser 160 Tyr Ile 170 Pro Pro Gly Glu Ser 175 Leu Ser 185 Ser Gly Ser Gly Ser 190 Gly Leu 136 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
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<210> 109 <211> 502 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109
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<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 116 gctccgcgcc gagggctgga ggatgcgttc cctggggtcc ggacttatga aaatatgcat 60 cagtttaata ctgtcttgga attcatgaga tggaagcata ggtcaaagct gtttggagaa 120 aatcagaagt acagttttat ctagccacat cttggaggag tcgtaagaaa gcagtgggag 180 ttgaagtcat tgtcaagtgc ttgcgatctt ttacaagaaa atctcactga atgatagtca 240 tttaaattgg tgaagtagca agaccaatta ttaaaggtga cagtacacag gaaacattac 300 aattgaacaa tgactcagct atacatttac atcagattat tgggagccta tttgttcatc 360 atttctcgtg ttcaaggaca gaatctggat agtatgcttc atggcactgg gatgaaatca 420 gactccgacc agaaaaagtc agaaaatgga gtaaccttag caccagagga taccttgcct 480 tttttaaagt gctattgctc agggcactgt ccagatgatg ctattaataa cacatgcata 540 actaatggac attgctttgc catcatagaa gaagatgacc agggagaaac cacattagct 600 tcagggtgta tgaaatatga aggatctgat tttcagtgca aagattctcc aaaagcccag 660 ctacgccgga caatagaatg ttgtcggacc aatttatgta accagtattt gcaacccaca 720 ctgccccotg ttgtcatagg tccgtttttt gatggcagca ttcgatggct ggttttgctc 780 atttctaEgg ctgtctgcat aattgctatg atcatcttct ceagctgctt ttgttacaaa 840 cattattgca agagcatctc aagcagacgt cgttacaatc gtgatttgga acaggatgaa 900 gcatttattc cagttggaga atcactaaaa gaccttattg accagtcaca aagttctggt 960 agtgggtctg gactaccttt attggttcag cgaactattg ccaaacagat tcagatggtc 1020 cggcaagttg gtaaaggccg atatggagaa gtatggatgg gcaaatggcg tggcgaaaaa 1080 gtggcggtga aagtattctt taccactgaa gaagccagct ggtttcgaga aacagaaatc 1140 taccaaactg tgctaatgcg ccatgaaaac atacttggtt tcatagcggc agacattaaa 1200 ggtacaggtt cctggactca gctctatttg attactgatt accatgaaaa tggatctctc 1260 tatgacttcc tgaaatgtgc tacactggac accagagccc tgcttaaatt ggcttattca 1320 gctgcctgtg gtctgtgcca cctgcacaca gaaatttatg gcacccaagg aaagcccgca 1380 attgctcatc gagacctaaa gagcaaaaac atcctcatca agaaaaatgg gagttgctgc 1440 attgctgacc tgggccttgc tgttaaattc aacagtgaca caaatgaagt tgatgtgccc 1500 ttgaatacoa gggtgggcao caaacgctac atggctcccg aagtgctgga cgaaagcctg 1560 aacaaaaacc acttccagcc ctacatcatg gctgacatct acagcttcgg cctaatcatt 1620 tgggagatgg ctcgtcgttg tatcacagga gggatcgtgg aagaatacca attgccatat 1680 tacaacatgg taccgagtga tccgtcatac gaagatatgc gtgaggttgt gtgtgtoaaa 1740 cgtttgcggc caattgtgtc taatcggtgg aacagtgatg aatgtctacg agcagtttcg 1800 aagctaatgt cagaatgctg ggcccacaat ccagcctcca gactcacagc attgagaatt 1860 aagaagacgc ttgccaagat ggttgaatcc caagatgtaa aaatctgatg gttaaaccat 1920 cggaggagaa actctagact gcaagaactg tttttaccca tggcatgggt ggaattagag 1980 tggaataagg atgttaactt ggttctcaga ctctttcttc actacgtgtt cacaggctgc 2040 taatattaaa cctttcagta ctcttattag gatacaagct gggaacttct aaacacttca 2100 ttctttatat atggacagct ttattttaaa tgtggttttt gatgcctttt tttaagtggg 2160 tttttatgaa ctgcatcaag acttcaatcc tgattagtgt ctccagtcaa gctctgggta 2220 ctgaattgcc tgttcataaa acggtgcttt ctgtgaaagc cttaagaaga taaatgagcg 2280 cagcagagat ggagaaatag actttgcctt ttacctgaga cattcagttc gtttgtattc 2340 tacctttgta aaacagccta tagatgatga tgtgtttggg atactgctta ttttatgata 2400 gtttgtcctg tgtccttagt gatgtgtgtg tgtctccatg cacatgcacg ccgggattcc 2460 tctgctgcca tttgaattag aagaaaataa tttatatgca tgcacaggaa gatattggtg 2520 gccggtggtt ttgtgcttta aaaatgcaat atctgaccaa gattcgccaa tctcatacaa 2580 gccatttact ttgcaagtga gatagcttcc ccaccagctt tattttttaa catgaaagct 2640 gatgccaagg ccaaaagaag tttaaagcat ctgtaaattt ggactgtttt ccttcaacca 2700 ccattttttt tgtggttatt atttttgtca cggaaagcat cctctccaaa gttggagctt 2760 ctattgccat gaaccatgct tacaaagaaa gcacttctta ttgaagtgaa ttcctgcatt 2820 tgatagcaat gtaagtgcct ataaccatgt tctatattct ttattctcag taacttttaa 2880 aagggaagtt atttatattt tgtgtataat gtgctttatt tgcaaatcac cc 2932
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<210> 119 <211> 3167 <212> ADN <213> Rattus sp. <400> 119 gaattcatga gatggaaaca taggtcaaag ctgtttggag aaattggaac tacagtttta 60 tctagccaca tctctgagaa gtctgaagaa agcagcaggt gaaagtcatt gtcaagtgat 120 tttgttcttc tgtaaggaaa cctcgttcag taaggccgtt tacttcagtg aaacagcagg 180 accagtaatc aaggtggccc ggacaggaca cgtgcgaatt ggacaatgac tcagctatac 240 acttacatca gattactggg agcctgtctg ttcatcattt ctcatgttca agggcagaat 300 ctagatagta tgctccatgg tactggtatg aaatcagacg tggaccagaa gaagccggaa 360 aatggagtga cgttagoacc agaggacacc ttacctttct taaaatgcta ttgctcagga 420 cactgcccag atgacgctat taataacaca tgcataacta atggccattg ctttgccatt 480 atagaagaag atgatcaggg agaaaccacg ttaacttctg ggtgtatgaa gtatgaaggc 540 tctgafctttc aatgcaagga ttcaccaaaa gcccagctac gcaggacaat agaatgttgt 600 cggaccaatt tgtgcaacca atatttgcag cctacactgc cccctgtcgt tataggccca 660 ttctttgatg gcagcgtcog atggctggct gtgctcatct ctatggctgt ctgtattgtc 720 gccatgatag tcttctccag ctgcttctgt tacaaacatt actgtaagag tatctcaagc 780 agaggtcgtt acaaccgtga cttggaacag gatgaagcat ttattccagt aggagaatca 840 ctgaaagacc tgattgacca gtcacaaagc tctggtagtg gatctggatt acctttattg 900 gttcagcgaa ctattgccaa acagatteag atggttcggc aggttggtaa aggccggtat 960 ggagaagtat ggatgggtaa atggcgtggt gaaaaagtgg ctgtcaaagt attttttacc 1020 actgaagaag ctagctggtt tagagaaaca gaaatctacc agacggtgtt aatgcgtcat 1080 gaaaatatac ttggttttat agctgcagao attaaaggca ccggttcctg gactcagctg 1140 tatttgatta ctgattacca tgagaatggg tctctctatg acttcctgaa atgtgccacc 1200 152 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ ctggacacca gagccctact caagttagct tattctgctg cctgtggtct gtgccacctc 1260 cacacagaaa Cttatggcac gcaaggcaag cctgcaattg ctcatcgaga cctgaagagc 1320 aaaaacatcc ttattaagaa aaatggtagt tgctgtattg ctgacctggg cctagctgtt 1380 aaattcaaca gtgacacaaa tgaagttgac atacccttga acaccagggt gggcaccagg 1440 cggtacatgg ctccagaagt gctggacgag agcctgagta aaaaccattt ccagccctac 1500 atcatggctg acatctacag ctttggtttg atcatttggg agatggcccg tcgctgtatC 1560 acaggaggaa tcgtggagga atatcaatta ccatattaca acatggtgcc tagtgaccca 1620 tcttatgaag acatgcgtga ggtcgtgtgt gtgaaacgct tgcggccaat cgtctctaac 1680 cgctggaaca gtgatgaatg tcttcgagcc gttttgaagc tgatgtcaga atgctgggcc 1740 cataatccag catccagact cacagctttg agaatcaaga agacgctcgc aaagatggtt 1800 gaatcccagg atgtaaagat ttgacaaaca gttttgagaa agaatttaga ctgcaagaaa 1860 ttcacccgag gaagggtgga gttagcatgg actaggatgt cggcttggtt tccagactct 1920 ctcctctaca tcttcacagg ctgctaacag taaactttca ggactctgca gaatgcaggg 1980 ttggagcttc agacatagga cttcagacat gctgttcttt gcgtatggac agctttgttt 2040 taaatgtggg cttttgatgc ctttttggtt tttatgaatt gcatcaagac tccaatcctg 2100 ataagaagtc tctggtcaaa ctctggttac tcactatcct gtccataaag tggtgctttc 2160 tgtgaaagcc ttaaggaaat tagtgagctc agcagagatg gagaaaggca tatttgccct 2220 ctacagagaa aatatctgtc tgtgttctgt ctctgtaaac agcctggact atgatctctt 2280 tgggaCgctg cctggttgat gatggtgcat catgcctctg atatgcatac cagacttcct 2340 ctgctgccat gggcttacaa gacaagaatg tgaaggttgc acaggacggt atttgtggcc 2400 agtggtttaa atatgcaata tctaatcgac attcgccaat ctcataaaag ccatctacct 2460 tgtaactgaa gtaacttctc taccaacttt atttttagca taatagttgt aaaggccaaa 2520 ctatgtataa agtgtccata gactcgaact: gttttcctcc agtcaccatt ttgttttcct 2580 tttggtaatt atttttgtta tataattcct cctatccaga attggcgctc actgtcttga 2640 accatacttt gaaagaaatg cctcttcctg gagtctgcct tactgcatct gatcaccatg 2700 tgcatacctc tgatcaaatt ctggagtott tgttctcggt acctcttaaa aagggaaatt 2760 gtgtatcatg tgtagtgtgc ttttattttc aaaatcttca tagcctttat tctagccatt 2820 tttacctaca tactcattct gtacaaaaca gctcactcgg tctcacggct gatcctcagt 2880 ggaaatgact taaagtagag ctgtgtàcga atttcagaat tcatgtattt aaaaacttca 2940 cactaacact ttactaagat attgtctcat atcttttatg aggatgtcag ctgattttca 3000 atgactataa atgtatctta gctatctaaa tcttttgaaa tttggtttta taatttctgg 3060 tccctaactt gtgaagacaa agaggcagaa gtacccagtc taccacattt acactgtaca 3120 ttattaaata aaaaaatgta tattttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 3167
<210> 120 <211> 3167 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <400> 120 gaattoatga gatggaaaca taggtcaaag ctgtttggag aaattggaac tacagtttta 60 tctagccaca tctctgagaa gtctgaagaa agcagcaggt gaaagtcatt gtcaagtgat 120 tttgttcttc tgtaaggaaa cctogttcag taaggccgtt tacttcagtg aaacagcagg 180 accagtaatc aaggtggccc ggacaggaca cgtgcgaatt ggacaatgac tcagctatao 240 acttacatca gattactggg agcctgtotg ttcatcattt ctcatgttca agggcagaat 300 ctagatagta tgctccatgg tactggtatg aaatcagacg tggaccagaa gaagccggaa 360 aatggagtga cgttagcacc agaggacacc ttacctttct taaaatgcta ttgctoagga 420 cactgcccag atgacgctat taataacaca tgcataacta atggccattg ctttgccatt 480 atagaagaag atgatcaggg agaaaccacg ttaacttctg ggtgtatgaa gtatgaaggc 540 tctgattttc aatgcaagga ttcaccaaaa gcccagctac gcaggacaat agaatgttgt 600 cggaccaatt tgtgcaacca atatttgcag cctacactgc cccctgtcgt tataggccca 660 ttctttgatg gcagcgtccg atggctggct gtgctcatct ctatggcegt ctgtattgtc 720 gccatgatcg tcttctccag ctgcttctgt tacaaacatt actgtaagag tatctcaagc 780 agaggtcgtt acaaccgtga cttggaacag gatgaagcat ttattccagt aggagaatca 840 ctgaaagacc tgattgacoa gtcacaaago tctggtagtg gatctggatt acctttattg 900 gttcagcgaa ctattgccaa acagattcag atggttcggc aggttggtaa aggccggtat 960 ggagaagtat ggatgggtaa atggcgtggt gaaaaagtgg ctgtcaaagt attttttacc 1020 153 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ actgaagaag ctagctggtt tagagaaaca gaaaatatac ttggttttat agctgcagac tatttgatta ctgattacca tgagaatggg ctggacacca gagccctact caagttagct cacacagaaa tttatggcac gcaaggcaag aaaaacatcc ttattaagaa aaatggtagt aaattcaaca gtgacacaaa tgaagttgac cggtacatgg ctccagaagt gctggacgag atcatggctg acatctacag ctttggtttg acaggaggaa tcgtggagga atatcaatta tcttatgaag acatgcgtga ggtcgtgtgt cgctggaaca gtgatgaatg tcttcgagcc cataatccag catccagact cacagctttg gaatcccagg atgtaaagat ttgacaaaca ttcacccgag gaagggtgga gttagcatgg ctcctctaca tcttcacagg ctgctaacag ttggagcttc agacatagga cttcagacat taaatgtggg cttttgatgc ctttttggtt ataagaagtc tctggtcaaa ctctggttac tgtgaaagcc ttaaggaaat tagtgagctc ctacagagaa aatatctgtc tgtgttctgt tgggatgctg cctggttgat gatggtgcat ctgctgccat gggcttacaa gacaagaatg agtggtttaa atatgcaata tctaatcgac tgtaactgaa gtaacttctc taccaacttt ctatgtataa agtgtccata gactcgaact tttggtaatt atttttgtta tataattcct accatacttt gaaagaaatg cctcttcctg tgcatacctc tgatcaaatt ctggagtctt gtgtatcatg tgtagtgtgc ttttattttc tttacctkca tactcattct gtacaaaaca ggaaatgatt taaagtagag ctgtgtacga cactaacact ttactaagat attgtctcat atgactataa atgtatctta gctatctaaa tccctaactt gtgaagacaa agaggcagaa ttattaaata aaaaaatgta tattttaaaa
<210> 121 <211> 3003 <212> ADN <213> Rattus norvegicus gaaatctacc agaoggtgtt aatgcgtcat 1080 attaaaggca ccggttcctg gactcagctg 1140 tctctctatg acttcctgaa atgtgcoacc 1200 tattctgctg cctgtggtct gtgccacctc 1260 cctgcaattg ctcatcgaga cctgaagagc 1320 tgcegtattg ctgacctggg cctagctgtt 1380 atacccttga acaccagggt gggcaccagg 1440 agcctgagta aaaaccattt ccagccctac 1500 atcatttggg agatggcccg tcgctgtatt 1560 ccatattaca acatggtgcc tagtgaccca 1620 gtgaaacgct tgcggccaat cgtctctaac 1680 gttttgaagc tgatgtcaga atgctgggcc 1740 agaatcaaga agacgctcgc aaagatggtt 1800 gttttgagaa agaatttaga ctgcaagaaa 1860 actaggatgt cggcttggtt tccagactct 1920 taaactttca ggactctgca gaatgcaggg 1980 gctgttcttt gcgtatggac agctttgttt 2040 tttatgaatt gcatcaagac tccaatcctg 2100 tcactatcct gtccataaag tggtgctttc 2160 agcagagatg gagaaaggca tatttgccct 2220 ctctgtaaac agcctggact atgatctctt 2280 catgcctctg atatgcatac cagacttcct 2340 tgaaggttgc acaggacggt atttgtggcc 2400 attcgccaat ctcataaaag ccatctacct 2460 atttttagca taatagttgt aaaggccaaa 2520 gttttcctcc agtcaccatt ttgttttcct 2580 cctatccaga attggcgctc actgtcttga 2640 gagtctgcct tactgcatct gatcaccatg 2700 tgttctcggt acctcttaaa aagggaaatt 2760 aaaatcttca tagcctttat tctagccatt 2820 gctcactcgg tctcacggct gatcctcagt 2880 acttcagaat tcatgtatct aaaaacttca 2940 atcttttatg aggatgtcag otgattttca 3000 tcttttgaaa tttggtttta taatttctgg 3060 gtacccagtc taccacattt acactgtaca 3120 aaaaaaaaaa aaaaaaa 3167 <400> 121 cgttcagtaa ggccgtttac ttcagtgaaa caggacacgt gcgaattgga caatgactca ctgtctgttc atcatttctc atgttcaagg tggtatgaaa tcagacgtgg accagaagaa ggacacctta cctttcttaa aatgctattg taacacatgc ataactaatg gccattgctt aaccacgtta acttctgggt gtatgaagta accaaaagcc cagctacgca ggacaataga tttgcagcct acactgcccc ctgtcgttat gctggctgtg ctcatctcta tggctgtctg cttctgttac aaacattact gtaagagtat ggaacaggat gaagcattta ttccagtagg acaaagctct ggtagtggat ctggattacc gattcagatg gttcggcagg ttggtaaagg cagcaggacc agtaatcaag gtggcccgga 60 gctatacact taoatcagat tactgggagc 120 gcagaatcta gatagtatgc tccatggtac 180 gccggaaaat ggagtgacgt tagcaccaga 240 ctcaggacac tgcccagatg acgctattaa 300 tgccattata gaagaagatg atcagggaga 360 tgaaggctct gattttcaat gcaaggattc 420 atgttgtcgg accaatttgt gcaaccaata 480 aggcocattc tttgatggca gcgtccgatg 540 tattgtcgcc atgatcgtct tctccagctg 600 ctcaagcaga ggtcgttaca accgtgactt 660 agaatcactg aaagacctga ttgaccagtc 720 tttattggtt cagcgaacta ttgccaaaca 780 ccggtatgga gaagtatgga tgggtaaatg 840 154 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ gcgtggtgaa aaagtggctg tcaaagtatt ttttaccact gaagaagcta gctggtttag 900 agaaacagaa atctaccaga cggtgttaat gcgtcatgaa aatatacttg gttttatagc 960 tgcagacatt aaaggcaccg gttcctggac tcagctgtat ttgattactg attaccatga 1020 gaatgggtct ctctatgact tcctgaaatg tgccaccccg gacaccagag ccctacteaa 1080 gttagcttat tctgctgcct gtggtctgtg ccacctccac acagaaattt atggcacgca 1140 aggcaagcct gcaattgctc atcgagacct gaagagcaaa aacatcctta ttaagaaaaa 1200 tggtagttgc tgtattgctg acctgggcct agctgttaaa ttcaacagtg acacaaatga 1260 agttgacata cccttgaaca ccagggtggg caccaggcgg tacatggcto cagaagtgct 1320 ggacgagagc ctgagtaaaa accatttcca gccctacatc atggctgaca tctacagctt 1380 tggtttgatc atttgggaga tggcccgtcg ctgtattaca ggaggaatcg tggaggaata 1440 tcaattacca tattacaaca tggtgcctag tgacccatct tatgaagaca tgcgtgaggt 1500 cgtgtgtgtg aaacgcttgc ggccaatcgt ctctaaccgc tggaacagtg atgaatgtct 1560 tcgagccgtt ttgaagctga tgtcagaatg ctgggcccat aatccagcat ccagactcac 1620 agctttgaga atcaagaaga cgotcgcaaa gatggttgaa tcccaggatg taaagatttg 1680 acaaacagtt ttgagaaaga atttagactg caagaaattc acccgaggaa gggtggagtt 1740 agcatggact aggatgtcgg cttggtttcc agactctctc ctctacatct tcacaggctg 1800 ctaacagtaa actttcagga ctctgcagaa tgcagggttg gagcttcaga cataggactt 1860 cagacatgct gttctttgcg tatggacagc tttgttttaa atgtgggctt ttgatgcctt 1920 tttggttttt atgaattgca tcaagactcc aatcctgata agaagtctct ggtcaaactc 1980 tggttactca ctatcetgtc cataaagtgg tgctttctgt gaaagoctta aggaaattag 2040 tgagctcagc agagatggag aaaggcatat ttgccctcta cagagaaaat atctgtctgt 2100 gttctgtctc tgtaaacagc ctggactatg atctctttgg gatgctgcct ggttgatgat 2160 ggtgcatcat gcctctgata tgcataccag acttcctctg ctgccatggg cttacaagac 2220 aagaatgtga aggttgcaca ggacggtatt tgtggccagt ggtttaaata tgcaatatct 2280 aatcgacatt cgccaatctc ataaaagcca tctaccttgt aactgaagta acttctctac 2340 caactttatt tttagcataa tagttgtaaa ggccaaacta tgtataaagt gtccatagac 2400 tcgaactgtt ttcctccagt caccattttg ttttcctttt ggtaattatt tttgttatat 2460 aattcctcct atccagaatt ggcgctcact gtcttgaacc atactttgaa agaaatgcct 2520 cttcctggag tctgccttac tgcatctgat caccatgtgc atacctctga tcaaattctg 2580 gagtctttgt tctcggtacc tcttaaaaag ggaaattgtg tatcatgtgt agtgtgcttt 2640 tattttcaaa atcttcatag cctttattct agccattttt acctacatac tcattctgta 2700 caaaacagct cactcggtct cacggctgat cctcagtgga aatgatttaa agtagagctg 2760 tgtacgaatt tcagaattca tgtatttaaa aacttcacac taacacttta ctaagatatt 2820 gtctcatatc ttttatgagg atgtcagctg attttcaatg actataaatg tatcttagct 2880 atctaaatct tttgaaattt ggttttataa tttctggtcc ctaacttgtg aagacaaaga 2940 ggcagaagta cccagtctac cacatttaca ctgtacatta ttaaataaaa aaatgtatat 3000 ttt 3003
<210> 122 <211> 2063 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 122 gaattccggt gatgatgatg gtgatggtga tgatggtgtt ggtgatggtt tttgcatctt aatttctttt ctttgccctc ctgattcttg cggccctggc gggtgccctg gctaccatgg tcgcagaatc aagaacggct atgtgcgttt ggtgagagta gaatotctca tgaaaatggg tatggccttt gggagaaatc aaaaggggac cacattggag atccccaaga gtgtcactat tcaattcaga atggaacata ccgtttctgc tttactgaga attttccacc tcctgacaca cgagatgaga caataatcat tgctttggca gccttatgct ttggatacag aatgttgaca aacatgatgg aggcagcagc atccgaaccc tgatggtgat gaggatgatg gtgatgatga 60 ccattcatga actaagtact cttattagtg 120 gctggcccag ggatgacttc ctcgctgcag 180 accatcctgc tggtcagcac tgcggctgct 240 aaagatccgt atcagcaaga ccttgggata 300 acaatattat gctcgaaagg tagcacctgc 360 ataaatcttg taaaacaagg atgttggtct 420 gaagaatgtg tagtaactac cactcctccc 480 tgttgtagca cagatttatg taatgtcaac 540 acaccactca gtccaoctca ttcatttaac 600 tcagtctctg tattagctgt tttgatagtt 660 ggagaccgta aacaaggtct tcacagtatg 720 tctcttgatc tagataatct gaaactgttg 780 155 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ gagctgattg gccgaggtcg atatggagca gtatataaag gctccttgga tgagcgtcca 840 gttgctgtaa aagtgttttc ctttgcaaac cgtcagaatt ttatcaacga aaagaacatt 900 tacagagtgc ctttgatgga acatgacaac attgcccgct ttatagttgg agatgagaga 960 gtcactgcag atggacgcac ggaatatttg cttgtgatgg agtactatcc caatggatct 1020 ttatgcaagt atttaagtct ccacacaagt gactgggtaa gctcttgccg tcttgctcat 1080 tctgttacta gaggactggc ttatcttcac acagaattac cacgaggaga tcattataaa 1140 cctgcaattt cccatcgaga tttaaacagc agaaatgtcc tagtgaaaaa tgatggaacc 1200 tgtgttatta gtgactttgg actgtccatg aggctgactg gaaatagact ggtgcgccca 1260 ggggaggaag ataatgcagc cataagcgag gttggcacta tcagatatat ggcaccagaa 1320 gtgctagaag gagctgtgaa cttgagggac tgtgaatcag ctttgaaaca agtagacatg 1380 tatgctcttg gactaatcta ttgggagata tttatgagat gtacagacct cttcccaggg 1440 gaatccgtac cagagtacca gatggctttt cagacagagg ttggaaacca tcccactttt 1500 gaggatatgc aggttctcgt gtctagggaa aaacagagac ccaagttccc agaagcctgg 1560 aaagaaaata gcctggcagt gaggtcaccc aaggagacaa tcgaagactg ttgggaccag 1620 gatgcagagg ctcggcttac tgcacagtgt gctgaggaaa ggatggctga aottatgatg 1680 atttgggaaa gaaaoaaatc tgtgagccca acagtoaatc caatgtctac tgctatgcag 1740 aatgaacgta ggtgagtcaa cacaagatgg caaatcagga tcaggtgaaa agatcaagaa 1800 acgtgtgaaa actccctatt ctcttaagcg gtggcgcccc tccacctggg tcatctccac 1860 tgaatcgctg gactgtgaag tcaacaataa tggcagtaac agggcagttc attccaaatc 1920 cagcactgct gtttaccttg cagaaggagg cactgctaca accatggtgt ctaaagatat 1980 aggaatgaac tgtctgtgaa atgttttcaa gcctatggag tgaaattatt ttttgcatca 2040 tttaaacatg cagaagatgt tta 2063
<210> 123 <211> 1964 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 123 atttcttttc tttgccctcc tgattcttgg ctggcccagg gatgacttcc tcgctgcagc 60 ggccctggçg ggtgccctgg ctaccatgga ccatcctgct ggtcagcact gcggctgctt 120 cgcagaatca agaacggcta tgtgcgttta aagatccgta tcagcaagac cttgggatag 180 gtgagagtag aatctctcat gaaaatggga caatattatg otcgaaaggt agcacctgct 240 atggcctttg ggagaaatca aaaggggaca taaatcttgt aaaacaagga tgttggtctc 300 acattggaga tccccaagag tgtcactatg aagaatgtgt agtaactacc actcctccct 360 caattcagaa tggaacatac cgtttctgct gttgtagcac agatttatgt aatgtcaact 420 ttactgagaa ttttccacct cctgacacaa caccactcag tccacctcat tcatttaacc 480 gagatgagac aataatcatt gctttggcat cagtctctgt attagctgtt ttgatagttg 540 ccttatgctt tggatacaga atgttgacag gagaccgtaa acaaggtctt cacagtatga 600 acatgatgga ggcagcagca tccgaaccct ctcttgatct agataatccg aaactgttgg 660 agctgattgg ccgaggtcga tatggagcag tatataaagg ctccttggat gagcgtccag 720 ttgctgtaaa agtgttttcc tttgcaaacc gtcagaattt tatcaacgaa aagaacattt 780 acagagtgcc tttgatggaa catgacaaca ttgcccgctt tatagttgga gatgagagag 840 tcactgcaga tggacgcatg gaatatttgc ttgtgatgga gtactatccc aatggatctt 900 tatgcaagta tttaagtctc cacacaagtg actgggtaag ctcttgccgt cttgctcatt 960 ctgttactag aggactggct tatcttcaca cagaattacc acgaggagat cattataaac 1020 ctgcaatttc ccatcgagat ttaaacagca gaaatgtcct agtgaaaaat gatggaacct 1080 gtgttattag tgactttgga ctgtccatga ggctgactgg aaatagactg gtgcgcccag 1140 gggaggaaga taatgcagcc ataagcgagg ttggcactat cagatatacg gcaccagaag 1200 tgctagaagg agctgtgaac ttgagggact gtgaatcagc tttgaaacaa gtagacatgt 1260 atgctcttgg actaatctat tgggagatat ttatgagatg tacagacctc ttcccagggg 1320 aatccgtacc agagtaccag atggcttttc agacagaggt tggaaaccat cccacttttg 1380 aggatatgca ggttotcgtg tctagggaaa aacagagacc caagttccca gaagcctgga 1440 aagaaaatag cctggcagtg aggtcactca aggagacaat cgaagactgt tgggaccagg 1500 atgcagaggc tcggcttact gcacagtgtg ctgaggaaag gatggctgaa cttatgatga 1560 tttgggaaag aaacaaatct gtgagcccaa cagtoaatcc aatgtctact gctatgcaga 1620 atgaacgtag gtgagtcaac acaagatggc aaatcaggat caggtgaaaa gatcaagaaa 1680 cgtgtgaaaa ctccctattc tcttaagcgg tggcgcccct ccacctgggt catctccact 1740 gaatcgctgg actgtgaagt caacaataat ggcagtaaca gggcagttca ttccaaatcc 1800 agcactgctg tttaccttgc agaaggaggc actgctacaa ccatggtgtc taaagatata 1860 ggaatgaact gtctgtgaaa tgttttcaag cctatggagt gaaattattt tttgcatcat 1920 ttaaacatgc agaagatgtt taaaaataaa aaaaaaactg cttt 1964 <210> 124 <211> 3611 156 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
<212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 124 cgccccccga ccccggatcg aatccccgcc cctggatatt tttttgatat cgtgaaacta ggctccctgc tttccccaca gacatgcctt ggcgaaggaa cccccccagc cgcgagggag aaagctctgc agctaggtcc tctcatcagc gggcaggatc agtccacggg agagaagacg ttcccatatt tcttttcttt gccctcctga ctgcagcggc cctggcgggt gccctggcta gctgcttcgc agaatcaaga acggctatgt gggataggtg agagtagaat ctctcatgaa acctgctatg gcctttggga gaaatcaaaa tggtctcaca ttggagatcc ccaagagtgt cctccctcaa ttcagaatgg aacataccgt gtcaacttta ctgagaattt tccacctcct tttaaccgag atgagacaat aatcattgct atagttgcct tatgctttgg atacagaatg agtatgaaca tgatggaggc agcagcatcc ctgttggagc tgattggccg aggtcgatat cgtccagttg ctgtaaaagt gttttccttt aacatttaca gagtgccctt gatggaacat gagagagtca ctgcagatgg acgcatggaa ggatctttat gcaagtattt aagtctccac gotoattctg ttactagagg actggcttat tataaacctg caatttccca tcgagattta ggaacctgtg ttattagtga ctttggactg cgcccagggg aggaagataa tgcagccata ccagaagtgc tagaaggagc tgtgaacttg gacatgtatg ctcttggact aatctattgg ccaggggaat ccgtaccaga gtaccagatg acttttgagg atatgcaggt tctcgtgtct gcctggaaag aaaatagcct ggcagtgagg gaccaggatg cagaggctcg gcttactgca atgatgattt gggaaagaaa caaatctgtg atgcagaatg aacgcaacct gtcacataat gattattctt cctcctcata cattgaagac aatatttcct ctgagcattc tatgtccagc aattcaatta actatgaacg acagcaagca gtcaccagcc tctccaccaa cacaacaacc ggcatgacta ctatatctga gatgccatac gttgcacagt caattgggcc aacccctgtc accaacaagc tagacccaaa agaagttgat ctcatggagc actctcttaa acagttcagt agcttgcttt acccactcat aaaacttgca cagactgcaa atggccaagc atgtttgatt ctccccaagc agcagaacct tcccaagaga tcaacaaaag agccccggct aaaatttggc gaaactggag ttgccaagat gaatacaatc accatgaatg gtgtggcagg tagaaaccac tatgccaatg ggacagtact atctggccaa gaaatgttgc agaatcagtt tattggtgag gatgagcatg agcctttact gagacgagag gatcgtcttg tggacaggag ggaacggcca aacaacagca atccatgttc agaacaagat gcagatcctg ggccatcaaa gcccagaaga gccacaaatg tcctggatgg cagcagtata tcaggatcag gtgaaaagat caagaaacgt cgcccctcca cctgggtcat ctccactgaa agtaacaggg cagttcattc caaatccagc gctacaacca tggtgtctaa agatatagga atggagtgaa attatttttt gcatcatCta aaaactgctt t ctccgcaccc tggatatgtt ttctcccaga 60 cgagggaaat aatttggggg atttcttctt 120 ccgtttggag ggccgcggca ccccgtccga 180 agaaatgaag ggaatttctg cagcggcatg 240 catttgtcct ttcaaactgt attgtgatac 300 agcctcccgg ctgtttctcc gccggtctac 360 ttcttggctg gcccagggat gacttcctcg 420 ccatggacca tcctgctggt cagcactgcg 480 gcgtttaaag atccgtatca gcaagacctt 540 aatgggacaa tattatgctc gaaaggtagc 600 ggggacataa atcttgtaaa acaaggatgt 660 cactatgaag aatgtgtagt aactaccact 720 ttctgctgtt gtagcaoaga tttatgtaat 780 gacacaacac cactcagtcc acctcattca 840 ttggcatcag tctctgtatt agctgttttg 900 ttgacaggag accgtaaaca aggtcttcac 960 gaaccctctc ttgatctaga taatctgaaa 1020 ggagcagtat ataaaggctc cttggatgag 1080 gcaaaccgtc agaattttat caacgaaaag 1140 gacaacattg cccgctttat agttggagat 1200 tatttgcttg tgatggagta ctatcccaat 1260 acaagtgact gggtaagctc ttgccgtctt 1320 cttcacacag aattaccacg aggagatcat 1380 aacagcagaa atgtcctagt gaaaaatgat 1440 tccatgaggc tgactggaaa tagactggtg 1500 agcgaggttg gcactatcag atatatggca 1560 agggactgtg aatcagcttt gaaacaagta 1620 gagatattta tgagatgtac agacctcttc 1680 gcttttcaga cagaggttgg aaaccatccc 1740 agggaaaaac agagacccaa gttcccagaa 1800 tcactcaagg agacaatcga agactgttgg 1860 cagtgtgctg aggaaaggat ggctgaactt 1920 agcccaacag tcaatccaat gtctactgct 1980 aggcgtgtgc caaaaattgg tccttatcca 2040 tctatccatc atactgacag catcgtgaag 2100 acacctttga ctatagggga aaaaaaccga 2160 caagctcgaa tccccagccc tgaaacaagt 2220 acaaacacca caggactcac gccaagtact 2280 ccagatgaaa caaatctgca taccacaaat 2340 tgcttacagc tgacagaaga agacttggaa 2400 aagaacctca aggaaagctc tgatgagaat 2460 ggcccagacc cactgagcag tactagttct 2520 gtagaagcaa ctggacagca ggacttcaca 2580 cctgatgttc tgcctactca gatctatcct 2640 cctactagtt tgcctttgaa caccaaaaat 2700 agcaagcaca aatcaaactt gaaacaagtc 2760 aatgcagcag aacctcatgt ggtgacagtc 2820 agtgttaact cccatgctgc cacaacccaa 2880 acaaccaaca tagtgacaca tagggcccaa 2940 gacacccggc tgaatattaa ttccagtcct 3000 caacaagctg gccatgatga aggtgttctg 3060 ctagaaggtg gccgaactaa ttccaataac 3120 gttcttgcac agggtgttcc aagcacagca 3180 gcacagaggc ctaattctct ggatctttca 3240 cagataggtg agtcaacaca agatggcaaa 3300 gtgaaaactc cctattctct taagcggtgg 3360 tcgctggact gtgaagtcaa caataatggc 3420 actgctgttt accttgcaga aggaggcact 3480 atgaactgtc tgtgaaatgt tttcaagcct 3540 aacatgcaga agatgtttaa aaataaaaaa 3600 3611 <210> 125 157 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
<211> 3871 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 125 ggcctccgca ccctggatat gttttctccc agacctggat atttttttga tatogtgaaa 60 ctacgaggga aataatttgg gggatttctt cttggctccc tgctttcccc acagacatac 120 cttccgtttg gagggccgcg gcaccccgtc cgaggcgaag gaaccccccc atccgcgagg 180 gagagaaatg aagggaattt ctgcagcggc atgaaagctc tgcagctagg tcctctcatc 240 agccatttgt cctttcaaac tgtattgtga tacgggcagg atcagtccac gggagagaag 300 acgagcctcc cggctgtttc tccgccggtc tacttcccat atttcttttc tttgccotcc 360 tgattcttgg ctggcccagg gatgacttcc tcgctgcagc ggccctggcg ggtgccctgg 420 ctaccatgga ccatcctgct ggtcagcact gcggctgctt cgcagaatca agaacggcta 480 tgtgcgttta aagatccgta tcagcaagac cttgggatag gtgagagtag aatctctcat 540 gaaaatggga caatattatg ctcgaaaggt agcacctgct atggcctttg ggagaaatca 600 aaaggggaca taaatcttgt aaaacaagga'tgttggtctc acattggaga tccccaagag 660 tgtcactatg aagaatgtgt agtaactacc actcctccct caattcagaa tggaacatac 720 cgtttctgct gttgtagcac agatttatgt aatgtcaact ttactgagaa ttttccacct 780 cctgacacaa caccactcag tccacctcat tcatttaacc gagatgagac aataatcatt 840 gctttggcat cagtctctgt attagctgtt ttgatagttg ccttatgctt tggatacaga 900 atgttgacag gagaccgtaa acaaggtctt cacagtatga acatgatgga ggcagcagca 960 tccgaaccct ctcttgatct agataatctg aaactgttgg agctgattgg ccgaggtcga 1020 tatggagcag tatataaagg ctccttggat gagcgtccag ttgctgtaaa agtgttttcc 1080 tttgcaaacc gtcagaattt tatcaacgaa aagaacattt acagagtgcc tttgatggaa 1140 catgacaaca ttgcccgctt tatagttgga gatgagagag tcactgcaga tggacgcatg 1200 gaatatttgc ttgtgatgga gtactatccc aatggatctt tatgcaagta tttaagtctc 1260 cacacaagtg actgggtaag ctcttgccgt cttgctcatt ctgttactag aggactggct 1320 tatcttcaca cagaattaoc acgaggagat cattataaac ctgcaatttc ccatcgagat 1380 ttaaacagca gaaatgtcct agtgaaaaat gatggaacct gtgttattag tgactttgga 1440 ctgtccatga ggctgaetgg aaatagactg gtgcgcccag gggaggaaga taatgcagcc 1500 ataagcgagg ttggcactat cagatatatg gcaccagaag tgctagaagg agctgtgaac 1560 ttgagggact gtgaatcagc tttgaaacaa gtagacatgt atgctcttgg actaatctat 1620 tgggagatat ttatgagatg tacagacctc ttcccagggg aatccgtacc agagtaccag 1680 atggcttttc agacagaggt tggaaaccat cccacttttg aggatatgca ggttctcgtg 1740 tctagggaaa aacagagacc caagttccca gaagcctgga aagaaaatag cctggcagtg 1800 aggtcactca aggagacaat cgaagactgt tgggaccagg atgcagaggc tcggcttact 1860 gcacagtgtg ctgaggaaag gatggctgaa cttatgatga tttgggaaag aaacaaatct 1920 gtgagcccaa cagtcaatcc aatgtctact gctatgcaga atgaacgcaa cctgtcacat 1980 aataggcgtg tgccaaaaat tggtccttat ccagattatt cttcctcctc atacattgaa 2040 158 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ gactctatcc atcatactga cagcatcgtg aagaatattt cctctgagca ttctatgtcc 2100 agcacacctt tgactatagg ggaaaaaaac cgaaattcaa ttaactatga acgacagcaa 2160 gcacaagctc gaatccccag ccctgaaaca agtgtcacca gcctctccac caacacaaca 2220 accacaaaca ccaeaggact cacgccaagt actggcatga ctactatatc tgagatgcca 2280 tacccagatg aaacaaatct gcataccaca aatgttgcac agtcaattgg gccaacccct 2340 gtctgcttac agctgacaga agaagacttg gaaaccaaca agctagaccc aaaagaagtt 2400 gataagaacc tcaaggaaag ctctgatgag aatctcatgg agcactctct taaacagttc 2460 agtggcccag acccactgag cagtactagt tctagcttgc tttacccact cataaaactt 2520 gcagtagaag caactggaca gcaggacttc acacagactg caaatggcca agcatgtttg 2580 attcctgatg ttctgcctac tcagatctat cctctcccca agcagcagaa ccttcccaag 2640 agacctacta gtttgccttt gaacaccaaa aattcaacaa aagagccccg gctaaaattt 2700 ggcagcaagc acaaatcaaa cttgaaacaa gtcgaaactg gagttgccaa gatgaataca 2760 atcaatgcag cagaacctca tgtggtgaca gtcaccatga atggtgtggc aggtagaaac 2820 cacagtgtta actcccatgc tgecacaacc caatatgcca ataggacagt actatctggc 2880 caaacaacca acatagtgac acatagggcc caagaaatgt tgcagaatca gtttattggt: 2940 gaggacaccc ggctgaatac taattccagt cctgatgagc atgagccttt actgagacga 3000 gagcaacaag ctggccatga tgaaggtgtt ctggatcgtc ttgtggacag gagggaacgg 3060 ccactagaag gtggccgaac taattccaat aacaacaaca gcaatccatg ttcagaacaa 3120 gatgttcttg cacagggtgt tccaagcaca gcagcagatc ctgggccatc aaagcccaga 3180 agagcacaga ggcctaattc tctggatctt tcagccacaa atgtcctgga tggcagcagt 3240 atacagatag gtgagtcaac acaagatggc aaatcaggat caggtgaaaa gatcaagaaa 3300 cgtgtgaaaa ctccctattc tcttaagcgg tggcgcccct ccacctgggt catctccact 3360 gaatcgctgg actgtgaagt caacaataat ggcagtaaca gggcagttca ttccaaatcc 3420 agcactgctg tttaccttgc agaaggaggc actgctacaa ccatggtgtc taaagatata 3480 ggaatgaact gtctgtgaaa tgttttcaag cctatggagt gaaattattt tttgcatcat 3540 ttaaacatgc agaagatgtt taccgggcgg ggtgacagga gagagcgtca gcggcaagct 3600 gtggaggatg gggctcagaa tgcagacctg ggctggccgc atggcctctc cctgagccct 3660 gatttgtggt agggaagcag tatgggtgca gtcccctcct aggcctccct ctggggtccc 3720 ccgatcctat cccacctctt cagggtgagc cagcctcacc tcttcctagt cctgagggtg 3780 agggcaggct gaggcaacga gtgggaggtt caaacaagag tgggctggag ccaagggaaa 3840 atagagatga tgtaatttct ttccggaatt c 3871 <210> 126 <211> 88 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126
Cys Arg Glu Leu His Phe Thr Arg Tyr Vai Thr Asp Gly Pro Cys Arg 1 5 10 15 Ser Ala Lys Pro Vai Thr Glu Leu Vai Cys Ser Gly Gin Cys Gly Pro 20 25 30 Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro 35 40 45 Ser Gly pro Asp Phe Arg Cys Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gin Arg 50 55 60 Vai Gin Leu Leu Cys Pro Gly Gly Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Vai 65 70 75 80 Arg Leu Vai Ala Ser 85 Cys Lys Cys
<210> 127 <211> 82 <212> PRT <213> Homo sapiens 159 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <400> 127
Cys 1 Arg Pro Ile Asn 5 Ala Thr Leu Ala Val 10 Glu Lys Glu Gly Cys Pro 15 Val Cys Ile Thr 20 val Asn Thr Thr Ile 25 Cys Ala Gly Tyr Cys 30 Pro Thr Met Thr Arg 35 Val Leu Gin Gly Val 40 Leu Pro Ala Leu Pro 45 Gin Val Val Cys Asn 50 Tyr Arg Asp val Arg 55 Phe Glu Ser Ile Arg 60 Leu Pro Gly Cys Pro 65 Gin Arg Cys Gly Val Asn Pro 70 Val Val Ser Tyr Ala 75 Val Ala Leu Ser Cys 80
<210> 128 <211> 82 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 128
Cys 1 Glu Leu Thr Asn 5 Ile Thr Ile Ala Ile 10 Glu Lys Glu Glu Cys Arg 15 Phe Cys Ile Ser 20 Ile Asn Thr Thr Trp Cys 25 Ala Gly Tyr Cys 30 Tyr Thr Arg Asp Leu 35 val Tyr Lys ASp Pro Ala Arg 40 Pro Lys Ile 45 Gin Lys Thr Cys Thr 50 Phe Lys Glu Leu Val 55 Tyr Glu Thr Val Arg 60 Val Pro Gly Cys Ala 65 His His Cys His Ala Asp Ser 70 Leu Tyr Thr Tyr Pro 75 Val Ala Thr Gin Cys 80 <210> 129 <211> 84 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Cys Ile Pro Thr Glu Tyr Thr Met His Ile Glu Arg Arg Glu Cys Ala 1 5 10 15 Tyr Cys Leu Thr Ile Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Met Thr 20 25 30 Arg· Asp Ile Asn Gly Lys Leu Phe Leu Pro Lys Tyr Ala Leu Ser Gin 35 40 45 Asp val Cys Thr Tyr Arg ASp Phe Ile Tyr Arg Thr Val Glu Ile Pro 50 55 60 Gly Cys Pro Leu His Val Ala Pro Tyr Phe Ser Tyr Pro Val Ala Leu 65 70 75 80 Ser Cys Lys Cys
<210> 130 <211> 83 <212> PRT <213> Homo sapiens 160 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <40 0> 130 Cys 1 Asn Asp Ile Thr 5 Ala Arg Leu Gin Tyr Vai 10 Lys Vai Gly Ser Cys 15 Lys Ser Glu Vai 20 Glu. Vai Asp Ile His 25 Tyr Cys Gin Gly Lys 30 Cys Ala Ser Lys Ala 35 Met Tyr Ser Ile Asp 40 Ile Asn Asp Vai Gin 45 Asp Gin Cys Ser Cys 50 Cys Ser Pro Thr Arg 55 Thr Glu Pro Met Gin 60 Vai Ala Leu His Cys 65 Cys Thr Lys Asn Cys Gly Ser Vai 70 Vai Tyr His Glu Vai 75 Leu Asn Ala Met Glu 80 <210> 131 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Cys 1 Ser Thr Val Pro 5 Val Thr Thr Glu Val 10 Ser Tyr Ala Gly Cys 15 Thr Lys Thr Val Leu 20 Met Asn His Cys Ser Gly 25 Ser Cys Gly Thr 30 Phe Val Met Tyr Ser 35 Ala Lys Ala Gin Ala 40 Leu Asp His Ser Cys Ser 45 Cys Cys ' Lys Glu1 50 Glu Lys Thr Ser Gin Arg 55 Glu Val Val Leu 60 Ser Cys Pro Asn Gly 65 Gly Ser Leu Thr His 70 Thr Tyr Thr His Ile 75 Glu Ser Cys Gin Cys 80
<210> 132 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132
Cys 1 Arg Thr Val Pro 5 Phe Ser Gin Thr Ile 10 Thr His Glu Gly Cys Glu 15 Lys Val val Val 20 Gin Asn Asn Leu Cys 25 Phe Gly Lys Cys Gly 30 Ser Val His Phe Pro 35 Gly Ala Ala Gin His 40 Ser His Thr Ser Cys 45 Ser His Cys Leu Pro 50 Ala Lys Phe Thr Thr 55 Met His Leu Pro Leu 60 Asn Cys Thr Glu Leu 65 Ser Ser Val Ile Lys 70 Val Val Met Leu Val 75 Glu Glu Cys Gin Cys 80
<210> 133 <211> 85 <212> PRT <213> Homo sapiens 161 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <40 0> 133
Cys Lys Thr Gin Pro Leu Lys Gin Thr Ile His Glu Glu Gly Cys Asn 1 5 10 15 Ser Arg Thr Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly Gin Cys Asn Ser Phe 20 25 30 Tyr Ile Pro Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly Ser Phe Gin Ser Cys 35 40 45 Ser Phe Cys Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met Met Val Thr Leu Asn 50 55 60 Cys Pro Glu Leu Gin Pro Pro Thr Lys Lys Lys Arg Val Thr Arg Val 65 70 75 80 Lys Gin Cys Arg Cys 85
<210> 134 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134
Cys 1 Glu Ala Lys Asn S Ile Thr Gin Ile Val 10 Gly His Ser Gly Cys 15 Glu Ala Lys Ser Ile 20 Gin Asn Arg Ala Cys 25 Leu Gly Gin Cys Phe 30 Ser Tyr Ser Val Pro 35 Asn Thr Phe Pro Gin 40 Ser Thr Glu Ser Leu Val 45 His Cys Asp Ser 50 Cys Met Pro Ala Gin 55 Ser Met Trp Glu Ile Val Thr 60 Leu Glu Cys 65 Ile Pro Leu Gly His His Cys Glu Ser 85 Glu 70 Cys Val Pro Arg Val Asp Lys Leu Val 75 Glu Lys 80 <210> 135 <211> 70
<212> PRT <213> Homo sapies <400> 135
Cys Ile Arg Thr Pro Lys Ile Ser Lys Pro Ile Lys Phe Glu Leu Ser 1 5 10 15 Gly Cys Thr Ser Met Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe Cys Gly Val Cys 20 25 30 Thr Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro Val 35 40 45 Glu Phe Lys Cys Pro Asp Gly Glu Val Met Lys Lys Asn Met Met Phe 50 55 60 Ile Lys Thr cys Ala Cys 65 70
<210> 136 <211> 70 <212> PRT 162 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <213> Homo sapiens <40 0> 136
Cys 1 Leu Arg Thr Lys 5 Lys Ser Leu Lys Ala 10 Ile Hls Leu Gin Phe 15 Lys Asn Cys Thr Ser 20 Leu Hls Thr Tyr Lys 25 Pro Arg Phe Cys Gly 30 Val Cys Ser Asp Gly 35 Arg Cys Cys Thr Pro 40 Hls Asn Thr Lys Thr 45 Ile Gin Ala Glu Ile 65 Phe 50 Gly Gin Thr Cys Cys Ser Thr Pro Gly 55 Cys 70 Gin Ile Vai Lys Lys 60 Pro Val Met Val <210> 137 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 Λ O 137 Cys Ser Lys Thr Lys Lys Ser Pro Glu Pro Val Arg Phe Thr Tyr Ala 1 5 10 15 Gly Cys Leu Ser Val Lys Lys Tyr Arg Pro Lys Tyr Cys Gly Ser Cys 20 25 30 Val Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro Gin Leu Thr Arg Thr Val Lys Met 35 40 45 Arg Phe Arg Cys Glu Asp Gly Glu Thr Phe Ser Lys Asn Val Met Met 50 55 60 Ile Gin Ser Cys Lys Cys 65 70 <210> 138 <211> 205 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Gin 1 His Tyr Leu His 5 Ile Arg Pro Ala Pro 10 Ser Asp Asn Leu Pro Leu 15 Val Asp Leu Ile 20 Glu His Pro Asp Pro 25 Ile Phe Asp Pro Lys 30 Glu Lys Asp Leu Asn 35 Glu Thr Leu Leu Arg 40 Ser Leu Leu Gly Gly 45 His Tyr Asp Pro Gly 50 Phe Met Ala Thr Ser 55 Pro Pro Glu Asp Arg 60 Pro Gly Gly Gly Gly 65 Gly Ala Ala Gly Gly 70 Ala Glu Asp Leu Ala Glu 75 Leu Asp Gin Leu 80 Leu Arg Gin Arg Pro 85 Ser Gly Ala Met Pro 90 Ser Glu Ile Lys Gly Leu 95 Glu Phe Ser Glu 100 Gly Leu Ala Gin Gly Lys Lys Gin 105 Arg Leu 110 Ser Lys Lys Leu Arg 115 Arg Lys Leu Gin Met 120 Trp Leu Trp Ser Gin 125 Thr Phe Cys Pro Val Leu Tyr Ala Trp Asn Asp Leu Gly Ser Arg Phe Trp Pro Arg 163 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ
Tyr 130 Vai Lys Vai Gly Ser 135 Cys Phe Ser Lys Arg 140 Ser Cys Ser Vai Pro 145 Glu Gly Met Vai Cys 150 Lys Pro Ser Lys Ser 155 Vai His Leu Thr Vai 160 Leu Arg Trp Arg Cys 165 Gin Arg Arg Gly Gly 170 Gin Arg Cys Gly Trp 175 Ile Pro Ile Gin Tyr 195 180 Pro Ile Ile Ser Glu 200 185 Cys Lys Cys Ser Cys 205 190 <210> 139 <211> 197 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 139
Gin 1 His Tyr Leu His 5 Ile Arg Pro Ala Pro 10 Ser Asp Asn Leu Pro 15 Leu Vai Asp Leu Ile 20 Glu His Pro Asp Pro 25 Ile Phe Asp Pro Lys 30 Glu Lys Asp Leu Asn 35 Glu Thr Leu Leu Arg 40 Ser Leu Met Gly Gly 45 HiS Phe Asp Pro Asn 50 Phe Met Ala Met Ser 55 Leu Pro GlU Asp Arg 60 Leu Gly Vai Asp Asp 65 Leu Ala Glu Leu Asp 70 Leu Leu Leu Arg Gin 75 Arg Pro Ser Gly Ala 80 Met Pro Gly Glu Ile 85 Lys Gly Leu Glu Phe 90 Tyr Asp Gly Leu Gin 95 Pro Gly Lys Lys His 100 Arg Leu Ser Lys Lys 105 Leu Arg Arg Lys Leu 110 Gin Met Trp Leu Trp 115 Ser Gin Thr Phe Cys 120 Pro Vai Leu Tyr Thr 125 Trp Asn Asp Leu Gly 130 Ser Arg Phe Trp Pro 135 Arg Tyr Vai Lys Vai 140 Gly Ser Cys Tyr Ser 145 Lys Arg Ser Cys Ser 150 Vai Pro Glu Gly Met 155 Vai Cys Lys Pro Ala 160 Lys Ser Vai His Leu 165 Thr Ile Leu Arg Trp 170 Arg Cys Gin Arg Arg 175 Gly Gly Cys Gin Lys Arg Cys 195 Cys 180 Ser Thr Cys Trp Ile Pro Ile 185 Gin Tyr Pro Ile Ile 190 Ala Glu <210> 140 <211> 196 <212> PRT <213> Xenopus laevis 164 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <40 0> 140
Pro Asn Phe Met Ala Thr Ile Leu Pro Glu Glu Arg Leu Gly Vai Glu 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Leu Asp Leu Leu Leu Arg Gin Lys Pro Ser Gly Ala 65 70 75 80 Met Pro Ala Glu Ile Lys Gly Leu Glu Phe Tyr Glu Gly Leu Gin Ser 85 90 95 Lys Lys His Arg Leu Ser Lys Lys Leu Arg Arg Lys Leu Gin Met Trp 100 105 110 Leu Trp Ser Gin Thr Phe Cys Pro Vai Leu Tyr Thr Trp Asn Asp Leu 115 120 125 Gly Thr Arg Phe Trp Pro Arg Tyr Vai Lys Vai Gly Ser Cys Tyr Ser 130 135 140 Lys Arg Ser Cys Ser Vai Pro Glu Gly Met Vai Cys Lys Ala Ala Lys 145 150 155 160 Ser Met His Leu Thr Ile Leu Arg Trp Arg Cys Gin Arg Arg Vai Gin 165 170 175 Gin Lys Cys Ala Trp Ile Thr Ile Gin Tyr Pro Vai Ile Ser Glu Cys 180 185 190
Lys Cys Ser Cys 195
<210> 141 <211> 195 <212> PRT <213> Takifugu rubripes <400> 141
Gin 1 Pro Tyr Tyr Leu 5 Leu Arg Pro Vai Glu Leu Lys 20 Glu Asp Pro Gly Asp Leu Asn 35 Glu Thr Glu Leu Lys 40 Arg Phe 50 Leu Ser Vai Leu Pro 55 Pro Asp 65 Glu Leu Asp Asp Phe 70 Asp Ala Lys Glu Ile Arg Ala 85 Vai Asp Phe His Lys Pro Ser 100 Lys Lys Leu Lys Ala Tyr Ser 115 Phe Cys Pro Leu Ala 120 Arg Phe 130 Trp Pro Arg Phe Vai 135 Arg Ser 145 Cys Ser Vai Pro Glu 150 Gly Met His Leu Thr Ile Leu 165 Arg Trp Arg Lys Cys Cys Ser Ala Cys 195 Trp 180 Ile Pro Met Gin
Ile Pro 10 Ser Asp Ser Leu Pro Ile 15 Pro 25 Vai Phe Asp Pro Lys 30 Glu Arg Ser Vai Leu Gly Asp 45 Phe Asp Ser Ala Glu Asp Gly 60 His Ala Gly Asn Gin Arg Trp 75 Gly Gly Ala Leu Pro 80 Asp Ala 90 Pro Gin Leu Gly Lys Lys 95 Arg 105 Arg Leu Gin Gin Trp 110 Leu Trp His Ala Trp Thr Asp 125 Leu Gly Ser Ala Gly Ser Cys 140 Leu Ser Lys Arg Thr Cys Lys 155 Pro Ala Thr Ser Thr 160 Cys Vai 170 Gin Arg Lys Vai Gly Leu 175 Tyr 185 Pro Vai Ile Thr Asp 190 Cys Lys <210> 142 <211> 196 <212> PRT <213> Danio rerio 165 ΕΡ 1 638 999/ΡΤ <400> 142
Gin 1 His Tyr Tyr Leu 5 Leu Arg Pro Ile Pro 10 Ser Asp Ser Leu Pro 15 Ile Vai Glu Leu Lys 20 Glu Asp Pro Asp Pro 25 Vai Leu Asp Pro Lys 30 Glu Arg Asp Leu Asn 35 Glu Thr Glu Leu Arg 40 Ala Ile Leu Gly Ser 45 His Phe Glu Gin Asn 50 Phe Met Ser Ile Asn 55 Pro Pro Glu Asp Lys 60 His Ala Gly Gin Asp 65 Glu Leu Asn Glu Ser 70 Glu Leu Met Lys Gin 75 Arg Pro Asn Gly Ile 80 Met Pro Lys Glu lie 85 Lys Ala Met Glu Phe 90 Asp Ile Gin His Gly 95 Lys Lys Hls Lys Pro 100 Ser Lys Lys Leu Arg Arg Arg 105 Leu Gin Leu 110 Trp Leu Trp Ser Tyr 115 Thr Phe Cys Pro Vai 120 Vai His Thr Trp Gin 125 Asp Leu Gly Asn Arg 130 Phe Trp Pro Arg Tyr 135 Leu Lys Vai Gly Ser 140 Cys Tyr Asn Lys Arg 145 Ser Cys Ser Vai Pro 150 Glu Gly Met Vai Cys 155 Lys Pro Pro Lys Ser 160 Ser His Leu Thr Vai 165 Leu Arg Trp Arg Cys 170 Vai Gin Arg Lys Gly 175 Gly Leu Lys Lys Cys Cys Ser 195 Ala 180 Cys Trp Ile Pro Vai Gin 185 Tyr Pro Vai Ile Ser 190 Glu Cys
<210> 143 <211> 188 <212> PRT <213> Mus musculus <40 0> 143
Gin Gly Trp Gin Ala Phe Arg Asn Asp Ala Thr Glu Vai Ile Pro Gly 1 5 10 15 Leu Gly Glu Tyr Pro GlU Pro Pro Pro Glu Asn Asn Gin Thr Met Asn 20 25 30 Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro His His Pro Tyr Asp Ala Lys 35 40 45 Gly Vai Ser Glu Tyr Ser Cys Arg Glu Leu His Tyr Thr Arg Phe Leu 50 5S 60 Thr ASp Gly Pro Cys Arg Ser Ala Lys Pro Vai Thr Glu Leu Vai Cys 65 70 75 ao Ser Gly Gin Cys Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Xle Gly Arg 85 90 95 Vai Lys Trp Trp Arg Pro Asn Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile Pro Asp 10G 105 110 Arg Tyr Arg Ala Gin Arg vai Gin Leu Leu Cys Pro Gly Gly Ala Ala 115 120 125 Pro Arg Ser Arg Lys Vai Arg Leu vai Ala Ser Cys Lys Cys Lys Arg 130 135 140 Leu Thr Arg Phe His Asn Gin Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly Pro Glu 145 ISO 155 160 Thr Ala Arg Pro Gin Lys Gly Arg Lys Pro Arg Pro Gly Ala Arg Gly 165 170 175 Ala Lys Ala Asn Gin Ala Glu Leu Glu Asn Ala Tyr 180 185
Lisboa, 2013-08-27

Claims (15)

  1. ΕΡ 1 638 999/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigénio que se liga especificamente a um polipéptido esclerostina compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 46, em que o referido anticorpo ou fragmento se liga à sequência de SEQ ID NO: 98.
  2. 2. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigénio da reivindicação 1, em que 0 referido anticorpo ou fragmento se liga à sequência de SEQ ID NO: 74.
  3. 3. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigénio da reivindicação 1, em que 0 referido anticorpo ou fragmento se liga à sequência de SEQ ID NO: 75.
  4. 4. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigénio da reivindicação 1 que se liga especif icamente a pelo menos quatro aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 46 .
  5. 5. Anticorpo ou fragmento de ligaçao de antigénio de qualquer uma das reivindicações anteriores, que é policlonal ou monoclonal.
  6. 6. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigénio de qualquer uma das reivindicações anteriores, que é humano, humanizado ou quimérico.
  7. 7. Fragmento de ligação de antigénio de qualquer uma das reivindicações anteriores, que é seleccionado de F(ab')2, Fab, Fab', Fd e Fv.
  8. 8. Célula hospedeira que produz ou expressa o anticorpo ou fragmento de qualquer uma das reivindicações anteriores.
  9. 9. Célula hospedeira da reivindicação 8, que é uma célula de hibridoma.
  10. 10. Polinucleótido que codifica o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 7. ΕΡ 1 638 999/ΡΤ 2/2
  11. 11. Utilização da célula hospedeira da reivindicação 8 ou 9 para produzir ou expressar o referido anticorpo ou fragmento.
  12. 12. Composição compreendendo o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e um transportador fisiologicamente aceitável.
  13. 13. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 para uso num método de aumentar o teor mineral do osso e/ou a densidade mineral do osso num animal de sangue quente ou humano.
  14. 14. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigénio da reivindicação 13 para uso no tratamento de osteopenia, osteoporose, uma fractura, acondroplasia, disostose cleidocraniana, encondromatose, displasia fibrosa, doença de Gaucher, raquitismo hipofosfatémico, sindrome de Marfan, exotoses hereditárias múltiplas, neurofibromatose, osteogénese imperfeita, osteopetrose, osteopoiquilose, lesões escleróticas, doença periodontal, pseudo-artrose ou osteomielite piogénica.
  15. 15. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigénio para o uso da reivindicação 14, em que a osteopenia é causada por um estado anémico, esteróides, heparina, uma doença da medula óssea, escorbuto, malnutrição, deficiência de cálcio, osteoporose idiopática, osteopenia ou osteoporose congénitas, alcoolismo, doença hepática crónica, senilidade, estado pós-menopausa, oligomenorreia, amenorreia, gravidez, diabetes mellitus, hipertiroidismo, doença de Cushing, acromegalia, hipogonadismo, imobilização ou falta de uso, sindrome de distrofia simpático-reflexa, osteoporose regional transitória e osteomalacia. Lisboa, 2013-08-27
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