KR20060064568A - 뼈의 무기질화를 증가시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

뼈의 무기질화를 증가시키기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

새로운 부류 또는 새로운 족의 TGF-베타 결합-단백질이 개시된다. 또한, 뼈의 무기질화를 증가시키기 위한 분자 선택용 검정법 및 이러한 분자를 사용하는 방법이 개시된다. 특히, TGF-베타 결합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 방법 및 조성물은 TGF-베타 결합 단백질인 스클레로스틴 및 TGF-베타 거대족 구성원, 특히 뼈 형태발생 단백질 사이의 상호작용에 간섭하여 뼈의 무기질 밀도를 대체하는 것에 관한 것이다. 뼈의 무기질 밀도의 증가는, 낮은 뼈의 무기질 밀도가 상태를 나타내는 질병 및 상태, 예컨대 골감소증, 골다공증, 및 뼈 골절에서 사용된다.
TGF-베타 결합 단백질, 뼈의 무기질화, 무기질 밀도

Description

뼈의 무기질화를 증가시키기 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING BONE MINERALIZATION}
본 발명은 일반적으로 제약 생성물 및 방법에 관한 것이고, 더욱 구체적으로는 뼈의 무기질 함량을 증가시키는데 적합한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물 및 방법은, 예를 들어 골감소증, 골다공증, 골절, 및 뼈의 무기질 밀도가 낮은 것이 질환의 특징인 기타 장애 등을 비롯하여 광범위하게 다양한 상태를 치료하는데 이용될 수 있다.
개인의 일생에 걸쳐서, 뼈의 중량에는 2 단계 또는 3 단계의 뚜렷한 변화기가 있다 (문헌 [Riggs, West J. Med. 154:63-77, 1991] 참조). 제1기는 남성과 여성 모두에서 일어나며, 뼈의 중량이 최대에 이를 때까지 진행된다. 이러한 제1기는 연골내 성장판의 일정한 성장 및 골막의 연립(連立) 속도로 인한 요골 성장(radial growth)을 통해 일어난다. 제2기는 기둥 뼈(trabecular bone) (척추 및 골반 등과 같은 평평한 뼈)의 경우에는 약 30세에 시작되고 피질골 (예를 들어, 사지에 존재하는 긴 뼈)의 경우에는 약 40세에 시작되며 노후까지 지속된다. 이러한 제2기는 뼈 손실이 느리다는 점을 특징으로 하며, 남성과 여성 모두에서 일어난다. 여성의 경우에는 뼈 손실이라는 제3기도 있으며, 대개는 폐경 후의 에스트로겐 결 핍으로 인한 것이다. 상기한 제3기 한 시기 동안에 여성은 뼈 중량이 피질골에서 10％ 추가 손실되고 기둥 구획에서는 25％ 추가 손실될 수 있다 (예를 들어, 상기 리그즈(Riggs)의 문헌 참조).
뼈의 무기질 함량 손실은 광범위하게 다양한 상태에 의해 야기되는 것일 수 있고, 유의한 의학적 문제를 초래하는 수가 있다. 예를 들어, 골다공증은 골다공증에 걸린 개인에서 골격의 중량 및 무기질 밀도가 현저하게 감소하고, 뼈의 미세구조 분해를 비롯하여 뼈가 구조적으로 악화되며 그에 상응하게 뼈의 취약성 및 골절에 대한 민감도가 증가하는 것을 특징으로 하는, 인간에서의 쇠약성 질병이다. 인간에서는 골다공증 이전에 미국의 대략 2천 5백만 명에게서 발생하는 상태인 임상적 골감소증 (뼈의 무기질 밀도의 표준 편차는 1 초과이지만, 젊은 성인의 뼈에 대한 평균치보다는 표준 편차가 2.5 더 낮음)이 발생한다. 미국에서는 또다른 7백만 명 내지 8백만 명의 환자가 임상적 골다공증 (뼈의 무기질 함량의 표준 편차가 성숙한 젊은 성인의 뼈에 대한 무기질 함량보다 2.5 초과로 더 낮은 것으로 정의됨)으로 진단받고 있다. 골다공증은 건강 관리 체계에 있어서 비용이 가장 많이 드는 질환 중 하나이며, 미국에서는 매년 수백억 달러가 소모되고 있다. 이 질환의 재정적 및 사회적 비용에는 건강 관리와 관련된 비용뿐만 아니라 장기간의 거주 진료 및 근무 일수 손해까지도 추가된다. 전세계적으로 대략 7천 5백만 명의 사람들이 골다공증에 걸릴 위험에 있다.
인간 집단에서 골다공증의 발생 빈도는 연령에 따라 증가하며, 백인 중에서는 주로 여성에서 발생한다 (미국 골다공증 환자 집단의 80％를 차지함). 나이든 사람에서는 골격의 취약성과 골절에 대한 민감도가 증가하는데, 이러한 상황은 상기 집단의 사람들이 넘어질 위험이 더 높다는 점으로 인해 더욱 악화된다. 미국에서는 매년 150만건 초과의 골다공증 관련 골절이 보고되고 있다. 둔부, 손목 및 척추 골절이 골다공증과 관련된 가장 흔한 상해이다. 특히 둔부 골절은 환자에게 크게 불편하고 비용이 많이 들며, 여성의 경우에는 이로 인한 사망률과 이환률의 비율이 높다.
골다공증은 뼈 중량의 감소로 인한 골절의 위험 증가로 정의되어 왔으나, 현재 골격 장애를 위해 이용가능한 치료법 중 그 어느 것도 성인의 뼈 밀도를 실질적으로 증가시킬 수는 없다. 모든 의사들에게는, 성인에서 뼈 밀도를 증가시킬 수 있는 약물, 특히 골감소증과 골다공증의 위험이 있는 손목, 척추 및 둔부의 뼈에서 뼈 밀도를 증가시킬 수 있는 약물의 필요성이 절실하게 인식되고 있다.
골다공증을 예방하기 위한 최근 전략들은 개인에게 약간 이로울 수는 있겠지만, 골다공증을 완전히 해결할 수는 없다. 이러한 전략으로는, 나이가 들수록 신체 운동 (특히, 체중-부하 운동)을 줄이고 식사 중에 적절한 칼슘을 포함시키고, 알콜 함유 제품의 섭취나 흡연을 금지하는 것 등이 있다. 임상적인 골감소증 또는 골다공증을 보이는 환자를 위한 모든 현행 치료 약물 및 치료 전략은, 구조적으로 일어나는 자연스러운 뼈 리모델링 과정의 일부인 뼈 흡수 과정을 억제하여 뼈 중량의 추가 손실을 줄이는 것과 관련이 있다.
예를 들어, 에스트로겐은 뼈 손실을 지연시키는데 처방되고 있다. 그러나, 환자에게 장기적으로도 유익한 지의 여부와 75세를 넘는 환자에게 진실로 효과가 있는지의 여부에 대해서는 약간의 논란이 있다. 또한, 에스트로겐의 사용은 유방암과 자궁내막암의 위험을 증가시킨다고 여겨진다.
폐경후 여성에게는 다량의 칼슘을 비타민 D와 함께 또는 비타민 D 없이 식품으로 섭취하는 것도 권장되어 왔다. 그러나, 다량의 칼슘 섭취는 종종 위장에 불쾌감을 주는 부작용이 있을 수 있고, 혈청 및 뇨에서의 칼슘 수준을 지속적으로 모니터링해야 한다 (문헌 [Khosla and Rigss, Mayo Clin. Proc. 70:978-982, 1995] 참조).
제안되어 온 다른 치료제로는 칼시토닌, 비스포스폰산염, 동화성 스테로이드 및 플루오르화나트륨 등이 있다. 그러나, 이러한 치료제에는 바람직하지 않은 부작용 (예를 들어, 칼시토닌과 스테로이드는 구역질을 일으키고 면역 반응을 유발할 수 있으며, 비스포스폰산염과 플루오르화나트륨은 뼈 밀도를 적당하게 증가시키긴 하지만 골절의 복구를 저해하는 수가 있음)이 있어서 이것들의 사용에 제약이 있을 수 있다 (상기한 코슬라(Khosla) 및 리그즈의 문헌 참조).
현재 실시되고 있는 어떠한 치료 전략도, 새로운 뼈의 중량 증가를 자극하거나 증진시키는 약물을 포함하지 않는다. 본 발명은 뼈의 무기질화를 증가시키는데 이용할 수 있어서, 뼈 중량의 증가가 요구되는 광범위하게 다양한 상태의 치료에 이용할 수 있는 조성물 및 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 이와 관련된 다른 이점도 제공한다.
발명의 요약
상기한 바와 같이, 본 발명은 새로운 부류 또는 새로운 족의 TGF-베타 결합- 단백질 및 뼈의 무기질 함량과 뼈의 무기질 밀도를 증가시키는 화합물을 선별하는 검정법, 뼈의 무기질 함량과 뼈의 무기질 밀도를 증가시키는 화합물, 및 이러한 화합물을 광범위하게 다양한 상태의 치료 또는 예방에 이용하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 1, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15, 또는 이들의 상보적 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자; (b) 매우 엄격한 조건하에서, 상기 (a)의 핵산 분자와 특이적으로 혼성화하는 단리된 핵산 분자; 및 (c) 상기 (a) 또는 상기 (b)에 따른 TGF-베타 결합-단백질을 코딩하는 단리된 핵산으로 구성된 군에서 선택된 단리된 핵산 분자를 제공한다. 관련 측면에서, 본 발명은 상기한 서열 중 하나의 단지 일부와도 혼성화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다 (예를 들어, 상기 (a)에 대한 혼성화는 서열 1의 뉴클레오티드 156 내지 539 또는 555 내지 687로부터 선택된 20개, 25개, 50개 또는 100개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 프로브에 대한 것일 수 있음). 매우 명백하게도, 혼성화에 이용하는데 필요한 엄격도는 프로브의 크기에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 25-mer 프로브에 대한 고엄격 조건은 60 mM Tris (pH 8.0), 2 mM EDTA, 5× 덴하르트(Denhardt's), 6× SSC, 0.1％ (w/v) N-라우릴사르코신, 0.5％ (w/v) NP-40(Nonidet P-40) 중에서 밤새 45℃로 방치한 후에 45℃ 내지 50℃에서 0.2× SSC/0.1％ SDS로 2회 세척하는 것을 포함할 수 있다. 100-mer 프로브에 대한 저엄격 조건으로 적합한 조건은 5× SSPE, 5× 덴하르트 및 0.5％ SDS 중에서 밤새 42℃ 내지 50℃로 방치한 후에 42℃ 내지 50℃에서 2× SSPE (또는 2× SSC)/0.1％ SDS로 2회 세척하는 것을 포함할 수 있다.
관련 측면에서, 본 발명은 서열 1, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 대한 상동성 수준이 윌부르-립맨(Wilbur-Lipman) 알고리즘을 이용할 때 50％, 60％, 75％, 80％, 90％, 95％ 또는 98％인 단리된 핵산 분자를 제공한다. 이러한 단리된 분자의 대표예로는, 서열 2, 6, 10, 12, 14 또는 16을 포함하거나 또는 이들 서열에 대한 상동성 수준이 립맨-피어슨(Lipman-Pearson) 알고리즘을 이용할 때 50％, 60％, 75％, 80％, 90％, 95％ 또는 98％인 단백질을 코딩하는 핵산 분자 등이 있다.
단리된 핵산 분자의 크기는 전형적으로 100 kb 미만이며, 특정 실시양태에서는 50 kb 미만, 25 kb 미만, 10 kb 미만 또는 심지어는 5 kb 미만이다. 추가로, 다른 실시양태에서는 단리된 핵산 분자가 관련없는 다른 핵산 분자의 "라이브러리" (예를 들어, 진뱅크(GenBank) 접속 번호 AC003098 및 EMB 번호 AQ171546에 기재된 것과 같은 서브클론 BAC)에 존재하지 않는다. 그러나, 단리된 핵산 분자가 관련 분자의 라이브러리 (예를 들어, 셔플링(shuffling)의 경우에는 미국 특허 제5,837,458호, 동 제5,830,721호 및 동 제5,811,238호에 기재된 것)에서는 발견될 수 있다. 마지막으로, 본원에 기재한 바와 같은 단리된 핵산 분자는 댄(Dan), 세르베루스(Cerberus), 그렘린(Gremlin) 또는 SCGF (미국 특허 제5,780,263호)를 코딩하는 핵산 분자는 포함하지 않는다.
또한, 본 발명은 상기한 핵산 분자를 함유하는 클로닝 벡터, 및 상기한 핵산 분자 중 하나에 작동가능하게 연결된 프로모터 (예를 들어, 조절 서열)를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 적합한 프로모터의 대표예로는 조직-특이적 프로모터 및 바이러스-기재의 프로모터 (예를 들어, CMV-기재의 프로모터, 예컨대 CMV I-E, SV40 초기 프로모터 및 MuLV LTR) 등이 있다. 또한, 발현 벡터는 바이러스를 기재 로 하는 것이거나 바이러스로부터 유래된 것일 수도 있다 (예를 들어, "바이러스 벡터"). 바이러스 벡터의 대표예로는 단순 포진 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노바이러스-관련 바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터 등이 있다. 또한, 본 발명은 상기한 임의의 벡터를 함유하거나 포함하는 숙주 세포 (예를 들어, 인간, 원숭이, 개, 래트 또는 마우스 기원의 숙주 세포 포함)도 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 벡터를 함유하는 상기한 숙주 세포를 TGF-베타 결합-단백질 생성에 충분한 조건 및 시간하에서 배양하는 단계를 포함하는, TGF-베타 결합-단백질을 생성하는 방법을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 이러한 방법으로 생성된 단백질을 추가로 정제할 수 있다 (예를 들어, 컬럼 크로마토그래피법, 친화도 정제법 등에 의한 정제). 따라서, 상기한 핵산 분자에 의해 코딩되는 단리된 단백질 (예를 들어, 서열 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16)은 본 출원 명세서의 개시내용으로부터 쉽게 생성될 수 있다.
또한, 상술한 단백질 또는 그의 단편이 융합 단백질로서 생성될 수 있다는 것도 주목해야 한다. 예를 들어, 본 발명은 한 측면에서 상기한 바와 같은 핵산 분자에 의해 코딩되는 TGF-베타 결합-단백질 또는 아미노산 10개, 20개, 30개, 50개 또는 100개 이상 길이의 그의 일부를 포함하는 제1 폴리펩티드 절편, 및 비-TGF-베타 결합-단백질을 포함하는 제2 폴리펩티드 절편을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 제2 폴리펩티드는 정제 또는 인식에 적합한 태그 (예를 들어, 다중 음이온성 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드, 미국 특허 제4,851,341호 참조), 마커 (예를 들어, 녹색 형광성 단백질 또는 알칼리성 포스파 타제) 또는 독성 분자 (예를 들어, 리신)일 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 상기한 부류의 TGF-베타 결합-단백질 (예를 들어, 인간 비어(BEER))에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 제공한다. 여러 실시양태에서, 상기 항체는 폴리클로날 항체이거나 모노클로날 항체일 수 있다 (예를 들어, 인간 또는 뮤린(murine) 기원의 항체). 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 온전한 항체의 결합 특성을 보유하는 항체의 단편 (예를 들어, F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab 또는 Fv 단편 또는 심지어 CDR)일 수 있다. 또한, 본 발명은 상술한 항체를 생성하거나 발현할 수 있는 하이브리도마 및 다른 세포도 제공한다.
관련 측면에서, 본 발명은 상기한 바와 같은 항체를 이것이 TGF-베타 결합-단백질과 결합할 수 있도록 하기에 충분한 조건 및 시간하에서 인큐베이션하는 단계 및 이러한 결합을 검출하는 단계를 포함하는, TGF-베타 결합-단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 여러 실시양태에서, 상기 항체를 세척 또는 분리 및(또는) 표지 (예를 들어, 효소, 형광성 단백질 및 방사성동위원소로 구성된 군에서 선택된 마커를 사용함)를 용이하게 하기 위해 고형 지지체에 결합시킬 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 매우 엄격한 조건하에서, 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 또는 18에 따른 핵산 분자 또는 그에 대한 상보체와 혼성화하는 단리된 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16을 코딩하는 서열에 존재하는 것일 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 올리고클레오티드의 길이는 뉴클레오티드 15개, 20개, 30개, 50개 또는 100개 이상이다. 추가의 실시양태에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 또다른 분자 (예를 들어, 효소, 형광성 분자 또는 방사성동위원소)로 표지된다. 또한, 본 발명은 TGF-베타 결합-단백질을 코딩하는 상술한 핵산 분자 전체 또는 그의 일부를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머를 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "특이적 증폭"은 상술한 TGF-베타 결합-단백질은 증폭시키지만, 다른 TGF-베타 결합-단백질, 예를 들어 댄, 세르베루스, 그렘린 또는 SCGF (미국 특허 제5,780,263호)는 증폭시키지 않는 프라이머를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
관련 측면에서, 본 발명은 상기한 바와 같은 올리고뉴클레오티드를 매우 엄격한 조건하에서 인큐베이션하는 단계, 및 상기 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 검출하는 단계를 포함하는, TGF-베타 결합-단백질을 코딩하는 핵산 분자를 검출하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 표지되고(되거나) 고형 지지체에 결합될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 상술한 TGF-베타 결합-단백질 중 하나 (예를 들어, 서열 2, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16)를 코딩하는 RNA를 절단할 수 있는 리보자임을 제공한다. 이러한 리보자임은 DNA, RNA (2'-O-메틸 리보핵산 포함), 핵산 유사체 (예를 들어, 포스포로티오에이트 연결기를 보유하는 핵산) 또는 이들의 혼합물로 구성될 수 있다. 또한, 본 발명은 이들 리보자임을 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 cDNA) 및 상기 리보자임을 발현하거나 생성할 수 있는 벡터를 제공한다. 벡터의 대표예로는 플라스미드, 레트로트란스포손, 코스미드 및 바이러 스-기재의 벡터 (예를 들어, 적어도 일부가 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스로부터 생성된 바이러스 벡터) 등이 있다. 또한, 본 발명은 이들 벡터를 함유하는 숙주 세포 (예를 들어, 인간, 개, 래트 또는 마우스 세포)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 상기 벡터로 안정적으로 형질전환될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 합성하거나 시험관내 또는 생체내 전사를 통해 리보자임을 생성하는 방법을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 이와 같이 생성된 리보자임은 추가로 정제되고(되거나) 제약 조성물 (예를 들어, 상기 리보자임 또는 리보자임을 코딩하는 핵산 분자 및 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제)로 제제화될 수 있다. 유사하게, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 항체 또는 본원에 기재한 기타 선택된 분자를 제약 조성물로 제제화할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 따른 핵산 분자, 또는 이에 대한 상보체와 혼성화하는 핵산 분자를 포함하며 본원에 기재한 바와 같은 TGF-베타 결합-단백질 (예를 들어, 인간 비어)의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 여러 실시양태에서, 상기 올리고뉴클레오티드의 길이는 뉴클레오티드 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개 또는 50개이다. 상기 올리고뉴클레오티드의 길이는 뉴클레오티드 100개, 75개 또는 60개 미만인 것이 바람직하다. 매우 명백하게도, 상기 올리고뉴클레오티드는 1종 이상의 핵산 유사체, 리보핵산 또는 데옥시리보핵산으로 구성될 수 있다. 추가로, 상기 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 포스포로티오에이트 연결기, 포스포트리에스테르 연결기, 메틸 포스폰산염 연결기, 메틸렌(메틸이미노) 연결기, 모르폴리노 연결기, 아미드 연결기, 폴리아미드 연결기, 단쇄 알킬 당간(intersugar) 연결기, 시클로알킬 당간 연결기, 단쇄 이종원자 당간 연결기 및 헤테로시클릭 당간 연결기와 같은 공유 연결기 등을 비롯한 1개 이상의 연결기로 변형될 수 있다. 키메라 올리고뉴클레오티드의 대표적인 일례는 미국 특허 제5,989,912호에서 제공된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 상기한 바와 같은 유효량의 리보자임을 온혈 동물에게 도입하는 단계를 포함하는, 뼈의 무기질화를 증가시키는 방법을 제공한다. 관련 측면에서, 이러한 방법은 본원에 기재한 바와 같이 원하는 리보자임을 생성할 수 있는 핵산 분자 또는 벡터의 전사를 유리하게 하여 리보자임이 생성되도록 하는 조건하에서 유효량의 상기 핵산 분자 또는 벡터를 환자에게 도입하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 트랜스제닉 비-인간 동물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 상기한 바와 같은 TGF-베타 결합-단백질을 코딩하는 유전자의 발현에 효과적인 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 상기 TGF-베타 결합-단백질을 코딩하는 핵산 분자가 도입되어 생식 세포 및 체세포에 함유되어 있는 비-인간 트랜스제닉 동물 또는 상기 동물의 배아 단계의 조상을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 생식 세포 및 체세포에서 본원에 기재한 바와 같은 TGF-결합 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 혼성화하는 내인성 핵산 분자의 1개 이상의 대립유전자가 파괴되어 있어서, 이것이 파괴되지 않은 동물에 비해 상기 대립유전자로부터의 전령 RNA 전사가 저해되는 비-인간 트랜스제닉 넉아웃(knockout) 동물을 제공한 다. 여러 실시양태에서, 상기 파괴는 핵산 결실, 치환 또는 삽입이다. 다른 실시양태에서, 상기 트랜스제닉 동물은 마우스, 래트, 양, 돼지 또는 개이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 또는 101의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자; (b) 상기 (a)의 뉴클레오티드 서열의 상보체를 포함하는 핵산 분자; (c) 길이가 뉴클레오티드 15개, 20개, 30개, 50개, 75개 또는 100개 이상인, 상기 (a) 또는 (b)의 단편인 핵산 분자로 구성된 군에서 선택된 핵산 분자를 포함하는 용기를 포함하는, TGF-베타 결합-단백질 유전자의 발현을 검출하기 위한 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 본원에 기재한 TGF-베타 결합-단백질 항체 중 하나를 포함하는 용기를 포함하는, TGF-베타 결합-단백질을 검출하기 위한 키트를 제공한다.
예를 들어, 본 발명은 한 측면에서 (a) 뼈의 무기질 함량을 증가시킬 수 있는지 여부를 결정할 1종 이상의 후보 분자를 제1항에 따른 핵산 분자에 의해 코딩되는 TGF-베타-결합-단백질 및 TGF-베타 족 단백질의 선택된 구성원 (예를 들어, BMP5 또는 BMP6)과 혼합하는 단계, 및 (b) 상기 후보 분자가 TGF-베타 족 구성원의 신호전달을 변경시키는지 또는 상기 후보 분자가 TGF-베타 결합-단백질이 TGF-베타 족 구성원에 결합하는 것을 변경시키는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 선택된 분자가 뼈의 무기질 함량을 증가시킬 수 있는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 분자는 TGF-베타가 간엽 세포 분화의 양성 조절자로서 기능하는 능력을 변경시킨다. 본 발명의 이러한 측면에서, 상기 후보 분자(들)은, 예를 들어 신호전달 또는 결합을 감소 (예를 들어, 억제)시키거나 증가 (예를 들어, 증진)시켜서 신호전달 또는 결합을 변경시킬 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 선택된 분자가 TGF-베타 결합-단백질이 뼈 또는 그의 유사체에 결합하는 것을 억제하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 선택된 분자가 뼈의 무기질 함량을 증가시킬 수 있는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 뼈 또는 그의 유사체의 대표예로는 수산화인회석 및 생체검사를 통해 수득한 인간의 초대 뼈 샘플 등이 있다.
앞서 언급한 방법의 특정 실시양태에서, 상기 선택된 분자는 분자들의 혼합물 중에 함유되어 있고, 상기 방법은 기능적인 것으로 검정된 1종 이상의 분자를 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, TGF-베타 족의 단백질이 고형 지지체에 결합되어 있고 TGF-베타 결합-단백질의 결합을 측정하거나, 또는 TGF-베타 결합-단백질이 고형 지지체에 결합되어 있고 TGF-베타 단백질의 결합을 측정한다.
상기한 것과 같은 방법을 이용하면, 광범위하게 다양한 분자가 TGF-베타 결합-단백질이 TGF-베타 족의 단백질에 결합하는 것을 억제하여 뼈의 무기질 함량을 증가시키는 능력이 있는지를 검정할 수 있다. 이러한 분자의 대표예로는 단백질 또는 펩티드, 유기 분자 및 핵산 분자 등이 있다.
다른 관련 측면에서, 본 발명은 본원에서 언급한 검정법으로 확인된 치료 유효량의 분자를 온혈 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 온혈 동물에서 뼈의 무기질 함량을 증가시키는 방법을 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 TGF-베타 결합-단백질이 뼈 형태발생 단백질 (BMP, Bone Morphogenic Protein) 등을 비롯한 TGF-베타 거대족의 단백질에 결합하는 것을 억제하는 치료 유효량의 분자를 온혈 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 온혈 동물에서 뼈의 무기질 함량을 증가시키는 방법을 제공한다. 적합한 분자의 대표예로는 TGF-베타 결합-단백질을 특이적으로 인식하고 그의 활성을 변경시키는 안티센스 분자, 리보자임, 리보자임 유전자 및 항체 (예를 들어, 인간화 항체) 등이 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (a) TGF-베타 결합-단백질이 TGF-베타 족의 단백질 및 뼈 형태발생 단백질 (BMP)에 결합하는 것을 억제하는 분자를 발현시키는 벡터를, 뼈를 표적으로 하는 세포에 도입하는 단계, 및 (b) 상기 벡터-함유 세포를 온혈 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 온혈 동물에서 뼈의 무기질 함량을 증가시키는 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 말초 투여된 세포가 뼈의 기질 내에 국소화될 경우, 상기 세포가 "뼈를 표적으로 하는" 것임을 이해해야 한다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 뼈를 표적으로 하는 세포를 도입하는 단계 이전에, 뼈를 표적으로 하는 세포를 골수로부터 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 뼈를 표적으로 하는 상기 세포는 CD34+ 세포 및 골모세포로 구성된 군에서 선택된다.
다른 측면에서, 본 발명은 TGF-베타 결합-단백질이 TGF-베타 거대족의 단백질에 결합하는 것을 억제하는 분자 (바람직하게는 단리된 상태의 분자)를 제공한다.
추가의 실시양태에서, 상기 분자는 조성물로서 제공되며, 뼈 재흡수의 억제 제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 억제제의 대표예로는 칼시토닌, 에스트로겐, 비스포스폰산염, 항-재흡수 활성을 보유하는 성장 인자 및 탐옥시펜 등이 있다.
상술한 치료법에 이용될 수 있는 분자의 대표예로는 리보자임, 리보자임 유전자, 안티센스 분자 및(또는) 항체 (예를 들어, 인간화 항체) 등이 있다. 이러한 분자는, 어떠한 분자를 선택했는지에 따라 본원에 기재한 바와 같은 TGF-베타 결합-단백질 족 구성원의 신호전달 또는 결합을 변경시키거나 길항하거나 또는 작동시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 여러 실시양태에서, 상기한 분자 및 치료 또는 예방 방법은 골다공증, 골연화증, 치주 질환, 괴혈병, 쿠싱병, 골절 및 사지 부동 및 스테로이드 사용으로 인한 상태 등과 같은 상태에 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 TGF-베타 결합-단백질인 스클레로스틴 (SOST)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하고, 스클레로스틴 중 TGF-베타 거대족의 구성원, 예를 들어 뼈 형태발생 단백질과 상호작용하는 영역에서 유래된 스클레로스틴 펩티드를 포함하는 면역원을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열 2, 6, 8, 14, 46 또는 65에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 스클레로스틴 (SOST) 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며 SOST 폴리펩티드가 (i) 진뱅크 등록 번호 NM_004329 (서열 102); D89675 (서열 103); NM_001203 (서열 104); S75359 (서열 105); NM_030849 (서열 106); D38082 (서열 107); NP_001194 (서열 108); BAA19765 (서열 109) 또는 AAB33865 (서열 110)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 뼈 형태발생 단백질 (BMP) 제I형 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 BMP 제I형 수용체 결합 부위 및 (ii) 진뱅크 등록 번호 U25110 (서열 111); NM_033346 (서열 112); Z48923 (서열 114); CAA88759 (서열 115) 또는 NM_001204 (서열 113)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 제II형 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 BMP 제II형 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 2, 6, 8, 14, 46 또는 65에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 스클레로스틴 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며 스클레로스틴 동종이량체의 형성을 저해하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명의 특별한 특정 실시양태에서, 상기 항체는 폴리클로날 항체이다. 다른 실시양태에서, 상기 항체는 마우스, 인간, 래트 또는 햄스터 모노클로날 항체인 모노클로날 항체이다. 또한, 본 발명은 상기 모노클로날 항체를 생성할 수 있는 하이브리도마 세포 또는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 항체는 인간화 항체 또는 키메라 항체이다. 본 발명은 인간화 항체 또는 키메라 항체를 생성하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체의 항원-결합 단편은 F(ab')2, Fab', Fab, Fd 또는 Fv 단편이다. 또한, 본 발명은 단일쇄 항체인 항체 및 상기 단일쇄 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포를 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 이러한 항체 및 생리적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 2, 6, 8, 14, 46 또는 65에 기재된 아 미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드의 21개 이상의 연속적인 아미노산 및 50개 이하의 연속적인 아미노산을 포함하고, 비-인간 동물에서 상기 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며 SOST 폴리펩티드가 (i) 진뱅크 등록 번호 NM_004329 (서열 102); D89675 (서열 103); NM_001203 (서열 104); S75359 (서열 105); NM_030849 (서열 106); D38082 (서열 107); NP_001194 (서열 108); BAA19765 (서열 109) 또는 AAB33865 (서열 110)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 뼈 형태발생 단백질 (BMP) 제I형 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 BMP 제I형 수용체 결합 부위 및 (ii) 진뱅크 등록 번호 U25110 (서열 111); NM_033346 (서열 112); Z48923 (서열 114); CAA88759 (서열 115) 또는 NM_001204 (서열 113)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 제II형 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 BMP 제II형 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체를 유발할 수 있는 펩티드를 포함하는 면역원을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열 2, 6, 8, 14, 46 또는 65에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드의 21개 이상의 연속적인 아미노산 및 50개 이하의 연속적인 아미노산을 포함하고, 비-인간 동물에서 상기 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며 SOST 동종이량체의 형성을 저해하는 항체를 유발할 수 있는 펩티드를 포함하는 면역원을 제공한다.
특정의 특별한 실시양태에서, 본 발명의 면역원은 담체 분자와 회합된다. 특정 실시양태에서, 담체 분자는 담체 폴리펩티드이고, 특별한 실시양태에서, 담체 폴리펩티드는 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌이다.
본 발명은 또한 SOST 폴리펩티드의 21개 이상의 연속적인 아미노산 및 50개 이하의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하는 면역원으로 비-인간 동물을 면역화시키는 단계를 포함하며, (a) 상기 SOST 폴리펩티드가 서열 2, 6, 8, 14, 46 또는 65의 아미노산 서열 포함하고; (b) 상기 항체가 (i) 뼈 형태발생 단백질 (BMP) 제I형 수용체 결합 부위 및 (ii) BMP 제II형 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 대한 SOST 폴리펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제하고; (c) 상기 BMP 제I형 수용체 결합 부위가 진뱅크 등록 번호 NM_004329 (서열 102), D89675 (서열 103), NM_001203 (서열 104), S75359 (서열 105), NM_030849 (서열 106), D38082 (서열 107), NP_001194 (서열 108), BAA19765 (서열 109) 또는 AAB33865 (서열 110)의 아미노산 서열을 포함하는 BMP 제I형 수용체 폴리펩티드와 결합할 수 있고, (d) 상기 BMP 제II형 수용체 결합 부위가 진뱅크 등록 번호 U25110 (서열 111), NM_033346 (서열 112), Z48923 (서열 114), CAA88759 (서열 115) 또는 NM_001204 (서열 113)의 아미노산 서열을 포함하는 BMP 제II형 수용체 폴리펩티드와 결합할 수 있는 것인, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 SOST 폴리펩티드의 21개 이상의 연속적인 아미노산 및 50개 이하의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하는 면역원으로 비-인간 동물을 면역화시키는 단계를 포함하며, 상기 SOST 폴리펩티드가 서열 2, 6, 8, 14, 46 또는 65의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체가 SOST 동종이량체의 형성을 저해하는 것인, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 이들 및 다른 측면은 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참고하 면 명백해질 것이다. 또한, 더욱 상세한 특정한 절차 또는 조성물 (예를 들어, 플라스미드 등)을 기재하는 본원에 설명된 다양한 참고문헌을 비롯한 문헌들은 그의 전문이 참고로 포함된다.
도 1은 인간 댄(Human Dan), 인간 그렘린(Human Gremlin), 인간 세르베루스(Human Cerberus) 및 인간 비어(Human Beer)의 아미노산 서열을 포함하는 개략도이다. 화살표는 시스테인 골격을 나타낸다.
도 2는 TGF-베타 결합-단백질 유전자, 구체적으로 인간 비어 유전자의 발현에 대해 다양한 인간 조직을 조사하여 얻은 결과를 요약한 것이다. 반정량적 역전사-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 절차를 이용하여, 전체 RNA로부터 합성된 제1 가닥 cDNA로부터의 유전자의 일부분을 증폭시켰다 (실시예 2A에 더욱 상세히 기재됨).
도 3A 내지 3D는 마우스 비어 전사체에 상보적인 cRNA 프로브를 이용하여 마우스 배아 부분의 RNA 계내 혼성화로부터 얻은 결과를 요약한 것이다 (실시예 2B에 더욱 상세히 기재됨). 패널 3A는 10.5 dpc 배아의 횡단면이다. 패널 3B는 12.5 dpc 배아의 시상 단면이고, 패널 3C 및 3D는 15.5 dpc 배아의 시상 단면이다.
도 4A 내지 4C는 웨스턴 블롯 분석에 의해 세가지 상이한 폴리클로날 항체의 각각의 항원에 대한 특이성을 도시한다 (실시예 4에 더욱 상세히 기재됨). 도 4A는 항-인간 비어 항체가 인간 비어 항원에 대해서는 특이적 반응성을 나타내나, 인간 댄 또는 인간 그렘린에 대해서는 그렇지 않다는 것을 보여준다. 도 4B는 항-인 간 그렘린 항체가 인간 그렘린 항원에 대해서는 반응성을 나타내나, 인간 비어 또는 인간 댄에 대해서는 그렇지 않다는 것을 보여준다. 도 4C는 항-인간 댄 항체가 인간 댄에 대해서는 반응성을 나타내나, 인간 비어 또는 인간 그렘린에 대해서는 그렇지 않다는 것을 보여준다.
도 5는 웨스턴 블롯 분석에 의해 TGF-베타 결합-단백질 비어가 BMP-5 및 BMP-6에 대해서는 선택성을 나타내나, BMP-4에 대해서는 그렇지 않다는 것을 보여준다 (실시예 5에 더욱 상세히 기재됨).
도 6은 TGF-베타 결합-단백질 비어와 BMP-5 사이의 이온성 상호작용이 15 내지 30 nM 범위에서 해리 상수를 갖는다는 것을 보여준다.
도 7은 SOST (스클레로스틴) 폴리펩티드 및 그의 가장 유사한 동족체의 특징적인 시스틴-노트(cystine-knot)를 함유하는 영역의 정렬을 나타낸다. 시스틴-노트를 형성하는 세 개의 디술피드 결합은 실선으로 표시하였다. 점선으로 표시한 나머지 디술피드 결합은 이 족에서 독특한 것이며, 이는 3D 구조에서 두개의 β-헤어핀 팁을 연결시킨다. 도시된 폴리펩티드는 SOST: 스클레로스틴 (서열 126); CGHB: 인간 융모막 고나도트로핀 β (서열 127); FSHB: 여포 자극 호르몬 베타 서브유닛 (서열 128); TSHB: 티로트로핀 베타쇄 전구체 (서열 129); VWF: 폰 빌리브란트(Von Willebrand) 인자 (서열 130); MUC2: 인간 뮤신 2 전구체 (서열 131); CER1: 세르베루스 1 (크세노푸스 래비스 (Xenopus laevis) 동족체) (서열 132); DRM: 그렘린 (서열 133); 댄: (서열 134); CTGF: 결합 조직 성장 인자 전구체 (서열 135); NOV: NovH (신모세포종 과발현된 유전자 단백질 동족체) (서열 136); CYR6: (서열 137)이다.
도 8은 SOST의 코어 영역 (SOST_Core)의 3D 모델을 나타낸다.
도 9는 SOST 동종이량체의 코어 영역의 3D 모델을 나타낸다.
도 10A 및 10B는 인간 (NOGG_HUMAN (서열 138), 닭 (NOGG_CHICK, 서열 139), 아프리카 발톱 개구리 (NOGG_XENLA, 서열 140), (NOGG_FUGRU, 서열 141), 및 지브라피쉬(zebrafish) (NOGG_ZEBRA, 서열 142)의 5가지 상이한 동물로부터의 노긴(Noggin), 및 인간 (SOST_HUMAN, 서열 46), 래트 (SOST_RAT, 서열 65) 및 마우스 (SOST_MOUSE, 서열 143)로부터의 SOST의 아미노산 서열 정렬을 제공한다.
도 11은 노긴/BMP-7 복합체 구조를 도시한다. BMP 동종이량체는 평면형으로 도면의 바닥 부분에 도시되어 있다. 노긴 동종이량체는 그림형으로 BMP 이량체의 상단에 도시되어 있다. 원으로 표시한 부분은 N-말단 결합 영역, 코어 영역, 및 N-말단 영역과 코어 영역 사이의 연결기를 개략적으로 나타낸다.
도 12는 SOST N-말단 영역에 위치한 잠재적인 BMP-결합 단편의 3D 모델을 도시한다. BMP 이량체는 평면형으로 도시되어 있고, 잠재적인 BMP-결합 단편은 막대형으로 도시되어 있다. BMP 평면상의 소수성 포켓 속에 고정된 페닐알라닌 잔기가 표시되어 있다.
정의
본 발명을 상세히 설명하기에 앞서, 특정 용어의 정의를 설명하고 이후 사용될 약어를 열거 및 정의하는 것이 이해에 도움될 수 있다.
"분자"는 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 항체, 재조합 결합 파트너, 원하는 결합 친화도를 갖는 펩티드), 핵산 (예를 들어, DNA, RNA, 키메라 핵산 분자 및 핵산 유사체, 예컨대 PNA), 및 유기 또는 무기 화합물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"TGF -베타"는 뼈 형태발생 단백질 (BMP)을 비롯하여 TGF-베타 거대족의 임의의 공지된 또는 신규한 구성원을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"TGF -베타 수용체"는 뼈 형태발생 단백질 (BMP)을 비롯하여 TGF-베타 거대족의 특정한 구성원에 대해 특이적인 수용체를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
"TGF -베타 결합-단백질"은 뼈 형태발생 단백질 (BMP)를 비롯하여 TGF-베타 거대족의 특정 구성원 또는 구성원의 하위집합에 대해 특이적 결합 친화성을 갖는 단백질을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. TGF-베타 결합-단백질의 구체적인 예로는 서열 1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 및 101에 의해 코딩되는 단백질이 있다.
"TGF - 베타족의 단백질 및 뼈 형태발생 단백질 (BMP)에 대한 TGF -베타 결합-단백질의 결합"의 억제는 TGF-베타가 TGF-결합-단백질에 결합하는 것을 제거하거나 방지함으로써, TGF-베타 또는 뼈 형태발생 단백질 (BMP)의 활성화를 가능하게 하거나, 뼈 형태발생 단백질 (BMP)을 비롯한 TGF-베타족 구성원의 그들의 각 수용체에 대한 결합을 가능하게 하는 분자를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 억제는, 예를 들어 TGF-베타 거대족의 특정한 구성원에 대한 TGF-베타 결합-단백질의 결합을 억제하는 분자에 의해 달성된다.
"벡터"는 원하는 단백질의 발현을 지시할 수 있는 어셈블리를 지칭한다. 벡터는 관심의 대상인 유전자(들)에 작동가능하게 연결된 전사 프로모터 요소를 포함해야 한다. 벡터는 데옥시리보핵산 ("DNA"), 리보핵산 ("RNA"), 또는 이들 둘의 조합물 (예를 들어, DNA-RNA 키메라)로 구성될 수 있다. 임의로, 벡터는 폴리아데닐화 서열, 하나 이상의 제한 부위 뿐만 아니라, 하나 이상의 선택가능한 마커, 예컨대 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 또는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제를 포함할 수 있다. 추가로, 선택된 숙주 세포 및 이용되는 벡터에 따라, 복제 기점, 추가의 핵산 제한 부위, 상승제, 전사 유도성을 부여하는 서열, 및 선택가능한 마커와 같은 다른 유전자 요소를 본원에 기재된 벡터에 삽입할 수도 있다.
"단리된 핵산 분자"는 유기체의 게놈 DNA에 일체화되지 않은 핵산 분자이다. 예를 들어, 진핵 세포의 게놈 DNA로부터 분리된 TGF-결합 단백질을 코딩하는 DNA 분자는 단리된 DNA 분자이다. 단리된 핵산 분자의 또다른 예는 유기체의 게놈에 일체화되지 않은 화학적으로 합성된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 게놈 DNA, cDNA, RNA일 수 있거나, 핵산 유사체의 적어도 일부분으로 구성될 수 있다.
"단리된 폴리펩티드"는 오염성 세포 성분, 예컨대 탄수화물, 지질, 또는 원래부터 상기 폴리펩티드와 회합되어 있는 다른 단백질성 불순물이 본질적으로 없는 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 이러한 단리된 폴리펩티드는 순도가 약 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상, 가장 바람직하게는 약 99％ 이상이다. 특정 실시양태에서, 특정한 단백질 제제는 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 염색을 이용한 SDS-PAGE 겔상의 단일 밴드로서 명목상 확인된다면 단리된 폴리펩티드를 함유한다. 유기 분자 (예를 들어, 소분자)와 관련하여 사용된 용어 "단리된"은 화합물이 선행 기술에 널리 공지된 방법 (예를 들어, NMR, 융점)에 따라 90％가 넘는 순도를 갖는다는 것을 의미한다.
"경화협착증"은 한센(Hansen, 1967) (문헌 [Hansen, H. G., Sklerosteose. in: Opitz, H.; Schmid, F., Handbuch der Kinderheilkunde. Berlin: Springer (pub.) 6 1967. Pp. 351-355])에 의해, 판 부헴 피질성 전신성 과골증(van Buchem hyperostosis Corticalis generalisata)과 유사하나, 여러 경우 뼈 변화의 방사선 외견 및 검지와 중지의 피부 합지증의 존재의 면에서는 상이할 수 있는 질환에 대해 지칭된 용어이다. 이 증상에서 보통과는 달리 턱이 사각형이다.
"인간화 항체"는 쥐과 또는 다른 비-인간 동물에서의 모노클로날 항체의 상보성 결정 영역이 쥐과 또는 다른 비-인간 동물 면역글로불린의 가변 중쇄 및 경쇄로부터 인간 가변 도메인으로 전달되는 재조합 단백질이다.
본원에서 사용된 "항체 단편"은 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab 등의 항체의 일부분이다. 항체 단편은 구조와는 무관하게 본래의 항체에 의해 인식되는 동일한 항원과 결합한다. 예를 들어, 항-TGF-베타 결합-단백질 모노클로날 항체 단편은 TGF-베타 결합-단백질의 에피토프와 결합한다.
용어 항체 단편 또는 항원-결합 단편은 또한 특이적 항원과의 결합에 의해 복합체를 형성하여 항체와 같이 작용하는 임의의 합성 단백질 또는 유전자 조작 단백질을 포함한다. 예를 들어, 항체 단편은 경쇄 가변 영역으로 이루어진 단리된 단편, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 이루어진 "Fv" 단편, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 연결기 ("sFv 단백질")에 의해 연결된 재조합 단일쇄 폴리펩티드 분자, 및 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위를 포함한다.
"검출가능한 표지"는 항체 잔기 또는 핵산 잔기와 같은 폴리펩티드 잔기에 접합되어 진단에 유용한 분자를 형성할 수 있는 분자 또는 원자이다. 검출가능한 표지의 예로는 킬레이터, 광활성제, 방사성동위원소, 형광제, 상자성 이온, 효소, 및 다른 마커 잔기가 있다.
본원에 사용된 "면역접합체"는 항-TGF-베타 결합-단백질 항체 또는 항체 단편, 및 검출가능한 표지 또는 효능제 분자를 포함하는 분자이다. 바람직하게는, 면역접합체는 접합전에 비해 접합후에 TGF-베타 결합-단백질에 결합할 수 있는 능력이 거의 동일하거나 단지 경미하게 감소된다.
약어: TGF-베타 - "형질전환 성장 인자-베타"; TGF-bBP - "형질전환 성장 인자-베타 결합-단백질" (한 대표적인 TGF-bBP는 "인간 비어"가 있음); BMP - "뼈 형태발생 단백질"; PCR - "중합효소 연쇄 반응"; RT-PCR - 먼저 RNA가 역전사효소 (RT)에 의해 DNA로 전사되는 PCR 공정; cDNA - RNA 서열을 DNA 형태로 복사함으로써 형성되는 임의의 DNA.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 신규 부류의 TGF-베타 결합-단백질 뿐만 아니라, 온혈 동물에서 뼈 무기질 함량을 증가시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 간략히, 본 발명은 TGF-베타 결합-단백질 족의 신규 구성원을 코딩하는 유전자에서의 돌연변이 결과, 정상 개체에 비해 1 내지 4배 높은 뼈의 무기질 함량을 특징으로 하는 드문 증상 (경화협착증)이 나타난다는 예상치 못한 발견을 기초로 한다. 따라서, 하기에 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 상기 발견은 TGF-베타 결합-단백질이 TGF-베타 족의 단백질 및 뼈 형태발생 단백질 (BMP)에 결합하는 것을 억제하는 분자를 선택하는데 이용될 수 있는 검정법, 및 온혈 동물 (예를 들어, 인간)의 뼈의 무기질 함량의 증가시키기 위해 상기 분자를 이용하는 방법의 개발을 유도하였다.
경화협착증으로 공지된 질환에 대한 논의
경화협착증은 인간에서 비정상적인 뼈의 무기질 밀도와 관련이 있는 질환이다. 경화협착증은 한센(Hansen, 1967) (문헌 [Hansen, H. G., Sklerosteose. in: Opitz, H.; Schmid, F., Handbuch der Kinderheilkunde. Berlin: Springer (pub.) 6 1967. Pp. 351-355])에 의해, 판 부헴 피질성 전신성 과골증(van Buchem hyperostosis Corticalis generalisata)과 유사하나, 여러 경우에서 뼈 변화의 방사선 외견 및 검지와 중지의 피부 합지증의 존재의 면에서는 상이할 수 있는 질환에 대해 지칭된 용어이다.
이제, 경화협착증은 성인의 뼈에서 광범위한 다발성 경화증 병변을 특징으로 하는 상염색체성 반-우성 질환으로 공지된다. 증상은 진행성이다. 경화협착증은 또한 합지증 (두개 이상의 손가락이 함께 합쳐짐)과 연관된 발병적 측면을 갖는다. 경화협착증 증후군은 큰 키와 관련이 있고, 여러 발병 개체는 키가 6 피트 이상이 된다. 동형접합체의 뼈의 무기질 함량은 정상 개체보다 1 내지 6배가 넘을 수 있으며, 뼈의 무기질 밀도는 정상 수치 (예를 들어, 발병되지 않은 형제의 수치)보다 1 내지 4배 더 높을 수 있다.
경화협착증 증후군은 남아프리카 혈통의 독일의 아프리카인에서 주로 발생한다. 상기 아프리카인의 대략 1/140 개체는 돌연변이 유전자 (이형접합체)의 보균자이다. 상기 돌연변이는 100％ 침투성을 보인다. 이형접합체에서 뼈 무기질 밀도의 증가는 연관된 병인 (합지증 또는 두개골 과형성)이 없다는 한 보고가 있다.
뇌하수체-시상하부 축의 비정상이 경화협착증 환자에서 발견된 적이 없다. 특히, 성장 호르몬 및 코르티손의 과다한 생성이 없는 것으로 보인다. 또한, 발병한 개체에서 성 호르몬 수준은 정상이다. 그러나, 뼈 교체 마커 (골모세포 특이적 알칼리성 포스파타제, 오스테오칼신, 제1형 프로콜라겐 C' 프로펩티드 (PICP), 및 전체 알칼리성 포스파타제; 문헌 [Comier, C., Curr. Opin. in Rheu. 7:243, 1995] 참조)는 상기 질병과 연관된 과골모세포 활성이 있음을 나타내나, 뼈 재흡수의 마커 (피리디놀린, 데옥시피리디놀린, N-텔로펩티드, 뇨의 히드록시프롤린, 혈장 타르트레이트-내성 산 포스파타제 및 갈락토실 히드록시리신; 상기 코미어(Comier)의 문헌 참조)에 의해서는 정상 내지는 경미하게 감소된 골모세포 활성이 있는 것으로 측정된다.
경화협착증은 발병한 개체의 일생 동안 골격에 걸쳐 뼈의 지속적인 침착을 특징으로 한다. 동형접합체에서, 뼈 무기질의 지속적인 침착은 기계적 자극 수용기이 부재하는 골격 (안면, 턱, 두개골)의 영역에서 뼈의 과다성장을 유도한다. 경화협착증을 가진 동형접합체에서, 두개골의 과다성장은 두개골 압축을 유도하여 결국 뇌간에 대한 과도한 수압으로 인해 사망을 일으킨다. 골격의 모든 다른 부분에는 전신성 및 확산성 경화증이 있다. 긴 뼈의 피질 영역이 매우 두꺼워져서, 뼈 강도의 실질적인 증가를 일으킨다. 소주상 결합부는 두께가 증가하여 기둥 뼈의 강도를 증가시킨다. 경화성 골은 보통과는 달리 x-선에 불투명하게 보이다.
실시예 1에서 더욱 상세하게 설명되는 바와 같이, 경화협착증 증후군에 관여하는 드문 유전성 돌연변이는 TGF-베타 결합-단백질 족 (대표적인 일례로 "인간 비어"가 있음)의 신규 구성원을 코딩하는 인간 염색체 17의 영역으로 국소화되었다. 이하에 더욱 상세히 기재되는 바와 같이, 상기 발견을 기초로 하여 뼈의 무기질화의 메카니즘을 더욱 충분히 이해하며, 이는 뼈의 무기질화를 증가시키는 분자에 대한 검정법, 및 광범위한 질병의 치료 및 예방에 있어서 뼈의 무기질 함량을 증가시키는 상기 분자의 용도에 대한 개발을 가능하게 한다.
TGF -베타 거대족
형질전환 성장 인자-베타 (TGF-베타) 거대족은 공통된 서열 요소 및 구조 모티프를 (이원 및 삼원 수준으로) 공유하는 다양한 성장 인자를 함유한다. 이 단백질 족은 매우 다양한 세포 유형에 영향을 미치는 광범위한 스펙트럼의 생물학적 반응을 발휘하는 것으로 공지되어 있다. 여러 TGF-베타 족 구성원은 배아 발생 동안 패턴 형성 및 조직 구체화에 중요한 기능을 하는데, 성인에서 상기 족 구성원은, 예를 들어 창상 치유, 뼈 복구 리모델링, 및 면역계의 조정과 연관이 있다. 상기 거대족은 TGF-베타 이외에도 뼈 형태발생 단백질 (BMP), 악티빈(Activin), 인히빈(Inhibin), 성장 및 분화 인자 (GDF), 및 아교세포-유래된 신경영양 인자 (GDNF)를 포함한다. 초대 분류는 특이적 단백질을 일반적인 아족으로 묶는 일반적인 서열 특징을 통해 달성되었다. 상기 아족 내에서의 추가의 계층화는 보다 작은 군의 구성원들 사이의 보다 엄격한 서열 보존성으로 인해 가능하다. BMP-5, BMP-6 및 BMP-7과 같은 특정한 예에서, 아미노산 일치성은 보다 작은 군의 구성원들 중에서 75％만큼 높을 수 있다. 상기 수준의 일치성은 하나의 대표적인 서열이 보다 큰 족의 다른 구성원과 구별되는 상기 아족의 중요한 생화학적 요소를 설명가능하게 해준다.
TGF-베타2의 결정 구조를 측정하였다. TGF-베타2 단량체의 일반적인 접힘부는 세 개의 디술피드 가교에 의해 형성된 안정하고 밀집된 시스테인 노트 유사 구조를 함유한다. 하나의 디술피드 가교에 의해 안정화된 이량체는 역평행이다.
TGF-베타 신호는 제I형 및 제II형 수용체의 헤테로-올리고머 복합체의 형성에 의해 유도된다. TGF-베타 신호의 형질도입은 세린/트레오닌 키나제 수용체의 두 가지 상이한 제I형 및 제II형 아족과 관련이 있다. 7가지 이상의 제I형 수용체 및 5가지 이상의 제II형 수용체가 확인되었다 (문헌 [Kawabata et al., Cytokine Growth Factor Rev. 9: 49-61 (1998)], [Miyazono et al., Adv. Immunol. 75: 115-57 (2000)] 참조). TGF-베타 족 구성원은 일시적인 세린/트레오닌 키나제 활성을 갖는 수용체와의 결합에 의해 그들의 세포 작용을 개시한다. TGF-베타 족의 각 구성원은 신호전달에 필요한 제I형 및 제II형 수용체의 특징적인 조합물에 결합한다. TGF-베타 수용체 활성화를 위한 현재의 모델에서, 먼저 TGF-베타 리간드는 활성화된 키나제를 갖는 올리고머 형태의 세포막에서 발생하는 제II형 수용체 (TbR-II)와 결합한다. 그 후, TbR-II의 부재시에는 리간드와 결합할 수 없는 제I형 수용체 (TbR-I)를 상기 복합체로 동원하여 리간드/제II형/제I형 삼원 복합체를 형성한다. 이어서, TbR-II는 막주변 영역에서 글리신 및 세린 잔기가 풍부한 도메인 (GS 도메인)에서 TbR-I을 우세하게 인산화시키며, 이로써 TbR-I을 활성화시킨다. 그 후, 활성화된 제I형 수용체 키나제는 특정한 유전자의 전사를 조정하는 핵으로 이동하는 Smad 족의 단백질의 특정 구성원을 인산화시킨다.
뼈 형태발생 단백질 (BMP)은 인간에서 뼈 무기질 밀도를 측정하는데 중요한 조절 단백질이다.
뼈 형성을 이해하는데 있어서의 주요한 진보는 생체내 연골 및 뼈 분화를 조절하는, 골원성 단백질 (OP)로 공지된 뼈 형태발생 단백질 (BMP)의 확인이었다. BMP/OP는 연골 형성, 연골의 비대화 및 석회화, 맥관 침투, 골모세포의 분화, 및 뼈의 형성을 포함하는 일련의 사건을 통해 연골내 뼈 분화를 유도한다. 상기 기재된 바와 같이, BMP/OP (BMP 2-14, 및 골원성 단백질 1 및 2, OP-1 및 OP-2) (예를 들어, 진뱅크 P12643 (BMP-2), 진뱅크 P12645 (BMP3), 진뱅크 P55107 (BMP-3b, 성장/분화 인자 10) (GDF-10), 진뱅크 P12644 (BMP4), 진뱅크 P22003 (BMP5), 진뱅크 P22004 (BMP6), 진뱅크 P18075 (BMP7), 진뱅크 P34820 (BMP8), 진뱅크 Q9UK05 (BMP9), 진뱅크 O95393 (BM10), 진뱅크 O95390 (BMP11, 성장/분화 인자 11 전구체(GDF-11)), 진뱅크 O95972 (BM15) 참조)는 TGF-베타 거대족의 구성원이다. BMP/OP 아족의 구성원들 사이의 현저한 진화적 보존성은 이들이 동물의 정상적인 발달 및 기능에 결정적임을 제시한다. 또한, BMP/OP의 다중 형태의 존재는 이러한 명백한 중복성의 생물학적 관련성에 대한 중요한 의문점을 증가시킨다. 태아후 연골형성 및 골형성 이외에도, BMP/OP는 (두개안면 및 치아 조직의 발달을 비롯한) 골격형성에 및 신장을 비롯한 실질 기관의 배아 발달 및 조직형성에 여러 역할을 한다. 현재 본질은, 특수화된 조직 및 기관의 출현을 제공하도록 조정된 공통된 (그리고 몇몇) 분자 메카니즘에 의해 결정된다는 것을 이해한다. BMP/OP 거대족은 고도로 보존된 카르복시-말단 영역 내에서 아미노산 모티프의 변형이 적은 분자 이형체를 배치하는 다중 특수화된 기능을 프로그래밍하는 본질 절약성의 훌륭한 예이다.
BMP는 큰 전구체 단백질로서 합성된다. 이량체화시, BMP는 세포내에서 단백질 가수분해에 의해 분해되어, 카르복시-말단 성숙 단백질을 형성한 다음, 세포로부터 분비된다. 다른 TGF-베타 족 구성원과 마찬가지로 BMP는 제I형 및 제II형 세린/트레오닌 키나제 수용체 둘다에 함께 결합함으로써 신호 형질도입을 개시한다. BMP가 리간드로서 작용할 수 있는 제I형 수용체로는 BMPR-IA (ALK-3으로도 공지됨), BMPR-IB (ALK-6으로도 공지됨), ALK-1, 및 ALK-2 (ActR-I로도 공지됨)이 있다. 제II형 수용체 중에서, BMP는 BMP 제II형 수용체 (BMPR-I), 악티빈 제II형(ActR-II), 및 악티빈 제IIB형 (ActR-IIB)에 결합한다 (상기 베일만스(Balemans) 등의 문헌 및 그에 인용된 문헌 참조). BMP 제I형 수용체 폴리펩티드의 폴리뉴클레오티드 서열 및 코딩된 아미노산 서열은 진뱅크 데이타베이스에서, 예를 들어 진뱅크 NM_004329 (서열 116에 의해 코딩되는 서열 102), D89675 (서열 117에 의해 코딩되는 서열 103), NM_001203 (서열 118에 의해 코딩되는 서열 104), S75359 (서열 119에 의해 코딩되는 서열 105), NM_030849 (서열 120에 의해 코딩되는 서열 106) 및 D38082 (서열 121에 의해 코딩되는 서열 107)로 제공된다. 제I형 수용체의 다른 폴리펩티드 서열로는 진뱅크 데이타베이스에서, 예를 들어 NP_001194 (서열 108), BAA17965 (서열 109) 및 AA33865 (서열 110)으로 제공된다. BMP 제II형 수용체 폴리펩티드의 폴리뉴클레오티드 서열 및 코딩된 아미노산 서열은 진뱅크 데이타베이스에서, 예를 들어 U25110 (서열 122에 의해 코딩되는 서열 111), NM_033346 (서열 123에 의해 코딩되는 서열 112), NM_001204 (서열 124에 의해 코딩되는 서열 113) 및 Z48923 (서열 125에 의해 코딩되는 서열 114)으로 제공된다. 제II형 수용체의 추가의 폴리펩티드 서열로는 진뱅크 데이타베이스에서, 예를 들어 CAA88759 (서열 115)로 제공된다.
다른 시스틴-노트 단백질과 유사한 BMP는 동종이량체 구조체를 형성한다 (문헌 [Scheufler et al., J. Mol. Biol. 287:103-15 (1999)]). BMP/TGF-β 족에 대해 수행한 진화적 추적 분석에 따르면, BMP 제I형 수용체 결합 부위 및 제II형 수용체 결합 부위는 BMP 구조체의 표면에 맵핑되었다 (문헌 [Innis et al., Protein Eng. 13:839-47 (2000)]). BMP 상의 제I형 수용체 결합 부위의 위치는 BMP-2/BMP 수용체 제IA형 복합체의 x-선 구조에 의해 이후 확인되었다 (문헌 [Nickel et al., J. Joint Surg. Am. 83A(Suppl 1(Pt 1):S7-S14 (2001)]). 추정된 제II형 수용체 결합 부위는 TGF-β3/TGF-β 제II형 수용체 복합체의 x-선 구조 분석에 의해 양호한 일치성을 나타내었다 (문헌 [Hart et al., Nat. Struct. Biol. 9:203-208 (2002)]).
BMP 길항작용
BMP 및 악티빈 아족은 TGF-베타 결합 단백질에 의해 유의한 전사후 조절을 거친다. 복잡한 세포외 조절 시스템이 존재하기 때문에, 고 친화성 길항제가 합성 및 배출되고, 후속적으로 BMP 또는 악티빈과 선택적으로 복합체를 형성하여, 그들의 생물학적 활성을 방해한다 (문헌 [W.C. Smith (1999) TIG 15(1) 3-6]). 이러한 수많은 천연 길항제가 확인되었고, 서열 분기성을 기초로 하면 상기 길항제는 초대 서열 보존성이 없어서 독립적으로 진화된 것으로 보인다. 이들 길항제에 대한 초기 연구에서는 BMP-2 및 BMP-4의 상호작용 및 중화에 대한 선호성 차이에 대해 주목하였다. 척추동물에서 길항제로는 노긴, 코르딘, 코르딘 유사체, 폴리스타틴, FSRP, 댄/세르베루스 단백질 족, 및 스클레로스틴 (SOST)이 있다 (상기 베일만스(Balemans) 등의 문헌 및 그에 인용된 문헌 참조). 길항작용 또는 억제작용의 메카니즘은 상이한 길항제에 따라 다른 것으로 여겨진다 (문헌 [Iemura et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 9337-9342] 참조).
또한, BMP 길항제 노긴 상의 제I형 및 제II형 수용체 결합 부위가 맵핑되었다. 노긴은 BMP에 고 친화성으로 결합한다 [Zimmerman et al., 1996]. 노긴/BMP-7 복합체 구조에 대한 연구 결과, 이들 두 단백질 사이의 결합 상호작용이 밝혀졌다 [Groppe et al., Nature 420:636-42 (2002)]. 노긴-BMP-7 구조를 BMP 신호전달 복합체의 모델에 중첩하자, 노긴 결합이 BMP-7 상의 두 쌍의 결합 에피토프(즉, BMP 제I형 및 제II형 수용체 결합 부위)를 효과적으로 차폐하는(mask) 것으로 나타났다. 노긴의 시스테인-풍부 스캐폴드 서열의 앞쪽에는 "클립(clip)"(잔기 28-48)이라 불리는 약 20개의 아미노산 잔기로 된 N-말단 절편이 존재한다. 제I형 수용체-결합 부위는 노긴의 클립 도메인의 N-말단 부위에 의해 차단되며, 제II형 수용체 결합 부위는 클립 도메인의 카르복시 말단 부위에 의해 차단된다. 노긴의 C-말단 근처의 코어 영역에서 두 β-가닥은 또한 제II형 수용체 결합 부위에서 BMP-7과 접촉한다. 이러한 결합 방식에 의해 노긴 이량체는 BMP 이량체 상의 모든 수용체 결합 부위 (2개의 제I형 및 2개의 제II형 수용체 결합 부위)를 효과적으로 차단할 수 있다.
신규 TGF -베타 결합-단백질
상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 인간 댄, 인간 그렘린, 인간 세르베루스, 및 SCGF (미국 특허 제5,780,263호)에 비해 거의 동일한 시스테인 (디술피드) 스캐폴드(scaffold)를 보유하지만 뉴클레오티드 수준에서의 상동성은 거의 없는 신규한 부류의 TGF-베타 결합-단백질을 제공한다 (배경 정보를 위해서는 일반적으로 문헌 [Hsu, D. R., Economides, A. N., Wang, X., Eimon, P. M., Harland, R. M., "The Xenopus Dorsalizing Factor Gremlin Identifies a Novel Family of Secreted Proteins that Antagonize BMP Activities," Molecular Cell 1:673-683, 1998]을 참조한다).
TGF-베타 결합-단백질을 코딩하는 신규한 부류의 핵산 분자의 대표예가 서열 1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 및 101에 개시되어 있다. 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 비어로 불리며, 본원에서 스클레로스틴 또는 SOST라고도 불리는 폴리펩티드를 코딩한다. 또한, 이러한 부류의 결합 단백질의 대표적 구성원은 TGF-베타 결합-단백질의 변이체(예, 서열 5 및 7)를 포함하는 것으로 이해된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "TGF-베타 결합-단백질 변이체 유전자"(예, TGF-베타 결합 단백질 변이체를 코딩하는 단리된 핵산 분자)는 서열 2, 10, 12, 14, 16, 46 또는 65의 변형인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 지칭한다. 이러한 변이체는 TGF-베타 결합-단백질 유전자의 자연 발생적인 다형성 또는 대립유전자 변이체, 및 이들 아미노산 서열의 보존적 아미노산 치환을 함유하는 합성 유전자를 포함한다. 당업계의 숙련자들에게 공지된 다양한 기준은 펩티드 또는 폴리펩티드에서 특정 위치의 아미노산이 유사한지의 여부를 나타낸다. 예를 들어, 유사한 아미노산 또는 보존적 아미노산 치환이란 아미노산 잔기가, 염기성 측쇄 (예, 리신, 아르기닌, 히스티딘); 산성 측쇄 (예, 아스파르트산, 글루탐산); 비하전 극성 측쇄 (예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 히스티딘); 비극성 측쇄 (예, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판); 베타-분지 측쇄 (예, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판)를 갖는 아미노산을 포함하여 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 분류하기가 더 어려운 것으로 고려되는 프롤린은 지방족 측쇄 (예, Leu, Val, Ile 및 Ala)를 갖는 아미노산과 특성을 공유한다. 어떤 상황에서는, 글루타민 및 아스파라긴이 각각 글루탐산 및 아스파르트산의 아미드 유도체라는 점에서, 글루탐산을 글루타민으로 또는 아스파르트산을 아스파라긴으로 치환하는 것은 유사한 치환으로 고려될 수 있다.
TGF-베타 결합-단백질 유전자의 추가의 변이체 형태는 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열의 삽입 또는 결실을 함유하는 핵산 분자이다. TGF-베타 결합-단백질 변이체 유전자는 이 유전자가 엄격 조건하에 서열 1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 또는 101의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자와 혼성화하는지 여부를 결정함으로써 확인될 수 있다. 또한, TGF-베타 결합-단백질 변이체 유전자는 시스테인 주쇄를 갖는 단백질을 코딩해야 한다.
대안으로, TGF-베타 결합-단백질 변이체 유전자는 서열 비교에 의해 확인될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 최대한 일치하도록 정렬시켰을 때 두 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 동일하다면, 이들 두 아미노산 서열은 "100％ 아미노산 서열 동일성"을 갖는다. 유사하게, 최대한 일치하도록 정렬시켰을 때 두 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 잔기가 동일하다면 이들 두 뉴클레오티드 서열은 "100％ 뉴클레오티드 서열 동일성"을 갖는다. 서열 비교는 DNASTAR (Madison, Wisconsin)에 의해 제작되는 LASERGENE 생물정보학 컴퓨터 슈트(suite)에 포함된 것들과 같은 표준 소프트웨어 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 최적의 정렬을 결정함으로써 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 비교하는 다른 방법은 당업계의 숙련자들에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," in Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997), and Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998)] 참조).
변이체 TGF-베타 결합-단백질은 서열 2, 6, 10, 12, 14, 16, 46 또는 65와 50％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％ 또는 95％가 넘는 동일성을 가져야 한다. 별법으로, TGF-베타 결합-단백질 변이체는 서열 1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 또는 101과 70％ 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가짐으로써 확인될 수 있다. 게다가, 본 발명은 서열 1 또는 서열 100과 75％, 80％, 85％, 90％ 또는 95％ 넘는 동일성을 갖는 TGF-베타 결합-단백질 유전자 변이체를 포함한다. TGF-베타 결합-단백질 변이체 유전자 또는 변이체 TGF-베타 결합-단백질을 확인하는데 사용된 특정 방법과는 무관하게, 변이체 TGF-베타 결합-단백질 유전자에 의해 코딩된 변이체 TGF-베타 결합-단백질 또는 폴리펩티드는, 예를 들어 TGF-베타 단백질 족의 선택된 구성원에 결합하고(하거나) 그의 신호전달을 억제하는 능력에 의해 또는 항-TGF-베타 결합-단백질 항체에 특이적으로 결합하는 능력에 의해 기능적으로 특성화될 수 있다.
본 발명은 TGF-베타 결합-단백질 유전자의 기능적 단편을 포함한다. 본 발명의 범위내에서, TGF-베타 결합-단백질 유전자의 "기능적 단편"은 (1) 상기 언급한 기능 활성을 보유하거나 또는 (2) 항-TGF-베타 결합-단백질 항체와 특이적으로 결합하는 TGF-베타 결합-단백질 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 핵산 분자를 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 TGF-베타 결합-단백질 유전자의 기능적 단편은 서열 1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 또는 101의 뉴클레오티드 서열의 일부를 포함한다.
2. TGF-베타 결합-단백질 유전자의 단리
TGF-베타 결합-단백질을 코딩하는 DNA 분자는, 예를 들어 서열 1을 기초로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하여 인간 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 예를 들어, cDNA 라이브러리의 제조에서 제1 단계는 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 RNA를 단리하는 것이다. 일반적으로, RNA 단리 기술은 세포를 파열시키는 방법, RNase-지시된 RNA 분해를 억제하는 수단, 및 DNA, 단백질 및 다당류 오염물로부터 RNA를 분리하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 액체 질소 중에 조직을 동결시키고, 동결된 조직을 막자 사발로 분쇄하여 세포를 용해시키고, 분쇄된 조직을 페놀/클로로포름 용액으로 추출하여 단백질을 제거하고, 염화리튬에 의한 선택적 침전에 의해 남은 불순물로부터 RNA를 분리함으로써 전체 RNA를 단리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, pages 4-1 to 4-6 (John Wiley & Sons 1995) ["Ausubel (1995)"]; Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, pages 33-41 (CRC Press, Inc.1997) ["Wu (1997)"] 참조). 별법으로, 분쇄된 조직을 구아니디늄 이소티오시아네이트로 추출하고, 유기 용매로 추출하고, 분별 원심분리를 이용하여 오염물로부터 RNA를 분리함으로써 전체 RNA를 단리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel (1995), pages 4-1 to 4-6; Wu (1997), pages 33-41] 참조).
cDNA 라이브러리를 구성하기 위해, 폴리(A)+ RNA를 바람직하게는 전체 RNA 시료로부터 단리한다. 폴리(A)+ RNA는 올리고(dT)-셀룰로스 크로마토그래피의 표준 기술을 이용하여 전체 RNA로부터 단리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel (1995), pages 4-11 to 4-12] 참조). 이중-가닥 cDNA 분자는 당업계에 잘 알려진 기술을 이용하여 폴리(A)+ RNA로부터 합성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Wu (1997), pages 41-46] 참조). 게다가, 시판되는 키트를 사용하여 이중-가닥 cDNA 분자를 합성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, Maryland); CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, California); Promega Corporation (Madison, Wisconsin); and Stratagene Cloning Systems (La Jolla, California)] 참조).
TGF-결합-단백질-특이적 cDNA 분자에 풍부한, 감소된(subtracted) cDNA 라이브러리를 구성함으로써 TGF-베타 결합-단백질 cDNA 클론을 얻기 위한 기본적인 접근법을 변경할 수 있다. 감소된 라이브러리를 구성하기 위한 기술은 당업자의 숙련자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Sargent, "Isolation of Differentially Expressed Genes," in Meth. Enzymol. 152:423, 1987; and Wu et al. (eds.), "Construction and Screening of Subtracted and Complete Expression cDNA Libraries," in Methods in Gene Biotechnology, pages 29-65 (CRC Press, Inc. 1997)] 참조).
다양한 클로닝 벡터는 cDNA 라이브러리를 구성하는데 있어서 적절하다. 예를 들어, cDNA 라이브러리는 박테리오파지 유래의 벡터, 예를 들어 λgt1O 벡터에서 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Huynh et al., "Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt1O and λgt11," in DNA Cloning: A Practical Approach Vol. I, Glover (ed.), page 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997), pages 47-52] 참조). 별법으로, 이중-가닥 cDNA 분자는 플라스미드 벡터, 예를 들어 p블루스크립트(pBluescript) 벡터 (Stratagene Cloning Systems; La Jolla, California), 람다GEM-4 (Promega Corp.; Madison, Wisconsin) 또는 다른 시판 벡터에 삽입할 수 있다. 또한, 적합한 클로닝 벡터는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(Rockville, Maryland)으로부터 얻을 수 있다.
클로닝된 cDNA 분자를 증폭시키기 위해, 표준 기술을 이용하여 cDNA 라이브러리를 원핵생물 숙주에 삽입한다. 예를 들어, cDNA 라이브러리는 라이프 테크놀로지스, 인크.(Life Technologies, Inc.)(Gaithersburg, Maryland)로부터 얻을 수 있는 수용성(competent) 이. 콜라이 DH5 세포에 도입할 수 있다.
인간 게놈 DNA 라이브러리는 당업계에 잘 알려진 수단에 의해 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel (1995), pages 5-1 to 5-6; Wu (1997), pages 307-327] 참조). 조직을 세정제 사르코실(Sarkosyl)로 용해시키고, 용해물을 프로테이나제 K로 절단하고, 원심분리에 의해 용해물로부터 불용성 잔해를 제거하고, 이소프로판올을 사용하여 용해물로부터 핵산을 침전시키고, 재현탁된 DNA를 염화세슘 밀도 농도구배 상에서 정제함으로써 게놈 DNA를 단리할 수 있다.
게놈 라이브러리의 제조에 적합한 DNA 단편은 게놈 DNA를 무작위 전단변형시키거나 또는 게놈 DNA를 제한 엔도뉴클레아제로 부분 절단함으로써 얻을 수 있다. 통상의 기술에 따라, 예를 들어 적절한 말단을 제공하기 위해 제한효소 절단을 이용하고, DNA 분자의 바람직하지 않은 연결을 방지하기 위해 알칼리 포스파타제 처리를 이용하고, 적절한 리가제를 사용한 라이게이션에 의해 게놈 DNA 단편을 벡터, 예를 들어 박테리오파지 또는 코스미드 벡터에 삽입할 수 있다. 이러한 조작 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel (1995), pages 5-1 to 5-6; Wu (1997), pages 307-327] 참조).
또한, TGF-베타 결합-단백질을 코딩하는 핵산 분자는, 본원에 기재된 바와 같이, 인간 TGF-베타 결합-단백질 유전자의 뉴클레오티드 서열을 기초로 하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 얻을 수도 있다. PCR에 의해 라이브러리를 스크리닝하는 일반적인 방법은, 예를 들어 문헌 [Yu et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries," in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), pages 211-215 (Humana Press, Inc. 1993)]에 제시되어 있다. 게다가, PCR을 이용하여 관련된 유전자를 단리하는 기술은, 예를 들어 문헌 [Preston, "Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members," in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), pages 317-337 (Humana Press, Inc. 1993)]에 기재되어 있다.
별법으로, 인간 게놈 라이브러리는 리서치 제네틱스(Research Genetics)(Huntsville, AL) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(Rockville, Maryland)과 같은 상업적인 공급처로부터 얻을 수 있다. cDNA 또는 게놈 클론을 함유하는 라이브러리는, 본원에 기재되고 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 서열 1을 기초로 하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하여 스크리닝할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel (1995), pages 6-1 to 6-11] 참조).
본원에 기재된 바와 같이 제조된 항-TGF-베타 결합-단백질 항체를 사용하여, TGF-베타 결합-단백질을 코딩하는 DNA 서열을 cDNA 라이브러리로부터 단리할 수도 있다. 예를 들어, 항체를 사용하여 λgt11 발현 라이브러리를 스크리닝할 수 있거나, 또는 항체를 하이브리드 선택 및 번역 후의 면역스크리닝을 위해 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel (1995), pages 6-12 to 6-16; Margolis et al., "Screening λ expression libraries with antibody and protein probes," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 1-14 (Oxford University Press 1995)] 참조).
TGF-베타 결합-단백질 cDNA 또는 TGF-베타 결합-단백질 게놈 단편의 서열은 표준 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 또한, TGF-베타 결합-단백질 프로모터 또는 조절 요소를 함유하는 게놈 단편의 확인은 잘 확립된 기술, 예를 들어 결실 분석을 이용하여 달성할 수 있다 (일반적으로, 문헌 [Ausubel (1995), supra] 참조).
대안으로, TGF-베타 결합-단백질 유전자는 긴 올리고뉴클레오티드를 상호 프라이밍(mutually priming)하는 것과 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열을 이용하여 DNA 분자를 합성함으로써 얻을 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel (1995), pages 8-8 to 8-9] 참조). 중합효소 연쇄 반응을 이용하는 확립된 기술은 2 킬로베이스 이상의 길이를 갖는 DNA 분자를 합성하는 능력을 제공한다 [Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131, 1993; Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266, 1993; Dillon et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes," in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), pages 263-268, (Humana Press, Inc. 1993); Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299, 1995].
3. TGF-베타 결합-단백질 유전자의 생성
변이체 TGF-베타 결합-단백질 유전자를 코딩하는 핵산 분자는, 본원에 기재된 절차를 이용하여 서열 1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 또는 101을 기초로 하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 프로브로 다양한 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 또한, TGF-베타 결합-단백질 유전자 변이체는 합성적으로 구성할 수도 있다. 예를 들어, 서열 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 또는 65의 아미노산 서열에 비해 보존적 아미노산 변화를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 유도할 수 있다. 즉, 서열 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 또는 65의 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 변이체를 얻을 수 있으며, 여기서 알킬 아미노산이 TGF-베타 결합-단백질 아미노산 서열내의 알킬 아미노산을 치환하거나, 방향족 아미노산이 TGF-베타 결합-단백질 아미노산 서열내의 방향족 아미노산을 치환하거나, 황-함유 아미노산이 TGF-베타 결합-단백질 아미노산 서열내의 황-함유 아미노산을 치환하거나, 히드록시-함유 아미노산이 TGF-베타 결합-단백질 아미노산 서열내의 히드록시-함유 아미노산을 치환하거나, 산성 아미노산이 TGF-베타 결합-단백질 아미노산 서열내의 산성 아미노산을 치환하거나, 염기성 아미노산이 TGF-베타 결합-단백질 아미노산 서열내의 염기성 아미노산을 치환하거나, 또는 이염기 모노카르복실산 아미노산이 TGF-베타 결합-단백질 아미노산 서열내의 이염기 모노카르복실산 아미노산을 치환한다. 통상의 아미노산들 중에서, 예를 들어 "보존적 아미노산 치환"은 다음과 같은 군들 각각 내에 존재하는 아미노산들 중에서의 치환에 의해 예시된다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신, (2) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판, (3) 세린 및 트레오닌, (4) 아스파르테이트 및 글루타메이트, (5) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (6) 리신, 아르기닌 및 히스티딘. 이러한 치환을 수행하는데 있어서, 가능하다면 도 1에 개략적으로 나타낸 시스테인 주쇄를 유지하는 것이 중요하다.
TGF-베타 결합-단백질 유전자에서의 보존적 아미노산 변화는 서열 1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 또는 101에 인용된 뉴클레오티드를 다른 뉴클레오티드로 치환함으로써 도입할 수 있다. 이러한 "보존적 아미노산" 변이체는, 예를 들어 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발, 링커-스캐닝 돌연변이유발, 및 중합효소 연쇄 반응을 이용하는 돌연변이유발 등에 의해 얻을 수 있다 (문헌 [Ausubel (1995), pages 8-10 to 8-22; McPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991)] 참조). 이러한 변이체의 기능적 능력은 표준 방법, 예를 들어 본원에 기재된 분석법을 이용하여 결정할 수 있다. 별법으로, 변이체 TGF-베타 결합-단백질 폴리펩티드는 항-TGF-베타 결합-단백질 항체와 특이적으로 결합하는 능력에 의해 확인할 수 있다.
핵산 분자에 대한 통상의 결실 분석을 수행하여, TGF-베타 결합-단백질 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 "기능적 단편"을 얻을 수 있다. 예로서, 서열 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자를 Bal31 뉴클레아제로 절단하여 일련의 네스티드(nested) 결실을 얻을 수 있다. 이어서, 단편을 발현 벡터내에 적절한 리딩 프레임으로 삽입하고, 발현된 폴리펩티드를 단리하여 활성에 대하여 시험하거나, 또는 항-TGF-베타 결합-단백질 항체와 결합하는 능력에 대하여 시험한다. 엑소뉴클레아제 절단에 대한 한가지 대안은 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발을 이용하여 결실 또는 종결 코돈을 도입함으로써 목적하는 단편의 제조를 지정하는 것이다. 별법으로, TGF-베타 결합-단백질 유전자의 특정 단편은 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 합성할 수 있다.
단백질의 기능적 분석을 위한 표준 기술은, 예를 들어 문헌 [Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240:113, 1993; Content et al., "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon," in Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), pages 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, "The EGF Receptor," in Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton et al., (eds.) pages 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270:29270, 1995; Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270:25291, 1995; Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50:1295, 1995; Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30:1, 1996]에 기재되어 있다.
또한, 본 발명은 보존적 아미노산 변화를 갖는, TGF-베타 결합 단백질 유전자의 기능적 단편을 포함한다.
TGF-베타 결합-단백질 변이체 유전자는 구조를 기초로 하여 상기 논의된 바와 같은 서열 1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 또는 101, 및 2, 6, 10, 12, 14, 16, 46 또는 65의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열과의 동일성 수준을 측정함으로써 확인할 수 있다. 구조를 기초로 하여 변이체 유전자를 확인하는 다른 접근법은 잠재적인 변이체 TGF-베타 결합 단백질 유전자를 코딩하는 핵산 분자가 엄격 조건하에 서열 1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 또는 101의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자, 또는 뉴클레오티드 15개 또는 20개 이상의 길이인 상기 핵산 분자의 일부와 혼성화할 수 있다. 엄격 혼성화 조건에 대한 설명으로, 변이체 TGF-베타 결합-단백질 서열을 갖는 핵산 분자는, 예를 들어 5xSSPE (1xSSPE = 180 mM 염화나트륨, 10 mM 인산나트륨, 1 mM EDTA (pH 7.7)), 5x덴하르트(Denhardt's) 용액(100x덴하르트(Denhardt's) = 2％ (w/v) 소 혈청 알부민, 2％ (w/v) 피콜(Ficoll), 2％ (w/v) 폴리비닐피롤리돈) 및 0.5％ SDS를 함유하며 55 내지 60 ℃에서 밤새 인큐베이션된 완충액 중에서, 서열 1로부터의 서열을 갖는 핵산 분자의 단편과 결합할 수 있다. 고 염격 조건하에서의 후-혼성화 세척은 통상적으로 55 내지 60 ℃에서 0.5xSSC (1xSSC = 150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산삼나트륨) 또는 0.5xSSPE 중에서 수행된다.
변이체 TGF-베타 결합-단백질 유전자의 특정 뉴클레오티드 서열과는 무관하게, 이 유전자는 그의 기능적 능력에 의해 또는 항-TGF-베타 결합-단백질 항체에 특이적으로 결합하는 능력에 의해 특성화될 수 있다. 보다 구체적으로, 변이체 TGF-베타 결합-단백질 유전자는 본원에 기재된 인간 TGF-베타 결합-단백질 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드의 활성의 50％ 이상, 바람직하게는 60％, 70％, 80％ 또는 90％ 넘는 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩한다.
4. 배양된 세포에서 TGF-베타 결합-단백질의 제조
TGF-베타 결합-단백질 유전자를 발현시키기 위해, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 발현 벡터에서 전사 발현을 조절하는 조절 서열에 작동가능하게 연결되고, 이어서 숙주 세포내에 도입되어야 한다. 전사 조절 서열, 예를 들어 프로모터 및 인핸서 이외에도, 발현 벡터는 번역 조절 서열, 및 발현 벡터를 운반하는 세포의 선별에 적합한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 진핵 세포에서 외래 단백질의 제조에 적합한 발현 벡터는 통상적으로 (1) 박테리아 숙주에서 발현 벡터의 성장 및 선별을 제공하는 박테리아 복제 기점 및 항생제 내성 마커를 코딩하는 원핵생물 DNA 요소; (2) 전사 개시를 조절하는 진핵생물 DNA 요소, 예를 들어 프로모터; 및 (3) 전사체의 프로세싱을 조절하는 DNA 요소, 예를 들어 전사종결/폴리아데닐화 서열을 함유한다.
본 발명의 TGF-베타 결합-단백질은 바람직하게는 포유동물 세포에서 발현된다. 포유동물 숙주 세포의 예는 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (Vero; ATCC CRL 1587), 인간 배아 신장 세포 (293-HEK; ATCC CRL 1573), 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK-21; ATCC CRL 8544), 개 신장 세포 (MDCK; ATCC CCL 34), 차이니스 햄스터 난소 세포 (CHO-K1; ATCC CCL61), 래트 뇌하수체 세포 (GH1; ATCC CCL82), HeLa S3 세포 (ATCC CCL2.2), 래트 간암 세포 (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), SV40-형질전환된 원숭이 신장 세포 (COS-1; ATCC CRL 1650) 및 쥐 배아 세포(NIH-3T3; ATCC CRL 1658)를 포함한다.
포유동물 숙주의 경우, 전사 및 번역 조절 신호는 바이러스 공급원, 예를 들어 아데노바이러스, 소 파필로마 바이러스 또는 시미안(simian) 바이러스 등으로부터 유도될 수 있으며, 여기서 조절 신호는 높은 발현 수준을 갖는 특정 유전자와 관련된다. 또한, 적합한 전사 및 번역 조절 서열은 포유동물 유전자, 예를 들어 액틴, 콜라겐, 미오신 및 메탈로티오네인 유전자로부터 얻을 수 있다.
전사 조절 서열은 RNA 합성 개시를 지시하는데 충분한 프로모터 영역을 포함한다. 적합한 진핵생물 프로모터는 마우스 메탈로티오네인 I 유전자의 프로모터 [Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet. 1:273, 1982], 헤르페스(Herpes) 바이러스의 TK 프로모터 [McKnight, Cell 31:355, 1982], SV40 초기 프로모터 [Benoist et al., Nature 290:304, 1981], 로우스(Rous) 육종 바이러스 프로모터 [Gorman et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:6777, 1982], 사이토메갈로바이러스 프로모터 [Foecking et al., Gene 45:101, 1980] 및 마우스 유방 종양 바이러스 프로모터를 포함한다 (일반적으로, 문헌 [Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)] 참조).
별법으로, 원핵생물 프로모터, 예를 들어 박테리오파지 T3 RNA 중합효소 프로모터는, 이 원핵생물 프로모터가 진핵생물 프로모터에 의해 조절되는 경우, 포유동물 세포에서 TGF-베타 결합-단백질 유전자 발현을 조절하는데 사용될 수 있다 [Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10:4529, 1990; Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19:4485, 1991].
또한, TGF-베타 결합-단백질 유전자는 박테리아, 효모, 곤충 또는 식물 세포에서 발현될 수도 있다. 원핵생물 숙주에서 TGF-베타 결합-단백질 폴리펩티드를 발현시키는데 사용될 수 있는 적합한 프로모터는 당업계의 숙련자들에게 널리 공지되어 있으며, T4, T3, Sp6 및 T7 중합효소를 인식할 수 있는 프로모터, 박테리오파지 람다의 PR 및 PL 프로모터, 이. 콜라이의 trp, recA, 열 충격, lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA 및 lacZ 프로모터, 비. 서브틸리스(B. subtilis)의 프로모터, 바실러스(Bacillus)의 박테리오파지의 프로모터, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 프로모터, 박테리오파지 람다의 int 프로모터, pBR322의 bla 프로모터, 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자의 CAT 프로모터를 포함한다. 원핵생물 프로모터는 문헌 [Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277, 1987, Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamin Cummins 1987), and by Ausubel et al. (1995)]에서 검토되었다.
바람직한 원핵생물 숙주는 이. 콜라이 및 바실러스 서브틸리스를 포함한다. 적합한 이. 콜라이 균주는 BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 및 ER1647 (예를 들어, 문헌 [Brown (Ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)] 참조)을 포함한다. 적합한 바실러스 서브틸리스 균주는 BR151, YB886, MI119, MI120 및 B170을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Hardy, "Bacillus Cloning Methods," in DAN Cloning: A Practical Approach, Glover (Ed.)(IRL Press 1985)] 참조).
원핵생물 숙주에서 단백질을 발현시키는 방법은 당업계의 숙련자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 15 (Oxford University Press 1995); Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995); and Georgiou, "Expression of Proteins in Bacteria," in Protein Engineering. Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), page 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)] 참조).
바쿨로바이러스 시스템은 클로닝된 TGF-베타 결합-단백질 유전자를 곤충 세포내로 도입하는 효과적인 수단을 제공한다. 적합한 발현 벡터는 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 다중 핵 폴리헤드론형성 바이러스(AcMNPV)를 기초로 하며, 널리 공지된 프로모터, 예를 들어 드로소필라(Drosophila) 열 충격 단백질(hsp) 70 프로모터, 아우토그라파 칼리포르니카 핵 폴리헤드론형성 바이러스 즉시-초기 유전자 프로모터(ie-1) 및 지연된 초기 39K 프로모터, 바쿨로바이러스 p1O 프로모터 및 드로소필라 메탈로티오네인 프로모터를 함유한다. 적합한 곤충 숙주 세포는 IPLB-Sf-21로부터 유도된 세포주, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 번데기 난소 세포주, 예를 들어 Sf9 (ATCC CRL 1711), Sf21AE 및 Sf21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA), 및 드로소필라 슈나이더(Schneider)-2 세포를 포함한다. 바쿨로바이러스 시스템에서 재조합 단백질을 제조하는 확립된 기술은 문헌 [Bailey et al., "Manipulation of Baculovirus Vectors," in Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), pages 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991), by Patel et al., "The baculovirus expression system," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 205-244 (Oxford University Press 1995), by Ausubel (1995), pages 16-37 to 16-57, by Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995), and by Lucknow, "Insect Cell Expression Technology," in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)]에 제시되어 있다.
효모에서의 발현용 프로모터의 예로는 GHL1 (갈락토스), PGK (포스포글리세레이트 키나제), ADH (알콜 데히드로게나제), AOX1 (알콜 옥시다제), HIS4 (히스티디놀 데히드로게나제) 등으로부터의 프로모터를 들 수 있다. 많은 효모 클로닝 벡터가 설계되었으며, 용이하게 입수가능하다. 상기 벡터의 예로는 YIp5와 같은 YIp-기재 벡터, YRp17과 같은 YRp 벡터, YEp13과 같은 YEp 벡터 및 YCp19와 같은 YCp 벡터를 들 수 있다. 당업자는 효모 세포에서의 발현용으로 광범위하게 다양한 적합한 벡터가 있음을 이해할 것이다.
또한, 발현 벡터는 식물 원형질체, 무손상 식물 조직, 또는 단리된 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 일반적인 식물 조직의 배양 방법은, 예를 들어 문헌 [Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants," in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), pages 67-88 (CRC Press, 1993)]에 의해 제공된다.
발현 벡터는 인산칼슘 형질감염, 리포솜-매개 형질감염, 미소추진제-매개 전달, 전기천공 등을 비롯한 다양한 표준 기술을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 바람직하게는, 형질감염된 세포를 선별하고 증식시켜 숙주 세포 게놈에 안정적으로 통합된 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 벡터를 진핵 세포 내로 도입하는 기술 및 우세한 선택성 마커를 사용하여 이러한 안정한 형질감염체를 선별하는 기술은, 예를 들어 문헌 [Ausubel (1995) and Murray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991)]에 기재되어 있다. 발현 벡터를 박테리아, 효모, 곤충 및 식물 세포 내로 도입하는 방법은 또한 문헌 [Ausubel (1995)]에 의해 제공된다.
포유동물 세포 시스템에 의해 제조된 외부 단백질을 발현시키고 회수하는 일반적인 방법은, 예를 들어 문헌 [Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996)]에 의해 제공된다. 박테리아 시스템에 의해 제조된 단백질을 회수하는 표준 기술은, 예를 들어 문헌 [Grisshammer et al., "Purification of over-produced proteins from E. coli cells," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 59-92 (Oxford University Press 1995)]에 의해 제공된다. 바쿨로바이러스 시스템으로부터의 재조합 단백질을 단리하는 확립된 방법은 문헌 [Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc., 1995)]에 기재되어 있다.
보다 일반적으로, TGF-베타 결합-단백질은 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, HPLC 등과 같은 표준 기술에 의해 단리될 수 있다. TGF-베타 결합-단백질 단리 및 정제에 있어서 추가의 변형법이 당업자에 의해 고안될 수 있다. 예를 들어, 하기 기재한 바와 같이 수득된 항-TGF-베타 결합-단백질 항체를 사용하여 면역친화도 정제에 의해 대량의 단백질을 단리할 수 있다.
5. TGF-베타 결합-단백질에 대한 항체의 제조
본 발명은 본원에 상세히 기재한 바와 같은 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. TGF-베타 결합-단백질에 대한 항체는, 예를 들어 발현 벡터의 산물을 항원으로서 사용하여 수득될 수 있다. 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 본원에 제공된 스클레로스틴 폴리펩티드 서열 (서열 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 및 65) 중 임의의 하나로부터 유래된 펩티드를 사용함으로써 제조될 수 있다. 특히 유용한 항-TGF-베타 결합-단백질 항체는 서열 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 또는 65의 TGF-베타 결합-단백질과는 "특이적으로 결합"하지만, 댄, 세르베루스, SCGF, 또는 그렘린과 같은 다른 TGF-베타 결합-단백질에는 결합하지 않는다. 본 발명의 항체 (그의 단편 및 유도체 포함)는 폴리클로날 항체일 수 있거나, 특히 모노클로날 항체이다. 항체는 임의의 면역글로불린 부류에 속할 수 있으며, 예를 들어 IgG, (인간 항체용으로 당업계에 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로 알려진 IgG의 이소형 포함); IgE; IgM; 또는 IgA 항체일 수 있다. 항체는 가금류 또는 포유동물, 바람직하게는, 예를 들어 뮤린, 래트, 인간 또는 다른 영장류 항체로부터 수득될 수 있다. 원하는 경우, 항체는 내장(internalising) 항체일 수 있다.
재조합 TGF-베타 결합-단백질에 대한 폴리클로날 항체는 당업자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Green et al., "Production of Polyclonal Antisera, "in Immuraochemical Protocols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press 1992)]; [Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies, "in DNA Cloning 2: Exrpession Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 15 (Oxford University Press 1995)] 참조). 전형적으로 폴리클로날 항체는 래트, 마우스, 토끼, 염소 또는 양과 같은 동물에서 생성할 수 있지만, 본 발명의 항-TGF-베타 결합-단백질 항체는 또한 유인 영장류 항체로부터 유래될 수도 있다. 개코원숭이에서 진단적 및 치료적으로 유용한 항체를 생성하는 일반적인 기술은, 예를 들어 골든버그(Goldenberg) 등의 국제 특허 공개 제WO 91/11465호 (1991) 및 문헌 [Losman et al., Int . J. Cancer 46:310, 1990]에서 찾아볼 수 있다.
항체는 적어도 하나의 가변 영역 도메인을 포함해야 한다. 가변 영역 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성의 것일 수 있으며, 일반적으로 프레임워크 서열에 삽입되는 항원 결합을 담당하는 하나 이상의 초가변 아미노산 서열을 포함할 것이다. 일반적으로, 가변 (V) 영역 도메인이라는 용어는 임의의 적합한 배열의 면역글로불린 중쇄 (VH) 가변 도메인 및(또는) 경쇄 (VL) 가변 도메인일 수 있다. 즉, 예를 들어 V 영역 도메인은 단량체성이며 허용가능한 친화도를 갖는 항원에 독립적으로 결합할 수 있는 VH 또는 VL 도메인일 수 있다. 별법으로, V 영역 도메인은 이량체성이며, VH 및 VL 쇄가 비-공유 회합된 VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 이량체 (이하 Fv로 약칭함)를 함유할 수 있다. 그러나, 원하는 경우 쇄는, 예를 들어 2개의 가변 도메인 사이의 디술피드 결합을 통해 직접적으로, 또는, 예를 들어 펩티드 링커와 같은 링커를 통해 공유 커플링되어 단일쇄 도메인 (이하 scFv로 약칭함)을 형성할 수 있다.
가변 영역 도메인은 임의의 천연 발생 가변 도메인 또는 그의 유전자조작된 형태일 수 있다. 유전자조작된 형태는 재조합 DNA 유전자조작 기술을 사용하여 생성된 가변 영역 도메인을 의미한다. 이러한 유전자조작된 형태의 예로는, 예를 들어 천연 항체에서 아미노산 서열을 삽입, 결실 또는 변화시켜 천연 항체 가변 영역으로부터 생성한 것들을 들 수 있다. 이러한 유형의 특정 예로는 CDR 하나 이상 및 임의로 항체 하나로부터의 프레임워크 아미노산 하나 이상 및 제2 항체로부터의 가변 영역 도메인의 잔류부를 함유하는 유전자조작된 가변 영역 도메인을 들 수 있다.
가변 영역 도메인은 C-말단 아미노산에서 하나 이상의 다른 항체 도메인 또는 그의 단편에 공유 부착될 수 있다. 즉, 예를 들어 VH 도메인이 가변 영역 도메인에 존재할 경우, 이것은 면역글로불린 CH1 도메인 또는 그의 단편에 연결될 수 있다. 유사하게, VL 도메인은 CK 도메인 또는 그의 단편에 연결될 수 있다. 상기 방식에서, 예를 들어 항체는 항원 결합 도메인이 그들의 C-말단에서 CH1 및 CK 도메인에 각각 공유 연결된 회합된 VH 및 VL 도메인을 함유하는 Fab 단편일 수 있다. CH1 도메인은, 예를 들어 Fab' 단편에서 발견되는 바와 같은 힌지 영역 도메인을 제공하거나, 항체 CH2 및 CH3 도메인과 같은 추가의 도메인을 제공하기 위해 추가의 아미노산으로 연장될 수 있다.
항체 단편의 또다른 형태는 단일 상보성-결정 영역 (CDR)을 코딩하는 펩티드이다. CDR 펩티드 ("최소 인식 단위")는 관심의 항체의 CDR을 코딩하는 유전자를 구축함으로써 수득될 수 있다. 이러한 유전자는, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 항체-생산 세포의 RNA로부터 가변 영역을 합성함으로써 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991]; [Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995)]; 및 [Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)] 참조).
본 발명에 사용하는 항체는 일반적으로 (통상적인 면역화 및 세포 융합 절차에 의해 제조된) 모노클로날일 수 있거나, 단편의 경우는 환원 또는 효소 절단 및(또는) 소화(digestion) 기술 (예를 들어, 펩신 처리)과 같은 임의의 적합한 표준 화학을 사용함으로써 그로부터 유래될 수 있다. 보다 구체적으로, 모노클로날 항-TGF-베타 결합-단백질 항체는 다양한 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 특이적 항원에 대한 설치류 모노클로날 항체는 당업자에게 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495, 1975]; 및 [Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan"]]; [Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995)] 참조).
간략하게, 모노클로날 항체는 TGF-베타 결합-단백질 유전자 산물을 포함하는 조성물을 마우스에게 주사하고, 혈청 샘플을 제거하여 항체 생산의 존재를 확인하고, 비장을 제거하여 B-림프구를 수득하고, B-림프구와 골수종 세포를 융합시켜 하이브리도마를 생성하고, 하이브리도마를 클로닝하고, 항원에 대한 항체를 생산하는 양성 클론을 선별하고, 항원에 대한 항체를 생산하는 클론을 배양하고, 하이브리도마 배양물로부터 항체를 단리함으로써 수득될 수 있다.
또한, 본 발명의 항-TGF-베타 결합-단백질 항체는 인간 모노클로날 항체로부터 유래될 수 있다. 인간 모노클로날 항체는 항원 투여에 반응하여 특이적 인간 항체를 생산하기 위해 유전자조작된 트랜스제닉 마우스로부터 수득된다. 상기 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 좌위 요소는 내인성 중쇄 및 경쇄 좌위의 표적화된 파괴물을 함유하는 배아 줄기 세포주로부터 유래된 마우스의 균주 내로 도입된다. 트랜스제닉 마우스는 인간 항원에 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있으며, 마우스를 사용하여 인간 항체-분비 하이브리도마를 제조할 수 있다. 트랜스제닉 마우스로부터 인간 항체를 수득하는 방법은, 예를 들어 문헌 [Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994]; [Lonberg et al., Nature 368:856, 1994]; 및 [Taylor et al., Int . Immun . 6:579, 1994]에 기재되어 있다.
모노클로날 항체는 다양한 잘 확립된 기술에 의해 하이브리도마 배양물로부터 단리 및 정제될 수 있다. 이러한 단리 기술의 예로는 단백질-A 세파로스를 사용한 친화도 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피 및 이온-교환 크로마토그래피를 들 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Coligan at pages 2.7.1-2.7.12 and pages 2.9.1-2.9.3]; [Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)] 참조).
특정 용도를 위해, 항-TGF-베타 결합-단백질 항체 단편의 제조가 요망될 수 있다. 이러한 항체 단편은, 예를 들어 항체의 단백질 가수분해에 의해 수득될 수 있다. 항체 단편은 통상적인 방법에 의해 온전한 항체를 펩신 또는 파파인 소화시킴으로써 수득될 수 있다. 설명하자면, 항체 단편은 펩신을 사용해 항체를 효소 절단하여 5S 단편 표시된 F(ab')2를 제공함으로써 제조될 수 있다. 상기 단편을 티올 환원제를 사용하여 추가로 절단하여 3.5S Fab' 1가 단편을 제조할 수 있다. 임의로, 절단 반응은 디술피드 연결의 절단으로부터 초래되는 술프히드릴기에 대한 블록킹기를 사용하여 수행할 수 있다. 대안으로서, 펩신을 사용해 효소 절단하면 2개의 1가 Fab 단편 및 Fc 단편이 직접 생성된다. 상기 방법은, 예를 들어 골든버그의 미국 특허 제4,331,647호, 문헌 [Nisonoff et al., Arch Biochem . Biophys. 89:230, 1960], [Porter, Biochem. J. 73:119, 1959], [Edelman et al., in Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967)] 및 [Coligan at pages 2.8.1-2.8.10 and 2.10.-2.10.4]에 기재되어 있다.
또한, 단편이 무손상 항체에 의해 인식되는 항원에 결합하는 한, 중쇄를 분리하여 1가 경-중쇄 단편을 형성하는 것, 단편의 추가의 절단 또는 다른 효소적, 화학적 또는 유전학적 기술과 같은 다른 항체 절단 방법도 사용될 수 있다.
대안적으로, 항체는 항체 가변 및(또는) 불변 영역을 코딩하는 DNA의 조작 및 재발현에 관련된 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득된 재조합 또는 유전자조작된 항체일 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고(거나), 예를 들어 파지-항체 라이브러리를 비롯한 DNA 라이브러리로부터 용이하게 입수가능거나 (예를 들어, 문헌 [Chiswell, D J and McCafferty, J. Tibtech. 10 80-84 (1992)] 참조), 원하는 경우 합성할 수 있다. 표준 분자 생물학 및(또는) 화학 절차는, 예를 들어 코돈을 도입하여 시스테인 잔기를 생성하고, 원하는 경우 다른 아미노산 또는 도메인을 변형, 삽입 또는 결실시키기 위해 DNA를 서열화하고 조작하는데 사용될 수 있다.
가변 및(또는) 불변 영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 하나 이상의 복제가능한 발현 벡터를 제작하여 항체를 생산할 적절한 세포주, 예를 들어 마우스 NSO 세포주와 같은 비-생산 골수종 세포주 또는 이. 콜라이와 같은 박테리아에 형질전환시키는데 사용할 수 있다. 효과적인 전사 및 해독을 위해, 각각의 벡터 내의 DNA 서열은 적절한 조절 서열, 특히 가변 도메인 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 리더 서열을 포함해야 한다. 상기 방식으로 항체를 생산하는 특정 방법은 일반적으로 공지되어 있으며 통상적으로 사용된다. 예를 들어, 기본적인 분자 생물학 절차는 문헌 [Maniatis et al (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)]에 기재되어 있으며; DNA 서열화는 문헌 [Sanger et al, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 74:5463, (1977)] 및 [Amersham International plc sequencing handbook]에 기재한 바와 같이 수행될 수 있고, 부위 지정 돌연변이유발은 문헌 [Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12, 9441, (1984)]; [the Anglian Biotechnology Ltd handbook]; [Kunkel Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:488-92 (1985)]; [Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154:367-82 (1987)]에 기재된 바와 같은 방법에 따라 수행될 수 있다. 또한, 예를 들어 문헌 [Mountain A and Adair, J R in Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Chapter 1,1992, Intercept, Andover, UK)] 및 국제 특허 공개 제WO 91/09967호에서 검토된 바와 같은 수많은 간행물은 DNA의 조작, 발현 벡터의 생성 및 적절한 세포의 형질전환에 의한 항체의 제조를 상세히 설명하고 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 그에 부착된 하나 이상의 이펙터 또는 리포터 분자를 가질 수 있으며, 본 발명은 이러한 변형된 단백질에까지 확대된다. 리포터 분자는 효소, 세포독성제, 또는 염료, 방사성핵종, 발광성 기, 형광성 기 또는 바이오틴 등을 비롯한 다른 리포터 분자와 같은 검출가능한 잔기 또는 표지일 수 있다. TGF-베타 결합 단백질-특이적 면역글로불린 또는 그의 단편은 진단 또는 치료 용도로 방사성표지될 수 있다. 항체의 방사성표지 기술은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 [Adams 1998 In Vivo 12:11-21]; [Hiltunen 1993 Acta Oncol. 32:831-9]을 참조한다. 치료 용도는 하기에 보다 상세히 기재하며, TGF-베타 결합 단백질 특이적 항체 (또는 그의 단편)를 다른 치료제와 함께 사용하는 것을 포함한다. 이펙터 또는 리포터 분자는, 부착 또는 부착 방법이 분자의 결합 특성 및 유용성에 부작용을 주지 않는 한 임의의 이용가능한 아미노산 측쇄, 말단 아미노산, 또는 존재할 경우 항체에 위치한 탄수화물 관능기를 통해 항체에 부착될 수 있다. 특정 관능기의 예로는, 예를 들어 임의의 유리 아미노, 이미노, 티올, 히드록실, 카르복실 또는 알데히드기를 들 수 있다. 항체 및 이펙터 및(또는) 리포터 분자(들)의 부착은 이러한 기와 이펙터 또는 리포터 분자의 적절한 관능기를 통해 달성될 수 있다. 연결은 직접 연결이거나 이격 또는 다리기를 통한 간접 연결일 수 있다.
이펙터 분자의 예로는, 예를 들어 항신생물제, 톡신 (예를 들어, 박테리아 (예를 들어, 피. 에루기노사(P. aeruginosa) 또는 식물 기원의 효소 활성 톡신 엑소톡신 A) 및 그의 단편 (예를 들어, 리신 및 그의 단편; 식물 겔로닌, 브리오니아 디오이카(Bryonia dioica)로부터의 브리오닌 등), 예를 들어 문헌 [Thrush et al., 1996 Annu . Rev. Immunol. 14:49-71]; [Frankel et al., 1996 Cancer Res. 56:926-32] 참조; 생물학적 활성 단백질, 예를 들어 효소; 핵산 및 그의 단편, 예를 들어 DNA, RNA 및 그의 단편; 천연 발생 및 합성 중합체 (예를 들어, 다당류 및 폴리알킬렌 중합체, 예를 들어 폴리(에틸렌 글리콜) 및 그의 유도체); 방사성핵종, 특히 방사성요오드; 및 킬레이트화 금속을 들 수 있다. 적합한 리포터기의 예로는 킬레이트화 금속, 형광성 화합물, 또는 NMR 또는 ESR 분광법에 의해 검출될 수 있는 화합물을 들 수 있다. 특히 유용한 이펙터기는 칼리케미신 및 그의 유도체이다 (예를 들어, 남아프리카 공화국 특허 공개 제85/8794호, 제88/8127호 및 제90/2839호 참조).
화학치료제, 항-유사분열제, 항생제, 아팝토시스 유도제 (또는 "아팝토젠", 예를 들어 문헌 [Green and Reed, 1998, Science 281:1309-1312] 참조) 등을 비롯한 수많은 다른 톡신도 당업자에게 공지되어 있으며, 본원에 제공된 예는 본 발명의 범위 및 개념을 제한하는 것이라 설명하려는 의도이다. 특정 항신생물제의 예로는 세포독성제 및 세포활동억제제, 예를 들어 알킬화제, 예를 들어 질소 머스타드 (예를 들어 클로람부실, 멜팔란, 메클로레타민, 시클로포스파미드 또는 우리실 머스타드) 및 그의 유도체, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드, 부술판 또는 시스플라틴; 항대사물질, 예를 들어 메토트렉세이트, 플루오로우라실, 플록수리딘, 시타라빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 플루오로아세트산 또는 플루오로시트르산, 항생제, 예를 들어 블레오마이신 (예를 들어 블레오마이신 술페이트), 독소루비신, 다우노루비신, 미토마이신 (예를 들어 미토마이신 C), 악티노마이신 (예를 들어 닥티노마이신), 플리카마이신, 칼리케미신 및 그의 유도체, 또는 에스페라마신 및 그의 유도체; 유사분열 억제제, 예를 들어 에토포시드, 빈크리스틴 또는 빈블라스틴 및 그의 유도체; 알칼로이드, 예를 들어 엘립티신; 폴리올, 예를 들어 탁시신-I 또는 탁시신-II; 호르몬, 예를 들어 안드로겐 (예를 들어 드로모스타놀론 또는 테스토락톤), 프로게스틴 (예를 들어 메게스트롤 아세테이트 또는 메드록시프로게스테론 아세테이트), 에스트로겐 (예를 들어 디메틸스틸베스트롤 디포스페이트, 폴리에스트라디올 포스페이트 또는 에스트라무스틴 포스페이트) 또는 항에스트로겐 (예를 들어 타목시펜); 안트라퀴논, 예를 들어 미톡산트론, 우레아, 예를 들어 히드록시우레아; 히드라진, 예를 들어 프로카르바진; 또는 이미다졸, 예를 들어 다카르바진을 들 수 있다.
킬레이트화 금속의 예로는 배위수가 2 내지 8인 2+ 또는 3+ 금속을 들 수 있다. 이러한 금속의 특정 예로는 테크네튬 (Tc), 레늄 (Re), 코발트 (Co), 구리 (Cu), 금 (Au), 은 (Ag), 납 (Pb), 비스무스 (Bi), 인듐 (In), 갈륨 (Ga), 이트륨 (Y), 테르븀 (Tb), 가돌리늄 (Gd) 및 스칸듐 (Sc)을 들 수 있다. 일반적으로, 금속은 바람직하게는 방사성핵종이다. 특정 방사성핵종의 예로는 99 mTc, 186Re, 188Re, 58Co, 60Co, 67Cu, 195Au, 199Au, 110Ag, 203Pb, 206Bi, 207Bi, 111In, 67Ga, 68Ga, 88Y, 90Y, 160Tb, 153Gd 및 47Sc를 들 수 있다.
킬레이트화 금속은 예를 들어 임의의 적합한 여러자리 킬레이트제, 예를 들어 아시클릭 또는 시클릭 폴리아민, 폴리에테르 (예를 들어 크라운 에테르 및 그의 유도체); 폴리아미드; 포르피린; 및 카르보시클릭 유도체로 킬레이트화된 상기 종류의 금속 중 하나일 수 있다. 일반적으로, 킬레이트제의 종류는 사용하는 금속에 따라 다를 것이다. 그러나, 본 발명에 따른 콘쥬게이트에서 킬레이트제의 특히 유용한 한 가지 군은 아시클릭 및 시클릭 폴리아민, 특히 폴리아미노카르복실산, 예를 들어 디에틸렌트리아민펜타아세트산 및 그의 유도체, 및 마크로시클릭 아민, 예를 들어 시클릭 트리-아자 및 테트라-아자 유도체 (예를 들어 국제 특허 공개 제WO 92/22583호에 기재된 바와 같은 것) 및 폴리아미드, 특히 데스페리옥사민 및 그의 유도체를 포함한다.
항체의 티올기가 부착 지점으로 사용될 경우, 이는 이펙터 또는 리포터 분자에 존재하는 티올 반응성기와의 반응을 통해 달성될 수 있다. 이러한 기의 예로는 α-할로카르복실산 또는 에스테르, 예를 들어 요오도아세트아미드, 이미드, 예를 들어 말레이미드, 비닐 술폰 또는 디술피드를 들 수 있다. 이들 및 다른 적합한 연결 절차는 일반적으로 그리고 보다 구체적으로 국제 특허 공개 제WO 93/06231호, 제WO 92/22583호, 제WO 90/091195호 및 제WO 89/01476호에 기재되어 있다.
골 밀도를 증가시키는 분자 선택용 검정법
상기 논의한 바와 같이, 본 발명은 골 밀도를 증가시킬 수 있는 화합물의 선별 및(또는) 단리 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 한 측면에서, (a) 선택된 분자를 TGF-베타 결합 단백질 및 TGF-베타 족의 단백질의 선택된 구성원과 혼합하는 단계, 및 (b) 선택된 분자가, TGF-베타 족의 단백질에 의해 신호전달을 자극하는지 또는 TGF-베타 결합 단백질의 TGF-베타 족의 단백질의 하나 이상의 구성원에의 결합을 억제하는지 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 선택된 분자 (예를 들어 후보 작용제)가 골의 무기질 함량을 증가시킬 수 있는지 여부를 결정하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 분자는 간엽 세포 분화의 양성 조절인자로서 작용하는 TGF-베타의 능력을 상승시킨다.
본 발명의 다른 측면에서, (a) 선택된 분자를 TGF-베타 결합-단백질을 발현하는 세포에 노출 (접촉, 혼합, 결합)시키는 단계, 및 (b) 노출된 세포에서 TGF-베타 결합-단백질 발현 (또는 활성)이 감소되는지 또는 TGF-베타 결합-단백질 활성이 감소되는지 여부를 측정하는 단계, 및 이로부터 화합물이 골의 무기질 함량을 증가시킬 수 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 선택된 분자 (후보 작용제)가 골의 무기질 함량을 증가시킬 수 있는지 여부의 결정 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 세포는 골 생검으로부터의 자발적으로 형질전환되거나 비형질전환된 정상 인간 골 및 래트 두정 골 골모세포 이루어진 군에서 선택된다. TGF-베타 결합 단백질 발현 수준의 검출 방법은 당업계에 공지된 그리고 본원에 기재한 광범위하게 다양한 검정 형식으로 달성될 수 있다. 면역검정법은 TGF-베타 결합 단백질의 발현을 검출 및 정량하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어 역전류 면역-전기영동 (CEP), 방사성면역검정법, 방사성면역침전법, 효소-결합 면역-흡착 검정법 (ELISA), 면역블롯 검정법, 예를 들어 도트 블롯 검정법 및 웨스턴 블롯, 억제 또는 경쟁 검정법, 및 샌드위치 검정법을 들 수 있다 (예를 들어 미국 특허 제4,376,110호 및 제4,486,530호; 또한 상기 문헌 [Antibodies: A Laboratory Mannual] 참조). 이러한 면역검정법은 본원에 기재한 항-스클레로스틴 항체와 같은 TGF-베타 결합 단백질에 특이적인 항체를 사용할 수 있거나, TGF-베타 결합 단백질에 부착된 리포터 분자에 특이적인 항체를 사용할 수 있다. 폴리펩티드 발현 수준은 또한 TGF-베타 결합 단백질 리간드에 결합하는 TGF-베타 결합 단백질의 양을 정량함으로써 측정될 수 있다. 그 예로서, 샘플 중 스클레로스틴의 BMP에의 결합은 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 특이적 TGF-베타 결합 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 정량할 수도 있다.
이러한 검정법의 대표적인 실시양태는 하기 실시예 5 및 6에 제공된다. 간략하게, TGF-베타 거대족의 족 구성원 또는 TGF-베타 결합 단백질을 먼저 고체상에 결합시킨 후, 후보 분자를 첨가한다. 그 후, TGF-베타 거대족의 족 구성원 또는 TGF-베타 결합 단백질을 검정법에 첨가하고 (즉, 표지된 폴리펩티드는 어느쪽 폴리펩티드든지 고체상에 결합되는 리간드임), 고체상을 세척하고, 고상 지지체 상의 결합된 또는 표지된 TGF-베타 거대족 구성원 또는 TGF-베타 결합 단백질의 양을 측정한다. 본원에 기재한 바와 같은 골의 무기질 함량을 증가시키는데 사용하기에 적합한 분자는 TGF-베타 결합 단백질의 TGF-베타 거대족의 구성원 또는 구성원들에의 결합을 통계적으로 유의한 방식으로 증가시키는 분자이다. 명백하게, 본 발명에 사용하기에 적합한 검정법은 실시예 2 및 3에 기재한 실시양태에 제한되지 않는다. 특히, TGF-베타의 고체상에의 결합에 의해 또는 전적으로 고체상을 제거함으로써 수많은 파라미터를 변경할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, (a) 선택된 분자 (후보 작용제)를 TGF-베타를 발현하는 세포에 노출 (접촉, 혼합, 결합)시키는 단계, 및 (b) 상기 노출된 세포로부터의 TGF-베타의 활성이 변하는지 여부를 결정하고, 이로부터 상기 화합물이 골의 무기질 함량을 증가시키는지 여부 결정 단계를 포함하는, 선택된 분자가 골의 무기질 함량을 증가시킬 수 있는지 여부의 결정 방법이 제공된다. 본원에 기재한 방법과 유사한 광범위하게 다양한 방법이, 선택된 시험 화합물에 따른 TGF-베타 결합-단백질 발현의 변화를 평가하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 후보 작용제는 본원에 기재한 TGF-베타 결합 단백질 스클레로스틴에 결합하는 항체이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를, 항체 플러스 (+) SOST (항체/SOST) 복합체의 형성을 허용하는 조건하에서 충분한 시간 동안 본원에 기재한 펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는 SOST 펩티드와 접촉시킨 후, SOST/항체 복합체의 수준을 검출 (예를 들어 정량)하여 TGF-베타 신호전달 경로를 조절하는 항체의 존재를 결정하는 것을 포함하는, TGF-베타 신호전달 경로를 조절하는 항체의 확인 방법이 제공된다. 상기 방법은 SPR, 또는 ELISA, 면역블롯 등을 비롯한 당업계에 공지된 및 본원에 기재한 임의의 수많은 여러가지 면역검정법을 사용하여 수행될 수 있다. TGF-베타 신호전달 경로는 BMP가 세포 상의 제I형 및 제II형 수용체에 결합하여 골의 무기질 함량을 조절하는 경로를 자극하거나 유도하는 신호전달 경로를 포함한다. 본 발명의 특정 바람직한 실시양태에서, SOST에 특이적으로 결합하는 항체는 골의 무기질 함량을 증가시키는 경로를 자극하거나 상승시킨다. 이러한 항체는 항체의 SOST 특이적 펩티드에의 결합을 검출하는 본원에 기재한 방법을 사용하여 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 BMP가 결합하는 SOST 상의 영역 또는 영역의 일부에 위치한 SOST 펩티드, 예를 들어 SOST의 아미노 말단에 있는 펩티드 및 아미노 말단 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 및 SOST의 코어 영역 (도킹 코어)의 일부 (예를 들어, 서열 47 내지 64, 66 내지 73 및 92 내지 95)에 항체가 결합하는지 여부를 검출함으로써, BMP의 SOST 폴리펩티드에의 결합을 저해, 억제 (경쟁적 저해 포함) 또는 방지하는 항체를 확인하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 SOST 동종이량체의 형성을 저해, 방지 또는 억제하는 항체를 확인하는데 사용될 수 있다. SOST에 특이적으로 결합하는 이러한 항체는 SOST의 코어 또는 카르복시 말단 영역으로부터 유래된 펩티드 (예를 들어 서열 74 내지 91 및 96 내지 99)에의 항체의 결합을 검출함으로써 확인할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, (a) 선택된 분자 (후보 물질)를 TGF-베타-결합-단백질 및 선택된 TGF-베타 족 단백질의 구성원과 혼합하거나 접촉시키는 단계, (b) 선택된 분자가 TGF-베타 족 단백질의 신호전달을 상향조절하는지의 여부, 또는 TGF-베타 결합-단백질이 TGF-베타 족 단백질에 결합하는 것을 억제하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 선택된 분자가 뼈의 무기질 함량을 증가시킬 수 있는지의 여부를 결정하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 분자는 TGF-베타가 간엽 세포(mesenchymal cell)의 분화에 대한 양성 조절자로서 작용하는 능력을 상승시킨다.
상기 기재된 방법과 유사하게, 선택된 시험 화합물로 인한 TGF-베타의 자극을 평가하는 다양한 방법이 이용될 수 있다. 그러한 대표적인 방법 중 하나가 하기 실시예 6에 제공되어 있다 (또한, 문헌 [Durham et al., Endo. 136:1374-1380] 참조).
본 발명의 또다른 측면에서, 선택된 분자가 TGF-베타 결합-단백질의 뼈 또는 그의 유사물에 대한 결합을 억제하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 선택된 분자 (후보 물질)가 뼈의 무기질 함량을 증가시킬 수 있는지의 여부를 결정하는 방법이 제공된다. 본원에 사용되는 경우, 뼈 또는 그의 유사물은 수산화인회석, 또는 뼈, 파쇄된 뼈 또는 무손상 뼈의 분말화 형태로 구성된 표면을 지칭하는 것으로 이해해야 한다. 상기 기재된 방법과 유사하게, TGF-베타 결합-단백질이 뼈 매트릭스로 국재화(localization)되는 현상의 억제를 평가하는 다양한 방법이 이용될 수 있다. 그러한 대표적인 방법 중 하나가 하기 실시예 7에 제공되어 있다 (또한, 문헌 [Nicolas et al., Calcif. Tissue Int. 47:206-12 (1995)] 참조).
본 발명의 한 실시양태에서, 스클레로스틴(sclerostin) 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 TGF-베타 족의 구성원이 스클레로스틴 폴리펩티드에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제할 수 있다. TGF-베타 족 구성원 (예컨대, BMP)이 스클레로스틴에 결합하는 것을 저해하거나 차단하는 항체 또는 항체 단편의 능력은 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 결정될 수 있다. 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편은 스클레로스틴의 동종이량체 형성을 저해함으로써 TGF-베타 족 구성원이 스클레로스틴에 결합하는 것을 저해, 차단 또는 방지할 수 있다. 또한, 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체는, 스클레로스틴이 BMP에 결합하는 것을 억제하거나 저해함으로써 스클레로스틴의 활성을 확인하는데 사용될 수 있다. 별법으로, 항체 또는 그의 단편은 스클레로스틴이 정해진 활성을 갖는 세포-기초의 검정법 또는 동물 모델에 혼입되어, 항체가 상기 활성을 변경 (통계적으로 유의한 방식으로 증가 또는 감소)시키는지의 여부를 결정할 수 있다. 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편은 신호전달 경로에 있어서 상기 항체의 효과를 조사하는데 사용될 수 있고, 이로써 신호전달 경로를 조절 (자극 또는 억제)할 수 있다. 바람직하게는, 항체가 SOST에 결합하면 신호전달 경로를 자극 또는 유도하게 된다.
본원에 인용된 방법이 개별 시험 분자의 분석을 지칭할 수는 있지만, 본 발명이 이와 같이 제한되어서는 안된다. 특히, 선택된 분자는 화합물들의 혼합물 내에 함유될 수 있다. 따라서, 인용된 방법은 TGF-베타 결합-단백질의 TGF-베타 족 구성원에 대한 결합을 억제하는 분자를 단리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
후보 분자
다양한 분자들이 TGF-베타 결합-단백질의 TGF-베타 족 구성원에 대한 결합을 억제하는 그들의 능력에 대해 검정될 수 있다. 하기에 보다 상세하게 논의되는 대표적인 예로는 유기 분자 (예컨대, 유기 소분자), 단백질 또는 펩티드, 및 핵산 분자가 있다. 하기 논의로부터 본원에 기재된 후보 분자가 본원에 기재된 검정법에 사용될 수 있음이 명백하기는 하지만, 그러한 분자가 다양한 진단 및 치료 환경에도 사용될 수 있음이 매우 분명할 것이다.
1. 유기 분자
무수한 유기 소분자가 TGF-베타 결합-단백질의 TGF-베타 족 구성원에 대한 결합을 억제하는 그의 능력에 대해 검정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서는 적합한 유기 분자가 화학 라이브러리 (이 경우, 화학물질들이 개별적으로 검정됨) 또는 조합적 화학 라이브러리 (이 경우, 다수의 화합물이 한번에 검정된 후, 가장 활성이 높은 화합물을 결정하고 단리하기 위해 해리해석됨)로부터 선택될 수 있다.
이와 같은 조합적 화학 라이브러리의 대표적인 예로는 아그라피오티스(Agrafiotis) 등의 미국 특허 제5,463,564호 (발명의 명칭: System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties); 암스트롱, 알. 더블유(Armstrong, R. W.)의 WO 95/02566호 (발명의 명칭: Synthesis of combinatorial arrays of organic compounds through the use of multiple component combinatorial array syntheses); 볼드윈, 제이.제이.(Baldwin, J.J.) 등의 WO 95/24186호 (발명의 명칭: Sulfonamide derivatives and their use); 볼드윈, 제이.제이.(Baldwin, J.J.) 등의 WO 95/30642호 (발명의 명칭: Combinatorial dihydrobenzopyran library); 브레너, 에스.(Brenner, S.)의 WO 95/16918호 (발명의 명칭: New kit for preparing combinatorial libraries); 체네라, 비.(Chenera, B.) 등의 WO 95/16712호 (발명의 명칭: Preparation of library of resin-bound aromatic carbocyclic compounds); 엘만, 제이.에이.(Ellman, J.A.)의 미국 특허 제5,288,514호 (발명의 명칭: Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support); 펠더, 이.(Felder, E.) 등의 WO 95/16209호 (발명의 명칭: Novel combinatorial compound libraries); 레르너, 알.(Lerner, R.) 등의 WO 93/20242호 (발명의 명칭: Encoded combinatorial chemical libraries); 파비아, 엠.알.(Pavia, M.R.) 등의 WO 95/04277호 (발명의 명칭: A method for preparing and selecting pharmaceutically useful non-peptide compounds from a structurally diverse universal library); 서머톤, 제이.이.(Summerton, J. E.) 및 디.디. 웰러(D.D. Weller)의 미국 특허 제5,506,337호 (발명의 명칭: Morpholino-subunit combinatorial library and method); 홈즈, 씨.(Holmes, C.)의 WO 96/00148호 (발명의 명칭: Methods for the Solid Phase Synthesis of Thiazolidinones, Metathiazanones, and Derivatives thereof); 문헌 [Phillips, G.B. and G.P. Wei, "Solid-phase Synthesis of Benzimidazoles", Tet. Letters 37:4887-90, 1996]; 문헌 [Ruhland, B. et al., "Solid-supported Combinatorial Synthesis of Structurally Diverse β-Lactams", J. Amer. Chem. Soc. 111:253-4, 1996]; 문헌 [Look, G.C. et al., "The Indentification of Cyclooxygenase-1 Inhibitors from 4-Thiazolidinone Combinatorial Libraries", Bioorg and Med. Chem. Letters 6:707-12, 1996]에 기재된 것들이 있다.
2. 단백질 및 펩티드
다양한 단백질 및 펩티드가 TGF-베타 결합-단백질의 TGF-베타 족 구성원에 한 결합 억제제의 후보 분자로서 유사하게 사용될 수 있다.
a. 조합적 펩티드 라이브러리
TGF-베타 결합-단백질의 TGF-베타 족 구성원에 대한 결합 억제제로 추정되는 펩티드 분자가 조합적 펩티드 라이브러리의 스크리닝을 통해 수득될 수 있다. 그러한 라이브러리는 당업자에 의해 제조되거나 (예를 들어, 미국 특허 제4,528,266호 및 제4,359,535호, 및 특허 협력 조약 공개 WO 92/15679호, WO 92/15677호, WO 90/07862호 및 WO 90/02809호 참조), 또는 상업적으로 시판하는 공급업체로부터 구입 (예를 들어, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)에서 시판하는 Ph.D.(상표명) 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리 키트(Phage Display Peptide Library Kit))할 수 있다.
b. 항체
본 발명은 스클레로스틴 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 및 그러한 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 이들 항체를 생성하고 분석하는데 사용될 수 있는 스클레로스틴 폴리펩티드 면역원을 제공한다. 이 항체는 TGF-베타 결합 단백질인 스클레로스틴 폴리펩티드가 리간드 (특히, 뼈 형태발생 단백질)에 결합하는 것을 차단 또는 저해하는데 유용할 수 있으며, 또한 스클레로스틴 폴리펩티드가 1종 이상의 리간드에 결합하는 것을 차단 또는 저해할 수도 있다.
TGF-베타 결합 단백질이 1종 이상의 뼈 형태발생 단백질(BMP)을 비롯한 1종 이상의 TGF-베타 족 단백질 구성원에 결합하는 것을 억제하는 항체와 같은 소정의 분자는, 예를 들어 TGF-베타 족 구성원 또는 BMP의 활성화를 가능하게 하는 분자, 또는 TGF-베타 구성원이 TGF-결합-단백질에 결합하는 것을 제거 또는 방지함으로써 1종 이상의 BMP를 비롯한 TGF-베타 족 구성원의 각 수용체에 대한 결합을 가능하게 하는 분자를 지칭하는 것으로 이해해야 한다.
또한, 본 발명은 TGF-베타 결합 단백질인 스클레로스틴이 1종 이상의 BMP에 결합하는 것을 억제, 방지 또는 저해할 수 있는 항체 또는 그의 단편을 생성하고(하거나) 확인하는데 사용될 수 있는 펩티드 및 폴리펩티드 면역원을 제공한다. 또한, 본 발명은 스클레로스틴 동종이량체의 형성을 억제, 방지 또는 저해 (예를 들어, 통계적으로 유의한 방식으로 감소시킴)할 수 있는 항체 또는 그의 단편을 생성하고(하거나) 확인하는데 사용될 수 있는 펩티드 및 폴리펩티드 면역원을 제공한다. 본 발명의 항체는 뼈의 무기질 함량 및 무기질 밀도를 증가시킴으로써, 예를 들어 뼈의 무기질 함량의 손실을 초래하는 다수의 증상 (예컨대, 질환, 유전적 소양 포함), 뼈의 사용 결여를 초래하는 사고 (예컨대, 골절로 인해), 뼈의 재흡수에 영향을 미치거나 뼈 형성 세포를 사멸시키는 요법, 및 정상적인 노화 현상을 완화시키는데 유용하다.
또한, 스클레로스틴-특이적 항체의 면역화 및(또는) 분석에 유용한 폴리펩티드 또는 펩티드는, 숙주 동물에서 항원성 반응을 생성할 가능성이 더욱 높은 아미노산 서열을 결정하기 위해, 당업자에게 공지되어 있고 본원에 기재된 방법에 따라 TGF-베타 결합 단백질의 1차, 2차 및 3차 구조를 분석함으로써 선택할 수도 있다. 예를 들어, 문헌 [Novotny, Mol. Immunol. 28:201-207 (1991)] 및 [Berzofsky, Science 229:932-40 (1985)]을 참조할 수 있다. 모델링 및 x-선 결정학 데이타도 TGF-베타 결합 단백질의 어떤 부분 또는 영역이 BMP와 같은 TGF-베타 결합 단백질 리간드의 어떤 부분과 상호작용하는지 예측하고(하거나) 확인하는데 이용될 수 있다. TGF-베타 결합 단백질 펩티드 면역원은 상호작용의 부분 또는 영역 내의 아미노산 서열 또는 상호작용의 부분 또는 영역을 둘러싸고 있는 아미노산 서열을 포함하도록 디자인되고 제조될 수 있다. 이들 항체는 TGF-베타 결합 단백질의 동일한 리간드에 대한 결합을 차단하거나 저해하는데 유용할 수 있으며, 또한 TGF-베타 결합 단백질이 1종 이상의 다른 리간드에 결합하는 것을 차단하거나 저해할 수도 있다.
본 발명에 의해 고려되는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에는, 스클레로스틴에 특이적으로 결합하여 TGF-베타 폴리펩티드 (예컨대, BMP)가 스클레로스틴에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체가 포함된다. 예를 들어, 본 발명에 의해 고려되는 항체는 스클레로스틴 폴리펩티드가 BMP 상의 제I형 BMP 수용체 부위에 결합하는 것 또는 제II형 수용체 결합 부위에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하거나, 또는 스클레로스틴이 BMP 상의 제I형과 제II형 수용체 결합 부위 둘 다에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제할 수 있다. 이론에 얽매이려는 것은 아니지만, 항-스클레로스틴 항체가 BMP 폴리펩티드의 제I형 및(또는) 제II형 결합 부위의 스클레로스틴에 대한 결합을 경쟁적으로 억제함으로써 스클레로스틴의 길항 활성을 차단할 때, BMP 상의 수용체 결합 부위는 제I형 및 제II형 수용체에 대한 결합에 이용가능하며, 따라서 뼈의 무기질화를 증가시킨다. TGF-베타 결합 단백질 (예컨대, 스클레로스틴)과 TGF-베타 폴리펩티드 (예컨대, BMP) 사이의 결합 상호작용은 일반적으로 각각의 리간드 쌍이 동종이량체를 형성할 때 발생한다. 따라서, 스클레로스틴의 BMP에 대한 결합을 경쟁적으로 억제함으로써 스클레로스틴의 BMP에 대한 결합을 차단, 저해 또는 방지하는 스클레로스틴 특이적 항체를 사용하는 것 대신, 또는 이에 부가하여, 스클레로스틴 특이적 항체는 스클레로스틴 동종이량체 형성을 차단하거나 저해하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, BMP에 높은 친화도로 결합하는 능력을 지닌 BMP 길항제인 인간 노긴의 한 이량체 (침머만(Zimmerman) 등의 상기 문헌)가 인간 BMP-7의 한 이량체와 복합체를 형성한 채로 단리되었으며, 이를 다파장 변칙 회절(multiwavelength anomalous diffraction; MAD)에 의해 분석하였다 (문헌 [Groppe et al., Nature 420:636-42 (2002)]). 본원에 논의되는 바와 같이, 이 연구 결과 노긴 이량체가 BMP 이량체 상의 모든 수용체 결합 부위 (2개의 제I형 및 2개의 제II형 수용체 결합 부위)를 효율적으로 차단할 수 있음이 밝혀졌다. BMP-7과 접촉하는 노긴의 아미노산 위치는 다른 TGF-베타 결합 단백질 (예컨대, 스클레로스틴(SOST))과 BMP 사이의 상호작용을 모델링하는데 유용할 수 있으며, 따라서 그러한 상호작용을 차단하거나 저해하는 항체를 생성하는 면역원으로서 사용될 수 있는 펩티드의 디자인에 도움을 줄 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 뼈 형태발생 단백질(BMP) 상에 위치하는 BMP 제I형 수용체 결합 부위와 BMP 제II형 수용체 결합 부위 중 적어도 하나 또는 둘 다에 대한 SOST 폴리펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제한다. 이들 항체가 결합하는 SOST 상의 에피토프는 SOST 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는 인접 아미노산 서열들 (서열 46의 아미노산 위치 약 1 내지 56)을 포함하거나 이 서열들 내에 포함될 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드는 N-말단 영역을 코어 영역과 연결시키는 짧은 링커 펩티드 서열을 포함할 수 있으며, 그 예로는 서열 92 (인간) 및 서열 93 (래트)에 제공된 폴리펩티드가 있다. 인간 SOST (예컨대, 서열 46)의 더 짧은 대표적 N-말단 펩티드 서열에는 서열 47 내지 51이 포함되며, 대표적인 래트 SOST (예컨대, 서열 65) 펩티드 서열에는 서열 57 내지 60이 포함된다.
SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하여, 예를 들어 1종 이상의 제I형 및 제II형 수용체 결합 부위에 상응하는 BMP의 아미노산에 대한 결합을 차단하거나 억제함으로써, SOST 폴리펩티드의 BMP에 대한 결합을 차단하거나 경쟁적으로 억제하는 항체도 또한 SOST의 코어 영역에 상응하는 아미노산 서열 (서열 46의 아미노산 위치 약 57 내지 146)을 포함하는 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 코어 영역을 포함하는 폴리펩티드는 N-말단과 C-말단 중 어느 하나 또는 둘 다에서 연장되는 부가적인 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 폴리펩티드를 담체 분자에 접합시키는데 유용할 수 있는 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 인간 및 래트 SOST의 대표적인 코어 폴리펩티드는, 예를 들어 서열 94 및 서열 95에 각각 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 그러한 항체는 또한 더 짧은 폴리펩티드 서열에 결합할 수 있다. 대표적인 인간 SOST 코어 펩티드 서열은 서열 66 내지 69에 제공되며, 대표적인 래트 SOST 코어 서열은 서열 70 내지 73에 제공된다.
또다른 실시양태에서, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 SOST 동종이량체 형성을 저해 (억제, 방지 또는 차단, 예컨대 통계적으로 유의한 방식으로 감소시킴)한다. SOST와 BMP 사이의 상호작용은 SOST의 동종이량체 및 BMP의 동종이량체가 관여할 수 있기 때문에, SOST의 동종이량체 형성을 방지하거나 저해하는 항체는 이로써 뼈의 무기질 밀도를 변경시키고, 바람직하게는 뼈의 무기질 밀도를 증가시킨다. 한 실시양태에서, SOST의 코어 영역에 결합하는 항체는 동종이량체 형성을 방지한다. 또한, 그러한 항체는 코어 영역에 상응하는 인접 아미노산 서열 (예컨대, 서열 74, 75 및 98 (인간 SOST) 및 서열 76 및 99 (래트 SOST))을 포함하는 펩티드에 결합할 수도 있다. 또한, SOST 폴리펩티드의 C-말단 영역에 위치한 에피토프 (서열 46 또는 65 중 하나의 아미노산 위치 약 147 내지 190)에 결합하는 항체도 동종이량체 형성을 저해할 수 있다. 인간 및 래트 SOST의 대표적인 C-말단 폴리펩티드는, 예를 들어 서열 96 및 서열 97에 각각 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 그러한 항체는 또한 더 짧은 폴리펩티드 서열에 결합할 수 있다. 대표적인 인간 SOST C-말단 펩티드 서열은 서열 78 내지 81에 제공되며, 대표적인 래트 SOST C-말단 서열은 서열 86 내지 88에 제공된다.
항체가 특이적으로 결합할 수 있는 본원 개시의 SOST 폴리펩티드 및 펩티드는 면역원으로서 유용하다. 본 발명의 이들 면역원은 동물을 면역화시켜 체액성 면역 반응을 창출하는데 사용될 수 있으며, 이러한 면역 반응의 결과로, SOST의 N-말단 영역으로부터 유래한 펩티드를 포함하는 BMP에 위치한 제I형 또는 제II형 수용체 결합 부위 또는 제I형과 제II형 둘 다에 특이적으로 결합하거나, 또는 SOST 동종이량체 형성을 방지할 수 있는 항체가 생성된다.
또한, 면역원으로서 유용한 상기 SOST 폴리펩티드 및 펩티드는 항체를 함유하는 샘플, 예를 들어 정제된 항체, 항혈청 또는 세포 상층액의 샘플, 또는 SOST에 특이적인 1종 이상의 항체를 함유할 수 있는 임의의 다른 생물학적 샘플을 스크니링하는 방법에 사용될 수도 있다. 또한, 이들 펩티드는 생물학적 샘플로부터 SOST에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 1종 이상의 B 세포를 확인하고 선별하는 방법 (예를 들어, 플라크 형성 검정법 등)에 사용될 수도 있다. 이후에, 상기 B 세포는 당업계에 공지되고 본원에 기재된 재조합 분자생물학 기술에 의해 클로닝되고(되거나) 변형될 수 있는 SOST 특이적 항체-코딩 폴리뉴클레오티드의 공급원으로서 사용될 수도 있다.
본원에 사용된 "생물학적 샘플"은 특정 실시양태에서 SOST 폴리펩티드에 특이적인 1종 이상의 항체를 함유하는 샘플을 지칭하며, 생물학적 샘플은 혈액 샘플, 생검 표본, 조직 이식물, 기관 배양물, 또는 대상체 또는 생물학적 공급원으로부터 유래한 임의의 기타 조직 또는 세포 제제를 수득함으로써 제공될 수 있다. 추가로 샘플은, 예를 들어 절개, 분리, 가용화, 분획화, 균질화, 생물학적 또는 화학적 추출, 분쇄, 동결건조, 초음파 처리, 또는 대상체 또는 생물학적 공급원으로부터 유래한 샘플을 가공하기 위한 임의의 기타 수단에 의해 형태학적 일체성 또는 물리적 상태가 붕괴된 조직 또는 세포 제제를 지칭할 수 있다. 대상체 또는 생물학적 공급원은 인간 또는 비-인간 동물, 1차 세포 배양물 (예컨대, 시험관내에서 면역화된 B 세포), 또는 염색체에 통합되거나 에피좀 형태인 재조합 핵산 서열을 함유할 수 있는 유전공학적 처리 세포주, 무한증식 세포주 또는 무한증식이 가능한 세포주, 체세포 하이브리드 세포주, 분화 세포주 또는 분화 가능한 세포주, 형질전환 세포주 등을 비롯한 배양-적응 세포주일 수 있다.
또한, SOST 펩티드 면역원은, 그 전체가 SOST 폴리펩티드의 완전한 폴리펩티드 서열을 나타내고 각각이 다른 펩티드와 공통의 SOST 아미노산 서열 부분을 갖는 일련의 펩티드를 합성함으로써 제조될 수도 있다. 이러한 중첩 부분은 바람직하게는 4개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산일 것이다. 각각의 펩티드는 동물을 면역화시키는데 사용될 수 있고, 혈청을 상기 동물로부터 수집하고, 이것을 어떤 동물이 TGF-베타 단백질에 대한 SOST의 결합을 저해하거나 차단하는 항체를 생성하는지 확인하는 검정법에서 시험할 수 있다.
TGF-베타 결합-단백질이 TGF-베타 족 구성원에 결합하는 것을 억제하는 항체는 본원에 제공된 개시내용으로부터 용이하게 제조될 수 있다. 특히 유용한 것은, 서열 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 또는 65의 TGF-베타 결합-단백질에는 "특이적으로 결합"하지만, 댄, 세르베루스, SCGF 또는 그렘린과 같은 다른 TGF-베타 결합-단백질에는 특이적으로 결합하지 않는 항-TGF-베타 결합-단백질 항체이다. 본 발명에 있어서, 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단일쇄, 키메라, CDR-접합 면역글로불린, 항-유전자형 항체, 및 이들의 항체 단편 (예컨대, Fab, Fd, Fab' 및 F(ab')2, Fv 가변 영역, 또는 상보성 결정 영역)을 포함하는 것으로 이해된다. 상기 논의한 바와 같이, 항체는 107 M-1 이상 (바람직하게는, 108 M-1 이상)의 Ka로 결합하고, 다른 TGF-베타 결합-단백질에 결합하지 않거나 106 M-1 이하의 Ka로 결합하는 경우에, TGF-베타 결합-단백질에 대해 특이적이거나, 또는 특정 TGF-베타 족 구성원에 대해 특이적인 것으로 이해된다. 자신의 동족 항원에 대한 항체의 친화도는 보통 해리 상수인 KD로서도 표현되며, 항-SOST 항체는 약 10-5 M 이하, 보다 바람직하게는 약 10-6 M 이하, 보다 더 바람직하게는 10-7 M 이하, 보다 더 바람직하게는 10-8 M 이하의 KD로 결합하는 경우에, TGF-베타 족 구성원에 특이적으로 결합하는 것이다. 또한, 본 발명의 항체는 바람직하게는 TGF-베타 족 구성원에 대한 TGF-베타 결합-단백질의 결합을 차단, 저해 또는 억제 (예를 들어, 통계적으로 유의하게 감소시킴)한다. 모노클로날 항체 또는 결합 파트너의 친화도, 및 결합의 억제 정도는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다 (문헌 [Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660-672, 1949] 참조). 또한, 친화도는 표면 플라스몬 공명 (SPR; BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ)에 의해 결정될 수도 있다. 표면 플라스몬 공명의 경우, 표적 분자는 고체상에 고정되고, 유동중인 세포를 따라 이동하는 이동상 중의 리간드에 노출된다. 리간드가 고정된 표적 세포에 결합하면, 국부 굴절 지수가 변하여 SPR 각도의 변화를 초래하고, 이러한 변화는 반사광의 강도 변화를 검출함으로써 실시간으로 모니터링될 수 있다. SPR 신호의 변화율을 분석하면, 결합 반응의 결합상 및 해리상에 대한 겉보기 속도 상수를 산출할 수 있다. 이들 값의 비율은 겉보기 평형 상수 (친화도)를 제공한다 (예를 들어, 문헌 [Wolf et al., Cancer Res. 53:2560-65 (1993)] 참조).
본 발명에 따른 항체는 임의의 면역글로불린 부류, 예를 들어 IgG, IgE, IgM, IgD 또는 IgA에 속할 수 있으며, 또한 소정의 부류를 포함할 수 있는 하나 이상의 상이한 이소형 (예컨대, 인간 IgG 부류의 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4) 중 어느 것일 수도 있다. 이는 동물, 예를 들어 가금류 (예컨대, 닭) 및 포유류 (마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 기타 설치류, 소, 말, 양, 염소, 낙타, 인간 또는 기타 영장류를 포함하나, 이들로 한정되지는 않음)로부터 수득되거나 유래할 수 있다. 항체는 내부화 항체일 수도 있다.
당업계에 공지된 방법을 이용하여 항체, 폴리클로날 항혈청, 또는 SOST와 같은 TGF-베타 결합 단백질에 특이적인 모노클로날 항체를 생성할 수 있다. 또한, 항체는 원하는 특성을 갖도록 디자인된, 유전공학적으로 처리된 면역글로불린(Ig) 또는 Ig 단편으로서 생성될 수도 있다. 예를 들어, 항체는 제1 포유류 종으로부터 유래한 하나 이상의 가변 (V) 영역 도메인 및 제2의 다른 포유류 종으로부터 유래한 하나 이상의 불변 영역 도메인을 갖는 케메라 융합 단백질인 재조합 IgG를 포함할 수 있는데, 이는 단지 예시일 뿐, 본 발명을 제한하려는 것은 아니다. 가장 통상적으로, 키메라 항체는 쥐과동물 가변 영역 서열과 인간 불변 영역 서열을 갖는다. 이러한 쥐과동물/인간 키메라 면역글로불린은, 쥐과동물 항체로부터 유래하고, 항원에 대한 결합 특이성을 인간-유래의 V 영역 프레임워크 영역 및 인간-유래의 불변 영역에 부여하는 상보성 결정 영역 (CDR)을 접합시킴으로써 "인간화"될 수 있다. 이들 분자의 단편은 단백질 분해성 소화에 의해, 또는 임의로 단백질 분해성 소화에 이은 이황결합의 적당한 환원 및 알킬화에 의해 생성될 수 있다. 별법으로, 그러한 단편은 또한 재조합 유전공학 기술에 의해 생성될 수도 있다.
바람직한 특정 항체는 본원에 기재된 시험관내 검정법에서 TGF-베타 결합 단백질 활성을 억제하거나 차단하는 항체이다. TGF-베타 결합 단백질에 대한 항체의 결합 특성은 일반적으로 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA), 면역침전법, 면역블롯팅, 향류 면역전기영동법, 방사성면역검정법, 도트 블롯 검정법, 억제 또는 경쟁 검정법 등과 같은 방법을 비롯한 면역검출 방법을 이용하여 평가할 수 있으며, 상기 방법들은 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,376,110호 및 제4,486,530호; 문헌 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] 참조).
면역원은 TGF-베타 결합 단백질, 정제되거나 부분 정제된 TGF-베타 결합 폴리펩티드, 또는 이들의 변이체 또는 단편 (즉, 펩티드), 또는 TGF-베타 결합 단백질로부터 유래한 펩티드를 발현하는 세포로 구성될 수 있다. 이러한 펩티드는 더 큰 폴리펩티드의 단백질 분해성 절단에 의해, 또는 재조합 분자생물학 방법에 의해 생성될 수도 있으며, 또한 화학적으로 합성될 수도 있다. 예를 들어, TGF-베타 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 본원에 제공되어 있으며, 따라서 당업자는 면역원으로서 사용하기 위해 TGF-베타 결합 단백질을 일상적으로 제조할 수 있다. 펩티드는 본원에 기재되고 당업계에 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수도 있다. 별법으로, 펩티드는 TGF-베타 결합 단백질의 단백질 분해성 절단에 의해 생성될 수 있으며, 개별 펩티드는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 또는 임의 수의 액체 크로마토그래피 또는 기타 분리 방법과 같은 당업계 공지의 방법에 의해 단리될 수 있다. 면역원으로서 유용한 펩티드는 전형적으로 본원에 기재된 바와 같은 TGF-베타 결합 단백질의 아미노산 서열로부터 유래한 4개 또는 5개 이상의 아미노산으로 된 연속적인 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 바람직하게는 TGF-베타 결합 단백질의 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 14개, 15개, 16개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 연속적인 아미노산을 갖는다. 다른 바람직한 특정 펩티드 면역원은 TGF-베타 결합 단백질 서열의 6개 이상 12개 이하의 연속적인 아미노산을 포함하며, 다른 바람직한 펩티드 면역원은 SOST 폴리펩티드의 21개 이상 50개 이하의 연속적인 아미노산을 포함한다. 다른 바람직한 펩티드 면역원은 TGF-베타 결합 단백질 서열의 21개 내지 25개, 26개 내지 30개, 31개 내지 35개, 36개 내지 40개, 41개 내지 50개, 또는 21개 내지 100개 사이 (경계 포함)의 임의의 모든 정수 개수의 연속적인 아미노산, 및 100개 내지 190개 사이의 연속적인 아미노산을 포함한다.
본원에 개시된 폴리클로날 항체는 말, 소, 각종 가금류, 토끼, 마우스, 양, 염소, 비비(baboon) 또는 래트와 같은 각종 온혈 동물로부터 당업자에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 전형적으로, TGF-베타 결합-단백질 또는 본원에 기재된 13개 내지 20개 아미노산으로 된 그의 특유한 펩티드 단편 (바람직하게는, 글루타르알데히드를 사용하여 가교결합시킴으로써 키홀 림펫 헤모시아닌에 접함됨)은, 아주반트(adjuvant) (예컨대, 프로인트(Freund's) 완전 또는 불완전 아주반트, 또는 리비 아주반트 시스템(Ribi Adjuvant System; Corixa Corporation, Seattle, WA))와 함께 복막내, 근육내, 안구내, 피부내 또는 피하 주사를 통해 동물을 면역화시키는데 사용된다. 또한, 예를 들어 할로우(Harlow) 등의 상기 문헌을 참조할 수 있다. 일반적으로, 제1 주사 후에, 바람직한 스케줄에 따라 동물에게 1회 이상의 부스터(booster) 면역화를 제공하며, 이 경우 바람직한 스케줄은 특히 항원, 아주반트 (존재하는 경우) 및(또는) 특정 동물 종에 따라 달라질 수 있다. 면역 반응은, 동물에게서 주기적으로 채혈하고, ELISA 또는 오크텔로니(Ouchterlony) 확산 검정법 등과 같은 면역검정법으로 혈청을 제조 및 분석하여 특정 항체 역가를 결정함으로써 모니터링될 수 있다. 특히 바람직한 폴리클로날 항혈청은 ELISA와 같은 상기 검정법들 중 하나에서 검출 가능한 신호 (바람직하게는, 배경값보다 3배 이상 큰 신호)를 나타낼 것이다. 일단 동물의 역가가 단백질에 대한 반응성의 관점에서 정체 상태에 도달하면, 매주 채혈하거나 동물에게서 완전히 방혈시킴으로써 다량의 항혈청을 용이하게 수득할 수 있다.
이후에, TGF-베타 결합 단백질 또는 펩티드에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체는, 예를 들어 단백질 A를 사용한 친화도 크로마토그래피에 의해 상기 항혈청으로부터 정제될 수 있다. 별법으로, TGF-베타 결합 단백질 또는 펩티드, 또는 면역화된 특정 동물 종의 Ig 불변 영역에 특이적인 항체를 적합한 고형 지지체에 고정시켜 친화도 크로마토그래피를 수행할 수도 있다.
본 발명에 사용하기 위한 항체에는 본원에 기재하고 당업계에 공지된 통상적 면역화 및 세포 융합 방법에 의해 제조한 모노클로날 항체가 포함된다. 통상적 기술을 사용하여 모노클로날 항체를 용이하게 생산할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Kohler et al., Nature 256: 495, 1975; Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan"]]; 미국 특허 제RE 32,011호, 동 제4,902,614호, 동 제4,543,439호, 및 동 제4,411,993호를 참조함 (이들은 본원에 참고로 인용됨); 또한 문헌 [Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol (eds.), 1980, and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988]을 참조함, (이들도 본원에 참고로 인용됨); 문헌 [Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995)]을 참조함). 항체 단편은 그로부터 임의의 적합한 표준 기술, 예컨대 단백질분해 절단을 사용하거나, 또는 임의로, 단백질분해 절단 (예를 들어, 파파인 또는 펩신을 사용함), 이어서 디술피드 결합 및 알킬화의 가벼운 환원에 의해 유도될 수 있다. 달리, 이러한 단편은 재조합 유전학적 가공 기술에 의해 생산할 수도 있다.
간략하게는, 한 실시양태 내에서, 대상 동물, 예컨대 래트 또는 마우스 또는 햄스터를 TGF-베타 결합-단백질 또는 그의 영역 일부 (상기 기재한 영역 내의 펩티드도 포함함)로 면역화시킨다. 상기 단백질은 생성되는 면역 반응을 증가시키기 위해 아쥬반트, 예컨대 프로인트 완전 또는 불완전 아쥬반트 또는 리비(Ribi) 아쥬반트와 혼합할 수 있다. 초기 면역화 후 1 내지 3주 간에, 동물을 또다른 추가접종 면역화로 재면역화시키고, 본원에 기재된 검정으로 상기 단백질에 대한 반응성에 대해 시험할 수 있다. 주사된 단백질에 대한 동물의 반응성이 고원에 도달하면, 그를 도살시키고, 다수의 B 세포를 함유한 기관, 예컨대 비장 및 림프절을 수확한다. 수확한 비장 및(또는) 림프절 세포 현탁액은 모노클로날 항체를 분비하는 "하이브리도마"를 생산하기 위해 약물-증감화된 적합한 골수종 세포와 융합시킨다. 적합한 골수종 세포주는, 예를 들어, NS-0, SP20, NS-1 (ATCC 번호 TIB 18), 및 P3X63-Ag 8.653 (ATCC 번호 CRL1580)을 포함한다.
림프계 (예컨대, 비장) 세포 및 골수종 세포를 수분 동안 막 융합-촉진제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 비이온성 세제와 합하고, 이어서 하이브리도마 세포의 성장을 지원하지만 비융합된 골수종 세포는 지원하지 않는 선택 배지 상에서 저밀도로 플레이팅할 수 있다. 융합 후에, 세포를 적합한 배지, 예컨대 RPMI 1640, 또는 DMEM (둘베코(Dulbecco) 개질 이글(Eagles) 배지) (미국 켄자스 레넥사 소재의 JRH 바이오사이언스(Biosciences)), 뿐만 아니라 추가 성분, 예컨대 소 태아 혈청 (즉, 미국 유타주 로간 소재의 히클론(Hyclone) 또는 JRH 바이오사이언스로부터의 FBS)을 함유하는 배양 플레이트 내에 둘 수 있다. 추가로, 배지는 융합된 비장 및 골수종 세포의 성장을 선택적으로 허용하는 시약, 예컨대 HAT (히폭산틴, 아미노프테린, 및 티미딘) (미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마 케미칼 코포레이션(Sigma Chemical Co.))를 함유하여야 한다. 약 7일 후에, 생성된 융합 세포 또는 하이브리도마는 TGF-베타 결합-단백질 (사용한 항원에 따라 다름)과 반응성이고, TGF-베타 패밀리 구성원에 대한 TGF-베타 결합-단백질의 결합을 블로킹, 저해 또는 억제하는 항체의 존재를 측정하기 위해 스크리닝할 수 있다. 스클레로스틴 또는 그의 변이체에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마가 바람직하다.
광범위한 검정은 본 발명의 단백질에 대해 반응성인 항체의 존재를 측정하기 위해 사용할 수 있으며, 그에는, 예를 들어 대조 면역-전기영동, 방사능면역검정, 방사능면역침전, 효소-연결 면역-흡착 검정 (ELISA), 도트 블롯 검정, 웨스턴 블롯, 면역침전, 억제 또는 경쟁 검정, 및 샌드위치 검정 (미국 특허 제4,376,110호 및 동 제4,486,530호; 또한 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988] 참조)이 포함된다. 하이브리도마를, 예를 들어 제한 희석 클로닝 또는 연질 한천 플라크 단리에 의해 클로닝하고, 재검정하였다. 따라서, 목적 단백질에 대해 반응성인 항체를 생산하는 하이브리도마를 단리할 수 있다.
하이브리도마 배양물로부터의 모노클로날 항체를 하이브리도마 배양물의 상등액으로부터 단리할 수 있다. 뮤린 모노클로날 항체의 다른 생산 방법은 동계 마우스, 예를 들어, 모노클로날 항체를 함유한 복수액의 형성을 촉진하기 위해 처리된 (예컨대, 프리스테인-프라이밍된) 마우스의 복강에 하이브리도마 세포를 주사하는 것이다. 모노클로날 항체를 각종 잘 확립된 기술에 의해 단리 및 정제할 수 있다. 이러한 단리 기술에는 단백질-A 세파로스를 사용하는 친화성 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 및 이온-교환 크로마토그래피가 포함된다 (예를 들어, 문헌 [Coligan at pages 2.7.1-2.7.12 and pages 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)] 참조). 모노클로날 항체는 항체의 특정 특성 (예컨대, 중쇄 또는 경쇄 이소형, 결합 특이성 등)에 기초하여 선택한 적절한 리간드를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 고체 지지체에 고정화된 적합한 리간드의 예에는 단백질 A, 단백질 G, 항-불변 영역 (경쇄 또는 중쇄) 항체, 항-이디오타입 항체, 및 TGF-베타 결합 단백질, 또는 그의 단편 또는 변이체가 포함된다.
또한, 본 발명의 항-TGF-베타 결합-단백질 항체는 인간 모노클로날 항체일 수 있다. 인간 모노클로날 항체는 당업자에게 친숙할 임의의 수의 기술에 의해 생산할 수 있다. 이러한 방법에는 인간 말초 혈액 세포 (예컨대, B 림프구 함유)의 엡스타인 바르 바이러스 (Epstein Barr Virus; EBV) 형질전환, 인간 B 세포의 시험관내 면역화, 삽입된 인간 면역글로불린 유전자를 갖는 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터의 비장 세포의 융합, 인간 면역글로불린 V 영역 파지 라이브러리로부터의 단리, 또는 당업계에 공지되고 본원의 개시내용에 기초한 기타 과정이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 인간 모노클로날 항체는 항원성 항원투여에 대한 반응에서 특정 인간 항체를 생산하기 위해 가공된 트랜스제닉 마우스로부터 수득할 수 있다. 트랜스제닉 마우스로부터의 인간 항체의 수득 방법은, 예를 들어, 문헌 [Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg et al., Nature 368: 856, 1994; Taylor et al., Int. Immun. 6: 579, 1994; 미국 특허 제5,877,397호; Bruggemann et al., 1997 Curr. Opina. Biotechinol 8: 455-58; Jakobovits et al., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: 525-35]에 기재되어 있다. 이 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 좌위의 요소는 내인성 중쇄 및 경쇄 좌위의 표적 파괴를 함유한 배아 줄기 세포주로부터 유래된 마우스 종 내로 도입된다 (또한 문헌 [Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58 (1997)] 참조)., 예를 들어, 인간 면역글로불린 트랜스진은 마우스 림프계 조직에서 B 세포-특이적 DNA 재배열 및 과다돌연변이가 발생하는 미니-유전자 작제물, 또는 효모 인공 염색체 상의 전좌(translocus)일 수 있다. 인간 모노클로날 항체는 트랜스제닉 마우스를 면역화시킴으로써 수득하고, 이어서 상기 항원에 특이적인 인간 항체를 생산할 수 있다. 면역화된 트랜스제닉 마우스의 림프계 세포는 본원에 기재된 방법에 따라 인간 항체-분비 하이브리도마를 생산하기 위해 사용할 수 있다. 인간 항체를 함유한 폴리클로날 혈청은 면역화된 동물의 혈액으로부터 수득할 수도 있다.
인간 TGF-베타 결합 단백질 특이적 모노클로날 항체의 또다른 생산 방법에는 EBV 형질전환에 의한 인간 말초 혈액 세포의 불멸화가 포함된다 (예컨대, 미국 특허 제4,464,456호 참조). TGF-베타 결합 단백질 (또는 그의 변이체 또는 단편)에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 이러한 불멸화된 B 세포주 (또는 림프아구양 세포주)를 본원에 제공된 면역검출 방법, 예를 들어, ELISA에 의해 동정하고, 이어서 표준 클로닝 기술에 의해 단리할 수 있다. 항-TGF-베타 결합 단백질 항체를 생산하는 림프아구양 세포주의 안정성은 당업계에 공지된 방법에 따라 형질전환된 세포주를 뮤린 골수종과 융합시켜 마우스-인간 하이브리드 세포주를 생산함으로써 개선할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Glasky et al., Hybridoma 8: 377-89 (1989)] 참조). 인간 모노클로날 항체의 또다른 생산 방법은 인간 비장 B 세포를 항원으로 프라이밍시킨 후에, 프리이밍된 B 세포를 헤테로하이브리드 융합 파트너와 융합시키는 것을 포함하는 시험관내 면역화이다 (예컨대, 문헌 [Boerner et al., 1991 J. Immunol. 147: 86-95] 참조).
특정 실시양태에서, 당업계에 공지되고 (WO 92/02551; 미국 특허 제5,627,052호; 문헌 [Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-48 (1996)]) 본원에 기재된 분자 생물학 기술에 따라 항-SOST 항체를 생산하고 있는 B 세포를 선별하고, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 B 세포로부터 클로닝한다. 바람직하게는 면역화된 동물로부터의 B 세포는 SOST에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하고 있는 세포를 선별함으로써 비장, 림프절, 또는 말초 혈액 샘플로부터 단리된다. B 세포는 인간, 예를 들어, 말초 혈액 샘플로부터 단리될 수도 있다. 목적하는 특이성을 갖는 항체를 생산하는 단일 B 세포의 검출 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예에는 플라크 형성, 형광-활성화 세포 분류, 시험관내 자극후 특정 항체의 검출 등이 있다. B 세포를 생산하는 특정 항체의 선별 방법에는, 예를 들어 SOST 또는 그의 펩티드 단편을 함유하는 연질 한천 중에서의 B 세포의 단일 세포 현택액의 제조가 포함된다. B 세포에 의해 생산된 특정 항체가 항원에 결합하는 것은 면역침전물과 같이 가시화될 수 있는 복합체의 형성을 야기한다. 특정 항체를 생산하는 B 세포를 선별한 후에, 특정 항체 유전자는 당업계에 공지되고 본원에 기재된 방법에 따라 DNA 또는 mRNA를 단리하고 증폭시킴으로써 클로닝할 수 있다.
특정한 사용의 경우에, 항-TGF-베타 결합 단백질 항체의 단편이 바람직할 수 있다. 항체 단편, F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc, Fd는 전체 항체의 항원 결합 부위를 보유하여 동일한 에피토프에 결합한다. 항체로부터 유도된 이들 항원-결합 단편은, 예를 들어 항체의 단백질 가수분해, 예를 들어, 통상적 방법에 따라 전체 항체의 펩신 또는 파파인 절단에 의해 수득할 수 있다. 실례로서, 항체 단편은 펩신으로 항체를 효소 절단하여 F(ab')2로 나타내는 5S 단편을 제공함으로써 생산할 수 있다. 이 단편을 티올 환원제로 추가로 절단하여 3.5S Fab' 일가 단편을 생산할 수 있다. 임의로, 절단 반응은 디술피드 연결기의 절단으로부터 발생하는 술프히드릴기에 대한 블로킹기를 사용하여 수행될 수 있다. 별법으로서, 파파인을 사용하는 효소 절단은 2종의 일가 Fab 단편 및 1종의 Fc 단편을 직접적으로 생산한다. 이들 방법은, 예를 들어 골덴버그(Goldenberg)의 미국 특허 제4,331,647호, 문헌 [Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230, 1960; Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959; Edelman et al., in Methods in Enzymology 1: 422 (Academic Press 1967)]; 및 문헌 [Coligan at pages 2.8.1-2.8.10 and 2.10.-2.10.4]에 기재되어 있다. 항체 절단에 대한 다른 방법, 예컨대 중쇄를 분리하여 일가 경쇄-중쇄 단편 (Fd)을 형성하는 방법, 단편의 추가 절단 방법, 또는 다른 효소적, 화학적 또는 유전학적 기술도 단편이 무손상 항체에 의해 인식되는 항원에 결합하는 한 사용할 수 있다.
항체 단편은 특정 항원에 결합하여 복합체를 형성하는 항체와 같이 작용하는 임의의 합성 또는 유전학적 가공 단백질일 수도 있다. 예를 들어, 항체 단편에는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 단리된 단편, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 이루어진 "Fv" 단편, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단일 쇄 폴리펩티드 분자 (scFv 단백질), 및 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위가 포함된다. 본 발명의 항체는 바람직하게는 하나 이상의 가변 영역 도메인을 포함한다. 가변 영역 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성일 수 있고, 항원 결합을 담당하고, 하나 이상의 프레임워크 서열을 갖는 프레임에 또는 그 중에 인접한 하나 이상의 초가변 아미노산 서열을 일반적으로 포함할 것이다. 일반적으로, 가변 (V) 영역 도메인은 면역글로불린 중쇄 (VH) 및(또는) 경쇄 (VL) 가변 도메인의 임의의 적합한 배열일 수 있다. 따라서, 예를 들어, V 영역 도메인은 허용가능한 친화도로 항원과 독립적으로 결합할 수 있는 단량체이고, VH 또는 VL 도메인일 수 있다. 달리, V 영역 도메인은 이량체이고, VH-VH, VH-VL, 또는 VL-VL 이량체를 함유할 수 있다. 바람직하게는, V 영역 이량체는 비공유적으로 결합된 하나 이상의 VH 및 하나 이상의 VL 쇄를 포함한다 (이하, Fv로 칭함). 필요에 따라, 쇄는 직접적으로, 예를 들어 2개의 가변 도메인 간의 디술피드 결합을 통해, 또는 링커, 예를 들어 펩티드 링커를 통해 공유결합적으로 커플링되어 단일 쇄 Fv(scFv)를 형성할 수 있다.
가변 영역 도메인은 임의의 자연 발생 가변 도메인 또는 그의 가공 형태일 수 있다. 가공 형태는 재조합 DNA 가공 기술을 사용하여 생산한 가변 영역 도메인을 의미한다. 이러한 가공 형태에는, 예를 들어 특이적 항체 가변 영역으로부터 특이적 항체의 아미노산 서열 중에 또는 그에 대한 삽입, 결실 또는 또는 변화에 의해 생산한 것이 포함된다. 특정 예에는 제1 항체로부터의 하나 이상의 CDR 및 임의로 하나 이상의 프레임워크 아미노산을 함유하는 가공 가변 영역 도메인 및 제2 항체로부터의 가변 영역 도메인의 나머지가 포함된다.
가변 영역 도메인은 C-말단 아미노산에서 하나 이상의 다른 항체 도메인 또는 그의 단편에 공유결합적으로 부착될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 가변 영역 도메인에 존재하는 VH 도메인은 면역글로불린 CH1 도메인, 또는 그의 단편에 연결될 수 있다. 유사하게는, VL 도메인은 CK 도메인 또는 그의 단편에 연결될 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 항체는 Fab 단편일 수 있으며, 여기서 항원 결합 도메인은 C-말단에서 CH1 및 CK 도메인에 각각 공유결합적으로 연결된, 결합된 VH 및 VL 도메인을 함유한다. CH1 도메인은 추가 아미노산으로 연장되어, 예를 들어 Fab' 단편에서 발견되는 바와 같이 힌지 영역 또는 힌지 영역 도메인의 일부, 또는 추가 도메인, 예컨대 항체 CH2 및 CH3 도메인을 제공할 수 있다.
항체 단편의 또다른 형태는 단일 상보성-결정 영역 (CDR)을 포함하는 펩티드이다. CDR 펩티드 ("최소 인식 단위")는 목적 항체의 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 작제함으로써 수득될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 항체-생산 세포의 mRNA를 주형으로서 사용하여 가변 영역을 합성하기 위해 중합효소 연쇄 반응을 사용함으로써 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995); and Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)] 참조)
달리, 항체는 항체 가변 및(또는) 불변 영역 코딩 DNA의 조작 및 재-발현을 포함하는 재조합 DNA 기술의 사용에 의해 수득된 재조합 또는 가공된 항체일 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고(거나), 예를 들어 파지-항체 라이브러리를 포함하는 DNA 라이브러리로부터 용이하게 입수할 수 있거나 (문헌 [Chiswell and McCafferty, Tibtech. 10: 80-84 (1992)] 참조) 또는 필요에 따라 합성할 수 있다. 표준 분자 생물학 및(또는) 화학 방법을 사용하여 DNA를 서열 분석 및 조작, 예를 들어, 시스테인 잔기를 생성하는 코돈을 도입하거나, 또는 목적하는 다른 아미노산 또는 도메인을 변형, 첨가 또는 결실시킬 수 있다.
TGF-베타 결합 단백질에 특이적이고, 인간화된 항체를 포함하는 키메라 항체는 본 발명에 따라 생산할 수도 있다. 키메라 항체는 제1 포유동물 종으로부터 유래된 하나 이상의 불변 영역 도메인 및 제2 별개 포유동물 종으로부터 유래된 하나 이상의 가변 영역 도메인을 가진다 (예컨대, 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-55 (1984)] 참조). 바람직한 실시양태에서, 키메라 항체는 비-인간 모노클로날 항체로부터 유래된 하나 이상의 가변 영역 도메인, 예컨대 뮤린, 래트, 또는 햄스터 모노클로날 항체로부터 유래된 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을, 하나 이상의 인간 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터 내로 클로닝함으로써 작제할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Shin et al., Methods Enzymol. 178: 459-76(1989); Walls et al., Nucleic Acids Res. 21: 2921-29 (1993)] 참조). 예로서, 뮤린 모노클로날 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 카파 경쇄 불변 영역 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터 내로 삽입할 수 있다. 별개의 벡터에서, 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 IgG 불변 영역, 예를 들어, 인간 IgG1 불변 영역을 코팅하는 서열을 갖는 플레임에 클로닝될 수 있다. 선택된 특정 인간 불변 영역은 특정 항체에 요구되는 이펙터 기능 (예컨대, 상보체 고정, 특정 Fc 수용체에 대한 결합 등)에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는, 작제된 벡터로 키메라 항체의 안정한 발현을 위해 진핵 세포 내로 형질감염시킬 것이다. 키메라 항체 생산을 위한 당업계에 공지된 또다른 방법은 상동 재조합이다 (예컨대, 미국 특허 제5,482,856호).
비-인간/인간 키메라 항체는 "인간화된" 항체를 생산하기 위해 추가로 유전학적으로 가공할 수 있다. 이러한 인간화된 항체는 비-인간 포유동물 종의 면역글로불린, 하나 이상의 인간 가변 프레임워크 영역, 및 하나 이상의 인간 면역글로불린 불변 영역으로부터 유래된 다수의 CDR을 포함할 수 있다. 인간화된 항체를 디자인하기에 유용한 방법에는, 예를 들어 키메라 항체의 비-인간 프레임워크 영역에 가장 상동성인 인간 가변 프레임워크 영역의 동정 (이는 설명하기 위한 것이지 이에 제한되지 않음)이 포함된다. 이론에 얽매임 없이, 이러한 방법은 인간화된 항체가 TGF-베타 결합 단백질에 대한 특이적 결합 친화도를 보유할 가능성을 증가시킬 수 있는데, 이는 일부 바람직한 실시양태에서는 TGF-베타 결합 단백질, 또는 그의 변이체 또는 단편에 대해 실질적으로 동일한 친화도일 수 있고, 특정 다른 바람직한 실시양태에서는 TGF-베타 결합 단백질에 대해 더 큰 친화도일 수 있다 (예컨대, 문헌 [Jones et al., 1986 Nature 321: 522-25; Riechmann et al., 1988 Nature 332: 323-27] 참조). 따라서, 이러한 인간화된 항체의 디자인은, 예를 들어 컴퓨터 모델링에 의한 CDR 루프 형태 및 비-인간 가변 영역의 구조적 결정자를 측정하고, 이어서 CDR 루프 및 결정자를 공지된 인간 CDR 루프 구조 및 결정자와 비교하는 것을 포함할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Padlan et al., 1995 FASEB 9: 133-39; Chothia et al., 1989 Nature, 342: 377-383] 참조). 컴퓨터 모델링은 비-인간 가변 영역과의 서열 상동성에 의해 선택된 인간 구조 주형을 비교하기 위해 사용할 수도 있다 (예컨대, 문헌 [Bajorath et al., 1995 Ther. Immunol. 2:95-103]; EP-0578515-A3 참조). 비-인간 CDR의 인간화가 결합 친화도를 감소시키는 경우에, 컴퓨터 모데링은 부분적으로, 완전히 또는 초-적합적으로 친화도를 회복시키기 위해 (즉, 비-인간화된 항체보다 더 큰 수준으로 증가시키기 위해) 부위-지정 또는 다른 돌연변이유발 기술에 의해 변화될 수 있는 특정 아미노산 잔기의 동정에 도움될 수 있다. 당업자는 이들 기술에 친숙하고, 이러한 디자인 방법에 대한 다수의 변형 및 변화를 용이하게 인식할 것이다.
인간화된 항체를 제조하기 위한 이러한 한 방법을 베니어링(veneering)이라 칭한다. 본원에 사용하는 바와 같이, 용어 "베니어링된 FR" 및 "재조합적으로 베니어링된 FR"은 실질적으로 모든 천연 FR 폴리펩티드 폴딩 구조를 보유하는 항원-결합 부위를 포함하는 이종발생 분자를 제공하기 위해 예컨대, 설치류 중쇄 또는 경쇄 V 영역으로부터의 FR 잔기를 인간 FR 잔기로 선택적으로 치환하는 것을 나타낸다. 베니어링 기술은 항원-결합 부위의 리간드 결합 특성이 항원-결합 표면 내의 중쇄 및 경쇄 CDR 세트의 구조 및 상대적 경향에 의해 우선적으로 결정된다는 이해에 기초한다 (문헌 [Davies et al., Ann. Rev. Biochem. 59: 439-73, 1990]). 따라서, 항원 결합 특이성은 단지 CDR 구조, 서로 간의 그의 상호작용, 및 V 영역 도메인의 나머지와의 그의 상호작용이 조심스럽게 유지되는 인간화된 항체에서만 보존될 수 있다. 베니어링 기술을 사용함으로써, 면역계에 의해 용이하게 조우되는 외부 (예컨대, 용매-접근가능함) FR 잔기는 약하게 면역원성, 또는 실질적으로 비-면역원성 베니어링된 표면을 포함하는 하이브리드 분자를 제공하기 위해 인간 잔기로 선택적으로 치환된다.
베니어링 프로세스는 인간 항체 가변 도메인에 대한 사용가능한 서열 데이타의 용도를 만들고, 이는 카바트 등(문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1987])에 의해 편집되고, 카바트 데이타베이스, 및 다른 접근가능한 미국 및 해외 데이타베이스 (핵산 및 단백질 모두)에 갱신된다. V 영역 아미노산의 용매 접근성은 인간 및 뮤린 항체 단편에 대한 공지된 3차원 구조로부터 추론될 수 있다. 먼저, 목적 항체 분자의 가변 도메인의 FR은 상기 확인된 공급원으로부터 수득된 인간 가변 도메인의 상응하는 FR 서열과 비교한다. 가장 상동성인 인간 V 영역은 이어서 상응하는 뮤린 아미노산에 잔기 대 잔기로 비교한다. 인간 대응체와 상이한 뮤린 FR 중의 잔기는 당업계에 잘 공지된 재조합 기술을 사용하여 인간 부분에 존재하는 잔기에 의해 치환된다. 잔기 스위칭(switching)은 적어도 부분적으로 노출되고 (용매 접근성), V 영역 도메인의 3차 구조에 유의한 영향을 가질 수 있는 아미노산 잔기, 예컨대 프롤린, 글리신, 및 하전된 아미노산의 치환에 보호되는 부분으로 단지 수행된다.
따라서, 이러한 방식으로, 생성된 "베니어링된" 항원-결합 부위는 설치류 CDR 잔기, CDR에 실질적으로 인접한 잔기, 매립 또는 주로 매립된 것으로 확인된 잔기 (용매 비접근성), 중쇄 및 경쇄 도메인 간의 비-공유결합 (예컨대, 정전 및 소수성) 접촉에 참여되는 것으로 여겨지는 잔기, 및 CDR 루프의 "정준" 3차 구조에 영향을 미치는 것으로 여겨지는 FR의 보존된 구조적 영역으로부터의 잔기를 보유하도록 디자인한다. 이들 디자인 표준은 항원-결합 부위의 중쇄 및 경쇄 모두의 CDR을, 설치류 항체 분자의 항원 특이성을 나타내는 재조합 인간 항체의 발현을 위해 포유동물 세포의 형질감염에 사용될 수 있는 인간-출현 FR 내로 합한 재조합 뉴클레오티드 서열의 제조에 이어서 사용된다.
TGF-베타 결합 단백질, 또는 그의 변이체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 항체의 추가 선별 방법은 파지 디스플레이이다 (예컨대, 문헌 [Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12: 433-55; Burton et al., 1994 Adv. Immunol. 57: 191-280] 참조). 인간 또는 뮤린 면역글로불린 가변 영역 유전자 조합 라이브러리는 TGF-베타 결합 단백질, 또는 그의 변이체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 Ig 단편 (Fab, Fv, sFv, 또는 이들의 다합체)을 선별하기 위해 스크리닝될 수 있는 파지 벡터로 생산할 수 있다 (예컨대, 미국 특허 제5,223,409호; 문헌 [William D. Huse et al., "Generation of a Large Combinational Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda, "Science 246: 1275-1281, December 1989]; 또한 문헌 [L. Sastry et al., "Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5728-5732, August 1989] 참조; 또한 문헌 [Michelle Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas, "Strategies in Molecular Biology 3: 1-9, January 1990; Kang et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4363-66; Hoogenboom et al., 1992 J. Molec. Biol. 227: 381-388; Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16: 47-52] 및 그에 인용된 참조문헌 참조). 시판 시스템은 재조합 기술을 통해 항체를 생산할 수 있는 스트라타진(Stratagene) (미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)으로부터 입수가능하다. 간략하게는, mRNA는 B 세포군으로부터 단리하고, λImmunoZap(H) 및 λImmunoZap(L) 벡터 중의 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 cDNA 발현 라이브러리를 생산하기 위해 사용한다. 양성 플라크는 이. 콜라이로부터 모노클로날 항체 단편의 고수준 발현을 허용하는 비-용해성 플라스미드로 차후에 전환될 수 있다. 달리, Ig 가변 영역 단편을 코딩하는 다수의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 라이브러리는 파지 코트 단백질을 코딩하는 서열을 갖는 프레임으로 사상 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 그의 변이체의 게놈 내로 삽입될 수 있다. 융합 단백질은 경쇄 가변 영역 도메인 및(또는) 중쇄 가변 영역 도메인을 갖는 코트 단백질의 융합물일 수 있다. 특정 실시양태에 따라, 면역글로불린 Fab 단편은 파지 입자 상에 디스플레이될 수도 있다 (예컨대, 미국 특허 제5,698,426호 참조). 이들 벡터를 개별적으로 스크리닝하거나 또는 공-발현시켜 Fab 단편 또는 항체를 형성할 수 있다 (문헌 [Huse et al., 상기문헌] 참조; 또한 문헌 [Sastry et al., 상기문헌] 참조).
유사하게는, 항체의 부분 또는 단편, 예컨대 Fab 및 Fv 단편은 또한 통상적인 효소 절단 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제함으로써 특이적 결합 항체를 코딩하는 유전자의 가변 영역을 통합할 수 있다. 한 실시양태 내에서, 목적 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터의 가변 영역을 코딩하는 유전자는 가변 영역에 대한 뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭한다. 이들 프라이머는 당업자에 의해 합성할 수 있거나 또는 상업적으로 입수가능한 공급원으로부터 구입할 수 있다. 스트라타진 (미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)은 마우스 및 인간 가변 영역에 대한 프라이머 (그 중에서도 VHa, VHb, VHc, VHd, CH1, VL 및 CL 영역에 대한 프라이머를 포함함)를 판매한다. 이들 프라이머는 차후에 벡터, 예컨대 ImmunoZAP (상표명) 또는 ImmunoZAP (상표명) (스트라타진) 내로 각각 삽입될 수 있는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 증폭하기 위해 사용할 수 있다. 이들 벡터는 이어서 발현을 위해 이. 콜라이, 효모, 또는 포유동물-기재 시스템 내로 도입될 수 있다. 이들 기술을 사용하며, VH 및 VL 도메인의 융합을 함유한 대량의 단일쇄 단백질을 생산할 수 있다 (문헌 [Bird et al., Science 242: 423-426, 1988] 참조). 또한, 이러한 기술은 항체의 결합 특이성의 변경 없이 "뮤린" 항체에서 "인간" 항체로 변화시키기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 조합 파지 라이브러리는 비-인간 가변 영역의 인간화를 위해 사용할 수도 있다 (예컨대 문헌 [Rosok et al., 1996 J. Biol. Chem. 271: 22611-18; Rader et al., 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-15] 참조). 파지 라이브러리는 당업계에 공지되고 본원에 기재된 면역검출 방법에 의해 목적하는 Ig 가변 영역 단편을 선별하기 위해 스크리닝할 수 있고, 선별된 파지 중의 삽입된 면역글로불린 유전자의 DNA 서열은 표준 기술에 의해 결정될 수 있다 (문헌 [Sambrook et al., 2001 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조). 선별된 Ig-코딩 서열은 Ig 단편의 발현을 위해 또다른 적합한 벡터 내로 이어서 클로닝할 수 있거나 또는 임의로, 전체 면역글로불린 쇄의 Ig 발현을 위해 불변 영역을 함유한 벡터 내로 클로닝할 수 있다.
특정 다른 실시양태에서, 본 발명은 다중결합의 항체 단편인 SOST-특이적 항체를 고려한다. 유용한 방법론은 일반적으로, 예를 들어, 문헌 [Hayden et al., 1997, Curr Opin. Immunol. 9:201-12] 및 문헌 [Coloma et al., 1997, Nat. Biotechnol. 15:159-63]에 개시되어 있다. 예를 들어, 다중결합의 항체 단편은 미니항체(miniantibody) (미국 특허 제5,910,573호) 또는 디아바디(diabody) (문헌 [Holliger et al., 1997, Cancer Immunol. Immunother. 45:128-130])를 형성하기 위한 파지 기술에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, SOST에 대해 특이적인 항체는 세포내 단백질로서 발현되는 항체일 수 있다. 이러한 세포내 항체는 인트라바디(intrabody)라고도 불리며 Fab 단편을 포함할 수 있거나, 또는 바람직하게는 scFv 단편을 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Lecerf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:4764-49 (2001)] 참조). CDR 영역이 플랭킹된 프레임워크 영역을 변형시켜 세포내 환원성 환경에서의 발현 수준 및 인트라바디의 용해도를 향상시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Worn et al., J. Biol. Chem. 275:2795-803 (2000)] 참조). 인트라바디는, 예를 들어, 세포 내에서 특정한 표적 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 융합될 수 있는 인트라바디의 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 구축함으로써 특정한 세포 위치 또는 소기관으로 인도될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Graus-Porta et al., Mol. Cell Biol. 15:1182-91 (1995)] 및 문헌 [Lener et al., Eur. J. Biochem. 267:1196-205 (2000)] 참조). 인트라바디는 유전자 요법 벡터, 또는 지질 혼합물 (예를 들어, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재의 임제넥스 코포레이션(Imgenex Corporation)에 의해 제조된 프로벡틴(Provectin, 상표명)을 통해, 또는 광화학적 내재화 방법에 따른 기술을 비롯하여, 당업자가 이용가능한 여러 기술에 의해 세포에 도입될 수 있다.
아미노산 돌연변이를 TGF-베타 결합 단백질에 대해 특이적인 면역글로불린 분자에 도입하는 것은 TGF-베타 결합 단백질에 대한 특이성 또는 친화성을 증가시키거나 또는 이펙터 기능을 변경하는 데 유용할 수 있다. TGF-베타 결합 단백질에 대해 높은 친화성을 갖는 면역글로불린은 특정 잔기의 부위 지정 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. TGF-베타 결합 단백질에 대한 친화성을 향상시키기 위해, 컴퓨터 기반의 3차원 분자 모델링을 사용하여 변화시킬 아미노산 잔기를 확인할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Mountain et al., 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10: 1-142] 참조). 별법으로, CDR의 조합 라이브러리를 M13 파지에서 생성하고 향상된 친화성을 갖는 면역글로불린 단편을 스크리닝할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Glaser et al., 1992, J. Immunol. 149:3903-3913]; 문헌 [Barbas et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3809-13] 및 미국 특허 제5,792,456호 참조).
이펙터 기능은 또한 부위 지정 돌연변이유발에 의해 변경될 수도 있다 (예를 들어, 문헌 [Duncan et al., 1988 Nature 332:563-64]; 문헌 [Morgan et al., 1995 Immunology 86:319-24]; 문헌 [Eghtedarzedeh-Kondri et al., 1997 Biotechniques 23:830-34] 참조). 예를 들어, 면역글로불린의 Fc 부분에서의 글리코실화 부위의 돌연변이에 의해 면역글로불린이 상보체를 고정시키는 능력을 변경시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Wright et al., 1997 Trends Biotechnol. 15:26-32] 참조). 불변 영역 도메인에서의 다른 돌연변이에 의해 면역글로불린이 상보체를 고정시키거나, 또는 항체 의존성 세포 독성을 유발하는 능력을 변경시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Duncan et al., 1988 Nature 332:563-64]; 문헌 [Morgan et al., 1995 Immunology 86:319-24] 및 문헌 [Sensel et al., 1997 Mol. Immunol. 34:1019-29] 참조).
특정 실시양태에 따라서, 본원에 기술된, 비-인간의, 인간의, 또는 인간화된 임의의 Ig 분자의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 단일쇄 Fv (scFv) 폴리펩티드 단편 (단일쇄 항체)으로서 구축할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426]; 문헌 [Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). 다기능의 scFv 융합 단백질은 프레임 내 (in-frame) scFv 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 임의의 다수의 공지된 이펙터 단백질을 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열과 연결함으로써 생성될 수 있다. 이들 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 유럽 특허 제B1-0318554호, 미국 특허 제5,132,405호, 미국 특허 제5,091,513호, 및 미국 특허 제5,476,786호에 개시되어 있다. 예를 들어, 이펙터 단백질은 면역글로불린 불변 영역 서열을 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hollenbaugh et al., 1995 J. Immunol. Methods 188:1-7] 참조). 이펙터 단백질의 다른 예는 효소이다. 한정하지 않는 예로서, 이러한 효소는 치료 목적의 생물할적 활성을 제공할 수 있거나 (예를 들어, 문헌 [Siemers et al., 1997 Bioconjug. Chem. 8:510-19] 참조), 또는 진단용으로 임의의 다수의 널리 공지된 기질을 검출가능한 생성물로 호스래디쉬 퍼옥시다제-촉매에 의해 전환시키는 것과 같은 검출가능한 활성을 제공할 수 있다. scFv 융합 단백질의 또다른 예로는 Ig-톡신 융합체, 또는 scFv 폴리펩티드가 톡신에 연결된 면역톡신이 포함된다.
본원에 기술된 scFv 또는 임의의 항체 단편은, 특정 실시양태에서, 융합 단백질과 항원 (예를 들어, TGF-베타 결합 단백질) 간의 특이적 결합의 검출을 가능하게 하는 펩티드 또는 폴리펩티드 도메인에 융합될 수 있다. 예를 들어, 융합 폴리펩티드 도메인은 당업자에게 익숙한 다수의 기술에 의해 scFv 융합 단백질이 TGF-베타 결합 단백질에 결합하는 것을 검출하기 위한 친화성 태그(tag) 폴리펩티드일 수 있다. 펩티드 태그의 예로는, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 His (예, 폴리히스티딘)가 포함된다. 또한 검출 기술에는, 예를 들어 아비딘 또는 스트렙타비딘 융합 단백질을 비오틴 또는 비오틴 모의 서열에 결합시키는 것 (예를 들어, 문헌 [Luo et al., 1998 J. Biotechnol. 65:225] 및 그의 인용 문헌 참조), 융합 단백질을 검출가능한 잔기 (예, 표지 잔기)로 직접적으로 공유결합성을 변형시키는 것, 융합 단백질을 특이적인 표지된 리포터 분자에 비공유적으로 결합시키는 것, 검출가능한 기질을 효소 활성을 갖는 부분을 포함하는 융합 단백질로 효소적으로 변형시키는 것, 또는 융합 단백질을 고체상 지지체에 고정시키는 것 (공유적 또는 비공유적)이 포함된다. scFv 융합 단백질의 구축을 위한 다른 유용한 친화성 폴리펩티드에는, 예를 들어, WO 89/03422, 미국 특허 제5,489,528호, 미국 특허 제5,672,691호, WO 93/24631, 미국 특허 제5,168,049호, 미국 특허 제5,272,254호에 개시된 스트렙타비딘 융합 단백질; 아비딘 융합 단백질 (예를 들어, 유럽 특허 제511,747호 참조); 글루타티온-S-트랜스퍼라제와 같은 효소; 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A 폴리펩티드가 포함될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, TGF-베타 결합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 임의의 다수의 공지된 발현 벡터를 사용하여 널리 공지된 다수의 핵산 절단, 라이게이션, 형질전환 및 형질감염 절차에 따라 증식 및 발현될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서는 대장균(Escherichia coli)과 같은 원핵성 숙주에서 항체 단편을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Pluckthun et al., 1989 Methods Enzymol. 178: 497-515] 참조). 특정 다른 실시양태에서는, 효모 (예를 들어, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)), 동물 세포 (포유류 세포를 포함함) 또는 식물 세포를 비롯한, 진핵성 숙주 세포에서 항체 또는 그의 단편을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 동물 세포의 예로는 골수종 (예컨대, 마우스 NSO 세포주), COS, CHO, 또는 하이브리도마 세포가 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 식물 세포의 예로는 담배, 옥수수, 대두 및 벼 세포가 포함된다.
적합한 항체가 얻어지면, 이들을 당업계에 널리 공지된 다수의 기술을 사용하여 단리 또는 정제할 수 있다 (문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988] 참조). 적합한 기술로는 펩티드 또는 단백질 친화성 컬럼 (컬럼 매트릭스에 부착된 항-불변 영역 항체를 사용하는 것을 포함함), HPLC 또는 RP-HPLC, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 상에서의 정제, 또는 이들 기술을 임의로 조합한 것이 포함된다.
c. 돌연변이체 TGF-베타 결합 단백질
본원 및 하기 실시예 (예를 들어, 실시예 8 및 실시예 9)에 기술되어 있는 바와 같이, 천연 TGF-베타 결합 단백질의 특정한 TGF-베타 족 구성원의 작용을 차단하는 능력에 필적하는, TGF-베타 결합 단백질의 변경된 버젼은 증가된 뼈 밀도를 초래해야 한다. 따라서, TGF-베타 족의 구성원과 결합하지만 TGF-베타 족의 구성원의 기능을 억제하지 않는 TGF-베타 결합 단백질의 돌연변이체는 상기 조건을 만족시킬 것이다. 돌연변이체 버젼은 TGF-베타 결합 단백질의 내인성 억제 기능에 효과적으로 필적해야 한다.
d. 단백질의 생산
본원에 기술된 폴리펩티드는 TGF 결합 단백질 스클레로스틴 및 그의 변이체와 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 이들 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 소정의 유전자와 실질적으로 유사한 유전자의 유도체 및 단리된 핵산 분자와, 필요에 따라, 상기 유전자 및 그의 유도체에 의해 코딩된 단백질 (펩티드 및 폴리펩티드를 포함함)을 포함한다. 본원에서 사용되는 뉴클레오티드 서열은, (a) 뉴클레오티드 서열이 상기 기술된 유전자 및 핵산 분자의 코딩 영역으로부터 유래되고, 예를 들어 상기 기술한 서열 또는 그의 대립형 변이체의 일부를 포함하거나, 그렇지 않으면 TGF-베타 결합 단백질이 TGF-베타 족의 구성원과 결합하는 것을 억제하는 분자를 코딩한다면, (b) 뉴클레오티드 서열이 본 발명의 뉴클레오티드 서열로의 보통 엄격하거나, 고도로 엄격하거나 또는 매우 고도로 엄격한 혼성화가 일어날 수 있다면 (문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989] 참조); 및(또는) (c) DNA 서열이 유전자 코드에 따라 (a) 또는 (b)에 규정된 DNA 서열로 퇴화된다면, "실질적으로 유사한" 것으로 간주된다. 또한, 본원에 기술된 핵산 분자는 상보적 및 비-상보적 서열 둘 다를 포함하고, 단 그렇지 않은 서열들은 본원에 상술된 조건을 만족시킨다. 본 발명의 범주 내에서, 고도의 엄격함이란 표준 혼성화 조건을 의미한다 (예를 들어, 5XSSPE, 65 ℃에서 0.5％ SDS, 또는 이의 등가).
본원에 기술된 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질의 구조는, 예를 들어 P/C Gene 또는 인텔리제네틱스 스위트(Intelligenetics Suite) (미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 인텔리제네틱스(Intelligenetics))의 소수성 플롯 함수를 사용하거나, 또는 문헌 [Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982]에 개시된 방법에 따라 일차 번역 생성물로부터 예견될 수 있다.
본 발명의 단백질은 산성 또는 염기성 염, 또는 중성 형태로 생산될 수 있다. 또한, 각 아미노산 잔기는 산화 또는 환원에 의해 변형될 수 있다. 게다가, 다수의 치환, 결실 또는 부가가 아미노산 또는 핵산 서열에서 일어날 수 있고, 이들의 순 효과 (net effect)는 돌연변이체 또는 야생형 단백질의 생물학적 활성을 유지하거나 또는 추가로 증가 또는 감소시키는 것이다. 게다가, 예를 들어, 유전자 코드의 축퇴로 인해, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상당한 변이가 있을 수 있다.
본원에 기술된 단백질의 다른 유도체에는 단백질의 다른 단백질 또는 폴리펩티드와의 콘쥬게이트가 포함된다. 이는, 예를 들어 단백질의 정제 또는 확인을 용이하게 하기 위해 부가될 수 있는 N-말단 또는 C-말단 융합 단백질을 합성함으로써 달성될 수 있다 (미국 특허 제4,851,341호 참조, 또한 문헌 [Hopp et al., Bio/Technology, 6:1204, 1988] 참조). 별법으로, 플래그(Flag, 등록상표)/TGF-베타 결합 단백질과 같은 융합 단백질을 구축하여 단백질의 확인, 발현 및 분석을 보조한다.
본 발명의 단백질은 본원에 기술된 다양한 기술을 사용하여 구축될 수 있다. 또한, 제한 부위에 의해 플랭킹된 돌연변이체 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 특정한 좌위에서 돌연변이를 일으켜, 천연 서열의 단편에의 라이게이션을 가능하게 한다. 라이게이션 후에, 생성된 재구축된 서열은 목적하는 아미노산 삽입, 치환, 또는 결실이 일어난 유도체를 코딩한다.
별법으로, 올리고뉴클레오티드-지시 부위-특이적 (또는 절편-특이적) 돌연변이유발 절차를 사용하여 필요한 치환, 결실, 또는 삽입에 따라 변경된 특정한 코돈을 갖는 변경된 유전자 또는 핵산 분자를 제공할 수 있다. 상기 상술한 변경을 일으키는 예시용 방법은 문헌 [Walder et al., Gene 42:133, 1986]; 문헌 [Bauer et al., Gene 37:73, 1985]; 문헌 [Craik, BioTechniques, January 1985, 12-19]; 문헌 [Smith et al., Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981]; 및 샘브룩(Sambrook) 등의 상기 문헌에 개시되어 있다. 단백질의 결실 또는 말단절단형(truncation) 유도체 (예를 들어, 가용성 세포외 부분) 또한 목적하는 결실 부위에 인접한 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 사용하여 구축할 수 있다. 제한 후에, 오버행(overhang)을 채우고 DNA를 재라이게이션할 수 있다. 상기 상술한 변경을 일으키는 예시용 방법은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]에 개시되어 있다.
본 발명의 핵산 분자에 일어난 돌연변이는 바람직하게는 코딩 서열의 리딩 프레임을 보존한다. 게다가, 돌연변이는 바람직하게는 전사되었을 때 혼성화되어 mRNA의 해독에 불리한 영향을 미칠 2차 mRNA 구조, 예컨대 루프 또는 헤어핀을 형성할 수 있는 상보적 영역을 구성하지 않을 것이다. 돌연변이 부위를 미리 결정할 수는 있지만, 돌연변이 자체의 특성을 미리 결정할 필요는 없다. 예를 들어, 소정의 부위에서 최적의 특징을 갖는 돌연변이체를 선별하기 위해서는, 랜덤 돌연변이유발을 표적 코돈에서 행할 수 있고, 발현된 돌연변이체를 생물학적 활성을 획득하였거나 상실하였거나 또는 유지하고 있는 것을 스크리닝한다. 별법으로, 돌연변이를 제한 부위에 의해 플랭킹된 돌연변이체 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 특정한 좌위에서 일으켜, 천연 서열의 단편에의 라이게이션을 가능하게 한다. 라이게이션 후에, 생성된 재구축된 서열은 목적하는 아미노산 삽입, 치환 또는 결실이 일어난 유도체를 코딩한다.
본 발명의 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 또한 PCR 돌연변이유발, 화학적 돌연변이유발 (문헌 [Drinkwater and Klinedinst, PNAS 83:3402-3406, 1986]), 강제 뉴클레오티드 오편입(misincorporation) (예를 들어, 문헌 [Liao and Wise Gene 88:107-111, 1990]), 또는 랜덤 돌연변이를 일으킨 올리고뉴클레오티드 (문헌 [ Horwitz et al., Genome 3:112-117, 1989])를 사용하는 것과 같은 기술을 사용하여 구축될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기술한 유전자를 발현할 수 있는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양함으로써 상기 기술한 유전자 및 핵산 분자의 조작 및 발현을 제공한다. 이러한 벡터 또는 벡터 구축물은, 적합한 전사 또는 해독 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 목적하는 단백질을 코딩하는 합성 또는 cDNA-유래 핵산 분자를 포함한다. 적합한 조절 요소는 박테리아, 진균, 바이러스, 포유류, 곤충 또는 식물 유전자를 비롯한 다수의 기원으로부터 유래될 수 있다. 적합한 조절 요소는 선택된 숙주 세포에 따라 선택되고, 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 조절 요소의 예로는 전사 프로모터 및 인핸서 또는 RNA 폴리머라제 결합 서열, 전사 종결자, 및 해독 개시 신호를 비롯한 리보솜 결합 서열이 포함된다.
상기 기술한 임의의 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 박테리아, 포유류, 효모 또는 다른 진균, 바이러스, 곤충, 또는 식물 세포를 비롯한, 다양한 원핵성 및 진핵성 숙주 세포에 의해 용이하게 발현될 수 있다. 이러한 세포를 형질전환 또는 형질감염시켜 외래 DNA를 발현시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 이따꾸라(Itakura) 등의 미국 특허 제4,704,362호; 문헌 [Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933, 1978]; 머레이(Murray) 등의 미국 특허 제4,801,542호; 업쉘(Upshall) 등의 미국 특허 제4,935,349호; 하겐(Hagen) 등의 미국 특허 제4,784,950호; 액셀(Axel) 등의 미국 특허 제4,399,216호; 괴델(Goeddel) 등의 미국 특허 제4,766,075호; 및 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 참조; 식물 세포일 경우에는 문헌 [Czako and Marton, Plant Physiol. 104:1067-1071, 1994]; 및 문헌 [Paszkowski et al., Biotech. 24:387-392, 1992] 참조).
본 발명을 수행하기에 적합한 박테리아 숙주 세포에는 대장균, 비. 섭틸리스(B. subtilis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 및 수도모나스(Pseudomonas), 스트렙토미세스(Streptomyces), 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속의 다양한 종들 뿐만 아니라, 당업계에 널리 공지되어 있고 본원에 기술된 다수의 다른 박테리아 종들이 포함된다. 박테리아 숙주 세포의 대표예로는 대장균 DH5α (미국 캘리포니아주 라홀라 소재의 스트라타진(Stratagene))가 포함된다.
박테리아 발현 벡터는 바람직하게는 숙주 세포에서 작용하는 프로모터, 1개 이상의 선별가능한 표현형 마커, 및 박테리아 복제 개시점을 포함한다. 대표 프로모터에는 β-락타마제 (페니실리나제) 및 락토오스 프로모터 시스템 (문헌 [Chang et al., Nature 275:615, 1978]), T7 RNA 폴리머라제 프로모터 (문헌 [Studier et al., Meth. Enzymol. 185:60-89, 1990]), 람다 프로모터 (문헌 [Elvin et al., Gene 87:123-126,1990]), trp 프로모터 (문헌 [Nichols and Yanofsky, Meth. in Enzymology 101:155, 1983]), 및 tac 프로모터 (문헌 [Russell et al., Gene 20: 231, 1982])가 포함된다. 대표 선별가능한 마커에는 카나마이신 또는 암피실린 내성 유전자와 같은 다수의 항생제 내성 마커가 포함된다. 그 중에서도 특히, pBR322 (문헌 [Bolivar et al., Gene 2:95, 1977] 참조), pUC 플라스미드 pUC18, pUC19, pUC118, pUCll9 (문헌 [Messing, Meth. in Enzymology 101:20-77, 1983] 및 문헌 [Vieira and Messing, Gene 19:259-268, 1982] 참조), 및 pNH8A, pNH16a, pNH18a, 및 블루스크립트(Bluescript) M13 (미국 캘리포니아주 라홀라 소재의 스트라타진)을 비롯한, 숙주 세포를 형질전환시키는 데 적합한 다수의 플라스미드가 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 발명을 수행하기에 적합한 효모 및 진균 숙주 세포에는, 그 중에서도 특히, 사카로미세스 폼베(Saccharomyces pombe), 사카로미세스 세레비시아, 피키아(Pichia) 또는 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 속 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 (맥나이트(McKnight) 등의 미국 특허 제4,935,349호)의 다수의 종들이 포함된다. 효모 및 진균을 위한 적합한 발현 벡터에는, 그 중에서도 특히, 효모일 경우에는 YCp50 (ATCC 번호 37419)과, amdS 클로닝 벡터 pV3 (문헌 [Turnbull, Bio/Technology 7:169, 1989]), YRp7 (문헌 [Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1035-1039, 1978]), YEp13 (문헌 [Broach et al., Gene 8:121-133, 1979]), pJDB249 및 pJDB219 (문헌 [Beggs, Nature 275:104-108, 1978]) 및 이들의 유도체가 포함된다.
효모에 사용하기에 바람직한 프로모터에는 효모 해당 유전자 (문헌 [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:12073-12080, 1980]; 문헌 [Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1:419-434, 1982]) 또는 알콜 탈수소효소 유전자 (문헌 [Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al. (eds.), p. 355, Plenum, New York, 1982]; 문헌 [Ammerer, Meth. Enzymol. 101:192-201, 1983])로부터의 프로모터가 포함된다. 진균 벡터를 위해 유용한 프로모터의 예로는 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 해당 유전자, 예컨대 adh3 프로모터 (문헌 [McKnight et al., EMBO J. 4:2093-2099, 1985])로부터 유래된 것들이 포함된다. 발현 단위는 또한 전사 종결자를 포함할 수 있다. 적합한 종결자의 예로는 adh3 종결자가 있다 (맥나이트의 상기 문헌, 1985).
박테리아 벡터와 같이, 효모 벡터는 일반적으로, 표현형 검정법에 의해 형질전환체를 선별할 수 있도록 우세한 표현형을 나타내는 임의의 다수의 유전자 중 하나일 수 있는 선별가능한 마커를 포함할 것이다. 바람직한 선별가능한 마커는 숙주 세포 영양요구체를 보완하거나, 항생제에 대한 내성을 제공하거나, 또는 세포가 특정 탄소 기원을 사용하도록 하는 것들이고, leu2 (브로치(Broach) 등, ibid.), ura3 (문헌 [Botstein et al., Gene 8:17, 1979]), 또는 his3 (스트룰(Struhl) 등, ibid.)가 포함된다. 또다른 적합한 선별가능한 마커는 효모 세포에 클로람페니콜 내성을 부여하는 cat 유전자이다.
진균의 형질전환 기술은 문헌에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [벡스(Beggs), ibid.], 문헌 [Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933, 1978], 문헌 [Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1740-1747, 1984], 및 문헌 [Russell, Nature 301:167-169, 1983]에 개시되어 있다. 숙주 세포의 유전자형은 발현 벡터에 존재하는 선별가능한 마커에 의해 보완되는 유전자 결손을 함유할 수 있다. 특정한 숙주 및 선별가능한 마커를 선택하는 것은 당업자의 통상의 기술 수준이다.
효모의 형질전환 프로토콜 또한 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 형질전환은 DNA를 갖는 효모의 스페로플라스트를 제조 (문헌 [Hinnen et al., PNAS USA 75:1929, 1978] 참조)함으로써 또는 알칼리 염, 예컨대 LiCl로 처리(문헌 [Itoh et al., J. Bacteriology 153:163, 1983] 참조)함으로써 용이하게 수행될 수 있다. 진균의 형질전환은 또한 문헌 [Cullen et al., Bio/Technology 5: 369, 1987]에 개시된 바와 같이 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 수행할 수도 있다.
바이러스 벡터에는 상기 기술한 바와 같이 목적하는 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자의 발현을 인도하는 프로모터를 포함하는 것들이 포함된다. 예를 들어, MoMLV LTR, RSV LTR, Friend MuLV LTR, 아데노바이러스 프로모터 (문헌 [Ohno et al., Science 265:781-784, 1994]), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 프로모터/인핸서, 후기 파르보바이러스 프로모터 (문헌 [Koering et al., Hum. Gene Therap. 5:457-463, 1994]), 헤르페스 TK 프로모터, SV40 프로모터, 메탈로티오네인 IIa 유전자 인핸서/프로모터, 사이토메갈로바이러스 이미디어트 어얼리 프로모터, 및 사이토메갈로바이러스 이미디어트 레이트 프로모터와 같은 프로모터를 비롯한, 매우 다양한 프로모터가 본 발명의 범주 내에서 사용될 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터 (예를 들어, WO 91/02805; 유럽 특허 제0,415,731호; 및 WO 90/07936 참조)이다. 적합한 조직 특이적 프로모터의 대표예에는 중성 특이적 에놀라제 프로모터, 혈소판 유래 성장 인자 베타 프로모터, 뼈 형태발생 단백질 프로모터, 인간 알파1-키메라 프로모터, 시냅신 I 프로모터 및 시냅신 II 프로모터가 포함된다. 상기 언급한 프로모터 외에도, 다른 바이러스-특이적 프로모터 (예를 들어, 레트로바이러스 프로모터 (상기 언급한 것들 뿐만 아니라, HIV 프로모터와 같은 다른 프로모터를 포함함)), 간염, 헤르페스 (예를 들어, EBV), 및 박테리아, 진균 또는 기생충 (예를 들어, 말리리아)-특이적 프로모터를 사용하여 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생충으로 감염된 특정 세포 또는 조직을 표적화할 수 있다.
본 발명을 수행하기에 적합한 포유류 세포에는, 그 중에서도 특히, COS, CHO, SaOS, 골육종, KS483, MG-63, 초대 골모세포, 및 인간 또는 포유류 골수 유래의 단핵세포(stroma)가 포함된다. 본 발명을 수행할 때 사용하기 위한 포유류 발현 벡터는 클로닝된 유전자, 핵산 분자, 또는 cDNA의 전사를 인도할 수 있는 프로모터를 포함할 것이다. 바람직한 프로모터에는 바이러스 프로모터 및 세포성 프로모터가 포함된다. 뼈 특이적 프로모터에는 뼈 타액단백질을 위한 프르모터 및 오스티오칼신(osteocalcin)을 위한 프르모터가 포함된다. 바이러스 프로모터에는 사이토메갈로바이러스 최전 프로모터 (문헌 [Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985]), 사이토메갈로바이러스 최후 프로모터, SV40 프로모터 (문헌 [Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1:854-864, 1981]), MMTV LTR, RSV LTR, 메탈로티오네인-1, 아데노바이러스 Ela가 포함된다. 세포성 프로모터에는 마우스 메탈로티오네인-1 프로모터 (팔미터(Palmiter) 등의 미국 특허 제4,579,821호), 마우스 Vk 프로모터 (문헌 [Bergman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7041-7045, 1983]; 문헌 [Grant et al., Nucleic Acids Res. 15:5496, 1987]) 및 마우스 VH 프로모터 (문헌 [Loh et al., Cell 33:85-93, 1983])가 포함된다. 프로모터는 적어도 부분적으로는, 목적하는 발현 수준 또는 형질감염될 수용자 세포주에 따라 선택될 것이다.
이러한 발현 벡터는 또한 프로모터로부터 하류 및 원하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 DNA 서열로부터 상류에 위치하는 RNA 스플라이스 부위의 세트를 함유할 수 있다. 바람직한 RNA 스플라이스 부위는 아데노바이러스 및(또는) 면역글로불린 유전자로부터 얻어질 수 있다. 발현 벡터에는 또한 원하는 코딩 서열의 하류에 위치하는 폴리아데닐화 신호도 함유되어 있다. 적합한 폴리아데닐화 신호에는 SV 40으로부터의 초기 또는 후기 폴리아데닐화 신호 (카우프만(Kaufman) 및 샤프(Sharp)의 동서), 아데노바이러스 5 E1B 영역으로부터의 폴리아데닐화 신호 및 인간 성장 호르몬 유전자 종결자 (문헌 [DeNoto et al., Nucleic Acids Res. 9:3719-3730, 1981])가 포함된다. 발현 벡터는 프로모터와 RNA 스플라이스 부위 사이에 위치하는, 비-코딩 바이러스 리더 서열, 예컨대 아데노바이러스 2 삼원구조 리더를 포함할 수 있다. 바람직한 벡터는 또한 인핸서 서열, 예컨대 SV40 인핸서를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 또한 아데노바이러스 VA RNA를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 적합한 발현 벡터는 시판원 (예를 들어, 미국 캘리포니아주 라홀라 소재의 스트라타진)으로부터 입수할 수 있다.
클로닝된 DNA 서열을 포함하는 벡터 구축물은, 예를 들어, 칼슘 포스페이트-매개 형질감염 (문헌 [Wigler et al., Cell 14:725, 1978]; 문헌 [Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981]; 문헌 [Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973]), 전기천공법 (문헌 [Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982]), 또는 DEAE-덱스트란 매개 형질감염 (문헌 [Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987])에 의해 배양된 포유류 세포에 도입될 수 있다. 벡터로 안정하게 형질감염되었거나 클로닝된 DNA를 통합한 세포를 확인하기 위해, 선별가능한 마커를 일반적으로 원하는 유전자 또는 cDNA와 함께 세포에 도입한다. 배양된 포유류 세포에 사용하기에 바람직한 선별가능한 마커는 약물, 예컨대 네오마이신, 하이그로마이신, 및 메토트렉사트에 대한 내성을 부여하는 유전자를 포함한다. 선별가능한 마커는 증폭성 선별가능한 마커일 수 있다. 바람직한 증폭성 선별가능한 마커는 DHFR 유전자 및 네오마이신 내성 유전자이다. 선별가능한 마커는 틸리(Thilly) (본원에 참조로 인용되는, 문헌 [Mammalian Cell Technology], 미국 매사추세츠주 스톤햄 소재의 버터워쓰 퍼블리셔즈(Butterworth Publishers))에 의해 연구되었다.
적합한 벡터를 함유하는 포유류 세포를 전형적으로는, 1 내지 2일의 시간 동안 성장시켜, 원하는 DNA 서열(들)의 발현을 개시한다. 그 후에 약물을 선택하여 안정한 방식으로 선별가능한 마커를 발현하는 세포의 성장을 선별한다. 증폭성 선별가능한 마커로 형질감염된 세포의 경우, 약물 농도를 순차적으로 증가시켜 클로닝된 서열의 카피수가 증가하여, 그에 따라 발현 수준이 증가한 것을 선별할 수 있다. 도입된 서열을 발현하는 세포를 목적하는 형태로 또는 목적하는 수준으로 원하는 단백질을 생산한 것을 선별하고 스크리닝한다. 이들 기준을 만족시키는 세포를 그 후에 클로닝하고 대규모 생산한다.
포유류 세포의 형질감염 프로토콜은 당업계에 널리 공지되어 있다. 대표 방법으로는 칼슘 포스페이트 매개 형질감염, 전기천공법, 리포펙션(lipofection), 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 원형질체 융합-매개 형질감염 (상기 샘브룩 문헌 참조)이 포함된다. 네이키드 (naked) 벡터 구축물은 또한 포유류 (또는 다른 동물)의 근육에 주사한 후에 근육 세포 또는 다른 적합한 세포에 의해 획득될 수 있다.
폴리펩티드를 생산하기 위해 곤충 숙주 세포 및 식물 숙주 세포를 사용하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 본원에 기술되어 있다. 당업계에 공지된 다수의 곤충 숙주 세포가 또한 본 발명에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 곤충 세포에서 이종의 DNA 서열을 발현하기 위해 벡터로서 바큘로바이러스를 사용하는 것은 앳킨슨(Atkinson) 등 (문헌 [Pestic. Sci. 28:215-224, 1990])에 의해 연구되었다. 당업계에 공지된 다수의 벡터 및 식물 숙주 세포, 예를 들어 식물 세포에서 유전자 및 핵산 분자를 발현하기 위해 벡터로서 아그로박테리움 리조겐(Agrobacterium rhizogene)을 사용하는 것 (문헌 [Sinkar et al., J. Biosci., Bangalore 11:47-58, 1987]에서 연구됨)이 또한 본 발명에서 유용할 수 있다.
본 발명의 관련 측면에서, 본 발명의 단백질은 생식 세포 및 체세포가 목적하는 단백질을 코딩하고 유전자의 발현을 위해 효과적인 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자를 함유하는 트랜스제닉 동물에서 발현될 수 있다. 별법으로, 유사한 방식으로, 목적하는 유전자가 결실된 트랜스제닉 동물 (예를 들어, "녹-아웃" 마우스)이 생산될 수 있다. 이러한 트랜스제닉은 마우스, 래트, 토끼, 양, 개, 염소 및 돼지를 비롯한 다양한 비-인간 동물에서 생산될 수 있다 (문헌 [Hammer et al., Nature 315:680-683, 1985], 문헌 [Palmiter et al., Science 222:809-814, 1983], 문헌 [Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442, 1985], 문헌 [Palmiter and Brinster, Cell 41:343-345, 1985], 및 미국 특허 제5,175,383호, 미국 특허 제5,087,571호, 미국 특허 제4,736,866호, 미국 특허 제5,387,742호, 미국 특허 제5,347,075호, 미국 특허 제5,221,778호 및 미국 특허 제5,175,384호 참조). 간략하게 말하면, 적절하게 위치한 발현 제어 서열과 함께 발현될 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터는, 예를 들어, 미세주입법으로 수정란의 전핵에 도입된다. 주입된 DNA의 통합은 조직 샘플로부터의 DNA의 블롯 분석법에 의해 검출된다. 도입된 DNA가 동물의 생식 세포주에 도입되어 동물의 자손들에게 전해지는 것이 바람직하다. 조직-특이적 발현은 조직-특이적 프로모터를 사용함으로써, 또는 트랜스진(transgene)의 조절된 발현을 가능하게 하는, 유도성 프로모터, 예컨대 메탈로티오네인 유전자 프로모터 (상기 팔미터 등의 문헌, 1983)를 사용함으로써 달성될 수 있다.
단백질은 본원에 기재한 바와 같은 재조합 번역 생성물을 생성하는데 적합한 숙주 및 벡터 시스템을 배양하는 기타 방법들 중 하나로서 단리할 수 있다. 이어서, 목적하는 단백질을 단리하기 위해 상기 세포주로부터의 상청액, 또는 단백질 포함물, 또는 단백질을 상청액으로 배출시키지 않는 전체 세포를 다양한 정제 절차에 의해 처리할 수 있다. 예를 들어, 우선 상청액을 시판되는 단백질 농축 여과기, 예컨대 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 초미세여과 장치를 사용하여 농축시킬 수 있다. 농축시킨 다음, 농축액을, 예를 들어, 적합한 지지체에 결합된 항-단백질 항체 (예를 들어, 단리되는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체)와 같은 적합한 정제 매트릭스에 적용시킬 수 있다. 별법으로, 단백질을 정제하기 위해 음이온 또는 양이온 교환 수지를 사용할 수 있다. 또다른 별법으로, 하나 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 단계를 수행하여 단백질을 추가로 정제할 수 있다. 본 발명의 단백질을 단리하는 그 밖의 방법들은 당업계에 익히 공지되어 있다.
단리된 폴리펩티드의 순도를 당업계에 공지되고, 본원에 기재된 기술, 예컨대 젤 전기영동 및 크로마토그래피법에 의해 측정할 수 있다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 순도가 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상이다. 특정한 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 관점에서 단백질은 SDS-PAGE 분석 후, 쿠마시 블루 염색법에 따라 기타 목적하지 않은 단백질이 검출되지 않는 경우, "단리된" 것으로 간주한다. 다른 실시양태에서는, 목적하는 단백질을 SDS-PAGE 분석 후, 은 염색법에 따라 기타 목적하지 않은 단백질이 검출되지 않도록 단리할 수 있다.
3. 핵산 분자
본 발명의 또다른 측면에서, TGF-베타 결합-단백질이 TGF-베타 족의 구성원에 결합하는 것을 억제할 수 있는 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 하나의 실시양태에서, TGF-베타 결합-단백질 핵산 서열의 발현을 특이적으로 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자를 제공한다 (일반적으로, 문헌 [Hirashima et al. in Molecular Biology of RNA: New Perspectives (M. Inouye and B.S. Dudock, eds., 1987 Academic Press, San Diego, p.401); Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression (J.S. Cohen, ed., 1989 MacMillan Press, London); Stein and Cheng, Science 261: 1004-1012, 1993]; 제WO 95/10607호; 미국 특허 제5,359,051호; 제WO 92/06693호; 및 제EP-A2-612844호 참조). 간단하게, 상기 분자들은 전사되는 TGF-베타 결합-단백질 mRNA 서열의 영역과 상보적이고, 이들과 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍을 형성할 수 있도록 작제된다. 생성된 이중-가닥 핵산은 mRNA의 후속적인 프로세싱을 방해하여 단백질 합성을 방지한다 (실시예 10 참조).
본 발명의 또다른 측면에서, TGF-베타 결합-단백질이 TGF-베타 족의 구성원에 결합하는 것을 억제할 수 있는 리보자임을 제공한다. 본원에서 사용되는 "리보자임"은 특이적 인지 및 RNA-절단 효소 활성을 위한 안티센스 서열을 함유하는 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 촉매성 가닥은 화학량론적인 농도 이상에서 표적 RNA 중 특이적 부위를 절단한다. 예를 들어, 해머헤드(hammerhead) 리보자임 (예를 들어, 문헌 [Forster and Symons, Cell 48: 211-220, 1987]; [Haseloff and Gerlach, Nature 328: 596-600, 1988]; [Walbot and Bruening, Nature 334: 196, 1988]에 기재된 해머헤드 리보자임); 헤어핀(hairpin) 리보자임 (예를 들어, 1993년 10월 19일에 허여된 하셀로프(Haseloff) 등의 미국 특허 제5,254,678호 및 1990년 3월 26일에 공개된 헴펠(Hempel) 등의 유럽 특허 공개 제0 360 257호에 기재된 헤어핀 리보자임); 테트라히메나(Tetrahymena) 리보좀 RNA-기재 리보자임 (세크(Cech) 등의 미국 특허 제4,987,071호 참조)을 비롯한 광범위하게 다양한 리보자임이 본 발명의 관점에서 사용될 수 있다. 본 발명의 리보자임은 전형적으로 RNA로 구성되어 있지만, 또한 DNA, 핵산 유사체 (예를 들어, 포스포로티오에이트) 또는 이들의 키메라 (예를 들어, DNA/RNA/RNA)로도 구성될 수 있다.
4. 표지
상기 및 하기 기재된 유전자 생성물 또는 임의의 후보 분자를, 예를 들어, 형광 분자, 톡신 및 방사핵을 비롯한 다양한 화합물로 표지할 수 있다. 형광 분자의 대표적인 예로는 플루오레세인, 피코빌리(Phycobili) 단백질, 예컨대 피코에리트린, 로다민, 텍사스 레드(Texas red) 및 루시퍼라제를 포함한다. 톡신의 대표적인 예로는 리신, 아브린 디프테리아 톡신, 콜레라 톡신, 젤로닌, 억세풀 항바이러스 단백질, 트리틴, 시겔라(Shigella) 톡신 및 슈도모나스(Pseudomonas) 엑소톡신 A를 포함한다. 방사핵의 대표적인 예로는 Cu-64, Ga-67, Ga-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99m, Rh-105, Pd-109, In-111, I-123, I-125, I-131, Re-186, Re-188, Au-198, Au-199, Pb-203, At-211, Pb-212 및 Bi-212를 포함한다. 추가로, 또한 상기 기재한 항체를 표지하거나, 리간드 결합 쌍 중 하나의 파트너와 접합시킬 수 있다. 대표적인 예로는 아비딘-비오틴, 스트렙타비딘-비오틴 및 리보플라빈-리보플라빈 결합 단백질을 포함한다.
상기 기술한 대표적인 표지로 본원에 기재한 분자들을 접합시키거나 표지하기 위한 방법은 당업자에 의해 용이하게 실시될 수 있다 (Trichothecene Antibody Conjugate, 미국 특허 제4,744,981호; Antibody Conjugate, 미국 특허 제5,106,951호; Fluorogenic Materials and Labeling Techniques, 미국 특허 제4,018,884호; Metal Radionuclide Labeled Proteins for Diagnosis and Therapy, 미국 특허 제4,897,255호; 및 Metal Radionuclide Chelating Compounds for Improved Chelation Kinetics, 미국 특허 제4,988,496호 참조; 또한 문헌 [Inman, Methods In Enzymology, Vol.34, Affinity Techniques, Enzyme Purification: Part B, Jakoby and Wilchek (eds.), Academic Press, New York, p.30, 1974] 참조; 또한 문헌 [Wilchek and Bayer, "The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications," Anal. Biochem. 171: 1-32, 1988] 참조).
제약 조성물
상기 지적한 바와 같이, 본 발명은 또한 TGF-베타 결합-단백질이 TGF-베타 족의 구성원에 결합하는 것을 억제하는 상기 기재한 분자 중 하나를 제약상 또는 생리학상 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는, 다양한 제약 조성물을 제공한다. 일반적으로, 상기 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 비독성이어야 한다. 통상적으로, 이러한 조성물의 제조는 치료제를 완충액, 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드, 단백질, 아미노산, 탄수화물, 예컨대 글루코스, 말토스, 수크로스 또는 덱스트린, 킬레이트화제, 예컨대 EDTA, 글루타티온 및 기타 안정화제 및 부형제와 합하는 것을 수반한다. 중성 완충 식염수 또는 비특이적 혈청 알부민과 혼합된 식염수가 예시적인 적절한 희석제이다.
본 발명의 제약 조성물은 다양한 여러 경로에 의해 투여되도록 제조할 수 있다. 일반적으로, 담체의 유형은 투여의 형식을 기준으로 선택한다. 제약 조성물은, 예를 들어, 국소, 경구, 비강, 경막내, 직장, 질관, 설하 또는 비경구 투여, 예컨대 피하, 정맥내, 근육내, 복장내, 해면내, 내이강 또는 요도내 주사 또는 주입을 비롯한 임의의 적합한 방식의 투여용으로 제형화할 수 있다. 제약 조성물 (예를 들어, 경구 투여용 또는 주사에 의한 전달용)은 액체의 형태 (예를 들어, 엘릭서제, 시럽제, 액제, 에멀젼제 또는 현탁제)일 수 있다. 액체 제약 조성물은, 예를 들어, 멸균 희석제, 예컨대 주사용 물, 식염수 용액, 바람직하게는 생리학적 식염수, 링거 용액, 등장성 염화나트륨, 용매 또는 현탁화 매질로서 작용할 수 있는 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 용매, 항균제; 항산화제; 킬레이트화제; 완충액, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 인산염 및 장성의 조절을 위한 작용제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 분배용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 투여 바이알 중에 담길 수 있다. 생리학적 식염수를 사용하는 것이 바람직하며, 주사용 제약 조성물은 바람직하게는 멸균한다.
본원에 기재한 조성물은 지속 방출용으로 제형화할 수 있다 (즉, 투여 후 화합물의 느린 방출을 달성하는 캡슐 또는 스폰지와 같은 제형). 이러한 조성물은 일반적으로 익히 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 예를 들어, 경구, 직장 또는 피하 주입에 의해, 또는 목적하는 표적 부위에서의 주입에 의해 투여할 수 있다. 서방형 제형은 담체 매트릭스 중에 분산되고(거나) 속도 조절 막에 의해 둘러쌓인 저장소 내에 함유된 작용제를 함유할 수 있다. 상기 제형 내에 사용하기 위한 담체는 생적합성이고, 또한 생분해성일 수 있으며; 바람직하게는 상기 제형은 비교적 일정한 수준의 활성 성분의 방출을 제공한다. 서방형 제형 내에 함유된 활성 화합물의 양은 주입의 부위, 방출 속도 및 예상 기간 및 치료되거나 예방되는 증상의 특성에 따라 다르다. 이러한 점에서 유용한 예시적인 담체로는 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀룰로스, 덱스트란, 등의 미세입자를 포함한다. 기타 예시적인 지연-방출 담체로는 비-액체 친수성 코어 (예를 들어, 가교된 다당류 또는 올리고당)를 포함하는 초분자 바이오벡터 및 임의로는, 양쪽성 화합물, 예컨대 인지질을 포함하는 외층을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 제5,151,254호 및 PCT 출원 제WO 94/20078호, 제WO 94/23701호 및 제WO 96/06638호 참조).
또다른 예시적인 실시양태에서, 생분해성 미소구체 (예를 들어, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)를 본 발명의 조성물을 위한 담체로서 사용한다. 적합한 생분해성 미소구체는, 예를 들어, 미국 특허 제4,897,268호; 동 제5,075,109호; 동 제5,928,647호; 동 제5,811,128호; 동 제5,820,883호; 동 제5,853,763호; 동 제5,814,344호, 동 제5,407,609호 및 동 제5,942,252호에 개시되어 있다. 또한, 예를 들어 제WO/99 40934호 및 이의 인용 참고문헌에 기재된 개질된 B형 간염 코어 단백질 담체 시스템이 다수의 적용에 대해 유용할 것이다. 또다른 예시적인 담체/전달 시스템은 미립자-단백질 복합물, 예컨대 숙주에서 제I 부류-제한된 세포독성 T 림프구 반응을 유도시킬 수 있는, 미국 특허 제5,928,647호에 기재된 복합물을 포함하는 담체를 사용한다.
또다른 예시적인 실시양태에서, 칼슘 포스페이트 코어 입자를 본 발명의 조성물을 위한 담체 또는 조절 방출 매트릭스로서 사용한다. 예시적인 칼슘 포스페이트 입자는, 예를 들어, 공개 특허 출원 제WO/0046147호에 개시되어 있다.
항-SOST 항체 및(또는) 조절제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물 (이는 폴리펩티드 및(또는) 조절제를 계내에서 생성되도록 함)에 대해서는, 상기 폴리뉴클레오티드가 당업자에게 공지된 임의의 다양한 전달 시스템, 예컨대 핵산, 및 박테리아, 바이러스 및 포유동물 발현 시스템 내에 존재할 수 있다. DNA를 이러한 발현 시스템 내로 혼입시키는 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있다. DNA는 또한, 예를 들어, 문헌 [Ulmer et al., Science 259: 1745-1749, 1993]에 기재되어 있고, 문헌 [Cohen, Science 259: 1691-1692, 1993]에서 검토된 바와 같이 "네이키드"일 수 있다. 네이키드 DNA의 흡수는 세포 내로 효율적으로 이동되는 생분해성 비드 상에 DNA를 코팅시킴으로써 증가시킬 수 있다.
예를 들어, 경구, 비경구, 정맥내, 비강내 및 근육내 투여 및 제형을 비롯한 다양한 치료 처방법에서의 본원에 기재된 특정 조성물을 사용하기 위한 적합한 투여량 및 치료 처방법의 개발이 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 일부가 예시의 일반적인 목적을 위해 하기에 간단하게 논의되었다.
특정 적용에서, 본원에 개시된 제약 조성물은 동물에게 경구 투여를 통해 전달할 수 있다. 이러한 경우, 이들 조성물은 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 제형화되거나, 경질- 또는 연질-껍질 젤라틴 캡슐 중에 담기거나, 또는 정제로 압착하거나, 또는 식사의 식품과 함께 직접적으로 도입할 수 있다.
특정 상황에서는, 본원에 개시한 제약 조성물을 비경구적으로, 정맥내로, 근육내로, 또는 심지어 복막내로 전달하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 접근은 당업자에게 공지되어 있으며, 이들 중 일부는, 예를 들어, 미국 특허 제5,543,158호; 동 제5,641,515호; 동 제5,399,363호에 추가로 기재되어 있다. 특정 실시양태에서는, 유리 염기 또는 약리학상 허용가능한 염으로서의 활성 화합물의 용액을 계면활성제, 예컨대 히드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 물 중에 제조할 수 있다. 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물, 및 오일 중에 제조할 수 있다. 저장 및 적용의 일반적인 조건하에, 이들 제제들은 일반적으로 미생물의 성장을 방해하는 방부제를 함유할 것이다.
주사 용도에 적합한 예시적인 제약 형태는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 임시 제제를 위한 멸균 분말을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 제5,466,468호 참조). 모든 경우에서, 상기 형태는 멸균되어야 하며, 용이하게 주사기에 존재할 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 저장의 조건하에 안정해야 하며, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보호되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등), 이들의 적합한 혼합물 및(또는) 식물유를 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅제, 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우, 필수 입자 크기의 유지 및(또는) 계면활성제의 사용으로 유지할 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤스, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살, 등에 의해 용이하게 할 수 있다. 다수의 경우에서, 등장성 제제, 예를 들어, 설탕 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 조성물 중에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 주사용 조성물의 연장된 흡수를 일으킬 수 있다.
하나의 실시양태에서, 수성 액제로의 비경구 투여를 위해, 액제는 필요한 경우 적합하게 완충되어야 하며, 우선 충분한 식염수 또는 글루코스를 사용하여 액체 희석제를 등장성이 되도록 해야한다. 이들 특정 수성 액제는 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용할 수 있는 멸균 수성 매질은 본 기재 내용에 의하여 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1회 투여량을 등장성 NaCl 용액 1 ml 중에 용해시키고, 피하주입 수액 1000 ml에 첨가하거나, 또는 지정된 주입 부위에서 주사할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, l5th ed., pp.1035-1038 and 1570-1580] 참조). 치료되는 대상체의 증상에 따라 투여량에서의 일부 변화가 필수적으로 일어날 것이다. 또한, 인간 투여를 위해서, 바림직하게는 제제는 당연한 일로서, FDA 사무국의 생물학적 표준에 의해 요구되는 멸균성, 발열원성 및 일반 안전성 및 순도 표준을 충족할 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 예시적인 제약상 허용가능한 염은 산 부가 염 (단백질의 유리 아미노기와 함께 형성됨) 및 무기 산, 예컨대 염산염 또는 인산염, 또는 유기 산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산, 등과 함께 형성된 염을 포함한다. 유리 카르복실기와 형성된 염은 또한 무기 염기, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물, 및 유기 염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인, 등으로부터 유도될 수 있다. 제형화한 다음, 액제를 투여 제형과 상용성인 방식으로 치료적으로 유효한 양을 투여할 것이다.
담체는 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅제, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제, 완충액, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드, 등 중 임의의 것 또는 모두를 추가로 포함할 수 있다. 제약상 활성 물질을 위한 상기 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 익히 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 비적합성인 경우를 제외하고, 치료 조성물 중에서의 이의 사용이 고려된다. 또한, 보충적인 활성 성분을 본 조성물에 혼입시킬 수 있다. 문구 "제약상 허용가능한"은 인간에게 투여되는 경우, 알레르기 또는 유사한 부적당한 반응을 발생시키지 않는 분자 전체 및 조성물을 말한다.
특정 실시양태에서, 리포좀, 나노캡슐, 미세입자, 지질 입자, 소포, 등을 본 발명의 조성물을 적합한 숙주 세포/미생물에 도입하기 위해 사용한다. 특히, 본 발명의 조성물을 지질 입자, 리포좀, 소포, 나노스피어 또는 나노입자 등으로 피막화시켜 전달을 위해 제형화될 수 있다. 별법으로, 본 발명의 조성물을 공유 또는 비공유적으로 상기 담체 비히클의 표면에 결합시킬 수 있다.
잠재적인 약물 담체로서 리포좀 및 리포좀형 제제의 형성 및 용도는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 각각의 전문이 참고문헌으로 본원에 구체적으로 혼입된 문헌 [Lasic, Trends Biotechnol. 16(7): 307-21, 1998]; [Takakura, Nippon Rinsho 56(3): 691-95, 1998]; [Chandran et al., Indian J. Exp. Biol. 35(8): 801-09, 1997]; [Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 12(2-3): 233-61, 1995]; 미국 특허 제5,567,434호; 동 제5,552,157호; 동 제5,565,213호; 동 제5,738,868호 및 동 제5,795,587호 참조).
리포좀은 일반적으로 그 밖의 절차에 의해 형질감염시키기 어려운 다수의 세포 유형, 예컨대 T 세포 현탁액, 1차 간세포 배양액 및 PC 12 세포와 함께 성공적으로 사용되어 왔다 (문헌 [Renneisen et al., J. Biol Chem. 265(27): 16337-42, 1990]; [Muller et al., DNA Cell Biol. 9(3): 221-29, 1990] 참조). 또한, 리포좀은 바이러스-기재 전달 시스템의 특징인 DNA 길이 제한이 없다. 리포좀은 유전자, 다양한 약물, 방사능 치료제, 효소, 바이러스, 전사 인자, 알로스테릭 이펙터 등을 다양한 배양 세포주 및 동물에 도입하는데 효과적으로 사용되어 왔다. 또한, 리포좀의 사용은 전신 전달 후의 자가면역 반응 또는 허용불가능한 독성과 관련되지 않은 것으로 보인다.
특정 실시양태에서, 리포좀은 수성 매질 중에 분산되고, 자연발생적으로 다층판체 동심 이중층 소포 (또한, 다층판체 소포 (MLV)로도 불림)를 형성하는 인지질로부터 형성된다.
별법으로, 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 조성물의 제약상 허용가능한 나노캡슐 제형을 제공한다. 나노캡슐은 일반적으로 안정하고, 재생가능한 방법으로 화합물을 포획할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev. Ind. Pharm. 24 (12): 1113-28, 1998] 참조). 세포내 중합체 과다부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 상기 초미세 입자 (약 0.1 ㎛ 크기임)를 고안하여 생체 내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용할 수 있다. 이러한 입자는, 예를 들어 문헌 [Couvreur et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5(1): 1-20, 1988]; [zur Muhlen et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 45(2): 149-55, 1998]; [Zambaux et al., J. Controlled Release 50(1-3): 31-40, 1998]; 및 미국 특허 제5,145,684호에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 제약 조성물은 상기 제약 조성물의 적용과 관련한 지침서를 제공하는 포장 물질과 함께 용기 내에 넣을 수 있다. 일반적으로는, 이러한 지침서는 시약 농도뿐 아니라 특정 실시양태에서는, 제약 조성물을 재구성하는데 필요할 수 있는 부형제 성분 또는 희석제 (예를 들어, 물, 식염수 또는 PBS)의 상대적인 양을 기재하는 명확한 표현을 포함할 것이다.
치료 방법
또한, 본 발명은 뼈의 무기질 함량 및 무기질 밀도를 증가시키는 방법을 제공한다. 간단하게, 예를 들어 질환, 유전적 질병소질, 뼈의 사용 결여를 초래하는 사고 (예를 들어, 골절로 인해), 뼈 재흡수를 일으키는 치료 또는 뼈 형성 세포를 사멸시키는 치료 및 일반 노화를 비롯한 다수의 증상이 뼈 무기질 함량의 손실을 일으킨다. TGF-베타 결합-단백질이 TGF-베타 족 구성원에 결합하는 것을 억제하는 본원에 기재한 분자를 사용하여 상기 증상들을 치료하거나 예방할 수 있다. 본원에서 사용되는 경우, 뼈 무기질 함량은 선택된 부위에서의 뼈 무기질 함량이 통계적으로 유의한 방식으로 증가되는 경우 (예를 들어, 1/2 표준 편차 이상), 증가된 것으로 이해되어야 할 것이다.
뼈 무기질 함량의 손실을 일으키는 광범위하게 다양한 증상을 본원에 기재한 분자를 사용하여 치료할 수 있다. 이러한 증상을 앓고 있는 환자는 익히 공지된 기술 (예를 들어, 문헌 [Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, Inc.] 참조)을 사용하여 임상적 진단을 통해 확인할 수 있다. 치료될 수 있는 질환의 대표적인 예로는 뼈의 비정상 성장 또는 발달이 있는 형성이상을 포함한다. 상기 증상의 대표적인 예로는 연골무형성, 쇄골두개골 이골증, 골내연골종증, 섬유형성이상, 고쉐병, 저인산염혈성 구루병, 마르팡 증후군, 다발성 유전성 외골증, 신경섬유종증, 불완전 골형성증, 골화석증, 골반문증, 경화 병변, 골절, 치주 질환, 가성관절증 및 화농 골수염을 포함한다.
치료되거나 예방될 수 있는 기타 증상은 광범위하게 다양한 원인의 골감소증을 포함한다 (즉, 유년기에서의 최고 골격 무기질 함량 미만으로 1 이상의 표준 편차의 뼈 무기질 함량 또는 밀도를 유발하는 증상). 이러한 증상의 대표적인 예로는 빈혈 상태, 스테로이드에 의해 발생된 증상, 헤파린에 의해 발생된 증상, 골수 장애, 괴혈병, 영양실조, 칼슘 부족, 특발성 골다공증, 선천성 골감소증 또는 골다공증, 알콜중독, 만성 간질환, 조로증, 폐경후 상태, 희발월경, 무월경, 임신, 당뇨병, 갑상선기능항진증, 쿠싱병, 말단거대증, 생식샘기능저하증, 부동 또는 불용, 반사 교감신경성 위축 증후군, 일과적 국소 골다공증 및 골연화증을 포함한다.
본 발명의 하나의 측면에서, 뼈 무기질 함량 또는 밀도는 TGF-베타 결합-단백질이 TGF-베타 족의 구성원에 결합하는 것을 억제하는 치료 유효량의 분자를 온혈 동물에게 투여하여 증가시킬 수 있다. 치료될 수 있는 온혈 동물의 예로는 척추동물 및, 예를 들어, 인간, 말, 소, 돼지, 양, 개, 고양이, 래트 및 마우스 비롯한 포유동물 둘 다를 포함한다. 치료 분자의 대표적인 예로는 리보자임, 리보자임 유전자, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 항체 (예를 들어, 인간화 항체 또는 본원에 기재한 임의의 기타 항체)를 포함한다.
본 발명의 또다른 측면에서, TGF-베타 결합-단백질이 TGF-베타 족의 구성원에 결합하는 것을 억제하는 분자의 발현을 지시하는 벡터를 골로 다시 돌아오는 세포 중으로 도입하는 단계 및 상기 벡터-함유 세포를 온혈 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 뼈 밀도를 증가시키는 방법을 제공한다. 간단하게는, 다시 골로 돌아오는 세포는 환자의 골, 말초 혈액 또는 배양액으로부터 직접적으로 수득할 수 있다 (예를 들어, CD34+, 골모세포, 골세포, 등과 같은 세포는 골수로부터 수득됨).
TGF-베타 결합-단백질이 TGF-베타 족의 구성원에 결합하는 것을 억제하는 분자의 발현을 지시하는 벡터를 세포 중으로 도입시킬 수 있다. 적합한 벡터의 대표적인 예로는 바이러스 벡터, 예컨대 헤르페스 바이러스 벡터 (예를 들어, 미국 특허 제5,288,641호 참조), 아데노바이러스 벡터 (예를 들어, 제WO 94/26914호, 제WO 93/9191호; 문헌 [Kolls et al., PNAS 91(1): 215-219, 1994]; [Kass-Eisler et al., PNAS 90(24): 11498-502, 1993]; [Guzman et al., Circulation 88(6): 2838-48, 1993 ]; [Guzman et al., Cir. Res. 73(6): 1202-1207, 1993]; [Zabner et al., Cell 75(2): 207-216, 1993]; [Li et al., Hum Gene Ther. 4(4): 403-409, 1993]; [Caillaud et al., Eur. J. Neurosci. 5(10): 1287-1291, 1993]; [Vincent et al., Nat. Genet. 5(2): 130-134, 1993]; [Jaffe et al., Nat. Genet. 1(5): 372-378, 1992]; 및 [Levrero et al., Gene 101(2): 195-202, 1991] 참조), 아데노-관련 바이러스 벡터 (제WO 95/13365호; 문헌 [Flotte et al., PNAS 90(22): 10613-10617, 1993] 참조), 바큘로바이러스 벡터, 파르보바이러스 벡터 (문헌 [Koering et al., Hum. Gene Therap. 5: 457-463, 1994]), 폭스 바이러스 벡터 (문헌 [Panicali and Paoletti, PNAS 79: 4927-4931, 1982]; 및 [Ozaki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193(2): 653-660, 1993]) 및 레트로바이러스 (제EP 0,415,731호; 제WO 90/07936호; 제WO 91/0285호, 제WO 94/03622호; 제WO 93/25698호; 제WO 93/25234호; 미국 특허 제5,219,740호; 제WO 93/11230호; 제WO 93/10218호)를 포함한다. 유사하게, 바이러스 벡터를 여러 바이러스 또는 비-바이러스 공급원으로부터 여러 요소들 (예를 들어, 프로모터, 외피 서열 등)의 혼합물을 함유하는 것으로 작제할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 바이러스 벡터 그 자체, 또는 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자, 둘 다를 하기 기재하는 본 방법 및 조성물 중에 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, TGF-베타 결합 단백질이 TGF-베타 족의 구성원에 결합하는 것을 억제하는 분자를 코딩하는 핵산 분자를 예컨대, 폴리-L-리신 DNA 복합물과 접합된 아시아루소뮤코이드 (asialoosomucoid, ASOR) (문헌 [Cristano et al., PNAS 92122-92126, 1993]), DNA 연결된 사멸된 아데노바이러스 (문헌 [Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3(2): 147-154, 1992])의 투여, 세포감염-매개된 도입 (DMRIE-DOPE, Vical, California), 직접적인 DNA 주사 (문헌 [Acsadi et al., Nature 352: 815-818, 1991]); DNA 리간드 (문헌 [Wu et al., J. of Biol. Chem. 264: 16985-16987, 1989]); 리포펙션(lipofection) (문헌 [Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417, 1989]); 리포좀 (문헌 [Pickering et al., Circ. 89(1): 13-21, 1994]; 및 [Wang et al., PNAS 84: 7851- 7855, 1987]); 유전자총 충격 (문헌 [Williams et al., PNAS 88: 2726-2730, 1991]); 및 단독의 단백질 그 자체를 코딩하는 핵산의 직접적인 전달 (문헌 [Vile and Hart, Cancer Res. 53: 3860-3864, 1993]) 또는 PEG-핵산 복합물을 사용한 전달을 비롯한 다양한 기술로 투여할 수 있다. 본 발명의 벡터에 의해 발현될 수 있는 분자의 대표적인 예는 각각이 상기에 보다 상세하게 논의된 리보자임 및 안티센스 분자를 포함한다.
증가된 뼈 무기질 함량은 X-선 (예를 들어, 이중 에너지 X-선 흡광분석법 (Dual Energy X-ray Absorptometry) 또는 "DEXA")을 사용하여 직접 측정할 수 있거나, 또는 뼈 턴오버 마커 (예컨대, 골모세포 특이적인 알칼리성 포스파타제, 오스테오칼신 (osteocalcin), 제1형 프로콜라겐 C' 프로펩티드 (PICP), 및 전체 알칼리성 포스파타제; 문헌 [Comier, C., Curr. Opin. in Rheu. 7:243, 1995] 참조) 또는 뼈 흡수 마커 (피리디놀린, 데옥시피리디놀린, N-텔로펩티드, 뇨 히드록시프롤린, 혈장 타르트레이트-내성 산 포스파타제 및 갈락토실 히드록실리신; 코미어 [Comier]의 상기 문헌 참조)를 통해 추정할 수도 있다. 또한, 골 매스 (bone mass)의 양은 체중으로부터 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 산출될 수 있다 (문헌 [Guinness-Hey, Metab. Bone Dis. and Relat. Res. 5:177-181, 1984] 참조).
당업자에게 명백한 바와 같이, 투여량 및 투여 횟수는 치료될 증상의 특성 및 중증도, 원하는 반응, 환자의 상태 등과 같은 요인에 따라서도 달라질 것이다. 전형적으로, 조성물은 상기 언급한 바와 같이 다양한 기술에 의해 투여될 수 있다.
하기 실시예는 설명을 위해 제공된 것이며, 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
인간 염색체 17의 장완 (LONG ARM)에 대한 경화협착증 맵
인간에서 경화협착증를 초래하지 않는 유전자를 맵핑하여 신규 TGF-β 결합-단백질 족 구성원을 코딩하는 인간 염색체 17의 영역에서 상기 질병을 유발하는 유전자의 위치를 정하였다. 경화협착증 환자에서는, 골격뼈의 무기질 밀도가 발병하지 않는 개체에 비해 실질적으로 증가하는 것으로 나타났다. 머리 내 뼈도 과다성장하는 것으로 나타났다. 경화협착증 환자는, 출생시 다양한 정도의 합지증을 나타내고 두개골에서 다양한 정도의 두개골 압박증 및 신경 압박증을 나타낼 수 있지만, 일반적으로는 건강하다.
경화협착증와 관련된 유전자 결손에 대한 연결기 분석은, 질병이 발생한 24 종의 남아프리카 태생의 백인족으로부터 수집한 DNA 샘플에 대한 동형 맵핑 방법을 적용하여 수행하였다 (문헌 [Sheffield et al., 1994, Human Molecular Genetics 3:1331-1335. "Identification of a Bardet-Biedl syndrome locus on chromosome 3 and evaluation of an efficient approach to homozygosity mapping"] 참조). 남아프리카 태생의 백인 집단은 유전학상 동일한 종이며; 이 집단은 수세기 전에 이 지역을 발견한 몇몇 개척자의 자손으로, 개척 이후로 지리적 및 사회적 장벽에 의 해 분리되었다. 경화협착증는 남아프리카 태생의 백인 사회 이외의 모든 세계에서는 보기 드문 증상인데, 이는 상기 개척 집단의 유전자에 돌연변이가 존재하며 그 수가 집단이 커짐에 따라 함께 증가하여 왔다는 것을 시사한다. 동형 맵핑법의 이용은 열성 돌연변이체에 인접한 DNA 맵핑 마커가 동족 및 단리된 집단으로부터의 발병한 개체에서 동형일 수 있다는 가정에 기초한다.
상염색체로부터의 371개의 미세위성 (microsatellite) 마커 세트 (리서치 제네틱스 (Research Genetics), 세트 6)를 선별하여 경화협착증 환자 샘플의 DNA 풀 (pool)로 분류하였다. 상기 분석용 DNA 샘플은 상기 24 종의 족으로부터의 경화협착증 환자 29 명, 발병하지 않은 족 구성원 59명, 및 동일한 집단으로부터의 관련되지 않은 대조군 개체 세트로부터 수집하였다. 상기 풀은 발병한 개체, 동족으로부터의 발병한 개체, 부모 및 발병하지 않은 형제, 또는 관련되지 않은 대조군 개체 4 내지 6 명으로 구성된다. 관련되지 않은 개체의 풀 및 발병한 개체 또는 족 구성원으로 구성된 대부분의 풀에서, 마커 분석 결과는 각 마커의 대립 유전자 크기가 다르다는 것을 나타내었다. 마커 D17S1299는 동형이라는 증거, 즉 발병한 개체로 구성된 여러 가지 풀에서 하나의 밴드를 나타내었다.
모든 24 종의 경화협착증 족을 D17S1299 영역 (17q12 내지 q21) 내의 총 19개의 마커를 이용하여 분류하였다. 모든 족으로부터의 발병한 개체는 상기 영역에서 동형인 것으로 나타났고, 29 명의 개체 중 25 명의 개체는 중심 단상형에 대해 동형인 것으로 나타났으며; 이들은 각각 D17S1787과 D17S930 사이에서 동일한 대립 유전자를 갖는다. 나머지 4 명의 개체의 경우, 하나의 염색체는 상기 단상형과 매 칭되었지만 다른 염색체는 매칭되지 않았다. 요컨대, 이와 같은 데이터는 상기 3 mb 영역이 경화협착증 돌연변이를 함유한다는 것을 강력하게 시사한다. 상기 3 mb 영역 내의 거의 모든 엑손의 서열을 분석하여 신규 TGF-β 결합-단백질 코딩 서열에서의 넌센스 돌연변이를 확인하였다 (서열 1의 117 위치에서의 C > T 돌연변이가 종결 코돈을 생성함). 상기 돌연변이는 경화협착증 환자 및 남아프리카 태생의 백인 혈통 보유자에게 고유한 것으로 나타났다. 상기 영역 내의 인트론에서의 돌연변이 (인트론의 +3 위치에서의 A > T 돌연변이)를 확인함으로써 유전자의 동일성을 추가로 확인하였으며, 이러한 돌연변이는 경화협착증에 걸린 것으로 진단된 관련되지 않은 단일 환자에서 부적절한 mRNA 프로세싱을 초래하였다.
실시예 2
TGF-β 결합-단백질 유전자 발현의 조직-특이성
A. RT-PCR에 의한 인간 비어 유전자 발현:
하기 전체 RNA 샘플로부터 시판되는 키트 ("제1-가닥 cDNA 합성용 슈퍼스크립트 예비증폭 시스템 (Superscript Preamplication System)", 미국 메릴랜드주 로크빌 소재의 라이프 테크놀로지스사 (Life Technologies))를 이용하여 제1-가닥 cDNA를 제조하였다: 인간 뇌, 인간 간, 인간 비장, 인간 흉선, 인간 태반, 인간 골격 근육, 인간 갑상선, 인간 뇌하수체, 인간 골모세포 (미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 클로네틱스사 (Clonetics Corp.)의 NHOst), 인간 골육종 세포주 (Saos-2, ATCC＃ HTB-85), 인간 골, 인간 골수, 인간 연골, 긴꼬리 원숭이 골, 사카로미세스 세레비시아, 및 인간 말초혈 단핵 세포. 모든 RNA 샘플은 상업적 공급원 (미 국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 클론테크사 (Clontech))으로부터 입수하였으며, 단 인간 골모세포, 인간 골육종 세포주, 인간 골, 인간 연골 및 긴꼬리 원숭이 뼈의 RNA 샘플은 실험실 내에서 (in-house) 제조하였다. 상기 실험실 내에서 제조한 RNA 샘플은 시판되는 키트 ("TRI 시약", 미국 오하이오주 신시네티 소재의 몰레큘라 리서치 센터사 (Molecular Research Center, Inc.))를 이용하여 제조하였다.
상기 샘플, 및 대조군으로서의 부가적인 인간 게놈 샘플에 대한 PCR을 수행하였다. 센스 비어 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열은 5'- CCGGAGCTGGAGAACAACAAG-3' (서열 19)이다. 안티센스 비어 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열은 5'-GCACTGGCCGGAGCACACC-3' (서열 20)이다. 또한, 대조군으로서 인간 β-엑틴 유전자용 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 센스 β-엑틴 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열은 5'-AGGCCAACCGCGAGAAGATGACC-3' (서열 21)이다. 안티센스 β-엑틴 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열은 5'-GAAGT CCAGGGCGACGTAGCA-3' (서열 22)이다. PCR은 61 ℃의 어닐링 온도에서 25 ㎕ 부피의 반응으로 표준 조건을 이용하여 수행하였다. 비어 프라이머를 사용하여 32 사이클의 PCR을 수행하고, β-엑틴 프라이머를 사용하여 24 사이클의 PCR을 수행하였다.
증폭시킨 후에, 각 반응물 12 ㎕ 씩을 아가로스 겔 전기영동법 및 에티듐 브로마이드 염색법에 의해 분석하였다 (도 2A 참조).
B. 마우스 배아 절편의 RNA 계내 혼성화:
전장 마우스 비어 cDNA (서열 11)를 제조사의 프로토콜을 이용하여 pCR2.1 벡터 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠사 (Invitrogen))에 안티센스 및 센스 방향으로 클로닝하였다. 35S-α-GTP-표지된 cRNA 센스 및 안티센스 전사체를 암비온사 (Ambion, Inc; 미국 텍사스주 오스틴 소재)로부터 제공된 시험관내 전사 시약을 사용하여 합성하였다. 라이온스 (Lyons) 등의 문헌 [J. Cell Biol. 111:2427-2436, 1990]의 프로토콜에 따라 계내 혼성화 반응을 수행하였다.
마우스 비어 cRNA 프로브는 발생 중인 마우스 배아의 신경관, 팔다리싹 (limb bud), 혈관 및 골화 연골에서 발현되는 특이적인 메세지를 검출한다. 도 3의 패널 A는 팔다리싹 (1)의 꼭대기 외배엽능선 (aer), 혈관 (bv) 및 신경관 (nt)에서의 발현을 나타낸다. 패널 B는 뇌의 제4 뇌실 (4)에서의 발현을 나타낸다. 패널 C는 하악뼈 (ma), 자궁경부 척추 (cv), 후두뼈 (oc), 구개 (pa) 및 혈관 (bv)에서의 발현을 나타낸다. 패널 D는 늑뼈 (r) 및 심장 판막 (va)에서의 발현을 나타낸다. 패널 A는 10.5 dpc 배아의 횡단면이다. 패널 B는 12.5 dpc 배아의 시상 봉합부 단면이고, 패널 C 및 D는 15.5 dpc 배아의 시상 봉합부 단면이다.
ba = 새궁 (branchial arch), h = 심장, te = 종뇌 (전뇌), b = 뇌, f = 이마코 매스 (frontonasal mass), g = 소화관, h= 심장, j = 턱, li = 간, lu = 폐, ot = 귀의 소낭, ao =, sc = 척수, skm = 골격 근육, ns = 비강굴, th = 흉선, to = 혀, fl = 상지, di = 횡경막
실시예 3
재조합 비어 단백질의 발현 및 정제
A. COS-1 세포에서의 발현:
전장 인간 비어 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 하기 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시켰다: 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열은 5'- AAGCTTGGTACCATGCAGCTCCCAC-3' (서열 23)이며, HindIII 제한효소 부위 (볼드체)에 이어 이미 지정된 아미노 말단 출발 코돈 (ATG) 앞의 6개의 염기쌍에서 출발하여 비어 유전자 뉴클레오티드 19개를 함유한다. 3' 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열은 5'-AAGCTTCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTAGGCGTTCTCCAGCT-3' (서열 24)이며, HindIII 제한효소 부위 (볼드체)에 이어 역 상보적 종결 코돈 (CTA), 이에 이어서 비어의 카르복시 말단에 위치한 5 개의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드의 역 상보적 서열이 측면에 위치한 FLAG 에피토프 (밑줄침, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치사 (Sigma-Aldrich Co.))의 역 상보적 서열을 함유한다. PCR 산물을 TA 클로닝하고 ("오리지날 TA 클로닝 키트", 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠사), 각각의 클론을 DNA 서열분석을 통해 스크리닝하였다. 이어서, 서열-확인된 클론을 HindIII에 의해 분해하고, 시판되는 시약 ("퀴아퀵 (QIAquick) 겔 추출 키트", 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠사 (Qiagen, Inc.))을 이용하여 1.5％ 아가로스 겔 상에서 정제하였다. 이어서, 상기 단편을 HindIII로 분해한 포스파타제-처리된 pcDNA3.1 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠사) 플라스미드에 T4 DNA 리가아제를 사용하여 라이게이션시켰다. DH10B 이. 콜라이를 형질전환시키고, LB (100 ㎍/ml 엠피실린) 플레이트에 플레이팅하였다. 원하는 재조합체를 적합한 방위로 보유하는 콜로니를, pcDNA3.1 의 T7 프로모터/프라이밍 부위에 상응하는 5' 프라이머 및 내부 비어 서열의 역 상보적 서열에 상응하는 5'-GCACTGGCCGGAGCACACC-3' (서열 25) 서열을 갖는 3' 프라이머를 사용하여, PCR에 기초한 스크리닝에 의해 확인하였다. 클로닝된 단편의 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
COS-1 세포 (ATCC＃ CRL-1650)를 사용하여 형질감염시켰다. 발현 플라스미드 pcDNA-비어-Flag 50 ㎍을 시판되는 키트 ("DEAE-덱스트란 (DEAE-Dextran) 형질감염 키트", 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼사 (Sigma Chemical Co.))를 이용하여 제조사로부터 제공된 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 형질감염시킨 후의 최종 배지는 0.1％ 태아 소 혈청을 함유하는 DMEM (미국 메릴랜드주 로크빌 소재의 라이프 테크놀로지스)이다. 4 일 동안 배양한 후에, 배지를 제거하였다. 재조합 비어의 발현을 항-FLAG (등록상표) M2 모노클로날 항체 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치사)를 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 항-FLAG M2 친화성 컬럼 ("포유동물의 일시적 발현 시스템", 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치사)을 이용하여 재조합 비어 단백질을 정제하였다. 컬럼 프로파일을 항-FLAG M2 모노클로날 항체를 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
B. SF9 곤충 세포에서의 발현:
인간 비어 유전자 서열을 표준 조건 및 하기 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다:
센스 프라이머: 5'-GTCGTCGGATCCATGGGGTGGCAGGCGTTCAAGAATGAT-3' (서열 26)
안티센스 프라이머: 5'-GTCGTCAAGCTTCTACTTGTCATCGTCCTTGTAGTCGTA GGCGTTCTCCAGCTCGGC-3' (서열 27)
생성된 cDNA는 두 가지 변형된 형태를 갖는 비어의 코딩 영역을 함유한다. N-말단의 분비 신호를 제거하고, FLAG 에피토프 태그 (시그마사)를 삽입체의 C-말단부의 프레임에 맞추어 (in-frame) 융합시켰다. BamHI 및 HindIII 클로닝 부위를 첨가하고, 유전자를 표준 방법을 이용하여 배큘로바이러스 발현 벡터로 전달하는데 사용하기 위한 pMelBac 벡터 (인비트로젠사)에 서브클로닝하였다.
비어 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 Bac-N-Blue 형질감염 키트 (인비트로젠사)를 이용하여 제조하고, 제조사의 지시에 따라 정제하였다.
SF9 세포 (인비트로젠사)를 10％ 태아 송아지 혈청을 함유하는 TNM_FH 배지 (인비트로젠사)에 넣어 두었다. 단백질을 발현시키기 위해, 스피너 플라스크에 함유된 SF9 배양액을 10을 초과하는 MOI로 감염시켰다. 배지 및 세포의 샘플을 5 일 동안 매일 채취하고, 비어 발현을 항-FLAG M2 모노클로날 항체 (시그마사) 또는 항-비어 토끼 폴리클로날 항혈청을 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 모니터링하였다.
5일 후에, 배큘로바이러스-감염된 SF9 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 세포 관련 단백질을 고염도의 추출 완충액 (1.5 M NaCl, 50 mM 트리스 (pH 7.5))을 사용하여 세포 펠렛으로부터 추출하였다. 추출물 (배양액 300 ml 당 20 ml)을 원심분리하여 맑게 하고, 트리스 완충된 염수 (150 mM NaCl, 50 mM 트리스 (pH 7.5)) 4 L에 대해 3회 투석하고, 다시 원심분리하여 맑게 하였다. 상기 고염도 분획을 하이트랩 헤파린 (trap Heparin) (파마시아 (Pharmacia); 5 ml 베드 부피)에 첨가 하고, HEPES 완충된 염수 (25 mM HEPES 7.5, 150 mM NaCl)로 충분히 세척하고, 결합된 단백질을 150 mM NaCl 내지 1200 mM NaCl의 구배로 용출하였다. 대략 800 mM NaCl의 구배에서 비어가 용출되는 것이 관찰되었다. 비어 함유 분획에 10％ 글리세롤 및 1 mM DTT를 보충하고, -80 ℃에서 동결시켰다.
실시예 4
비어, 그렘린 및 댄에 대한 폴리클로날 항체의 제조 및 시험
A. 항원의 제조:
인간 비어, 인간 그렘린 및 인간 댄의 DNA 서열을 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 표준 PCR 방법에 의해 증폭시켰다:
인간 비어
센스: 5'-GACTTGGATCCCAGGGGTGGCAGGCGTTC-3' (서열 28)
안티센스: 5'-AGCATAAGCTTCTAGTAGGCGTTCTCCAG-3' (서열 29)
인간 그렘린
센스: 5'-GACTTGGATCCGAAGGGAAAAAGAAAGGG-3' (서열 30)
안티센스: 5'-AGCATAAGCTTTTAATCCAAATCGATGGA-3' (서열 31)
인간 댄
센스: 5'-ACTACGAGCTCGGCCCCACCACCCATCAACAAG-3' (서열 32)
안티센스: 5'-ACTTAGAAGCTTTCAGTCCTCAGCCCCCTCTTCC-3' (서열 33)
각각의 경우에, 상기 나열된 프라이머는 분비 신호 서열을 제외한 코딩 영역 전부를 증폭시킨다. 이들은 비어 및 그렘린의 경우에는 BamHI/HindIII 부위, 댄의 경우에는 SacI/HindIII 부위에서 박테리아 발현 벡터 pQE-30 (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠사)에 서브클로닝하는데 사용되는 제한효소 부위를 포함한다. pQE30은 클로닝 영역의 5' 말단에 위치한 6x His 태그에 대한 코딩 서열을 함유한다. 완성된 구조물을 이. 콜라이 균주 M-15/pRep (퀴아젠사)로 형질전환시키고, 각각의 클론을 서열분석을 통해 확인하였다. 제조사 (퀴아젠사, 퀴아익스프레셔니스트 (The QIAexpressionist))가 설명하는 바와 같이 단백질을 M-15/pRep에서 발현시키고, 정제 (세파로스 (Sepharose)에 커플링된 Ni-NTA에 결합하는 6x His 친화성 태그)하였다.
이. 콜라이-유래된 비어 단백질을 6 M 구아니딘에 용해시켜 유의한 양으로 회수하고, 2 내지 4 M으로 투석하여 보관하는 동안 침전되는 것을 방지하였다. 비어 및 댄 단백질을 6 M 구아니딘 및 정제후 0.5 M 농도의 구아니딘에 용해시켜 보다 많은 양을 회수하였다.
B. 폴리클로날 항체의 생산 및 시험:
3 가지 항원 각각에 대한 폴리클로날 항체를 표준 프로토콜을 이용하여 토끼 및 닭 숙주에서 생산하였다 ([R ＆ R Antibody, Stanwood, WA; standard protocol for rabbit immunization and antisera recovery; Short Protocols in Molecular Biology. 2nd edition. 1992. 11.37-11.41. Contributors Helen M. Cooper and Yvonne Paterson; chicken antisera was generated with Strategic Biosolutions, Ramona, CA]).
토끼 항혈청 및 달걀 Igy 분획을 웨스턴 블롯을 통해 활성에 대해 스크리닝 하였다. 상기 3 가지 항원 각각을 PAGE에 의해 분리하고, 0.45 ㎛ 니트로셀룰로스 (미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 노벡스사 (Novex))로 전달하였다. 막은 각각 대략 75 ng의 항원을 함유하는 스트립으로 절단하였다. 이 스트립을 3％ 블롯팅 그레이트 블락 (Blotting Grade Block) (미국 캘리포니아주 허큘레스 소재의 바이오-랩 레버러토리즈사 (Bio-Rad Laboratories)) 중에서 차단시키고, 1X 트리스 완충 염수 (TBS)/0.02％ TWEEN 완충액으로 3회 세척하였다. 1차 항체 (차단 완충액 중 1:100 내지 1:10,000 범위의 희석액 중에서 혈액, 토끼 항혈청 또는 달걀 IgY를 미리면역화시킴)를 부드럽게 진동시키면서 1 시간 동안 스트립과 함께 인큐베이션하였다. 이를 1X TBS/0.02％ TWEEN으로 3회 세척한 후에 2차 항체 (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 라이프 사이언스사 (Amersham Life Science)의 퍼옥시다제 접합된 당나귀 항-토끼 항체; 또는 미국 펜실베니아 웨스트 그로브 소재의 잭슨 이뮤노리서치사 (Jackson ImmunoResearch)의 퍼옥시다제 접합된 당나귀 항-닭 항체)와 함께 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로 1X TBS/0.02％ TWEEN으로 3회 세척하고, 스트립을 루미-라이트 (Lumi-Light) 웨스턴 블롯팅 기질 (독일 만하임 소재의 로쉐 몰레큘라 바이오케미칼즈사 (Roche Molecular Biochemicals))을 사용하여 발색시켰다.
C. 항체 교차-반응성 시험:
이전 단락에 기재된 프로토콜에 따라, 비어, 그렘린 또는 댄의 니트로셀룰로스 스트립을 각각 이들의 토끼 항혈청 또는 달걀 IgY의 희석액 (1:5000 및 1:10,000) 뿐만 아니라 나머지 두 가지 항원에 대해 제조된 항혈청 또는 달걀 Igy 의 희석액 (1:1000 및 1:5000 희석액)과 함께 인큐베이션하였다. 매칭되지 않은 항체의 수준을 증가시켜 증가된 농도에서만 관찰될 수 있는 상기 항체에 의한 낮은 친화성 결합을 검출하였다. 상기 기재된 프로토콜을 이용하는 3 가지 결합 사건 모두에서 프로토콜 및 반응 지속기간은 동일하였다. 시험된 항원 중 어느 것에서도 항원 교차-반응성은 관찰되지 않았다.
실시예 5
비어와 TGF-β 거대족 단백질과의 상호작용
비어와 TGF-β 거대족의 상이한 계통발생 완 (arm)으로부터의 단백질과의 상호작용을 면역침전 방법을 이용하여 연구하였다. 정제된 TGFβ-1, TGFβ-2, TGFβ-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 및 GDNF를 상업적 공급원 (미국 미네소타주 미네아폴리스 소재의 알 앤드 디 시스템즈사 (R ＆ D systems))으로부터 입수하였다. 대표적인 프로토콜은 다음과 같다. 부분적으로 정제된 비어를 HEPES 완충된 염수 (25 mM HEPES 7.5, 150 mM NaCl)로 투석하였다. IP 완충액 (150 mM NaCl, 25 mM 트리스 (pH 7.5), 1 mM EDTA, 1.4 mM β-머캅토에탄올, 0.5％ 트리톤 X 100, 및 10％ 글리세롤) 300 ㎕ 중에서 면역침전법을 수행하였다. 재조합 인간 BMP-5 단백질 (알 앤드 디 시스템즈사) 30 ng을 FLAG 에피토프-태깅된 비어 500 ng의 존재 및 부재하에 FLAG 친화성 매트릭스 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마사) 15 ㎕에 첨가하였다. 단백질을 4 ℃에서 4 시간 동안 인큐베이션한 후에 친화성 매트릭스-관련 단백질을 IP 완충액으로 5회 (1회 세척시 1 ml) 세척하였다. 결합된 단백질을 60 ㎕의 1X SDS PAGE 샘플 완충액 중 친화성 매트릭스로부터 용출하였다. 단백질 을 SDS PAGE에 의해 분리하고, 비어 관련 BMP-5를 항-BMP-5 항혈청 (리서치 디아그노스틱스사 (Research Diagnostics, Inc))을 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다 (도 5 참조).
비어 리간드 결합 분석:
FLAG-비어 단백질 (20 ng)을 PBS/0.2％ BSA 100 ㎕에 첨가하고, 항-FLAG 모노클로날 항체 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마사)로 미리 코팅시킨 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 흡착시키고, PBS 중 10％ BSA로 차단시켰다. 상기 절차는 실온에서 60 분 동안 수행하였다. 상기 단백질 용액을 제거하고, 웰을 세척하여 결합하지 않은 단백질을 제거하였다. BMP-5를 10 pM 내지 500 nM 범위 농도로 PBS/0.2％ BSA가 함유된 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 결합 용액을 제거하고, 플레이트를 200 ㎕ 부피의 PBS/0.2％ BSA로 3회 세척하였다. 이어서, BMP-5 수준을 BMP-5 항혈청을 사용하여 ELISA를 통해 검출하였다 (문헌 [F.M. Ausubel et al., (1998) Current Protocols in Mol Biol. Vol 2 11.2.1-11.2.22]). 전체 결합으로부터 비-특이적 결합을 감하고 리간드 프로그램에 의해 분석하여 특이적 결합을 산출하였다 (문헌 [Munson and Podbard, Anal. Biochem., 107, p220-239, (1980)]).
상기 방법이 변형된 다른 방법에서, 비어를 인간 Fc 융합 단백질로 설계하고 발현시켰다. 이와 마찬가지로, 리간드 BMP를 마우스 Fc 융합 단백질로 설계하고 발현시켰다. 이들 단백질을 함께 인큐베이션하고, 동종의 시간 분할된 형광 검출법을 이용하여 멜러 (Mellor) 등의 문헌 [G.W. Mellor et al., J of Biomol Screening, 3(2) 91-99, 1998]에 기재된 바와 같이 분석하였다.
실시예 6
TGF-β 결합-단백질의 TGF-β 족 구성원으로의 결합 억제에 대한 스크리닝 분석
상기 기재된 분석법을 하기 두 가지 사항을 제외하고는 동일하게 반복하였다. 첫째, BMP 농도를 미리 결정된 Kd에 고정되도록 유지하였다. 둘째, 길항제 후보 물질의 수집물을 고정된 농도로 첨가하였다 (유기 소분자 수집물의 경우에는 20 μM, 항체 연구시에는 1 μM). TGF-β 결합-단백질 결합에 대한 상기 후보 분자 (길항제)는 다양한 화학 구조를 나타내는 시판되는 수집물 또는 내부 수집물로부터 유래된 유기 화합물을 포함한다. 이러한 화합물을 DMSO 중 원액으로 제조하고, 표준 분석 조건 하에서 분석 웰에 1％ 미만의 최종 부피로 첨가하였다. 이들을 BMP 및 비어와 함께 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 용액을 제거하고, 결합된 BMP를 상기 기재된 바와 같이 정량하였다. 화합물 또는 항체의 부재하에 관찰된 BMP 결합을 40％ 억제하는 제제를 상기 상호작용의 길항제로 간주한다. 이들을 잠재적인 억제제로서 역가측정 연구에 기초하여 추가로 평가함으로써 이들의 억제 상수 및 TGF-β 결합-단백질 결합 친화성에 대한 영향을 결정하였다. 또한, 비교가능한 특이성 대조군 분석을 수행하여, BMP 리간드의 작용에 의존하는 분석법을 이용하는 연구 (예를 들어, BMP/BMP 수용체 경쟁 연구)를 통해 확인된 길항제에 대한 선택성 프로파일을 확립할 수 있었다.
실시예 7
TGF-β 결합-단백질의 뼈 매트릭스로의 국소화 억제
니콜라스 (Nicolas)의 문헌 [Nicolas, V. Calcif Tissue Int. 57:206, 1995])의 방법을 변형시킨 방법을 이용하여 뼈 매트릭스 (히드록시아파타이트)로의 국소화를 억제하는 정도를 평가하였다. 요컨대, 125I-표지된 TGF-β 결합-단백질을 니콜라스의 상기 문헌에 기재된 바와 같이 제조하였다. 히드록시아파타이트를 폴리프로필렌 여과 막이 장착된 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (미국 메사추세츠주 웨이마우스 소재의 폴리필트론인크사 (Polyfiltroninc))의 각 웰에 첨가하였다. TGF-β 결합-단백질을 PBS 완충액 중 0.2％ 알부민에 첨가하였다. 매트릭스를 함유하는 웰을 상기 완충액으로 3회 세척하였다. 흡착된 TGF-β 결합-단백질을 0.3 M NaOH를 사용하여 용출하고, 정량하였다.
TGF-β 결합-단백질을 시험 분자와 함께 인큐베이션하고, 이 혼합물을 상기 기재된 바와 같이 매트릭스에 첨가하여 억제제를 확인하였다. 매트릭스를 PBS 완충액 중 0.2％ 알부민으로 3회 세척하였다. 흡착된 TGF-β 결합-단백질을 0.3 M NaOH를 사용하여 용출하고, 정량하였다. 화합물 또는 항체의 부재하에 관찰된 TGF-β 결합-단백질 결합을 40％ 억제하는 제제를 뼈 국소화 억제제로 간주한다. 이러한 억제제의 특징을 투여량 반응 연구를 통해 추가로 규명하여 이들의 억제 상수 및 TGF-β 결합-단백질 결합 친화성에 대한 영향을 결정하였다.
실시예 8
TGF-β 결합-단백질 돌연변이체의 제작
A. 돌연변이유발:
pBluescript SK 내의 전장 TGF-β 결합-단백질 cDNA를 돌연변이유발을 위한 주형으로 사용하였다. 요컨대, 적절한 프라이머 (상기 논의 부분 참조)를 사용하고, 벤트 (Vent) DNA 중합효소 (미국 메사추세츠주 비벌리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스사 (New England Biolabs))를 사용하는 중합효소 연쇄 반응에 의해 DNA 단편을 생성시켰다. 중합효소 연쇄 반응은 57 ℃의 어닐링 온도를 이용하고 제조사로부터 제공된 완충액 중에서 23 사이클 동안 수행하였다. 이어서, 상기 산물을 두 가지 제한 효소에 노출시킨 후에 아가로스 겔 전기영동법을 이용하여 단리하고, 제한효소로 분해하여 매칭 서열을 제거한 pRBP4-503에 다시 라이게이션시켰다. 돌연변이체의 통합성을 DNA 서열분석을 통해 확인하였다.
B. 포유동물 세포의 발현 및 돌연변이 TGF-β 결합-단백질의 단리:
돌연변이 TGF-β 결합-단백질 cDNA를 실시예 3에 기재된 pcDNA3.1 포유동물 발현 벡터에 전달하였다. 서열을 확인한 후에, 생성된 구조물을 COS-1 세포에 형질감염시키고, 분비된 단백질을 실시예 3에 기재된 바와 같이 정제하였다.
실시예 9
동물 모델-I
비어 유전자를 과다발현하는 트렌스제닉 마우스의 제조
CITB 마우스 게놈 DNA 라이브러리 (미국 알라바마주 헌츠빌 소재의 리서치 제네틱스사로부터 제공됨)로부터 단리된 ~200 kb의 BAC 클론 15G5를 사용하여 마우스 비어 유전자 및 그의 5' 및 3' 플랜킹 (flanking) 영역의 완전한 서열을 결정하였다. 유전자 전체 서열 및 ~17 kb의 5' 플랜킹 서열 및 ~20 kb의 3' 플랜킹 서열 을 함유하는 41 kb의 SalI 단편을 SuperCosI 코스미드 벡터 (미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진사 (Stratagene))의 BamHI 부위에 서브클로닝하고, 이. 콜라이 균주 DH10B에서 증식시켰다. 이어서, 상기 코스미드 구조물로부터, 마우스 비어 유전자 전체 서열 뿐만 아니라 각각 17 kb 및 14 kb의 5' 및 3' 플랜킹 서열을 포함하는 35 kb의 MluI-AviII 제한효소 분해 단편 (서열 6)을 통상적인 수단을 이용하여 겔 상에서 정제하고, 이를 마우스 접합체 (DNX 트랜스제닉스 (DNX Transgenics); 미국 특허 제4,873,191호)를 마이크로인젝션 (microinjection)하는데 사용하였다. 클로닝된 DNA 단편을 게놈에 랜덤하게 통합시켜 생성된 동물을 5 내지 30％의 생아 출생률로 수득하였다. 소량의 마우스 조직, 예컨대 꼬리 끝부분 조직으로부터 추출된 게놈 DNA에 대한 서던 (Southern) 블롯 분석을 수행하여 트랜스진의 존재 여부를 확인하였다. 하기 프로토콜을 이용하여 DNA를 추출하였다: 조직을 200 mM NaCl, 100 mM 트리스 (pH 8.5), 5 mM EDTA, 0.2％ SDS 및 0.5 mg/ml 프로테이나제 K를 함유하는 55℃의 용해 완충액 중에서 밤새 분해하였다. 그 다음날, DNA를 페놀/클로로포름 (50:50)으로 1회, 클로로포름/이소아밀알코올 (24:1)로 1회 추출하고, 에탄올로 침전시켰다. TE (10 mM 트리스 (pH 7.5), 1 mM EDTA) 중에서 재현탁하면서, 각각의 DNA 샘플 8 내지 10 ㎍을 제한 엔도뉴클레아제, 예컨대 EcoRI으로 분해하고, 이를 겔 전기영동하고, 하전된 나일론 막, 예컨대 HyBondN+ (미국 일리노이주 알링톤 헤이츠 소재의 아머샴사)로 전달하였다. 이어서, 생성된 필터를, 마우스 비어 유전자 로커스로부터 유래되었으며 내생 유전자 로커스로부터 유래된 단편 및 트랜스진으로부터 유래된 크기가 다른 단편 둘 모두를 인식할 수 있는 DNA의 방사선 동위원소로 표지된 단편과 혼성화시켰다. 생성된 동물을 정상적인 비-트랜스제닉 마우스로 성장시켜 비어 유전자 과다발현의 효과를 측정하기에 충분한 수의 트랜스제닉 및 비-트랜스제닉 자손을 생성하였다. 상기 연구에서, 다양한 연령대의 동물 (예를 들어, 생후 1일, 3주, 6주, 4개월 된 동물)을 대상으로 하여 총체적인 골격 형성, 뼈 무기질 밀도, 뼈 무기질 함량, 파골세포 및 골모세포 활성, 연골내 골화의 정도, 연골 형성 등을 확인하기 위해 설계된 다수의 다른 분석을 수행하였다. 트랜스진으부터의 전사 활성은 다양한 조직으로부터 RNA를 추출하고, 트랜스진이 유래되는 마우스 종 (129Sv/J)과 DNA 마이크로인젝션에 사용되는 마우스 종 [(C57BL5/J x SJL/J)F2] 사이의 단일 뉴클레오티드 다형성의 이점을 갖는 RT-PCR 분석을 이용하여 측정할 수 있다.
동물 모델-II
상동성 재조합에 의한 마우스 비어 유전자의 파괴
배아 줄기 (ES) 세포에서 상동성 재조합을 사용하여 내인성 마우스 비어 유전자를 불활성화시키고, 후속적으로 기능 손실 돌연변이를 갖는 동물을 생성시킬 수 있다. 이. 콜라이의 β-갈락토시다제 유전자와 같은 리포터 유전자를 유전공학적으로 표적 벡터에 삽입함으로써 그의 발현을 내인성 비어 유전자의 프로모터 및 번역 개시 신호에 의해 제어하였다. 이러한 방법으로, 표적 대립형질을 가진 동물에서 비어 유전자 발현의 시공 패턴을 측정할 수 있다.
먼저, pGT-N29 (미국 매사추세츠주 비벌리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))로부터의 약물-선별가능 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터 제어 네오마이신-내성 유전자 (neo) 카젯트를 클로닝 벡터 pSP72 (미국 위스콘신주 매드슨 소재의 프로메가(Promega))로 클로닝함으로써 표적 벡터를 제작하였다. PCR을 사용하여 P1 Cre 리콤비나제에 대한 인식 부위인 박테리오파아지 P1 loxP 부위로 PGKneo 카젯트를 플랭킹시켰다 (문헌 [Hoess et al., PNAS USA, 79: 3398, 1982]). 이를 통하여 후속적으로 표적 ES 세포 또는 ES 세포-유래 동물 (미국 특허 제4,959,317호)에서 neo-내성 마커를 제거시켰다. PCR 프라이머는 34개의 뉴클레오티드 (ntd) loxP 서열, PGKneo 카젯트의 5' 및 3' 말단에 상보적인 15 내지 25개의 ntd, 및 pSP72로의 클로닝을 위한 내성 효소 인식 부위 (센스 프라이머의 BamHI 및 안티-센스 프라이머의 EcoRI)로 이루어져 있다. 센스 프라이머의 서열은 5'-AATCTGGATCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTGCAGGATTCGAGGGCCCCT-3' (서열: 34)이고; 안티-센스 프라이머의 서열은 5'-AATCTGAATTCCACCGGTGTTAATTAAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATAGATCTAGAGTCAGCTTCTGA-3' (서열: 35)이다.
다음 단계에서 이. 콜라이 β-갈락토시다제 유전자 및 pSVβ (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 클론텍(Clontech))로부터의 SV40 폴리아데닐화 신호를 함유하는 3.6 kb XhoI-HindIII 단편을 pSP72-PGKneo 플라스미드로 클로닝하였다. BAC 클론 15G5로부터의 2.4 kb 단편을 증폭시킴으로써 마우스 비어 좌위 유래 상동성 "단완(short arm)"을 발생시켰다. 3' 말단 단편은 비어 유전자의 번역 개시 부위에 일치하며, PCR에 사용된 안티-센스 프라이머는 또한 β-갈락토시다제 유전자의 5' 말단에 상보적인 30개의 ntd를 포함하므로 그의 코딩 영역은 틀 내에서 비어 개시 부위와 융합될 수 있다. "단완"을 pSP72-βgal-PGKneo 플라스미드로 도입시키기 위해 취해진 접근법은 β-gal 유전자의 상류 부위에서 플라스미드를 선형화시키고, 이어서 상기 단편과 "단완" PCR 생성물로 동시 형질감염시키고, PCR 생성물이 상동성 재조합에 의해 통합된 플라스미드를 선별하는 것이다. "단완" 증폭을 위한 센스 프라이머는 상기 재조합 사건이 일어나도록 하기 위해 pSP72 벡터에 상보적인 30개의 ntd를 포함하였다. 센스 프라이머 서열은 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGAGCAGCTGAAGCTTAACCACATGGTGGCTCACAACCAT-3' (서열: 36)이고, 안티-센스 프라이머 서열은 5'-AACGACGGCCAGTGAATCCGTAATCATGGTCATGCTGCCAGGTGGAGGAGGGCA-3' (서열: 37)이었다.
희귀-절단 제한 효소 부위 SgrAI, FseI, AscI 및 PacI으로도 도입되는 프라이머로 AC 클론 15G5 유래의 6.1 kb 단편을 증폭시킴으로써 비어 유전자 좌위 유래의 "장완(long arm)"을 생성시켰다. 구체적으로, 센스 프라이머 서열은 5'- ATTACCACCGGTGACACCCGCTTCCTGACAG-3' (서열: 38)이고; 안티-센스 프라이머의 서열은 5'-ATTACTTAATTAAACATGGCGCGCCATATGGCCGGCCCCTAATTGCGGCGCATCGTTAATT-3' (서열: 39)이다. 생성된 PCR 생성물을 중간 단계로서 TA 벡터 (미국 캘리포니아주 칼스버드 소재의 인비트로겐(Invitrogen))로 클로닝하였다.
마우스 비어 표적 작제물은 또한 제2 선별 마커인 라우스(rous) 육종 바이러스 장말단 반복 인자 (RSV LTR)의 조절하의 헤르페스 심플렉스 바이러스 I 티미딘 키나제 유전자 (HSVTK)를 포함하였다. 상기 유전자가 발현됨으로써 포유동물 세포는 간시클로비르에 대해 민감 (생존불가능)해진다; 따라서, 이는 비상동성 사건에 의해 작제물이 통합된 네오마이신-내성 세포를 선별하는데 있어 편리한 방법이다 (미국 특허 제5,464,764호). 뒤이어 "장완"-TA 벡터 플라스미드의 FseI 및 AscI 부위로 클로닝할 수 있게 하는 프라이머를 사용하여 pPS1337로부터 RSVLTR-HSVTK 카젯트를 증폭시켰다. 상기 PCR의 경우, 센스 프라이머의 서열은 5'-ATTACGGCCGGCCGCAAAGGAATTCAAGA TCTGA-3' (서열: 40)이고; 안티-센스 프라이머의 서열은 5'- ATTACGGCGCGCCCCTCACAGGCCGCACCCAGCT-3' (서열: 41)이었다.
표적 벡터의 제작의 최종 단계에서, "장완" 및 RSVLTR-HSVTK 유전자를 함유하는 8.8 kb SgrAI-AscI 단편을 pSP72-"단완"-βgal-PGKneo 플라스미드의 SgrAI 및 AscI 부위로 클로닝하였다. 상기 표적 벡터를 AscI 또는 PacI으로 분해하여 선형화시킨 다음 ES 세포로 전기 천공시켰다.
실시예 10
안티센스-매개 비어 불활성화
제1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 비어 전사물의 번역 개시 AUG와 겹쳐지게 하고, 뒤이은 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이 비어 AUG에 대해 5' 방향으로 5개의 뉴클레오티드 간격으로 움직일 수 있도록 (50 뉴클레오티드 거리 이하)하는 방식과 같이 17개의 뉴클레오티드 안티센스 올리고뉴클레오티드를 겹쳐지는 형태로 제조하였다. 상응하는 대조 올리고뉴클레오티드를 설계하고, 등가 염기 조성물을 이용하여 제조하였으나, 서열 내에서 재분배시켜 코딩 mRNA에 대한 임의의 유의적인 혼성화를 억제하였다. 양이온성 지질 운반을 통해 시약을 시험 세포내 시스템으로 전달하였다 (문헌 [P.L. Felgner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413, 1987]). 안티센스 올리고뉴클레오티드 2 μg을 환원성 혈청 배지 ((Opti-MEMI 환원성 혈청 배지; 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)) 100 μl에 첨가하고, 이를 환원성 혈청 배지 100 μl 중 리포텍틴(Lipofectin) 시약 (6 μl) (미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 라이프 테크놀로지즈)과 혼합하였다. 이들을 혼합하고, 실온에서 30분 동안 합하고, 혼합물을 미리 시딩한 MC3T3E21 또는 KS483 세포에 첨가하였다. 이들 세포를 배양하고, mRNA를 회수하였다. 비어 특이적 프라이머를 사용하는 RT-PCR을 이용하여 비어 mRNA를 모니터링하였다. 또한, 분리된 실험 웰을 수집하고, 단백질 수준을 실시예 4에 기재된 웨스턴 블롯 방법을 통해 특징규명하였다. 상기 세포를 수확하고, 용해 완충액 (50 mM 트리스 (pH 7.5), 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% SDS) 중에 재현탁시키고, 가용성 단백질을 수집하였다. 상기 물질을 10 내지 20% 구배 변성 SDS PAGE에 적용하였다. 분리된 단백질을 니트로셀룰로스로 옮기고, 기재한 항체 시약을 사용하여 상기한 바와 같이 웨스턴 블롯을 수행하였다. 별법으로, 대조 올리고뉴클레오티드를 동일한 배양액에 첨가하고, 실험 작업을 반복하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였을 때 대조군 스크램블 올리고뉴클레오티드와 비교하여 50%가 변한 경우, 비어 mRNA 또는 단백질 수준의 감소는 유의한 것으로 간주된다. 이러한 방법론은 조직 배양 모델에서 선별 유전자 불활성 및 후속적인 광물화 결절의 표현형 특징규명을 할 수 있게 한다.
실시예 11
스클레로스틴 코어 영역의 모델링
상동성 인식 기술 (예를 들어, PSI-BLAST (문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997)]), FUGUE (문헌 [Shi et al., J. Mol. Biol. 310: 243-57 (2001)])은 SOST (SOST_코어)의 코어 영역이 시스틴-결찰 주름을 택하는 것으로 제시하였다. FUGUE는 서열과 구조 사이의 상동성을 검출하는데 예민한 방법이다. FUGUE (쉬(Shi)와 그의 동료들의 상기 문헌)에 의해 실험으로 결정된 3D 구조가 공지되어 있는 인간 융모막 고나도트로핀 β (hCG-β)를 SOST_코어의 가장 밀접한 동족체로서 규명하였다. 따라서, hCG-β를 구조 주형으로 사용하여 SOST_코어에 대한 3D 모델을 구축하였다.
SOST_코어 및 그의 밀접한 동족체의 정렬을 도 7에 나타냈다. 정렬에 나타낸 동족체 중에서, 단지 hCG-β (CGHB)만이 공지된 3D 구조를 가졌다. SOST_코어와 hCG-β 간의 서열 동일성은 약 25%였다. 8개의 CYS 잔기는 족을 통해 보존되어 있으며, 이는 SOST_코어와 hCG-β 간의 전체적 구조 유사성을 강조하는 것이다. 3쌍의 시스틴 (1-5, 3-7, 4-8)은 "결찰" 구조에서 이황화 결합을 형성하였으며 (도 7에 실선으로 나타냄), 이는 시스틴-결찰 주름으로 특징지워진다. 도 7에 점선으로 나타낸 여분의 이황화 결합 (2-6)은 이들 족에 대해 독특하며, 단백질 족을 다른 시스틴-결찰 족 (예를 들어, TGF-β, BMP)과 구분시킨다.
SOST_코어는 구조 주형으로서 PDB (문헌 [Berman et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 58(Pt 6 Pt1): 899-907 (2002)]) 기재 1HCN인 hCG-β의 3D 구조 (문헌 [Wu et al., Structure 2: 545-58 (1994)])를 이용하여 모델링하였다. 가장 우수한 모델의 스냅 사진을 도 8에 나타냈다.
대부분의 시스틴-결찰 단백질은 단량체의 소수성 코어의 부족 때문에 이량체를 형성한다 (슈에우플러(Scheufler)와 그의 동료들의 상기 문헌; 문헌 [Schlunegger and Grutter, J. Mol. Biol. 231:445-58 (1993)]); 와우(Wu)와 그의 동료들의 상기 문헌). SOST는 대체로 동일한 규칙을 따르며 동종이량체를 형성하여 그의 안정성을 증가시킨다. (1) SOST_코어와 hCG-β간의 서열 유사성은 낮고 (25%); (2) 동종이량체 대신에, hCG-β는 hCG-α와 이종이량체를 형성하며; (3) 다수의 상이한 단량체의 상대적 형태가 상이한 부류로부터의 이량체화 시스틴-결찰 단백질 (예를 들어, PDGF, TGF-β, 신경영양인자(Neurotrophin), IL-17F, 고나트로핀)에서 관찰되었으며, 이는 SOST의 이량체 형태가 hCG-α/β 이종이량체 형태로부터 상당히 달라질 수 있음을 제시하기 때문에 이량체화 SOST_코어 영역에 대한 모델 구축은 몇가지 난제가 존재한다. 상기 모델을 구축하는데 있어, 구조 중첩 기술을 수동 조절과 함께 이용하여 hCG-α를 이종이량체 구조 (1HCN) 유래의 hCG-β로 대체하고, 이어서 SOST_코어 동종이량체 모델을 가상의 hCG-β 동종이량체 구조에 따라 구축하였다. 최종 모델을 도 9에 나타냈다.
실시예 12
SOST-BMP 상호작용 모델링
이 실시예에서는 BMP와 SOST간의 상호작용을 수반하는 BMP 상의 제I형 및 제II형 수용체 결합 부위의 단백질 모델링을 기재한다.
경쟁 연구들은 SOST가 BMP와 결합하기 위해 제I형 및 제II형 수용체 둘다와 경쟁함을 입증하였다. ELISA-기반 경쟁 분석에서, BMP-6는 높은 친화도 (KD = 3.4 nM)를 갖는 스클레로스틴-코팅 표면 (300 ng/웰)과 선별적으로 상호작용하였다. BMP 수용체 IA (FC 융합 작제물)의 증가된 양은 BMP-6 (11 nM) (IC50 = 114 nM)에 결합하기 위해 스클레로스틴과 경쟁하였다. BMP 수용체의 10배의 몰 과량은 스클레로스틴의 BMP-6과의 결합을 약 60%까지 감소시키는데 충분하였다. 이러한 경쟁은 또한 BMP 수용체 II-FC 융합 단백질 (IC50 = 36 nM) 및 댄(IC50 = 43 nM)과 함께 관찰되었다. 분석의 특이성은 스클레로스틴과 액티빈(Activin) R1B-FC 융합 단백질 (BMP와 결합하지 않는 TGF-β 수용체족 일원) 간의 BMP-6과의 결합 경쟁 부족으로 나타났다.
BMP 폴리펩티드에 대한 제I형 및 제II형 수용체 결합 부위를 맵핑하고, 공간적으로 분리시켰다 (슈에우플러와 그의 동료들의 상기 문헌; 인니스(Innis)와 그의 동료들의 상기 문헌; 니켈(Nickel)과 그의 동료들의 상기 문헌; 하르트(Hart)와 그의 동료들의 상기 문헌). 높은 친화도를 가지고 BMP와 결합하는 또다른 BMP 길항제인 노긴은 노긴의 N-말단 부분을 통해 제I형 및 제II형 수용체 결합 부위 둘다에서 BMP와 접촉한다 (그로프(Groppe)와 그의 동료들의 상기 문헌). C-말단 근처의 코어 영역에서의 2개의 β-가닥은 또한 제II형 수용체 결합 부위에서 BMP와 접촉한다.
노긴과 SOST의 수작업 조정된 서열 정렬은 2개의 폴리펩티드가 단백질의 N-말단 부분 및 코어 영역 사이에서 서열 유사성을 공유함을 나타냈다. 아미노산 서 열 정렬은 도 10에 나타냈다. 특징적 cys-결찰을 형성하는 시스테인 잔기는 노긴과 SOST 사이에 보존되어 있다. 전체적인 서열 동일성은 24%이고, N-말단 결합 영역 (정렬 위치 1-45) 내의 서열 동일성은 33%였다. 노긴 N-말단 결합 영역의 2개의 잔기, 즉 정렬 위치 21의 Leu (L) 및 위치 23의 Glu (E)은 BMP 결합 (그로프와 그의 동료들의 상기 문헌)에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다. 이들 잔기 둘다는 SOST에서도 보존되어 있다. 코어 영역 (정렬 위치 131-228)의 서열 유사성은 약 20%이나, cys-결찰 골격을 유지하고, 충분한 수의 주요 잔기가 보존되어 있었으며, 이는 노긴과 SOST 간의 상동성을 지지한다.
노긴 구조를 SOST와 비교하여 2개의 SOST 단량체의 이량체화 방법을 이해하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 노긴 구조는 N-말단 영역과 코어 영역 간의 링커가 2개의 영역을 접촉시키는데 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 2개의 노긴 단량체 간의 이량체화 접촉면 부분을 형성함을 제시하였다. 노긴과 SOST 간의 중요한 하나의 차이는 N-말단 영역과 코어 영역 간의 링커가 SOST에서 훨씬 더 짧다는 것이다.
SOST의 C-말단 영역은 SOST 이량체화에서 역할을 담당할 수 있다. 노긴 서열의 말단은 코어 영역인 반면, SOST는 여분의 C-말단 영역을 가졌다. 노긴 구조에서 이황화 결합은 2개의 노긴 단량체의 C-말단과 접촉하였다. 이와 같이, SOST의 C-말단 영역은 2개의 단량체 접촉면과 가까이 출발하고, 이량체화에 기여할 수 있다. 또한, 2차 구조 예측은 SOST의 C-말단 영역의 특정 부분이 헬릭스(helix)를 형성하는 경향이 있는 것으로 나타났다. SOST의 이러한 영역은 아마도 노긴의 더 긴 링커 작용을 모방하는 헬릭스-헬릭스 패킹을 통해 이량체화 활성을 담당할 수 있다. 노긴과 SOST 구조 간의 또다른 차이는 정렬 위치 169-185의 SOST 코어 영역의 아미노산 삽입이다 (도 10 참조). 이러한 삽입은 노긴 구조의 이량체화 접촉면을 향해 있는 β-헤어핀으로 연장된다 (단량체 및 상기의 C-말단 Cys 잔기의 중심에서 루프 영역으로서 도 11에 나타남). 연장된 β-헤어핀은 SOST 이량체화에 또한 기여할 수 있다.
실시예 13
SOST 펩티드 면역원의 설계 및 제조
이번 실시예는 동물을 면역시키고 항체를 생성시키는데 사용하는 SOST 펩티드 면역원의 설계를 설명하며, 여기서 상기 항체는 BMP와 SOST 간의 상호작용을 차단시키고 SOST 단량체의 이량체 형성을 방해한다.
BMP 결합 단편
SOST과 노긴 간의 전체적인 유사성 및 2개의 폴리펩티드의 N-말단 영역 간의 유사성은 SOST가 노긴과 유사한 방식으로 BMP와 상호작용할 수 있음을 제시한다. 즉, SOST의 N-말단 영역은 BMP 상의 제I형 및 제II형 수용체 결합 부위 둘다와 상호작용하고, 코어 영역의 부분 (도 10의 아미노산 정렬 위치 190-220)은 제II형 수용체 결합 부위와 상호작용하여 이러한 SOST 영역에 특이적인 항체가 SOST에 대한 BMP 결합을 차단하거나 저해시킬 수 있다.
래트 및 인간 SOST의 경우 이들 SOST 폴리펩티드 단편의 아미노산 서열은 하기와 같이 제공된다.
SOST_N_링커: N-말단 영역 (코어 영역에 접촉하는 짧은 링커를 포함함)
인간: QGWQAFKNDATEIIPELGEYPEPPPELENNKTMNRAENGGRPPHHPFETKDVSEYS (서열: 92)
래트: QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPPQELENNQTMNRAENGGRPPHHPYDTKDVSEYS (서열: 93)
SOST_코어_결합: BMP의 제II형 수용체 결합 부위에서 BMP와 접촉가능한 코어 영역 부분 (두개의 말단에서 조금 더 연장시켜 CYS 잔기 앵커를 포함시킴):
인간: PDRYRAQRVQLLCPGGEAPRARKVRLVASC (서열: 94)
래트: DRYRAQRVQLLCPGGAAPRSRKVRLVASC (서열: 95)
SOST 이량체화 단편
SOST의 C-말단 영역은 SOST 동종이량체 형성과 관련될 수 있다 (실시예 12 참조). 연장된 β-헤어핀은 또한 동종이량체 형성에 역할을 담당할 수 있다. 이러한 영역에 특이적으로 결합하는 항체는 SOST 단량체의 이량체화를 방해하거나 저해시킬 수 있으며, 이는 다음으로 SOST와 BMP 간의 상호작용을 방해할 수 있다. 이러한 영역에 상응하는 래트 및 인간 SOST의 폴리펩티드 단편은 하기와 같다.
SOST_C: C-말단 영역
인간: LTRFHNQSELKDFGTEAARPQKGRKPRPRARSAKANQAELENAY (서열: 96)
래트: LTRFHNQSELKDFGPETARPQKGRKPRPRARGAKANQAELENAY (서열: 97)
SOST_코어_이량체: SOST 이량체화에 관련이 있을 것 같은 코어 영역 부분 (두 말단에서 조금 더 연장시켜 Cys 잔기 앵커를 포함시킴):
인간: CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC (서열: 98)
래트: CGPARLLPNAIGRVKWWRPNGPDFRC (서열: 99)
SOST N-말단에서의 BMP 결합 단편
SOST의 주요 N-말단 결합 영역 (도 10에서의 정렬 위치 1-35)은 노긴/BMP-7 복합 구조 (단백질 데이타 뱅크 기재 번호: 1M4U) 및 아미노산 서열 정렬 (도 10 참조)를 기초로 모델링하여 BMP와 상호작용할 거 같은 SOST N-말단의 아미노산 잔기를 규명하였다. SOST의 모델을 도 12에 나타냈다. 비교 모델에서, SOST 서열의 정렬 위치 8의 페닐알라닌 (Phe, F) (화살표 및 이에 수반된 설명 참조)은 BMP 이량체의 표면 상의 소수성 포켓(pocket)으로 돌출되어 있다. 동일한 "노브-인투-홀(knob-into-hole)" 특징은 BMP 및 제I형 수용체 복합 구조에서 발견되며 (니켈과 그의 동료들의 상기 문헌), 여기서 수용체의 Phe85는 동일한 포켓에 꼭 맞으며, 상기 포켓은 TGF-β 거대족 일원 (예를 들어, TGF-β족, BMP족 등을 포함함)에 대한 리간드-제I형 수용체의 주요 특징이다. 모델에 따라, 프롤린 (Pro) 방향성 턴(turn)이 또한 보존되어 있으며, 이는 N-말단 결합 단편이 BMP 이량체 표면을 따라 늘어지게 하고, 제I형 수용체 결합 부위에서 복합체의 다른 면 상의 제II형 수용체 결합 부위로 이동하게 한다. 또한, 결합 단편의 카르복시 말단 가까이의 또다른 Pro-방향성 턴이 보존되어 있으며, 이는 링커 영역과 접촉한다. SOST와 BMP 간의 넓은 접촉은 도 12에서 명백하다.
펩티드 면역원
BMP 단백질과 접촉하는 예측 SOST N-말단 영역을 포함하는 펩티드를 설계하 였다. 이러한 단백질 서열은 하기에 나타냈다. 동물을 면역시키는 경우, 펩티드 서열이 겹쳐지도록 설계하고, 추가의 시스테인을 C-말단에 첨가하여 KLH와의 가교결합을 촉진시켰다. 이어서, 상기 펩티드를 면역화시키는데 사용하였다. 면역원의 펩티드 서열은 하기와 같다.
인간 SOST:
QGWQAFKNDATEIIPELGEY (서열: 47)
TEIIPELGEYPEPPPELENN (서열: 48)
PEPPPELENNKTMNRAENGG (서열: 49)
KTMNRAENGGRPPHHPFETK (서열: 50)
RPPHHPFETKDVSEYS (서열:51)
추가의 Cys를 가진 인간 SOST 펩티드:
QGWQAFKNDATEIIPELGEY-C (서열: 52)
TEIIPELGEYPEPPPELENN-C (서열: 53)
PEPPPELENNKTMNRAENGG-C (서열: 54)
KTMNRAENGGRPPHHPFETK-C (서열: 55)
RPPHHPFETKDVSEYS-C (서열: 56)
래트 SOST:
QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPP (서열: 57)
PEPPQELENNQTMNRAENGG (서열: 58)
ENGGRPPHHPYDTKDVSEYS (서열: 59)
TEIIPGLREYPEPPQELENN (서열: 60)
추가의 Cys를 가진 래트 SOST 펩티드:
QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPP-C (서열: 61)
PEPPQELENNQTMNRAENGG-C (서열: 62)
ENGGRPPHHPYDTKDVSEYS-C (서열: 63)
TEIIPGLREYPEPPQELENN-C (서열: 64)
하기 펩티드는 BMP 단백질과 접촉하게 하는 것으로 예측되는 코어 영역의 아미노산 부분을 함유하도록 설계되었다. KLH와의 결합을 위해 시스테인을 각 펩티드의 C-말단에 첨가하고, 결합된 펩티드를 면역화에 사용하였다. 도킹(Docking) 코어 N-말단 펩티드에서, 내부 시스테인을 세린으로 바꿔서 KLH와의 이중 결합을 피했다.
인간 SOST의 경우:
Cys 잔기를 첨가하지 않은 아미노산 서열:
도킹_코어_N-말단_펩티드: IPDRYRAQRVQLLCPGGEAP (서열: 66)
도킹_코어_C-말단_펩티드: QLLCPGGEAPRARKVRLVAS (서열: 67)
도킹_코어_N-말단_펩티드: IPDRYRAQRVQLLCPGGEAP-C (서열: 68)
도킹_코어_C-말단_펩티드: QLLCPGGEAPRARKVRLVAS-C (서열: 69)
래트 SOST의 경우:
Cys 잔기를 첨가하지 않거나 이를 치환하지 않은 아미노산 서열:
도킹_코어_N-말단_펩티드: IPDRYRAQRVQLLSPGG (서열: 70)
도킹_코어_C-말단_펩티드: PGGAAPRSRKVRLVAS (서열: 71)
Cys 잔기를 첨가하거나 이를 치환한 펩티드 면역원:
도킹_코어_N-말단_펩티드: IPDRYRAQRVQLLSPGG-C (서열: 72)
도킹_코어_C-말단_펩티드: PGGAAPRSRKVRLVAS-C (서열: 73)
잠재적으로 상호작용하여 SOST 동종이량체를 형성하는 SOST 내의 2개의 영역은 노긴에서 나타나지 않은 SOST 코어 영역에 아미노산을 포함하였다. 이러한 서열을 함유하도록 설계된 인간 SOST 펩티드는 KLH와 결합하는 C-말단 또는 N-말단 Cys를 가졌다. 래트 SOST 펩티드의 경우, 시스테인을 서열의 카르복시 말단에 첨가하였다. KLH 결합된 펩티드를 면역화에 사용하였다.
인간 SOST의 경우:
Figure 112005073679696-PCT00001
래트 SOST의 경우:
Figure 112005073679696-PCT00002
시스테인을 첨가한 래트 SOST 펩티드
Figure 112005073679696-PCT00003
잠재적으로 상호작용하여 SOST 동종이량체를 형성하는SOST 내의 제2 영역은 C-말단 영역을 포함한다. 펩티드 면역원은 이들 영역 내에 아미노산 서열 (하기 참조)을 포함하도록 설계하였다. KLH와의 접합을 위해, 시스테인 잔기를 C-말단에 첨가하고, 접합된 펩티드를 면역화에 사용하였다.
인간 SOST의 경우:
Figure 112005073679696-PCT00004
C-말단에서 Cys를 첨가한 펩티드 면역원:
Figure 112005073679696-PCT00005
래트 SOST의 경우:
Figure 112005073679696-PCT00006
C-말단에 Cys를 첨가한 펩티드 면역원:
Figure 112005073679696-PCT00007
실시예 14
항체의 TGA-베타 결합-단백질과의 결합을 검출하는 분석법
이 실시예는 리간드, 예를 들어 항체 또는 그의 항체 단편이 스클레로스틴에 결합한 것을 검출하는 분석법을 기재한다.
FLAG(등록상표)-스클레로스틴 융합 단백질을 제조사 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 알드리치(Sigma Aldrich))에 의해 제공된 프로토콜 및 미국 특허 제6,395,511호에 기재된 프로토콜에 따라 제조하였다. 96 웰 마이크로필터 플레이트의 각 웰을 항-FLAG(등록상표) 모노클로날 항체 (시그마 알드리치)로 코팅하고, 이어서 PBS 중 10% BSA로 차단하였다. PBS/0.2% BSA 100 μl에 첨가하고, 96-웰 플레이트 상에 융합 단백질 (20 ng)을 실온에서 60분 동안 흡착시켰다. 상기 단백질 용액을 제거하고, 웰을 세척하여 결합하지 않은 융합 단백질을 제거하였다. BMP, 예를 들어 BMP-4, BMP-5, BMP-6 또는 BMP-7을 PBS/0.2% BSA로 희석하고, 각 웰에 10 pM 내지 500 nM 범위의 농도로 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시킨 후, 결합 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS/0.2% BSA 200 μl 용량으로 3회 세척하였다. 표준 ELISA 기술 (문헌 [Ausubel er al., Current Protocols in Mol Biol. Vol 2 11.2.1-11.2.22 (1998)] 참조)에 따라 BMP에 특이적인 폴리클로날 항혈청 또는 모노클로날 항체 및 적합한 효소-접합된 제2 단계 시약을 사용하여 BMP의 스클레로스틴과의 결합을 검출하였다 (문헌 [Munson and Podbard, Anal. Biochem. 107: 220-39 (1980)]).
스클레로스틴의 BMP와의 결합은 또한 균일한 시간 분해 형광 검출법(homogeneous time resolved fluorescence detection)으로 검출하였다 (문헌 [Mellor et al., J Biomol. Screening, 3: 91-99 (1998)]). 당업계에 공지되고 본원에 기재된 방법에 따라 스클레로스틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 재조합 헥산 작제물의 인간 면역글로불린 불변 영역과 작동하게 연결시켜 Fc-스클레로 스틴 융합 단백질로서 발현시켰다. 유사하게는, BMP 리간드를 유전공학 처리하여 BMP-마우스 Fc 융합 단백질로서 발현시켰다. 이러한 2종의 융합 단백질을 함께 인큐베이션하여 멜러(Mellor)와 그의 동료들에 의해 기재된 바와 같이 분석을 수행하였다.
실시예 15
TGF-베타족 일원의 TGF-베타 결합 단백질과의 결합을 억제하는 항체에 대한 스크리닝 분석
이 실시예에서는 TGF-베타족 일원의 스클레로스틴의 결합을 억제하는 항체를 검출하는 방법을 기재한다. BMP 농도를 그의 Kd값 (예를 들어, BIA코어 분석에 의해 결정됨)에 고정시켰다는 점을 제외하고는 실시예 14에 기재된 바와 같이 ELISA를 본질적으로 수행하였다. 또한, 항체 또는 항체의 집합인 라이브러리를 1 μM의 농도로 웰에 첨가하였다. 항체를 BMP 및 스클레로스틴과 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 용액을 제거하고, 결합한 BMP를 기재한 바와 같이 정량하였다 (실시예14 참조). 항체의 부재하에 관찰되는 BMP 결합의 40%를 억제하는 항체는 이러한 상호작용의 길항제로 간주하였다. 이러한 항체는 TGF-베타 결합-단백질 결합 친화도에 대한 그들의 억제 상수 및 그의 효과를 결정하기 위한 적정 연구를 수행함으로써 추가로 잠재적인 억제제를 감정하였다. 또한, 상당한 특이성 조절 분석법을 수행하여 BMP 리간드 작용에 의존하는 분석법을 이용함으로써 규명된 길항제에 대한 선택성 프로필을 수립하였다 (예를 들어, BMP/BMP 수용체 경쟁 연구)
실시예 16
뼈 매트릭스에 대한 TGF-베타 결합-단백질 위치결정의 억제
니콜라스(Nicolas)의 방법 (문헌 [Calcif. Tissue Int. 57: 206-12 (1995)])의 변형법을 이용하여 뼈 매트릭스 (수산화인회석)에 대한 위치결정의 억제 평가를 수행하였다. 요약하면, 125I-표지 TGF-베타 결합-단백질을 니콜라스 (상기 문헌)에 기재된 바와 같이 제조하였다. 폴리프로필렌 여과막 (미국 매사추세츠주 위머스 소재의 폴리필트로닌크(Polyfiltroninc))이 장착된 96-웰 마이크로필터 플레이트의 각 웰에 수산화인회석을 첨가하였다. 매트릭스를 함유한 웰을 PBS 완충액 중 0.2% 알부민으로 3회 세척하였다. 0.3 M NaOH를 사용하여 흡착된 TGF-베타 결합-단백질을 용출시키고, 이어서 정량하였다.
상기한 바와 같이 TGF-베타 결합 단백질을 항체와 인큐베이션하고, 혼합물을 매트릭스에 적용시킴으로써 스클레로스틴 TGF-베타 결합 단백질의 수산화인회석과의 결합을 억제하거나 저해시키는 항체를 규명하였다. 상기 매트릭스를 PBS 완충액 중 0.2% 알부민으로 3회 세척하였다. 흡착한 스클레로스틴을 0.3 M NaOH로 용출시키고, 이어서 정량하였다. 항체 부재하에 관찰되는 수준에 비해 스클레로스틴의 수산화인회석과의 결합을 40% 이상의 수준으로 억제하는 항체는 뼈 위치결정 억제제로 간주하였다. 이러한 항체를 뼈 반응 연구로 특징규명하여 TGF-베타 결합-단백질 친화도에 대한 그의 억제 상수 및 효과를 측정하였다.
상기에서 본 발명의 특정 실시양태가 예시의 목적으로 본원에 기재되었지만, 다양한 변형이 본 발명의 취지 및 범위에서 벗어나지 않는 한 행해질 수 있다. 따 라서, 본 발명은 첨가되는 청구의 범위에 의한 것을 제외하고는 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Celltech R & D, Inc. <120> COMPOSITIONS AND MEHTODS FOR INCREASING BONE MINERALIZATION <130> 60117-136 <140> <141> 2004-06-15 <160> 143 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 2301 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 1 agagcctgtg ctactggaag gtggcgtgcc ctcctctggc tggtaccatg cagctcccac 60 tggccctgtg tctcgtctgc ctgctggtac acacagcctt ccgtgtagtg gagggccagg 120 ggtggcaggc gttcaagaat gatgccacgg aaatcatccc cgagctcgga gagtaccccg 180 agcctccacc ggagctggag aacaacaaga ccatgaaccg ggcggagaac ggagggcggc 240 ctccccacca cccctttgag accaaagacg tgtccgagta cagctgccgc gagctgcact 300 tcacccgcta cgtgaccgat gggccgtgcc gcagcgccaa gccggtcacc gagctggtgt 360 gctccggcca gtgcggcccg gcgcgcctgc tgcccaacgc catcggccgc ggcaagtggt 420 ggcgacctag tgggcccgac ttccgctgca tccccgaccg ctaccgcgcg cagcgcgtgc 480 agctgctgtg tcccggtggt gaggcgccgc gcgcgcgcaa ggtgcgcctg gtggcctcgt 540 gcaagtgcaa gcgcctcacc cgcttccaca accagtcgga gctcaaggac ttcgggaccg 600 aggccgctcg gccgcagaag ggccggaagc cgcggccccg 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 40 attacggccg gccgcaaagg aattcaagat ctga 34 <210> 41 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 41 attacggcgc gcccctcaca ggccgcaccc agct 34 <210> 42 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Met Ser Arg Thr Ala Tyr Thr Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Thr Leu Leu Pro Ala Ala Glu Gly Lys Lys Lys Gly Ser Gln Gly Ala 20 25 30 Ile Pro Pro Pro Asp Lys Ala Gln His Asn Asp Ser Glu Gln Thr Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Gln Pro Gly Ser Arg Asn Arg Gly Arg Gly Gln Gly Arg 50 55 60 Gly Thr Ala Met Pro Gly Glu Glu Val Leu Glu Ser Ser Gln Glu Ala 65 70 75 80 Leu His Val Thr Glu Arg Lys Tyr Leu Lys Arg Asp Trp Cys Lys Thr 85 90 95 Gln Pro Leu Lys Gln Thr Ile His Glu Glu Gly Cys Asn Ser Arg Thr 100 105 110 Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly Gln Cys Asn Ser Phe Tyr Ile Pro 115 120 125 Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly Ser Phe Gln Ser Cys Ser Phe Cys 130 135 140 Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met Met 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tacaacatgg taccgagtga tccgtcatac gaagatatgc gtgaggttgt gtgtgtcaaa 1740 cgtttgcggc caattgtgtc taatcggtgg aacagtgatg aatgtctacg agcagttttg 1800 aagctaatgt cagaatgctg ggcccacaat ccagcctcca gactcacagc attgagaatt 1860 aagaagacgc ttgccaagat ggttgaatcc caagatgtaa aaatctgatg gttaaaccat 1920 cggaggagaa actctagact gcaagaactg tttttaccca tggcatgggt ggaattagag 1980 tggaataagg atgttaactt ggttctcaga ctctttcttc actacgtgtt cacaggctgc 2040 taatattaaa cctttcagta ctcttattag gatacaagct gggaacttct aaacacttca 2100 ttctttatat atggacagct ttattttaaa tgtggttttt gatgcctttt tttaagtggg 2160 tttttatgaa ctgcatcaag acttcaatcc tgattagtgt ctccagtcaa gctctgggta 2220 ctgaattgcc tgttcataaa acggtgcttt ctgtgaaagc cttaagaaga taaatgagcg 2280 cagcagagat ggagaaatag actttgcctt ttacctgaga cattcagttc gtttgtattc 2340 tacctttgta aaacagccta tagatgatga tgtgtttggg atactgctta ttttatgata 2400 gtttgtcctg tgtccttagt gatgtgtgtg tgtctccatg cacatgcacg ccgggattcc 2460 tctgctgcca tttgaattag aagaaaataa tttatatgca tgcacaggaa gatattggtg 2520 gccggtggtt ttgtgcttta aaaatgcaat atctgaccaa gattcgccaa tctcatacaa 2580 gccatttact ttgcaagtga gatagcttcc ccaccagctt tattttttaa catgaaagct 2640 gatgccaagg ccaaaagaag tttaaagcat ctgtaaattt ggactgtttt ccttcaacca 2700 ccattttttt tgtggttatt atttttgtca cggaaagcat cctctccaaa gttggagctt 2760 ctattgccat gaaccatgct tacaaagaaa gcacttctta ttgaagtgaa ttcctgcatt 2820 tgatagcaat gtaagtgcct ataaccatgt tctatattct ttattctcag taacttttaa 2880 aagggaagtt atttatattt tgtgtataat gtgctttatt tgcaaatcac cc 2932 <210> 117 <211> 1575 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 gcaaacttcc ttgataacat gcttttgcga agtgcaggaa aattaaatgt gggcaccaag 60 aaagaggatg gtgagagtac agcccccacc ccccgtccaa aggtcttgcg ttgtaaatgc 120 caccaccatt gtccagaaga ctcagtcaac aatatttgca gcacagacgg atattgtttc 180 acgatgatag aagaggatga ctctgggttg cctgtggtca cttctggttg cctaggacta 240 gaaggctcag attttcagtg tcgggacact cccattcctc atcaaagaag atcaattgaa 300 tgctgcacag aaaggaacga atgtaataaa gacctacacc ctacactgcc tccattgaaa 360 aacagagatt ttgttgatgg acctatacac cacagggctt tacttatatc tgtgactgtc 420 tgtagtttgc tcttggtcct tatcatatta ttttgttact tccggtataa aagacaagaa 480 accagacctc gatacagcat tgggttagaa caggatgaaa cttacattcc tcctggagaa 540 tccctgagag acttaattga gcagtctcag agctcaggaa gtggatcagg cctccctctg 600 ctggtccaaa ggactatagc taagcagatt cagatggtga aacagattgg aaaaggtcgc 660 tatggggaag tttggatggg aaagtggcgt ggcgaaaagg tagctgtgaa agtgttcttc 720 accacagagg aagccagctg gttcagagag acagaaatat atcagacagt gttgatgagg 780 catgaaaaca ttttgggttt cattgctgca gatatcaaag ggacagggtc ctggacccag 840 ttgtacctaa tcacagacta tcatgaaaat ggttcccttt atgattatct gaagtccacc 900 accctagacg ctaaatcaat gctgaagtta gcctactctt ctgtcagtgg cttatgtcat 960 ttacacacag aaatctttag tactcaaggc aaaccagcaa ttgcccatcg agatctgaaa 1020 agtaaaaaca ttctggtgaa gaaaaatgga acttgctgta ttgctgacct gggcctggct 1080 gttaaattta ttagtgatac aaatgaagtt gacataccac ctaacactcg agttggcacc 1140 aaacgctata tgcctccaga agtgttggac gagagcttga acagaaatca cttccagtct 1200 tacatcatgg ctgacatgta tagttttggc ctcatccttt gggaggttgc taggagatgt 1260 gtatcaggag gtatagtgga agaataccag cttccttatc atgacctagt gcccagtgac 1320 ccctcttatg aggacatgag ggagattgtg tgcatcaaga agttacgccc ctcattccca 1380 aaccggtgga gcagtgatga gtgtctaagg cagatgggaa aactcatgac agaatgctgg 1440 gctcacaatc ctgcatcaag gctgacagcc ctgcgggtta agaaaacact tgccaaaatg 1500 tcagagtccc aggacattaa actctgatag gagaggaaaa gtaagcatct ctgcagaaag 1560 ccaacaggta ccctt 1575 <210> 118 <211> 2032 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 118 cgcggggcgc ggagtcggcg gggcctcgcg ggacgcgggc agtgcggaga ccgcggcgct 60 gaggacgcgg gagccgggag cgcacgcgcg gggtggagtt cagcctactc tttcttagat 120 gtgaaaggaa aggaagatca tttcatgcct tgttgataaa ggttcagact tctgctgatt 180 cataaccatt tggctctgag ctatgacaag agaggaaaca aaaagttaaa cttacaagcc 240 tgccataagt gagaagcaaa cttccttgat aacatgcttt tgcgaagtgc aggaaaatta 300 aatgtgggca ccaagaaaga ggatggtgag agtacagccc ccaccccccg tccaaaggtc 360 ttgcgttgta aatgccacca ccattgtcca gaagactcag tcaacaatat ttgcagcaca 420 gacggatatt gtttcacgat gatagaagag gatgactctg 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1964 <210> 124 <211> 3611 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 124 cgccccccga ccccggatcg aatccccgcc ctccgcaccc tggatatgtt ttctcccaga 60 cctggatatt tttttgatat cgtgaaacta cgagggaaat aatttggggg atttcttctt 120 ggctccctgc tttccccaca gacatgcctt ccgtttggag ggccgcggca ccccgtccga 180 ggcgaaggaa cccccccagc cgcgagggag agaaatgaag ggaatttctg cagcggcatg 240 aaagctctgc agctaggtcc tctcatcagc catttgtcct ttcaaactgt attgtgatac 300 gggcaggatc agtccacggg agagaagacg agcctcccgg ctgtttctcc gccggtctac 360 ttcccatatt tcttttcttt gccctcctga ttcttggctg gcccagggat gacttcctcg 420 ctgcagcggc cctggcgggt gccctggcta ccatggacca tcctgctggt cagcactgcg 480 gctgcttcgc agaatcaaga acggctatgt gcgtttaaag atccgtatca gcaagacctt 540 gggataggtg agagtagaat ctctcatgaa aatgggacaa tattatgctc gaaaggtagc 600 acctgctatg gcctttggga gaaatcaaaa ggggacataa atcttgtaaa acaaggatgt 660 tggtctcaca ttggagatcc ccaagagtgt cactatgaag aatgtgtagt aactaccact 720 cctccctcaa ttcagaatgg aacataccgt ttctgctgtt gtagcacaga tttatgtaat 780 gtcaacttta ctgagaattt tccacctcct gacacaacac cactcagtcc acctcattca 840 tttaaccgag atgagacaat aatcattgct ttggcatcag tctctgtatt agctgttttg 900 atagttgcct tatgctttgg atacagaatg ttgacaggag accgtaaaca aggtcttcac 960 agtatgaaca tgatggaggc agcagcatcc gaaccctctc ttgatctaga taatctgaaa 1020 ctgttggagc tgattggccg aggtcgatat ggagcagtat ataaaggctc cttggatgag 1080 cgtccagttg ctgtaaaagt gttttccttt gcaaaccgtc agaattttat caacgaaaag 1140 aacatttaca gagtgccttt gatggaacat gacaacattg cccgctttat agttggagat 1200 gagagagtca ctgcagatgg acgcatggaa tatttgcttg tgatggagta ctatcccaat 1260 ggatctttat gcaagtattt aagtctccac acaagtgact gggtaagctc ttgccgtctt 1320 gctcattctg ttactagagg actggcttat cttcacacag aattaccacg aggagatcat 1380 tataaacctg caatttccca tcgagattta aacagcagaa atgtcctagt gaaaaatgat 1440 ggaacctgtg ttattagtga ctttggactg tccatgaggc tgactggaaa tagactggtg 1500 cgcccagggg aggaagataa tgcagccata agcgaggttg gcactatcag atatatggca 1560 ccagaagtgc tagaaggagc tgtgaacttg agggactgtg aatcagcttt gaaacaagta 1620 gacatgtatg ctcttggact aatctattgg gagatattta tgagatgtac agacctcttc 1680 ccaggggaat ccgtaccaga gtaccagatg gcttttcaga cagaggttgg aaaccatccc 1740 acttttgagg atatgcaggt tctcgtgtct agggaaaaac agagacccaa gttcccagaa 1800 gcctggaaag aaaatagcct ggcagtgagg tcactcaagg agacaatcga agactgttgg 1860 gaccaggatg cagaggctcg gcttactgca cagtgtgctg aggaaaggat ggctgaactt 1920 atgatgattt gggaaagaaa caaatctgtg agcccaacag tcaatccaat gtctactgct 1980 atgcagaatg aacgcaacct gtcacataat aggcgtgtgc caaaaattgg tccttatcca 2040 gattattctt cctcctcata cattgaagac tctatccatc atactgacag catcgtgaag 2100 aatatttcct ctgagcattc tatgtccagc acacctttga ctatagggga aaaaaaccga 2160 aattcaatta actatgaacg acagcaagca caagctcgaa tccccagccc tgaaacaagt 2220 gtcaccagcc tctccaccaa cacaacaacc acaaacacca caggactcac gccaagtact 2280 ggcatgacta ctatatctga gatgccatac ccagatgaaa caaatctgca taccacaaat 2340 gttgcacagt caattgggcc aacccctgtc tgcttacagc tgacagaaga agacttggaa 2400 accaacaagc tagacccaaa agaagttgat aagaacctca aggaaagctc tgatgagaat 2460 ctcatggagc actctcttaa acagttcagt ggcccagacc cactgagcag tactagttct 2520 agcttgcttt acccactcat aaaacttgca gtagaagcaa ctggacagca ggacttcaca 2580 cagactgcaa atggccaagc atgtttgatt cctgatgttc tgcctactca gatctatcct 2640 ctccccaagc agcagaacct tcccaagaga cctactagtt tgcctttgaa caccaaaaat 2700 tcaacaaaag agccccggct aaaatttggc agcaagcaca aatcaaactt gaaacaagtc 2760 gaaactggag ttgccaagat gaatacaatc aatgcagcag aacctcatgt ggtgacagtc 2820 accatgaatg gtgtggcagg tagaaaccac agtgttaact cccatgctgc cacaacccaa 2880 tatgccaatg ggacagtact atctggccaa acaaccaaca tagtgacaca tagggcccaa 2940 gaaatgttgc agaatcagtt tattggtgag gacacccggc tgaatattaa ttccagtcct 3000 gatgagcatg agcctttact gagacgagag caacaagctg gccatgatga aggtgttctg 3060 gatcgtcttg tggacaggag ggaacggcca ctagaaggtg gccgaactaa ttccaataac 3120 aacaacagca atccatgttc agaacaagat gttcttgcac agggtgttcc aagcacagca 3180 gcagatcctg ggccatcaaa gcccagaaga gcacagaggc ctaattctct ggatctttca 3240 gccacaaatg tcctggatgg cagcagtata cagataggtg agtcaacaca agatggcaaa 3300 tcaggatcag gtgaaaagat caagaaacgt gtgaaaactc cctattctct taagcggtgg 3360 cgcccctcca cctgggtcat ctccactgaa tcgctggact gtgaagtcaa caataatggc 3420 agtaacaggg cagttcattc caaatccagc actgctgttt accttgcaga aggaggcact 3480 gctacaacca tggtgtctaa agatatagga atgaactgtc tgtgaaatgt tttcaagcct 3540 atggagtgaa attatttttt gcatcattta aacatgcaga agatgtttaa aaataaaaaa 3600 aaaactgctt t 3611 <210> 125 <211> 3871 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 125 ggcctccgca ccctggatat gttttctccc agacctggat atttttttga tatcgtgaaa 60 ctacgaggga aataatttgg gggatttctt cttggctccc tgctttcccc acagacatac 120 cttccgtttg gagggccgcg gcaccccgtc cgaggcgaag gaaccccccc atccgcgagg 180 gagagaaatg aagggaattt ctgcagcggc atgaaagctc tgcagctagg tcctctcatc 240 agccatttgt cctttcaaac tgtattgtga tacgggcagg atcagtccac gggagagaag 300 acgagcctcc cggctgtttc tccgccggtc tacttcccat atttcttttc tttgccctcc 360 tgattcttgg ctggcccagg gatgacttcc tcgctgcagc ggccctggcg ggtgccctgg 420 ctaccatgga ccatcctgct ggtcagcact gcggctgctt cgcagaatca agaacggcta 480 tgtgcgttta aagatccgta tcagcaagac cttgggatag gtgagagtag aatctctcat 540 gaaaatggga caatattatg ctcgaaaggt agcacctgct atggcctttg ggagaaatca 600 aaaggggaca taaatcttgt aaaacaagga tgttggtctc acattggaga tccccaagag 660 tgtcactatg aagaatgtgt agtaactacc actcctccct caattcagaa tggaacatac 720 cgtttctgct gttgtagcac agatttatgt aatgtcaact ttactgagaa ttttccacct 780 cctgacacaa caccactcag tccacctcat tcatttaacc gagatgagac aataatcatt 840 gctttggcat cagtctctgt attagctgtt ttgatagttg ccttatgctt tggatacaga 900 atgttgacag gagaccgtaa acaaggtctt cacagtatga acatgatgga ggcagcagca 960 tccgaaccct ctcttgatct agataatctg aaactgttgg agctgattgg ccgaggtcga 1020 tatggagcag tatataaagg ctccttggat gagcgtccag ttgctgtaaa agtgttttcc 1080 tttgcaaacc gtcagaattt tatcaacgaa aagaacattt acagagtgcc tttgatggaa 1140 catgacaaca ttgcccgctt tatagttgga gatgagagag tcactgcaga tggacgcatg 1200 gaatatttgc ttgtgatgga gtactatccc aatggatctt tatgcaagta tttaagtctc 1260 cacacaagtg actgggtaag ctcttgccgt cttgctcatt ctgttactag aggactggct 1320 tatcttcaca cagaattacc acgaggagat cattataaac ctgcaatttc ccatcgagat 1380 ttaaacagca gaaatgtcct agtgaaaaat gatggaacct gtgttattag tgactttgga 1440 ctgtccatga ggctgactgg aaatagactg gtgcgcccag gggaggaaga taatgcagcc 1500 ataagcgagg ttggcactat cagatatatg gcaccagaag tgctagaagg agctgtgaac 1560 ttgagggact gtgaatcagc tttgaaacaa gtagacatgt atgctcttgg actaatctat 1620 tgggagatat ttatgagatg tacagacctc ttcccagggg aatccgtacc agagtaccag 1680 atggcttttc agacagaggt tggaaaccat cccacttttg aggatatgca ggttctcgtg 1740 tctagggaaa aacagagacc caagttccca gaagcctgga aagaaaatag cctggcagtg 1800 aggtcactca aggagacaat cgaagactgt tgggaccagg atgcagaggc tcggcttact 1860 gcacagtgtg ctgaggaaag gatggctgaa cttatgatga tttgggaaag aaacaaatct 1920 gtgagcccaa cagtcaatcc aatgtctact gctatgcaga atgaacgcaa cctgtcacat 1980 aataggcgtg tgccaaaaat tggtccttat ccagattatt cttcctcctc atacattgaa 2040 gactctatcc atcatactga cagcatcgtg aagaatattt cctctgagca ttctatgtcc 2100 agcacacctt tgactatagg ggaaaaaaac cgaaattcaa ttaactatga acgacagcaa 2160 gcacaagctc gaatccccag ccctgaaaca agtgtcacca gcctctccac caacacaaca 2220 accacaaaca ccacaggact cacgccaagt actggcatga ctactatatc tgagatgcca 2280 tacccagatg aaacaaatct gcataccaca aatgttgcac agtcaattgg gccaacccct 2340 gtctgcttac agctgacaga agaagacttg gaaaccaaca agctagaccc aaaagaagtt 2400 gataagaacc tcaaggaaag ctctgatgag aatctcatgg agcactctct taaacagttc 2460 agtggcccag acccactgag cagtactagt tctagcttgc tttacccact cataaaactt 2520 gcagtagaag caactggaca gcaggacttc acacagactg caaatggcca agcatgtttg 2580 attcctgatg ttctgcctac tcagatctat cctctcccca agcagcagaa ccttcccaag 2640 agacctacta gtttgccttt gaacaccaaa aattcaacaa aagagccccg gctaaaattt 2700 ggcagcaagc acaaatcaaa cttgaaacaa gtcgaaactg gagttgccaa gatgaataca 2760 atcaatgcag cagaacctca tgtggtgaca gtcaccatga atggtgtggc aggtagaaac 2820 cacagtgtta actcccatgc tgccacaacc caatatgcca ataggacagt actatctggc 2880 caaacaacca acatagtgac acatagggcc caagaaatgt tgcagaatca gtttattggt 2940 gaggacaccc ggctgaatat taattccagt cctgatgagc atgagccttt actgagacga 3000 gagcaacaag ctggccatga tgaaggtgtt 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165 170 175 Gln Lys Cys Ala Trp Ile Thr Ile Gln Tyr Pro Val Ile Ser Glu Cys 180 185 190 Lys Cys Ser Cys 195 <210> 141 <211> 195 <212> PRT <213> Takifugu rubripes <400> 141 Gln Pro Tyr Tyr Leu Leu Arg Pro Ile Pro Ser Asp Ser Leu Pro Ile 1 5 10 15 Val Glu Leu Lys Glu Asp Pro Gly Pro Val Phe Asp Pro Lys Glu Arg 20 25 30 Asp Leu Asn Glu Thr Glu Leu Lys Ser Val Leu Gly Asp Phe Asp Ser 35 40 45 Arg Phe Leu Ser Val Leu Pro Pro Ala Glu Asp Gly His Ala Gly Asn 50 55 60 Asp Glu Leu Asp Asp Phe Asp Ala Gln Arg Trp Gly Gly Ala Leu Pro 65 70 75 80 Lys Glu Ile Arg Ala Val Asp Phe Asp Ala Pro Gln Leu Gly Lys Lys 85 90 95 His Lys Pro Ser Lys Lys Leu Lys Arg Arg Leu Gln Gln Trp Leu Trp 100 105 110 Ala Tyr Ser Phe Cys Pro Leu Ala His Ala Trp Thr Asp Leu Gly Ser 115 120 125 Arg Phe Trp Pro Arg Phe Val Arg Ala Gly Ser Cys Leu Ser Lys Arg 130 135 140 Ser Cys Ser Val Pro Glu Gly Met Thr Cys Lys Pro Ala Thr Ser Thr 145 150 155 160 His Leu Thr Ile Leu Arg Trp Arg Cys Val Gln Arg Lys Val Gly Leu 165 170 175 Lys Cys Ala Trp Ile Pro Met Gln Tyr Pro Val Ile Thr Asp Cys Lys 180 185 190 Cys Ser Cys 195 <210> 142 <211> 196 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 142 Gln His Tyr Tyr Leu Leu Arg Pro Ile Pro Ser Asp Ser Leu Pro Ile 1 5 10 15 Val Glu Leu Lys Glu Asp Pro Asp Pro Val Leu Asp Pro Lys Glu Arg 20 25 30 Asp Leu Asn Glu Thr Glu Leu Arg Ala Ile Leu Gly Ser His Phe Glu 35 40 45 Gln Asn Phe Met Ser Ile Asn Pro Pro Glu Asp Lys His Ala Gly Gln 50 55 60 Asp Glu Leu Asn Glu Ser Glu Leu Met Lys Gln Arg Pro Asn Gly Ile 65 70 75 80 Met Pro Lys Glu Ile Lys Ala Met Glu Phe Asp Ile Gln His Gly Lys 85 90 95 Lys His Lys Pro Ser Lys Lys Leu Arg Arg Arg Leu Gln Leu Trp Leu 100 105 110 Trp Ser Tyr Thr Phe Cys Pro Val Val His Thr Trp Gln Asp Leu Gly 115 120 125 Asn Arg Phe Trp Pro Arg Tyr Leu Lys Val Gly Ser Cys Tyr Asn Lys 130 135 140 Arg Ser Cys Ser Val Pro Glu Gly Met Val Cys Lys Pro Pro Lys Ser 145 150 155 160 Ser His Leu Thr Val Leu Arg Trp Arg Cys Val Gln Arg Lys Gly Gly 165 170 175 Leu Lys Cys Ala Trp Ile Pro Val Gln Tyr Pro Val Ile Ser Glu Cys 180 185 190 Lys Cys Ser Cys 195 <210> 143 <211> 188 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 143 Gln Gly Trp Gln Ala Phe Arg Asn Asp Ala Thr Glu Val Ile Pro Gly 1 5 10 15 Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro Glu Asn Asn Gln Thr Met Asn 20 25 30 Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro His His Pro Tyr Asp Ala Lys 35 40 45 Gly Val Ser Glu Tyr Ser Cys Arg Glu Leu His Tyr Thr Arg Phe Leu 50 55 60 Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser Ala Lys Pro Val Thr Glu Leu Val Cys 65 70 75 80 Ser Gly Gln Cys Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg 85 90 95 Val Lys Trp Trp Arg Pro Asn Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile Pro Asp 100 105 110 Arg Tyr Arg Ala Gln Arg Val Gln Leu Leu Cys Pro Gly Gly Ala Ala 115 120 125 Pro Arg Ser Arg Lys Val Arg Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys Lys Arg 130 135 140 Leu Thr Arg Phe His Asn Gln Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly Pro Glu 145 150 155 160 Thr Ala Arg Pro Gln Lys Gly Arg Lys Pro Arg Pro Gly Ala Arg Gly 165 170 175 Ala Lys Ala Asn Gln Ala Glu Leu Glu Asn Ala Tyr 180 185

Claims (20)

  1. 서열 2, 6, 8, 14, 46 또는 65에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 스클레로스틴 (SOST) 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며 스클레로스틴 폴리펩티드가 (i) 진뱅크 등록 번호 NM_004329 (서열 102); D89675 (서열 103); NM_001203 (서열 104); S75359 (서열 105); NM_030849 (서열 106); D38082 (서열 107); NP_001194 (서열 108); BAA19765 (서열 109) 또는 AAB33865 (서열 110)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 뼈 형태발생 단백질 (BMP) 제I형 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 BMP 제I형 수용체 결합 부위 및 (ii) 진뱅크 등록 번호 U25110 (서열 111); NM_033346 (서열 112); Z48923 (서열 114); CAA88759 (서열 115) 또는 NM_001204 (서열 113)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 제II형 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 BMP 제II형 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 서열 2, 6, 8, 14, 46 또는 65에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 스클레로스틴 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며 스클레로스틴 동종이량체의 형성을 저해하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리클로날 항체인 항체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  5. 제4항에 있어서, 모노클로날 항체가 마우스 모노클로날 항체, 인간 모노클로날 항체, 래트 모노클로날 항체, 및 햄스터 모노클로날 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체.
  6. 제4항의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포.
  7. 제4항의 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간화 항체 또는 키메라 항체인 항체.
  9. 제8항의 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원-결합 단편이 F(ab')2, Fab', Fab, Fd, 및 Fv로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단일쇄 항체를 포함하는 항체.
  12. 제11항의 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포.
  13. 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 생리적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  14. 서열 2, 6, 8, 14, 46 또는 65에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드의 21개 이상의 연속적인 아미노산 및 50개 이하의 연속적인 아미노산을 포함하고, 비-인간 동물에서 상기 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며 SOST 폴리펩티드가 (i) 진뱅크 등록 번호 NM_004329 (서열 102); D89675 (서열 103); NM_001203 (서열 104); S75359 (서열 105); NM_030849 (서열 106); D38082 (서열 107); NP_001194 (서열 108); BAA19765 (서열 109) 또는 AAB33865 (서열 110)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 뼈 형태발생 단백질 (BMP) 제I형 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 BMP 제I형 수용체 결합 부위 및 (ii) 진뱅크 등록 번호 U25110 (서열 111); NM_033346 (서열 112); Z48923 (서열 114); CAA88759 (서열 115) 또는 NM_001204 (서열 113)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 제II형 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 BMP 제II형 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체를 유발할 수 있는 펩티드를 포함하는 면역원.
  15. 서열 2, 6, 8, 14, 46 또는 65에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴 리펩티드의 21개 이상의 연속적인 아미노산 및 50개 이하의 연속적인 아미노산을 포함하고, 비-인간 동물에서 상기 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며 SOST 동종이량체의 형성을 저해하는 항체를 유발할 수 있는 펩티드를 포함하는 면역원.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 펩티드가 담체 분자와 결합된 것인 면역원.
  17. 제16항에 있어서, 담체 분자가 담체 폴리펩티드인 면역원.
  18. 제17항에 있어서, 담체 폴리펩티드가 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)인 면역원.
  19. SOST 폴리펩티드의 21개 이상의 연속적인 아미노산 및 50개 이하의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하는 면역원으로 비-인간 동물을 면역화시키는 단계를 포함하며, (a) 상기 SOST 폴리펩티드가 서열 2, 6, 8, 14, 46 또는 65의 아미노산 서열을 포함하고; (b) 상기 항체가 (i) 뼈 형태발생 단백질 (BMP) 제I형 수용체 결합 부위 및 (ii) BMP 제II형 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 대한 SOST 폴리펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제하고; (c) 상기 BMP 제I형 수용체 결합 부위가 진뱅크 등록 번호 NM_004329 (서열 102), D89675 (서열 103), NM_001203 (서열 104), S75359 (서열 105), NM_030849 (서열 106), D38082 (서열 107), NP_001194 (서열 108), BAA19765 (서열 109) 또는 AAB33865 (서열 110)의 아미노산 서열을 포 함하는 BMP 제I형 수용체 폴리펩티드와 결합할 수 있고, (d) 상기 BMP 제II형 수용체 결합 부위가 진뱅크 등록 번호 U25110 (서열 111), NM_033346 (서열 112), Z48923 (서열 114), CAA88759 (서열 115) 또는 NM_001204 (서열 113)의 아미노산 서열을 포함하는 BMP 제II형 수용체 폴리펩티드와 결합할 수 있는 것인, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  20. SOST 폴리펩티드의 21개 이상의 연속적인 아미노산 및 50개 이하의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하는 면역원으로 비-인간 동물을 면역화시키는 단계를 포함하며, 상기 SOST 폴리펩티드가 서열 2, 6, 8, 14, 46 또는 65의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체가 SOST 동종이량체의 형성을 저해하는 것인, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
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