EA022991B1 - Антитело к склеростину и его применение - Google Patents

Антитело к склеростину и его применение Download PDF

Info

Publication number
EA022991B1
EA022991B1 EA201001528A EA201001528A EA022991B1 EA 022991 B1 EA022991 B1 EA 022991B1 EA 201001528 A EA201001528 A EA 201001528A EA 201001528 A EA201001528 A EA 201001528A EA 022991 B1 EA022991 B1 EA 022991B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
beta
binding
bone
binding protein
Prior art date
Application number
EA201001528A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201001528A1 (ru
Inventor
Мэри И. Брункоу
Дейвид Дж. Гэлас
Брайан Ковасевич
Джон Т. Маллиген
Брайан У. Пипер
Джеффри Вэн Несс
Дейвид Дж. Уинклер
Original Assignee
Юсб Фарма С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=33563705&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA022991(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Юсб Фарма С.А. filed Critical Юсб Фарма С.А.
Publication of EA201001528A1 publication Critical patent/EA201001528A1/ru
Publication of EA022991B1 publication Critical patent/EA022991B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/11—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production isolated from eggs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/23—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from birds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/495—Transforming growth factor [TGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/108—Osteoporosis

Abstract

Настоящее изобретение относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связываются с эпитопом полипептида склеростина и являются способными к увеличению плотности кости или содержанию минеральных веществ в кости млекопитающего. Увеличение минеральной плотности кости имеет применение при заболеваниях и состояниях, в которых низкая минеральная плотность кости характеризуется для такого состояния, как остеопения, остеопороз, переломы кости.

Description

Данное изобретение относится, в общем, к фармацевтическим продуктам и способам и, более конкретно, к способам и композициям, пригодным для увеличения минерального содержания кости. Такие композиции и способы могут быть использованы для лечения большого разнообразия состояний, в том числе, например, остеопении, остеопороза, переломов и других нарушений, в которых отличительным признаком заболевания является низкая минеральная плотность кости.
Уровень техники
Две или три отличающиеся фазы изменений костной массы встречаются на протяжении жизни индивидуума (см. Κί§§8, \УеЧ 1. Меб. 154:63-77, 1991). Первая фаза имеет место как у мужчин, так и у женщин и протекает для приобретения максимальной костной массы. Эта первая фаза достигается посредством линейного роста хрящевых пластинок роста и радиального роста вследствие скорости периостеального присоединения новых слоев (утолщения надкостницы). Вторая фаза начинается в возрасте около 30 лет для губчатой кости (плоских костей, таких как позвонки и таз) и в возрасте около 40 лет для кортикального слоя кости (например, длинных костей, находящихся в конечностях) и продолжается до старости. Эта фаза характеризуется медленным разрежением кости и встречается как у мужчин, так и у женщин. У женщин встречается также третья фаза разрежения кости, наиболее вероятно, обусловленная постклимактерической недостаточностью эстрогена. Во время только этой фазы женщины могут терять дополнительные 10% костной массы из кортикального слоя кости и 25% из губчатого компартмента (см. Κίββδ. 8ирга).
Потеря минерального содержания кости может быть обусловлена большим разнообразием состояний и может быть результатом существенных медицинских проблем. Например, остеопороз является истощающим заболеванием у людей, характеризующимся заметными уменьшениями скелетной костной массы и минеральной плотности, структурным разрушением кости, включающим деградацию микроархитектуры кости и соответствующие увеличения хрупкости кости и подверженности к перелому у пораженных индивидуумов. Остеопорозу у людей предшествует клиническая остеопения (минеральная плотность костей, которая более, чем на одно стандартное отклонение, но менее, чем на 2,5 стандартных отклонений, ниже средней величины для кости молодого взрослого человека), состояние,обнаруживаемое у приблизительно 25 млн лоюдей в Соединенных Штатах. Другие 7-8 млн пациентов в Соединенных Штатах диагностированы как имеющие клинический остеопороз (определяемый как минеральное содержание кости, которое более, чем на 2,5 стандартных отклонений, ниже минерального содержания кости зрелой кости молодого взрослого человека). Остеопороз является одним из требующих наибольших расходов заболеваний для системы здравоохранения, стоящим десятков миллиардов долларов ежегодно в Соединенных Штатах. Кроме связанных с медико-санитарной помощью расходов долгосрочное врачебное обслуживание и потерянные рабочие дни увеличивают финансовую и социальную стоимость этого заболевания. Во всем мире приблизительно 75 млн людей находятся при риске остеопороза.
Частота встречаемости остеопороза у населения увеличивается с возрастом и среди членов ИндоЕвропейской группы населения остеопороз является преобладающим у женщин (которые составляют 80% пула пациентов с остеопорозом в Соединенных Штатах). Увеличенная хрупкость и подверженность к перелому скелетных костей у пожилых людей усугубляется увеличением риска случайных падений в этой популяции. Более 1,5 млн связанных с остеопорозом переломов костей сообщаются каждый год в Соединенных Штатах. Переломы тазобедренных суставов, кистей и позвонков находятся среди наиболее частых повреждений, связанных с остеопорозом. Переломы тазобедренных суставов, в частности, являются крайне неудобными и дорогими для пациента, а для женщин коррелируют с высокими коэффициентами смертности и болезненности.
Хотя остеопороз определяется как увеличение риска перелома вследствие уменьшения костной массы, ни одно из доступных в настоящее время лечений для скелетных нарушений, по существу, не может увеличивать плотность кости у взрослых. Все врачи хорошо понимают, что необходимы лекарственные средства, которые могли бы увеличивать плотность костей у взрослых, в частности, костей кисти, позвоночника и тазобедренного сустава, которые находятся при риске в случае остеопении и остеопороза.
Существующие стратегии для предупреждения остеопороза могут предоставить некоторую пользу для индивидуумов, но не могут гарантировать освобождение от этого заболевания. Эти стратегии включают снижение физической активности (в частности, активностей, приводящих к увеличению массы) с достижением старости, включение достаточного количества кальция в пищевой рацион и избегание потребления продуктов, содержащих алкоголь или табак. Для пациентов, обнаруживающих клиническую остеопению или остеопороз, все существующие терапевтическиие лекарственные средства и стратегии направлены на уменьшение дополнительной потери костной массы ингибированием процесса резорбции костей, природного компонента процесса ремоделирования, который встречается конститутивно.
Например, в настоящее время для замедления потери костной массы прописывают эстроген. Однако, имеется некоторая полемика относительно того, имеется ли долгосрочная польза для пациентов и имеется ли какой-то эффект вообще в случае пациентов в возрасте более 75 лет. Кроме того, считается, что применение эстрогена увеличивает риск рака молочной железы и эндометрия.
Высокие дозы пищевого кальция, с витамином или без витамина Ό, также предлагаются для по- 1 022991 стклимактерических женщин. Однако высокие дозы кальция могут часто иметь неприятные побочные желудочно-кишечные эффекты, и постоянно должен проводиться мониторинг уровней кальция в сыворотке и моче (см. КПок1а апб Рщкк, Мауо Сйи. Ргос. 70:978-982, 1995).
Другие терапевтические вещества, которые были предложены, включают кальцитонин, бисфосфонаты, анаболические стероиды и фторид натрия. Однако такие терапевтическиие вещества имеют нежелательные побочные действия (например, кальцитонин и стероиды могут вызывать тошноту и провоцировать иммунную реакцию, бисфосфонаты и фторид натрия могут ингибировать репарацию переломов, даже при умеренном увеличении плотности костей), которые могут предотвращать их применение (см. КПок1а апб Рщкк, кирга).
Ни одна практикуемая в настоящее время терапевтическая стратегия не включает лекарственное средство, которое стимулирует или усиливает рост новой костной массы. Данное изобретение обеспечивает композиции и способы, которые могут быть использованы для увеличения минерализации кости и, следовательно, могут быть использованы для лечения широкого разнообразия состояний, в которых желательным является увеличение костной массы. Кроме того, данное изобретение обеспечивает другие, связанные с этим преимущества.
Сущность изобретения
Изобретение относится к антителу или его антиген-связывающему фрагменту, которые специфично связываются с полипептидом склеростина, содержащим аминокислотную последовательность, представленную в 5>ЕО ГО N0:4, где указанные антитело или фрагмент связываются с последовательностью аминокислот в пределах аминокислот 57-146 5>Е0 ГО N0:46. Изобретение дополнительно включает клеткухозяина, которая способна продуцировать или экспрессировать указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, и полинуклеотид, кодирующий указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела.
Краткое описание графического материала
Фиг. 1 является схематической иллюстрацией, сравнивающей аминокислотную последовательность Нитап Иап; Нитап ОгетПп; Нитап СегЬегик и Нитап Веег. Стрелки указывают цистеиновый скелет.
Фиг. 2 суммирует результаты, полученные из обследования различных тканей человека на экспрессию гена ТОР-бета-связывающего белка, конкретно, гена Нитап Веег. Полуколичественную процедуру полимеразной цепной реакции с обращенно-фазовой транскрипцией (ОТ-ПЦР) использовали для амплификации части этого гена из кДНК первой цепи, синтезированной из тотальной РНК (описано более подробно в примере 2А).
Фиг. 3Ά-3Ό суммируют результаты, полученные из гибридизации РНК ш κίΐυ срезов эмбриона мыши с использованием кРНК-зонда, который комплементарен мышиному транскрипту Веег (описано более подробно в примере 2В). Панель ЗА является поперечным срезом эмбриона 10,5 брс. Панель 3В является сагиттальным срезом эмбриона 12,5 брс, и панели ЗС и 3Ό являются сагиттальными срезами эмбрионов 15,5 брс.
Фиг. 4А-4С иллюстрируют, посредством Вестерн-блот-анализа, специфичность трех различных поликлональных антител в отношении их соответствующих антигенов (описано более подробно в примере 4). Фиг. 4А показывает специфическую реактивность анти-Н. Веег-антитела в отношении антигена Н. Веег, но не в отношении Н. Иап или Н. ОгетПп. Фиг. 4В показывает реактивность анти-Н. ОгетПпантитела в отношении антигена Н. ОгетПп, но не Н. Веег или Н. Иап. Фиг. 4С показывает реактивность анти-Н. Иап-антитела в отношении Н. Иап, но не Н. Веег или Н. ОгетПп.
Фиг. 5 иллюстрирует, посредством Вестерн-блот-анализа, селективность ТОР-бета-связывающего белка, Веег, в отношении ВМР-5 и ВМР-6, но не ВМР-4 (описано более подробно в примере 5).
Фиг. 6 демонстрирует, что ионное взаимодействие между ТОР-бета-связывающим белком, Веег, и ВМР-5 имеет константу диссоциации в диапазоне 15-30 нМ.
Фиг. 7 представляет выравнивание района, содержащего характерный цистиновый узел полипептида 808Т (склеростина) и его ближайших гомологов. Три дисульфидные связи, которые образуют цистиновый узел, проиллюстрированы жирными линиями. Дополнительная дисульфидная связь, показанная пунктирной линией, является уникальной для этого семейства, и она соединяет концы двух β-шпилек в 3Н-структуре. Изображенные полипептиды являются §08Т: склеростин (5>Е0 ГО N0:126); СОНВ: Хорионический Гонадотропин (3 человека (5>Е0 ГО N0:127); Р8НВ: бета-субъединица фолликулостимулирующего гормона (5>Е0 ГО N0: 128); Т8НВ: предшественник бета-цепи тиротропина (5>Е0 ГО N0: 129); У№Р: фактор фон Виллебранда (5>Е0 ГО N0:130); МИС2: предшественник муцина 2 человека (5>Е0 ГО N0:131); СегЬегик 1 (гомолог Хепорик 1аеу1к) (5>Е0 ГО N0:132); ИКМ: дгетЛп (5>Е0 ГО N0:133); ΌΆΝ (5>Е0 ГО N0:134); СТОР: предшественник фактора роста соединительной ткани (5>Е0 ГО N0:135); N0V: №уН (гомолог белка сверхэкспрессируемого гена нефробластомы) (5>Е0 ГО N0:136); СУК6: (5>Е0 ГО N0:137).
Фиг. 8 иллюстрирует 3И-модель внутреннего района (кора) 808Т (§08Т_Соге).
Фиг. 9 представляет 30-модель внутреннего района (кора) гомодимера 808Т.
Фиг. 10А и 10В представляют выравнивание аминокислотных последовательностей №ддш из пяти различных животных: человека (К0ОО1НиМАК (5>Е0 ГО N0:138); курицы (К0ОО_СН1СК, 5>Е0 ГО
- 2 022991
N0:139); Африканской шпорцевой лягушки (ΝΟΟΟ_ΧΕΝΕΑ, δΕΟ ΙΌ N0:140); Ν000_Ρυ0Κυ, δΕΟ ΙΌ N0:141); и полосатой перцины (ΝΟΟΟ_ΖΕΒΚΑ, δΕΟ ΙΌ N0:142); и δΟδΤ из человека (δΟδΤ_ΗυΜΑΝ, δΕΟ ΙΌ N0:46), крысы (δ0δΤ_ΚΑΤ, δΕΟ ΙΌ N0:65) и мыши (δ0δΤ_Μοπ5€, δΕΟ ΙΌ N0:143).
Фиг. 11 иллюстрирует структуру комплекса №ддш/ВМР-7. Гомодимер ΒΜΡ показан на нижней части этой фигуры поверхностным способом. Гомодимер №ддш показан на верхней части димера ВМР в в виде огрубленного изображения. Круги очерчивают ^концевой связывающий район, внутренний (коровый) район и линкер между ^концевым и коровым районами.
Фиг. 12 иллюстрирует 30-модель потенциального ВМР-связывающего фрагмента, локализованного в ^концевом районе δ0δΤ. Димер ВМР показан поверхностным способом, а потенциальный ВМРсвязывающий фрагмент показан способом послеизображения. Отмечен остаток фенилаланина, соответствующий гидрофобному карману на поверхности ВМР.
Подробное описание изобретения
Как отмечалось выше, данное изобретение обеспечивает новый класс или семейство ΤΟΡ-бетасвязывающих белков, а также анализы для отбора соединений, которые увеличивают минеральное содержание кости и минеральную плотность кости, соединения, которые увеличивают минеральное содержание кости и минеральную плотность кости, и способы использования таких соединений для лечения или предупреждения широкого разнообразия состояний.
В одном аспекте данного изобретения обеспечены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, которые выбирают из группы, состоящей из: (а) выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, включающей последовательность δΕΟ ΙΌ N0:1, 5, 7, 9, 11, 13 или 15, или ее комплементарной последовательности; (Ь) выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая специфически гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты (а) при жестких условиях; и (с) выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует ΤΟΡ-бета-связывающий белок по (а) или (Ь). В родственных аспектах данного изобретения выделенные молекулы нуклеиновых кислот обеспечивают на основе гибридизации только с частью одной из вышеописанных последовательностей (например, для (а) гибридизация может быть с зондом из по меньшей мере 20, 25, 50 или 100 нуклеотидов, выбранных из нуклеотидов 156-539 или 555-687 δΕΟ ΙΌ N0:1). Как должно быть вполне очевидным, необходимая жесткость, используемая для гибридизации, может варьироваться на основании размера зонда. Например, для 25-мерного зонда жесткие условия могут включать следующее: 60 мМ Трис рН 8,0, 2 мМ ЭДТА, 5х среду Денхардта, 6х δδΟ, 0,1% (мас./об.) ^лаурилсаркозин, 0,5% (мас./об.) №-40 (нонидет Р-40) в течение ночи при 45°С с последующими двумя промывками 0,2х δδΟ/0,1% ДСН при 45-50°С. Для 100-мерного зонда при условиях низкой жесткости подходящие условия могут включать следующее: 5х δδΡΕ, 5х среду Денхардта и 0,5% ДСН в течение ночи при 42-50°С с последующими двумя промывками 2х δδΡΕ (или 2х δδΟ)/0,1% ДСН при 42-50°С.
В родственных аспектах данного изобретения обеспечены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, которые имеют гомологию с последовательностями δΕΟ ΙΌ N0:1, 5, 7, 9, 11, 13 или 15 при уровне гомологии 50, 60, 75, 80, 90, 95 или 98% с использованием алгоритма ^ПЬиг-Пртап. Репрезентативные примеры таких выделенных молекул включают, например, молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белок, включающий последовательности δΕΟ ΙΌ N0:2, 6, 10, 12, 14 или 16, или имеют гомологию с этими последовательностями при уровне 50, 60, 75, 80, 90, 95 или 98% гомологии с использованием алгоритма Ыртап-Реагкоп.
Выделенные молекулы нуклеиновых кислот обычно имеют размер менее, чем 100 т.п.н. и в некоторых вариантах осуществления размер менее чем 50 т.п.н., 25 т.п.н., 10 т.п.н. или даже 5 т.п.н. Далее выделенные молекулы нуклеиновых кислот в других вариантах осуществления не существуют в библиотеке других неродственных молекул нуклеиновых кислот (например, субклоне ВАС, таком как описанный в ОепВапк Ассеккюп N0. АС003098 и БМВ N0. ΑΟ171546). Однако выделенные молекулы нуклеиновых кислот могут быть найдены в библиотеках родственных молекул (например, для перетасовки, такой как описанная в патентах США с номерами 5837458; 5830721 и 5811238). Наконец, выделенные молекулы нуклеиновых кислот, описанные здесь, не включают молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют Оап, СегЬегш, ОгетПп или δί'ΌΕ (Патент США № 5780263).
Данное изобретение обеспечивает также клонирующие векторы, которые содержат вышеупомянутые молекулы нуклеиновых кислот, и экспрессирующие векторы, которые содержат промотор (например, регуляторную последовательность), функционально связанный с одной из вышеупомянутых молекул нуклеиновых кислот. Репрезентативные примеры подходящих промоторов включают тканеспецифические промоторы и промоторы на основе вирусов (например, промоторы на основе СМУ, такие как СМУ Ι-Е, ранний промотор δν40 и МиБУ ΕΤΚ). Экспрессирующие векторы могут быть также основаны на вирусах или произведены из вирусов (например, вирусный вектор). Репрезентативные примеры вирусных векторов включают вирусные векторы на основе вируса простого герпеса, аденовирусные векторы, аденовирус-ассоциированные векторы и ретровирусные векторы. Обеспечены также клетки-хозяева, содержащие или включающие любой из вышеупомянутых векторов (в том числе, например, клеткихозяева, полученные из человека, обезьяны, собаки, крысы или мыши).
В других аспектах данного изобретения обеспечены способы получения ΤΟΕ-бета-связывающих
- 3 022991 белков, предусматривающие стадию культивирования вышеупомянутой клетки-хозяина, содержащей вектор, при условиях и времени, достаточных для продуцирования этого ТОР-бета-связывающего белка. В других вариантах осуществления белок, продуцируемый этим способом, может быть дополнительно очищен (например, колоночной хроматографией, аффинной очисткой и т.п.). Таким образом, выделенные белки, которые кодируются вышеупомянутыми молекулами нуклеиновых кислот (например, 5>ЕО ГО N0:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16), могут быть легко получены в соответствии с описанием данной заявки.
Следует также отметить, что вышеупомянутые белки или их фрагменты могут быть получены в виде слитых белков. Например, в одном аспекте обеспечены слитые белки, содержащие первый полипептидный сегмент, содержащий ТОР-бета-связывающий белок, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, описанной выше, или его часть длиной по меньшей мере 10, 20, 30, 50 или 100 аминокислот, и второй полипептидный сегмент, содержащий не связывающий ТОР-бета белок. В некоторых вариантах осуществления вторым полипептидом может быть метка (тэг), подходящая для очистки или узнавания (например, полипептид, содержащий множественные анионные аминокислотные остатки - см. Патент США № 4851341), маркер (например, зеленый флуоресцентный белок или щелочная фосфатаза) или токсичная молекула (например, рицин).
В другом аспекте данного изобретения обеспечены антитела, которые способны специфически связывать вышеописанный класс ТОР-бета-связывающих белков (например, ВЕЕК человека). В различных вариантах осуществления это антитело может быть поликлональным антителом или моноклональным антителом (например, полученным из человека или мыши). В других вариантах осуществления это антитело является фрагментом антитела, который сохраняет связывающие характеристики целого антитела (например, Р(аЬ')2, Р(аЬ)2, РаЬ', РаЬ или Ρν-фрагментом или даже СБК). Обеспечены также гибридомы и другие клетки, которые способны продуцировать или экспрессировать вышеупомянутые антитела.
В родственных аспектах данного изобретения обеспечены способы детектирования ТОР-бетасвязывающего белка, предусматривающие стадии инкубирования антитела, описанного выше, при условиях и в течение времени, достаточных для обеспечения возможности для указанного антитела связывать ТОР-бета-связывающий белок, и детектирования этого связывания. В различных вариантах осуществления это антитело может быть связано с твердым носителем для облегчения промывки или разделения и/или помечено (например, маркером, выбранным из группы, состоящей из ферментов, флуоресцентных белков и радиоизотопов).
В других аспектах данного изобретения обеспечены выделенные олигонуклеотиды, которые гибридизуются с молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с 5>ЕО ГО N0:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 или 18 или ее комплементом при жестких условиях. В следующих вариантах осуществления этот олигонуклеотид может быть обнаружен в последовательности, которая кодирует 5>Е0 ГО N0.2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16. В некоторых вариантах осуществления этот олигонуклеотид имеет длину по меньшей мере 15, 20, 30, 50 или 100 нуклеотидов. В следующих вариантах осуществления этот олигонуклеотид является меченым другой молекулой (например, ферментом, флуоресцентной молекулой или радиоизотопом). Обеспечены также праймеры, которые способны специфически амплифицировать все или часть вышеуказанных молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют ТОР-бета-связывающие белки. В данном контексте термин специфически амплифицировать должен пониматься как относящийся к праймерам, которые амплифицируют вышеупомянутые ТОР-бета-связывающие белки, а не другие ТОР-бетасвязывающие белки, такие как Баи, СегЬегик, ОгетИи или §СОР (патент США № 5780263).
В родственных аспектах данного изобретения обеспечены способы обнаружения молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует ТОР-бета-связывающий белок, предусматривающие стадии инкубирования олигонуклеотида, описанного выше, при жестких условиях и детектирования гибридизации указанного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления этот олигонуклеотид может быть меченым и/или связанным с твердым носителем.
В других аспектах данного изобретения обеспечены рибозимы, которые способны расщеплять РНК, которая кодирует один из вышеупомянутых ТОР-бета-связывающих белков (например, 5>Е0 ГО N0: 2, 6, 8, 10, 12, 14 или 16). Такие рибозимы могут состоять из ДНК, РНК (в том числе 2'-0метилрибонуклеиновых кислот), аналогов нуклеиновых кислот (например, нуклеиновых кислот, имеющих фосфоротиоатные связи) или их смесей. Обеспечены также молекулы нуклеиновых кислот (например, ДНК или кДНК), которые кодируют эти рибозимы, и векторы, которые способны экспрессировать или продуцировать рибозимы. Репрезентативные примеры векторов включают плазмиды, ретротранспозоны, космиды и векторы на основе вирусов (например, вирусные векторы, генерируемые по меньшей мере отчасти, из ретровируса, аденовируса или аденоассоциированного вируса). Обеспечены также клетки-хозяева (например, клетки человека, собаки, крысы или мыши), которые содержат эти векторы. В некоторых вариантах осуществления, эти клетки-хозяева могут быть стабильно трансформированы вектором.
В следующих аспектах данного изобретения обеспечены способы получения рибозимов или синтетически, или транскрипцией ίη νίίτο или ίη νίνο. В других вариантах осуществления полученные таким образом рибозимы могут быть дополнительно очищены и/или приготовлены в виде фармацевтических композиций (например, рибозим или молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая этот рибозим, вместе
- 4 022991 с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем). Подобным образом, антисмысловые олигонуклеотиды и антитела или другие выбранные молекулы, описанные здесь, могут быть приготовлены в фармацевтических композициях.
В других аспектах данного изобретения обеспечены антисмысловые олигонуклеотиды, включающие молекулу нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 или 15, или с ее комплементом, причем указанный олигонуклеотид ингибирует экспрессию ТОР-бета-связывающего белка, описанного здесь (например, ВЕЕК человека). В различных вариантах осуществления олигонуклеотид имеет длину 15, 20, 25, 30, 35, 40 или 50 нуклеотидов. Предпочтительно этот олигонуклеотид имеет длину менее, чем 100, 75 или 60 нуклеотидов. Как должно быть вполне очевидно, этот олигонуклеотид может состоять из одного или нескольких аналогов нуклеиновых кислот, рибонуклеиновых кислот или дезоксирибонуклеиновых кислот. Далее, этот олигонуклеотид может быть модифицирован одной или несколькими связями, в том числе, например, ковалентной связью, такой как фосфоротиоатная связь, фосфотриэфирная связь, метилфосфонатная связь, метилен(метилимино)-связь, морфолино-связь, амидная связь, полиамидная связь, межсахарная алкильная связь с короткой цепью, циклоалкильная межсахарная связь, гетероатомная межсахарная связь с короткой цепью и гетероциклическая межсахарная связь. Один реперезентативный пример химерного олигонуклеотида описан в патенте США № 5989912.
Еще в одном аспекте данного изобретения обеспечены способы увеличения минерализации кости, предусматривающие введение в теплокровное животное эффективного количества описанного здесь рибозима. В родственных аспектах такие способы предусматривают стадию введения пациенту эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, описанных здесь, которые способны продуцировать желаемый рибозим при условиях, способствующих транскрипции этой молекулы нуклеиновой кислоты для получения рибозима.
В других аспектах данного изобретения обеспечены трансгенные животные, не являющиеся человеком. В одном варианте осуществления обеспечено трансгенное животное, зародышевые клетки и соматические клетки которого содержат молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую ТОР-бетасвязывающий белок, описанный выше, который функционально связан с промотором, эффективным для экспрессии гена, который введен в это животное или предка этого животного на эмбриональной стадии, при условии, что указанное животное не является человеком. В других вариантах осуществления, обеспечены трансгенные животные с нокаутом гена, включающие животное, зародышевые клетки и соматические клетки которого содержат нарушение по меньшей мере одного аллеля эндогенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует ТОРбета-связывающий белок, описанный здесь, где это нарушение предотвращает транскрипцию информационной РНК из указанного аллеля по сравнению с животным без этого разрушения, при условии, что это животное не является человеком. В различных вариантах осуществления этим нарушением является делеция, замена или инсерция нуклеиновой кислоты. В других вариантах осуществления этим трансгенным животным является мышь, крыса, овца, свинья или собака.
В следующих аспектах данного изобретения обеспечены наборы для детектирования экспрессии ТОР-бета-связывающего белка, содержащие контейнер, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из (а) молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО N0:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 или 101; (Ь) молекулы нуклеиновой кислоты, включающей комплемент нуклеотидной последовательности (а); (с) молекулы нуклеиновой кислоты, которая является фрагментом (а) или (Ь) с длиной по меньшей мере 15, 20, 30, 50, 75 или 100 нуклеотидов. Обеспечены также наборы для детектирования ТОР-бета-связывающего белка, которые содержат контейнер, содержащий одно из описанных здесь антител против ТОР-бета-связывающего белка.
Например, в одном аспекте данного изобретения обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии (а) смешивания одного или нескольких кандидатных молекул с ТОР-бета-связывающим белком, кодируемым молекулой нуклеиновой кислоты по п.1, и выбранного члена ТОР-бета-семейства белков (например, ВМР 5 или 6), (Ь) определения, изменяет ли кандидатная молекула передачу сигнала члена ТОР-бетасемейства или изменяет ли связывание ТОР-бета-связывающего белка с членом ТОР-бета-семейства. В некоторых вариантах осуществления эта молекула изменяет способность ТОР-бета функционировать в качестве положительного регулятора дифференцировки мезенхимальных клеток. В этом аспекте данного изобретения кандидатная молекула (кандидатные молекулы) могут изменять передачу сигнала или связывание, например, или уменьшением (например, ингибированием), или увеличением (например, усилением) передачи сигнала или связывания.
Еще в одном аспекте обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадию определения, ингибирует ли выбранная молекула связывание ТОР-бета-связывающего белка с костью, или ее аналогом. Репрезентативные примеры кости или ее аналогов включают гидроксиапатит и пробы первичной кости человека, полученные посредством биопсии.
- 5 022991
В некоторых вариантах осуществления описанных выше способов выбранная молекула содержится в смеси молекул, и эти способы могут дополнительно предусматривать стадию выделения одной или нескольких молекул, которые являются функциональными в этом анализе. В других вариантах осуществления ТОР-бета-семейство белков связывают с твердым носителем и измеряют связывание ТОР-бетасвязывающего белка, или ТОР-бета-связывающий белок связывают с твердым носителем и измеряют связывание ТОР-бета-белков.
С использованием таких способов, как описанные выше, большое разнообразие молекул может быть проанализировано на их способность увеличивать минеральное содержание кости ингибированием связывания ТОР-бета-связывающего белка с ТОР-бета-семейством белков. Репрезентативные примеры таких молекул включают белки или пептиды, органические молекулы и молекулы нуклеиновых кислот.
В других родственных аспектах данного изобретения обеспечены способы увеличения минерального содержания кости у теплокровного животного, предусматривающие стадию введения теплокровному животному терапевтически эффективного количества молекулы, идентифицированной из описанных здесь анализов. В другом аспекте обеспечены способы увеличения минерального содержания кости у теплокровного животного, предусматривающие стадию введения теплокровному животному терапевтически эффективного количества молекулы, которая ингибирует связывание ТОР-бета-связывающего белка с ТОР-бета-суперсемейством белкоа, в том числе костных морфогенетических белков (ВМР). Репрезентативные примеры подходящих молекул включают антисмысловые молекулы, рибозимы, гены рибозимов и антитела (например, гуманизированное антитело), которые специфически узнают и изменяют активность ТОР-бета-связывающего белка.
В другом аспекте данного изобретения обеспечены способы увеличения минерального содержания кости у теплокровного животного, предусматривающие стадии: (а) введения в клетки, которые направляются домой - в кость, вектора, который управляет экспрессией молекулы, ингибирующей связывание ТОР-бета-связывающего белка с ТОР-бета-семейством белков и морфогенетическими белками кости (ВМР), и (Ь) введение содержащих вектор клеток в теплокровное животное. Должно быть понятно, в данном контексте, что клетки «направляются домой - в кость», если они локализованы в костном матриксе после периферического введения. В одном варианте осуществления такие способы дополнительно включают, перед стадией введения, выделение клеток из костного мозга, которые направляются домой в кость. В следующем варианте осуществления клетки, которые направляются домой - в кость, выбирают из группы, состоящей из СГО34+ клеток и остеобластов.
В других аспектах данного изобретения обеспечены (предпочтительно выделены) молекулы, которые ингибируют связывание ТОР-бета-связывающего белка с ТОР-бета-суперсемейством белков.
В следующих вариантах осуществления эти молекулы могут быть обеспечены в виде композиции и могут дополнительно содержать ингибитор резорбции кости. Репрезентвтивные примеры таких ингибиторов включают кальцитонин, эстроген, бифосфонат, фактор роста, имеющий антирезорбирующую активность и тамоксифен.
Репрезентативные примеры молекул, которые могут быть использованы в вышеупомянутых контекстах, включают, например, рибозимы, гены рибозимов, антисмысловые молекулы и/или антитела (например, гуманизированные антитела). Такие молекулы могут в зависимости от их выбора использоваться для изменения, антагонистического или агонистического действия на передачу сигнала или связывание члена семейства ТОР-бета-связывающих белков, описанных здесь.
В различных вариантах осуществления данного изобретения вышеописанные молекулы и способы лечения или предупреждения могут быть использованы в случае таких состояний, как остеопороз, остеомаляция, периодонтальное заболевание, цинга, болезнь Кушинга, перелом кости, и состояний, обусловленных иммобилизацией конечности и применением стероидов.
Данное изобретение обеспечивает также антитела, которые специфически связываются с ТОР-бетасвязывающим белком, склеростином (808Т), и обеспечивает иммуногены, содержащие пептиды склеростина, произведенные из районов склеростина, которые взаимодействуют с членом ТОР-бетасуперсемейства, таким как костный морфогенетический белок. В одном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются специфически с полипептидом склеростина, включающим аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО N0:2, 6, 8, 14, 46 или 65, где это антитело конкурентно ингибирует связывание полипептида 808Т по меньшей мере с одним из сайтов: (ί) сайтом связывания рецептора Типа I костного морфогенетического белка (ВМР) и (ίί) сайтом связывания рецептора Типа II ВМР, где сайт связывания рецептора Типа I ВМР способен связываться с полипептидом рецептора типа I ВМР, включающим аминокислотную последовательность, представленную в ОепВапк Асе. №№ NМ_004329 (8ЕЦ ГО N0:102); Ό89675 (8ЕС) ГО N0:103); ММ_001203 (8ЕС) ГО N0:104); 875359 (8ЕС) ГО N0:105); ММ_030849 (8ЕС) ГО N0:106); Ό38082 (8ЕС) ГО N0:107); ЯР_001194 (8ЕС) ГО N0:108); ВАА19765 (8ЕС) ГО N0:109) или ААВ33865 (8ЕЦ ГО N0:110), и где сайт связывания рецептора Типа II ВМР способен связываться с полипептидом рецептора Типа II ВМР, включающим аминокислотную последовательность, представленную в ОепВапк Асе. №№ И25110 (8ЕС) ГО N0:111); ММ_033346 (8ЕС) ГО N0:112); Ζ48923 (8ЕС) ГО N0:114); САА88759 (8ЕЦ ГО N0:115) или ЯМ_001204 (8ЕЦ ГО N0:113). В другом варианте осуществле- 6 022991 ния данное изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются специфически с полипептидом склеростина и которые нарушают образование гомодимера склеростина, где этот полипептид склеростина включает аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО N0:2, 6, 8, 14, 46 или 65.
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения это антитело является поликлональным антителом. В других вариантах осуществления это антитело является моноклональным антителом, которое является моноклональным антителом мыши, человека, крысы или хомячка. Данное изобретение обеспечивает также гибридомную клетку или клетку-хозяина, которая способна продуцировать это моноклональное антитело. В других вариантах осуществления данного изобретения это антитело является гуманизированным антителом или химерным антителом. Данное изобретение обеспечивает дополнительно клетку-хозяина, которая продуцирует гуманизированное или химерное антитело. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела является фрагментом Р(аЬ')2, РаЬ', РаЬ, Ρά или Ρν. Данное изобретение обеспечивает также антитело, которое является одноцепочечным антителом, и обеспечивает клетку-хозяина, которая способна экспрессировать это одноцепочечное антитело. В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает композицию, содержащую такие антитела и физиологически приемлемый носитель.
В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает иммуноген, содержащий пептид, содержащий по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более, чем 50 последовательных аминокислот полипептида 808Т, включающего аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО N0:2, 6, 8, 14, 46 или 65, где этот пептид способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом 808Т и которое конкурентно ингибирует связывание полипептида 808Т по меньшей мере с одним из сайтов: (ί) сайтом связывания рецептора Типа I костного морфогенетического белка (ВМР) и (ίί) сайтом связывания рецептора Типа II ВМР, где сайт связывания рецептора Типа I ВМР способен связываться с полипептидом рецептора типа I ВМР, включающим аминокислотную последовательность, представленную в ОепВапк Асе. №№ ММ_004329 (8ЕЦ ГО N0:102); Ό89675 (8ЕЦ ГО N0:103); N11 001203 (8ЕЦ ГО N0:104); 875359 (8ЕЦ ГО N0:105); ММ_030849 (8ЕЦ ГО N0:106); Ό38082 (8ЕЦ ГО N0:107); N0 001194 (8Ш ГО N0:108); ВАА19765 (8ЕЦ ГО N0:109) или ААВ33865 (8ЕЦ ГО N0:110), и где сайт связывания рецептора Типа II ВМР способен связываться с полипептидом рецептора Типа II ВМР, включающим аминокислотную последовательность, представленную в ОепВапк Асе. №№ И25110 (8Н0) ГО N0:111); ММ_033346 (8ЕЦ ГО N0:112); Ζ48923 (8ЕЦ ГО N0:114); САА88759 (8ЕЦ ГО N0:115) или ЯМ_001204 (8Е0 ГО N0:113). Данное изобретение обеспечивает также иммуноген, содержащий пептид, который содержит по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более, чем 50 последовательных аминокислот полипептида 808Т, включающего аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО N0:2, 6, 8, 14, 46 или 65, где этот пептид способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом 808Т и которое нарушает образование гомодимера 808Т.
В некоторых конкретных вариантах осуществления иммуногены рассматриваемого изобретения связаны с молекулой-носителем. В некоторых вариантах осуществления молекула-носитель является полипептидом-носителем и в конкретных вариантах осуществления этот полипептид-носитель является гемоцианином фиссуреллы.
Данное изобретение обеспечивает также способ получения антитела, которое специфически связывается с полипептидом 808Т, предусматривающий иммунизацию животного, не являющегося человеком, иммуноегном, содержащим по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более, чем 50 последовательных аминокислот полипептида 808Т, где (а) указанный полипептид 808Т включает аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО N0:2, 6, 8, 14, 46 или 65, (Ь) это антитело конкурентно ингибирует связывание полипептида 808Т по меньшей мере с одним из сайтов: (ί) сайтом связывания рецептора Типа I костного морфогенетического белка (ВМР) и (ίί) сайтом связывания рецептора Типа II ВМР, (с) сайт связывания рецептора Типа I ВМР способен связываться с полипептидом рецептора типа I ВМР, включающим аминокислотную последовательность, представленную в ОепВапк Асе. №№ ИМ_004329 (8ЕЦ ГО N0:102); Ό89675 (8ЕЦ ГО N0:103); NМ_001203 (8ЕЦ ГО N0:104); 875359 (8Н0) ГО N0:105); ММ_030849 (8ЕЦ ГО N0:106); Ό38082 (8ЕЦ ГО N0:107); N1’ 001194 (8Ш ГО N0:108); ВАА19765 (8ЕЦ ГО N0:109) или ААВ33865 (8ЕЦ ГО N0:110), и (ά) сайт связывания рецептора Типа II ВМР способен связываться с полипептидом рецептора Типа II ВМР, включающим аминокислотную последовательность, представленную в ОепВапк Асе. №№ И25110 (8ЕЦ ГО N0:111); ЯМ_033346 (8ЕЦ ГО N0:112); Ζ48923 (8ЕЦ ГО N0:114); САА88759 (8ЕЦ ГО N0:115) или N11 001204 (8ЕЦ ГО N0:113).
В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способ получения антитела, которое специфически связывается с полипептидом 808Т, включающим аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО N0: 2, 6, 8, 14, 46 или 65, предусматривающий иммунизацию животного, не являющимся человеком, иммуногеном, содержащим по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более, чем 50 последовательных аминокислот полипептида 808Т, включающего аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО N0:2, 6, 8, 14, 46 или 65, где это антитело
- 7 022991 нарушает образование гомодимера 8Ο8Τ.
Эти и другие аспекты данного изобретения будут очевидными после ссылки на следующее подробное описание и сопутствующие фигуры. Кроме того, документы, включающие различные приведенные здесь ссылки, которые описывают более подробно некоторые процедуры или композиции (например, плазмиды и т.д.), полностью включены в качестве ссылок.
Определения
Перед подробным изложением данного изобретения может быть полезным для его понимания приведение определений некоторых терминов и перечисление и определение аббревиатур, которые будут использованы далее.
Молекула включает белки или пептиды (например, антитела, рекомбинантные партнеры по связыванию, пептиды с желаемой аффинностью связывания), нуклеиновые кислоты (например, ДНК, РНК, химерные молекулы нуклеиновых кислот и аналоги нуклеиновых кислот, такие как ПНК) и органические или неорганические соединения.
ΤΟΡ-бета включает любой известный или новый член ΤΟΡ-бета-суперсемейства, который включает также костные морфогенетические белки (ВМР).
ΤΟΡ-бета-рецептор относится к рецептору, специфическому в отношении конкретного члена ΤΟΡ-бета-суперсемейства (в том числе костных морфогенетических белков (ВМР)).
ΤΟΡ-бета-связывающий белок обозначает белок со специфической аффинностью связывания в отношении конкретного члена или субпопуляции членов ΤΟΡ-бета-суперсемейства (в том числе костных морфогенетических белков (ВМР)). Конкретные примеры ΤΟΡ-бета-связывающих белков включают белки, кодируемые последовательностями 8ЕО ГО N0:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 и 101.
Ингибирование связывания ΤΟΡ-бета-связывающего белка с ΤΟΡ-бета-семейством белков и костными морфогенетическими белками (ВМР) относится к молекулам, которые делают возможной активацию ΤΟΡ-бета- или костных морфогентических белков (ВМР) или делают возможным связывание членов ΤΟΡ-бета-семейства, в том числе костных морфогенетических белков (ВМР), с их соответствующими рецепторами, посредством удаления или предотвращения ΤΟΡ-бета от связывания с ΤΟΡ-бетасвязывающим белком. Такое ингибирование может выполняться, например, молекулами, которые ингибируют связывание ΤΟΡ-бета-связывающего белка со специфическими членами ΤΟΡ-бетасуперсемейства.
Вектор обозначает ансамбль, который способен управлять экспрессией желаемого белка. Вектор должен включать промоторные элементы транскрипции, которые функционально связаны с представляющим интерес геном (представляюими интерес генами). Вектор может состоять из ДНК, РНК или комбинации этих двух компонентов (ДНК-РНК-химерный вектор). Необязательно, вектор може включать последовательность полиаденилирования, один или несколько сайтов рестрикции, а также один или несколько селектируемых маркеров, таких как неомицинфосфотрансфераза или гигромицинфосфотрансфераза. Дополнительно, в зависимости от выбранной клетки-хозяина и используемого вектора, в описанные здесь векторы могут быть также включены другие генетические элементы, такие как сайт инициации репликации, дополнительные сайты рестрикции нуклеиновых кислот, энхансеры, последовательности, придающие индуцибельность транскрипции, и селектируемые маркеры.
Выделенная молекула нуклеиновой кислоты обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая не интегрирована в геномную ДНК организма. Например, ДНК-молекула, которая кодирует ΤΟΡ-бетасвязывающий белок, которая была выделена из геномной ДНК эукариотической клетки, является выделенной молекулой ДНК. Другим примером выделенной молекулы нуклеиновой кислоты является химически синтезированная молекула нуклеиновой кислоты, которая не интегрирована в геном организма. Выделенной молекулой нуклеиновой кислоты может быть геномная ДНК, кДНК, РНК или молекула, составленная по меньшей мере частично из аналогов нуклеиновых кислот.
Выделенный полипептид является полипептидом, который, по существу, свободен от загрязняющих клеточных компонентов, таких как углеводы, липиды или другие небелковые примеси, ассоциированные с этим полипептидом в природе. Предпочтительно такие выделенные полипептиды являются по меньшей мере на приблизительно 90% чистыми, более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 95% чистыми и наиболее предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 99% чистыми. В некоторых вариантах осуществления конкретный препарат белка содержит выделенный полипептид, если он появляется номинально в виде единственной полосы при электрофорезе в ДСН-ПААГ с окрашиванием Кумасси. Термин выделенный, при применении к органическим молекулам (например, небольшим органическим молекулам) означает, что эти соединения являются более чем на 90%, чистыми согласно способам, хорошо известным в данной области (например, ЯМР, точка кипения).
Склеростеоз является термином, который использовался Наикеи (1967) (Наикеи, Η.Ο., 8к1егок1еоке, ίη: Ορίΐζ, Η.; 8α1ιιηίύΙ. Ρ, НаибЬисй бег КшбегЬейкиибе. Вегйи: 8ргш§ег (риЬ.) 6 1967. Рр. 351355) в отношении нарушения, сходного с синдромом ван Бухема генерализованного кортикального гиперостоза, но, возможно, отличающегося радиологическим изображением изменений костей и присутствием асиммметричной кожной синдактилии указательного и среднего пальцев во многих случаях. Подбородок имеет обычно квадратный вид в этом состоянии.
- 8 022991
Гуманизированные антитела являются рекомбинантными белками, в которых определяющие комплементарность районы моноклональных антител мыши или другого животного, не являющегося человеком, были перенесены из вариабельных районов тяжелых и легких цепей из иммуноглобулина мыши или другого животного, не являющегося человеком, в вариабельный домен человека.
В данном контексте фрагмент антитела является частью антитела, такой как Р(аЬ')2, Р(аЬ)2, РаЬ', РаЬ и т.п. Независимо от структуры, фрагмент антитела связывается с тем же самым антигеном, который узнается интактным антителом. Например, фрагмент моноклонального антитела против ТОР-бетасвязывающего белка связывается с эпитопом ТОР-бета-связывающего белка.
Термин фрагмент антитела или антигенсвязывающий фрагмент включает также любой синтетический или генетически сконструированный белок, который действует подобно антителу посредством связывания специфического антигена с образованием комплекса. Например, фрагменты антител включают выделенные фрагменты, состоящие из вариабельного района легкой цепи, Ру-фрагменты, состоящие из вариабельных районов тяжелой и легкой цепей, рекомбинантные одноцепочечные полипептидные молекулы, в которых вариабельные районы легкой и тяжелой цепей соединены пептидным линкером (δΡνбелки), и минимальные единицы узнавания, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельный район.
Детектируемая метка является молекулой или атомом, которые могут быть конъюгированы с полипептидной частью, такой как часть антитела или часть нуклеиновой кислоты, для получения молекулы, полезной для диагностики. Примеры детектируемых меток включают хелаторы, фотоактивные агенты, радиоизотопы, флуоресцентные агенты, парамагнитные ионы, ферменты и другие маркерные молекулы.
В данном контексте, иммуноконъюгат является молекулой, содержащей антитело против ТОРбета-связывающего белка, или фрагмент антитела, и детектируемую метку или эффекторную молекулу. Предпочтительно, иммуноконъюгат имеет в грубом приближении такую же, или только слегка уменьшенную, способность связывать ТОР-бета-связывающий белок после конъюгации, что и до конъюгации.
Аббревиатуры: ТОР-бета - трансформирующий фактор роста бета; ТОР-ЬВР - трансформирующий фактор роста бета-связывающий белок (один репрезентативный ТОР-ЬВР обзначается как Н, ВЕЕК); ВМР - костный морфогенетический белок; ПЦР - полимеразная цепная реакция; ОТ-ПЦР ПЦР-процесс, в котором РНК сначала транскрибируют в ДНК с использованием обратной транскриптазы (ОТ); ДНК - любая ДНК, полученная копированием РНК-последовательности в ДНК-форму.
Как отмечалось выше, данное изобретение обеспечивает новый класс ТОР-бета-связывающих белков, а также способы и композиции для увеличения минерального содержания кости у теплокровных животных. Вкратце, данное изобретение основывается на неожиданном открытии, что мутация в гене, который кодирует новый член семейства ТОР-бета-связывающих белков, приводит к редкому состоянию (склеростеозу), характеризующемуся минеральными содержаниями кости, которые являются в один раз четыре раза более высокими, чем у нормальных индивидуумов. Таким образом, как обсуждается более подробно ниже, это открытие привело к развитию анализов, которые могут быть использованы для отбора молекул, которые ингибируют связывание ТОР-бета-связывающего белка с семейством белков ТОРбета и костными морфогенетическими белками (ВМР), и способов использования таких молекул для увеличения минерального содержания кости теплокровных животных (в том числе, например, людей).
Обсуждение заболевания, известного как склеростеоз
Склеростеоз является заболеванием, родственным атипичной минеральной плотности кости у людей. Склеростеоз является термином, который применялся Напкеп (1967 (Напкеп Н.О., 8к1сго51со5с. ίη: Θρίΐζ Н.; §еЬш1б1 К, НапбЬиеЬ бег КшбегЬебкипбе. Вегбп: 8ргш§ег (риЬ.) 6 1967. Рр. 351-355) в отношении нарушения, сходного с синдромом ван Бухема генерализованного кортикального гиперостоза, но, возможно, отличающегося радиологическим изображением изменений костей и присутствием асиммметричной кожной синдактилии указательного и среднего пальцев во многих случаях.
В настоящее время известно, что склеростеоз является аутосомным полудоминантным нарушением, которое характеризуется широко диссеминированными склеротическими повреждениями кости у взрослого человека. Это состояние является прогрессирующим. Склеростеоз имеет также связанный с развитием аспект, который связан с синдактилией (два или более пальцев слиты вместе). Синдром склеростеоза ассоциирован с высоким ростом, и многие пораженные индивидуумы достигают высоты шесть или более футов. Минеральное содержание кости гомозигот может быть в 1-6 раз большим, чем наблюдаемое у нормальных индивидуумов, и минеральная плотность кости может быть в 1-4 раза выше нормальных величин (например, из непораженных сибсов).
Синдром склеростеоза встречается прежде всего у африканцев нидерланского происхождения в Южной Африке. Приблизительно 1/140 индивидуумов в населении Африки являются носителями этого мутированного гена (гетерозиготами). Эта мутация обнаруживает 100% пенетрантность. Имеются невероятные сообщения об увеличенной минеральной плотности кости в гетерозиготах без ассоциированных патологий (синдактилии или разрастания черепа).
Отсутствие аномалии системы гипофиз-гипоталамус наблюдали у пациентов со склеростеозом. В частности, по-видимому, нет сверхпродуцирования гормона роста и кортизона. Кроме того, уровни по- 9 022991 ловых гормонов являются нормальными у пораженных индивидуумов. Однако маркеры обновления кости (остеобласт-специфическая щелочная фосфатаза, остеокальцин, пропептид проколлагена С типа 1 (Р1СР) и общая щелочная фосфатаза; (см. Согшег С., Сигг. Θρίη. ίη КНеи. 7:243, 1995) показывают, что имеется гиперостеобластическая активность, ассоциированная с этим заболеванием, но имеется нормальная - слегка уменьшенная активность остеокластов, как измерено с использованием маркеров резорбции кости (пиридинолина, дезоксипиридинолина, Ν-телопептида, гидроксипролина мочи, тартратустойчивых кислых фосфатаз плазмы и галактолилгидроксилизина (см. Согшег, кирга)).
Склеростеоз характеризуется непрерывным депонированием минералов кости по всему скелету во время времени жизни пораженных индивидуумов. В гомозиготах непрерывное депонирование минералов кости приводит к разрастанию кости в зонах скелета, в которых отсутствуют механорецепторы (череп, подбородок, мозговой череп). В гомозиготах со склеростеозом разрастание костей черепа приводит к сдавливанию черепа и со временем к смерти вследствие избыточного гидростатического давления на ствол мозга. Во всех других частях скелета имеется генерализованный или диффузный склероз. Кортикальные зоны длинных (трубчатых) костей сильно утолщаются, приводя к существенному увеличению прочности кости. Губчатые соединения увеличиваются по толщине, что, в свою очередь, увеличивает прочность губчатой кости. Склеротические кости, по-видимому, являются непрозрачными для рентгеновских лучей.
Как описано более подробно в примере 1, редкая генетическая мутация, которая является ответственной за синдром склеростеоза, была обнаружена в хромосоме 17 человека, которая кодирует новый член смейства ТОР-бета-связывающих белков (один репрезентативный пример назван Н. Веег). Как описано более подробно ниже, на основании этого открытия механизм минерализации кости стал более полно понимаемым, что позволяет разработку анализов на молекулы, которые увеличивают минерализацию кости, и использование таких молекул для увеличения минерального содержания кости и для лечения или предупреждения большого числа заболеваний.
ТСЕ-бета-еупереемейетво
Суперсемейство трасформирующих факторов роста бета (ТОР-бета) содержит различные факторы роста, которые имеют общие элементы и структурные мотивы последовательности (как на вторичном, так и на третичном уровне). Известно, что это семейство белков проявляет широкий спектр биологических реакций, которые влияют на большое разнообразие типов клеток. Многие из членов семейства ТОРбета имеют важные функции во время эмбрионального развития в процессе приобретения упорядоченного распределения типов клеток и активностей и спецификации ткани; у взрослых члены этого семейства участвуют, например, в заживлении ран, репарации и ремоделировании кости и в модуляции иммунной системы. Кроме ТОР-бета это суперсемейство включает костные морфогенетические белки (ВМР), активины, ингибины, факторы роста и дифференцировки (ОЭР) и нейротрофические факторы глиального происхождения (ΟΌΝΡ). Первичная классификация установлена посредством общих признаков последовательности, которые относят конкретный белок к общему подсемейству. Дополнительное расслоение в этом подсемействе является возможным вследствие более строгой консервации последовательности между членами меньших групп. В некоторых случаях, таких как ВМР-5, ВМР-6 и ВМР-7, идентичность аминокислот может быть такой высокой, как 75%, среди членов этой меньшей группы. Этот уровень идентичности позволяет единственной реперезентативной последовательности иллюстрировать ключевые биохимические элементы данной подгруппы, которые выделяют ее из других членов большего семейства.
Кристаллическая структура ТОР-бета 2 была определена. Общая укладка ТОР-бета 2-мономера содержит стабильную, компактную цистеиновую, подобную узлу структуру, образованную тремя дисульфидными мостиками. Димеризация, стабилизированная одним дисульфидным мостиком, является антипараллельной.
ТОР-бета передает сигналы посредством индукции образования гетероолигомерных комплексов рецепторов типа I и типа II. Трансдукция сигналов ТОР-бета включает эти два отличающиеся подсемейства типа I и типа II трансмембранных серин/треонинкиназных рецепторов. Были идентифицированы по меньшей мере семь рецепторов типа I и пять рецепторов типа II (см. Ка\уаЬа1а е! а1., Су!окше ОтоМк Рас1от Кеу. 9:49-61 (1998); М|уа/опо е! а1., Αάν. Iттиηо1. 75:115-57 (2000). Члены семейства ТОР-бета инициируют свое клеточное действие посредством связывания с рецепторами с присущей им серин/треонинкиназной активностью. Каждый член ТОР-бета-семейства связывается с характерной комбинацией рецепторов типа I и типа II, оба из которых являются необходимыми для передачи сигнала. В существующей модели активации рецептора ТОР-бета ТОР-бета-лиганд сначала связывается с рецептором типа II (ТЬК-П), который встречается в клеточной мембране в олигомерной форме с активированной киназой. После этого рецептор типа I (ТЬК-Е), который не может связывать лиганд в отсутствие ТЪКЛ, рекрутируется в этот комплекс для образования тройного комплекса лиганд/тип П/тип I. Затем ТЬК-П фосфорилирует ТЬКЧ преимущественно в домене, богатом остатками глицина и серина (О8-домене), в расположенном рядом с мембраной районе и тем самым активирует ТЬК-Г Затем эта активированная киназа рецептора типа I фосфорилирует конкретные члены 8таб-семейства белков, которые перемещаются в ядро, где они модулируют транскрипцию специфических генов.
- 10 022991
Костные морфогенетические белки (ВМР) являются ключевыми регуляторными белками в определении минеральной плотности кости у людей
Главным успехом в понимании остеогенеза была идентификация костных морфогенетических белков (ВМР), также известных как остеогенные белки (ОР), которые регулируют дифференцировку хряща и кости ίη νίνο. ВМР/ОР индуцируют дифференцировку кости через каскад событий, которые включают образование хряща, гипертрофию и кальцификацию хряща, васкулярную инвазию, дифференцировку остеобластов и образование кости. Как описано выше, ВМР/ОР (ВМР 2-14 и остеогенные белки 1 и 2 (ОР-1 и ОР-2) (см., например, ОепВапк Р12643 (ВМР-2); ОепВапк Р12645 (ВМР3); ОепВапк Р55107 (ВМР-3Ъ, фактор 10 роста/дифференцировки) (ΟΌΓ-10)); ОепВапк Р12644 (ВМР4); ОепВапк Р22003 (ВМР5); ОепВапк Р22004 (ВМР6); ОепВапк Р18075 (ВМР7); ОепВапк Р34820 (ВМР8); ОепВапк О9ГК05 (ВМР9); ОепВапк 095393 (ВМР10); ОепВапк 095390 (ВМР11, предшественник фактора 11 роста/дифференцировки (ОЭР-11)); ОепВапк 095972 (ВМР15)) являются членами суперсемейства ТОГ-бета. Поразительное эволюционное сохранение между членами подсемейства ВМР/ОР предполагает, что они являются решающими в нормальном развитии и функционировании животных. Кроме того, присутствие множественных форм ВМР/ОР вызывает важный вопрос о биологическом значении этой видимой избыточности. Кроме постфетального хондрогенеза и остеогенеза ВМР/ОР играют множественные роли в скелетогенезе (в том числе, в развитии черепно-лицевых и зубных тканей) и в эмбриональном развитии и органогенезе паренхиматозных органов, в том числе, почек. В настоящее время понятно, что природа основывается на общих (и находящихся в небольшом количестве) молекулярных механизмах, созданных для обеспечения появления специализированных тканей и органов. Суперсемейство ВМР/ОР является изящным примером бережливости природы в программировании множественных специализированных функций, использующих молекулярные изоформы с минорными вариациями в аминокислотных мотивах в высоко консервативных карбоксиконцевых районах.
ВМР синтезируются в виде больших белков-предшественников. После димеризации ВМР протеолитически расщепляются в клетке с образованием карбоксиконцевых зрелых белков, которые затем секретируются из клетки. ВМР, подобно другим членам семейства ТОГ-бета, инициируют трансдукцию сигнала связыванием кооперативно с серин/треонинкиназными рецепторами как типа I, так и типа II. Рецепторы типа I, в отношении которых ВМР могут действовать в качестве лигандов, включают ВМРКΙΑ (также известный как ЛЬК-3), ВМРК.4В (также известный как ЛЬК-6), ЛЬК-1 и ЛЬК-2 (также известный как АсШП). Из рецепторов типа II, ВМР связывается с рецептором ВМР типа II (ВМРК.-П), активином типа II (Ас®.-П) и активином типа ПВ (Ас®.-ПВ). (См. ВаДешапк е1 а1., кирта и ссылки в этой работе). Полинуклеотидные последовательности и кодируемая аминокислотная последовательность полипептидов рецептора типа I ВМР обеспечены в базе данных ОепВапк, например, ИМ_004329 (8ЕО ГО N0:102, кодируемая 81 Г) ГО N0:116); Ό89675 (81 Г) ГО N0:103, кодируемая 81 Г) ГО N0:117); ММ_001203 (81Т) ГО N0:104, кодируемая 8ГО ГО N0:118); 875359 (81 (О ГО N0:105, кодируемая 8ΙΓ) ГО N0:119); ММ_030849 (81 (О ГО N0:106, кодируемая 8ГО ГО N0:120) и Ό38082 (81 (О ГО N0:107, кодируемая 8Е0 ГО N0:121). Другие полипептидные последовательности рецепторов типа I обеспечены в базе данных ОепВапк, например, N0 001194 (8ГО ГО N0:108); ВАА19765 (81 Г) ГО N0:109) и ААВ33865 (8Е0 ГО N0:110). Полинуклеотидные последовательности и кодируемая аминокислотная последовательность полипептидов рецептора типа II ВМР обеспечены в базе данных ОепВапк, например, И25110 (8Е0 ГО N0:111, кодируемая 8ГО ГО N0:122); ММ 033346 (8ГО ГО N0:112, кодируемая 8ГО ГО N0:123); ММ_001204 (81 Г) ГО N0:113, кодируемая 81 Г) ГО N0:124) и Ζ48923 (81 Г) ГО N0:114, кодируемая 8ГО ГО N0:125). Дополнительные полипептидные последовательности рецепторов типа II также обеспечены в базе данных ОепВапк, например, САА88759 (8Е0 ГО N0:115).
ВМР, сходные с другими имеющими цистиновый узел белками, образуют гомодимерную структуру (8сЬеийет е( а1., I. Мо1. Вю1. 287:103-15 (1999)). В соответствии с анализом эволюционного прослеживания, выполненного на семействе ВМР/ТОГ-β, сайт связывания рецептора типа I ВМР и сайт связывания рецептора типа II ВМР были картированы на поверхности структуры ВМР Дпшк е( а1., Рго1еш Епд. 13:839-47 (2000)). Местоположение сайта связывания рецептора типа I на ВМР было позднее подтверждено рентгеновской структурой комплекса ВМР-2/рецептор ВМР (N^ске1 е( а1., I. ДоиН 8игд. Ат. 83А(8ирр1 1(РП)):87-814 (2001)). Предсказанный сайт связывания рецептора типа II хорошо согласуется с рентгеновской структурой комплекса ТОГ-в3/рецептор типа II ТОГ-β (Най е( а1., №1. 8(гнс(. Вю1. 9:203208 (2002)), который имеет большое сходство с системой ВМР/рецептор ПА ВМР.
Антагонизм в отношении ВМР
Подсемейства ВМР и активина подвергаются значительной посттрансляционной регуляции, например, ТОГ-бета-связывающими белками. Существует сложная система внеклеточной регуляции, посредством которой синтезируется и экспортируется высокоаффинный антагонист, и затем он образует комплексы селективно с ВМР или активинами для разрушения их биологической активности (\ν.Ο8ιηί11ι (1999) ТЮ 15(1) 3-6). Ряд этих природных антагонистов были идентифицированы и, на основе дивергенции последовательности, эти антагонисты, по-видимому, эволюционировали независимо вследствие отсутствия сохранения первичной последовательности. Более ранние исследования этих антагонистов ярко
- 11 022991 выявили отличающуюся предпочтительность в отношении взаимодействия и нейтрализации ВМР-2 и ВМР-4. У позвоночных антагонисты включают ноггин, хордин, хордин-подобный, фоллистатин, Р8РК, семейство белков БАХ/СегЬегик и склеростин (808Т) (см. Ва1етапк еί а1., кирга и ссылки в этой работе). Механизм антагонизма или ингибирования, по-видимому, отличается для различных антагонистов (1етига е1 а1., (1998) Ргос. №ί1. Асай. δοΐ. И8А 95 9337-9342).
Сайты связывания рецепторов типа I и типа II на антагонисте ВМР ноогине были также картированы. Ноггин связывается с ВМР с высокой аффинностью (Аттегтап еί а1., 1996). Исследование структуры комплекса ноггин/ВМР-7 выявило связывающие взаимодействия между этими двумя белками (Огорре еί а1., №1иге 420:636-42 (2000)). Наложение структуры ноггин-ВМР-7 на модель комплекса передачи сигнала ВМР показало, что связывание ноггина эффективно маскирует обе пары связывающих эпитопов (т.е. сайтов связывания рецепторов типа I и типа II ВМР) на ВМР-7. Последовательности богатого цистеином каркаса ноггина предшествует №концевой сегмент из приблизительно 20 аминокислотных остатков, который называют зажимом (клипом) (остатки 28-48). Сайт связывания рецептора типа I закрыт ^концевой частью домена-зажима ноггина, а сайт связывания рецептора типа II закрыт карбоксиконцевой частью этого домена-зажима. Две β-цепи во внутреннем (коровом) районе вблизи С-конца ноггина также контактируют с ВМР-7 при сайте связывания рецептора типа II. Этот способ связывания позволяет димеру ноггина эффективно блокировать все сайты связывания рецепторов (два сайта связывания рецептора типа I и два сайта связывания рецептора типа II) на димере ВМР.
Новые ТСГ-бета-связывающие белки
Как отмечалось выше, данное изобретение обеспечивает новый класс ТОР-бета-связывающих белков, которые имеют почти идентичный цистеиновый (дисульфидный) каркас при сравнении с белками Нитап БАИ, Нитап СгетПп и Нитап СегЬегик и 8СОР (Патент США № 5780263), но почти не имеют гомологии на уровне нуклеотидов (в отношении предшествующей информации см. в основном Нки Б.К., Есопот1йек А.К, ХУапд X., Еипоп Р.М., Наг1апй К.М., Тйе Хепорик ЭогкаП/тд РасЮг Отетйп (йеШШек а Nονе1 Ратйу о£ 8есге1ей РгоЮтк 1Па1 ЛгЛадош/е ВМР Лс11У1(1ек. Мо1еси1аг Се11 1:673-683, 1998).
Репрезентативные примеры нового класса молекул нуклеиновых кислот, кодирующих ТОР-бетасвязывающие белки, описаны в последовательностях 8ЕО ГО N0:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 и 101. Полинуклеотиды, описанные здесь, кодируют полипептид, названный Веег, который называют здесь также склеростин или 808Т. Следует также понимать, что репрезентативные члены этого класса связывающих белков включают варианты ТОР-бета-связывающего белка (например, 8ЕО ГБ N0:5 и 7). В данном контексте вариантный ген ТОР-бета-связывающего белка (например, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариант ТОР-бета-связывающего белка) обозначает молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является модификацией 8Е0 ГО N0:2, 10, 12, 14, 16, 46 или 65. Такие варианты включают природно встречающиеся полиморфизмы или аллельные варианты генов ТОР-бета-связывающих белков, а также синтетические гены, которые содержат консервативные аминокислотные замены этих последовательностей аминокислот. Различные критерии, известные специалистам с квалификацией в данной области, показывают, являются ли аминокислоты в конкретном положении в пептиде или полипептиде подобными. Например, сходной аминокислотой или консервативной аминокислотной заменой является замена, в которой аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь, причем сходные аминокислоты включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин); кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота); незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, гистидин); неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан); бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан). Пролин, который, как считается, более трудно классифицировать, имеет общие свойства с аминокислотами, которые имеют алифатические боковые цепи (например, Ьеи, Уа1, Не и А1а). В некоторых обстоятельствах замена глутамином глутаминой кислоты или аспарагином аспарагиновой кислоты может рассматриваться как сходная замена вследствие того, что глутамин и аспарагин являются амидными производными глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, соответственно.
Дополнительными вариантными формами гена ТОР-бета-связывающего белка являются молекулы нуклеиновых кислот, которые содержат инсерции или делеции описанных здесь нуклеотидных последовательностей. Вариантные гены ТОР-бета-связывающих белков могут быть идентифицированы определением, гибридизуются ли эти гены с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО N0:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 и 101 в жестких условиях. Кроме того, вариантные гены ТОР-бета-связывающих белков должны кодировать белок, имеющий цистеиновый скелет основной цепи.
В качестве альтернативы, вариантные гены ТОР-бета-связывающих белков могут быть идентифицированы сравнением последовательностей. В данном контексте, две аминокислотные последовательности имеют 100% идентичность аминокислотной последовательности, если аминокислотные остатки этих двух аминокислотных последовательностей являются одинаковыми при выравнивании для макси- 12 022991 мального соответствия. Подобным образом, две нуклеотидные последовательности имеют 100% идентичность нуклеотидной последовательности, если нуклеотидные остатки этих двух нуклеотидных последовательностей являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия. Сравнения последовательностей могут выполняться с использованием стандартных программ программного обеспечения, таких как программы, включенные в компьютерный комплект биоинформатики ЬАЗЕКОЕИЕ, который производится ЭНАЗТАК. (МабШоп, ХУРсопкт). Другие способы сравнения двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей определением оптимального выравнивания хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области (см., например, Регикк апб Регикк, Т1е 1п!егпе! апб !1е №ν Вю1оду: Тоо1к Гог Оепопис апб Мо1еси1аг Кекеагс! (АЗМ Ргекк, 1пс. 1997), №п е! а1., (ебк.), ШогтаПоп ЗирегкдЬетау апб Сотри!ег Эа1аЬакек оГ Шскс Лабк апб РгоЮтк, ш МеПюбк т Оепе Вю1есНпо1оду, радек 123-151 (СКС Ргекк, 1пс. 1997) и ВШЬор (еб.), Ошбе !о Нитап Оепоте СотриПпд, 2пб ЕбШоп (Асабепис Ргекк, 1пс. 1998).
Вариантные ТОР-бета-связывающие белки должны иметь по меньшей мере 50% идентичность аминокислотной последовательности относительно ЗЕО ГО N0:2, 6, 10, 12, 14, 16, 46 или 65 и предпочтительно идентичность, большую чем 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95%. Альтернативно, варианты ТОРбета-связывающих белков могут быть идентифицированы по наличию по меньшей мере 70% идентичности нуклеотидной последовательности относительно ЗЕО ГО N0:1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 и 101. Кроме того, данное изобретение рассматривает варианты генов ТОР-бета-связывающих белков, имеющие 75, 80, 85, 90 или 95% идентичность относительно ЗЕО ГО N0:1 или ЗЕО ГО N0:100. Независимо от конкретного способа, используемого для идентификации вариантного гена ТОР-бета-связывающего белка или варианта ТОР-бета-связывающего белка, вариантный ТОР-бета-связывающий белок или полипептид, кодируемый вариантным геном ТОР-бета-связывающего белка, может быть функционально охарактеризован, например, его способностью связываться с выбранным членом ТОР-бета-семейства белков и/или ингибировать передачу сигнала выбранного члена ТОР-бета-семейства белков или его способностью связываться специфически с антителом против ТОР-бета-связывающего белка.
Данное изобретение включает функциональные фрагменты генов ТОР-бета-связывающих белков. В контексте данного изобретения функциональный фрагмент гена ТОР-бета-связывающего белка обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует часть полипептида ТОР-бета-связывающего белка, которая или (1) обладает вышеупомянутой функциональной активностью, или (2) специфически связывается с антителом против ТОР-бета-связывающего белка. Например, функциональный фрагмент гена ТОР-бета-связывающего белка, описанный здесь, содержит часть нуклеотидной последовательности ЗЕО ГО N0:1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 или 101.
Выделение гена ТСЕ-бета-связывающего белка
Молекулы ДНК, кодирующие ТОР-бета-связывающий белок, могут быть получены скринингом библиотеки кДНК или геномной библиотеки человека с использованием полинуклеотидных зондов на основе, например, ЗЕО ГО N0:1. Например, первой стадией в получении кДНК-библиотеки является выделение РНК с использованием способов, хорошо известных специалистам с квалификацией в данной области. Обычно способы выделения РНК обеспечивают способ разрушения клеток, средство ингибирования РНКазной деградации РНК и способ отделения РНК от ДНК-, белковых и полисахаридных загрязнителей. Например, тотальная РНК может быть выделена замораживанием ткани в жидком азоте, растиранием замороженной ткани пестиком в ступке для лизиса клеток, экстракцией измельченной ткани раствором фенол/хлорорм для удаления белков и отделением РНК от оставшихся примесей селективным осаждением хлоридом лития (см., например, АикиЬе1 е! а1., (ебк.), З1юг1 Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Ью1оду, 3гб ЕбШоп, радек 4-1 - 4-6 (кЬп №Пеу атб Зопк 1995) [АикиЬе1 (1995)]; №п е! а1., МеПюбк ш Оепе Вю!ес1по1оду, радек 33-41 (СКС Ргекк, 1пс. 1997) [№и (1997)]). Альтернативно, тотальная РНК может быть выделена экстракцией измельченной ткани изотиоцианатом гуанидиния, экстракцией органическими растворителями и отделением РНК от загрязнителей с использованием дифференциального центрифугирования (см., например, АикиЬе1 (1995), радек 4-1 -4-6; №п (1997), радек 33-41).
Для конструирования кДНК-библиотеки из препарата тотальной РНК предпочтительно выделяют поли(А') РНК. Поли(А+) РНК может быть выделена из тотальной РНК с использованием стандартного способа олиго(бТ)-целлюлозной хроматографии (см., например, АикиЬе1 (1995), радек 4-11 - 4-12). Двухцепочечные молекулы кДНК могут быть синтезированы из поли(А+) РНК с использованием способов, хорошо известных специалистам с квалификацией в данной области (см., например, №и (1997), радек 4146). Кроме того, для синтеза двухцепочечных молекул кДНК могут быть использованы коммерчески доступные наборы (например, ЫГе ТесЬпо1од1ек, 1пс. (ОайПегкЬигд, Магу1апб); СЬ0ЭТЕСН ЬаЬога!опек, 1пс. (Ра1о А1!о, СаПГогша); Рготеда СогрогаПоп (Мабшоп, №1ксопкт); и ЗПШадепе С1отпд Зук!етк (Ьа 1о11а, СаПГогша)).
Основной подход для получения кДНК-клонов ТОР-бета-связывающих белков может быть модифицирован конструированием произведенной путем вычитания кДНК-библиотеки, которая обогащена специфическими в отношении ТОР-бета-связывающих белков кДНК-молекулами. Способы конструирования произведенных путем вычитания библиотек хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области (см., например, Загдеп!, 1ко1аПоп оГ ОПТегепПаПу Ехргеккеб Оепек, ш Ме!1. Еп/утоЕ
- 13 022991
152:423, 1987 и \Уи с1 а1., (ебк.), Сопк1гисйоп апб Зсгеешпд о£ ЗиЬк1гас1еб апб Сотр1е1е Ехргеккюп οΩΝΛ ЫЪгайек, ш Ме!йобк ш Оепе Вю!есйпо1оду, радек 29-65 (СКС Ргекк, 1пс. 1997)).
Различные клонирующие векторы являются подходящими для конструирования кДНК-библиотеки. Например, кДНК-библиотека может получена в векторе, полученном из бактериофага, таком как вектор λ д!10 (см., например, Ниупй е! а1., Сопкйисйпд апб Зсгеешпд с^NΑ ЫЪгапек ш λ д!10 апб ХдИ1, ш ΌΝΆ С1отпд: А Ргасйса1 Арргоасй Уо1. I, О1оуег (еб.), раде 49 (1КЬ Ргекк, 1985); \Уи (1997), радек 47-52). Альтернативно, двухцепочечные молекулы кДНК могут быть встроены в плазмидный вектор, такой как вектор рВШексйр! (З!га!адепе С1отпд Зук!етк; Ьа 1о11а. СайГогта), ЬатЪбаОЕМ-4 (Рготеда Согр.; МабЬ коп, ХУЬсопкт) или другие коммерчески доступные векторы. Подходящие клонирующие векторы могут быть также получены из Американской Коллекции Типовых Культур (КоскуШе, Магу1апб).
Для амплификации клонированных молекул кДНК кДНК-библиотеку встраивают в прокариотического хозяина с использованием стандартных способов. Например, кДНК-библиотека может быть введена в компетентные клетки Е. сой ΌΗ5, которые могут быть получены из Ьбс Тесйпо1од1ек, 1пс. (ОаййегкЪигд, Магу1апб).
Библиотека геномной ДНК человека может быть получена способами, хорошо известными в данной области (см., например, АикиЪе1 (1995), радек 5-1 - 5-6; \Уи (1997), радек 307-327). Геномная ДНК может быть выделена лизисом ткани детергентом Саркозилом, расщеплением этого лизата протеиназой К, осветлением посредством удаления нерастворимых остатоков (дебриса) из лизата центрифугированием, осаждением нуклеиновой кислоты из лизата с использованием изопропанола и очисткой ресуспендированной ДНК в градиенте плотности хлорида цезия.
ДНК-фрагменты, которые являются подходящими для получения геномной библиотеки, могут быть получены случайным разрезанием геномной ДНК или частичным расщеплением геномной ДНК рестрикционными эндонуклеазами. Фрагменты геномной ДНК могут быть встроены в вектор, такой как бактериофаг или космидный вектор, в соответствии с общепринятыми способами, такими как использование расщепления рестриктазами для получения подходящих концов, использование обработки щелочной фосфатазой во избежание нежелательного соединения молекул ДНК и лигирование с использованием подходящих лигаз. Способы такой манипуляции являются хорошо известными в данной области (см., например, АикиЪе1 (1995), радек 5-1 - 5-6; \Уи (1997), радек 307-327.
Молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют ТОР-бета-связывающий белок, могут быть также получены с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) с олигонуклеотидными праймерами, имеющими нуклеотидные последовательности, которые основаны на нуклеотидных последовательностях гена ТОР-бета-связывающего белка человека, описанного здесь. Общие способы для скрининга библиотек с использованием ПЦР описаны, например, Уи е! а1., Ике о£ !йе Ро1утегаке Сйат Кеасйоп !о Зсгееп РЬаде ЫЪгапек, ш Ме!йобк ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 15: РСК Рго1осо1к: Сиггеп! Ме!йобк апб Аррйсайопк, ^ййе (еб.), радек 211-215 (Нитапа Ргекк, 1пс. 1993). Кроме того, способы использования ПЦР для выделения родственных генов описаны, например, Ргек!оп, Ике о£ Ьедепега1е Ойдопис1еойбе Рйтегк апб !йе Ро1утегаке Сйат Кеасйоп !о С1опе Оепе Ратйу МетЪегк, ш Ме!йобк ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 15: РСК Рго1осо1к: Сиггеп! Ме!йобк апб Аррйсайопк, ^ййе (еб.), радек 317-337 (Нитапа Ргекк, 1пс. 1993).
Альтернативно, геномные библиотеки человека могут быть получены из коммерческих источников, таких как Кекеагсй Оепейск (НийкуШе, АЬ) и Американская Коллекция Типовых Культур (КоскуШе, Магу1апб). Библиотека, содержащая кДНК- или геномные клоны, может быть подвергнута скринингу с использованием одного или нескольких полинуклеотидных зондов на основе ЗЕЦ ГО N0:1, с использованием стандартных способов, описанных здесь и известных в данной области (см., например, АикиЪе1 (1995), радек 6-1 - 6-11).
Антитела против ТОР-бета-связывающих белков, полученные как описано здесь, могут быть также использованы для выделения последовательностей ДНК, которые кодируют ТОР-бета-связывающий белок, из кДНК-библиотек. Например, эти антитела могут быть использованы для скрининга библиотек экспрессии λ§ί11, или эти антитела могут быть использованы для иммуноскрининга после отбора и трансляции гибридов (см., например, АикиЪе1 (1995), радек 6-12 - 6-16; Магдойк е! а1., Зсгеешпд λ ехргеккюп йЪгайек \\йй апйЪобу апб рго!еш ргоЪек, ш ΩΝΛ С1ошпд 2: Ехргеккюп Зук!етк, 2пб ЕбШоп, О1оуег е! а1. (ебк.), радек 1-14 (Ох&гб Ьшуегкбу Ргекк 1995)).
Последовательность кДНК ТОР-бета-связывающего белка или геномного фрагмента ТОР-бетасвязывающего белка может быть определена с использованием стандартных способов. Кроме того, идентификация геномных фрагментов, содержащих промотор или регуляторный элемент ТОР-бетасвязывающего белка, может быть достигнута с использованием хорошо установленных способов, таких как делеционный анализ (см. в общем АикиЪе1 (1995), кирга).
В качестве альтернативы, ген ТОР-бета-связывающего белка может быть получен синтезом молекул ДНК с использованием взаимнопраймирующих длинных олигонуклеотидов и нуклеотидных последовательностей, описанных здесь (см., например, АикиЪе1 (1995), радек 8-8 - 8-9). Установленные способы с использованием полимеразной цепной реакции обеспечивают возможность синтеза молекул ДНК с длиной по меньшей мере две т.п.н. (Абапд е! а1., Р1ап! Мо1ес. Вю1. 21:1131, 1993; ВатЪо! е! а1., РСК
- 14 022991
Мебобк апб АррИсакопк 2:266, 1993; Όίΐΐοη е! а1., Ике οί !ке Ро1утегаке Скат Кеаскоп 1ог !ке Кар1б Сопк!гископ οί ЗуШкекс Оепек, ш Ме!кобк ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 15: РСК Рго!осо1к: Сиггеп! Ме!кобк апб Аррксакопк, \Укке (еб.), радек 263-268, (Нитапа Ргекк, 1пс. 1993); Но1о\\ас1шк е! а1., РСК Ме!кобк Арр1. 4:299, 1995).
Получение генов ТСГ-бета-связывающих белков
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие вариантные гены ТОР-бета-связывающих белков, могут быть получены скринингом различных кДНК-библиотек или геномных библиотек полинуклеотидными зондами, имеющими нуклеотидные последовательности на основе ЗЕО ГО N0:1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 и 101, с использованием процедур, описанных здесь. Варианты генов ТОР-бета-связывающих белков могут быть также сконструированы синтетически. Например, может быть изобретена молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, имеющий консервативную аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью ЗЕО ГО N0: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 или 65. То есть, могут быть получены варианты, которые содержат одну или несколько аминокислотных замен ЗЕО ГО N0: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 или 65, в которых алкиламинокислотой заменяют алкиламинокислоту в аминокислотной последовательности ТОР-бета-связывающего белка, ароматической аминокислотой заменяют ароматическую аминокислоту в аминокислотной последовательности ТОР-бета-связывающего белка, серусодержащей аминокислотой заменяют серусодержащую аминокислоту в аминокислотной последовательности ТОР-бета-связывающего белка, гидроксисодержащей аминокислотой заменяют гидроксиаминокислоту в аминокислотной последовательности ТОР-бета-связывающего белка, кислотной аминокислотой заменяют кислотную аминокислоту в аминокислотной последовательности ТОР-бетасвязывающего белка, основной аминокислотой заменяют основную аминокислоту в аминокислотной последовательности ТОР-бета-связывающего белка или двухосновной монокарбоновой аминокислотой заменяют двухосновную монокарбоновую аминокислоту в аминокислотной последовательности ТОРбета-связывающего белка. Среди обычных аминокислот, например, консервативная аминокислотная замена иллюстрируется заменой среди аминокислот в каждой из следующих групп: (1) глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин, (2) фенилаланин, тирозин и триптофан, (3) серии и треонин, (4) аспартат и глутамат, (5) глутамин и аспарагин и (6) лизин, аргинин и гистидин. В выполнении таких замен важно, когда это возможно, сохранять цистеиновый скелет, показанный на фиг. 1.
Консервативные аминокислотные изменения в гене ТОР-бета-связывающего белка могут быть введены заменой другими нуклеотидами нуклеотидов, указанных в ЗЕО ГО N0:1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 и 101. Такие варианты консервативных аминокислот могут быть получены, например, олигонуклеотиднаправленным мутагенезом, линкер-сканирующим мутагенезом, мутагенезом с использованием полимеразной цепной реакции и т.п. (см. АикиЬе1 (1995), радек 8-10 - 8-22; МсРкегкоп (еб.), ОнесЮб Ми!адепек: А РтасИса1 Арргоаск (1КЬ Ргекк 1991)). Функциональная способность таких вариантов может быть определена с использованием стандартного способа, такого как описанный здесь анализ. Альтернативно, вариантный полипептид ТОР-бета-связывающего белка может быть идентифицирован по способности специфически связывать антитела против ТОР-бета-связывающего белка.
Рутинные делеционные анализы молекул нуклеиновых кислот могут выполняться для получения функциональных фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид ТОРбета-связывающего белка. В качестве иллюстрации молекулы ДНК, имеющие нуклеотидную последовательность ЗЕО ГО N0:1, могут быть расщеплены нуклеазой Ва131 с получением ряда вмонтированных делеций. Затем эти фрагменты встраивают в экспрессирующие векторы в правильной рамке считывания и экспрессируемые полипептиды выделяют и испытывают на активность или на способность связывать антитела против ТОР-бета-связывающего белка. Одной альтернативой экзонуклеазному расщеплению является использование олигонуклеотид-направленного мутагенеза для введения делеций или стопкодонов для спецификации получения желаемого фрагмента. Альтернативно, конкретные фрагменты гена ТОР-бета-связывающего белка могут быть синтезированы с использованием полимеразной цепной реакции.
Стандартные способы функционального анализа белков описаны, например, Тгеи!ег е! а1., Мо1ес. Оеп. Оепе!. 240:113, 1993; Соп!еп! е! а1., Ехртеккюп апб ртекттату бе1е!юп апа1укк οί !ке 42 кПа 2-5А куп!ке!аке шбисеб Ьу китап нИебегоп. ш Вю1одюа1 1п!ебегоп Зук!етк, Ртосеебшдк οί 131К-ТЫ0 МееИпд оп 1п!ебегоп Зук!етк, Сап!е1 (еб.), радек 65-72 (№)коб 1987); Негксктап, Тке ЕОР Кесер!ог, ш Соп!го1 οί Атта1 Се11 Ртокбетакоп, Уо1. 1, Воуп!оп е! а1., (ебк.) радек 169-199 (Асабетю Ргекк 1985); СоитаШеаи е! а1., 1. Вю1. Скет. 270:29270, 1995; Рикипада е! а1., 1. Вю1. Скет. 270: 25291, 1995; УатадисЫ е! а1., Вюскет. Ркагтасо1. 50: 1295, 1995; Меке1 е! а1., Р1ап! Мо1ес. Вю1. 30:1, 1996.
Данное изобретение рассматривает также функциональные фрагменты гена ТОР-бетасвязывающего белка, которые имеют консервативные замены аминокислот.
Вариантный ген ТОР-бета-связывающего белка может быть идентифицирован на основе структуры определением уровня идентичности с нуклеотидными и аминокислотными последовательностями ЗЕО ГО N0: 1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 и 101 и 2, 6, 10, 12, 14, 16, 46 или 65, как обсуждалось выше. Альтернативный подход для идентификации вариантного гена на основе структуры заключается в определении, может ли молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая потенциальный вариантный ген ТОР-бета- 15 022991 связывающего белка, гибридизоваться в жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО N0:1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 и 101 или ее частью с длиной по меньшей мере 15 или 20 нуклеотидов. В качестве иллюстрации жестких условий гибридизации молекула нуклеиновой кислоты, имеющая вариантную последовательность гена ТОР-бета-связывающего белка, может связываться с фрагментом молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность из 8Е0 ГО N0:1, в буфере, содержащем, например, 5/88РЕ (1/88РЕ = 180 мМ хлорид натрия, 10 мМ фосфат натрия, 1 мМ ЭДТА (рН 7,7), 5/ раствор Денхардта (100 / раствор Денхардта = 2% (мас./об) бычий сывороточный альбумин, 2% (мас./об) Фиколл, 2% (мас./об.) поливинилпирролидон) и 0,5% ДМН, при инкубировании в течение ночи при 55-60°С. Постгибридизационные промывки при высокой жесткости обычно выполняют в 0,5/88С (1/88С = 150 мМ хлорид натрия, 15 мМ тринатрийцитрат) или в 0,5/88РЕ при 55-60°С.
Независимо от конкретной нуклеотидной последовательности вариантного гена ТОР-бетасвязывающего белка этот ген кодирует полипептид, который может быть охарактеризован его функциональной активностью или его способностью связываться специфически с антителом против ТОР-бетасвязывающего белка. Более конкретно, вариантные гены ТОР-бета-связывающих белков кодируют полипептиды, которые проявляют по меньшей мере 50% и предпочтительно большую, чем 60, 70, 80 или 90% активность полипептидов, кодируемых геном ТОР-бета-связывающего белка человека, описанным здесь.
Получение ТСГ-бета-связывающего белка в культивируемых клетках
Для экспрессии гена ТОР-бета-связывающего белка молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая этот полипептид, должна быть функционально связана с регуляторными последовательностями, которые регулируют транскрипционную экспрессию, в экспрессирующем векторе и затем введена в клеткухозяина. Кроме регуляторных последовательностей транскрипции, таких как промоторы и энхансеры, экспрессирующие векторы могут включать регуляторные последовательности трансляции и маркерный ген, который пригоден для отбора клеток, которые несут этот экспрессирующий вектор. Экспрессирующие векторы, которые пригодны для получения чужеродного белка в эукариотических клетках, обычно содержат (1) элементы прокариотической ДНК, кодирующие бактериальный сайт инициации репликации и маркер устойчивости к антибиотику для обеспечения роста и отбора этого экспрессирующего вектора в бактериальном хозяине; (2) элементы эукариотической ДНК, которые регулируют инициацию транскрипции, такие как промотор; и (3) элементы ДНК, которые регулируют процессинг транскриптов, такие как последовательность терминации транскрипции/полиаденилирования.
ТОР-бета-связывающие белки данного изобретения предпочтительно экспрессируются в клетках млекопитающих. Примеры клеток-хозяев млекопитающих включают клетки почки Африканской зеленой мартышки (Уего; АТСС СКЬ 1587), клетки эмбриональной почки человека (293-НЕК; АТСС СКЬ 1573), клетки почки хомячка (ЬаЬу Ьатк!ег) (ВНК-21; АТСС СКЬ8544), клетки почки собачьих (МОСК; АТСС ССЬ 34), клетки яичника Китайского хомячка (СНО-К1; АТСС ССЬ61), клетки гипофиза крысы (ОН1; АТСС ССЬ82), клетки НеЬа 83 (АТСС ССЬ2.2), клетки гепатомы крысы (Н-4-11-Е; АТСС СКЬ 1548), 8У40-трансформированные клетки почки обезьяны (С08-1; АТСС СКЬ 1650) и мышиные эмбриональные клетки (№Н-3Т3; АТСС СКЬ 1658).
Для хозяина-млекопитающего регуляторные сигналы транскрипции и трансляции могут быть получены из вирусных источников, таких как аденовирус, бычий папилломавирус, вирус обезьян или т.п., в которых регуляторные сигналы ассоциированы с конкретным геном, который имеет высокий уровень экспрессии. Подходящие регуляторные последовательности транскрипции и трансляции могут быть также получены из генов млекопитающих, таких как гены актина, коллагена, миозина и металлотионеина.
Транскрипционные регуляторные последовательности включают промоторный район, достаточный для управления инициацией синтеза РНК. Подходящие эукариотические промоторы включают промотор мышиного гена металлотионеина I [Натег е1 а1., 1. Мо1ес. Арр1. Оепе! 1:273, 1982], промотор ТК вируса герпеса [МсКтдЬ!, Се11 31:355, 1982], ранний промотор 8У40 |Вепо151 е1 а1., №11иге 290:304, 1981], промотор вируса саркомы Рауса [Оогтап е! а1., Ргос. №И1. Асаб. 8сЕ И8А 79:6777, 1982], промотор цитомегаловируса [Роескшд е! а1., Оепе 45:101, 1980] и промотор вируса опухоли молочной железы мыши (см., в общем, Еюкеуеггу, Ехргеккюп оГ Епдшеегеб Ргсйетк ίη МаттаЬап Се11 СиИиге, ίη Рго!ет Епдшеегшд: Ргтс1р1ек апб Ргаубсе, С1е1апб е1 а1., (ебк.), радек 163-181 (бокп \УПеу апб 8опк, 1пс. 1996)).
Альтернативно, прокариотический промотор, такой как промотор РНК-полимеразы бактериофага Т3, может быть использован для регуляции экспрессии гена ТОР-бета-связывающего белка в клетках млекопитающих, если этот прокариотический промотор регулируется эукариотическим промотором (2бои е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 10:4529, 1990; КаиГтап е! а1., №с1е1с Аибк Кек. 19:4485, 1991).
Гены ТОР-бета-связывающего белка могут быть также экспрессированы в бактериальных, дрожжевых клетках, клетках насекомых или клетках растений. Подходящие промоторы, которые могут быть использованы для экспрессии полипептидов ТОР-бета-связывающих белков в прокариотическом хозяине, хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области и включают промоторы, способ- 16 022991 ные узнавать полимеразы Т4, Т3, δρ6 и Т7, промоторы РК и Ръ бактериофага лямбда, промоторы 1гр. гес^ белков теплового шока, ЬасиУ5, Гас, [рр-к^рг ρΙιοΑ и промоторы 1;κΖ Ε. соН, промоторы ВасШик киЬйПк, промоторы бактериофагов ВасШик, промоторы δГ^еρГοтусек, промотор шГ бактериофага лямбда, промотор Ыа рВК322 и промотор СΑΤ гена хлорамфениколацетилтрансферазы. Прокариотические промоторы обсуждались в обзоре ОНск, 1. Ιηά. М1сгоЬю1. 1:277, 1987, УаГкоп еГ а1., Мо1еси1аг Вю1оду оГ ГНе Оепе, 4'1' Εά. (ВефатФ СиттФк 1987) и Αιΐ5ΐι^1 (1995).
Предпочтительные прокариотические хозяева включают Е. соН и ВасШик киЬГШк. Подходящие штаммы Ε. соН включают В1.21(1)12Ч ВЕ21(ОВ3)рЕу^, В1.21(1)12фр1.\к12 ΌΗ1, ΌΗ4Ι, ΌΗ5, ΌΗ5Ι, ПН5ГР, ОШГМСК, ОШ0В, ОШ0В/р3, ΌΗ118, С600, №101, ЛМ101, 1М105, 1М109, ДМ110, К38, КК1, Υ1088, Υ1089, СδΗ18, ΕΚ.1451 и ΕΚ.1647 (см., например, Вго\\п (Εά.), Мо1еси1аг Вю1оду ЬаЬГах ^сапетю Ргекк 1991)). Подходящие штаммы ВасШик киЬГШк включают ВК151, ΥΒ886, М1 119, МП20 и В170 (см., например, Ηа^άу, ВасШик С1отпд ΜеГНοάк, ίη ΩΧΑ С1отпд: Α РгасНса1 Αρρ^οасН, О1оуег ^ά.) (ШЬ Ргекк 1985).
Способы экспрессии белков в прокариотических хозяевах хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области (см., например, ХУППатк еГ а1., ^хрюкНои оГ Гогефп ргоГетк ίη Ε. соН икФд р1актф уесГогк аЫ рипйсаГюпк оГ кресШс ро1ус1опа1 апиЬоФ1ек„ ίη ΩΧΑ С1отпд 2: Вxρ^екк^οη δукГетк, 2ηά Вά^Г^οη, О1оуег еГ а1., ^ά^), раде 15 (0хГоШ ипФегкНу Ргекк 1995); ХУаФ еГ а1., ОепеНс Матри1аГюп аЫ Вxρ^екк^οη оГ ΑηГ^Ьοά^ек, ίη Мопос1опа1 ΑηГ^Ьοά^ек: Ргттр1ек аЫ Αρρ1^саГ^οηк, раде 137 (ХУНех-икк, Фс.
1995) и Оеогдюи, ^хрюкк^ оГ РгоГеШк ш ВасГепа, ш РгоГет Вηд^ηее^^ηд: Ргтар1ек агФ РгасНсе, С1е1аЫ еГ а1., ^ά^), раде 101 ОоНп УПеу аЫ δοηк, Фс, 1996)).
Бакуловирусная система обеспечивает эффективное средство введения клонированных генов ΤΟΕбета-связывающих белков в клетки насекомых. Подходящие экспрессирующие векторы основаны на вирусе множественного ядерного полиэдроза ΑиГοд^аρНе саНГогтса ^сМ№У и содержат хорошо известные промоторы, такие как промотор белка 70 теплового шока (Нкр) ОгокорНИа, промотор немедленно раннего гена вируса множественного ядерного полиэдроза ΑиГοд^аρНа саНГогтса (1е-1) и задержанный ранний промотор 39К, промотор бакуловируса рЮ и промотор металлотионеина ЭгокорННа. Подходящие клетки-хозяева насекомых включают клеточные линии, полученные из ГРЬВ-ЗГ-21, клеточную линию пупального яичника δροάορГе^а Ггид1реФа, такую как δ© (АТСС СКЬ 1711), δί21ΑΕ и δ£21 (ФуНгодеп СогрогаНоп; δаη О1едо, СΑ), а также клетки ЭгокорННа δсНηе^άе^-2. Установленные способы для получения рекомбинантных белков в бакуловирусных системах обеспечены ВаНеу еГ а1., Матри1аГюп оГ Васи1оу1гик УесГогк, т ΜеГНοάк ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1ите 7: Оепе ^апТет агФ Вxρ^екк^οη РгоГосо1к, Миггау ^ά.), Радек 147-168 (ГНе Ηитаηа Ргекк, Фс. 1991), РаГе1 еГ а1., 'ТНе ЬасШоуНик ехргеккюп кукГет, ш ΩΧΑ С1отпд 2: Вxρ^екк^οη δукГетк, 2п<1 Вά^Г^οη, О1оуег еГ а1., ^ά^), радек 205-244 (0хГоШ иПуегкНу Ргекк 1995), ΑикиЬе1 (1995), радек 16-37 - 16-57, ФсНаФкоп ^ά.), ВасШоуНик Вxρ^екк^οη РгоГосо1к ШНе ^тапа Ргекк, Фс. 1995), и Ьискпоте, (ФкесГ Се11 Вxρ^екк^οη ΤесНηο1οду, ш РгоГет Вηд^ηее^^ηд: Ргттр1ек агФ РгасНсе, С1е1агФ еГ а1., ^ά^), радек 183-218 ОоНп ХУПеу агФ δοηк, Фс. 1996).
Промоторы для экспрессии в дрожжах включают промоторы из ΟΑΕ1 (галактозы), РОК (фосфоглицераткиназы), ΑΌΗ (алкогольдегидрогеназы), АОХ1 (алкогольоксидазы), ΗΙδ4 (гистидинолдегидрогеназы) и т.п. Многие клонирующие векторы дрожжей были сконструированы и являются легко доступными. Эти векторы включают векторы на основе Υφ, такие как Υφ5, векторы ΥΚρ, такие как векторы ΥΚρ17, векторы ΥВρ, такие как ΥВρ13, и векторы ΥСρ, такие как ΥСρ19. Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что имеется большое разнообразие подходящих векторов для экспрессии в клетках дрожжей.
Экспрессирующие векторы могут также вводиться в протопласты растений, ткани интактных растений или в выделенные клетки растений. Общие способы культивирования тканей растений обеспечены, например, МПН еГ а1., Ρ^οсеάи^ек Гог ПИгсФистд Еоге1дп ΩΧΑ шГо Р1апГк, ш ΜеГНοάк ш Р1апГ Мо1еси1аг Вю1оду агФ ВюГесНпо1оду, ОНск еГ а1. φά^), радек 67-88 (СКС Ргекк, 1993).
Экспрессирующий вектор может быть введен в клетки-хозяева стандартными способами, в том числе, кальций-фосфатной трансфекцией, опосредованной липосомами трансфекцией, опосредованной микроснарядами доставкой, электропорацией и т.п. Предпочтительно трансфицированные клетки отбирают и размножают для обеспечения рекомбинантных клеток-хозяев, которые содержат этот экспрессирующий вектор, стабильно интегрированный в геном клетки-хозяина. Способы введения векторов в эукариотические клетки и способы отбора таких стабильных трансформантов с использованием доминантного селектируемого маркера описаны, например, ΑикиЬе1 (1995) и Миггау ^ά.), Оепе ^апТет агФ Εχргеккюп РгоГосо1к Щитат Ргекк 1991). Способы введения экспрессирующих векторов в бактериальные, дрожжевые клетки, клетки насекомых и клетки растений обеспечены также ΑикиЬе1 (1995).
Общие способы экспрессии и извлечения чужеродного белка, продуцируемого системой клеток млекопитающего, обеспечены, например, ВГсНеνе^^у, ^хрюкк^ оГ Вηд^ηее^еά РгоГетк ш МаттаНап Се11 СиНиге, ш РгоГет Вηд^ηее^^ηд: Ргттр1ек агФ РгасНсе, С1е1агФ еГ а1., ^ά^), радек 163 (ХУНех-икк, Фс.
1996) . Стандартные способы извлечения белка, продуцируемого бактериальной системой, обеспечены, например, ОпккНаттег еГ а1., РипПсаНоп оГ ονе^-ρ^οάисеά ргоГетк Ггот Ε. соН се11к, ш ΩΧΑ С1отпд 2: Вxρ^екк^οη δукГетк, 2п<1 Вά^Г^οη, О1оуег еГ а1., ^ά^), радек 59-62 (0хГоШ иГуегкНу Ргекк 1995). Установ- 17 022991 ленные способы выделения рекомбинантных белков из бакуловирусной системы описаны КюЬагбкои (еб.), Васи1оу1ги5 Ехргеккюи Рго!осо1к (УНе Нитапа Ргекк, 1ис. 1995).
Более часто ΤΟΡ-бета-связывающий белок может быть выделен стандартными способами, такими как аффинная хроматография, гель-фильтрационная хроматография, ионообменная хроматография, ВЖХ и т.п. Дополнительные вариации в выделении и очистке ΤΟΡ-бета-связывающего белка могут быть придуманы специалистами с квалификацией в данной области. Например, антитела против ΤΟΡ-бетасвязывающего белка, полученные как описано ниже, могут быть использованы для выделения больших количеств белка иммуноаффинной очисткой.
Получение антител к ТСГ-бета-связывающим белкам
Данное изобретение обеспечивает антитела, которые специфически связываются со склеростином, как описано здесь подробно. Антитела к ΤΟΡ-бета-связывающему белку могут быть получены, например, с использованием продукта экспрессирующего вектора в качестве антигена. Антитела, которые специфически связываются со склеростином, могут быть также получены с использованием пептидов, полученных из любой из полипептидных последовательностей склеростина, обеспеченных здесь (8Е0 ГО N0:2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 и 65). Особенно предпочтительные антитела против ΤΟΡ-бета-связывающего белка связываются специфически с ΤΟΡ-бета-связывающим белком 8Е0 ГО N0: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 и 65, но не с другими ΤΟΡ-бета-связывающими белками, такими как Паи, СегЬегик, 8ΟΟΡ или СтетЕт Антитело данного изобретения (в том числе его фрагменты и производные) может быть поликлональным или, в частности, моноклональным антителом. Это антитело может принадлежать к любому классу иммуноглобулинов и может быть, например, Ι§Ο (в том числе изотипами 1§Ο, которые для антител человека известны в данной области как 1§Οι, 1§Ο2, 1§Ο3, 1§Ο4); антитело 1дЕ; 1дМ или 1дА. Антитело может быть получено из птицы или млекопитающих, предпочтительно, например, из мышиных, крысы, человека или другого примата. Когда это желательно, это антитело может быть интернализующим антителом.
Поликлональные антитела к рекомбинантному ΤΟΡ-бета-связывающему белку могут быть получены с использованием способов, хорошо известных специалистам с квалификацией в данной области (см., например, Ο^ееи е! а1., Ргобисбои оГ Ро1ус1оиа1 Аибкега, ш 1ттииосбетюа1 Рго!осо1к (Маикои, еб.), радек 1-5 (Нитаиа Ргекк, 1992); ХУППатк е! а1., Ехргеккюи оГ £оге1ди рго!ешк ш Е. соб икшд р1акт1б уесЮгк аиб рипбсабоик оГ кресШс ро1ус1оиа1 аибЬоб1ек, ш ΏΝΑ С1ошид 2: Ехргеккюи 8ук!етк, 2иб ЕбНюи Ο1оνе^ е! а1., (ебк.), раде 15 (0х£огб иш\'егкбу Ргекк 1995). Хотя поликлональные антитела обычно индуцируются у животных, таких как крысы, мыши, кролики, козы или овцы, антитело против ΤΟΡ-бета-связывающего белка данного изобретения может быть также получено из антитела примата (не человека). Общие способы индукции диагностически и терапевтически применимых антител у павианов может быть найдены, например, в Со1беиЬегд е! а1., 1и!егиабоиа1 ра!еи! риЬбсабои №. ХУ0 91/11465 (1991) и в Ьоктаи е! а1., 1иЕ 1. Саисег 46:310, 1990.
Это антитело должно содержать по меньшей мере домен вариабельной области. Этот домен вариабельной области может быть любого размера или любого аминокислотного состава и будет обычно содержать по меньшей мере одну гипервариабельную аминокислотную последовательность, ответственную за связывание антигена, заключенную в каркасную последовательность. В общих чертах, этот домен вариабельной области (V) может быть любым подходящим расположением вариабельных доменов тяжелой (УН) и/или легкой (Уъ) цепи. Так, например, домен ν-области может быть мономерным и быть УН- и У^-доменом, где они способны независимо связывать антиген с приемлемой аффинностью. Альтернативно, домен У-области может быть димерным и содержать УН-УН, УН-УЪ или Уъ-Уъ-димеры, в которых УН- и Уь-цепи нековалентно связаны (сокращенно называется далее Ρν). Однако, если желательно, эти цепи могут быть ковалентно связаны или непосредственно, например, через дисульфидную связь между двумя вариабельными доменами, или через линкер, например, пептидный линкер, с образованием одноцепочечного домена (сокращенно называемого здесь ксЕт).
Домен вариабельной области может быть любым природно встречающимся вариабельным доменом или его сконструированной версией. Под сконструированной версией имеют в виду домен вариабельной области, который был создан с использованием способов конструирования рекомбинантных ДНК. Такие сконструированные версии включают версии, созданные, например, из вариабельных областей природного антитела посредством инсерций, делеций или замен в отношении аминокислотных последовательностей природных антител.
Конкретные примеры этого типа включают сконструированные домены вариабельной области, содержащие по меньшей мере один СОК и необязательно одну или несколько аминокислот каркасной области из одного антитела и остальную часть домена вариабельной области из второго антитела.
Этот домен вариабельной области может быть ковалентно связан при С-концевой аминокилоте с по меньшей мере одним другим доменом антитела или его фрагментом. Так, например, если присутствует Ун-домен в домене вариабельной области, он может быть связан с доменом иммуноглобулина СН1 или его фрагментом. Подобным образом, У[-домен может быть связан с Ск-доменом или его фрагментом. Таким путем, например, это антитело может быть ΡаЬ-фрагментом, где антигенсвязывающий домен содержит ассоциированные УН- и Уъ-домены, ковалентно связанные на их С-концах с Сн1 и СК-доменом, соответственно. СН1-домен может быть удлинен дополнительными аминокислотами, например, для
- 18 022991 обеспечения домена шарнирной области, как обнаруживается в РаЬ'-фрагменте, или для обеспечения дополнительных доменов, таких как домены СН2 и СН3.
Другой формой фрагмента антитела является пептид, включающий единственный определяющий комплементарность район (СГОК). СГОК-пептиды (минимальные единицы узнавания) могут быть получены конструированием генов, кодирующих СГОК представляющего интерес антитела. Такие гены получают, например, с использованием полимеразной цепной реакции для синтеза вариабельной области из РНК продуцирующих антитело клеток (см., например, Батек еГ а1., МеГЬобк: А Сотрапкоп Го МеГЬобк ίη Еηζуто1оду 2:106, 1991; СоигГепау-Ьиск, Оепебе Матри1аНоп оГ Мопос1опа1 АпНЬоб1ек, ίη Мопос1опа1 АпНЬоб1ек: РгобисНоп, Епдшеегшд апб СНтса1 АррНсаНоп, КгГГег еГ а1. (ебк.), раде 166 (СатЬпбде ИпАегкбу Ргекк 1995) и Уагб еГ а1., ОепеНс Матри1аНоп апб Ехргеккюп оГ АпНЬоб1ек, т Мопос1опа1 АпНЬоб1ек: Ргшс1р1ек апб АррНсаГюпк, ВисН еГ а1., (ебк.), раде 137 (УПеу-Пкк, 1пс. 1995)).
Антитела для применения в данном изобретении могут быть в общем моноклональными (полученными общепринятыми процедурами иммунизацией и слияния клеток) или, в случае фрагментов, полученными из них с использованием любого стандартного химического способа, такого как восстановление или ферментативное расщепление, и/или способов расщепления, например, обработкой пепсином. Более конкретно, моноклональные антитела против ТОР-бета-связывающего белка могут быть генерированы с использованием различных способов. Моноклональные антитела грызунов к специфическим антигенам могут быть получены способами, известными специалистам с квалификацией в данной области (см., например, КоЫег еГ а1., ИаГиге 256:495, 1975 и СоНдап еГ а1., (ебк.), СштепГ РгоГосо1к ш 1ттипо1оду, 1:2.5.1-2.6.7 ЦоЬп \УПеу апб 8опк 1991) [СоНдап]; Рюкк1еу еГ а1., РгобисНоп оГ топос1опа1 апНЬоб1ек адаткГ ргоГетк ехргеккеб ш Е. сой, т ΩΝΛ С1отпд 2: Ехргеккюп 8укГетк, 2пб Ебйюп, С1о\'ег еГ а1., (ебк.), раде 93 (ОхГогб ИпАегкйу Ргекк 1995)).
Вкратце, моноклональные антитела могут быть получены инъекцией мышей композицией, содержащей продукт гена ТОР-бета-связывающего белка, подтверждением присутствия продуцирования антитела взятием пробы сыворотки, удалением селезенки для получения В-лимфоцитов, слиянием этих Влимфоцитов с миеломными клетками для получения гибридом, клонированием этих гибридом, отбором положительных клонов, которые продуцируют антитела к данному антигену, культивированием клонов, которые продуцируют антитела к данному антигену и выделением этих антител из гибридомных культур.
Кроме того, антитело против ТОР-бета-связывающего белка данного изобретения может быть получено из моноклонального антитела человека. Моноклональные антитела человека получают из трансгенных мышей, которые были получены генной инженерией для получения специфических антител человека в ответ на введение антигена. В этом способе элементы локуса тяжелой и легкой цепи человека вводят в линии мышей, полученных из линий эмбриональных стволовых клеток, которые содержат нацеленные разрушения эндогенных локусов тяжелой цепи и легкой цепи. Трансгенные мыши могут синтезировать антитела человека, специфические в отношении антигенов человека, и эти мыши могут быть использованы для получения гибридом, секретирующих антитела человека. Способы получения антитела человека из трансгенных мышей описаны, например, Огееп еГ а1., №Гиге ОепеГ. 7:13, 1994; ЬопЬегд еГ а1., №Гиге 368:856, 1994 и Тау1ог еГ а1., 1пГ. 1ттип. 6:579, 1994.
Моноклональные антитела могут быть выделены и очищены из гибридомных культур различными хорошо установленными способами. Такие способы выделения включают аффинную хроматографию с использованием Белок-А-сефарозы, гель-фильтрационную хроматографию и ионообменную хроматографию (см., например, СоНдап, радек 2.7.1-2.7.12 апб радек 2.9.1-2.9.3; Ватек еГ а1., РипПсаНопк оГ 1ттиподЮЬш О (1дО), ш МеГЬобк ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 10, радек 79-104 (ТЬе Нитапа Ргекк, 1пс. 1992)).
Для конкретных применений может быть желательным получение фрагментов антитела против ТОР-бета-связывающих белков. Такие фрагменты антител могут быть получены, например, протеолитическим гидролизом антитела. Фрагменты антител могут быть получены расщеплением пепсином или папаином целых антител общепринятыми способами. В качестве иллюстрации фрагменты антител могут быть получены ферментативным расщеплением антител пепсином для обеспечения фрагмента 58, названного Р(аЬ')2. Этот фрагмент может быть дополнительно расщеплен с использованием восстанавливающего тиол агента с получением моновалентных РаЬ'-фрагментов 3,58. Необязательно, реакцию расщепления можно выполнять с использованием блокирующей группы для сульфгидрильных групп, которые возникают из расщепления дисульфидных связей. В качестве альтернативы, ферментативное расщепление с использованием пепсина производит два моновалентных РаЬ-фрагмента и Рс-фрагмент непосредственно. Эти способы описаны, например, Оо1бепЬегд, Патент США № 4331647, №копоГГ еГ а1., АгсЬ. ВюсЬет. ВюрЬук. 89:230, 1960, РогГег, Вюсет. 1. 73:119, 1959, Ебе1тап еГ а1., ш МеГЬобк ш Еηζуто1оду 1:422 (Асабетю Ргекк 1967) и СоНдап, радек 2.8.1-2.8.10 и 2.10-2.10.4.
Другие способы расщепления антител, такие как отделение тяжелых цепей для образования моновалентных фрагментов легких-тяжелых цепей, дополнительное расщепление фрагментов или другие ферментативные, химические или генетические способы, могут быть использованы, пока эти фрагменты связываются с антигеном, который узнается интактным антителом.
Альтернативно, это антитело может быть рекомбинантным или полученным генной инженерией
- 19 022991 антителом, полученным с использованием способов рекомбинантных ДНК, включающих манипулирование и повторную экспрессию ДНК, кодирующей вариабельные и/или константные области антитела. Такая ДНК известна и/или является легко доступной из библиотек ДНК, в том числе, например, фаговых библиотек антител (см. С1йз\уе11, Ό.ί. апб МсСаГГеПу, ί. НЫесН. 10 80-84 (1992)), или, если желательно, может быть синтезирована. Стандартные процедуры молекулярной биологии и/или химии могут быть использованы для секвенирования ДНК и манипуляции с ДНК, например, для введения кодонов для создания остатков цистеина, для модификации, добавления или делеции других аминокислот или доменов, если это желательно.
Один или несколько реплицируемых экспрессирующих векторов, содержащих ДНК, кодирующую вариабельную и/или константную область, могут быть получены и использованы для трансформации подходящей клеточной линии, например, непродуцирующей линии клеток миеломы, такой как мышиная линия N80, или бактериальной линии, такой как Е. сой, в которых будет происходить продуцирование этого антитела. Для получения эффективной транскрипции и трансляции ДНК-последовательность в каждом векторе должна включать подходящие регуляторные последовательности, в частности, промоторную и лидерную последовательность, функционально связанные с последовательностью вариабельного домена. Конкретные способы получения антител таким путем обычно хорошо известны и рутинно используются. Например, основные процедуры молекулярной биологии описаны МатаЬз е( а1., (Мо1еси1аг С1отп§, Со1б 8рйп§ НагЬог ЬаЬогаГогу, №\у Уогк, 1989); секвенирование ДНК может выполняться, как описано 8апдег е( а1 (Ргос. №ιΐ1. Асаб. 8с1. И8А 74: 5463, (1977)) и АтегзЬат !п1егпаНопа1 р1с зециепстд ЬапбЬоок; сайт-направленный мутагенез может проводиться в соответствии со способом Кгатег е( а1. (№с1ею Аабз Кез. 12, 9441, (1984); (Не АпдЬап Вю1есНпо1оду Ыб ЬапбЬоок; Кипке1 Ргос. №ιΚ Асаб. 8сН И8А 82:488-92 (1985); Кипке1 е( а1., МеГЬобз ш Еп/уто1. 154:367-82 (1987). Дополнительно, многочисленные публикации подробно описывают способы, подходящие для получения антител манипуляцией ДНК, создание экспрессирующих векторов и трансформацию подходящих клеток, например, как описано в обзоре МоипГшп А апб Абаи, ί К ίπ В1о1есНпо1оду апб ОепеЬс Епдшеейпд Ре\ае\уз (еб. ТотЬз, М Р, 10, СНар1ег 1, 1992, ЬЛегсерГ Апбоуег, ИК) и в !п1егпа11опа1 Ра1еп1 8реаПсаЬоп N0. \У0 91/09967.
В некоторых вариантах осуществления антитело в соответствии с данным изобретением может иметь одну или несколько эффекторных или репортерных молекул, присоединенных к нему, и данное изобретение включает в себя такие модифицированные белки. Репортерной молекулой может быть детектируемая часть или метка, такая как фермент, цитотоксичный агент или другая репортерная молекула, в том числе, краситель, радионуклид, люминесцентная группа, флуоресцентная группа или биотин или т.п. Специфические в отношении ТОР-бета-связывающего белка иммуноглобулин или его фрагмент могут быть радиоактивно помечены для диагностических или терапевтических применений. Способы радиоактивного мечения антител известны в данной области. См., например, Абатз 1998 Ы УНо 12:11-21; НШипеп 1993 Ас1а 0псо1. 32:831-9. Терапевтические применения описаны более подробно ниже и могут включать использование специфического в отношении ТОР-бета-связывающего белка антитела (или его фрагмента) вместе с другими терапевтическими агентами. Эффекторная или репортерная молекулы могут быть присоединены к этому антителу через любую доступную боковую цепь аминокислоты, концевую аминокислоту или, через углеводную функциональную группу, расположенную в этом антителе, когда она присутствует, при условии, что это присоединение или процесс присоединения не оказывает неблагоприятного влияния на связывающие свойства и применимость этой молекулы. Конкретные функциональные группы включают, например, любую свободную амино-, имино-, тиол-, гидрокси-, карбоксильную или альдегидную группу. Соединение антитела и эффекторной и/или репортерной молекулы (молекул) может быть достигнуто через такие группы и подходящую функциональную группу в этих эффекторных или репортерных молекулах. Эта связь может быть прямой или непрямой через спейсерные или мостиковые группы.
Эффекторные молекулы включают, например, противоопухолевые агенты, токсины (такие как ферментативно активные токсины бактериального (например, экзотоксин А Р. аегидшоза) или растительного происхождения и их фрагменты (например, рицин и его фрагменты; гелонин растений, бриодин из Вгуота бююа или т.п. См., например, ТЬгизЬ е( а1., 1996 Аппи. Кеу. Тттипо1. 14: 49-71; Ргапке1 е( а1., 1996 Сапсег Кез. 56:926-32); биологически активные белки, например, ферменты; нуклеиновые кислоты и их фрагменты, такие как ДНК, РНК и их фрагменты; природно встречающиеся и синтетические полимеры (например, полисахариды и полиалкиленовые полимеры, такие как поли(этиленгликоль), и их производные); радионуклиды, в частности радиоиодид; и хелатированные металлы. Подходящие репортерные группы включают хелатированные металлы, флуоресцентные соединения или соединения, которые могут быть детектированы с помощью ЯМР и ЭПР (электорнный парамагнитный резонанс) спектроскопии. Подходящими применимыми эффекторными группами являются калихаемицин и его производные (см., например, 8ои!Ь АГпсап Ра1еп1 8рес1йсаЬопз Ьоз. 85/8794, 88/8127 апб 90/2839).
Многочисленные другие токсины, в том числе, химиотерапевтические агенты, антимитотические агенты, антибиотики, индукторы апоптоза (или апоптогены, см., например, Огееп апб Кееб, 1998, 8аепсе 281:1309-1312) или т.п. известны лицам, знакомым с данной областью, и примеры, обеспеченные здесь, предназначены для иллюстрации без ограничения объема и идеи данного изобретения. Конкрет- 20 022991 ные противоопухолевые агенты включают цитотоксические и цитостатические агенты, например, алкилирующие агенты, такие как азотные аналоги горчичного газа (например, хлорамбуцил, мелфалан, мехлорэтамин, циклофосфамид или урацилиприт) и их производные, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, бусульфан или цисплатин; антиметаболиты, такие как метотрексат, фторурацил, флоксуридин, цитарабин, меркаптопурин, тиогуанин, фторуксусная кислота или фторлимонная кислота, антибиотики, такие как блеомицины (например, блеомицина сульфат), доксорубицин, даунорубицин, митомицины (например, митомицин С), актиномицины (например, дактиномицин), пликамицин, калихаемицин и его производные, или эсперамицин и его производные; митотические ингибиторы, такие как этопозид, винкристин или винбластин и их производные; алкалоиды, такие как эллиптицин; полиолы, такие как таксицинЧ или таксицин-П; гормоны, такие как андрогены (например, дромостанолон или тестолактон), прогестины (например, мегестрола ацетат или медроксипрогестерона ацетат), эстрогены (например, диметилстилбестрола дифосфат, полиэстрадиола фосфат или эстрамустина фосфат) или антиэстрогены (например, тамоксифен); антрахиноны, такие как митоксантрон, мочевины, такие как гидроксимочевина; гидразины, такие как прокарбазин; или имидазолы, такие как дакарбазин.
Хелатированные металлы включают хелаты ди- или триположительных металлов, имеющих координационное число от 2 до 8, включительно. Конкретные примеры таких металлов включают технеций (Тс), рений (Ке), кобальт (Со), медь (Си), золото (Аи), серебро (Ад), свинец (РЬ), висмут (Βί), индий Οη), галлий (Оа), иттрий (Υ), тербий (ТЬ) гадолиний (Об) и скандий (8е). Обычно этот металл предпочтительно является радионуклидом. Конкретные радионуклиды включают 99тТс, 186Ке, 188Ке, 58Со, 60Со, 67Си, 195Аи, 199Аи, Ад. 203РЬ, 206Βί, 207Βί, 1η. 67Оа, 68Оа, 88Υ, 90Υ, 160ТЬ, 153Об и 47§с
Хелатированным металлом может быть, например, один из вышеуказанных типов металла, хелатированных любым подходящим полидентатным хелатообразующим агентом, например, ациклическими или циклическими полиаминами, простыми полиэфирами (например, кроун-эфирами и их производными); полиамидами; порфиринами и карбоциклическими производными. Обычно, тип хелатообразующего агента будет зависеть от используемого металла. Однако одной особенно применимой группой хелатообразующих агентов в конъюгатах по данному изобретению являются ациклические и циклические полиамины, особенно полиаминокарбоновые кислоты, например, диэтилентриаминпентауксусная кислота и ее производные, и макроциклические амины, такие как циклические триазапроизводные и тетразапроизводные (например, описанные в Международной заявке на патент νθ 92/22583) и полиамиды, в частности дезферриоксамин и его производные.
При использовании тиоловой группы в антителе в качестве точки присоединения это может быть достигнуто посредством реакции с тиоловой реактивной группой, присутствующей в эффекторной или репортерной молекуле. Примеры таких групп включают а-галогенкарбоновую кислоту или эфир, такой как иодацетамид, имид, такой как малеимид, винилсульфон или дисульфид. Эти и другие подходящие процедуры связывания описаны в общем виде и более конкретно в Международных заявках на патент νθ 93/06231, νθ 92/22583, νθ 90/091195 апб νθ 89/01476.
Анализы для отбора молекул, которые увеличивают плотность кости
Как описано выше, данное изобретение обеспечивает способы отбора и/или выделения соединений, которые способны увеличивать плотность кости. Например, в одном аспекте данного изобретения обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула (например, кандидатный агент) увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии (а) смешивания (или контактирования) выбранной молекулы с ТОР-бета-связывающим белком и выбранным членом белков ТОР-бетасемейства, (Ь) определения, стимулирует ли выбранная молекула передачу сигнала ТОР-бета-семейством белков или ингибирует связывание ТОР-бета-связывающего белка по меньшей мере с одним членом ТОР-бета-семейства белков. В некоторых вариантах осуществления эта молекула усиливает способность ТОР-бета функционировать в качестве положительного регулятора дифференцировки мезенхимальных клеток.
В других аспектах данного изобретения обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула (кандидатный агент) увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии (а) экспонирования (контактирования, смешивания, объединения) выбранной молекулы клеткам, которые экспрессируют ТОР-бета-связывающий белок, и (Ь) определения, уменьшается ли экспрессия (или активность) ТОР-бета-связывающего белка в экспонированных клетках, или уменьшается ли активность ТОР-бета-связывающего белка, и определения из этих данных, способно ли это соединение увеличивать минеральное содержание кости. В одном варианте осуществления эти клетки выбраны из группы, состоящей из самопроизвольно перерожденной или неперерожденной кости нормального человека из костных биопсий и остеобластов теменной кости крысы. Способы детектирования уровня экспрессии ТОРбета-связывающего белка могут выполняться в большом разнообразии форматов, известных в данной области и описанных здесь. Для детектирования и количественного определения экспрессии ТОР-бетасвязывающего белка могут быть использованы иммуноанализы, например противоточный иммуноэлектрофорез (СЕЕР), радиоиммуноанализы, радиоиммунопреципитации, твердофазные иммуноферментные анализы (ЕЫ8А), иммуноблот-анализы, такие как дот-блот-анализы и Вестерн-блоты, анализы ингибирования или конкурентные анализы и сэндвич-анализы (см. патенты США с номерами 4376110 и
- 21 022991
4486530; см также АпйЬоФек: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 8ирга). Такие иммуноанализы могут использовать антитело, которое является специфическим в отношении ТОР-бета-связывающего белка, такое как описанные здесь антитела против склеростина, или могут использовать антитело, которое является специфическим в отношении репортерной молекулы, которая присоединена к ТОР-бета-связывающему белку. Уровень экспрессии полипептида может быть также определен определением количества ТОР-бетасвязывающего белка, которое связывается с лигандом ТОР-бета-связывающего белка. Например, связывание склеростина в пробе с ВМР может быть детектировано с использованием резонанса поверхностных плазмонов (§РК). Альтернативно, может быть количественно определен уровень экспрессии мРНК, кодирующей специфический ТОР-бета-связывающий белок.
Репрезентативные варианты таких анализов обеспечены ниже в примерах 5 и 6. Вкратце, член ТОРбета-суперсемейства или ТОР-бета-связывающий белок сначала связывают с твердой фазой с последующим добавлением кандидатной молекулы. Затем в этот анализ добавляют меченый член ТОР-бетасуперсемейства или ТОР-бета-связывающий белок (т.е. меченым полипептидом является лиганд для полипептида, связанного с твердой фазой), твердую фазу промывают и количество связанного или меченого члена ТОР-бета-суперсемейства или ТОР-бета-связывающего белка определяют на твердом носителе. Молекулы, которые пригодны для применения в увеличении минерального содержания кости, как описано здесь, являются молекулами, которые уменьшают связывание ТОР-бета-связывающего белка с членом или членами ТОР-бета-суперсемейства статистически значимым образом. Очевидно, что анализы, подходящие для использования в данном изобретении, не должны ограничиваться вариантами, описанными в примерах 2 и 3. В частности, многочисленные параметры могут быть изменены, например, связыванием ТОР-бета с твердой фазой или элиминацией полностью твердой фазы.
В других аспектах данного изобретения обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии (а) экспонирования (контактирования, смешивания, комбинирования) выбранной молекулы (кандидатного агента) клеткам, которые экспрессируют ТОР-бета, и (Ь) определения, изменяется ли активность ТОР-бета из указанных экспонированных клеток, и определения из этих данных, способно ли это соединение увеличивать минеральное содержание кости. Подобно описанным здесь способам, большое разнообразие способов может быть использовано для оценки изменений экспрессии ТОР-бета-связывающего белка, обусловленных выбранным тест-соединением. В одном варианте осуществления данного изобретения кандидатным агентом является антитело, которое связывается с описанным здесь ТОР-бета-связывающим белком склеростином.
В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, обеспечен способ идентификации антитела, которое модулирует путь передачи сигнала ТОР-бета, предусматривающий контактирование антитела, которое специфически связывается с полипептидом ЗОЗТ, с пептидом ЗОЗТ, в том числе, но не только, с описанными здесь пептидами, при условиях и в течение времени, достаточных для создания возможности образования комплекса антитело плюс (+) ЗОЗТ (антитело/ЗОЗТ), и затем детектирования уровня (например, определения количества) комплекса ЗОЗТ/антитело для определения присутствия антитела, которое модулирует путь передачи сигнала ТОР-бета. Этот способ может выполняться с использованием §РК или любого числа других иммуноанализов, известных в данной области и описанных здесь, в том числе, ЕЬ18А, иммуноблоттинга или т.п. Путь передачи сигнала ТОР-бета включает путь передачи сигнала, при помощи которого ВМР связывается с рецептором типа I и рецептором типа II на клетке для стимуляции или индукции пути, который модулирует минеральное содержание кости. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с ЗОЗТ, стимулирует или усиливает путь для увеличения минерального содержания кости. Такое антитело может быть идентифицировано с использованием описанных здесь способов для детектирования связывания антитела с ЗОЗТ-специфическими пептидами.
Способы данного изобретения могут быть также использованы для идентификации антител, которые нарушают, ингибируют (в том числе конкурентно ингибируют) или предотвращают связывание ВМР с полипептидом ЗОЗТ, детектированием, связывается ли антитело с пептидами ЗОЗТ, которые находятся в районах или частях районов на 8О8Т, с которыми связывается ВМР, таких как пептиды на амино-концевой стороне ЗОЗТ, и пептиды, которые включают амино-концевые аминокислотные остатки и часть внутреннего района (боскшд соге) 8О8Т (например, ЗЕО ГО ЫО:47-64, 66-73 и 92-95). Способы данного изобретения могут быть также использованы для идентификации антитела, которое нарушает, предотвращает или ингибирует образование гомодимеров ЗОЗТ Такое антитело, которое связывается специфически с ЗОЗТ, может быть идентифицировано детектированием связывания этого антитела с пептидами, которые произведены из внутренней части или карбокси-концевого района ЗОЗТ (например, ЗЕО ГО ЫО:74-91 и 96-99).
В другом варианте осуществления данного изобретения обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии (а) смешивания или контактирования выбранной молекулы (кандидатного агента) с ТОР-бета-связывающим белком и выбранным членом белков ТОР-бета-семейства, (Ь) определения, увеличивает ли выбранная
- 22 022991 молекула передачу сигнала белков ТОР-бета-семейства, или ингибирует связывание ТОР-бетасвязывающего белка с белками ТОР-бета-семейства. В некоторых вариантах осуществления эта молекула усиливает способность ТОР-бета функционировать в качестве положительного регулятора дифференцировки мезенхимальных клеток.
Подобно вышеописанным способам, большое разнообразие способов может быть использовано для оценки стимуляции ТОР-бета, обусловленной выбранным тест-соединением. Один такой репрезентативный способ обеспечен ниже в примере 6 (см. также ЭигНат е( а1., Епйо. 136:1374-1380).
В других аспектах данного изобретения обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула (кандидатный агент) увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадию определения, ингибирует ли выбранная молекула связывание ТОР-бета-связывающего белка с костью или ее аналогом. В данном контексте, должно быть понятно, что выражение кость или ее аналог относится к гидроксиапатиту или поверхности, состоящей из порошкообразной формы кости, измельченной кости или интактной кости. Подобно вышеописанным способам, большое разнообразие способов может быть использовано для оценки ингибирования локализации ТОР-бета-связывающего белка в костном матриксе. Один такой репрезентативный способ обеспечен ниже в примере 7 (см., также №со1ак е( а1., СаШГ. Тшкие Ш. 47:206-12 (1995)).
В одном варианте осуществления данного изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с полипептидом склеростина, способны конкурентно ингибировать связывание члена ТОР-бета-семейства с полипептидом склеростина. Способность антитела или фрагмента антитела разрушать или блокировать связывание члена ТОР-бета-семейства, такого как ВМР, со склеростином, может быть определена в соответствии с любым из описанных здесь способов. Антитело или его фрагмент, которые специфически связываются со склеростином, могут нарушать, блокировать или предотвращать связывание члена ТОР-бета-семейства со склеростином нарушением образования гомодимеров склеростина. Антитело, которое специфически связывается со склеростином, может быть также использовано для идентификации активности склеростина по ингибированию или нарушению связывания склеростина с ВМР Альтернативно, это антитело или его фрагмент могут быть включены в анализ на основе клеток или в модели животного, в которых склеростин имеет определенную активность, для определения, изменяет ли антитело (увеличивает или уменьшает статистически значимым образом) эту активность. Антитело или его фрагмент, которые специфически связываются со склеростином, могут быть использованы для испытания действия такого антитела в пути передачи сигнала и посредством этого модуляции (стимуляции или ингибирования) этого пути передачи сигнала. Предпочтительно, связывание антитела с 808Т приводит к стимуляции или индукции пути передачи сигнала.
Хотя описанные здесь способы могут относиться к анализу индивидуальной тест-молекулы, данное изобретение не должно ограничиваться таким образом. В частности, выбранная молекула может содержаться в смеси соединений. Таким образом, описанные способы могут дополнительно включать стадию выделения молекулы, которая ингибирует связывание ТОР-бета-связывающего белка с членом ТОРбета-семейства.
Кандидатные молекулы
Большое разнообразие молекул может быть проанализировано на их способность ингибировать связывание ТОР-бета-связывающего белка с членом ТОР-бета-семейства. Репрезентативные примеры, обсуждаемые более подробно ниже, включают органические молекулы (например, органические небольшие молекулы), белки или пептиды и молекулы нуклеиновых кислот. Хотя из приведенного ниже обсуждения должно быть очевидно, что описанные здесь кандидатные молекулы могут быть использованы в описанных здесь способах, должно быть также вполне очевидно, что такие молекулы могут быть также использованы в различных диагностических и терапевтических ситуациях.
1. Органические молекулы
Многочисленные органические небольшие молекулы могут быть проанализированы на их способность ингибировать связывание ТОР-бета-связывающего белка с членом ТОР-бета-семейства. Например, в одном варианте осуществления данного изобретения подходящие органические молекулы могут быть выбраны или из химической библиотеки, где химикалии анализируют индивидуально, или из комбинаторных химических библиотек, где множественные соединения анализируют сразу, затем подвергают деконволюции для определения и выделения наиболее активных соединений.
Репрезентативные примеры таких комбинаторных химических библиотек включают библиотеки, описанные Адгайойк е! а1., 8ук!ет апй те!Ьой оГ анЮтайсаПу депегайпд сНет1са1 сотроипйк \νίΐ1ι йекпей ргорегйек, Патент США № 5463564; Агтк!гопд, РЛУ.. 8уп!Ьек1к оГ сотЬтаЮпа1к аггаук оГ огдашс сотроипйк (НгоидН 1Не ике оГ ти1йр1е сотропеп! сотЫпа!опа1 аггау куп!Ьек1к. \У0 95/02566; Ва1<Бут, II е! а1., 8и1Гопат1<е йегАтпек апй 1Не1г ике, \У0 95/24186; Ва1<\ут, II е! а1., СотЫпаЮпа1 йШуйгоЬеп/оругап йЬгагу,^0 95/30642; Вгеппег, 8., №ν Ιίί Гог ргерагшд сотЬта!опа1 ЙЬгапек, \У0 95/16918; СЬепега, В. е! а1., Ргерагайоп оГ йЬгагу оГ гект-Ьоипй аготайс сагЬосусйс сотроипйк, \У0 95/16712; Е11тап, 1А., 8оИй рЬаке апй сотЬта1опа1 куп!Ьеык оГ Ьеп/оШа/ерте сотроипйк оп а коЬй киррой, и.8. Ра(еп! №. 5288514; Ре1йег Е. е! а1., Nоνе1 сотЫпа!ойа1 сотроипй йЬгапек, \У0 95/16209; Ьетег К. е! а1., Епсойей сотЬта!опа1 сЬетюа1 ЙЬгапек. \У0 93/20242; Ра\аа М.К. е! а1., А те!Ьой Гог ргерагшд апй ке- 23 022991
1есИпд рНатасеиНсаПу икеГи1 поп-рерНйе сотроипйк Ггот а к(гис(ига11у йКегке ишуегка1 НЬгагу, \У0 95/04277; 8иттег1оп ГЕ. апй Б.Б. ^е11ег, МогрЬоНпокиЬипй сотЬтаЮпа1 НЬгагу апй теНюй, υ.δ. Раίеηί №. 5506337; Но1тек С. Ме(Ьойк Гог (Не 8оНй РЬаке 8уп(Нек1к оГ ТЖа/оЕйитопек, Ме(а(Жа7апопек, апй БеШаШек (НегоГ, \У0 96/00148; РЖШрк, О.В. апй О.Р. \УеГ 8оПй-рНаке 8уп(Нек1к оГ Веп/НЖйа/окк, Те(. ЬеПегк 37:4887-90, 1996; КиЖапй В. е( а1., 8оНй-киррог(ей сотЬта(опа1 8уп(Нек1к оГ 8(гис(ига11у БЖегке (3-Ьас(атк, I Атег. СЬет. §ос. 111:253-4, 1996; Ьоок, О.С. е( а1., ТНе ИепНйсаНоп оГ Сус1оохудепаке-1 (пЖЬНогк Ггот 4-ТЖа/оПйтопе С.’отЫпа(опа1 ЫЬгапек, ВИогд. апй Мей. СЬет. Ьейегк 6:707-12, 1996.
2. Белки и пептиды
Большой диапазон белков и пептидов могут быть подобным образом использованы в качестве кандидатных молекул для ингибиторов связывания ТОР-бета-связывающего белка с членом ТОР-бетасемейства.
a) Комбинаторные библиотеки пептидов
Молекулы пептидов, которые являются предположительными ингибиторами связывания ТОР-бетасвязывающего белка с членом ТОР-бета-семейства, могут быть получены посредством скрининга комбинаторных библиотек пептидов. Такие библиотеки могут быть либо получены специалистом с квалификацией в данной области (см., например, Патенты США с номерами 4528266 и 4359535 и Публикации Договора о патентной кооперации с номерами \У0 92/15679, \У0 92/15677, \У0 90/07862, \У0 90/02809), либо куплены из коммерчески доступных источников (например, №\ν Епд1апй ВИ1аЬк РЬ.Б. ™РНаде БЖр1ау Рер(1йе ПЬгагу КН).
b) Антитела
Данное изобретение обеспечивает антитела, которые специфически связываются с полипептидами склеростина, и способы применения таких антител. Данное изобретение обеспечивает также полипептидные иммуногены склеростина, которые могут быть использованы для получения и анализа этих антител. Эти антитела могут быть применимы для блокирования или нарушения связывания полипептида склеростина, который является ТОР-бета-связывающим белком, с лигандом, в частности, костным морфогенетическим белком, и могут также блокировать или нарушать связывание полипептида склеростина с одним или несколькими другими лигандами.
Молекула, такая как антитело, которое ингибирует связывание ТОР-бета-связывающего белка с одним или несколькими членами ТОР-бета-семейства белков, в том числе одним или несколькими костными морфогенетическими белками (ВМР), является, как должно быть понятно, например, молекулой, которая делает возможной активацию члена ТОР-бета-семейства или ВМР или делает возможным связывание членов ТОР-бета-семейства, в том числе одного или нескольких ВМР, с их соответствующими рецепторами посредством удаления или предотвращения связывания члена ТОР-бета-семейства с ТОРбета-связывающим белком.
Данное изобретение обеспечивает также пептидные и полипептидные иммуногены, которые могут быть использованы для генерирования и/или идентификации антител или их фрагментов, которые способны ингибировать, предотвращать или нарушать связывание ТОР-бета-связывающего белка склеростина с одним или несколькими ВМР. Данное изобретение обеспечивает также пептидные и полипептидные иммуногены, которые могут быть использованы для генерирования и/или идентификации антител или их фрагментов, которые способны ингибировать, предотвращать или нарушать (например, уменьшать статистически значимым образом) образование гомодимеров склеростина. Антитела данного изобретения могут быть применимы для увеличения минерального содержания и минеральной плотности кости, с ослаблением посредством этого многочисленных состояний, которые приводят к потере минерального содержания кости, в том числе, например, заболевания, генетической предрасположенности, несчастных случаев, которые приводят к дефекту кости (например, вследствие перелома), терапевтических веществ, которые влияют на резорбцию кости или которые убивают образующие кость клетки, и обычного старения.
Полипептиды или пептиды, применимые для иммунизации и/или анализа склеростинспецифических антител, могут быть также выбраны посредством анализа первичной, вторичной и третичной структуры ТОР-бета-связывающего белка в соответствии со способами, известными специалистам с квалификацией в данной области и описанными здесь, для определения аминокислотных последовательностей, которые с большей вероятностью будут генерировать антигенный ответ в животномхозяине. См., например, Nονοίηу, Мо1. Тштипо1. 28:201-207 (1991); Вег/оГкку, §аепсе 229:923-40 (1985)). Моделирование и результаты рентгеновской кристаллографии могут быть также использованы для предсказания и/или идентификации, какие части или районы ТОР-бета-связывающего белка взаимодействуют с какими частями лиганда ТОР-бета-связывающего белка, такого как ВМР. Могут быть сконструированы и получены пептидные иммуногены ТОР-бета-связывающего белка, которые включают аминокислотные последовательности в частях или районах взаимодействия или окружают части или районы взаимодействия. Эти антитела могут быть использованы для блокирования или нарушения связывания ТОРбета-связывающего белка с тем же самым лигандом и могут также блокировать или нарушать связывание ТОР-бета-связывающего белка с одним или несколькими другими лигандами.
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, рассматриваемые данным изобретением, вклю- 24 022991 чают антитела, которые способны специфически связываться со склеростином и конкурентно ингибировать связывание ТОР-бета-полипептида, такого как ВМР, со склеростином. Например, антитела, рассматриваемые данным изобретением, конкурентно ингибируют связывание полипептида склеростина с сайтом связывания рецептора типа I ВМР на ВМР или с сайтом связывания рецептора типа II ВМР на ВМР или могут конкурентно ингибировать связывание склеростина с сайтами связывания как рецептора типа I, так и рецептора типа II на ВМР. Не желая связывать себя теорией, авторы изобретения считают, что, когда антитело против склеростина конкурентно ингибирует связывание сайтов связывания типа I и/или типа II полипептида ВМР со склеростином, блокируя таким образом антагонистическую активность склеростина, сайты связывания рецептора на ВМР являются доступными для связывания рецепторов типа I и типа II, с увеличением посредством этого минерализации кости. Связывающее взаимодействие ТОР-бета-связывающего белка, такого как склеростин и ТОР-бета-полипептид, такой как ВМР, обычно имеет место, когда эта пара лигандов образует гомодимер. Таким образом, вместо или в дополнение к использованию антитела, специфического для склеростина, для блокирования, нарушения или предотвращения связывания склеростина с ВМР посредством конкурентного ингибирования связывания склеростина с ВМР, склеростин-специфическое антитело может быть использовано для блокирования или нарушения образования гомодимера склеростина.
В качестве примера, один димер №ддш человека, который является антагонистом ВМР, который способен связываться с ВМР с высокой аффинностью (21ттегтап е! а1., кирга), выделяли в комплексе с одним димером.ВМР-7 человека и анализировали мультивалентной аномальной дифракцией (МАО) (Огорре е! а1., ШШге 420:636-42 (2002)). Как обсуждается здесь, это исследование выявило, что димер №ддш может эффективно блокировать все сайты связывания рецепторов (сайты связывания рецепторов типа I и типа II) на димере ВМР. Определение местоположения аминокислот №ддш, которые контактируют с ВМР-7, может быть использовано в моделировании взаимодействия между другими ТОР-бетасвязывающими белками, такими как склеростин (8О8Т) и ВМР, и, следовательно, это будет способствовать конструированию пептидов, которые могут быть использованы в качестве иммуногенов для генерирования антител, которые блокируют или нарушают такое взаимодействие.
В одном варианте осуществления данного изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с полипептидом 8О8Т, конкурентно ингибируют связывание полипептида 8О8Т по меньшей мере с одним или обоими из сайтов: сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (ВМР) и сайтом связывания рецептора типа II ВМР, которые расположены на ВМР. Эпитопы на 8О8Т, с которыми связываются эти антитела, могут включать или быть включены в смежные аминокислотные последовательности, которые расположены в Ν-конце полипептида 8О8Т (аминокислоты в положениях приблизительно 1-56 8Еф ГО NО.46). Эти полипептиды могут также включать последовательность короткого линкерного пептида, который соединяет этот Νконцевой район с внутренним районом, например, полипептиды, представленные в 8Еф ГО NО:92 (человека) и 8ЕО ГО NО:93 (крысы). Более короткие репрезентативные Ν-концевые пептидные последовательности 8О8Т человека (например, 8ЕО ГО NО:46) включают 8ЕО ГО NО:47-51, а репрезентативные пептидные последовательности 8О8Т крысы (например, 8Еф ГО NО:65) включают 8Еф ГО NО:57-60.
Антитела, которые специфически связываются с полипептидом 8О8Т и блокируют или конкурентно ингибируют связывание полипептида 8О8Т с ВМР, например, блокированием или ингибированием связывания аминокислот ВМР, соответствующих одному или нескольким из сайтов связывания рецепторов типа I и типа II, могут также специфически связываться с пептидами, которые включают аминокислотную последовательность, соответствующую внутреннему (коровому) району 8О8Т (аминокислоты в положениях приблизительно 57-146 8Еф ГО NО:46). Полипептиды, которые включают этот внутренний район, могут также включать дополнительные аминокислоты, простирающиеся на любом или на обоих Ν-конце и С-конце, например, для включения остатков цистеина, которые могут быть полезными для конъюгирования этого полипептида с молекулой-носителем. Репрезентативные внутренние полипептиды 8О8Т человека и крысы, например, включают аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ГО NО:94 и 8Еф ГО NО:95 соответственно. Такие антитела могут также связывать более короткие полипептидные последовательности. Репрезентативные внутренние пептидные последовательности 8О8Т человека представлены в 8ЕО ГО NО:66-69, а репрезентативные внутренние последовательности 8О8Т крысы представлены в 8Еф ГО NО:70-73.
В другом варианте осуществления антитела, которые специфически связываются с полипептидом 8О8Т, нарушают (ингибируют, предотвращают или блокируют, например, уменьшают статистически значимым образом) образование гомодимера 8О8Т. Поскольку взаимодействие между 8О8Т и ВМР может включать гомодимер 8О8Т и гомодимер ВМР, антитело, которое предотвращает или нарушает образование гомодимера 8О8Т, может посредством этого изменять минеральную плотность кости, предпочтительно увеличивать минеральную плотность кости. В одном варианте осуществления антитела, которые связываются с внутренним районом 8О8Т, предотвращают образование гомодимера. Такие антитела могут также связываться с пептидами, которые включают последовательности смежных аминокислот, соответствующие внутреннему району, например, 8Еф ГО NО:74, 75 и 98 (8О8Т человека) и 8Еф ГО NО:76 и 99 (8О8Т крысы). Антитела, которые связываются с эпитопом, расположенным на С-концевом
- 25 022991 районе полипептида 808Т (приблизительно в положениях аминокислот 147-190 8ЕО ГО N0:46 или 65), могут также нарушать образование гомодимера. Репрезентативные С-концевые полипептиды 808Т человека и крысы, например, включают аминокислотные последовательности, представленные в 8Е0 ГО N0:96 и 8Е0 ГО N0:97 соответственно. Такие антитела могут также связывать более короткие полипептидные последовательности. Репрезентативные С-концевые пептидные последовательности 808Т человека представлены в 8Е0 ГО N0: 78-81, а репрезентативные С-концевые пептидные последовательности 808Т крысы представлены в 8Е0 ГО N0: 86-88.
Описанные здесь полипептиды и пептиды 808Т, с которыми антитела могут специфически связываться, применимы в качестве иммуногенов. Эти иммуногены данного изобретения могут быть использованы для иммунизации животного для генерирования гуморального иммунного ответа, который приводит к продуцированию антител, которые специфически связываются с сайтом связывания рецептора типа I или типа II или с обоими, расположенными на ВМР, и включают пептиды, произведенные из N концевого района 808Т, или которые могут предотвращать образование гомодимера 808Т.
Такие полипептиды и пептиды 808Т, которые применимы в качестве иммуногенов, могут быть также использованы в способах скрининга проб, содержащих антитела, например, проб очищенных антител, антисывороток или супернатантов клеточных культур или любой другой биологической пробы, которая может содержать одно или несколько антител, специфических в отношении 808Т. Эти пептиды могут быть также использованы в способах идентификации и отбора из биологической пробы одной или нескольких В-клеток, которые продуцируют антитело, которое специфически связывается с 808Т (например, анализы образования бляшек и т.п.). Затем эти В-клетки используют в качестве источника, кодирующего 808Т-специфическое антитело полинуклеотида, который может быть клонирован и/или модифицирован рекомбинантными способами молекулярной биологии, известными в данной области и описанными здесь.
Биологическая проба обозначает в некоторых вариантах осуществления пробу, содержащую по меньшей мере одно антитело, специфическое в отношении полипептида 808Т, и биологическая проба может быть обеспечена получением пробы крови, образца биопсии, эксплантата ткани, культуры органа или любой другой ткани или препарата клеток из субъекта или биологического источника. Пробой может дополнительно называться препарат ткани или клеток, в котором морфологическая целостность или физическое состояние было разрушено, например, иссечением, диссоциацией, солюбилизацией, фракционированием, гомогенизацией, биохимической или химической экстракцией, измельчением в порошок, лиофилизацией, обработкой ультразвуком или любым другим способом для обработки пробы, полученной из субъекта или биологического источника. Субъектом или биологическим источником может быть человек или животное, не являющееся человеком, первичная культура клеток (например, В-клеток, иммунизированных ш νίίτο) или адаптированная к культуре клеточная линия, в том числе, но не только, генетически сконструированные клеточные линии, которые могут содержать интегрированные в хромосомы или эписомные рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот, иммортализованные или иммортализируемые клеточные линии, гибридные клеточные линии соматических клеток, дифференцированные или дифферецируемые клеточные линии, трансформированные клеточные линии и т.п.
Пептидные иммуногены 808Т могут быть также получены синтезом серии пептидов, которые, в целом, представляют полную полипептидную последовательность полипептида 808Т и каждый из которых имеет часть аминокислотной последовательности 808Т, общую с другим пептидом в этой серии. Эта перекрывающаяся часть может состоять предпочтительно по меньшей мере из четырех аминокислот и более предпочтительно из 5, 6, 7, 8, 9, или 10 аминокислот. Каждый пептид может быть использован для иммунизации животного, сыворотки собирают из этого животного и испытывают в анализе для идентификации, какое животное продуцирует антитела, которые нарушают или блокируют связывание 808Т с ТОГ-бета-белком. Затем получают антитела из таких идентифицированных иммунизированных животных в соответствии со способами, известными в данной области и описанными здесь.
Антитела, которые ингибируют связывание ТОГ-бета-связывающего белка с членом ТОГ-бетасемейства, могут быть легко получены с использованием обеспеченного здесь описания. Особенно полезными являются антитела против ТОГ-бета-связывающего белка, которые специфически связывают ТОГ-бета-связывающий белок 8Е0 ГО N0: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 или 65, но не другие ТОГ-бетасвязывающие белки, такие как Эап. СегЪегик. 8СОГ или Отетйп. В контексте данного изобретения, антитела включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, одноцепочечные, химерные, иммуноглобулины с пересаженными СЭЕ, антиидиотипические антитела и фрагменты этих антител (например, вариабельные области ГаЪ, Гй, ГаЪ' и Г(аЪ')2 или определяющие комплементарность районы). Как описано выше, предполагается, что антитела являются специфическими против ТОГ-бета-связывающего белка или против конкретного члена ТОГ-бета-семейства, если они связываются с Ка, равной или большей, чем 107 М-1, предпочтительно равной или большей, чем 108 М-1, и не связываются с другими ТОГбета-связывающими белками, или связываются с Ка, равной или меньшей, чем 106 М-1. Аффинность антитела в отношении его родственного антигена выражают обычно в виде константы диссоциации Кс, и анти-808Т-антитело специфически связывается с членом ТОГ-бета-семейства, если оно связывается с Кс, равной или меньшей, чем 10-5 М, более предпочтительно равной или меньшей, чем 10-6 М и еще бо- 26 022991 лее предпочтительно равной или меньшей, чем 10-7 М, и даже еще более предпочтительно равной или меньшей, чем 10-8 М. Кроме того, антитела данного изобретения предпочтительно блокируют, нарушают или ингибируют (например, уменьшают со статистической значимостью) связывание ТОР-бетасвязывающего белка с членом ТОР-бета-семейства. Аффинность моноклонального антитела или партнера связывания, а также ингибирование связывания могут быть легко определены специалистом с обычной квалификацией в данной области (см. 8са!сЬагб, Апп. КУ.Асаб. 8сг 51:660-672, 1949). Аффинность может быть также легко определена с использованием резонанса поверхностных плазмонов (8РК; В1Асоге, Вюкепког, Р1кса1а\уау, N1). Для резонанса поверхностных плазмонов молекулы-мишени иммобилизуют на твердой фазе и подвергают действию лигандов в подвижной фазе, идущей вместе с потоком клеток. Если связывание лиганда с иммобилизованной мишенью имеет место, локальный показатель преломления изменяется, приводя к изменению угла 8РК, которое может быть подвергнуто мониторингу в реальном времени детектированием изменений в интенсивности отраженного света. Скорости изменения сигнала 8РК могут анализироваться для получения видимых констант скорости для фаз ассоциации и диссоциации реакции связывания. Отношение этих величин дает видимую константу равновесия (аффинность) (см., например, ^о1ГГ е! а1., Сапсег Кек. 53:2560-65 (1993)).
Антитело в соответствии с данным изобретением может принадлежать к любому классу иммуноглобулинов, например, 1дО, 1дЕ, 1дМ, 1дО или 1дА, и может быть любым из различных изотипов, которые могут составлять класс (таким как 1дО1, 1дО2, 1дО3 и 1дО4 класса 1дО человека). Оно может быть получено или произведено из животного, например, домашней птицы (например, курицы) и млекопитающих, которые включают, но не ограничиваются ими, мышь, крысу, хомячка, кролика или другого грызуна, корову, лошадь, овцу, козу, верблюда, человека или другого примата. Это антитело может быть интернализующимся антителом.
Хорошо известные в данной области способы могут быть использованы для генерирования антител, поликлональных антител или моноклональных антител, которые являются специфическими в отношении ТОР-бета-связывающего белка, такого как 808Т. Антитела могут быть также получены в виде генетически сконструированных иммуноглобулинов (1д) или 1д-фрагментов, сконструированных таким образом, что они имеют желаемые свойства. Например, в качестве иллюстрации, а не для ограничения, антитела могут включать рекомбинантный 1дО, который является химерным слитым белком, имеющим по меньшей мере один домен вариабельной области (V) из первого вида млекопитающего и по меньшей мере один домен константной области из второго, отличающегося вида млекопитающего. Наиболее часто, химерное антитело имеет последовательности вариабельной области мыши и последовательности константной области человека. Такой мышь/человек-химерный иммуноглобулин может быть «гуманизирован» пересадкой определяющих комплементарность районов (СОК), происходящих из мышиного антитела, которые придают специфичность связывания в отношении антигена, в районы каркасной области (V) человека и происходящие из человека константные области. Фрагменты этих молекул могут быть генерированы протеолитическим расщеплением или, необязательно, протеолитическим расщеплением с последующим мягким восстановлением дисульфидных связей и алкилированием. Альтернативно, такие фрагменты могут быть также генерированы рекомбинантными способами генной инженерии.
Некоторые предпочтительные антитела являются антителами, которые ингибируют или блокируют активность ТОР-бета-связывающего белка в анализе ш уйго, как описано здесь. Связывающие свойства антитела в отношении ТОР-бета-связывающего белка могут быть, как правило, оценены с использованием способов иммунодетектирования, включающих, например, иммуноферментный твердофазный анализ (ЕЫ8А), иммунопреципитацию, иммуноблоттинг, противоточный иммуноэлектрофорез, радиоиммуноанализы, дот-блот-анализы, анализы ингибирования или конкуренции и т.п., которые могут легко выполняться специалистами с обычной квалификацией в данной области (см., например, Патенты США с номерами 4376110 и 4486530; Наг1о\у е! а1., АпбЬоб1ек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу, 1988)).
Иммуноген может состоять из клеток, экспрессирующих ТОР-бета-связывающий белок, очищенных или частично очищенных ТОР-бета-связывающих полипептидов или их вариантов или фрагментов (т.е. пептидов) или пептидов, полученных из ТОР-бета-связывающего белка. Такие пептиды могут быть получены протеолитическим расщеплением большего полипептида, рекомбинантными молекулярными методологиями или могут быть синтезированы химически. Например, здесь обеспечены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие ТОР-бета-связывающие белки, так что лица с квалификацией в данной области могут рутинным образом получить ТОР-бета-связывающие белки для использования в качестве иммуногенов. Пептиды могут быть химически синтезированы способами, описанными здесь и известными в данной области. Альтернативно, пептиды могут быть получены протеолитическим расщеплением ТОР-бета-связывающего белка, и индивидуальные пептиды могут быть выделены способами, известными в данной области, такими как электрофорез в полиакриламидном геле, или любым количеством из способов жидкостной хроматографии или других способов разделенияя. Пептиды, применимые в качестве иммногенов, обычно могут иметь аминокислотные последовательности по меньшей мере из 4 или 5 последовательных аминокислот из аминокислотной последовательности ТОР-бета-связывающего белка, такой как описанные здесь, и предпочтительно имеют по меньшей мере 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15,
- 27 022991
16, 18, 19 или 20 последовательных аминокислот ТОР-бета-связывающего белка. Некоторые другие предпочтительные пептидные иммуногены содержат по меньшей мере 6, но не более, чем 12, последовательных аминокислот последовательности ТОР-бета-связывающего белка, а другие предпочтительные пептидные иммуногены содержат по меньшей мере 21, но не более, чем 50, последовательных аминокислот полипептида З0ЗТ Другие предпочтительные пептидные иммуногены содержат 21-25, 26-30, 3135, 36-40, 41-50 или любое целое число аминокислот между 21 и 100, включительно, последовательных аминокислот и между 100 и 190 последовательных аминокислот последовательности ТОР-бетасвязывающего белка.
Как описано здесь, поликлональные антитела могут быть легко получены специалистом с обычной квалификацией в данной области из различных теплокровных животных, таких как лошади, коровы, различная домашняя птица, кролики, мыши, овцы, козы, павианы или крысы. Обычно, ТОР-бетасвязывающий белок или его уникальный пептид из 13-20 аминокислот или описанный здесь (предпочтительно конъюгированный с гемоцианином фиссуреллы сшиванием с глутаровым альдегидом), используют для иммунизации животного с использованием внутрибрюшинной, внутримышечной, интраокулярной, интрадермальной или подкожной инъекций, вместе с адъювантом, таким как полный или неполный адъювант Фрейнда, или системой адъювантов ΚίΠί (Сопха СогрогаПоп, Зеай1е, №А). См. также, например, Наг1о\у е! а1., кирга. Обычно после первой инъекции животные получают одну или несколько бустер-иммунизаций в соответствии с предпочтительной схемой, которая может варьироваться в соответствии, ш!ег аПа, с антигеном, адъювантом (если его вводят) и/или конкретным видом животного. Иммунный ответ может быть подвергнут мониторингу периодическим взятием крови животного и получением и анализом сывороток в иммуноанализе, таком как ЕЫЗА или диффузионный анализ Оухтерлони или т.п., для определения титра специфических антител. Особенно предпочтительные поликлональные антитела будут давать детектируемый сигнал в одном из этих анализов, таком как ЕиЗА, который предпочтительно является по меньшей мере в три раза большим, чем фон. После того как титр животного достиг плато в отношении его реактивности с белком, могут быть получены большие количества антисывороток либо еженедельными взятиями крови, либо обескровливанием животного.
Поликлональные антитела, которые связываются специфически с ТОР-бета-связывающим белком или пептидом, могут быть затем очищены из таких антисывороток, например, аффинной хроматографией с использованием белка А. Альтернативно, может выполняться аффинная хроматография, где ТОРбета-связывающий белок или пептид или антитело, специфическое в отношении константной области 1д конкретного иммунизированного вида животного иммубилизовано на подходящем твердом носителе.
Антитела для применения в данном изобретении включают моноклональные антитела, которые получают общепринятыми процедурами иммунизации и слияния клеток, описанными здесь и известными в данной области. Моноклональные антитела могут быть легко получены с использованием общепринятых способов (см., например, КоП1ег е! а1., №йиге 256:495, 1975; СоНдап е! а1., (ебк.), Сиггеп! Рго!осо1к ш 1ттипо1оду, 1:2.5.1-2.6.7 (1оПп №Пеу апб Зопк 1991) [СоНдап]; Патенты США с номерами КЕ32011, 4902614, 4543439 и 4411993, которые включены здесь в качестве ссылки; см. также Мопос1опа1 АпПЬоб1ек, НуЬпботак: А №ν Эипепкюп т Вю1одюа1 Апа1укек, Р1епит Ргекк, Кеппе!, МсКеагп апб ВесП!о1 (ебк.), 1980 и АпПЬобгек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Наг1о\у апб Ьапе (ебк.), Со1б Зрппд НагЬог ЬаЬога!огу, 1988, которые включены здесь в качестве ссылок; Рюкк1еу е! а1., РгобисПоп оГ топос1опа1 апПЬоб1ек адагпк! рго!ешк ехргеккеб ш Е. со1!, т ЭКА С1отпд 2: Ехргеккюп Зук!етк, 2пб Ебйюп О1оуег е! а1. (ебк.), раде 93 (0хГогб Итуегкйу Ргекк 1995)). Фрагменты антител могут быть получены из антител с использованием любого подходящего стандартного способа, такого как протеолитическое расщепление, или, необязательно, протеолитическим расщеплением (например, при помощи папаина или пепсина) с последующим мягким восстановлением дисульфидных связей и алкилированием. Альтернативно, такие фрагменты могут быть также созданы рекомбинантными способами генной инженерии.
Вкратце, в одном варианте осуществления животное, такое как крыса, мышь или хомячок, иммунизируют ТОР-бета-связывающим белком или частью района его последовательности, в том числе пептидами в районе, описанном здесь. Этот белок может быть смешан с адъювантом, таким как полный или неполный адъювант Фрейнда или адъювант КгЫ, для увеличения полученного иммунного ответа. Спустя одну-три недели после начальной иммунизации животное повторно иммунизируют другой бустериммунизацией и испытывают на реактивность в отношении белка с использованием описанных здесь анализов. После того как животное достигает плато в его реактивности в отношении инъецированного белка, его умещвляют и собирают органы, которые содержат большие количества В-клеток, такие как селезенка и лимфатические узлы. Суспензии клеток собранных селезенок и/или лимфатических узлов сливают с подходящими клетками миеломы, которые сенсибилизированы лекарственным средством, для создания гибридомы, которая секретирует моноклональное антитело. Подходящие гибридомные линии включают, например, N8-0, ЗР20, N8-1 (АТСС № ТВ 18) и Р3Х63 - Ад 8.653 (АТСС № СКЬ 1580).
Лимфоидные клетки (например, селезенки) и миеломные клетки могут быть объединены на несколько минут с агентом, усиливающим слияние мембран, таким как полиэтиленгликоль или неионогенный детергент, и затем посеяны при низкой плотности на селективной среде, которая поддерживает рост гибридомных клеток, но не неслитых миеломных клеток. После слияния эти клетки могут быть помеще- 28 022991 ны в культуральные чашки, содержащие подходящую среду, такую как ΚΡΜΙ 1640 или ИМЕМ (модифицированная Дульбекко среда Игла) (ЖН Вюкаепсек, Ьеиеха, Капкак), а также дополнительные ингредиенты, такие как фетальная телячья сыворотка (ФТС, т.е. из Нус1опе, Ьодап, И1аЪ или ЖН Вюкаеисек). Дополнительно, эта среда должна содержать реагент, который избирательно позволяет расти слитым клеткам селезенки и миеломы, такой как НАТ (гипоксантин, аминоптерин и тимидин) (§Цта СНет1са1 Со., 81. Ьошк, МЦкошт). Спустя приблизительно семь дней полученные слитые клетки или гибридомы могут быть подвергнуты скринингу для определения присутствия антител, которые являются реактивными с ТОР-бета-связывающим белком (в зависимости от используемого антигена) и которые блокируют, нарушают или ингибируют связывание ТОР-бета-связывающего белка с членом ТОР-бета-семейства. Гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела, которые специфически связываются со склеростином или его вариантом, являются предпочтительными.
Большое разнообразие анализов может быть использовано для определения присутствия антител, которые являются реактивными в отношении белков данного изобретения, включающих, например, противоточный иммуноэлектрофорез, радиоиммуноанализы, радиоиммунопреципитации, иммуноферментный твердофазный анализ (ЕЫ8А), дот-блот-анализы, вестерн-блоты, иммунопреципитацию, анализы ингибирования или конкуренции и сэндвич-анализы (см., например, Патенты США с номерами 4376110 и 4486530; см. также АпкЪоФек: А ЬаЬога1огу Маииа1, Наг1о\у апк Ьапе (екк.), Со1к 8ргшд НагЪог ЬаЪога1огу, 1988)). Эти гибридомы клонируют, например, клонированием с использованием лимитирующих разведений или выделением бляшек с использованием мягкого агара и повторно анализируют. Таким образом может быть выделена гибридома, продуцирующая антитела, реактивные в отношении желаемого белка.
Моноклональные антитела из гибридомных культур могут быть выделены из супернатантов гибридомных культур. Альтернативным способом получения мышиного моноклонального антитела является инъецирование этих гибридомных клеток в брюшную полость сингенной мыши, например, мыши, которая была обработана (например, праймирована пристаном) для усиления образования асцитной жидкости, содержащей моноклональное антитело. Моноклональные антитела могут быть выделены и очищены различными хорошо установленными способами. Такие способы выделения включают аффинную хроматографию с использованием Белок А-Сефарозы, гель-фильтрационную хроматографию и ионообменную хроматографию (см., например, СоЪдап на страницах 2.7.1-2.7.12 и на стр. 2.9.1-2.9.3; Вашек е1 а1., Ршгйсайоп о£ 1ттипод1оЪи1т О (1дО), ш МеШокк ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 10, радек 79-104 (ТЪе Нитапа Ргекк, 1пс. 1992)). Моноклональные антитела могут быть очищены аффинной хроматографией с использованием подходящего лиганда, выбранного на основе конкретных свойств антитела (например, изотипа тяжелой или легкой цепи, специфичности связывания и т.д.). Примеры подходящего лиганда, иммобилизованного на твердом носителе, включают белок А, белок О, антитело против константной области (легкой цепи или тяжелой цепи), антиидиотипическое антитело и ТОР-бета-связывающий белок или его фрагмент или вариант.
Кроме того, антитело против ТОР-бета-связывающего белка данного изобретения может быть моноклональным антителом человека. Моноклональные антитела человека могут быть генерированы любым числом способов, с которыми знакомы специалисты с обычной квалификацией в данной области. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, трансформацию периферических клеток крови (например, содержащих В-лимфоциты) человека вирусом Эпстейна-Барра (ЕВУ), ш уйго иммунизацию В-клеток человека, слияние клеток селезенки из иммунизированных трансгенных мышей, несущих инсертированные гены иммуноглобулина человека, выделение из фаговых библиотек У-области иммуноглобулина человека или другие процедуры, известные в данной области и основанные на раскрытии данной заявки. Например, моноклональные антитела человека могут быть получены из трансгенных мышей, которые были получены с использованием генной инженерии для продуцирования специфических антител человека в ответ на введение антигена. Способы получения антител человека из трансгенных мышей описаны, например, Огееп е1 а1., Иа1иге Оепе1. 7:13, 1994; ЬопЪегд е1 а1., Иа1иге 368:856, 1994; Тау1ог е1 а1., 1п1. 1ттип. 6:579, 1994; 8. Ра1еп1 Ио. 5,877,397; Вгиддетапп е1 а1., 1997 Сигг. Орш. Вю1есЬпо1. 8:455-58; .ТакоЪоукк е1 а1., 1995 Апп. Ν.Υ. Асак. 8сг 764:525-35. В этом способе элементы локуса тяжелой и легкой цепей человека вводят в линии мышей, полученных из линий эмбриональных стволовых клеток, которые содержат нацеленные разрывы эндогенных локусов тяжелой и легкой цепей. (См. также Вгиддетапп е1 а1., Сигг. Орш. Вю1есЪпо1. 8:455-58 (1997)). Например, трансгены иммуноглобулина человека могут быть минигенными конструкциями или транслокусами на искусственных хромосомах дрожжей, которые подвергаются специфической в отношении В-клеток реаранжировке ДНК и гипермутации в лимфоидной ткани мыши. Моноклональные антитела человека могут быть получены иммунизацией трансгенных мышей, которые затем могут продуцировать антитела человека, специфические в отношении этого антигена. Лимфоидные клетки иммунизированных трансгенных мышей могут быть использованы для получения гибридом, секретирующих антитело человека, в соответствии с описанными здесь способами. Поликлональные сыворотки, содержащие антитела человека, могут быть также получены из крови этих иммунизированных животных.
Другой способ получения моноклональных антител, специфических в отношении ТОР-бета- 29 022991 связывающего белка человека, включает иммортализацию периферических клеток крови человека трансформацией ЕВУ. См., например, Патент США № 4464456. Такая иммортализованная линия Вклеток (или линия лимфобластоидных клеток), продуцирующая моноклинальное антитело, которое специфически связывается с ТОР-бета-связывающим белком (или его вариантом или фрагментом), может быть идентифицирована обеспеченными здесь способами иммунодетектирования, например, ЕЫЗА, и затем выделена стандартными способами клонирования. Стабильность лимфобластоидной клеточной линии, продуцирующей антитело против ТОР-бета-связывающего белка, может быть улучшена слиянием этой трансформированной клеточной линии с мышиной миеломой с получением гибридной мышьчеловек клеточной линии в соответствии со способами, известными в данной области (см., например, О1а§ку е! а1., НуЬпбота 8:377-89 (1989)). Еще одним способом генерирования моноклональных антител человека является иммунизация ίη уйго. которая включает праймирование В-клеток селезенки человека антигеном с последующим слиянием праймированных В-клеток с гетерогибридным партнером слияния. См., например, Воегпег е! а1., ί. 1ттипо1. 147:86-95.
В некоторых вариантах осуществления отбирают В-клетку, которая продуцирует антитело против ЗОЗТ, и вариабельные области легкой и тяжелой цепей клонируют из этой В-клетки в соответствии со способами молекулярной биологии, известными в данной области (\УО 92/02551; патент США 5627052; ВаЬсоок е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. Зст ИЗА 93:7843-48 (1996)) и описанными здесь. Предпочтительно, Вклетки из иммунизированного животного выделяют из селезенки, лимфатического узла или пробы периферической крови с использованием отбора клетки, которая продуцирует антитело, которое специфически связывается с ЗОЗТ. В-клетки могут быть также выделены из людей, например, из пробы периферической крови. Способы детектирования отдельных В-клеток, которые продуцируют антитело с желаемой специфичностью, хорошо известны в данной области, например, способ образования бляшек, клеточный сортинг с возбуждением флуоресценции, стимуляция ίη уйго с последующим детектированием специфического антитела и т.п. Способы отбора продуцирующих специфическое антитело В-клеток включают, например, получение суспензии отдельных В-клеток в мягком агаре, который содержит ЗОЗТ или его пептидный фрагмент. Связывание специфического антитела, продуцируемого В-клеткой в ответ на антиген, приводит к образованию комплекса, который может быть видимым в виде иммунопреципитата. После отбора В-клеток, продуцирующих специфическое антитело, гены этого специфического антитела могут быть клонированы выделением и амплификацией ДНК или мРНК в соответствии со способами, известными в данной области и описанными здесь.
Для конкретных применений могут быть желательными фрагменты антител против ТОР-бетасвязывающего белка. Фрагменты антител, Р(аЬ')2, РаЬ, РаЬ', Ру, Рс, Рб, сохраняют антигенсвязывающий сайт целого антитела и, следовательно, связываются с тем же самым эпитопом. Эти антигенсвязывающие фрагменты, произведенные из антитела, могут быть получены, например, протеолитическим гидролизом этого антитела, например, расщеплением пепсином или папаином целых антител в соответствии с общепринятыми способами. В качестве иллюстрации, фрагменты антител могут быть получены ферментативным расщеплением антител пепсином с получением фрагмента 5З, названного Р(аЬ')2. Этот фрагмент может быть дополнительно расщеплен с использованием восстанавливающего тиолы агента с получением моновалентных фрагментов 3,53 РаЬ'. Необязательно, реакцию расщепления можно выполнять с использованием блокирующей группы для сульфгидрильных групп, которые присходят из расщепления дисульфидных связей. В качестве альтернативы, ферментативное расщепление с использованием папаина дает два моновалентных РаЬ-фрагмента и непосредственно Рс-фрагмент. Эти способы описаны, например, Оо1бепЬег§, патент США Ыо. 4331647, ЫйопоГГ е! а1., Агсй. Вюсет. Вюрйук. 89:230, 1960; Ройег, Вюсйет. ί. 73:119, 1959; Ебе1тап е! а1., т Ме!йоб8 ш Еп/уто1оду 1:422 (Асабетю Рге88 1 967); и Сойдап страницы 2.8.1-2.8.10 и 2.10-2.10.4. Другие способы расщепления антител, такие как отделение тяжелых цепей с образованием моновалентных фрагментов легких цепей (Рб), дополнительное расщепление фрагментов или другие ферментативные, химические или генетические способы, могут быть также использованы, пока эти фрагменты связываются с антигеном, который узнается интактным антителом.
Фрагмент антитела может быть также любым синтетическим или генетически сконструированным белком, который действует подобно антителу, т.е. связывается со специфическим антигеном с образованием комплекса. Например, фрагменты антитела включают выделенные фрагменты, состоящие из вариабельной области легкой цепи, Еу''-фрагменты, состоящие из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, рекомбинантные одноцепочечные полипептидные молекулы, в которых вариабельные области легкой и тяжелой цепей соединены пептидным линкером (ксРу-белки) и минимальные единицы узнавания, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельный район. Антитело данного изобретения предпочтительно содержит по меньшей мере один домен вариабельной области. Этот домен вариабельной области может иметь любой размер или аминокислотный состав и будет обычно содержать по меньшей мере одну гипервариабельную аминокислотную последовательность, ответственную за связывание антигена, которая является смежной или находится в рамке считывания с одной или несколькими каркасными последовательностями. В общем, домен вариабельной области (V) может быть любым подходящим расположением вариабельных доменов тяжелой (УН) и/или легкой (Уъ) цепей иммуноглобулина. Таким образом, например, домен У-области может быть мономерным и может быть
- 30 022991
УН- ИЛИ Уь-доменом, который способен независимо связывать антиген с приемлемой аффинностью. Альтернативно, домен У-области может быть димерным и содержать димеры УН-УН, УН-УЪ ИЛИ Уь-Уь. Предпочтительно димер У-области содержит по меньшей мере одну цепь УН и по меньшей мере одну цепь Уъ, которые нековалентно ассоциированы (далее называемые Ρν). Если желательно, эти цепи могут быть ковалентно связаны либо непосредственно, либо, например, через дисульфидную связь между двумя вариабельными доменами, или через линкер, например, пептидный линкер, с образованием одноцепочечной цепи Ρν (ксНх·').
Домен вариабельной области может быть любым природно встречающися вариабельным доменом или его сконструированной версией. Под сконструированной версией имеют в виду домен вариабельной области, который был создан с использованием рекомбинантных способов генной инженерии ДНК. Такие сконструированные версии включают версии, созданные, например, из вариабельной области специфического антитела посредством инсерций, делеций или изменений в аминокислотных последовательностях этого специфического антитела. Конкретные примеры включают сконструированные домены вариабельной области, содержащие по меньшей мере один СОК и необязательно одну или более аминокислот каркасной области из первого антитела и остальной домен вариабельной области из второго антитела.
Домен вариабельной области может быть ковалентно присоединен при С-концевой аминокислоте по меньшей мере к одному другому домену антитела или его фрагменту. Так, например, УН-домен, который присутствует в домене вариабельной области, может быть связан с СН1 -доменом иммуноглобулина или его фрагментом. Подобным образом Уъ-домен может быть связан с Ск-доменом или его фрагментом. Таким образом, например, это антитело может быть РаЬ-фрагментом, в котором антигенсвязывающий домен содержит ассоциированные УН- и Уъ-домены, ковалентно связанные при их С-концах с СН1- и Скдоменом, соответственно. СН1-домен может быть удлинен дополнительными аминокислотами, например, для обеспечения шарнирной области или части домена шарнирной области, как обнаружено в РаЬ'фрагменте, или для обеспечения дополнительных доменов, таких как домены СН2 и СН3.
Другой формой фрагмента антитела является пептид, содержащий единственный определяющий комплементарность район (СОК). СЭК-пептиды (минимальные узнающие единицы) могут быть получены конструированием полинуклеотидов, которые кодируют СОК представляющего интерес антитела. Такие полинуклеотиды получают, например, с использованием полимеразной цепной реакции для синтеза вариабельной области с использованием мРНК антитело-продуцирующих клеток в качестве матрицы (см., например, Ьатск е! а1., Ме!кобк: А Сотрашоп !о Ме!кобк т Еп/уто1оду 2:106, 1991; СоикепауЬиск, Оепекс Машри1акоп об Мопос1опа1 АпкЬоб1ек, т Мопос1опа1 АпкЬоб1ек: Ргобископ, Епдшееппд апб СИтса1 АррИсакопк, Кк!еге! а1. (ебк.), раде 166 (СатЬпбде Ипбегкку Ргекк 1995) и \Уагб е! а1., Оепекс Матри1акоп апб Ехргеккюп об АпкЬоб1ек, т Мопос1опа1 АпкЬоб1ек: Ргшс1р1ек апб АррИсакопк, Вкск е! а1., (ебк.), раде 137 (^Пеу-Пкк, 1пс. 1995)).
Альтернативно, антитело может быть рекомбинантным или сконструированным антителом, полученным с использованием способов рекомбинантных ДНК, включающих манипуляцию и повторную экспрессию ДНК, кодирующей вариабельные и/или константные области антитела. Такая ДНК известна и/или является легко доступной из библиотек ДНК, в том числе, например, библиотек фаг-антитело (см. СЫкюе11 апб МсСаббеку, Т1Ь!еск. 10:80-84 (1992)), или, если желательно, может быть синтезирована. Стандартные процедуры молекулярной биологии и/или химии могут быть использованы для секвенирования и манипуляции этой ДНК, например, для введения кодонов для создания остатков цистеина или для модификации, добавления или делеции других аминокислот или доменов, если это желательно.
Химерные антитела, специфические в отношении ТОР-бета-связывающего белка, которые включают гуманизированные антитела, могут быть также генерированы в соответствии с данным изобретением. Химерное антитело имеет по меньшей мере один домен константной области, полученный из первого вида млекопитающего, и по меньшей мере один домен вариабельной области, полученный из второго, отличающегося вида млекопитающего (см., например, Моткоп е! а1., Ргос. №к1. Асаб. Зсг И8А 81:685155 (1984)). В предпочтительных вариантах осуществления химерное антитело может быть сконструировано клонированием полинуклеотидной последовательности, которая кодирует по меньшей мере один домен вариабельной области, полученный из моноклонального антитела не человека, такой как вариабельная область, полученная из моноклонального антитела мыши, крысы или хомячка, в вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует по меньшей мере одну константную область человека (см., например, 8Ып е! а1., Ме!кобк Еп/уто1. 178:459-76 (1989); ^а11к е! а1., №с1ею Аабк Кек. 21:2921-29 (1993)). В качестве примера полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи мышиного моноклонального антитела, может быть встроена в вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность константной области легкой цепи каппа. В отдельном векторе полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела, может быть клонирована в рамке считывания с последовательностями, кодирующими константную область 1дО человека, например, константную область 1дО1 человека. Конкретная выбранная константная область человека может зависеть от эффекторных функций, желаемых для конкретного антитела (например, фиксация (связывание) комплемента, свя- 31 022991 зывание с конкретным Ре-рецептором и т.д.). Предпочтительно сконструированные векторы будут трансфицироваться в эукариотические клетки для стабильной экспрессии этого химерного антитела. Другим способом, известным в данной области, для генерирования химерных антител является гомологичная рекомбинация (например, патент США № 5482856).
Химерное антитело не человек/человек может быть дополнительно генетически сконструировано для создания гуманизированного антитела. Такое гуманизированное антитело может содержать множество ί',ΌΚ полученных из иммуноглобулина вида млекопитающего, не являющегося человеком, по меньшей мере одну вариабельную каркасную область человека и по меньшей мере одну константную область иммуноглобулина человека. Применимые стратегии для конструирования гуманизированных антител могут включать, например, для иллюстрации, а не для ограничения, идентификацию вариабельных каркасных областей человека, которые являются наиболее гомологичными относительно каркасных областей не человека химерного антитела. Не желая связывать себя теорией, авторы считают, что такая стратегия может увеличивать вероятность того, что это гуманизированное антитело будет сохранять специфическую связывающую аффинность в отношении ТОР-бета-связывающего белка, которая в некоторых предпочтительных вариантах осуществления может быть, по существу, такой же аффинностью в отношении ТОР-бета-связывающего белка или его варианта или фрагмента, а в некоторых вариантах осуществления может быть более высокой аффинностью в отношении ТОР-бета-связывающего белка. См., например, 1опек е! а1., 1986 №-11иге 321:522-25; ШесЬшаии е! а1., 1988 №-11игс 332:323-27. Таким образом, конструирование такого гуманизированного антитела может включать определение конформаций петель СОК и структурных детерминант вариабельных областей не человека, например, компьютерным моделированием, и затем сравнение петель и детерминант СОК с известными структурами петель и детерминантами СОК человека (См., например, Рак1ап е1 а1., 1995 РА8ЕВ 9:133-39; С1ю11йа е1 а1., 1989 ХаГите, 342:377-383). Компьютерное моделирование может быть также использовано для сравнения структурных шаблонов человека, выбранных по гомологии последовательности, с вариабельными областями не человека. См., например, Ва)ога1Н е! а1., 1995 Т1ег. 1ттипо1. 2:95-103; ЕР-0578515-А3. Если гуманизация этих СОК не человека приводит к уменьшению аффинности связывания, компьютерное моделирование может способствовать идентификации специфических аминокислотных остатков, которые могли бы быть изменены способами сайт-направленного или иного мутагенеза для частичного, полного или супра-оптимального (т.е. увеличение до уровня, большего, чем уровень негуманизированного антитела) восстановления аффинности. Специалисты с обычной квалификацией в данной области знакомы с этими способами и смогут легко понять многочисленные вариации и модификации в отношении таких стратегий конструирования.
Один подобный способ получения гуманизированного антитела называют «облицовкой». В данном контексте, термины облицованные РК и рекомбинантно облицованные РК относятся к селективной замене остатков РК, например, из У-области тяжелой или легкой цепи грызуна, остатками РК человека для обеспечения ксеногенной молекулы, содержащей антигенсвязывающий сайт, который сохраняет по существу всю структуру укладки нативного полипептида РК. Способы облицовки основаны на понимании того, что характеристики связывания лиганда антигенсвязывающего сайта определяются прежде всего структурой и относительным расположением наборов СОК тяжелой и легкой цепей на антигенсвязывающей поверхности. Оау1ек е! а1., Апп. Кеу. ВюсНет. 59:439-73, 1990. Таким образом, антигенсвязывающая специфичность может быть сохранена в гуманизированном антителе только при тщательном поддержании структур СОК, их взаимодействия друг с другом и их взаимодействия с остальными доменами вариабельной (V) области. С использованием способов облицовки РК-остатки наружной части (например, доступные для растворителя), с которыми легко сталкивается иммунная система, селективно заменяют остатками человека для обеспечения гибридной молекулы, которая содержит либо слабо иммуногенную, либо, по существу, неиммуногенную облицованную поверхность.
Способ облицовки использует доступные данные о последовательности для вариабельных областей антитела человека, собранные КаЬа! е! а1., ίη Зециепсек οί РгоГеНъ οί 1ттипо1одюа1 Шегек!:, 4'1' ек., (И.8. Оер1. οί НеаНН апк НитаЬ Зегуюек, И.8. ОоуегптеШ Ргшкпд □ГПсе, 1987), усовершенствования в отношении базы данных КаЬа! и других И.8. и иностранных баз данных (как нуклеиновых кислот, так и белков). Доступность для растворителя аминокислот У-области может быть расшифрована из известной трехмерной структуры фрагментов антител человека и мыши. Сначала РК этих вариабельных доменов представляющей интерес молекулы антитела сравнивают с соответствующими РКпоследовательностями вариабельных областей человека, полученных из вышеуказанных источников. Затем наиболее гомологичные У-области человека сравнивают остаток-за-остатком с соответствующими мышиными аминокислотами. Остатки в мышиных РК, которые отличаются от копии человека, заменяют остатками, присутствующими в соответствующей области человека, с использованием рекомбинантных способов, хорошо известных в данной области. Переключение остатка проводят только с частями, которые по меньшей мере частично являются экспонированными (доступными для растворителя), и соблюдают осторожность в замене аминокислотных остатков, которые могут иметь значимое влияние на третичную структуру доменов У-области, таких как пролин, глицин и заряженные аминокислоты.
Таким образом, полученные облицованные антигенсвязывающие сайты конструируют для сохра- 32 022991 нения СОК-остатков грызунов, остатков, по существу, примыкающих к СОК, остатков, идентифицированных как скрытые или в основном скрытые (недоступные для растворителя), остатков, которые, как считается, участвуют в нековалентных (например, электростатических или гидрофобных) контактах между доменами тяжелых и легких цепей, и остатков из консервативных структурных областей ΡΚ, которые, как считается, влияют на канонические третичные структуры петель СОК. Затем эти критерии конструирования используют для получения рекомбинантных нуклеотидных последовательностей, которые объединяют СОК как тяжелой, так и легкой цепи антигенсвязывающего сайта в ΡΚ, похожие на ΡΚ человека, которые могут быть использованы для трансфекции клеток млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител человека, которые проявляют антигенную специфичность молекулы антитела грызуна.
Дополнительным способом отбора антител, которые специфически связываются с ΤΟΡ-бетасвязывающим белком или его вариантом или фрагментом, является фаговый дисплей. См., например, ХУпЛег е! а1., 1994 Аиии. Ке\\ 1ттиио1. 12:433-55; Вийои е! а1., 1994 Αбν. 1ттиио1. 57:191-280. Комбинаторные библиотеки генов вариабельной области иммуноглобулина человека и мыши могут быть созданы в векторах-фагах, которые могут быть подвергнуты скриингу для отбора 1д-фрагментов (Гад, Ρν, кГу или их мультимеров), которые связываются специфически с ΤΟΡ-бета-связывающим белком или его вариантом или фрагментом. См., например, патент США № 5223409; ХУППат О. Нике е! а1., ^е^тНои оГ а Ьагде СотЬша!юиа1 ЫЬгагу оГ (Не 1ттииод1оЬт КереПоие ш РНаде ЬатЬба, 8аеисе 246:1275-1281, ОесетЬег 1989; см. также Ь 8ак!гу е! а1., С1отид оГ !Не 1ттиио1одюа1 КереПоие т ЕксНебсЫа сой Гог Οеиегабои оГ Моиос1оиа1 Са!а1уНс АибЬобгек: Соикбисбои оГ а Неауу СНат УапаЫе Кедюи-8ресШс с^NΑ ЫЬгагу, Ргос. №б. Асаб. 8сг И8А 86:5728-5732, Аидик! 1989; см., также МюНе11е А1Нид-Меек е! а1., Моиос1оиа1 АибЬобу Ехргеккюи ЫЬгабек: А Кар1б АНетабуе !о НуЬбботак, 8!га!ед1ек т Мо1еси1аг Вйоду 3:1-9, 1аииагу 1990; Каид е! а1., 1991 Ргос. №Ы. Асаб. 8сг И8А 88:4363-66; НоодеиЬоот е! а1., 1992 1. Мо1ес. Вю1. 227:381-388; 8сН1еЬикН е! а1., 1997 НуЬббота 16:47-52 и ссылки в них). Коммерческая система является доступной из 8!га!адеие (Ьа 1о11а, СаНГогта), которая позволяет получать антитела с использованием рекомбинантных способов. Вкратце, мРНК выделяют из популяции В-клеток и используют для создания экспрессионных библиотек кДНК тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина в векторах 1ттиио2ар(Н) и 1ттиио2ар(Ь). Затем положительные бляшки могут быть превращены в нелитическую плазмиду, которая делает возможным высокие уровни экспрессии фрагментов моноклональных антител из Е. сой. Альтернативно, библиотека, содержащая множество полинуклеотидных последовательностей, кодирующих фрагменты вариабельной области 1д, может быть встроена в геном нитчатого бактериофага, такого как М13 или его вариант, в рамке считывания с последовательностью, кодирующей белок оболочки фага. Слитым белком может быть слияние белка оболочки с доменом вариабельной области легкой цепи и/или с доменом вариабельной области тяжелой цепи. Согласно некоторым вариантам осуществления ΡаЬ-фрагменты иммуноглобулина могут быть также представлены на частице фага (см., например, Патент США № 5698426). Эти векторы могут быть подвергнуты скринингу индивидуально или коэкспрессированы с образованием ΡаЬ-фрагментов или антител (см. Нике е! а1., кирга; см. также 8ак!гу е! а1., кирга).
Подобным образом, части или фрагменты, такие как ΡаЬ- и Ρν-фрагменты, антител могут быть также сконструированы с использованием общепринятого ферментативного расщепления или способов рекомбинантных ДНК для включения вариабельных областей гена, который кодирует специфически связывающее антитело. В одном варианте осуществления эти гены, которые кодируют вариабельную область из гибридомы, продуцирующей представляющее интерес моноклональное антитело, амплифицируют с использованием нуклеотидных праймеров для вариабельной области. Эти праймеры могут быть синтезированы специалистом с обычной квалификацией в данной области или могут быть куплены из коммерчески доступных источников. 8!га!адеие (Ьа 1о11а, СаПГогша) продает праймеры для вариабельных областей иммуноглобулина мыши и человека, среди прочих, праймеры для областей УНа, УНЬ, УНс, УНб, СН1, Уь и Сь. Эти праймеры могут быть использованы для амплификации вариабельных областей тяжелой или легкой цепи, которые затем могут быть встроены в векторы, такие как 1ттиио2АР™ Н или 1ттиио2АР™ Ь (8!га!адеие) соответственно. Затем эти векторы могут быть введены в Е. сой, дрожжи или системы на основе млекопитающего для экспрессии. С использованием этих способов могут быть получены большие количества одноцепочечного белка, содержащего слияние доменов УН и Уъ (см. Виб е! а1., 8с1еисе 242:423-426, 1988). Кроме того, такие способы могут быть использованы для изменения мышиного антитела на антитело человека без изменения связывающей специфичности этого антитела.
В некоторых конкретных вариантах осуществления данного изобретения комбинаторные фаговые библиотеки могут быть также использованы для гуманизации вариабельных областей не человека. См., например, Кокок е! а1., 1996 Ь Вю1. СНет. 271:22611-18; Кас1ег е! а1., Ргос. №б. Асаб. 8ст И8А 95:891015. Фаговая библиотека может быть подвергнута скринингу для отбора представляющей интерес вариабельной области 1д с использованием способов иммунодетектирования, известных в данной области и описанных здесь, и таким образом может быть отобрана ДНК-последовательность встроенного в фаг гена иммуноглобулина с использованием стандартных способов. См. 8атЬгоок е! а1., 2001 Мо1еси1аг С1отид: А ЬаЬога!огу Маииа1, Со1б 8рбид НагЬог Ргекк. Затем выбранная 1д-кодирующая последователь- 33 022991 ность может быть клонирована в другой подходящий вектор для экспресси этого 1д-фрагмента или, необязательно, может быть клонирована в вектор, содержащий константные области 1д, для экспрессии полных цепей иммуноглобулина.
В некоторых других вариантах осуществления данное изобретение предусматривает 808Тспецифические антитела, которые являются мультимерными фрагментами антител. Применимые методологии описаны в общем, например, в Наубеп е! а1., 1997, Сигг 0рш. Iттипо1. 9:201-12; Со1ота е! а1., 1997 Вю!есЬпо1. 15:159-63). Например, мультимерные фрагменты антител могут быть получены фаговыми способами с образованием миниантител (Патент США № 5910573) или диантител (НоШдег е! а1., 1997, Сапсег Iттипо1. ЬптипоШег. 45:128-130).
В некоторых вариантах осуществления антитело, специфическое в отношении 808Т, может быть антителом, которое экспрессируется в виде внутриклеточного белка. Такие внутриклеточные антитела называют также интрателами, и они могут содержать РаЬ-фрагмент или предпочтительно содержать зсРу-фрагмент (см., например, ЬесегГ е! а1., Ргос. №и1. Асаб. 8сг И8А 98:4764-49 (2001). Каркасные области, фланкирующие СЭК-районы, могут быть модифицированы для улучшения уровней экспрессии и растворимости интратела в интрацеллюлярной стесненной среде (см., например, \Уогп е! а1., ί. Вю1. СНет. 275:2795-803 (2000). Интратело может быть направлено в конкретные клеточные местоположение или органеллу, например, конструированием вектора, который содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельные области интратела, которые могут быть функционально связаны с полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует конкретный антиген-мишень в этой клетке (см., например, Огаиз-Ройа е! а1., Мо1. Се11 Вю1. 15:1182-91 (1995); Ьепег е! а1., Еиг. ί. ВюсЬет. 267:1195205 (2000)). Интратело может быть введено в клетку различными способами, доступными для квалифицированного специалиста, в том числе с использованием вектора генотерапии или липидной смеси (например, РгоуесЬп™, изготовляемого Ьпдепех СогрогаЬоп, 8ап О|едо, СА) или в соответствии с фотохимическими способами интернализации.
Введение аминокислотных мутаций в молекулу иммуноглобулина, специфического в отношении ТОР-бета-связывающего белка, может быть полезным для увеличения специфичности или аффинности ТОР-бета-связывающего белка или изменения эффекторной функции. Иммуноглобины с более высокой аффинностью в отношении ТОР-бета-связывающего белка могут быть генерированы сайт-направленным мутагенезом конкретных остатков. Трехмерное молекулярное моделирование при помощи компьютера может быть использовано для идентификации аминокислотных остатков, которые должны быть изменены для улучшения аффинности в отношении ТОР-бета-связывающего белка. См., например, Моийаш е! а1., 1992, Вю!есНпо1. Оепе!, Епд, Кеу. 10: 1-142. Альтернативно, комбинаторные библиотеки СИК могут быть генерированы в фаге М13 и подвергнуты скринингу на фрагменты иммуноглобулина с улучшенной аффинностью. См., например, О1азег е! а1., 1992, ί. Тттипок 149:3902-3913; ВагЬаз е! а1., 1994 Ргос. №!1. Асаб. 8сг И8А 91:3809-13; Патент США № 5792456.
Эффекторные функции могут быть также изменены сайт-направленным мутагенезом. См., например, Эипсап е! а1., 1988 №йиге 332:563-64; Могдап е! а1., 1995 Ьпишпо^ду 86:319-24; ЕдШебаг/ебеНКопбп е! а1., 1997 ВюЮсНпщиез 23:830-34. Например, мутация сайта гликозилирования на Рс-части иммуноглобулина может изменять способность этого иммуноглобулина фиксировать комплемент. См., например, \УпдЫ е! а1., 1997 Тгепбз Вю!есНпо1. 15:26-32. Другие мутации в доменах константной области могут изменять способность иммуноглобулинов фиксировать комплемент или осуществлять антителозависимую клеточную цитотоксичность. См., например, Эипсап е! а1., 1988 №йиге 332:563-64; Могдап е! а1., 1995 Ьпишпо^ду 86:319-24; 8епзе1 е! а1., 1997 Мо1. ^типок 34:1019-29.
Согласно некоторым вариантам осуществления вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи не человека, человека или гуманизированные, любой из описанных здесь 1§-молекул могут быть сконструированы в виде одноцепочечных Ру (зсРу)-фрагментов (одноцепочечных антител). См., например, Вйб е! а1., 1988 8с1епсе 242:423-426; Низ!оп е! а1., 1988, Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А 85:5879-5883. Мультифункциональные зРу-слитые белки могут быть генерированы связыванием полинуклеотидной последовательности, кодирующей зсРу-полипептид, в рамке считывания по меньшей мере с одной полинуклеотидной последовательности, кодирующей любой из различных известных эффекторных белков. Эти способы известны в данной области и описаны, например, в ЕР-В1-0318554, патенте США № 5132405, патенте США № 5091513 и патенте США № 5476786. В качестве примера, эффекторные белки могут включать последовательности константной области иммуноглобулина. См., например, Но11епЬаидЬ е! а1., 1995 ί. Iттипо1. МеШобз 188:1-7. Другими примерами эффекторных белков являются ферменты. В качестве неограничивающего примера, такой фермент может обеспечивать биологическую активность для терапевтических целей (см., например, 81етегз е! а1., 1997 В|осоп)ид. СНет. 8:510-19) или могут обеспечивать детектируемую активность, такую как катализируемое пероксидазой хрена превращение любого из хорошо известных субстратов в детектируемый продукт, для диагностических целей. Другие примеры слитых зсРу-белков включают слияния 1§-токсина или иммунотоксинов, в которых зсРу-полипептид слит с токсином.
зсРу-фрагмент или любой описанный здесь фрагмент может в некоторых вариантах осуществления
- 34 022991 быть слит с пептидным или полипептидным доменом, который делает возможным детектирование специфического связывания между этим слитым белком и антигеном (например, ТОР-бета-связывающим белком). Например, домен слитого полипептида может быть полипептидом аффинной метки для детектирования связывания слитого ксРу-белка с ТОР-бета-связывающим белком любым из различных способов, которые известны специалисту с квалификацией в данной области. Примеры пептидной метки включают авидин, стрептавидин или Шк (например, полигистидин). Способы детектирования могут также включать, например, связывание слитого с авидином или стрептавидином белка с последовательностью биотина или миметика биотина (см., например, Ьио е! а1., 1998 1. Вю!есйио1. 65:225 и ссылки в этой статье), прямую ковалентную модификацию слитого белка детектируемой частью (например, метящей частью), нековалентное связывание слитого белка со специфически меченой репортерной молекулой, ферментативную модификацию детектируемого субстрата слитым белком, которая включает часть, имеющую ферментативную активность, или иммобилизацию (ковалентную или нековалентную) слитого белка на подложке из твердой фазы. Другие применимые аффинные полипептиды для конструирования слитых ксРу-белков могут включать слитые со стрептавидином белки, описанные, например, в АО 89/03422, патенты США с номерами 5489528, 5672691, АО 93/24631, патенты США 5168049, 5272254; слитые с авидином белки (см., например, ЕР 511747); фермент, такой как глутатион-З-трансфераза; и полипептид белка А З!арйу1о аигеик.
Полинуклеотиды, кодирующие антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с ТОР-бета-связывающим белком, описанным здесь, могут быть размножены и экспрессированы в соответствии с любой из различных хорошо известных процедур разрезания, лигирования, трансформации и трансфекции нуклеиновых кислот с использованием любого количества известных экспрессирующих векторов. Так, в некоторых вариантах осуществления экспрессия фрагмента антитела может быть предпочтительной в прокариотическом хозяине, таком как ЕксйейсЫа сой (см., например, Р1иск1йип е! а1., 1989 Ме!йобк Еп/уто1. 176:497-515). В некоторых других вариантах осуществления, может быть предпочтительной экспрессия антитела или его фрагмента в эукариотической клетке-хозяине, в том числе в дрожжах (например, Зассйаготусек сегеуыае. ЗсЮ/окассйаготусек ротЪе и РЮЫа ракГОпк). клетках животных (в том числе клетках млекопитающих) или клетках растений. Примеры подходящих клеток животных включают, но не ограничиваются ими, миелому (например, мышиную клеточную линию МО), клетки СОЗ, СНО или гибридомные клетки. Примеры клеток растений включают клетки табака, кукурузы, сои и риса.
После получения подходящих антител они могут быть выделены или очищены многими способами, хорошо известными специалистам с обычной квалификацией в данной области (см. АпйЪоб1ек: А ЬаЪога!огу Мапиа1, Наг1оу апб Ьапе (ебк.), Со1б Зрппд НагЪог ЬаЪогаЮгу Ргекк, 1988). Подходящие способы включают аффинные колонки с иммобилизованным пептидом или белком (в том числе, использующие антитела против константной области, присоединенные к матриксу колонки), ВЖХ или ОФ-ВЖХ, очистку на колонках с белком А или белком О или комбинацию этих способов.
с) Мутантные ТОР-бета-связывающие белки
Как описано здесь и ниже в Примерах (например, примерах 8 и 9), измененные версии ТОР-бетасвязывающего белка, которые конкурируют со способностью нативного ТОР-бета-связывающего белка блокировать активность конкретного члена ТОР-бета-семейства, должны приводить к увеличенной плотности кости. Таким образом, мутанты ТОР-бета-связывающего белка, которые связываются с членом ТОР-бета-семейства, но не ингибируют функцию этого члена ТОР-бета-семейства, удовлетворяют этим критериям. Эти мутантные версии должны эффективно конкурировать с эндогенными ингибиторными функциями ТОР-бета-связывающего белка.
б) Получение белков
Описанные здесь полипептиды включают ТОР-бета-связывающий белок склеростин и его варианты и антитела или их фрагменты, которые специфически связываются со склеростином. Полинуклеотиды, которые кодируют эти полипептиды, включают производные генов, которые являются, по существу, сходными с этими генами, и выделенные молекулы нуклеиновых кислот, и, при необходимости, белки (в том числе пептиды и полипептиды), которые кодируются этими генами и их производными. В данном контексте считается, что нуклеотидная последовательность является по существу сходной, если (а) эта нуклеотидная последовательность получена из кодирующего района вышеуказанных генов и молекул нуклеиновых кислот и включает, например, части этой последовательности или аллельные вариации обсуждаемых выше последовательностей, или альтернативно, кодирует молекулу, которая ингибирует связывание ТОР-бета-связывающего белка с членом ТОР-бета-семейства; (Ъ) эта нуклеотидная последовательность способна гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями данного изобретения при умеренной, высокой или очень высокой жесткости (см. ЗатЪгоок е! а1., Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЪогаЮгу Мапиа1, 2пб еб., Со1б Зрппд НагЪог ЬаЪогаЮгу Ргекк, ΝΥ, 1989); и/или (с) эти ДНК-последовательности являются вырожденными в результате вырожденности генетического кода относительно ДНКпоследовательностей, определенных в (а) или (Ъ). Далее, описанная здесь молекула нуклеиновой кислоты включает как комплементарные, так и некомплементарные последовательности, при условии, что эти последовательности в остальном удовлетворяют приведенным здесь критериям. В контексте данного
- 35 022991 изобретения, высокая жесткость означает стандартные условия гибридизации (например, 5Х88РЕ, 0,5% ДСН при 65°С или эквивалентные условия).
Структура белков, кодируемых молекулами нуклеиновых кислот, описанных здесь, может быть предсказана из первичных продуктов трансляции с использованием функции графика гидрофобное™, например, Р/С Оепе ог 1пГе1НдепеНск 8шГе (1пГе1НдепеНск, МоипГаш У1е\у, СаЪГогша) или в соответствии со способами, описанными КуГе апб ИооНГНе (1. Мо1. Вю1. 157:105-132, 1982).
Белки данного изобретения могут быть получены в форме кислотных или основных солей или в нейтральной форме. Кроме того, индивидуальные аминокислотные остатки могут быть модифицированы окислением или восстановлением. Кроме того, могут быть произведены различные замены, делеции или добавления в отношении аминокислотных последовательностей или последовательностей нуклеиновых кислот, общий эффект которых заключается в сохранении или дополнительном увеличении или уменьшении биологической активности мутантного белка или белка дикого типа. Кроме того, вследствие вырожденности генетического кода, например, может быть значительное варьирование в нуклеотидных последовательностях, кодирующих одну и ту же аминокислотную последовательность.
Другие производные описанных здесь белков включают конъюгаты этих белков с другими белками или полипептидами. Это может выполняться, например, синтезом слитых на Ν-конце или на С-конце белков, которые могут быть добавлены для облегчения очистки или идентификации белков (см. Патент США № 4851341, см., также Норр еГ а1., Вю/ТесЬпо1о§у 6:1204, 1988). Альтернативно, слитые белки, такие как РЬАОО/ТОР-бета-связывающий белок, могут быть сконструированы для помощи в идентификации, экспрессии и анализе этого белка.
Белки данного изобретения могут быть сконструированы с использованием большого разнообразия описанных здесь способов. Далее, могут быть введены мутации в конкретных локусах синтезом олигонуклеотидов, содержащих мутантную последовательность, фланкированную сайтами рестрикции, которые позволяет лигировать ее с фрагментами нативной последовательности. После лигирования полученная реконструированная последовательность кодирует производное, имеющее желаемую инсерцию, замену или желаемую делецию аминокислоты.
Альтернативно, могут быть использованы олигонуклеотид-направленные сайт-специфические (или сегмент-специфические) мутагенезы для обеспечения измененных гена или молекулы нуклеиновой кислоты, имеющих конкретные кодоны, измененные в соответствии с требуемыми заменой, делецией или инсерцией. Примерные способы получения таких изменений, изложенных выше, описаны \Уа1бег еГ а1., (Оепе 42:133, 1986); Ваиег еГ а1., (Оепе 37:73, 1985); Синк (ВюТесЬшдиек, 1апиагу 1985, 12-19); 8тНЬ еГ а1., (ОепеНс Епдшеегшд: Ргшшркк апб МеГЬобк, Р1епит Ргекк, 1981); и 8атЬгоок еГ а1. (кирга). Делеционные или укороченные производные белков (например, растворимая внеклеточная часть) могут быть также сконструированы с использованием сайтов подходящих рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз), рядом с желаемой делецией. После рестрикции выступы могут быть заполнены, и эта ДНК может быть повторно лигирована. Примерные способы получения изменений, изложенных выше, описаны 8атЬгоок еГ а1., Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬогаГогу Мапиа1, 2пб еб., Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаГогу Ргекк, ΝΥ, 1989).
Мутации, которые производят в молекулах нуклеиновых кислот данного изобретения, предпочтительно сохраняют рамку считывания кодирующих последовательностей. Кроме того, эти мутации предпочтительно не будут создавать комплементарных районов, которые при транскрипции могли бы гибридизоваться с образованием вторичных мРНК-структур, таких как петли или шпильки, которые могут неблагоприятно влиять на трансляцию этой мРНК. Хотя сайт мутации может быть заданным, необходимо, предварительно определить мутацию рег ке. Например, для выбора оптимальных характеристик мутантов в конкретном сайте может быть проведен случайный мутагенез в кодоне-мишени, и экспрессированные мутанты могут быть подвергнуты скринингу на увеличение или потерю или сохранение биологической активности. Альтернативно, мутации могут вводиться в конкретных локусах синтезом олигонуклеотидов, содержащих мутантную последовательность, фланкированную сайтами рестрикции, позволяющими проводить лигирование с фрагментами этой нативной последовательности. После лигирования полученная реконструированная последовательность кодирует производное, имеющее желаемые аминокислотные инсерцию, замену или делецию.
Молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белки данного изобретения, могут быть также сконструированы такими способами, как ПЦР-мутагенез, химический мутагенез (ИНиктаГег апб КНпебткГ РNА8 83:3402-3406, 1986), принудительными ошибочными включениями нуклеотидов (например, Ыао апб \У1ке Оепе 88:107-111, 1990) или использованием случайным образом мутагенизированных олигонуклеотидов (НогтГО еГ а1., Оепоте 3:112-117, 1989).
Данное изобретение обеспечивает также манипуляцию и экспрессию вышеописанных генов и молекул нуклеиновых кислот культивированием клеток-хозяев, содержащих вектор, способный экспрессировать вышеописанные гены. Такие векторы или векторные конструкции включают либо синтетические, либо полученные из кДНК молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие желаемый белок, которые функционально связаны с подходящими регуляторными элементами транскрипции или трансляции. Подходящие регуляторные элементы могут быть произведены из различных источников, в том числе бактериальных, грибных, вирусных генов, генов млекопитающих, насекомых или растений. Выбор подходящих
- 36 022991 регуляторных элементов зависит от выбранной клетки-хозяина и может быть легко выполнен лицом с обычной квалификацией в данной области. Примеры регуляторных элементов включают промотор и энхансер транскрипции или последовательность связывания РНК-полимеразы, терминатор транскрипции и последовательность связывания рибосом, в том числе сигнал инициации трансляции.
Молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют любой из вышеописанных белков, могут быть легко экспрессированы в большом разнообразии прокариотических и эукариотических клеток-хозяев, в том числе бактериальных клетках, клетках млекопитающих, дрожжевых или других грибных клетках, вирусных клетках, клетках насекомых или клетках растений. Способы трансформации или трансфекции таких клеток для экспрессии чужеродных ДНК хорошо известны в данной области (см., например, Йакига е! а1., и.8. Ра!еп! №. 4704362; Ншпеп е! а1., Ргос. №б. Асаб. 8с1. И8А 75:1929-1933, 1978; Миггау е! а1., и.8. Ра!еп! №. 4801542; Иркка11 е! а1., и.8. Ра!еп! №. 4935349; Надеп е! а1., и.8. Ра!еп! №. 4784950; Ахе1 е! а1., и.8. Ра!еп! №. 4399216; Ооеббе1 е! а1., и.8. Ра!еп! №. 4766075; и 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1отпд; А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2пб еб., Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, 1989; в отношении клеток растений см. С/ако апб Майоп, Р1ап! Ркукю1. 104:1067-1071, 1994; и Рак/ко\укк1 е! а1., Вю!еск. 24:387-392, 1992).
Бактериальные клетки-хозяева, подходящие для проведения данного изобретения, включают Е. сок, ВасШик киЬкНк, 8а1топе11а 1урЫтитшт и различные виды в родах Ркеиботопак, 8!гер!отусек и 8!арку1ососсик, а также многие другие виды бактерий, хорошо известные специалисту с обычной квалификацией в данной области и описанные здесь. Репрезентативный пример бактериальной клетки-хозяина включает Е. сок ЭН5а (8!га!адепе, Ьа Ло11а, СаПГопиа).
Бактериальные экспрессирующие векторы предпочтительно содержат промотор, который функционирует в клетке-хозяине, один или несколько селектируемых фенотипических маркеров и бактериальный сайт инициации репликации. Репрезентативные промоторы включают систему промотора рлактамазы (пенициллиназы) и лактозы (см. Скапд е! а1., №!иге 275:615, 1978), промотор РНКполимеразы Т7 (8!иб1ег е! а1., Ме!к. Еп/уто1. 185:60-89, 1990), промотор лямбда (Ε1νίη е! а1., Оепе 87:123126, 1990), промотор !гр (№ско1к апб УапоГкку, Ме!к. ίη Еп/уто1оду 101:155, 1983) и промотор !ас (Кикке1 е! а1., Оепе 20:231, 1982). Репрезентативные селектируемые маркеры включают различные маркеры устойчивости к антибиотикам, такие как гены устойчивости к канамицину или ампициллину. Многие плазмиды, подходящие для трансформации клеток-хозяев, хорошо известны в данной области, в том числе, среди других, рВК322 (см. ВоПуаг е! а1., Оепе 2:95, 1977), плазмиды рИС18, рИС19, рИС118, рИС119 (см. Меккшд, Ме!к. ίη Еηζуто1оду 101:20-77, 1983 и У1ека апб Меккшд, Оепе 19:259-268, 1982) и рЯН8А, рЯН16а, рЯН18А и рВ1иексйр! М13 (81га1адепе, Ьа боПа, СаПГопиа).
Дрожжевые и грибные клетки-хозяева, подходящие для проведения данного изобретения включают, среди прочих, 8асскаготусек ротЬе, 8асскаготусек сегеуыае, роды РюЫа или Кбиууеготусек и различные виды рода АкрегдШик (МсКтдк! е! а1., патент США № 4935349). Подходящие экспрессирующие векторы для дрожжей и грибов включают, среди прочих, ΥСρ50 (АТСС №. 37419) для дрожжей и атб8-клонирующий вектор рУ8 (ТитЬи11, Вю/Тескпо1оду 7:169, 1989), УКр7 (8!гик1 е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А 76:1035-1039, 1978), УЕр13 (Вгоаск е! а1., Оепе 8:121-133, 1979), рГОВ249 и рГОВ219 (Веддк, №!иге 275:104-108, 1978) и их производные.
Предпочтительные промоторы для применения в дрожжах включают промоторы из гликолитических генов дрожжей (НП/етап е! а1., ί. Вю1. Скеп. 255:12073-12080, 1980; А1Ьег апб Ка\уакакг ί. Мо1. Арр1. Оепе!. 1:419-434, 1982) или гены алкогольдегидрогеназы (Уоипд е! а1., ίη Оепекс Епдшеегтд оГ М1сгоогдатктк Гог Скетюа1к, Но11аепбег е! а1., (ебк.), р. 355, Р1епит, №у Уогк, 1982; Аттегег, Ме!к. Еп/уто1. 101:192-201, 1983). Примеры применимых промоторов для грибных векторов включают промоторы, произведенные из гликолитических генов АкрегдШик шби1апк, например, промотор абк3 (Мс Ктдк! е! а1., ЕМВО б. 4:2093-2099, 1985). Экспрессионная единица может также включать терминатор транскрипции. Примером подходящего терминатора является терминатор абк3 (Мс Ктдк! е! а1., кирга, 1985).
Как и в случае бактериальных векторов, дрожжевые векторы будут обычно включать селектируемый маркер, которым может быть один из любого числа генов, которые проявляют доминантный фенотип, для которого существует фенотипический анализ, позволяющий выбрать трансформанты. Предпочтительными селектируемыми маркерами являются маркеры, которые дополняют ауксотрофию клеткихозаяина, обеспечивают устойчивость к антибиотику или позволяют клетке использовать конкретные источники углерода, и включают !еи2 (Вгоаск е! а1., 1Ыб.), ига3 (Во!к!еш е! а1., Оепе 8:17, 1979) или 1ик3 (8!гик1 е! а1., 1Ыб.). Другим подходящим селектируемым маркером является ген са!, который придает устойчивость к хлорамфениколу дрожжевым клеткам.
Способы трансформации грибов хорошо известны в литературе и были описаны, например, Веддк (1Ыб.), Ншпеп е! а1., (Ргос. №б. Асаб. 8сГ И8А 75:1929-1933, 1978), Уе1!оп е! а1., (Ргос. №б. Асаб. 8сГ И8А 81:1740-1747, 1984) и Кикке1 (№!иге 301:167-169, 1983). Генотип клетки-хозяина может содержать генетический дефект, который комплементируется селектируемым маркером, присутствующим на экспрессирующем векторе. Выбор конкретного хозяина и селектируемого маркера находятся в пределах уровня обычной квалификации в данной области.
Протоколы для трансформации дрожжей также хорошо известны специалистам с обычной квали- 37 022991 фикацией в данной области. Например, трансформация может легко выполняться либо получением сферопластов дрожжей с ДНК (см. Ншпеп е( а1., РNАδ и§А 75:1929, 1978), либо обработкой щелочными солями, такими как ЫС1 (см. ИоЬ е( а1., I. Вас(епо1оду 153:163, 1983). Трансформация грибов может также проводиться с использованием полиэтиленгликоля, как описано Си11еп е( а1., (В1о/ТесНпо1оду 5:369, 1987).
Вирусные векторы включают векторы, которые содержат промотор, который управляет экспрессией выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует желаемый белок, как описано выше. Большое разнообразие промоторов могжет быть использовано в контексте данного изобретения, в том числе, например, такие промоторы, как МоМЬУ ЬТК, К8У ЬТК, Рпепй МиЬУ ЬТК, аденовирусный промотор (0Ьпо е( а1., 8аепсе 265:781-784, 1994), промотор/энхансер неомицинфосфотрансферазы, поздний промотор парвовируса (Коегшд е( а1., Ниш. Оепе ТЬегар. 5:457-463, 1994), ТК-промотор герпесвируса, промотор 8У40, энхансер/промотор гена металлотионеина На, немедленно ранний промотор цитомегаловируса и немедленно поздний промотор цитомегаловируса. В особенно предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, промотором является тканеспецифический промотор (см., например, \У0 91/02805; ЕР 415731 и \У0 90/07936. Репрезентативные примеры подходящих тканеспецифических промоторов включают специфический для нервных клеток промотор енолазы, промотор тромбоцитарного фактора роста бета, промотор костного морфогенетического белка, промотор альфа1-химерина человека, промотор синапсина I и промотор синапсина II. Кроме вышеуказанных промоторов, другие, вирус-специфическиие промоторы (например, ретровирусные промоторы (в том числе указанный выше, а также другие, например, ВИЧ-промоторы), промоторы гепатита, герпеса (например, ЕВУ) и специфические в отношении бактерий, грибов или паразитов (например, малярийные) промоторы, могут быть использованы для нацеливания на специфическую клетку или ткань при инфицировании вирусом, бактерией, грибом или паразитом.
Клетки млекопитающих, подходящие для проведения данного изобретения, включают, среди прочих, клетки С08, СНО, 8а08, остеосаркомы, К8483, МО-63, первичные остеобласты и клетки стромы костного мозга человека или млекопитающего. Экспрессирующие векторы млекопитающих для применения в проведении данного изобретения будут включать промотор, способный управлять транскрипцией клонированного гена, молекулы нуклеиновой кислоты или кДНК. Предпочтительные промоторы включают вирусные промоторы и клеточные промоторы. Специфические для кости промоторы включают промотор сиалопротеина кости и промотор для остеокальцина. Вирусные промоторы включают немедленно ранний промотор цитомегаловируса (ВокЬай е( а1., Се11 41:521-530, 1985), немедленно поздний промотор цитомегаловируса, промотор 8У40 (§иЬгатат е( а1., Мо1. Се11. Вю1. 1:854-864, 1981), ММТУ ЬТК, К8У ЬТК, промотор металлотионеина-1, Е1а адновируса. Клеточные промоторы включают промотор мышиного металлотионеина-1 (РайпПег е( а1., Патент США № 4579821), промотор УК мыши (Вегдтап е( а1., Ргос. №(1. Асай. δα. и8А 81:7041-7045, 1982; Огап( е( а1., №с1ею Аайк Кек. 15:5496, 1987) и промотор УН мыши (ЬоЬ е( а1., Се11 33:85-93, 1983). Выбор промотора будет зависеть, по меньшей мере частично, от желаемого уровня экспрессии или от трансфицируемой клеточной линии.
Такие экспрессирующие векторы могут содержать также ряд сайтов сплайсинга РНК, расположенных справа от промотора и слева от последовательности ДНК, кодирующей представляющий интерес пептид или белок. Предпочтительные сайты сплайсинга РНК могут быть получены из генов аденовируса и/или иммуноглобулина. В этих экспрессирующих векторах содержится также сигнал полиаденилирования, расположенный справа от представляющей интерес кодирующей последовательности. Подходящие сигналы полиаденилирования включают ранние или поздние сигналы полиаденилирования из 8У40 (КаиГтап апй 8Ьагр, ΐΗΐά.), сигнал полиаденилирования из района Е1В аденовируса 5 и терминатор гена гормона роста человека (Бе№(о е( а1., №с1ею Аайк Кек. 9:3719-3730, 1981). Экспрессирующие векторы могут включать некодирующую вирусную лидерную последовательность, такую как состоящий из трех частей лидер аденовируса 2, расположенный между промотором и сайтами сплайсинга РНК. Предпочтительные векторы могут также включать энхансерные последовательности, такие как энхансер 8У40. Экспрессирующие векторы могут также включать последовательности, кодирующие РНК аденовируса УА. Подходящие экспрессирующие векторы могут быть получены из коммерческих источников (например, 8(га(адепе, Ьа 1о11а, СайГогта).
Векторные конструкции, содержащие клонированные ДНК-последовательности, могут быть введены в культивируемые клетки млекопитающего, например, опосредованной фосфатом кальция трансфекцией (^1д1ег е( а1., Се11 14:725, 1978); Согкаго апй Реагкоп, 8отаПс Се11 Оепейск 7:603, 1981; ОгаНат апй Уап йег ЕЬ, УНо1оду 52:456, 1973), электропорацией (№шпапп е( а1., ЕМВ0 I. 1:841-845, 1982) или опосредованной ДЭАЭ-декстраном трансфекцией (АикиЬе1 е( а1., (ейк.), Сиггеп( Рго(осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, ИЬп \УПеу апй 8опк, Нгс., 1987). Для идентификации клеток, которые были стабильно трансфицированы вектором или в которые была интегрирована клонированная ДНК, селектируемый маркер обычно вводят в эти клетки вместе с представляющими интерес геном или кДНК. Предпочтительные селектируемые маркеры для применения в культивируемых клетках млекопитающих, включают гены, которые придают устойчивость к лекарственным средствам, таким как неомицин, гигромицин и метотрексат. Селектируемым маркером может быть амплифицируемый селектируемый маркер. Пред- 38 022991 почтительными амплифицируемыми селектируемыми маркерами являются ген ОНРК и ген устойчивости к неомицину. Селектируемые маркеры обсуждаются в обзоре ТЫ11у (Маттайап Се11 ТесЬпо1о§у, Ви!!егообЬ РиЬНкЬегк, 8!опе1ат, Маккас1ике!!к, который включен здесь в качестве ссылки).
Клеткам млекопитающих, содержащим подходящий вектор, дают расти в течение некоторого периода времени, обычно 1-2 дней, до начала экспрессии представляющей интерес ДНКпоследовательности. Затем отбор с использованием лекарственного средства используют для отбора на рост клеток, которые стабильно экспрессируют селектируемый маркер. Для клеток, которые были трансфицированы амплифицируемым, селектируемым маркером, концентрация лекарственного средства может быть увеличена ступенчатым образом для отбора на увеличенную копийность клонированных последовательностей, с увеличением посредством этого уровней экспрессии. Клетки, экспрессирующие введенные последовательности, отбирают и подвергают скринингу на продуцирование представляющего интерес белка в желаемой форме или при желаемом уровне. Затем, клетки, которые удовлетворяют этим критериям, клонируют и используют для увеличения масштаба для продуцирования.
Протоколы для трансфекции клеток млекопитающих хорошо известны специалистам с обычной квалификацией в данной области. Репрезентативные способы включают опосредованную фосфатом кальция трансфекцию, электропорацию, липофекцию, опосредованную ретровирусом, аденовирусом и слиянием протопластов трансфекцию (см. 8атЬгоок е! а1., кирга). Голые векторные конструкции могут также поглощаться мышечными клетками или другими подходящими клетками после инъекции в мышцу млекопитающего (или других животных).
Способы использования клеток-хозяев насекомых и клеток-хозяев растений для получения полипептидов известны в данной области и описаны здесь. Многочисленные клетки-хозяева насекомых могут быть также применимы в данном изобретении. Например, применение бакуловирусов в качестве векторов для экспрессии гетерологичных ДНК-последовательностей в клетках насекомых обсуждались в обзоре АШпкоп е! а1. (Рекбс. 8с£ 28:215-224, 1990). Многочисленные векторы и клетки-хозяева растений, известные в данной области, могут быть также использованы в данном изобретении, например, использование АдгоЬас!егшт г1й/одепек в качестве векторов для экспрессии генов и молекул нуклеиновых кислот в клетках растений (см. обзор 8шкаг е! а1., I. Вюксг (Вапда1оге 11:47-58, 1987).
В родственных аспектах данного изобретения белки данного изобретения могут экспрессироваться в трансгенном животном, зародышевые клетки и соматические клетки которого содержат ген, который кодирует желаемый белок и который функционально связан с промотором, эффективным для экспрессии этого гена. Альтернативно, подобным образом могут быть получены трансгенные животные, которые лишены желаемого гена (например, мыши с «нокаутом» гена). Такие трансгенные животные могут быть получены в различных животных, не являющихся людьми, в том числе мышах, крысах, кроликах, овцах, собаках, козах и свиньях (см. Наттег е! а1., №!иге 315:680-683, 1985, Ра1т!ег е! а1., 8с1епсе 222:809-814, 1983, Вгшк!ег е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8с£ И8А 82:4438-4442, 1985, Ра1тйег апб Вппк1ег, Се11 41:343-345, 1985, и Патенты США с номерами 5175383, 5087571, 4736866, 5387742, 5347075, 5221778 и 5175384). Вкратце, экспрессирующий вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты, подлежащую экспрессии, вместе с подходящим образом расположенными регуляторными последовательностями экспрессии, вводят в пронуклеусы оплодотворенных яиц, например, микроинъекцией. Интеграцию инъецированной ДНК детектируют блот-анализом ДНК из проб ткани. Предпочтительно, чтобы введенная ДНК была включена в зародышевую линию животного таким образом, что она передается потомству этого животного. Тканспецифическая экспрессия может достигаться посредством использования тканеспецифического промотора или посредством использования индуцируемого промотора, такого как промотор гена металлотионеина (Ра1т1!ег е! а1., 1983, кирга), который делает возможной регулируемую экспрессию этого трансгена.
Белки могут быть выделены среди других способов культивированием подходящих систем хозяина и вектора для продуцирования рекомбинантных продуктов трансляции, как описано здесь. Супернатанты из таких клеточных линий или белковые включения или целые клетки, из которых этот белок не секретируется в супернатант, могут быть затем обработаны различными процедурами очистки для выделения желаемого белка. Например, супернатант может быть сначала сконцентрирован с использованием коммерчески доступных фильтров для концентрирования белков, таких как ультрафильтрационное устройство Апчсоп или МПйроге РеШсоп. После концентрирования конъюгат может быть нанесен на подходящий матрикс для очистки, такой как, например, антитело против этого белка (например, антитело, которое специфически связывается с полипептидом, который должен быть выделен), связанное с подходящим носителем. Альтернативно, для очистки этого белка могут быть использованы анионо- или катионообменные смолы.
В качестве следующей альтернативы, одна или несколько стадий обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЖХ) могут быть использованы для дополнительной очистки этого белка. Другие способы выделения белков данного изобретения хорошо известны в данной области.
Чистота выделенного полипептида может быть определена способами, известными в данной области и описанными здесь, такими как гель-электрофорез и хроматографические способы. Предпочтитель- 39 022991 но, такие выделенные полипептиды являются по меньшей мере на приблизительно 90% чистыми, более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 95% чистыми и наиболее предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 99% чистыми. В некоторых специфических вариантах осуществления, белок считается выделенным, в контексте данного изобретения, если никакой другой нежелаемый белок не детектируется согласно анализу электрофорезом в ДСН-ПААГ, с последующим окрашиванием Кумасси синим. В других вариантах осуществления желаемый белок может быть выделен таким образом, что нежелаемый другой белок не детектируется согласно анализу электрофорезом в ДСН-ПААГ после окрашивания серебром.
3. Молекулы нуклеиновых кислот
В других аспектах данного изобретения обеспечены молекулы нуклеиновых кислот, которые способны ингибировать связывание ТОГ-бета-связывающего белка с членом ТОГ-бета-семейства. Например, в одном варианте осуществления обеспечены антисмысловые олигонуклеотидные молекулы, которые специфически ингибируют экспрессию последовательностей нуклеиновых кислот ТОГ-бетасвязывающего белка (см., в общем, НиаккДта еД а1., Дп Мо1еси1аг ВДо1оду οί РИА: №ν Регкресйтек (М. Шоиуе апй В.8. Оийоск, ейк., 1987 АсайетДс Ргекк, 8ап ЭДедо, р. 401); 01Ддопис1еоДДйе8: АпДДкепке ДпНДЪДЮгк оД Оепе ЕхртеккДоп (Д.8. Сокеп, ей., 1989 МасМШап Ргекк, Ьопйоп); 8ДеДп апй Скепд, 8сДепсе 261:1004-1012, 1993; ν0 95/10607; патент США № 5359051; ν0 92/06693 и ЕР-А2-612844). Вкратце, такие молекулы конструируют таким образом, что они являются комплементарными району транскрибируемой мРНКпоследовательности ТОГ-бета-связывающего белка или способны образовывать пары оснований Уотсона-Крика с этим районом. Полученная двухцепочечная нуклеиновая кислота подавляет последующий процессинг мРНК, предотвращая тем самым синтез белка (см. пример 10).
В других аспектах данного изобретения обеспечены рибозимы, которые способны ингибировать связывание ТОГ-бета-связывающего белка с членом ТОГ-бета-семейства. В данном контексте рибозимы включают РНК-молекулы, которые содержат антисмысловые последовательности для специфического узнавания и расщепляющую РНК ферментативную активность. Каталитическая цепь расщепляет специфический сайт в РНК-мишени при более высокой концентрации, чем стехиометрическая концентрация. Большое разнообразие рибозимов может быть использовано в контексте данного изобретения, в том числе, например, молотоголовый рибозим (например, описанный ГогкДег апй 8утопк, Се11 48:211220, 1987; Наке1оДД апй Оег1аск, ^Дите 328:596-600, 1988; ^а1ЪоД апй ВтиепДпд, №1Диге 334:196, 1987; Наке1оДД апй Оег1аск, NаДи^е 334:585, 1988); шпилечный рибозим (например, описанный Наке1оДД еД а1., Патент США № 5254678, выданный 19 октября 1993 г., и Нетре1 еД а1., Европейский патент № 360257, опубликованный 26 марта 1990 г.) и рибозимы на основе рибосомной РНК ТеДгакутепа (см. Сеск еД а1., Патент США № 4987071). Рибозимы данного изобретения обычно состоят из РНК, но могут также состоять из ДНК, аналогов нуклеиновых кислот (например, фосфоротиоатов) или их химер (например, ДНК/РНК/РНК).
4. Метки
Продукт гена или любые описанные выше и ниже кандидатные молекулы могут быть помечены различными соединениями, в том числе, например, флуоресцентными молекулами, токсинами и радионуклидами. Репрезентативные примеры флуоресцентных молекул включают флуоресцеин, белки РкусоЪДИ, такие как фикоэритрин, родамин, Техасский красный и люцифераза. Репрезентативные примеры токсинов включают рицин, абрин, дифтерийный токсин, холерный токсин, гелонин, антивирусный белок фитолакки американской, тритин, токсин 8кДде11а и экзотоксин А Ркеийотопак. Рерпезентативные примеры радионуклидов включают Си-64, Оа-67, Оа-68, Ζτ-89, Ки-97, Тс-99т, Кк-105, Рй-109, 1п-111, 1123, 1-125, 1-131, Ке-186, Ке-188, Аи-198, Аи-199, РЪ-203, АД-211, РЪ-212 и ВД-212. Кроме того, описанные выше антитела могут быть также помечены или конъюгированы с одним партнером пары связывания лиганда. Репрезентативные примеры включают авидин-биотин, стрептавидин-биотин и рибофлавинрибофлавинсвязывающий белок.
Способы конъюгирования или мечения описанных здесь молекул репрезентативными метками, указанными выше, могут быть легко выполнены специалистом с обычной квалификацией в данной области (см. ТтДскоДкесепе АпДДЪойу СоищдаДе, патент США № 4744081; АпДДЪойу СопщдаДе, патент США № 5106951; ГДиотодепДс МаДетДаЛ апй ЬаЪекпд ТескпДциек, Патент США № 4018884; МеДа1 КайДопискйе ЬаЪе1ей РтоДеДпк Дог ОДадпДкДк апй Ткегару, патент США № 4897255; и МеДа1 КайДопискйе СкеДаДДпд Сотроипйк Дог Нпргоуей СкеДаДДоп Каменск, патент США № 4988496; см., также Iηтаη, МеДкойк 1п Еп/уто1оду, Уо1. 34, АДДДпДДу ТескпДциек, Еп/уте РигДДсаДДоп: РагД В, ДакоЪу апй ^Пскек (ейк.), АсайетДс Ргекк, №ν Уогк, р. 30, 1974; см. также ^Пскек апй Вауег, Тке А\Дйт-В1ойп Сотр1ех Дп Вюапа1уДДса1 АррксаДДопк, Апа1. Вюскет. 171:1-32, 1988).
Фармацевтические композиции
Как отмечалось выше, данное изобретение обеспечивает также различные фармацевтические композиции, содержащие одну из вышеуказанных молекул, которая ингибирует связывание ТОГ-бетасвязывающего белка с членом ТОГ-бета-семейства, вместе с фармацевтически или физиологически приемлемыми носителем, эксципиентами или разбавителями. Обычно такие носители должны быть нетоксичными в отношении реципиентов при используемых дозах и концентрациях. Обычно получение таких
- 40 022991 композиций влечет за собой объединение терапевтического агента с буферами, антиоксидантами, такими как аскорбиновая кислота, низкомолекулярными (менее, чем 10 остатков) полипептидами, белками, аминокислотами, углеводами, в том числе, глюкозой, мальтозой, сахарозой или декстринами, хелатообразующими агентами, такими как ЭДТА, глутатионом и другими стабилизаторами и эксципиентами. Примером подходящих растворителей являются нейтральный забуференный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с неспецифическим сывороточным альбумином.
Фармацевтические композиции данного изобретения могут быть приготовлены для введения различными способами введения. Обычно тип носителя выбирают на основе способа введения. Фармацевтические композиции могут быть приготовлены для любого подходящего способа введения, в том числе, например, местного, перорального, назального, внутриоболочечного, ректального, вагинального, сублингвального или парентерального введения, в том числе, подкожной, внутривенной, внутримышечной, внутригрудинной, внутриполостной, внутриканальной или интрауретральной инъекцией или инфузией. Фармацевтическая композиция (например, пероральное введение или доставка инъекцией) может быть в форме жидкости (например, элексира, сиропа, раствора, эмульсии или суспензии). Жидкая фармацевтическая композиция может включать, например, один или более из следующих компонентов: стерильные разбавители, такие как вода для инъекций, солевой раствор, предпочтительно физиологический солевой раствор, раствор Рингера, изотонический хлорид натрия, нелетучие масла, которые могут служить в качестве растворителя или суспендирующей среды, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие растворители; антибактериальные агенты; антиоксиданты, хелатообразующие агенты; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для доведения тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Парентеральный препарат может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или многодозовые флаконы, изготовленные из стекла или пластика. Предпочтительным является применение физиологического солевого раствора, и инъецируемая фармацевтическая композиция является предпочтительно стерильной.
Описанные здесь композиции могут быть приготовлены для пролонгированного высвобождения (т.е. композиция, такая как капсула или тампон, которые выполняют медленное высвобождение соединения после введения). Такие композиции могут быть обычно приготовлены с использованием хорошо известной технологии и введены, например, перорально, ректально или имплантацией под кожу или имплантацией в желаемом месте-мишени. Формы пролонгированного высвобождения могут содержать агент, диспергированный в матриксе-носителе и/или содержащийся в резервуаре, окруженном регулирующей скорость высвобождения мембраной. Носители для применения с такими композициями являются биосовместимыми и могут быть также биодеградируемыми; предпочтительно эта композиция обеспечивает относительно постоянный уровень высвобождения активного компонента. Количество активного соединения, содержащегося в композиции пролонгированного высвобождения, зависит от места трансплантации, скорости и ожидаемой продолжительности высвобождения и характера состояния, подлежащего лечению или предотвращению. Иллюстративные носители, применимые в этой связи, включают микрочастицы поли(сополимпера лактида и гликолида), полиакрилата, латекса, крахмала, целлюлозы, декстрана и т.п. Другие иллюстративные носители задержанного высвобождения включают супрамолекулярные биовекторы, которые содержат нежидкую гидрофильную внутреннюю часть (например, сшитый полисахарид или олигосахарид) и, необязательно, наружный слой, содержащий амфифильное соединение, такое как фосфолипид (см., например, патент США № 5151254 и Заявки РСТ \0 94/20078, \0 94/23701 и \0 96/06638).
В другом иллюстративном варианте осуществления используют биодеградируемые микросферы (например, полилактат-полигликолат) в качестве носителей для композиций этого изобретения. Подходящие биодеградируемые микросферы описаны, например, в патентах США с номерами 4897268; 5075109; 5928647; 5811128; 5820883; 5853763; 5814344; 5407609 и 5942252. Системы носителя из модифицированного корового белка вируса гепатита В, такие как описанные в заявке \0 99/40934 и процитированных в ней ссылках, также будут применимы для многих приложений. Другая иллюстративная система носителя/доставки использует носитель, содержащий состоящие из частиц белковые комплексы, такие как описанные в патенте США № 5928647, которые способны индуцировать в хозяине ответы в виде цитотоксических Т-лимфоцитов, рестриктированных по классу I.
В другом иллюстративном варианте осуществления используют коровые (внутренние) частицы фосфата кальция в качестве носителей или в качестве матриксов регулируемого высвобождения для композиций данного изобретения. Примеры частиц из фосфата кальция описаны, например, в опубликованной заявке на патент \0 00/46147.
Для фармацевтических композиций, содержащих полинуклеотид, кодирующий антитело против 808Т и/или модулирующий агент (такой как полипептид, и/или модулирующий агент, генерируемые ш кйи), этот полинуклеотид может присутствовать в любой из различных систем доставки, известных специалистам с обычной квалификацией в данной области, в том числе, в нуклеиновой кислоте и бактериальных, вирусных системах экспрессии и системе экспрессии млекопитающего. Способы включения ДНК в такие системы экспрессии хорошо известны специалистам с обычной квалификацией в данной области. Эта ДНК может быть голой, как описано, например, в И1тег е! а1., 8с1епсе 259:1745-1749, 1993
- 41 022991 и обсуждается в обзоре СоПеп, Зсу1епсе 259:1691-1692, 1993. Поглощение голой ДНК может быть увеличено нанесением в виде покрытия этой ДНК на биодеградируемые гранулы, которые эффективно транспортируются в эти клетки.
Развитие подходящих схем введения доз и лечения для использования конкретных композиций, описанных здесь, в различных схемах лечения, включающих, например, пероральное, парентеральное, внутривенное, интраназальное и внутримышечное введение и соответствующую композицию, хорошо известно в данной области, некоторые из них вкратце обсуждаются ниже для целей иллюстрации.
В некоторых применениях описанные здесь фармацевтические композиции могут доставляться посредством перорального введения животному. В этом случае, эти композиции могут быть приготовлены с инертным разбавителем или с ассимилируемым годным в пищу носителем, или они могут быть заключены в твердую или мягкую желатиновую капсулу, или они могут быть спрессованы в таблетки, или они могут быть включены непосредственно в пищевой продукт рациона.
В некоторых обстоятельствах будет желательной доставка фармацевтических композиций, описанных здесь, парентерально, внутривенно, внутримышечно или даже внутрибрюшинно. Такие подходы хорошо известны квалифицированному работнику, некоторые из которых дополнительно обсуждаются, например, в патентах США с номерами 5543158; 5641515 и 5399363. В некоторых вариантах осуществления могут быть приготовлены растворы активных соединений в виде свободного основания или фармацевтически приемлемых солей в воде, подходящим образом смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Могут быть также приготовлены дисперсии в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях или в маслах. При обычных условиях хранения и использования эти препараты обычно будут содержать консервант для предотвращения роста микроорганизмов.
Иллюстративные фармацевтические формы, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для незапланированного приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий (например, см. Патент США № 5466468). Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть текучей до такой степени, чтобы она могла легко вводиться с использованием шприца. Она должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения и должна быть предохранена против загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси и/или растительные масла. Должная текучесть может поддерживаться, например, посредством применения покрытия, такого как лецитин, поддержанием требуемого размера частиц в случае дисперсии и/или использованием поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может облегчаться различными антибактериальными и противогрибковыми агентами, например, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбиновой кислотой, тимерозалом и т.п. Во многих случаях будет предпочтительно включать изотонические агенты, например сахара или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть получена применением в композициях агентов, задерживающих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.
В одном варианте осуществления для парентерального введения в водном растворе этот раствор должен быть подходящим образом забуферен, если это необходимо, и жидкий растворитель сначала должен быть сделан изотоническим с использованием достаточного количества солевого раствора или глюкозы. Эти конкретные водные растворы являются особенно подходящими для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. В этой связи стерильная водная среда, которая может быть использована, будет известна специалистам с квалификацией в данной области в свете данного описания. Например, одна доза может быть растворена в 1 мл изотонического раствора ЫаС1 и либо добавлена к 1000 мл жидкости для введения в подкожную клетчатку, либо введена в предлагаемом месте инфузии (см., например, Кетт§!оп'8 РЬагтасеийса1 Заепсек, 15* еб., рр. 1035-1038 апб 1570-1580). Некоторое варьирование дозы будет, необязательно, иметь место в зависимости от состояния проходящего лечение субъекта. Кроме того, для введения человеку, препараты должны, конечно, удовлетворять стандартам стерильности, пирогенности и общей безопасности и чистоты, требуемым службой биологических стандартов Управления по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (ГЭЛ).
В другом варианте осуществления данного изобретения описанные здесь композиции могут быть приготовлены в нейтральной форме или в форме соли. Иллюстративные фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли (образованные со свободными аминогруппами белка), которые образованы с неорганическими кислотами, такими как, например, хлористо-водородная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная кислоты и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, могут быть также получены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п. После приготовления растворы должны вводиться способом, совместимым с данной дозовой формой, и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным.
Носители могут дополнительно содержать любой из перечисленных и все перечисленные раствори- 42 022991 тели, дисперсионные среды, носители, покрытия, разбавители, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты, буферы, растворы носителей, суспензии, коллоиды и т.п. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. За исключением случаев, когда какие-либо общепринятые среда или агент являются несовместимыми с активным ингредиентом, рассматривается их применение в терапевтических композициях. В эти композиции могут быть также включены дополнительные активные ингредиенты. Выражение фармацевтически приемлемые относится к молекулярным частицам и композициям, которые не производят аллергической или сходной вредной реакции при введении человеку.
В некоторых вариантах осуществления липосомы, нанокапсулы, микрочастицы, липидные частицы, пузырьки (везикулы) и т.п. используют для введения композиций данного изобретения в подходящие клетки/организмы-хозяева. В частности, композиции данного изобретения могут быть приготовлены для доставки инкапсулированными либо в липидной частице, липосоме, везикуле, наносфере, либо наночастице или т.п. Альтернативно, композиции данного изобретения могут быть связаны, ковалентно или нековалентно, с поверхностью таких носителей.
Образование и применение липосомы и липосома-подобных препаратов в качестве потенциальных носителей лекарственных средств обычно известно специалистам с квалификацией в данной области (см., например, Ьакк, Тгепбк В1о!есЬпо1. 16(7):307-21, 1998; Такакига, №рроп КшкЬо 56(3):691-95, 1998; СЬапбгап е! а1., 1пб1ап I. Ехр. Вю1. 35(8):801-09, 1997; МагдаШ, СгП. Кеу. ТЬег. Игид Сатег Зук!. 12(23):233-61, 1995; патент США № 5567434; патент США № 5552157; патент США № 5565213; патент США № 5738868 и патент США № 5795587, каждый из которых включен здесь в качестве ссылки в его полном виде).
Липосомы успешно использовали с рядом типов клеток, которые обычно трудно трансфицировать другими процедурами, в том числе с суспензиями Т-клеток, культурами первичных гепатоцитов и клетками РС 12 (Кеппегкеп е! а1., I. Вю1. СЬет. 265(27): 16337-42, 1990; Ми11ег е! а1., ЭХА Се11 Вю1. 9(3): 22129, 1990). Кроме того, липосомы свободны от ограничений длины ДНК, которые являются типичными для систем доставки на основе вирусов. Липосомы использовали эффективно для введения генов, различных лекарственных средств, радиотерапевтических агентов, ферментов, вирусов, факторов транскрипции, аллостерических эффекторов и т.п. в различные культивируемые клеточные линии и в различных животных. Кроме того, применение липосом, по-видимому, не связано с аутоиммунными реакциями или неприемлемой токсичностью после системной доставки.
В некоторых вариантах осуществления липосомы образуют из фосфолипидов, которые диспергированы в водной среде и самопроизвольно образуют мультиламеллярные концентрические бислойные везикулы (также называемые мультиламеллярными везикулами (МЬУ).
Альтернативно, в других вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает такие фармацевтически приемлемые формы композиций данного изобретения, как нанокапсулы. Нанокапсулы могут обычно захватывать соединения стабильным и воспроизводимым образом (см., например, ОшШапагОиеггего е! а1., Игид Эеу. 1пб. РЬагт. 24(12):1113-28, 1998). Во избежание побочных эффектов вследствие избыточной внутриклеточной нагрузки полимерами, могут быть сконструированы ультратонкие частицы (с размерами около 0,1 мкм) с использованием полимеров, способных деградироваться ш У1уо. Такие частицы могут быть приготовлены, как описано, например, Соиугеиг е! а1., СгП. Кеу. ТЬег. Игид Сатег Зук!. 5(1):1-20, 1988; /иг МиЬ1еп е! а1., Еиг. I. РЬагт. ВтрЬагт. 45(2):149-55, 1998; 2атЬаих е! а1., I. Соп1го11еб Ке1еаке 50(1-3):31-40, 1998 и патенте США № 5145684.
Кроме того, фармацевтические композиции данного изобретения могут быть помещены в контейнеры вместе с упаковочным материалом, который обеспечивает инструкции в отношении применения таких фармацевтических композиций. Обычно такие инструкции будут включать реальное выражение, описывающее концентрацию реагентов, а также в некоторых вариантах осуществления, относительные количества ингредиентов эксципиента или разбавителей (например, воды, солевого раствора или ФСБ), которые могут быть необходимыми для воссоздания этой фармацевтической композиции.
Способы лечения
Данное изобретение обеспечивает также способы увеличения минерального содержания и минеральной плотности кости. Вкратце, многочисленные состояния приводят к потере минерального содержания кости, в том числе, например, болезнь, генетическое предрасположение, несчастные случаи, которые приводят к прекращению использования кости (например, вследствие перелома), терапевтические средства, которые влияют на резорбцию кости или которые убивают костеобразующие клетки, и нормальное старение. Посредством использования описанных здесь молекул, которые ингибируют связывание ТОР-бета-связывающего белка с членом ТОР-бета-семейства, такие состояния могут лечиться или предотвращаться. В данном контексте, должно быть понятно, что минеральное содержание кости считается увеличившимся, если минеральное содержание кости увеличилось статистически значимым образом (например, более, чем на половину стандартного отклонения) в выбранном участке.
Большое разнообразие состояний, которые приводят к потере минерального содержания кости, может лечиться описанными здесь молекулами. Пациенты с такими состояниями могут быть идентифицированы посредством клинического диагноза с использованием хорошо известных способов (см., напри- 43 022991 мер, Наткоп'к Ргшс1р1ек о£ 1п!егпа1 Мебюте, МсОгау-НШ, 1пс.). Репрезентативные примеры заболеваний, которые могут лечиться, включают дисплазии, в которых имеется атипичный рост или развитие кости. Репрезентативные примеры таких состояний включают ахондроплазию, ключично-черепной дизостоз, энхондроматоз, фиброзную дисплазию, болезнь Гоше, гипофосфатемический рахит, синдром Марфана, множественные костно-хрящевые экзостозы, нейрофиброматоз, несовершенный остеогенез, остеопетроз, остеопойкилоз, склеротические повреждения, переломы, периодонтальное заболевание, псевдоартроз и пиогенный остеомиелит.
Другие состояния, которые могут лечиться или предотвращаться, включают большое разнообразие причин остеопении (т.е. состояния, которое вызывает более чем одно стандартное отклонение минерального содержания кости или плотности ниже максимума минерального содержания скелета в молодости). Репрезентативные примеры таких состояний включают анемические состояния, состояния, обусловленные стероидами, состояния, обусловленные гепарином, нарушения костного мозга, цингу, недостаточность питания, недостаточность кальция, идиопатический остеопороз, врожденную остеопению или остеопороз, алкоголизм, хроническую болезнь печени, старость, постклимактерическое состояние, олигоменорею, аменорею, беременность, сахарный диабет, гипертиреоз, болезнь Кушинга, акромегалию, гипогонадизм, иммобилизацию или неиспользование, синдром рефлекторно-симпатической дистрофии, транзиторный регионарный остеопороз и остеомаляцию.
В одном аспекте данного изобретения минеральное содержание или плотность кости может увеличиваться введением теплокровному животному терапевтически эффективного количества молекулы, которая ингибирует связывание ТОР-бета-связывающего белка с членом ТОР-бета-семейства. Примеры теплокровных животных, которые могут лечиться, включают как позвоночных, так и млекопитающих, в том числе, например, людей, лошадей, коров, свиней, овец, собак, кошек, крыс и мышей. Репрезентативные примеры терапевтических молекул включают рибозимы, гены рибозимов, антисмысловые олигонуклеотиды и антитела (например, гуманизированные антитела или любое другое описанное здесь антитело).
В других аспектах данного изобретения обеспечены способы увеличения плотности кости, предусматривающие стадии введения в клетки, которые направляются домой - в кость, вектора, который управляет экспрессией молекулы, ингибирующей связывание ТОР-бета-связывающего белка с членом ТОР-бета-семейства, и введения векторсодержащих клеток теплокровному животному. Вкратце, клетки, которые направляются домой - в кость, могут быть получены непосредственно из кости пациентов (например, клетки из костного мозга, такие как СЭ34+, остеобласты, остеоциты и т.п.) из периферической крови или из культур.
Вектор, который управляет экспрессией молекулы, которая ингибирует связывание ТОР-бетасвязывающего белка с членом ТОР-бета-семейства, может быть введен в клетки. Репрезентативные примеры подходящих векторов включают вирусные векторы, такие как герпесвирусные векторы (например, Патент США № 5288641), аденовирусные векторы (например, АО 94/26914, АО 93/9191; Ко11к е! а1., РЦАЗ 91(1):215-219, 1994; Какк-Е1к1ег е! а1., Р^З 90(24):11498-502, 1993; Сш/тап е! а1., С1гси1айоп 88(6):2838-48, 1993; Сш/тап е! а1., Сй. Кек. 73(6): 1202-1207, 1993; 2аЪпег е! а1., Се11 75(2):207-216, 1993; Ы е! а1., Нит Оепе Тйег. 4(4):403-409, 1993; СаШаиб е! а1., Еиг. 1. №игоксг 5(10:1287-1291, 1993; Утсеп! е! а1., N3!. Оепе!. 5(2): 130-134, 1993; .1а11е е! а1., N3!. Оепе!. 1(5):372-378, 1992; и Ьеугего е! а1., Оепе 101 (2): 195-202, 1991), аденоассоциированные вирусные векторы (АО 95/13365; Р1о!!е е! а1., РNАЗ 90(22):10613-10617, 1993), бакуловирусные векторы, парвовирусные векторы (Коеппд е! а1., Нит. Оепе Тйегар. 5:457-463, 1994), поксвирусные векторы (РатсаИ апб Рао1е!!и, РNАЗ 79:4927-4931, 1982 и О/а1б е! а1., Вюсйет. Вюрйук. Кек. Сотт. 193(2):653-660, 1993) и ретровирусы (например, ЕР 0415731; АО 90/07936; АО 91/0285, АО 94/03622; АО 93/25698; АО 93/25234; патент США № 5219740; АО 93/11230; АО 93/10218). Могут быть также сконструированы вирусные векторы, которые содержат смесь различных элементов (например, промоторов, последовательностей оболочки и т.п.) из различных вирусов или невирусных источников. В различных вариантах осуществления, либо сам вирусный вектор, либо вирусная частица, которая содержит этот вирусный вектор, могут быть использованы в описанных ниже способах и композициях.
В других вариантах осуществления данного изобретения молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют молекулу, которая ингибирует связывание ТОР-бета-связывающего белка с членом ТОР-бетасемейства, могут вводиться различными способами, в том числе, например, введением асиалоозомукоида (АЗОК), конъюгированного с комплексами поли-Ь-лизин-ДНК (СйкГапо е! а1., РNАЗ 92122-92126, 1993), ДНК, связанной с убитым аденовирусом (Сийе1 е! а1., Нит. Оепе Тйег. 3(2): 147-154, 1992), цитофектинопосредованным введением (ПМК1Е-ООРЕ, Уюа1, СаШогта), прямой инъекцией ДНК (Аскаб1 е! а1., №!иге 352:815-818, 1991); ДНК-лиганда (Аи е! а1., 1. о£ Вю1. Сйет. 264:16985-16987, 1989); липофекцией (Ре1дпег е! а1., Ргос. №И. Асаб. Зсг ИЗА 84:7413-7417, 1989); липосомами (Рюкейпд е! а1., Сие. 89(1):1321, 1994; и Аапд е! а1., РNАЗ 84:7851-7855, 1987); бомбардировкой микроснарядами (АШПатк е! а1., РNАЗ 88:2726-2730, 1991) и прямой доставкой нуклеиновых кислот, которые кодируют сам этот белок, отдельно (Уйе апб Най, Сапсег Кек. 53:3860-3864, 1993) или с использованием комплексов ПЭГнуклеиновая кислота. Репрезентативные примеры молекул, которые могут быть экспрессированы векто- 44 022991 рами данного изобретения, включают рибозимы и антисмысловые молекулы, которые обсуждались более подробно выше.
Определение увеличенного минерального содержания кости может выполняться непосредственно с использованием рентгеновских лучей (например, Эиа1 Χ-гау ΑЬкο^ρГН^οтеГ^у или ΌΕΧΑ) или опосредованно на основе маркеров обновления кости (таких как остеобласт-специфическая щелочная фосфатаза, остеокальцин, пропептид проколлагена С типа 1 (РЮР) и общая щелочная фосфатаза; см. Согтег, С, Сигг. 0рт. т КЬеи. 7:243, 1995) или с использованием маркеров резорбции кости (пиридинолина, дезоксипиридинолина, ^телопептида, гидроксипролина мочи, тартрат-резистентных кислых фосфатаз и галактозилгидроксилизина плазмы; см. Согтег, кирга). Количество массы кости может быть также рассчитано из масс тела или другими способами, известными в данной области (см. Оттекк-Шу, МеГаЬ. Вопе ΌΦ ;·ιπά Ке1аГ. Кек. 5:177-181, 1984).
Как будет очевидно специалисту с квалификацией в данной области, количество и частота введения будет зависеть, конечно, от таких факторов, как характер и тяжесть показания, подлежещего лечению, желаемой реакции, состояния пациента и т.д. Обычно, эти композиции могут вводиться различными способами, как отмечалось выше.
Следующие примеры предоставлены в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения.
Примеры
Пример 1. Склеростеоз картируется на длинном плече хромосомы 17 человека
Генетическое картирование дефекта, ответственного за склеростеоз у людей, локализовало ген, ответственный за это нарушение, в районе хромосомы 17 человека, который кодирует новый член семейства ΤОΕ-бета-связывающих белков. При склеростеозе скелетная кость проявляет существенное увеличение минеральной плотности относительно минеральной плотности непораженных субъектов. Кость в голове также обнаруживает избыточный рост. Пациенты со склеростеозом являются обычно здоровыми, хотя они проявляют вариабельные степени синдактилии при рождении и вариабельные степени черепного сдавления и сдавления нервов в черепе.
Анализ сцепления дефекта гена, связанного со склеростеозом, проводили применением способа картирования гомозиготности к пробам ДНК, собранным из 24 Южно-Африканских семей, в которых имело место данное заболевание. (ЗНеГйеЫ еГ а1., 1994, Ηιιιη;·ιπ Мо1еси1аг ОепеНск 3:1331-1335. МепГШсаНоп оГ а Βа^άеГ-Β^еά1 кугФгот 1осик оп сНготокоте 3 ;·ιπά еуа1иаГюп оГ ейтепГ арргоасН Го Ното/удокЛу тарршд). Африканское население Южной Африки является генетически гомогенным; это население являются потомством небольшого числа основателей, которые колонизировали эту зону несколько столетий назад, и оно было изолировано географическими и социальными барьерами со времени основания. Склеростеоз является редким повсюду в мире вне этого Африканского сообщества, что предполагает, что мутация в этом гене присутствовала в популяции основателей и с тех пор увеличивалась численно вместе с увеличением этой популяции.
Использование картирования гомозиготности основывается на предположении, что маркеры картирования ДНК, смежные с рецессивной мутацией, должны быть, вероятно, гомозиготными у пораженных субъектов из находящихся в кровном родстве семей и в изолированных популяциях.
Набор из 371 микросателлитного маркера (КекеагсН ОепеНск, δеГ 6) из аутосомных хромосом был выбран для типирования пулов ДНК из проб пациентов со склеростеозом. Пробы ДНК для этого анализа были взяты из 29 пациентов со склеростеозом в 24 семьях, 59 непораженных членов семей и ряда неродственных контрольных субъектов из той же самой популяции. Эти пулы состояли из 4-6 индивидуумов: либо пораженных индивидуумов, пораженных индивидуумов из находящихся в кровном родстве людей, родителей и непораженных сибсов, либо неродственных контролей. В пулах неродственных индивидуумов и в большинстве пулов с пораженными индивидуумами или членами семей анализ маркеров показал несколько размеров аллелей для каждого маркера. Один маркер, Ό17δ1299, обнаруживал признак гомозиготности: одна полоса в нескольких пулах пораженных индивидуумов.
Все 24 семьи со склеростеозом типировались с 19 маркерами в целом в районе Ό17δ1299 (в 17ц12ц21). Было показано, что пораженные индивидуумы из каждой семьи являются гомозиготными в этом районе, и 25 из 29 индивидуумов были гомозиготными в отношении гаплотипа кора; каждый из них имел одни и те же аллели между Ό17δ1787 и Ό17δ930. Другие четыре индивидуума имели одну хромосому, которая совпадала с этим гаплотипом, и вторую, которая не совпадала. В сумме, эти данные неоспоримо предполагают, что этот район из 3 мега (106) пар нуклеотидов содержал мутацию склеростеоза. Анализ последовательности большинства экзонов в этом районе из 3 мега (106) пар нуклеотидов идентифицировал нонсенс-мутацию в кодирующей последовательности нового ΤОΕ-бета-связывающего белка (С^Тмутация в положении 117 δΕΟ ΙΌ N0:1 приводит к стоп-кодону). Было показано, что эта мутация является уникальной относительно пациентов со склеростеозом и носителей Африканского происхождения. Идентичность этого гена дополнительно подтверждали идентификацией мутации в его интроне (А^Тмутации в положении +3 этого интрона), которая приводит к неправильному процессингу мРНК в единственном, неродственном пациенте с диагностированным склеростеозом.
- 45 022991
Пример 2. Тканеспецифичность экспрессии гена ТОР-бета-связывающего белка А. Экспрессия гена Веег человека при помощи ОТ-ПЦР
Первую цепь кДНК получали из следующих проб тотальной РНК с использованием коммерчески доступного набора (’^ирегксйр! Ргеатрййсайоп §ук1ет Гог Р1гк1-§1гапк сОХА§упШе515, ЬгГе Тесйпо1одге5, КоскуШе, ΜΌ): мозг человека, печень человека, селезенка человека, тимус человека, плацента человека, скелетная мышца человека, щитовидная железа человека, гипофиз человека, остеобласт человека (ΝΗΘκΐ из С1опейск Согр., §ап Огедо, СА), клеточная линия остеосаркомы человека (8аок-2, АТСС # НТВ-85), кость человека, костный мозг человека, хрящ человека, кость зеленой мартышки, ЗассЬаготусек сегеугкгае и моноциты периферической крови человека. Все пробы РНК покупали из коммерческого источника (ОоШеск Ра1о А11о, СА), за исключением следующих, которые получали у себя в лаборатории: остеобласт человека, клеточная линия остеосаркомы человека, кость человека, хрящ человека и кость зеленой мартышки. Полученные у себя пробы РНК получали с использованием коммерчески доступного набора (ТК1 Кеадеп!, Мо1еси1аг КекеагсЬ СеШег, 1пс., Сгпсгппай, ОН).
ПЦР выполняли на этих пробах и дополнительно на геномной пробе человека в качестве контроля. Смысловой рлигонуклеотидный праймер Веег имел последовательность 5'ССООАОСТООАОААСААСААО-3' (8ЕС ГО N0:19). Антисмысловой олигонуклеотидный праймер Веег имел последовательность 5'-ОСАСТООССООАОСАСАСС-3' (8ЕС ГО N0:20). Кроме того, ПЦР выполняли с использованием праймеров для гена бета-актина человека в качестве контроля. Смысловой олигонуклеотидный праймер бета-актина имел последовательность 5'-АООССААССОСОАОААОАТОА СС-3' (5>ЕС ГО N0:21). Антисмысловой олигонуклеотидный праймер бета-актина имел последовательность 5'ОААОТССАОООСОАСОТАОСА-3' (8ЕС ГО N0:22). ПЦР выполняли с использованием стандартных условий в реакциях по 25 мкл с температурой отжига 61°С. Тридцать два цикла ПЦР выполняли с праймерами Веег, и двадцать четыре цикла выполняли с праймерами бета-актина.
После амплификации 12 мкл из каждой реакции анализировали электрофорезом в агарозном геле и окрашиванием бромидом этидия. См. фиг. 2А. В. РНК-гибридизация ш Ши срезов мышиного эмбриона:
Полноразмерную кДНК мышиного Веег (8ЕС ГО N0:11) клонировали в вектор рСК2.1 (1пуйгодеп, СагкЬак СА) в антисмысловом и смысловом направлении с использованием протокола изготовителя. 35δальфа-ОТР-меченые смысловой и антисмысловой кРНК-транскрипты синтезировали с использованием реагентов транскрипции ш уйго, поставляемых АтЬюп, 1пс. (Аикйп, ТХ). Гибридизацию ш кйи выполняли в соответствии с протоколами Ьуопз е! а1., (ί. Се11 Вю1. 111:2427-2436, 1990).
кРНК-зонд мышиного Веег детектировал специфическую мРНК, экспрессируемую в нервной трубке, зачатках конечностей, кровеносных сосудах и остеогенных хрящах развивающихся эмбрионов мыши. Панель А на фиг. 3 показывает экспрессию в апикальном эктодермальном выступе (аег) зачатка конечности (1), кровеносных сосудах (Ьу) и нервной трубке (п!). Панель В показывает экспрессию в 4-ом желудочке головного мозга (4). Панель С показывает экспрессию в мандибулярных (та), цервикальных позвонках (су), затылочной кости (ос), небе (ра) и кровеносном сосуде (Ьу). Панель Ό показывает экспрессию в ребрах (г) и клапане сердца (уа). Панель А является поперечным срезом эмбриона 10,5 крс. Панель В является сагиттальным срезом эмбриона 12,5 крс и панели С и Ό являются сагиттальными срезами эмбрионов 15,5 крс.
Ьа=жаберная дуга, й=сердце, !е=мозговой пузырь (передний мозг), Ь=головной мозг, Злобноносовая масса, д=кишечник, п=сердце, _)=челюсть, й=печень, 1и=легкое, о!=ушной пузырек, ао=, кс=спинной мозг, ккт=скелетная мышца, пк=носовая пазуха, !й=тимус, !о=язык, Г1=передняя конечность, кг=диафрагма.
Пример 3. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка ВЕЕК а) Экспрессия в клетках С08-1
ДНК-последовательность, кодирующую полноразмерный белок Веег человека, амплифицировали с использованием следующих олигонуклеотидных праймеров ПЦР: 5'-олигонуклеотидный праймер имел последовательность 5'-ААОСТТООТАССАТОСАОСТСССАС-3' (8ЕС ГО N0:23) и содержал сайт рестрикции НгпкШ (жирный шрифт) с последующими 19 нуклеотидами гена Веег, начинающимися с пары оснований 6, перед предполагаемым аминоконцевым старт-кодоном (АТО). 3'-олигонуклеотидный праймер имел последовательность 5'-ААОСТТСТАСТТОТСАТСОТСОТССТТОТАОТСОТАООСОТТСТССАОСТ-3' (δΗΟ ГО N0:24) и содержал сайт рестрикции НгпкШ (жирный шрифт) с последущим стоп-кодоном обращенного комплемента (СТА) с последующим обращенным комплементом эпитопа РЬАО (подчеркнутым, §гдта-Л1ктгсй Со., δ!. Ьоик, М0), фланкированным обращенным комплементом нуклеотидов, кодирующих 5 карбоксиконцевых аминокислот Веег. Продукт ПЦР ТА-клонировали (0тгдша1 ТА С1опгпд Кй, 1пуйтодеп, Сат1кЬак СА), и индивидуальные клоны подвергали скринингу секвенированием ДНК. Затем клон с подтвержденной последовательностью расщепляли НгпкШ и очищали на 1,5% агарозном геле с использованием коммерчески доступных реагентов (СЗсцйск Ое1 Ехйасйоп Кй, ргадеп 1пс., Уа1епсга, СА). Затем этот фрагмент лигировали с расщепленной НгпкШ, обработанной фосфатазой плазмидой рс^NА3.1 (1пуйгодеп, СагкЬак СА) с использованием ДНК-лигазы Т4. Е. сой ЭН10В трансформировали и высевали на чашки со средой ЬВ с 100 мкг/мл ампициллина. Колонии, несущие желаемый рекомбинант в правильной ориентации, идентифицировали с использованием скрининга на основе ПЦР с применением 5'-праймера,
- 46 022991 соответствующего сайту промотора Т7/праймирования в рсЭИА3.1, и 3'-праймера с последовательностью 5'-ОСАСТООССООАОСАСАСС-3' (8ЕР 10 N0:25), которая соответствует обращенному комплементу внутренней последовательности ВЕЕК. Последовательность этого клонированного фрагмента подтверждали секвенированием ДНК.
Клетки СО8-1 (АТСС № СКЬ-1650) использовали для трансфекции. 50 мкг экспрессионной плазмиды рс^NА-Вее^-Р1ад трансфицировали с использованием коммерчески доступного набора в соответствии с протоколами, поставляемыми изготовителем (0ЕЛЕ-0ех1гап Тгапк1’есйоп К1, 81§та СЬетюа1 Со. 81. Ьошк, МО). Конечной средой после трансфекции была ОМЕМ (ЬИе ТесЬпо1од1ек, КоскуШе, МО), содержащая 0,1% фетальную телячью сыворотку. После 4 дней в культуре эту среду удаляли. Экспрессию рекомбинантного ВЕЕК анализировали при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга с использованием моноклонального антитела М2 против РЬАО® (81дта-А1кг1сЬ Со., 8ί. 1 .ошк, МО). Очистку рекомбинантного белка ВЕЕК выполняли с использованием аффинной колонки с анти-РЕАО-М2-антителом (МатшаНап ТгапыеШ Ехргеккюп 8ук1ет, 8^дша-А1к^^сЬ Со., 81. Ьошк, МО). Профиль колонки анализировали с использованием электрофореза в ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга с использованием моноклонального антитела М2 против РЬАО®.
В. Экспрессия в клетках насекомых 8Р9
Последовательность гена Веег человека амплифицировали с использованием ПЦР со стандартными условиями и следующими праймерами:
Смысловой праймер:
Антисмысловой праймер:
5’СТСОТСААССТТСТАСТТОТСАТССТССТТСТАОТССТАСОССТТСТССАОСТССОС -3’ (5ЕО Ю N0:27)
Полученная кДНК содержала кодирующий район Веег с двумя модификациями. Ν-концевой сигнал секреции был удален, и эпитопная метка РЬАО (81дта) была слита в рамке считывания с С-концевой стороной инсерта. Добавляли сайты клонирования ВатН1 и I ΙίικΙΙΙΙ и этот ген субклонировали в вектор рМе1Вас (ИпаЦодеп) для переноса в бакуловирусный экспрессирующий вектор с использованием стандартных способов.
Рекомбинантные бакуловирусы, экспрессирующие белок Веег, получали с использованием набора для трансфекции Вас-^В1ие (Йпуйгодеп) и очищали в соответствии с инструкциями изготовителя.
Клетки 8Р9 (1пу11годеп) поддерживали в среде ТNΜ_РН (1пу|1годеп), содержащей 10% фетальную телячью сыворотку. Для экспрессии белка культуры 8Р9 во вращающихся колбах инфицировали при множественности заражения (МО1), большей чем 10. Пробы среды и клеток брали ежедневно в течение пяти дней, и экспрессию Веег подвергали мониторингу при помощи Вестерн-блоттинга с применением моноклонального анти-РЬАО-М2-антитела (81§та) или поликлональной кроличьей антисыворотки против Веег.
После пяти дней инфицированные бакуловирусом клетки 8Р9 собирали центрифугированием, и ассоциированный с клетками белок экстрагировали из осадка клеток с использованием высокосолевого буфера для экстракции (1,5 М №С1, 50 мМ Трис рН 7,5). Экстракт (20 мл на 300 мл культуры) осветляли центрифугированием, диализовали три раза против четырех литров забуференного Трисом солевого раствора (150 мМ №С1, 50 мМ Трис рН 7,5) и опять осветляли центрифугированием. Эту высокосолевую фракцию наносили на НШар 11ерапп (РЬагташа; объем слоя 5 мл), промывали интенсивно забуференым НЕРЕ8 солевым раствором (25 мМ НЕРЕ8 7,5, 150 мМ №С1), и связанные белки элюировали градиентом 150 мМ №С1 - 1200 мМ №С1. Элюцию Веег наблюдали при приблизительно 800 мМ №С1. К содержащим Веег фракциям добавляли 10% глицерин и 1 мМ ДТТ и их замораживали при -80°С.
Пример 4. Получение и испытание поликлональных антител к Веег, Огет1т и Оап
А. Получение антигена:
ДНК-последовательности Веег человека, Огет1т человека и Оап человека амплифицировали с использованием стандартных ПЦР-способов со следующими олигонуклеотидными праймерами:
Н. Веег(Веег человека)
Смысловой:
Антисмысловой:
б’-АССАТААССТТСТАСТАОСССТТСТССАО-З’ (5Е0 Ю
N0:29)
Н. Огет1т Смысловой:
Антисмысловой:
- 47 022991
5’-АССАТААССТТТТААТССАААТССАТОСА-3’ (5ЕО ГО
N0:31)
Н. Пап Смысловой:
5’-АСТАССАССТСОСССССАССАСССАТСААСААС-3’ (5ЕО ГО
N0:32)
Антисмысловой:
5’-АСТТА0ААССТТТСАСТССТСА0СССССТСТТСС-3’ (5Е0
ГО N0:33)
В каждом случае приведенные праймеры амплифицировали весь кодирующий район минус сигнальная последовательность секреции. Полученные последовательности включают сайты рестрикции для субклонирования в бактериальный экспрессирующий вектор рОЕ-30 (01а§еп 1пс., Уа1епс1а, СА) в сайтах ВатН1/Нтб111 для Веег и ОгетНп и сайтах Зас1/НтбШ для Пап. р(')Е30 содержит кодирующую последовательность для метки 6х №§ на 5'-конце района клонирования. Эти полные конструкции трансформировали в штамм Е. соН М-15/рКер (СНауеп 1пс), и индивидуальные клоны подтверждали секвенированием. Экспрессию белка в М-15/рКер и очистку (аффинное связывание метки 6хН1§ с №-ЭТА, связанным с Сефарозой) выполняли, как описано изготовителем (СНауеп, Тке ОНЛехргеклошЛ).
Полученный из Е. соН белок Веег извлекали в значительном количестве с использованием солюбилизации в 6М гуанидине и диализовали до 2-4 М для предотвращения осаждения во время хранения. Белки ОгетНп и Пап извлекали в более высоком количестве с солюбилизацией в 6 М гуанидине, и концентрация гуанидина после очистки была 0,5 М.
B. Получение и испытание поликлональных антител.
Поликлональные антитела к каждому из этих трех антигенов получали в кролике и в курице в качестве хозяев с использованием стандартных протоколов (К & К АпНЬобу, ЗкатоосН \\'Л; З!апбаг! рго!осо1 бог гаЬЫ! тшшш/аНоп апб апНкега ^есονе^у; Зког! Рго!осо1§ т Мо1еси1аг Вю1о§у. 2пб ебШоп. 1992. 11.3711.41. Соп!лЬи!ог§ Не1еп М. Соорег апб Υνοηηе Ра!ег§оп; антитела курицы были получены с ЗНа!е§ю Вю§о1и!юп§, Катопа, СА).
Кроличьи антисыворотки и фракцию Ι§Υ куриного яйца подвергали скринингу на активность посредством Вестерн-блоттинга. Каждый из трех антигенов разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ и переносили на нитроцеллюлозу 0,45 мкм (Nονеx, Зап Эхедо, СА). Эту мембрану разрезали на полоски, причем каждая полоска содержала приблизительно 75 нг антигена. Полоски блокировали в 3% В1о!Нп§ Огабе В1оск (Вю-Каб ЬаЬогаШпез, Негси1е§, СА) и промывали 3 раза в буфере 1Х Трис-буфер-солевой раствор (ТВЗ)/0,02% Твин. Первичное антитело (кровопускания перед иммунизацией, кроличьи антисыворотки или !у¥ куриного яйца в разведениях в диапазоне 1:100 - 1:10000 в блокирующем буфере) инкубировали с этими полосками в течение 1 ч при осторожном качании. За второй серией трех промывок 1Х ТВЗ/0,02% Твин следовала одночасовая инкубация со вторичным антителом (конъюгированное с пероксидазой ослиное антитело против кроличьего иммуноглобулина, Атегккат Нбе Зс1епсе, Р1§са!а^ау, \.1; или конъюгированное с пероксидазой ослиное антитело против куриного иммуноглобулина, 1аск§оп 1ттипоКекеагск, ^е§! О^ονе, РА). Выполняли конечный цикл из 3х промывок 1Х ТВЗ/0,02% Твин и полоски проявляли с использованием субстрата Ьит1-ЫдЬ! ХТеЛегп В1о!Нп§ ЗиЬ§!га!е (Коске Мо1еси1аг Вюскетюа1§, Маппкет, Оегтапу).
C. Испытание перекрестной реактивности антител
Согласно протоколу, описанному в предыдущем разделе, нитроцеллюлозные полоски Веег, ОгетНп или Пап инкубировали с разведениями (1:5000 и 1:10000) из соответствующих кроличьей антисыворотки или 6Υ куриного яйца, а также с антисыворотками или 6Υ куриного яйца с разведениями (1:1000 и 1:5000), приготовленными с оставшимися двумя антигенами. Эти увеличенные уровни несовпадающих антител использовали для детектирования связывания низкой аффинности этими антигенами, которое можно обнаружить только при увеличенной концентрации. Протокол и продолжительность развития являются одинаковыми для всех трех событий связывания с использованием описанного выше протокола. Не наблюдали антигенной перекрестной реактивности для любого из испытанных антигенов.
Пример 5. Взаимодействие Веег с белками ТОР-бета-суперсемейства
Взаимодействие Веег с белками из различных филогенетических плечей ТОР-бета-суперсемейства исследовали с использованием способов иммунопреципитации. Очищенные ТОР-31, ТОР-32, ТОР-33, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6 и О[)\Р получали из коммерческих источников (К&1) §у§!ет§; МтпеароНк М^. Репрезентативный протокол является следующим. Частично очищенный Веег диализовали в забуференный НЕРЕЗ солевой раствор (25 мМ НЕРЕЗ 7,5, 150 мМ №С1). Иммунопреципитации выполняли в 300 мл 1Р-буфера (150 мМ №С1, 25 мМ Трис рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 1,4 мМ р-меркаптоэтанол, 0,5% Тритон Х100 и 10% глицерин). 30 нг рекомбинантного белка ВМР-5 человека (К&1) §у§!ет§) наносили на 15 мкл РЬАО-аффинного матрикса (З1§та; З!. Бошк М0)) в присутствии и в отстутствие 500 нг меченого РЬАОэпитопом Веег. Белки инкубировали в течение 4 ч при 4°С и затем ассоциированные с этим аффинным матриксом белки промывали 5 раз в 1Р-буфере (1 мл на одну промывку). Связанные белки элюировали из
- 48 022991 аффинного матрикса в 60 мклитрах 1Х буфера для взятия проб для ДСН-ПААГ. Белки разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ и ассоциированный с Веег ВМР-5 детектировали с использованием Вестернблота с применением антисыворотки против ВМР-5 (КекеагсЬ Б1адпокНск, Ис.) (см. фиг. 5).
Анализ связывания лиганда Веег
Белок РЬАО-Веег (20 нг) добавляют к 100 мкл ФСБ/0,2% БСА и адсорбируют в каждую лунку 96луночного микротитрационного планшета, предварительно покрытого моноклональным антителом против РЬАО (81дта; δ(. Ьошк М0), и блокируют 10% БСА в ФСБ. Это выполняют при комнатной температуре в течение 60 минут. Этот раствор белка удаляют, и лунки промывают для удаления несвязавшегося белка. Добавляют ВМР-5 в каждую лунку в концентрациях в диапазоне от 10 пМ до 500 нМ в ФСБ /0,2% БСА и инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре. Раствор для связывания удаляют, и планшет промывают три раза по 200 мкл ФСБ/0,2% БСА. Затем уровни ВМР-5 детектируют с использованием антисыворотки ВМР-5 посредством ЕЫ8А (РМ. АикиЬе1 е( а1 (1998) Сиггеп( Рго(осо1к ш Мо1 Вю1. Уо1 2 11.2.1-11.2.22). Специфическое связывание рассчитывают вычитанием неспецифического связывания из общего связывания и анализируют с использованием программы ИОАНО (Мипкоп апй РойЬагй, Апа1. ВИсНет., 107, р220-239, (1980).
В вариации этого способа Веег конструируют и экспрессируют в виде слитого с Рс человека белка. Подобным образом конструируют лиганд ВМР и экспрессируют в виде мышиного Рс-слияния. Эти белки инкубируют вместе, и анализ проводят как описано Ме11ог е( а1., с использованием гомогенного детектирования с разделенной во времени флуоресценцией (ОЛУ. Ме11ог е( а1., I оГ Вюшо1 §сгеетпд, 3(2) 91-99, 1998).
Пример 6. Анализ-скрининг на ингибирование связывания ТОР-бета-связывающего белка с членами ТОР-бета-семейства
Описанный выше анализ повторяют с двумя исключениями. Во-первых, концентрацию ВМР поддерживают фиксированной при Кс, определенной предварительно. Во-вторых, коллекцию кандидатных антагонистов добавляют при фиксированной концентрации (20 мкМ в случае коллекций малых органических молекул и 1 мкМ в исследованиях антител). Эти кандидатные молекулы (антагонисты) связывания ТОР-бета-связывающего белка включают органические соединения, полученные из коммерческих или внутренних коллекций, представляющих разнообразные химические структуры. Эти соединения готовят в виде исходных растворов в ДМСО и добавляют в лунки для анализа при < 1% конечного объема при стандартных условиях анализа. Их инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре с ВМР и Веег, раствор удаляют и связанный ВМР определяют количественно, как описано выше. Агенты, которые ингибируют 40% связывания ВМР, наблюдаемого в отсутствие соединения или антитела, считают антагонистами этого взаимодействия. Затем их оценивают в качестве потенциальных ингибиторов на основе исследований с титрованием для определения их констант ингибирования и их влияния на связывающую аффинность ТОР-бета-связывающего белка. Могут также проводиться контрольные анализы сравнимой специфичности для установления профиля селективности для идентифицированного антагониста посредством исследований с использованием анализов, зависимых от действия лиганда ВМР (например, конкурентное исследование с использованием ВМР/ВМР-рецептора).
Пример 7. Ингибирование локализации ТОР-бета-связывающего белка в матриксе кости
Оценку ингибирования локализации в матриксе кости (гидроксиапатите) проводят с использованием модификаций в отношении способа Николаса (№со1ак, У. Са1аГ ТЖкие Н'К 57:206, 1995). Вкратце, Ι2'ΐмеченый ТОР-бета-связывающий белок получают, как описано №со1ак (кирга). В каждую лунку 96луночного планшета с полипропиленовой фильтрующей мембраной (Ро1уй1(готс, \Уеутои(Н МА) добавляют гидроксиапатит. ТОР-бета-связывающий белок добавляют к 0,2% альбумину в ФСБ. Лунки, содержащие матрикс, промывают 3 раза этим буфером. Адсорбированный ТОР-бета-связывающий белок элюируют с использованием 0,3 М №0Н и определяют количественно.
Идентификацию ингибитора проводят посредством инкубирования ТОР-бета-связывающего белка с тест-молекулами и нанесением этой смеси на матрикс, описанный выше. Матрикс промывают 3 раза 0,2% альбумином в ФСБ. Адсорбированный ТОР-бета-связывающий белок элюируют с использованием 0,3 М №0Н и определяют количественно. Агенты, которые ингибируют 40% связывания ТОР-бетасвязывающего белка, наблюдаемого в отсутствие соединения или антитела, считают ингибиторами локализации в кости. Эти ингибиторы дополнительно характеризуют посредством исследований доза-ответ для определения их констант ингибирования и их влияния на связывающую аффинность ТОР-бетасвязывающего белка.
Пример 8. Конструирование мутанта ТОР-бета-связывающего белка а) Мутагенез:
Полноразмерная кДНК ТОР-бета-связывающего белка в плазмиде рВ1иекспр( §К служит в качестве матрицы для мутагенеза. Вкратце, подходящие праймеры (см. приведенное выше обсуждение) используют для генерирования ДНК-фрагмента полимеразной цепной реакцией с использованием ДНКполимеразы Уеп( (№ν Епд1апй Вю1аЬк, Вегег1у, МА). Полимеразная цепная реакция протекает в течение 23 циклов в буферах, обеспечиваемых изготовителем, с использованием температуры отжига 57°С. Затем этот продукт подвергают действию двух рестриктаз и после выделения с использованием электрофореза
- 49 022991 в агарозном геле опять лигируют в плазмиду рКВР4-503, из которой совпадающая последовательность была удалена ферментативным расщеплением. Целостность мутанта подтверждают секвенированием ДНК.
В) Экспрессия в клетках млекопитающих и выделение мутантного ТОР-бета-связывающего белка:
Мутантные кДНК ТОР-бета-связывающего белка переносят в рсОНА3.1, экспрессирующий вектор млекопитающих, описанный в примере 3. После подтверждения этой последовательности, полученные конструкции трансфицируют в клетки С08-1, и секретируемый белок очищают, как описано в примере 3.
Пример 9. модели животных - I
Генерирование трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих ген
ВЕЕК ВАС-клон 15О5 ~200 т.п.н., выделенный из библиотеки геномной ДНК мыши С1ТВ (распространяемой Кекеагсй Оепейск, Нип!куШе, ЛЬ), использовали для определения полной последовательности гена Веег мыши и его 5'- и 3'-фланкирующих районов. 8а11-фрагмент 41 т.п.н., содержащий полный ген, плюс ~17 т.п.н. 5'- фланкирующей и ~20 т.п.н. 3'-фланкирующей последовательности субклонировали в сайт ВатН1 космидного вектора 8ирегСок1 (8йа1адепе, Ьа 1о11а, СА) и размножали в штамме Е. сой ЭН10В. Затем из этой космидной конструкции М1и1 - АуШ-фрагмент рестрикции 35 т.п.н. (8ЕЦ ГО N0: 6), включающий полный ген Веег, а также 17 т.п.н. и 14 т.п.н. 5'- и 3'-фланкирующей последовательности, соответственно, очищали из геля с использованием общепринятого способа и использовали для микроинъекции мышиных зигот (ЭХХ Тгапкдетск; патент США № 4873191). Животных-основателей, в которых этот клонированный ДНК-фрагмент интегрировался случайным образом в геном, получали при частоте 5-30% выживших детенышей. Присутствие трансгена определяли проведением блот-анализа по Саузерну геномной ДНК, экстрагированной из небольшого количества мышиной ткани, такой как кончик хвоста. ДНК экстрагировали с использованием следующего протокола: ткань расщепляли в течение ночи при 55% в буфере для лизиса, содержащем 200 мМ №С1, 100 мМ Трис рН 8,5, 5 мМ ЭДТА, 0,2% ДСН и 0,5 мг/мл протеиназы К. На следующий день ДНК экстрагировали один раз смесью фенол/хлороформ (50:50), один раз смесью хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали этанолом. После ресуспендирования в ТЭ (10 мМ Трис рН 7,5, 1 мМ ЭДТА) 8-10 мкг каждой пробы ДНК расщепляли рестрикционной эндонуклеазой, такой как ЕсоК1, подвергали гель-электрофорезу и переносили на заряженную найлоновую мембрану, такую как НуВопбХ+ (АтегкЬат, Аг1тд!оп Не1дЬ!к, ГО). Затем полученный фильтр гибридизовали с радиоактивно меченым фрагментом ДНК, происходящим из локуса гена Веег мыши и способным узнавать как фрагмент из локуса эндогенного гена, так и фрагмент другого размера, происходящий из трансгена. Животных-основателей разводили до нормальных трансгенных мышей для получения достаточных количеств трансгенного и нетрансгенного потомства, в котором можно определять эффекты сверхэкспрессии гена Веег. Для этих исследований животных разного возраста (например, 1 день, 3 недели, 6 недель, 4 месяца) подвергали ряду различных анализов, предназначенных для определения макроскопического образования скелета, минеральной плотности кости, минерального содержания кости, активности остеокластов и остеобластов, степени эндохрящевого окостенения, образования хряща и т.д. Транскрипционная активность из этого трансгена может быть определена экстракцией РНК из различных тканей и использованием ОТ-ПЦР-анализа, который использует преимущество полиморфизмов единственного нуклеотида между мышиной линией, из которой получен этот трансген (1298ν/Τ), и линией мышей, используемой для микроинъекции ДНК [(С57ВЬ5/1 / 8ίΕ/ί)Ε2|.
Модели животных - II
Разрушение гена Веег мыши гомологичной рекомбинацией
Гомологичная рекомбинация в эмбриональных стволовых клетках (Е8) может быть использована для инактивации эндогенного гена Веег мыши и затем генерирования животных, несущих мутацию с потерей функции. Репортерный ген, такой как ген β-галактозидазы Е. сой, был встроен в нацеливающий вектор таким образом, что его экспрессия регулируется промотором и сигналом инициации трансляции эндогенного гена Веег. Таким путем могут быть определены пространственные и временные паттерны (распределения) экспрессии гена Веег в животных, несущих аллель-мишень.
Этот нацеливающий вектор конструировали сначала клонированием отобранной с использованием лекарственного средства, запускаемой промотором фосфоглицераткиназы (РОК) кассеты с геном устойчивости к неомицину (пео) из рОТ-Ы29 (№те Епд1апб Вю1аЬк, Ветейу, МА), в клонирующий вектор р8Р72 (Рготеда, Мабкоп, VI). Использовали ПЦР для фланкирования этой кассеты РОКпео сайтами 1охР бактериофага Р1, которые являются сайтами узнавания для Сге-рекомбиназы Р1 (Ноекк е! а1., РNА8 И8А, 79:3398, 1982). Это делает возможным последующее удаление маркера пео-устойчивости в Е8-клеткахмишенях или полученных из Е8-клеток животных (патент США 4959317). Праймеры ПЦР состояли из последовательности 1охР из 34 нуклеотидов (п!б), 15-25-нуклеотидов, комплементарных 5'- и 3'-концам кассеты РОКпео, а также сайтов узнавания рестриктаз (ВатН1 в смысловом праймере и ЕсоК1 в антисмысловом праймере) для клонирования в р8Р72. Последовательность смыслового праймера была 8'ААТСТООАТССАТААСТТСОТАТАОСАТАСАТТАТАСОААОТТАТСТОСАООАТТСОА ОООССССТ3' (8ЕЦ ГО N0:34); последовательность антисмыслового праймера была 5'ААТСТОААТТССАССООТОТТААТТАААТААСТТСОТАТААТОТАТОСТАТАСОААОТТАТАОАТСТ
- 50 022991
АОАОТСАОСТТСТОА-3' (81 У) ΙΌ N0:35).
Следующей стадией было клонирование ХЬо1-НтбШ-фрагмента 3,6 т.п.н., содержащего ген βгалактозидазы Е. соП и сигнал полиаденилирования 8У40 из р8У β (С1опГесЬ, Ра1о А1Го, СА), в плазмиду р8Р72-РОКпео. Короткое плечо гомологии из локуса гена Веег мыши генерировали амплификацией фрагмента 2,4 т.п.н. из ВАС-клона 15О5. 3'-конец этого фрагмента совпадал с сайтом инициации трансляции гена Веег, и антисмысловой праймер, используемый в ПЦР, также включал 30 нуклеотидов, комплементарных 5'-концу гена р-галактозидазы, так что его кодирующий район мог быть слит с сайтом инициации Веег в рамке считывания. Подходом, использованным для введения короткого плеча в плазмиду р8Р72-в да1-РОКпео, была линеаризация этой плазмиды в сайте слева от гена в-да1 и затем котрансформация этого фрагмента с коротким плечом продукта ПЦР и отбор плазмид, в которых этот продукт ПЦР интегрировался посредством гомологичной рекомбинации. Смысловой праймер для амплификации этого короткого плеча включал 30 нуклеотидов, комплементарных вектору р8Р72, для создания возможности этого события рекомбинации. Последовательность смыслового праймера была 5'АТТТАООТОАСАСТАТАОААСТСОАОСАОСТОААОСТТААССАСАТООТООСТСАС (8ЕЦ ГО N0:36) и последовательность антисмыслового праймера ААСОАСООССАОТОААТССОТААТСАТООТСАТОСТОССАООТООАООАОООСА-3'
ААССАТ-3' была 5'(81 У) ГО
N0:37).
Длинное плечо из локуса гена Веег генерировали амплификацией фрагмента 6,1 т.п.н. из ВАС-клона 15О5 с праймерами, которые также вводят сайты редко-разрезающих (редкощепящих) ферментов 8дгА1, Рке1, Акс1 и Рас1. Конкретно, последовательность смыслового праймера была 5'-АТТАССАССООТОАСАСССОСТТССТОАСАО-3' (8ЕЦ ГО N0:38); последовательность антисмыслового праймера была 5'АТТАСТТΛАТТΛΛАСАТСОСОССССАТАТОСССОСССССТΛАТТОССОСОСАТСОТТААТТ-3' (81 У) ГО N0:39). Полученный продукт ПЦР клонировали в вектор ТА (Iиν^ί^одеи, Саг1кЬаб СА) в виде промежуточной стадии.
Эта нацеливающая конструкция гена Веег мыши включала также второй селектируемый маркер, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса I (Н8УТК) под контролем элемента длинного концевого повтора вируса саркомы Рауса (К8У ЬТК). Экспрессия этого гена делает клетки млекопитающих чувствительными (и нежизнеспособными) к ганцикловиру; таким образом она является удобным путем для отбора против неомицин-устойчивых клеток, в которых эта конструкция была интегрирована негомологичным событием (Патент США 5464764). Кассету К8УЪТК-Н8УТК амплифицировали из рР81337 с использованием праймеров, которые делают возможным последующее клонирование в сайты Рке1 и Акс1 векторной плазмиды длинного плеча-ТА. Для этой ПЦР последовательность смыслового праймера была 5'-АТТАСООССООССОСАААООААТТСААОА ТСТОА-3' (81 У) ГО N0:40); последовательность антисмыслового праймера была 5'-АТТАСООСОСОССССТСАСАООССОСАСССАОСТ-3' (81 У) ГО N0:41).
Конечная стадия в конструировании этого нацеливающего вектора включала клонирование 8дгА1Акс1-фрагмента 8,8 т.п.н., содержащего длинное плечо и ген К8УЬТК-Н8УТК, в сайты 8§гА1 и Акс1 плазмиды р8Р72-короткое плечо-вда1-РОКпео. Этот нацеливающий вектор линеаризовали расщеплением либо Акс1, либо Рас1 перед электропорацией в клетки Е8.
Пример 10. Опосредованная антисмысловым олигонуклеотидом инактивация ВЕЕК
Антисмысловые олигонуклеотиды из 17 нуклеотидов получают в перекрывающемся формате таким образом, что 5'-конец первого олигонуклеотида перекрывает кодон инициации трансляции АИО транскрипта Веег, а 5'-концы последовательных олигонуклеотидов встречаются в 5-нуклеотидных приращениях при движении в 5'-направлении (до 50 нуклеотидов далее) относительно АИО Веег. Соответствующие контрольные олигонуклеотиды конструируют и получают с использованием эквивалентного состава оснований, но перераспределенного в последовательности, для ингибирования какой-либо значимой гибридизации с кодирующей мРНК. Доставку реагентов к клеточной тест-системе проводят посредством доставки с использованием катионных липидов (Р.Ь. Ре1дпег, Ргос. №Г1. Асаб. 8ст И8А 84:7413, 1987). 2 мкг антисмыслового олигонуклеотида добавляют к 100 мкл среды с уменьшенным содержанием сыворотки (0рй-МЕМ I среда с уменьшенным содержанием сыворотки; ЫГе ТесЬпо1о§1ек, ОайЬеткЬигд МИ) и смешивают с реагентом Липофектином (6 мкл) (ЫГе ТесЬпо1од1ек, ОайЬегкЬигд МИ) в 100 мкл среды с уменьшенным содержанием сыворотки. Эти компоненты смешивают, дают возможность образоваться комплексу в течение 30 минут при комнатной температуре, и эту смесь добавляют к предварительно посеянным клеткам МСЗТЗЕ21 или К8483. Эти клетки культивируют и извлекают мРНК. мРНК Веег подвергают мониторингу с использованием ОТ-ПЦР вместе с Веег-специфическими праймерами. Кроме того, отдельные экспериментальные лунки собирают, и уровни белка определяют с использованием способов Вестерн-блоттинга, описанных в примере 4. Клетки собирают, ресуспендируют в буфере для лизиса (50 мМ Трис рН 7,5, 20 мМ №С1, 1 мМ ЭДТА, 1% ДСН), и растворимый белок собирают. Этот материал наносят на 10-20%-градиентный денатурирующий гель для электрофореза в ДСН-ПААГ. Разделенные белки переносят на нитроцеллюлозу и проводят Вестерн-блоттинг, как описано выше, с использованием описанных реагентов-антител. Параллельно контрольные олигонуклеотиды добавляют к идентич- 51 022991 ным культурам и экспериментальные операции повторяют. Уменьшение уровней мРНК Веег или белка считают значимым, если обработка антисмысловым олигонуклеотидом приводит к 50% изменению в любом случае по сравнению с контрольным перемешанным олигонуклеотидом. Эта методология делает возможными селективную инактивацию гена и последующую характеристику фенотипа минерализованных узелков в модели культуры ткани.
Пример 11. Моделирование внутреннего района (кора) склеростина
Способы узнавания гомологии (например, Р31-ВЬА3Т (А1!ксЬи1 е! а1., Ыис1е1с Аабк Кек. 25:3389-402 (1997)), РИОИЕ (ЗИ е! а1., 1. Мо1. Вю1. 310:243-57 (2001)) предполагали, что внутренний район (кор) ЗОЗТ (ЗОЗТ_Соге) принимает укладку цистинового узла. РИОИЕ является чувствительным способом для детектирования гомологии между последовательностями и структурами. Хорионический гонадотропин β человека (ЬСО-β), для которого известна экспериментально определенная 3И-структура, идентифицировали при помощи РИОИЕ (ЗЫ е! а1., кирга) как самый близкий гомолог ЗОЗТ_Соге. Таким образом, ЬСО-β использовали в качестве структурного шаблона для построения 3И-моделей для ЗОЗТ_Соге.
Выравнивание ЗОЗТ_Соге и его близких гомологов показано на фиг. 7. Среди гомологов, показанных в этом выравнивании, только ЬСО-β (СОНВ) имел известную 3И-структуру. Идентичность последовательности между ЗОЗТ_Соге и ЬСО-β была приблизительно 25%. Восемь остатков СУЗ были консервативными во всем семействе, подчеркивая общее структурное сходство между ЗОЗТ_Соге и ЬСО-β. Три пары цистинов (1-5, 3-7, 4-8) образовывали дисульфидные связи (показанные жирными линиями на фиг. 7) в конфигурации узла, которая была характерной для укладки цистинового узла. Дополнительная дисульфидная связь (2-6), показанная пунктирной линией на фиг. 7, была уникальной для этого семейства и отличала это семейство белков от других семейств с цистиновым узлом (например, ТОР-β, ВМР).
ЗОЗТ_Соге моделировали с использованием РИВ (Вегтап е! а1., Ас!а Сгук!а11одг. И. Вю1. Сгук!а11одг. 58(Р! 6 Р!1):899-907 (2002)), вход 1НСЫ, 3И-структура ЬСО-р (Щи е! а1., З!гис!иге 2:545-58 (1994)), в качестве структурного шаблона. Модели рассчитывали с использованием программы МОИЕЬЕК (ЗаЪ апб В1ипбе11, 1. Мо1. Вю1. 234:779-815 (1993)). Снимок наилучшей модели показан на фигуре 8.
Большинство белков с цистиновыми узлами образуют димеры вследствие отсутствия гидрофобного кора в мономере (ЗсЬеийег е! а1., кирга; ЗсЫипеддег апб Оги!!ег, 1. Мо1. Вю1. 231:445-58 (1993)); Щи е! а1., кирга). ЗОЗТ, по-видимому, подчиняется тому же самому правилу и образует гомодимер для увеличения его стабильности. Конструирование модели для димеризованного района ЗОЗТ_Соге представляло несколько трудностей, которые было бы важно преодолеть, так как (1) сходство последовательности между ЗОЗТ_Соге и ЬСО-β было низким (25%); (2) вместо гомодимера, ЬСО-β образовывал гетеродимер с ЬСОаааа; и (3) ряд различных родственных конформаций мономеров наблюдали в димеризованных белках с цистиновыми узлами из различных семейств (например, РИОР, ТОР-β, нейротрофин, 1Ь-17Р, гонадотропин), что предполагало, что димерная конформация ЗОЗТ могла бы значимо отклоняться от гетеродимерной конформации ЬСО-α/β. При конструировании этой модели ЬСО-аааа заменяли ЬСО-β из гетеродимерной структуры (1НСЫ), с использованием способов структурного наложения, комбинированных с мануальной коррекцией, и затем строили модель гомодимера ЗОЗТ_Соге в соответствии с этой псевдоструктурой гомодимера ЬСО-β.
Пример 12. Моделирование взаимодействия ЗОЗТ-ВМР
Этот пример описывает белковое моделирование сайтов связывания рецепторов типа I и типа II на ВМР, которые участвуют во взаимодействии между ВМР и ЗОЗТ.
Конкурентные исследования продемонстрировали, что ЗОЗТ конкурировал с рецепторами как типа I, так и типа II за связывание с ВМР. В конкурентном анализе на основе ЕЫЗА ВМР-6 селективно взаимодействовал с покрытой склеростином последовательностью (300 нг на лунку) с высокой аффинностью (Кс = 3,4 нМ). Увеличивающиеся количества рецептора ТА ВМР (Рс-слитой конструкции) конкурировали со склеростином за связывание с ВМР-6 (11 нМ) (Ю50 =114 нМ). 10-кратный молярный избыток этого рецептора ВМР был достаточным для уменьшения связывания склеростина с ВМР-6 приблизительно на 50%. Эту конкуренцию наблюдали также со слитым белком ВМР-рецептор П-Рс (Ю50 = 36 нМ) и ИАИ (Σθ5ο = 43 нМ). Специфичность этого анализа была показана отсутствием конкуренции за связывание ВМР-6 между склеростином и слитым белком гАсйуш К1В-Рс, членом семейства рецепторов ТОР-р, который не связывал ВМР.
Сайты связыания рецепторов типа I и типа II на полипептиде ВМР были картированы и пространственно разделены (ЗсЬеийег е! а1., кирга; !пп1к е! а1., кирга; №ске1 е! а1., кирга; НаЬ е! а1., кирга). Ыодщп, другой антагонист ВМР, который связывается с ВМР с высокой активностью, контактирует с ВМР при обоих сайтах связывания рецептора типа I и рецептора типа II через Ν-концевую часть Иоддш (Огорре е! а1., кирга). Две β-цепи в районе кора вблизи С-конца также контактируют с ВМР при сайте связывания рецептора типа II.
Мануально доведенное выравнивание Ыоддш и ЗОЗТ показало, что эти два полипептида имеют сходство последовательности между Ν-концевыми частями этих белков и между районами внутренней части (кора). Выравнивание аминокислотных последовательностей представлено на фиг. 10. Остатки цистеина, которые образуют характерный цистиновый узел, были консервативными между Ыоддш и
- 52 022991
808Т. Общая идентичность последовательностей была 24%, а идентичность последовательностей в N концевом связывающем районе (положения 1-45 выравнивания) была 33%. Сообщалось, что два остатка в ^концевом связывающем районе Nодд^η, а именно, Ьеи (Ь) в положении 21 выравнивания и О1и (Е) в положении 23, играют важную роль в связывании ВМР (Огорре е! а1., кирга). Оба остатка были также консервативными в 808Т. Сходство последовательности в районе кора (положения 131-228 выравнивания) было приблизительно 20%, но каркас сук-узла сохранялся и достаточное количество ключевых остатков были консервативными, подтверждая гомологию между Nодд^η и 808Т.
Структуру Nодд^п сравнивали с 808Т также для выяснения, каким образом димеризуются два мономера 808Т. Как показано на фигуре 11, структура Коддт предполагала, что линкер между N концевым районом и районом кора не только играл роль в соединении этих двух районов, но также образовывал часть границы раздела димеризации между двумя мономерами Nодд^η. Одним большим различием между Nодд^п и 808Т было то, что линкер между ^концевым районом и районом кора был гораздо более коротким в 808Т.
С-концевой район 808Т может играть роль в димеризации 808Т. Последовательность Коддщ заканчивалась районом кора, тогда как 808Т имел дополнительный С-концевой район. В структуре Nодд^п дисульфидная связь соединяла С-концы двух мономеров Nодд^п. Таким образом, С-концевой район 808Т начинался близко к границе раздела двух мономеров и мог способствовать димеризации. Кроме того, предсказание вторичной структуры показало, что некоторые части С-концевого района 808Т имели тенденцию образования спиралей. Этот район в 808Т может быть ответственным за активность димеризации, возможно, через упаковку спираль-спираль, которая имитировала функцию более длинного линкера в Nодд^η. Другим различием между структурой Nодд^п и 808Т была инсерция аминокислоты в районе кора 808Т в положениях 169-185 выравнивания (см. фиг. 10). Эта инсерция удлиняла β-шпильку, которая была направлена к поверхности раздела димеризации в структуре Коддт (показано на фиг. 11 в виде района петли в середине этих мономеров и выше С-концевого остатка Сук). Эта удлиненная βшпилька могла также способствовать димеризации 808Т.
Пример 13. Конструирование и получение пептидных иммуногенов 808Т
Этот пример описывает конструирование пептидных иммуногенов 808Т, которые используют для иммунизации животных и генерирования антител, которые блокируют взаимодействия между ВМР и 808Т и предотвращают образование димеров мономеров 808Т.
Связывающие ВМР фрагменты
Общее сходство между 808Т и Nодд^η и сходство между ^концевыми районами этих двух полипептидов предполагают, что 808Т может взаимодействовать с ВМР подобно взаимодействию Nодд^η. То есть, ^концевой район 808Т может взаимодействовать с сайтами связывания рецептора как типа I, так и типа II на ВМР, а часть района внутренней части (кора) (положения аминокислот 190-220 в выравнивании на фиг. 10) может взаимодействовать с сайтом связывания рецептора типа II таким образом, что антитела, специфические для этих районов 808Т, могут блокировать или нарушать связывание ВМР с 808Т.
Аминокислотные последовательности этих полипептидных фрагментов 808Т для 808Т крысы и человека являются следующими.
8Ο8Т_N_^^ηке^: ^концевой район (включает короткий линкер, который соединяется с районом кора)
Человек:
ΟΟννΟΑΡΚΝΟΑΤΕΙΙΡΕίΘΕΥΡΕΡΡΡΕΙΕΝΝΚΤΜΝΡΑΕΝΟΟΡΡΡΗΗΡΡΕΤΚΟνδΕΥδ (δΕΩ Ю N0:92)
Крыса:
ΟΟννΟΑΡΚΝΟΑΤΕΙΙΡΟΙΡΕΥΡΕΡΡΩΕΙΕΝΝΟΤΜΝΡΑΕΝΟΟΡΡΡΗΗΡΥΟΤΚΟνδΕΥδ (δΕΟ Ю N0:93)
808Т_Соге_Втй: Часть района кора, которая, вероятно, контактирует с ВМР при его сайте связывания рецептора типа II (слегка удлиненная на обоих концах для включения якорей захвата остатка СУ8):
Человек:
С1РОРУКАОР\/01_1_СРОСЕАРРАРК\/Р1_\/АЗС (ЗЕО Ю N0:94)
Крыса:
С1Р0РУРА0Р\/01_1_СРС0ААРРЗРК\/Р1_\/АЗС (5ЕО Ю N0:95)
Фрагменты димеризации 8О8Т
С-концевой район 808Т, вероятно, участвует в образовании гомодимеров 808Т (см. пример 12). Удлиненная β-шпилька может также играть роль в образовании гомодимера. Антитела, которые специфически связываются с такими районами, могут предотвращать или нарушать димеризацию мономеров 808Т, что, в свою очередь, может подавлять взаимодействие между 808Т и ВМР Полипептидные фрагменты в 808Т крысы и человека, соответствующие этим районам, являются следующими.
- 53 022991
808Т_С: С-концевой район Человек:
ί-ΤΡΡΗΝΟδΕΙ_ΚΟΡ<3ΤΕΑΑΡΡΟΚΟΡΚΡΡΡΡΑΡ3ΑΚΑΝΟΑΕΙ_ΕΝΑΥ (δΕΟ Ю N0:96)
Крыса:
ЬТРРНΝΩδΕΙΚϋΡΟΡΕΤΑΡΡΟΚΟΡΚΡΡΡΡΑΡΟΑΚΑΝΟΑΕΙΕΝΑΥ (δΕΟ Ю N0:97)
808Т_Соге_Б1тег: Часть района кора, которая, вероятно, участвует в димеризации 808Т (слегка удлиненная на обоих концах для включения якорей захвата остатка СΥ8):
Человек:
ΩΟΡΑΡυ_ΡΝΑΙΟΡ<3Κν\Λ/νΡΡδΟΡΟΡΡΩ (δΕΟ Ю N0:98)
Крыса:
ΟΟΡΑΡΙΙΡΝΑΙΟΡνκννννΡΡΝΘΡΟΡΡΟ (δΕΟ Ю N0:99)
Связывающий ВМР фрагмент на Ν-конце 8О8Т
Ключевой Ы-концевой связывающий район 808Т (положения 1-35 выравнивания на фиг. 10) моделировали на основе структуры комплекса Кт/ВМР-7 (вход № 1М4и Банка данных белков) и выравнивания аминокислотных последовательностей (см. фигуру 10) для идентификации аминокислотных остатков К-конца 808Т, которые, вероятно, взаимодействуют с ВМР Модель 808Т представлена на фигуре 12. В этой сравнительной модели, фенилаланин (РНе, Р) в положении 8 выравнивания (см. стрелку и сопутствующий текст) в последовательности 808Т выступает в гидрофобный карман на поверхности ВМР-димера. Тот же самый признак выпуклость-в-углубление наблюдали в структуре комплекса ВМР и рецептора типа I (№ске1 е! а1., зирга), где РНе85 этого рецептора соответствует тому же самому карману, что является ключевым признаком узнавания лиганд-рецептор типа I для членов ТОР-бетасуперсемейства (включающего в себя, например, ТОР-бета-семейство, ВМР-семейство и т.п.). Согласно этой модели, консервативным является также управляемый пролином (Рго) виток, который позволяет N концевому связывающему фрагменту проходить вдоль поверхности ВМР-димера, перемещаясь от сайта связывания рецептора типа I к сайту связывания рецептора типа II на другой стороне этого комплекса. Консервативным является также другой управляемый пролином (Рго) виток вблизи карбокси-конца связывающего фрагмента, который затем соединяется с районом линкера. Сильные контакты между 808Т и ВМР являются очевидными на фиг. 12.
Пептидные иммуногены
Были сконструированы пептиды для включения Н-концевого района 808Т, который, как было предсказано, осуществляет контакт с ВМР-белками. Эти пептидные последовательности представлены ниже. Для иммунизации животных эти пептидные последовательности были сконструированы так, что они являются перекрывающимися, и был добавлен дополнительный цистеин к С-концу для облегчения сшивания с КТН. Затем эти пептиды использовали для иммунизации. Пептидные последовательности этих иммуногенов являются следующими:
808Т человека:
ΟΟννΟΑΡΚΝϋΑΤΕΙΙΡΕΙΟΕΥ (ЗЕО ГО N0:47)
ΤΕΙΙΡΕΙ_ΟΕΥΡΕΡΡΡΕΙ_ΕΝΝ (ЗЕО ГО N0:48)
ΡΕΡΡΡΕΙ_ΕΝΝΚΤΜΝΡΑΕΝΟΟ (ЗЕО ГО N0:49)
ΚΤΜΝΡΑΕΝΟΟΡΡΡΗΗΡΡΕΤΚ (3ΕΩ ГО N0:50)
ΡΡΡΗΗΡΡΕΤΚϋνδΕΥδ (δΕΟ ГО N0:51)
Пептиды δΟδΤ человека с дополнительным Суз:
ΟΟννΟΑΡΚΝΟΑΤΕΙΙΡΕΙ-ΟΕΥ-Ο (δΕΟ ГО N0:52)
ΤΕΙΙΡΕΙ_ΟΕΥΡΕΡΡΡΕΙ_ΕΝΝ-0 (δΕΟ ГО N0:53)
ΡΕΡΡΡΕΙ_ΕΝΝΚΤΜΝΡΑΕΝ00-0 (δΕΟ ГО N0:54)
ΚΤΜΝΡΑΕΝΟΟΡΡΡΗΗΡΡΕΤΚ-С (δΕΟ ГО N0:55)
ΡΡΡΗΗΡΡΕΤΚΟνδΕΥδ-С (δΕΟ ГО N0:56)
808Т крысы:
ΟΟννΟΑΡΚΝΟΑΤΕΙΙΡΟΙ,ΡΕΥΡΕΡΡ (δΕΟ ГО N0:57)
ΡΕΡΡ0ΕΙ.ΕΝΝ0ΤΜΝΡΑΕΝ06 (δΕΟ ГО N0:58)
ΕΝΟΟΡΡΡΗΗΡΥϋΤΚΟνδΕΥδ (δΕΟ ГО N0:59)
ΤΕΙΙΡΟΙ_ΡΕΥΡΕΡΡΟΕΙ_ΕΝΝ (δΕΟ ГО N0:60)
Пептиды δΟδΤ крысы с дополнительным Суз:
0(3νν0ΑΡΚΝ0ΑΤΕΙΙΡ0Ι_ΡΕΥΡΕΡΡ-0 (δΕΟ ГО N0:61)
ΡΕΡΡΟΕίΕΝΝΟΤΜΝΡΑΕΝΟΟ-С (δΕΟ ГО N0:62)
ΕΝΟΟΡΡΡΗΗΡΥϋΤΚϋνδΕΥδ-Ο (δΕΟ ГО N0:63)
ΤΕΙΙΡ0Ι_ΡΕΥΡΕΡΡ0Ε[_ΕΝΝ-0 (δΕΟ ГО N0:64)
Следующие пептиды были сконструированы таким образом, что они содержат аминокислотную
- 54 022991 часть района кора, которая, согласно предсказанию, осуществляет контакт с ВМР-белками. Цистеин добавляли на С-конце каждого пептида для конъюгации с КЬН, и эти конъюгированные пептиды использовали для иммунизации. В Босктд Соге №!егтта1 РерИбе внутренний цистеин заменяли на серии во избежание двойной конъюгации с КЬН.
Для 808Τ человека:
Аминокислотная последовательность без добавленных остатков Сук:
Ооск1пд_Соге_М4егт1па1_Рер110е: ΙΡΟΡΥΗΑΟΗνθΙ_1_ΟΡΟΟΕΑΡ (ЗЕО Ю
N0:66)
Ооск1пд_Соге_С-1егт1па1_Рер11с1е: ОНСРООЕАРРАРКУРЬУАЗ (8Е0 Ю
N0:67)
Аминокислотная последовательность с добавленными остатками Сук:
Ооск1пд_Соге_^1егт!па1_Рер11с1е: 1Р0РУРА0Р\/01_1_СР00ЕАР-С (ЗЕО Ю
N0:68)
Ооск1пд_Соге_С4егт(па1_Рер|10е: ОНСРОСЕАРВАРКХ/КкУАЗ-С (ЗЕО Ю
N0:69)
Для 808Τ крысы:
Аминокислотная последовательность без добавленных или замененных остатков Сук:
Ооск1пд_Соге_^1егггппа1_Рерй0е: ΙΡ0ΗΥΡΑ0Ην01Ι_5Ρ00 (ЗЕО Ю N0:70) Ооск1пд_Соге_С4ептнпа1_Рерйс1е: Ρ00ΑΑΡΡ5ΡΚνΡΙ_νΑ3 (ЗЕО Ю N0:71)
Пептидные иммуногены с добавленными или замененными остатками Суз: Ооск1пд_СогеЦ\1-1егггнпа1_Рерйс1е: ΙΡ0ΡΥΡΑ0Ρν0Ι_1.3ΡΟ(3-0 (ЗЕО Ю N0:72) Ооск1пд_Соге_С-1егт1па1_Рер11с1е: Ρ00ΑΑΡΡ3ΡΚνΡΙ_νΑ3-0 (ЗЕО Ю N0:73)
Два района в 808Τ, которые потенциально взаимодействуют с образованием гомодимеров 808Τ, включают аминокислоты с районом кора 808Τ, которые не присутствуют в №§§т. Пептиды 808Τ человека, сконструированные таким образом, что они содержат эту последовательность, имели С-концевой Сук или Ν-концевой Сук, который был конъюгирован с КЬН. Для пептида 808Τ крысы цистеин добавляли к карбокси-концу последовательности (8Е^ ΙΌ N0:76). Конъюгированные с КЬН пептиды использовали для иммунизации.
Для 808Τ человека:
0(3ΡΑΡΙ_ί_ΡΝΑΙ0Η6Κν\Λ/νΡΡ5 (ЗЕО Ю N0:74) 1ОРСЗК\МЛ/РРЗОРОРРС (ЗЕО Ю N0:75)
Для 808Τ крысы:
ΡΝΑΙΟΡνκννννΡΡΝΟΡϋΡΡ (ЗЕО Ю N0:76) Пептид ЗО5Т крысы с добавленным цистеином ΡΝΑΙΟΡνκννννΡΡΝΟΡϋΡΡ-Ο (ЗЕО Ю N0:77)
Второй район в 808Τ, который потенциально взаимодействует с образованием гомодимеров 808Τ, включает С-концевой район. Пептидные иммуногены конструировали таким образом, чтобы они включали аминокислотные последовательности в этом районе (см. ниже). Для конъюгации с КЬН добавляли остаток цистеина к С-концевой стороне, и эти конъюгированные пептиды использовали для иммунизации.
Для 808Τ человека:
ΚΡίΤΡΡΗΝΟδ ΕΙ_ΚϋΡΟΤΕΑΑ (ЗЕО Ю N0:78) ΕίΚϋΡΘΤΕΑΑ РРОКСРКРРР (ЗЕО Ю N0:79) РРОКСРКРРР ΡΑΡ3ΑΚΑΝ0Α (ЗЕО Ю N0:80) ΡΑΡ3ΑΚΑΝ0Α ΕΙ.ΕΝΑΥ (ЗЕО Ю N0:81)
Пептидные иммуногены с Суз, добавленным на С-конце: ΚΡΙ.ΤΡΡΗΝ05 ЕЬКОРСТЕАА-С (ЗЕО Ю N0:82) ЕЬКОРСТЕАА РРОКСРКРРР-С (ЗЕО Ю N0:83) РРОКСРКРРР ΡΑΡδΑΚΑΝΟΑ-С (ЗЕО Ю N0:84) ΡΑΡ3ΑΚΑΝ0Α ΕΙ,ΕΝΑΥ-С (ЗЕО Ю N0:85)
- 55 022991
Для 8О8Т крысы:
ΚΒΙ_ΤΚΕΗΝΟ5ΕΙ_Κ0ΕΟΡΕΤΑΡΡΟ (ЗЕО Ю N0:86)
ΚΟΡΚΡΡΡΡΑΡΟΑΚΑΝΟΑΕΙ_ΕΝΑΥ (ЗЕО Ю N0:87)
ЗЕЬКОРСРЕТАРРОКСРКРРРРАР (ЗЕО Ю N0:88)
Пептидные иммуногены с Суз, добавленным на С-конце:
ΚΡΙ_ΤΡΡΗΝ03ΕΙ_Κ0Ρ0ΡΕΤΑΡΡ0-0 (ЗЕО Ю N0:89)
ΚΟΡΚΡΠΡΠΑΡΟΑΚΑΝΟΑΕΙ_ΕΝΑΥ-0 (ЗЕО Ю N0:90)
ЗЕЬКОРОРЕТАРРОКСРКРРРРАР-С (ЗЕО Ю N0:91)
Пример 14. Анализ для детектирования связывания антител с ТОР-бета связывающим белком
Этот пример описывает анализ для детектирования связывания лиганда, например, антитела или фрагмента антитела, со склеростином.
Слитый белок РЕАО®-склеростин получали в соответствии с протоколами, обеспеченными изготовителем (81§та А1бг1ск, 8!. Ьошк, МО), и как описано в Патенте США № 6395511. Каждую лунку 96луночного микротитрационного планшета покрывают моноклональным антителом против РЬАО® (8ΐ§та АМп'ск) и затем блокируют 10% БСА в ФСБ. Слитый белок (20 нг) добавляют к 100 мкл ФСБ/0,2% БСА и адсорбируют на 96-луночном планшете в течение 60 мин при комнатной температуре. Этот раствор белка удаляют и лунки промывают для удаления несвязанного слитого белка. ВМР, например, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6 или ВМР-7, разводят в ФСБ/0,2% БСА и добавляют в каждую лунку при концентрациях в диапазоне 10 пМ - 500 нМ. После инкубирования в течение 2 ч при комнатной температуре этот раствор для связывания удаляют, и планшет промывают три раза 200 мкл ФСБ/0,2% БСА. Связывание ВМР со склеростином детектируют с использованием поликлональной сыворотки или моноклонального антитела, специфических в отношении ВМР, и подходящего фермент-конъюгированного реагента второй стадии в соответствии со стандартными способами ЕЫ8А (см., например, АикиЬе1 е! а1., Сиггеп! Рго!осо1к ΐη Мо1 В1о1. Уо1 2 11.2.1-11.2.22 (1998)). Специфическое связывание рассчитывают вычитанием неспецифического связывания из общего связывания и анализируют с использованием программы ЫОАЖ) (Мипкоп апб РобЬагб, Апа1. Вюскет. 107:220-39 (1980)).
Связывание склеростина с ВМР детектируют также гомогенным детектированием с разделенной во времени флуоресценцией (Ме11ог е! а1., I Вюто1. 8сгеепт§, 3:91-99 (1998)). Полинуклеотидную последовательность, кодирующую склеростин, функционально связывают с константной областью иммуноглобулина человека в рекомбинантной конструкции нуклеиновой кислоты и экспрессируют в виде слитого белка Рс человека-склеростин в соответствии со способами, известными в данной области и описанными здесь. Подобным образом, лиганд ВМР конструируют и экспрессируют в виде слитого белка ВМРмышиный Рс. Эти два слитых белка инкубируют вместе и анализ проводят, как описано Ме11ог е! а1.
Пример 15. Анализ-скрининг на антитела, которые ингибируют связывание членов ТОР-бетасемейства с ТОР-связывающим белком
Этот пример описывает способ для детектирования антитела, которое ингибирует связывание члена ТОР-бета-семейства со склеростином. ЕЫ8А выполняют по существу как описано в примере 14, за исключением того, что концентрацию ВМР поддерживают фиксированной при ее Ко (определенной, например, анализом ШАсоге). Кроме того, антитело или библиотеку или коллекцию антител добавляют в лунки до концентрации 1 мкМ. Антитела инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре с ВМР и склеростином, раствор удаляют и связанный ВМР определяют количественно, как описано (см. пример 14). Антитела, которые ингибируют 40% связывания ВМР, наблюдаемого в отсутствие антитела, считают антагонистами этого взаимодействия. Эти антитела дополнительно оценивают в качестве потенциальных ингибиторов выполнением исследований с титрованием для определения их констант ингибирования и их действия на связывающую аффинность ТОР-бета-связывающего белка. Анализы контролей сравнимой специфичности могут быть также проведены для установления профиля селективности для идентифицированного антагониста с использованием анализов, зависимых от действия лиганда ВМР (например, конкурентного исследования с использованием ВМР/ВМР-рецептора).
Пример 16. Ингибирование локализации ТОР-БЕТА-связывающего белка в матриксе кости
Оценку ингибирования локализации в матриксе кости (гидроксиапатите) проводят с использованием модификаций в отношении способа Николаса (№со1ак, V. СаЫГ Т1ккие Ы. 57:206-12 1995). Вкратце, ^-меченый ТОР-бета-связывающий белок получают, как описано №со1ак (кирга). В каждую лунку 96луночного планшета, снабженную полипропиленовой фильтрующей мембраной (Ро1уй1!гошс, Vеутои!к МА), добавляют гидроксиапатит. ТОР-бета-связывающий белок, разведенный в 0,2% альбумине в ФСБ, затем добавляют в лунки. Лунки, содержащие матрикс, промывают 3 раза 0,2% альбумином в ФСБ. Адсорбированный ТОР-бета-связывающий белок элюируют с использованием 0,3 М ЖО11 и затем определяют количественно.
Антитело, которое ингибирует или нарушает связывание ТОР-бета-связывающего белка склеростина с гидроксиапатитом, идентифицируют посредством инкубирования ТОР-бета-связывающего белка с этим антителом и нанесением этой смеси на матрикс, описанный выше. Матрикс промывают 3 раза 0,2%
- 56 022991 альбумином в ФСБ. Адсорбированный склеростин элюируют с использованием 0,3 М №0Н и затем определяют количественно. Антитело, которое ингибирует уровень связывания склеростина с гидроксиапатитом по меньшей мере на 40% по сравнению с уровнем связывания, наблюдаемого в отсутствие антитела, считают ингибиторами локализации в кости. Такое антитело дополнительно характеризуют посредством исследований доза-ответ для определения его константы ингибирования и его влияния на связывающую аффинность ТОР-бета-связывающего белка.
На основании вышеизложенного, хотя конкретные варианты осуществления данного изобретения были описаны для целей иллюстрации, различные модификации могут быть произведены без отклонения от идеи и объема данного изобретения. Таким образом, данное изобретение не ограничивается ничем, за исключением прилагаемой формулы изобретения.

Claims (13)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с полипептидом склеростина, включающим аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ГО N0: 46, где указанные антитело или фрагмент связываются с последовательностью аминокислот в пределах аминокислот 57-146 из ЗЕО ГО N0: 46 и способны увеличивать плотность минеральных веществ кости или содержание минеральных веществ в кости у млекопитающего.
  2. 2. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которые специфично связываются по меньшей мере с четырьмя последовательными аминокислотами в пределах аминокислот 57-146 из ЗЕО ГО N0: 46.
  3. 3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, которые связываются с полипептидом склеростина, включающим аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ГО N0: 46, с аффиностью Кс, равной или меньшей чем 10-6 М, равной или меньшей чем 10-7 М, равной или меньшей чем 10-8 М.
  4. 4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов, где антитело является поликлональным или моноклональным.
  5. 5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов, где антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело или химерное антитело.
  6. 6. Антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов, выбранный из Р(аЬ')2, РаЬ, РаЬ', Рб и Ру.
  7. 7. Клетка-хозяин, такая как гибридомная клетка, способная продуцировать или экспрессировать антитело или фрагмент по любому из предшествующих пунктов.
  8. 8. Полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6.
  9. 9. Применение клетки-хозяина по п.7 для продуцирования или экспрессии указанных антитела или фрагмента.
  10. 10. Композиция, включающая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.16 и физиологически приемлемый носитель.
  11. 11. Применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-6 для увеличения содержания минеральных веществ в кости и/или плотности минеральных веществ кости у теплокровных животных или человека.
  12. 12. Применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента по п.11 в лечении остеопении, остеопороза, перелома, ахондроплазии, ключично-черепного дизостоза, эхондроматоза, фиброзной дисплазии, болезни Гоше, гипофосфатемического рахита, синдрома Марфана, множественных наследственных экзостозов, нейрофиброматоза, несовершенного остеогенеза, остеопетроза, остеопойкилоза, склеротических повреждений, периодонтального заболевания, псевдоартроза или пирогенного остеомиелита.
  13. 13. Применение по п.12, где остеопения вызвана анемичным состоянием, стероидами, гепарином, нарушением костного мозга, цингой, нарушением питания, недостатком кальция, идиопатическим остеопорозом, врожденной остеопенией или остеопорозом, алкоголизмом, хроническим заболеванием печени, старостью, постменструальным состоянием, олигоменореей, аменореей, беременностью, сахарным диабетом, гипертиреоидизмом, болезнью Кушинга, акромегалией, гипогонадизмом, неподвижностью или бездействием, синдромом симпатической рефлекторной дистрофии, временным локальным остеопорозом или остеомаляцией.
EA201001528A 2003-06-16 2004-06-15 Антитело к склеростину и его применение EA022991B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/463,190 US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2003-06-16 Compositions and methods for increasing bone mineralization

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201001528A1 EA201001528A1 (ru) 2011-06-30
EA022991B1 true EA022991B1 (ru) 2016-04-29

Family

ID=33563705

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200600037A EA014525B1 (ru) 2003-06-16 2004-06-15 Антитела к склеростину и способы их применения
EA201001528A EA022991B1 (ru) 2003-06-16 2004-06-15 Антитело к склеростину и его применение

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200600037A EA014525B1 (ru) 2003-06-16 2004-06-15 Антитела к склеростину и способы их применения

Country Status (25)

Country Link
US (3) US20040009535A1 (ru)
EP (3) EP2341071A1 (ru)
JP (2) JP4818107B2 (ru)
KR (1) KR101221147B1 (ru)
CN (2) CN103319596A (ru)
AU (1) AU2004253870B2 (ru)
BR (1) BRPI0411535A (ru)
CA (1) CA2529578C (ru)
CY (1) CY1114701T1 (ru)
DK (1) DK1638999T3 (ru)
EA (2) EA014525B1 (ru)
ES (1) ES2428767T3 (ru)
HK (1) HK1088907A1 (ru)
HR (1) HRP20131014T1 (ru)
IL (2) IL172599A (ru)
ME (2) MEP3108A (ru)
NO (1) NO20060235L (ru)
NZ (1) NZ544617A (ru)
PL (1) PL1638999T3 (ru)
PT (1) PT1638999E (ru)
RS (1) RS52769B (ru)
SG (1) SG185824A1 (ru)
SI (1) SI1638999T1 (ru)
WO (1) WO2005003158A2 (ru)
ZA (1) ZA200600384B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2651091C1 (ru) * 2016-12-22 2018-04-18 Федеральное Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СПбГПМУ Минздрава России) Способ диагностики остеомиелита у детей

Families Citing this family (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
NZ552959A (en) 1998-11-27 2008-06-30 Darwin Discovery Ltd Compositions and methods for increasing bone mineralization
US7332276B2 (en) * 2002-03-01 2008-02-19 Celltech R&D, Inc. Methods to increase or decrease bone density
US7193069B2 (en) 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
AU2003221841A1 (en) 2002-04-03 2003-10-27 Celltech R And D, Inc. Association of polymorphisms in the sost gene region with bone mineral density
US7893218B2 (en) 2003-06-16 2011-02-22 Stowers Institute For Medical Research Antibodies that specifically bind SOST peptides
US7585501B2 (en) 2002-06-14 2009-09-08 Stowers Institute For Medical Research Compositions and methods for treating kidney disease
AU2003276430A1 (en) 2002-06-14 2003-12-31 Stowers Institute For Medical Research Wise/sost nucleic acid sequences and amino acid sequences
EP1636270B1 (en) 2003-06-16 2016-07-20 UCB Pharma S.A. Antibodies specific for sclerostin and methods for increasing bone mineralization
US9046537B2 (en) 2003-09-22 2015-06-02 Enzo Biochem, Inc. Method for treating inflammation by administering a compound which binds LDL-receptor-related protein (LRP) ligand binding domain
US8637506B2 (en) * 2003-09-22 2014-01-28 Enzo Biochem, Inc. Compositions and methods for bone formation and remodeling
US8461155B2 (en) * 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
US20100041599A1 (en) * 2006-11-14 2010-02-18 Dakai Liu Compositions and methods for bone formation, bone remodeling and toxin protection
US8367822B2 (en) 2003-09-22 2013-02-05 Enzo Therapeutics, Inc. Compositions and methods for bone formation and remodeling
US8343922B2 (en) * 2004-05-19 2013-01-01 Enzo Biochem, Inc. Compositions and methods for the stimulation or enhancement of bone formation and the self-renewal of cells
US9052324B2 (en) 2004-05-19 2015-06-09 Enzo Biochem, Inc. Compounds and assays for controlling Wnt activity
US9045553B2 (en) 2004-05-27 2015-06-02 Acceleron Pharma, Inc. Cerberus/Coco derivatives and uses thereof
US20100183695A1 (en) 2004-05-27 2010-07-22 John Knopf Cerberus/coco derivatives and uses thereof
CA2891010C (en) 2004-07-23 2022-09-20 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions
ITMI20050739A1 (it) * 2005-04-22 2006-10-23 Effebi Spa Piastrina di connsessione valvola-attuatore
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
US7592429B2 (en) * 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
US7998500B2 (en) * 2005-08-04 2011-08-16 Vertical Pharmaceuticals, Inc. Nutritional supplement for women
US8202546B2 (en) * 2005-08-04 2012-06-19 Vertical Pharmaceuticals, Inc. Nutritional supplement for use under physiologically stressful conditions
US7901710B2 (en) * 2005-08-04 2011-03-08 Vertical Pharmaceuticals, Inc. Nutritional supplement for use under physiologically stressful conditions
US8263137B2 (en) * 2005-08-04 2012-09-11 Vertical Pharmaceuticals, Inc. Nutritional supplement for women
CN105001320A (zh) 2005-11-23 2015-10-28 阿塞勒隆制药公司 Activin-ActRIIa拮抗剂及其促进骨骼生长的应用
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
WO2007124486A2 (en) * 2006-04-21 2007-11-01 Childrens Hospital Los Angeles Bmp4 inhibitors
US20100015665A1 (en) * 2006-11-10 2010-01-21 Ucb Pharma S.A. Antibodies and diagnostics
WO2008061013A2 (en) * 2006-11-10 2008-05-22 Amgen Inc. Antibody-based diagnostics and therapeutics
CA2671983A1 (en) 2006-12-08 2009-06-19 Acceleron Pharma Inc. Uses of cerberus, coco and derivatives thereof
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
EP2144613B1 (en) 2006-12-29 2018-03-21 OstéoQC Inc. Methods of altering bone growth by administration of sost or wise antagonist or agonist
KR20140137463A (ko) 2007-02-01 2014-12-02 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒⅱａ 길항제 및 유방암을 치료 또는 예방하기 위한 이들의 용도
TW201803890A (zh) 2007-02-02 2018-02-01 艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
TWI606062B (zh) 2007-02-09 2017-11-21 艾瑟勒朗法瑪公司 包含ＡｃｔＲＩＩａ-Ｆｃ融合蛋白的醫藥組合物；ＡｃｔＲＩＩａ-Ｆｃ融合蛋白於治療或預防與癌症相關的骨質流失之用途；ＡｃｔＲＩＩａ-Ｆｃ融合蛋白於治療或預防多發性骨髓瘤之用途
US7744874B2 (en) 2007-03-20 2010-06-29 Eli Lilly And Company Anti-sclerostin antibodies
US8133553B2 (en) 2007-06-18 2012-03-13 Zimmer, Inc. Process for forming a ceramic layer
US8309521B2 (en) 2007-06-19 2012-11-13 Zimmer, Inc. Spacer with a coating thereon for use with an implant device
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
WO2009038745A1 (en) 2007-09-18 2009-03-26 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for decreasing or inhibiting fsh secretion
US8608049B2 (en) 2007-10-10 2013-12-17 Zimmer, Inc. Method for bonding a tantalum structure to a cobalt-alloy substrate
AR068767A1 (es) 2007-10-12 2009-12-02 Novartis Ag Anticuerpos contra esclerostina, composiciones y metodos de uso de estos anticuerpos para tratar un trastorno patologico mediado por esclerostina
CA2707400A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-25 Amgen Inc. Method for treating bone fracture with anti-sclerostin antibodies
JPWO2009110215A1 (ja) * 2008-03-03 2011-07-14 独立行政法人科学技術振興機構 繊毛細胞の分化誘導方法
WO2010002835A2 (en) * 2008-07-03 2010-01-07 Osteogenex, Inc. Vinpocetine and eburnamonine derivatives for promoting bone growth
HUE051137T2 (hu) 2008-08-14 2021-03-01 Acceleron Pharma Inc GDF-csapdák
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
US8138142B2 (en) 2009-01-13 2012-03-20 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin in a patient in need thereof
NZ594481A (en) * 2009-02-06 2012-09-28 Pepscan Systems Bv Truncated cystine-knot proteins
EP3058986B1 (en) * 2009-03-30 2018-05-09 Acceleron Pharma Inc. Bmp-alk3 antagonists and uses for promoting bone growth
WO2010115932A1 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Novartis Ag Combination for the treatment of bone loss
WO2010130830A2 (en) * 2009-05-15 2010-11-18 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against sclerostin and polypeptides comprising the same for the treatment of bone diseases and disorders
KR20120049214A (ko) 2009-06-08 2012-05-16 악셀레론 파마 인코포레이티드 발열성 지방세포를 증가시키는 방법
EP3805259A1 (en) 2009-06-12 2021-04-14 Acceleron Pharma Inc. Truncated actriib-fc fusion proteins
ES2658292T3 (es) 2009-11-17 2018-03-09 Acceleron Pharma, Inc. Proteínas ActRIIB y variantes y usos de las mismas con respecto a la inducción de la utrofina para el tratamiento de la distrofia muscular
CA2795886A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Novartis Ag Methods and compositions for improving implant osseointegration
DK3195880T3 (da) 2010-05-14 2020-03-02 Amgen Inc Højkoncentrerede anti-sclerostin-antistofformuleringer
US9493541B2 (en) 2010-06-07 2016-11-15 Joshua Rabbani Antibodies specific for sulfated sclerostin
US9617323B2 (en) 2010-06-07 2017-04-11 Joshua Rabbani Sulfonated sclerostin, antibodies, epitopes and methods for identification and use therefor
US11167011B2 (en) 2010-06-07 2021-11-09 Enzo Biochem, Inc. Methods for treating bone loss using sclerostin peptides
US9403882B2 (en) 2010-06-07 2016-08-02 Joshua Rabbani Sulfation of Wnt pathway proteins
WO2013032527A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 The Regents Of The University Of California Llp2a-bisphosphonate conjugates for osteoporosis treatment
SG189138A1 (en) 2010-11-05 2013-05-31 Novartis Ag Methods of treating rheumatoid arthritis using il-17 antagonists
WO2012064771A1 (en) 2010-11-08 2012-05-18 Acceleron Pharma, Inc. Actriia binding agents and uses thereof
JP2014509588A (ja) 2011-03-01 2014-04-21 アムジエン・インコーポレーテツド 二特異性結合剤
SG10201701634PA (en) 2011-03-25 2017-04-27 Amgen Inc Anti - sclerostin antibody crystals and formulations thereof
FR2974061B1 (fr) 2011-04-13 2013-06-07 Michelin Soc Tech Procede et dispositif de comptage du nombre d'atterrissages d'un pneumatique d'un aeronef
LT3404041T (lt) 2011-04-19 2020-08-25 Amgen Inc. Osteoporozės gydymo būdas
JP2014515759A (ja) 2011-04-29 2014-07-03 ノバルティス アーゲー 扁平上皮がんを治療する方法関連出願
US8895254B2 (en) * 2011-07-19 2014-11-25 University Health Network Biomarkers for ankylosing spondylitis
ES2667554T3 (es) 2011-08-04 2018-05-11 Amgen Inc. Método para el tratamiento de los defectos de espacio óseo
SG10201509629QA (en) 2011-12-28 2015-12-30 Amgen Inc Method Of Treating Alveolar Bone Loss Through The Use Of Anti-Sclerostin Antibodies
JP6770312B2 (ja) 2012-07-05 2020-10-14 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 骨疾患の治療
CN104936605A (zh) 2012-11-02 2015-09-23 细胞基因公司 激活素-actrii拮抗剂和用于治疗骨和其它病症的用途
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
WO2014118705A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 Novartis Ag Methods of treating chronic kidney disease-mineral and bone disorder using sclerostin antagonists
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
MY172324A (en) 2013-03-20 2019-11-21 Genzyme Corp Methods for treating osteogenesis imperfecta
WO2014155278A2 (en) 2013-03-26 2014-10-02 Novartis Ag Methods of treating autoimmune diseases using il-17 antagonists
BR112016029226A2 (pt) 2014-06-13 2017-10-17 Acceleron Pharma Inc métodos e composições para o tratamento de úlceras
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
WO2016090077A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Celgene Corporation Activin-actrii antagonists and uses for treating anemia
MA41142A (fr) 2014-12-12 2017-10-17 Amgen Inc Anticorps anti-sclérostine et utilisation de ceux-ci pour traiter des affections osseuses en tant qu'élements du protocole de traitement
GB201510758D0 (en) 2015-06-18 2015-08-05 Ucb Biopharma Sprl Novel TNFa structure for use in therapy
GB201604124D0 (en) 2016-03-10 2016-04-27 Ucb Biopharma Sprl Pharmaceutical formulation
US20190185556A1 (en) 2016-08-08 2019-06-20 Amgen Inc. Method of improving connective tissue attachment using anti-sclerostin antibodies
GB201621907D0 (en) * 2016-12-21 2017-02-01 Ucb Biopharma Sprl And Sanofi Antibody epitope
KR20190096409A (ko) 2016-12-21 2019-08-19 메레오 바이오파마 3 리미티드 불완전 골형성증 치료에서의 항-스클레로스틴 항체의 용도
JP2020502218A (ja) 2016-12-21 2020-01-23 メレオ バイオファーマ ３ リミテッド 骨形成不全症の処置における抗スクレロスチン抗体の使用
JP7120531B2 (ja) * 2018-02-12 2022-08-17 アプタキュア セラピューティクス リミテッド スクレロスチンに対するアプタマー及びその使用
CA3093457A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Amgen Inc. C-terminal antibody variants
GB201810746D0 (en) 2018-06-29 2018-08-15 Mereo Biopharma 3 Ltd Use of sclerostin antagonist
CA3108693A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Ashutosh Sharma Method of preparing an antibody pharmaceutical formulation
MX2022001805A (es) 2019-08-12 2022-06-08 Amgen Inc Formulaciones de anticuerpos anti-esclerostina.

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000032773A1 (en) * 1998-11-27 2000-06-08 Darwin Discovery Ltd. Compositions and methods for increasing bone mineralization
WO2001092308A2 (en) * 2000-06-01 2001-12-06 Amgen, Inc. Cystine-knot polypeptides: cloaked-2 molecules and uses thereof
WO2003106657A2 (en) * 2002-06-14 2003-12-24 Stowers Institute For Medical Research Wise/sost nucleic acid sequences and amino acid sequences

Family Cites Families (160)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US751929A (en) 1904-02-09 Ash-pan
US793398A (en) 1905-03-24 1905-06-27 Herschel A Schermerhorn Fastening for wagon eng-gates.
US4018884A (en) 1975-06-26 1977-04-19 Hoffmann-La Roche Inc. Fluorogenic materials and labeling techniques
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
US4359535A (en) 1979-10-01 1982-11-16 George Pieczenik Autonomously replicating DNA containing inserted DNA sequences
US4528266A (en) 1979-10-01 1985-07-09 George Pieczenik Method of inserting unique DNA sequences into DNA vectors
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4486530A (en) 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4411993A (en) 1981-04-29 1983-10-25 Steven Gillis Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4427115A (en) 1981-10-19 1984-01-24 Laipply Thomas C One piece alcohol preparation device
US4579821A (en) 1981-11-23 1986-04-01 University Patents, Inc. Control of DNA sequence transcription
USRE32011E (en) 1981-12-14 1985-10-22 Scripps Clinic And Research Foundation Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies
JPS58117537A (ja) 1982-01-06 1983-07-13 Toray Ind Inc 感光性樹脂組成物
US4766075A (en) 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
US4543439A (en) 1982-12-13 1985-09-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of monoclonal antibodies to phosphotyrosine-containing proteins
US6054561A (en) 1984-02-08 2000-04-25 Chiron Corporation Antigen-binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens
DE3417525C1 (de) 1984-05-11 1986-01-09 Matter + Siegmann Ag, Wohlen Vorrichtung zur quantitativen und qualitativen Erfassung von kohlenwasserstoffhaltigen Schwebeteilchen in Gasen
US5288641A (en) 1984-06-04 1994-02-22 Arch Development Corporation Herpes Simplex virus as a vector
US5087571A (en) 1984-06-22 1992-02-11 President And Fellows Of Harvard College Method for providing a cell culture from a transgenic non-human mammal
US4736866B1 (en) 1984-06-22 1988-04-12 Transgenic non-human mammals
US5272254A (en) 1984-10-02 1993-12-21 Biogen Inc. Production of streptavidin-like polypeptides
WO1986002077A1 (en) 1984-10-02 1986-04-10 Meade Harry M Production of streptavidin-like polypeptides
US4801542A (en) 1984-10-12 1989-01-31 Zymogenetics, Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
SG64329A1 (en) 1984-11-16 1999-04-27 American Cyanamid Co Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US4902614A (en) 1984-12-03 1990-02-20 Teijin Limited Monoclonal antibody to human protein C
US4897255A (en) 1985-01-14 1990-01-30 Neorx Corporation Metal radionuclide labeled proteins for diagnosis and therapy
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
CA1293460C (en) 1985-10-07 1991-12-24 Brian Lee Sauer Site-specific recombination of dna in yeast
US4744981A (en) 1985-10-17 1988-05-17 Neorx Corporation Trichothecene antibody conjugates
US4935349A (en) 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
US5811128A (en) 1986-10-24 1998-09-22 Southern Research Institute Method for oral or rectal delivery of microencapsulated vaccines and compositions therefor
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US4851341A (en) 1986-12-19 1989-07-25 Immunex Corporation Immunoaffinity purification system
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
DE3854823T2 (de) 1987-05-01 1996-05-23 Stratagene Inc Mutagenesetest durch Verwendung von nicht menschlichen Lebewesen, die Test-DNS-Sequenzen enthalten
EP0623679B1 (en) 1987-05-21 2003-06-25 Micromet AG Targeted multifunctional proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
GB8723661D0 (en) 1987-10-08 1987-11-11 British Bio Technology Synthetic gene
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
EP0313873B1 (en) 1987-10-30 1994-09-28 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5254678A (en) 1987-12-15 1993-10-19 Gene Shears Pty. Limited Ribozymes
EP0329184A3 (en) 1988-02-19 1990-05-23 Neorx Corporation Antimers and antimeric conjugation
US4988496A (en) 1988-05-31 1991-01-29 Neorx Corporation Metal radionuclide chelating compounds for improved chelation kinetics
US5221778A (en) 1988-08-24 1993-06-22 Yale University Multiplex gene regulation
IL91501A (en) 1988-09-02 1998-03-10 Dyax Corp Generation of a variegated library of mutant potential binding proteins and screening of said library for proteins with a desired binding activity
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
CA1340323C (en) 1988-09-20 1999-01-19 Arnold E. Hampel Rna catalyst for cleaving specific rna sequences
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5096815A (en) 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
EP0832980B1 (en) 1989-01-23 2002-06-19 Chiron Corporation Recombinant therapies for infection and hyperproliferative disorders
GB8903022D0 (en) 1989-02-10 1989-03-30 Celltech Ltd Chemical compounds
US5175383A (en) 1989-02-17 1992-12-29 President And Fellows Of Harvard College Animal model for benign prostatic disease
US5549910A (en) 1989-03-31 1996-08-27 The Regents Of The University Of California Preparation of liposome and lipid complex compositions
DE69024953T3 (de) 1989-05-04 2005-01-27 Southern Research Institute, Birmingham Einkapselungsverfahren
GB8914543D0 (en) 1989-06-23 1989-08-09 Parker David Chemical compounds
AU648261B2 (en) 1989-08-18 1994-04-21 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
US5464764A (en) 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
KR920007887B1 (ko) 1989-08-29 1992-09-18 스즈키 지도오샤 고오교오 가부시키가이샤 내연기관의 배기가스 정화장치
GB8919607D0 (en) 1989-08-30 1989-10-11 Wellcome Found Novel entities for cancer therapy
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5359051A (en) 1990-01-11 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Compounds useful in the synthesis of nucleic acids capable of cleaning RNA
EP0438803B1 (en) 1990-01-26 1997-03-12 Immunomedics, Inc. Vaccines against cancer and infectious diseases
US5177197A (en) 1990-02-27 1993-01-05 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleotide sequence expressing human transforming growth factor-β1-binding protein
US5466468A (en) 1990-04-03 1995-11-14 Ciba-Geigy Corporation Parenterally administrable liposome formulation comprising synthetic lipids
ES2217250T3 (es) 1990-06-15 2004-11-01 Scios Inc. Mamifero transgenico, no humano que muestra la patologia de formacion amiloides de la enfermedad de alzheimer.
JP3218637B2 (ja) 1990-07-26 2001-10-15 大正製薬株式会社 安定なリポソーム水懸濁液
WO1992002551A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
JP2958076B2 (ja) 1990-08-27 1999-10-06 株式会社ビタミン研究所 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
JPH04141095A (ja) 1990-10-02 1992-05-14 Chemo Sero Therapeut Res Inst 組換え抗ｈｉｖ改変抗体および改変抗体の調製方法
US5070108A (en) 1990-10-12 1991-12-03 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of treating osteoporosis, increasing bone mineral content and preventing the occurrence of compression fractures in a mammal
AU662304B2 (en) 1990-10-22 1995-08-31 Fox Chase Cancer Center DNA construct for providing RNA therapy
US5145684A (en) 1991-01-25 1992-09-08 Sterling Drug Inc. Surface modified drug nanoparticles
US5399363A (en) 1991-01-25 1995-03-21 Eastman Kodak Company Surface modified anticancer nanoparticles
DE69233697T2 (de) 1991-03-01 2008-01-24 Dyax Corp., Cambridge Verfahren zur Entwicklung von bindenden Mikroproteinen
US6072039A (en) 1991-04-19 2000-06-06 Rohm And Haas Company Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
DE4135543A1 (de) 1991-10-28 1993-04-29 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinantes core-streptavidin
US5203975A (en) 1991-10-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for cathodic electrodeposition of a clear coating over a conductive paint layer
WO1993010218A1 (en) 1991-11-14 1993-05-27 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vectors including foreign genes and negative selective markers
GB9125623D0 (en) 1991-12-02 1992-01-29 Dynal As Cell modification
AU676150B2 (en) 1992-01-23 1997-03-06 Merck Patent Gmbh Monomeric and dimeric antibody-fragment fusion proteins
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
EP0578515A3 (en) 1992-05-26 1995-05-10 Bristol Myers Squibb Co Humanized monoclonal antibodies.
CA2136178A1 (en) 1992-05-29 1993-12-09 Vasantha Nagarajan Production of streptavidin from bacillus subtilis
WO1993025234A1 (en) 1992-06-08 1993-12-23 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for targeting specific tissue
EP0644946A4 (en) 1992-06-10 1997-03-12 Us Health VECTOR PARTICLES RESISTANT TO HUMAN SERUM INACTIVATION.
GB2269175A (en) 1992-07-31 1994-02-02 Imperial College Retroviral vectors
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
US5928647A (en) 1993-01-11 1999-07-27 Dana-Farber Cancer Institute Inducing cytotoxic T lymphocyte responses
IL108719A0 (en) 1993-02-25 1994-08-26 Ortho Pharma Corp Expression constructs containing hiv inhibitory antisense and other nucleotide sequences, retroviralvectors and recombinant retroviruses containing them
FR2702160B1 (fr) 1993-03-02 1995-06-02 Biovecteurs As Vecteurs particulaires synthétiques et procédé de préparation.
FR2704145B1 (fr) 1993-04-21 1995-07-21 Pasteur Institut Vecteur particulaire et composition pharmaceutique le contenant.
FR2705361B1 (fr) 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
CA2164505A1 (en) 1993-06-07 1994-12-22 Phillip W. Berman Hiv envelope polypeptides
WO1995002566A1 (en) 1993-07-16 1995-01-26 Ontogen Corporation Synthesis of combinatorial arrays of organic compounds through the use of multiple component combinatorial array syntheses
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
US5453492A (en) 1993-07-28 1995-09-26 La Jolla Cancer Research Foundation 60 kDa transforming growth factor-β-binding protein and its use to detect or purify TGF-β
AU7329394A (en) 1993-08-03 1995-02-28 Sphinx Pharmaceuticals Corporation A method for preparing and selecting pharmaceutically useful non-peptide compounds from a structurally diverse universal library
US5624803A (en) 1993-10-14 1997-04-29 The Regents Of The University Of California In vivo oligonucleotide generator, and methods of testing the binding affinity of triplex forming oligonucleotides derived therefrom
DE69433592T2 (de) 1993-11-09 2005-02-10 Targeted Genetics Corp., Seattle Die erzielung hoher titer des rekombinanten aav-vektors
CA2175078A1 (en) 1993-12-09 1995-06-15 Eduard Felder Process for the production of combinatorial compound libraries
JPH09506611A (ja) 1993-12-15 1997-06-30 コンビケム，インコーポレイテッド 組合わせライブラリーおよびその使用法
WO1995016712A1 (en) 1993-12-15 1995-06-22 Smithkline Beecham Corporation Compounds and methods
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
AU690656B2 (en) 1994-03-11 1998-04-30 Pharmacopeia Drug Discovery, Inc. Sulfonamide derivatives and their use
AU702163B2 (en) 1994-04-29 1999-02-18 Creative Biomolecules, Inc. Morphogenic protein-specific cell surface receptors and uses therefor
AU691296B2 (en) 1994-05-06 1998-05-14 Pharmacopeia Drug Discovery, Inc. Combinatorial dihydrobenzopyran library
US5549974A (en) 1994-06-23 1996-08-27 Affymax Technologies Nv Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof
US5792456A (en) 1994-08-04 1998-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Mutant BR96 antibodies reactive with human carcinomas
FR2723849B1 (fr) 1994-08-31 1997-04-11 Biovector Therapeutics Sa Procede pour augmenter l'immunogenicite, produit obtenu et composition pharmaceutique
US5463564A (en) 1994-09-16 1995-10-31 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties
US5846770A (en) 1994-11-22 1998-12-08 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding human chordin
US6057421A (en) 1994-11-30 2000-05-02 Immpheron, Inc. Variable heavy and light chain regions of murine monoclonal antibody 1F7
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
IE80468B1 (en) 1995-04-04 1998-07-29 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin
CA2220912A1 (en) 1995-06-05 1996-12-12 Gregg A. Hastings Human ccn-like growth factor
US5738868A (en) 1995-07-18 1998-04-14 Lipogenics Ltd. Liposome compositions and kits therefor
BR9710811A (pt) 1996-05-22 1999-08-17 Novopharm Biotech Inc Fragmentos de liga-Æo de antigeno que detecta especificamente c-lulas cancerigenas nucleotideos que codificam os fragmentos e o seu uso para a profilaxia e detec-Æo de c-nceres
US5989912A (en) 1996-11-21 1999-11-23 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US5989909A (en) 1997-09-26 1999-11-23 Millennium Biotherapeutics, Inc. Huchordin and uses thereof
WO1998046588A2 (en) 1997-04-11 1998-10-22 Neorx Corporation Compounds and therapies for the prevention of vascular and non-vascular pathologies
JP3614866B2 (ja) 1997-06-12 2005-01-26 リサーチ コーポレイション テクノロジーズ，インコーポレイティド 人工抗体ポリペプチド
US6075007A (en) 1997-07-17 2000-06-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified noggin polypeptide and compositions
CA2297109A1 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Genset 5' ests for secreted proteins expressed in muscle and other mesodermal tissues
US6815201B2 (en) 1997-09-08 2004-11-09 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. HIV-1 gp120 V1/V2 domain epitopes capable of generating neutralizing antibodies
KR100581991B1 (ko) 1998-02-12 2006-05-23 이뮨 컴플렉스, 코포레이션 변형된 ｂ형 간염 코어 단백질 및 이의 유도체
US6544485B1 (en) 2001-01-29 2003-04-08 Sharper Image Corporation Electro-kinetic device with enhanced anti-microorganism capability
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
DK1150918T3 (da) 1999-02-03 2004-12-20 Biosante Pharmaceuticals Inc Fremgangsmåde til fremstilling af terapeutiske calciumphosphatpartikler
JP2003501087A (ja) 1999-06-09 2003-01-14 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍の治療のための組成物と方法
JP4141095B2 (ja) 1999-10-29 2008-08-27 三洋電機株式会社 半導体装置とその製造方法
MXPA02008506A (es) 2000-03-02 2002-12-13 Amgen Inc Moleculas semejantes a chordin-2 y sus usos.
CA2412110A1 (en) 2000-06-19 2001-12-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Osteolevin gene polymorphisms
AU2002216610A1 (en) 2000-09-01 2002-04-02 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2374027A1 (en) 2001-03-13 2002-09-13 The Minister Of National Defence Cloning, expression, sequencing, and functional enhancement of monoclonal scfv antibody against venezuelan equine encephalitis virus(vee)
US20030186915A1 (en) 2002-02-11 2003-10-02 Yang Pan Regulatory polynucleotides and uses thereof
FR2838379B1 (fr) 2002-04-12 2005-06-24 Valeo Climatisation Dispositif de purification de l'air de l'habitacle d'un vehicule automobile
US7893218B2 (en) 2003-06-16 2011-02-22 Stowers Institute For Medical Research Antibodies that specifically bind SOST peptides
DE10255152A1 (de) 2002-11-26 2004-06-03 Von Langen Ursula Lang Schadstoffsauger
US20040141875A1 (en) 2003-01-15 2004-07-22 Rajiv Doshi System and method for treating microorganisms within motor vehicle heating, ventilation, and air conditioning units
EP1636270B1 (en) * 2003-06-16 2016-07-20 UCB Pharma S.A. Antibodies specific for sclerostin and methods for increasing bone mineralization
US7592429B2 (en) * 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
US7744874B2 (en) * 2007-03-20 2010-06-29 Eli Lilly And Company Anti-sclerostin antibodies
AR068767A1 (es) * 2007-10-12 2009-12-02 Novartis Ag Anticuerpos contra esclerostina, composiciones y metodos de uso de estos anticuerpos para tratar un trastorno patologico mediado por esclerostina

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000032773A1 (en) * 1998-11-27 2000-06-08 Darwin Discovery Ltd. Compositions and methods for increasing bone mineralization
US6495736B1 (en) * 1998-11-27 2002-12-17 Darwin Discovery, Ltd. Compositions and methods for increasing bone mineralization
WO2001092308A2 (en) * 2000-06-01 2001-12-06 Amgen, Inc. Cystine-knot polypeptides: cloaked-2 molecules and uses thereof
WO2003106657A2 (en) * 2002-06-14 2003-12-24 Stowers Institute For Medical Research Wise/sost nucleic acid sequences and amino acid sequences

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BALEMANS W. ET AL.: "INCREASED BONE DENSITY IN SCLEROSTEOSIS IS DUE TO THE DEFICIENCY OFA NOVEL SECRETED PROTEIN (SOST)", HUMAN MOLECULAR GENETICS, OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY, GB, vol. 10, no. 5, 2001, pages 537-543, XP001058218, ISSN: 0964-6906, the whole document *
BRUNKOW M. E. ET AL.: "BONE DYSPLASIA SCLEROSTEOSIS RESULTS FROM LOSS OF THE SOST GENE PRODUCT, A NOVEL CYSTINE KNON-CONTAINING PROTEIN", AMERICAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS, AMERICAN SOCIETY OF HUMAN GENETICS, CHICAGO, IL, US, vol. 68, no. 3, 2001, pages 577-589, XP001052847, ISSN: 0002-9297, fig. 6 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2651091C1 (ru) * 2016-12-22 2018-04-18 Федеральное Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СПбГПМУ Минздрава России) Способ диагностики остеомиелита у детей

Also Published As

Publication number Publication date
JP2011246482A (ja) 2011-12-08
US20100151524A1 (en) 2010-06-17
CA2529578A1 (en) 2005-01-13
EA201001528A1 (ru) 2011-06-30
ME00023B (me) 2010-06-10
HRP20131014T1 (hr) 2013-12-20
HK1088907A1 (en) 2006-11-17
JP2008505843A (ja) 2008-02-28
SG185824A1 (en) 2012-12-28
JP4818107B2 (ja) 2011-11-16
PT1638999E (pt) 2013-09-03
EP1638999A2 (en) 2006-03-29
IL172599A0 (en) 2006-04-10
CN103319596A (zh) 2013-09-25
US20040009535A1 (en) 2004-01-15
KR20060064568A (ko) 2006-06-13
BRPI0411535A (pt) 2006-08-01
ZA200600384B (en) 2008-10-29
WO2005003158A2 (en) 2005-01-13
ES2428767T3 (es) 2013-11-11
EP2338906A1 (en) 2011-06-29
CY1114701T1 (el) 2016-10-05
EP1638999B1 (en) 2013-07-24
EA014525B1 (ru) 2010-12-30
MEP3108A (xx) 2010-02-10
NZ544617A (en) 2009-11-27
EA200600037A1 (ru) 2006-06-30
US7578999B2 (en) 2009-08-25
SI1638999T1 (sl) 2013-12-31
DK1638999T3 (da) 2013-10-14
US7985834B2 (en) 2011-07-26
NO20060235L (no) 2006-03-14
CA2529578C (en) 2014-11-18
IL222756A0 (en) 2012-12-31
IL172599A (en) 2016-05-31
RS20050932A (en) 2008-11-28
US20060233801A1 (en) 2006-10-19
CN1835968B (zh) 2013-01-30
KR101221147B1 (ko) 2013-01-10
AU2004253870B2 (en) 2011-11-10
RS52769B (sr) 2013-10-31
WO2005003158A3 (en) 2005-05-26
AU2004253870A1 (en) 2005-01-13
CN1835968A (zh) 2006-09-20
PL1638999T3 (pl) 2014-04-30
EP2341071A1 (en) 2011-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA022991B1 (ru) Антитело к склеростину и его применение
EA015166B1 (ru) Иммуногенные пептиды склеростина (sost), индуцирующие образование специфических антител
ES2272093T5 (es) Composiciones y métodos para incrementar la mineralización de la substancia ósea
CN101641373B (zh) Dkk-1的特异性抗体
US20060252724A1 (en) Method and composition for modulating bone growth
WO1999033878A1 (fr) Anticorps monoclonal contre le facteur de croissance du tissu conjonctif et ses mises en applications medicales
ES2290072T3 (es) Anticuerpos frente a la proteina semp1, metodos para su produccion y usos de los mismos.
MXPA05013796A (en) Compositions and methods for increasing bone mineralization
AU2012200748A1 (en) Compositions and methods for increasing bone mineralization

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ MD