MXPA05013796A - Composiciones y métodos para aumentar la mineralizacion osea - Google Patents

Abstract

Se describe una nueva clase o familia de proteínas de unión TGF-ß. También se describen ensayos para seleccionar moléculas para aumentar la mineralizaciónósea y métodos para utilizar tales moléculas. En particular, se describen las composiciones y los métodos que se refieren a anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas de unión TGF-beta. Estos métodos y composiciones se refieren a la alteración de la densidad mineralósea al interferir con la interacción entre una proteína de unión TGF-beta esclerostina y un miembro de la súper familia TGF-beta particularmente una proteína morfogénicaósea. El aumento de la densidad mineralósea tiene usos en las enfermedades y condiciones en las cuales la baja densidad mineralósea tipifica la condición, tal como osteopenia, osteoporosis, y fracturasóseas.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA AUMENTAR LA MINERALIZACIÓN ÓSEA CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere generalmente a productos farmacéuticos y métodos y, más específicamente, a métodos y composiciones adecuadas para aumentar el contenido mineral del hueso. Tales composiciones y métodos pueden utilizarse para tratar una amplia variedad de condiciones incluyendo, por ejemplo, osteopenia, osteoporosis, fracturas, y otros desórdenes en los cuales la baja densidad mineral ósea es un distintivo de la enfermedad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Dos o tres distintas fases de cambios a la masa ósea se presentan durante la vida de un individuo (véase Riggs, West J. Med. 154:63-77 (1 991 )). La primera fase se presenta tanto en hombres como en mujeres y procede al logro de una masa ósea máxima. Esta primera fase se logra a través del crecimiento lineal de las placas de crecimiento endocrinas y crecimiento radial debido a una tasa de aposición periosteal. La segunda fase comienza alrededor de los 30 para el hueso trabecular (huesos planos tales como las vértebras y la pelvis) y alrededor de la edad 40 para el hueso cortical (por ejemplo, huesos largos encontrados en las extremidades) y continua hasta la edad avanzada. Esta fase se caracteriza por la lenta pérdida ósea y se presenta tanto en hombres como mujeres. En mujeres, una tercera fase de pérdida ósea también se presenta, más probablemente debido a las deficiencias de estrógeno post-menopaúsico. Durante esta fase sola, las mujeres pueden perder un adicional de 10% de masa ósea del hueso cortical y 25% del compartimiento trabecular (véase Riggs, supra). La pérdida de contenido mineral óseo puede originarse por una amplia variedad de condiciones y puede dar como resultado problemas médicos importantes. Por ejemplo, la osteoporosis es una enfermedad debilitante en humanos y se caracteriza por las reducciones marcadas en la masa ósea esquelética y la densidad mineral, deterioro estructural del hueso, incluyendo la degradación de la microarquitectura del hueso y aumentos correspondientes en fragilidad del hueso, y susceptibilidad a la fractura en individuos que la padecen. La osteoporosis en humanos se precede por osteopenia clínica (densidad mineral ósea que es mayor a una desviación estándar pero menor a 2.5 desviaciones estándar abajo del valor promedio para huesos de adulto joven), una condición encontrada en aproximadamente 25 millones de personas en los Estados Unidos. Otros 7-8 millones de pacientes en los Estados Unidos han sido diagnosticados con osteoporosis clínica (definida como contenido mineral óseo mayor a 2.5 desviaciones estándar abajo de aquel de huesos de adulto joven maduro). La osteoporosis es una de las enfermedades más caras para el sistema de cuidado de salud, costando decenas de billones de dólares anualmente en los Estados Unidos. Además de los costos relacionados al cuidado de la salud, el cuidado residencial a largo plazo, y los días de trabajo perdidos se agregan a los costos socales y financieros de esta enfermedad. A nivel mundial, aproximadamente 75 millones de personas se encuentran en riesgo de osteoporosis. La frecuencia de osteoporosis en la población humana aumenta con la edad. Entre los caucásicos, la osteoporosis es predominante en mujeres quienes, en los Estados Unidos, comprenden 80% del grupo de pacientes con osteoporosis. La fragilidad aumentada y la susceptibilidad a fractura de hueso esquelético en la edad avanzada se agrava por el riesgo mayor de caídas en esta población. Más de 1.5 millones de fracturas de hueso relacionadas a la osteoporosis se reportan en los Estados Unidos cada año. Las caderas, muñecas y vértebras fracturas se encuentran entre las lesiones más comunes asociadas con la osteoporosis. Las fracturas de cadera en particular son extremadamente incómodas y caras para el paciente, y para las mujeres, se correlacionan con las altas tasas de mortalidad y morbidez. A pesar de que la osteoporosis se ha considerado como un aumento en el riesgo de fractura debido a la masa ósea reducida, ninguno de los tratamientos actualmente disponibles para desórdenes esqueléticos pueden aumentar sustancialmente la densidad ósea de los adultos. Una fuerte percepción entre varios médicos es que se necesitan fármacos que puedan aumentar la densidad ósea en adultos, particularmente en los huesos de la muñeca; columna espinal, y cadera que se encuentran en riesgo de osteopenia y osteoporosis. Las estrategias actuales para la prevención de osteoporosis pueden ofrecer cierto beneficio a individuos pero no pueden asegurar la resolución de la enfermedad. Estas estrategias ¡ncluyen moderar la actividad física (particularmente en actividades que llevan peso) con el inicio de la edad avanzada, proporcionar calcio adecuado en la dieta, y evitar el consumo de productos que contengan alcohol o tabaco. Para los pacientes que presentan osteopenia clínica u osteoporosis, los fármacos terapéuticos actuales prevalentes y las estrategias se dirigen a reducir la pérdida adicional de masa ósea al inhibir el proceso de la absorción del hueso, un aspecto natural del proceso remodelador del hueso que se presenta constitutivamente. Por ejemplo, el estrógeno ahora se está prescribiendo para retardar la pérdida ósea. Sin embargo, existe cierta controversia sobre si los pacientes ganan cualquier beneficio a largo plazo y si el estrógeno tiene algún efecto en todos los pacientes de más de 75 años de edad. Además, se cree que el uso de estrógeno aumenta el riesgo de cáncer endometrial y de mama. Las altas dosis de calcio dietético, con o sin vitamina D, también se han sugerido para las mujeres postmenopáusicas. Sin embargo, las altas dosis de calcios frecuentemente pueden tener efectos secundarios gastrointestinales desagradables, y los niveles de calcio urinarios y de suero deben monitorearse continuamente (por ejemplo, Khosla y Rigss, Mayo Clin. Proc. 70:978-982, 1995). Otros procedimientos terapéuticos que se han sugerido incluyen calcitonina, bisfosfonatos, esteroides anabólicos y fluoruro sódico. Tales terapéuticos, sin embargo, frecuentemente se asocian con efectos secundarios indeseables (por ejemplo, la calcitonina y los esteroides pueden originar nausea y provocar una reacción inmune, los bísfosfonatos y fluoruro sódico pueden inhibir la reparación de fracturas, a pesar de que la densidad ósea aumente modestamente) que pueden descartar su uso eficaz (véase Khosla y Rigss, supra). Ninguna estrategia terapéutica actualmente practicada incluye un fármaco que estimule o mejore el crecimiento de nueva masa ósea. La presente invención proporciona composiciones y métodos que pueden utilizarse para aumentar la mineraiización ósea, y que por lo tanto pueden utilizarse para tratar una amplia variedad de condiciones en las cuales un aumento en la masa ósea es deseable. La presente invención también ofrece otras ventajas relacionadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Según se señala anteriormente, la presente invención proporciona una nueva clase o familia de proteínas de unión TGF-beta, así como también ensayos para seleccionar los compuestos que aumentan el contenido mineral óseo y densidad mineral ósea, los compuestos que aumentan el contenido mineral óseo y densidad mineral ósea y métodos para utilizar tales compuestos en el tratamiento o prevención de una amplia variedad de condiciones.

Dentro de un aspecto de la presente invención, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aislado, en donde dichas moléculas de ácido nucleico se seleccionan del grupo que consiste de (a) una molécula de ácido nucleico aislado que comprende la secuencia ID Nos. 1 , 5, 7, 9, 1 1 , 13, o, 15, o secuencia complementaria de las mismas; (b) una molécula de ácido nucleico aislado que hibridiza específicamente a la molécula de ácido nucleico de (a) bajo condiciones de alta rigurosidad; y (c) una molécula de ácido nucleico aislado que codifica una proteína de unión TGF-beta de acuerdo a (a) o (b). Dentro de los aspectos relacionados de la presente invención, se proporcionan las moléculas de ácido nucleico aislado en base a la hibridización a solamente una parte de una de las secuencias anteriormente identificadas (por ejemplo, para (a) la hibridización puede ser a un medidor de al menos 20, 25, 50, o 100 nucleótidos seleccionados de los nucleótidos 156 a 539 o 555 a 687 de Secuencia ID No. 1 ). Como deberá ser fácilmente evidente, la rigurosidad necesaria para utilizarse para hibridización puede variar en base al tamaño del medidor. Por ejemplo, para un medidor 25-mer de condiciones de alta rigurosidad podrían incluir: 60 mM de Tris pH 8.0, 2 mM de EDTA, 5x Denhardt's, 6x SSC, 0.1 % (p/v) de N-laurilsarcosina, 0.5% (p/v) NP-40 (nonidet P-40) durante la noche a 45 grados C, seguido por dos lavados con 0.2xSSC/0.1 % SDS a 45-50 grados. Para un medidor 100-mer bajo condiciones de baja rigurosidad, las condiciones adecuadas podrían incluir lo siguiente: 5x SSPE, 5x Denhardt's, y 0.5% de SDS durante la noche a 42-50 grados, seguido por dos lavados con 2x SSPE (o 2x SSC)/0.1 % de SDS a 42-50 grados. Dentro de los aspectos relacionados de la presente invención, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aislado que tienen homología a las Secuencias ID Nos. 1 , 5, 7, 9, 11 , 13, o 15, a un 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95%, o 98% de nivel de homología utilizando un algoritmo Wilbur-Lipman. Los ejemplos representativos de tales moléculas aisladas incluyen, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína comprendiendo Secuencia ID NOs. 2, 6, 10, 12, 14, o 16, o tienen homología a estas secuencias a un nivel de 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95%, o 98% de nivel de homología utilizando un algoritmo Lipman-Pearson. Las moléculas de ácido nucleico aisladas típicamente son menores a 100 Kb en tamaño, y, dentro de ciertas modalidades, menos de 50 b, 25kb, 10kb, o aún 5kb en tamaño. Además, las moléculas de ácido nucleico aislado, dentro de otras modalidades no existen en una "biblioteca" de otras moléculas de ácido nucleico no relacionado (por ejemplo, un subclon BAC tal como se describen en GenBank No. de acceso AC003098 y EMB No. AQ171546). Sin embargo, las moléculas de ácido nucleico aislado pueden encontrarse en bibliotecas de moléculas relacionadas (por ejemplo, para cambio, tal como se describe en Patentes de EE.UU. Nos. 5,837,458; 5,830,721 ; y 5,811 ,238). Finalmente, las moléculas de ácido nucleico aislado según se describe en la presente no incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican Dan, Cerberus, Gremlin, o SCGF (Patente de EE.UU. No. 5,780,263). También se proporcionan por la presente invención los vectores de clonación que contienen las moléculas de ácido nucleico anteriormente señaladas, y los vectores de expresión que comprenden un promotor (por ejemplo, una secuencia reguladora) unido operativamente a una de las moléculas de ácido nucleico anteriormente señaladas. Los ejemplos representativos de promotores adecuados incluyen promotores específicos de tejido, y promotores de base viral (por ejemplo, promotores con base CMV tales como CMV l-E, promotor temprano SV40, y MuLV LTR). Los vectores de expresión también pueden basarse en, o derivarse de virus (por ejemplo, un "vector viral"). Los ejemplos representativos de vectores virales incluyen vectores virales de herpes simple, vectores adenovirales, vectores virales asociados por adenovirus y vectores retrovirales. También se proporcionan las células huésped que contienen o que comprenden cualquiera de los vectores anteriormente señalados (incluyendo, por ejemplo, células huésped de origen humano, mono, perro, rata, o ratón). Dentro de otros aspectos de la presente invención, los métodos para producir las proteínas de unión TGF-beta se proporcionan, comprendiendo la etapa de cultivar el vector que contiene el huésped anteriormente mencionado bajo condiciones y por un tiempo suficiente para producir la proteína de unión TGF-beta. Dentro de las modalidades adicionales, la proteína producida por este método puede además purificarse (por ejemplo, por cromatografía de columna, purificación de afinidad, y lo similar). De allí, las proteínas aisladas que se codifican por las moléculas de ácido nucleico anteriormente mencionadas (por ejemplo, Secuencia ID NOs. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, o 16) o pueden producirse fácilmente dada la descripción de la solicitud objeto. También deberá señalarse que las proteínas anteriormente mencionadas, o fragmentos de las mismas, pueden producirse como proteínas de fusión. Por ejemplo, dentro de un aspecto se proporcionan las proteínas de fusión comprendiendo un primer segmento de polipéptido que comprende una proteína de unión TGF-beta codificada por una molécula de ácido nucleico según se describe anteriormente, o una parte de la misma de al menos 10, 20, 30, 50, o 100 aminoácidos en longitud, y un segundo segmento de polipéptido comprendiendo una proteína de unión no TGF-beta. Dentro de ciertas modalidades, el segundo polipéptido puede ser una etiqueta adecuada para la purificación o reconocimiento (por ejemplo, un polipéptido que comprende múltiples residuos de aminoácido aniónico - véase Patente de EE.UU. No. 4,851 ,341 ), un marcador (por ejemplo, proteína fluorescente verde, o fosfatasa alcalina), o una molécula tóxica (por ejemplo, ricina). Dentro de otro aspecto de la presente invención, se proporcionan anticuerpos que son capaces de unir específicamente la clase anteriormente descrita de proteínas de unión TGF- beta (por ejemplo, BEER humana). Dentro de varias modalidades, el anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, o un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, de origen murino o humano). Dentro de las modalidades adicionales, el anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo que retiene las características de unión de un anticuerpo total (por ejemplo, un fragmento F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, o Fv, o aún un CDR). También se proporcionan los hibridomas y otras células que son capaces de producir o expresar los anticuerpos anteriormente mencionados. Dentro de los aspectos relacionados de la invención, se proporcionan métodos para detectar una proteína de unión TGF-beta, comprendiendo las etapas de incubar un anticuerpo según se describe anteriormente bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir a dicho anticuerpo unirse a una proteína de unión TGF-beta, y detectar la unión. Dentro de varias modalidades, el anticuerpo puede unirse a un soporte sólido para facilitar el lavado o separación, y/o etiquetarse (por ejemplo, con un marcador seleccionado del grupo que consiste de enzimas, proteínas fluorescentes, y radioisótopos). Dentro de otros aspectos de la presente invención, se proporcionan oligonucleótidos que hibridizan a una molécula de ácido nucleico de acuerdo a Secuencia ID NOs. 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, o 18 o el complemento a la misma, bajo condiciones de alta rigurosidad. Dentro de las modalidades adicionales, el oligonucleótido puede encontrarse en la secuencia que codifica la Secuencia ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, o 16. Dentro de ciertas modalidades, el oligonucleótido es al menos 15, 20, 30, 50, o 100 nucleótidos en longitud. Dentro de las modalidades adicionales, el oligonucleótido se marca con otra molécula (por ejemplo, una enzima, molécula fluorescente, o radioisótopo). También se proporcionan los cebadores que son capaces de amplificar específicamente toda o una parte de las moléculas de ácido nucleico anteriormente mencionadas que codifican las proteínas de unión TGF-beta. Según se utiliza en la presente, el término "amplificar específicamente" deberá entenderse que se refiere a cebadores que amplifican las proteínas de unión TGF-beta anteriormente mencionadas, y no otras proteínas de unión TGF-beta tales como Dan, Cerberus, Gremlin, o SCGF (Patente de EE.UU. No. 5,780,263). Dentro de aspectos relacionados de la presente invención, se proporcionan métodos para detectar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de unión TGF-beta, comprendiendo las etapas para incubar un oligonucleótido según se describe anteriormente bajo condiciones de alta rigurosidad, y detectar la hibridización de dicho oligonucleótido. Dentro de ciertas modalidades, el oligonucleótido puede marcarse y/o unirse a un soporte sólido. Dentro de otros aspectos de la presente invención, se proporcionan ribozimas que son capaces de dividir el ARN que codifica una de las proteínas de unión TGF-beta anteriormente mencionadas (por ejemplo, Secuencia ID NOs. 2, 6, 8, 10, 12, 14, o 16). Tales ribozimas pueden componerse de ADN, ARN (incluyendo ácidos ribonucleicos 2'-O-metil), análogos de ácido nucleico (por ejemplo, ácidos nucleicos que tienen enlaces de fosforotioato) o mezclas de los mismos. También se propocionan las moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o cADN) que codifican estas ribozimas, y vectores que son capaces de expresar o producir los ribozimas. Los ejemplos representativos de vectores incluyen plásmidos, retrotransposones, cósmidos, y vectores con base viral (por ejemplo, vectores virales generados al menos en parte de un retrovirus, adenovirus, o virus adeno-asociado). También se propocionan las células huésped (por ejemplo, células de humano, perro, ratón, o rata) que contienen estos vectores. En ciertas modalidades, la célula huésped puede transformarse establemente con el vector. Dentro de aspectos adicionales de la invención, se proporcionan métodos para producir ribozimas ya sea sintéticamente, o por transcripción in Vitro o in vivo. Dentro de las modalidades adicionales, los ribozimas así producidos pueden purificarse además y/o formularse en composiciones farmacéuticas (por ejemplo, el ribozima o molécula de ácido nucleico que codifica el ribozima junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable o diluyente). De igual forma, los oligonucleótidos anti-sentido y anticuerpos u otras moléculas seleccionadas descritas en la presente pueden formularse en composiciones farmacéuticas. Dentro de otros aspectos de la presente invención, los oligonucleótidos anti-sentido se proporcionan comprendiendo una molécula de ácido nucleico que hibridiza a una molécula de ácido nucleico de acuerdo a Secuencia ID NOs. 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, o 15, o el complemento a la misma, y en donde dicho oligonucleótido inhibe la expresión de proteína de unión TGF-beta según se describe en la presente, (por ejemplo, BEER humana). Dentro de varias modalidades, el oligonucleótido es 15, 20, 25, 30, 35, 40, o 50 nucleótidos en longitud. Preferentemente, el oligonucleótido es menor a 100, 75, o 60 nucleótidos en longitud. Como deberá ser fácilmente evidente, el oligonucleótido puede comprenderse de uno o más análogos de ácido nucleico, ácidos ribonucleicos, o ácidos deoxiribonucleicos. Además, el oligonucleótido puede modificarse por uno o más enlaces, incluyendo, por ejemplo, enlace covalente tal como un enlace de fosforotioato, un enlace fosfotriéster, un enlace fosfonato metilo, un enlace metileno(metilimino), un enlace morfolino), un enlace amida, un enlace poliamida, un enlace entre-azúcar de alquilo de cadena corta, un enlace entre-azúcar de cicloalquilo, un enlace entre-azúcar heteroatómico de cadena corta y un enlace entre-azúcar heterocíclico. Un ejemplo representativo de un oligonucleótido quimérico se proporciona en la Patente de EE.UU. No. 5,989,912. Dentro de todavía otro aspecto de la presente invención, se proporcionan los métodos para aumentar la mineralización ósea, comprendiendo introducirse en un animal de sangre caliente una cantidad eficaz del ribozima según se describe anteriormente. Dentro de aspectos relacionados, tales métodos comprenden la etapa de introducir en un paciente una cantidad eficaz de la molécula de ácido nucleico o vector según se describe en la presente que es capaz de producir el ribozima deseado, bajo condiciones que favorecen la transcripción de la molécula de ácido nucleico para producir el ribozima. Dentro de otros aspectos de la invención, se proporcionan animales no humanos, transgénicos. Dentro de una modalidad se proporciona un animal transgénico cuyas células germinales y células somáticas contienen una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de unión TGF-beta según se describe anteriormente que se une operativamente a un promotor eficaz para la expresión del gen, el gen introduciéndose en el animal, o un ancestro del animal, en una etapa embriónica, con la condición de que dicho animal no sea humano. Dentro de otras modalidades, los animales de golpe transgénico se proporcionan, comprendiendo un animal cuyas células germinales y células somáticas comprenden una ruptura de al menos un alelo de una molécula de ácido nucleico endógena que hibridiza a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de unión TGF según se describe en la presente, en donde, la ruptura previene la transcripción de ARN mensajero de dicho alelo según se compara a un animal sin la ruptura, con la condición de que el animal no sea humano. Dentro de varias modalidades, la ruptura es una supresión, sustitución, o inserción de ácido nucleico. Dentro de otras modalidades, el animal transgénico es un ratón, rata, oveja, cerdo o perro. Dentro de los aspectos adicionales de la invención, se proporcionan equipos para la detección de la expresión de gen de proteína de unión TGF-beta, comprendiendo un contenedor que comprende una molécula de ácido nucleico, en donde la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste de (a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de SEQ ID NOs: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 100, o 101 ; (b) una molécula de ácido nucleico comprendiendo el complemento de la secuencia de nucleótido de (a); (c) una molécula de ácido nucleico que es un fragmento de (a) o (b) de la menos 15, 20 30, 50, 75, o, 100 nucleótidos en longitud. También se proporcionan equipos para la detección de una proteína de unión TGF-beta que comprenden un contenedor que comprende uno de los anticuerpos de la proteína de unión TGF-beta descritos en la presente. Por ejemplo, dentro de un aspecto de la presente invención se proporcionan métodos para determinar si una molécula seleccionada es capaz de aumentar el contenido mineral óseo, comprendiendo las etapas de (a) mezclar una o más moléculas candidato con la proteína de unión TGF-beta codificada por la molécula de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 1 y un miembro seleccionado de la familia de TGF-beta de las proteínas (por ejemplo, BMP 5 o 6), (b) determinar si la molécula candidato altera la señalización del miembro de familia TGF-beta, o altera la unión de la proteína de unión TGF-beta al miembro de familia TGF-beta. Dentro de ciertas modalidades, las moléculas alteran la habilidad de TGF-beta para funcionar como un regulador positivo de diferenciación de célula mesénquima. Dentro de este aspecto de la presente invención, la (s) molécula (s) candidato puede (n) alterar la señalización o unión por ejemplo, ya sea al reducir (por ejemplo, inhibir), o aumentar (por ejemplo, reforzar) la señalización o unión. Dentro de todavía otro aspecto, se proporcionan métodos para determinar si una molécula seleccionada es capaz de aumentar el contenido mineral óseo, comprendiendo la etapa de determinar si una molécula seleccionada inhibe la unión de la proteína de unión TGF-beta a hueso, o un análogo de la misma. Los ejemplos representativos de hueso o análogos del mismo incluyen hidroxipatita y muestras de hueso primario humano obtenida por biopsia. Dentro de ciertas modalidades de los métodos anteriormente citados, la molécula seleccionada se contiene dentro de una mezcla de moléculas y los métodos pueden además comprender la etapa de aislar una o más moléculas que son funcionales dentro del ensayo. Dentro de todavía otras modalidades, la familia TGF-beta de proteínas se une a un soporte sólido y la unión de proteína de unión TGF-beta se mide o la proteína de unión TGF-beta se unen a un soporte sólido y la unión de las proteínas de TGF-beta se mide. Al utilizar los métodos descritos tales como aquellos anteriormente describir una amplia variedad de moléculas pueden ensayarse por su habilidad para aumentar el contenido mineral óseo al inhibir la unión de la proteína de unión TGF-beta a la familia de proteínas de TGF-beta. Los ejemplos representativos de tales moléculas incluyen proteínas o péptidos, moléculas orgánicas, y moléculas de ácido nucleico. Dentro de otros aspectos relacionados de la invención, se proporcionan métodos para aumentar el contenido mineral óseo en un animal con sangre caliente, comprendiendo la etapa de administrar a un animal con sangre caliente una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula identificada de los ensayos citados en la presente. Dentro de otro aspecto, los métodos se proporcionan para aumentar el contenido mineral óseo en un animal con sangre caliente, comprendiendo la etapa de administrar a un animal con sangre caliente una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula que inhibe la unión de la proteína de unión TGF-beta a la súper familia de proteínas de TGF-beta, incluyendo las proteínas morfogénicas óseas (BMPs). Los ejemplos representativos de las moléculas adecuadas incluyen las moléculas antisentido, ribozimas, genes de ribozima, y anticuerpos (por ejemplo, un anticuerpo humanizado) que reconocen específicamente y alteran la actividad de la proteína de unión TGF-beta. Dentro de otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para aumentar el contenido mineral óseo en un animal con sangre caliente, comprendiendo las etapas de (a) introducir en las células que alojan al hueso un vector que dirige la expresión de una molécula que inhibe la unión de la proteína de unión TGF-beta a la familia de proteínas de TGF-beta y proteínas morfogénicas óseas (BMPs) y (b) administrar las células que contienen el vector a un animal con sangre caliente. Según se utiliza en la presente, deberá entenderse que las células "se alojan al hueso" si se ubican dentro del aglomerante de hueso después de la administración periférica. Dentro de una modalidad, tales métodos además comprenden, antes de la etapa de introducción, las células de aislamiento de la médula de hueso que se alojan al hueso. Dentro de una modalidad adicional, las células que se alojan al hueso se seleccionan del grupo que consiste de células CD34+ y osteoblastos. Dentro de otros aspectos de la presente invención, se proporcionan las moléculas (preferentemente aisladas) que inhiben la unión de la proteína de unión TGF-beta a la súper familia de proteínas de TGF-beta. Dentro de las modalidades adicionales, las moléculas pueden proporcionarse como una composición, y pueden además comprender un inhibidor de resorción de hueso. Los ejemplos representativos de tales inhibidores incluyen calcitonina, estrógeno, un bifosfonato, un factor de crecimiento que tiene actividad anti-resorción y tamoxifen. Los ejemplos representativos de las moléculas que pueden utilizarse en los contextos terapéuticos anteriormente mencionados incluyen, por ejemplo, ribozimas, genes de ribozima, moléculas antisentido, y/o anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanizados). Tales moléculas pueden depender de su selección, utilizarse para alterar, antagonizar, o agonizar la señalización o la unión de un miembro de familia de proteína de unión TGF-beta según se describe en la presente. Dentro de diversas modalidades de la invención, las moléculas anteriormente descritas y los métodos de tratamiento o prevención pueden utilizarse en condiciones tales como osteoporosis, osteomalasia, enfermedad periodontal, escorbuto, enfermedad de Cushing, fractura de hueso y condiciones debido a la inmovilización de la extremidad y uso de esteroides. La presente invención también proporciona anticuerpos que se unen específicamente a una proteína de unión TGF-beta, esclerostina (SOST), y proporciona inmunógenos que comprenden péptidos SOST derivados de regiones de SOST que interactúan con un miembro de la súper familia TGF-beta tal como una proteína morfogénica ósea. En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido esclerostina, dicho polipéptido esclerostina comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 2, 6, 8, 14, 46 o 65, en donde el anticuerpo inhibe competitivamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo l de BMP que comprende una secuencia de aminoácido establecida en GenBank Nos. de Acceso NM_004329 (SEQ ID NO: 102); D89675 (SEQ ID NO:103); NM_001203 (SEQ ID NO: 104); S75359 (SEQ ID NO: 105); NM_030849 (SEQ ID NO:106); D38082 (SEQ ID NO: 107); NP_001 194 (SEQ ID NO: 108); BAA19765 (SEQ ID NO: 109); o AAB33865 (SEQ ID NO: 110), y en donde el sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo II de BMP que comprende la secuencia de aminoácido establecida en GenBank Nos. de Acceso U251 10 (SEQ ID NO: 1 1 1 ); NM_033346 (SEQ ID NO.H 2); Z48923 (SEQ ID NO:1 14); CAA88759 (SEQ ID NO: 115); o NM_001204 (SEQ ID NO:113). En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, se une específicamente a un polipéptido esclerostina y que deteriora la formación de un homodímero esclerostina, en donde el polipéptido esclerostina comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 14, 46 o 65. En ciertas modalidades particulares de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En otras modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, el cual es de un ratón, humano, rata, o anticuerpo monoclonal de hámster. En otras modalidades de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. La invención además proporciona una célula huésped que produce el anticuerpo quimérico o humano. En ciertas modalidades, el fragmento de unión de antígeno del anticuerpo es un fragmento F(ab')2, Fab', Fd, o Fv. La invención también proporciona un anticuerpo que es un anticuerpo de cadena única y proporciona una célula huésped que es capaz de expresar el anticuerpo de cadena única. En otra modalidad, la invención proporciona una composición que comprende tales anticuerpos y un vehículo fisiológicamente aceptable. En otra modalidad, la invención proporciona un inmunógeno que comprende un péptido comprendiendo al menos 21 aminoácidos consecutivos y no más de 50 aminoácidos consecutivos de un polipéptido SOST, dicho polipéptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NOs:2, 6, 8, 14, 46 o 65, en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido SOST y que inhibe competitivamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en GenBank Nos. de Acceso: NM_004329 (SEQ ID NO: 1 02); D89675 (SEQ ID NO: 103); NM_001203 (SEQ ID NO: 104); S75359 (SEQ ID NO: 105); NM_030849 (SEQ ID NO: 106); D38082 (SEQ ID NO: 107); NP_001 194 (SEQ ID NO: 1 08); BAA19765 (SEQ ID NO: 109); o AAB33865 (SEQ ID NO: 1 10), y en donde el sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP es capaz de unirse a un Polipéptido de Receptor Tipo II de BMP que comprende la secuencia de aminoácido establecida en GenBank Nos. de Acceso U251 10 (SEQ ID NO: 1 1 1 ); NM_033346 (SEQ ID NO: 1 12); Z48923 (SEQ ID NO: 1 14); CAA88759 (SEQ ID NO: 1 15); o NM_001204 (SEQ ID NO: 1 13). La invención también proporciona un inmunógeno que comprende un péptido que comprende al menos 21 aminoácidos consecutivos y no más de 50 aminoácidos consecutivos de un polipéptido SOST, dicho polipéptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 2, 6, 8, 14, 46 o 65, en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido SOST y que deteriora la formación de un homodímero SOST. En ciertas modalidades particulares, los inmunógenos de la invención objeto se asocian con una molécula vehículo. En ciertas modalidades, la molécula vehículo es un polipéptido vehículo, y en modalidades particulares, el polipéptido vehículo es una lapa principal hemocianina. La presente invención también proporciona un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST, comprendiendo inmunizar un animal no humano con un inmunógeno que comprende un péptido comprendiendo al menos 21 y no más de 50 aminoácidos consecutivos de un polipéptido SOST, en donde (a) el polipéptido SOST comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO:2, 6, 8, 14, 46 o 65; (b) el anticuerpo inhibe competitivamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP, (c) el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo l de BMP, comprendiendo la secuencia de aminoácido establecida en GenBank Nos. de Acceso NM 304329 (SEQ ID NO.102); D89675 (SEQ ID NO.103); NMJD01203 (SEQ ID NO: 104); S75359 (SEQ ID NO: 105); NM_030849 (SEQ ID NO.106); D38082 (SEQ ID NO: 107); NP_001 194 (SEQ ID NO: 108); BAA19765 (SEQ ID NO: 109); o AAB33865 (SEQ ID NO: 1 10), y (d) el sitio de unión de Receptor Tipo I I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo II de BMP comprendiendo la secuencia de aminoácido establecida en GenBank Nos. de Acceso U251 10 (SEQ ID NO: 1 1 1 ); NM_033346 (SEQ ID NO.H 2); Z48923 (SEQ ID NO: 14); CAA88759 (SEQ ID NO: 1 15); o NM_001204 (SEQ ID NO: 1 13). En otra modalidad, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST, dicho polipéptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 2, 6, 8, 14, 46 o 65, comprendiendo inmunizar un animal no humano con un péptido de que comprende al menos 21 aminoácidos y no más de 50 aminoácidos de un polipéptido SOST, dicho polipéptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ I D NO:2, 6, 8, 14, 46 o 65, en donde el anticuerpo deteriora la formación de un homodímero SOST. Estos y otros aspectos de la presente invención llegarán a ser aparentes en referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos anexos. Además, los documentos que incluyen varias referencias establecidas en la presente que describen a mayor detalle ciertos procedimientos o composiciones (por ejemplo, plásmidos, etc.), se incorporan para referencia en su totalidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una ilustración esquemática que compara la secuencia de aminoácido de Dan Humano; Gremlin Humano; Cerebrus Humano y Beeer Humano. Las flechas indican el elemento principal de Cisteína. La Figura 2 resume los resultados obtenidos de la súper vivencia de una variedad de tejidos humanos para la expresión de un gen de proteína de unión TGF-beta, específicamente, el gen Beer humano. Se utilizó un Procedimiento de Reacción en Cadena de Polimerasa-Transcripción Inversa semi-cuantitativa (RT-PCR) para amplificar una parte del gen del cADN de primer filamento del ARN total (descrito a mayor detalle en el EJEMPLO 2A). Las Figuras 3A-3D resumen los resultados obtenidos de la hibridización in situ de ARN de secciones de embrión de ratón, utilizando un medidor de cADN que es complementario a la transcripción de Beer humano (descrito a mayor detalle en el EJEMPLO 2B). El panel 3A es una sección transversal de 10.5 dpc de embrión. El panel 3B es una sección sagital de 12.5 dpc de embrión y los paneles 3C y 3D son secciones sagitales de 15.5 dpc de embriones. Las Figuras 4A-4C ilustran, por análisis western blot, la especificidad de tres diferentes anticuerpos policlonales para sus antígenos respectivos (descritos a mayor detalle en el EJEMPLO 4).

La Figura 4A muestra la reactividad específica de un anticuerpo Beer anti-H para el antígeno Beer H., pero no Dan H. o Gremlin H. La Figura 4B muestra la reactividad de un anticuerpo Kremlin anti-H. para el antígeno Gremlin H, pero no Beer H. o Dan H. La Figura 4C muestra la reactividad de un anticuerpo Dan anti-H. para Dan H., pero no Beer H. o Gremlin H. La Figura 5 ilustra, por análisis western blot, la selectividad de la proteína de unión TGF-beta, Beer, para BMP-5 y BMP-6, pero no BMP-4 (descrita a mayor detalle en el EJEMPLO 5). La Figura 6 demuestra que la interacción iónica entre la proteína de unión TGF-beta, Beer, y BMP-5 tiene una constante de disociación en el rango de 15-30 nM. La Figura 7 presenta una alineación de la región que contiene el nudo de cisteína característico de un polipéptido SOST (esclerostina) y sus homólogos más cercanos. Tres enlaces de disulfuro que forman el nudo de cisteína se ilustran como líneas sólidas. Un enlace de disulfuro extra, mostrado por una línea punteada, es único para esta familia, la cual conecta dos puntas de ß-horquilla en la estructura 3D. Los polipéptidos representados son SOST: esclerostina (SEQ ID NO: 126); CCGHB: Gonadotropina Coriónica Humana o (SEQ ID NO:127); FSHB: subunidad beta de hormona estimuladora de folículo (SEQ ID NO: 128); TSHB: precursor de cadena beta de tirotropina (SEQ ID NO: 129); VWF: factor Von Willebrand (SEQ ID NO: 130); MUC2: precursor de mucina humana 2 (SEQ ID NO: 131 ); CER1 : Cerberus 1 (homologo Xenopus íaevis) (SEQ ID NO:132); DRM: gremiin (SEQ ID NO:133); DAN: (SEQ ID NO:134); CTGF: precursor de factor de crecimiento de tejido conectivo (SEQ ID NO: 135); NOV: NovH (homólogo de proteína de gen sobreexpresado de nefroblastoma) (SEQ ID NO: 136); CYR6: (SEQ ID NO: 137). La Figura 8 ilustra un modelo 3D de la región de núcleo de SOST (SOST_Núcleo). La Figura 9 presenta un modelo 3D de la región de núcleo de homodímero SOST. La Figura 10A y 10B proporciona una alineación de secuencia de aminoácido de Noggin de cinco diferentes animales: humano (NOGG_HUMANO (SEQ ID NO: 138); pollo (NOGG_POLLO, SEQ ID NO: 139); rana con garras africana (NOGG_XENLA, SEQ ID NO: 140); NOGG_FUGRU, SEQ ID NO: 141 ); y pez cebra (NOGG_ZEBRA, SEQ ID NO: 142); y SOST de humano (SOSTJHUMANO, SEQ ID NO:46), rata (SOST_RATA, SEQ ID NO:65), y ratón (SOST_Ratón, SEQ ID NO: 143). La Figura 1 1 ilustra la estructura de complejo Noggin/BMP-7. El homodímero BMP se muestra en la parte inferior de la figura en modo de superficie. El homodímero Noggin se muestra en la parte superior del dímero DMP en modo de caricatura. Los círculos señalan la región de unión de terminal N, la región de núcleo, y el enlazador entre las regiones de núcleo y de terminal N. La Figura 12 representa un modelo 3D del fragmento de unión de BMP potencial ubicado en la región de terminal N de SOS. Un dímero BMP se muestra en modo de superficie, y el fragmento de unión de BMP potencial se muestra en modo adhesivo. Un residuo de fenilalanina que se fija en una cavidad hidrofóbica en la superficie de BMP, se señala.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DEFINICIONES Antes de establecer la invención a detalle, puede ser útil para un entendimiento de la misma establecer definiciones de ciertos términos y enlistar y definir las abreviaturas que se utilizarán de aquí en adelante. "Molécula" deberá entenderse que ¡ncluye proteínas o péptidos (por ejemplo, anticuerpos, parejas de unión recombinante, péptidos con una afinidad de unión deseada), ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN, moléculas de ácido nucleico quimérico, y análogos de ácido nucleico tal como PNA); y compuestos inorgánicos u orgánicos. "TGF-beta" deberá entenderse que incluye cualquier nuevo o conocido miembro de la súper familia de TGF-beta, que también incluye las proteínas morfogénicas óseas (BMPs). "Receptor TGF-beta" deberá entenderse que se refiere al receptor específico para un miembro particular de la súper familia de TGF-beta (incluyendo proteínas morfogénicas óseas (BMPs)). "Proteína de unión TGF-beta" deberá entenderse que se refiere a una proteína con afinidad de unión específica para un miembro particular o subgrupo de miembros de la súper familia de TGF-beta (incluyendo proteínas morfogénicas óseas (BMPs)). Los ejemplos específicos de las proteínas de unión TGF-beta incluyen proteínas codificadas por Secuencia ID Nos. 1 , 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 100 y 101 . La inhibición de la "unión de la proteína de unión TGF-beta a la familia TGF-beta de proteínas v proteínas morfogénicas óseas (BMPs)" deberá entenderse que se refiere a las moléculas que permiten la activación de TGF-beta o proteínas morfogénicas óseas (BMPs), o permiten la unión de miembros de familia de TGF-beta incluyendo proteínas morfogénicas óseas (BMPs) a sus receptores respectivos, al remover o prevenir TGF-beta de la unión a proteína de unión TGF. Tal inhibición puede lograrse, por ejemplo, mediante moléculas que inhiben la unión de la proteína de unión TGF-beta a los miembros específicos de la súper familia TGF-beta. "Vector" se refiere a un montaje que es capaz de dirigir la expresión de proteína deseada. El vector debe incluir los elementos promotores de transcripción que se unen operativamente al (a los) gen (es) de interés. El vector puede componerse de ácidos deoxiribonucleicos ("ADN"), ácidos ribonucleicos ("ARN"), o una combinación de los dos (por ejemplo, ADN-ARN quimérico). Opcionalmente, el vector puede incluir una secuencia de poliadenilación, uno o más sitios de restricción, así como también uno o más marcadores elegibles tales como fosfotransferasa de neomicina o fosfotransferasa de higromicina. Adicionalmente, dependiendo de la célula huésped elegida y el vector empleado, otros elementos genéticos tales como un origen de duplicación, sitios de restricción de ácido nucleico adicionales, reforzadores, secuencias que confieren inducción de transcripción, y marcadores elegibles, también pueden incorporarse en los vectores descritos en la presente. Una "molécula de ácido nucleico aislado" es una molécula de ácido nucleico que no se integra en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula ADN que codifica una proteína de unión TGF que se ha separado del ADN genómico de una célula eucariótica es una molécula de ADN aislada. Otro ejemplo de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico químicamente sintetizada que no se integra en el genoma de un organismo. La molécula de ácido nucleico aislada puede ser ADN genómico, cADN, ARN, o componerse de al menos en parte de análogos de ácido nucleico. Un "polipéptido aislado" es un polipéptido que se encuentra esencialmente libre de componentes celulares contaminantes, tales como carbohidrato, lípido, u otras impurezas proteínicas asociadas con el polipéptido en naturaleza. Preferentemente, tales polipéptidos aislados son al menos aproximadamente 90% puros, más preferentemente al menos aproximadamente 95% puros, y más preferentemente al menos aproximadamente 99% puros. Dentro de ciertas modalidades, una preparación de proteína particular contiene un polipéptido aislado si aparece de manera nominal como una banda única en gel SDS-PAGE con tintación Azul Coomassie. El término "aislada" cuando se refiere a moléculas orgánicas (por ejemplo, moléculas pequeñas orgánicas) significa que los compuestos son mayores a 90% puros utilizando los métodos que se conocen bien en la materia (por ejemplo, punto de fusión, NMR). "Esclerosteosis" es un término que se aplicó por Hansen (1967) (Hansen H. G., Sklerostose. in: Optiz, ,H.; Schmid, F., Handbuch der Kinderheilkunde. Berlín: Springer (pub.) 6 1967. Pp. 351 -355) a un desorden similar para a hyperostosis corticalis van Buchem pero posiblemente diferente en apariencia radiológica de los cambios óseos y en la presencia de sindactilia cutánea asimétrica de los dedos medio e índice en varios casos. La mandíbula tiene una apariencia usualmente cuadrada en esta condición. "Anticuerpos humanizados" son proteínas recombinantes en las cuales las regiones determinantes complementarias de animal no humano u otras murino de anticuerpos monoclonales se han transferido desde las cadenas variables, ligera y pesada, de una inmunoglobulina de animal no humano u otro murino en un dominio variable de humano. Según se utiliza en la presente, un "fragmento de anticuerpo" es una parte de un anticuerpo tal como F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, y lo similar. Sin considerar la estructura, un fragmento de anticuerpo se une con el mismo antígeno que se reconoce por el anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monoclonal de proteína de unión anti-TGF-beta se une a un epítopo de proteína de unión de TGF-beta. El término de fragmento de anticuerpo o fragmento de unión de antígeno también incluye cualquier proteína genéticamente elaborada o sintética que actúa como un anticuerpo al unirse a un antígeno específico para formar un complejo. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos aislados que consisten de la región variable de cadena ligera, los fragmentos "Fv" que consisten de las regiones variables de las cadenas, ligera y pesada, moléculas de polipéptido de cadena única recombinante en las cuales se conectan las regiones variables, ligera y pesada, por un enlazador de péptido ("proteínas sFv") y las unidades de mínimo reconocimiento que consisten de los residuos de aminoácido que imitan la región hipervariable. Una "etigueta detectable" es una molécula o átomo que puede conjugarse a una porción de polipéptido tal como una porción de anticuerpo o una porción de ácido nucleico para producir una molécula útil para diagnóstico. Los ejemplos de etiquetas detectables incluyen queladores, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iones paramagnéticos, enzimas, y otras porciones de marcadores. Según se utiliza en la presente, "Inmunoconiugado" es una molécula que comprende un anticuerpo de proteína de unión anti-TGF-beta, o un fragmento de anticuerpo, y una etiqueta detectable o una molécula efectora. Preferentemente, un inmunoconjugado tiene rigurosamente la misma, o solamente ligeramente reducida, habilidad para unirse la proteína de unión TGF-beta después de la conjugación como antes de la conjugación. Abreviaturas: TGF-beta - "Factor de Crecimiento de Transformación-Beta"; TGF-bBP - "Factor de Crecimiento de Transformación-proteína de unión beta" (una TGF-bBP representativa se designa "Beer H."); BMP - "proteína morfogénica ósea"; PCR -"reacción en cadena de polimerasa"; proceso RT-PCR-PCR en el cual el ARN se transcribe primero en ADN utilizando transcriptasa inversa (RT); cADN - cualquier ADN elaborado al copiar una secuencia de ARN en forma de ADN. Según se señala anteriormente, la presente invención proporciona una nueva clase de proteínas de unión TGF-beta, así como también métodos y composiciones para aumentar el contenido mineral óseo en animales con sangre caliente. En resumen, las presentes invenciones se basan en el descubrimiento inesperado de que una mutación en el gen que codifica un nuevo miembro de la familia de proteína de unión TGF-beta da como resultado una condición rara (esclerostosis) caracterizada por los contenidos minerales óseos que son de uno a cuatro pliegues más altos que en los individuos normales. De esta manera, según se discute a mayor detalle abajo este descubrimiento ha conducido al desarrollo de ensayos que pueden utilizarse para seleccionar moléculas que inhiben la unión de la proteína de unión TGF-beta a la familia de proteínas de TGF-beta y proteínas morfogénicas óseas (BMPs), y métodos para utilizar tales moléculas para aumentar el contenido mineral óseo de animales con sangre caliente (incluyendo, por ejemplo, humanos).

DISCUSIÓN DE LA ENFERMEDAD CONOCIDA COMO ESCLEROSTOSIS 1. Esclerosteosis La esclerosteosis es una enfermedad relacionada a la densidad mineral ósea anormal en humanos. La esclerosteosis es un término que se aplicó por Hansen (Hansen, H. G. , Sklerosteose in: Opitz er al. , eds. Handbuch der Kinderheilkunde, (Berlín: Springer 1967) 351 -355) a un desorden similar a corticalis generalisata hyperostosis de van Buchem pero posiblemente diferente en apariencia radiológica de los cambios óseos y en la presencia de sindactilia cutánea asimétrica de los dedos, índice y medio, en varios casos. La esclerosteosis ahora se entiende que es un desorden semi-dominante autosomal que se caracteriza por lesiones escleróticas ampliamente diseminadas del hueso en el adulto. La condición es progresiva. La esclerosteosis también tiene un aspecto en desarrollo que se asocia con la sindactilia (dos o más dedos unidos juntos). El síndrome de eslerosteosis se asocia con la estatura grande, y varios individuos afectados logran una altura de seis pies o más. El contenido mineral óseo de homocigotos puede ser 1 o 6 veces más grande que los individuos normales, y la densidad mineral ósea puede ser 1 a 4 veces más arriba de los valores normales (por ejemplo, en comparación a los medios hermanos no afectados). El Síndrome de Esclerosteosis se presenta principalmente en sudafricanos blancos de descendencia Holandesa en Sudáfrica.

Aproximadamente 1 /140 individuos en la población sudafricana blanca es un vehículo del gen mutado (heterocigotos). La mutación muestra 100% de penetración. Existen reportes de anécdota de la densidad mineral ósea aumentada se ha observado en heterocigotos pero que tienen patologías no asociadas (por ejemplo, sobrecrecimiento del cráneo o sindactilia). La no anormalidad del eje pituitaria-hipotálamo se ha observado en pacientes con esclerosteosis. En particular, la no sobre producción de hormona de crecimiento y cortisona se presenta, y los niveles de hormonal sexual son normales en individuos afectados. , Sin embargo, los marcadores de inversión de hueso (tales como fosfatasa alcalina específica de osteoblasto, osteocalcina, propéptido procolágeno C tipo 1 (PICP), y fosfatasa alcalina total (véase Comier, Curr. Opin. in Rheu. 7:243 (1995)) indican que la actividad hiperosteoblástica se asocial con la enfermedad pero la actividad osteoblasto de normal a ligeramente reducida se observa según se mide por los marcadores de la resorción de hueso (pirridinolina, deoxipriridinolina, N-telopéptido, hidroxiprolina urinaria, fosfatasas de ácido resistente al tartrate de plasma, e hidroxilisina galactosil (véase Comier, supra)). La esclerosteosis se caracteriza por la deposición continua de hueso a lo largo del esqueleto durante la vida de tiempo de los individuos afectados. En los homocigotos, la deposición continua de mineral óseo conduce a un sobre crecimiento de hueso en áreas del esqueleto en donde los mecanoreceptores se encuentran ausentes (cerebro, mandíbula, cráneo). En los homocigotos con Esclerosteosis, el sobre crecimiento de los huesos del cerebro conduce a la compresión craneal y eventualmente a la muerte debido a la presión hidrostática excesiva en la raíz del cerebro. Existe una esclerosis difusa y generalizada en todas las otras partes del esqueleto. Las áreas corticales de los huesos largos se espesan mayormente en un aumento sustancial en resistencia del hueso. Las conexiones trabeculares se aumentan en espesor, que a su vez aumenta la resistencia del hueso trabecular. Los huesos escleróticos aparecen inusualmente opacos a los rayos X. Según se describe a mayor detalle en el Ejemplo 1 , la mutación genética rara que es responsable del Síndrome de Esclerosteosis se ha localizado en la región de cromosoma humano 17 que codifica un nuevo miembro de la familia de proteína de unión TGF-beta (un ejemplo representativo del cual se designa "H. Beer"). Según se describe a mayor detalle abajo, en base a este descubrimiento, el mecanismo de mineralización ósea se entiende más completamente, permitiendo el desarrollo de ensayos para moléculas que aumentan la mineralización ósea, y u el uso de tales moléculas para aumentar el contenido mineral óseo, y en el tratamiento o prevención de un amplio número de enfermedades.

SÚPER FAMILIA DE TGF-BETA La súper familia de Factor de Crecimiento Transformador-beta (TGF-beta) contiene una variedad de factores de crecimiento que comparten elementos de secuencia comunes y motivos estructurales (tanto en niveles terciarios como secundarios). Esta familia de proteína se sabe que ejerce un amplio espectro de respuestas biológicas que afectan una gran variedad de tipos de célula. Varios de los miembros de la familia de TGF-beta tienen importantes funciones en la formación de patrón y especificación de tejido durante el desarrollo embrional; en adultos, se incluyen los miembros de la familia de TGF-beta, por ejemplo, en cicatrización de herida, reparación del hueso y remoldeo del hueso, y en la modulación del sistema inmune. Además de los TGF-beta's, la súper familia incluye las Proteínas Morfogénicas Óseas (BMPs), activitas, inhibinas, Factores de Diferenciación y Crecimiento (GDFs), y Factores Neutróficos Glial-Derivados (GDNFs). La clasificación primaria se establece a través de características de secuencia generales que unen una proteína específica en una sub-familia general. La estratificación adicional dentro de la sub-familia es posible debido a la conservación de secuencia más estricta entre los miembros del grupo más pequeño. En ciertos casos, tales como con BMP-5, BMP-6, y BMP-7, el porcentaje de identidad de aminoácido puede ser tan alta como 75% entre miembros del grupo más pequeño. Este nivel de identidad permite a una secuencia representativa única ilustrar los elementos bioquímicos clave del sub-grupo que la separa de otros miembros de la familia más grande. La estructura de cristal de TGF-beta2 se ha determinado. El pliegue general del monómero TGF-beta2 contiene una estructura tipo nudo de cisteína, compacta, adecuada, formada por tres puentes de disulfuro. La dimerización, la cual se estabiliza por un puente de disulfuro, es anti-paralela. La TGF-beta se señala al inducir la formación de complejos de receptor hetero-oligoméricos tipo I y tipo II . La transducción de señales TGF-beta incluye dos sub-familias distintas de receptores de serina transmembrana/treonina quinasa, tipo I y tipo II. Al menos siete receptores tipo I y cinco receptores tipo I I se ha identificado (véase Kawabata et al. , Cytokine Growth Factor Rev. 9:49-61 (1998); Miyazono et al. , Adv. Immunol. 75: 1 1 5-57 (2000). Los miembros de la familia TGF-beta inician su acción celular al unirse a receptores con actividad de serina/treonina íntriseca. Cada miembro de la familia TGF-beta se une a una combinación característica de receptores tipo I y tipo II, ambos necesarios para señalización. En el modelo actual para la activación de receptor TGF-beta, un ligante TGF-beta primero se une al receptor Tipo I I (TbR-l l), el cual se presenta en la membrana celular en una forma oligomérica con quinasa activada. De allí en adelante, el receptro tipo I (TbR-l), el cual no puede unir el ligante en la ausencia de TbR-l l , se recluta así para formar un complejo ternario ligante/tipo I i/tipo I . El TbR-l l fosforilata así el TbR-l predominantemente en un dominio rico en residuos de serina y glicina (dominio GS) en la región yuxtamembrana, activando de tal modo el TbR-l. La quinasa de receptor tipo I activada fosforilata así los miembros particulares de la familia Smad de proteína que se translocalizan al núcleo en donde modulan la transcripción de los genes específicos.

PROTEÍNAS MORFOGÉNICAS ÓSEAS (BMPS) SON PROTEÍNAS REGULADORAS CLAVE PARA DETERMINAR LA DENSIDAD MI NERAL ÓSEA EN HUMANOS Una ventaja principal en el entendimiento de la formación del hueso fue la identificación de las BMPs, también conocidas como proteínas osteogénicas (OPs), las cuales regulan el cartílago y la diferenciación del hueso en vivo. Las BMPs/OPs inducen la diferenciación del hueso endocrino a través de una cascada de casos que incluyen la formación de cartílago, hipertrofia y calcificación del cartílago, invasión vascular, diferenciación de osteoblastos, y formación de hueso. Según se describe anteriormente, las BMPs/OPs (BMP 2-14, y proteína osteogénica 1 y 2, OP-1 y OP-2) (véase, por ejemplo, GenBank P12643 (BMP-2); GenBank P12645 (BMP3); GenBank P551 07 (BMP-3b, factor de crecimiento/diferenciación 10) (GDF-10)); GenBank P12644 (BMP4); GenBank P22003 (BMP5); GenBank P22004 (BMP6); GenBank P18075 (BMP7); GenBank P34820 (BMP8); GenBank Q9UK05 (BMP9); GenBank 095393 (BM10); GenBank O95390 (BMP1 1 , factor de crecimiento/diferenciación 1 1 precursor (GDF-1 1 )); GenBank 095972 (BM15)) son miembros de la súper famila de TGF-beta. La conservación evolutiva de golpeteo entre los miembros de la sub-familia de BMP/OP sugiere que son importantes en el desarrollo normal y función de los animales. Además, la presencia de múltiple formas de BMPs/OPs origina una importante pregunta acerca de la relevancia biológica de esta redundancia aparente. Además de la condrogénesis y osteogénesis post-fetal, las BMPs/OPs juegan múltiples papeles en la esqueletogénesis (incluyendo el desarrollo de los tejidos dentales y craneófaciales) y en desarrollo embriónico y organogénesis de órganos de parénquima, incluyendo el riñon. Ahora se entiende que la naturaleza depende de comunes (y pocos) mecanismos moleculares que se adaptan para proporcionar la emergencia de órganos y tejids especializados. La súper familia BMP/OP es un ejemplo elegante de parsimonia de naturaleza en la programación de múltiples funciones especializadas que muestran isoformas mleculares con la mínima variación en motivos de aminoácido dentro de regiones de terminal carboxi altamente conservadas. Las BMPs se sintetizan como proteínas precursoras grandes. En la dimerización, las BMPs se dividen de manera proteolítica dentro de la célula para producir proteínas maduras de terminal carboxi que se secretan así de la célula. Las BMPs, como otros miembros de la familia TGF-beta, inician la transducción de señal al unirse cooperativamente tanto a los receptores de quinasa de serina/treonina tipo I como tipo II . Los receptores tipo I para los cuales las BMPs pueden actuar como ligantes incluyen BMPR-IA (también conocidos como ALK-3), BMPR-IB (también conocidos como ALK-6), ALK-1 , y ALK-2 (también conocidos como ActR-l). De los receptores tipo I I , las BMPs se unen al receptor tipo II de BMP (BMPR-l l), Activina tipo I I (ActR-l l), y Activina tipo IIB (ActR-IIB).

(Véase Balemans er al., supra, y referencias citadas en la presente). Las secuencias de polinucleótido y la secuencia de aminoácido codificada de polipéptidos de recetor tipo I de BMP se proporcionan en la base de datos de GenBank, por ejemplo, GenBank NM_004329 (SEQ ID NO:102 codificada por SEQ ID NO:116); D89675 (SEQ ID NO:103 codificada por SEQ ID NO:117); NM_001203 (SEQ ID NO:104 codificada por SEQ ID NO:118); S75359 (SEQ ID NO:105 codificada por SEQ ID NO:119); NM_030849 (SEQ ID NO:106 codificada por SEQ ID NO:120); y D38082 (SEQ ID NO:107 codificada por SEQ ID NO:121). Otras secuencias de polipéptido de los receptores tipo I se proporcionan en la base de datos de GenBank, por ejemplo, NP_001194 (SEQ ID NO:108); BAA19765 (SEQ ID NO:109); y AAB33865 (SEQ ID NO:110). Las secuencias de polinucleótido y la secuencia de aminoácido codificado de polipéptidos de receptor tipo II de BPM se proporcionan en la base de datos de GenBank e incluyen, por ejemplo, U25110 (SEQ ID NO:111 codificada por SEQ ID NO:122); NM_033346 (SEQ ID NO.112 codificada por SEQ ID NO:123); c NM_001204 (SEQ ID NO:113 codificada por SEQ ID NO.124); y Z48923 (SEQ ID NO:114 codificada por SEQ ID NO:125). Las secuencias de polipéptido adicionales de los receptores tipo II también se proporcionan en la base de datos de GenBank, por ejemplo, CAA88759 (SEQ ID NO.115). Las BMPs, similares a otras proteínas de nudo de cistina, forman una estructura de homodímero (Scheufler et al., J. Mol. Biol. 287:103-15 (1999)). De acuerdo al análisis de indicio evolutivo realizado en la familia BMP/TGF-ß, el sitio de unión de receptor tipo I de BMP y el sitio de unión de receptor tipo II se delimitaron a la superficie de la estructura de BMP (Innis ef al. , Protein Eng. 13:839-47 (2000)). La ubicación del sitio de unión de receptor tipo I en BMP se confirmó posteriormente por la estructura de rayos X del complejo Receptor IA BMP-2/BMP (Nickel et al. , J. Joint Surg. Am. 83A(Suppl 1 (Pt 1 )):S7-S14 (2001 )). El sitio de unión de receptor tipo ll pronosticado se encuentra en buen acuerdo con la estructura de rayos X de complejo de receptor Tipo II de TGF-ß3/TGF-ß (Hart et al., Nat. Struct. Biol. 9:203-208 (2002)), el cual es altamente similar al sistema de Receptor HA de BMP/BMP.

ANTAGONISMO DE BMP Las sub-familias de BMP y Activina se someten a la regulación post-translacional importante tal como las proteínas de unión de TGF-beta. Un sistema de control extracelular complicado existe, mediante el cual un antagonista de alta afinidad se sintetiza y se exporta, y subsecuentemente forma un complejo selectivamente con BMPs o activinas para romper su actividad biológica (W.C. Smith, Trends Genet. 15:3-6 (1999)). Un número de tales proteínas de unión TGF-beta se han identificado, y en base a la divergencia de secuencia, los antagonistas parece que se desenvuelven independientemente debido a la falta de conservación de secuencia primaria. Estudios tempranos de estos antagonistas destacaron una preferencia específica para interactuar y neutralizar BMP-2 y BMP-4.

En los vertebrados, los antagonistas incluyen noggin, chordin, chordin-similar, follistatin, FSRP, la familia de proteína DAN/Cerberus, y esclerostina (SOST) (véase Balemans er al., supra, y referencias citadas en la presente). El mecanismo de antagonismo parece que difiere de los diferentes antagonistas (lemura et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:9337-9342). Los sitios de unión de receptor tipo I y tipo II en el noggin de antagonista de BMP se han también delimitado. Noggin se une a BMPs con alta afinidad (Zimmerman et al. , 1996). Un estudio de la estructura de complejo noggin/BMP-7 reveló las interacciones de unión entre las dos proteínas (Groppe et ai. , Nature 420:636-42 (2002)). La superposición de la estructura de noggin-BMP-7 sobre un modelo del complejo de señalización de BMP mostró que la unión de noggin enmascara eficazmente ambos pares de epítopos de unión (es decir, sitios de unión de receptor Tipo I y Tipo ll de BMP) en BMP-7. La secuencia de andamio rica en cisteína de noggin se precede por un segmento de N-terminal de aproximadamente 20 residuos de aminoácido que se refieren como el "clip" (residuos 28-48). El sitio de unión de receptor tipo I se excluye por la parte de N-terminal del dominio de clip de Noggin, y el sitio de unión de receptor tipo II se excluye por ia parte de terminal de carboxi del dominio de clip. Dos filamentos ß en la región de núcleo cerca de la C-terminal de noggin también contactan la BMP-7 en el sitio de unión de receptor tipo II. Este modo de unión permite a un dímero Noggin bloquear eficazmente todos los sitios de unión de receptor (dos sitios de unión de receptor tipo 1 y dos tipo I I) en un dímero DMP.

NUEVAS PROTEÍNAS DE UNIÓN TGF-BETA Según se señala anteriormente, la presente invención proporciona una nueva clase de proteínas de unión TGF-beta que posee un andamio de cisteína (disulfuro) casi idéntico cuando se compara con DAN Humano, Gremlin Humano, y Cerberus Humano, y SCGF (Patente de EE.UU. No. 5,780,263) pero casi nada de homología en el nivel de nucleótido (para información de antecedentes, véase generalmente Hsu ef al. , Mol. Cell 1 :673-683 (1998)). Los ejemplos representativos de la nueva clase de moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de unión TGF-beta se describen en SEQ ID NOs: 1 , 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 100 y 101 . Los polinucleótidos descritos en la presente codifican un polipéptido llamado Beer, el cual también se refiere en la presente como esclerostina o SOST. Los miembros representativos de esta clease de proteínas de unión deberá entenderse que incluyen variantes de la proteína de unión TGF-beta (por ejemplo SEQ ID NOs: 5 y 7). Según se utiliza en la presente, un "gen de variante de proteína de unión TGF-beta" (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico aislado que coifica una variante de proteína de unión TGF-beta) se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican un peiípeptido que tiene una secuencia de aminoácido que es una modificación de SEQ ID NOs: 2, 10, 12, 14, 16, 46 o 65. Tales variantes incluyen polimorfismos que se presentan naturalmente o variantes alélicas de los polinucleótidos codificadores de proteína de unión TGF-beta, así como también polinucleótidos sintéticos que codifican las sustituciones de aminoácido conservadoras de estas secuencias de aminoácido. Una variedad de criterio conocida por aquellos expertos en la materia indica si los aminoácidos en una posición particular en un péptido o polipéptido son similares. Por ejemplo, un aminoácido similar o sustitución de aminoácido conservadora es uno en el cual un residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar, la cual ¡ncluye aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin cargar (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, histidina), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano); cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina), y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano). Prolina, la cual se considera la más difícil de clasificar, comparte propiedades con los aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas (por ejemplo, Leu, Val, lie, y Ala). En ciertas circunstancias, la sustitución de glutamina por el ácido glutámico o asparagina por el ácido aspártico puede considerarse una sustitución similar en la que la glutamina y asparagina son derivados de amida de ácido glutámico y ácido aspártico, respectivamente. Las formas de variante adicionales de un polinucleótido codificador de proteína de unión TGF-beta son moléculas de ácido nucleico que contienen sustituciones, inserciones o supresiones de uno o más nucleótidos encontradas dentro de las secuencias de nucleótido descritas en la presente. Los genes de una variante de proteína de unión TGF-beta pueden identificarse al determinar si los los genes se hibridizan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótido de SEQ ID NOs: 1 , 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 100, o 101 bajo condiciones rigurosas. Además, los genes de variante de proteína de unión TGF-beta deberán codificar una proteína que tiene un elemento principal de cisteína. Como una alternativa, los genes de variante de proteína de unión TGF-beta también pueden identificarse por comparación de secuencia. Según se utiliza en la presente, dos secuencias de aminoácido tienen "100% de identidad de secuencia de aminoácido" si los residuos de aminoácido de las dos secuencias de aminoácido son los mismos cuando se alinean para correspondencia máxima. De igual forma, dos secuencias de nucleótdio tienen "100% de identidad de secuencia de nucleótido" si los residuos de nucleótido de las dos secuencias de nucleótido son los mismos cuando se alinean para correspondencia máxima. Las comparaciones de secuencia pueden realizarse utilizando programas de software estándar tales como aquellos incluidos en el sitio de computación de bioinformática LASERGENE, el cual se produce por DNASTAR (Madison, Wisconsin).

Otros métodos para comparar dos o más secuencias de aminoácido o nucleótido al optimizar la alineación óptima se conocen bien por aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Peruski y Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu eí al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," in Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997), y Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998)). Una proteína de unión TGF-beta variante deberá tener al menos un 50% de identidad de secuencia de aminoácido a las SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 12, 14, 16, 46 o 65, y preferentemente mayor a 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 98% de identidad. Alternativamente, las variantes de proteína de unión TGF-beta pueden identificarse al tener al menos un 70% de identidad de secuencia de nucleótido a las SEQ ID NOs: 1 , 5, 9, 1 1 13, 15, 100 o 101 . Además, la presente invención contempla las variantes de polinucleótido de proteína de unión TGF-beta que tienen más de 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% de identidad a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 100. Sin considerar el método particular utilizado para identificar un polinucleótido de variante de proteína de unión TGF-beta o proteína de unión TGF-beta variante, tal como un variante puede caracterizarse funcionalmente por, por ejemplo, su habilidad para unirse a y/o inhibir la señalización de un miembro seleccionado de la familia de proteínas de TGF-beta, o por su habilidad para unirse específicamente a un anticuerpo de proteína de unión anti-TGF-beta. La presente invención incluye fragmentos funcionales de los genes de proteína de unión TGF-beta. Dentro del contexto de esta invención, un "fragmento funcional" de un polinucleótido de proteína de unión TGF-beta se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una parte de un polipéptido de proteína de unión TGF-beta que ya sea (1) posee una actividad funcional según se describe en la presente o (2) específicamente se une a un anticuerpo de proteína de unión anti-TGF-beta. Por ejemplo, un fragmento funcional de un polinucleótido codificador de proteína de unión TGF-beta descrito en la presente comprende una parte de la secuencia de nucleótido de SEQ ID Nos: 1 , 5, 9, 11 , 13, 15, 100, o 101. 2. Aislamiento del gen de proteína de unión TGF-beta Las moléculas de ADN que codifican una proteína de unión TGF-beta pueden obtenerse al seleccionar una biblioteca genómica o cADN humano utilizando medidores de polinucleótido en base a, por ejemplo, SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, la primera etapa en la preparación de una biblioteca de cADN es aislar el ARN utilizando los métodos bien conocidos por aquellos expertos en la materia. En general, las técnicas de aislamiento ARN proporcionan un método para romper las células, un medio para inhibir la degradación RNAsa-dirigida de ARN, y un método para separar el ARN del ADN, proteína, y contaminantes de polisacárido. Por ejemplo, el ARN total puede aislarse al congelar el tejido en nitrógeno líquido, triturando el tejido congelado con un mortero y triturador para destruir por usinas las células, extraer el tejido triturado con una solución de fenol/cloroformo para remover las proteínas, y separar el ARN de las impurezas restantes mediante precipitación selectiva con cloruro de litio (véase, por ejemplo, Ausubel eí al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, páginas 4-1 a 4-6 (John Wiley & Sons 1995) ["Ausubel (1995)"]; Wu eí al. , Methods in Gene Biotechnology, páginas 33-41 (CRC Press, Inc. 1997) ["Wu (1997)"]). Alternativamente, el ARN puede aislarse al extraer el tejido triturado con isotiocianato guanidio, extraer con solvents orgánicos, y separar el ARN de los contaminantes utilizando la centrifugación diferencial ( (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 4-1 to 4-6; Wu (1997) en las páginas 33-41 ). A fin de construir una bibliotecta de cADN, ARN poly(A)+ se aisla preferentemente de un total de preparación de ARN. El ARN poly(A)+ puede aislarse del ARN total al utilizar la técnica estándar de cromatografía de oIigo(dT)-ceiulosa (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 4-1 1 a 4-12). Las moléculas de cADN de doble filamento pueden sintetizarse de ARN poly(A)+ utilizando las técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Wu (1997) en las páginas 41 -46). Además, los equipos comercialmente disponibles pueden utilizarse para sintetizar las moléculas de cADN de doble filamento (por ejemplo, Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, Maryland); CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, California); Promega Corporation (Madison, Wisconsin); and Stratagene Cloning Systems (La Jolla, California)). El procedimiento básico para obtener los clones de cADN de proteína de unión TGF-beta pueden modificarse al construir una biblioteca de cADN extraída que se enriquece en las moléculas de cADN específicas de proteína de unión TGF. Las técnicas para construir las bibliotecas extraídas se conocen bien por aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Sargent, "Isolation of Differentially Expressed Genes," in Meth. Enzymol. 152:423, 1987; and Wu eí al. (eds.), "Construction and Screening of Subtracted and Complete Expression cDNA Libraries," in Methods in Gene Biotechnology, páginas 29-65 (CRC Press, Inc. 1997)). Diversos vectores de clonación son adecuados para la construcción de una bibliotecta de cADN. Por ejemplo, una biblioteca de cADN puede prepararse en un vector derivado de bacteriófago, tal como un vector ? gt10 (véase, por ejemplo, Huynh eí al., "Constructing and Screening cDNA Libraries in ?gt10 and ?gt11 ," in DNA Cloning: A Practical Approach Vol. I, Glover (ed.), página 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) en las páginas 47-52). Alternativamente, las moléculas de cADN de doble filamento pueden insertarse en un vector de plásmido, tal como un vector pBluescript (Stratagene Cloning Systems; La Jolla, California), uno LambdaGEM-4 (Promega Corp.; Madison, Wisconsin) u otros vectores comercialmente disponibles. Los vectores de clonación adecuados también pueden obtenerse de la Colección de Cultivo Tipo Americano (Rockville, Maryland).

A fin de amplificar las moléculas de cADN clonadas, la biblioteca de cADN se inserta en un huésped procariótico, utilizando técnicas estándar. Por ejemplo, una biblioteca de cADN puede introducirse en células DH5 de E. coli competentes, las cuales pueden obtenerse de Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, Maryland). Una biblioteca de ADN genómico humano puede prepararse por medios bien conocidos en la materia (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 5-1 a 5-6; Wu (1997) en las páginas 307-327). El ADN genómico puede aislarse al destruir por usinas el tejido con el detergente Sarkosyl, digerir el lisado con proteinasa K, eliminar el polvo insoluble de lisado por centrifugación, precipitar el ácido nucleico del lisado utilizando isopropanol, y purificar el ADN vuelto a suspender en un gradiente de densidad de cloruro de cesio. Los fragmentos de ADN que son adecuados para la producción de una biblioteca genómica pueden obtenerse por unión al azar de ADN genómico o por la digestión parcial de ADN genómico con endonucleasas de restricción. Los fragmentos de ADN genómico pueden insertarse en un vector, tal como un bacteriófago o vector cósmido, de acuerdo con las técnicas convencionales, tales como el uso de digestión de enzima de restricción para proporcionar terminal adecuada, el uso de tratamiento de fosfatasa alcalina para evitar la unión no deseable de las moléculas de ADN, y ligación con ligasas adecuadas. Las técnicas para tal manipulación se conocen bien en la materia (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 5-1 to 5- 6; Wu (1997) en las páginas 307-327). Las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de unión TGF-beta también pueden obtenerse utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) con cebadores de oligonucleótdio que tienen secuencias de nucleótido que se basan en las secuencias de nucleótido del gen de proteína de unión TGF-beta humana, según se describe en la presente. Los métodos generales para seleccionar bibliotecas con PCR se proporcionan, por ejemplo, por Yu eí al., "Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries," en Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), páginas 21 1 -215 (Humana Press, Inc. 1993). Además, las técnicas para utilizar PCR para aislar los genes relacionados se describen por, por ejemplo, Preston, "Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members," en Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), páginas 317-337 (Humana Press, Inc. 1993). Alternativamente, las bibliotecas genómicas humanas pueden obtenerse de fuentes comerciales tales como Research Genetics (Huntsville, AL) y la Colección de Cultivo Tipo Americano (Rockville, Maryland). Una biblioteca que contiene cADN o clones genómicos puede seleccionarse con uno o más medidores de polinucleótido en base a SEQ ID NO: 1 , utilizando métodos estándar según se describe en la presente y se conoce en la materia (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 6-1 a 6-1 1 ). Los anticuerpos de proteína de unión anti-TGF-beta, producidos según se describe en la presente, también pueden utilizarse para aislar las secuencias de ADN que codifican una proteína de unión TGF-beta de bibliotecas de cADN. Por ejemplo, los anticuerpos pueden utilizarse para seleccionar bibliotecas de expresión ?gt11 , o los anticuerpos pueden utilizarse para inmunoselección siguiente a la selección híbrida y traducción (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 6-12 a 6-16; Margolis eí al. , "Screening ? expression libraries with antibody and protein probes," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 1 -14 (Oxford University Press 1995)). La secuencia de un fragmento genómico de proteína de unión TGF-beta o cADN de proteína de unión TGF-beta puede determinarse utilizando métodos estándar. Además, la identificación de los fragmentos genómicos que contienen un promotor o elemento regulador de proteína de unión TGF-beta puede lograrse utilizando Isa técnicas bin establecidas, tales como análisis de supresión (véase, generalmente, Ausubel (1995), supra). Como una alternativa, un gen que codifica una proteína de unión TGF-beta puede obtenerse al sintetizar las moléculas de ADN utilizando los oligonucleótidos largos de mutua cebación y las secuencias de nucleótido descritas en la presente (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 8-8 a 8-9). Las técnicas establecidas utilizando la reacción en cadena de polimerasa proporcionan la habilidad de sintetizar las moléculas ADN al menos dos kilobases en longitud (Adang eí al. , Plant Molec. Biol. 27: 1 131 , 1993; Bambot eí al. , PCR Methods and Applications 2:266, 1993; Dillon eí al. , "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes," en Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), páginas 263-268, (Humana Press, Inc. 1993); Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299, 1 995). 3. Producción de genes de proteína de unión TGF-beta Las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de unión TGF-beta variante pueden obtenerse al seleccionar varias bibliotecas genómicas o cADN con medidores de polinucleótido que tienen secuencias de nucleótidos basadas en SEQ ID NO: 1 , 5, 9, 1 1 , 13, 15, 100 o 101 , utilizando procedimientos descritos en la presente. Las variantes de gen de proteína de unión TGF-beta también pueden construirse sintéticamente. Por ejemplo, puede diseñarse una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene un cambio de aminoácido conservador cuando se compara con la secuencia de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 o 65. Es decir, pueden obtenerse variantes que contienen una o más sustituciones de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 o 65, en las cuales se sustituye un aminoácido alquilo para un aminoácido alquilo en una secuencia de aminoácido de proteína de unión TGF-beta; un aminoácido aromático se sustituye por un aminoácido aromático en una secuencia de aminoácido de proteína de unión TGF-beta; un aminoácido que contiene azufre se sustituye por un aminoácido que contiene azufre en una secuencia de aminoácido de proteína de unión TGF-beta; un aminoácido que contiene hidroxi se sustituye por un aminoácido que contiene hidroxi en una secuencia de aminoácido de proteína de unión TGF-beta; un aminoácido acídico se sustituye por un aminoácido acídico en una secuencia de aminoácido de proteína de unión TGF-beta; un aminoácido básico se sustituye por un aminoácido básico en una secuencia de aminoácido de proteína de unión TGF-beta; o un aminoácido monocarboxílico dibásico se sustituye por un aminoácido monocarboxílico dibásico en una secuencia de aminoácido de proteína de unión TGF-beta. Entre los aminoácidos comunes, por ejemplo, una "sustitución de aminoácido conservadora" se ilustra por una sustitución entre los aminoácidos dentro de cada uno de los siguientes grupos: (1 ) glicina, alanina, valina, leucina, y e isoleucina (cadena lateral que contiene grupo alquilo no polar); (2) fenilalanina, tirosina, y triptofano (cadena lateral aromática) (3) serina y treonina (cadena lateral de grupo hidróxilo), (4) aspartate y glutamato (cadena lateral de grupo de ácido carboxílico); (5) glutamina y asparaginas (cadena lateral que contiene grupo amida) y (6) lisina, arginina e histidina (cadena lateral de grupo amino). Al elaborar tales sustituciones, es importante, en donde sea posible, mantener el elemento principal de cisteína señalado en la Figura 1 . Los cambios de aminoácido conservador en un gen de proteína de unión TGF-beta pueden introducirse al sustituir los nucleótidos por los nucieótido citados SEQ ID NO: 1 , 5, 9, 1 1 , 13, 15, 100 o 101. Tales variantes de "aminoácido conservador" pueden obtenerse, por ejemplo, por mutagénesis dirigida por oligonucleótido, mutagénesis de exploración por enlazador, mutagénesis utilizando la reacción en cadena de polimerasa, y lo similar (véase Ausubel (1995) en páginas 8-10, a 8-22; y McPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991 )). La habilidad funcional de tales variantes puede determinarse utilizando un método estándar, tal como el ensayo descrito en la presente. Alternativamente, un polipéptido de proteína de unión TGF-beta variante puede identificarse por la habilidad de unirse específicamente a anticuerpos de proteína de unión anti-TGF-beta. Los análisis de supresión rutinaria de las moléculas de ácido nucleico pueden realizarse para obtener "fragmentos adicionales" de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de proteína de unión TGF-beta. A manera de ilustración, las moléculas ADN que tienen la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: I pueden digerirse con nucleasa ßa/31 para obtener una serie de supresiones jerarquizadas. Los fragmentos se insertan así en los vectores de expresión en estructura de lectura adecuada, y los polipéptidos expresados se aislan y se prueban para actividad, o por la habilidad para unir los anticuerpos de proteína de unión anti-TGF-beta. Una alternativa para digestión de exonucleasa es utilizar mutagénesis dirigida por oligonucleótido para introducir supresiones o codones de detención para especificar la producción de un fragmento deseado. Alternativamente, los fragmentos particulares de un polinucleótido codificador de proteína pueden sintetizarse utilizando la utilizando la reacción en cadena de polimerasa. Las técnicas estándares para análisis funcional de proteínas se describen, por ejemplo, por Treuter eí al. , Treuter eí al., Molec. Gen. Genet. 240: 113, 1993; Content eí al. , "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon," en Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), páginas 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, "The EGF Receptor,"in Control of Animal Cell Prolif eration, Vol. 1 , Boynton eí al. , (eds.) páginas 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau eí al. , J Biol. Chem. 270: 29270, 1995; Fukunaga eí al., J. Biol. Chem. 270: 25291 , 1995; Yamaguchi eí al., Biochem. Pharmacol. 50: 1295, 1995; and Meisel eí al. , Plant Molec. Biol. 30: 1 , 1996. La presente invención también contempla los fragmentos funcionales de un gen de proteína de unión TGF-beta que tienen cambios de aminoácido conservadores. Un gen de variante de proteína de unión TGF-beta puede identificarse en base a la estructura al determinar el nivel de identidad con secuencias de nucleótido y aminoácido de SEQ ID NOs: 1 , 5, 9, 11 , 13, 15, 100 o 101 y 2, 6, 10, 12, 14, 16, 46 o 65 según se discute anteriormente. Un procedimiento alternativo para identificar un gen variante en base a la estructura es determinar si una molécula de ácido nucleico que codifica un gen de proteína de unión TGF-beta variante potencial puede hibridizar bajo condiciones rigurosas a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótido de SEQ ID NOs: 1 , 5, 9, 1 1 , 13, 15, 100, o 101 , o una parte de la misma de al menos 15 o 20 nucleótidos en longitud. Como una ilustración de las condiciones de hibridización rigurosas, una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de proteína de unión TGF-beta variante puede unirse con un fragmento de una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1 en un regulador que contiene, por ejemplo, 5xSSPE (I xSSPE = 180 nM de cloruro de sodio, 10 mM de fosfato de sodio, 1 mM de EDTA (pH 7.7), dxsolución de Denhardt (100xDenhardt's = 2% (p/v) de albúmina de suero de bovino, 2% (p/v) de Ficoll, 2% (p/v) polivinilpirrolidona) y 0.5% de SDS incubado durante la noche a 55-60°C. Los lavados de post-hibridización a alta rigurosidad se realizan típicamente en O.dxSSC (1 xSSC=150 mM de cloruro de sodio, 15 mM de citrato de trisodio) o en 0.5xSSPE a 55-60°C. Sin considerar la secuencia de nucleótido particular de un gen de proteína de unión TGF-beta variante, el gen codifica un polipéptido que puede caracterizarse por su actividad funcional, o por la habilidad de unirse específicamente a un anticuerpo de proteína de unión anti-TGF-beta. Más específicamente, los genes de proteína de unión de TGF-beta variante codifican polipéptidos que muestran al menos 50% y preferentemente, más de 60, 70, 80 o 90% de la actividad de polipéptidos codificados por el gen de proteína de unión TGF-beta humano descrito en la presente. 4. Producción de proteína de unión TGF-beta en Células Cultivadas Para expresar un gen de proteína de unión TGF-beta, una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido debe unirse operativamente a secuencias reguladoras que controlan la expresión transcripcional en un vector de expresión y después introducirse en una célula huésped. Además de las secuencias reguladoras de transcripción, tales como promotores y reforzadores, los vectores de expresión pueden incluir secuencias reguladoras de transcripción y un gen marcador que sea adecuado para la selección de células que llevan el vector de expresión. Los vectores de expresión que son adecuados para la producción de una proteína ajena en células eucarióticas típicamente contienen (1 ) elementos de ADN procariótico que se codifican para un origen de duplicación bacteriano y un marcador de resistencia antibiótica para proporcionar el crecimiento y selección del vector de expresión en un huésped bacteriano; (2) elementos de ADN eucariótico que controlan la inhibición de transcripción, tal como un promotor; y (3) elementos de ADN que controlar el procesamiento de transcripciones, tales como secuencia de terminación de transcripción/poliadenilación. Las proteínas de unión TGF-beta de la presente invención preferentemente se expresan en células de mamífero. Los ejemplos de células huésped de mamífero adicionales incluyen células de riñon de mono verde africano (Vero; ATCC CRL 1587), células de riñon embriónicas de humano (293-HEK; ATCC CRL 1573), células de riñon de hámster bebé (BHK-21 ; ATCC CRL 8544), células de riñon caninas (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovario de hámster chino (CHO-K1 ; ATCC CCL61 ), células pituitarias de rata (GH 1 ; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2.2), células de hepatoma de rata (H-4-I I-E; ATCC CRL 1548) SV40-células de riñon de mono transformadas SV40 (COS-1 ; ATCC CRL 1650) y células embriónicas murino (NIH-3T3; ATCC CRL 1658). Para un huésped mamífero, las señales reguladoras de translación y traducción pueden derivarse de fuentes virales, tales como adenovirus, virus de papiloma de bovino, virus de simio, o lo similar, en los cuales las señales reguladoras se asocian con un gen particular que tiene un alto nivel de expresión. Las secuencias reguladoras de translación y traducción también pueden obtenerse de genes de mamífero, tales como actina, colágeno, miosina, y genes de metalotioneina. Las secuencias reguladoras de transcripción incluyen una región promotora suficiente para dirigir la iniciación de síntesis de ARN. Los promotores eucarióticos adecuados incluyen el promotor del gen de metalotioneina I de ratón [Hamer et al. , J. Molec. Appl. Genet. 1:273, 1982], el promotor TK de virus Herpes [McKnight, Cell 31:355, 1982], el promoter temprano SV40 [Benoist eí al. , Nature 290:304, 1981 ], el promotor virus de sarcoma Rous [Gorman et al. , Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:6777, 1982], el promotor citomegalovirus [Foecking et al. , Gene 45: 101 , 1980], y el promoter de virus de tumor mamario de ratón (véase, generalmente, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," in Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)). Alternativamente, un promotor procariótico, tal como el promotor de polimerasa ARN bacteriófago T3, puede utilizarse para controlar la expresión de gen de proteína de unión TGF-beta en células de mamífero si el promotor procariótico se regula por un promotor eucariótico (Zhou eí al., Mol. Cell. Biol. 10:4529, 1990; Kaufman eí al. , Nucí. Acids Res. 79:4485, 1991). Los genes de proteína de unión TGF-beta también pueden expresarse en células bacterianas, levadura, de insecto o planta. Los promotores adecuados que pueden utilizarse para expresar los polipéptidos de proteína de unión TGF-beta en un huésped procariótico se conocen bien por aquellos expertos en la materia e incluyen promotores capaces de reconocer las polimerasas T4, T3, Sp6 y T7, los promotores PR y PL de bacteriófago lamda, recA, choque térmico, promotores lacUVd, tac, Ipp-lacSpr, phoA, y lacZ de E. coli, promotores de B. subtilis, los promotores de los bacteriófagos de Bacillus, Streptomyces, el promotor int de bacteriófago lambda, el promotor bla de pBR322, y el promotor CAT del gen de transferasa acetil cloramfenicol. Los promotores procarióticos se han revisado por Glick, J. Ind. Microbiol. 1: 277,1987, Watson eí al. , Molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamin Cummins 1987), y por Ausubel et al. (1995). Los huéspedes procarióticos preferidos incluyen E. coli y Bacillus subtilus. Las cepas adecuadas de E. coli incluyen BL21 (DE3), BL21 (DE3)pLysS, BL21 (DE3)pLysE, DH1 , DH41, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH1 1 S, C600, HB101 , JM101 , JM105, JM109, JM1 10, K38, RR1 , Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 , y ER1647 (véase, por ejemplo, Brown (Ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991 )). Las cepas adecuadas de Bacillus subtilus incluyen BR151 , YB886, MU 19, MI 120, y B170 (véase, por ejemplo, Hardy, "Bacillus Cloning Methods," in DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (Ed.) (IRL Press 1985)). Los métodos para expresar proteínas en huéspedes procarióticos se conocen bien por aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Williams eí al. , "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995); Ward eí al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995); y Georgiou, "Expression of Proteins in Bacteria," en Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland eí al. (eds.), página 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)). El sistema de baculovirus proporciona un medio eficiente para introducir polinucleótidos codificadores de proteína de unión TGF-beta en células de insecto. Los vectores de expresión adecuados se basan en el virus de polihedrosis nuclear múltiple Autographa californica (AcMNPV), que contienen promotores bien conocidos tal como promotor 70 (hsp) de proteína de choque térmico Drosophilia, promotor de gen temprano inmediato de virus de polihedrosis nuclear Autographa californica (ie-1), y el promotor temprano retardado 39K, promotor p10 baculovirus, y el promotor de metalotioneina Drosophila. Las células huésped de insecto adecuadas incluyen estirpes de célula derivadas de I PLB-Sf-21 , una estirpe de célula ovárica Spodoptera frugiperda tal como Sf9 (ATCC CRL 171 1 ), Sí"21AE, y Sf21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA), así como también células Drosophila Schneider-2. Las técnicas establecidas para producir proteínas recombinantes en sistemas de baculovirus se proporcionan por Bailey eí al. , "Manipularon of Baculovirus Vectors," en Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), páginas 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991 ); Patel eí al. , "The baculovirus expression system," en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover eí al. (eds.), páginas 205-244 (Oxford University Press 1995); Ausubel (1995) en páginas 16-37 a 16-57, por Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995); y Lucknow, "Insect Cell Expression Technology," in Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland eí al. (eds.), páginas 1 83-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996). Los promotores para expresión en levadura incluyen promotores de GALI (galactosa), PGK (quinasa fosfoglicerato), ADH (alcohol dehidrogenasa), AOXI (alcohol oxidasa), HIS4 (histidinol dehidrogenasa), y lo similar. Varios vectores de clonación de levadura se han diseñado y se encuentran fácilmente disponibles. Estos vectores incluyen vectores basados en Ylp, tales como Ylp5, vectores YRp, tales como YRp17, vectores YEp tales como vectores YEp13 y YCp, tales como YCp19. Un experto en la materia apreciará que existe una amplia variedad de vectores adecuados para la expresión en células de levadura. Los vectores de expresión también pueden introducirse en protoplastos de planta, tejidos de planta intactos, o células de planta aisladas. Los métodos generales para cultivar los tejidos de planta se proporciona, por ejemplo, por Miki eí al. , Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick eí al. (eds.), páginas 67-88 (CRC Press, 1993). Un vector de expresión puede introducirse en células huésped utilizando una variedad de técnicas estándares incluyen transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por liposoma, suministro mediado por microproyectil, electroporación, y lo similar. Preferentemente, las células transfectadas se seleccionan y se propagan para proporcionar las células huésped recombinantes que comprenden el vector de expresión adecuadamente integrado en el genoma de célula huésped. Las técnicas para introducir vectores en células eucarióticas y técnicas para seleccionar tales transformantes estables utilizando un marcador elegible dominante se describen, por ejemplo, por Ausubel (1995) y por Murria (ed.) Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press, 1991 ). Los métodos para introducir ios vectores de epxreisón en células bacterianas, de levadura, de insecto y de planta también se proporcionan por Ausubel (1995). Los métodos generales para expresar y recuperar la proteína ajena producida por un sistema de célula de mamífero se proporciona por ejemplo, por Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," en Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland eí al. (eds.), pages 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Las técnicas estándar para recuperar la proteína producida por un sistema bacteriano se proporciona por, por ejemplo, Grisshammer eí al. , "Purification of over-produced proteins from E. coli cells," en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover eí al. (eds.), páginas 59-92 (Oxford University Press 1995). Los métodos establecidos para aislar las proteínas recombinantes de un sistema de baculovirus se describen por Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc., 1995). Más generalmente, una proteína de unión TGF-beta puede aislarse por técnicas estándar, tales como cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio de ion, HPLC, y lo similar. Las variaciones adicionales en el aislamiento y purificación de proteína de unión TGF-beta pueden contemplarse por aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, anticuerpos de proteína de unión anti-TGF-beta, obtenidos según se describe en la presente, pueden utilizarse para aislar grandes cantidades de proteína por purificación de inmunoafinidad. 5. Producción de Anticuerpos en proteínas de unión TGF-beta La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a esclerostina según se describe en la presente a detalle. Los anticuerpos para la proteína de unión TGF-beta pueden obtenerse, por ejemplo, utilizando el producto de un vector de expresión como un antígeno. Los anticuerpos que se unen específicamente a esclerostina también pueden prepararse al utilizar péptidos derivados de cualquiera de las secuencias de polipéptido esclerostina proporcionadas en la presente (SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46, o 65 pero no a otras proteínas de unión TGF-beta tales como Dan, Cerberus, SCGF, o Kremlin. Los anticuerpos de la presente invención (incluyendo fragmentos y derivados de los mismos) pueden ser un anticuerpo policlonal, o especialmente un monoclonal. El anticuerpo puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina, y puede ser por ejemplo una IgG, (incluyendo isotipos de IgG, que para anticuerpos humanos se conocen en la materia como IgG^ lgG2, lgG3, lgG ); IgE; IgM; o anticuerpo IgA. Un anticuerpo puede obtenerse de aves de corral o mamíferos, preferentemente, por ejemplo, de un anticuerpo murino, rata, humano u otro primate. Cuando se desee el anticuerpo puede ser un anticuerpo de inter-absorción. Los anticuerpos policlonales que se unen específicamente a un SOST pueden prepararse utilizando los métodos descritos en la presente y bien conocidos por aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Green eí al. , "Production of Polyclonal Antisera", en Immunochemical Protocols (Manson, ed.), páginas 1-5 (Humana Press 1992); Harlow eí al. , Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Williams eí al. , "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover eí al. (eds.) página 15 (Oxford University Press 1995)). A pesar de que los anticuerpos policlonales se aumentan típicamente en animales tales como ratas, ratones, conejos, cabras, ganado, u oveja, un anticuerpo de proteína de unión anti-TGF-beta de la presente invención también puede obtenerse de un primate sub-humano. Las técnicas generales para aumentar los anticuerpos diagnósticamente y terapéuticamente útiles en mandriles pueden encontrarse, por ejemplo, en WO 91/1 1465 (1991 ) y en Losman eí al. , Int. J. Cáncer 46:310, 1990. El anticuerpo deberá comprender al menos un dominio de región variable. El dominio de región variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácido y generalmente comprenderá al menos una secuencia de aminoácido hipervariable responsable de la unión de antígeno y que se encuentra adyacente o en estructura con una o más estructuras. En términos generales, el dominio de región variable (V) puede ser cualquier ajuste adecuado de dominios variables de cadena ligera (V ) y/o pesada (VH) de inmunoglobulina. De esta manera, por ejemplo, el dominio de región V puede ser monomérico y puede ser un dominio VH o VL, en donde estos son capaces de unir independientemente el antígeno con afinidad aceptable. Alternativamente, el dominio de región V puede ser dimérico y contener dímeros VH-VH, VH-V?_, o V -VL en los cuales las cadenas, VH y VL, se asocian de manera no covalente (de aquí en adelante referidas como F ). Si se desea, sin embargo, las cadenas pueden acoplarse covalentemente ya sea de manera directa, por ejemplo, por medio de un enlace de disulfuro entre los dominios variables, o a través de un enlazador, por ejemplo, un enlazador péptido, para formar una cadena única Fv (scFv). El dominio de región variable puede ser cualquier dominio variable que se presenta naturalmente o una versión elaborada del mismo. Por versión elaborada se entiende un dominio de región variable que se ha creado utilizando las técnicas de elaboración de ADN recombinantes. Tales versiones elaboradas incluyen aquellas creadas, por ejemplo, de una región variable de anticuerpo específico por inserciones, supresiones, o cambios en o a las secuencias de aminoácido de los anticuerpos naturales. Los ejemplos particulares de este tipo incluyen dominios de región variable elaborados que contienen al menos un CDR y opcionalmente uno o más aminoácidos de estructura de un primer anticuerpo y el resto del dominio de región variable de un segundo anticuerpo. El dominio de región variable puede unirse de manera covalente a un aminoácido de C-terminal a al menos otro dominio de anticuerpo o un fragmento del mismo. De esta manera, por ejemplo, un dominio VH que se presenta en el dominio de región variable puede unirse a un dominio CH1 de inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. De igual forma, un dominio V puede unirse a un dominio C? o un fragmento del mismo. En este aspecto, por ejemplo, el anticuerpo puede ser un fragmento Fab en donde el dominio de unión de antígeno contiene dominios VH y VL unidos de manera covalente a su C-terminal a un dominio CH 1 y C? , respectivamente. El dominio CH 1 puede extenderse con aminoácidos adicionales, por ejemplo, para proporcionar una región articulada según se encuentra en un fragmento Fab', o para proporcionar dominios adicionales, tales como dominios de anticuerpo CH2 y CH3. Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que se comprende para una región determinante de complementariedad única (CDR). Los péptidos CDR ("unidades de reconocimiento mínimo") pueden obtenerse al construir los genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes se preparan, por ejemplo, al utilizar la reacción en cadena de polimerasa para sintetizar la región variable de ARN de las células que producen anticuerpos (véase, por ejemplo, Larrick eí al. , Methods: A Comparison to Methods in Enzymology 2: 106, 1991 ; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter eí al. (eds.) página 166 (Cambridge University Press 1995); y Ward eí al. , "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Birch eí al. , (eds.) página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)). Los anticuerpos para utilizarse en la invención pueden ser monoclonales (preparados por inmunización convencional y procedimientos de fusión celular) o en el caso de fragmentos, derivados de los mismos utilizando cualquier químico estándar adecuado tal como técnicas de digestión y/o división enzimática o reducción, por ejemplo, por tratamiento con pepsina. Más específicamente, los anticuerpos monoclonales de proteína de unión anti-TGF-beta pueden generarse utilizando una variedad de técnicas. Los anticuerpos monoclonales de roedor para antígenos específicos pueden obtenerse mediante métodos conocidos por aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Kohier eí al. , Nature 256:495, 1975; y Coligan eí al. (eds.), Current Protocols in Inmunology, 1 :2.5 1 -2.6.7 (John Wiley & Sons 1991 ) ["Coligan"]; Pickesley eí al. , "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. Coli", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover eí al. (Eds.) página 93 (Oxford University Press 1 995)). En resumen, los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse al inyectar ratones con una composición que comprende un producto de gen de proteína de unión TGF-beta, verificando la presencia de producción de anticuerpo al remover una muestra de suero, removiendo el bazo para obtener B-linfocitos, fusionando los B-linfocitos con células mieloma para producir hibridomas, clonando los hibridomas, seleccionando los clones positivos que producen anticuerpos para el antígeno, cultivando los clones que producen anticuerpos para el antígeno, y aislando los anticuerpos de los cultivos de hibridoma.

Además, un anticuerpo de proteína de unión anti-TGF-beta de la presente invención puede derivarse de un anticuerpo monoclonal humano. Los anticuerpos monoclonales humanos se obtienen de ratones transgénicos que se han elaborado para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta al cambio antigénico. En esta técnica, los elementos de los sitios de cadena ligera y pesada humana se introducen en cepas de ratones derivadas de estirpes de célula germinal embriónicas que contienen rupturas del sitio de cadena ligera y cadena pesada endógenas. Los ratones transgénicos pueden sintetizar los anticuerpos humanos específicos para antígenos humanos, y los ratones pueden utilizarse para producir hibridomas secretores de anticuerpo humano. Los métodos para inhibir los anticuerpos humanos de ratones transgénicos se describen, por ejemplo, por Green eí al. , Nature Genet. 7: 13, 1994; Lonberg eí al. , Nature 368:856, 1994; y Taylor eí al. , Int. immun. 6:579, 1994. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse de cultivos de hibridoma por una variedad de técnicas bien establecidas. Tales técnicas de aislamiento incluyen la cromatografía de afinidad con Proteína A Sefarosa, cromatografía de exclusión de tamaño, y cromatografía de intercambio de ion (véase, por ejemplo, Coligan en páginas 2.7.1 -2.7.12 y páginas 2.9.1 -2.9.3; Baines eí al. , "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Para usos particulares, puede ser deseable preparar fragmentos de anticuerpos de proteína de unión anti-TGF-beta. Los fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse, por ejemplo, por hidrólisis del anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse por digestión de pepsina o papaína de anticuerpos completos de acuerdo a métodos convencionales. Como una ilustración, los fragmentos de anticuerpo pueden producirse por división enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S señalado F(ab')2. Este fragmento puede además dividirse utilizando un agente reductor tilo para producir fragmentos monovalentes 3.5S Fab'. Opcionalmente, la reacción de división puede realizarse utilizando un grupo bloqueador para los grupos sulfhidrilo que se dan como resultado de enlaces de disulfuro. Como una alternativa, una división enzimática que utiliza papaína produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fe directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, por Goldenberg, Patente de EE.UU. No. 4,331 ,647, Nisonoff eí al. , Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73: 1 19, 1959; Edelman eí al., en Methods in Enzymology 1 :422 (Academic Press 1967); y por Coligan en páginas 2.8.1 -2.8.10 y 2.10.-2.10.4. Otros métodos para dividir anticuerpos, tal como separación de las cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena de ligera-pesada monovalente, además división de fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas, o genéticas también pueden utilizarse, mientras que los fragmentos se unen al antígeno que se reconoce por el anticuerpo intacto. Alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo elaborado o recombinante obtenido mediante el uso de técnicas de ADN recombinante incluyendo la manipulación y re-expresión de las regiones constantes y/o variables del anticuerpo que codifica ADN. Tal ADN se conoce y/o se encuentra fácilmente disponible de las bibliotecas de ADN incluyendo por ejemplo bibliotecas de fago-anticuerpo (véase Chiswell y McCafferty, Tibtech. 10:80-84 (1992)) o si se desea puede sintetizarse. Los procedimientos de química y/o biología molecular estándar pueden utilizarse para secuenciar y manipular el ADN, por ejemplo, para introducir codones para crear residuos de cisteína, o para modificar, agregar o suprimir otros aminoácidos o dominios según se desee. Uno o más vectores de expresión replicable que contienen ADN que codifica una región constante y/o variable pueden prepararse y utilizarse para transformar una estirpe de célula adecuada, por ejemplo, una estirpe de célula de mieloma no productora, tal como una estirpe NSO de ratón o una bacteria, tal como E. coli, en la cual la producción del anticuerpo se presentará. A fin de obtener la transcripción eficiente y traducción, la secuencia de ADN en cada vector podría incluir secuencias reguladoras adecuadas, particularmente una secuencia líder y promotor operativamente unida a la secuencia de dominio variable. Los métodos particulares para producir anticuerpos en este aspecto generalmente se conocen bien y se utilizan rutinariamente. Por ejemplo, los procedimientos de biología molecular se describen por Maniatis eí al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989; véase también Maniatis eí al. , 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (2001 )). La secuencia de ADN puede realizarse según se describe en Sanger eí al. (PNAS 74:5463, (1977)) y el manual de secuencialización pie International Amersham, y mutagenesis dirigida por sitio puede llevarse a cabo de acuerdo a métodos conocidos en la materia (Kramer eí al. , Nucleic Acids Res. 12:9441 , (1984); el manual Biotechnology Ltd Anglian; Kunkel Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985); Kunkel eí al. , Methods in Enzymol 154:367-82 (1987). Adicionalmente, las publicaciones numerosas describen técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos por manipulación de ADN, creación de vectores de expresión, y transformación de células adecuadas (Mountain A and Adair, J R in Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Chapter I , 1992, Intercept, Andover, UK); y en la Especificación de Patente Internacional No. WO 91 /09967. En ciertas modalidades, el anticuerpo de acuerdo a la invención puede tener una o más moléculas reporteras o efectoras unidas al mismo y la invención se extiende a tales proteínas modificadas. Una molécula reportera puede ser una porción o etiqueta detectable tal como una enzima, agente citotóxico u otra molécula reportera, incluyendo un tinte, radionúclido, grupo luminescente, grupo fluorescente, o biotina, o lo similar. La inmunoglobulina específica de proteína de unión TGF-beta o fragmento de la misma puede radiomarcarse para aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico. Las técnicas para radiomarcado de anticuerpos se conocen en la materia. Véase, por ejemplo, Adams 1998 In Vivo 12: 1 1 -21 ; Hiltunen 1993 Acta Oncol. 32:831 -9). Las aplicaciones terapéuticas se describen a mayor detalle abajo y pueden incluir el uso del anticuerpo específico de proteína de unión TGF-beta (o fragmento del mismo) junto con otros agentes terapéuticos. Las moléculas reporteras o efectoras pueden unirse al anticuerpo a través de cualquier cadena lateral de aminoácido disponible, aminoácido terminal, o grupo funcional de carbohidrato ubicado en el anticuerpo, con la condición de que la unión o proceso de unión no afecte adversamente las propiedades de unión de tal forma que la utilidad de la molécula se abroga. Los grupos funcionales particulares incluyen, por ejemplo, cualquier grupo amino libre, ¡mino, tilo, hidróxilo, carboxilo, o aldehido. La unión del anticuerpo y la (s) molécula (s) reportera (s) y/o efectora (s) puede (n) lograrse por medio de tales grupos y un grupo funcional adecuado en la molécula reportera o efectora. El enlace puede ser directa o indirecta a través de grupos de puenteo o separación. Las moléculas efectoras incluyen, por ejemplo, agentes anti-neoplásticos, toxinas (tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano (tal como exotoxina A Pseudomonas aeruginosa) o planta y fragmentos de los mismos (por ejemplo, ricina y fragmentos de la misma, planta gelonina, briodina de Bryonia dioica, o lo similar. Véase, por ejemplo, Thrush eí al. , 1996 Annu. Rev. Immunol. 74:49-71 ; Frankel eí al. , 1996 Cáncer Res. 56:926-32); las proteínas biológicamente activas, por ejemplo, enzimas; ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos tales como ADN y ARN y fragmentos de los mismos; polímeros sintéticos y que se presentan naturalmente (por ejemplo, polisacáridos y polímeros de polialquileno tales como poli(etilénglicol) y derivados de los mismos); radionúclidos, particularmente radioyoduro, y metales quelados. Los grupos reporteros adecuados incluyen metales quelados, compuestos fluorescentes o compuestos que pueden detectarse por espectroscopia ESR o NMR. Los grupos efectores particularmente útiles son calicaemicina y derivados de la misma (véase, por ejemplo, Especificaciones de Patente Sudafricana Nos. 85/8794, 88/8127 y 90/2839). Otras numerosas toxinas, incluyendo agentes quimioterapéuticos, agentes anti-mitóticos, antibióticos, inductores de apoptosis (o "apoptógenos", véase, por ejemplo, Green and Reed, 1998, Science 287: 1309-1312) o lo similar, se conocen por aquellos expertos en la materia, y los ejemplos proporcionados en la presente se pretende que sean ilustrativos sin limitar el alcance y espíritu de la ¡nvención. Los agentes antineoplásticos particulares ¡ncluyen agentes citostáticos y citotóxicos, por ejemplo, agentes de alquilación, tales como iperitas nitrogenadas (por ejemplo, clorambucil, melfalan, mecloretamina, ciclofosfamida, o iparita uracil) y derivados de las mismas, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, busulfan, o cisplatin; antimetabolitos, tales como metotrexato, fluorouracil, floxuridina, citarabina, mercaptopurina, tioguanina, ácido fluoroacético o ácido fluorocítrico, antibióticos, tales como bleomicinas (por ejemplo, sulfato bleomicin), doxorubicin, daunorubicin, mitomicinas (por ejemplo, mitomicin C), actinomicinas (por ejemplo, dactinomicina), plicamicina, calicaemicina y derivados de las mismas, o esperamicina y derivados de la misma; inhibidores mitóticos, tales como etoposide, vincristine o vinblastine y derivados de los mismos; alcaloides, tales como elipticina; polioles tales como taxicin-l o taxicin-ll; hormonas, tales como andrógenos (por ejemplo, dromostanolona o testolactona), progestinas (por ejemplo, acetato megestrol o acetato medroxiprogesterona), estrógenos (por ejemplo, difosfato dimetilstilbestrol, fosfato poliestradiol o fosfato estramustina) o antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifen); antraquinonas, tales como mitoxantrona, ureas, tales como hidroxiurea; hidracinas, tales como procarbazina; o imidazoles, tales como dacarbazina. Los metales quelados útiles como moléculas efectoras incluyen quelatos de metales di-o tripositivos que tienen un número de coordinación de 2 a 8 inclusive. Los ejemplos particulares de tales metales incluyen tecnecio (Te), renio (Re), cobalto (Co), cobre (Cu), oro (Au), plata (Ag), plomo (Pb), bismuto (Bi), indio (In), galio (Ga), ¡trio (Y), terbio (Tb), gadolinio (Gd), y escandio (Se). En general, el metal es preferentemente un radionúclido. Los radionúclidos particulares incluyen 99mTc, 186Re, 188Re, 58Co, 60Co, 67Cu, 195Au, 99Au, 110Ag, 203Pb, 206Bi, 207B¡, 111ln, 67Ga, 68Ga, 88Y, 90Y, 160Tb, 53Gd, y 47Sc. El metal quelado puede ser por ejemplo uno de los tipos anteriores de metal quelado con cualquier agente quelante poiidentado adecuado, por ejemplo, poliaminas acíclicas o cíclicas, poliéteres, (por ejemplo, éteres coronados y derivados de los mismos), poliamidas; porfrinas; y derivados carbocíclicos. En general, el tipo de agente quelante dependerá del metal en uso. Un grupo particularmente útil de agentes quelantes en conjugados de acuerdo a la invención, sin embargo, comprende poliaminas cíclicas y acíclicas, especialmente ácidos poliaminocarboxílicos, por ejemplo, ácido dietilenotriaminapentaacético y derivados del mismo, y aminas macrocíclicas, por ejemplo, derivados tetra-aza y tri-aza cíclica (por ejemplo, según se describe en Especificación de Patente Internacional No. WO 92/22583); y poliamidas, especialmente desferrioxamina y derivados de la misma. Cuando un grupo tiol en el anticuerpo se utiliza como el punto de unión esto puede lograrse a través de la reacción presente con un grupo reactivo tiol presente en la molécula reportera o efectora. Los ejemplos de tales grupos incluyen un ácido á-halocarboxílico o éster, tal como yodoacetamida, una imida, tal como maleimida, una sulfona vinilo, o un disulfuro. Estos y otros procedimientos de enlace adecuados se describen generalmente y más particularmente en Especificaciones de Patente Internacional Nos. WO 93/06231 , WO 92/22583, WO 90/091 195, y WO 89/01476.

ENSAYOS PARA SELECCIONAR AGENTES QUE AUMENTAN LA DENSIDAD ÓSEA Según se describe anteriormente, la presente invención proporciona métodos para seleccionar y/o aislar agentes que son capaces de aumentar la densidad ósea. Por ejemplo, dentro de un aspecto de la presente invención, los métodos se proporcionan para determinar si una molécula seleccionada (por ejemplo, un agente candidato) es capaz de aumentar el contenido mineral óseo, comprendiendo las etapas de (a) mezclar (o contactar) una molécula seleccionada con una proteína de unión TGF-beta y un miembro seleccionado de la familia TGF-beta de proteínas, (b) determinar si el agente candidato estimula la señalización por la familia de proteínas TGF-beta, o deteriora o inhibe la unión de la proteína de unión TGF-beta a uno o más miembros de la familia de proteínas TGF-beta. Dentro de ciertas modalidades, la molécula mejora la habilidad de TGF-beta para funcionar como un regulador positivo de diferencia de célula mesénquima. Dentro de otros aspectos de la invención, los métodos se proporcionan para determinar si una molécula seleccionada (agente candidato) es capaz de aumentar el contenido mineral óseo, comprendiendo las etapas de (a) exponer (contactar, mezclar, combinar) una molécula seleccionada a las células que expresan una proteína de unión TGF-beta y (b) determinar si la expresión (o la actividad) de la proteína de unión TGF-beta en las células expuestas se reduce o si una actividad de la proteína de unión TGF-beta se reduce, y de tal modo determinar si el compuesto es capaz de aumentar el contenido mineral óseo. Dentro de una modalidad, las células se seleccionan del grupo que consiste del hueso humano normal espontáneamente transformado o no transformado de biopsias óseas u osteoblastos de hueso parietal de rata. Los métodos para detectar el nivel de expresión de una proteína de unión TGF-beta pueden lograrse en una amplia variedad de formatos de ensayo conocidos en la materia y descritos en la presente. Los inmunoensayos pueden utilizarse para detectar y cuantificar la expresión de una proteína de unión TGF-beta e incluyen, por ejemplo, Inmuno-Electroforessis Contracorriente (CIEP), radioinmunoensayos, radioinmunoprecipitaciones, Ensayos Inmuno-Absorbentes Enlazados por Enzima (ELISA), ensayos inmunomancha como ensayos de mancha punto y Westerns blots, ensayos de inhibición o competencia, y ensayos intercalados (véase, Patentes de EE. UU. Nos. 4,376, 1 10 y 4,486,530; véase también Antibodies: A Laboratory Manual, supra). Tales inmunoensayos pueden utilizar un anticuerpo que es específico para una proteína de unión TGF-beta tal como los anticuerpos anti-esclerotina descritos en la presente, o pueden utilizar un anticuerpo que es específico para una molécula reportera que se une a la proteína de unión TGF-beta. El nivel de expresión de polipéptido también puede determinarse al cuantificar la cantidad de proteína de unión TGF-beta que se une a un ligante de proteína de unión TGF-beta. A manera de ejemplo, la unión de esclerostina en una muestra a una BMP puede detectarse por resonancia de plasmón de superficie (SPR). Alternativamente, el nivel de expresión de mARN que codifica la proteína de unión TGF-beta específica puede cuantificarse.

Las modalidades representativas de tales ensayos se proporcionan abajo en los Ejemplos 5 y 6. En resumen, un miembro de familia de la súper familia TGF-beta o una proteína de unión TGF-beta se une primero a una fase sólida, seguida por la adición de una molécula candidato. Un miembro de familia etiquetado de la súper familia de TGF-beta o una proteína de unión TGF-beta se agrega así al ensayo (es decir, el polipéptido etiquetado es el ligante para el cual el polipéptido se unió a la fase sólida), la fase sólida se lavó, y la cantidad de miembro de súper familia TGF-beta etiquetado o unido o proteína de unión TGF-beta en el soporte sólido determinarse. Las moléculas que son adecuadas para utilizarse en el aumento del contenido mineral óseo según se describe en la presente son aquellas moléculas que reducen la unión de una proteína de unión TGF-beta a un miembro o miembros de la súper familia TGF-beta en una manera estadísticamente importante. Obviamente, los ensayos adecuados para utilizarse dentro de la presente invención no deberán limitarse a las modalidades descritas dentro de los Ejemplos 2 y 3. En particular, los numerosos parámetros pueden alterarse, tales como por unión de TGF-beta a una fase sólida, o por eliminación de una fase sólida completamente. Dentro de otros aspectos de la invención, los métodos se proporcionan para determinar si una molécula seleccionada es capaz de aumentar el contenido mineral óseo, comprendiendo las etapas de (a) exponer (contactar, mezclar, combinar) una molécula seleccionada (agente candidato) a las células que expresan TGF-beta y (b) determinar si la actividad de TGF-beta de dichas células expuestas se altera, y de allí determinar si el compuesto es capaz de aumentar el contenido mineral óseo. Similares a los métodos descritos en la presente, una amplia variedad de métodos pueden utilizarse para valorar los cambios de la expresión de proteína de unión TGF-beta debido a un compuesto de prueba seleccionado. En una modalidad de la invención, el agente candidato es un anticuerpo que se une a la proteína de unión TGF-beta esclerostina descrita en la presente. En una modalidad preferida de la invención, se proporciona un método para identificar un anticuerpo que modula una trayectoria de señalización TGF-beta que comprende contactar un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST con un péptido SOST, incluyendo pero no limitándose a los péptidos descritos en la presente, bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir la formación de un anticuerpo plus (+) complejo SOST (anticuerpo/SOST) y después detectar el nivel (por ejemplo, cuantificar la cantidad) del complejo de SOST/anticuerpo para determinar la presencia de un anticuerpo que modula la trayectoria de señalización TGF-beta. El método puede realizarse utilizando SPR o cualquier número de diferentes inmunoensayos conocidos en la materia y descritos en la presente, incluyendo una ELISA, inmunomancha, o lo similar. Una trayectoria de señalización TGF-beta incluye una trayectoria de señalización mediante la cual una BMP se une a un receptor Tipo I y Tipo II en una célula para estimular o inducir la trayectoria que modula el contenido mineral óseo. En ciertas modalidades preferidas de la invención, un anticuerpo que se une específicamente a SOST estimula o mejora la trayectoria para aumentar el contenido mineral óseo. Tal anticuerpo puede identificarse utilizando los métodos descritos en la presente para detectar la unión de un anticuerpo a péptidos específicos SOST. Los métodos de invención objeto también pueden utilizarse para identificar los anticuerpos que deterioran, inhiben (incluyendo inhiben competitivamente) o previenen la unión de una BMP a un polipéptido SOST al detectar si un anticuerpo se une a péptidos SOST que se ubican en las regiones o partes de regiones en SOST a las cuales se une BMP, tales como péptidos en el extremo de terminal amino de SOST y péptidos que incluyen residuos de aminoácido de terminal amino y una parte de la región de núcleo (núcleo de atraque) de SOST (por ejemplo, SEQ ID NOs: 47-64, 66-73, y 92-95). Los métodos de la presente invención también pueden utilizarse para identificar un anticuerpo que deteriora, previene, o inhibe la formación de homodímeros SOST. Tal anticuerpo que se une específicamente a SOST puede identificarse ai detectar la unión del anticuerpo a péptidos que se derivan dei núcleo o la región de terminal carboxi de SOST (por ejemplo, SEQ ID NOs: 74-91 y 96-99). Dentro de otra modalidad de la presente invención, se proporcionan los métodos para determinar si una molécula seleccionada es capaz de aumentar el contenido mineral óseo, comprendiendo las etapas de (a) mezclar o contactar una molécula seleccionada (agente candidato) con una proteína de unión TGF-beta y un miembro seleccionado de la familia de proteínas TGF-beta, y (b) determinar si la molécula seleccionada regula la señalización de la familia de proteínas TGF-beta o inhibe la unión de la proteína de unión TGF-beta al miembro de familia TGF-beta. Dentro de ciertas modalidades, la molécula mejora la habilidad de un miembro de familia TGF-beta para funcionar como un regulador positivo de diferenciación de célula mesénquima. Similar a los métodos anteriormente descritos, una variedad de métodos puede utilizarse para valorar la estimulación de un miembro de familia TGF-beta mediante un compuesto de prueba. Tal método representativo se proporciona abajo en el Ejemplo 6 (véase también Durham eí al. , Endo. 736: 1374-1380). Dentro de todavía otras modalidades de la presente invención, se proporcionan métodos para determinar si una molécula seleccionada (agente candidato) es capaz de aumentar el contenido mineral óseo, comprendiendo la etapa de determinar si una molécula seleccionada inhibe la unión de proteína de unión TGF-beta a hueso, o un análogo del mismo. Según se utiliza en la presente, deberá entenderse que el hueso o análogos del mismo se refiere a hidroxiapatita, o una superficie compuesta de una forma en polvo de hueso, hueso triturado o hueso intacto. Similar a los métodos descritos en la presente, una amplia variedad de métodos pueden utilizarse para valorar la inhibición de la localización de proteína de unión TGF-beta a aglomerante de hueso. Tal método representativo se proporciona abajo en el Ejemplo 7 (véase también Nicolás eí al. , Calcif. Tissue Int. 47:206-12 (1995)). En una modalidad de la invención, un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido esclerostina es capaz de inhibir competitivamente ia unión de un miembro de familia TGF-beta al polipéptido esclerostina. La capacidad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo para deteriorar o bloquear la unión de un miembro de familia de TGF-beta, tal como una BMP, a esclerostina puede determinarse de acuerdo a cualquiera de los métodos descritos en la presente. El anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a esclerostina puede deteriorar, bloquear, o prevenir la unión de un miembro de familia TGF-beta a esclerostina al deteriorar la formación de homodímero esclerostina. Un anticuerpo que se une específicamente a esclerostina también puede utilizarse para identificar una actividad de esclerostina al inhibir o deteriorar esclerostina de la unión a una BMP. Alternativamente, el anticuerpo o fragmento del mismo puede incorporarse en un ensayo basado en célula o en un modelo animal en el cual la esclerostina tiene una actividad definida para determinar si el anticuerpo altera (aumenta o reduce en una manera estadísticamente importante) esa actividad. Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a esclerostina puede utilizarse para examinar el efecto de tal anticuerpo en una trayectoria de transducción de señal y de tal modo modular (estimular o unir) la trayectoria de señalización. Preferentemente, la unión de un anticuerpo a SOST da como resultado una estimulación o inducción de una trayectoria de señalización. Mientras que los métodos descritos en la presente pueden referirse al análisis de una molécula de prueba individual, la presente invención no deberá limitarse así. En particular, la molécula seleccionada puede contenerse dentro de una mezcla de compuestos. De allí, los métodos recitados pueden además comprender la etapa de aislar una molécula que inhibe la unión de proteína de unión TGF-beta a un miembro de familia TGF-beta.

MOLÉCULAS CANDI DATO Una amplia variedad de moléculas pueden ensayarse por su habilidad para inhibir la unión de la proteína de unión TGF-beta a un miembro de familia TGF-beta. Los ejemplos representativos discutidos a mayor detalle abajo incluyen moléculas orgánicas (por ejemplo, moléculas pequeñas orgánicas), proteínas o péptidos, y moléculas de ácido nucleico). A pesar de que deberá ser evidente de la discusión de abajo que las moléculas candidato descritas en la presente pueden utilizares en los ensayos descritos en la presente, deberán también ser fácilmente aparente que tales moléculas también pueden utilizarse en una variedad de establecimientos terapéuticos y de diagnóstico. 1 . Moléculas Orgánicas Numerosas moléculas orgánicas pequeñas pueden ensayarse por su habilidad para inhibir la unió de la proteína de unión TGF-beta a un miembro de familia TGF-beta. Por ejemplo, dentro de una modalidad de la invención las moléculas orgánicas adecuadas pueden seleccionarse ya sea de una biblioteca química, en donde los químicos se ensayan individualmente, o de bibliotecas químicas de combinación en donde los múltiples compuestos se ensayan una vez, después se des-convolutan para determinar y aislar los compuestos más activos. Los ejemplos representativos de tales bibliotecas químicas de combinación incluyen aquellos descritos por Agrafiotis eí al. , "System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties," Patente de EE.UU. No. 5,463,564; Armstrong, R.W. , "Synthesis of combinatorial arrays of organic compounds through the use of múltiple component combinatorial array syntheses," WO 95/02566; Baldwin, J.J. eí al. , "Sulfonamide derivatives and their use," WO 95/24186; Baldwin, J.J. eí al. , "Combinatorial dihydrobenzopyran library," WO 95/30642; Brenner, S. , "New kit for preparing combinatorial libraries," WO 95/16918; Chenera, B. eí al. , "Preparation of library of resin-bound aromatic carbocyclic compounds," WO 95/16712; Ellman, J.A. , "Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support," Patente de EE.UU. No. 5,288,514; Felder, E. eí al. , "Novel combinatorial compound libraries," WO 95/16209; Lerner, R. eí al. , "Encoded combinatorial chemical libraries," WO 93/20242; Pavia, M. R. eí al. , "A method for preparing and selecting pharmaceutically useful non-peptide compounds from a structurally diverse universal library," WO 95/04277; Summerton, J. E. and D. D. Weller, "Morpholino- subunit combinatorial library and method," Patente de EE. UU. No. 5,506,337; Holmes, C , "Methods for the Solid Phase Synthesis of Thiazolidinones, Metathiazanones, and Derivatives thereof, " WO 96/00148; Phillips, G.B. and G. P. Wei, "Solid-phase Synthesis of Benzimidazoles," Tet. Letters 37:4887-90, 1996; Ruhland, B. eí al. , "Solid-supported Combinatorial Synthesis of Structurally Diverse ß-Lactams," J. Amer. Chem. Soc. 777:253-4, 1996; Look, G.C. eí al. , "The Indentification of Cyclooxygenase-1 Inhibitors from 4-Thiazolidinone Combinatorial Libraries," Bioorg and Med. Chem. Letters 6:707-12, 1996. 2. Proteínas y Péptidos Un amplio rango de proteínas y péptidos pueden utilizarse de igual forma como moléculas candidato para inhibidores de la unión de la proteína de unión TGF-beta a un miembro de familia TGF-beta. a. Bibliotecas de Péptido de Combinación Las moléculas péptido que son inhibidores putativos de la unión de proteína de unión TGF-beta a un miembro de familia de TGF-beta pueden obtenerse a través de la selección de bibliotecas de péptido de combinación. Tales bibliotecas pueden ya sea prepararse por un experto en la materia (por ejemplo, véase, Patentes de EE. UU. Nos. 4,528,266 y 4,359,535, y Solicitud de Tratado de Cooperación de Patentes Nos. WO 92/15679, WO 92/15677, WO 90/07862, WO 90/02809, o adquiridas de fuentes comercialmente disponibles (por ejemplo, New Engiand Biolabs Ph.D. ™ Phage Display Peptide Library Kit). b. Anticuerpos La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido esclerostina, métodos para utilizar tales anticuerpos. La presente invención también proporciona inmunógenos de polipéptido esclerostina que pueden utilizarse para la generación y análisis de estos anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser útiles para bloquear o deteriorar la unión de un polipéptido esclerostina, el cual es una proteína de unión TGF-beta, a un ligante, particularmente una proteína morfogénica ósea, y también pueden bloquear o deteriorar la unión del polipéptido esclerostina a uno u otros más ligantes. Una molécula tal como un anticuerpo que inhibe la unión de la proteína de unión TGF-beta a uno o más miembros de la familia de proteínas de TGF-beta, incluyendo una o más proteínas morfogénicas óseas (BMPs), podría entenderse que se refieren, por ejemplo, a una molécula que permite la activación de un miembro de familia de TGF-beta o BMP, o permite la unión de los miembros de familia de TGF-beta incluyendo una o más BMPs a sus receptores respectivos al remover o prevenir el miembro de TGF-beta de unirse a la proteína de unión de TGF. La presente invención también proporciona los inmunógenos de polipéptido y péptido que pueden utilizarse para generar y/o identificar los anticuerpos o fragmentos de los mismos que son capaces de inhibir, prevenir, o deteriorar la unión de la proteína de unión de TGF-beta SOST a una o más BMPs. La presente invención también proporciona inmunógenos de polipéptido y péptido que pueden utilizarse para generar y/o identificar los anticuerpos o fragmentos de los mismos que son capaces de inhibir, prevenir, o deteriorar (por ejemplo, reducir en una manera estadísticamente significante) la formación de homodímeros esclerostina. Los anticuerpos de la presente invención son útiles para aumentar el contenido mineral y densidad mineral del hueso, aminorando de tal modo condiciones numerosas que dan como resultado la pérdida de contenido mineral óseo, incluyendo, por ejemplo, enfermedad, predisposición genética, accidentes que dan como resultado la falta de uso del hueso (por ejemplo, debido a la fractura), terapéuticos que efectúan la resorción del hueso o que eliminan las células formadoras del hueso, y envejecimiento normal. Los péptidos o polipéptidos útiles para la inmunización y/o análisis de anticuerpos específicos de esclerostina también pueden seleccionarse al analizar la estructura, primaria, secundaria y terciaria de una proteína de unión TGF-beta de acuerdo a los métodos conocidos por aquellos expertos en la materia y descritos en la presente, a fin de determinar las secuencias de aminoácido más probablemente para generar una respuesta antigénica en un huésped animal. Véase por ejemplo, Novotny, Mol. Immunol. 28:201-207 (1991 ); Berzofsky, Science 229:932-40 (1985)). Los datos de cristalografía de rayos x y moldeo también pueden utilizarse para pronosticar y/o identificar cuáles partes o regiones de una proteína de unión TGF-beta interactúan con qué otras partes de un ligante de proteína de unión TGF-beta, tal como una BMP. Los inmunógenos de péptido de proteína de unión TGF-beta pueden diseñarse y prepararse para que incluyan secuencias de aminoácido dentro o alrededor de las partes o regiones de interacción. Estos anticuerpos pueden ser útiles para bloquear o deteriorar la unión de la proteína de unión TGF-beta al mismo ligante y también pueden bloquear o deteriorar la unión de la proteína de unión TGF-beta a uno u otros más ligantes. Los anticuerpos o fragmentos de unión de antígeno de los mismos contemplados por la presente invención incluyen anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a SOST e inhibir competitivamente la unión de un polipéptido TGF-beta, tal como una BMP, a esclerostina. Por ejemplo, los anticuerpos contemplados por la presente invención inhiben competitivamente la unión del polipéptido esclerostina al sitio de receptor Tipo I de BMP en una BMP, o al sitio de unión de receptor Tipo II de BMP, o pueden inhibir competitivamente la unión de SOST tanto a los sitios de receptor Tipo I como Tipo ll en una BMP. Sin desear someterse por teoría, cuando un anticuerpo anti-esclerostina competitivamente inhibe la unión de los sitios de unión Tipo I y/o Tipo II del polipéptido BMP a esclerostina, de esta manera bloqueando la actividad antagonística de esclerostina, los sitios de unión de receptor en BMP se encuentran disponibles para unirse a los receptores Tipo I y Tipo II, aumentando de tal modo la mineralización ósea. La interacción de unión entre una proteína de unión TGF-beta tal como esclerostina y un polipéptido TGF-beta tal como una BMP se presenta generalmente cuando cada uno de los pares del ligante forma un homodímero. Por lo tanto, en lugar de o además de utilizar un anticuerpo específico para que esclerostina bloquee, deteriore, o prevenga la unión de esclerostina a una BMP al inhibir competitivamente la unión de esclerostina a BMP, un anticuerpo específico esclerostina puede utilizarse para bloquear o deteriorar la formación de homodímero esclerostina. A manera de ejemplo, un dímero de Noggin humano, que es un antagonista BMP que tiene la habilidad de unirse a una BMP con alta afinidad (Zimmerman eí al. , supra), se aisló en complejo con un dímero de BMP-7 humano y se analizó por difracción anómala de múltiples longitudes de onda (MAD) (Groppe eí al. , Nature 420:636-42 (2002)). Según se discute en la presente, este estudio reveló que el dímero Noggin puede bloquear eficazmente todos los sitios de unión de receptor (dos sitios de unión de receptor tipo I y dos tipo l l) en un dímero BMP. La ubicación de los aminoácidos de Noggin que contactan BMP-7 puede ser útil en el moldeo de la interacción entre otras proteínas de unión TGF-beta, tales como esclerostina (SOST), y BMPs, y de esta manera ayudar al diseño de péptidos que pueden utilizarse como inmunógenos para generar los anticuerpos que bloquean o deterioran tal interacción. En una modalidad de la presente invención, un anticuerpo, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido SOST competitivamente inhibe la unión del polipéptido SOST a al menos uno o ambos sitios de unión de receptor Tipo II de BMP como sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) que se ubican en una BMP. Los epítopos en SOST a los cuales estos anticuerpos se unen pueden incluir o incluirse dentro de las secuencias de aminoácido contiguas que se ubican en la N-terminal del polipéptido SOST (aminoácidos en aproximadamente las posiciones 1 -56 de SEQ ID NO:46). Los polipéptidos también pueden incluir una secuencia de péptido de enlazador corto que conecta la región de N-terminal a la región de núcleo, por ejemplo, los polipéptidos según se proporcionan en SEQ ID NO:92 (humano) and SEQ ID NO:93 (rata). Las secuencias de péptido de N-terminal representativas más cortas de SOST de humano (por ejemplo, SEQ ID NO:46) incluyen SEQ ID NOS:47-51 , y secuencias de péptido SOST de rata representativas (por ejemplo, SEQ ID NO:65) incluyen SEQ I D NOS:57-60. Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipétido SOST y bloquean o inhiben competitivamente la unión del polipéptido SOST a una BMP, por ejemplo, al bloquear o inhibir la unión a aminoácidos de una BMP correspondiente a uno o más de los sitios de unión de receptor Tipo I y Tipo I I también pueden unirse específicamente a péptidos que comprenden una secuencia de aminoácido correspondiente a la región de núcleo de SOST (aminoácidos en aproximadamente las posiciones 57-146 de SEQ ID NO:46). Los polipéptidos que incluyen la región de núcleo también pueden incluir aminoácidos adicionales extendiéndose a cualquiera o ambas N-terminal y C-terminal, por ejemplo, para incluir residuos de cisteína que pueden ser útiles para conjugar el polipéptido a una molécula vehículo. Los polipéptidos de núcleo representativos de SOST de rata y humano, por ejemplo, comprenden las secuencias de aminoácido establecidas en SEQ ID NO:94 y SEQ ID NO:95, respectivamente. Tales anticuerpos pueden también unir las secuencias de polipéptido más cortas. Las secuencias de péptido de núcleo de SOST de humano representativas se proporcionan en SEQ ID NOs:66-69 y las secuencias de núcleo de SOST de rata representativas se proporcionan en SEQ ID NOs:70-73. En otra modalidad, los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido SOST deterioran (inhiben, previenen, o bloquean, por ejemplo, reducen en una manera estadísticamente significante) la formación de un homodímero SOST. Debido a que la interacción entre SOST y una BMP puede incluir un homodímero de SOST y un homodímero de la BMP, un anticuerpo que previene o deteriora la formación de homodímero de SOST puede de tal modo alterar la densidad mineral ósea, preferentemente aumentando la densidad mineral ósea. En una modalidad, los anticuerpos que se unen a la región de núcleo de SOST previenen la formación de homodímero. Tales anticuerpos también pueden unirse a péptidos que comprenden secuencias de aminoácido contiguas correspondientes a la región de núcleo, por ejemplo, SEQ ID NOs:74, 75, y 98 (SOST de humano) y SEQ ID NOs: 76 y 99 (SOST de rata). Los anticuerpos que se unen a un epítopo ubicado en la región de C-terminal de un polipéptido SOST (en aproximadamente las posiciones de aminoácido 147-190 ya sea de SEQ ID NO:46 o 65) también pueden deteriorar la formación de homodímero. Los polipéptidos de C-terminal representativos de SOST de rata y humano, por ejemplo, comprenden las secuencias de aminoácido establecidas en SEQ I D NO:96 y SEQ ID NO:97 respectivamente. Tales anticuerpos pueden también unir las secuencias de polipéptido más cortas. Las secuencias de péptido de C-terminal de SOST humano representativas se proporcionan en SEQ ID NOs:78-81 y las secuencias de C-terminal de SOST de rata representativas se proporcionan en SEQ ID NOs:86-88. Los polipéptidos y péptidos SOST descritos en la presente a los cuales pueden unirse específicamente los anticuerpos son útiles como inmunógenos. Estos inmunógenos de la presente invención pueden utilizarse para inmunizar un animal para generar una respuesta inmune humana que de cómo resultado la producción de anticuerpos que se unen específicamente a un sitio de unión de receptor Tipo I o Tipo II o ambos ubicados en una BMP incluyen los péptidos derivados de la región de N-terminal de SOST o que pueden prevenir la formación de homodímero SOST. Tales polipéptidos y péptidos SOST que son útiles como inmunógenos también pueden utilizarse en métodos para seleccionar las muestras que contienen anticuerpos, por ejemplo, muestras de anticuerpos purificados, antisuero, o sobrenadantes de cultivo celular y cualquier otra muestra biológica que puede contener uno o más anticuerpos específicos para SOST. Estos péptidos también pueden utilizarse en métodos para identificar y seleccionar de una muestra biológica una o más células B que se encuentran produciendo un anticuerpo que se une específicamente a SOST (por ejemplo, ensayos formadores de placa y lo similar). Las células B pueden utilizarse así como fuente de un polinucleótido codificador de anticuerpo específico SOST que puede clonarse y/o modificarse mediante las técnicas de biología molecular recombinante conocidas en la materia y descritas en la presente. Una "muestra biológica" según se utiliza en la presente se refiere en ciertas modalidades a una muestra que contiene al menos un anticuerpo específico para un polipéptido SOST, y una muestra biológica puede proporcionarse al obtener una muestra sanguínea, espécimen de biopsia, explante de tejido, cultivo de órgano, o cualquier otra preparación de célula o tejido de un sujeto o una fuente biológica. Una muestra puede además referirse a una preparación de célula o tejido en la cual la integridad morfológica o estado físico se ha roto, por ejemplo, por disección, disociación, solubilización, fraccionación, homogenización, extracción bioquímica o química, extracción, pulverización, liofilización, sonicación, o cualquier otro medio para procesar una muestra derivada de un sujeto o fuente biológica. El sujeto o la fuente biológica puede ser un humano o un animal no humano, un cultivo celular primario (por ejemplo, células B inmunizadas en vivo), o estirpe de célula adaptada por cultivo incluyendo pero no limitándose a estirpes de célula genéticamente elaboradas que pueden contener secuencias de ácido nucleico recombinantes episomales o cromosómicamente integradas, estirpes de célula inmortalizables o inmortalizadas, estirpes de célula híbridas de célula somática, estirpes de célula diferenciadas o diferenciables, estirpes de célula transformadas, y lo similar. Los inmunógenos de péptido SOST también pueden prepararse al sintetizar una serie de péptidos que, en total, representan la secuencia de polipéptido completa de un polipéptido SOST y que cada uno tiene una parte de la secuencia de aminoácido SOST en común con otro péptido en la serie. Esta parte subyacente podría preferentemente ser al menos de cuatro aminoácidos, y más preferentemente 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos. Cada péptido puede utilizarse para inmunizar un animal, los sueros colectados del animal, y probarse en un ensayo para identificar cuál animal está produciendo anticuerpos que deterioran o bloquean la unión de SOST a una proteína TGF-beta. Los anticuerpos se preparan así de tales animales inmunizados identificados de acuerdo a los métodos conocidos en la materia y descritos en la presente. Los anticuerpo que inhiben la proteína de unión TGF-beta a un miembro de familia TGF-beta pueden prepararse fácilmente dada la descripción proporcionada en la presente. Los particularmente útiles son los anticuerpos de proteína de unión anti-TGF-beta que "se unen específicamente" la proteína de unión TGF-beta de SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 o 65, pero no a otras proteínas de unión TGF-beta tales como Dan, Cerberus, SCGF, o Gremlin. Dentro del contexto de la presente invención, se entiende que los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, cadena única, quiméricos, inmunoglobulinas injertadas con CDR, anticuerpos anti-idiotípicos, y fragmentos de anticuerpo de los mismos (por ejemplo, Fab, Fd, Fab', y F(ab')2, regiones de variable Fv, o regiones determinantes de complementariedad). Según se discute anteriormente, se entiende que los anticuerpos se unen específicamente a una proteína de unión TGF-beta, o un miembro de la familia de TGF-beta específica, si se unen con una Ka de más de o igual a 107 M"1 , más preferentemente más de o igual a aproximadamente 1 08 M"1 , y no se unen a otras proteínas de unión de TGF-beta, o se unen con una Ka de menos de o igual a 106 M"1. La afinidad de un anticuerpo para su antígeno cognado también se expresa comúnmente como una constante de disociación KD, y un anticuerpo anti-SOST se une específicamente a un miembro de familia de TGF-beta si se une con una K de menos de o igual a 10"5 M, más preferentemente menos de o igual a aproximadamente 10"6M, todavía más preferentemente menos de o igual a aproximadamente 10"7 M, y todavía más preferentemente menos de o igual a 1 0"8M. Además, los anticuerpos de la presente invención preferentemente bloquean, deterioran o inhiben (por ejemplo, reducen con importancia estadística) la unión de una proteína de unión TGF-beta a un miembro de familia de TGF-beta. La afinidad de un anticuerpo o pareja de unión, así como también la inhibición de unión puede determinarse fácilmente por cualquier experto en la materia utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, aquellas descritas (véase Scatchard eí al. Ann. N. Y. Acad. Sci. 51 :660-672, 1949). La afinidad también puede determinarse por resonancia de plasmón de superficie (SPR; BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ). Para resonancia de plasmón de superficie, las moléculas objetivo se inmovilizan sobre una fase sólida y se expone a ligantes en una fase móvil ejecutándose a lo largo de una célula de flujo. Si la unión de ligante al objetivo inmovilizado se presenta, el índice refractivo local cambia, conduciendo a un cambio en el ángulo SPR, el cual puede monitorearse en tiempo real al detectar los cambios en la intensidad de la luz reflejada. Las tasas de cambio de la señal de SPR pueden analizarse para producir constantes de tasa aparentes para las fases de disociación y asociación de la reacción de unión. La proporción de estos valores da la constante de equilibrio aparente (afinidad) (véase, por ejemplo, Wolff eí al. , Cáncer Res. 53:2560-65 (1993)). Un anticuerpo de acuerdo a la presente invención puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, o IgA, y puede ser de cualquiera de los diferentes isotipos que comprenden una clase (tal como lgG1 , lgG2, IgG3, y lgG4 de la clase IgG humano). Puede obtenerse de o derivarse de un animal, por ejemplo, aves de corral (por ejemplo, pollo) y mamíferos, el cual incluye pero no se limita a un ratón, rata, hámster, conejo, u otro roedor, una vaca, caballo, oveja, cabra, camello, humano, u otro primate. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de inter-absorción. Los métodos bien conocidos en la materia pueden utilizarse para generar anticuerpos, antisuero proliclonal, o anticuerpos monoclonales que son específicos para una proteína de unión TGF-beta tal como SOST. Los anticuerpos también pueden producirse como inmunoglobulinas genéticamente elaboradas (Ig) o fragmentos Ig diseñados por tener propiedades deseables. Por ejemplo, a manera de ilustración y no limitación, los anticuerpos pueden incluir un IgG recombinante que es una proteína de fusión quimérica que tiene al menos un dominio de región variable (V) de una primer especie de mamífero y al menos un dominio de región constante de una segunda especie de mamífero distinta. Más comúnmente, un anticuerpo quimérico tiene secuencias de región variable murino y secuencias de región constante humana. Tal inmunoglobulina quimérica murino/humana puede "humanizarse" ai injertar las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) derivadas de un anticuerpo murino, las cuales confieren especificad de unión para un antígeno, en regiones de estructura de región V derivada de humano y regiones constantes derivadas de humano. Los fragmentos de estas moléculas pueden generarse por digestión proteolítica, u opcionalmente, por digestión proteolítica seguida por reducción media de enlaces de disulfuro y alquilación. Alternativamente, tales fragmentos pueden también generarse por técnicas de elaboración genética recombinante. Ciertos anticuerpos preferidos son aquellos anticuerpos que inhiben o bloquean una actividad de proteína de unión TGF-beta dentro de un ensayo in vitro, según se describe en la presente. Las propiedades de unión de un anticuerpo a una proteína de unión TGF-beta puede valorarse generalmente utilizando métodos de inmunodetección incluyendo, por ejemplo, un ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzima (ELISA), inmunoprecipitación, inmunomanchado, inmunoelectroforesis de contracorriente, radioinmunoensayos, ensayos de mancha de punto, ensayos de competencia o inhibición, y lo similar, los cuales pueden realizarse fácilmente por aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Patentes de EE.UU. No. 4,376, 110 y 4,486,530; Harlow eí al. , Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Un inmunógeno puede comprenderse de células que expresan una proteína de unión TGF-beta tal como un polipéptido SOST, polipéptido SOST purificado o parcialmente purificado, o variantes o fragmentos (es decir, péptidos) de los mismos, o péptidos derivados de una proteína de unión TGF-beta. Tales péptidos pueden generarse por división proteolítica de un polipéptido más grande, mediante metodologías moleculares recombinantes, o pueden sintetizarse químicamente. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido SOST se proporcionan en la presente, de tal forma que aquellos expertos en la materia pueden preparar rutinariamente el polipéptido SOST para utilizarse como ¡nmunógenos. Los péptidos pueden sintetizarse químicamente mediante métodos según se describen en la presente y se conocen en la materia. Alternativamente, los péptidos pueden generarse por división proteolítica de una proteína de unión TGF-beta, y péptidos individuales aislados mediante métodos conocidos en la materia tales como electroforesis de gel poliacrilamida o cualquier número de cromatografía líquida u otros medios de separación. Los péptidos útiles como inmunógenos típicamente pueden tener una secuencia de aminoácido de al menos 4 o 5 aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácido de proteína de unión TGF-beta tales como aquellos descritos en la presente, y preferentemente tienen al menos 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 14, 15, 16, 18, 19 o 20 aminoácidos consecutivos de una proteína de unión TGF-beta. Otros ciertos inmunógenos de péptido preferidos comprenden al menos 6 pero no más de 12 o más aminoácidos consecutivos de una secuencia de proteína de unión TGF-beta, y otros inmunógenos de péptido preferidos comprenden al menos 21 pero no más de 50 aminoácidos de un polipéptido SOST. Otros inmunógenos de péptido preferidos comprenden 21-25, 26-30, 31 -35, 36-40, 41 -50, o cualquier número entero total de aminoácidos entre e incluyendo 21 y 100 aminoácidos consecutivos, y entre 100 y 190 aminoácidos consecutivos de una secuencia de proteína de unión TGF-beta. Según se describe en la presente, los anticuerpos policlonales pueden generarse fácilmente por un experto en la materia de una variedad de animales con sangre caliente tales como caballos, vacas, varias aves de corral, conejos, ratones, ovejas, cabras, mandriles o ratas. Típicamente la proteína de unión TGF-beta o péptido único de 13-20 aminoácidos o según se describe en la presente (preferentemente conjugado a hemocianina de lapa prncipal al degradarse con glutaraldehído) se utiliza inmunizar al animal a través de las inyecciones intraperitoneales, intramusculares, infraoculares, intradérmicas, o subcutáneas, junto con un adyuvante tal como adyuvante incompleto o completo de Freund o el Sistema Adyuvante Ribi (Corixa Corporation Seattle, WA). Véase también, por ejemplo, Harlow eí al. , supra. En general, después de la primera inyección, los animales reciben una o más inmunizaciones de refuerzo de acuerdo un horario preferido que puede variar de acuerdo a, entre otras cosas, el antígeno, el adyuvante (si lo hubiere), y/o la especie de animal particular. La respuesta inmune puede monitorearse al sangrar periódicamente el animal y preparar y analizar el suero en un inmunoensayo, tal como un ensayo de difusión Ouchterlony o ELISA, o lo similar, para determinar la concentración de anticuerpo específica. Los antisueros policlonales particularmente preferido darán una señal detectable en uno de estos ensayos, tales como una ELISA, que es preferentemente al menos tres veces mayor al anterior. Una vez que la concentración del animal ha alcanzado un altiplano en términos de su reactividad de la proteína, grandes cantidades de antisuero pueden obtenerse fácilmente ya sea por sangrados semanales, o por desangrado del animal. Los anticuerpos policlonales que se unen específicamente a una proteína de unión TGF-beta o péptido pueden purificarse así de tal antisuero, por ejemplo, por cromatografía de afinidad utilizando la proteína A. Alternativamente, la cromatografía de afinidad puede realizarse en donde la proteína de unión TGF-beta o péptido o un anticuerpo específico para una región constante Ig de la especie de animal inmunizado particular se inmoviliza en un soporte sólido adecuado. Los anticuerpos para utilizarse en la invención incluyen anticuerpos monoclonales que se preparan por inmunización convencional y procedimientos de fusión celular según se describe en la presente y se conoce en la materia. Los anticuerpos monoclonales pueden generarse fácilmente utilizando técnicas convencionales (véase, por ejemplo, Kohier eí al. , Nature 256:495, 1975; Coligan eí al. (eds.), Current Protocols in Inmunology, 1 :2.5 1 -2.6.7 (John Wiley & Sons 1991 ) ["Coligan"]; Patentes de EE.UU. Nos. RE 32, 011 , 4,902,614, 4,543,439 y 4,411 ,993, las cuales se incorporan en ia presente para referencia; véase también Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimensión in Biological Analices, Plenum Press, Kennett, McKearn, y Bechtol (eds.) (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988, las cuales también se incorporan en la presente para referencia; Pickesley eí al. , "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. Coli", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover eí al. (Eds.) página 93 (Oxford University Press 1995)). Los fragmentos de anticuerpo pueden derivarse de los mismos utilizando cualquier técnica estándar adecuada tal como digestión proteolítica, u opcionalmente, por digestión proteolítica (por ejemplo, utilizando papaína o pepsina) seguida por reducción media de enlaces de disulfuro y alquilación. Alternativamente, tales fragmentos pueden también generarse por técnicas de elaboración genética recombinante. En resumen, dentro de una modalidad un animal sujeto tal como una rata o ratón o hámster se inmuniza con una proteína de unión TGF-beta de una región de la misma, incluyendo péptidos dentro de una región, según se describe en la presente. La proteína puede mezclarse con un adyuvante tal como adyuvante incompleto o completo de Freund o adyuvante Ribi a fin de aumentar la respuesta inmune resultante. Entre una y tres semanas después de la inmunización inicial, el animal puede volver a inmunizarse con otra inmunización de refuerzo, y probarse por reactividad a la proteína utilizando los ensayos descritos en la presente. Una vez que el animal ha alcanzado un altiplano en su reactividad a la proteína inyectada, se sacrifica, y los órganos que contienen grandes números de células B tales como el bazo y los nudos linfáticos se colectan. Las suspensiones de célula de nudo linfático y/o de bazo colectadas se fusionan con una célula de mieloma adecuada que se sensibiliza por fármaco a fin de crear un hibridoma que secreta anticuerpo monoclonal. Las estirpes de mieloma adecuadas incluyen, por ejemplo, NS-0, SP20, NS-1 (No. ATCC TIB 18), y P3X63 - Ag 8.653 (No. ATCC CRL 1580). Las células de linfoide (por ejemplo, bazo) y las células de mieloma pueden combinarse por pocos minutos con un agente promotor de fusión de membrana, tal como un polietilénglicol o un detergente no iónico, y después laminarse a una baja densidad en un medio selectivo que soporta el crecimiento de células hibridoma pero no células mieloma fusionadas. Siguiente a la fusión, las células pueden colocarse en placas de cultivo que contienen un medio adecuado, tal como RPMI 1640, o DMEM (Medio Eagles Modificado de Dulbecco) (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas), así como también ingredientes adicionales, tales como suero de bovino fetal, (FBS, es decir, de Hyclone, Logan, uTA o JRH Biosciences). Adicionalmente, el medio deberá contener un reactivo que permita selectivamente el crecimiento de células mieloma y baso fusionadas tales como HAT (hipoxantina, aminopterina, y timidina) (Sigma Chemical Co. , St. Louis, Missouri). Después de aproximadamente siete días, las células fusionadas resultantes o hibridomas pueden seleccionarse a fin de determinar la presencia de anticuerpos que son reactivos con la proteína de unión TGF-beta (dependiendo del antígeno utilizado), y que bloquean, deterioran, o inhiben la unión de la proteína de unión TGF-beta a un miembro de familia TGF-beta. Los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a esclerostina o una variante de la misma, se prefieren. Una amplia variedad de ensayos pueden utilizarse para determinar la presencia de anticuerpos que son reactivos contra las proteínas de la presente invención, incluyendo, por ejemplo, Inmuno-Electroforessis Contracorriente, radioinmunoensayos, radioinmunoprecipitaciones, Ensayos Inmuno-Absorbentes Enlazados por Enzima (ELISA), ensayos inmunomanha como ensayos de mancha punto y Westerns blots, ensayos de inhibición o competencia, y ensayos intercalados (véase, Patentes de EE. UU. Nos. 4,376, 1 10 y 4,486,530; véase también Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Los hibridomas se clonan, por ejemplo, por clonación de dilución limitada o por aislamiento de placa ágar suave, y se vuelven a ensayar. De esta manera, un hibridoma que produce anticuerpos reactivos contra la proteína deseada pueden aislarse. Los anticuerpos monoclonales de los cultivos de hibridoma pueden aislarse de los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma. Un método alternativo para la producción de un anticuerpo monoclonal murino es inyectar las células hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón singeneico, por ejemplo, un ratón que se ha tratado (por ejemplo, cebado con pristane) para promover la formación de fluido de ascitis que contiene el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse por una variedad de técnicas bien establecidas. Tales técnicas de aislamiento incluyen la cromatografía de afinidad con Proteína A Sefarosa, cromatografía de exclusión de tamaño, y cromatografía de intercambio de ion (véase, por ejemplo, Coligan en páginas 2.7.1 -2.7.12 y páginas 2.9.1 -2.9.3; Baines eí al. , "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Los anticuerpos monoclonales pueden purificarse por cromatografía de afinidad utilizando un ligante adecuado seleccionado en base a propiedades particulares del anticuerpo (por ejemplo, isotipo de cadena ligera o pesada, especificidad de unión, etc.). Los ejemplos de un ligante adecuado, inmovilizado en un soporte sólido, incluyen Proteína A, Proteína G, un anticuerpo de región anti-constante (cadena ligera o cadena pesada), un anticuerpo anti-idiotipo, y una proteína de unión TGF-beta, o fragmento o variante de los mismos. Además, un anticuerpo de proteína de unión anti-TGF-beta de ia presente invención puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse por cualquier número de técnicas con las cuales aquellos expertos en la materia serán familiares. Tales métodos incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, transformación de células de sangre periférica humana de Virus Epstein Barr (EBV) (por ejemplo, conteniendo linfocitos B), inmunización in vitro de células B humanas, fusión de células de bazo de ratones transgénicos inmunizados que llevan genes de inmunoglobulina humana insertada, aislamiento de bibliotecas de fago de región V inmunoglobulina humana, u otros procedimientos según se conocen en la materia y se basan en la descripción en la presente. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos pueden obtenerse de ratones transgénicos que se han elaborado para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta al cambio antigénico. Los métodos para obtener anticuerpos humanos de ratones transgénicos se describen, por ejemplo, por Green eí al., Nature Genet. 7: 13, 1994; Lonberg eí al. , Nature 368:336, 1994; Taylor eí al. , Int. Immun. 6:579, 1994; Patente de EE. UU. No. 5,877,397; Bruggemann eí al. , 1 997 Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58; Jakobovits eí al. , 1995 Ann N. Y. Acad. Sci. 764:525-35. En esta técnica, los elementos del sitio de cadena pesada y ligera humana se introducen en cepas de ratón derivadas de estirpes de célula germinal embriónica que contienen rupturas objetivo de los sitios de cadena ligera y cadena pesada endógenas. (Véase también Bruggemann eí al. , Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997)). Por ejemplo, los transgenes de inmunoglobulina humana pueden ser construcciones de mini-gen, o trans-sitios en cromosomas artificiales de levadura, que superan el reajuste y la hipermutación de ADN específico de célula B en el tejido linfoide de ratón. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden obtenerse al inmunizar los ratones transgénicos, que pueden producir así los anticuerpos de humano específicos para el antígeno. Las células linfoides de los ratones transgénicos inmunizados pueden utilizarse para producir los hibridomas que secretan el anticuerpo humano de acuerdo a los métodos descritos en la presente. El suero policlonal que contiene los anticuerpos humanos también puede obtenerse de la sangre de los animales inmunizados. Otro método para generar los anticuerpos monoclonales específicos de proteína de unión TGF-beta humanos incluye inmortalizar las células de sangre periférica humanas por transformación EBV. Véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 4,464,456. Tal estirpe de célula B inmortalizada (o estirpe de célula linfoide) que produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a una proteína de unión TGF-beta (o una variante o fragmento de la misma) puede identificarse por métodos de inmunodetección según se proporciona en la presente, por ejemplo, una ELISA, y después aislarse por técnicas de clonación estándar. La estabilidad de la estirpe de célula linfoblastoide que produce un anticuerpo de proteína de unión anti-TGF-beta puede mejorarse al fusionar la estirpe de célula transformada con un mieloma murino para producir una estirpe de célula híbrida de ratón-humano de acuerdo a los métodos bien conocidos en la materia (véase, por ejemplo, Glasky eí al., Hybridoma 8:377-89 (1989)). Todavía otro método para generar los anticuerpos monoclonales humanos es la inmunización in íro, que incluye cebar las células B de bazo humanas con antígeno, seguida por fusión de células B primadas con una pareja de unión heterohíbrida. Véase, por ejemplo, Boerner eí al. , 1991 , J. Immunol. 147:86-95. En ciertas modalidades, una célula B que se encuentra produciendo un anticuerpo anti-SOST se selecciona y las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera se clonan de la célula B de acuerdo a las técnicas de biología molecular conocidas en la materia (WO 92/02551 ; Patente de EE.UU. No. 5,627,052; Babcook eí ai. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)) y descritas en la presente. Preferentemente, las células B de un animal inmunizado se aislan del bazo, nudo linfático, o muestra de sangre periférica al seleccionar una célula que se encuentra produciendo un anticuerpo que se une específicamente a SOST. Las células B pueden también aislarse de humanos, por ejemplo, de una muestra de sangre periférica. Los métodos para detectar las células B únicas que se encuentran produciendo un anticuerpo con la especificidad deseada se conocen bien en la materia, por ejemplo, por formación de placa, elección de célula activada por fluorescencia, estimulación in vitro seguida por detección de anticuerpo específico, y lo similar. Los métodos para la selección de células B que producen un anticuerpo específico incluyen, por ejemplo, preparar una suspensión de célula única de células B en ágar suave que contiene SOST o un fragmento de péptido del mismo. La unión del anticuerpo específico producido por la célula B al antígeno da como resultado la formación de un complejo, que puede ser visible como un inmunoprecipitado. Después de que las células B que producen el anticuerpo específico se selecciona, los genes de anticuerpo específicos pueden clonarse al aislar y amplificar el ADN o mARN de acuerdo a los métodos conocidos en la materia y descritos en la presente. Para usos particulares, los fragmentos de anticuerpos de proteína de unión anti-TGF-beta pueden desearse. Los fragmentos de anticuerpo, F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fe, Fd, retienen el sitio de unión de antígeno del anticuerpo completo y por lo tanto se unen al mismo epítopo. Estos fragmentos de unión de antígeno derivados de un anticuerpo pueden obtenerse, por ejemplo, por hidrólisis proteolítica del anticuerpo, por ejemplo, digestión de pepsina o papaína de anticuerpos completos de acuerdo a métodos convencionales. Como una ilustración, los fragmentos de anticuerpo pueden producirse por división enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S señalado F(ab')2. Este fragmento puede además dividirse utilizando un agente reductor tilo para producir fragmentos monovalentes 3.5S Fab'. Opcionalmente, la reacción de división puede realizarse utilizando un grupo bloqueador para los grupos sulfhidrilo que se dan como resultado de enlaces de disulfuro. Como una alternativa, una división enzimática que utiliza papaína produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fe directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, por Goldenberg, Patente de EE.UU. No. 4,331 ,647, Nisonoff eí a/. , Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73: 1 19, 1959; Edelman eí al. , en Methods in Enzymology 1 :422 (Academic Press 1967); y por Coligan en páginas 2.8.1 -2.8.10 y 2.10.-2.10.4. Otros métodos para dividir anticuerpos, tal como separar las cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena de ligera-pesada monovalente (Fd), además división de fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas, o genéticas también pueden utilizarse, mientras que los fragmentos se unen al antígeno que se reconoce por el anticuerpo intacto. Un fragmento de anticuerpo también puede ser cualquier proteína sintética o genéticamente elaborada que actúa como un anticuerpo que se une a un antígeno específico para formar un complejo. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos aislados que consisten de la región variable de cadena ligera, fragmentos "Fv" que consisten de las regiones variables de las cadenas, ligera y pesada, moléculas de péptido de cadena única recombinante en las cuales las regiones variables pesadas y ligeras se conectan por un enlazador de péptido (proteínas scFv), y unidades de reconocimiento mínimo que consisten de los residuos de aminoácido que imitan la región hipervariable. El anticuerpo de la presente invención preferentemente comprende al menos un dominio de región variable. El dominio de región variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácido y generalmente comprenderá al menos una secuencia de aminoácido hipervariable responsable de la unión de antígeno y que se encuentra adyacente o en estructura con una o más estructuras. En términos generales, el dominio de región variable (V) puede ser cualquier ajuste adecuado de dominios variables de cadena ligera (V ) y/o pesada (VH) de inmunoglobulina. De esta manera, por ejemplo, el dominio de región V puede ser monomérico y puede ser un dominio VH o VL, que es capaz de unir independientemente el antígeno con afinidad aceptable. Alternativamente, el dominio de región V puede ser dimérico y contener dímeros VH-VH, VH-V , o VL-VL. Preferentemente, el dímero de región V comprende al menos VH y al menos una cadena VL que se asocian de manera no covalente (de aquí en adelante referidas como Fv)- Si se desea, las cadenas pueden acoplarse covalentemente ya sea de manera directa, por ejemplo, por medio de un enlace de disulfuro entre los dominios variables, o a través de un enlazador, por ejemplo, un enlazador péptido, para formar una cadena única Fv (scFv). El dominio de región variable puede ser cualquier dominio variable que se presenta naturalmente o una versión elaborada del mismo. Por versión elaborada se entiende un dominio de región variable que se ha creado utilizando las técnicas de elaboración de ADN recombinantes. Tales versiones elaboradas incluyen aquellas creadas, por ejemplo, de una región variable de anticuerpo específico por inserciones, supresiones, o cambios en o a las secuencias de aminoácido del anticuerpo específico. Los ejemplos particulares incluyen dominios de región variable elaborados que contienen al menos un CDR y opcionalmente uno o más aminoácidos de estructura de un primer anticuerpo y el resto del dominio de región variable de un segundo anticuerpo. El dominio de región variable puede unirse de manera covalente a un aminoácido de C-terminal a al menos otro dominio de anticuerpo o un fragmento del mismo. De esta manera, por ejemplo, un dominio VH que se presenta en el dominio de región variable puede unirse a un dominio CH1 de inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. De igual forma, un dominio VL puede unirse a un dominio C? o un fragmento del mismo. En este aspecto, por ejemplo, el anticuerpo puede ser un fragmento Fab en donde el dominio de unión de antígeno contiene un dominio VH y V asociado unido de manera covalente a su C-terminal a un dominio CH 1 y C? , respectivamente. El dominio CH1 puede extenderse con aminoácidos adicionales, por ejemplo, para proporcionar una región articulada o una parte de un dominio de región articulada según se encuentra en un fragmento Fab', o para proporcionar dominios adicionales, tales como dominios de anticuerpo CH2 y CH3. Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que se comprende para una región determinante de complementariedad única (CDR). Los péptidos CDR ("unidades de reconocimiento mínimo") pueden obtenerse al construir los polinucleótidos que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Tales polinucleótidos se preparan, por ejemplo, al utilizar la reacción en cadena de polimerasa para sintetizar la región variable que utiliza mARN de las células que producen anticuerpo tal como templado (véase, por ejemplo, Larrick eí al. , Methods: A Comparison to Methods in Enzymology 2: 1 06, 1991 ; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter eí al. (eds.) página 166 (Cambridge University Press 1995); y Ward eí al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Birch eí al. , (eds.) página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)). Alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo elaborado o recombinante obtenido mediante le uso de técnicas de ADN recombinante incluyendo la manipulación y re-expresión de las regiones constantes y/o variables del anticuerpo que codifica ADN. Tal ADN se conoce y/o se encuentra fácilmente disponible de las bibliotecas de ADN incluyendo por ejemplo bibliotecas de fago-anticuerpo (véase Chiswell y McCafferty, Tibtech. 10:80-84 (1992)) o si se desea puede sintetizarse. Los procedimientos de química y/o biología molecular estándar pueden utilizarse para secuenciar y manipular el ADN, por ejemplo, para introducir codones para crear residuos de cisteína, o para modificar, agregar o suprimir otros aminoácidos o dominios según se desee. Los anticuerpos quiméricos, específicos para una proteína de unión TGF-beta, y que incluyen anticuerpos humanizados, también pueden generarse de acuerdo a la presente invención. Un anticuerpo quimérico tiene al menos un dominio de región constante derivado de una primer especie de mamífero y al menos un dominio de región variable derivado de una segunda especie de mamífero directa (véase, por ejemplo, Morrison eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81 :6851 -55 (1984)). En las modalidades preferidas, un anticuerpo quimérico puede construirse al clonar la secuencia de polinucleótido que codifica al menos un dominio de región variable derivado de un anticuerpo monocional no humano, tal como la región variable derivada de un anticuerpo monoclonal de murino, rata, o hámster, en un vector que contiene una secuencia de nucleótido que codifica ai menos una región constante humana (véase, por ejemplo, Shin eí al. , Methods Enzymol. 178:459-76 (1989); Walls et al. , Nucleic Acids Res. 21 :2921 -29 (1993)). A manera de ejemplo, la secuencia de polinucleótido que codifica la región variable de cadena ligera de un anticuerpo monoclonal de murino puede insertarse en un vector que contiene una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de región constante de cadena ligera kappa humana. En un vector separado, la secuencia de polinucleótido que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal puede clonarse en estructura con secuencias que codifican una región constante IgG humana, por ejemplo, la región constante lgG1 humana. La región constante humana particular seleccionada puede depender de las funciones de efector deseadas para el anticuerpo particular (por ejemplo, fijación de complemento, unión a un receptor Fe particular, etc.). Preferentemente, los vectores construidos se transfectaran en células eucarióticas para expresión estable del anticuerpo quimérico. Otro método conocido en la materia para generar anticuerpos quiméricos es la recombinación homologa (por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 5,482,856). Un anticuerpo quimérico no humano/humano puede además elaborarse genéticamente para crear un anticuerpo "humanizado". Tal anticuerpo humanizado puede comprender una pluralidad de CDRs derivadas de una inmunoglobulina de una especie de mamífero no humano, al menos una región de estructura variable humana, y al menos una región constante de inmunoglobulina humana. Las estrategias útiles para diseñar los anticuerpos humanizados pueden incluir, por ejemplo, a manera de ilustración y no limitación, la identificación de regiones de estructura variables humanas que son las más homologas a las regiones de estructura no humanas del anticuerpo quimérico. Sin desear someterse por teoría, tal estrategia puede aumentar la probabilidad de que el anticuerpo humanizado retendrá la afinidad de unión específica para una proteína de unión TGF-beta, la cual en algunas modalidades preferidas, puede sustancialmente ser la misma afinidad para una proteína de unión TGF-beta o variante o fragmento de la misma, y en otras ciertas modalidades preferidas puede ser una mayor afinidad para la proteína de unión de TGF-beta. Véase, por ejemplo, Jones eí al., 1986 Nature 321 :522-25; Riechmann eí al. , 1988 Nature 332:323-27. El diseño de tal anticuerpo humanizado puede por lo tanto incluir determinar conformaciones de ciclo CDR y determinantes estructurales de las regiones variables no humanas, por ejemplo, por moldeo por computadora, y después comparar los ciclos CDR y determinantes a las estructuras y los determinantes de ciclo CDR humanas conocidas. Véase, por ejemplo, Padlan eí al. , 1995 FASEB9: 133-39; Chothia eí al., 1989 Nature, 342:377-383. El moldeo de computadora puede también utilizarse para comparar los templados estructurales humanos seleccionados por homología de secuencia con las regiones variables no humanas. Véase, por ejemplo, Bajorath eí al. , 1995 Ther. Immunol. 2:95-103; EP-0578515-A3. Si la humanización de las CDRs no humanas da como resultado la reducción en la afinidad de unión, el moldeo por computadora puede ayudar en la identificación de residuos de aminoácido específicos que podrían cambiarse por técnicas dirigidas por sitio u otras mutagénesis para aumentar parcial, completa o supra-óptimamente (es decir, aumentar a un nivel mayor a aquel de un anticuerpo no humanizado) la afinidad de restauración. Aquellos que tienen experiencia en la materia son familiares con estas técnicas, y fácilmente apreciarán numerosas variaciones y modificaciones a tales estrategias de diseño. Tal método para preparar un anticuerpo humanizado se llama revestimiento. Según se utiliza en la presente, los términos "FRs revestidas" y "FRs recombinante revestidas" se refieren al reemplazo selectivo de los residuos FR de, por ejemplo, una región V de cadena ligera o pesada de roedor, con residuos FR humanos a fin de proporcionar una molécula xenogeneica que comprende un sitio de unión de antígeno que retiene sustancialmente toda la estructura de pliegue de polipéptido FR nativo. Las técnicas de revestimiento se basan en el entendimiento de que las características de unión de ligante de un sitio de unión de antígeno se determinan principalmente por la estructura y disposición relativa de los grupos CDR de cadena ligera y pesada dentro de la superficie de unión de antígeno. Davies eí al. , Ann. Rev. Biochem. 59:439-73, 1990. De esta manera, la especificidad de unión de antígeno puede conservarse en un anticuerpo humanizado solamente en donde las estructuras CDR, su interacción entre sí, y su interacción con el resto de los dominios de región V, se mantienen cuidadosamente. Al utilizar las técnicas de revestimiento, los residuos FR externos (por ejemplo, accesibles por solvente) que se encuentran fácilmente por el sistema inmune se reemplazan selectivamente con residuos humanos para proporcionar una molécula híbrida que comprende ya sea una superficie revestida débilmente inmunogénica, o sustancialmente no inmunogénica. El proceso de revestimiento hace uso de los datos de secuencia disponible para dominios variables de anticuerpo humano compilados por Kabat eí al. , Sequences of Proteins of Inmunological Interest, 4th ed. , (U .S. Dept. of Health and Human Services, U.S.

Government Printing Office, 1987), actualizaciones a la base de datos Kabat, y otras bases de datos extranjeras y EE. UU. accesibles (tanto de proteína como ácido nucleico). Las accesabilidades de solvente de los aminoácidos de región V pueden deducirse de la estructura tridimensional conocida para los fragmentos de anticuerpo murino y humano. Inicialmente, las FRs de los dominios variables de una molécula de anticuerpo de interés se comparan con las secuencias de FR correspondientes de dominios variables humanas obtenidos de las fuentes anteriormente mencionadas. Las regiones V humanas más homologas se comparan así residuo por residuo a los aminoácidos de murino correspondientes. Los residuos en la FR de murino que difieren de la contraparte humana se reemplazan por los residuos presentes en la porción humana utilizando las técnicas recombinantes bien conocidas en la materia. El cambio de residuo solamente se lleva a cabo con porciones que se exponen al menos parcialmente (accesibles por solvente), y se ejerce cuidado en el reemplazo de residuos de aminoácido que pueden tener un efecto importante en la estructura terciaria de los dominios de región V, tales como prolina, glicina, y aminoácidos cargados. En esta manera, los sitios de unión de antígeno "revestidos" resultantes se diseñan de esta manera para retener los residuos de CDR de roedor, los residuos sustancialmente adyacentes a las CDRs, los residuos identificados como enmascarados o mayormente enmascarados (inaccesibles por solvente), se cree que los residuos participan en contactos no covalentes (por ejemplo, electrostáticos e hidrofóbicos) entre dominios de cadena ligera y pesada, y los residuos de las regiones estructurales conservadas de las FRs que se cree que incluyen en las estructuras terciarias "canónicas" de los ciclos CDR. Estos criterios de diseño se utilizan así para preparar secuencias de nucleótido recombinantes que combinan las CDRs tanto de cadena ligera como pesada de un sitio de antígeno de unión en FRs que aparecen en humanos que pueden utilizarse para transfectar las células de mamífero para la expresión de anticuerpos humanos recombinantes que muestran la especificidad de antígeno de la molécula de anticuerpo de roedor. Un método adicional para seleccionar anticuerpos que se unen específicamente a una proteína de unión TGF-beta o variante o fragmento de la misma es mediante despliegue de fago. Véase, por ejemplo, Winter eí al. , 1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55; Burton eí al., 1994 Adv. Immunol. 57: 191 -280. Las bibliotecas de combinación de la región variable de inmunoglobulina murino o humana pueden crearse en vectores de fago que pueden seleccionarse para elegir fragmentos Ig (Fab, Fv, sFv, o multímeros de los mismos) que se unen específicamente a proteína de unión TGF-beta o variante o fragmento del mismo. Véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. No. ,223,409;Wilüam D. Huse eí al. , "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 246:1275-81 , Diciembre 1989; véase también Sastry eí al., "Cloning of the Inmunological Repertoire in Escherichia coli. for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library," Proc Nati. Acad. Sci. USA 86:5728-32, Agosto1989; véase también Michelle Alting-Mees eí al. , "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3: 1 -9 Enero 1990; Kang eí al. , 1991 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:4363-66; Hoogenboom eí al., 1992 J. Molec. Biol. 227:381 -388; Schlebusch eí al., 1997 Hybridoma 16:47-52 y referencias citadas en la presente. Un sistema comercial se encuentra disponible de Strategene (La Jolla, California) el cual permite la producción de anticuerpos a través de técnicas recombinantes. En resumen, el mARN se aisla de una población de célula B, y se utiliza para crear las bibliotecas de expresión de cADN de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada en los vectores ?lmmunoZap (H) y ?lmmunoZap(L). Las placas positivas pueden convertirse subsecuentemente en un plásmido no lítico que permite la expresión de alto nivel de fragmentos de anticuerpo monoclonal de E. coli. Alternativamente, una biblioteca que contiene una pluralidad de secuencia de polinucleótido que codifica fragmentos de región variable Ig pueden insertarse en el genoma de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o una variante del mismo, en estructura con la secuencia que codifica una proteína de cabra fago. Una proteína de fusión puede ser una fusión de la proteína con el dominio de región variable de cadena ligera y/o con el dominio de región variable de cadena pesada. De acuerdo a ciertas modalidades, los fragmentos Fab de inmunoglobulina también pueden desplegarse en una partícula de fago (véase, por ejemplo, Patentes de EE.UU.

Nos. 5,698,426). Estos vectores pueden seleccionarse individualmente o co-expresarse para formar fragmentos Fab o anticuerpos (véase Huse eí al. , supra; véase también Sastry eí al. , supra). De igual forma, las partes o fragmentos, tales como fragmentos Fab y Fv, de anticuerpos también pueden construirse utilizando técnicas de digestión enzimática convencional o ADN recombinante para incorporar las regiones variables de un gen que codifica un anticuerpo de unión específica. Dentro de una modalidad, los genes que codifican la región variable de un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de interés se amplifican utilizando cebadores de nucleótido para la región variable. Estos cebadores pueden sintetizarse por un experto en la materia, o pueden adquirirse de fuentes comercialmente disponibles. Stratagene (La Jolla, California) vende cebadores para regiones variables humanas y de ratón que incluyen, entre otros, los cebadores para regiones VHa. VHb > VHC, VHd, CHI , VL y CL. Estos cebadores pueden utilizarse para amplificar regiones variables de cadena ligera o pesada, que pueden insertarse así en vectores tales como ImmunoZAP™ H o ImmunoZAP™ L (Stratagene), respectivamente. Estos vectores pueden introducirse así en levadura E. coli, o sistemas basados en mamífero para expresión. Utilizando estas técnicas, grandes cantidades de una proteína de cadena única que contienen una fusión de los dominios VH y V pueden producirse utilizando estos métodos (véase Bird eí al. , Science 242:423-426, 1988). Además, tales técnicas pueden utilizarse para cambiar un anticuerpo "murino" a un anticuerpo "humano", sin alterar la especificidad de unión del anticuerpo. En ciertas modalidades particulares de la invención, las bibliotecas de combinación de fago también pueden utilizarse para humanización de regiones variables no humanas. Véase, por ejemplo, Rosok eí al. , 1996 J. Biol. Chem. 277:2261 1 -18; Rader eí al. , 1998 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:8910-15. Una biblioteca de fago puede seleccionarse para elegir un fragmento de región variable Ig de interés mediante métodos de inmunodetección conocidos en la materia y descritos en la presente, y la secuencia de ADN del gen de inmunoglobulina insertada en el fago así seleccionada puede determinarse mediante técnicas estándares. Véase, Sambrook eí al. , 2001 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. La secuencia que codifica Ig seleccionada puede clonarse así en otro vector adecuado para expresión del fragmento Ig u, opcionalmente, puede clonarse en un vector que contiene regiones constantes Ig, para expresión de cadenas de inmunoglobulina completas. En ciertas otras modalidades, la invención contempla anticuerpos específicos de SOST que son fragmentos de anticuerpo multimérico. Las metodologías útiles se describen generalmente, por ejemplo, en Hayden eí al. , 1997, Curr Opin. Immunol. 9:201 -12; Coloma eí al. , 1997 Nat. Biotechnol. 15: 159-63. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo multimérico pueden crearse mediante técnicas de fago para formar mini-anticuerpos (Patente de EE.UU. No. 5,910,573) o diacuerpos (Holliger, eí al. , 1997, Cáncer Immunol. Immunother. 45: 128-130). En ciertas modalidades de la invención, un anticuerpo específico para SOST puede ser un anticuerpo que se expresa como una proteína intracelular. Tales anticuerpos ¡ntracelulares también se refieren como intra-cuerpos y pueden comprender un fragmento Fab, o preferentemente comprender un fragmento scFv (véase, por ejemplo, Lecerf eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98:4764-49 (2001 ). Las regiones de estructura que flanquean las regiones CDR pueden modificarse para mejorar los niveles de expresión y solubilidad de un intracuerpo en un ambiente reductor intracelular (véase, por ejemplo, Worn eí al. , J. Biol. Chem. 275:2795-803 (2000). Un intracuerpo puede dirigirse a una ubicación celular particular u organelo, por ejemplo, al construir un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica las regiones variables de un intracuerpo que puede fusionarse operativamente a una secuencia de polinucleótido que codifica un antígeno objetivo particular dentro de la célula (Véase, por ejemplo, Graus-Porta eí al. , Mol. Cell. Biol. 15: 1 182-91 (1995); Lener eí al. , Eur. J. Biochem. 267: 1 196-205 (2000)). Un intracuerpo puede introducirse en una célula por una variedad de técnicas disponibles para el experto en la materia incluyéndose por medio de un vector de terapia de gen, o una mezcla lípida (por ejemplo, Provectin™ elaborado por Imgenex Corporation, San Diego, CA), o de acuerdo a métodos de ínternalización fotoquímica. La introducción de mutaciones de aminoácido en una molécula de inmunoglobuiina específica par una proteína de unión TGF-beta puede ser útil para aumentar la especificidad o afinidad para la proteína de unión TGF-beta o para alterar una función de efector. Las inmunoglobulinas con afinidad más alta para la proteína de unión TGF-beta pueden generarse por mutagénesis dirigida por sitio de residuos particulares. El moldeo molecular tridimensional asistido por computadora puede emplearse para identificar los residuos de aminoácido a cambiar, a fin de mejorar la afinidad para la proteína de unión TGF-beta. Véase, por ejemplo, Mountain eí al. , 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10: 1 -142. Alternativamente, las bibliotecas de combinación de CDRs pueden generarse en fago M 13 y seleccionarse para fragmentos de inmunoglobulina con afinidad mejorada. Véase, por ejemplo, Glaser eí al. , 1992, J. Immunol. 149:3903-3913; Barbas eí al. , 1994 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :3809-13; Patente de EE.UU. No. 5,792,456. Las funciones de efector también pueden alterarse por mutagénesis dirigida por sitio. Véase, por ejemplo, Duncan eí al. , 1988 Nature 332:563-64; Morgan eí al. , 1995 Immunology 86:319-24; Eghtedarzedeh-Kondri eí al. , 1997 Biotechniques 23:830-34. Por ejemplo, la mutación del sitio de glicosilación en la parte Fe de la inmunoglobulina puede alterar la habilidad de la inmunoglobulina para fijar el complemento. Véase, por ejemplo, Wright eí al. , 1997 Trends Biotechnol. 1 5:26-32. Otras mutaciones en los dominios de región constante pueden alterar la habilidad de la inmunoglobulina para fijar el complemento, o para efectuar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. Véase, por ejemplo, Duncan et al. , 1988, Nature 332:563-64; Morgan eí al. , 1995 Immunology 86:319-24; Sensel eí al. , 1997 Mol. Immunol. 34: 101 9-29. De acuerdo a ciertas modalidades, las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada humanizadas, humanas, o no humanas de cualquiera de las moléculas Ig descritas en la presente pueden construirse como fragmentos de polipéptido Fv (scFv) de cadena única (anticuerpos de cadena única). Véase, por ejemplo, Bird eí al. , 1 988 Science 242:423-426; Huston eí al. , 1 988 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883. Las proteínas de fusión scFv multi-funcionales pueden generarse al enlazar una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido scFv en estructura con al menos una secuencia de polinucleótido que codifica cualquiera de una variedad de proteínas efectoras conocidas. Estos métodos se conocen en la materia, y se describen, por ejemplo, en EP-B1 -0318554, Patente de EE.UU. No. 5, 132,405, Patente de EE.UU. No. 5,091 ,513 y Patente de EE.UU. No. 5,476,786. A manera de ejemplo, las proteínas efectoras pueden incluir secuencias de región constante de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Hollenbaugh eí al. , 1995 J. Immunol. Methods 188: 1 -7. Otros ejemplos de proteínas efectoras son enzimas. Como un ejemplo no limitante, tal enzima puede proporcionar una actividad biológica para propósitos terapéuticos (véase, por ejemplo, Siemers eí al. , 1997 Bioconjug. Chem. 8:510-19) o puede proporcionar una actividad detectable, tal como una conversión catalizada por peroxidasa de rábano picante de cualquiera de un número de sustratos bien conocidos en un producto detectable, para usos de diagnóstico. Todavía otros ejemplos de proteínas de fusión scFv incluyen fusiones de toxina Ig, o inmunotoxinas, en donde el polipéptido scFv se enlaza a una toxina. La scFv o cualquier fragmento de anticuerpo descrito en la presente puede, en ciertas modalidades, fusionarse a dominios de péptido o polipéptido que permite la detección de unión específica entre la proteína de fusión y antígeno (por ejemplo, una proteína de unión TGF-beta). Por ejemplo, el dominio de polipéptido de fusión puede ser un polipéptido tag de afinidad para detectar la unión de la proteína de fusión scFv a una proteína de unión TGF-beta mediante cualquiera de una variedad de técnicas con las cuales aquellos expertos en la materia serán familiares. Los ejemplos de un péptido tag, incluyen avidina, estreptavidina o His (por ejemplo, polihistidina). Las técnicas de detección también pueden incluir, por ejemplo, unión de una proteína de fusión de avidina o estraptividina a biotina o secuencia mimética de biotina (véase, por ejemplo, Luo eí al., 1998, J. Biotechnol. 65:225 y referencias citadas en la presente), modificación covalente directa de una proteína de fusión con una porción detectable (por ejemplo, una porción de etiquetado), unión no covalente de la proteína de fusión a una molécula reportera etiquetada específica, modificación enzimática de un sustrato detectable mediante una proteína de fusión que incluye una parte que tiene actividad de enzima, o inmovilización (covalente o no covalente) de la proteína de fusión en un soporte de fase sólida. Otros polipéptidos de afinidad útiles para la construcción de proteínas de fusión scFv pueden incluir las proteínas de fusión de estreptavidina, según se describe, por ejemplo, en WO 89/03422, EE.UU. 5,489,528, EE.UU. 5,672,691 , WO 93/24631 , EE.UU. 5, 168,049, EE.UU. 5,272,254; proteínas de fusión de avidina (véase, por ejemplo, EP 511 ,747); una enzima tal como S-transferasa de glutationa; y polipéptido de proteína A Staphylococcus aureus. Los polinucleótidos que codifican un anticuerpo o fragmento del mismo que unen específicamente una proteína de unión TGF-beta, según se describe en la presente, pueden propagarse y expresarse de acuerdo a cualquiera de una variedad de procedimientos bien conocidos para excisión, ligación, transformación, y transfección de ácido nucleico utilizando cualquier número de vectores de expresión conocidos. De esta manera, en ciertas modalidades la expresión de un fragmento de anticuerpo puede preferirse en un huésped procariótico, tal como Escherichia coli (véase, por ejemplo, Plucktun eí al. , 1989 Methods Enzymol. 178:497-515). En otras ciertas modalidades, la expresión del anticuerpo o un fragmento del mismo puede preferirse en una célula huésped eucariótica, incluyendo levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, y Pichia pastoris), células de animal (incluyendo células de mamífero) o células de planta. Los ejemplos de células de animal adecuados incluyen, pero no se limitan a, mieloma (tal como una estirpe NSO de ratón), COS, CHO, o células hibridoma. Los ejemplos de células de planta incluyen células de tabaco, maíz, soya, y arroz. Una vez que los anticuerpos adecuados se han obtenido, pueden aislarse o purificarse por varias técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la materia (véase Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory (1988). Las técnicas adecuadas incluyen péptido o columnas de afinidad de proteína (incluyendo el uso de anticuerpos de región anti-constnte unidos al aglomerante de columna), HPLC o RP-HPLC, purificación en proteína A o columnas de proteína G, o cualquier combinación de estas técnicas. c. Proteínas de unión TGF-beta mutantes Según se describe en la presente y abajo en los Ejemplos (por ejemplo, Ejemplos 8 y 9), las versiones alteradas de proteína de unión TGF-beta que compiten con la habilidad de la proteína de unión TGF-beta nativa para bloquear la actividad de un miembro de familia de TGF-beta particular deberá conducir a densidad ósea aumentada. De esta manera, los mutantes de la proteína de unión TGF-beta que se unen al miembro de familia TGF-beta no inhiben la función del miembro de familia TGF-beta que cumpliría el criterio. Las versiones mutantes deben competir eficazmente con las funciones inhibidoras endógenas de proteína de unión TGF-beta. d. Producción de Proteínas Los polipéptidos descritos en la presente incluyen la proteína de unión TGF esclerostina y variantes de la misma y anticuerpos o fragmentos de la misma que se unen específicamente a esclerostina. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos incluyen derivados que son sustancialmente similares a los polinucleótidos y, cuando es adecuado, a las proteínas (incluyendo péptidos y polipéptidos) que se codifican por los polinucleótidos y sus derivados. Según se utiliza en la presente, una secuencia de nucleótido se considera que es "sustancialmente similar" si (a) la secuencia de nucleótido se deriva de la región codificadora de los polinucleótidos descrita en la presente e incluye, por ejemplo, las partes de la secuencia o variaciones alélicas de las secuencias anteriormente discutidas, o alternativamente, codifica una molécula que inhibe la unión de proteína de unión TGF-beta a un miembro de la familia TGF-beta; (b) la secuencia de polinucleótido es capaz de hibridizar a secuencias de polinucleótido de la presente invención bajo rigurosidad modera, alta o muy alta (véase Sambrook eí al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001 ); y/o (c) las secuencias de ADN se degeneran como resultado del código genético a las secuencias de ADN definidas en (a) o (b). Además, la molécula de ácido nucleico descrita en la presente incluye tanto secuencias complementarias como no complementarias, con la condición de que las secuencias de otra forma cumplan los criterios establecidos en la presente. Dentro del contexto de la presente invención, la rigurosidad alta significa las condiciones de hibridización estándar (por ejemplo, 5xSSPE, 0.5% a 65°C, o el equivalente). La estructura de las proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente puede pronosticarse de los productos de traducción primaria utilizando la función de grupo de hidrofobicidad de, por ejemplo, P/C Gene or Intelligenetics Suite (lntelligenetics, Mountain View, California), o de acuerdo a los métodos descritos por Kyte and Doolittle (J. Mol. Biol. 1 d7: 106-132, 1982). Las proteínas de la presente invención pueden prepararse en la forma de sales básicas o acídicas o en forma neutral. Además, los residuos de aminoácido individuales pueden modificarse por oxidación o reducción. Además, diversas sustituciones, supresiones, o adiciones pueden hacerse a las secuencias de ácido nucleico o aminoácido, el efecto neto de lo cual es retener o además mejorar o reducir la actividad biológica de la proteína tipo silvestre o mutante. Además, debido a la degeneración en el código genético, por ejemplo, puede existir variación considerable en las secuencias de nucleótido que codifican la misma secuencia de aminoácido. Otros derivados de las proteínas descritas en la presente incluyen conjugados de las proteínas con otras proteínas o polipéptidos. Esto puede lograrse, por ejemplo, por la síntesis de proteínas de fusión de N-terminal o C-terminal que pueden agregarse para facilitar la purificación o identificación de proteínas (véase, Patente de EE. UU. No. 4,851 , 341 , véase también, Hopp eí al. , BiolTechnology 6: 1204, 1988). Alternativamente, las proteínas de fusión tales como proteína de unión FLAG/TGF-beta pueden construirse a fin de ayudar en la identificación, expresión, y análisis de la proteína. Las proteínas descritas en la presente pueden construirse utilizando una amplia variedad de técnicas descritas en la presente. Además, las mutaciones pueden introducirse en sitios particulares al sintetizar oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción, permitiendo la ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Siguiente a la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un derivado que tiene la inserción, sustitución, o supresión de aminoácido deseada. Alternativamente, los procedimientos de mutagénesis específicos por sitio dirigido por oligonucleótido (o segmento específico) pueden emplearse para proporcionar un polínucleótido alterado que tiene codones particulares alterados de acuerdo a la sustitución, supresión, o inserción. Los métodos ejemplares para elaborar las alteraciones establecidas anteriormente se describen por Walder et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer eí al. (Gene 37: 73, 1985); Craik (BioTechniques, Enero 1985, 12-19); Smith eí al. (Genetic Engineering: Principies and Methods, Plenum Press, 1981 ); y Sambrook eí al. (supra). Los derivados de truncación o supresión de proteínas (por ejemplo, una parte extracelular soluble) también pueden construirse al utilizar sitios de endonucleasa de restricción conveniente adyacentes a la supresión deseada. Subsecuente a la restricción, pueden llenarse salientes en y el ADN religado. Los métodos ejemplares para elaborar las alteraciones establecidas anteriormente se describen por Sambrook eí al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989). Las mutaciones que se elaboran en las moléculas de ácido nucleico preferentemente preservan la estructura de lectura de las secuencias codificadoras. Además, las mutaciones preferentemente no crearán regiones complementarias que cuando se transcriben podrían hibridizarse para producir estructuras de mARN secundarias, tales como ciclos u horquillas, que podrían afectar la traducción del mARN. A pesar de que puede determinarse un sitio de mutación, no es necesario que la naturaleza de la mutación per se se predetermine. Por ejemplo, a fin de seleccionarse para características óptimas de mutantes a un sitio dado, la mutagénesis al azar puede conducirse en el codón objetivo y los mutantes expresados seleccionados para ganancia, pérdida o retención de actividad biológica. Alternativamente, las mutaciones pueden introducirse en sitios particulares al sintetizar oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción permitiendo la ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Siguiente a la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un derivado que tiene la inserción, sustitución o supresión del aminoácido deseada. Las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de la presente invención también pueden construirse utilizando técnicas tales como mutagénesis PCR, mutagénesis química (Drinkwater and Klinedinst, PNAS 83: 3402-3406, 1986), por mala incorporación de nucleótido forzada (por ejemplo, Liao and Wise Gene 88: 107- 1 1 1 , 1990), o uso de oligonucleótidos mutagenizados al d azar (Horwitz eí al. , Genome 3: 1 12- 1 17, 1989). La presente invención también se proporciona para la manipulación y expresión de los genes anteriormente descritos y las moléculas de ácido nucleico al cultivar las células huésped que contienen un vector capaz de expresar los genes anteriormente 0 descritos. Tales vectores o construcciones de vector incluyen ya sea moléculas de ácido nucleico derivado por cADN o sintético que codifica la proteína deseada, los cuales se unen operativamente a elementos reguladores de traducción o transcripción adecuados. Los elementos reguladores adecuados pueden derivarse de una variedad d de fuentes, incluyendo genes bacterianos, fúngicos, virales, mamífero, insecto o planta. La selección de elementos reguladores adecuados es dependiente de la célula huésped seleccionada, y puede lograrse fácilmente por un experto en la materia. Los ejemplos de elementos reguladores incluyen un reforzador y promotor de traducción o 0 secuencia de unión de polimerasa de ARN, un terminador de traducción, y una secuencia de unión ribosómica que ¡ncluye una señal de inicio de traducción. Las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las proteínas anteriormente descritas pueden expresarse d fácilmente por una amplia variedad de células huésped eucarióticas y procarióticas, incluyendo células bacterianas, de mamífero, levadura u otros hongos, virales, de insecto o de planta. Los métodos para transformar o transfectar tales células para expresar el ADN ajeno se conocen bien en la materia (véase, por ejemplo, Itakura eí al. , Patente d de EE.UU. No. 4,704, 362; Hinnen eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 7d: 1929-1933, 1 978; Murray eí al. , Patente de EE.UU. No. 4,801 , 642; Upshall eí al. , Patente de EE.UU. No. 4,93d, 349; Hagen eí al. , Patente de EE. UU. No. 4, 784, 9d0; Axel eí al. , Patente de EE.UU. No. 4,399, 216; Goeddel eí al. , Patente de EE. UU. No. 4,766, 07d; and 0 Sambrook eí al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; para células de planta véase Czako and Marton, Plant Physio. 104: 1067-1071 , 1994; y Paszkowski eí al. , Biotech. 24: 387-392, 1992). Las células huésped bacterianas adecuadas para llevar a d cabo la presente ¡nvención ¡ncluyen E. col, ; B. subtilis, Salmonella typhimurium; y diversas especies dentro del género Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus, así como también otras especies bacterianas bien conocidas por un experto en la materia. Un ejemplo representativo de una célula huésped bacteriana incluye E. coli DHda 0 (Stratagene, LaJolla, California). Los vectores de expresión bacteriana preferentemente comprenden un promotor que funciona en la célula huésped, uno o más marcadores fenotípicos elegibles, y un origen bacteriano de duplicación. Los promotores representativos incluyen la ß-lactamasa 5 (penicilinasa) y sistema de promotor de lactosa (véase Chang eí al. , Nature 275: 616, 1978), el promotor de polimerasa ARN T7 (Studier eí al. , Meth. Enzymol. 185: 60-89, 1990), el promotor lambda (Elvin eí al., Gene 87: 123-126, 1990), el promotor trp (Nichols and Yanofsky, Meth. in Enzymology 101: 155, 1 983), y el promotor tac (Russell eí al. , Gene 20: 231 , 1982). Los marcadores elegibles representativos incluyen varios marcadores de resistencia antibiótica tales como genes de resistencia de ampicilina o kanamicina. Varios plásmidos adecuados para transformar las células huésped se conocen bien en la materia, incluyendo entre otros, pBR322 (véase Bolívar eí al. , Gene 2: 96, 1977), los plásmidos pUC 18, pUC 19, pUC 1 1 8, pUC 1 19 (véase Messing, Meth. in Enzymology 101: 20-77, 1983 y Vieira and Messing, Gene 19: 269-268, 1982), y pNH8A, pNH 16a, pNH1 8a, y Bluescript M13 (Stratagene, La Jolla, California). Las células huésped de hongos y levadura para llevar a cabo la presente invención incluyen entre otras, Saccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, los géneros Pichia o Kluyveromyces y diversas especies del género Aspergillus (McKnight eí al. , Patente de EE. UU. No. 4,936, 349). Los vectores de expresión adecuados para levadura y hongos incluyen, entre otros, YCpdO (ATCC No. 37419) para levadura, y el vector de clonación amdS pV3 (Turnbull, Bio/Technology 7: 169, 1989), YRp7 (Struhl et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76: 1036-1039, 1978), YEpl3 (Broach eí al. , Gene 8: 121 -133, 1979), pJDB249 y pJDB219 (Beggs, Nature 275: 104-108, 1978) y derivados de los mismos. Los promotores preferidos para utilizarse en levadura incluyen promotores de genes glicolíticos de levadura (Hitzeman eí al. , J Biol. Chem. 255: 12073-12080, 1980; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1: 419-434, 1982) o genes dehidrogenasa de alcohol (Young eí al. , en Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender eí al. (eds.), p. 365, Plenum, New York, 1982; Ammerer, Meth. Enzymol. 101: 192-201 , 1983). Los ejemplos de promotores útiles para vectores de hongo incluyen aquellos derivados de genes glicolíticos Aspergillus nidulans, tales como el promotor adh3 (McKnight eí al. , EMBO J 4: 2093-2099, 1985). Las unidades de expresión también pueden incluir un terminador de transcripción. Un ejemplo de un terminador adecuado es el terminado adh3 (McKnight eí al. , supra, 1985). Así como los vectores bacterianos, los vectores de levadura generalmente incluirán un marcador elegible, el cual puede ser uno de cualquier número de genes que muestran un fenotipo de dominio para lo cual existe un ensayo fenotípico para permitir a los transformantes seleccionarse. Los marcadores elegibles preferidos son aquellos que complementan la auxotrofía de célula huésped, proporcionan resistencia antibiótica, o permiten a una célula utilizar fuentes de carbono específicas, e incluyen leu2 (Broach et al. , ibid), ura3 (Botstein eí al. , Gene 8: 17, 1 979), o his3 (Struhl et al., ibid.). Otro marcador elegible adecuado es el gen cat, el cual confiere la resistencia de cloramfenicol en células de levadura. Las técnicas para transformar hongos se conocen bien en la literatura y se han descrito, por ejemplo, por Beggs (ibid.), Hinnen ef al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75: 1929- 1 933, 1978), Yelton eí al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1740-1747, 1 984), y Russell (Nature 301: 167-169, 1983). El genotipo de la célula huésped puede contener un defecto genético que se complementa por el marcador elegible presente en el vector de expresión. La elección de un huésped particular y marcador elegible se encuentra bien dentro del nivel del experto en la materia. Los protocolos para la transformación de levadura también se conocen por aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, la transformación puede lograrse fácilmente ya sea por preparación de esferoplastos de levadura con ADN (véase Hinnen eí al. , PNAS USA 75: 1929, 1978) o por tratamiento con sales alcalinas tales como LilCI (véase Itoh eí al. , J. Bacteriology 753: 163, 1983). La transformación de hongos también pueden llevarse a cabo utilizando polietilenglicol según se describe por Cullen eí al. (Bio/Technology 5:369, 1987). Los vectores virales incluyen aquellos que comprenden un promotor que dirige la expresión de una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína deseada según se describe anteriormente. Una amplia variedad de promotores pueden utilizarse dentro del contexto de la presente invención, incluyendo, por ejemplo, promotores tales como MoMLV LTR; RSV LTR, Friend MuLV LTR; promotor adenoviral (Ohno eí al. , Science 265:781 -784, 1994); promotor/reforzador de fosfotransferasa de neomicina; promotor tardío parvovirus (Koering eí al. , Hum. Gene Therap. 5:457-463, 1994); promotor Herpes TK; promotor SV40; reforzador/promotor de gen metalotioneina lia; promotor temprano inmediato de citomegalovirus, y el promotor tardío inmediato de citomegalovirus. Dentro de las modalidades particulares preferidas de la invención, el promotor es un promotor específico de tejido (véase, por ejemplo, WO 91/02805; EP 0,415,731 ; y WO 90/07936). Los ejemplos representativos de promotores específicos de tejido adecuados incluyen promotor de enolasa específico neural, promotor beta de factor de crecimiento derivado de plaqueta, promotor de proteína morfogénica ósea, promotor alfal -quimaerina humano, promotor sinapsina I y promotor sinapsina I I . Además, de los promotores anteriormente señalados, otros promotores específicos virales (por ejemplo, promotores retrovirales (incluyendo aquellos anteriormente señalados, así como también otros promotores tales como VIH), hepatitis, herpes (por ejemplo, EBV), y promotores específicos bacterianos, fúngicos o de parásito (por ejemplo, malarios) pueden utilizarse a fin de tener como objetivo una célula específica o tejido que se infecta con un virus, bacteria, hongo o parásito. Las células de mamífero adecuadas para llevar a cabo la presente invención incluyen, entre otras, COS, CHO, SaOS, osteosarcomas, KS483, MG-63, osteoblastos primarios, y estroma de médula ósea de mamífero y humano. Los vectores de expresión de mamífero para utilizarse en llevar a cabo la presente invención incluirán un promotor capaz de dirigir la transcripción de un gen clonado o cADN. Los promotores preferidos incluyen promotores virales y promotores celulares. Los promotores específicos de hueso incluyen el promotor para la proteína de sialo de hueso y el promotor para osteocalcina. Los promotores virales incluyen el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (Boshart eí al. , Cell 47:521 -530, 1985), promotor tardío inmediato citomegalovirus, promotor SV40 (Subramani eí al. , Mol. Cell. Biol. 1 :854-864, 1981 ), MMTV LTR, RSV LTR, metalotioneina-1 , adenovirus E1 a. Los promotores celulares incluyen el promotor metalotioneina-1 de ratón (Palmiter eí al. , Patente de EE.UU. No. 4,579,821 ), un promotor V? (Bergman eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87 :7041 -7045, 1 983; Grant eí al. , Nucleic Acids Res. 15:5496, 1987) y un promotor de ratón VH (Loh eí al. , Cell 33:85-93, 1983). La elección de promotor dependerá, al menos en parte, del nivel de expresión deseada o de la estirpe de célula de recipiente a transfectar. Tales vectores de expresión también pueden contener un grupo de sitios de división de ARN ubicados río abajo del promotor y río arriba de la secuencia de ADN que codifica el péptido o proteína de interés. Los sitios de división de ARN preferidos pueden obtenerse de adenovirus y/o genes de inmunoglobulina. También se contiene en los vectores de expresión una señal de poliadenilación ubicada río arriba de la secuencia codificadora de interés. Las señales de poliadenilación adecuadas incluyen las señales de poliadenilación tempranas o tardías de SV40 (Kaufman and Sharp, ibid.), la señal de poliadenilación de la región Adenovirus 5 E1 B y el terminador de gen de hormona de crecimiento humano (DeNoto eí al. , Nucleic Acids Res. 9:3719-3730, 1981 ). Los vectores de expresión pueden incluir una secuencia líder viral no codificadora, tal como líder tripartido Adenovirus 2, ubicado entre el promotor y los sitios de división de ARN. Los vectores preferidos también pueden incluir secuencias de reforzador, tal como el reforzador SV40. Los vectores de expresión también pueden incluir secuencias que codifican los ARNs de adenovirus VA. Los vectores de expresión adecuados pueden obtenerse de fuentes comerciales (por ejemplo, Stratagene, La Jolla, California). Las construcciones de vector que comprenden secuencias de ADN clonado pueden introducirse en células de mamífero cultivadas, por ejemplo, por transfección mediada por liposoma, transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler eí al. , Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981 ; Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973), electroporación (Neumann eí al. , EMBO J. 7:841 -845, 1982), o transfección mediada por dextrano DEAE (Ausubel eí al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. , NY, 1987). Para identificar las células que se han transfectado adecuadamente con el vector que contiene el ADN clonado, un marcador elegible se introduce generalmente en las células junto con el gen o cADN de interés. Los marcadores elegibles preferidos para utilizarse en genes de células de mamífero cultivados incluyen genes que confieren resistencia a fármacos, tales como neomicina, higromicina, y metotrexato. El marcador elegible puede ser un marcador elegible amplificable. Los marcadores elegibles amplificables preferidos son el gen DHFR y el gen de resistencia neomicina. Los marcadores elegibles se revisan por Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Massachusetts). Las células de mamífero que contienen un vector adecuado se permiten crecer por un período de tiempo, típicamente 1 -2 días, para comenzar a expresar la (s) secuencia (s) de ADN de interés. La selección de fármaco se aplica así para seleccionar el crecimiento de las células que se encuentran expresando el marcador elegible en una forma adecuada. Para las células que se han transfectado con un marcador amplificable, elegible, la concentración de fármaco puede aumentarse en una manera gradual para seleccionar un número de copia aumentado de las secuencias clonadas, aumentando de tal modo los niveles de expresión. Las células que expresan las secuencias introducidas se seleccionan y se seleccionan para la producción de la proteína de interés en la forma deseada o en el nivel deseado. Las células que satisfacen estos criterios pueden clonarse y clasificarse para producción. Los protocolos para la transfección de células de mamífero se conocen bien por aquellos expertos en la materia. Los métodos representativos incluyen transfección mediada por fosfato de calcio, transfección mediada por fusión de protopolasto, electroporación, lipofección, retroviral, y adenoviral (véase, Sambrook, eí al. supra). Las construcciones de vector naturales también pueden tomarse por células musculares u otras células adecuadas subsecuentes para la inyección en el músculo de un mamífero (u otros animales). Los métodos para utilizar las células huésped de insecto y las células huésped de planta para la producción de polipéptidos se conocen en la materia y se describen en la presente. Numerosas células huésped de insecto conocidas en la materia también pueden ser útiles en la presente invención. Por ejemplo, el uso de baculovirus como vectores para expresar las secuencias de ADN heterólogas en células de insecto se ha revisado por Atkinson eí al. , (Pestic. sci. 28:215-224, 990). Numerosos vectores y células huésped de planta conocidas en la materia también pueden ser útiles dentro de la presente invención, por ejemplo, el uso de Agrobacterium rhizogenes como vectores para expresar genes y moléculas de ácido nucleico en células de planta (véase revisión Sinkar eí ai. J. Biosci. (Bangalore) 1 1 :47-58, 1987). Dentro de los aspectos relacionados de la presente invención, las proteínas de la presente invención pueden expresarse en un animal transgénico cuya células germinales y células somáticas contienen un gen que codifica la proteína deseada y que se une operativamente a un promotor eficaz para la expresión del gen. Alternativamente, en una manera similar, pueden prepararse animales transgénicos que carecen el gen deseado (por ejemplo, ratones de "golpe"). Tales transgénicos pueden prepararse en una variedad de animales no humanos, incluyendo, ratones, ratas, conejos, ovejas, perros, cabras, y cerdos (véase Hammer eí al. , Nature 375:680-683, 1985, Palmiter eí al. , Science 222:809-814, 1983, Brinster eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:4438-4442, 1985, Palmiter and Brinster, Cell 47:343-345, 1985, y Patentes de EE.UU. Nos. 5, 175,383, 5,087,571 , 4,736,866, 5,387,742, 5,347,075, 5,221 ,778, and 5, 175,384). En resumen, un vector de expresión, incluyendo una molécula de ácido nucleico a expresar junto con las secuencias de control de expresión adecuadamente colocadas, se introduce en pro-núcleos de huevos fertilizados, por ejemplo, por microinyección. La integración del ADN inyectado se detecta por el análisis de mancha de ADN de muestras de tejido. Se prefiere que el ADN introducido se incorpore en la estirpe germinal del animal de tal forma que se pase sobre la descendencia del animal. La expresión específica de tejido puede lograrse a través del uso de un promotor específico de tejido, o a través del uso de un promotor inducible, tal como el promotor de gen metalotioneina (Palmiter eí al., 1983, supra), ei cual permite la expresión regulada del transgen. Las proteínas pueden aislarse, entre otros métodos, al cultivar sistemas de vector y huésped adecuados para producir los productos de traducción recombinante según se describe en la presente. Los sobrenadantes de tales estirpes de célula, o cuerpos de Inclusión de proteína, o células completas de las cuales la proteína no se secreta en el sobrenadante, pueden tratarse así por una variedad de procedimientos de purificación a fin de aislar las proteínas deseadas. Por ejemplo, el sobrenadante puede concentrarse primero utilizando filtros de concentración de proteína comercialmente disponibles, tales como unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Siguiente a la concentración, el concentrado puede aplicarse a un aglomerante de purificación adecuado tal como un aglomerante de afinidad, por ejemplo, un anticuerpo anti-proteína (por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido a aislarse) unido a un soporte sólido. Alternativamente, las resinas de intercambio de catión o anión o aglomerantes de exclusión por tamaño pueden emplearse a fin de purificar la proteína. Como una alternativa adicional, una o más etapas de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) pueden utilizarse para purificar la proteína. Otros métodos para aislar las proteínas de la presente invención se conocen bien en la materia. La pureza de un polipéptido aislado puede determinarse mediante técnicas conocidas en la materia y descritas en la presente, tal como electroforesis de gel y métodos de cromatografía. Preferentemente, tales polipéptidos aislados son al menos aproximadamente 90% puros, más preferentemente al menos aproximadamente 95% puros, y más preferentemente al menos aproximadamente 99% puros. Dentro de ciertas modalidades específicas, una proteína se considera que se "aisla" dentro del contexto de la presente invención si no se selecciona otra proteína no deseada respecto al análisis SDS-PAGE seguido por tintación azul Coomassie. Dentro de otras modalidades, la proteína deseada puede aislarse de tal forma que ninguna otra proteína no deseada se detecta en cuanto al análisis SDS-PAGE seguido por tintación de plata. 3. Moléculas de Ácido Nucleico Dentro de otros aspectos de la invención, se proporcionan las moléculas de ácido nucleico que son capaces de inhibir la proteína de unión TGF-beta a un miembro de la familia de TGF-beta. Por ejemplo, dentro de una modalidad se proporcionan las moléculas anti-sentido que inhiben específicamente la expresión de secuencias de ácido nucleico de proteína de unión TGF-beta (véase generalmente, Hirashima eí al. in Molecular Biology of RNA: New Perspectives (M. Inouye and B. S. Dudock, eds. , 1987 Academic Press, San Diego, p. 401 ); Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression (J.S. Cohén, ed. , 1989 MacMillan Press, London); Stein and Cheng, Science 267: 1004-1012, 1993; WO 95/10607; Patente de EE.UU. No. 5,359,051 ; WO 92/06693; and EP-A2-612844). En resumen, tales moléculas se construyen de tal forma que son complementarias a, y capaces de formar pares base Watson-Crick con, una región de secuencia de mARN de proteína de unión TGF-beta transcrita. El ácido nucleico de doble filamento resultante interfiere con el procesamiento subsecuente del mARN, previniendo de tal modo la síntesis de proteína (véase Ejemplo 1 0). Dentro de otros aspectos de la invención, se proporcionan ribozimas que son capaces de inhibir la unión de proteína de unión TGF-beta a un miembro de la familia TGF-beta. Según se utiliza en ia presente, "ribozimas" se pretende que incluyen moléculas de ARN que contienen secuencias anti-sentido para el reconocimiento específico, y una actividad enzimática de división de ARN. El filamento catalítico divide un sitio específico en un ARN objetivo a más de una concentración estequiométrica. Una amplia variedad de ribozimas pueden utilizarse dentro del contexto de la presente invención, incluyendo por ejemplo, el ribozima martillo (por ejemplo, según se describe por Forster and Symons, Cell 48:21 1 -220, 1987; Haseloff and Gerlach, Nature 328:596-600, 1988; Walbot and Bruening, Nature 334: 1 96, 1988; Haseloff and Gerlach, Nature 334:585, 1988); ribozima de horquilla (por ejemplo, según se describe por Haseloff eí al. , Patente de EE. UU. No. 5,254,678, otorgada el 1 9 de octubre de 1 993 y Hempel eí al. , Solicitud de Patente Europea No. 0 360 257, publicada el 26 de Marzo de 2000); y ribozimas basados en ARN ribosómico Tetrahymena (véase Cech eí al. , Patente de EE. UU. No. 4,987,071 ). Los ribozimas de la presente invención típicamente consisten de ARN, pero también pueden componerse de ADN, análogos de ácido nucleico (por ejemplo, fosforotioatos), o quiméricos del mismo (por ejemplo, ADN/ARN/ARN). 4. Etiquetas El producto de gen o cualquiera de las moléculas candidato anteriormente descritas y abajo, pueden etiquetarse con una variedad de compuestos, incluyendo por ejemplo, moléculas fluorescentes, toxinas, y radionúclidos. Los ejemplos representativos de moléculas fluorescentes incluyen fluoresceína, proteínas Phycobili, tales como ficoeritricina, rodamina, rojo Texas, y luciferasa. Los ejemplos representativos de toxinas incluyen ricina, toxina de difteria abrin, toxina de cólera, gelonina, proteína antiviral de grana, tritin, toxina Shigella, y exotoxina A Pseudomonas. Los ejemplos representativos de radionúclidos incluyen Cu-64, Ga-67, Ga-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99m , Rh-105, Pd-109, ln-1 1 1 , 1-123, 1-125, 1-131 , Re-1 86, Re-188, Au-198, Au-199, Pb-203, At-21 1 , Pb-212 y Bi-212. Además, los anticuerpos anteriormente descritos también pueden marcarse o conjugarse para una pareja de un par de unión de ligante. Los ejemplos representativos incluyen proteína avidina-biotina, estraptividina-biotina, y riboflavina-riboflavina. Los métodos para conjugar o etiquetar las moléculas descritos en la presente con las etiquetas representativas anteriormente establecidas pueden lograrse fácilmente por un experto en la materia (véase Trichothecene Antibody Conjúgate, Patente de EE. UU. No. 4,744,981 ; Antíbody Conjúgate, Patente de EE. UU. No. 5, 106,951 ; Fluorogenic Materials and Labeling Techniques, Patente de EE.UU. No. 4,01 8,884; Metal Radionuclide Labeled Proteins for Diagnosis and Therapy, Patente de EE. UU. No. 4,897,255; and Metal Radionuclide Chelating Compounds for Improved Chelation Kinetics, Patente de EE. UU. No. 4,988,496; véase también Inman, Methods In Enzymology, Vol. 34, Affinity Techniques, Enzyme Purification: Part B, Jakoby and Wilchek (eds.), Academic Press, New York, p. 30, 1 974; véase también Wilchek y Bayer, "The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications," Anal. Biochem. 777 : 1 -32, 1 988).

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Según se señala anteriormente, la presente invención también proporciona una variedad de composiciones farmacéuticas, comprendiendo una de las moléculas anteriormente descritas que inhibe la unión de la proteína de unión TGF-beta a un miembro de la familia TGF-beta junto con un vehículo, excipiente, o diluyente farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable. Generalmente, tales vehículos deberán ser no tóxicos para los recipientes en las dosis y concentraciones empleadas. Ordinariamente, la preparación de tales composiciones comprende combinar el agente terapéutico con reguladores; anti-oxidantes tales como ácido ascórbico, bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos), polipéptidos; proteínas; aminoácidos; carbohidratos que incluyen maltosa, glucosa, sucrosa, o dextrinas; agentes queladores tal como EDTA; glutationa; y otros estabilizadores y excipientes. La salina regulada neutral o salina mezclada con albúmina de suero no específica son diluyentes ejemplares. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden prepararse para administración mediante una variedad de diferentes rutas. En general, el tipo de vehículo se selecciona en base al modo de administración. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse por cualquiera manera adecuada de administración, incluyendo, por ejemplo administración local, oral, nasal, intratecal, rectal, vaginal, sublingual o parenteral, incluyendo inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intrasternal, intracavernosa, intrametal, o intrauretral. Una composición farmacéutica (por ejemplo, para administración oral o suministro por inyección) puede encontrarse en la forma de un líquido (por ejemplo, un elixir, jarabe, solución, emulsión o suspensión). Una composición farmacéutica líquida puede incluir, por ejemplo, uno o más de los siguientes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, preferentemente salina fisiológica, solución Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites fijos que pueden servir como el solvente o medio de suspensión, polietilénglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes; agente antibacterianos; antioxidantes; agentes queladores; reguladores tales como acetatos, citratos, o fosfatos y agentes para el ajuste de tonicidad tal como cloruro de sodio o dextrosa. Una preparación parenteral puede encerrarse en ampolletas, jeringas desechables o frascos de múltiples dosis elaborados de vidrio o plástico. El uso de salina fisiológica se prefiere, y una composición farmacéutica inyectable es preferentemente estéril. Las composiciones descritas en la presente pueden formularse para liberación sostenida (es decir, una formulación tal como una cápsula o esponja que efectúa una liberación lenta de compuesto siguiente a la administración). Tales composiciones pueden prepararse generalmente utilizando tecnología bien conocida y administrarse, por ejemplo, por implantación recta o subcutánea, o por implantación en el sitio objetivo deseado. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener un agente disperso en un aglomerante vehículo y/o contenerse dentro de un recipiente rodeado por una membrana controladora de tasa. Los vehículos para utilizarse dentro de tales formulaciones son biocompatibles, y también pueden ser biodegradables; preferentemente, la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación de componente activo. La cantidad de compuesto activo contenida dentro de una formulación de liberación sostenida depende del sitio de implantación, la tasa y duración esperada de liberación y la naturaleza de la condición a tratar o prevenir. Los vehículos ilustrativos útiles en este aspecto ¡ncluyen micropartículas de poli(láctido-co-glicólido), poliacrilato, látex, almidón, celulosa, dextrano y lo similar. Otros vehículos de liberación retardada ilustrativos incluyen biovectores supramoleculares, que comprenden un núcleo hidrofílico no líquido (por ejemplo, polisacárido u oligosacárido degradado) y, opcionalmente, una capa externa que comprende un compuesto anfífílico, tal como fosfolípido (véase, por ejemplo, Patente de EE. UU. No. 5, 151 ,254 y solicitudes PCT WO 94/20078, WO/94/23701 y WO 96/06638). En otra modalidad ilustrativa, las microesferas biodegradables (por ejemplo, polilactato, poliglicolato) se emplean como vehículos para las composiciones de esta invención. Las microesferas biodegradables adecuadas se describen, por ejemplo, en Patentes de EE.UU. Nos. 4,897,268; 5,075, 109; 5,928,647; 5,81 1 , 128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344, 5,407,609 y 5,942,252. Los sistemas de vehículo de proteína de núcleo de hepatitis B modificados, tal como se describen en WO/99 40934, y referencias citadas en la presente, también serán útiles para varias solicitudes. Otro sistema de vehículo/suministro ilustrativo emplea un vehículo que comprende complejos de particulado-proteína, tal como aquellos descritos en la Patente de EE.UU. No. 5,928,647, los cuales son capaces de inducir respuestas de linfocito T citotóxico restringido por clase I en un huésped. En otra modalidad ilustrativa, las partículas de núcleo de fosfato de calcio se emplean como vehículos o aglomerantes de liberación controlada para las composiciones de esta invención. Las partículas de fosfato de calcio ejemplares se describen, por ejemplo, en solicitud de patente publicada No. WO/0046147. Para composiciones farmacéuticas que comprenden un polinucleótido que codifica un anticuerpo anti-SOST y/o agente modulador (de tal forma que el polipéptido y/o agente modulador se genera en su sitio), el polinucleótido puede presentarse dentro de cualquiera de una variedad de sistemas de suministro conocidos por aquellos expertos en la materia, incluyendo ácido nucleido y sistemas de expresión bacteriana, viral y mamífera. Las técnicas para incorporar el ADN en tales sistemas de expresión se conocen bien por aquellos expertos en la materia. El ADN también puede ser "natural", según se describe, por ejemplo, en Ulmer eí ai , Science 259: 1745-1749, 1993 y revisarse por Cohén, Science 259: 1691 -1692, 1993. La toma de ADN natural puede aumentarse al revestir el ADN en perlas biodegradables, que se transportan eficazmente en las células. El desarrollo de regímenes de tratamiento y dosificación adecuados para utilizar las composiciones particulares descritas en la presente en una variedad de regímenes de tratamiento, incluyendo, por ejemplo, administración y formulación oral, parenteral, intravenosa, intranasal e intramuscular, se conoce bien en la materia, algunos de los cuales se discuten abajo a detalle para propósitos generales de ilustración. En ciertas solicitudes, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden suministrarse por medio de administración oral a un animal. Como tales, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o pueden encerrarse en cápsula de gelatina de corteza dura o suave, o pueden comprimirse en tabletas, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta. En ciertas circunstancias será deseable suministrar las composiciones farmacéuticas descritas en la presente parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente o aún intraperitonealmente. Tales procedimientos se conocen bien por aquel experto en la materia, algunos de los cuales se describen además, por ejemplo, en Patente de EE. UU. No. 5,543, 158; Patente de EE. UU. No. 5,641 ,515 y Patente de EE. UU. No. 5,399,363. En ciertas modalidades, las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua adecuadamente mezclada con un agente tensoactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones pueden también prepararse en glicerol, polietilénglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones generalmente contendrán un conservador para prevenir el crecimiento de microorganismos. Las formas farmacéuticas ilustrativas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (por ejemplo, véase, Patente de EE.UU. No. 5,466,468). En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida al grado que exista facilidad para inyectar. Deber ser estable bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un medio de dispersión o solvente que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y lo similar), mezclas adecuadas del mismo, y/o aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerida en el caso de dispersión y/o por el uso de agentes tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede facilitarse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y lo similar. En varios casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables pueden traerse aproximadamente por el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. En una modalidad, para la administración parenteral en una solución acuosa, la solución deberá regularse adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido primero convertirse en isotónico con suficiente salina o glucosa. Esas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En este caso, un medio acuoso estéril que puede emplearse se conocerá por aquellos expertos en la materia a luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosis puede disolverse en 1 ml de solución de NaCI ¡sotónico y después agregarse a 1000 ml de fluido hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión, (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed. , pp. 1035-1038 and 1570-1580). Alguna variación en dosificación se presentará dependiendo de la condición del sujeto a tratar. Además, para la administración humana, las preparaciones por supuesto cumplirán los estándares de esterilidad, pirogenicidad, y la seguridad y pureza general según se requiera por los estándares de la Oficina de Biología FDA. En otra modalidad de la invención, las composiciones descritas en la presente pueden formularse en una forma de sal o neutral. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición acidas (formadas con grupos de amino libre de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos fosfóricos o hidroclóricos, o tales ácidos orgánicos tales como acéticos, oxálicos, tartáricos, mandélicos, y lo similar. Las sales formadas con los grupo carboxilo libre pueden también derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o férrico, y tales bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y lo similar. En la formulación, las soluciones se administrarán en una manera compatible con la formulación de dosificación y en tal cantidad a medida que es terapéuticamente eficaz. Los vehículos pueden además comprender cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, vehículos, revestimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardadores de absorción e isotónicos, reguladores, soluciones de vehículo, suspensiones, coloides, y lo similar. El uso de tales medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas se conoce bien en la materia. Excepto hasta ahora a medida que cualquier medio convencional o agente es compatible con el ingrediente activo, su uso en las composiciones terapéuticas se contempla. Los ingredientes activos complementarios también pueden incorporarse en las composiciones. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción desfarovable similar o alérgica cuando se administran a un humano. En ciertas modalidades, los liposomas, nanocápsulas, micropartículas, partículas lípidas, vesículas, y lo similar, se utilizan para la introducción de las composiciones de la presente invención en organismos/células huésped adecuados. En particular, las composiciones de la presente ¡nvención pueden formularse para suministro ya sea encapsularse en una partícula lípída, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, o una nanopartícula o lo similar. Alternativamente, las composiciones de la presente invención pueden unirse, ya sea covalente o no covalentemente, a la superficie de tales vehículos portadores. La formación y uso de liposoma y preparaciones tipo liposoma como vehículos de fármaco potenciales se conoce generalmente por aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Lasic, Trends Biotechnol. 76(7):307-21 , 1998; Takakura, Nippon Rinsho 56(3):691 -95, 1998; Chandran eí ai. , indian J. Exp. Biol. 35(8):801 -09, 1 997; Margaüt, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 72(2-3):233-61 , 1995; Patente de EE. UU. No. 5,567,434; Patente de EE.UU. No. 5,552, 157; Patente de EE.UU. No. 5,565,213; Patente de EE. UU. No. 5,738,868 y Patente de EE. UU. No. 5,795,587, cada una específicamente incorporada en la presente para referencia en su totalidad). Los liposomas se han utilizado exitosamente con un número de tipos de célula que son normalmente difíciles de transfectar por otros procedimientos, incluyendo suspensiones de célula T, cultivos de hepatocito primario y células PC12 ( (Renneisen eí al. , J. Biol. Chem. 265(27) ? 6337 -42, 1990; Muller eí al. , DNA Cell Biol. 9(3):221 -29, 1990). Además, los liposomas se encuentran libres de constricciones de longitud de ADN que son típicas de sistemas de suministro con base viral. Los liposomas se han utilizado eficazmente para introducir los genes, diversos fármacos, agentes radioterapéuticos, enzimas, virus, factores de transcripción, efectores alostéricos y lo similar, en una variedad de estirpes de célula cultivadas y animales. Además, el uso de liposomas no parece que se asocie con respuestas autoinmunes o toxicidad inaceptable después del suministro sistémico. En ciertas modalidades, los liposomas se forman de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y espontáneamente forman vesículas de bicapa concéntricas multi-laminales (también denominadas vesículas multi-laminales (MLVs)). Alternativamente, en otras modalidades, ia invención se proporciona para formulaciones de nanocápsula farmacéuticamente aceptables de las composiciones de la presente invención. Las nanocápsulas pueden comprender generalmente compuestos en una manera reproducible y estable (véase, por ejemplo, Quintanar-Guerrero eí al. , Drug Dev. Ind. Pharm. 24(12): 1 1 13-28, 1998). Para evitar efectos secundarios debido a la sobre carga polimérica intracelular, tales partículas ultrafinas (denominadas aproximadamente 0.1 µm) pueden diseñarse utilizando polímeros capaces de degradarse in vivo. Tales partículas pueden elaborarse según se describe, por ejemplo, por Couvreur eí al. , Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5(1 ): 1 -20, 1988; zur Muhlen eí al. , Eur. J. Pharm. Biopharm. 45(2): 149-55, 1 998; Zambaux eí al. , J. Controlled Reléase 50(1 -3):31 -40, 1998; and Patente de EE. UU. No. 5, 145,684. Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden colocarse dentro de contenedores, junto con material de envasado que proporciona instrucciones respecto al uso de tales composiciones farmacéuticas. Generalmente, tales instrucciones incluirán una expresión tangible que describe la concentración de reactivo, así como también dentro de ciertas modalidades, cantidades relativas de ingredientes de excipiente o diluyentes (por ejemplo, agua, salina o PBS) que pueden ser necesarias para reconstituir la composición farmacéutica.

MÉTODOS DE TRATAMIENTO La presente invención también proporciona métodos para aumentar el contenido mineral y la densidad mineral del hueso. En resumen, numerosas condiciones dan como resultado la pérdida de contenido mineral óseo, incluyendo, por ejemplo, enfermedad, predisposición genética, accidentes que dan como resultado la falta de uso del hueso (por ejemplo, debido a la fractura), terapéuticos que efectúan la resorción del hueso o que matan las células formadoras de hueso y envejecimiento normal. A través del uso de las moléculas descritas en la presente que inhiben la unión de la proteína de unión TGF-beta a un miembro de familia TGF-beta, tales condiciones pueden tratarse o prevenirse. Según se utiliza en la presente, ese contenido mineral óseo se entiende que ha aumentado si el contenido mineral óseo ha aumentado en una manera estadísticamente importante en un sitio seleccionado. Una amplia variedad de condiciones que dan como resultado la pérdida de contenido mineral óseo pueden tratarse con las moléculas descritas en la presente. Los pacientes con tales condiciones pueden identificarse a través del diagnóstico clínico utilizando técnicas bien conocidas (véase, por ejemplo, Harrison's Principies of Internal Medicine, McGraw-Hill, Inc.). Los ejemplos representativos de enfermedades que pueden tratarse incluyeron displasias, en donde el crecimiento o desarrollo de hueso es anormal. Los ejemplos representativos de tales condiciones incluyen acondroplasia, disostosis cleidocraneales, encondromatosis, displasia fibrosa, Enfermedad Gaucher, raquitis hipofosfatémica, síndrome Marfan, exotosis hereditaria múltiple, neurofibromatosis, imperfecta osteogenesis, osteopetrosis, osteopoiquilosis, lesiones escleróticas, fracturas, enfermedad periodontal, pseudoartrosis, y osteomielitis piogénicas. Otras condiciones que pueden tratarse o prevenirse incluyen una amplia variedad de causas de osteopenia (es decir, una condición que origina más de una desviación estándar de contenido mineral óseo o densidad abajo del contenido mineral esquelético máximo en juventud). Los ejemplos representativos de tales condiciones incluyen estados anémicos, condiciones originadas por esteroides, condiciones originadas por heparina, desórdenes de médula ósea, escorbuto, desnutrición, deficiencia de calcio, osteoporosis idiopática, osteopenia congenital u osteoporosis, alcoholismo, enfermedad renal crónica, senilidad, estado post-menopáusico, oligomenorrea, amenorrea, embarazo, diabetes mellitus, hipertiroidismo, enfermedad Cushing, acromegalia, hipogonadismo, inmovilización o mal uso, síndrome de distrofia simpatética de reflejo, osteoporosis regional transitoria, y osteomalacia. Dentro de una modalidad de la presente invención, el contenido mineral óseo o densidad puede aumentarse al administrar a un animal de sangre caliente una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula que inhibe la unión de la proteína de unión TGF-beta a un miembro de familia TGF-beta. Los ejemplos de animales de sangre caliente que pueden tratarse incluyen tanto vertebrados como mamíferos, incluyendo por ejemplo, humanos, caballos, vacas, cerdos, ovejas, perros, gatos, ratas, y ratones. Los ejemplos representativos de moléculas terapéuticas ¡ncluyen ribozimas, genes de ribozima, oligonucleótidos anti-sentido, y anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanizados o cualquier otro anticuerpo descrito en la presente). Dentro de otros aspectos de la presente invención, se proporcionan métodos para aumentar la densidad ósea que comprenden las etapas de introducir células que se alojan en hueso, un vector que dirige la expresión de una molécula que inhibe la unión de SOST a un miembro de la familia TGF-beta, y administrar el vector que contiene las células a un animal de sangre caliente. En resumen, las células que se alojan en hueso pueden obtenerse directamente del hueso de pacientes (por ejemplo, células obtenidas de la médula ósea tal como CD34+, osteoblastos, osteocitos, y lo similar), de sangre periférica, o de cultivos. Un vector que dirige la expresión de una molécula que inhibe la unión de proteína de unión TGF-beta a un miembro de la familia de TGF-beta puede introducirse en las células. Los ejemplos representativos de vectores adecuados incluyen vectores virales tales como vectores de herpes viral (por ejemplo, Patente de EE. UU. No. 5,288,641 ); vectores adenoviral (por ejemplo, WO 94/26914, WO 93/9191 ; Kolls et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97(1 ):215-219, 1994; Kass-Eisler eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90(24): 1 1498-502, 1993; Guzman eí al. , Circulation 88(6):2838-48, 1993; Guzman eí al. , Cir. Res. 73(6): 1202-1207, 1993; Zabner eí al. , Cell 75(2):207-216, 1993; Li eí al. , Hum. Gene Ther. 4(4):403-409, 1993; Caillaud eí al. , Eur. J. Neurosci. 5(10: 1287-1291 , 1993; Vincent eí al. , Nat. Genet. 5(2): 130-134, 1 993; Jaffe eí al. , Nat. Genet. 7(5):372-378, 1 992; and Levrero eí al. , Gene 707(2): 195-202, 1991 ); vectores virales adeno-asociados (WO 95/13365; Flotte eí al. , PNAS 90(22): 10613-10617, 1993); vectores baculovirus; vectores parvovirus (Koering eí al. , Hum. Gene Therap. 5:457-463, 1994); vectores de virus sífilis (Panicali y Paoletti, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79:4927-4931 , 1982; y Ozaki eí al. , Biochem. Biophys. Res. Comm. 193(2):653-660, 1993), y retrovirus (por ejemplo, EP 0,415,731 ; WO 90/07936; WO 91 /0285, WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; Patente de EE.UU. No. 5,219,740; WO 93/1 1230; WO 93/10218). De igual forma pueden construirse vectores virales que contienen una mezcla de diferentes elementos (por ejemplo, promotores, secuencias de cubierta, y lo similar) de diferentes virus o de fuentes no virales. Dentro de varias modalidades, ya sea el vector viral por sí mismo, o una partícula viral que contiene el vector viral pueden utilizarse en los métodos y composiciones abajo descritas. Dentro de otras modalidades de la invención, las moléculas de ácido nucleico que codifican una molécula que inhibe la unión de la proteína de unión TGF-beta a un miembro de la familia TGF-beta pueden administrarse por una variedad de técnicas incluyendo, por ejemplo, administración de asialoosomucoide (ASOR) conjugado con complejos de ADN poly-L-lisina (Cristano eí al. , PNAS 92122-92126, 1993); ADN unido a adenovirus eliminado (Curiel eí al. , Hum. Gene Ther. 3(2): 147-154, 1992); introducción mediada por citofectina (DMRIE-DOPE, Vical, California); inyección de ADN directa (Acsadi eí al. , Nature 352:815-818, 1991 ); ligante ADN (Wu eí al. , J. of Biol. Chem. 264: 16985-16987, 1 989); lipofección (Felgner eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989); liposomas (Pickering eí al. , Circ. 89(1 ): 13-21 , 1994; y Wang et al. , PNAS 84:7851 -7855, 1987); bombardeo de microproyectil (Williams eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:2726-2730, 1991 ); y suministro directo de ácidos nucleicos que codifican la proteína por sí misma ya sea solos (Vile and Hart, Cáncer Res. 53: 3860-3864, 1993), o utilizando complejos de PEG-ácido nucleico. Los ejemplos representativos de moléculas que pueden expresarse por los vectores de la presente invención incluyen ribozimas y moléculas anti-sentido, cada una de las cuales se discuten a mayor detalle anteriormente.

La determinación de contenido mineral óseo aumentado puede determinarse directamente a través del uso de rayos X (por ejemplo, Absorptometría de rayos X de Energía Dual o "DEXA") o por interferencia a través de los marcadores de cambio óseo tal como fosfatasa alcalina específica de osteoblasto, osteocalcina, propéptido de procolágeno C tipo 1 (PICP), y fosfatasa alcalina total (véase Comier, Curr. Opin. in Rheu. 7:243 (1995)), o por marcadores de resorción ósea (piridinolina, deoxipiridinolina, N-telopéptido, hidroxiprolina urinaria, fosfatasas de ácido resistente a tartrato de plasma, y galactosilil hidroxilisina (véase Comier, supra.). La cantidad de masa ósea puede también calcularse de pesos corporales o a utilizarse otros métodos (véase Guinness-Hey, Metab. Bone Dis. Relat. Res. 5: 177-181 , 1984). Según será evidente por un experto en la materia, la cantidad y frecuencia de administración dependerá, por supuesto, de tales factores tales como la naturaleza y severidad de la indicación que se trata, la respuesta deseada, la condición del paciente, y así sucesivamente. Típicamente, las composiciones pueden administrarse por una variedad de técnicas, según se señala anteriormente. Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración, y no a manera de limitación.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 MAPAS DE ESCLEROSTOSIS PARA EL BRAZO LARGO DE CROMOSOMA HUMANO 17 El mapeo genético del defecto responsable de la esclerostosis en humanos ubicó el gen responsable de este desorden a la región de cromosoma humano 17 que codifica un nuevo miembro de familia de proteína de unión TGF-beta. En esclerostosis, el hueso esquelético muestra un aumento sustancial en la densidad mineral en relación a aquella de los individuos que la padecen. El hueso en la caberza muestra sobre crecimiento así también. Los pacientes con esclerostosis generalmente son saludables a pesar de que pueden mostrar varios grados de sindactilia en el nacimiento y varios grados de compresión craneal y compresión de nervios en el cerebelo. El análisis de enlace del defecto de gen asociado con esclerostosis se condujo al aplicar el método de mapeo de homozigosidad para las muestras de ADN colectadas de 24 familias de sudafricanos blancos en los cuales se presentó la enfermedad. (Sheffield eí al. , 1994, Human Molecular Genetics 3: 1331 -1335. "Identification of a Bardet-Biedl síndrome locus on chromosome 3 and evaluation of an efficient approach to homozygosity mapping"). La población sudafricana blanca de Sudáfrica es genéticamente homogénea; la población se desciende de un pequeño número de descubridores que colonizaron el área siglos atrás, y se ha aislado por barreras geográficas y sociales desde el descubrimiento. La esclerostosis es rara en cualquier parte en el mundo fuera de la comunidad sudafricana blanca, lo cual sugiere que una mutación en el gen se presentó en la población en descubrimiento y desde entonces ha aumentado en números junto con el aumento en la población. El uso de mapeo de homozigosidad se basa en el presunción de que los marcadores de mapeo de ADN adyacentes a una mutación recesiva es probable que sean homocigotos en individuos que la padecen de familias consanguíneas y poblaciones aisladas. Un grupo de 371 marcadores microsatélite (Research Genetics, Grupo 6) de los cromosomas autosomales se seleccionó para marcar grupos de ADN de muestras de paciente con esclerosteosis. Las muestras de ADN para este análisis vienen de 29 pacientes con esclerostosis en 24 familias, 59 miembras de familia sin padecerla y un grupo de individuos de control no relacionados de la misma población. Los grupos consistieron de 4-6 individuos, ya sea individuos que la padecen, individuos que la padecen de familias consanguíneas, parientes y hermanos que no la padecen, o controles no relacionados. En los grupos de individuos no relacionados y en la mayoría de los grupos con individuos que la padecen o miembros de la familia el análisis de los marcadores mostró varios tamaños de alelo para cada marcador. Un marcador, D17S1299, mostró una indicación de homozigosidad: una banda en varios de los grupos de individuos que la padecen. Todas las 24 familias con esclerostosis se marcaron con un total de 1 9 marcadores en la región de D17S1299 (en 17q 12-q21 ). Los individuos que la padecen de cada familia se mostró que fueron homocigosos en esta región, y 25 de los 29 individuos fueron homocigosos para un haplotipo de núcleo; cada uno de ellos tuvo los mismos alelos entre D17S1787 y D17S930. Los otros cuatro indviduos tuvieron un cromosoma que igualó este haplotipo y un segundo que no lo hizo. En resumen, los datos sugirieron convincentemente que esta regió megabase 3 contuvo la mutación de esclerostosis. El análisis de secuencia de la mayoría de los exones en esta región megabase 3 identifió una mutación de no sentido en la nueva secuencia codificadora de proteína de unión TGF-beta (mutación C>T en la posición 1 17 de la Secuencia ID NO. 1 da como resultado en un codón de detención). Esta mutación se mostró que fue única para los pacientes con esclerostosis y vehículos de descendencia sudafricana blanca. La identidad del gen se confirmó además al identificar una mutación en su intrón (mutación A>T en la posición +3 del intrón) el cual da como resultado un procesamiento en mARN inadecuado en un paciente no relacionado, único con esclerostosis diagnosticada.

EJEMPLO 2 ESPECIFICIDAD DE TEJIDO DE EXPRESIÓN DE GEN DE PROTEÍNA DE UNIÓN TGF-BETA A. Expresión de Gen Beer Humano por RT-PCR: El cADN de primer filamento se preparó de las siguientes muestras de ARN total utilizando un equipo comercialmente disponible ("Superscript Preamplification System for First-strand cADN Synthesis" Life Technologies, Rockville, MD): cerebro humano, hígado humano, bazo humano, timo humano, placenta humana, músculo esquelético humano, tiroide humana, pituitaria humana, osteoblasto humano (NHOst de Clonetics Corp. , San Diego, CA), estirpe de célula de osteosarcoma humano (Saos-2, ATCC# HTB-85), hueso humano, médula ósea humana, cartílago humano, hueso de mono vervet, saccharomyces cerevisiae, y monocitos de sangre periférica humana. Todas las muestras de ARN se adquirieron de una fuente comercial (Clontech, Palo Alto, CA), excepto que las siguientes se prepararon en alojamiento: osteoblasto humano, estirpe de célula de osteosarcoma humano, hueso humano, cartílago humano y hueso de mono vervet. Estas muestras de ARN en alojamiento se prepararon utilizando un equipo comercialmente disponible ("TRI Reagent", Molecular Research Center, Inc. , Cincinnati, OH). PCR se realizó en estas muestras y adicionalmente en una muestra genómica humana como un control. El cebador de oligonucleótido Beer sentido tuvo la secuencia 5'-CCGGAGCTGGAGAACAACAAG-3' (SEQ ID NO: 19). El cebador de oligonucleótido Beer antisentido tuvo la secuencia 5'-GCACTGGCCGGAGCACACC-3' (SEQ I D NO:20). Además, PCR se realizó utilizando los cebadores para el gen beta-actina, como un control. El cebador de oligonucleótido beta-actina sentido tuvo la secuencia 5'-AGGCCAACCGCGAGAAGATGA CC -3' (SEQ ID NO:21 ). El cebador de oligonucleótido beta-actina anti-sentido tuvo la secuencia 5'-GAAGT CCAGGGCGACGTAGCA-3' (SEQ I D NO:22). PCR se realizó utilizando las condiciones estándares en 25 ul reacciones, con una temperatura de ablandamiento de 61 grados Celsius. Treinta y dos ciclos de PCR se realizaron con los cebadores Beer y veinticuatro ciclos se realizaron con los cebadores beta-actina. Siguiente a la amplificación, 12 ul de cada reacción se analizaron po electroforesis de gel de agarosa y tintación de bromuro de etidio. Véase Figura 2A. B. Hibridización in situ de ARN de Secciones de Embrión de Ratón: El cADN de Beer de ratón de longitud completa (Secuencia ID No. 1 1 ) se clonó en el vector pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) en la dirección sentido y antisentido utilizando el protocolo del fabricante. Las transcripciones antisentido y sentido de cARN 35S-aIfa-GTP-marcadas se sintetizaron utilizando los reactivos de transcripción in Vitro suministrados por Ambion, Inc (Austin, TX). La hibridización in situ se realize de acuerdo a los protocolos de Lyons et al. (J. Cell Biol. 777 :2427-2436, 1 990). El medidor de cARN de Beer de ratón detectó un mensaje específico en ei tubo neural, nudos linfáticos, vasos sanguíneos y cartílagos osificantes de embriones de ratón en desarrollo. El Panel A en la Figura 3 muestra la expresión en el borde ectodérmico apical (aer) del nudo linfático (I), vasos sanguíneos (bv) y el tubo neural (nt). El Panel B muestra la expresión en el 4to ventrículo del cerebro (4). El Panel C muestra la expresión en la mandíbula (ma), vértebras cervicales (cv), hueso occipital (oc), paladar (pa) y un vaso sanguíneo (bv). El Panel D muestra la expresión en las costillas (r) y una válvula del corazón (va). El Panel A es una sección transversal de 10.5 dpc de embrión. El Panel B es una sección sagital de 12.5 dpc de embrión y los Paneles C y D son secciones sagitales de 15.5 dpc de embriones. ba=arco branquial, h=corazón, te=telencéfalo (forebrain), b=cerebro, f=masa frontonasal, g=tripa, h=corazón, j=mandíbula, li=hígado, lu=pulmón, ot=vesícula ótica, ao=, sc=médula espinal, skm=músculo esquelético, ns=seno nasal, th=timo, to=lengua, fl=forelimb, di=diafragma.

EJEMPLO 3 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNA BEER RECOMBINANTE A. Expresión en Células COS-1 : La secuencia de ADN que codifica la proteína Beer humana de longitud completa se amplificó utilizando los siguientes cebadores de oligonucleótido PCR: El cebador de oligonucleótido 5' tuvo tuvo la secuencia 5'-AAGCTTGGTACCATGCAGCTCCCAC-3' (SEQ ID NO:23) y contuvo un sitio de enzima de restricción Hindl l l (en negritas) seguido por 19 nucleótidos del gen Beer comenzando 6 pares base antes del codón de inicio de terminal amino presumida (ATG). El cebador de oligonucleótido 3' tuvo ia secuencia 5'-AAGCTTCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTAGGCGTTCTCCAG CT-3' (SEQ ID NO:24) y contuvo un sitio de enzima de restricción Hindl l l (en negritas) segudo por un codón de detención de complemento inverso (CTA) seguido por el complemento inverso del epítopo FLAG (subrayado, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) flanqueado por el complemento inverso de nucleótidos que se codifican para los 5 aminoácidos de terminal caroxi del Beer. El producto PCR se clonó TA ("Original TA Cloning Kit", Invitrogen, Carlsbad, CA) y los clones individuales se seleccionaron por secuencialización ADN. Un clon verificado po secuencia se digirió así por Hindlll y se purificó en 1.5% de gel agarosa utilizando reactivos comercialmente disponibles ("QIAquick Gel Extraction Kit", Qiagen Inc., Valencia, CA). Este fragmento se ligó así al plásmido pcADN3.1 tratado por fosfatasa, digerido po Hindlll (Invitrogen, Carlsbad, CA) con ligasa T4 ADN. DH10B E. coli se transformaron y se laminaron en LB, placas de ampicilina de 100 µg/ml. Las colonias que llevan el recombinante deseado en la orientación adecuada se identificaron por una selección basada en PCR, utilizando un cebador 5' correspondiente al sitio de cebador/promotor T7 en pcDNA3.1 y un cebador 3' con la secuencia 5'-GCACTGGCCGGAGCACACC-3' (SEQ ID NO:25) que corresponde al complemento inverso de secuencia BEER interna. La secuencia del fragmento clonado se confirmó por secuencialización de ADN. Las células COS-1 (ATCC# CRL-1650) se utilizaron para transfección. 50 µg del plásmido de expresión pcADN-beer-Flag se transfectó utilizando un equipo comercialmente disponible siguiendo los protocolos suministrados por el fabricante ("Equipo de Transfección DEAE-Dextran", Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). El medio final siguiente a la transfección fue DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) conteniendo 0.1 % de Suero de Bovino Fetal. Después de 4 días en cultivo, el medio se removió. La expresión de BEER recombinante se analizó por SDS-PAGE y Western Blot utilizando un anticuerpo monoclonal anti-FLAG® M2 (Sigma-Aldrich Co. , St. Louis, MO). La purificación de proteína BEER recombinante se realizó utilizando una columna de afinidad anti-FLAG M2 ("Mammalian Transient Expression System", Sigma-Aldrich Co. , St. Louis, MO). La configuración de columna se analizó por medio de SDS-PAGE y Western Blot utilizando un anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2. B. Expresión en células de insecto SF9: La secuencia de gen Beer humana se amplificó utilizando PCR con condiciones estándares y los siguientes cebadores: Cebador sentido: 5'-GTCGTCGGATCCATGGGGTGGCAGGCGTTCAAGAATGAT-3' (SEQ ID NO:26) Cebador anti-sentido: 5'-GTCGTCAAGCTTCTACTTGTCATCGTCCTTGTAGTCGTAGGCGT TCTCCAGCTCGGC-3' (SEQ ID NO:27) El cADN resultante contuvo la región codificadora de Beer con dos modificaciones. La señal de secreción de N-terminal se removió y una etiqueta de epítopo FLAG (Sigma) se fusionó en estructura al extremo de C-terminal de la inserción. Los sitios de clonación BamH1 y Hindl l l se agregaron y el gen se subclongó en vector pMel Bac (Invitrogen) para transferencia en un vector de expresión baculoviral utilizando métodos estándares. Los baculovirus recombinantes que expresan la proteína Beer se hicieron utilizando el equipo de transfección Bac-N-Blue (Invitrogen) y se purificaron de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes. Las células SF9 (Invitrogen) se mantuvieron en medios TNM_FH (Invitrogen) conteniendo 10% de suero de cabra fetal. Para expresión de proteína, los cultivos SF9 en matraces giratorios se infectaron en un MOI de más de 10. Las muestras de los medios y las células se tomaron diariamente por cinco días, y la expresión de Beer se monitoreó por western blot utilizando un anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 (Sigma) o un antisuero policlonal de conejo anti-Beer. Después de cinco días, las células SFS9 infectadas con baculovirus se colectaron por centriguración y la proteína asociada por célula se extrajo de la pastilla de célula utilizando un regulador de extracción alto en sal (1 .5 M NaCI, 50 mM Tris pH 7.5). El extracto (20 ml por 300 ml de cultivo) se clarificó por centriguración, se dializó tres veces contra cuatro litros de salina regulada Tris (150 mM NaCI, 50 mM Tris pH 7.5), y se clarificó por centrifugación nuevamente. Esta fracción alta en sal se aplicó a Heparina Hitrap (Pharmacia; 5 ml de volumen de lecho), se lavó extensivamente con salina regulada HEPES (25 mM HEPES 7.5, 150 mM Nací) y las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente de 1 50 mM de NaCI a 1200 mM de NaCl. La elución Beer se observó a aproximadamente 800 mM de NaCl. Las fracciones que contienen Beer se complementaron a 10% de glicerol y 1 mM de DTT y se congelaron a -80 grados C.

EJEMPLO 4 PREPARACIÓN Y PRUEBA DE ANTICUERPOS POLICLONALES PARA BEER, GREMLIN Y DAN A. Preparación de antígeno: Las secuencias de ADN de Beer humano, Gremlin humano y Dan humano se amplificaron utilizando métodos PCR estándar con los siguientes cebadores de oligonucleótido: Beer H. Sentido: 5' -GACTTGGATCCCAGGGGTGGCAGGCGTTC- 3' (SEQ ID NO:28) AntiSentido: 5' -AGCATAAGCTTCTAGTAGGCGTTCTCCAG- 3' (SEQ ID NO.29) Gremlin H. Sentido: 5' -GACTTGGATCCGAAGGGAAAAAGAAAGGG- 3' (SEQ ID NO:30) AntiSentido: 5' -AGCATAAGCTTTTAATCCAAATCGATGGA- 3' (SEQ ID NO:31 ) Dan H. Sentido: 5' -ACTACGAGCTCGGCCCCACCACCCATCAACAAG- 3' (SEQ ID NO:32) AntiSentido: 5*-ACTTAGAAGCTTTCAGTCCTCAGCCCCCTCTTCC-3' (SEQ I D NO:33) En cada caso los cebadores listados amplificaron la región codificadora completa menos la secuencia de señal de secreción. Estos incluyen sitios de restricción para subclonarse en el vector de expresión bacteriano pQE-30 (Qiagen Inc. , Valencia, CA) en sitios BamHI/HindII I para Beer y Gremlin, y sitios Sacl/Hindlll para Dan. pQE30 contiene una secuencia codificadora para una etiqueta dxHis en el extremo 5' de la región codificadora. Las construcciones completadas se transformaron en cepa E. coli M-1 d/pRep (Qiagen Inc) y clones individuales verificados por secuencialización. La expresión de proteína en M-1 d/pRep y purificación (unión de etiqueta de afinidad 6xHis a Ni-NTA acoplado a Sepharose) se realizaron según se describe por el fabricante (Qiagen, The QIAexpressionist). La proteína Beer derivada por E. coli se recuperó en cantidad importante utilizando la solubilización en 6M de guanidina y se dializó a 2-4M para prevenir la precipitación durante almacenamiento. Las proteínas Gremlin y Dan se recuperaron en cantidad mayor con solubilización en 6M de guandina y una concentración de guanidina de post-purificación de O.d M. B. Producción y prueba de anticuerpos policlonales: Los anticuerpos policlonales para cada uno de los tres antígenos se produjeron en huéspedes de pollo y conejo utilizando protocolos estándar (R & R Antibody, Stanwood, WA; protocolo estándar para inmunización de conejo y recuperación de antisuero; Short Protocols in Molecular Biology. 2nd edition. 1992. 1 1.37-1 1 .41. Los contribuidores Helen M. Cooper y Yvonne Paterson; el antisuero de pollo se generó con Strategic Biosolutions, Ramona, CA). La fracción Iggy de huevo de pollo y antisuero de conejo se seleccionaron para actividad por medio de Western blot. Cada uno de los tres antígenos se separó por PAGE y se transfirió a 0.46 um de nitrocelulosa (Novex, San Diego, CA). La membrana se cortó en tiras con cada tira conteniendo aproximadamente 76 ng de antígeno. Las tiras se bloquearon en 3% de Bloque de Grado Blotting (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y se lavaron 3 veces en 1 X Tris de salina regulador (TBS)/0.02% de regulador TWEEN. El anticuerpo primario (sangrados pre-inmunización, antisuero de conejo o IgY de pollo de huevo en diluciones variando de 1 : 100 a 1 : 10,000 en regulador de bloqueo) se incubó con las tiras por una hora con balanceo suave. Una segunda serie de tres lavados 1 X TBS/0.02% de TWEEN se siguió por una hora de incubación con el anticuerpo secundario (peroxidasa conjugada de anti-conejo, mono, Amersham Life Science, Piscataway, NJ; o peroxidasa conjugad anti-pollo mono Jackson lmmunoResearch, West Grove, PA). Un ciclo final de 3X de lavados de 1X TBS/0.02%TWEEN se realizó y las tiras se desarrollaron con Sustrato Lumi-Light Western Blotting (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany).

C. Prueba de reactividad cruzada de anticuerpo: Siguiendo el protocolo descrito en la sección previa, las tiras de nitrocelulosa de Beer, Gremlin o Dan se incubaron con diluciones (1 :5000 y 1 : 10,000) de su antisuero de conejo respectivo o IgY de huevo de pollo así como también para antisuero o Igy de huevo de pollo (diluciones 1 : 1000 y 1 :5000) elaboradas para el resto de dos antígenos. Los niveles aumentados de anticuerpos de no equilibrio se realizaron para detectar la unión de baja afinidad por aquellos anticuerpos que pueden observarse solamente en concentración aumentada. El protocolo y duración de desarrollo es el mismo para toos los tres casos de unión utilizando el protocolo anteriormente descrito. No hubo reactividad cruzada de antígeno observada para cualquiera de los antígenos probados.

EJEMPLO 5 INTERACCIÓN DE BEER CON PROTEÍNAS DE SÚPER FAMILIA TGF- BETA La interacción de Beer con proteínas de diferentes brazos filogenéticos se estudiaron utilizando los métodos de inmunoprecipitación. TGFß-1 , TGFß-2, TGFß-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 y GDNF purificadas se obtuvieron de Fuentes comerciales (R&D systems; Minneapolis, MN). Un protocolo representativo es como sigue. Beer parcialmente purificada se dializó en salina regulada por HEPES (25 mM HEPES 7.5, 150 mM NaCI). Las inmunoprecipitaciones se hicieron en 300 ul de reguador IP (150 mM NaCI, 25 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 .4 mM ß-mercaptoethanol, 0.5 % tritón X 100, y 10% de glicerol). 30 ng de proteína BMP-5 humana recombinante (R&D systems) se aplicó a 15 ul de aglomerante de afinidad FLAG (Sigma; St Louis MO)) en la presencia y ausencia de 500 ng de Beer marcada con epítopo FLAG. Las proteínas se incubaron por 4 horas @ 4°C y después las proteínas asociadas por aglomerante de afinidad se lavaron 5 veces en regulador IP (1 ml por lavado). Las proteínas unidas se eluyeron del aglomernte de afinidad en 60 microlitos de 1 X SDS PAGE de regulador de muestra. Las proteínas se resolvieron por SDS PAGE y Beer BMP-5 asociada se detectó por western blot utilizando antisuero anti-BMP-5 (Research Diagnostics, Inc) (véase Figura 5).

Ensayo de Unión de Ligante Beer: La proteína FLAG-Beer (20 ng) se agrega a 100 ul de PBS/0.2% de BSA y se absorbe en cada cavidad de placa de microconcentración de 96 cavidades previamente revestida con anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma; St Louis MO) y se bloqueó con 10% de BSA en PBS. Esto se conduce a temperatura ambiente por 60 minutos. La solución de proteína se remueve y las cavidades se lavan para remover la proteína no unida. BMP-5 se agrega a cada cavidad en concentraciones que varían de 10 pM a 500 nM en PBS/0.2% de BSA y se incubaron por 2 horas a temperatura ambiente. La solución de unión se remueve y la placa se lava tres veces con 200 ul de volúmenes de PBS/0.2% de BSA. Los niveles de BMP-5 se detectan así utilizando el anti-suero BMP-5 por medio de ELISA (F.M. Ausubel et al (1998) Current Protocols in Mol Biol. Vol 2 1 1 .2.1 -1 1 .2.22). La unión específica se calcula al restar la unión no específica de la unión total y se analiza por el programa LIGAND (Munson and Podbard, Anal. Biochem. , 1 07, p220-239, (1980). En una variación de este método, Beer se elabora y se expresa como una proteína de fusión Fe humana. De igual forma, el BMP ligante se elabora y se expreas como fusión Fe de ratón. Estas proteínas se incuban juntas y el ensayo se conduce según se describe por Mellor eí al. utilizando la detección de fluorescencia resuelta por tiempo homogéneo (G.W. Mellor et al. , J of Biomol Screening, 3(2) 91 -99, 1998).

EJEMPLO 6 ENSAYO DE SELECCIÓN PARA INHIBICIÓN DE LA UNIÓN DE PROTEÍNA DE UNIÓN TFG-BETA A MIEMBROS DE FAMI LIA TGF- BETA El ensayo descrito anteriormente se repite con dos excepciones. Primero, la concentración BMP se mantiene fija en la Kd previamente determinada. Segundo, una colección de candidatos antagonista se agrega a una concentración fija (20 uM en el caso de las colecciones de molécula orgánica pequeña y 1 uM en estudios de anticuerpo). Estas moléculas candidato (antagonistas) de la unión de proteína de unión TGF-beta incluyen compuestos orgánicos derivados de colecciones comerciales o internas que representan diversas estructuras químicas. Estos compuestos se prepararon como soluciones concentradas en DMSO y se agregan a las cavidades de ensayo a <1 % de volumen final bajo las condiciones de ensayo estándar. Estas se incuban por 2 horas a temperatura ambiente con la BMP y Beer, la solución se remueve y la BMP unida se cuantifica según se describe. Los agentes que inhiben 40% de la unión de BMP observados en la ausencia de compuesto o anticuerpo se consideran antagonistas de esta interacción. Estos se evalúan además como inhibidores potenciales en base a los estudios de concentración para determinar sus constantes de inhibición y su influencia en la afinidad de unión de proteína de unión TGF-beta. Los ensayos de control de especificidad comparables también pueden conducirse para establecer la configuración de selectividad para el antagonista identificado a través de estudios que utilizan ensayos dependientes de la acción de ligante BMP (por ejemplo, estudio de competencia de receptor BMP/BMP).

EJEMPLO 7 INHIBICIÓN DE UBICACIÓN DE PROTEÍNA DE UNIÓN TGF-BETA A AGLOMERANTE DE HUESO La evaluación de inhibición de ubicación a aglomerante de hueso (hidroxiapatita) se conduce utilizando modificaciones al método de Nicolás (Nicolás, V. Calcif. Tissue Int. 57:206-12 1995). En resumen, la proteína de unión TGF-beta 125I-marcada se prepara según se describe por Nicolás (supra). Hidroxiapatita se agrega a cada cavidad de una placa de microconcentración de 96 cavidades equipada con una membrana de filtración de polipropileno (Polyfiltronic, Weymouth MA). La proteína de unión TGF-beta se agrega a 0.2% de albúmina en regulador PBS. Las cavidades que contienen aglomerante se lavan 3 veces con este regulador. La proteína de unión TGF-beta absorbida se eluye utilizando 0.3 M de NaOH y después se cuantifica. La identificación de inhibidor se conduce por medio de incubación de proteína de unión TGF-beta con moléculas de prueba y aplicando la mezcla al aglomerante según se describe anteriormente. El aglomerante se lava 3 veces con 0.2% de albúmina en regulador PBS. La proteína de unión TGF-beta absorbida se eluye utilizando 0.3M de NaOH y se cuantifica. Los agente que inhiben 40% de la unión de proteína de unión TGF-beta observada en la ausencia de compuesto o anticuerpo se consideran inhibidores de ubicación ósea. Estos inhibidores se caracterizan además a través de estudios de respuesta de dosis para determinar sus constantes de inhibición y su influencia en la afinidad de unión de proteína de unión TGF-beta.

EJEMPLO 8 CONSTRUCCIÓN DE MUTANTE DE PROTEÍNA DE UNIÓN TGF-BETA A. Mutagenesis: Un cADN de proteína de unión TGF-beta de longitud completa en pBluescript SK sirve como un templado para mutagénesis. En resumen, los cebadores adecuados (véase la discusión previamente descrita) se utilizan para generar el fragmento de ADN por reacción en cadena de polimerasa utilizando polimerasa de ADN Vent (New England Biolabs, Beverly, MA). La reacción en cadena de polimerasa se ejecuta por 23 ciclos en reguladores proporcionados por el fabricante utilizando una temperatura de ablandamiento de 57°C. El producto se expone así a dos enzimas de restricción y después del aislamiento utilizando electroforesis de gel de agarosa, se liga nuevamente en pRBP4-503 del cual la secuencia de equilibrio se ha removido por digestión enzimática. La integrdad del mutante se verifica por secuencialización de ADN. B. Expresión de Célula de Mamífero y Aislamiento de proteína de unión TGF-beta mutante: Los cADNs de proteína de unión TGF-beta mutante se transfieren en el vector de expresión de mamífero pcADN3.1 en el EJEMPLO 3. Después de verificar la secuencia, las construcciones resultantes se transfectan en células COS-1 , y la proteína secreta se purifica según se describe en el EJEMPLO 3.

EJEMPLO 9 MODELOS DE ANIMAL-I GENERACIÓN DE RATONES TRANSGÉNICOS QUE SOBREEXPRESAN EL GEN BEER El clon 15G5 BAC -200 kilobase (kb), aislado de la bibliotecta de ADN genómico de ratón CITB (distribuida por Research Genetics, Huntsville, AL) se utilizó para determinar la secuencia completa del gen Beer de ratón y sus regiones de flanqueo 5' y 3'. Un fragmento 41 kb Salí, que contiene el cuerpo de gen completo, más ~17 kb de la secuencia de flanqueo 5' y ~20 kb de secuencia de flanqueo 3' se sub-clonó en el sitio BamHI del vector de cósmido SuperCosI (Stratagene, La Jolla, CA) y se propagó en la cepa E. coli DH 10B. De esta construcción de cósmido, un fragmento de restricción de 35 kb Mlul-Avill (Secuencia No. 6), incluyendo el gen Beer de ratón completo, así como también 17 kb y 14 kb de secuencia de flanqueo 5' y 3', respectivamente, se purificó por gel así, utilizando medios convencionales, y se utilizó para la microinyección de cigotos de ratón (DNX Transgenics; Patente de EE. UU. No. 4,873, 1 91 ). Los animales fundadores en los cuales el fragmento de ADN clonado se integró al azar en el genoma se obtuvieron a una frecuencia de 5-30% de cachorros nacidos vivos. La presencia del transgen se logró al realizar el análilsis Southern blot de ADN genómico extraído de una pequeña cantidad de tejido de ratón, tal como la punta de una cola. El ADN se extrajo utilizando el siguiente protocolo: el tejido se digirió durante la noche a 55°C en un regulador lisis que contiene 200 mM de NaCI, 100 mM de Tris pH 8.5, 5 mM de EDTA, 0.2% de SDS y 0.5 mg/ml de Proteinasa K. Al siguiente día, el ADN se extrajo una vez con fenol/cloroformo (50:50), una vez con cloroformo/isoamilalcohol (24: 1 ) y se precipitó con etanol. En la resuspensión en TE (10 mM de Tris pH 7.5, 1 mM de EDTA) 8-10 ug de cada muestra de ADN se digirieron con una endonucleasa de restricción, tal como EcoRI, s sometió a electroforesis de gel y se transfirió a una membrana de nylon cargado, tal como HyBondN+ (Amersham, Arlington Heights, IL). El filtro resultante se hibridizó así con un fragmento radioactivamente marcado de ADN derivando del sitio de gen Beer de ratón, y capaz de reconocer tanto un fragmento del sitio de gen endógeno como un fragmento de un tamaño de diferente que se deriva del transgen. Los animales fundadores se criaron para animáis no transgénicos normales para generar suficientes números de descendencia transgénica o no transgénica en donde se determina la sobreexpresión de gen Beer. Para estos estudios, los animales en diversas edades (por ejemplo, 1 día, 3 semanas, 6 semanas, 4 meses) se someten a un número de diferentes ensayos designados para lograr la formación esquelética gruesa, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, actividad de osteoclasto y osteoblasto, grado de osificación endocrina, formación de cartílago, etc. La actividad transcripcional del transgen puede determinarse al extraer el ARN de varios tejidos, y utiilzar un ensayo RT-PCR que toma ventaja de polimorfismos de nucleótido único entre la cepa de ratón de la cual se deriva el transgen (129Sv/J) y la cepa de ratón utilizada para la microinyección de ADN [(C57BL5/J x SJL/J)F2].

MODELOS DE ANIMAL - I I RUPTURA DEL GEN BEER HUMANO POR RECOMBINACIÓN HOMOLOGA La recombinación homologa en células germinales embriónicas (ES) puede utilizarse para inactivar el gen Beer de ratón endógeno y subsecuentemente generar animales que llevan la mutación de pérdida de función. Un gen reportero, tal como el gen E. coli ß-galactosidasa, se elaboró en el vector objetivo de tal forma que su expresión se controla por el promotor y señal de inicio traductiva del gen Beer endógeno. En este aspecto, los patrones espaciales y temporales de expresión de gen Beer puede determinarse en animales que llevan un alelo objetivo. El vector objetivo se construyó al clonar primero el cásete de gen de resistencia a neomicina (neo) conducido por promotor de quinasa fosfoglicerato elegible por fármaco (PGK) de pGT-N9 (New England Biolabs, Beverly, MA) en el vector de clonación pSP72 (Promega, Madson, Wl). Se utilizó PCR para flanquear el cásete PGKneo con sitios loXP bacteriófago P1 , los cuales son sitios de reconocimiento para la recombinasa P1 Cre (Hoess et al. , PNAS USA, 79:3398, 1982). Esto permite la remoción del marcador de resistencia a neo en las células ES objetivo o animales derivados de célula ES (patente de EE. UU. No. 4,959,317). Los cebadores PCR se comprendieron de la secuencia loxP de 34 nucleótidos (ntd), 15-25 ntd complementarios a los extremos 5' y 3' del cásete PGKneo, así como también los sitios de reconocimiento de enzima de restricción (BamHI en el cebabor sentido y EcoRl en el cebador anti-sentido) para clonarse en pSP72. La secuencia del cebador sentido fue 5'-AATCTGGATCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTGA GGATTCGAGGGCCCCT-3' (SEQ ID NO:34); la secuencia del cebador anti-sentido fue 5'-AATCTGAATTCCACCGGTGTTAATTAAATAACTTCGTATAATGTATGCT ATACGA AGTTATAGATCTAGAG TCAGCTTCTGA-3' (SEQ ID NO:35). La siguiente etapa fue clonar un fragmento 3.6 kb Xhol-Hindlll, que contiene el gen E. coli ß-galactosidasa y señale de poliadenilación SV40 de pSVß (Clontech, Palo Alto, CA) en el plásmido pSP72-PGKneo. El "brazo corto" de homología del sitio de gen Beer de ratón se generó al amplificar un fragmento 2.4 kb del clon BAC 15G5. El extremo 3' del fragmento coincidió con el sitio de inicio de traducción del gen Beer, y el cebador anti-sentido utilizado en el PCR también incluye 30 ntd complemetario al extremo 5' del gen ß-galactosidasa de tal forma que su región codificadora podría fusionarse al sitio de inicio Beer en estructura. El procedimiento tomado para introducir el "brazo corto" en el plásmido pSP72-ßgal-PGKneo fue linearizar el plásmido en un sitio río arriba del gen ß-gal y después co-transformar este fragmento con el producto PCR de "brazo corto" y seleccionar los plásmidos en los cuales el producto PCR se integró por recombinación homologa. El cebador sentido para la amplifiación de "brazo corto" incluyó 30 ntd complementarios al vector pSP72 para permitirse para este caso de recombinación. La secuencia del cebador sentido fue 5'- ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGAGCAGCTGAAGCTTAACCACATGG TGGCTCACAACCAT-3' (SEQ ID NO:36) y la secuencia del cebador anti-sentido fue 5'- AACGACGGCCAGTGAATCCGTAATCATGGTCATGCTGCCAGGTGGAG GAGGGCA-3' (SEQ ID NO:37).

El "brazo largo" del sitio de gen Beer se generó al amplificar un fragmento 6.1 kb de BAC clon 15G5 con cebadores que también introducen los sitios de enzima de restricción de corte rato SgrA1 , Fsel , Ascl y Pací. Específicamente, la secuencia del cebador sentido fue 5'-ATTACCACCGGTGACACCCGCTTCCTGACAG-3' (SEQ ID NO:38); la secuencia del cebador anti-sentido fue 5'-ATTACTTAATTAAACATGGCGCGCCATATGGCCGGCCCCTAATTGCG GCGCATCGTTAATT-3' (SEQ ID NO.39). El producto PCR resultante se clonó en el vector TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) como una etapa intermedia. La construcción objetivo de gen Beer de ratón también incluyó un segundo marcador elegible, el gen de quinasa timidina de virus herpes simple I (HSVTK) bajo el control de elemento de repetición terminal largo de virus sarcoma rojo (RSV LTR). La expresión de este gen convierte las células de mamífero sensibles (y no viable) para gancyclovir; por lo tanto una manera conveniente para seleccionarse contra las células resistentes a neomicina en las cuales se ha integrado la construcción por un caso no homólogo (Patente de EE. UU No. 5,464,764). El cásete RSVLTR-HSVTK se amplificó de pPS1337 utilizando cebadores que permiten la clonación subsecuente en los sitios Fsel y Ascl del plásmido de vector TA de "brazo largo". Para este PCR, la secuencia del cebador sentido fue 5'-ATTACGGCCGGCCGCAAA GGAATTCAAGA TCTGA-3' (SEQ ID NO:40); la secuencia del cebador anti-sentido fue 5'-ATTACGGCGCGCCCCTCACAGGCCGCACCCAGCT-3' (SEQ ID NO:41 ). La etap afinal en la construcción del vector objetivo incluyó clonar el fragmento 8.8 kb SgrAI-Ascl que contiene el "brazo largo" y gen RSVLTR-HSVTK en los sitios SgrA1 y Ascl del plásmido pSP72-"brazo corto"-ßgal-PGKneo. Esste vector objetivo se linealizó por digestión ya sea con Ascl o Pací antes de electroporación en células ES.

EJEMPLO 10 INACTIVACIÓN BEER MEDIADO POR ANTISENTIDO Los oligonucleótidos antisentido de 17 nucleótidos se preparan en un formato de recubrimiento, de tal manera que el extremo 5' del primer oligonucleótido recubre el AUG de inicio de traducción de la transcripción Beer, y los extremos 5' de oligonucleótidos sucesivos presentes en 5 incrementos de nucleótido que se mueven en la dirección 5' (hasta 50 nucleótidos más), en relación a AUG Beer. Los oligonucleótidos de control correspondientes se diseñan y se preparan utilizando la composición de base equivalente pero redistribuida en secuencia para inhibir cualquier hibridización importante para el mARN codificador. El suministro de reactivo al sistema celular de prueba se conduce a través de suministro de lípido catiónico (P.L. Felgner, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987). 2 ug de oligonucleótido antisentido se agrega a 100 ul de medio de suero reducido (Opti-MEM l medio de suero reducido; Life Technologies, Gaithersburg MD) y este se mezcló con reactivo Lipofectin (6 ul) (Life Technologies, Gaithersburg MD) en los ul de medio de suero reducido. Estos se mezclan, se dejan acomplejar por 30 minutos a temperatura ambiente y la mezcla se agrega a células MC3T3E21 o KS483 previamente cultivadas. Estas células se cultivan y el mARN se recubre. El mARN Beer se monitorea utilizando RT-PCR junto con cebadores específicos Beer. Además, las cavidades experimentales separadas se colectan y los niveles de proteína se caracterizan a través de métodos western blot descritos en el Ejemplo 4. Las células se colectan, se vuelven a suspender en regulador lisis (50 mM Tris pH 7.5, 20 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 % SDS) y la proteína soluble se colecta. Este material se aplica a 10-20% gradiente de SDS PAGE de desnaturalización. Las proteínas separadas se transfieren a nitrocelulosa y el western blot se conduce según anteriormente utilizando los reactivos de anticuerpo descritos. En paralelo, los oligonucleótidos de control se agregan a cultivos idénticos y las operaciones experimentales se repiten. La reducción en mARN Beer o niveles de proteína se consideran importantes si el tratamiento con el oligonucleótido antisentido da como resultado un 50% de cambio ya sea por ejemplo en comparación al oligonucleótido mezclado de control. Esta metodología permite la inactivación de gen selectiva y la caracterización de fenotipo subsecuente de los nodulos mineralizados en el modelo de cultivo de tejido. EJEMPLO 1 1 MOLDEO DE REGIÓN DE NÚCLEO DE ESCLEROSTINA Las técnicas de reconocimiento por homología (por ejemplo, PSI-BLAST (Altschul eí al. , Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997)), FUGUE (Shi eí al. , J. Mol. Biol. 310:243-57 (2001 )) sugirió que la región de núcleo de SOST (SOST_Núcleo) adopta un pliegue de nudo de cistina. FUGUE es un método sensible para detectar la homología entre secuencias y estructuras. La Gonadotropina ß Coriónica Human (hCG-ß) , para la cual se conoce una estructura 3D experimentalmente determinada, se identificó por FUGUE (Shi eí al. , supra) como el homólogo más cercano de SOST_Núcleo. Por lo tanto, hCG-ß se utilizó como el templado estructural para construir modelos 3D para SOST_Núcleo. Una alineación de SOST_Núcleo y sus homólogos más cercanos se muestra en la Figura 7. Entre los homólogos mostrados en la alineación, solamente hCG-ß (CGHB) tuvo estructura 3D conocida. La identidad de secuencia entre SOST_Núcleo and hCG-ß fue aproximadamente 25%. Ocho residuos CYS se conservaron a través de la familia, enfatizando la similitud estructural global entre SOST_Núcleo and hCG-ß. Tres pares de cistinas (1 -5, 3-7, 4-8) formaron enlaces de disulfuro (mostrados con líneas sólidas en la Figura 7) en una configuración de "nudo", que es característica para el pliegue de nudo de cistína. Un enlace de disulfuro extra (2-6), mostrado como una línea con puntos en la Figura 7, fue único para esta familia y se distingue de la familia de proteínas de otras familias de nudo de cistina (por ejemplo, TGF-ß, BMP). SOST_Núcleo se moldeó utilizando PDB (Berman ef a/. , Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 58(Pt 6 Pt1 ):899-907 (2002)) entrada 1 HCN, la estructura 3D de hCG-ß (Wu eí al. , Structure 2:545-58 (1994)), como el templado estructural. Los modelos se calcularon con MODELER (Sali & Blundell, J. Mol. Biol. 234:779-815 (1993)). Una instantánea del mejor modelo se muestra en la Figura 8. La mayoría de las proteínas de nudo de cistina forman dímeros debido a ia falta de núcleo hidrofóbico en un monómero (Scheufler eí al. , supra; Schlunegger and Grutter, J. Mol. Biol. 231 :445-58 (1993)); Wu eí al. , supra). SOST probablemente sigue la misma regla y forma un homodímero para aumentar su estabilidad. La construcción de un modelo para la región SOST_Núcleo dimerizada presentó varios cambios debido a que (1 ) la similitud de secuencia entre SOST_Núcleo y hCG-ß fue baja (25%); (2) en lugar de un homodímero, hCG-ß formó un heterodímero con hCG-a; y (3) un número de diferentes conformaciones relativas de monómeros se ha observado en proteínas de nudo de cistina dimerizada de diferentes familias (por ejemplo, PDGF, TGF-ß, Neurotrofina, IL-17F, Gonadotropina), que sugirió que la conformación de dímero de SOST podría desviar significativamente de la conformación de heterodímero hCG-a/ß. En construcción del modelo, hCG-a se reemplazó con hCG-ß de la estructura de heterodímero (1 HCN) utilizando técnicas de súper imposición de estructura combinadas con ajuste manual, y después un modelo de homodímero SOST_Núcleo se construyó de acuerdo a la estructura de homodímero hCG-ß pseudo. El modelo final se muestra en la Figura 9.

EJEMPLO 12 MOLDEO DE INTERACCIÓN DE SOST-BMP Este ejemplo describe el moldeo de proteína de sitios de unión de receptor tipo I y tipo II en BMP que se incluyen con interacción entre BMP y SOST. Los estudios de competencia demostraron que SOST compitió tanto con receptores tipo I como tipo II para unirse a BMP.

En un ensayo de competencia basado en ELISA, BMP-6 selectivamente interactuó con la superficie revestida de esclerostina (300 ng/cavidad) con alta afinidad (KD = 3.4 nM). Al aumentar las cantidades de receptor IA BMP (construcción de fusión FC) compitió con esclerostina para unirse a BMP-6 (1 1 nM) (IC50 = 1 14 nM). Un exceso molar de 10 pliegues del receptor BMP fue suficiente para reducir la unión de esclerostina a BMP-6 por aproximadamente 50%.

Esta competencia también se observó con una proteína de fusión FC de receptor II BMP (IC50=36 nM) y DAN (IC50=43 nM). La especificidad del ensayo se mostró por la falta de competencia para la unión a BMP-6 entre esclerostina y una proteína de fusión R1 B-FC Activina, un miembro de familia de receptor TGF-ß que no unión BMP. Los sitios de unión de receptor tipo I y tipo II en un polipéptido BMP se han mapeado y se separado espacialmente (Scheufler et al. , supra; Innis eí al. , supra; Nickel eí al. , supra; Hart eí al. supra). Noggin, otro antagonista BMP que se une a BMP con alta afinidad, contacta BMP en sitios de unión de receptor tanto tipo I como tipo II por medio de la parte de N-terminal de Noggin (Groppe, eí al. , supra). Los dos ß-filamentos en la región de núcleo cerca de C-terminal también contactan BMP en el sitio de unión de receptor tipo II. Una alineación manualmente sintonizada de Noggin y SOST indicó que los dos polipéptidos compartieron la similitud de secuencia entre las partes de N-terminal de las proteínas y entre las regiones de núcleo. Una alineación de secuencia de aminoácido se presenta en la Figura 10. Los residuos de cisteína que forman el cys-nudo característico se conservaron entre Noggin y SOST. La identidad de secuencia global fue 24%, y la identidad de secuencia dentro de la región de unión N-terminal (posiciones de alineación 1 -45) fue 33%. Dos residuos en la región de unión de N-terminal Noggin, principalmente Leu (L) en posición de alineación 21 y Glu (E) en la posición 23, se reportó que juegan papeles importantes en la unión de BMP (Groppe, eí al., supra). Ambos residuos se conservaron en SOST así también. La similitud de secuencia dentro de la región de núcleo (posiciones de alineación 131 -228) fue de aproximadamente 20%, pero el andamio de cys-nudo se mantuvo y un número suficiente de residuos clave se conservó, soportando la homología entre Noggin y SOST. La estructura Noggin se comparó a SOST también para entenderse cómo dos monómeros SOST se dimerizan. Según se muestra en la Figura 1 1 , la estructura Noggin sugirió que el enlazador entre la región de N-terminal y la región de núcleo no solamente jugaron un papel en relación con las dos regiones, sino también formaron parte de la interfase de dimerización entre dos monómeros Noggin. Una diferencia principal entre Noggin y SOST fue que el enlazador entre la región de N-terminal y la región de núcleo era mucho más corta en SOST. La región de C-terminal de SOST puede jugar un papel en dimerización de SOST. La secuencia de Noggin terminó con la región de núcleo, mientras que SOST tuvo una región de C-terminal extra. En la estructura de Noggin un enlace de disulfuro conectado a la C-terminal de dos monómeros Noggin. De esta manera, la región de C-terminal de SOST comenzó cerca de la interfase de los dos monómeros y podría contribuir a la dimerización. Además, la predicción de estructura secundaria muestra que algunas partes de la región de C-terminal de SOST tuvo una tendencia para formar hélices. Esta región en SOST puede ser responsable de la actividad de dimerización, posiblemente a través del envasado hélice-hélice, que imitó la función del enlazador más largo en Noggin. Otra diferencia entre la estructura de Noggin y SOST fue la inserción de aminoácido en la región de núcleo SOST en posiciones de alineación 169-185, (véase Figura 10). Esta inserción extendió una horquilla ß, la cual se señaló hacia la interfase de dimerización en la estructura Noggin (mostrada en la Figura 1 1 como una región de ciclo en la parte media de los monómeros y arriba del residuo Cys de C-terminal). Esta ß-horquilla alargada también podría contribuir a la dimerización SOST.

EJEMPLO 13 DISEÑO Y PREPARACIÓN DE INMUNÓGENOS DE PÉPTIDO SOST Este Ejemplo describe el diseño de inmunógenos de péptido SOST que se utilizan para inmunizar animales y generar anticuerpos que bloquean interacciones entre BMP y SOST y previenen la formación de dímero de monómeros SOST.

Fragmentos de Unión BMP La similitud global entre SOST y Noggin y la similitud entre las regiones de N-terminal de los dos polipéptidos sugieren que SOST puede interactuar con BMP en una manera similar a Noggin. Es decir, la región de N-terminal de SOST puede interactuar tanto con los sitios de unión de receptor tipo I como tipo II, y una parte de la región de núcleo (posiciones de alineación de aminoácido 190-220 en la Figura 10) puede interactuar con el sitio de unión de receptor tipo II de tal forma que los anticuerpos específicos para estas regiones SOST pueden bloquear o deteriorar la unión de BMP a SOST. Las secuencias de aminoácido de estos fragmentos de polipéptido SOST para SOST de rata y humano se proporcionan como sigue.

SOST_N_Enlazador: La región de N-terminal (incluye el enlazador corto que conecta a la región de núcleo). Humano: QGWQAFKNDATEI IPELGEYPEPPPELE NNKTMNRAENGGRPPHHPFETKD VSEYS (SEQ ID NO:92) Rata: QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPPQELEN NQTMNRAENGGRPPHHPYDTKDVSEYS (SEQ ID NO:93) SOST_Núcleo_Unión: Parte de la región de núcleo que es probablemente que contacte BMP a su sitio de unión de receptor tipo II (ligeramente extendido en ambas terminales para incluir anclas de residuo CYS): Humano: CIPDRYRAQRVQLLCPGGEAPRARKVRLVASC (SEQ ID NO:94) Rata: CIPDRYRAQRVQLLCPGGAAPRSRKVRLVASC (SEQ ID NO:95) Fragmentos de Dimerización SOST La región de C-terminal de SOST es probablemente que se incluya en la formación de homodímeros SOST (véase Ejemplo 12). La ß-horquilla alargada también puede jugar un papel en formación de homodímero. Los anticuerpos que se unen específicamente a tales regiones pueden prevenir o deteriorar la dimerización de monómeros SOST, que pueden a su vez interferir con interacción entre SOST y BMP. SOST_C: la región de C-terminal Humano: LTRFHNQSELKDFGTEAARPQKGRKP RPRARSAKANQAELENAY (SEQ ID NO:96) Rata: LTRFHNQSELKDFGPETARPQKGRKPRP RARGAKANQAELENAY (SEQ ID NO:97) SOST_Núcleo_Dímero: Parte de la región de núcleo que se incluye probablemente en dimerización SOST (ligeramente extendido en ambas terminales para incluir los soportes de residuo Cys). Humano: CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID NO:98) Rata: CGPARLLPNAIGRVKWWRPNGPDFRC (SEQ ID NO:99) Fragmento de Unión BMP en N-terminal SOST La región de unión de N-terminal clave de SOST (posiciones de alineación 1 -35 en la Figura 10) se moldeó en la base de estructura de complejo Noggin/BMP-7 (Banco de Datos de Proteína Entrada No: 1 M4U) y la alineación de secuencia de aminoácido (véase Figura 10) para identificar residuos de aminoácido de la N-terminal SOST que interactúa probablemente con BMP. El modelo de SOST se presenta en la Figura 12. En el modelo comparativo, fenilalanina (Phe, F) en la posición de alineación 8 (véase flecha y texto acompañante) en la secuencia SOST se proyecta hacia una cavidad hidrofóbica en la superficie del dímero BMP. La misma característica "saliente-en-agujero" se ha observado en la BMP y la estructura de complejo de receptor tipo I (Nickel eí al. , supra), en donde Phe85 del receptor se ajusta en la misma cavidad, la cual es una característica clave en el reconocimiento de receptor ligante-tipo l para miembros de la súper familia TGF-ß (incluyendo, por ejemplo, familia TGF-ß, familia BMP, y lo similar). De acuerdo al modelo, un cambio dirigido por prolina (Pro) también se conserva, el cual permite al fragmento de unión de N-terminal roscarse alrededor de la superficie de dímero BMP, viajando desde el sitio de unión de receptor tipo I al sitio de unión de receptor tipo I I en el otro sitio del complejo. También se conserva otro cambio dirigido por Pro cerca del extremo carboxi del fragmento de unión, el cual se conecta así a la región enlazadora. Los contactos extensivos entre SOST y BMP son evidentes en la Figura 12.

Inmunógenos de Péptido Los péptidos se diseñaron para comprender la región de N-terminal SOST pronosticó hacer contacto con las proteínas BMP.

Las secuencias de péptido se presentan abajo. Para inmunizar animales, las secuencias de péptido se diseñaron para recubrirse, y una cisteína adicional se agregó al extremo de C-terminal para facilitar la degradación a KLH. Los péptidos se utilizaron así para inmunización. Las secuencias de péptido de los inmunógenos son como sigue: SOST Humano: QGWQAFKNDATEII PELGEY (SEQ I D NO:47) TEIIPELGEYPEPPPELENN (SEQ ID NO:48) PEPPPELENNKTMNRAENGG (SEQ ID NO:49) KTMNRAENGGRPPHHPFETK (SEQ ID NO:50) RPPHHPFETKDVSEYS (SEQ ID NO:51 ) Péptidos SOST humano con Cys Adicional: QGWQAFKNDATEIIPELGEY-C (SEQ ID NO:52) TEI I PELGEYPEPPPELENN-C (SEQ I D NO:53) PEPPPELENNKTMNRAENGG-C (SEQ ID NO:54) KTMNRAENGGRPPHHPFETK-C (SEQ ID NO:55) RPPHHPFETKDVSEYS-C (SEQ ID NO:56) SOST de Rata: QGWQAFKNDATEI I PGLREYPEPP (SEQ ID NO:57) PEPPQELENNQTMNRAENGG (SEQ ID NO:58) ENGGRPPHHPYDTKDVSEYS (SEQ ID NO:59) TEI IPGLREYPEPPQELENN (SEQ ID NO:60) Péptidos SOST de rata con Cys Adicional: QGWQAFKNDATEI IPGLREYPEPP-C (SEQ ID NO:61 ) PEPPQELENNQTMNRAENGG-C (SEQ ID NO:62) ENGGRPPHHPYDTKDVSEYS-C (SEQ ID NO:63) TEI IPGLREYPEPPQELENN-C (SEQ I D NO:64) Los siguientes péptidos se diseñaron para contener parte de región de núcleo que se pronosticó que hiciera contacto con las proteínas BMP. La cisteína se agregó al extremo de C-terminal de cada péptido para conjugación a KLH, y los péptidos conjugados se utilizaron para inmunización. En el Péptido de N-terminal de Núcleo de Ensamblaje una cisteína interna se cambió a una serina para evitar la doble conjugación a KLH. Para SOST Humano: Secuencia de aminoácido sin residuos Cys agregados: Ensamblaje_Núcleo_N-terminaI__Péptido: IPDRYRAQRVQLLCPGGEAP (SEQ ID NO:66) Ensamblaje_Núcleo_Cterm_Péptido: QLLCPGGEAPRARKVRLVAS (SEQ ID NO:67) Ensamblaje_Núcleo_N-term_Péptido: I PDRYRAQRVQLLCPGGEAP-C (SEQ I D NO:68) Ensamblaje_Núcleo_Cterm_Péptido: QLLCPGGEAPRARKVRLVAS-C (SEQ ID NO:69) Para SOST de Rata: Secuencia de aminoácido sin residuos Cys agregados o sustituidos: Ensamblaje_Núcleo_N-terminal_Péptido: I PDRYRAQRVQLLCPGG (SEQ I D NO:70) Ensamb!aje_Núcleo_C-term_Péptido: PGGAAPRSRKVRLVAS (SEQ ID NO:71 ) Inmunógenos de Péptido con Cys agregados y sustituidos: Ensamblaje_Núcleo_N-terminal_Péptido: IPDRYRAQRVQLLSPGG-C (SEQ ID NO:72) Ensamblaje_Núcleo_Cterm_Péptido: PGGAAPRSRKVRLVAS-C (SEQ ID NO:73) Dos regiones dentro de SOST que interactúan potencialmente para formar homodímeros SOST incluyen los aminoácidos con la región de núcleo SOST que no se presentan en Noggin. Los péptidos SOST de humano se diseñaron para contener esta secuencia, tuvieron una Cys de C-terminal o N-terminal que se conjugó a KLH. Para el péptido de SOST de rata, una cisteína se agregó a la terminal carboxi de la secuencia (SEQ ID no:76). Los péptidos conjugados por KLH se utilizaron para inmunización. Para SOST de humano: CGPARLLPNAIGRGKWWRPS (SEQ ID NO:74) IGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID NO:75) Para SOST de rata: PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO:76) Péptido SOST de rata con cisteína agregada PNAIGRVKWWRPNGPDFR-C (SEQ ID NO:77) La segunda región dentro de SOST que interactúa potencialmente para formar homodímeros SOST incluye la región C-terminal. Los inmunógenos de péptido se diseñaron para incluir las secuencias de aminoácido dentro de esta región (véase abajo). Para conjugación a KLH, un residuo de cisteína se agregó al extremo C-terminal, y los péptidos conjugados se utilizaron para inmunización.

Para SOST Humano: KRLTRFHNQS ELKDFGTEAA (SEQ ID NO:78) ELKDFGTEAA RPQKGRKPRP (SEQ ID NO:79) RPQKGRKPRP RARSAKANQA (SEQ ID NO:80) RARSAKANQA ELENAY (SEQ ID NO:81 ) Inmunógenos de péptido con Cys agregada en C-terminal: KRLTRFHNQS ELKDFGTEAA-C (SEQ ID NO:82) ELKDFGTEAA RPQKGRKPRP-C (SEQ ID NO:83) RPQKGRKPRP RARSAKANQA-C (SEQ ID NO:84) RARSAKANQA ELENAY-C (SEQ ID NO:85) Para SOST de rata: KRLTRFHNQSELKDFGPETARPQ (SEQ ID NO:86) KGRKPRPRARGAKANQAELENAY (SEQ ID NO:87) SELKDFGPETARPQKGRKPRPRAR (SEQ ID NO:88) Inmunógenos de péptido con Cys agregado en C-terminal: KRLTRFHNQSELKDFGPETARPQ-C (SEQ ID NO:89) KGRKPRPRARGAKANQAELENAY-C (SEQ ID NO:90) SELKDFGPETARPQKGRKPRPRAR-C (SEQ ID NO:91 ) EJEMPLO 14 ENSAYO PARA DETECTAR LA UNIÓN DE ANTICUERPOS A UNA PROTEÍNA DE UNIÓN TGF-BETA Este ejemplo describe un ensayo para detectar la unión de un ligante, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo, a esclerostina. Una proteína de fusión FLAG®-esclerostina se preparó de acuerdo a los protocolos proporcionados por el fabricante (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y según se describe en Patente de EE. UU. No. 6,395,51 1 . Cada cavidad de una placa de microconcentración de 96 cavidades se reviste con anticuerpo monoclonal anti-FLAG® (Sigma Aldrich) y después se bloquea con 10% de BSA en PBS. La proteína de fusión (20 ng) se agrega a 100 µl de PBS/0.2% de BSA y se absorba en la placa de 96 cavidades por 60 minutos a temperatura ambiente. Esta solución de proteína se remueve y las cavidades se lavan para remover la proteína de fusión no unida. Una BMP, por ejemplo, BMP-4, BMP-5, BMP-6, o BMP-7, se diluye en PBS/0.2% BSA y se agrega a cada cavidad en concentraciones que varían de 10 pM a 500 nM. Después de una incubación por 2 horas a temperatura ambiente, la solución de unión se remueve y la placa se lava tres veces con 200 µl de volúmenes de PBS/0.2% BSA. La unión de la BMP a esclerostina se detecta utilizando el antisuero policlonal o anticuerpo monoclonal específico para la BMP y un reactivo de segunda etapa de enzima conjugada por enzima adecuada de acuerdo a las técnicas ELISA estándar, (véase, por ejemplo, Ausubel eí al., Current Protocols in Mol Biol. Vol 2 11.2.1 -1 1.2.22 (1998)). La unión específica se calcula al restar la unión no específica de la unión total y se analiza utilizando el programa LIGAND (Munson and Podbard, Anal. Biochem. 107:220-39 (1980)). La unión de esclerostina a una BMP también se detecta por detección de fluorescencia por tiempo homogéneo (Mellor eí al., J Biomol. Screening, 3:91-99 (1998)). Una secuencia de polinucleótido que codifica esclerostina se une operativamente a una región constante de inmunoglobulina humana en una construcción de ácido nucleico recombinante y se expresó como una proteína de fusión de Fe humano-esclerostina de acuerdo a los métodos conocidos en la materia y descritos en la presente. De igual forma, un ligante BMP se elabora y se expresa como una proteína de fusión Fe de BMP-ratón. Estas dos proteínas de fusión se incuban juntas y el ensayo conducido según se describe por Mellor eí al.

EJEMPLO 15 ENSAYO DE SELECCIÓN PARA ANTICUERPOS QUE INHIBEN LA UNIÓN DE MIEMBROS DE FAMILIA DE TGF-BETA PARA PROTEÍNA DE UNIÓN TGF-BETA Este ejemplo describe un método para detectar un anticuerpo que inhibe la unión de un miembro de la familia TGF-beta a esclerostina. Una ELISA se realiza esencialmente según se describe en el Ejemplo 14 excepto que la concentración de BMP se mantiene fija en su Kd (determinada, por ejemplo, por análisis BIAcore). Además, un anticuerpo o una biblioteca o colección de anticuerpos se agrega a las cavidades a una concentración de 1 µM. Los anticuerpos se incuban por 2 horas a temperatura ambiente con la BMP y esclerostina, la solución se remueve, y la BMP unida se cuantifica según se describe (véase Ejemplo 14). Los anticuerpos que inhiben 40% de la unión de BMP observada en la ausencia de anticuerpo se consideran antagonistas de esta interacción. Estos anticuerpos se evalúan además como inhibidores potenciales al realizar estudios de concentración para determinar sus constantes de inhibición y su efecto en afinidad de proteína de unión TGF-beta. Los ensayos de control de especificidad comparable también pueden conducirse para establecer el perfil de selectividad para el antagonista identificado utilizando ensayos dependientes de la acción de ligante BMP (por ejemplo, un estudio de competencia de receptor BMP/BMP).

EJEMPLO 16 INHIBICIÓN DE UBICACIÓN DE PROTEÍNA DE UNIÓN TGF-BETA A AGLOMERANTE DE HUESO La evaluación de inhibición de ubicación a aglomerante de hueso (hidroxiapatita) se conduce utilizando modificaciones al método de Nicolás ( (Calcif. Tissue Int. 57:206-12 (1995)). En resumen, la proteína de unión TGF-beta 125l-marcada se prepara según se describe por Nicolás (supra). Hidroxiapatita se agrega a cada cavidad de una placa de microconcentración de 96 cavidades equipada con una membrana de filtración de polipropileno (Polyfiltronic, Weymouth MA). La proteína de unión TGF-beta diluida en 0.2% de albúmina en regulador PBS se agrega así a las cavidades. Las cavidades que contienen aglomerante se lavan 3 veces con 0.2% de albúmina en regulador PBS. La proteína de unión TGF-beta absorbida se eluye utilizando 0.3 M de NaOH y después se cuantifica. Un anticuerpo u otro agente que inhibe o deteriora la unión de la proteína de unión TGF-beta esclerostina a la hidroxiapatita se identifica al incubar la proteína de unión TGF-beta con el anticuerpo y aplicar la mezcla al aglomerante según se describe anteriormente. El aglomerante se lava 3 veces con 0.2% de albúmina en regulador PBS. La esclerostina absorbida se eluye con 0.3M de NaOH y después se cuantificó. Un anticuerpo que inhibe el nivel de unión de esclerostina a la hidroxiapatita por al menos 40% según se compara al nivel de unión observada en la ausencia de anticuerpo se considera un inhibidor de ubicación de hueso. Tal anticuerpo se caracteriza además en estudios de respuesta de dosis para determinar su constante de inhibición y su efecto en afinidad de unión de proteína de unión TGF-beta. De lo precedente, a pesar de que las modalidades específicas de la invención se han descrito en la presente para propósitos de ilustración, varias modificaciones pueden hacerse sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. De acuerdo con lo anterior, la invención no se limita excepto por las reivindicaciones anexas.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un anticuerpo, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido esclerostina, dicho polipéptido esclerostina comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO:2, 6, 8, 14, 46 o 65 en donde el anticuerpo inhibe competitivamente la unión del polipéptido esclerostina a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso. NM_004329 (SEQ ID NO: 102); D89675 (SEQ ID NO:103); NM_001203 (SEQ I D NO: 104); S75359 (SEQ I D NO: 105); NM_030849 (SEQ ID NO: 1 06); D38082 (SEQ ID NO: 107); NP_001 1 94 (SEQ ID NO: 108); BAA1 9765 (SEQ I D NO: 109); y AAB33865 (SEQ ID NO: 1 10), y en donde el sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I I de BMP comprendiendo la secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso U251 10 (SEQ ID NO:11 1); NM_033346 (SEQ ID NO.1 12); Z48923 (SEQ ID NO: 14); CAA88759 (SEQ ID NO: 1 15); y NM_001204 (SEQ ID NO: 1 13).
2. 2. Un anticuerpo, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido esclerostina y que deteriora la formación de un homodímero esclerostina, en donde el polipéptido esclerostina comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NOs:2, 6, 8, 14, 46 o 65.
3. 3. El anticuerpo ya sea de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
4. 4. El anticuerpo ya sea de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
5. 5. El anticuerpo según la reivindicación 4 en donde el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo monoclonal de ratón, un anticuerpo monoclonal humano, un anticuerpo monoclonal de rata, y un anticuerpo monoclonal de hámster.
6. 6. Una célula de hibridoma que produce el anticuerpo según la reivindicación 4.
7. 7. Una célula huésped que es capaz de expresar el anticuerpo según la reivindicación 4.
8. 8. El anticuerpo ya sea de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.
9. 9. Una célula huésped que es capaz de expresar el anticuerpo según la reivindicación 8.
10. 10. El anticuerpo ya sea de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el fragmento de unión de antígeno se selecciona del grupo que consiste de F(ab')2, Fab', Fab, Fd, y Fv.
11. 1 1 . El anticuerpo ya sea de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende un anticuerpo de cadena única.
12. 12. Una célula huésped que es capaz de expresar el anticuerpo según la reivindicación 1 1 .
13. 13. Una composición que comprende un anticuerpo, o fragmento de unión de antígeno del mismo, según ya sea la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y un vehículo fisiológicamente aceptable.
14. 14. Un inmunógeno comprendiendo un péptido que comprende al menos 21 aminoácidos consecutivos y no más de 50 aminoácidos consecutivos de un polipéptido SOST, dicho polipéptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NOs:2, 6, 8, 14, 46 o 65, en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido SOST y que inhibe completamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso NM_004329 (SEQ ID NO: 102); D89675 (SEQ ID NO: 103); NM_001203 (SEQ ID NO: 104); S75359 (SEQ ID NO: 105); NM_030849 (SEQ ID NO: 106); D38082 (SEQ ID NO: 107); NP_001 194 (SEQ ID NO: 108); BAA19765 (SEQ ID NO: 109); y AAB33865 (SEQ ID NO: 1 10), y en donde el sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo II de BMP comprendiendo la secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso U251 10 (SEQ ID NO: 1 1 1 ); NM_033346 (SEQ I D NO: 1 12); Z48923 (SEQ I D NO: 1 14); CAA88759 (SEQ ID NO: 1 15); y NM_001204 (SEQ ID NO: 1 13).
15. 15. Un inmunógeno comprendiendo un péptido que comprende al menos 21 aminoácidos consecutivos y no más de 50 aminoácidos consecutivos de un polipéptido SOST, dicho polipéptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO:2, 6, 8, 14, 46 o 65, en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido SOST y que deteriora la formación de un homodímero SOST.
16. 16. El inmunógeno ya sea de la reivindicación 14 o la reivindicación 15 en donde el péptido se asocia con un una molécula vehículo.
17. 17. El inmunógeno según la reivindicación 16 en donde la molécula vehículo es un polipéptido vehículo.
18. 18. El inmunógeno según la reivindicación 17 en donde el polipéptido vehículo es hemocianina de lapa principal.
19. 1 9. Un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST, comprendiendo inmunizar un animal no humano con un inmunógeno según la reivindicación 14, en donde (a) el polipéptido SOST comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 2, 6, 8, 14, 46 o 65; (b) el anticuerpo inhibe competitivamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo I I de BMP; (c) el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP comprendiendo la secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso NM_004329 (SEQ I D NO: 102); D89675 (SEQ ID NO: 103); NM_001203 (SEQ ID NO: 104); S75359 (SEQ ID NO: 1 05); NM_030849 (SEQ ID NO: 106); D38082 (SEQ ID NO: 107); NP_001 194 (SEQ ID NO.108); BAA19765 (SEQ ID NO: 109); y AAB33865 (SEQ ID NO: 1 10); y (d) el sitio de unión de Receptor Tipo I I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I I de BMP comprendiendo la secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso U251 10 (SEQ ID NO: 1 1 1 ); NM_033346 (SEQ ID NO: 1 12); Z48923 (SEQ ID NO: 1 14); CAA88759 (SEQ ID NO.1 15); y NM_001204 (SEQ ID NO: 1 13).
20. 20. Un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST, dicho polipéptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO:2, 6, 8, 14, 46 o 65, comprendiendo inmunizar un animal no humano con un inmunógeno según la reivindicación 15, en donde el anticuerpo deteriora la formación de un homodímero SOST.