MXPA05013797A - Anticuerpos especificos para esclerostina y metodos para aumentar la mineralizacion osea - Google Patents

Abstract

Se describen las composiciones y los métodos que se refieren a anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas de unión TGF-beta. Estos métodos y composiciones se refieren a la alteración de la densidad mineralósea al interferir con la interacción entre una proteína de unión TGF-beta esclerostina y un miembro de la súper familia TGF-beta, particularmente una proteína morfogénicaósea. El aumento de la densidad mineralósea tiene usos en las enfermedades y condiciones en las cuales la baja densidad mineralósea tipifica la condición, tal como osteopenia, osteoporosis, y fracturasóseas.

Description

ANTICUERPOS ESPECÍFICOS PARA ESCLEROSTINA Y MÉTODOS PARA AUMENTAR LA MINERALIZACIÓN ÓSEA CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere generalmente a productos farmacéuticos y métodos y, más específicamente, a métodos y anticuerpos específicos de esclerostina adecuados para aumentar el contenido mineral del hueso. Tales composiciones y métodos pueden utilizarse para tratar una amplia variedad de condiciones incluyendo, por ejemplo, osteopenia, osteoporosis, fracturas, y otros desórdenes en los cuales la baja densidad mineral ósea es un distintivo de la enfermedad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Dos o tres distintas fases de cambios a la masa ósea se presentan durante la vida de un individuo (véase Riggs, West J. Med. 154:63-77 (1 991 )). La primera fase se presenta tanto en hombres como en mujeres y procede al logro de una masa ósea máxima. Esta primera fase se logra a través del crecimiento lineal de las placas de crecimiento endocrinas y crecimiento radial debido a una tasa de aposición periosteal. La segunda fase comienza alrededor de los 30 para el hueso trabecular (huesos planos tales como las vértebras y la pelvis) y alrededor de la edad 40 para el hueso cortical (por ejemplo, huesos largos encontrados en las extremidades) y continua hasta la edad avanzada. Esta fase se caracteriza por la lenta pérdida ósea y se presenta tanto en hombres como mujeres. En mujeres, una tercera fase de pérdida ósea también se presenta, más probablemente debido a las deficiencias de estrógeno post-menopaúsico. Durante esta fase sola, las mujeres pueden perder un adicional de 10% de masa ósea del hueso cortical y 25% del compartimiento trabecular (véase Riggs, supra). La pérdida de contenido mineral óseo puede originarse por una amplia variedad de condiciones y puede dar como resultado problemas médicos importantes. Por ejemplo, la osteoporosis es una enfermedad debilitante en humanos y se caracteriza por las reducciones marcadas en la masa ósea esquelética y la densidad mineral, deterioro estructural del hueso, incluyendo la degradación de la microarquitectura del hueso y aumentos correspondientes en fragilidad del hueso, y susceptibilidad a la fractura en individuos que la padecen. La osteoporosis en humanos se precede por osteopenia clínica (densidad mineral ósea que es mayor a una desviación estándar pero menor a 2.5 desviaciones estándar abajo del valor promedio para huesos de adulto joven), una condición encontrada en aproximadamente 25 millones de personas en los Estados Unidos. Otros 7-8 millones de pacientes en los Estados Unidos han sido diagnosticados con osteoporosis clínica (definida como contenido mineral óseo mayor a 2.5 desviaciones estándar abajo de aquel de huesos de adulto joven maduro). La osteoporosis es una de las enfermedades más caras para el sistema de cuidado de salud, costando decenas de billones de dólares anulamente en los Estados Unidos. Además de los costos relacionados al cuidado de la salud, el cuidado residencial a largo plazo, y los días de trabajo perdidos se agregan a los costos socales y financieros de esta enfermedad. A nivel mundial, aproximadamente 75 millones de personas se encuentran en riesgo de osteoporosis. La frecuencia de osteoporosis en la población humana aumenta con la edad. Entre los caucásicos, la osteoporosis es predominante en mujeres quienes, en los Estados Unidos, comprenden 80% del grupo de pacientes con osteoporosis. La fragilidad aumentada y la susceptibilidad a fractura de hueso esquelético en la edad avanzada se agrava por el riesgo mayor de caídas en esta población. Más de 1 .5 millones de fracturas de hueso relacionadas a la osteoporosis se reportan en los Estados Unidos cada año. Las caderas, muñecas y vértebras fracturas se encuentran entre las lesiones más comunes asociadas con la osteoporosis. Las fracturas de cadera en particular son extremadamente incómodas y caras para el paciente, y para las mujeres, se correlacionan con las altas tasas de mortalidad y morbidez. A pesar de que la osteoporosis se ha considerado como un aumento en el riesgo de fractura debido a la masa ósea reducida, ninguno de los tratamientos actualmente disponibles para desórdenes esqueléticos pueden aumentar sustancialmente la densidad ósea de los adultos. Una fuerte percepción entre varios médicos es que se necesitan fármacos que puedan aumentar la densidad ósea en adultos, particularmente en los huesos de la muñeca; columna espinal, y cadera que se encuentran en riesgo de osteopenia y osteoporosis. Las estrategias actuales para la prevención de osteoporosis pueden ofrecer cierto beneficio a individuos pero no pueden asegurar la resolución de ia enfermedad. Estas estrategias incluyen moderar la actividad física (particularmente en actividades que llevan peso) con el inicio de la edad avanzada, proporcionar calcio adecuado en la dieta, y evitar el consumo de productos que contengan alcohol o tabaco. Para los pacientes que presentan osteopenia clínica u osteoporosis, los fármacos terapéuticos actuales prevalentes y las estrategias se dirigen a reducir la pérdida adicional de masa ósea al inhibir el proceso de la absorción del hueso, un aspecto natural del proceso remodelador del hueso que se presenta constitutivamente. Por ejemplo, el estrógeno ahora se está prescribiendo para retardar la pérdida ósea. Sin embargo, existe cierta controversia sobre si los pacientes ganan cualquier beneficio a largo plazo y si el estrógeno tiene algún efecto en todos los pacientes de más de 75 años de edad. Además, se cree que el uso de estrógeno aumenta el riesgo de cáncer endometrial y de mama. La calcitonina, osteocalcina con vitamina K, o altas dosis de calcio dietético, con o sin vitamina D, también se han sugerido para las mujeres postmenopáusicas. Sin embargo, las altas dosis de calcios frecuentemente pueden tener efectos secundarios gastrointestinales desagradables, y los niveles de calcio urinarios y de suero deben monitorearse continuamente (por ejemplo, Khosla y Rigss, Mayo Clin. Proc. 70:978-982, 1995). Otros procedimientos terapéuticos para la osteoporosis incluyen bisfosfonatos (por ejemplo, Fosamax™, Actonel™, Bonviva™, Zometa™, olpadronate, neridronate, skelid, bonefos), hormona paratifoidea, calcilíticos, calcimiméticos (por ejemplo, cinacalcet), estatinas, esteroides anabólicos, sales de estroncio y lantano, y fluoruro sódico. Tales terapéuticos, sin embargo, frecuentemente se asocian con efectos secundarios indeseables (por ejemplo, la calcitonina y los esteroides pueden originar nausea y provocar una reacción inmune, los bisfosfonatos y fluoruro sódico pueden inhibir la reparación de fracturas, a pesar de que la densidad ósea aumente modestamente) que pueden descartar su uso eficaz (véase Khosla y Rigss, supra). Ninguna estrategia terapéutica actualmente practicada para tratar una condición asociada con mineralización ósea insuficiente o excesiva, tal como osteoporosis u otros desórdenes caracterizados por la pérdida de mineralización ósea, incluye un fármaco que altere (es decir, aumente o reduzca en una manera estadísticamente importante) la masa ósea. En particular, ninguna estrategia actual estimula o mejora el crecimiento de nueva masa ósea. La presente invención proporciona composiciones y métodos que pueden utilizarse para aumentar la mineralización ósea, y que por lo tanto pueden utilizarse para tratar una amplia variedad de condiciones en las cuales un aumento en la masa ósea es deseable. La presente invención también ofrece otras ventajas relacionadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Brevemente establecida, la presente ¡nvención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a una proteína de unión TGF-beta, esclerostina (SOST), y proporciona inmunógenos que comprenden péptidos SOST derivados de regiones de SOST que interactúan con un miembro de la súper familia TGF-beta tal como una proteína morfogénica ósea. En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido SOST, el cual comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ I D NO: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, en donde el anticuerpo inhibe competitivamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo I I de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP que comprende una secuencia de aminoácido establecida en GenBank Nos. de Acceso NM_004329 (SEQ ID NO:71 ); D89675 (SEQ ID NO:72); NMJ301203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM_030849 (SEQ I D NO:75); D38082 (SEQ I D NO:76); NP_001 194 (SEQ I D NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); o AAB33865 (SEQ ID NO:79), y en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I I de BMP que comprende la secuencia de aminoácido establecida en GenBank Nos. de Acceso U251 10 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81 ); Z48923 (SEQ I D NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); o NM_001204 (SEQ I D NO:82). En una modalidad particular, el anticuerpo, o el fragmento de unión de antígeno del mismo, se une específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO:2-6, 12-15, 21 , 22, 25, 26, 47, 48, 49, o 50, y en otras modalidades particulares, el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ I D NO: 5, 6, o 14. En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que se produce al inmunizar un animal no humano con un péptido de al menos 20 aminoácidos y no más de 75 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NOs: 2-19, 21 -28, o 47-50, en donde el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido SOST, el cual comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NOs: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, y en donde el anticuerpo inhibe competitivamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (¡i) un sitio de unión de Receptor Tipo I I de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor tipo I de BMP (establecido en cualquiera de las secuencias de GenBank proporcionadas en la presente), y en donde los sitios de unión de Receptor Tipo I I de BMP son capaces de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I I de BMP (establecido en cualquiera de las secuencias de GenBank proporcionadas en la presente). En ciertas modalidades preferidas, se produce un anticuerpo al inmunizar un animal no humano con un péptido de al menos 20 aminoácidos y no más de 75 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácido deSEQ ID NO: 5, 6, 10, 1 1 , 14 o 18. La presente invención además proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido SOST y que deteriora la formación de un homodímero SOST, en donde el polipéptido SOST comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NOs: 1 , 20, 58, 60, 62 o 68, y en donde el anticuerpo se une a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NOs:29-31 , 33-36, 41 -43, o 51 -54. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que se produce al inmunizar un animal no humano con un péptido de al menos 20 aminoácidos y no más de 75 aminoácidos comprendiendo una secuencia de aminoácido de 29-46, 51 , 52, 53, o 54, en donde el anticuerpo, o el fragmento de unión de antígeno del mismo, se une específicamente a un polipéptido SOST que comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, y en donde el anticuerpo deteriora la formación de un homodímero SOST. En ciertas modalidades particulares de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En otras modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, el cual es de un ratón, humano, rata, o anticuerpo monoclonal de hámster. En otras modalidades de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. La invención además proporciona una célula huésped que produce el anticuerpo quimérico o humano. En ciertas modalidades, el fragmento de unión de antígeno del anticuerpo es un fragmento F(ab')2, Fab', Fd, o Fv. La invención también proporciona un anticuerpo que es un anticuerpo de cadena única y proporciona una célula huésped que es capaz de expresar el anticuerpo de cadena única. En otra modalidad, la invención proporciona una composición que comprende tales anticuerpos y un vehículo fisiológicamente aceptable. La invención proporciona un inmunógeno que comprende un péptido comprendiendo 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , o 12 aminoácidos consecutivos de un polipéptido SOST, cuyo polipéptido SOST comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NOs: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, y en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente al polipéptidoSOST y que inhibe competitivamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en GenBank Nos. de Acceso: NM_004329 (SEQ ID NO:71 ); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ I D NO:74); NM_030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ I D NO:76); NP_001 194 (SEQ ID NO:77); BAA1 9765 (SEQ ID NO:78); o AAB33865 (SEQ ID NO:79), y en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I I de BMP es capaz de unirse a un Polipéptido de Receptor Tipo I I de BMP que comprende la secuencia de aminoácido establecida en GenBank Nos. de Acceso U251 10 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81 ); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); o NM_001204 (SEQ ID NO:82). En otra modalidad, un inmunógeno comprende un péptido que comprende al menos 21 aminoácidos consecutivos y no más de 50 aminoácidos consecutivos de un polipéptido SOST, dicho polipéptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NOs: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido SOST y que inhibe competitivamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo l de BMP (establecido en cualquiera de las secuencias de GenBank proporcionadas en la presente), y en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I I de BMP (establecido en cualquiera de las secuencias de GenBank proporcionadas en la presente). En ciertas modalidades, la invención proporciona un inmunógeno que comprende un péptido de al menos 20 aminoácidos y no más de 75 aminoácidos comprendiendo una secuencia de aminoácido de SEQ I D NOs: 2-1 9, 21 -28, 47, 48, 49, o 50, en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST, el cual comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, en donde el anticuerpo inhibe competitivamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo I I de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en GenBank Nos. de Acceso NM_004329 (SEQ ID NO:71 ); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ I D NO:74); NM_030849 (SEQ I D NO:75); D38082 (SEQ I D NO:76); NPJ301 194 (SEQ I D NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); o AAB33865 (SEQ ID NO:79), y en donde el sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo II de BMP comprendiendo la secuencia de aminoácido establecida en GenBank Nos. de Acceso U251 10 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81 ); Z48923 (SEQ I D NO:83); CAA88759 (SEQ I D NO:84); o NM_001204 (SEQ ID NO:82). En una modalidad particular, la invención proporciona un inmunógeno que comprende un péptido de al menos 20 aminoácidos y no más de 75 aminoácidos comprendiendo una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:5, 6, 10, 1 1 , 14, o 18. La invención también proporciona un inmunógeno que comprende un péptido de al menos 20 aminoácidos y no más de 75 aminoácidos comprendiendo una secuencia de aminoácido de SEQ ID NOs: 29-46, 51 , 52, 53, o 54, en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST, el cual comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ I D NO: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, y en donde el anticuerpo deteriora la formación de un homodímero SOST. En otra modalidad, un inmunógeno comprende un péptido comprendiendo 6, 7, 8, 9, 1 0, 1 1 o 12 aminoácidos consecutivos de un polipéptido SOST, en donde el polipéptido SOST comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, y en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido SOST y que deteriora la formación de un homodímero SOST. En ciertas modalidades, la invención proporciona un inmunógeno que comprende un péptido comprendiendo al menos 21 aminoácidos consecutivos y no más de 50 aminoácidos consecutivos de un polipéptido SOST, cuyo polipéptido comprende SEQ ID NO: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, y en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido SOST y que deteriora la formación de un homodímero SOST. En ciertas modalidades particulares, los inmunógenos de la invención objeto se asocian con una molécula vehículo. En ciertas modalidades, la molécula vehículo es un polipéptido vehículo, y en modalidades particulares, el polipéptido vehículo es una lapa principal hemocianina. La presente invención también proporciona un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST, comprendiendo inmunizar un animal no humano con un inmunógeno que comprende un péptido de 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 o 12 aminoácidos consecutivos o al menos 21 y no más de 50 aminoácidos consecutivos de un polipéptido SOST que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, que es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido SOST y que inhibe competitivamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo l l de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP que comprende una secuencia de aminoácido establecida en GenBank Nos. de Acceso NM_004329 (SEQ I D NO:71 ); D89675 (SEQ I D NO:72); NM_001203 (SEQ I D NO:73); S75359 (SEQ I D NO:74); NM_030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ I D NO:76); NP_001 194 (SEQ I D NO:77); BAA1 9765 (SEQ ID NO:78); o AAB33865 (SEQ ID NO:79), y en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I I de BMP comprendiendo la secuencia de aminoácido establecida en GenBank Nos. de Acceso U251 10 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81 ); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); o NM_001204 (SEQ I D NO:82). En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST, comprendiendo inmunizar un animal no humano con un inmunógeno que comprende un péptido de al menos 20 aminoácidos y no más de 75 aminoácidos comprendiendo una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2-19, 21 -28, 47, 48, 49, o 50, en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST, el cual comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, en donde el anticuerpo inhibe competitivamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo I I de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP. En una modalidad particular, el inmunógeno comprende un péptido al menos 20 aminoácidos y no más de 75 aminoácidos comprendiendo una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 5, 6, 10, 1 1 , 14 o 18.

En otras modalidades preferidas, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST, comprendiendo inmunizar un animal no humano con un inmunógeno que comprende un péptido de 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 o 12 aminoácidos consecutivas o al menos 21 y no más de 50 aminoácidos consecutivos de un polipéptido SOST que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, que es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido SOST y que es capaz de deteriorar la formación de un homodímero HOST. En otra modalidad, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST, comprendiendo inmunizar un animal no humano con un inmunógeno que comprende un péptido de al menos 20 aminoácidos y no más de 75 aminoácidos comprendiendo una secuencia de aminoácido de SEQ I D NO: 29-46, 51 , 52, 53, o 54, en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST y deteriora la formación de un homodímero SOST. La presente invención también proporciona un método para identificar un anticuerpo que modula una trayectoria de señalización de TGF-beta, comprendiendo contactar un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST que comprende una secuencia de aminoácido establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68 con al menos un péptido SOST que comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2-19, o 21 - 54, bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir la formación de un anticuerpo/complejo péptido SOST; y detectar un nivel de anticuerpo/complejo péptido SOST, y de tal modo detectar la presencia de un anticuerpo que modula una trayectoria de señalización de TGF-beta. En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar un anticuerpo que deteriora la unión de una BMP a un polipéptido SOST, comprendiendo contactar (i) un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST el cual comprende una secuencia de aminoácido establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68 con (¡i) al menos un péptido SOST que comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2-1 9, 21 -28, o 47-50 bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir la formación de un anticuerpo/complejo de péptido SOST; y detectar un nivel de anticuerpo/complejo de péptido SOST, y de tal modo detectar la presencia de un anticuerpo que deteriora la unión de una BMP a un polipéptido SOST. En las modalidades particulares, el método para identificar un anticuerpo que modula una trayectoria de señalización de TGF-beta y para identificar un anticuerpo que deteriora la unión de una BMP a un polipéptido SOST, el péptido SOST comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:5, 6, 10, 1 1 , 14, o 18. En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar un anticuerpo que deteriora la formación de homodímero SOST, comprendiendo contactar (i) un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST que comprende una secuencia de aminoácido establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, con (ii) al menos un péptido SOST que comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 29-46 o 51 -54 bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir la formación de un anticuerpo/complejo de péptido SOST; y detectar un nivel de anticuerpo/complejo de péptido SOST, y de tal modo detectar la presencia de un anticuerpo que deteriora la formación de homodímero SOST. En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar un anticuerpo que aumenta el contenido mineral óseo, comprendiendo contactar (i) un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST que comprende una secuencia de aminoácido establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68 con (ii) al menos un péptido SOST que comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2-19, o 21 -54 bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir la formación de un anticuerpo/complejo de péptido SOST; y detectar un nivel de anticuerpo/complejo de péptido SOST, y detectar de tal modo la presencia de un anticuerpo que aumenta el contenido mineral óseo. En una modalidad particular, el péptido comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:5, 6, 10, 1 1 , 14, o 1 8. En ciertas modalidades particulares para identificar un anticuerpo que modula una trayectoria de señalización TGF-beta, para identificar un anticuerpo que deteriora la unión de una BMP a un polipéptido SOST, para identificar un anticuerpo que deteriora la formación de homodímero SOST, o para identificar un anticuerpo que aumenta el contenido mineral óseo, el anticuerpo se presenta en una muestra biológica o el anticuerpo es un anticuerpo purificado. En ciertas modalidades, el anticuerpo purificado es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, o un fragmento de unión de antígeno de cualquiera de estos anticuerpos. Estas y otras modalidades de la presente ¡nvención llegarán a ser aparentes en referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos anexos. Todas las referencias descritas en la presente se incorporan de tal modo para referencia en sus totalidades como si cada una se incorporara individualmente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 presenta una alineación de la región que contiene el nudo de cisteína característico de un polipéptido SOST y sus homólogos más cercanos. Tres enlaces de disulfuro que forman el nudo de cisteína se ilustran como líneas sólidas. Un enlace de disulfuro extra, mostrado por una línea punteada, es único para esta familia, la cual conecta dos puntas de ß-horquilla en la estructura 3D. Los polipéptidos representados son SOST: esclerostina (SEQ ID NO: 95); CCGHB: Gonadotropina Coriónica Humana ß (SEQ ID NO:96); FSHB: subunidad beta de hormona estimuladora de folículo (SEQ ID NO:97); TSHB: precursor de cadena beta de tirotropina (SEQ ID NO:98); VWF: factor Von Willebrand (SEQ I D NO:99); MUC2: precursor de mucina humana 2 (SEQ ID NO: 100); CER1 : Cerberus 1 (homologo Xenopus laevis) (SEQ ID NO: 101 ); DRM: gremlin (SEQ ID NO: 1 02); DAN: (SEQ ID NO: 103); CTGF: precursor de factor de crecimiento de tejido conectivo (SEQ ID NO: 104); NOV: NovH (homólogo de proteína de gen sobreexpresado de nefroblastoma) (SEQ ID NO: 105); CYR6: (SEQ ID NO: 106). La Figura 2 ilustra un modelo 3D de la región de núcleo de SOST (SOST_Núcleo). La Figura 3 presenta un modelo 3D de la región de núcleo de homodímero SOST. La Figura 4A y B proporciona una alineación de secuencia de aminoácido de Noggin de cinco diferentes animales: humano (NOGG_HUMAN (SEQ ID NO: 107); pollo (NOGG_CHICK, SEQ I D NO: 108); rana con garras africana (NOGG_XENLA, SEQ ID NO.109); NOGG_FUGRU, SEQ ID NO: 1 10); y pez cebra (NOGG_ZEBRA, SEQ I D NO: 1 1 1 ); y SOST de humano (SOSTJHUMANO, SEQ ID NO: 1 ), rata (SOST_RATA, SEQ ID NO:20), y ratón (SOST_Mouse, SEQ ID NO: 1 12). La Figura 5 ilustra la estructura de complejo Noggin/BMP-7. El homodímero BMP se muestra en la parte inferior de la figura en modo de superficie. El homodímero Noggin se muestra en la parte superior del dímero DMP en modo de caricatura. Los círculos señalan la región de unión de terminal N, la región de núcleo, y el enlazador entre las regiones de núcleo y de terminal N. La Figura 6 representa un modelo 3D del fragmento de unión de BMP potencial ubicado en la región de terminal N de SOS. Un dímero BMP se muestra en modo de superficie, y el fragmento de unión de BMP potencial se muestra en modo adhesivo. Un residuo de fenilalanina que se fija en una cavidad hidrofóbica en la superficie de BMP, se señala.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido SOST, métodos para utilizar tales anticuerpos. La presente invención también proporciona inmunógenos de polipéptido SOST que pueden utilizarse para la generación y análisis de estos anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser útiles para bloquear o deteriorar la unión de un polipéptido SOST, el cual es una proteína de unión TGF-beta, a un ligante, particularmente una proteína morfogénica ósea, y también pueden bloquear o deteriorar la unión del polipéptido SOST a uno u otros más ligantes. La invención se refiere en parte al descubrimiento sorprendente, dentro de la secuencia de polipéptido, esclerostina, de secuencias de péptido corto específicas que se reconocen específicamente por los anticuerpos anti-esclerostina capaces de inhibir competitivamente la unión de los polipéptios de esclerostina a BMP, en donde tal unión de BMP de esclerostina podría presentarse por medio de un sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP y/o un sitio de unión de Receptor Tipo I I de BMP. Una molécula tal como un anticuerpo que inhibe la unión de la proteína de unión TGF-beta a uno o más miembros de la familia de proteínas de TGF-beta, incluyendo una o más proteínas morfogénicas óseas (BMPs), podría entenderse que incluye, por ejemplo, una molécula que permite la activación de un miembro de familia de TGF-beta o BMP, o permite la unión de los miembros de familia de TGF-beta incluyendo una o más BMPs a sus receptores respectivos al remover o prevenir el miembro de TGF-beta de unirse a la proteína de unión de TGF. La presente ¡nvención también proporciona los inmunógenos de polipéptido y péptido que, inesperadamente, pueden utilizarse para generar y/o identificar los anticuerpos o fragmentos de los mismos que son capaces de inhibir, prevenir, o deteriorar (por ejemplo, reducir en una manera estadísticamente significante) la unión de la proteína de unión de TGF-beta SOST a una o más BMPs. Los inmunógenos de péptido ejemplares pueden comprender 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 20-25, 21 -50, 26-30, 31 -40, 41 -50, 51 -60, 61 -70, o 71 -75 aminoácidos consecutivos de un polipéptido esclerostina según se proporciona en la presente (o de una variante del mismo), tales péptidos comprendiendo, por ejemplo, secuencias de aminoácido según se establecen en SEQ ID NOS:2-19, 21 -53, y 54. La presente invención también proporciona inmunógenos de polipéptido y péptido que pueden utilizarse para generar y/o identificar los anticuerpos o fragmentos de los mismos que son capaces de inhibir, prevenir, o deteriorar la formación de homodímeros SOST. Los anticuerpos de la presente invención son útiles para aumentar el contenido mineral y densidad mineral del hueso, aminorando de tal modo condiciones numerosas que dan como resultado la pérdida de contenido mineral óseo, incluyendo, por ejemplo, enfermedad, predisposición genética, accidentes que dan como resultado la falta de uso del hueso (por ejemplo, debido a la fractura), terapéuticos que efectúan la resorción del hueso o que eliminan las células formadoras del hueso, y envejecimiento normal.

Esclerosteosis La esclerosteosis es una enfermedad relacionada a la densidad mineral ósea anormal en humanos. La esclerosteosis es un término que se aplicó por Hansen (Hansen, H. G. , Sklerosteose in: Opitz eí al. , eds. Handbuch der Kinderheilkunde, (Berlin: Springer 1967) 351 -355) a un desorden similar a corticalis generalisata hyperostosis de van Buchem pero posiblemente diferente en apariencia radiológica de los cambios óseos y en la presencia de sindactilia cutánea asimétrica de los dedos, índice y medio, en varios casos. La esclerosteosis ahora se entiende que es un desorden semi-dominante autosomal que se caracteriza por lesiones escleróticas ampliamente diseminadas del hueso en el adulto. La condición es progresiva. La esclerosteosis también tiene un aspecto en desarrollo que se asocia con la sindactilia (dos o más dedos unidos juntos). El síndrome de eslerosteosis se asocia con la estatura grande, y varios individuos afectados logran una altura de seis pies o más. Además, la mandíbula de las personas con esta condición tiene una apariencia inusualmente cuadrada. El contenido mineral óseo de homocigotos puede ser 1 o 6 veces más grande que los individuos normales, y la densidad mineral ósea puede ser 1 a 4 veces más arriba de los valores normales (por ejemplo, en comparación a los medios hermanos no afectados). El Síndrome de Esclerosteosis se presenta principalmente en sudafricanos blancos de descendencia Holandesa en Sudáfrica. Aproximadamente 1 de cada 140 individuos en la población sudafricana blanca es un vehículo del gen mutado (heterocigotos). La mutación muestra 100% de penetración. Los reportes de anécdota indican que la densidad mineral ósea aumentada se ha observado en heterocigotos pero que tienen patologías no asociadas (por ejemplo, sobrecrecimiento del cráneo o sindactilia). La no anormalidad del eje pituitaria-hipotálamo se ha observado en pacientes con esclerosteosis. En particular, la no sobre producción de hormona de crecimiento y cortisona se presenta, y los niveles de hormonal sexual son normales en individuos afectados. Los marcadores de inversión de hueso (tales como fosfatasa alcalina específica de osteoblasto, osteocalcina, propéptido procolágeno C tipo 1 (PICP), y fosfatasa alcalina total (véase Comier, Curr. Opin. in Rheu. 7:243 (1995)) indican que la actividad hiperosteoblástica se asocial con la enfermedad pero la actividad osteoblasto de normal a ligeramente reducida se observa según se mide por los marcadores de la resorción de hueso (pirridinolina, deoxipriridinolina, N-telopéptido, hidroxiprolina urinaria, fosfatasas de ácido resistente al tartrate de plasma, e hidroxilisina galactosil (véase Comier, supra)). La esclerosteosis se caracteriza por la deposición continua de hueso a lo largo del esqueleto durante la vida de tiempo de los individuos afectados. En los homocigotos, la deposición continua de mineral óseo conduce a un sobre crecimiento de hueso en áreas del esqueleto en donde los mecanoreceptores se encuentran ausentes (por ejemplo, cerebro, mandíbula, cráneo). En los homocigotos con Esclerosteosis, el sobre crecimiento de los huesos del cerebro conduce a la compresión craneal y eventualmente a la muerte debido a la presión hidrostática excesiva en la raíz del cerebro. Se observa una esclerosis difusa y generalizada en todas las otras partes del esqueleto. Las áreas corticales de los huesos largos se espesan mayormente en un aumento sustancial en resistencia del hueso. Las conexiones trabeculares se aumentan en espesor, que a su vez aumenta la resistencia del hueso trabecular.

Los huesos escleróticos aparecen inusualmente opacos a los rayos X. La mutación genética rara que es responsable del Síndrome de Esclerosteosis se ha localizado en la región de cromosoma humano 17. Un gen dentro de esta región codifica un nuevo miembro de la familia de proteína de unión TGF-beta (véase, por ejemplo, Patentes de EE. UU. Nos. 6,395,51 1 , 6,489,445, y 6,495,736; Brunkow et al. , Am. J. Hum. Genet. 68:577-89 (2001 )). Los terapéuticos relacionados a alterar o modular el nivel de esclerostina pueden por lo tanto ser útiles en las condiciones y enfermedades en tratamiento relacionadas al desarrollo o deterioro del hueso anormal. Según se describe a mayor detalle abajo, los anticuerpos que se unen específicamente a esta proteína de unión TGF-beta, esclerostina, (también referida en la presente como Beer o como SOST), pueden utilizarse para aumentar el contenido mineral óseo de esta manera tratando, previniendo, retardando el avance, o aminorando los síntomas de un número de enfermedades.

Súper Familia de TGF-Beta Entre las moléculas importantes a las cuales se hace referencia en la presente incluyen cualquiera de los miembros nuevos o conocidos de la súper familia de Factor de Crecimiento Transformador-beta (TGF-beta), la cual incluye proteínas morfogénicas óseas (BMPs). También se incluyen en la súper familia de TGF-beta los receptores TGF-beta, los cuales podría entenderse que se refieren a uno o más receptores que son específicos para un miembro particular de la súper familia de TGF-beta (incluyendo BMPs), y proteínas de unión de TGF-beta, las cuales podría entenderse que se refieren a uno o más polipéptidos con afinidad de unión específica para un miembro particular o subgrupo de miembros de la súper familia de TGF-beta (incluyendo BMPs). Un ejemplo específico de una proteína de unión de TGF-beta incluye esclerostina o SOST. Las secuencias de polipéptido que codifican SOST y variantes SOST en varios animales, incluyendo humanos, se proporcionan en la presente en SEQ I D NOs: 55, 56, 57, 59, 61 , 63, 65, y 67 y 69 (las secuencias de polipéptido codificadas se proporcionan en SEQ ID NOs: 1 , 20, 58, 60, 62, 64, 66, 68, y 70, respectivamente). (Véase, por ejemplo, Patentes de EE. UU. Nos. 6,395,51 1 ; 6,489,445; y 6,495,736. Véase también por ejemplo, Balemans et al. , 2002 Dev. Biol. 250:231 ; Schmitt et al. , 1 999 J. Orthopaed. Res. 17:269; Khalil, 1999 Microbes Infecí. 1 : 1255; Miyazono et al. , 1 993 Growth Factors 8: 1 1 ; von Bubnoff eí al. , 2001 Dev. Biol. 239: 1 ; Koli eí al. , 2001 Microsc. Res. Tech. 52:354; Ebara et al. , 2002 Spine 27(16 Suppl. 1 ):S10; Bondestam, 2002, Ligands & Signaling Components of the Transforming Growth Factor ß Family, Helsinki University Biomedical Dissertations No. 17). La súper familia de TGF-beta contiene una variedad de factores de crecimiento que comparten elementos de secuencia comunes y motivos estructurales tanto en niveles terciarios como secundarios. Esta familia de proteína ejerce un amplio espectro de respuestas biológicas que afectan una gran variedad de tipos de célula. Varios de los miembros de la familia de TGF-beta tienen importantes funciones en la formación de patrón y especificación de tejido durante el desarrollo embrional. En adultos, se incluyen los miembros de la familia de TGF-beta, por ejemplo, en cicatrización de herida, reparación del hueso y remoldeo del hueso, y en la modulación del sistema inmune. Además de los polipéptidos TGF-beta, esta súper familia incluye BMPs, activitas, inhibinas, Factores de Diferenciación y Crecimiento (GDFs), y Factores Neutróficos Glial-Derivados (GDNFs). La clasificación primaria se establece a través de características de secuencia generales que unen una proteína específica en una sub-familia general. La estratificación adicional dentro de la sub-familia es posible debido a la conservación de secuencia más estricta entre los miembros del grupo más pequeño. En ciertos casos, tales como con BMP-5, BMP-6, y BMP-7, el porcentaje de identidad de aminoácido puede ser tan alta como 75% entre miembros del grupo más pequeño. Este nivel de identidad permite a una secuencia representativa única ilustrar los elementos bioquímicos clave del sub-grupo que la separa de otros miembros de la familia más grande. La estructura de cristal de TGF-beta2 se ha determinado.

El pliegue general del monómero TGF-beta2 contiene una estructura tipo nudo de cisteína, compacta, adecuada, formada por tres puentes de disulfuro. La dimerización, la cual se estabiliza por un puente de disulfuro, es anti-paralela. Los miembros de familia de TGF-beta se señalan al inducir la formación de complejos de receptor hetero-oligoméricos. La transducción de señales TGF-beta incluye dos sub-familias distintas de receptores de serina transmembrana/treonina quinasa, tipo I y tipo I I . Al menos siete receptores tipo I y cinco receptores tipo II se ha identificado (véase Kawabata eí a/. , Cytokine Growth Factor Rev. 9:49-61 (1 998); Miyazono et al. , Adv. Immunol. 75: 1 15-57 (2000). Cada miembro de la familia TGF-beta se une a una combinación característica de receptores tipo l y tipo I I , ambos necesarios para señalización. En el modelo actual para la activación de receptor TGF-beta, un ligante TGF-beta primero se une al receptor Tipo II (TbR-ll), el cual recluta así un receptor Tipo I (TbR-1 ) para formar un complejo ternario ligante/tipo l l/tipo I. El receptor tipo I , no puede unir el ligante en la ausencia de TbR-l l. El TbR-l l fosforilata así el TbR-l predominantemente en un dominio rico en residuos de serina y glicina (dominio GS) en la región yuxtamembrana, activando de tal modo el TbR-l. La quinasa de receptor tipo I activada fosforilata así los miembros particulares de la familia Smad de proteína que se translocalizan al núcleo en donde modulan la transcripción de los genes específicos.

Proteínas Morfo énicas Óseas (BMPs): Proteínas Reguladoras Clave de Densidad Mineral Ósea Una ventaja principal en el entendimiento de la formación del hueso fue la identificación de las BMPs, también conocidas como proteínas osteogénicas (OPs), las cuales regulan el cartílago y la diferenciación del hueso en vivo. Las BMPs/OPs inducen la diferenciación del hueso endocrino a través de una cascada de casos mediante los cuales las células germinales mesénquimas se diferencian en condrocitos que establecen una estructura de cartílago que se vuelve a absorber y reemplazar por el tejido del hueso (véase Balemans eí al. , Dev. Biol. 250:231 -50 (2002)). De esta manera, este proceso incluye la formación de cartílago, hipertrofia y calcificación del cartílago, invasión vascular, diferenciación de osteoblastos, y formación de hueso. Según se describe anteriormente, las BMPs/OPs (BMP 2-14, y proteína osteogénica 1 y 2, OP-1 y OP-2) (véase, por ejemplo, GenBank P12643 (BMP-2); GenBank P12645 (BMP3); GenBank P551 07 (BMP-3b, factor de crecimiento/diferenciación 10) (GDF-10)); GenBank P12644 (BMP4); GenBank P22003 (BMP5); GenBank P22004 (BMP6); GenBank P18075 (BMP7); GenBank P34820 (BMP8); GenBank Q9UK05 (BMP9); GenBank 095393 (BM10); GenBank O95390 (BMP1 1 , factor de crecimiento/diferenciación 1 1 precursor (GDF-1 1 )); GenBank 095972 (BM15)) son miembros de la súper famila de TGF-beta. La conservación evolutiva de golpeteo entre los miembros de la sub-familia de BMP/OP sugiere que son importantes en el desarrollo normal y función de los animales. Además de la condrogénesis y osteogénesis post-fetal, las BMPs/OPs juegan múltiples papeles en la esqueletogénesis, incluyendo el desarrollo de los tejidos dentales y craneófaciales. Diferentes miembros de la familia BMP también tienen actividades biológicas otros diversos tipos de célula, incluyendo monocitos, células epiteliales, células mesénquimas, y células neuronales. Las BMPs regulan la proliferación y diferenciación celular, la quimiotaxs y apoptosis, y también controlan los papeles fundamentales, por ejemplo, asimetría izquierda-derecha, neurogénesis, modelo de mesodermo, y desarrollo embriónico y organogénesis de un número de órganos incluyendo el riñon, intestino, pulmón, dientes, extremidad, amnios, testículos (véase, Balemans, supra). Las BMPs se sintetizan como proteínas precursoras grandes. En la dimerización, las BMPs se dividen de manera proteolítica dentro de la célula para producir proteínas maduras de terminal carboxi que se secretan así de la célula. Las BMPs, como otros miembros de la familia TGF-beta, inician la transducción de señal al unirse cooperativamente tanto a los receptores de quinasa de serina/treonina tipo I como tipo II. Los receptores tipo 1 para los cuales las BMPs pueden actuar como ligantes incluyen BMPR-IA (también conocidos como ALK-3), BMPR-IB (también conocidos como ALK-6), ALK-1 , y ALK-2 (también conocidos como ActR-l). De los receptores tipo I I , las BMPs se unen al receptor tipo I I de BMP (BMPR-I I), Activina tipo ll (ActR-ll), y Activina tipo IIB (ActR-IIB). (Véase Balemans eí al. , supra, y referencias citadas en la presente). Las secuencias de polinucleótido y la secuencia de aminoácido codificada de polipéptidos de recetor tipo I de BMP se proporcionan en la base de datos de GenBank, por ejemplo, GenBank NM_004329 (SEQ I D NO:71 codificada por SEQ ID NO:85); D89675 (SEQ ID NO:72 codificada por SEQ I D NO:86); NM_001203 (SEQ ID NO:73 codificada por SEQ ID NO:87); S75359 (SEQ I D NO:74 codificada por SEQ ID NO:88); NM_030849 (SEQ ID NO:75 codificada por SEQ ID NO:89); y D38082 (SEQ I D NO:76 codificada por SEQ I D NO:90). Otras secuencias de polipéptido de los receptores tipo I se proporcionan en la base de datos de GenBank, por ejemplo, NP_001 194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); y AAB33865 (SEQ ID NO:79). Las secuencias de polinucleótido y la secuencia de aminoácido codificado de polipéptidos de receptor tipo II de BPM se proporcionan en la base de datos de GenBank e incluyen, por ejemplo, U251 10 (SEQ I D NO:80 codificada por SEQ ID NO:91 ); NM_033346 (SEQ I D NO:81 codificada por SEQ I D NO:92); NM_001204 (SEQ ID NO:82 codificada por SEQ I D NO:93); y Z48923 (SEQ ID NO:83 codificada por SEQ ID NO:94). Las secuencias de polipéptido adicionales de los receptores tipo I I también se proporcionan en la base de datos de GenBank, por ejemplo, CAA88759 (SEQ ID NO:84). Las BMPs, similares a otras proteínas de nudo de cistina, forman una estructura de homodímero (Scheufler eí al. , J. Mol. Biol. 287: 103-15 (1 999)). De acuerdo al análisis de indicio evolutivo realizado en la familia BMP/TGF-ß, el sitio de unión de receptor tipo I de BMP y el sitio de unión de receptor tipo I I se delimitaron a la superficie de la estructura de BMP (Innis eí al. , Protein Eng. 13:839-47 (2000)). La ubicación del sitio de unión de receptor tipo I en BMP se confirmó posteriormente por la estructura de rayos X del complejo Receptor IA BMP-2/BMP (Nickel eí al. , J. Joint Surg. Am. 83A(Suppl 1 (Pt 1 )):S7-S14 (2001 )). El sitio de unión de receptor tipo II pronosticado se encuentra en buen acuerdo con la estructura de rayos X de complejo de receptor Tipo I I de TGF-ß3/TGF-ß (Hart eí al. , Nat. Struct. Biol. 9:203-208 (2002)), el cual es altamente similar al sistema de Receptor HA de BMP/BMP. Las sub-familias de BMP y Activina se someten a la regulación post-translacional importante mediante las proteínas de unión de TGF-beta. Un sistema de control extracelular complicado existe, mediante el cual un antagonista de alta afinidad se sintetiza y se exporta, y subsecuentemente forma un complejo selectivamente con BMPs o activinas para romper su actividad biológica (Smith, Trends Genet. 15:3-6 (1999)). Un número de tales proteínas de unión TGF-beta se han identificado, y en base a la divergencia de secuencia, los antagonistas parece que se desenvuelven independientemente debido a la falta de conservación de secuencia primaria. En los vertebrados, los antagonistas incluyen noggin, chordin, chordin-similar, follistatin, FSRP, la familia de proteína DAN/Cerberus, y esclerostina (SOST) (véase Balemans eí al. , supra, y referencias citadas en la presente). El mecanismo de antagonismo parece que difiere de los diferentes antagonistas (lemura eí al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:9337-9342). Los sitios de unión de receptor tipo I y tipo II en el noggin de antagonista de BMP se han también delimitado. Noggin se une a BMPs con alta afinidad (Zimmerman eí al. , 1 996). Un estudio de la estructura de complejo noggin/BMP-7 reveló las interacciones de unión entre las dos proteínas (Groppe eí al. , Nature 420:636-42 (2002)). La superposición de la estructura de noggin-BMP-7 sobre un modelo del complejo de señalización de BMP mostró que la unión de noggin enmascara eficazmente ambos pares de epítopos de unión (es decir, sitios de unción de receptor Tipo I y Tipo I I de BMP) en BMP-7. La secuencia de andamio rica en cisteína de noggin se precede por un segmento de N-terminal de aproximadamente 20 residuos de aminoácido que se refieren como el "clip" (residuos 28-48) . El sitio de unión de receptor tipo I se excluye por la parte de N-terminal del dominio de clip de Noggin, y el sitio de unión de receptor tipo ll se excluye por la parte de terminal de carboxi del dominio de clip. Dos filamentos ß en la región de núcleo cerca de la C-terminal de noggin también contactan la BMP-7 en el sitio de unión de receptor tipo II . Este modo de unión permite a un dímero Noggin bloquear eficazmente todos los sitios de unión de receptor (dos sitios de unión de receptor tipo I y dos tipo I I) en un dímero DMP.

Polinucléotidos Codificadores y Polipéptidos de Esclerostina El antagonista de BMP, esclerostina (Patentes de EE. UU. Nos. 67,395,51 1 , 6,489,445, y 6,495,736; véase también SEQ ID NOs: 1 , 20, 58, 60, 62, 64, 66, 68, y 70), posee un andamio de cisteína (disulfuro) casi idéntico cuando se compara con DAN Humano, Gremlin Humano, y Cerberus Humano, y SCGF (Patente de EE.UU. No. 5,780,263) pero casi nada de homología en el nivel de nucleótido (para información de antecedentes, véase generalmente Hsu eí al. , Mol. Cell 1 :673-683 (1998)). La esclerostina también deberá entenderse que incluye variantes de esta proteína de unión TGF-beta (por ejemplo, SEQ I D NOs. 60 y 62). Según se utiliza en la presente, el polinucleótido variante de proteína de unión TGF-beta se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que es una modificación (inserción, , supresión, o sustitución de uno o más nucleótidos) de SEQ ID NOs: 55-57, 59, 61 , 63, 65, 67, o 69. Tales variantes incluyen polimorfismos que se presentan naturalmente o variantes alélicas de los polinucleótidos codificadores de proteína de unión TGF-beta, así como también polinucleótidos sintéticos que codifican las sustituciones de aminoácido conservadoras de estas secuencias de aminoácido. Una variedad de criterio conocida por aquellos expertos en la materia indica si los aminoácidos en una posición particular en un péptido o polipéptido son similares. Por ejemplo, un aminoácido similar o sustitución de aminoácido conservadora es uno en el cual un residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar, la cual incluye aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin cargar (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, histidina), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano); cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina), y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano). Prolinala, la cual se considera la más difícil de clasificar, comparte propiedades con los aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas (por ejemplo, Leu, Val, lie, y Ala). En ciertas circunstancias, la sustitución de glutamina por el ácido glutámico o asparagina por el ácido aspártico puede considerarse una sustitución similar en la que la glutamina y asparagina son derivados de amida de ácido glutámico y ácido aspártico, respectivamente. Las formas de variante adicionales de un polinucleótido codificador de proteína de unión TGF-beta son moléculas de ácido nucleico que contienen sustituciones, inserciones o supresiones de uno o más nucleótidos encontradas dentro de las secuencias de nucleótido descritas en la presente. Una variante o un mutante de una proteína de unión TGF-beta puede construirse o identificarse de tal forma que la versión alterada de la proteína de unión TGF-beta compite con la proteína de unión TGF-beta tipo silvestre. Tal competencia podría preferentemente bloquear la actividad de la proteína de unión TGF-beta tipo silvestre y de esta manera conducir a la densidad ósea aumentada. Un polinucléotido aislado es una molécula de ácido nucleico (polinucleótido u oligonucleótido) que no se integra en el ADN genómico de un organismo. Un polinucleótido se considera que se aisla si, por ejemplo, se clona en un vector que no es parte del ambiente natural. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica una proteína de unión TGF que se ha separado del ADN genómico de una célula eucariótica es una molécula de ADN aislada. Otro ejemplo de un ácido nucleico aislado es una molécula de ácido nucleico químicamente sintetizada que no se integra en el genoma de un organismo. La molécula de ácido nucleico aislada puede ser ADN, cADN, ARN, o componerse al menos en parte de análogos de ácido nucleico. Los polinucleótidos de variante de proteína de unión TGF-beta pueden identificarse al determinar si los polinucléotido se hibridizan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótido de SEQ I D NOs: 55-57, 59, 61 , 63, 65, 67, o 69 bajo condiciones rigurosas. Además, los polinucleótidos de variante de proteína de unión TGF-beta codifican una proteína que tiene un elemento principal de cisteína. Los polinucleótidos de variante de proteína de unión TGF-beta también pueden identificarse por comparación de secuencia. Según se utiliza en la presente, dos secuencias de aminoácido tienen "1 00% de identidad de secuencia de aminoácido" si los residuos de aminoácido de las dos secuencias de aminoácido son las mismas cuando se alinean para correspondencia máxima. Las comparaciones de secuencia pueden realizarse utilizando programas de software estándar tales como aquellos incluidos en el sitio de computación de bioinformática LASERGENE, el cual se produce por DNASTAR (Madison, Wisconsin), o el algoritmo BLAST disponible en el sitio web NCBI ([lnternet]<:http:www. ncbi.nlm. nih.gov>). Otros métodos para comparar dos o más secuencias de aminoácido o nucleótido al optimizar la alineación óptima se conocen bien por aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Peruski y Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1 997), Wu eí al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," in Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997), y Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998)). Una proteína de unión TGF-beta variante deberá tener al menos un 50% de identidad de secuencia de aminoácido a las SEQ ID NOs: 1 , 20, 58, 60, 62, 64, 66, y 68, y preferentemente mayor a 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 98% de identidad. Alternativamente, las variantes de proteína de unión TGF-beta pueden identificarse al tener al menos un 70% de identidad de secuencia de nucleótido a las SEQ ID NOs: 55-57, 59, 61 , 63, 65, 67, o 69. Además, la presente invención contempla las variantes de polinucleótido de proteína de unión TGF-beta que tienen más de 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% de identidad a SEQ I D NO: 55 o 57. Sin considerar el método particular utilizado para identificar un polinucleótido de variante de proteína de unión TGF-beta o proteína de unión TGF-beta variante, tal como un variante puede caracterizarse funcionalmente por, por ejemplo, su habilidad para unirse a y/o inhibir la señalización de un miembro seleccionado de la familia de proteínas de TGF-beta, o por su habilidad para unirse específicamente a un anticuerpo de proteína de unión anti-TGF-beta. Dentro del contexto de esta invención, un "fragmento funcional" de un polinucleótido de proteína de unión TGF-beta se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una parte de un polipéptido de proteína de unión TGF-beta que ya sea (1 ) posee una actividad funcional según se describe en la presente o (2) específicamente se une a un anticuerpo de proteína de unión anti-TGF-beta. Por ejemplo, un fragmento funcional de un polinucleótido codificador de proteína de unión TGF-beta descrito en la presente comprende una parte de la secuencia de nucleótido de SEQ ID Nos: 55-57, 59, 61 , 63, 65, 67, 0 69.

Un "polipéptido aislado" referido en la presente es un polipéptido que se remueve de su ambiente natural. Por ejemplo, una proteína que se presenta naturalmente se aisla si ésta se separa de algunos o todos los materiales co-existentes en el sistema natural, tales como carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, o impurezas proteínicas, asociadas con el polipéptido en naturaleza. Preferentemente, tales polipéptidos aislados son al menos aproximadamente 90% puros, más preferentemente al menos aproximadamente 95% puros, y más preferentemente al menos aproximadamente 99% puros.

Anticuerpos Específicos Para Las Proteínas de Unión TGF-Beta La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a SOST y también proporciona inmunógenos de polipéptido SOST que pueden utilizarse para la generación y análisis de estos anticuerpos y también proporciona métodos para utilizar tales anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención según se describe en la presente se unen específicamente a un polipéptido SOST y de tal modo bloquean o inhiben la unión de una BMP al polipéptido SOST, es decir, previenen o deterioran la interacción entre la BMP y SOST. El efecto de bloqueo de esta interacción es alterar (aumentar o reducir en una manera estadísticamente importante) la densidad mineral ósea, preferentemente aumentar la densidad mineral ósea.

Los péptidos o polipéptidos útiles para la inmunización y/o análisis de anticuerpos específicos de SOST también pueden seleccionarse al analizar la estructura, primaria, secundaria y terciaria de una proteína de unión TGF-beta de acuerdo a los métodos conocidos por aquellos expertos en la materia y descritos en la presente, a fin de determinar las secuencias de aminoácido más probablemente para generar una respuesta antigénica en un huésped animal. Véase por ejemplo, Novotny, Mol. Immunol. 28:201 -207 (1991 ); Berzofsky, Science 229:932-40 (1985)). Los datos de cristalografía de rayos x y moldeo también pueden utilizarse para pronosticar y/o identificar cuáles partes o regiones de una proteína de unión TGF-beta interactúan con qué otras partes de un ligante de proteína de unión TGF-beta, tal como una BMP. Los inmunógenos de péptido de proteína de unión TGF-beta pueden diseñarse y prepararse para que incluyan secuencias de aminoácido dentro o alrededor de las partes o regiones de interacción. Estos anticuerpos pueden ser útiles para bloquear o deteriorar la unión de la proteína de unión TGF-beta al mismo ligante y también pueden bloquear o deteriorar la unión de la proteína de unión TGF-beta a uno u otros más ligantes. Los anticuerpos o fragmentos de unión de antígeno de los mismos contemplados por la presente invención incluyen anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a SOST e inhibir competitivamente la unión de un polipéptido TGF-beta, tal como una BMP, a SOST. Por ejemplo, los anticuerpos contemplados por la presente invención inhiben competitivamente la unión del polipéptido SOST al sitio de receptor Tipo I de BMP en una BMP, o al sitio de unión de receptor Tipo I I de BMP, o pueden inhibir competitivamente la unión de SOST tanto a los sitios de receptor Tipo I como Tipo II en una BMP. Sin desear someterse por teoría, cuando un anticuerpo anti-SOST competitivamente inhibe la unión de los sitios de unión Tipo I y/o Tipo I I del polipéptido BMP a SOST, de esta manera bloqueando la actividad antagonística de SOST, los sitios de unión de receptor en BMP se encuentran disponibles para unirse a los receptores Tipo I y Tipo I I, aumentando de tal modo la mineralización ósea. La interacción de unión entre una proteína de unión TGF-beta tal como SOST y un polipéptido TGF-beta tal como una BMP se presenta generalmente cuando cada uno de los pares del ligante forma un homodímero. Por lo tanto, en lugar de o además de utilizar un anticuerpo específico para que SOST bloquee, deteriore, o prevenga la unión de SOST a una BMP al inhibir competitivamente la unión de SOST a BMP, un anticuerpo específico SOST puede utilizarse para bloquear o deteriorar la formación de homodímero SOST. A manera de ejemplo, un dímero de Noggin humano, que es un antagonista BMP que tiene la habilidad de unirse a una BMP con alta afinidad (Zimmerman eí al. , supra), se aisló en complejo con un dímero de BMP-7 humano y se analizó por difracción anómala de múltiples longitudes de onda (MAD) (Groppe eí al. , Nature 420:636-42 (2002)). Según se discute en la presente, este estudio reveló que el dímero Noggin puede bloquear eficazmente todos los sitios de unión de receptor (dos sitios de unión de receptor tipo I y dos tipo I I) en un dímero BMP. La ubicación de los aminoácidos de Noggin que contactan BMP-7 puede ser útil en el moldeo de la interacción entre otras proteínas de unión TGF-beta, tales como esclerostina (SOST), y BMPs, y de esta manera ayudar al diseño de péptidos que pueden utilizarse como inmunógenos para generar los anticuerpos que bloquean o deterioran tal interacción. En una modalidad de la presente invención, un anticuerpo, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido SOST competitivamente inhibe la unión del polipéptido SOST a al menos uno o ambos sitios de unión de receptor Tipo I I de BMP como sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) que se ubican en una BMP. Los epítopos en SOST a los cuales estos anticuerpos se unen pueden incluir o incluirse dentro de las secuencias de aminoácido contiguas que se ubican en la N-terminal del polipéptido SOST (aminoácidos en aproximadamente las posiciones 1 -56 de SEQ I D NO: 1 ). Los polipéptidos también pueden incluir una secuencia de péptido de enlazador corto que conecta la región de N-terminal a la región de núcleo, por ejemplo, los polipéptidos según se proporcionan en SEQ ID NO:47 (humano) and SEQ ID NO:48 (rata). Las secuencias de péptido de N-terminal representativas más cortas de SOST de humano (por ejemplo, SEQ I D NO: 1 ) incluyen SEQ ID NOS:2-6, y secuencias de péptido SOST de rata representativas (por ejemplo, SEQ ID NO:20) incluyen SEQ ID NOS: 12-15.

Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipétido SOST y bloquean o inhiben competitivamente la unión del polipéptido SOST a una BMP, por ejemplo, al bloquear o inhibir la unión a aminoácidos de una BMP correspondiente a uno o más de los sitios de unión de receptor Tipo I y Tipo I I también pueden unirse específicamente a péptidos que comprenden una secuencia de aminoácido correspondiente a la región de núcleo de SOST (aminoácidos en aproximadamente las posiciones 57-146 de SEQ ID NO: 1 ). Los polipéptidos que incluyen la región de núcleo también pueden incluir aminoácidos adicionales extendiéndose a cualquiera o ambas N-terminal y C-terminal, por ejemplo, para incluir residuos de cisteína que pueden ser útiles para conjugar el polipéptido a una molécula vehículo. Los polipéptidos de núcleo representativos de SOST de rata y humano, por ejemplo, comprenden las secuencias de aminoácido establecidas en SEQ ID NO:49 y SEQ ID NO:50, respectivamente. Tales anticuerpos pueden también unir las secuencias de polipéptido más cortas. Las secuencias de péptido de núcleo de SOST de humano representativas se proporcionan en SEQ ID NOs:21 -24 y las secuencias de núcleo de SOST de rata representativas se proporcionan en SEQ ID NOs:25-28. En otra modalidad, los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido SOST deterioran (inhiben, previene, o bloquean, por ejemplo, reducen en una manera estadísticamente significante) la formación de un homodímero SOST. Debido a que la interacción entre SOST y una BMP puede incluir un homodímero de SOST y un homodímero de la BMP, un anticuerpo que previene o deteriora la formación de homodímero de SOST puede de tal modo alterar la densidad mineral ósea, preferentemente aumentando la densidad mineral ósea. En una modalidad, los anticuerpos que se unen a la región de núcleo de SOST previenen la formación de homodímero. Tales anticuerpos también pueden unirse a péptidos que comprenden secuencias de aminoácido contiguas correspondientes a la región de núcleo, por ejemplo, SEQ I D NOs:29, 30 y 53 (SOST de humano) y SEQ I D NOs: 31 y 54 (SOST de rata). Los anticuerpos que se unen a un epítopo ubicado en la región de C-terminal de un polipéptido SOST (en aproximadamente las posiciones de aminoácido 147-1490 ya sea de SEQ I D NO: 1 o 20) también pueden deteriorar la formación de homodímero. Los polipéptidos de C-terminal representativos de SOST de rata y humano, por ejemplo, comprenden las secuencias de aminoácido establecidas en SEQ ID NO:51 y SEQ ID NO:52, respectivamente. Tales anticuerpos pueden también unir las secuencias de polipéptido más cortas. Las secuencias de péptido de C-terminal de SOST humano representativas se proporcionan en SEQ ID NOs:33-36 y las secuencias de C-terminal de SOST de rata representativas se proporcionan en SEQ ID NOs:41 -43. Los polipéptidos y péptidos SOST descritos en la presente a los cuales pueden unirse específicamente los anticuerpos son útiles como inmunógenos. Estos inmunógenos de la presente invención pueden utilizarse para inmunizar un animal para generar una respuesta inmune humana que de cómo resultado la producción de anticuerpos que se unen específicamente a un sitio de unión de receptor Tipo I o Tipo I I o ambos ubicados en una BMP incluyen los péptidos derivados de la región de N-terminal de SOST o que pueden prevenir la formación de homodímero SOST. Tales polipéptidos y péptidos SOST que son útiles como inmunógenos también pueden utilizarse en métodos para seleccionar las muestras que contienen anticuerpos, por ejemplo, muestras de anticuerpos purificados, antisuero, o sobrenadantes de cultivo celular y cualquier otra muestra biológica que puede contener uno o más anticuerpos específicos para SOST. Estos péptidos también pueden utilizarse en métodos para identificar y seleccionar de una muestra biológica una o más células B que se encuentran produciendo un anticuerpo que se une específicamente a SOST (por ejemplo, ensayos formadores de placa y lo similar). Las células B pueden utilizarse así como fuente de un polinucleótido codificador de anticuerpo específico SOST que puede clonarse y/o modificarse mediante las técnicas de biología molecular recombinante conocidas en la materia y descritas en la presente. Una "muestra biológica" según se utiliza en la presente se refiere en ciertas modalidades a una muestra que contiene al menos un anticuerpo específico para un polipéptido SOST, y una muestra biológica puede proporcionarse al obtener una muestra sanguínea (de la cual puede prepararse el suero o plasma), espécimen de biopsia, explante de tejido, cultivo de órgano, o cualquier otra preparación de célula o tejido de un sujeto o una fuente biológica. Una muestra puede además referirse a una preparación de célula o tejido en la cual la integridad morfológica o estado físico se ha roto, por ejemplo, por disección, disociación, solubilización, fraccionación, homogenización, extracción bioquímica o química, extracción, pulverización, liofilización, sonicación, o cualquier otro medio para procesar una muestra derivada de un sujeto o fuente biológica. El sujeto o la fuente biológica puede ser un humano o un animal no humano, un cultivo celular primario (por ejemplo, células B inmunizadas en vivo), o estirpe de célula adaptada por cultivo incluyendo pero no limitándose a estirpes de célula genéticamente elaboradas que pueden contener secuencias de ácido nucleico recombinantes episomales o cromosómicamente integradas, estirpes de célula inmortalizables o inmortalizadas, estirpes de célula híbridas de célula somática, estirpes de célula diferenciadas o diferenciables, estirpes de célula transformadas, y lo similar. Los inmunógenos de péptido SOST también pueden prepararse al sintetizar una serie de péptidos que, en total, representan la secuencia de polipéptido completa de un polipéptido SOST y que cada uno tiene una parte de la secuencia de aminoácido SOST en común con otro péptido en la serie. Esta parte subyacente podría preferentemente ser al menos de cuatro aminoácidos, y más preferentemente 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos. Cada péptido puede utilizarse para inmunizar un animal, los sueros colectados del animal, y probarse en un ensayo para identificar cuál animal está produciendo anticuerpos que deterioran o bloquean la unión de SOST a una proteína TGF-beta. Los anticuerpos se preparan así de tales animales inmunizados identificados de acuerdo a los métodos conocidos en la materia y descritos en la presente. Los péptidos, polipéptidos, y otras moléculas de no péptido que se unen específicamente a una proteína de unión TGF-beta tal como SOST se contemplan por esta invención. Según se utiliza en la presente, se dice que una molécula se "une específicamente" a una proteína de unión TGF si ésta reacciona a un nivel detectable con la proteína de unión TGF-beta, pero no reacciona detectablemente con péptidos y polipéptidos que contienen una secuencia no relacionada, o una secuencia de una proteína de unión TGF-beta diferente.. Las moléculas de unión preferidas incluyen anticuerpos, que pueden ser, por ejemplo, policlonales, monoclonales, de cadena única, quiméricos, anti-idiotípicos, o inmunoglobulinas injertadas con CDR, o fragmentos de las mismas, tales como fragmentos F(ab')2, Fab, Fab' Fv, y Fd de inmunoglobulina recombinantemente producida o proteolíticamente generadas. Los particularmente útiles son los anticuerpos de proteína de unión anti-TGF-beta que "se unen específicamente" la proteína de unión TGF-beta de SEQ ID NOs: 1 , 20, 58, 60, 62, 64, 66, o 68, pero no a otras proteínas de unión TGF-beta tales como Dan, Cerberus, SCGF, o Gremlin. Se entiende que los anticuerpos se unen específicamente a una proteína de unión TGF-beta, o un miembro de la familia de TGF-beta específica, si se unen con una Ka de más de o igual a 1 04 M"1 , más preferentemente más de o igual a aproximadamente 105 M"\ más preferentemente más de o igual a aproximadamente 106 M"1 , todavía más preferentemente más de o igual a 1 07 M"\ y todavía más preferentemente más de o igual a 108 M"\ y no se unen a otras proteínas de unión de TGF-beta. La afinidad de un anticuerpo para su antígeno cognado también se expresa comúnmente como una constante de disociación KD, y un anticuerpo anti-SOST se une específicamente a un miembro de familia de TGF-beta si se une con una K de menos de o igual a 10"4 M, más preferentemente menos de o igual a aproximadamente 1 0"5M, más preferentemente menos de o igual a aproximadamente 1 0"6 M, todavía más preferentemente menos de o igual a 1 0"7 M, y todavía más preferentemente menos de o igual a 10"8M. Además, los anticuerpos de la presente invención preferentemente bloquean, deterioran o inhiben (por ejemplo, reducen con importancia estadística) la unión de una proteína de unión TGF-beta a un miembro de familia de TGF-beta. La afinidad de un anticuerpo o pareja de unión, así como también el grado al cual un anticuerpo inhibe la unión puede determinarse fácilmente por cualquier experto en la materia utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, aquellas descritas por Scatchard eí al. (Ann. N. Y. Acad. Sci. 51 :660-672, (1 949)) o por resonancia de plasmón de superficie (SPR; BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ). Para resonancia de plasmón de superficie, las moléculas objetivo se inmovilizan sobre una fase sólida y se expone a ligantes en una fase móvil ejecutándose a lo largo de una célula de flujo. Si la unión de ligante al objetivo inmovilizado se presenta, el índice refractivo local cambia, conduciendo a un cambio en el ángulo SPR, el cual puede monitorearse en tiempo real al detectar los cambios en la intensidad de la luz reflejada. Las tasas de cambio de la señal de SPR pueden analizarse para producir constantes de tasa aparentes para las fases de disociación y asociación de la reacción de unión. La proporción de estos valores da la constante de equilibrio aparente (afinidad) (véase, por ejemplo, Wolff eí al. , Cáncer Res. 53:2560-65 (1993)). Un anticuerpo de acuerdo a la presente ¡nvención puede pertenecer a cualquier clase de ¡nmunoglobulina, por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, o IgA. Puede obtenerse de o derivarse de un animal, por ejemplo, gallina (por ejemplo, pollo) y mamíferos, el cual incluye pero no se limita a un ratón, rata, hámster, conejo, u otro roedor, una vaca, caballo, oveja, cabra, camello, humano, u otro primate. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de inter-absorción. Los métodos bien conocidos en la materia pueden utilizarse para generar anticuerpos, antisuero proliclonal, o anticuerpos monoclonales que son específicos para una proteína de unión TGF-beta tal como SOST. Los anticuerpos también pueden producirse como inmunoglobulinas genéticamente elaboradas (Ig) o fragmentos Ig diseñados por tener propiedades deseables. Por ejemplo, a manera de ilustración y no limitación, los anticuerpos pueden incluir un IgG recombinante que es una proteína de fusión quimérica que tiene al menos un dominio de región variable (V) de una primer especie de mamífero y al menos un dominio de región constante de una segunda especie de mamífero distinta. Más comúnmente, un anticuerpo quimérico tiene secuencias de región variable murino y secuencias de región constante humana. Tal ¡nmunoglobulina quimérica murino/humana puede "humanizarse" al injertar las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) derivadas de un anticuerpo murino, las cuales confieren especificad de unión para un antígeno, en regiones de estructura de región V derivada de humano y regiones constantes derivadas de humano. Los fragmentos de estas moléculas pueden generarse por digestión proteolítica, u opcionalmente, por digestión proteolítica seguida por reducción media de enlaces de disulfuro y alquilación. Alternativamente, tales fragmentos pueden también generarse por técnicas de elaboración genética recombinante. Ciertos anticuerpos preferidos son aquellos anticuerpos que inhiben o bloquean una actividad de proteína de unión TGF-beta dentro de un ensayo in vitro, según se describe en la presente. Las propiedades de unión de un anticuerpo a una proteína de unión TGF-beta puede valorarse generalmente utilizando métodos de inmunodetección incluyendo, por ejemplo, un ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzima (ELISA), inmunoprecipitación, inmunomanchado, inmunoelectroforesis de contracorriente, radioinmunoensayos, ensayos de mancha de punto, ensayos de competencia o inhibición, y lo similar, los cuales pueden realizarse fácilmente por aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Patentes de EE. UU. No. 4,376, 1 1 0 y 4,486,530; Harlow eí al. , Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1 988)). Un inmunógeno puede comprenderse de células que expresan una proteína de unión TGF-beta tal como un polipéptido SOST, polipéptido SOST purificado o parcialmente purificado, o variantes o fragmentos (es decir, péptidos) de los mismos, o péptidos derivados de un polipéptido SOST. Tales péptidos pueden generarse por división proteolítica de un polipéptido más grande, mediante metodologías moleculares recombinantes, o pueden sintetizarse químicamente. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido SOST se proporcionan en la presente, de tal forma que aquellos expertos en la materia pueden preparar rutinariamente el polipéptido SOST para utilizarse como inmunógenos. Los péptidos pueden sintetizarse químicamente mediante métodos según se describen en la presente y se conocen en la materia. Alternativamente, los péptidos pueden generarse por división proteolítica de un polipéptido SOST, y péptidos individuales aislados mediante métodos conocidos en la materia tales como electroforesis de gel poliacrilamida o cualquier número de cromatografía líquida u otros medios de separación. Los péptidos útiles como inmunógenos típicamente pueden tener una secuencia de aminoácido de al menos 4 o 5 aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácido de polipéptido SOST tales como aquellos descritos en la presente, y preferentemente tienen al menos 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 14, 1 5, 16, 18, 19 o 20 aminoácidos consecutivos de un polipéptido SOST. Otros ciertos inmunógenos de péptido preferidos comprenden al menos 6 pero no más de 12 o más aminoácidos consecutivos de una secuencia de polipéptido SOST, y otros inmunógenos de péptido preferidos comprenden al menos 20 pero no más de 75 aminoácidos consecutivos, y otros inmunógenos de péptido preferidos comprenden al menos 21 pero no más de 50 aminoácidos consecutivos de un polipéptido SOST. Otros inmunógenos de péptido preferidos comprenden 21 -25, 26-30, 31 -35, 36-40, 41 -50, o cualquier número entero total de aminoácidos entre e incluyendo 21 o 100 aminoácidos consecutivos, y entre 100 y 1 90 aminoácidos consecutivos de una secuencia de polipéptido SOST. Los anticuerpos policlonales que se unen específicamente a un SOST pueden prepararse utilizando los métodos descritos en la presente y bien conocidos por aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Green eí al. , "Production of Polyclonal Antisera", en Immunochemical Protocols (Manson, ed.), páginas 1 -5 (Humana Press 1992); Harlow eí al. , Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1 988); Williams eí al. , "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover eí al. (eds.) página 15 (Oxford University Press 1995)). Los anticuerpos para una proteína de unión TGF-beta pueden obtenerse, por ejemplo, al inmunizar un animal con el producto de proteína de unión TGF-beta de un vector de expresión, o al inmunizar con una proteína de unión TGF-beta aislada o un fragmento de péptido del mismo, según se describe en la presente. A pesar de que los anticuerpos policlonales se aumentan típicamente en animales tales como ratas, ratones, conejos, cabras, ganado, u oveja, un anticuerpo de proteína de unión anti-TGF-beta de la presente invención también puede obtenerse de un primate sub-humano. Las técnicas generales para aumentar los anticuerpos diagnósticamente y terapéuticamente útiles en mandriles pueden encontrarse, por ejemplo, en WO 91 /1 1465 (1 991 ) y en Losman eí al. , Int. J. Cáncer 46:310, 1 990. La preparación de un inmunógeno para inyección en animales puede incluir acoplamiento covalente de la proteína de unión TGF-beta (o variante o fragmento del mismo), a otra proteína inmunogénica, por ejemplo, una proteína vehículo tal como una hemocianina de lapa principal (KLH) o albúmina de suero de bovino (BSA) o lo similar. Un inmunógeno de péptido o polipéptido puede incluir uno o más aminoácidos adicionales ya sea en el extremo N-terminal o C-terminal que facilitan el procedimiento de conjugación (por ejemplo, la adición de una cisteína para facilitar la conjugación de un péptido a KLH). Otros residuos de aminoácido dentro de un polipéptido o péptido pueden sustituirse para prevenir la conjugación en aquella posición de aminoácido particular a un polipéptido vehículo (por ejemplo, sustituir un residuo de serina por cisteína en posiciones internas de un polipéptido/péptido) o pueden sustituirse para facilitar la solubilidad o aumentar la inmunogenicidad.

El péptido de proteína de unión TGF-beta, polipéptido, o células que expresan la proteína de unión TGF-beta a utilizar como un inmunógeno puede emulsificarse en un adyuvante, por ejemplo, adyuvante incompleto o completo de Freund o el Sistema Adyuvante Ribi (Corixa Corporation Seattle, WA). Véase también, por ejemplo, Harlow eí al. , supra. El inmunógeno puede inyectarse en el animal por medio de cualquier número de vías diferentes, incluyendo intraperitonealmente, intramuscularmente, intraocularmente, intradérmicamente, o subcutáneamente. En general, después de la primera inyección, los animales reciben una o más inmunizaciones de refuerzo de acuerdo un horario preferido que puede variar de acuerdo a, entre otras cosas, el antígeno, el adyuvante (si lo hubiere), y/o la especie de animal particular. La respuesta inmune puede monitorearse al sangrar periódicamente el animal y preparar y analizar el suero en un inmunoensayo, tal como un ensayo de difusión Ouchterlony o ELISA, o lo similar, para determinar la concentración de anticuerpo específica. Una vez que se establece una concentración de anticuerpo adecuada, los animales pueden sangrarse periódicamente para acumular el antisuero policlonal o pueden desangrarse. Los anticuerpos policlonales que se unen específicamente a una proteína de unión TGF-beta o péptido pueden purificarse así de tal antisuero, por ejemplo, por cromatografía de afinidad utilizando la proteína A. Alternativamente, la cromatografía de afinidad puede realizarse en donde la proteína de unión TGF-beta o péptido o un anticuerpo específico para una región constante Ig de la especie de animal inmunizado particular se inmoviliza en un soporte sólido adecuado. Los anticuerpos para utilizarse en la invención incluyen anticuerpos monoclonales que se preparan por inmunización convencional y procedimientos de fusión celular según se describe en la presente y se conoce en la materia. Los anticuerpos de proteína de unión anti-TGF-beta monoclonales pueden generarse utilizando una variedad de técnicas. Los anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos específicos pueden obtenerse mediante métodos conocidos por aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Kohler eí al. , Nature 256:495, 1975; Coligan eí al. (eds.), Current Protocols in Inmunology, 1 :2.5 1 -2.6.7 (John Wiley & Sons 1 991 ); Patentes de EE. UU. Nos. RE 32, 01 1 , 4,902,614, 4,543,439 y 4,41 1 ,993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimensión in Biological Analices, Plenum Press, Kennett, McKearn, y Bechtol (eds.) (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1 988); Pickesley eí al. , "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. Coli", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover eí al. (Eds.) página 93 (Oxford University Press 1995)). Los fragmentos de anticuerpo pueden derivarse de los mismos utilizando cualquier técnica estándar adecuada tal como digestión proteolítica, u opcionalmente, por digestión proteolítica (por ejemplo, utilizando papaína o pepsina) seguida por reducción media de enlaces de disulfuro y alquilación. Alternativamente, tales fragmentos pueden también generarse por técnicas de elaboración genética recombinante. En resumen, los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse al inyectar un animal, por ejemplo, una rata, hámster, o preferentemente un ratón, con un inmunógeno que comprende un producto de gen de proteína de unión TGF-beta, o fragmento de péptido de la misma, de acuerdo a los métodos conocidos en la materia y descritos en la presente. La presencia de la producción de anticuerpo específica puede monitorearse después de la inyección inicial (las inyecciones pueden administrarse por cualquiera de las diversas vías según se describe en la presente para la generación de anticuerpos policlonales) y/o después de una inyección de refuerzo al obtener una muestra de suero y detectar la presencia de un anticuerpo que se une a una proteína de unión TGF-beta o péptido utilizando cualquiera de los diversos métodos de inmunodetección conocidos en la materia y descritos en la presente. De los animales que producen anticuerpos que se unen a la proteína de unión TGF-beta, las células linfoides, más comúnmente las células del nudo linfático o bazo, se remueven para obtener los B-linfocitos. Los B-linfocitos se fusionan así con una pareja de fusión de célula de mieloma sensibilizada por fármaco, preferentemente una que es singeneica con el animal inmunizado y que opcionalmente tiene otras propiedades deseables (por ejemplo, inhabilidad para expresar los productos de gen Ig endógenos, por ejemplo, P3X63-Ag 8.653 (ATCC No. CRL 1580); NSO, SP20) para producir hibridomas, las cuales son estirpes de célula eucarióticas inmortales. Las células linfoides (por ejemplo, bazo) y las células de mieloma pueden combinarse por unos pocos minutos con un agente promotor de fusión de membrana, tal como un polietilenglicol o un detergente no iónico, y después se laminan a una baja densidad en un medio selectivo que soporta el crecimiento de células de hibridoma pero no células de mieloma no fusionadas. Un medio de selección preferido es HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, usualmente aproximadamente una o dos semanas, se observan colonias de células. Las colonias únicas se aislan, y los anticuerpos producidos por las células pueden probarse para la actividad de unión a la proteína de unión TGF-beta, o variante o fragmento de la misma, utilizando cualquiera de una variedad de inmunoensayos conocidos en la materia y descritos en la presente. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales con alta afinidad y especificidad para SOST, se prefieren. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a una proteína de unión TGF-beta o variante o fragmento del mismo por lo tanto se contemplan por la presente ¡nvención. Los hibridomas se clonan (por ejemplo, por clonación de dilución limitada o por aislamiento de placa agar suave) y clones positivos que poseen un anticuerpo específico para el antígeno se seleccionan y se cultivan. Los anticuerpos que bloquean, inhiben, o deterioran la unión de la proteína de unión TGF-beta a un miembro de la familia de TGF-beta, se prefieren.

Los anticuerpos monoclonales de los cultivos de hibridoma pueden aislarse de los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma. Un método alternativo para la producción de un anticuerpo monoclonal murino es inyectar las células hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón singeneico, por ejemplo, un ratón que se ha tratado (por ejemplo, cebado con pristane) para promover la formación de fluido de ascitis que contiene el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse por una variedad de técnicas bien establecidas. Tales técnicas de aislamiento incluyen la cromatografía de afinidad con Proteína A Sefarosa, cromatografía de exclusión de tamaño, y cromatografía de intercambio de ion (véase, por ejemplo, Coligan en páginas 2.7.1 -2.7.12 y páginas 2.9.1 -2.9.3; Baines eí al. , "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-1 04 (The Humana Press, Inc. 1992)). Los anticuerpos monoclonales pueden purificarse por cromatografía de afinidad utilizando un ligante adecuado seleccionado en base a propiedades particulares del anticuerpo (por ejemplo, isotipo de cadena ligera o pesada, especificidad de unión, etc.). Los ejemplos de un ligante adecuado, inmovilizado en un soporte sólido, incluyen Proteína A, Proteína G, un anticuerpo de región anti-constante (cadena ligera o cadena pesada), un anticuerpo anti-idiotipo, y una proteína de unión TGF-beta, o fragmento o variante de los mismos. Además, un anticuerpo de proteína de unión anti-TGF-beta de la presente invención puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse por cualquier número de técnicas con las cuales aquellos expertos en la materia serán familiares. Tales métodos incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, transformación de células de sangre periférica humana de Virus Epstein Barr (EBV) (por ejemplo, conteniendo linfocitos B), inmunización in vitro de células B humanas, fusión de células de bazo de ratones transgénicos inmunizados que llevan genes de inmunoglobulina humana insertada, aislamiento de bibliotecas de fago de región V inmunoglobulina humana, u otros procedimientos según se conocen en la materia y se basan en la descripción en la presente. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos pueden obtenerse de ratones transgénicos que se han elaborado para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta al cambio antigénico. Los métodos para obtener anticuerpos humanos de ratones transgénicos se describen, por ejemplo, por Green eí al. , Nature Genet. 7: 13, 1994; Lonberg eí al. , Nature 368:336, 1994; Taylor eí al. , Int. Immun. 6:579, 1994; Patente de EE. UU. No. 5,877,397; Bruggemann eí al. , 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58; Jakobovits eí al. , 1995 Ann N. Y. Acad. Sci. 764:525-35. En esta técnica, los elementos del sitio de cadena pesada y ligera humana se introducen en cepas de ratón derivadas de estirpes de célula germinal embriónica que contienen rupturas objetivo de los sitios de cadena ligera y cadena pesada endógenas. (Véase también Bruggemann eí al. , Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997)). Por ejemplo, los transgenes de inmunoglobulina humana pueden ser construcciones de mini-gen, o trans-sitios en cromosomas artificiales de levadura, que superan el reajuste y la hipermutación de ADN específico de célula B en el tejido linfoide de ratón. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden obtenerse al inmunizar los ratones transgénicos, que pueden producir así los anticuerpos de humano específicos para el antígeno. Las células linfoides de los ratones transgénicos inmunizados pueden utilizarse para producir los hibridomas que secretan el anticuerpo humano de acuerdo a los métodos descritos en la presente. El suero policlonal que contiene los anticuerpos humanos también puede obtenerse de la sangre de los animales inmunizados. Otro método para generar los anticuerpos monoclonales específicos de proteína de unión TGF-beta humanos incluye inmortalizar las células de sangre periférica humanas por transformación EBV. Véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 4,464,456. Tal estirpe de célula B inmortalizada (o estirpe de célula linfoide) que produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a una proteína de unión TGF-beta (o una variante o fragmento de la misma) puede identificarse por métodos de inmunodetección según se proporciona en la presente, por ejemplo, una ELISA, y después aislarse por técnicas de clonación estándar. La estabilidad de la estirpe de célula linfoblastoide que produce un anticuerpo de proteína de unión anti-TGF-beta puede mejorarse al fusionar la estirpe de célula transformada con un mieloma murino para producir una estirpe de célula híbrida de ratón-humano de acuerdo a los métodos bien conocidos en la materia (véase, por ejemplo, Glasky eí al. , Hybridoma 8:377-89 (1989)). Todavía otro método para generar los anticuerpos monoclonales humanos es la inmunización in vitro, que incluye cebar las células B de bazo humanas con antígeno, seguida por fusión de células B primadas con una pareja de unión heterohíbrida. Véase, por ejemplo, Boerner eí al. , 1991 , J. Immunol. 147:86-95. En ciertas modalidades, una célula B que se encuentra produciendo un anticuerpo anti-SOST se selecciona y las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera se clonan de la célula B de acuerdo a las técnicas de biología molecular conocidas en la materia (WO 92/02551 ; Patente de EE. UU. No. 5,627,052; Babcook eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)) y descritas en la presente. Preferentemente, las células B de un animal inmunizado se aislan del bazo, nudo linfático, o muestra de sangre periférica al seleccionar una célula que se encuentra produciendo un anticuerpo que se une específicamente a SOST. Las células B pueden también aislarse de humanos, por ejemplo, de una muestra de sangre periférica. Los métodos para detectar las células B únicas que se encuentran produciendo un anticuerpo con la especificidad deseada se conocen bien en la materia, por ejemplo, por formación de placa, elección de célula activada por fluorescencia, estimulación in vitro seguida por detección de anticuerpo específico, y lo similar. Los métodos para la selección de células B que producen un anticuerpo específico incluyen, por ejemplo, preparar una suspensión de célula única de células B en ágar suave que contiene SOST o un fragmento de péptido del mismo. La unión del anticuerpo específico producido por la célula B al antígeno da como resultado la formación de un complejo, que puede ser visible como un inmunoprecipitado. Después de que las células B que producen el anticuerpo específico se selecciona, los genes de anticuerpo específicos pueden clonarse al aislar y amplificar el ADN o mARN de acuerdo a los métodos conocidos en la materia y descritos en la presente. Para usos particulares, los fragmentos de anticuerpos de proteína de unión anti-TGF-beta pueden desearse. Los fragmentos de anticuerpo, F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fe, Fd, retienen el sitio de unión de antígeno del anticuerpo completo y por lo tanto se unen al mismo epítopo. Estos fragmentos de unión de antígeno derivados de un anticuerpo pueden obtenerse, por ejemplo, por hidrólisis proteolítica del anticuerpo, por ejemplo, digestión de pepsina o papaína de anticuerpos completos de acuerdo a métodos convencionales. Como una ilustración, los fragmentos de anticuerpo pueden producirse por división enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S señalado F(ab')2. Este fragmento puede además dividirse utilizando un agente reductor tilo para producir fragmentos monovalentes 3.5S Fab'. Opcionalmente, la reacción de división puede realizarse utilizando un grupo bloqueador para los grupos sulfhidrilo que se dan como resultado de enlaces de disulfuro. Como una alternativa, una división enzimática que utiliza papaína produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fe directamente.

Estos métodos se describen, por ejemplo, por Goldenberg, Patente de EE. UU. No. 4,331 ,647, Nisonoff eí al. , Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73: 1 19, 1959; Edelman eí al. , en Methods in Enzymology 1 :422 (Academic Press 1 967); y por Coligan en páginas 2.8.1 -2.8.1 0 y 2.10.-2.10.4. Otros métodos para dividir anticuerpos, tal como separar las cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena de ligera-pesada monovalente (Fd), además división de fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas, o genéticas también pueden utilizarse, mientras que los fragmentos se unen al antígeno que se reconoce por el anticuerpo intacto. Un fragmento de anticuerpo también puede ser cualquier proteína sintética o genéticamente elaborada que actúa como un anticuerpo que se une a un antígeno específico para formar un complejo. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos aislados que consisten de la región variable de cadena ligera, fragmentos "Fv" que consisten de las regiones variables de las cadenas, ligera y pesada, moléculas de péptido de cadena única recombinante en las cuales las regiones variables pesadas y ligeras se conectan por un enlazador de péptido (proteínas scFv), y unidades de reconocimiento mínimo que consisten de los residuos de aminoácido que imitan la región hipervariable. El anticuerpo de la presente invención preferentemente comprende al menos un dominio de región variable. El dominio de región variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácido y generalmente comprenderá al menos una secuencia de aminoácido hipervariable responsable de la unión de antígeno y que se encuentra adyacente o en estructura con una o más estructuras. En términos generales, el dominio de región variable (V) puede ser cualquier ajuste adecuado de dominios variables de cadena ligera (VL) y/o pesada (VH) de inmunoglobulina. De esta manera, por ejemplo, el dominio de región V puede ser monomérico y puede ser un dominio VH o V , que es capaz de unir independientemente el antígeno con afinidad aceptable. Alternativamente, el dominio de región V puede ser dimérico y contener dímeros VH-VH, VH-VL, o VU-VL. Preferentemente, el dímero de región V comprende al menos VH y al menos una cadena V que se asocian de manera no covalente (de aquí en adelante referidas como F ). Si se desea, las cadenas pueden acoplarse covalentemente ya sea de manera directa, por ejemplo, por medio de un enlace de disulfuro entre los dominios variables, o a través de un enlazador, por ejemplo, un enlazador péptido, para formar una cadena única F (scFv). El dominio de región variable puede ser cualquier dominio variable que se presenta naturalmente o una versión elaborada del mismo. Por versión elaborada se entiende un dominio de región variable que se ha creado utilizando las técnicas de elaboración de ADN recombinantes. Tales versiones elaboradas incluyen aquellas creadas, por ejemplo, de una región variable de anticuerpo específico por inserciones, supresiones, o cambios en o a las secuencias de aminoácido del anticuerpo específico. Los ejemplos particulares incluyen dominios de región variable elaborados que contienen al menos un CDR y opcionalmente uno o más aminoácidos de estructura de un primer anticuerpo y el resto del dominio de región variable de un segundo anticuerpo. El dominio de región variable puede unirse de manera covalente a un aminoácido de C-terminal a al menos otro dominio de anticuerpo o un fragmento del mismo. De esta manera, por ejemplo, un dominio VH que se presenta en el dominio de región variable puede unirse a un dominio CH1 de inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. De igual forma, un dominio V puede unirse a un dominio C? o un fragmento del mismo. En este aspecto, por ejemplo, el anticuerpo puede ser un fragmento Fab en donde el dominio de unión de antígeno contiene un dominio VH y V asociado unido de manera covalente a su C-terminal a un dominio CH 1 y C? , respectivamente. El dominio CH1 puede extenderse con aminoácidos adicionales, por ejemplo, para proporcionar una región articulada o una parte de un dominio de región articulada según se encuentra en un fragmento Fab', o para proporcionar dominios adicionales, tales como dominios de anticuerpo CH2 y CH3. Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que se comprende para una región determinante de complementariedad única (CDR). Los péptidos CDR ("unidades de reconocimiento mínimo") pueden obtenerse al construir los polinucleótidos que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Tales polinucleótidos se preparan, por ejemplo, al utilizar la reacción en cadena de polimerasa para sintetizar la región variable que utiliza mARN de las células que producen anticuerpo tal como templado (véase, por ejemplo, Larrick eí al. , Methods: A Comparison to Methods in Enzymology 2: 106, 1991 ; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter eí al. (eds.) página 166 (Cambridge University Press 1995); y Ward eí al. , "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Birch eí al. , (eds.) página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1 995)). Alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo elaborado o recombinante obtenido mediante le uso de técnicas de ADN recombinante incluyendo la manipulación y re-expresión de las regiones constantes y/o variables del anticuerpo que codifica ADN. Tal ADN se conoce y/o se encuentra fácilmente disponible de las bibliotecas de ADN incluyendo por ejemplo bibliotecas de fago-anticuerpo (véase Chiswell y McCafferty, Tibtech. 10:80-84 (1992)) o si se desea puede sintetizarse. Los procedimientos de química y/o biología molecular estándar pueden utilizarse para secuenciar y manipular el ADN, por ejemplo, para introducir codones para crear residuos de cisteína, o para modificar, agregar o suprimir otros aminoácidos o dominios según se desee. Los anticuerpos quiméricos, específicos para una proteína de unión TGF-beta, y que incluyen anticuerpos humanizados, también pueden generarse de acuerdo a la presente invención. Un anticuerpo quimérico tiene al menos un dominio de región constante derivado de una primer especie de mamífero y al menos un dominio de región variable derivado de una segunda especie de mamífero directa (véase, por ejemplo, Morrison eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81 :6851 -55 (1984)). En las modalidades preferidas, un anticuerpo quimérico puede construirse al clonar la secuencia de polinucleótido que codifica al menos un dominio de región variable derivado de un anticuerpo monoclonal no humano, tal como la región variable derivada de un anticuerpo monoclonal de murino, rata, o hámster, en un vector que contiene una secuencia de nucleótido que codifica al menos una región constante humana (véase, por ejemplo, Shin eí al. , Methods Enzymol. 178:459-76 (1989); Wails eí al. , Nucleic Acids Res. 21 :2921 -29 (1 993)). A manera de ejemplo, la secuencia de polinucleótido que codifica la región variable de cadena ligera de un anticuerpo monoclonal de murino puede insertarse en un vector que contiene una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de región constante de cadena ligera kappa humana. En un vector separado, la secuencia de polinucleótido que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal puede clonarse en estructura con secuencias que codifican una región constante IgG humana, por ejemplo, la región constante lgG1 humana. La región constante humana particular seleccionada puede depender de las funciones de efector deseadas para el anticuerpo particular (por ejemplo, fijación de complemento, unión a un receptor Fe particular, etc.). Preferentemente, los vectores construidos se transfectaran en células eucarióticas para expresión estable del anticuerpo quimérico.

Otro método conocido en la materia para generar anticuerpos quiméricos es la recombinación homologa (por ejemplo, Patente de EE. UU. No. 5,482,856). Un anticuerpo quimérico no humano/humano puede además elaborarse genéticamente para crear un anticuerpo "humanizado". Tal anticuerpo humanizado puede comprender una pluralidad de CDRs derivadas de una inmunoglobulina de una especie de mamífero no humano, al menos una región de estructura variable humana, y al menos una región constante de inmunoglobulina humana. Las estrategias útiles para diseñar los anticuerpos humanizados pueden incluir, por ejemplo, a manera de ilustración y no limitación, la identificación de regiones de estructura variables humanas que son las más homologas a las regiones de estructura no humanas del anticuerpo quimérico. Sin desear someterse por teoría, tal estrategia puede aumentar la probabilidad de que el anticuerpo humanizado retendrá la afinidad de unión específica para una proteína de unión TGF-beta, la cual en algunas modalidades preferidas, puede sustancialmente ser la misma afinidad para una proteína de unión TGF-beta o variante o fragmento de la misma, y en otras ciertas modalidades preferidas puede ser una mayor afinidad para la proteína de unión de TGF-beta. Véase, por ejemplo, Jones eí al. , 1986 Nature 321 :522-25; Riechmann eí al. , 1988 Nature 332:323-27. El diseño de tal anticuerpo humanizado puede por lo tanto incluir determinar conformaciones de ciclo CDR y determinantes estructurales de las regiones variables no humanas, por ejemplo, por moldeo por computadora, y después comparar los ciclos CDR y determinantes a las estructuras y los determinantes de ciclo CDR humanas conocidas. Véase, por ejemplo, Padlan eí al. , 1995 FASEBQ: 1 33-39; Chothia eí al. , 1 989 Nature, 342:377-383. El moldeo de computadora puede también utilizarse para comparar los templados estructurales humanos seleccionados por homología de secuencia con las regiones variables no humanas. Véase, por ejemplo, Bajorath eí al. , 1995 Ther. Immunol. 2:95-103; EP-0578515-A3. Si la humanización de las CDRs no humanas da como resultado la reducción en la afinidad de unión, el moldeo por computadora puede ayudar en la identificación de residuos de aminoácido específicos que podrían cambiarse por técnicas dirigidas por sitio u otras mutagénesis para aumentar parcial, completa o supra-óptimamente (es decir, aumentar a un nivel mayor a aquel de un anticuerpo no humanizado) la afinidad de restauración. Aquellos que tienen experiencia en la materia son familiares con estas técnicas, y fácilmente apreciarán numerosas variaciones y modificaciones a tales estrategias de diseño. Tal método para preparar un anticuerpo humanizado se llama revestimiento. Según se utiliza en la presente, los términos "FRs revestidas" y "FRs recombinante revestidas" se refieren al reemplazo selectivo de los residuos FR de, por ejemplo, una región V de cadena ligera o pesada de roedor, con residuos FR humanos a fin de proporcionar una molécula xenogeneica que comprende un sitio de unión de antígeno que retiene sustancialmente toda la estructura de pliegue de polipéptido FR nativo. Las técnicas de revestimiento se basan en el entendimiento de que las características de unión de ligante de un sitio de unión de antígeno se determinan principalmente por la estructura y disposición relativa de los grupos CDR de cadena ligera y pesada dentro de la superficie de unión de antígeno. Davies eí al. , Ann. Rev. Biochem. 59:439-73, 1990. De esta manera, la especificidad de unión de antígeno puede conservarse en un anticuerpo humanizado solamente en donde las estructuras CDR, su interacción entre sí, y su interacción con el resto de los dominios de región V, se mantienen cuidadosamente. Al utilizar las técnicas de revestimiento, los residuos FR externos (por ejemplo, accesibles por solvente) que se encuentran fácilmente por el sistema inmune se reemplazan selectivamente con residuos humanos para proporcionar una molécula híbrida que comprende ya sea una superficie revestida débilmente inmunogénica, o sustancialmente no inmunogénica. El proceso de revestimiento hace uso de los datos de secuencia disponible para dominios variables de anticuerpo humano compilados por Kabat eí al. , Sequences of Proteins of Inmunological Interest, 4th ed. , (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1987), actualizaciones a la base de datos Kabat, y otras bases de datos extranjeras y EE. UU . accesibles (tanto de proteína como ácido nucleico). Las accesabilidades de solvente de los aminoácidos de región V pueden deducirse de la estructura tridimensional conocida para los fragmentos de anticuerpo murino y humano. Inicialmente, las FRs de los dominios variables de una molécula de anticuerpo de interés se comparan con las secuencias de FR correspondientes de dominios variables humanas obtenidos de las fuentes anteriormente mencionadas. Las regiones V humanas más homologas se comparan así residuo por residuo a los aminoácidos de murino correspondientes. Los residuos en la FR de murino que difieren de la contraparte humana se reemplazan por los residuos presentes en la porción humana utilizando las técnicas recombinantes bien conocidas en la materia. El cambio de residuo solamente se lleva a cabo con porciones que se exponen al menos parcialmente (accesibles por solvente), y se ejerce cuidado en el reemplazo de residuos de aminoácido que pueden tener un efecto importante en la estructura terciaria de los dominios de región V, tales como prolina, glicina, y aminoácidos cargados. En esta manera, los sitios de unión de antígeno "revestidos" resultantes se diseñan de esta manera para retener los residuos de CDR de roedor, los residuos sustancialmente adyacentes a las CDRs, los residuos identificados como enmascarados o mayormente enmascarados (inaccesibles por solvente), se cree que los residuos participan en contactos no covalentes (por ejemplo, electrostáticos e hidrofóbicos) entre dominios de cadena ligera y pesada, y los residuos de las regiones estructurales conservadas de las FRs que se cree que incluyen en las estructuras terciarias "canónicas" de los ciclos CDR. Estos criterios de diseño se utilizan así para preparar secuencias de nucleótido recombinantes que combinan las CDRs tanto de cadena ligera como pesada de un sitio de antígeno de unión en FRs que aparecen en humanos que pueden utilizarse para transfectar las células de mamífero para la expresión de anticuerpos humanos recombinantes que muestran la especificidad de antígeno de la molécula de anticuerpo de roedor. Un método adicional para seleccionar anticuerpos que se unen específicamente a una proteína de unión TGF-beta o variante o fragmento de la misma es mediante despliegue de fago. Véase, por ejemplo, Winter eí al. , 1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55; Burton eí al. , 1994 Adv. Immunol. 57:191-280. Las bibliotecas de combinación de la región variable de inmunoglobulina murino o humana pueden crearse en vectores de fago que pueden seleccionarse para elegir fragmentos Ig (Fab, Fv, sFv, o multímeros de los mismos) que se unen específicamente a proteína de unión TGF-beta o variante o fragmento del mismo. Véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 5,223,409; Huse eí al. , 1989 Science 246: 1275-81 ; Sastry eí al. , Proc Nati. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989); Alting-Mees eí al. , Strategies in Molecular Biology 3: 1 -9 (1990); Kang eí a/. , 1991 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:4363-66; Hoogenboom eí al. , 1992 J. Molec. Biol. 227:381 -388; Schlebusch eí al. , 1997 Hybridoma 16:47-52 y referencias citadas en la presente. Por ejemplo, una biblioteca que contiene una pluralidad de secuencia de polinucleótido que codifica fragmentos de región variable Ig pueden insertarse en el genoma de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o una variante del mismo, en estructura con la secuencia que codifica una proteína de cabra fago. Una proteína de fusión puede ser una fusión de la proteína con el dominio de región variable de cadena ligera y/o con el dominio de región variable de cadena pesada. De acuerdo a ciertas modalidades, los fragmentos Fab de inmunoglobulina también pueden desplegarse en una partícula de fago (véase, por ejemplo, Patentes de EE.UU. Nos. 5,698,426). Las bibliotecas de expresión de cADN de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada también pueden prepararse en fago lambda, por ejemplo, utilizando vectores ?lmmunoZap™ (H) y ?lmmunoZap™ (L) (Stratagene, La Jolla, Cailfornia). En resumen, el mARN se aisla de una población de célula B, y se utiliza para crear las bibliotecas de expresión de cADN de ¡nmunoglobulina de cadena ligera y pesada en los vectores ?lmmunoZap (H) y ?lmmunoZap(L). Estos vectores pueden seleccionarse individualmente o co-expresarse para formar fragmentos Fab o anticuerpos (véase Huse eí al. , supra; véase también Sastry eí al. , supra). Las placas positivas pueden convertirse subsecuentemente en un plásmido no lítico que permite la expresión de alto nivel de fragmentos de anticuerpo monoclonal de £. coli. De igual forma, las partes o fragmentos, tales como fragmentos Fab y Fv, de anticuerpos también pueden construirse utilizando técnicas de digestión enzimática convencional o ADN recombinante para incorporar las regiones variables de un gen que codifica un anticuerpo específico para una proteína de unión TGF-beta. Dentro de una modalidad, en el hibridoma las regiones variables de un gen que expresa un anticuerpo monoclonal de interés se amplifican utilizando cebadores de nucleótido. Estos cebadores pueden sintetizarse por un experto en la materia, o pueden adquirirse de fuentes comercialmente disponibles. (Véase, por ejemplo, Stratagene (La Jolla, California), el cual vende cebadores para regiones variables humanas y de ratón que incluyen, entre otros, los cebadores para regiones VHa, VHb, VHc, VHd, CH? , VL y CL). Estos cebadores pueden utilizarse para amplificar regiones variables de cadena ligera o pesada, que pueden insertarse así en vectores tales como ImmunoZAP™ H o ImmunoZAP™ L (Stratagene), respectivamente. Estos vectores pueden introducirse así en levadura £. coli, o sistemas basados en mamífero para expresión. Grandes cantidades de una proteína de cadena única que contienen una fusión de los dominios VH y V pueden producirse utilizando estos métodos (véase Bird eí al. , Science 242:423-426, 1 988). Además, tales técnicas pueden utilizarse para humanizar una región V de anticuerpo no humano sin alterar la especificidad de unión del anticuerpo. En ciertas modalidades particulares de la invención, las bibliotecas de combinación de fago también pueden utilizarse para humanización de regiones variables no humanas. Véase, por ejemplo, Rosok eí al. , 1996 J. Biol. Chem. 277:2261 1 -18; Rader eí al. , 1998 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:8910-15. Una biblioteca de fago puede seleccionarse para elegir un fragmento de región variable Ig de interés mediante métodos de inmunodetección conocidos en la materia y descritos en la presente, y la secuencia de ADN del gen de inmunoglobulina insertada en el fago así seleccionada puede determinarse mediante técnicas estándares. Véase, Sambrook eí al. , 2001 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. La secuencia que codifica Ig seleccionada puede clonarse así en otro vector adecuado para expresión del fragmento Ig u, opcionalmente, puede clonarse en un vector que contiene regiones constantes Ig, para expresión de cadenas de inmunoglobulina completas. En ciertas otras modalidades, la invención contempla anticuerpos específicos de SOST que son fragmentos de anticuerpo multimérico. Las metodologías útiles se describen generalmente, por ejemplo, en Hayden eí al. , 1997, Curr Opin. Immunol. 9:201 -12; Coloma eí al. , 1 997 Nat. Biotechnol. 15: 159-63. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo multimérico pueden crearse mediante técnicas de fago para formar mini-anticuerpos (Patenté de EE.UU. No. 5,910,573) o diacuerpos (Holliger, eí al. , 1 997, Cáncer Immunol. Immunother. 45: 128-130). En ciertas modalidades de la invención, un anticuerpo específico para SOST puede ser un anticuerpo que se expresa como una proteína intracelular. Tales anticuerpos intracelulares también se refieren como intra-cuerpos y pueden comprender un fragmento Fab, o preferentemente comprender un fragmento scFv (véase, por ejemplo, Lecerf eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98:4764-49 (2001 ). Las regiones de estructura que flanquean las regiones CDR pueden modificarse para mejorar los niveles de expresión y solubilidad de un intracuerpo en un ambiente reductor intracelular (véase, por ejemplo, Worn eí al. , J. Biol. Chem. 275:2795-803 (2000). Un intracuerpo puede dirigirse a una ubicación celular particular u organelo, por ejemplo, al construir un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica las regiones variables de un intracuerpo que puede fusionarse operativamente a una secuencia de polinucleótido que codifica un antígeno objetivo particular dentro de la célula (Véase, por ejemplo, Graus-Porta eí al. , Mol. Cell. Biol. 15: 1 182-91 (1995); Lener eí al. , Eur. J. Biochem. 267: 1 196-205 (2000)). Un intracuerpo puede introducirse en una célula por una variedad de técnicas disponibles para el experto en la materia incluyéndose por medio de un vector de terapia de gen, o una mezcla lípida (por ejemplo, Provectin™ elaborado por Imgenex Corporation, San Diego, CA), o de acuerdo a métodos de internalización fotoquímica. La introducción de mutaciones de aminoácido en una molécula de inmunoglobulina específica par una proteína de unión TGF-beta puede ser útil para aumentar la especificidad o afinidad para la proteína de unión TGF-beta o para alterar una función de efector. Las inmunoglobulinas con afinidad más alta para la proteína de unión TGF-beta pueden generarse por mutagénesis dirigida por sitio de residuos particulares. El moldeo molecular tridimensional asistido por computadora puede emplearse para identificar los residuos de aminoácido a cambiar, a fin de mejorar la afinidad para la proteína de unión TGF-beta. Véase, por ejemplo, Mountain eí al. , 1 992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 1 0: 1 -142. Alternativamente, las bibliotecas de combinación de CDRs pueden generarse en fago M13 y seleccionarse para fragmentos de inmunoglobulina con afinidad mejorada. Véase, por ejemplo, Glaser eí al. , 1992, J. Immunol. 149:3903-3913; Barbas eí al. , 1994 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :3809-13; Patente de EE. UU. No. 5,792,456. Las funciones de efector también pueden alterarse por mutagénesis dirigida por sitio. Véase, por ejemplo, Duncan eí al. , 1988 Nature 332:563-64; Morgan eí al. , 1995 Immunology 86:319-24; Eghtedarzedeh-Kondri eí al. , 1997 Biotechniques 23:830-34. Por ejemplo, la mutación del sitio de glicosilación en la parte Fe de la inmunoglobulina puede alterar la habilidad de la inmunoglobulina para fijar el complemento. Véase, por ejemplo, Wright eí al. , 1 997 Trends Biotechnol. 15:26-32. Otras mutaciones en los dominios de región constante pueden alterar la habilidad de la inmunoglobulina para fijar el complemento, o para efectuar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. Véase, por ejemplo, Duncan eí al. , 1988, Nature 332:563-64; Morgan eí al. , 1995 Immunology 86:319-24; Sensel eí al. , 1997 Mol. Immunol. 34: 1 019-29. De acuerdo a ciertas modalidades, las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada humanizadas, humanas, o no humanas de cualquiera de las moléculas Ig descritas en la presente pueden construirse como fragmentos de polipéptido Fv (scFv) de cadena única (anticuerpos de cadena única). Véase, por ejemplo, Bird eí al. , 1988 Science 242:423-426; Huston eí al. , 1988 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883. Las proteínas de fusión scFv multi- funcionales pueden generarse al enlazar una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido scFv en estructura con al menos una secuencia de polinucleótido que codifica cualquiera de una variedad de proteínas efectoras conocidas. Estos métodos se conocen en la materia, y se describen, por ejemplo, en EP-B1 -0318554, Patente de EE. UU. No. 5, 132,405, Patente de EE. UU. No. 5,091 ,51 3 y Patente de EE.UU. No. 5,476,786. A manera de ejemplo, las proteínas efectoras pueden incluir secuencias de región constante de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Hollenbaugh eí al. , 1995 J. Immunol. Methods 188: 1 -7. Otros ejemplos de proteínas efectoras son enzimas. Como un ejemplo no limitante, tal enzima puede proporcionar una actividad biológica para propósitos terapéuticos (véase, por ejemplo, Siemers eí al. , 1997 Bioconjug. Chem. 8:510-19) o puede proporcionar una actividad detectable, tal como una conversión catalizada por peroxidasa de rábano picante de cualquiera de un número de sustratos bien conocidos en un producto detectable, para usos de diagnóstico. Todavía otros ejemplos de proteínas de fusión scFv incluyen fusiones de toxina Ig, o inmunotoxinas, en donde el polipéptido scFv se enlaza a una toxina. La scFv o cualquier fragmento de anticuerpo descrito en la presente puede, en ciertas modalidades, fusionarse a dominios de péptido o polipéptido que permite la detección de unión específica entre la proteína de fusión y antígeno (por ejemplo, una proteína de unión TGF-beta). Por ejemplo, el dominio de polipéptido de fusión puede ser un polipéptido tag de afinidad para detectar la unión de la proteína de fusión scFv a una proteína de unión TGF-beta mediante cualquiera de una variedad de técnicas con las cuales aquellos expertos en la materia serán familiares/ Los ejemplos de un péptido tag, incluyen avidina, estreptavidina o His (por ejemplo, polihistidina). Las técnicas de detección también pueden incluir, por ejemplo, unión de una proteína de fusión de avidina o estraptividina a biotina o secuencia mimética de biotina (véase, por ejemplo, Luo eí al. , 1 998, J. Biotechnol. 65:225 y referencias citadas en la presente), modificación covalente directa de una proteína de fusión con una porción detectable (por ejemplo, una porción de etiquetado), unión no covalente de la proteína de fusión a una molécula reportera etiquetada específica, modificación enzimática de un sustrato detectable mediante una proteína de fusión que incluye una parte que tiene actividad de enzima, o inmovilización (covalente o no covalente) de la proteína de fusión en un soporte de fase sólida. Otros polipéptidos de afinidad útiles para la construcción de proteínas de fusión scFv pueden incluir las proteínas de fusión de estreptavidina, según se describe, por ejemplo, en WO 89/03422, EE. UU. 5,489,528, EE.UU. 5,672,691 , WO 93/24631 , EE. UU. 5, 168,049, EE. UU. 5,272,254; proteínas de fusión de avidina (véase, por ejemplo, EP 51 1 ,747); una enzima tal como S-transferasa de glutationa; y polipéptido de proteína A Staphylococcus aureus. Los polinucleótidos que codifican un anticuerpo o fragmento del mismo que unen específicamente una proteína de unión TGF-beta, según se describe en la presente, pueden propagarse y expresarse de acuerdo a cualquiera de una variedad de procedimientos bien conocidos para excisión, ligación, transformación, y transfección de ácido nucleico utilizando cualquier número de vectores de expresión conocidos. De esta manera, en ciertas modalidades la expresión de un fragmento de anticuerpo puede preferirse en un huésped procariótico, tal como Escherichia coli (véase, por ejemplo, Plucktun eí al. , 1989 Methods Enzymol. 178:497-515). En otras ciertas modalidades, la expresión del anticuerpo o un fragmento del mismo puede preferirse en una célula huésped eucariótica, incluyendo levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, y Pichia pastoris), células de animal (incluyendo células de mamífero) o células de planta. Los ejemplos de células de animal adecuados incluyen, pero no se limitan a, mieloma (tal como una estirpe NSO de ratón), COS, CHO, o células hibridoma. Los ejemplos de células de planta incluyen células de tabaco, maíz, soya, y arroz. Uno o más vectores de expresión replicable que contienen ADN que codifica una región constante y/o variable pueden prepararse y utilizarse para transformar una estirpe de célula adecuada, por ejemplo, una estirpe de célula de mieloma no productora, tal como una estirpe NSO de ratón o una bacteria, tal como £. coli, en la cual la producción del anticuerpo se presentará. A fin de obtener la transcripción eficiente y traducción, la secuencia de ADN en cada vector podría incluir secuencias reguladoras adecuadas, particularmente una secuencia líder y promotor operativamente unida a la secuencia de dominio variable. Los métodos particulares para producir anticuerpos en este aspecto generalmente se conocen bien y se utilizan rutinariamente. Por ejemplo, los procedimientos de biología molecular se describen por Maniatis eí al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1 989; véase también Maniatis eí al. , 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (2001 )). La secuencia de ADN puede realizarse según se describe en Sanger eí al. (PNAS 74:5463, (1977)) y el manual de secuencialización pie International Amersham, y mutagenesis dirigida por sitio puede llevarse a cabo de acuerdo a métodos conocidos en la materia (Kramer eí al. , Nucleic Acids Res. 12:9441 , (1 984); Kunkel Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985); Kunkel eí al. , Methods in Enzymol 154:367-82 (1 987); the Anglian Biotechnology Ltd Handbook). Adicionalmente, las publicaciones numerosas describen técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos por manipulación de ADN, creación de vectores de expresión, y transformación de células adecuadas (Mountain A and Adair, J R in Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Chapter I , 1992, Intercept, Andover, UK); Especificación de Patente Internacional No. WO 91 /09967). En ciertas modalidades, el anticuerpo de acuerdo a la invención puede tener una o más moléculas reporteras o efectoras unidas al mismo. Una molécula reportera puede ser una porción o etiqueta detectable tal como una enzima, agente citotóxico u otra molécula reportera, incluyendo un tinte, radionúclido, grupo luminescente, grupo fluorescente, o biotina, o lo similar. La inmunoglobulina específica de proteína de unión TGF-beta o fragmento de la misma puede radiomarcarse para aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico. Las técnicas para radiomarcado de anticuerpos se conocen en la materia. Véase, por ejemplo, Adams 1998 In Vivo 12: 1 1 -21 ; Hiltunen 1993 Acta Oncol. 32:831 -9). Las aplicaciones terapéuticas se describen a mayor detalle abajo y pueden incluir el uso del anticuerpo específico de proteína de unión TGF-beta (o fragmento del mismo) junto con otros agentes terapéuticos. Las moléculas reporteras o efectoras pueden unirse al anticuerpo a través de cualquier cadena lateral de aminoácido disponible, aminoácido terminal, o grupo funcional de carbohidrato ubicado en el anticuerpo, con la condición de que la unión o proceso de unión no afecte adversamente las propiedades de unión de tal forma que la utilidad de la molécula se abroga. Los grupos funcionales particulares incluyen, por ejemplo, cualquier grupo amino libre, imino, tilo, hidróxilo, carboxilo, o aldehido. La unión del anticuerpo y la (s) molécula (s) reportera (s) y/o efectora (s) puede (n) lograrse por medio de tales grupos y un grupo funcional adecuado en la molécula reportera o efectora. El enlace puede ser directa o indirecta a través de grupos de puenteo o separación. Las moléculas efectoras incluyen, por ejemplo, agentes anti-neoplásticos, toxinas (tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano (tal como exotoxina A Pseudomonas aeruginosa) o planta y fragmentos de los mismos (por ejemplo, ricina y fragmentos de la misma, planta gelonina, briodina de Bryonia dioica, o lo similar. Véase, por ejemplo, Thrush eí al. , 1 996 Annu. Rev. Immunol. 74:49-71 ; Frankel et al. , 1 996 Cáncer Res. 56:926-32). Las moléculas efectoras adicionales incluyen proteínas biológicamente activas (por ejemplo, enzimas), ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, polímeros sintéticos y que se presentan naturalmente, por ejemplo, polisacáridos y polímeros de polialquileno tales como poli(etilénglicol) y derivados de los mismos, radionúclidos, particularmente radioyoduro, y metales quelados. Los grupos reporteros adecuados incluyen metales quelados, compuestos fluorescentes o compuestos que pueden detectarse por espectroscopia ESR o NMR. Los grupos efectores particularmente útiles son calicaemicina y derivados de la misma (véase, por ejemplo, Especificaciones de Patente Sudafricana Nos. 85/8794, 88/8127 y 90/2839). Otras numerosas toxinas, incluyendo agentes quimioterapéuticos, agentes anti-mitóticos, antibióticos, inductores de apoptosis (o "apoptógenos", véase, por ejemplo, Green and Reed, 1 998, Science 287: 1309-1312) o lo similar, se conocen por aquellos expertos en la materia, y los ejemplos proporcionados en la presente se pretende que sean ilustrativos sin limitar el alcance y espíritu de la invención. Los agentes antineoplásticos particulares incluyen agentes citostáticos y citotóxicos, por ejemplo, agentes de alquilación, tales como iperitas nitrogenadas (por ejemplo, clorambucil, melfalan, mecloretamina, ciclofosfamida, o iparita uracil) y derivados de las mismas, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, busulfan, o cisplatin; antimetabolitos, tales como metotrexato, fluorouracil, floxuridina, citarabina, mercaptopurina, tioguanina, ácido fluoroacético o ácido fluorocítrico, antibióticos, tales como bleomicinas (por ejemplo, sulfato bleomicin), doxorubicin, daunorubicin, mitomicinas (por ejemplo, mitomicin C), actinomicinas (por ejemplo, dactinomicina) , plicamicina, calicaemicina y derivados de las mismas, o esperamicina y derivados de la misma; inhibidores mitóticos, tales como etoposide, vincristine o vinblastine y derivados de los mismos; alcaloides, tales como elipticina; polioles tales como taxicin-l o taxicin-ll; hormonas, tales como andrógenos (por ejemplo, dromostanolona o testolactona), progestinas (por ejemplo, acetato megestrol o acetato medroxiprogesterona), estrógenos (por ejemplo, difosfato dimetilstilbestrol, fosfato poliestradiol o fosfato estramustina) o antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifen); antraquinonas, tales como mitoxantrona, ureas, tales como hidroxiurea; hidracinas, tales como procarbazina; o imidazoles, tales como dacarbazina. Los metales quelados útiles como moléculas efectoras incluyen quelatos de metales di-o tripositivos que tienen un número de coordinación de 2 a 8 inclusive. Los ejemplos particulares de tales metales incluyen tecnecio (Tc), renio (Re), cobalto (Co), cobre (Cu), oro (Au), plata (Ag), plomo (Pb), bismuto (Bi), indio (In), galio (Ga), itrio (Y), terbio (Tb), gadolinio (Gd), y escandio (Se). En general, el metal es preferentemente un radionúclido. Los radionúclidos particulares incluyen 99mTc, 186Re, 188Re, 58Co, 60Co, 67Cu, 195Au, 199Au, 110Ag, 203Pb, 206Bi, 207Bi, 111ln, 67Ga, 68Ga, 88Y, 90Y, 160Tb, 153Gd, y 47Sc. El metal quelado puede ser por ejemplo uno de los tipos anteriores de metal quelado con cualquier agente quelante polidentado adecuado, por ejemplo, poliaminas acíclicas o cíclicas, poliéteres, (por ejemplo, éteres coronados y derivados de los mismos), poliamidas; porfrinas; y derivados carbocíclicos. En general, el tipo de agente quelante dependerá del metal en uso. Un grupo particularmente útil de agentes quelantes en conjugados de acuerdo a la invención, sin embargo, comprende poliaminas cíclicas y acíclicas, especialmente ácidos poliaminocarboxílicos, por ejemplo, ácido dietilenotriaminapentaacético y derivados del mismo, y aminas macrocíclicas, por ejemplo, derivados tetra-aza y tri-aza cíclica (por ejemplo, según se describe en Especificación de Patente Internacional No. WO 92/22583); y poliamidas, especialmente desferrioxamina y derivados de la misma. Cuando un grupo tilo en el anticuerpo se utiliza como el punto de unión, la molécula efectora puede unirse de acuerdo a una reacción que se presenta con un grupo reactivo tiol presente en la molécula reportera o efectora. Los ejemplos de tales grupos incluyen un ácido á-halocarboxílico o éster, tal como yodoacetamida, una imida, tal como maleimida, una sulfona vinilo, o un disulfuro. Estos y otros procedimientos de enlace adecuados se describen generalmente y más particularmente en Especificaciones de Patente Internacional Nos. WO 93/06231 , WO 92/22583, WO 90/091 195, y WO 89/01476.

La invención también contempla la generación de anticuerpos anti-idiotipo que reconocen un anticuerpo (o fragmento de unión de antígeno del mismo) que se une específicamente a un polipéptido SOST según se proporciona en la presente, o una variante o fragmento del mismo. Los anticuerpos anti-idiotipo pueden generarse como anticuerpos policlonales o como anticuerpos monoclonales mediante los métodos descritos en la presente utilizando un anticuerpo de proteína de unión anti-TGF-beta (o fragmento de unión de antígeno del mismo) como inmunógeno. Los anticuerpos anti-idiotipo o fragmentos de los mismos también pueden generarse por cualquiera de los métodos de elaboración genética recombinante anteriormente descritos, o por selección de despliegue de fago. Un anticuerpo anti-idiotipo puede reaccionar con el sitio de unión de antígeno del anticuerpo anti-SOST de tal forma que la unión del anticuerpo a un polipéptido SOST se inhibe competitivamente. Alternativamente, un anticuerpo anti-idiotipo según se proporciona en la presente puede no inhibir competitivamente la unión de un anticuerpo de proteína de unión anti-TGF-beta a una proteína de unión TGF-beta. En ciertas modalidades de la invención, un anticuerpo que se une específicamente a SOST puede utilizarse para detectar la expresión del polipéptido SOST. En ciertas modalidades particulares, un anticuerpo o un panel de anticuerpos puede exponerse a células que expresan un polipéptido SOST y expresión del polipéptido SOST puede determinarse por detección utilizando otro anticuerpo específico SOST que se une a un epítopo diferente al anticuerpo o anticuerpos primero utilizados en el ensayo.

ENSAYOS PARA SELECCIONAR AGENTES QUE AUMENTAN LA DENSIDAD ÓSEA Según se describe anteriormente, la presente invención proporciona métodos para seleccionar y/o aislar agentes que son capaces de aumentar la densidad ósea. En ciertas modalidades preferidas, el agente es un anticuerpo que se une específicamente a SOST (una proteína de unión TGF-beta) o una variante o un fragmento del mismo. Por ejemplo, dentro de una modalidad de la presente invención, los métodos se proporcionan para determinar si un agente es capaz de aumentar el contenido mineral óseo, comprendiendo las etapas de (a) contactar o mezclar un agente candidato con una proteína de unión TGF-beta y un miembro de la familia TGF-beta de proteínas y (b) determinar si el agente candidato estimula la señalización por la familia de proteínas TGF-beta, o deteriora o inhibe la unión de la proteína de unión TGF-beta a uno o más miembros de la familia de proteínas TGF-beta. Dentro de ciertas modalidades, el agente mejora la habilidad de TGF-beta para funcionar como un regulador positivo de diferencia de célula mesénquima. En una modalidad preferida de la invención, se proporciona un método para identificar un anticuerpo que modula una trayectoria de señalización TGF-beta que comprende contactar un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST con un péptido SOST, incluyendo pero no limitándose a los péptidos descritos en la presente, bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir la formación de un anticuerpo más (+) complejo SOST (anticuerpo/SOST) y después detectar el nivel (por ejemplo, cuantificar la cantidad) del complejo de SOST/anticuerpo para determinar la presencia de un anticuerpo que modula la trayectoria de señalización TGF-beta. El método puede realizarse utilizando SPR o cualquier número de diferentes inmunoensayos conocidos en la materia y descritos en la presente, incluyendo una ELISA, inmunomancha, o lo similar. Una trayectoria de señalización TGF-beta incluye una trayectoria de señalización mediante la cual una BMP se une a un receptor Tipo I y Tipo I I en una célula para estimular o inducir la trayectoria que modula el contenido mineral óseo. En ciertas modalidades preferidas de la invención, un anticuerpo que se une específicamente a SOST estimula o mejora la trayectoria para aumentar el contenido mineral óseo. Tal anticuerpo puede identificarse utilizando los métodos descritos en la presente para detectar la unión de un anticuerpo a péptidos específicos SOST. Los métodos de invención objeto también pueden utilizarse para identificar los anticuerpos que deterioran, inhiben (incluyendo inhiben competitivamente) o previenen la unión de una BMP a un polipéptido SOST al detectar si un anticuerpo se une a péptidos SOST que se ubican en las regiones o partes de regiones en SOST a las cuales se une BMP, tales como péptidos en el extremo de terminal amino de SOST y péptidos que incluyen residuos de aminoácido de terminal amino y una parte de la región de núcleo (núcleo de atraque) de SOST (por ejemplo, SEQ I D NOs: 2-1 9, 21 -28, y 47-50). Los métodos de la presente invención también pueden utilizarse para identificar un anticuerpo que deteriora, previene, o inhibe la formación de homodímeros SOST. Tal anticuerpo que se une específicamente a SOST puede identificarse al detectar la unión del anticuerpo a péptidos que se derivan del núcleo o la región de terminal carboxi de SOST (por ejemplo, SEQ I D NOs: 29-46 y 51 -54). Dentro de otras modalidades de la invención, los métodos se proporcionan para determinar si un agente es capaz de aumentar el contenido mineral óseo, comprendiendo las etapas de (a) contactar un agente candidato a las células que expresan una proteína de unión TGF-beta y (b) determinar si la expresión de la proteína de unión TGF-beta en las células expuestas se reduce o si una actividad de la proteína de unión TGF-beta se reduce, y de tal modo determinar si el compuesto es capaz de aumentar el contenido mineral óseo. Dentro de una modalidad, las células pueden incluir el hueso humano normal espontáneamente transformado o no transformado de biopsias óseas u osteoblastos de hueso parietal de rata. Los inmunoensayos pueden utilizarse para detectar y cuantificar la expresión de una proteína de unión TGF-beta e incluyen, por ejemplo, Inmuno-Electroforessis Contracorriente (CIEP), radioinmunoensayos, radioinmunoprecipitaciones, Ensayos Inmuno-Absorbentes Enlazados por Enzima (ELISA), ensayos inmunomanha como ensayos de mancha punto y Westerns blots, ensayos de inhibición o competencia, y ensayos intercalados (véase, Patentes de EE.UU. Nos. 4,376, 1 10 y 4,486,530; véase también Antibodies: A Laboratory Manual, supra). Tales inmunoensayos pueden utilizar un anticuerpo que es específico para una proteína de unión TGF-beta tal como los anticuerpos anti-esclerotina descritos en la presente, o pueden utilizar un anticuerpo que es específico para una molécula reportera que se une a la proteína de unión TGF-beta. El nivel de expresión de polipéptido también puede determinarse al cuantificar la cantidad de proteína de unión TGF-beta que se une a un ligante de proteína de unión TGF-beta. A manera de ejemplo, la unión de esclerostina en una muestra a una BMP puede detectarse por resonancia de plasmón de superficie. Alternativamente, el nivel de expresión de mARN que codifica la proteína de unión TGF-beta específica puede cuantificarse. En otras modalidades, un anticuerpo específico para SOST puede utilizarse en un método, tal como un ensayo de competencia, en el cual los agentes candidato se seleccionan para identificar un agente que competirá con el anticuerpo para unirse a la proteína de unión TGF. La interacción entre un anticuerpo y una proteína de unión TGF-beta puede determinarse utilizando métodos de inmunoensayo conocidos en la materia y descritos en la presente. A manera de ejemplo, un miembro de familia de la súper familia de TGF-beta, tal como una proteína de unión TGF-beta o un miembro de súper familia de TGF-btea que es un ligante de proteína de unión TGF-beta, se une primero a una fase sólida, seguida por adición de un agente candidato. Un ligante del miembro de súper familia de TGF-beta que se une a la fase sólida se agrega concurrentemente o se agrega en una etapa subsecuente, la fase sólida se lava, y la cantidad de ligante que se une al miembro de familia se determina, lo cual indica si el agente candidato bloquea la unión del ligante al miembro de TGF-beta. Alternativamente, el ligante del miembro de súper familia TGF-beta puede unirse a la fase sólida, y el miembro de súper familia TGF-beta puede agregarse concurrentemente o subsecuentemente a la adición de la molécula candidato. La cantidad de ligante que se une al miembro de súper familia TGF-beta puede determinarse al marcar el ligante con una molécula detectable de acuerdo a los métodos conocidos en la materia y descritos en la presente. Alternativamente, la unión del ligante al miembro de super familia TGF-beta puede medirse al agregar una o más moléculas de detección, tal como un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente al ligante y cuantificar la cantidad de la molécula que se une al ligante. Los agentes que son adecuados para utilizarse en el aumento del contenido mineral óseo según se describe en la presente son aquellos agentes que reducen la unión de la proteína de unión TGF-beta a su ligante que es un miembro de la súper familia TGF-beta en una manera estadísticamente importante. Dentro de otras modalidades de la invención, se proporcionan los métodos para determinar si un agente es capaz de aumentar el contenido mineral óseo, comprendiendo las etapas de (a) contactar un agente candidato a células que expresan una proteína TGF-beta y (b) determinar si la actividad de la proteína TGF-beta de las células expuestas se altera, y de allí determinar si el compuesto es capaz de aumentar el contenido mineral óseo. Similar a los métodos descritos en la presente, una amplia variedad de métodos puede utilizarse para valorar los cambios en la expresión de proteína de unión TGF-beta cuando una célula que produce la proteína de unión TGF-beta se expone a un compuesto de prueba seleccionado. Dentro de otra modalidad de la presente invención, se proporcionan los métodos para determinar si un agente es capaz de aumentar el contenido mineral óseo, comprendiendo las etapas de (a) contactar un agente candidato con una proteína de unión TGF-beta y un miembro seleccionado de la familia de proteínas TGF-beta, y (b) determinar si el agente seleccionado regula la señalización de la familia de proteínas TGF-beta o inhibe la unión de la proteína de unión TGF-beta al miembro de familia TGF-beta. Dentro de ciertas modalidades, la molécula mejora la habilidad de un miembro de familia TGF-beta para funcionar como un regulador positivo de diferenciación de célula mesénquima. Similar a los métodos anteriormente descritos, una variedad de métodos puede utilizarse para valorar la estimulación de un miembro de familia TGF-beta mediante un compuesto de prueba, tal como un anticuerpo que se une específicamente a SOST. Tal método representativo (véase también Durham eí al. , Endo. 736: 1374- 1380) comprende unir un miembro de familia TGF-beta, tal como una BMP (por ejemplo, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7) a la fase sólida a una concentración que es equivalente a la Kd. La constante de disociación (Kd) puede determinarse de acuerdo a los métodos para medir las constantes de tasa de unión conocidas en la materia, tal como resonancia de plasmón de superficie utilizando un instrumento BIAcore de acuerdo a las técnicas conocidas en la materia y descritas por el fabricante (Biosensor, Piscataway, NJ). Una colección de agentes candidato antagonistas se agrega así a una concentración fija (típicamente, 20 µM para colecciones de molécula orgánica pequeña (una molécula pequeña orgánica aislada según se utiliza en la presente significa que la molécula es mayor a 90% puro según se determina de acuerdo a los métodos bien conocidos en la materia (por ejemplo, NMR, punto de fusión) y 1 µM para anticuerpos candidato). Un agente se considera un antagonista de esta interacción cuando el agente inhibe la unión de la BMP a SOST, es decir, una reducción en el nivel de unión se observa, por al menos 40%, preferentemente 50% o 60%, y más preferentemente 80% o 90% en comparación al nivel de unión de BMP a SOST que se observa en la ausencia del agente. Tal agente puede evaluarse además como un inhibidor potencial en la base de estudios de concentración de acuerdo a los cuales su constante de inhibición y su influencia en la afinidad de unión de proteína de unión TGF-beta se determina. Los ensayos de control de especificidad comparables también pueden conducirse para establecer el perfil de selectividad para el antagonista identificado de acuerdo a estudios que utilizan ensayos dependientes de la acción de ligante BMP (por ejemplo, estudio de competencia de receptor BMP/BMP). Dentro de todavía otras modalidades de la presente invención, se proporcionan métodos para determinar si un agente candidato es capaz de aumentar el contenido mineral óseo, comprendiendo la etapa de determinar si un agente candidato inhibe la unión de proteína de unión TGF-beta a hueso, o un análogo del mismo. Según se utiliza en la presente, deberá entenderse que el hueso o análogos del mismo se refiere a hidroxiapatita, o una superficie compuesta de una forma en polvo de hueso, hueso triturado o hueso intacto. Similar a los métodos descritos en la presente, una amplia variedad de métodos pueden utilizarse para valorar la inhibición de la localización de proteína de unión TGF-beta a aglomerante de hueso (por ejemplo, véase Nicolás eí al. , Calcif. Tissue Int. 47:206-12 (1995)). Mientras que los métodos descritos en la presente pueden referirse al análisis de un agente candidato individual, la presente invención no deberá limitarse así. En particular, el agente puede contenerse dentro de una mezcla de agentes candidato. Según se describe en la presente, los agentes candidato pueden ser pequeñas moléculas orgánicas o pueden ser anticuerpos o fragmentos de los mismos u otros péptidos o polipéptidos. Los anticuerpos o fragmentos pueden identificarse al seleccionar una biblioteca de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo o prepararse mediante métodos descritos en la presente. De allí, los métodos recitados pueden además comprender la etapa de aislar un agente que inhibe la unión de proteína de unión TGF-beta a un miembro de familia TGF-beta. En una modalidad de la invención, un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido SOST es capaz de inhibir competitivamente la unión de un miembro de familia TGF-beta al polipéptido SOST. La capacidad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo para deteriorar o bloquear la unión de un miembro de familia de TGF-beta, tal como una BMP, a SOST puede determinarse de acuerdo a cualquiera de los métodos descritos en la presente. El anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a SOST puede deteriorar, bloquear, o prevenir la unión de un miembro de familia TGF-beta a SOST al deteriorar la formación de homodímero SOST. Un anticuerpo que se une específicamente a SOST también puede utilizarse para identificar una actividad de SOST al inhibir o deteriorar SOST de la unión a una BMP. Alternativamente, el anticuerpo o fragmento del mismo puede incorporarse en un ensayo basado en célula o en un modelo animal en el cual SOST tiene una actividad definida para determinar si el anticuerpo altera (aumenta o reduce en una manera estadísticamente importante) esa actividad. Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a SOST puede utilizarse para examinar el efecto de tal anticuerpo en una trayectoria de transducción de señal y de tal modo modular (estimular o unir) la trayectoria de señalización. Preferentemente, la unión de un anticuerpo a SOST da como resultado una estimulación o inducción de una trayectoria de señalización.

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS Los polipéptidos descritos en la presente incluyen la proteína de unión TGF esclerostina y variantes de la misma y anticuerpos o fragmentos de la misma que se unen específicamente a esclerostina. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos incluyen derivados que son sustancialmente similares a los polinucleótidos (y, cuando es adecuado, a las proteínas que incluyen péptidos y polipéptidos que se codifican por los polinucleótidos y sus derivados). Según se utiliza en la presente, una secuencia de nucleótido se considera que es "sustancialmente similar" si (a) la secuencia de nucleótido se deriva de la región codificadora de los polinucleótidos descrita en la presente e incluye, por ejemplo, las partes de la secuencia o variaciones alélicas de las secuencias anteriormente discutidas, o alternativamente, codifica una molécula que inhibe la unión de proteína de unión TGF-beta a un miembro de la familia TGF-beta; (b) el polinucleótido es capaz de hibridizar a polinucleótido según se proporciona en la presente bajo rigurosidad modera, alta o muy alta (véase Sambrook eí al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001 ); y/o (c) las secuencias de polinucleótido se degeneran con respecto a las secuencias de codón para un aminoácido particular de las secuencias de polinucleótido descritas en (a) o (b). Además, la molécula de ácido nucleico descrita en la presente incluye tanto secuencias complementarias como no complementarias, con la condición de que las secuencias de otra forma cumplan los criterios establecidos en la presente. Dentro del contexto de la presente invención, la rigurosidad alta significa las condiciones de hibridización estándar (por ejemplo, 5xSSPE, 0.5% de SDS a 55-65°C, o el equivalente; 5xSSPE (1 xSSPE=180 mM de cloruro de sodio; 10 mM de fosfato de sodio; 1 mM de EDTA (pH 7.7); dxsolución Denhard (100x Denhardt's = 2% (p/v) de albúmina de suero de bovino, 2% (p/v) Ficoli, 2% (p/v) polivinilpirrolidona); y 0.5% (SDS) . Los lavados de post-hibridización a alta rigurosidad se realizan típicamente en O.dxSSC (1 xSSC = 150 nM de cloruro de sodio, 15 mM de citrato de trisodio) o en O.dxSSPE a 55-60°C). Los polinucleótidos que codifican SOST pueden aislarse de bibliotecas de cADN o genómicas, de células en una muestra biológica, tejidos, o estirpes de célula, y prepararse utilizando cualquier variedad de técnicas (véase, por ejemplo, Sambrook, supra). Por ejemplo, un polinucleótido puede amplificarse de cADN preparado de una célula adecuada o tejido. Estos polinucleótidos pueden amplificarse mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores específicos de secuencia que se diseñan en la base de las secuencias proporcionadas en la presente, y que pueden adquirirse o sintetizarse. Los polinucleótidos también pueden obtenerse al seleccionar las bibliotecas de ADN genómico o cADN utilizando los cebadores y medidores específicos de secuencia. Los métodos generales para seleccionar bibliotecas por PCR se proporcionan, por ejemplo, por Yu eí al. , "Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries," en Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), páginas 21 1 -216 (Humana Press, Inc. 1 993). Además, las técnicas para utilizar PCR para aislar los genes relacionados se describen por, por ejemplo, Preston, "Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members," en Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), páginas 317-337 (Humana Press, Inc. 1993). La secuencia de un fragmento genómico de proteína de unión TGF-beta o cADN de proteína de unión TGF-beta puede determinarse utilizando métodos estándar. Además, la identificación de los fragmentos genómicos que contienen un promotor o elemento regulador de proteína de unión TGF-beta puede lograrse utilizando Isa técnicas bin establecidas, tales como análisis de supresión (véase, generalmente, Ausubel (1995)). Como una alternativa, un polinucleótido que codifica una proteína de unión TGF-beta puede obtenerse al sintetizar las moléculas de ADN utilizando los oligonucleótidos largos de mutua cebación y las secuencias de nucleótido descritas en la presente (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 8-8 a 8-9). Si PCR se incorpora en un método las moléculas ADN al menos dos kilobases en longitud pueden sintetizarse (Adang eí al. , Plant Molec.

Biol. 27: 1 131 , 1993; Bambot eí al. , PCR Methods and Applications 2:266, 1 993; Dillon eí al. , "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes," en Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), páginas 263-268, (Humana Press, Inc. 1993); Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299, 1995). Las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de unión TGF-beta variante pueden obtenerse al seleccionar varias bibliotecas genómicas o cADN con medidores de polinucleótido que tienen secuencias de nucleótidos basadas en SEQ ID NO:55-57, 59, 61 , 63, 65, 67 y 69, utilizando procedimientos descritos en la presente. Las variantes de polinucleótido de proteína de unión TGF-beta también pueden construirse sintéticamente. Por ejemplo, puede diseñarse una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene un camio de aminoácido conservador cuando se compara con ia secuencia de aminoácido de SEQ I D NOs: 1 , 20, 58, 60, 62, 64, 66, 68, o 70. Es decir, pueden obtenerse variantes que contienen una o más sustituciones de aminoácido de SEQ I D NOs: 1 , 20, 58, 60, 62, 64, 66, 68, o 70, en las cuales se sustituye un aminoácido alquilo para un aminoácido alquilo en una secuencia de aminoácido de proteína de unión TGF-beta; un aminoácido aromático se sustituye por un aminoácido aromático en una secuencia de aminoácido de proteína de unión TGF-beta; un aminoácido que contiene azufre se sustituye por un aminoácido que contiene azufre en una secuencia de aminoácido de proteína de unión TGF-beta; un aminoácido que contiene hidroxi se sustituye por un aminoácido que contiene hidroxi en una secuencia de aminoácido de proteína de unión TGF-beta; un aminoácido acídico se sustituye por un aminoácido acídico en una secuencia de aminoácido de proteína de unión TGF-beta; un aminoácido básico se sustituye por un aminoácido básico en una secuencia de aminoácido de proteína de unión TGF-beta; o un aminoácido monocarboxílico dibásico se sustituye por un aminoácido monocarboxílico dibásico en una secuencia de aminoácido de proteína de unión TGF-beta. Entre los aminoácidos comunes, por ejemplo, una sustitución de aminoácido conservadora se ilustra por una sustitución entre los aminoácidos dentro de cada uno de los siguientes grupos: (1 ) glicina, alanina, valina, leucina, y e isoleucina (cadena lateral que contiene grupo alquilo no polar); (2) fenilalanina, tirosina, y triptofano (cadena lateral aromática) (3) serina y treonina (cadena lateral de grupo hidróxilo), (4) aspartate y glutamato (cadena lateral de grupo de ácido carboxílico); (5) glutamina y asparaginas (cadena lateral que contiene grupo amida) y (6) lisina, arginina e histidina (cadena lateral de grupo amino). Al elaborar tales sustituciones, es importante, en donde sea posible, mantener el elemento principal de cisteína señalado en la Figura 1 . Los cambios de aminoácido conservador en SOST pueden introducirse al sustituir los nucleótidos por los nucleótido citados en cualquiera de SEQ ID NOs: 55-57, 59, 61 , 63, 65, 67 o 69. Tales variantes de aminoácido conservador pueden obtenerse, por ejemplo, por mutagénesis dirigida por oligonucleótido, mutagénesis de exploración por enlazador, mutagénesis utilizando la reacción en cadena de polimerasa, y lo similar (véase Ausubel (1995) en páginas 8-10, a 8-22; y McPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (I RL Press 1 991 )). La actividad funcional de tales variantes puede determinarse utilizando ensayos y métodos estándar descritos en la presente. Alternativamente, un polipéptido de proteína de unión TGF-beta variante retiene la habilidad de unirse específicamente a anticuerpos anti-SOST. Los análisis de supresión rutinaria de las moléculas de ácido nucleico pueden realizarse para obtener "fragmentos adicionales" de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de proteína de unión TGF-beta. A manera de ilustración, las moléculas ADN que tienen la secuencia de nucleótido de cualquiera de SEQ I D NOs: 55-57, 59, 61 , 63, 65, 67 o 69 pueden digerirse con nucleasa ßa/31 para obtener una serie de supresiones jerarquizadas. Los fragmentos se insertan así en los vectores de expresión en estructura de lectura adecuada, y los polipéptidos expresados se aislan y se prueban para actividad, o por la habilidad para unir los anticuerpos de proteína de unión anti-TGF-beta. Una alternativa para digestión de exonucleasa es utilizar mutagénesis dirigida por oligonucleótido para introducir supresiones o codones de detención para especificar la producción de un fragmento deseado. Alternativamente, los fragmentos particulares de un polinucleótido codificador de proteína pueden sintetizarse utilizando la utilizando la reacción en cadena de polimerasa. Además de los ensayos y métodos descritos en la presente, las técnicas estándares para análisis funcional de proteínas se describen, por ejemplo, por Treuter eí al. , Treuter eí al. , Molec. Gen. Genet. 240: 1 13, 1993; Content eí al. , "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon," en Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), páginas 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, "The EGF Receptor, "in Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1 , Boynton eí al. , (eds.) páginas 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau eí al. , J Biol. Chem. 270: 29270, 1995; Fukunaga eí al. , J. Biol. Chem. 270: 25291 , 1 995; Yamaguchi eí al. , Biochem. Pharmacol. 50: 1295, 1995; and Meisel eí al. , Plant Molec. Biol. 30: 1 , 1996. La estructura de los polipéptidos codificados por las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente puede pronosticarse de los productos de traducción primaria utilizando la función de grupo de hidrofobicidad de, por ejemplo, P/C Gene or Intelligenetics Suite (Intelligenetics, Mountain View, California), o de acuerdo a los métodos descritos por Kyte and Doolittle (J. Mol. Biol. 157: 1 05-1 32, 1 982). Los polipéptidos pueden prepararse en la forma de sales básicas o acídicas o en forma neutral. Además, los residuos de aminoácido individuales pueden modificarse por oxidación o reducción. Además, diversas sustituciones, supresiones, o adiciones pueden hacerse a las secuencias de ácido nucleico o aminoácido, el efecto neto de lo cual es retener o además mejorar o reducir la actividad biológica de la proteína tipo silvestre o mutante.

Preferentemente, una variante SOST, o un fragmento del mismo retiene o ha mejorado su habilidad para unirse a un anticuerpo específico SOST. Además, debido a la degeneración en el código genético, por ejemplo, las secuencias de nucleótido que codifican la misma secuencia de aminoácido pueden variar considerablemente. Otros derivados de las proteínas proporcionadas en la presente incluyen conjugados de las proteínas con otras proteínas o polipéptidos. Esto puede lograrse, por ejemplo, por la síntesis de proteínas de fusión de N-terminal o C-terminal que pueden agregarse para facilitar la purificación o identificación de proteínas (véase, Patente de EE.UU. No. 4,851 , 341 , véase también, Hopp eí al. , BioITechnology 6: 1204, 1988). Alternativamente, las proteínas de fusión tales como proteína de unión FLAG/TGF-beta pueden construirse a fin de ayudar en la identificación, expresión, y análisis de la proteína. Las proteínas descritas en la presente pueden construirse utilizando una amplia variedad de técnicas descritas en la presente. Además, las mutaciones pueden introducirse en sitios particulares al sintetizar oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante que se flanquean por sitios de restricción, permitiendo la ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Siguiente a la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un derivado que tiene la inserción, sustitución, o supresión de aminoácido deseada. Alternativamente, los procedimientos de mutagénesis específicos por sitio dirigido por oligonucleótido (o segmento específico) pueden emplearse para proporcionar un polinucleótido alterado que tiene codones particulares alterados de acuerdo a la sustitución, supresión, o inserción. Los métodos ejemplares para elaborar las alteraciones establecidas anteriormente se describen por Walder eí al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer eí al. (Gene 37: 73, 1 985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith eí al. (Genetic Engineering: Principies and Methods, Plenum Press, 1981 ); y Sambrook eí al. (supra). Los derivados de truncación o supresión de proteínas (por ejemplo, una parte extracelular soluble) también pueden construirse al utilizar sitios de endonucleasa de restricción conveniente adyacentes a la supresión deseada. Subsecuente a la restricción, pueden llenarse salientes en y el ADN religado. Los métodos ejemplares para elaborar las alteraciones establecidas anteriormente se describen por Sambrook eí al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001 )). Las mutaciones que se elaboran en las moléculas de ácido nucleico preferentemente preservan la estructura de lectura de las secuencias codificadoras. Además, las mutaciones preferentemente no crearán regiones complementarias que cuando se transcriben podrían hibridizarse para producir estructuras de mARN secundarias, tales como ciclos u horquillas, que podrían afectar la traducción del mARN. A pesar de que puede determinarse un sitio de mutación, no es necesario que la naturaleza de la mutación per se se determine. Por ejemplo, a fin de seleccionarse para características óptimas de mutantes a un sitio dado, la mutagénesis al azar puede conducirse en el codón objetivo y los mutantes expresados seleccionados para ganancia, pérdida o retención de actividad biológica. Alternativamente, las mutaciones pueden introducirse en sitios particulares al sintetizar oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción permitiendo la ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Siguiente a la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un derivado que tiene la inserción, sustitución o supresión del aminoácido deseada. Las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de la presente invención también pueden construirse utilizando técnicas tales como mutagénesis de reacción en cadena de polimerasa (PCR), mutagénesis química (Drinkwater and Klinedinst, PNAS 83: 3402-3406, 1 986), mala incorporación de nucleótido forzada (por ejemplo, Liao and Wise Gene 88: 1 07- 1 1 1 , 1990), o uso de oligonucleótidos mutagenizados al azar (Horwitz eí al. , Genome 3: 1 12- 1 17, 1 989). La presente invención también se proporciona para la manipulación y expresión de los polinucleótidos proporcionados en la presente y de polinucleótidos que codifican los anticuerpos de invención objeto al cultivar las células huésped que contienen un vector capaz de expresar tales polinucleótidos. Un vector de expresión se refiere a construcción de ácido nucleico recombinante que es capaz de dirigir la expresión de proteína deseada. El vector puede componerse de ácidos deoxiribonucleico (ADN), sintéticos o derivados de cADN, ácidos ribonucleico (ARN), o una combinación de los dos (por ejemplo, una quimera de ADN-ARN). Un polinucleótido de cADN generalmente se entiende que signifique un polinucleótido de ADN preparado al transcribir una molécua de ARN, tal como mARN. Estos vectores o construcciones de vector que incluyen una secuencia de polinucleótido que codifican la proteína deseada preferentemente se unen operativamente a elementos reguladores de traducción o transcripción adecuados. Los elementos reguladores adecuados pueden derivarse de una variedad de fuentes, incluyendo genes bacterianos, fúngicos, virales, mamífero, insecto o planta. La selección de elementos reguladores adecuados es dependiente de la célula huésped seleccionada, y puede lograrse fácilmente por un experto en la materia. Los ejemplos de elementos reguladores incluyen un reforzador y promotor de traducción o secuencia de unión de polimerasa de ARN, un terminador de traducción, y una secuencia de unión ribosómica que incluye una señal de inicio de traducción. Opcionalmente, el vector puede incluir una secuencia de poliadenilación, uno o más sitios de restricción, así como también uno o más marcadores elegibles tal como fosfotransferasa neomicina o fosfotransferasa higromicina o cualquiera de los otros marcadores conocidos en la materia. Adicionalmente, dependiendo de la célula huésped seleccionada y el vector empleado, otros elementos genéticos tales como un origen de duplicación, los sitios de restricción de ácido nucleico adicionales, reforzadores, secuencias que confieren inducibilidad de traducción, y marcadores elegibles, también pueden incorporarse en los vectores descritos en la presente.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las proteínas anteriormente descritas pueden expresarse fácilmente por una amplia variedad de células huésped eucarióticas y procarióticas, incluyendo células bacterianas, de mamífero, levadura u otros hongos, virales, de insecto o de planta. Los métodos para transformar o transfectar tales células para expresar el ADN ajeno se conocen bien en la materia (véase, por ejemplo, Itakura eí al., Patente de EE.UU. No. 4,704, 362; Hinnen eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933,1978; Murray eí al., Patente de EE.UU. No.4,801, 542; Upshall eí al., Patente de EE.UU. No. 4,935, 349; Hagen eí al., Patente de EE.UU. No.4,784, 950; Axel eí al., Patente de EE.UU. No. 4,399, 216; Goeddel eí al., Patente de EE.UU. No. 4,766, 075; and Sambrook eí al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; para células de planta véase Czako and Marton, Plant Physio. 104: 1067-1071,1994; y Paszkowski eí al., Biotech.24: 387-392,1992). Las células huésped bacterianas adecuadas para llevar a cabo la presente invención incluyen E. coli BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS, BL21 (DE3) pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH1OB, DH1OB/p3, DHIIS, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, y ER1647 (véase, por ejemplo, Brown (Ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991) ); B. subtilis (BR151, YB886, MU 19, MI120, and B170 (véase, por ejemplo, Hardy, "Bacillus Cloning Methods, "in DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (Ed.) (IRL Press 1985)); Salmonella typhimurium; y diversas especies dentro del género Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus, así como también otras especies bacterianas bien conocidas por un experto en la materia. Un ejemplo representativo de una célula huésped bacteriana incluye £. coli DH5a (Stratagene, LaJolla, California). Los vectores de expresión bacteriana preferentemente comprenden un promotor que funciona en la célula huésped, uno o más marcadores fenotípicos elegibles, y un origen bacteriano de duplicación. Los promotores representativos incluyen la ß-lactamasa (penicilinasa) y sistema de promotor de lactosa (véase Chang eí al. , Nature 275: 615, 1978), el promotor de polimerasa ARN T7 (Studier eí al. , Meth. Enzymol. 185: 60-89, 1990), el promotor lambda (Elvin eí al. , Gene 87: 123-126, 1990), el promotor trp (Nichols and Yanofsky, Meth. in Enzymology 101: 155, 1983), y el promotor tac (Russell eí al. , Gene 20: 231 , 1982). Los promotores adicionales incluyen promotores capaces de reconocer las polimerasas T4, T3, Sp6 y T7, los promotores PR y PL de bacteriófago lamda, recA, choque térmico, promotores lacUVd, tac, Ipp-lacSpr, phoA, y lacZ de E. coli, promotores de B. subtilis, los promotores de los bacteriófagos de Bacillus, Streptomyces, el promotor int de bacteriófago lambda, el promotor bla de pBR322, y el promotor CAT del gen de transferasa acetil cloramfenicol. Los promotores procarióticos se han revisado por Glick, J. Ind. Microbiol. 1: 277, 1 987, Watson eí al. , Molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamín Cummins 1987), y por Ausubel eí al. (1 995). Los marcadores elegibles representativos incluyen varios marcadores de resistencia antibiótica tales como genes de resistencia de ampicilina o kanamicina. Varios plásmidos adecuados para transformar las células huésped se conocen bien en la materia, incluyendo entre otros, pBR322 (véase Bolívar eí al. , Gene 2: 95, 1977), los plásmidos pUC 18, pUC 19, pUC 1 18, pUC 1 19 (véase Messing, Meth. in Enzymology 101: 20-77, 1 983 y Vieira and Messing, Gene 19: 259-268, 1 982), y pNH8A, pNH 16a, pNH 18a, y Bluescript M13 (Stratagene, La Jolla, California). Las células huésped de hongos y levadura para llevar a cabo la presente invención incluyen entre otras, Saccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, los géneros Pichia o Kluyveromyces y diversas especies del género Aspergillus (McKnight eí al. , Patente de EE. UU. No. 4,935, 349). Los vectores de expresión adecuados para levadura y hongos incluyen, entre otros, YCp50 (ATCC No. 3741 9) para levadura, y el vector de clonación amdS pV3 (Turnbull, Bio/Technology 7: 169, 1989), YRp7 (Struhl eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76: 1 035-1039, 1978), YEpl3 (Broach eí al. , Gene 8: 121 -133, 1979), pJDB249 y pJDB219 (Beggs, Nature 275: 104-108, 1978) y derivados de los mismos. Los promotores preferidos para utilizarse en levadura incluyen promotores de genes glicolíticos de levadura (Hitzeman eí al. , J Biol. Chem. 255: 12073-12080, 1980; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1: 419-434, 1982) o genes dehidrogenasa de alcohol (Young eí al. , en Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender eí al. (eds.), p. 355, Plenum , New York, 1982; Ammerer, Meth. Enzymol. 101: 192-201 , 1 983). Los ejemplos de promotores útiles para vectores de hongo incluyen aquellos derivados de genes glicolíticos Aspergillus nidulans, tales como el promotor adh3 (McKnight eí al. , EMBO J 4: 2093-2099, 1985). Las unidades de expresión también pueden incluir un terminador de transcripción. Un ejemplo de un terminador adecuado es el terminado adh3 (McKnight eí al. , supra, 1985). Así como los vectores bacterianos, los vectores de levadura generalmente incluirán un marcador elegible, el cual puede ser uno de cualquier número de genes que muestran un fenotipo de dominio para lo cual existe un ensayo fenotípico para permitir a los transformantes seleccionarse. Los marcadores elegibles preferidos son aquellos que complementan la auxotrofía de célula huésped, proporcionan resistencia antibiótica, o permiten a una célula utilizar fuentes de carbono específicas, e incluyen Ieu2 (Broach eí al. , ibid), ura3 (Botstein eí al. , Gene 8: 17, 1 979), o his3 (Struhl eí al., ibid.). Otro marcador elegible adecuado es el gen cat, el cual confiere la resistencia de cloramfenicol en células de levadura. Varios de los vectores de clonación de levadura se han diseñado y se encuentran fácilmente disponibles. Estos vectores incluyen los vectores basados en Yip tales como vectores Ylp5, YRp tales como vectores YRpl7, YEp tales como vectores YEpl3, y YCp vectors tal como YCp 19. Un experto en la materia apreciará que una amplia variedad de vectores adecuados se encuentran disponibles para la expresión en células de levadura.

Las técnicas para transformar hongos se conocen bien en la literatura y se han descrito, por ejemplo, por Beggs (ibid.), Hinnen eí al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75: 1929- 1 933, 1978), Yelton eí al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1740-1747, 1984), y Russell (Nature 307; 167-169, 1983). El genotipo de la célula huésped puede contener un defecto genético que se complementa por el marcador elegible presente en el vector de expresión. La elección de un huésped particular y marcador elegible se encuentra bien dentro del nivel del experto en la materia. Los protocolos para la transformación de levadura también se conocen por aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, la transformación puede lograrse fácilmente ya sea por preparación de esferoplastos de levadura con ADN (véase Hinnen eí al. , PNAS USA 75: 1929, 1 978) o por tratamiento con sales alcalinas tales como LilCI (véase Itoh eí al. , J. Bacteriology 753: 163, 1983). La transformación de hongos también pueden llevarse a cabo utilizando polietilenglicol según se describe por Cullen eí al. (Bio/Technology 5:369, 1 987). Los vectores virales incluyen aquellos que comprenden un promotor que dirige la expresión de una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína deseada según se describe anteriormente. Una amplia variedad de promotores pueden utilizarse dentro del contexto de la presente invención, incluyendo, por ejemplo, promotores tales como MoMLV LTR; RSV LTR (por ejemplo, Gorman eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79:6777, 1982); Friend MuLV LTR; promotor adenoviral (Ohno eí al. , Science 265:781 -784, 1994); promotor/reforzador de fosfotransferasa de neomicina; promotor tardío parvovirus (Koering eí al. , Hum. Gene Therap. 5:457-463, 1994); promotor Herpes TK (véase, por ejemplo, McKnight, Cell 31 :355, 1 982); promotor SV40 (por ejemplo, SV40 promotor temprano (Benoist eí al. , Nature 290:304, 1981 ); reforzador/promotor de gen metalotioneina II ; g metalotioneina I de ratón (Hamer eí al. , J. Molec. Appl. Genet. 7:273, 1982); promotor de irus de tumor de mamífero de ratón (véase, generalmente, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," en Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland eí al. (eds.), páginas 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)); promotor temprano inmediato de citomegalovirus, y el promotor tardío inmediato de citomegalovirus. Alternativamente, un promotor procariótico, tal como el promotor de polimerasa ARN bacteriófago T3, puede utilizarse para controlar la expresión de gen de proteína de unión TGF-beta en células de mamífero si el promotor procariótico se regula por un promotor eucariótico (Zhou eí al. , Mol. Cell. Biol. 70:4529, 1990; Kaufman eí al. , Nucí. Acids Res. 79:4485, 1991 ). Dentro de las modalidades particulares preferidas de la ¡nvención, el promotor es un promotor específico de tejido (véase, por ejemplo, WO 91 /02805; EP 0,415,731 ; y WO 90/07936). Los ejemplos representativos de promotores específicos de tejido adecuados incluyen promotor de enolasa específico neural, promotor beta de factor de crecimiento derivado de plaqueta, promotor de proteína morfogénica ósea, promotor alfal -quimaerina humano, promotor sinapsina I y promotor sinapsina II. Además, de los promotores anteriormente señalados, otros promotores específicos virales (por ejemplo, promotores retrovirales (incluyendo aquellos anteriormente señalados, así como también otros promotores tales como VI H), hepatitis, herpes (por ejemplo, EBV), y promotores específicos bacterianos, fúngicos o de parásito (por ejemplo, malarios) pueden utilizarse a fin de tener como objetivo una célula específica o tejido que se infecta con un virus, bacteria, hongo o parásito. Las células de mamífero adecuadas para llevar a cabo la presente invención incluyen, entre otras, COS, CHO, SaOS, osteosarcomas, KS483, MG-63, osteoblastos primarios, y estroma de médula ósea de mamífero y humano. Las células huésped de mamífero adicionales incluyen células de riñon de mono verde africano (Vero; ATCC CRL 1587), células de riñon embriónicas de humano (293-HEK; ATCC CRL 1573), células de riñon de hámster bebé (BHK-21 ; ATCC CRL 8544), células de riñon caninas (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovario de hámster chino (CHO-K1 ; ATCC CCL61 ), células pituitarias de rata (GH 1 ; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2.2), células de hepatoma de rata (H-4-I I-E; ATCC CRL 1548) SV40-células de riñon de mono transformadas SV40 (COS-1 ; ATCC CRL 1650) y células embriónicas murino (NIH-3T3; ATCC CRL 1658). Los vectores de expresión de mamífero para utilizarse en llevar a cabo la presente invención incluirán un promotor capaz de dirigir la transcripción de un gen clonado o cADN. Los promotores preferidos incluyen promotores virales y promotores celulares. Los promotores específicos de hueso incluyen el promotor para la proteína de sialo de hueso y el promotor para osteocalcina. Los promotores virales incluyen el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (Boshart eí al. , Cell 47 :521 -530, 1985), promotor tardío inmediato citomegalovirus, promotor SV40 (Subramani eí al. , Mol. Cell. Biol. 1 :854-864, 1 981 ), MMTV LTR, RSV LTR, metalotioneina-1 , adenovirus E1 a. Los promotores celulares incluyen el promotor metalotioneina-1 de ratón (Palmiter eí al. , Patente de EE. UU. No. 4,579,821 ), un promotor V? (Bergman eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:7041 - 7045, 1 983; Grant eí al. , Nucleic Acids Res. 15:5496, 1987) y un promotor de ratón VH (Loh eí al. , Cell 33:85-93, 1983). La elección de promotor dependerá, al menos en parte, del nivel de expresión deseada o de la estirpe de célula de recipiente a transfectar. Tales vectores de expresión también pueden contener un grupo de sitios de división de ARN ubicados río abajo del promotor y río arriba de la secuencia de ADN que codifica el péptido o proteína de interés. Los sitios de división de ARN preferidos pueden obtenerse de adenovirus y/o genes de inmunoglobulina. También se contiene en los vectores de expresión una señal de poliadenilación ubicada río arriba de la secuencia codificadora de interés. Las señales de poliadenilación adecuadas incluyen las señales de poliadenilación tempranas o tardías de SV40 (Kaufman and Sharp, ibid.), la señal de poliadenilación de la región Adenovirus 5 E1 B y el terminador de gen de hormona de crecimiento humano (DeNoto eí al. , Nucleic Acids Res. 9:3719-3730, 1981 ). Los vectores de expresión pueden incluir una secuencia líder viral no codificadora, tal como líder tripartido Adenovirus 2, ubicado entre el promotor y los sitios de división de ARN. Los vectores preferidos también pueden incluir secuencias de reforzador, tal como el reforzador SV40. Los vectores de expresión también pueden incluir secuencias que codifican los ARNs de adenovirus VA. Los vectores de expresión adecuados pueden obtenerse de fuentes comerciales (por ejemplo, Stratagene, La Jolla, California). Las construcciones de vector que comprenden secuencias de ADN clonado pueden introducirse en células de mamífero cultivadas, por ejemplo, por transfección mediada por liposoma, transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler eí al. , Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981 ; Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973), electroporación (Neumann eí al. , EMBO J. 7 :841 -845, 1982), o transfección mediada por dextrano DEAE (Ausubel eí al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1 987); transfección mediada por fusión retroviral, adenoviral y protoplasta (see Sambrook eí al. , supra). Las construcciones de vector naturales también pueden tomarse por células musculares u otras células adecuadas subsecuentes a la inyección en el músculo de un mamífero (u otro animal). Para identificar las células que se han transfectado adecuadamente con el vector que contiene el ADN clonado, un marcador elegible se introduce generalmente en las células junto con el gen o cADN de interés. Los marcadores elegibles preferidos para utilizarse en genes de células de mamífero cultivados incluyen genes que confieren resistencia a fármacos, tales como neomicina, higromicina, y metotrexato. Los marcadores elegibles amplificables preferidos son el gen DHFR y el gen de resistencia neomicina. Los marcadores elegibles se revisan por Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham , Massachusetts). Las células de mamífero que contienen un vector adecuado se permiten crecer por un período de tiempo, típicamente 1 -2 días, para comenzar a expresar la (s) secuencia (s) de ADN de interés. La selección de fármaco se aplica así para seleccionar el crecimiento de las células que se encuentran expresando el marcador elegible en una forma adecuada. Para las células que se han transfectado con un marcador amplificable, elegible, la concentración de fármaco puede aumentarse en una manera gradual para seleccionar un número de copia aumentado de las secuencias clonadas, aumentando de tal modo los niveles de expresión. Las células que expresan las secuencias introducidas se seleccionan y se seleccionan para la producción de la proteína de interés en la forma deseada o en el nivel deseado. Las células que satisfacen estos criterios pueden clonarse y clasificarse para producción. Numerosas células huésped de interés conocidas en la materia también pueden ser útiles dentro de la presente invención. Por ejemplo, los baculovirus como vectores para (Atkinson eí al. , Pestic. Sci. 28:215-224 (1990)). El sistema de baculovirus proporciona un medio eficiente para introducir polinucleótidos codificadores de proteína de unión TGF-beta en células de insecto. Los vectores de expresión adecuados se basan en el virus de polihedrosis nuclear múltiple Autographa californica (AcMNPV), que contienen promotores bien conocidos tal como promotor 70 (hsp) de proteína de choque térmico Drosophilia, promotor de gen temprano inmediato de virus de polihedrosis nuclear Autographa californica (ie-1), y el promotor temprano retardado 39K, promotor p10 baculovirus, y el promotor de metalotioneina Drosophila. Las células huésped de insecto adecuadas incluyen estirpes de célula derivadas de IPLB-Sf-21 , una estirpe de célula ovárica Spodoptera frugiperda tal como Sf9 (ATCC CRL 171 1 ), S/21AE, y S 21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA), así como también células Drosophila Schneider-2. Las técnicas establecidas para producir proteínas recombinantes en sistemas de baculovirus se proporcionan por Bailey eí al. , "Manipulation of Baculovirus Vectors," en Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), páginas 147-168 (The Humana Press, Inc. 1 991 ); Patel eí al. , "The baculovirus expression system," en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover eí al. (eds.), páginas 205-244 (Oxford University Press 1995); Ausubel (1995) en páginas 16-37 a 16-57, por Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995); y Lucknow, "Insect Cell Expression Technology," in Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland eí al. (eds.), páginas 183-21 8 (John Wiley & Sons, Inc. 1996). Alternativamente, numerosas células huésped de planta se conocen en la materia y también pueden ser útiles para expresar polinucleótidos, por ejemplo, Agrobacterium rhizogenes (Sinkar eí al. J. Biosci. (Bangalore) 1 1 :47-58, 1 987). Los vectores de expresión también pueden introducirse en protoplastos de planta, tejidos de planta intactos, o células de planta aisladas. Los métodos generales para cultivar los tejidos de planta se proporcionan, por ejemplo, por Miki eí al. , "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants," in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick eí al. (eds.), pages 67-88 (CRC Press, 1993). Dentro de las modalidades relacionadas de la presente invención, las proteínas de la presente invención pueden expresarse en un animal transgénico cuya células germinales y células somáticas contienen un gen que codifica la proteína deseada y que se une operativamente a un promotor eficaz para la expresión del gen. Alternativamente, en una manera similar, pueden prepararse animales transgénicos que carecen el gen deseado (por ejemplo, ratones de "golpe"). Tales transgénicos pueden prepararse en una variedad de animales no humanos, incluyendo, ratones, ratas, conejos, ovejas, perros, cabras, y cerdos (véase Hammer eí al. , Nature 375:680-683, 1985, Palmiter eí al. , Science 222:809-814, 1 983, Brinster eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:4438-4442, 1985, Palmiter and Brinster, Cell 47 :343-345, 1 985, y Patentes de EE. UU. Nos. 5, 175,383, 5,087,571 , 4,736,866, 5,387,742, 5,347,075, 5,221 ,778, and 5, 175,384). En resumen, un vector de expresión, incluyendo una molécula de ácido nucleico a expresar junto con las secuencias de control de expresión adecuadamente colocadas, se introduce en pro-núcleos de huevos fertilizados, por ejemplo, por microinyección. La integración del ADN inyectado se detecta por el análisis de mancha de ADN de muestras de tejido. Se prefiere que el ADN introducido se incorpore en la estirpe germinal del animal de tal forma que se pase sobre la descendencia del animal. La expresión específica de tejido puede lograrse a través del uso de un promotor específico de tejido, o a través del uso de un promotor inducible, tal como el promotor de gen metalotioneina (Palmiter eí al. , 1 983, supra), el cual permite la expresión regulada del transgen. Las proteínas pueden aislarse, entre otros métodos, al cultivar sistemas de vector y huésped adecuados para producir los productos de traducción recombinante de la presente invención. Los sobrenadantes de tales estirpes de célula, o cuerpos de inclusión de proteína, o células completas de las cuales la proteína no se secreta en el sobrenadante, pueden tratarse así por una variedad de procedimientos de purificación a fin de aislar las proteínas deseadas. Por ejemplo, el sobrenadante puede concentrarse primero utilizando filtros de concentración de proteína comercialmente disponibles, tales como unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Siguiente a la concentración, el concentrado puede aplicarse a un aglomerante de purificación adecuado tal como un aglomerante de afinidad, por ejemplo, un anticuerpo específico unido a un soporte adecuado.

Alternativamente, las resinas de intercambio de catión o anión o aglomerantes de exclusión por tamaño pueden emplearse a fin de purificar la proteína. Como una alternativa adicional, una o más etapas de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) pueden utilizarse para purificar la proteína. Otros métodos para aislar las proteínas de la presente invención se conocen bien en la materia. La pureza de una proteína aislada o polipéptido puede determinarse por análisis SDS-PAGE seguido por tintación azul comassie o por tintación de plata. Los métodos generales para expresar y recuperar la proteína ajena producida por un sistema de célula de mamífero se proporciona por ejemplo, por Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," en Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland eí al. (eds.), pages 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Las técnicas estándar para recuperar la proteína producida por un sistema bacteriano se proporciona por, por ejemplo, Grisshammer eí al. , "Purification of over-produced proteins from E. coli cells," en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover eí al. (eds.), páginas 59-92 (Oxford University Press 1995). Los métodos establecidos para aislar las proteínas recombinantes de un sistema de baculovirus se describen por Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. , 1995). Más generalmente, una proteína de unión TGF-beta puede aislarse por técnicas estándar, tales como cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio de ion, HPLC, y lo similar. Las variaciones adicionales en el aislamiento y purificación de proteína de unión TGF-beta pueden contemplarse por aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, anticuerpos de proteína de unión anti-TGF-beta, obtenidos según se describe en la presente, pueden utilizarse para aislar grandes cantidades de proteína por purificación de inmunoafinidad. La purificación de anticuerpos de la presente invención se describen además en la presente.

ETIQUETAS DETECTABLES Una etiqueta detectable es una molécula o átomo que puede conjugarse a un polipéptido (incluyendo un anticuerpo o fragmento del mismo) o un polinucleótido para producir una molécula útil para diagnóstico. Los ejemplos de etiquetas detectables incluyen queladores, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iones paramagnéticos, enzimas y otras porciones marcadoras. Una proteína de unión TGF o un anticuerpo que se une específicamente a la proteína de unión TGF o moléculas candidato anteriormente descritas pueden marcarse con una variedad de compuestos incluyendo, por ejemplo, moléculas fluorescentes, toxinas, y radionúclidos. Los ejemplos representativos de moléculas fluorescentes incluyen fluoresceína, proteínas Phycobili, tales como ficoeritricina, rodamina, rojo Texas, y luciferasa. Los ejemplos representativos de toxinas incluyen ricina, toxina de difteria abrin, toxina de cólera, gelonina, proteína antiviral de grana, tritin, toxina Shigella, y exotoxina A Pseudomonas. Los ejemplos representativos de radionúclidos incluyen Cu-64, Ga-67, Ga-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99m, Rh-105, Pd-109, ln-1 1 1 , 1-123, 1-125, 1-131 , Re-186, Re-188, Au-198, Au-199, Pb-203, At-21 1 , Pb-212 y Bi-212. Además, los anticuerpos anteriormente descritos también pueden marcarse o conjugarse para una pareja de un par de unión de ligante. Los ejemplos representativos incluyen proteína avidina-biotina, estraptividina-biotina, y riboflavina-riboflavina. Los métodos para conjugar o etiquetar las moléculas descritos en la presente con las etiquetas representativas anteriormente establecidas pueden lograrse fácilmente por un experto en la materia (véase Trichothecene Antibody Conjúgate, Patente de EE.UU. No. 4,744,981 ; Antibody Conjúgate, Patente de EE. UU. No. 5, 1 06,951 ; Fluorogenic Materials and Labeling Techniques, Patente de EE.UU. No. 4,018,884; Metal Radionuclide Labeled Proteins for Diagnosis and Therapy, Patente de EE. UU. No. 4,897,255; and Metal Radionuclide Chelating Compounds for Improved Chelation Kinetics, Patente de EE.UU. No. 4,988,496; véase también Inman, Methods In Enzymology, Vol. 34, Affinity Techniques, Enzyme Purification: Part ß, Jakoby and Wilchek (eds.), Academic Press, New York, p. 30, 1 974; véase también Wilchek y Bayer, "The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications," Anal. Biochem. 777 : 1 -32, 1 988). Un inmunoconjugado es una composición que comprende un anticuerpo, tal como un anticuerpo de proteína de unión anti-TGF-beta, o un fragmento de anticuerpo del mismo; y una etiqueta detectable.

Preferentemente, la porción de anticuerpo del inmunoconjugado específicamente se une a su antígeno cognado con la misma o ligeramente reducida afinidad de unión después de la conjugación como la conjugación anterior.

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Según se señala anteriormente, la presente invención también proporciona una variedad de composiciones farmacéuticas, comprendiendo una de las moléculas anteriormente descritas que inhibe la unión de la proteína de unión TGF-beta a un miembro de la familia TGF-beta junto con un vehículo, excipiente, o diluyente farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable. Cualquier vehículo adecuado conocido por aquellos expertos en la materia puede emplearse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Los vehículos para uso terapéutico se conocen bien, y se describen, por ejemplo, en Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro ed. (1985)). Generalmente, tales vehículos podrían ser no tóxicos para recipientes en las dosis y concentraciones empleadas. Ordinariamente, la preparación de tales composiciones comprende combinar el agente terapéutico con reguladores; anti-oxidantes tales como ácido ascórbico, bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos), polipéptidos; proteínas; aminoácidos; carbohidratos que incluyen maltosa, glucosa, sucrosa, o dextrinas; agentes queladores tal como EDTA; glutationa; y otros estabilizadores y excipientes. La salina regulada neutral o salina mezclada con albúmina de suero no específica son diluyentes ejemplares. Alternativamente, las composiciones de la presente invención pueden formularse como un liofilizado. En general, el tipo de vehículo se selecciona en base al modo de administración. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse por cualquiera manera adecuada de administración, incluyendo, por ejemplo administración local, oral, nasal, intratecal, rectal, vaginal, sublingual o parenteral, incluyendo inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intrasternal, intracavernosa, intrametal, o ¡ntrauretral. Una composición farmacéutica (por ejemplo, para administración oral o suministro por inyección) puede encontrarse en la forma de un líquido (por ejemplo, un elixir, jarabe, solución, emulsión o suspensión). Una composición farmacéutica líquida puede incluir, por ejemplo, uno o más de los siguientes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, preferentemente salina fisiológica, solución Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites fijos que pueden servir como el solvente o medio de suspensión, polietilénglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes; agente antibacterianos; antioxidantes; agentes queladores; reguladores tales como acetatos, citratos, o fosfatos y agentes para el ajuste de tonicidad tal como cloruro de sodio o dextrosa. Una preparación parenteral puede encerrarse en ampolletas, jeringas desechables o frascos de múltiples dosis elaborados de vidrio o plástico. El uso de salina fisiológica se prefiere, y una composición farmacéutica inyectable es preferentemente estéril. Las composiciones descritas en la presente pueden formularse para liberación sostenida (es decir, una formulación tal como una cápsula o esponja que efectúa una liberación lenta de compuesto siguiente a la administración). Tales composiciones pueden prepararse generalmente utilizando tecnología bien conocida y administrarse, por ejemplo, por implantación recta o subcutánea, o por implantación en el sitio objetivo deseado. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener un agente disperso en un aglomerante vehículo y/o contenerse dentro de un recipiente rodeado por una membrana controladora de tasa. Los vehículos para utilizarse dentro de tales formulaciones son biocompatibles, y también pueden ser biodegradables; preferentemente, la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación de componente activo. La cantidad de compuesto activo contenida dentro de una formulación de liberación sostenida depende del sitio de implantación, la tasa y duración esperada de liberación y la naturaleza de la condición a tratar o prevenir. Los vehículos ilustrativos útiles en este aspecto incluyen micropartículas de poli(láctido-co-glicólido), poliacrilato, látex, almidón, celulosa, dextrano y lo similar. Otros vehículos de liberación retardada ilustrativos incluyen biovectores supramoleculares, que comprenden un núcleo hidrofílico no líquido (por ejemplo, polisacárido u oligosacárido degradado) y, opcionalmente, una capa externa que comprende un compuesto anfifílico, tal como fosfolípido (véase, por ejemplo, Patente de EE.UU .

No. 5, 151 ,254 y solicitudes PCT WO 94/20078, WO/94/23701 y WO 96/06638). En otra modalidad ilustrativa, las microesferas biodegradables (por ejemplo, polilactato, poliglicolato) se emplean como vehículos para las composiciones de esta invención. Las microesferas biodegradables adecuadas se describen, por ejemplo, en Patentes de EE. UU. Nos. 4,897,268; 5,075, 109; 5,928,647; 5,81 1 , 128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344, 5,407,609 y 5,942,252. Los sistemas de vehículo de proteína de núcleo de hepatitis B modificados, tal como se describen en WO/99 40934, y referencias citadas en la presente, también serán útiles para varias solicitudes. Otro sistema de vehículo/suministro ilustrativo emplea un vehículo que comprende complejos de particulado-proteína, tal como aquellos descritos en la Patente de EE. UU. No. 5,928,647, los cuales son capaces de inducir respuestas de linfocito T citotóxico restringido por clase I en un huésped. En otra modalidad ilustrativa, las partículas de núcleo de fosfato de calcio se emplean como vehículos o aglomerantes de liberación controlada para las composiciones de esta invención. Las partículas de fosfato de calcio ejemplares se describen, por ejemplo, en solicitud de patente publicada No. WO/0046147. Para composiciones farmacéuticas que comprenden un polinucleótido que codifica un anticuerpo anti-SOST y/o agente modulador (de tal forma que el polipéptido y/o agente modulador se genera en su sitio), el polinucleótido puede presentarse dentro de cualquiera de una variedad de sistemas de suministro conocidos por aquellos expertos en la materia, incluyendo ácido nucleido y sistemas de expresión bacteriana, viral y mamífera. Las técnicas para incorporar el ADN en tales sistemas de expresión se conocen bien por aquellos expertos en la materia. El ADN también puede ser "natural", según se describe, por ejemplo, en Ulmer eí al. , Science 259: 1745-1749, 1993 y revisarse por Cohén, Science 259: 1691 -1692, 1993. La toma de ADN natural puede aumentarse al revestir el ADN en perlas biodegradables, que se transportan eficazmente en las células. El desarrollo de regímenes de tratamiento y dosificación adecuados para utilizar las composiciones particulares descritas en la presente en una variedad de regímenes de tratamiento, incluyendo, por ejemplo, administración y formulación oral, parenteral, intravenosa, intranasal e intramuscular, se conoce bien en la materia, algunos de los cuales se discuten abajo a detalle para propósitos generales de ilustración. En ciertas solicitudes, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden suministrarse por medio de administración oral a un animal. Como tales, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o pueden encerrarse en cápsula de gelatina de corteza dura o suave, o pueden comprimirse en tabletas, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta. En ciertas circunstancias será deseable suministrar las composiciones farmacéuticas descritas en la presente parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente o aún intraperitonealmente. Tales procedimientos se conocen bien por aquel experto en la materia, algunos de los cuales se describen además, por ejemplo, en Patente de EE. UU. No. 5,543, 158; Patente de EE. UU. No. 5,641 ,515 y Patente de EE. UU. No. 5,399,363. En ciertas modalidades, las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua adecuadamente mezclada con un agente tensoactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones pueden también prepararse en glicerol, polietilénglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones generalmente contendrán un conservador para prevenir el crecimiento de microorganismos. Las formas farmacéuticas ilustrativas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (por ejemplo, véase, Patente de EE. UU. No. 5,466,468). En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida al grado que exista facilidad para inyectar. Deber ser estable bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un medio de dispersión o solvente que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y lo similar), mezclas adecuadas del mismo, y/o aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerida en el caso de dispersión y/o por el uso de agentes tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede facilitarse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y lo similar. En varios casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables pueden traerse aproximadamente por el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. En una modalidad, para la administración parenteral en una solución acuosa, la solución deberá regularse adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido primero convertirse en isotónico con suficiente salina o glucosa. Esas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En este caso, un medio acuoso estéril que puede emplearse se conocerá por aquellos expertos en la materia a luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosis puede disolverse en 1 ml de solución de NaCI isotónico y después agregarse a 1000 ml de fluido hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión, (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed. , pp. 1035-1038 and 1570-1580). Alguna variación en dosificación se presentará dependiendo de la condición del sujeto a tratar. Además, para la administración humana, las preparaciones por supuesto cumplirán los estándares de esterilidad, pirogenicidad, y la seguridad y pureza general según se requiera por los estándares de la Oficina de Biología FDA. En otra modalidad de la invención, las composiciones descritas en la presente pueden formularse en una forma de sal o neutral. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición acidas (formadas con grupos de amino libre de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos fosfóricos o hidroclóricos, o tales ácidos orgánicos tales como acéticos, oxálicos, tartáricos, mandélicos, y lo similar. Las sales formadas con los grupo carboxilo libre pueden también derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o férrico, y tales bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y lo similar. En la formulación, las soluciones se administrarán en una manera compatible con la formulación de dosificación y en tal cantidad a medida que es terapéuticamente eficaz. Los vehículos pueden además comprender cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, vehículos, revestimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardadores de absorción e isotónicos, reguladores, soluciones de vehículo, suspensiones, coloides, y lo similar. El uso de tales medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas se conoce bien en la materia. Excepto hasta ahora a medida que cualquier medio convencional o agente es compatible con el ingrediente activo, su uso en las composiciones terapéuticas se contempla. Los ingredientes activos complementarios también pueden incorporarse en las composiciones. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción desfarovable similar o alérgica cuando se administran a un humano. En ciertas modalidades, los liposomas, nanocápsulas, micropartículas, partículas lípidas, vesículas, y lo similar, se utilizan para la introducción de las composiciones de la presente invención en organismos/células huésped adecuados. En particular, las composiciones de la presente invención pueden formularse para suministro ya sea encapsularse en una partícula lípida, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, o una nanopartícula o lo similar. Alternativamente, las composiciones de la presente invención pueden unirse, ya sea covalente o no covalentemente, a la superficie de tales vehículos portadores. La formación y uso de liposoma y preparaciones tipo liposoma como vehículos de fármaco potenciales se conoce generalmente por aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Lasic, Trends Biotechnol. 76(7):307-21 , 1998; Takakura, Nippon Rinsho 56(3):691 -95, 1998; Chandran eí al. , Indian J. Exp. Biol. 35(8):801 -09, 1997; Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 72(2-3):233-61 , 1 995; Patente de EE. UU. No. 5,567,434; Patente de EE. UU. No. 5,552, 157; Patente de EE. UU. No. 5,565,213; Patente de EE.UU. No. 5,738,868 y Patente de EE. UU. No. 5,795,587, cada una específicamente incorporada en la presente para referencia en su totalidad). Los liposomas se han utilizado exitosamente con un número de tipos de célula que son normalmente difíciles de transfectar por otros procedimientos, incluyendo suspensiones de célula T, cultivos de hepatocito primario y células PC12 ( (Renneisen eí al. , J. Biol. Chem. 265(27) : 16337 -42, 1990; Muller eí al. , DNA Cell Biol. 9(3):221 -29, 1990). Además, los liposomas se encuentran libres de constricciones de longitud de ADN que son típicas de sistemas de suministro con base viral. Los liposomas se han utilizado eficazmente para introducir los genes, diversos fármacos, agentes radioterapéuticos, enzimas, virus, factores de transcripción, efectores alostéricos y lo similar, en una variedad de estirpes de célula cultivadas y animales. Además, el uso de liposomas no parece que se asocie con respuestas autoinmunes o toxicidad inaceptable después del suministro sistémico. En ciertas modalidades, los liposomas se forman de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y espontáneamente forman vesículas de bicapa concéntricas multi-laminales (también denominadas vesículas multi-laminales (MLVs)). Alternativamente, en otras modalidades, la invención se proporciona para formulaciones de nanocápsula farmacéuticamente aceptables de las composiciones de la presente invención. Las nanocápsulas pueden comprender generalmente compuestos en una manera reproducible y estable (véase, por ejemplo, Quintanar-Guerrero eí al. , Drug Dev. Ind. Pharm. 24(12): 1 1 13-28, 1998). Para evitar efectos secundarios debido a la sobre carga polimérica intracelular, tales partículas ultrafinas (denominadas aproximadamente 0.1 µm) pueden diseñarse utilizando polímeros capaces de degradarse in vivo. Tales partículas pueden elaborarse según se describe, por ejemplo, por Couvreur eí al. , Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5(1 ): 1 -20, 1988; zur Muhlen eí al. , Eur. J. Pharm. Biopharm. 45(2): 149-55, 1998; Zambaux eí al. , J. Controlled Reléase 50(1 -3):31 -40, 1998; and Patente de EE.UU. No. 5, 145,684. Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden colocarse dentro de contenedores, junto con material de envasado que proporciona instrucciones respecto al uso de tales composiciones farmacéuticas. Generalmente, tales instrucciones incluirán una expresión tangible que describe la concentración de reactivo, así como también dentro de ciertas modalidades, cantidades relativas de ingredientes de excipiente o diluyentes (por ejemplo, agua, salina o PBS) que pueden ser necesarias para reconstituir la composición farmacéutica.

MÉTODOS DE TRATAMI ENTO La presente invención también proporciona métodos para aumentar el contenido mineral y la densidad mineral del hueso. En resumen, numerosas condiciones dan como resultado la pérdida de contenido mineral óseo, incluyendo, por ejemplo, enfermedad, predisposición genética, accidentes que dan como resultado la falta de uso del hueso (por ejemplo, debido a la fractura), terapéuticos que efectúan la resorción del hueso o que matan las células formadoras de hueso y envejecimiento normal. A través del uso de las moléculas descritas en la presente que inhiben la unión de la proteína de unión TGF-beta a un miembro de familia TGF-beta, tales condiciones pueden tratarse o prevenirse. Según se utiliza en la presente, ese contenido mineral óseo se entiende que ha aumentado si el contenido mineral óseo ha aumentado en una manera estadísticamente importante en un sitio seleccionado. Una amplia variedad de condiciones que dan como resultado la pérdida de contenido mineral óseo pueden tratarse con las moléculas descritas en la presente. Los pacientes con tales condiciones pueden identificarse a través del diagnóstico clínico utilizando técnicas bien conocidas (véase, por ejemplo, Harrison's Principies of Infernal Medicine, McGraw-Hill, Inc.). Los ejemplos representativos de enfermedades que pueden tratarse incluyeron displasias, en donde el crecimiento o desarrollo de hueso es anormal. Los ejemplos representativos de tales condiciones incluyen acondroplasia, disostosis cleidocraneales, encondromatosis, displasia fibrosa, Enfermedad Gaucher, raquitis hipofosfatémica, síndrome Marfan, exotosis hereditaria múltiple, neurofibromatosis, imperfecta osteogenesis, osteopetrosis, osteopoiquilosis, lesiones escleróticas, fracturas, enfermedad periodontal, pseudoartrosis, y osteomielitis piogénicas. Otras condiciones que pueden tratarse o prevenirse incluyen una amplia variedad de causas de osteopenia (es decir, una condición que origina más de una desviación estándar de contenido mineral óseo o densidad abajo del contenido mineral esquelético máximo en juventud). Los ejemplos representativos de tales condiciones incluyen estados anémicos, condiciones originadas por esteroides, condiciones originadas por heparina, desórdenes de médula ósea, escorbuto, desnutrición, deficiencia de calcio, osteoporosis idiopática, osteopenia congenital u osteoporosis, alcoholismo, enfermedad renal crónica, senilidad, estado post-menopáusico, oligomenorrea, amenorrea, embarazo, diabetes mellitus, hipertiroidismo, enfermedad Cushing, acromegalia, hipogonadismo, inmovilización o mal uso, síndrome de distrofia simpatética de reflejo, osteoporosis regional transitoria, y osteomalacia. Dentro de una modalidad de la presente invención, el contenido mineral óseo o densidad puede aumentarse al administrar a un animal de sangre caliente una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula que inhibe un polipéptido SOST de unirse a un miembro de familia TGF-beta. Los ejemplos de animales de sangre caliente que pueden tratarse incluyen tanto vertebrados como mamíferos, incluyendo por ejemplo, humanos, caballos, vacas, cerdos, ovejas, perros, gatos, ratas, y ratones. Los ejemplos representativos de moléculas terapéuticas incluyen ribozimas, genes de ribozima, oligonucleótidos anti-sentido, y anticuerpos según se describe en la presente. Dentro de otras modalidades de la presente invención, se proporcionan métodos para aumentar la densidad ósea que comprenden las etapas de introducir células que se alojan en hueso, un vector que dirige la expresión de una molécula que inhibe la unión de SOST a un miembro de la familia TGF-beta, y administrar el vector que contiene las células a un animal de sangre caliente. En resumen, las células que se alojan en hueso pueden obtenerse directamente del hueso de pacientes (por ejemplo, células obtenidas de la médula ósea tal como CD34+, osteoblastos, osteocitos, y lo similar), de sangre periférica, o de cultivos. Los ejemplos representativos de vectores adecuados incluyen vectores virales tales como vectores de herpes viral (por ejemplo, Patente de EE. UU. No. 5,288,641 ); adenoviral vectors (por ejemplo, WO 94/26914, WO 93/91 91 ; Kolls eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97(1 ):215-219, 1994; Kass-Eisler eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90(24): 1 1498-502, 1993; Guzman eí al. , Circulation 88(6):2838-48, 1993; Guzman eí al. , Cir. Res. 73(6):1202-1207, 1993; Zabner eí al. , Cell 75(2):207-216, 1993; Li eí al. , Hum. Gene Ther. 4(4):403-409, 1993; Caillaud eí al. , Eur. J. Neurosci. 5(10: 1287-1291 , 1993; Vincent eí al. , Nat. Genet. 5(2): 130-134, 1993; Jaffe eí al. , Nat. Genet. 7(5):372-378, 1 992; and Levrero eí al. , Gene 707(2): 195-202, 1 991 ); vectores virales adeno-asociados (WO 95/13365; Flotte eí al. , PNAS 90(22): 10613-10617, 1993); vectores baculovirus; vectores parvovirus (Koering eí al. , Hum. Gene Therap. 5:457-463, 1994); vectores de virus sífilis (Panicali y Paoletti, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79:4927-4931 , 1982; y Ozaki eí al. , Biochem. Biophys. Res. Comm. 193(2):653-660, 1993), y retrovirus (por ejemplo, EP 0,41 5,731 ; WO 90/07936; WO 91 /0285, WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; Patente de EE.UU. No. 5,219,740; WO 93/1 1230; WO 93/1 0218). De igual forma pueden construirse vectores virales que contienen una mezcla de diferentes elementos (por ejemplo, promotores, secuencias de cubierta, y lo similar) de diferentes virus o de fuentes no virales. Dentro de varias modalidades, ya sea el vector viral por sí mismo, o una partícula viral que contiene el vector viral pueden utilizarse en los métodos y composiciones abajo descritas. Dentro de otras modalidades de la invención, las moléculas de ácido nucleico que codifican una molécula que inhibe la unión de un polipéptido SOST a un miembro de la familia TGF-beta por sí mismos, pueden administrarse por una variedad de técnicas incluyendo, por ejemplo, (Cristano eí al. , PNAS 92122-92126, 1 993); ADN unido a adenovirus eliminado (Curiel eí al. , Hum. Gene Ther. 3(2): 147-154, 1992); introducción mediada por citofectina (DMRIE-DOPE, Vical, California); inyección de ADN directa (Acsadi eí al. , Nature 352:815-81 8, 1991 ); ligante ADN (Wu eí al. , J. of Biol. Chem. 264: 16985-16987, 1989); lipofección (Felgner eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989); liposomas (Pickering eí al. , Circ. 89(1 ): 13-21 , 1 994; y Wang eí al. , PNAS 84:7851 -7855, 1987); bombardeo de microproyectil (Williams eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:2726-2730, 1991 ); y suministro directo de ácidos nucleicos que codifican la proteína por sí misma ya sea solos (Vile and Hart, Cáncer Res. 53: 3860-3864, 1 993), o utilizando complejos de PEG-ácido nucleico.

La determinación de contenido mineral óseo aumentado puede determinarse directamente a través del uso de rayos X (por ejemplo, Absorptometría de rayos X de Energía Dual o "DEXA") o por interferencia a través de los marcadores de cambio óseo tal como fosfatasa alcalina específica de osteoblasto, osteocalcina, propéptido de procolágeno C tipo 1 (PICP), y fosfatasa alcalina total (véase Comier, Curr. Opin. in Rheu. 7:243 (1 995)), o por marcadores de resorción ósea incluyen, pero no limitándose a, piridinolina, deoxipiridinolina, N-telopéptido, hidroxiprolina urinaria, fosfatasas de ácido resistente a tartrato de plasma, y galactosilil hidroxilisina (véase Comier, id.). La cantidad de masa ósea puede también calcularse de pesos corporales o a utilizarse otros métodos (véase Guinness-Hey, Metab. Bone Dis. Relat. Res. 5: 177-181 , 1984). Según será evidente por un experto en la materia, la cantidad y frecuencia de administración dependerá, por supuesto, de tales factores tales como la naturaleza y severidad de la indicación que se trata, la respuesta deseada, la condición del paciente, y así sucesivamente. Típicamente, las composiciones pueden administrarse por una variedad de técnicas, según se señala anteriormente. Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración, y no a manera de limitación.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 MOLDEO DE REGIÓN DE NÚCLEO DE ESCLEROSTINA Las técnicas de reconocimiento por homología (por ejemplo, PSI-BLAST (Altschul eí al. , Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997)), FUGUE (Shi eí al. , J. Mol. Biol. 310:243-57 (2001 )) sugirió que la región de núcleo de SOST (SOST_Núcleo) adopta un pliegue de nudo de cistina. FUGUE es un método sensible para detectar la homología entre secuencias y estructuras. La Gonadotropina ß Coriónica Human (hCG-ß), para la cual se conoce una estructura 3D experimentalmente determinada, se identificó por FUGUE (Shi eí al. , supra) como el homólogo más cercano de SOST_Núcleo. Por lo tanto, hCG-ß se utilizó como el templado estructural para construir modelos 3D para SOST_Núcleo. Una alineación de SOST_Núcleo y sus homólogos más cercanos se muestra en la Figura 1 . Entre los homólogos mostrados en la alineación, solamente hCG-ß (CGHB) tuvo estructura 3D conocida. La identidad de secuencia entre SOST_Núcleo and hCG-ß fue aproximadamente 25%. Ocho residuos CYS se conservaron a través de la familia, enfatizando la similitud estructural global entre SOST_NúcIeo and hCG-ß. Tres pares de cistinas (1 -5, 3-7, 4-8) formaron enlaces de disulfuro (mostrados con líneas sólidas en la Figura 1 ) en una configuración de "nudo", que es característica para el pliegue de nudo de cistína. Un enlace de disulfuro extra (2-6), mostrado como una línea con puntos en la Figura 1 , fue único para esta familia y se distingue de la familia de proteínas de otras familias de nudo de cistina (por ejemplo, TGF-ß, BMP). SOST_Núcleo se moldeó utilizando PDB (Berman eí al. , Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 58(Pt 6 Pt1 ):899-907 (2002)) entrada 1 HCN, la estructura 3D de hCG-ß (Wu eí al. , Structure 2:545-58 (1994)), como el templado estructural. Los modelos se calcularon con MODELER (Sali & Blundell, J. Mol. Biol. 234:779-815 (1993)). Una instantánea del mejor modelo se muestra en la Figura 2. La mayoría de las proteínas de nudo de cistina forman dímeros debido a la falta de núcleo hidrofóbico en un monómero (Scheufler eí al. , supra; Schlunegger and Grutter, J. Mol. Biol. 231 :445-58 (1993)); Wu eí al. , supra). SOST probablemente sigue la misma regla y forma un homodímero para aumentar su estabilidad. La construcción de un modelo para la región SOST_Núcleo dimerizada presentó varios cambios debido a que (1 ) la similitud de secuencia entre SOST_NúcIeo y hCG-ß fue baja (25%); (2) en lugar de un homodímero, hCG-ß formó un heterodímero con hCG-a; y (3) un número de diferentes conformaciones relativas de monómeros se ha observado en proteínas de nudo de cistina dimerizada de diferentes familias (por ejemplo, PDGF, TGF-ß, Neurotrofina, I L-17F, Gonadotropina), que sugirió que la conformación de dímero de SOST podría desviar significativamente de la conformación de heterodímero hCG-a/ß. En construcción del modelo, hCG-a se reemplazó con hCG-ß de la estructura de heterodímero (1 HCN) utilizando técnicas de súper imposición de estructura combinadas con ajuste manual, y después un modelo de homodímero SOST_Núcleo se construyó de acuerdo a la estructura de homodímero hCG-ß pseudo. El modelo final se muestra en la Figura 3.

EJEMPLO 2 MOLDEO DE I NTERACCIÓN DE SOST-BMP Este ejemplo describe el moldeo de proteína de sitios de unión de receptor tipo I y tipo II en BMP que se incluyen con interacción entre BMP y SOST. Los estudios de competencia demostraron que SOST compitió tanto con receptores tipo I como tipo I I para unirse a BMP. En un ensayo de competencia basado en ELISA, BMP-6 selectivamente interactuó con la superficie revestida de esclerostina (300 ng/cavidad) con alta afinidad (K = 3.4 nM). Al aumentar las cantidades de receptor IA BMP (construcción de fusión FC) compitió con esclerostina para unirse a BMP-6 (1 1 nM) (IC50 = 1 14 nM). Un exceso molar de 1 0 pliegues del receptor BMP fue suficiente para reducir la unión de esclerostina a BMP-6 por aproximadamente 50%. Esta competencia también se observó con una proteína de fusión FC de receptor II BMP (IC50=36 nM) y DAN (IC50=43 nM). La especificidad del ensayo se mostró por la falta de competencia para la unión a BMP-6 entre esclerostina y una proteína de fusión R1 B-FC Activina, un miembro de familia de receptor TGF-ß que no unión BMP. Los sitios de unión de receptor tipo I y tipo I I en un polipéptido BMP se han mapeado y se separado espacialmente (Scheufler eí al. , supra; Innis eí al. , supra; Nickel eí al. , supra; Hart eí al. supra). Noggin, otro antagonista BMP que se une a BMP con alta afinidad, contacta BMP en sitios de unión de receptor tanto tipo I como tipo I I por medio de la parte de N-terminal de Noggin (Groppe, eí al. , supra). Los dos ß-filamentos en la región de núcleo cerca de C-terminal también contactan BMP en el sitio de unión de receptor tipo II . Una alineación manualmente sintonizada de Noggin y SOST indicó que los dos polipéptidos compartieron la similitud de secuencia entre las partes de N-terminal de las proteínas y entre las regiones de núcleo. Una alineación de secuencia de aminoácido se presenta en la Figura 4. Los residuos de cisteína que forman el cys-nudo característico se conservaron entre Noggin y SOST. La identidad de secuencia global fue 24%, y la identidad de secuencia dentro de la región de unión N-terminal (posiciones de alineación 1 -45) fue 33%. Dos residuos en la región de unión de N-terminal Noggin, principalmente Leu (L) en posición de alineación 21 y Glu (E) en la posición 23, se reportó que juegan papeles importantes en la unión de BMP (Groppe, eí al., supra). Ambos residuos se conservaron en SOST así también. La similitud de secuencia dentro de la región de núcleo (posiciones de alineación 131 -228) fue de aproximadamente 20%, pero el andamio de cys-nudo se mantuvo y un número suficiente de residuos clave se conservó, soportando la homología entre Noggin y SOST.

La estructura Noggin se comparó a SOST también para entenderse cómo dos monómeros SOST se dimerizan. Según se muestra en la Figura 5, la estructura Noggin sugirió que el enlazador entre la región de N-terminal y la región de núcleo no solamente jugaron un papel en relación con las dos regiones, sino también formaron parte de la interfase de dimerización entre dos monómeros Noggin. Una diferencia principal entre Noggin y SOST fue que el enlazador entre la región de N-terminal y la región de núcleo era mucho más corta en SOST. La región de C-terminal de SOST puede jugar un papel en dimerización de SOST. La secuencia de Noggin terminó con la región de núcleo, mientras que SOST tuvo una región de C-terminal extra. En la estructura de Noggin un enlace de disulfuro conectado a la C-terminal de dos monómeros Noggin. De esta manera, la región de C-terminal de SOST comenzó cerca de la interfase de los dos monómeros y podría contribuir a la dimerización. Además, la predicción de estructura secundaria muestra que algunas partes de la región de C-terminal de SOST tuvo una tendencia para formar hélices. Esta región en SOST puede ser responsable de la actividad de dimerización, posiblemente a través del envasado hélice-hélice, que imitó la función del enlazador más largo en Noggin. Otra diferencia entre la estructura de Noggin y SOST fue la inserción de aminoácido en la región de núcleo SOST en posiciones de alineación 169-185, (véase Figura 4). Esta inserción extendió una horquilla ß, la cual se señaló hacia la interfase de dimerización en la estructura Noggin (mostrada en la Figura 5 como una región de ciclo en la parte media de los monómeros y arriba del residuo Cys de C-terminal). Esta ß-horquilla alargada también podría contribuir a la dimerización SOST.

EJEMPLO 3 DISEÑO Y PREPARACIÓN DE INMUNÓGENOS DE PÉPTI DO SOST Este Ejemplo describe el diseño de inmunógenos de péptido SOST que se utilizan para inmunizar animales y generar anticuerpos que bloquean interacciones entre BMP y SOST y previenen la formación de dímero de monómeros SOST.

Fragmentos de Unión BMP La similitud global entre SOST y Noggin y la similitud entre las regiones de N-terminal de los dos polipéptidos sugieren que SOST puede interactuar con BMP en una manera similar a Noggin. Es decir, la región de N-terminal de SOST puede interactuar tanto con los sitios de unión de receptor tipo I como tipo II, y una parte de la región de núcleo (posiciones de alineación de aminoácido 190-220) en Figura 4) puede interactuar con el sitio de unión de receptor tipo l l de tal forma que los anticuerpos específicos para estas regiones SOST pueden bloquear o deteriorar la unión de BMP a SOST. Las secuencias de aminoácido de estos fragmentos de polipéptido SOST para SOST de rata y humano se proporcionan como sigue.

SOST_N_Enlazador: La región de N-terminal (incluye el enlazador corto que conecta a la región de núcleo). Humano: QGWQAFKNDATEIIPELGEYPEPPPELE NNKTMNRAENGGRPPHHPFETKD VSEYS (SEQ ID NO:47) Rata: QGWQAFKNDATEI IPGLREYPEPPQELEN NQTMNRAENGGRPPHHPYDTKDVSEYS (SEQ ID NO:48) SOST_Núcleo_Unión: Parte de la región de núcleo que es probablemente que contacte BMP a su sitio de unión de receptor tipo I I (ligeramente extendido en ambas terminales para incluir anclas de residuo CYS): Humano: CIPDRYRAQRVQLLCPGGEAPRARKVRLVASC (SEQ ID NO:49) Rata: CIPDRYRAQRVQLLCPGGAAPRSRKVRLVASC (SEQ ID NO:50) Fragmentos de Dimerización SOST La región de C-terminal de SOST es probablemente que se incluya en la formación de homodímeros SOST (véase Ejemplo 2). La ß-horquilla alargada también puede jugar un papel en formación de homodímero. Los anticuerpos que se unen específicamente a tales regiones pueden prevenir o deteriorar la dimerización de monómeros SOST, que pueden a su vez interferir con interacción entre SOST y BMP. SOST_C: la región de C-terminal Humano: LTRFHNQSELKDFGTEAARPQKGRKP RPRARSAKANQAELENAY (SEQ I D NO:51 ) Rata: LTRFHNQSELKDFGPETARPQKGRKPRP RARGAKANQAELENAY (SEQ ID NO:52) SOST_Núcleo_Dímero: Parte de la región de núcleo que se ¡ncluye probablemente en dimerización SOST (ligeramente extendido en ambas terminales para incluir los soportes de residuo Cys). Humano: CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ I D NO:53) Rata: CGPARLLPNAIGRVKWWRPNGPDFRC (SEQ ID NO:54) Fragmento de Unión BMP en N-terminal SOST La región de unión de N-terminal clave de SOST (posiciones de alineación 1 -35 en la Figura 4) se moldeó en la base de estructura de complejo Noggin/BMP-7 (Banco de Datos de Proteína Entrada No: 1 M4U) y la alineación de secuencia de aminoácido (véase Figura 4) para identificar residuos de aminoácido de la N-terminal SOST que interactúa probablemente con BMP. El modelo de SOST se presenta en la Figura 6. En el modelo comparativo, fenilalanina (Phe, F) en la posición de alineación 8 (véase flecha y texto acompañante) en la secuencia SOST se proyecta hacia una cavidad hidrofóbica en la superficie del dímero BMP. La misma característica "saliente-en-agujero" se ha observado en la BMP y la estructura de complejo de receptor tipo I (Nickel eí al. , supra), en donde Phe85 del receptor se ajusta en la misma cavidad, la cual es una característica clave en el reconocimiento de receptor ligante-tipo I para miembros de la súper familia TGF-ß (incluyendo, por ejemplo, familia TGF-ß, familia BMP, y lo similar). De acuerdo al modelo, un cambio dirigido por prolina (Pro) también se conserva, el cual permite al fragmento de unión de N-terminal roscarse alrededor de la superficie de dímero BMP, viajando desde el sitio de unión de receptor tipo I al sitio de unión de receptor tipo II en el otro sitio del complejo. También se conserva otro cambio dirigido por Pro cerca del extremo carboxi del fragmento de unión, el cual se conecta así a la región enlazadora. Los contactos extensivos entre SOST y BMP son evidentes en la Figura 6.

Inmunógenos de Péptido Los péptidos se diseñaron para comprender la región de N-terminal SOST pronosticó hacer contacto con las proteínas BMP. Las secuencias de péptido se presentan abajo. Para inmunizar animales, las secuencias de péptido se diseñaron para recubrirse, y una cisteína adicional se agregó al extremo de C-terminal para facilitar la degradación a KLH. Los péptidos se utilizaron así para inmunización. Las secuencias de péptido de los inmunógenos son como sigue: SOST Humano: QGWQAFKNDATEHPELGEY (SEQ ID NO:2) TEIIPELGEYPEPPPELENN (SEQ ID NO:3) PEPPPELENNKTMNRAENGG (SEQ ID NO:4) KTMNRAENGGRPPHHPFETK (SEQ ID NO:5) RPPHHPFETKDVSEYS (SEQ ID NO:6) Péptidos SOST humano con Cys Adicional: QGWQAFKNDATEIIPELGEY-C (SEQ ID NO:7) TEIIPELGEYPEPPPELENN-C (SEQ ID NO:8) PEPPPELENNKTMNRAENGG-C (SEQ ID NO:9) KTMNRAENGGRPPHHPFETK-C (SEQ ID NO:10) RPPHHPFETKDVSEYS-C (SEQ ID NO:11) SOST de Rata: QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPP (SEQ ID NO:12) PEPPQELENNQTMNRAENGG (SEQ ID NO:13) ENGGRPPHHPYDTKDVSEYS (SEQ ID NO:14) TEIIPGLREYPEPPQELENN (SEQ ID NO:15) Péptidos SOST de rata con Cys Adicional: QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPP-C (SEQ ID NO:16) PEPPQELENNQTMNRAENGG-C (SEQ ID NO:17) ENGGRPPHHPYDTKDVSEYS-C (SEQ ID NO:18) TEI IPGLREYPEPPQELENN-C (SEQ I D NO: 19) Los siguientes péptidos se diseñaron para contener parte de región de núcleo que se pronosticó que hiciera contacto con las proteínas BMP. La cisteína se agregó al extremo de C-terminal de cada péptido para conjugación a KLH, y los péptidos conjugados se utilizaron para inmunización. En el Péptido de N-terminal de Núcleo de Ensamblaje una cisteína interna se cambió a una serina para evitar la doble conjugación a KLH. Para SOST Humano: Secuencia de aminoácido sin residuos Cys agregados: Ensamblaje_Núcleo_N-terminal_Péptido: IPDRYRAQRVQLLCPGGEAP (SEQ I D NO:21 ) Ensamblaje_Núcleo_Cterm_Péptido: QLLCPGGEAPRARKVRLVAS (SEQ ID NO:22) EnsambIaje_Núcleo_N-term_Péptido: IPDRYRAQRVQLLCPGGEAP-C (SEQ ID NO:23) Ensamblaje_NúcIeo_Cterm_Péptido: QLLCPGGEAPRARKVRLVAS-C (SEQ ID NO:24) Para SOST de Rata: Secuencia de aminoácido sin residuos Cys agregados o sustituidos: Ensamblaje_Núcleo_N-terminal_Péptido: I PDRYRAQRVQLLCPGG (SEQ ID NO:25) Ensamblaje_Núcleo_C-term_Péptido: PGGAAPRSRKVRLVAS (SEQ I D NO:26) Inmunógenos de Péptido con Cys agregados y sustituidos: Ensamblaje_Núcleo_N-terminal_Péptido: IPDRYRAQRVQLLSPGG-C (SEQ ID NO:27) Ensamblaje_Núcleo_Cterm_Pépt¡do: PGGAAPRSRKVRLVAS-C (SEQ ID NO:28) Dos regiones dentro de SOST que interactúan potencialmente para formar homodímeros SOST incluyen los aminoácidos con la región de núcleo SOST que no se presentan en Noggin. Los péptidos SOST de humano se diseñaron para contener esta secuencia, tuvieron una Cys de C-terminal o N-terminal que se conjugó a KLH. Para el péptido de SOST de rata, una cisteína se agregó a la terminal carboxi de la secuencia (SEQ I D no:31 ). Los péptidos conjugados por KLH se utilizaron para inmunización. Para SOST de humano: CGPARLLPNAIGRGKWWRPS (SEQ ID NO:29) IGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID NO:30) Para SOST de rata: PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO:31 ) Péptido SOST de rata con cisteína agregada PNAIGRVKWWRPNGPDFR-C (SEQ I D NO:32) La segunda región dentro de SOST que interactúa potencialmente para formar homodímeros SOST incluye la región C-terminal. Los inmunógenos de péptido se diseñaron para incluir las secuencias de aminoácido dentro de esta región (véase abajo). Para conjugación a KLH, un residuo de cisteína se agregó al extremo C-terminal, y los péptidos conjugados se utilizaron para inmunización.

Para SOST Humano: KRLTRFHNQS ELKDFGTEAA (SEQ ID NO:33) ELKDFGTEAA RPQKGRKPRP (SEQ ID NO:34) RPQKGRKPRP RARSAKANQA (SEQ I D NO:35) RARSAKANQA ELENAY (SEQ I D NO:36) Inmunógenos de péptido con Cys agregada en C-terminal: KRLTRFHNQS ELKDFGTEAA-C (SEQ ID NO:37) ELKDFGTEAA RPQKGRKPRP-C (SEQ ID NO:38) RPQKGRKPRP RARSAKANQA-C (SEQ I D NO:39) RARSAKANQA ELENAY-C (SEQ I D NO:40) Para SOST de rata: KRLTRFHNQSELKDFGPETARPQ (SEQ ID NO:41 ) KGRKPRPRARGAKANQAELENAY (SEQ I D NO:42) SELKDFGPETARPQKGRKPRPRAR (SEQ ID NO:43) Inmunógenos de péptido con Cys agregado en C-terminal: KRLTRFHNQSELKDFGPETARPQ-C (SEQ ID NO:44) KGRKPRPRARGAKANQAELENAY-C (SEQ I D NO:45) SELKDFGPETARPQKGRKPRPRAR-C (SEQ ID NO:46) EJEMPLO 4 ENSAYO PARA DETECTAR LA UNIÓN DE ANTICUERPOS A UNA PROTEÍNA DE UNIÓN TGF-BETA Este ejemplo describe un ensayo para detectar la unión de un ligante, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo, a esclerostina. Una proteína de fusión FLAG®-esclerostina se preparó de acuerdo a los protocolos proporcionados por el fabricante (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y según se describe en Patente de EE.UU. No. 6,395,51 1 . Cada cavidad de una placa de microconcentración de 96 cavidades se reviste con anticuerpo monoclonal anti-FLAG® (Sigma Aldrich) y después se bloquea con 10% de BSA en PBS. La proteína de fusión (20 ng) se agrega a 100 µl de PBS/0.2% de BSA y se absorba en la placa de 96 cavidades por 60 minutos a temperatura ambiente. Esta solución de proteína se remueve y las cavidades se lavan para remover la proteína de fusión no unida. Una BMP, por ejemplo, BMP-4, BMP-5, BMP-6, o BMP-7, se diluye en PBS/0.2% BSA y se agrega a cada cavidad en concentraciones que varían de 10 pM a 500 nM. Después de una incubación por 2 horas a temperatura ambiente, la solución de unión se remueve y la placa se lava tres veces con 200 µl de volúmenes de PBS/0.2% BSA. La unión de la BMP a esclerostina se detecta utilizando el antisuero policlonal o anticuerpo monoclonal específico para la BMP y un reactivo de segunda etapa de enzima conjugada por enzima adecuada de acuerdo a las técnicas ELISA estándar, (véase, por ejemplo, Ausubel eí al. , Current Protocols in Mol Biol. Vol 2 1 1 .2.1 -1 1 .2.22 (1 998)). La unión específica se calcula al restar la unión no específica de la unión total y se analiza utilizando el programa LIGAND (Munson and Podbard, Anal. Biochem. 107:220-39 (1980)). La unión de esclerostina a una BMP también se detecta por detección de fluorescencia por tiempo homogéneo (Mellor eí al. , J Biomol. Screening, 3:91 -99 (1998)). Una secuencia de polinucleótido que codifica esclerostina se une operativamente a una región constante de inmunoglobulina humana en una construcción de ácido nucleico recombinante y se expresó como una proteína de fusión de Fe humano-esclerostina de acuerdo a los métodos conocidos en la materia y descritos en la presente. De igual forma, un ligante BMP se elabora y se expresa como una proteína de fusión Fe de BMP-ratón. Estas dos proteínas de fusión se incuban juntas y el ensayo conducido según se describe por Mellor eí al.

EJEMPLO 5 ENSAYO DE SELECCIÓN PARA ANTICUERPOS QUE INHIBEN LA UNIÓN DE MI EMBROS DE FAMILIA DE TGF-BETA PARA PROTEÍNA DE UNIÓN TGF-BETA Este ejemplo describe un método para detectar un anticuerpo que inhibe la unión de un miembro de la familia TGF-beta a esclerostina. Una ELISA se realiza esencialmente según se describe en el Ejemplo 4 excepto que la concentración de BMP se mantiene fija en su Kd (determinada, por ejemplo, por análisis BIAcore). Además, un anticuerpo o una biblioteca o colección de anticuerpos se agrega a las cavidades a una concentración de 1 µM. Los anticuerpos se incuban por 2 horas a temperatura ambiente con la BMP y esclerostina, la solución se remueve, y la BMP unida se cuantifica según se describe (véase Ejemplo 4). Los anticuerpos que inhiben 40% de la unión de BMP observada en la ausencia de anticuerpo se consideran antagonistas de esta interacción. Estos anticuerpos se evalúan además como inhibidores potenciales al realizar estudios de concentración para determinar sus constantes de inhibición y su efecto en afinidad de proteína de unión TGF-beta. Los ensayos de control de especificidad comparable también pueden conducirse para establecer el perfil de selectividad para el antagonista identificado utilizando ensayos dependientes de la acción de ligante BMP (por ejemplo, un estudio de competencia de receptor BMP/BMP).

EJEMPLO 6 INHIBICIÓN DE UBICACIÓN DE PROTEÍNA DE UNIÓN TGF-BETA A AGLOMERANTE DE HUESO La evaluación de inhibición de ubicación a aglomerante de hueso (hidroxiapatita) se conduce utilizando modificaciones al método de Nicolás ( (Calcif. Tissue Int. 57:206-12 (1995)). En resumen, la proteína de unión TGF-beta 125l-marcada se prepara según se describe por Nicolás (supra). Hidroxiapatita se agrega a cada cavidad de una placa de microconcentración de 96 cavidades equipada con una membrana de filtración de polipropileno (Polyfiltronic, Weymouth MA). La proteína de unión TGF-beta diluida en 0.2% de albúmina en regulador PBS se agrega así a las cavidades. Las cavidades que contienen aglomerante se lavan 3 veces con 0.2% de albúmina en regulador PBS. La proteína de unión TGF-beta absorbida se eluye utilizando 0.3 M de NaOH y después se cuantifica. Un anticuerpo u otro agente que inhibe o deteriora la unión de la proteína de unión TGF-beta esclerostina a la hidroxiapatita se identifica al incubar la proteína de unión TGF-beta con el anticuerpo y aplicar la mezcla al aglomerante según se describe anteriormente. El aglomerante se lava 3 veces con 0.2% de albúmina en regulador PBS. La esclerostina absorbida se eluye con 0.3M de NaOH y después se cuantificó. Un anticuerpo que inhibe el nivel de unión de esclerostina a la hidroxiapatita por al menos 40% según se compara al nivel de unión observada en la ausencia de anticuerpo se considera un inhibidor de ubicación de hueso. Tal anticuerpo se caracteriza además en estudios de respuesta de dosis para determinar su constante de inhibición y su efecto en afinidad de unión de proteína de unión TGF-beta. De lo precedente, a pesar de que las modalidades específicas de la invención se han descrito en la presente para propósitos de ilustración, varias modificaciones pueden hacerse sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. De acuerdo con lo anterior, la invención no se limita excepto por las reivindicaciones anexas.

Claims (51)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido SOST, dicho polipéptído SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68 en donde el anticuerpo inhibe competitivamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso. NM_004329 (SEQ ID NO:71 ); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM_030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP_001 194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); y AAB33865 (SEQ ID NO:79), y en donde el sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo II de BMP comprendiendo la secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso U251 10 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81 ); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); y NM_001204 (SEQ ID NO:82).
2. 2. El anticuerpo, o fragmento de unión de antígeno del mismo, según la reivindicación 1 en donde el anticuerpo, o el fragmento de unión de antígeno del mismo, se une específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 12, 13, 14, 15, 21 , 22, 25, 26, 47, 48, 49, y 50.
3. 3. Un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que se produce al inmunizar un animal no humano con un péptido de al menos 20 aminoácidos y no más de 75 aminoácidos que comprende una SEQ ID NOs:2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 47, 48, 49, y 50.
4. 4. El anticuerpo, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, según la reivindicación 3 en donde el anticuerpo se une específicamente a un polipéptidoSOST, dicho polipéptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NOs: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68.
5. 5. El anticuerpo, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, según la reivindicación 4 en donde el anticuerpo inhibe competitivamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso NM_004329 (SEQ ID NO:71 ); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM_030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP_001 194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); y AAB33865 (SEQ ID NO:79), y en donde el sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo II de BMP comprendiendo la secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso U251 10 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81 ); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); y NMJ301204 (SEQ ID NO:82).
6. 6. Un anticuerpo, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que se produce al inmunizar un animal no humano con un péptido de al menos 20 aminoácidos y no más de 75 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 47, 48, 49, y 50 en donde el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido SOST, dicho polipéptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NOs: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, y en donde el anticuerpo inhibe completamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso NM_004329 (SEQ ID NO:71 ); D89675 (SEQ I D NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM_030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP_001 194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); y AAB33865 (SEQ I D NO:79), y en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I I de BMP comprendiendo la secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso U251 10 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81 ); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); y NM_001204 (SEQ ID NO:82).
7. 7. Un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido SOST y que deteriora la formación de un homodímero SOST, en donde el polipéptido SOST comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NOs: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68.
8. 8. El anticuerpo según la reivindicación 7 en donde el anticuerpo se une a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 29, 30, 31 , 33, 34, 35, 36, 41 , 42, 43, 51 , 52, 53, y 54.
9. 9. Un anticuerpo, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que se produce al inmunizar un animal no humano con un péptido de al menos 20 aminoácidos y no más de 75 aminoácidos comprendiendo una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 51 , 52, 53, y 54.
10. 10. El anticuerpo, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, según la reivindicación 9, en donde el anticuerpo, o el fragmento de unión de antígeno del mismo, se une específicamente a un polipéptido SOST que comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68.
11. 1 1 . El anticuerpo, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, según la reivindicación 10, en donde el anticuerpo, o el fragmento de unión de antígeno del mismo, deteriora la formación de un homodímero SOST.
12. 12. Un anticuerpo, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que se produce al inmunizar un animal no humano con un péptido de al menos 20 aminoácidos y no más de 75 aminoácidos comprendiendo una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 51 , 52, 53, y 54, en donde el anticuerpo, o el fragmento de unión de antígeno del mismo, se une específicamente a un polipéptido SOST que comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, y en donde el anticuerpo deteriora la formación de un homodímero SOST.
13. 13. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 -12, en donde el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
14. 14. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 -12, en donde eí anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
15. 15. El anticuerpo según la reivindicación 14 en donde el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo monoclonal de ratón, un anticuerpo monoclonal humano, un anticuerpo monoclonal de rata, y un anticuerpo monoclonal de hámster.
16. 16. Una célula de hibridoma que produce el anticuerpo según la reivindicación 14.
17. 17. Una célula huésped que es capaz de expresar el anticuerpo según la reivindicación 14.
18. 18. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 -12 en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.
19. 19. Una célula huésped que es capaz de expresar el anticuerpo según la reivindicación 18.
20. 20. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el fragmento de unión de antígeno se selecciona del grupo que consiste de F(ab')2, Fab', Fab, Fd, y Fv.
21. 21. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-12 que comprende un anticuerpo de cadena única.
22. 22. A célula huésped que es capaz de expresar el anticuerpo según la reivindicación 21.
23. 23. Una composición que comprende un anticuerpo, o fragmento de unión de antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 -12 y un vehículo fisiológicamente aceptable.
24. 24. Un inmunógeno que comprende un péptido comprendiendo 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , o 12 aminoácidos consecutivos de un polipéptido SOST, dicho polipéptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NOs: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido SOST y que inhibe completamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso NM_004329 (SEQ ID NO:71 ); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM_030849 (SEQ I D NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP_001 194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); y AAB33865 (SEQ ID NO:79), y en donde el sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo II de BMP comprendiendo la secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso U251 10 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81 ); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); y NM_001204 (SEQ ID NO:82).
25. 25. Un inmunógeno que comprende un péptido comprendiendo 21 aminoácidos consecutivos y no más de 50 aminoácidos consecutivos de un polipéptido SOST, dicho polipéptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NOs:1 , 20, 58, 60, 62, o 68, en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido SOST y que inhibe competitivamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso NM_004329 (SEQ ID NO:71 ); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM_030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP_001 194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); y AAB33865 (SEQ ID NO:79), y en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo ll de BMP comprendiendo la secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso U251 10 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81 ); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); y NM_001204 (SEQ ID NO:82).
26. 26. Un inmunógeno que comprende un péptido de al menos 20 aminoácidos y no más de 75 aminoácidos comprendiendo una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 47, 48, 49, y 50.
27. 27. El inmunógeno según la reivindicación 26 en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST, dicho polipéptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68.
28. 28. El inmunógeno según la reivindicación 27 en donde el anticuerpo inhibe completamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo l de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso NM_004329 (SEQ ID NO:71); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM_030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP_001 194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); y AAB33865 (SEQ ID NO:79), y en donde el sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP es capaz de unirse a un poiipéptido de Receptor Tipo I I de BMP comprendiendo la secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso U251 10 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81 ); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); y NM_001204 (SEQ I D NO:82).
29. 29. Un inmunógeno que comprende un péptido de al menos 20 aminoácidos y no más de 75 aminoácidos comprendiendo una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 47, 48, 49, y 50, en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST, dicho polipéptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, en donde el anticuerpo inhibe completamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP, en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso NM_004329 (SEQ ID NO:71 ); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM_030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP_001 194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); y AAB33865 (SEQ ID NO:79), y en donde el sitio de unión de Receptor Tipo I I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo II de BMP comprendiendo la secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso U251 10 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81 ); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); y NM_001204 (SEQ ID NO:82).
30. 30. Un inmunógeno que comprende un péptido de al menos 20 aminoácidos y no más de 75 aminoácidos comprendiendo una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 51 , 52, 53, y 54.
31. 31 . El inmunógeno según la reivindicación 30 en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST, dicho polipéptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68.
32. 32. El inmunógeno según la reivindicación 31 en donde el anticuerpo deteriora la formación de un homodímero SOST.
33. 33. Un inmunógeno que comprende un péptido de ai menos 20 aminoácidos y no más de 75 aminoácidos comprendiendo una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 51 , 52, 53, y 54, en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST, dicho polipéptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ I D NO: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, y en donde el anticuerpo deteriora la formación de un homodímero SOST.
34. 34. Un inmunógeno comprendiendo un péptido que comprende 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , o 12 aminoácidos consecutivos de un polipéptido SOST, dicho polipéptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido SOST y que deteriora la formación de un homodímero SOST.
35. 35. Un inmunógeno comprendiendo un péptido que comprende al menos 21 aminoácidos consecutivos y no más de 50 aminoácidos consecutivos de un polipéptido SOST, dicho polipéptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68, en donde el péptido es capaz de producir en un animal no humano un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido SOST y que deteriora la formación de un homodímero SOST.
36. 36. El inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 24-35 en donde el péptido se asocia con un una molécula vehículo.
37. 37. El inmunógeno según la reivindicación 36 en donde la molécula vehículo es un polipéptido vehículo.
38. 38. El inmunógeno según la reivindicación 37 en donde el polipéptido vehículo es hemocianina de lapa principal.
39. 39. Un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST, comprendiendo inmunizar un animal no humano con un inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 24-29, en donde (a) el polipéptido SOST comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 1 , 20, 58, 60, 62, o 68; (b) el anticuerpo inhibe completamente la unión del polipéptido SOST a al menos uno de (i) un sitio de unión de Receptor Tipo I de proteína morfogénica ósea (BMP) y (ii) un sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP; (c) el sitio de unión de Receptor Tipo I de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo I de BMP comprendiendo la secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso NM_004329 (SEQ ID NO:71); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM_030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP_001 194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); y AAB33865 (SEQ ID NO:79); y (d) el sitio de unión de Receptor Tipo II de BMP es capaz de unirse a un polipéptido de Receptor Tipo II de BMP comprendiendo la secuencia de aminoácido establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GenBank Nos. de Acceso U25110 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); y NM_001204 (SEQ ID NO:82).
40. 40. Un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST, dicho polipéptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO:1 , 20, 58, 60, 62, o 68, comprendiendo inmunizar un animal no humano con un inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 30-35, en donde ei anticuerpo deteriora la formación de un homodímero SOST.
41. 41. Un método para identificar un anticuerpo que modula una trayectoria de señalización TGF-BETA comprendiendo:: (a) contactar un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST que comprende una secuencia de aminoácido establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 1 , 20, 58, 60, 62, y 68 con al menos un péptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2-19, y 21 -54, bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo de anticuerpo/péptido SOST; (b) detectar un nivel de complejo de anticuerpo/péptido SOST, y de tal modo detectar la presencia de un anticuerpo que modula una trayectoria de señalización TGF-beta.
42. 42. Un método para identificar un anticuerpo que deteriora la unión de una BMP a un polipéptido SOST comprendiendo: (a) contactar (i) un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST que comprende una secuencia de aminoácido establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 1 , 20, 58, 60, 62, y 68 con (ii) al menos un péptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2-19, 21 -28, y 47-50 bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo de anticuerpo/péptido SOST; y (b) detectar un nivel de complejo de anticuerpo/péptido SOST, y de tal modo detectar la presencia de un anticuerpo que deteriora la unión de una BMP a un polipéptido SOST.
43. 43. Un método para identificar un anticuerpo que deteriora la formación de homodímero SOST comprendiendo: (a) contactar (i) un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST que comprende una secuencia de aminoácido establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 1 , 20, 58, 60, 62, y 68, con (ii) al menos un péptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 29-46 y 51 -54 bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo de anticuerpo/péptido SOST; y (b) detectar un nivel de complejo de anticuerpo/péptido SOST, y de tal modo detectar la presencia de un anticuerpo que deteriora la formación de homodímero SOST.
44. 44. Un método para identificar un anticuerpo que aumenta el contenido mineral óseo comprendiendo: (a) contactar (i) un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST que comprende una secuencia de aminoácido establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 1 , 20, 58, 60, 62, y 68 con (ii) al menos un péptido SOST comprendiendo una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2-19, y 21 -54 bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo de anticuerpo/péptido SOST; y (b) detectar un nivel de complejo de anticuerpo/péptido SOST, y de tal modo detectar la presencia de un anticuerpo que aumenta el contenido mineral óseo.
45. 45. El método según cualquiera de las reivindicaciones 41 -44 en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo que se presenta en una muestra biológica y un anticuerpo purificado.
46. 46. El método según la reivindicación 45 en donde el anticuerpo purificado se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, y un fragmento de unión de antígeno de un anticuerpo.
47. 47. El anticuerpo según ia reivindicación 2 en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:5, 6, y 14.
48. 48. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 3-6 en donde el péptido comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5, 6, 10, 1 1 , 14, y 18.
49. 49. El inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 26-29 en donde el péptido comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:5, 6, 10, 1 1 , 14, y 18.
50. 50. Un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST, comprendiendo inmunizar un animal no humano con un inmunógeno según la reivindicación 49, en donde el polipéptido SOST comprende una secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 1 , 20, 28, 60, 62, o 68.
51. 51 . El método según cualquiera de las reivindicaciones 41 , 42, y 44 en donde el péptido SOST comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:5, 6, 10, 1 1 , 14, y 18.