ES2380701T3

ES2380701T3 - Dímeros o trímeros de epigalocatequina que tienen activadad inhibidora de lipasa y/o actividad antioxidante

Info

Publication number: ES2380701T3
Application number: ES05743859T
Authority: ES
Inventors: Masaaki Nakai; Yuko Fukui; Sumio Asami
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2004-05-27
Filing date: 2005-05-26
Publication date: 2012-05-17
Anticipated expiration: 2025-05-26
Also published as: CN100471850C; JP4668553B2; TW200538146A; KR101213519B1; EP1754702A1; US20110124887A1; KR20110016507A; DK1754702T3; WO2005116005A1; CY1113005T1; US8309745B2; PT1754702E; TWI349548B; HK1103406A1; EP1754702A4; CN1989123A; JP2005336117A; ATE548362T1; KR101077802B1; US20080275258A1

Abstract

Un trímero de epigalocatequina en el que las unidades de epigalocatequina se polimerizan a través de grupos metileno que unen sus anillos de cromano en la posición 6 y/u 8;**Fórmula** en el que R3, R4 y R5 son cada uno independientemente H o un grupo galoílo

Description

Dímeros o trímeros de epigalocatequina que tienen actividad inhibidora de lipasa y/o actividad antioxidante

5 Campo técnico

La presente invención se refiere a dímeros o trímeros de epigalocatequina que tienen actividad inhibidora de lipasa y alimentos y bebidas que tienen esos dímeros o trímeros incluidos en los mismos. La invención también se refiere a dímeros o trímeros de epigalocatequina que tienen acción antioxidante y alimentos y bebidas que tienen esos dímeros o trímeros incluidos en los mismos. La invención se refiere además a procesos para producir esos dímeros y trímeros del epigalocatequina.

Antecedentes de la técnica

15 Inhibidor de lipasa

Con la reciente occidentalización del estilo de vida en Japón, la ingesta de comidas con alto contenido de grasa de los japoneses es cada vez mayor. De acuerdo con la encuesta de nutrición nacional japonesa de 1999, la ingesta de energía de los japoneses se ha reducido cada año pero sin embargo su proporción de lípido a energía ha superado los niveles normales de aproximadamente el 25%. También se ha observado que el 50-60% de las personas con más de 60 años de edad tienen niveles de grasa neutra y colesterol más elevados de lo normal (Ministry of Health, Labor and Welfare, “1999 National Nutrition Survey Results Summarized”, Rinshou Eiyou 2001, 98(5), 577-588).

La obesidad es una de las afecciones más graves en la sociedad moderna y se debe principalmente a la ingesta

25 excesiva de lípidos. Además de la obesidad, la ingesta de lípidos excesiva se conoce que causa la aparición de enfermedades asociadas incluyendo diabetes, hiperlipemia, hipertensión y arteriosclerosis. El único fármaco que se ha aprobado en Japón para tratar la obesidad es el supresor del apetito Mazindol (marca registrada) pero se ha informado que Mazindol provoca efectos secundarios tales como boca seca, estreñimiento, malestar de estómago, vomiturición o náuseas, etc. (Rinsho Hyoka, 1985, 13(2), págs. 419-459; Rinsho Hyoka, 1985, 13(2), págs. 461-515). Fuera de Japón, Zenical (marca registrada), un fármaco que tiene suficiente actividad inhibidora de lipasa para suprimir la absorción de grasa intestinal, está en el mercado para el tratamiento de la obesidad, pero Zenical también se ha informado que causa diversos efectos secundarios tales como heces grasas, movimientos intestinales frecuentes, paso de heces sueltas, diarrea, dolor de estómago, etc. (Lancet, 1998, 352, págs. 67-172).

35 Otra forma que se conoce que es eficaz para prevenir la obesidad es reducir la ingesta calórica a través de un régimen dietético. Sin embargo, este enfoque requiere guía y control nutricional estrictos y, por lo tanto, es difícil de implementar en la vida diaria. Por lo tanto, si la absorción corporal de grasa obtenida de la comida se pudiera suprimir de una manera segura y sana, se podría ofrecer una medida práctica y eficaz para tratar la obesidad y enfermedades asociadas y promover la salud.

En estas circunstancias, está llamando la atención el desarrollo de “alimentos para usos sanitarios especificados” que se ha demostrado que son seguros y eficaces en seres humanos. Los elementos para usos sanitarios especificados que se han comercializado hasta la fecha como que tienen la capacidad de suprimir el aumento de los niveles de grasas neutras en suero postprandial incluyen un digerido de globina que suprime la absorción de grasa

45 inhibiendo la lipasa pancreática (J. Nutr. 1988, 128, págs. 56-60; Journal of Nutritional Science and Vitaminotology, 1999,52(2), págs. 71-77; Kenkou-Eiyou Shokuhin Kenkyu, Japan Health Food & Nutrition Food Association, 2002, 5(3), págs. 131-144), diacil glicerol que tiene características de digestión/absorción diferentes en comparación con triacil glicerol (J. Am. Coll. Nutr. 2000, 19(6), págs. 789-796; Clin. Chim. Acta. 2001, 11 (2), págs. 109-117) y ácido eicosapentaenocio (EPA) y ácido docosahexaenoico (DHA) que se purifican a partir de aceite de pescado. Con el fin de suprimir la absorción de grasa de la dieta usando los alimentos para usos sanitarios especificados enumerados anteriormente, es deseable que los mismos se ingieran junto con las comidas. Sin embargo, se prevé que los alimentos enumerados anteriormente pueden influir sobre el sabor del alimento y la bebida que se tiene que ingerir con los alimentos enumerados anteriormente.

55 Se conocen algunos polifenoles que tienen actividad para inhibir la lipasa. Entre los ejemplos registrados hasta ahora se encuentran tanino obtenido a partir de cortezas de planta (documento JP 60-11912 B), taninos o flavonoides y glicósidos de los mismos que están contenidos en la planta leguminosa Cassia nomame (documento JP 8-259557 A), alimentos supresores de la absorción de lípidos que tienen incluidos en los mismos galato de epigalocatequina y galato de epicatequina que son los componentes principales en el té verde (documento JP 3228664 A), inhibidores de lipasa que comprenden extractos de agua de pimiento verde, hongo shimeji, calabaza, Grifola frondosa, Sargassum fusiforme (Harvey) Setchell, té verde o té oolong (documento JP 3-219872 A), flavona y flavonoles (documento JP 7-61927 A), ácidos hidroxibenzoicos (ácido gálico) (documento JP 1-102022 A), compuestos de triterpeno y sus derivados (documento JP 9-40689 A) y fármacos antiobesidad que contienen procianidina de tamarindo como un ingrediente activo (documento JP 9-291039 A). También se conoce la acción

65 inhibidora de lipasa del extracto de semillas de uva (Nutrition, 2003, 19, (10), págs. 876-879), la acción inhibidora de lipasa de polifenoles obtenidos de Salacia oblonga y su acción antiobesidad en rata (J. Nutr., 2002, 132, págs. 18191824) y la acción antiobesidad del extracto de té oolong en ratón (Int. J. Obes., 1999, 23, págs. 98-105).

El efecto reductor de lípidos del té oolong se ha informado por muchos investigadores. En un informe, se permitió que los sujetos bebieran té oolong comercial en porciones de 1330 ml diariamente durante seis semanas para

5 demostrar una caída significativa en los niveles de grasa neutra en sangre (Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 1991, 44(4), págs. 251-259) y en otro, a 102 sujetos masculino y femenino con obesidad simple se administró por vía oral té oolong (2 g x 4/día) durante seis semanas consecutivas y se observó una pérdida de peso de al menos 1 kg en el 67% de los sujetos y, adicionalmente, los sujetos que mostraban niveles de grasa neutra en sangre elevados mostraban mejoras significativas después de la ingestión del té oolong (Journal of The Japanese Society of Clinical Nutrition, 1998, 20(1), págs. 83-90).

J. Agric. Food Chem. 2005, 53(11), 4593-4598 describe los efectos inhibidores de los polifenoles del té oolong sobre la lipasa pancreática in vitro.

15 Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003, 67(2), 396-401 describe la evaluación de efectos antioxidativos (in vitro) de polifenoles del té.

Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 1996, 6(6), 695-700 describe la evaluación de polifenoles del té como agentes anti-VIH.

Chem. Pharm. Bull. 1989,37(12), 3255-3263 describe 8-C-ascorbil (-)-epigalocatequina 3-O-galato y flavan-3-oles diméricos, homobisflavinas A y B de oolong, a partir del té oolong.

J. Nutr. 2002, 132(7), 1819-1824 describe efectos específicos de Salacia reticulate y sus constituyentes 25 polifenólicos.

El documento JP 3-228644 se refiere a un alimento obtenido combinando un alimento con galato de (-)-epicatequina

o galato de epigalocatequina.

Documento no de patente 1: Ministry of Health, Labor and Welfare, “1999 National Nutrition Survey Results Summarized” Rinshou Eiyou 2001, 98(5)577-588 Documento no de Patente 2: Rinsho Hyoka, 1985, 13(2), págs. 419-459 Documento no de Patente 3: Rinsho Hyoka, 1985, 13(2), págs. 461-515 Documento no de Patente 4: Lancet, 1998, 352, págs. 67-172

35 Documento no de Patente 5: J. Nutr. 1988, 128, págs. 56-60 Documento no de Patente 6: Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 1999, 52(2), págs. 71-77 Documento no de Patente 7: Kenkou·Eiyou Shokuhin Kenkyu, Japan Health Food & Nutrition Food Association, 2002, 5(3), págs. 131-144 Documento no de Patente 8: J. Am. Coll. Nutr. 2000, 19(6), págs. 789-796 Documento no de Patente 9: Clin. Chim. Acta. 2001, 11 (2), págs. 109-117 Documento no de Patente 10: Nutrition, 2003, 19, (10), págs. 876-879 Documento no de Patente 11: J. Nutr., 2002, 132, págs. 1819-1824 Documento no de Patente 12: Int. J. Obes., 1999, 23, págs. 98-105 Documento no de Patente 13: Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 1991, 44(4), págs. 251-259

45 Documento no de Patente 14: Journal of The Japanese Society of Clinical Nutrition, 1998, 20(1), págs. 83-90 Documento no de Patente 15: J. Agric. Food Chem. 2005, 53(11), 4593-4598 Documento no de Patente 16: Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003, 67(2), 396-401 Documento no de Patente 17: Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 1996, 6(6), 695-700 Documento no de Patente 18: Chem. Pharm. Bull. 1989, 37(12), 3255-3263 Documento no de Patente 19: J. Nutr. 2002, 132(7), 1819-1824 Documento de Patente 1: J P 60-11912 B Documento de Patente 2: JP 8-259557 A Documento de Patente 3: JP 3-228664 A Documento de Patente 4: JP 3-219872 A

55 Documento de Patente 5: JP 7-61927 A Documento de Patente 6: JP 1-102022 A Documento de Patente 7: JP 9-40689 A Documento de Patente 8: JP 9-291039 A Documento de Patente 9: JP 3-228664 A

Divulgación de la invención

Problemas a solucionar por la invención

65 Los inhibidores de lipasa informados previamente mostrados anteriormente no tienen una eficacia para nada satisfactoria. Incluso si se demuestra que el extracto de una planta determinada es eficaz, su actividad inhibidora de lipasa es difícil de mantener de una manera consistente a menos que la cantidad del ingrediente activo en el extracto de planta esté clarificada, debido a que el extracto es de origen natural.

Adicionalmente, un inhibidor de lipasa obtenido a partir de una planta que no se adecua al gusto de muchos

5 consumidores muy probablemente influirá sobre el sabor del alimento o bebida en el cual se incorpora. Por lo tanto, los inhibidores de lipasa que se originan del té que se adecuan al gusto de muchos consumidores pueden ser candidatos prometedores. Por otra parte, si se desea reducir el nivel de lípido con té oolong que se adecua al gusto de muchos consumidores, tiene que beberse en cantidades lo suficientemente grandes para demostrar su eficacia pero esto no es práctico en la vida diaria. El suministro de un concentrado simple de té oolong no es un método

10 práctico, tampoco, ya que es demasiado amargo y picante y también tiene un contenido elevado de cafeína.

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un inhibidor de actividad de lipasa que demuestre actividad inhibidora elevada frente a lipasa pancreática para suprimir la absorción de triglicéridos obtenidos de la comida y/o que contribuya a suprimir y prevenir la obesidad.

15 Otro objeto de la presente invención es proporcionar un inhibidor de lipasa de origen de té oolong que se adecue al gusto de muchos consumidores y que no altere el sabor del alimento o bebida cuando se incluya en los mismos.

Otro objeto además de la presente invención es proporcionar procesos para producir dichos inhibidores de lipasa.

20 Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar alimentos y bebidas que tienen los inhibidores de lipasa de la invención incluidos en los mismos.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un antioxidante que pueda prevenir una diversidad de

25 afecciones que se producen como resultado del oxígeno activo incluyendo, por ejemplo, enfermedades relacionadas con el estilo de vida tales como hipertensión, diabetes e hiperlipemia, enfermedades cardiacas tales como arteriosclerosis y envejecimiento y cáncer.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un inhibidor de lipasa y/o un antioxidante, una cantidad 30 eficaz del cual se puede incluir de forma correcta en alimentos o bebidas.

La presente invención se resume mediante los siguientes aspectos [1] a [15]

[1] Un trímero de epigalocatequina en el cual las unidades de epigalocatequina se polimerizan a través de grupos 35 metileno que unen sus anillos de cromano en la posición 6 y/u 8;

en el que R3, R4 y R5 son cada uno independientemente H o un grupo galoílo.

[2] Un trímero de galato de epigalocatequina de la fórmula:

[3] Una composición que comprende un dímero de epigalocatequina en el que las unidades de epigalocatequina se polimerizan a través de un grupo metileno que une sus anillos de cromano en la posición 6 u 8:

10 en el que R1 y R2 son cada uno independientemente H o un grupo galoílo, y/o un trímero de epigalocatequina en el que las unidades de epigalocatequina se polimerizan a través de grupos metileno que unen sus anillos de cromano en la posición 6 y/u 8:

en el que R3, R4 y R5 son cada uno independientemente H o un grupo galoílo para uso en la supresión de la obesidad y/o la prevención de la obesidad.

[4] Uso de un dímero de epigalocatequina en el cual las unidades de epigalocatequina se polimerizan a través de un grupo metileno que une sus anillos de cromano en la posición 6 u 8:

10 en el que R1 y R2 son cada uno independientemente H o un grupo galoílo y/o un trímero de epigalocatequina en el cual las unidades de epigalocatequina se polimerizan a través de grupos metileno que unen sus anillos de cromano en la posición 6 y/u 8:

en el que R3, R4 y R5 son cada uno independientemente H o un grupo galoílo para la preparación de una composición para uso en la supresión de la absorción corporal de grasa obtenida de la comida, supresión de la elevación de grasa neutra en sangre, supresión de la obesidad y/o prevención de la obesidad.

[5] La composición de acuerdo con el aspecto 3 o el uso de acuerdo con el aspecto 4, en el que la composición es una composición farmacéutica, alimento o bebida.

[6] Un alimento o bebida que tiene el trímero de epigalocatequina como se define en el aspecto 1 ó 2 incluido en el 10 mismo.

[7] Una bebida de té que tiene el trímero de epigalocatequina como se define en el aspecto 1 ó 2 incluido en la misma.

15 [8] Una composición farmacéutica que comprende el trímero de epigalocatequina como se define en el aspecto 1 ó

2.

[9] Un cosmético que tiene el trímero de epigalocatequina como se define en el aspecto 1 ó 2 incluido en el mismo.

20 [10] Un proceso para producir el dímero de galato de epigalocatequina de acuerdo con la Fórmula 3 como se define en el aspecto 3 que comprende someter a reacción un flavan-3-ol con formaldehido en presencia de un ácido o que comprende la etapa de disolver un flavan-3-ol en sulfóxido de dimetilo y calentar la solución.

[11] Un proceso para producir el trímero de galato de epigalocatequina como se define en el aspecto 1 ó 2 que

25 comprende someter a reacción un flavan-3-ol con formaldehido en presencia de un ácido o que comprende la etapa de disolver un flavan-3-ol en sulfóxido de dimetilo y calentar la solución.

[12] Uso no terapéutico de una composición que comprende el dímero de epigalocatequina de Fórmula 3 o el trímero

de epigalocatequina de Fórmula 4 como se define en el aspecto 3 para suprimir la absorción corporal de grasa 30 obtenida de la comida y/o suprimir la elevación de grasa neutra en sangre.

[13] El uso de acuerdo con el aspecto 12, en el que la composición es un alimento o bebida.

[14] El uso de acuerdo con el aspecto 12, en el que la composición es una bebida de té. 35

[15] La composición de acuerdo con el aspecto 3 ó 5, el uso de acuerdo con cualquiera de los aspectos 4, 5 ó 12 a 14, el alimento o bebida de acuerdo con el aspecto 6, la bebida de té de acuerdo con el aspecto 7, en los que el dímero de epigalocatequina se selecciona entre homobisflaván A de oolong.

en el que R es un grupo galoílo; homobisflaván B de oolong

en el que R1y R2 son grupos galoílo; homobisflaván A de monodesgaloil oolong

en el que R es H; homobisflaván B de didesgaloil oolong

en el que R1 y R2son H; u homobisflaván C de oolong

y/o en el que el trímero de epigalocatequina es

Medios para resolver los problemas

5 Dímeros y trímeros de epigalocatequina

Como medios para alcanzar esos objetos, los presentes inventores encontraron ingredientes en el té oolong que inhibían la lipasa pancreática esencial para la absorción de grasa. Los presentes inventores evaluaron la actividad inhibidora de lipasa de los diversos polifenoles presentes en el té oolong y encontraron que un dímero de

10 epigalocatequina de la siguiente estructura en el que las unidades de epigalocatequina se polimerizan a través de un grupo metileno que une sus anillos de cromano en la posición 6 u 8:

en el que R1 y R2 son cada uno independientemente H o un grupo galoílo, tenían actividad inhibidora elevada. Los dímeros preferidos de la presente invención son compuestos representados por las siguientes fórmulas: que son homobisflaván A de oolong (1), homobisflaván B de oolong (2), homobisflaván A de monodesgaloil oolong

(5) y homobisflaván B de oolong didesgaloílo (6). Un dímero de epigalocatequina novedoso sintetizado, denominado homobisflaván C de oolong (3):

también tenía actividad inhibidora de lipasa elevada.

10 También de acuerdo con la presente invención, un trímero de epigalocatequina de la siguiente estructura en el que las unidades de epigalocatequina se polimerizan mediante grupos metileno que unen sus anillos de cromano en la posición 6 y/u 8:

en el que R3, R4 y R5 son cada uno independientemente H o un grupo galoílo, también tenía actividad inhibidora de lipasa marcada.

Un trímero de epigalocatequina preferido es un compuesto representado por la siguiente fórmula:

que se denomina compuesto (4).

10 Producción de dímeros y trímeros de epigalocatequina

Los dímeros de epigalocatequina útiles en la presente invención se pueden sintetizar en su mayoría o purificar para recuperación mediante métodos bien conocidos por los expertos. Por ejemplo, homobisflaván A(1) y B(2) de oolong

15 que son ambos dímeros de epigalocatequina se pueden sintetizar mediante el método descrito en Chem. Pharma. Bull. 37 (12), 3255-3563 (1989), mientras que homobisflaván A(5) de monodesgaloil oolong y homobisflaván B(6) didesgaloílo se pueden recuperar a partir de hojas de té mediante el método descrito en Chem. Pharma. Bull. 37 (12), 3255-3563 (1989).

Los trímeros de la presente invención se producen mediante el siguiente procedimiento. En resumen, los mismos se pueden producir mediante un proceso que incluye la etapa de someter a reacción flavan-3-oles tales como epigalocatequina-3-O-galato (7) con formaldehido en un disolvente tal como metanol o etanol, preferentemente metanol, en presencia de un ácido tal como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, preferentemente ácido clorhídrico

5 0,01 N. La temperatura de reacción no está limitada a ningún valor particular siempre y cuando los materiales de partida y el producto sean estables pero se prefiere llevar a cabo la reacción a temperatura ambiente. Como alternativa, los trímeros se pueden producir disolviendo flavan-3-ol tal como epigalocatequina-3-O-galato (7) en dimetil sulfóxido (DMSO) y calentar la solución. Las condiciones de la reacción de calentamiento no se limitan a ninguna forma particular siempre y cuando los materiales de partida y el producto sean estables pero la reacción preferentemente se lleva a cabo a 150-200ºC, más preferentemente a 180ºC, durante un periodo que preferentemente es entre 1 y 30 minutos, más preferentemente durante 15 minutos. La concentración de formaldehido en la solución de reacción preferentemente es el 3-37% p/v. El producto resultante se puede esterificar, hidrolizar o tratarse de otra manera opcionalmente para preparar formas derivadas.

15 Los métodos descritos anteriormente para producir los trímeros también son adecuados para producir los dímeros. Por ejemplo, como se describirá posteriormente en el Ejemplo 3, algunos dímeros incluyendo homobisflaván C novedoso (3) se produjeron mediante esos métodos.

Actividad inhibidora de lipasa

Los compuestos como se ha descrito anteriormente tienen actividad inhibidora de lipasa, en particular, actividad inhibidora de lipasa pancreática.

La actividad inhibidora de lipasa se puede medir mediante uno cualquiera de los ensayos de actividad de lipasa que

25 se describen en las solicitudes anteriores mencionadas en los Antecedentes de la Técnica. Con respecto a la actividad inhibidora frente a lipasa pancreática, se puede usar un éster oleico de 4-metilumbeliferona fluorescente como un sustrato para medir la fluorescencia de 4-metilumbeliferona que se forma mediante reacción con la lipasa. La cantidad de una muestra que proporciona el 50% de inhibición de actividad de lipasa (CI50) se puede sustituir para expresar la actividad inhibidora de lipasa de acuerdo con el método habitual.

Como se mostrará en el Ejemplo 1, los compuestos útiles en la presente invención tenían valores de CI50 muy bajos frente a lipasa pancreática en comparación con el inhibidor de lipasa conocido epigalocatequina-3-O-galato (7).

Por lo tanto, los inhibidores de lipasa se pueden usar en cantidades más pequeñas que los inhibidores de lipasa

35 conocidos hasta ahora de origen natural y pueden suprimir la absorción corporal de grasa obtenida del alimento, suprimiendo de ese modo la elevación de grasa neutra en sangre y/o previniendo la obesidad. Debido a que los compuestos útiles en la presente invención son de origen natural, los mismos presentan niveles de seguridad elevados y son adecuados para la ingesta diaria y/o prolongada de forma que los mismos puedan mostrar la eficacia pretendida. Adicionalmente, los compuestos útiles en la presente invención que se originan a partir del té oolong tienen la ventaja de adecuarse al gusto de la mayoría de los consumidores.

Actividad antioxidante

Los presentes inventores también observaron que los dímeros y trímeros como se han descrito anteriormente tenían 45 la actividad de captación de radicales de anión superóxido.

Los radicales de anión superóxido (O2-) son un tipo de oxígeno activo formado dentro del organismo vivo, donde los radicales no sólo muestran acción esterilizante sino también inducen una reacción de oxidación indiscriminada y marcada. Este efecto se cree que causa afecciones tales como envejecimiento y formación de cáncer en el organismo vivo, típicamente través de la peroxidación de ácidos grasos insaturados en membranas celulares (véase, por ejemplo, NANZANDO'S MEDICAL DICTIONARY, 18ª ed., pág. 329, publicado el 16 de enero de 1998). Además, una reacción de peroxidación de ácidos grasos insaturados en alimentos conducirá a su deterioro y puede incluso implicar la emisión de olor desagradable a partir del alimento. Por lo tanto, los compuestos como se han definido anteriormente que pueden captar radicales de anión superóxido tienen características beneficiosas en el sentido de

55 que los mismos pueden prevenir una diversidad de afecciones que se producen como resultado del oxígeno activo, incluyendo, por ejemplo, enfermedades relacionadas con el estilo de vida tales como hipertensión, diabetes e hiperlipemia, enfermedades cardiacas tales como arteriosclerosis, envejecimiento y cáncer.

La actividad de captación de radicales de aniones superóxido se midió mediante el método que se describirá en el Ejemplo 5. En resumen, se generó O2-por medio de reacción de hipoxantina-xantina oxidasa y se usó 5,5-dimetil-1pirrolin-N-óxido como un agente de captura para realizar la medición mediante ESR. La medición se condujo en presencia o ausencia de compuestos de epigalocatequina y los resultados se expresaron como CI50 o la cantidad de una muestra que proporcionaba el 50% de supresión de generación de O2-.

65 De acuerdo con el Ejemplo 5, los compuestos de epigalocatequina tenían valores de CI50 muy bajos en comparación con el compuesto (7), un captador de radicales de anión superóxido conocido.

Por lo tanto, estos compuestos se pueden usar en cantidades más pequeñas que los captadores de radicales de anión superóxido convencionales de origen natural y pueden aún prevenir una diversidad de afecciones que se producen como resultado del oxígeno activo incluyendo, por ejemplo, enfermedades relacionadas con el estilo de vida tales como hipertensión, diabetes e hiperlipemia, enfermedades cardiacas tales como arteriosclerosis,

5 envejecimiento y cáncer. Adicionalmente, ya que los compuestos de epigalocatequina son de origen natural, los mismos presentan niveles de seguridad elevados y se pueden ingerir durante un periodo de tiempo prolongado para mostrar la eficacia pretendida.

Alimentos y bebidas que tienen inhibidor de lipasa y/o antioxidante incorporados en los mismos.

Los dímeros y/o trímeros de epigalocatequina se pueden incluir en té con el fin de potenciar los polifenoles en el mismo, produciendo de ese modo alimentos y bebidas que tienen no sólo la acción de reducir la grasa natural y prevenir la peroxidación de lípidos, el envejecimiento y la obesidad, sino también la acción de prevenir una diversidad de afecciones que se producen como resultado del oxígeno activo, incluyendo, por ejemplo,

15 enfermedades relacionados con el estilo de vida, tales como hipertensión, diabetes e hiperlipemia, enfermedades cardiacas tales como arteriosclerosis, envejecimiento y cáncer.

Los ejemplos de bebidas en las cuales se pueden incorporar los compuestos de epigalocatequina incluyen bebidas gaseosas, bebidas de té, tónicos líquidos, bebidas saludables, bebidas de suministro nutricional, bebidas deportivas y bebidas carbonatadas (incluyendo concentrados líquidos y polvos de preparación de estas bebidas) y los alimentos ilustrativos en los que los compuestos se pueden incorporar incluyendo gomas, caramelos, jaleas, dulces en forma de comprimidos, alimentos saludables, alimentos de suministro nutricional y suplementos dietéticos.

Composición farmacéutica que comprende inhibidor de lipasa y/o antioxidante

25 Los dímeros y/o trímeros de epigalocatequina se pueden usar para producir agentes farmacéuticos que tengan no sólo acciones tales como la de reducir los triglicéridos, sino también la acción de prevenir una diversidad de afecciones que se producen como resultado del oxígeno activo incluyendo, por ejemplo, enfermedades relacionadas con el estilo de vida tales como hipertensión, diabetes e hiperlipemia, enfermedades cardiacas tales como arteriosclerosis, envejecimiento y cáncer.

Si los compuestos que se han descrito anteriormente se tienen que usar como medicinas, los mismos se proporcionan en forma de polvo, gránulo, comprimido, cápsula, solución, inyección, solución dérmica, emulsión, ungüento, etc.

35 Cosméticos que tienen inhibidor de lipasa y/o antioxidante incorporado en los mismos

Los dímeros y/o trímeros de epigalocatequina se pueden usar para producir cosméticos que tienen acciones diversas incluyendo la prevención de peroxidación de lípidos, retardo del envejecimiento y blanqueamiento de la piel.

Los cosméticos en los que los compuestos de epigalocatequina se pueden incluir son cremas faciales, de piel y de cabello, lociones, geles, espuma, champú, enjuague, etc.

Los compuestos de epigalocatequina que pueden ser productos sintetizados o extracción purificada, se pueden usar

45 independientemente en alimentos/bebidas, composiciones farmacéuticas o cosméticos; como alternativa, una mezcla que comprende más de uno de estos compuestos se puede añadir a alimentos o bebidas.

Por lo tanto, si un extracto a partir de un material de partida tal como hojas de té, contiene más de un compuesto como se ha descrito anteriormente, la mezcla extraída se puede emplear como un inhibidor de lipasa sin separar los componentes individuales.

Ventajas de la invención

Mediante la adición de cualquier polifenol de té oolong o dímeros y/o trímeros de epigalocatequina que es un

55 componente de la actividad inhibidora de lipasa más elevada, se pueden proporcionar bebidas que conservan el sabor del té, se adecuan al gusto de muchos consumidores y sirven a los propósitos de prevenir la obesidad y promover la salud.

Los compuestos así como los alimentos y bebidas también tienen actividad antioxidante y contribuyen a la prevención de peroxidación de lípidos y envejecimiento.

Breve descripción de los dibujos

[Fig. 1] La Fig. 1 muestra las fórmulas estructurales químicas de las muestras sometidas a la evaluación de su

65 actividad inhibidora de lipasa y actividad antioxidante; [Fig. 2] La Fig. 2 es un espectro de 1H-NMR de homobisflaván C de oolong (3);

[Fig. 3] La Fig. 3 es un espectro de 13C-NMR de homobisflaván C de oolong (3); [Fig. 4] La Fig. 4 es un espectro de 1H-NMR de trímero (4); y [Fig. 5] La Fig. 5 es un espectro de 13C-NMR de trímero (4).

5 La presente invención se describe más específicamente con referencia a los siguientes ejemplos que de ninguna manera tienen por objeto limitar el alcance de la invención.

Ejemplo

Medición de la actividad inhibidora de lipasa

Para la medición de la actividad de lipasa, se uso un éster oleico de 4-metilumbeliferona fluorescente (4-UMO) como un sustrato y se midió la fluorescencia a partir 4-metilumbeliferona formada mediante reacción enzimática.

15 El tampón usado en la medición fue tris-HCl 13 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 150 mM y CaCl2 1,36 mM. El sustrato 4-UMO (producto de Sigma-Aldrich Co.) se preparó como una solución 0,1 M en DMSO y después se diluyó 1000 veces con el tampón. La lipasa sometida a medición de enzima era lipasa pancreática de cerdo (producto de Sigma) que se había diluido hasta una concentración de 400 U/ml con el tampón.

Para comenzar la reacción enzimática, 50 μl de solución 4-UMO tamponada y 25 μl de agua destilada (o una solución acuosa de la muestra) se cargaron y mezclaron en una placa de micro titulación de 96 pocillos y 25 μl de la solución de lipasa tamponada se añadieron posteriormente. Después de reacción de 30 minutos, se añadieron 100 μl de solución tamponada de citrato 0,1 M (pH 4,2) para interrumpir la reacción y se midió la fluorescencia a partir de 4-metilumbeliferona (longitud de onda de excitación: 355 nm; longitud de onda de fluorescencia: 460 nm), que se

25 generó mediante la reacción, con un lector de placa de fluorescencia (Fluoroskan Asent CF: producto de Labsystems).

La actividad inhibidora de la muestra de ensayo se determinó como su cantidad que proporcionaría el 50% de inhibición de la actividad de lipasa (CI50 en μl) en comparación con la actividad del control (agua destilada).

Ejemplo 2

Muestras de medición

35 Homobisflaván A de oolong (1) y homobisflaván B de oolong (2) se sintetizaron de acuerdo con el artículo Chem. Pharm. Bull. 37(12), 3255-3563 (1989). Homobisflaván A de monodesgaloil oolong (5) y homobisflaván B de monodesgaloil oolong (6) se extrajeron y purificaron a partir de hojas de té mediante el método descrito en Chem. Pharm. Bull. 37(12), 3255-3563 (1989). Como alternativa, los mismos se pueden obtener mediante hidrólisis de homobisflaván A de oolong (1) y homobisflaván B de oolong (2) con tanasa. Los compuestos novedosos, homobisflaván C de oolong (3) y trímero (4), se sintetizaron y purificaron mediante los métodos de los Ejemplos 3 y 4 y a partir de entonces se determinó mediante análisis instrumental que tenían las estructuras mostradas en la Fig. 1. Incidentalmente, (-)-epigalocatequina-3-O-galato (EGCG, compuesto 7) se adquirió en Wako Pure Chemical Industries, Ltd.

45 Ejemplo 3

Síntesis y purificación de homobisflaván de oolong (OHBF)

A. Síntesis:

Cien miligramos de (-)-epigalocatequina-3-O-galato (Wako Pure Chemical Industries, Ltd) se disolvieron en 2 ml de metanol que contenía HCl 0,01 N y formaldehido al 18,5% y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Al final de la reacción, la mezcla se purificó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento.

55 B. Condiciones de HPLC preparatoria:

Columna: Develosil C30-UG-5 (2 cmφ x 25 cm; Nomura Chemical Co., Ud.) Fase móvil: A, 0,1 % TFA/H2O; B, 90% CH3CN, 0,1 % TFA/H2O; 6 ml/min Programa de gradiente: B 10% → 40% (0-40 min); B 40% iso (40-60 min)

Detección: A 280 nm

La HPLC preparatoria se realizó en las condiciones especificadas anteriormente, produciendo OHBF-A, OHBF-B, OHBF-C y el trímero en cantidades respectivas de 24,2 mg, 17,2 mg, 5,6 mg y 13,8 mg. Los compuestos 65 individuales se sometieron a EM mediante Q-TOF de micromasa en un modo positivo, tras lo cual se detectaron

picos de ión [M+H]+ a m/z 929, 929, 929 y 1399 para OHBF-A, OHBF-B, OHBF-C y el trímero, respectivamente. Los datos espectrales para OHBF-A y OHBF-B concordaron con los que se muestran en Chem. Pharm. Bull. 37(12), 3255-3563 (1989), determinando que aquellos compuestos tenían las estructuras representadas por las fórmulas 1 y 2 en la Fig. 1. Con respecto a OHBF-C y el trímero, las mediciones de NMR para 1H-NMR, 13C-NMR, 1H{13C}-HSQC,

5 1H{13C}-HMBC, TOCSY y DQF-COSY se realizaron con espectrómetro DMX-750 (BRUKER BIOSPIN) para mostrar que esos compuestos tenían las estructuras representadas por las fórmulas 3 y 4 en la Fig. 1. Los espectros de 1H-NMR y 13C-NMR de OHBF-C se muestran en las Figs. 2 y 3, mientras que los espectros de 1H-NMR y 13C-NMR del trímero se muestran en las Figs. 4 y 5.

10 Ejemplo 4

Actividades inhibidoras de lipasa de homobisflaván de oolong y sus trímeros

Las actividades inhibidoras de lipasa de seis compuestos (dímeros de OHBF y su trímero), así como del galato de

15 epigalocatequina (EGCG) se midieron de acuerdo con el Ejemplo 1 y los resultados se muestran en la Tabla 1. Las fórmulas estructurales químicas de los compuestos evaluados en el Ejemplo 4 se enumeran en la Fig. 1.

Los dímeros de flavan-3-ol que tienen un grupo galoílo unido al anillo de cromano en la posición 3 a través de un enlace éster, por ejemplo, homobisflaván A, B y C de oolong, así como el trímero mostraron actividad inhibidora de

20 lipasa potente en comparación con EGCG, que era el control, de forma que se sugirió que los dímeros y trímeros en los que EGCG están polimerizados serían útiles como inhibidores de lipasa.

Entre esos compuestos, se ha verificado que homobisflaván A y B de oolong que tienen actividad inhibidora de lipasa particularmente marcada están contenidos en el té oolong.

25 Tabla 1. Actividades inhibidoras de lipasa de diversos polifenoles

[Tabla 1]

CI50 (μM)

Homobisflaván A de oolong (1) 0,049

Homobisflaván B de oolong (2) 0,108

Homobisflaván C de oolong (3) 0,097

Trímero (4) 0,129

Homobisflaván A de monodesgaloil oolong (5) 2,271

Homobisflaván B de oolong didesgaloílo (6) 2,083

Epigalocatequina-3-O-galato (7) 0,349

Ejemplo 5

Actividad de captura de oxígeno activo

35 Se realizó la evaluación de la actividad de captura de radicales de anión superóxido generada por reacción de hipoxantina-xantina oxidasa, un tipo de oxígeno activo.

Método:

40 Después de preparar (1) solución de hipoxantina 3 mM (disuelta en solución tamponada de fosfato 0,1 M a pH 7,4) y

(2) ácido dietilentriamina-pentaacético 5,5 mM (disuelto en solución tamponada de fosfato 0,1 M a pH 7,4), 5,0 ml de la solución (1), 3,5 ml de la solución (2) y 1,5 ml de 5,5-dimetil-1-pirrolin-N-óxido (DMPO, producto de LABOTECH) se mezclaron para preparar el reactivo 1. Una parte de 50 μl del reactivo 1 se colocó en un microtubo de 1,5 ml y se 45 incubó a 37ºC durante 4 minutos. Al reactivo 1 incubado, se añadió una solución de metanol de la muestra en una cantidad de 20 μl y después se añadieron 50 μl de xantina oxidasa (0,4 unidades/ml), seguido por agitación durante 10 segundos. La mezcla de reacción se inyectó en un tubo de hematocrito, que se colocó en un aparato de ESR y el barrido en un campo magnético se comenzó 60 segundos después de la adición de xantina oxidasa. Las condiciones de medición de ESR fueron las siguientes: Potencia, 4 mW; Campo C, 335,5 mT, Ancho Sw (±), 5 mT;

50 Tiempo Sw, 1 min; Ancho Mod, 0,1 mT; Amp, 160; TiempoC, 0,1 s; Temperatura, 20ºC.

Entre las señales de ESR de DMPO-OOH, la señal de la potencia de campo más baja se comparó en altura con la

-

señal de Mn2+ de patrón interno y la proporción (S/M) se asumió que representaba la cantidad de O2 y la actividad de captura de O2-se calculó mediante la siguiente fórmula:

55 Actividad de captura de O2-(%) = 100 – {100 x (S/M en presencia de la muestra) / (S/M en ausencia de la muestra)} Resultados:

Para evaluar de capacidad de homobisflaván A, B y C de oolong (dímeros), así como del trímero de capturar radicales de anión superóxido (O2-), se calcularon sus concentraciones capaces de capturar el 50% de O2-(CI50) en μM. El control fue galato de epigalocatequina (EGCG). En comparación con EGCG, los homobisflaván de oolong (dímeros y trímeros) se observó que tenían actividad de captura de O2-más fuerte.

[Tabla 2] Tabla 2. Actividad de captura de radical superóxido Muestra P.M. CI50 (μM)

Homobisflaván A de oolong (1) 928 7,9 Homobisflaván B de oolong (2) 928 8,1 Homobisflaván 3 de oolong (1) 928 10,1

Trímero (4) 1398 10,1 EGG (7) 458 14,0

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un trímero de epigalocatequina en el que las unidades de epigalocatequina se polimerizan a través de grupos metileno que unen sus anillos de cromano en la posición 6 y/u 8;

en el que R3, R4 y R5 son cada uno independientemente H o un grupo galoílo.

10 2. Un trímero de galato de epigalocatequina de la fórmula:
3. Una composición que comprende un dímero de epigalocatequina en el que las unidades de epigalocatequina se polimerizan a través de un grupo metileno que une sus anillos de cromano en la posición 6 u 8:

en el que R1 y R2 son cada uno independientemente H o un grupo galoílo, y/o un trímero de epigalocatequina en el que las unidades de epigalocatequina se polimerizan a través de grupos metileno que unen sus anillos de cromano en la posición 6 y/u 8:

en el que R3, R4 y R5 son cada uno independientemente H o un grupo galoílo para uso en la supresión de la obesidad y/o prevención de obesidad.
4. Uso de un dímero de epigalocatequina en el que las unidades de epigalocatequina se polimerizan a través de un grupo metileno que forma un puente en sus anillos de cromano en la posición 6 u 8:

15 en el que R1 y R2 son cada uno independientemente H o un grupo galoílo y/o un trímero de epigalocatequina en el que las unidades de epigalocatequina se polimerizan a través de grupos metileno que forman un puente en sus anillos de cromano en la posición 6 y/u 8:

en el que R3,R4 y R5 son cada uno independientemente H o un grupo galoílo para la preparación de una composición para uso en la supresión de la absorción corporal de grasa obtenida de la comida, supresión de la elevación de grasa neutra en sangre, supresión de la obesidad y/o prevención de la obesidad.
5. La composición de acuerdo con la reivindicación 3 o el uso de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la composición es una composición farmacéutica, alimento o bebida.
6. Un alimento o bebida que tiene el trímero de epigalocatequina como se define en la reivindicación 1 ó 2 incluido 10 en el mismo.
7. Una bebida de té que tiene el trímero de epigalocatequina como se define en la reivindicación 1 ó 2 incluido en la misma.

15 8. Una composición farmacéutica que comprende el trímero de epigalocatequina como se define en la reivindicación 1 ó 2.
9. Un cosmético que tiene el trímero de epigalocatequina como se define en la reivindicación 1 ó 2 incluido en el

mismo. 20
10. Un proceso para producir el dímero de galato de epigalocatequina de acuerdo con la Fórmula 3 como se define en la reivindicación 3 que comprende someter a reacción flavan-3-ol con formaldehido en presencia de un ácido o que comprende la etapa de disolver un flavan-3-ol en dimetil sulfóxido y calentar la solución.

25 11. Un proceso para producir trímero de galato de epigalocatequina como se define en la reivindicación 1 ó 2 que comprende someter a reacción un flavan-3-ol con formaldehido en presencia de un ácido o que comprende la etapa de disolver un flavan-3-ol en dimetil sulfóxido y calentar la solución.
12. Uso no terapéutico de una composición que comprende el dímero de epigalocatequina de Fórmula 3 o el trímero

30 de epigalocatequina de Fórmula 4 como se define en la reivindicación 3 para la supresión de la absorción corporal de grasa obtenida de la comida y/o supresión de la elevación de grasa neutra en sangre.
13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la composición es un alimento o bebida.

35 14. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la composición es una bebida de té.
15. La composición de acuerdo con la reivindicación 3 ó 5, los usos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4, 5, 12 a 14, el alimento o bebida de acuerdo con la reivindicación 6 o la bebida de té de acuerdo con la reivindicación 7, en los que el dímero de epigalocatequina se selecciona entre homobisflaván A de oolong.

en el que R es un grupo galoílo; homobisflaván B de oolong

en el que R1y R2 son grupos galoílo; homobisflaván A de monodesgaloil oolong

en el que R es H; 10 homobisflaván B de oolong didesgaloílo

en el que R1 y R2 son H; u homobisflaván C de oolong