KR102172267B1 - 에피갈로카테킨 갈레이트 이량체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 화장료 조성물 - Google Patents

에피갈로카테킨 갈레이트 이량체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산화 조건에 하에서 불안정한 폴리페놀인 EGCG(Epigallocatechin gallate)를 입체 화학을 변화시키지 않고 EGCG 이량체를 효율적으로 제조하는 방법 및 제조한 EGCG 이량체를 이용한 미백 향상제 및/또는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

에피갈로카테킨 갈레이트 이량체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 화장료 조성물{Epigallocatechin gallate dimer, Preparing method thereof and Cosmetic composition using the same}
본 발명은 에피갈로카테킨 갈레이트 단량체(monomer)를 플라즈마 처리를 통해 에피갈로카테킨 갈레이트 이량체(dimer)를 효율적으로 제조하는 방법, 이 방법으로 제조한 에피갈로카테킨 갈레이트를 이용한 미백 향상제 및 화장료에 관한 것이다.
페놀릭 작용기를 적어도 2 개 함유한 천연 폴리페놀은 최근 인간의 건강을 향상시킬 수 있는 잠재력을 가진 식품 및 약용 식물에서의 생체 활성 성분으로서 많은 주목을 받고 있다. 폴리페놀은 노화 방지, 암 예방 및 심혈관 질환과 같은 다양한 건강상의 이점과 밀접한 관련이 있는 강력한 항산화능을 가지고 있으며, 몇 가지 알려진 폴리페놀은 산화적 및 생리적 조건 하에서 매우 안정하지 못하여 제한된 임상 효능을 나타낼 수 있다(Atala et al., 2017; Wang et al., 1997). 그러므로 효소 및 미생물 형질 전환을 이용하여 천연 폴리페놀의 구조를 변형시켜 생물학적 효능이 향상된 새로운 유도체를 만들려고 시도가 있었다.
(-)-카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)의 잎에서 분리된 주요 생체 활성 성분인 EGCG(Epigallocatechin gallate)는 광범위하게 연구되어 왔으며 항 혈관 형성, 항 당뇨병성, 저 콜레스테롤 혈증성의 여러 가지 건강상의 이점을 일으키는 강력한 약리학적 효과가 있다고 알려져 있으며, 항 박테리아성 및 노화 방지 성질이 있다(Cabrera et al., 2006; Kim et al., 2014).
녹차에서 가장 활동적인 카테킨으로 여겨지는 EGCG는 여러 가지 건강상의 이점, 특히 항암 화학 요법, 항 당뇨병 및 항 혈관 형성 특성을 지니고 있기 때문에 유망한 영양 보조제로 여겨지고 있다. 그리고, (-)-EGCG는 산화 조건에서 매우 불안정한 바, 다양한 생물학적 작용과 밀접하게 관련되어 있는 구조적 변형의 효과에 대한 최근의 연구가 있었다.
플라즈마 처리는 화학적 변화를 유도하는 물리적 처리로 알려져 있는데, 플라즈마 처리 기술 중 비열(Nonthermal) 대기압 플라즈마는 물질과 식품의 비열 살균이 가능하고 잠재적인 의학적 적용 때문에 유익한 관심을 받아 왔다. 병원성 박테리아를 오염 제거하는데 비열 플라즈마의 효과는 전자, 이온, 자유 라디칼 및 여기 분자의 형성을 포함하는 효과의 조합에 기인한다. 비열 플라즈마 기술의 주요 이점은 상대적으로 간단하고 저렴한 설계, 짧은 공정 시간, 독성 부재 및 적은 잔류물 형성이다. 따라서, 비열 플라즈마는 산업 폐기물을 발생시키지 않으면서 열 안정성 물질의 처리에 유용하여 새로운 녹색 기술로 대두되고 있다.
비열 플라즈마 처리 기술 중 유전 장벽 방전(DBD, dielectric barrier discharge) 플라즈마 처리는 식품 가공에 적용되고 있고, 또한 반응성 종(species)이 풍부하기 때문에 미생물의 파괴에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 고급 비열 기술인데, 이를 이용하여 물질 합성에 대한 응융 기술, 조건에 대한 새로운 연구가 부족한 실정인 바, 녹색기술로 대두되고 있는 DBD 플라즈마를 이용한 응용 기술 확대가 요구되고 있다.
한국 공개특허번호 10-2008-0023595호 A(공개일 2018.03.07)
다양한 자연적 기원의 생리 활성 제품을 만들기 위한 우리의 지속적인 노력한 결과, 본 발명자들은 DBD 플라즈마를 사용하여 EGCG 단량체의 입체 화학을 변화시키지 않으면서 EGCG의 이량체화 기술 및 조건을 확립하게 되었다. 즉, 본 발명은 EGCG 이량체 제조방법을 제공하고자 한다.
또한, 제조된 EGCG 이량체가 티로시나아제 관련 단백질 TRP(tyrosinase-related protein)-1, TRP-2 및 MITF(microphthalmia associated transcription factor) 발현 억제 등을 통한 멜라닌 생성 억제 효과가 있음을 확인하였는 바, 본 발명의 방법으로 제조한 EGCG 이량체를 미백 효과가 미백 향상제 및/또는 화장료 성분으로 제공하고자 한다.
과제를 해결하기 위한 본 발명은 에피갈로카테킨 갈레이트 이량체를 제조하는 방법에 관한 것으로서, EGCG(epigallocatechin gallate) 단량체를 유전 장벽 방전(dielectric barrier discharge) 플라즈마 처리 공정을 수행하여, 하기 화학식 1로 표시되는 이량체 및 화학식 2로 표시되는 이량체 중에서 선택된 1종 이상의 이량체를 합성할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112018125960411-pat00001
[화학식 2]
Figure 112018125960411-pat00002
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 상기 제조방법은 EGCG 단량체 및 메탄올 수용액을 혼합하여 반응용액을 제조하는 1단계; 상기 반응용액을 유전 장벽 방전 플라즈마 장치를 이용하여, 플라즈마 처리하여, 반응생성물 함유 용액을 제조하는 2단계; 상기 반응생성물 함유 용액을 진공 감압 농축하여 메탄올 수용액을 제거 및 건조시켜서 건조물을 획득하는 3단계; 상기 건조물을 메탄올 수용액에 용해시킨 후, 에틸아세테이트로 분획처리하여 분획물을 획득하는 4단계; 및 상기 분획물을 진공 감압 농축 및 건조하여 화학식 1로 표시되는 이량체 및 화학식 2로 표시되는 이량체를 포함하는 건조된 에틸아세테이트 가용성 분획물을 수득하는 5단계;를 포함하는 공정을 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 상기 제조방법은 5단계의 상기 건조된 에틸아세테이트 가용성 분획물을 ODS겔 컬럼으로 분획 처리하여 화학식 1로 표시되는 이량체 및 화학식 2로 표시되는 이량체 중에서 선택된 1종 이상의 이량체를 수득하는 6단계;를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 1단계의 상기 반응용액은 메탄올 수용액 1L 당 EGCG 단량체를 150 ~ 400 mg으로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 1단계의 상기 메탄올 수용액은 100 ~ 600ppm 농도의 메탄올 수용액일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 유전 장벽 방전 플라즈마 장치 내 반응기는 PTFE 시트로 구성된 전극 및 구리 전극을 구비하고 있을 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 2단계의 상기 플라즈마 처리는 대기 중의 공기를 방전 기체로 사용하여, 상기 구리 전극에 주파수 1 ~ 20 kHz의 양극성 사각파형 전압(bipolar squre-waveform voltage) 또는 양극성 싸인파형 전압을 인가하고, 200 ~ 300 W의 피크 전력 하에서 30분 ~ 70분간 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 제조방법은 상기 화학식 1로 표시되는 이량체의 수율은 22.0 ~ 40.0%이고, 순도는 99.0% 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 제조방법은 상기 화학식 2로 표시되는 이량체의 수율은 35 ~ 50%이고, 순도는 99.0% 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 앞서 설명한 방법으로 제조한 에피갈로카테킨 갈레이트 이량체로서, 상기 화학식 1로 표시되는 이량체 및 상기 화학식 2로 표시되는 이량체 중에서 선택된 1종 이상의 이량체를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 에피갈로카테킨 갈레이트 이량체를 포함하는 미백 향상제에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 에피갈로카테킨 갈레이트 이량체를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 EGCG 이량체 제조방법은 EGCG 단량체로부터 입체 화학을 변화시키지 않으면서 높은 수율 및 순도로 EGCG 이량체를 효율적으로 제조할 수 있으며, 제조된 EGCG 이량체는 멜라닌 단백질(melanogenic protein)인 티로시나제(tyrosinase), TRP-1, TRP-2 및 MIFE 효소의 발현 억제능이 우수한 바, 미백 향상제, 기능성 화장료 조성물 등으로 사용하기에 적합하다.
도 1은 실험예 2에서 실시한 크로마토그래피 분석을 실험 결과이다.
도 2 및 도 3은 실험예 5에서 실시한 멜라닌 생성 관련 효소에 대한 발현 여부 측정 실험 결과로서, 도 2는 웨스턴 블라팅 분석 결과이고, 도 3은 단백질 발현율(%)을 그래프로 나타낸 것이다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하 본 발명에 대해 구체적으로 설명한다.
본 발명은 에피갈로카테킨 갈레이트(이하, "EGCG"로 정의함) 단량체를 특정 조건에서 유전 장벽 방전 플라즈마 처리 공정을 수행하여 하기 화학식 1 및/또는 화학식 2로 표시되는 이량체를 고수율 및 고순도로 제조하는 방법에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 EGCG 단량체 및 메탄올 수용액을 혼합하여 반응용액을 제조하는 1단계; 상기 반응용액을 유전 장벽 방전 플라즈마 장치를 이용하여, 플라즈마 처리하여, 반응생성물 함유 용액을 제조하는 2단계; 상기 반응생성물 함유 용액로부터 메탄올 수용액을 제거 및 건조시켜서 건조물을 획득하는 3단계; 상기 건조물을 메탄올 수용액에 용해시킨 후, 에틸아세테이트로 분획처리하여 분획물을 획득하는 4단계; 및 상기 분획물을 진공 감압 농축 및 건조하여 화학식 1로 표시되는 이량체 및 화학식 2로 표시되는 이량체를 포함하는 건조된 에틸아세테이트 가용성 분획물을 수득하는 5단계;를 포함하는 공정을 수행하여 EGCG 이량체를 제조할 수 있다.
본 발명의 상기 제조방법은 5단계의 에틸아세테이트 가용성층 물질은 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 이량체를 포함하며, 에틸아세테이트 가용성층 물질로부터 화학식 1로 표시되는 이량체를 분리 및 수득하는 6단계;를 더 포함할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112018125960411-pat00003
[화학식 2]
Figure 112018125960411-pat00004
상기 1단계는 플라즈마 처리 대상인 반응용액을 제조하는 공정으로서, EGCG 단량체 및 메탄올 수용액을 혼합 및 교반하여 반응용액을 제조하며, 혼합비는 메탄올 수용액 1L 당 EGCG 단량체 150 ~ 400 mg을, 바람직하게는 메탄올 수용액 1L 당 EGCG 단량체 150 ~ 300 mg을, 더욱 바람직하게는 EGCG 단량체 180 ~ 250 mg을 혼합할 수 있다. 이때, EGCG 단량체 사용량이 혼합비는 메탄올 수용액 1L 당 150 mg 미만이면 반응용액 내 EGCG 단량체의 농도가 너무 낮아서 다수의 미량성분이 생성되는 문제가 있을 수 있고, 400 mg을 초과하면 이량체 전환 효율이 낮아지는 문제가 있을 수 있다.
그리고, 상기 메탄올 수용액은 100 ~ 600ppm 농도의 메탄올 수용액을, 바람직하게는 150 ~ 400 ppm 농도의 메탄올 수용액을 사용하는 것이 좋다.
다음으로, 2단계의 플라즈마 처리 공정은 유전 장벽 방전(DBD, dielectric barrier discharge) 플라즈마 장치를 이용하여 수행하며, 상기 DBD 플라즈마 장치는 장치 내 반응기에 PTFE(polytetrafluoroethylene) 시트로 구성된 전극 및 구리(Cu) 전극을 구비하고 있다.
그리고, 상기 플라즈마 처리는 대기 중의 공기를 방전 기체로 사용하여 수행할 수 있고, 상기 방전 기체 하에서 구리 전극에 양극성 사각파형 전압(bipolar squre-waveform voltage) 또는 양극성 싸인파형 전압(bipolar sine-form voltage) 를 인가하고, 200 ~ 300 W, 바람직하게는 220 ~ 280 W, 더욱 바람직하게는 230 ~ 260 W의 피크 전력 하에서 30분 ~ 70분간, 바람직하게는 30분 ~ 65분간, 더욱 바람직하게는 30분 ~ 50분간 수행할 수 있다. 이때, 피크 전력이 200W 미만이면 플라즈마 처리 시간이 너무 길어지고, 합성 수율이 떨어지는 문제가 있을 수 있고, 피크 전력이 300W를 초과하면 구리전극의 온도가 너무 높아지고 이로 인해 플라즈마 활성종이 변화되어서 합성이 잘 진행되지 않는 문제가 있을 수 있다. 그리고, 플라즈마 처리 시간이 30분 미만이면 EGCG 이량체의 수율이 너무 낮은 문제가 있을 수 있고, 플라즈마 처리 시간이 70분을 초과하더라도 EGCG 이량체의 수율 증대가 없는 바, 비경제적이다.
또한, 상기 전압 인가는 주파수 1 ~ 20 kHz, 바람직하게는 13 ~ 17 kHz, 더욱 바람직하게는 14 ~ 16 kHz의 양극성 사각파형 전압 또는 양극성 싸인파형 전압을 인가하여 수행할 수 있다. 이때, 전압의 주파수가 1 kHz 미만이면 EGCG 이량체의 수율이 너무 낮은 문제가 있고, 주파수가 20 kHz를 초과하면 구리전극의 온도가 너무 높아지고 이로 인해 플라즈마 활성종이 변화되어서 합성이 잘 진행되지 않는 문제가 있을 수 있다.
다음으로, 3단계는 2단계의 DBD 플라즈마 처리한 반응생성물을 포함하는 용액으로부터 메탄올 수용액을 제거하는 공정으로서, 상기 반응생성물을 포함하는 용액을 진공 감압 농축하여 메탄올 수용액을 제거한 후, 건조시켜서 건조물을 획득할 수 있다. 이때, 진공 감압 농축 방법은 당업계에서 사용하는 일반적인 방법을 사용할 수 있다.
다음으로, 4단계는 상기 건조물을 메탄올 수용액에 다시 용해시킨 후, 용해액을 에틸아세테이트(EtOAc)로 분획처리하여 EtOAc 가용성 부분을 포함하는 분획물을 획득하는 공정을 수행한다. 이때, 상기 4단계의 메탄올 수용액은 5 ~ 20 부피% 농도의 메탄올 수용액을, 바람직하게는 7 ~ 15 부피% 농도의 메탄올 수용액을, 더욱 바람직하게는 8 ~ 12 부피% 농도의 메탄올 수용액을 사용하는 것이 순도 증가 측면에서 유리하다.
다음으로, 5단계는 상기 분획물을 건조하여 화학식 1로 표시되는 이량체 및 화학식 2로 표시되는 이량체를 포함하는 갈색 무정형 분말의 건조된 에틸아세테이트 가용성 분획물을 수득할 수 있다.
그리고, 5단계는 건조 전에 상기 분획물의 분획물을 진공 감압 농축하여 화학식 1 및/또는 화학식 2로 표시되는 EGCG 이량체의 순도를 향상시킬 수도 있다.
또한, 6단계를 더 수행하여, 5단계의 건조된 에틸아세테이트 가용성 분획물을 컬럼으로, 바람직하게는 ODS 겔 컬럼으로 분획 처리하여 화학식 1 및/또는 화학식 2로 표시되는 갈색 무정형 분말 형태의 EGCG 이량체를 수득할 수도 있다.
이러한 방법으로 제조된 화학식 1로 표시되는 이량체의 수율은 22.0 ~ 40.0%, 바람직하게는 23.5 ~ 37.0%, 더욱 바람직하게는 24.0 ~ 36.0%일 수 있다. 그리고, 화학식 1로 표시되는 이량체의 순도는 99.0% 이상, 바람직하게는 99.50% ~ 99.99%, 더욱 바람직하게는 99.800 ~ 99.999%일 수 있다.
또한, 상기 화학식 2로 표시되는 이량체의 수율은 35 ~ 50%, 바람직하게는 40 ~ 47%, 더욱 바람직하게는 42.0 ~ 46.5%이고, 순도는 99.0% 이상, 바람직하게는 99.50% ~ 99.99%, 더욱 바람직하게는 99.800 ~ 99.999%일 수 있다.
이렇게 제조된 본 발명의 화학식 1 및/또는 화학식 2로 표시되는 EGCG 이량체는 멜라닌 생성 단백질인 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 MITF의 발현을 억제하여 피부 미백 향상 효과가 우수한 바, 미백 향상제, 기능성 화장료 조성물 등의 재료로 사용하기에 적합하다.
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 자세하게 설명을 한다. 그러나, 하기 실시예에 의해서 본 발명의 권리범위가 한정하여 해석해서는 안된다.
[ 실시예 ]
1. 시약(reagent) 및 도구
EGCG(Epigallocatechin gallate) 단량체, 아세토 니트릴, 메탄올, 포름산(HPLC 급), 에틸아세테이트 및 중수소화 메탄올은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA) 또는 Merck (KGaA, Darmstadt, Germany)에서 구입한 것을 사용하였다.
DMEM(Dulbecco 's modified Eagle's medium, 4.5g/L glucose)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입한 것을 사용하였다.
스트렙토마이신(Streptomycin), 페니실린(penicillin) 및 FBS(fetal bovine serum)은 Gibco(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 입수한 것을 사용하였다.
다른 화학 물질은 Wako Pure Chemical Co., Ltd.(Osaka, Japan)에서 구입하였으며, 또한, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.(Tokyo, Japan)에서 24-웰 마이크로플레이트(well multiplates)와 96-웰 마이크로플레이트(Sumilon)를 구입하여 사용하였다.
실시예 1 : EGCG 이량체의 합성
200ppm 농도의 메탄올 수용액 2.5L에 EGCG 단량체 500 mg을 혼합 및 교반시켜서 반응용액을 제조하였다.
DBD 플라스마 장치는 이전에 평행 육면체 플라스틱 용기(240mm × 200mm × 100mm)가 장착된 반면 반응기(actuator)가 구비되어 있고, 상기 반응기는 PTFE 시트 전극과 구리(Cu) 전극으로 구성되어 있다.
앞서 제조한 반응용액을 유리접시에 담은 후, 이를 상기 반응기의 플라스틱 용기 내에 투입한 후, 플라즈마 처리 공정을 수행하였다. 이때, 상기 구리 전극에는 주파수 15 kHz의 양극성 사각파형 전압(bipolar square-waveform voltage)을 인가하였다. 그리고, 공기를 방전 기체로 사용하여 피크 전압 250 W를 가하여 플라즈마를 발생시키고, 반응용액을 마그네틱 막대를 이용하여 교반시키면서, 발생된 플라즈마에 40분간 노출시켜서 DBD 플라즈마 처리 공정을 수행하였다.
다음으로, DBD 플라즈마 처리한 반응생성물을 포함하는 용액을 진공 감압 농축하여 메탄올 수용액을 증발시켜서 용매를 제거하여 건조물을 수득하였다.
다음으로, 상기 건조물을 10 부피% 농도의 메탄올 수용액(120 ml)에 용해시킨 후, 에틸아세테이트로 분획한 후(3×120 ml), 건조시켜서 건조된 EtOAc 가용성 물질(471.9 mg)을 수득하였다.
그리고, EtOAc 가용성 물질을 YMC GEL ODS AQ 120-50S 칼럼(1.1 cm × 47 cm, YMC Co., Kyoto, Japan)을 통과시켜 직접 구배 혼합물의 H2O-MeOH와 반응시켜 순수한 갈색 무정형 분말의 하기 화학식 2로 표시되는 EGCG 이량체(tR=12.1 분, 121.6 mg) 및 갈색 무정형 분말의 하기 화학식 1로 표시되는 EGCG 이량체(tR=13.8 분, 213.6 mg)을 수득하였다.
이하에서는 화학식 1로 표시되는 EGCG 이량체를 "화학식 1-이량체"로 칭하고, 화학식 2로 표시되는 EGCG 이량체를 "화학식 2-이량체"로 칭한다.
[화학식 1]
Figure 112018125960411-pat00005
[화학식 2]
Figure 112018125960411-pat00006
실시예 2
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 EGCG 이량체를 합성하되, 플라즈마 처리를 60분간 수행하여 화학식 1-이량체 및 화학식 2-이량체를 수득하였다.
비교예 1
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 EGCG 이량체를 합성하되, 플라즈마 처리를 20분간 수행하여 화학식 1-이량체 및 화학식 2-이량체를 수득하였다.
구분 실시예 1 실시예 2 비교예 1
DBD 플라즈마 처리시간 40분 60분 20분
피크 전압(입력 전압) 250 W 250 W 250 W
화학식 1-이량체의수율 / 순도 24.3% / 99.9% 31.1% / 99.9% 7.7% / 99.1%
화학식 2-이량체의수율 / 순도 42.7% / 99.9% 39.4% / 99.9% 16.9% / 99.2%
실험예 1 : 분광학 측정
상기 실시예 1에서 합성한 화학식 1-이량체 및 화학식 2-이량체의 분광학 데이터 (1H NMR, 13C NMR, 2D NMR 및 MS)를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
1H NMR 및 13C NMR은 Varian VNS600 기기(Varian, Palo Alto, CA, USA)에서 1H 및 13C NMR(핵자기공명) 스펙트럼을 측정하는 동안 Hitachi U-2000 분광 광도계(Hitachi, Tokyo, Japan)를 사용하여 자외선 (UV) 각각 600 MHz 및 150 MHz에서 작동시켜서 측정하였다. 그리고, 화학적 이동은 테트라메틸실란(TMS) 규모의 용매 아세톤 -d6 (H 2.04; C 29.8)의 값과 비교하여 ppm 값으로 주어지며, 기기에 프로그래밍된 표준 펄스 시퀀스를 각 2 차원 측정에 사용했다. JCH 값은 이핵 핵다중 결합(HMBC) 스펙트럼에서 8 Hz로 설정하였다.
또한, FABMS(Fast atom bombardment mass spectrometry)는 YMC GEL ODS AQ 120-50S (YMC Co., Kyoto, Japan)를 사용하여 컬럼 크로마토그래피를 수행하면서 Micro Mass Auto Spec OA-TOF 분광기(Micromass, 영국, Manchester)를 사용하여 수행하였다. 그리고, Kelselgel 60 F254 플레이트(0.25mm 두께, Merck, Darmstadt, Germany)에서 TLC(thin-layer chromatography)를 수행하고 UV 조사 (254 및 365 nm) 및 10 부피% 농도의 H2SO4 시약으로 분무하여 스폿(spot)을 검출하였다.
화학식 1-이량체 [α]25 D -201.9° (c 0.1, MeOH), FABMS m/z 929 [M+H]+,
1H NMR (600 MHz, acetone-d 6+D2O): δ 7.08 (2H, s, H-2'', 6''), 6.99 (2H, s, H-2a'', 6a''), 6.77 (2H, s, H-2', 6'), 6.60 (2H, s, H-2a', 6a'), 6.15 (1H, s, H-6), 6.12 (1H, s, H-8a), 5.57 (1H, m, H-3'), 5.48 (1H, m, H-3a'), 5.29 (1H, s, H-2), 4.99 (1H, brs, H-2a), 3.87 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-CH2), 3.82 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-CH2), 3.08 (1H, m, H-4), 3.05 (1H, m, H-4a), 2.97 (1H, m, H-4), 2.88 (1H, m, H-4a)
13C NMR(150 MHz, acetone-d 6+D2O): δ 166.1 (C-7''), 166.0 (C-7a''), 155.5 (C-9a), 154.9 (C-9), 154.3 (C-7), 154.2 (C-7a), 154.1 (C-5a), 152.5 (C-5), 146.2 (C-3a'), 146.0 (C-3'), 145.7 (C-3'', 5''), 145.6 (C-3a'', 5a''), 138.6 (C-4a''), 138.5 (C-4''), 133.4 (C-4'), 132.8 (C-4a'), 130.5 (C-1'), 129.3 (C-1a'), 121.5 (C-1''), 121.4 (C-1a''), 109.9 (C-2'', 6''), 109.7 (C-2a'', 6a''), 106.6 (C-2a', 6a'), 107.2 (C-8), 106.5 (C-2', 6'), 105.8 (C-6a), 100.2 (C-10), 99.7 (C-10a), 97.1 (C-6), 96.2 (C-8a), 79.6 (C-2), 77.8 (C-2a), 69.3 (C-3), 68.9 (C-3a), 26.9 (C-4), 26.5 (C-4a), 17.0 (C-CH2)
화학식 2-이량체 [α]25 D -262.1° (c 0.1, MeOH), FABMS m/z 929 [M+H]+
1H NMR (600 MHz, acetone-d 6+D2O): δ 7.11 (4H, s, H-2'', 2a'', 6'', 6a''), 6.77 (4H, s, H-2', 2a', 6', 6a'), 6.10 (2H, s, H-6, 6a), 5.52 (2H, m, H-3, 3a), 5.20 (2H, s, H-2, 2a), 3.98 (2H, s, H-CH2), 3.07 (2H, dd, J = 17.4, 4.8 Hz, H-4, 4a), 2.98 (2H, dd, J = 17.4, 1.8 Hz, H-4, 4a).
13C NMR(150 MHz, acetone-d 6+D2O): δ 166.5 (C-7'', 7a''), 155.8 (C-9, 9a), 155.6 (C-7, 7a), 152.6 (C-5, 5a), 146.4 (C-3'', 3a'', 5'', 5a''), 145.9 (C-3', 3a', 5', 5a'), 139.0 (C-4'', 4a''), 133.5 (C-4', 4a'), 129.7 (C-1', 1a'), 121.5 (C-1'', 1a''), 110.3 (C-2'', 2a'', 6'', 6a''), 106.8 (C-2', 2a', 6', 6a''), 105.5 (C-8, 8a), 99.3 (C-10, 10a), 97.4 (C-6, 6a), 79.5 (C-2, 2a), 69.3 (C-3, 3a), 26.9 (C-4, 4a), 16.3 (C-CH2)
분광학 측정을 통하여, 실시예 1에서 합성한 화학식 1-이량체가 상기 화학식 1로 표시되는 EGCG 이량체 화합물임을 확인할 수 있었으며, 화학식 2-이량체가 상기 화학식 2로 표시되는 EGCG 이량체 화합물임을 확인할 수 있었다.
실험예 2 : 크로마토그래피 분석을 통한 정량분석
플라스마 처리에 의해 합성된 EGCG 이량체 생성물의 크로마토 그래피 분석을 위해 광 다이오드 어레이(PDA, photodiode-array) 검출기가 있는 고성능 액체 크로마토 그래피(HPLC, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 사용하여 정량분석을 수행하였다.
YMC-Pack ODS(옥타데실실릴화한실리카)겔 A-302 컬럼(4.6 mm i.d.Х150 mm; YMC Co., Kyoto, Japan)을 사용하여 수행하였고 용매는 30 분에 걸쳐 CH3CN으로 증가되는 초기 1% HCOOH-H2O의 구배 모드로 구성되었다(온도: 40℃; 유량: 1.0 mL/min; UV 감지(detection); 280 nm).
또한, 연속 칼럼 크로마토 그래피는 YMC GEL ODS AQ 120-50S 시스템 (YMC Co., Kyoto, Japan)을 사용하여 수행하였다. EGCG 단량체로부터 새로 생성된 반응물인 EGCG 이량체 및 순수 EGCG 단량체의 보유 시간(retention times)을 비교하여 식별하였다.
3 가지 표준 용액(EGCG 단량체, 화학식 1-이량체 및 화학식 2-이량체)을 각각 2,500 mg/L의 메탄올로 제조하였다. 그런 다음 작업 용액(working solution)을 5 ~ 250 mg/L 범위의 5 가지 농도 수준을 달성하기 위해 메탄올을 사용하여 순차 희석한 후, 이들 스톡 용액(stock solution)의 혼합물로서 수득하였다.
그리고, 작동 용액을 HPLC 주입 전에 주사기 필터(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)를 통해 여과시킨 후, 5개의 상이한 농도에서 각각의 표준 농도(X mg/L)에 대한 적분 피크 면적(Y)의 선현 회귀 분석에 의해 선형성을 결정하였으며, 그 결과를 도 1의 (D) 표준 용액에 나타내었다.
도 1에서 (A)는 비교예 1, (B)는 실시예 1, (C)는 실시예 2에 대한 HPLC 크로마토그램 측정 결과이다. 그리고, 도 1에서 숫자 1은 EGCG 단량체에 대한 피크이고, 숫자 2는 화학식 1-이량체 피크이며, 숫자 3은 화학식 2-이량체 피크이다.
도 1을 살펴보면, 20분 동안 플라즈마 처리한 EGCG(비교예 1)의 경우 화학식 1과 2의 화합물이 소량 생성됨에 비해서 40분 플라즈마 처리군(실시예 1)에서는 화학식 1과 2의 화합물이 상당량 생성됨을 확인하였으며, 60분 플라즈마 처리군(실시예 2)에서는 40분 플라즈마 처리군과 거의 유사한 결과를 확인할 수 있었다.
또한, EGCG 단량체, 실시예 1 ~ 2와 비교예 1의 화학식 1-이량체 및 화학식 2-이량체의 함량을 외부 표준 방법을 사용하여 정량화하고 플라즈마 처리 용액의 개별 성분 함량(mg/g)측정 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
이때, 성분 함량 측정은 검량선 작성을 위해 5 가지 농도를 사용했으며, 선택된 화합물의 순수 용액 검량선은 완전히 선형이었다 (R2> 0.999). 3 개의 플라즈마 처리된 샘플에 대해 HPLC분석을 통하여 화학식 2-이량체(tR 12.1 분), 화학식 1-이량체(tR 13.8 분) 및 EGCG 단량체(tR 9.4 분)의 유지 시간을 280 nm에서 검출했다. 또한, 분석시 플라즈마 처리된 반응생성물로부터 EGCG 이량체만 분리하고 기타 불필요한 성분들을 제거하기 위하여 에틸아세테이트 분획을 수행하였으며 에틸아세테이트 가용성분획을 시료로 하여 정량 후 역으로 플라즈마 처리한 시료의 양에 대한 수율을 계산하였다.
정량 분석 결과 비교예 1(플라즈마 처리 시간-20분), 실시예 1(40분), 실시예 2(60분)의 반응물 중 가장 강력한 화학식 1-이량체의 함량은 각각 169.1±1.1 mg/g, 403.1±1.3 mg/g, 394.4±1.3 mg/g이었다. 또한, DBD 플라즈마 노출 40 분 후에 화학식 1-이량체와 화학식 2-이량체의 최대 생산이 발생했다. 대조적으로, EGCG 단량체 함량은 60 분 처리에서 149.2±0.7 mg/g의 최소값으로 감소했다(표 3). 이 결과는 DBD 플라스마 처리시 최대 40 분 동안 항멜라닌 화학식 1-이량체와 화학식 2-이량체가 효율적인 이량체화가 증가함을 시사한다. 특히, 8,6'- 위치의 메틸렌 다리를 통해 연결되어 있는 화학식 1-이량체는 전환율이 약 0.3%로 가장 많은 양으로 생성되었다.
구분 t R (retention time) 비교예 1
(mg/g)		 실시예 1
(mg/g)		 실시예 2
(mg/g)
EGCG 단량체 9.3 분 732.6±1.5 153.9±0.8 149.2±0.7
화학식 2-이량체 12.1 분 77.0±0.9 338.7±1.2 311.5±1.0
화학식 1-이량체 13.8 분 169.1±1.1 403.1±1.3 394.4±1.3
실험예 3 : 세포 생존율 측정 실험
(1) 흑색종 세포 배양
마우스(mouse) 멜라노 세포주인 B16F10은 한국 세포주 은행(Korea Cell Line Bank, Korea)에서 구입하여, 37℃에서 5% CO2/공기 중에서 페니실린(100 U/mL), 10% FBS 및 스트렙토마이신(100 ㎍/mL)을 함유한 DMEM(Dubecco's modified eagle medium)에서 배양하였다.
(2) 세포 생존율(Cell viability) 측정
상기 흑색종 세포(B16F10)를 96-웰 마이크로 플레이트에 접종하고 하루 동안 배양하였다(5.0×103 세포/100μL/well).
다음으로, 샘플을 1 mM 테오필린 및 시험화합물을 각 웰에 첨가하고 48 시간 배양하고, 그 후 20 ㎕의 MTT 용액(5 mg/mL)을 각 웰에 첨가하였다.
배양 4 시간 후, 세포에 의해 생성된 수용성 포르마잔(formazan)의 광학 밀도를 540 nm에서 마이크로 플레이트 판독기로 측정하였다. 이어서, 시험 화합물을 디메틸술폭사이드(DMSO)에 용해시키고, 배지 중의 DMSO의 최종 농도는 0.1 %이었다.
마지막으로, 세포 생존율(%)은 다음 식 1을 사용하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 여기서 A 및 B는 비하이클-(vehicle-) 및 시험 화합물-처리된 그룹의 광학 밀도를 각각 나타냈다.
[식 1]
세포 생존율(Cell viability, %) = B/A × 100(%)
시험화합물의 세포 독성은 120M 및 5M의 농도에서 B16F10 흑색종 세포 생존능에 기초하여 측정하였다. 세포 생존능 분석에서 100M 이하의 농도에서 시험 화합물 중 어느 것에 대해서도 주목할 만한 세포 독성은 관찰되지 않았다.
여기서, 상기 시험 화합물은 실시예 1에서 합성한 화학식 1-이량체, 화학식 2-이량체, EGCG 이량체 또는 알부틴이다.
구분 실시예 1
(%)		 실시예 2
(%)
화학식 2-이량체 93.8 92.9
화학식 1-이량체 96.9 96.2
상기 표 4의 세포 생존율 측정 결과를 통해 화학식 1 및 화학식 2의 이량체가 세포 독성이 없는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4 : 멜라닌 생성 분석
멜라닌은 박테리아, 균류, 식물 및 동물에서 가장 널리 분포된 화합물 중 하나이다. 포유류의 피부와 모발의 색깔은 여러 요인과 밀접한 관련이 있다. 가장 중요한 것은 멜라닌 색소 침착 정도와 분포이다.
멜라닌은 자외선을 흡수하고 활성 산소종을 제거하여 자외선(UV) 손상으로부터 피부를 보호하는 데 중요한 역할을 한다. 그러나, 햇빛에 장기간 노출되어 멜라닌이 과도하게 생성되면 주근깨, 멜리스마, 염증성 멜라닌 증후군 및 태양 lentigines와 같은 피부병이 유발한다. 멜라닌은 진피 기저층에 분포 된 멜라닌 세포로부터 분비된다. 멜라닌 세포는 자외선, MSH(amelanocyte-stimulating hormone) 및 인산디에스테라트억제제(phosphodiesterase)를 포함한 여러 요인에 의해 자극을 받는 것으로 알려져 있다.
실시예 1에서 합성한 화학식 1-이량체, 화학식 2-이량체, EGCG 이량체, 알부틴의 멜라닌 생성 억제 효과를 다음과 같이 분석하였다.
B16F10 흑색종 세포를 24-웰 플레이트에 접종하였다(2.0×104 cell/400 ㎕/well). 배양 24 시간 후, 시험 화합물 및 1 mM 테오필린(theophylline)을 각 웰에 첨가하고 샘플을 3일 동안 배양하였다. 다음으로, 0.25% 트립신과 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 1 mM을 함유한 PBS(phosphate buffer saline)로 배양하고, PBS로 세척한 다음, 1 M NaOH(120 μL/tube, 80℃, 30 분)로 처리하여 용해물을 얻었다.
상기 용해물의 분취량(100 μL)을 96-웰 마이크로 플레이트로 옮긴 후, 마이크로 플레이트 판독기(Infinite F200; Tecan Austria GmBH, Grφdig, Austria)로 405 nm에서 각 웰의 광학 밀도를 계산했다(기준 655 nm). 이어서, 시험 화합물을 DMSO에 용해시켜 배지 중 0.1% DMSO의 최종 농도를 얻었다. 이어서, 멜라닌 함량을 세포 생존 능력에 기초하여 보정하였고, 그 후 억제율(%)은 하기 식 2를 사용하여 계산하였다.
[식 2]
멜라닌 생성 억제율(%,Inhibition) = [(A - B)/A/(C/100)] × 100(%)
여기서 A 및 B는 비히클- 및 시험 화합물-처리된 그룹의 광학 밀도를 나타내고, C는 세포 생존률(%)을 나타내고, IC50 값은 그래프로 결정된다.
하기 표 5에 나타난 바와 같이, 입체 화학적으로 활성인 화학식 1-이량체는 IC50 값이 각각 34.0±1.8 M 및 43.1±1.7 M 인 세포질 티로시나제 및 멜라닌 생성 억제 활성을 현저히 하향 조절하고, EGCG 단량체 보다 유효 농도에서 세포 독성 효과를 나타내지 않았다.
시험화합물 IC50 value(M)a
티로시나제 억제율(Tyrosinase inhibition) 멜라닌 생성 억제율(Melanogenesis inhibition)
EGCG 단량체 65.1±2.9 110.3±5.6
화학식 1-이량체(실시예 1) 34.0±1.8 43.1±1.7
화학식 2-이량체(실시예 2) 57.4±2.1 66.3±3.0
알부틴(Arbutin)b >300 156.3±4.9
a : 모든 시험화합물은 3회 반복실시한 평균값을 나타낸 것이다.
b : 양성대조군(positive control)
실험예 5: 멜라닌 생성 관련 효소에 대한 발현 억제 측정
티로시나제, TRP-1, TRP-2와 같은 TRP 효소 군의 구성원은 멜라닌 합성의 주요 단계를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 실시예 1에서 합성한 화학식 1-이량체, 화학식 2-이량체의 B16F10 흑색종 세포에서 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2 및 MITF(Microphthalmia-associated transcription factor)에 대한 멜라닌 생성 관련 효소의 발현에 미치는 영향을 평가하기 위해 웨스턴 블라팅 분석 및 단백질 발현(protein expression rate,%)을 측정함으로서, 발현 억제 여부를 확인하였다.
실시예 1에서 합성한 화학식 1-이량체, 화학식 2-이량체 및 EGCG 단량체의 웨서턴 블롯 분석을 하기와 같은 방법으로 실시하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었으며, 단백질 발현율(%)을 도 3에 그래프로 나타내었다.
50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 350 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 0.5 % Nonidet P-40, 10 % 글리세롤, 0.1 % DS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 및 포스파타아제 억제제 칵테일(phosphatase inhibitor cocktail, Thermo Scientific)를 함유하는 용해 완충액에 중에서 얼음 위에서 30분 동안 세포를 용해시켰다.
이어서, 용해액을 SDS-PAGE로 분석하고, 니트로(nitro)-셀룰로오스 막(Sigma-Aldrich)에 옮겼다. 웨스턴 블랏팅(blotting)을 위해 상기 막을 5% 탈지유가 들어있는 블로킹 완충액에서 차단시킨 다음 4℃에서 밤새 적절한 표적 분자에 특이적인 1 차 항체와 함께 배양하였다. 이어서 블롯(blots)을 세척하고 서양고추냉이(horseradish) 퍼옥시다아제-결합 2차 항체(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies)로 실온(약 22~25℃)에서 1 시간 동안 배양한 후, 1 nM의 α-MSH의 존재 하에 20 μM의 시험 화합물(화학식 1-이량체, 화학식 2-이량체 및 EGCG 단량체)로 각각 처리하였으며, 대조군 1은 시험 화합물로 처리하지 않았고, 대조군 2는 알부틴(arbutin)으로 처리하였다. 그리고, ECL 검출 키트(SurModics, Inc., Eden Prairie, MN, USA)를 사용하여 신호를 검출하였다.
도 2 및 도 3을 살펴보면, EGCG 단량체 및 화학식 1-이량체는 티로시나제, MITF, TRP-1, TRP-2 효소의 발현이 억제시키는 것을 확인할 수 있다(표 6 참조). 이에 반해, 화학식 2-이량체의 경우, 효소 발현이 화학식 2-이량체에 비해 억제 효과가 미비한 결과를 보였다.
구분 티로시나아제 발현율(%) MITF
발현율(%)		 TRP-1
발현율(%)		 TRP-2
발현율(%)
대조군 1 100% 100% 100% 100%
대조군 2 58.1% 68.9% 72.3% 20.8%
EGCG 단량체 100% 91.3% 77.8% 97.2%
화학식 1-이량체 81.6% 73.5% 67.2% 65.8%
화학식 2-이량체 98.8% 97.5% 98.1% 96.7%
상기 분석 결과를 통해, EGCG의 DBD 플라즈마 처리하여 합성한 화학식 1로 표시되는 이량체가 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 MITF 발현의 억제를 통해 항-멜라닌 생성 효과를 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
상기 실시예 및 실험예를 통하여, 본 발명의 제조방법을 통해 EGCG 이량체를 높은 수율로 용이하게 제조할 수 있음을 확인할 수 있었을 뿐만 아니라, 제조된 EGCG 이량체 중 화학식 1로 표시되는 이량체가 매우 우수한 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 MITF 발현의 억제를 통해 항-멜라닌 생성 효과 얻을 수 있음을 확인할 수 있었다. 이를 통하여, 본 발명의 제조방법으로 제조한 특정 EGCG 이량체를 이용하여 미백 향상제, 기능성 화장료 조성물 등 다양한 피부 관련 제품에 응용할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (12)

  1. EGCG(epigallocatechin gallate) 단량체를 유전 장벽 방전(dielectric barrier discharge) 플라즈마 처리 공정을 수행하여, 하기 화학식 1로 표시되는 이량체 및 화학식 2로 표시되는 이량체를 포함하는 이량체 중에서 선택된 1종 이상의 이량체를 합성하는 것을 특징으로 하는 에피갈로카테킨 갈레이트 이량체를 제조하는 방법.
    [화학식 1]
    Figure 112018125960411-pat00007

    [화학식 2]
    Figure 112018125960411-pat00008
  2. 제1항에 있어서,
    EGCG 단량체 및 메탄올 수용액을 혼합하여 반응용액을 제조하는 1단계;
    상기 반응용액을 유전 장벽 방전 플라즈마 장치를 이용하여, 플라즈마 처리하여, 반응생성물 함유 용액을 제조하는 2단계;
    상기 반응생성물 함유 용액을 진공 감압 농축하여 메탄올 수용액을 제거 및 건조시켜서 건조물을 획득하는 3단계;
    상기 건조물을 5 ~ 20 부피% 농도의 메탄올 수용액에 용해시킨 후, 에틸아세테이트로 분획처리하여 분획물을 획득하는 4단계; 및
    상기 분획물을 진공 감압 농축 및 건조하여 화학식 1로 표시되는 이량체 및 화학식 2로 표시되는 이량체를 포함하는 건조된 에틸아세테이트 가용성 분획물을 수득하는 5단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 에피갈로카테킨 갈레이트 이량체를 제조하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 건조된 에틸아세테이트 가용성 분획물을 컬럼 분획 처리하여 화학식 1로 표시되는 이량체 및 화학식 2로 표시되는 이량체 중에서 선택된 1종 이상의 이량체를 수득하는 6단계;를 더 포함하는 것을 하는 에피갈로카테킨 갈레이트 이량체를 제조하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 1단계의 반응용액은 메탄올 수용액 1L 당 EGCG 단량체를 150 ~ 400 mg으로 포함하는 것을 특징으로 하는 에피갈로카테킨 갈레이트 이량체를 제조하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 메탄올 수용액은 100 ~ 600ppm 농도의 메탄올 수용액인 것을 특징으로 하는 에피갈로카테킨 갈레이트 이량체를 제조하는 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 유전 장벽 방전 플라즈마 장치 내 반응기는 PTFE 시트로 구성된 전극 및 구리 전극을 구비하고 있으며, 상기 플라즈마 처리는
    대기 중의 공기를 방전 기체로 사용하여, 상기 구리 전극에 주파수 1 ~ 20 kHz의 양극성 사각파형 전압(bipolar squre-waveform voltage) 또는 양극성 싸인파형 전압(bipolar sine-form voltage)를 인가하고, 200 ~ 300 W의 피크 전력 하에서 30분 ~ 70분간 수행하는 것을 특징으로 하는 에피갈로카테킨 갈레이트 이량체를 제조하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 이량체의 수율은 22.0 ~ 40.0%이고, 순도는 99.0% 이상인 것을 특징으로 하는 에피갈로카테킨 갈레이트 이량체를 제조하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 이량체의 수율은 35 ~ 50%이고, 순도는 99.0% 이상인 것을 특징으로 하는 에피갈로카테킨 갈레이트 이량체를 제조하는 방법.
  9. 삭제
  10. 제2항의 건조된 에틸아세테이트 가용성 분획물을 포함하는 미백 향상제.
  11. 삭제
  12. 제2항의 건조된 에틸아세테이트 가용성 분획물을 포함하는 화장료 조성물.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20080275258A1 (en) * 2004-05-27 2008-11-06 Suntory Limited Epigallocatechin Dimers or Trimers Having Lipase Inhibitory Activity and/or Antioxidant Activity

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080275258A1 (en) * 2004-05-27 2008-11-06 Suntory Limited Epigallocatechin Dimers or Trimers Having Lipase Inhibitory Activity and/or Antioxidant Activity

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HASHIMOTO, F. 등, Evaluation of the Anti-oxidative Effect (in vitro) of Tea Polyphenols, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67 (2), 396-401, 2003*
HASHIMOTO, F. 등, Tannins and Related Compounds X.C. 8-C-Ascorbyl(-)-Epigallocatedhin 3-O-Gallate and Novel Dimeric Flavan-3-ols, Oclonvhomobisflavans A and B, from Oolong Tea. Chem. Pharm. Bull. 37(1*
TANATKA, T. 등, Chemistry of Secondary Polyphenols Produced during Processing of Tea and Selected Foods, Int. J. Mol. Sci. 2010, 11, 14-40*

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