KR102221248B1

KR102221248B1 - 플라즈마 처리된 카테킨 유래 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항비만용 조성물

Info

Publication number: KR102221248B1
Application number: KR1020190095064A
Authority: KR
Inventors: 김태훈
Original assignee: 대구대학교 산학협력단
Priority date: 2019-08-05
Filing date: 2019-08-05
Publication date: 2021-03-03
Also published as: KR20210018580A

Abstract

본 발명은 플라즈마 처리된 카테킨 유래 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항비만용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 카테킨에 플라즈마를 처리하여 3종의 카테킨 유래의 신규 화합물(메틸렌테트라카테킨, 메틸렌트리카테킨 및 메틸렌디카테킨)을 제조하였으며, 상기 화합물들이 카테킨에 비해 췌장 리파아제(pancreatic lipase)의 활성을 저해하고, 지방세포의 분화 시 지방축적을 억제하는 효과가 현저하므로, 플라즈마 처리된 카테킨 유래 신규 화합물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 항비만용 치료제 또는 항비만용 건강기능식품의 소재로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 플라즈마 처리를 통한 신규한 카테킨 화합물은 대량생산이 가능하고, 플라즈마를 사용함으로써 인체에 유해한 시약을 전혀 사용하지 않는 청정화학의 방법으로 생산할 수 있다는 장점이 있다.

Description

플라즈마 처리된 카테킨 유래 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항비만용 조성물{Novel compound from plasma-treated catechin and anti-obesity composition comprising the same as effective component}

본 발명은 플라즈마 처리된 카테킨 유래 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항비만용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 카테킨에 플라즈마를 처리하여 생성된 카테킨 유래 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항비만용 조성물에 관한 것이다.

비만은 체내에 지방조직이 과다하게 축적된 상태로, 비만인 경우 일반적으로 체중이 많이 나가지만, 비만이 아니더라도 근육이 많은 사람도 체중이 많이 나갈 수 있기 때문에 체내에 지방조직이 과다한 상태를 비만으로 정의한다. 오랜 기간에 걸쳐 에너지 소비량에 비해 영양소를 과다 섭취할 경우 에너지 불균형에 의해 비만이 유도되며, 이 외에도 호르몬의 변화, 유전, 정신 건강 문제 및 사회경제적 요인 등이 복합적으로 관련되어 있다. 전 세계적으로 비만 인구가 증가하는 추세로, 최근 성인병을 유발하는 중요한 요인으로 지목받으며 비만의 심각성이 중요한 문제로 대두되고 있다.

비만을 예방 및 개선하고, 건강 체중을 유지하기 위해서는 균형잡힌 식사와 규칙적인 운동을 통하여 평생 동안 꾸준한 관리가 필요하다. 특히 지방세포는 한번 만들어지면 크기는 줄일 수 있으나, 자연적으로 제거하는 것은 불가능하여 영구적으로 인체에 남아있게 되므로 처음부터 비만이 되지 않도록 예방하는 것이 중요하다.

비만의 예방, 개선 또는 치료를 위해서 섭취하는 칼로리를 줄이고, 활동 및 운동량을 증가시키는 방법 및 지방흡수를 감소시키는 등의 약물을 복용하는 방법 등이 이용되고 있다.

현재 비만을 치료하는 치료제로는 세로토닌 신경계를 저해하는 펜플루라민, 노르아드레날린 신경계를 통한 에페드린 및 카페인, 세로토닌 및 노르아드레날린 신경계에 동시에 작용하는 시부트라민 및 췌장에서 생성되는 리파아제를 저해하여 지방의 흡수를 줄여주는 오르리스타트 등의 약물이 있다. 그러나 기존에 사용되어온 약물 중 펜플루라민 등은 원발성 폐고혈압이나 심장 판막 병변과 같은 부작용을 일으켜 사용이 금지되었으며, 다른 약물들도 혈압 감소나 유산혈증 등의 문제점이 발생하여 심부전, 신질환 등의 환자에는 사용하지 못하는 문제점이 있다. 따라서 부작용이 적은 비만의 예방, 개선 또는 치료 물질의 개발이 요구된다.

한편, 카테킨은 플라보노이드 그룹의 flavan-3-ols에 속하며, 폴리페놀의 일종으로 녹차의 떫은 맛 성분이다. 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)에서 파생되었으며, 백차, 녹차, 홍차, 우롱차에 포함되어 있다. 그러나 홍차나 우롱차의 경우 발효과정에서 반 이상의 카테킨이 줄어든다.

찻잎 중의 폴리페놀은 온화한 쓴맛을 내는 유리형 카테킨과 쓰고 떫은맛을 내는 에스터형 카테킨, 강한 쓴맛과 약한 떫은맛을 내는 결합형 카테킨이 있어 감의 타닌과는 달리 단백질과 분리되어 입안이 텁텁하지 않다. 주요한 카테킨으로는 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG: epigallocatechingallate), 에피갈로카테킨(EGC: epigallocatechin), 에피카테킨갈레이트(ECG: epicatechingallate), 에피카테킨(EC: epicatechin)이 있다.

카테킨은 발암억제, 동맥경화, 혈압상승 억제, 혈전예방, 항바이러스, 항당뇨, 항균, 해독작용, 소염작용, 충치예방, 구갈방지, 장내 세균총 정상화 등 다양한 효과가 있다. 카테킨의 항산화 작용과 노화의 근본적 요소인 자유라디컬 제거기능은 비타민C와 비타민E에 비해 강력한 활성산소 제거효과를 가지고 있으며, 항산화작용으로 인하여 저밀도지단백(low density lipoprotein) 산화와 같은 심혈관계 보호효과가 보고되었다.

한편, 전리된 가스 상태인 플라즈마에는 전자, 양이온, 음이온, 자유라디칼 및 광자 등을 포함하는 활성산소종이 존재한다. 최근에는 기존의 식품 살균 기술이 갖고 있는 문제점들을 최소화시키기 위하여 다양한 기술들이 개발되고 있으며, 그중에서도 비열 플라즈마 처리기술이 주목을 끌고 있다. 비열 플라즈마 기술은 식품의 미생물을 저해하는 기술 이외에 환경, 의료 분야에서 살균 및 소독기술로 개발되고 있으나, 식품의 성분에 화학적, 기능적 변화에 대한 연구는 아직 미흡한 상황이다.

한편, 한국등록특허 제1992808호에 플라즈마 처리된 플로리진 유래 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항비만용 조성물이 개시되어 있지만, 본 발명의 플라즈마 처리된 카테킨 유래 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항비만용 조성물에 관해 개시된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 카테킨에 플라즈마를 처리하여 카테킨 유래의 신규 화합물(메틸렌테트라카테킨, 메틸렌트리카테킨 및 메틸렌디카테킨)을 제조하고, 상기 플라즈마 처리된 신규 화합물을 유효성분으로 함유하는 항비만용 조성물을 제공하며, 상기 조성물이 카테킨에 비해 현저하게 췌장 리파아제(pancreatic lipase)의 활성을 저해하고, 지방축적을 억제하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

또한, 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 카테킨에 200~300W 범위의 플라즈마를 30~80분 동안 처리하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 상기 화합물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 플라즈마 처리된 카테킨 유래 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항비만용 조성물에 관한 것으로, 카테킨에 플라즈마를 처리하여 3종의 카테킨 유래의 화합물(메틸렌테트라카테킨, 메틸렌트리카테킨 및 메틸렌디카테킨)을 제조하였으며, 상기 화합물은 카테킨에 비해 췌장 리파아제(pancreatic lipase)의 활성을 저해하고, 지방세포의 분화 시 지방축적을 억제하는 효과가 현저하므로, 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로 활용할 수 있다.

또한, 본 발명의 플라즈마 처리를 통한 신규한 카테킨 화합물은 대량생산이 가능하고, 플라즈마를 사용함으로써 인체에 유해한 시약을 전혀 사용하지 않는 청정화학의 방법으로 생산할 수 있다는 장점이 있다.

도 1은 플라즈마 처리된 카테킨 반응물로부터 분리한 화합물 1 내지 6의 구조를 나타낸 그림이다. 1은 카테킨이고, 2는 신규 화합물인 메틸렌테트라카테킨(methylenetetracatechin)이고, 3은 신규 화합물인 메틸렌트리카테킨(methylenetricatechin) 화합물이고, 4는 신규 화합물인 메틸렌디카테킨(methylenedicatechin)이고, 5는 8,8'-카테키닐메탄(8,8'-catechinylmethane)이며, 6은 비스 6,8'-카테키닐메탄(bis 6,8'-catechinylmethane)이다. 도면 내 A~K는 NMR 분석 위치를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 신규 화합물인 메틸렌테트라카테킨(methylenetetracatechin)(2), 메틸렌트리카테킨(methylenetricatechin)(3) 및 메틸렌디카테킨(methylenedicatechin)(4)의 수소와 탄소의 상호 작용 관계를 나타내는 HMBC 수행결과(A) 및 CD 스펙트라(spectra) 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 신규 화합물에 의한 지방축적 억제효과를 지방의 생성 정도(A) 및 오일-레드-오 염색 사진(B)으로 확인한 결과이다. MDI[IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine), 덱사메타손(dexamethasone), 인슐린(insulin)의 혼합물]는 분화 유도 물질로, 지방전구세포인 3T3-L1의 분화를 유도하기 위해 사용하였다. Control은 화합물을 처리하지 않은 음성대조군이고, 1은 카테킨을 처리한 군이고, 2는 메틸렌테트라카테킨(methylenetetracatechin)을 처리한 군이고, 3은 메틸렌트리카테킨(methylenetricatechin)을 처리한 군이며, 4는 메틸렌디카테킨(methylenedicatechin)을 처리한 군이다. *은 동일 농도의 카테킨 처리군 대비 신규 카테킨 화합물 처리군의 지방세포 분화가 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, p<0.05이다.

본 발명은 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.

화학식 1은 메틸렌테트라카테킨(methylenetetracatechin) 화합물이고, 화학식 2는 메틸렌트리카테킨(methylenetricatechin) 화합물이며, 화학식 3은 메틸렌디카테킨(methylenedicatechin) 화합물이다.

또한, 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 플라즈마가 처리된 카테킨 유래 신규 화합물은 췌장 리파아제(pancreatic lipase)의 활성을 저해하고, 지방세포의 분화시 지방축적을 억제하는 것이지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 비만의 억제 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 주사제, 크림, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 화합물은 카테킨에 플라즈마를 처리하는 단계를 포함하여 제조할 수 있고, 상기 플라즈마는 유전장벽 방전, 코로나 방전, 마이크로파 방전 또는 아크 방전 플라즈마일 수 있으며, 예를 들면 유전체 장벽 방전의 방식으로 200~300W 전력 및 10~20㎑ 주파수 조건에서 카테킨에 30~80분 동안 처리하는 것이고, 바람직하게는 유전체 장벽 방전의 방식으로 250W 전력 및 15㎑ 주파수 조건에서 카테킨에 30~50분 동안 처리하는 것이고, 가장 바람직하게는 유전체 장벽 방전의 방식으로 250W 전력 및 15㎑ 주파수 조건에서 카테킨에 40분 동안 처리하는 것이지만, 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

실시예 1. 플라즈마가 처리된 카테킨 유래 신규 화합물의 제조 및 분리

플라즈마 처리를 위해 유전체 장벽 방전(dielectric barrier discharge, DBD)(250W, 15kHz, ambient air) 플라즈마 기기(240×200×100mm)를 사용하였다. (+)-카테킨 0.5g을 메탄올(MeOH) 2.5ℓ에 녹인 후, DBD 플라즈마 기기에서 40분 동안 처리하며, 신규 물질의 생성을 역상 HPLC(reversed phase high performance liquid chromatography)를 통하여 모니터링하였다.

HPLC 분석의 이동상 용매로는 1% 포름산(formic acid, A)과 아세토나이트릴(acetonitrile, B)을 사용하였다. 물질 분석은 0-5분 동안은 95%(v/v)의 A 용매와 5%(v/v)의 B 용매 조성으로, 5-10분 동안은 85%(v/v)의 A 용매와 15%(v/v)의 B 용매 조성으로, 10-15분 동안은 70%(v/v)의 A 용매와 30%(v/v)의 B 용매 조성으로, 15-20분 동안은 50%(v/v)의 A 용매와 50%(v/v)의 B 용매 조성으로, 20-30분 동안은 100%(v/v) B 용매 조성으로 물질 분석을 하였으며, 이동상의 유속은 분당 1.0㎖를 유지하였고, 280nm의 파장에서 화합물을 검출하였다. HPLC 분석용 칼럼은 YMC-Pack ODS A-302 컬럼(4.6mm i.d.×150mm; YMC Co., Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하였다.

플라즈마를 40분 동안 처리한 경우, 다양한 신규 물질이 생성됨을 확인한 후, 플라즈마를 40분 동안 처리한 후 생성된 카테킨 반응물을 건조하고, 메탄올(MeOH)에 용해시킨 후, YMC GEL ODS AQ 120-50S 컬럼(2.5㎝ i.d.×40㎝) 상에서 단계적 구배를 통해 총 6종의 화합물을 분리하였으며, 화합물 1은 카테킨, 화합물 2 내지 4는 신규 화합물, 화합물 5는 8,8'-카테키닐메탄(8,8'-catechinylmethane), 화합물 6은 비스 6,8'-카테키닐메탄(bis 6,8'-catechinylmethane)이라는 것을 확인하였다.

실시예 2. 플라즈마가 처리된 카테킨 유래 신규 화합물의 구조 분석

실시예 1에서 분리한 신규 화합물 3종의 구조를 분석하고, 도 1에 개시하였다.

신규 화합물 2: 황색의 무정형 분말. [α]²⁵ _D-85.1(c0.1, MeOH). 음성 HRFABMS 분석은 분자식 C₆₃H₅₆O₂₄와 일치하는 m/z 1195.3094[M-H]^-(calcd for C₆₃H₅₅O₂₄)에서 가짜 분자 이온 피크(pseudomolecular ion peak)를 나타냈다. 자외선 스펙트럼에서 206nm에서의 최대 흡수 최대치 및 280nm 부근에서의 넓은 밴드는 플라반-3-올 발색단(flavan-3-ol chromophore)의 존재를 암시하였다. ¹H NMR(CD₃OD, 600MHz) 및 ¹³C NMR(CD₃OD, 150MHz) 결과는 하기 표 1에 개시한 바와 같다. 화합물 2의 NMR 특성 및 비스 6,8'-카테키닐메탄과 화합물 2의 HRFAB 질량 스펙트럼의 m/z 1195에서의 피크를 해석하면 화합물 2가 2개의 동등한 비스 6,8'-카테키닐메탄 부분 C-8D와 C-8G 사이의 메틸렌 연결을 통해 대칭 상태로 존재한다는 것을 알 수 있었다. 화합물 2에서 3개의 메틸렌 다리 잔기의 부착위치는 도 2A에 개시된 바와 같이 HMBC 관계를 통해 명확히 확립하였다. C-3 및 C-2의 절대적 구성은 본질적으로 유사한 진단상의 원이색법(circular dichroism, CD) 스펙트럼 비교에 의해 확립되었다. 2R, 3S-구조를 갖는 플라반-3-올은 280nm에서 음성면 효과를 나타내며, 240nm 부근에서 양성면 표지를 나타내지만, 2S, 3R-트랜스 거울상 이성질체는 반대 면화 효과를 생성한다. 화합물 2의 CD 스펙트럼은 도 2B에 개시된 바와 같이 280nm 부근에서 음의 코튼 효과를 나타내고, 242nm에서 양성 코튼 효과 밴드를 나타내며, 포함하는 단위의 2R, 3S-배치를 나타냈다.

상기 분석 결과를 종합하여, 신규 화합물 2는 메틸렌테트라카테킨(methylenetetracatechin)으로 규명하였다.

신규 화합물 3: HRFABMS 분석은 분자식 C₄₇H₄₂O₁₈과 일치하는 m/z 893.2296[M-H]^-에서 가짜 분자 이온 피크(pseudomolecular ion peak)를 나타냈다. ¹H NMR(CD₃OD, 600MHz) 및 ¹³C NMR(CD₃OD, 150MHz) 결과는 하기 표 1에 개시한 바와 같다. 새로운 분자에서 두개의 메틸렌 브릿지의 연결 지점은 도 2A에 개시된 바와 같이 CH₂-그룹과 방향족 탄소 사이의 중요한 HMBC 상관 간계에 의해 명확하게 확립되었다. 2R, 3S-구성은 도 2B에 개시된 바와 같이 약 280nm에서의 강한 J _2,3 커플링 상수 및 강한 음의 코튼 효과 및 CD 스펙트럼의 약 240nm에서의 양성 코튼 효과에 기초하였다.

상기 분석 결과를 종합하여, 신규 화합물 3은 메틸렌트리카테킨(methylenetricatechin)으로 규명하였다.

신규 화합물 4: 황색의 무정형 분말. [α]²⁰ _D-7.1°(MeOH). 분자식은 이성질 카테킨에 상응하는 ¹³C NMR 분광학 관찰과 함께 음성 HRFABMS에 의해 C₃₁H₂₈O₁₂로 추론되었다. ¹H NMR(CD₃OD, 600MHz) 및 ¹³C NMR(CD₃OD, 150MHz) 결과는 하기 표 1에 개시한 바와 같다. 또한, 도 2A에 개시된 바와 같이 주요 HMBC 상관 관계의 존재로부터 C-6에서 메틸렌 다리의 결합 위치가 명확하게 확인되었다. CD 스펙트럼은 도 2B에 개시된 바와 같이 약 281nm의 음의 코튼 효과 및 240nm의 양의 코튼 효과를 나타내어 하부 및 상부 유닛의 2R, 3S-배치를 나타냈다.

상기 분석 결과를 종합하여, 신규 화합물 4는 메틸렌디카테킨(methylenedicatechin)으로 규명하였다.

¹H NMR(CD₃OD, 600MHz) 및 ¹³C NMR(CD₃OD, 150MHz) 결과

화합물		2		3		4
위치		δ_H(J in Hz)	δ_C mult.	δ_H(J in Hz)	δ_C mult.	δ_H(J in Hz)	δ_C mult.
C	2	4.76(d, 7.8)	82.8	4.75(d, 7.8)	84.4	4.57(d, 7.8)	82.7
	3	4.10(ddd, 8.4, 7.8, 5.4)	66.7	4.11(ddd, 8.4, 7.8, 5.4)	67.9	3.97(ddd, 8.4, 7.8, 5.4)	68.7
	4	2.91(dd, 16.2, 5.4)	27.2	2.92(dd, 16.2, 5.4)	28.7	2.84(dd, 16.2, 5.4)	28.6
	4	2.55(dd, 16.2, 8.4)		2.55(dd, 16.2, 8.4)		2.54(dd, 16.2, 8.4)
A	4a	-	101.1	-	101.9	-	102.2
	5	-	153.6	-	154.9	-	154.8
	6	6.03(s)	96.0	5.89(s)	97.0	-	108.1
	7	-	150.5	-	154.8	-	153.7
	8	-	105.0	-	107.8	5.99(s)	95.6
	8a	-	150.0	-	152.9	-	155.0
	9	3.65(s)	16.4	3.63(s)	18.1	3.72(s)	17.7
B	1'	-	130.4	-	130.3	-	132.1
	2'	6.88(d, 1.8)	113.8	6.88(d, 1.8)	115.6	6.79(d, 1.8)	115.1
	3'	-	145.0	-	149.9	-	146.2
	4'	-	144.7	-	146.4	-	146.1
	5'	6.77(d, 7.8)	114.9	6.76(d, 7.8)	116.4	6.74(d, 7.8)	116.1
	6'	6.80(dd, 7.8, 1.8)	119.1	6.75(dd, 7.8, 1.8)	120.6	6.68(dd, 7.8, 1.8)	119.9
F	2	4.44(d, 7.8)	81.5	4.70(d, 7.2)	84.2	4.57(d, 7.8)	82.7
	3	3.91(ddd, 8.4, 7.8, 5.4)	67.1	3.92(ddd, 7.8, 7.2, 4.8)	68.8	3.97(ddd, 8.4, 7.8, 5.4)	68.7
	4	2.73(dd, 16.2, 5.4)	29.3	2.77(dd, 16.2, 4.8)	29.0	2.84(dd, 16.2, 5.4)	28.6
	4	2.41(dd, 16.2, 8.4)		2.52(dd, 16.2, 7.8)		2.54(dd, 16.2, 8.4)
D	4a	-	100.1	-	103.1	-	102.2
	5	-	154.4	-	154.5	-	154.8
	6	-	106.7	-	109.1	-	108.1
	7	-	151.5	-	154.3	-	153.7
	8	-	105.9	-	107.4	5.99(s)	95.6
	8a	-	151.3	-	151.3	-	155.0
	10	3.74(s)	16.5	3.69(s)	18.0
E	1'	-	129.2	-	130.5	-	132.1
	2'	6.72(d, 1.8)	114.1	6.84(d, 1.8)	115.5	6.79(d, 1.8)	115.1
	3'	-	145.3	-	146.7	-	146.2
	4'	-	144.9	-	146.3	-	146.1
	5'	6.66(d, 7.8)	114.8	6.77(d, 7.8)	116.3	6.74(d, 7.8)	116.1
	6'	6.53(dd, 7.8, 1.8)	118.7	6.74(dd, 7.8, 1.8)	120.5	6.68(dd, 7.8, 1.8)	119.9
I	2	4.44(d, 7.2)	81.5	4.52(d, 7.8)	82.7
	3	3.91(ddd, 8.4, 7.2, 5.4)	67.1	4.06(ddd, 8.4, 7.8, 5.4)	68.1
	4	2.73(dd, 16.2, 5.4)	29.3	2.88(dd, 16.2, 5.4)	28.6
	4	2.41(dd, 16.2, 8.4)		2.46(dd, 16.2, 8.4)
G	4a	-	100.1	-	102.2
	5	-	154.4	-	155.9
	6	-	106.7	6.08(s)	97.1
	7	-	151.5	-	154.2
	8	-	105.9	-	106.1
	8a	-	151.3	-	151.1
	11	3.65(s)	16.4
H	1'	-	129.2	-	132.2
	2'	6.72(d, 1.8)	114.1	6.79(d, 2.4)	115.1
	3'	-	145.3	-	146.5
	4'	-	144.9	-	146.2
	5'	6.66(d, 7.8)	114.8	6.72(d, 8.4)	116.0
	6'	6.53(dd, 7.8, 1.8)	118.7	6.67(dd, 8.4, 2.4)	119.9
L	2	4.76(d, 7.8)	82.8
	3	4.10(ddd, 8.4, 7.8, 5.4)	66.7
	4	2.91(dd, 16.2, 5.4)	27.2
	4	2.55(dd, 16.2, 8.4)
J	4a	-	101.1
	5	-	153.6
	6	6.03(s)	96.0
	7	-	150.5
	8	-	105.0
	8a	-	150.0
K	1'	-	130.4
	2'	6.88(d, 1.8)	113.8
	3'	-	145.0
	4'	-	144.7
	5'	6.77(d, 7.8)	114.9
	6'	6.80(dd, 7.8, 1.8)	119.1

실시예 3. 플라즈마가 처리된 카테킨 유래 신규 화합물의 췌장 리파아제 저해 활성 측정

췌장 리파아제 저해활성 측정은 Kim 등이 행한 방법을 변형하여 실시하였다. 즉 효소 완충용액(10mM MOPS, 1mM EDTA, pH 6.8)에 돼지 췌장 리파아제(porcine pancreatic lipase)를 0.5g/200㎖의 농도로 4℃를 유지하면서 용해하고, 상기 용해물을 4000rpm으로 원심 분리한 후, 상층액에 트리스 완충용액(100mM Tris-HCl, 5mM CaCl₂, pH 7.0)과 효소 완충용액(enzyme buffer)을 혼합하였다. 실시예 1에서 분리한 화합물은 DMSO로 용해하여 최종 농도가 3%(w/v)가 되도록 한 후, 37℃에서 15분 동안 상기의 돼지 췌장 리파아제 효소와 함께 교반하였다. 그 후, 10mM이 되게 DMF에 용해한 기질용액 p-NPB(p-nitrophenyl butyrate)를 첨가하여 37℃에서 35분 동안 재반응시켰다. 반응물은 진탕한 후, ELISA 리더를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 오르리스타트(orlistat)는 양성대조군으로 사용하였다. 췌장 리파아제 저해활성은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

그 결과, 표 2에 개시된 바와 같이 카테킨에 비해 플라즈마 처리된 카테킨 반응물의 췌장 리파아제 저해 활성이 높았고, 플라즈마 처리된 카테킨 반응물로부터 분리한 화합물들의 췌장 리파아제 저해 활성을 확인하였을 때, 카테킨 반응물, 카테킨(화합물 1), 8,8'-카테키닐메탄(화합물 5) 및 비스 6,8'-카테키닐메탄(화합물 6)에 비해 본 발명의 신규 화합물인 메틸렌테트라카테킨(화합물 2), 메틸렌트리카테킨(화합물 3), 메틸렌디카테킨(화합물 4)의 저해 활성이 현저히 증가하였다. 특히 메틸렌테트라카테킨의 저해 활성이 가장 우수하였다.

화합물	IC₅₀ 값(μM)
플라즈마 처리된 카테킨 반응물	98.6±2.5
1(카테킨)	>500
2(메틸렌테트라카테킨)	18.8±1.3
3(메틸렌트리카테킨)	45.9±2.1
4(메틸렌디카테킨)	78.7±2.3
5(8,8'-카테키닐메탄)	110.3±3.5
6(비스 6,8'-카테키닐메탄)	101.9±3.1
오르리스타트	0.4±0.1

실시예 4. 플라즈마가 처리된 카테킨 유래 신규 화합물의 지방축적 억제효과 측정

플라즈마가 처리된 카테킨 유래 신규 화합물의 항비만 효과를 확인하기 위해, 3T3-L1 지방전구세포를 분화시켜 지방세포 내의 지방축적 정도를 오일-레드-오(Oil-red-O) 염색을 통하여 측정하였다.

3T3-L1 세포를 24 웰 플레이트에 웰당 5×10⁴개의 세포 수로 분주한 후, 웰이 세포로 100% 채워지는 시점이 된 이후에, 2일 동안 더 유지시켰다. 세포는 MDI(0.5mM 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), 1μM 덱사메타손, 1μM 인슐린)를 포함하는 10% FBS DMEM 배지로 지방세포 분화를 2일 동안 유도하였고, 배양 48시간 후, 2μM 인슐린이 함유된 10% FBS DMEM으로 이틀 동안 배양하였다. 그 후 2일 마다 총 4일 동안 10% FBS DMEM 배양액으로 교체하였다. 지방세포 분화를 유도하는 동안 실시예 1에서 분리한 본 발명의 신규 화합물을 5μM, 10μM 농도로 각 배양액에 처리하였고, 분화가 완성되는 시점인 8일째에 지방의 축적 정도를 확인하기 위해 오일-레드-오 염색을 실시하였다.

그 결과, 도 3에 개시된 바와 같이 카테킨에 비해 본 발명의 신규 화합물(메틸렌테트라카테킨, 메틸렌트리카테킨 및 메틸렌디카테킨)에 의한 지방축적 억제효과가 현저히 증가하였고, 특히 메틸렌테트라카테킨(화합물 2)의 지방축적 억제효과가 모든 농도에서 가장 우수하였다.

Claims

하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]
제1항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 조성물은 췌장 리파아제(pancreatic lipase)의 활성을 억제하거나, 지방세포의 지방축적을 억제하는 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
카테킨에 200~300W 범위의 플라즈마를 30~80분 동안 처리하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는, 제1항의 화합물의 제조방법.